UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADEMICA DE BIOLOGIA-MICROBIOLOGIA

TRABAJO ENCARGAOO

RECUENO ESTANDAR DE PLACAS AEROBICAS SEGÚN FDA 2001

Nombre: Merly Meddaly Alférez Alvarez

Código: 2011-118024

Docente: César Julio Cáceda

Curso: Microbiología de los Alimentos

TACNA-PERÚ

2018
I.FUNDAMENTO TEORICO

1. Método de recuento de placas convencional

El recuento de placa aeróbica (APC) está destinado a indicar el nivel de

microorganismo en un producto. Los procedimientos detallados para determinar el
APC de los alimentos han sido desarrollados por la Asociación de Químicos
Analíticos Oficiales (AOAC) y la Asociación Estadounidense de Salud Pública
(APHA). El método convencional de conteo de placas para examinar alimentos
congelados, refrigerados, precocinados o preparados, que se detalla a continuación,
cumple con los Métodos Oficiales de Análisis de AOAC , sec. 966.23, con un cambio
de procedimiento (966.23C). El rango de recuento de colonias adecuado es 25-
250. El método automático de recuento de placas en espiral para el examen de
alimentos y cosméticos, que se detalla a continuación, se ajusta a los métodos
oficiales de análisis de la AOAC., sec. 977.27. Para detalles de procedimientos del
conteo de placas estándar, ver ref. 2. Las directrices para calcular e informar el
recuento de placas se han modificado para cumplir con los cambios previstos en la
16ª edición de los Métodos estándar para el examen de productos lácteos  y
los procedimientos de la Federación Internacional de Lechería (FIL).

1.1 Equipos y materiales

 Área de trabajo, tabla de nivel con una amplia superficie en la sala que
está limpia, bien iluminada (100 pies-velas en la superficie de trabajo) y
bien ventilada, y razonablemente libre de polvo y corrientes de aire. La
densidad microbiana del aire en el área de trabajo, medida en las
placas de vertido de precipitación tomadas durante el enchapado, no
debe exceder las 15 colonias / placa durante una exposición de 15
minutos.

 Espacio de almacenamiento, libre de polvo e insectos y adecuado para

la protección de equipos y suministros
 Placas de Petri, vidrio o plástico (al menos 15 × 90 mm)
 Pipetas con ayudas para pipetas (sin pipeteo bucal) o pipetas, de 1, 5 y
10 ml, graduadas en unidades de 0,1 ml
  Botellas de dilución, 6 oz (160 ml), vidrio resistente al borosilicato, con
tapones de goma o tapas de rosca de plástico
 Contenedores de pipetas y placas de Petri, adecuados para la
protección
 Baño de agua circulante, para atemperar agar, termostáticamente
controlado a 45 ± 1 ° C
 Incubadora, 35 ± 1 ° C; leche, 32 ± 1 ° C
 Contador de colonias, campo oscuro, Quebec, o equivalente, con
fuente de luz adecuada y placa cuadriculada
 Registrador
 Dilución en blanco, 90 ± 1 ml de agua de dilución tamponada con
fosfato de Butterfield ( R11 ); leche, 99 ± 2 ml
 Recuento de placa de agar (métodos estándar) ( M124 )
 Refrigerador, para enfriar y mantener muestras a 0-5 ° C; leche, 0-4.4 °
C
 Congelador, para mantener muestras congeladas de -15 a -20 ° C
 Rango apropiado de termómetros (mercurio); precisión verificada con
un termómetro certificado por el Instituto Nacional de Estándares y
Tecnología (NIST)
 Procedimiento para el análisis de alimentos congelados, refrigerados,
precocinados o preparados

1.2 Metodología

Usando pipetas estériles separadas, prepare diluciones decimales de 10 -2,

10 -3, 10 -4 y otras, según corresponda en cuanto al homogeneizado de
alimentos. Para la preparación de la muestra) se debe transferir 10 ml de
dilución previa a 90 ml de diluyente. Evite tomar muestras de espuma. Agite
todas las diluciones 25 veces en 30 cm (1 pie) de arco en 7 s. Pipetear 1 ml
de cada dilución en placas de Petri separadas, duplicadas y debidamente
marcadas. Reviente la botella de dilución 25 veces en 30 cm de arco dentro
de los 7 s si permanece más de 3 min antes de pipetearla en una placa de
Petri. Agregue 12-15 ml de agar con recuento en placa (enfriado a 45 ± 1 ° C)
a cada placa dentro de los 15 min de la dilución original. Para muestras de
leche, vierta un control de agar, vierta un control de dilución de agua y pipetee
agua para un control de pipeta. Agregue agar a los dos últimos para cada
serie de muestras. Agregue agar inmediatamente a las placas de Petri cuando
el diluyente de muestra contiene materiales higroscópicos, por ejemplo, harina
y almidón. Vierta agar y placas de control de agua de dilución para cada serie
de muestras. Inmediatamente mezcle las diluciones de muestra y el medio de
agar de manera concienzuda y uniforme alternando la rotación y el
movimiento hacia adelante y hacia atrás de las placas sobre una superficie
plana y nivelada. Deje que el agar se solidifique. Invertir placas de Petri
solidificadas, e incubar rápidamente durante 48 ± 2 ha 35 ° C. No apile las
placas al verter agar o cuando el agar se solidifique.

1.3 Pautas para calcular e informar APCs en casos poco comunes

Los Métodos Oficiales de Análisis no proporcionan pautas para contar y

reportar conteos de placas, mientras que los Métodos Estándar para el
Examen de Productos Lácteos, 16ª ed. presenta pautas detalladas; para la
uniformidad, por lo tanto, use las pautas APHA tal como fueron
modificadas . Reporte todos los conteos de placas aeróbicas calculados a
partir de placas duplicadas. Para las muestras de leche, informe todos los
recuentos de placas aeróbicas calculados a partir de placas duplicadas que
contengan menos de 25 colonias como menos de 25 conteos
estimados. Reporte todos los conteos de placas aeróbicas calculados a partir
de placas duplicadas que contengan más de 250 colonias como recuentos
estimados. Los recuentos fuera del rango normal de 25-250 pueden dar
indicaciones erróneas de la composición bacteriana real de la muestra. Los
factores de dilución pueden exagerar los recuentos bajos (menos de 25) y las
placas atestadas (más de 250) pueden ser difíciles de contar o pueden inhibir
el crecimiento de algunas bacterias, lo que da como resultado un recuento
bajo. El informe cuenta menos de 25 o más de 250 colonias como conteos
estimados de placas aeróbicas (EAPC).

 Placas normales (25-250). Seleccione la placa sin esparcidor. Cuente

todas las unidades formadoras de colonias (UFC), incluidas las de
 tamaño de punta, en la (s) placa (s) seleccionada (s). Dilución (es) de
registro utilizada (s) y número total de colonias contadas.
 Placas con más de 250 colonias. Cuando el número de UFC por placa
excede de 250, para todas las diluciones, registre los conteos como
demasiado numerosos para contar (TNTC) para todos, excepto la
placa más cercana a 250, y cuente CFU en aquellas porciones de
placa que sean representativas de la distribución de colonias. .Mark
calculó APC con EAPC para indicar que se estimó a partir de conteos
fuera de 25-250 por rango de placa.

 Esparcidores. Las colonias dispersas suelen ser de 3 tipos distintos: 1)

una cadena de colonias, no muy claramente separadas, que parece ser
causada por la desintegración de un grupo bacteriano; 2) uno que se
desarrolla en una película de agua entre el agar y el fondo del plato; y
3) uno que se forma en una película de agua en el borde o en la
superficie del agar. Si las placas preparadas a partir de muestras
tienen un crecimiento excesivo, (a) el área cubierta por esparcidores,
incluyendo el área total de crecimiento reprimido, excede el 50% del
área de la placa, o (b) el área de crecimiento reprimido excede el 25%
del área de la placa como esparcidores Cuando sea necesario contar
las placas que contienen esparcidores no eliminados por (a) o (b)
arriba, cuente cada uno de los 3 tipos distintos de esparcidor como una
sola fuente. Para el primer tipo, si solo existe una cadena, cuéntela
como una sola colonia. Si una o más cadenas parecen originarse de
fuentes separadas, cuente cada fuente como una colonia. No cuente
cada crecimiento individual en tales cadenas como una colonia
separada. Los tipos 2 y 3 generalmente dan como resultado colonias
distintas y se cuentan como tales. Combine el recuento del esparcidor
y el recuento de colonias para calcular el APC.

 Placas sin CFU. Cuando las placas de todas las diluciones no tengan

colonias, informe APC como menos de 1 vez la dilución más baja
correspondiente utilizada. Mark calculó APC con un asterisco para
indicar que se estimó a partir de conteos fuera del rango de 25-250 por
 placa. Cuando se sabe que las placas de una muestra están
contaminadas o son insatisfactorias, registre los resultados como un
accidente de laboratorio (LA).

1.4 Cómputos y recuentos de grabación

Para evitar crear una impresión ficticia de precisión y precisión al calcular

APC, informe solo los dos primeros dígitos significativos. Redondea a dos
cifras significativas solo en el momento de la conversión a SPC. Para
muestras de leche, cuando las placas para todas las diluciones no tengan
colonias, informe APC como conteo estimado de menos de 25
colonias. Redondea subiendo el segundo dígito al siguiente número más alto
cuando el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 y usa ceros para cada dígito sucesivo
hacia la derecha desde el segundo dígito. Redondee hacia abajo cuando el
tercer dígito es 1, 2, 3 o 4. Cuando el tercer dígito es 5, redondee hacia arriba
cuando el segundo dígito es impar y redondee hacia abajo cuando el segundo
dígito sea par.

Ejemplos

Recuento calculado APC

12,700 13,000
12,400 12,000
15,500 16,000
14,500 14,000
*Placas con 25-250 CFU.

Calcule el APC de la siguiente manera: 

Dónde: 
N = Número de colonias por ml og de producto 
Σ C = Suma de todas las colonias en todas las placas contadas 
n 1 = Número de placas en la primera dilución contada 
n 2 = Número de placas en la segunda dilución contada 
d = Dilución a partir de la cual se obtuvieron los primeros conteos

Ejemplo

1: 100 1: 1000
232, 244 33, 28

= 537 / 0.022 
= 24,409 
≈ 24,000

Cuando los recuentos de placas duplicadas caen dentro y fuera del rango de
25-250 colonias, use solo los recuentos que se encuentren dentro de este
rango.

Todas las placas con menos de 25 CFU. Cuando las placas de ambas

diluciones rinden menos de 25 CFU cada una, registre el recuento real de la
placa, pero registre el recuento como inferior a 25 × 1 / d cuando “d ” es el
factor de dilución para la dilución de la cual se obtuvieron los primeros
recuentos.

Ejemplo

Colonias
1: 100 1: 1000 EAPC / ml (g)
18 2 <2,500
0 0 <2,500
Todas las placas con más de 250 CFU. Cuando las placas de ambas 2
diluciones rindan más de 250 CFU cada una (pero menos de 100 / cm 2 ),
estime los recuentos aeróbicos de las placas (EAPC) más cercanas a 250 y
multiplique por la dilución.

Ejemplo
 Colonias
1: 100 1: 1000 EAPC / ml (g)
TNTC 640 640,000

TNTC, demasiado numeroso para contar. 

EAPC, recuento de placas aeróbicas estimadas.

Todas las placas con esparcidores y / o accidente de laboratorio. Informe,

respectivamente, como Spreader (SPR) o Laboratory Accident (LA).

Todas las placas con más de un promedio de 100 CFU por cm

cuadrado. Estime el APC como mayor que 100 veces la dilución más alta
plateada, multiplicada por el área de la placa. Los ejemplos a continuación
tienen un recuento promedio de 110 por cm cuadrado.

Ejemplo

Colonias / Dilución
1: 100 1: 1000 EAPC / ml (g)
TNTC 7,150 (a) > 6,500,000 EAPC (b)
TNTC 6,490    > 5,900,000 EAPC   

a Basado en el área de la placa de 65 cm 2 

b EAPC, APC estimado 
c Basado en el área de la placa de 59 cm 2

2. Método de placa espiral

El método de conteo de placas en espiral (SPLC) para microorganismos en

leche, alimentos y cosméticos es un método oficial de la APHA y la
AOAC . En este método, una placa mecánica inocula una placa de agar
giratoria con muestra líquida. El volumen de muestra dispensado disminuye a
medida que el lápiz dispensador se mueve desde el centro hacia el borde de
la placa giratoria. La concentración microbiana se determina contando las
colonias en una parte de la placa de Petri donde son fácilmente contables y
dividiendo este conteo por el volumen apropiado. Una inoculación determina
densidades microbianas entre 500 y 500,000 microorganismos / ml. Se
pueden hacer diluciones adicionales por sospecha de altas concentraciones
microbianas.

2.1 Equipos y materiales

 Placas espirales (Spiral Systems Instruments, Inc., 7830 Old

Georgetown Road, Bethesda, MD 20814)
 Contador de colonias en espiral (Spiral Systems) con una cuadrícula
especial para relacionar los volúmenes de muestra depositados con
porciones específicas de placas de Petri
 Trampa de vacío para la eliminación de líquidos (botella de vacío de 2-
4 litros para actuar como depósito de vacío y fuente de vacío de 50-60
cm Hg)
 Vasos desechables, 5 ml
 Placas de Petri, plástico o vidrio, 150 × 15 mm o 100 × 15 mm
 Recuento de placa de agar (métodos estándar) ( M124 )
 Calculadora (opcional), se recomienda una económica calculadora de
mano electrónica
 Bolsas de polietileno para almacenamiento
 Solución comercial de hipoclorito de sodio, aproximadamente 5% de
NaOCl (blanqueador)
 Agua de dilución estéril
 Jeringa, con punta Luer para obstrucciones en el lápiz; capacidad no
crítica
 Área de trabajo, espacio de almacenamiento, refrigerador,
termómetros, recuento, incubador, como se describe para Método de
recuento de placas convencional, arriba.
 Solución de hipoclorito de sodio (5.25%). Disponible comercialmente

2.2 Preparación de placas de agar.

Se recomienda el dispensador automático con sistema de entrega estéril para

preparar placas de agar. El volumen de agar dispensado en las placas es
reproducible y la tasa de contaminación es baja en comparación con el vertido
manual de agar en laboratorio abierto. Cuando sea posible, use una campana
de flujo de aire laminar junto con un dispensador automático. Vierta la misma
cantidad de agar en todas las placas para que la misma altura de agar se
presente en la punta de la aguja del platillo espiral para mantener el ángulo de
contacto. Las placas de agar deben estar niveladas durante el enfriamiento.

Se sugiere el siguiente método para preparar placas de agar: use un

dispensador automático o vierta una cantidad constante (aproximadamente 15
ml / placa de 100 mm; placa de 50 ml / 150 mm) de agar estéril a 60-70 ° C en
cada placa de Petri. Deje que el agar se solidifique en una superficie nivelada
con placas vertidas apiladas no más de 10 platos. Coloque las placas de agar
solidificadas en bolsas de polietileno, cierre con abrazaderas o sellador de
calor, y almacénelas invertidas a 0-4.4 ° C. Ponga las placas previamente
preparadas a temperatura ambiente antes de la inoculación.

2.3 Preparación de muestras

Como se describe en el Capítulo 1, seleccione la parte de muestra con la

menor cantidad de tejido conectivo o glóbulos grasos.

2.3.1 Descripción de la placa espiral

La placa espiral inocula la superficie de la placa de agar preparada

para permitir la enumeración de microorganismos en soluciones que
contienen entre 500 y 500,000 microorganismos por ml. El operador
con entrenamiento mínimo puede inocular 50 placas por h. Dentro del
rango establecido, botellas de dilución o pipetas y otros equipos
auxiliares no son necesarios. El espacio requerido en el banco es
mínimo, y el tiempo para verificar la alineación del instrumento es de
menos de 2 minutos. El dispensador deposita una cantidad decreciente
de muestra en espiral de Arquímedes sobre la superficie de la placa de
agar preparada. Se conoce el volumen de muestra en cualquier porción
de placa. Después de la incubación, las colonias aparecen a lo largo de
la línea de la espiral. Si las colonias en una porción de la placa están lo
suficientemente espaciadas entre sí, cuéntelas en una cuadrícula
especial que asocie un volumen calibrado con cada área. Estime el
 número de microorganismos en la muestra dividiendo el número de
colonias en un área definida por el volumen contenido en la misma
área. Los estudios han demostrado que el método es competente no
solo con leche , sino también con otros alimentos .

2.4 Procedimiento de recubrimiento

Verifique el ángulo de la punta del lápiz diariamente y ajústelo si es

necesario. (Utilice el vacío para sostener el cubreobjetos del microscopio
contra la cara de la punta de la aguja; si el plano de deslizamiento de la
cubierta es paralelo a aproximadamente 1 mm de la superficie de la
plataforma, la punta está orientada correctamente). Los líquidos se
mueven a través del sistema por vacío. Limpie la punta de la aguja
enjuagando durante 1 s con solución de hipoclorito de sodio, seguido de
agua de dilución estéril durante 1 s antes de la introducción de la
muestra. Este procedimiento de enjuague entre el procesamiento de cada
muestra minimiza la contaminación cruzada. Después del enjuague, tome
la muestra en la punta de la tubería de teflón mediante vacío aplicado a la
válvula de 2 vías. Cuando el tubo y la jeringa se llenen con la muestra,
cierre la válvula unida a la jeringa. Coloque la placa de agar en la
plataforma, coloque la punta del lápiz en la superficie del agar y encienda
el motor. Durante la inoculación, etiquetar la tapa de la placa de
Petri. Después de que el agar ha sido inoculado, el stylus se levanta de la
superficie de agar y el platillo espiral se detiene automáticamente. Retire
la placa inoculada de la plataforma y cúbrala. Mueva el lápiz óptico a la
posición inicial. Enjuague el sistema de lavado con hipoclorito y agua, y
luego introduzca una nueva muestra. Invierta las placas y colóquelas en la
incubadora durante 48 ± 3 h a 35 ± 1 ° C.

2.5 Controles de esterilidad

Verifique la esterilidad de la placa espiral para cada serie de muestras

mediante el recubrimiento de agua de dilución estéril. PRECAUCIÓN: las
placas vertidas no deben estar contaminadas por una colonia de
superficie o estar por debajo de la temperatura ambiente (el agua puede
acumularse a partir del agar). No deben estar excesivamente secos, como
 lo indican las arrugas grandes o la apariencia acristalada. No deberían
tener gotas de agua sobre la superficie del agar o diferencias superiores a
2 mm en profundidad de agar, y no deben almacenarse a 0-4.4 ° C
durante más de 1 mes. La velocidad de flujo reducida a través de la
tubería indica obstrucciones o material en el sistema. Para despejar las
obstrucciones, retire la válvula de la jeringa, inserte la jeringa de mano
con el adaptador Luer que contiene agua y aplique presión. Use enjuague
con alcohol para eliminar el material residual que se adhiere a las paredes
del sistema. Disuelva los residuos acumulados con ácido
crómico. Enjuague bien después de la limpieza.

2.6 Rejilla de conteo

2.6.1 Descripción. Utilice la misma cuadrícula de conteo para placas de

Petri de 100 y 150 mm. Se proporciona una máscara para usar con platos
de 100 mm. Rejilla de conteo se divide en 8 cuñas iguales; cada cuña
está dividida por 4 arcos etiquetados como l, 2, 3 y 4 desde el borde de la
rejilla exterior. Se agregan otras líneas dentro de estos arcos para facilitar
el recuento. Un segmento es el área entre 2 líneas de arco dentro de una
cuña. El número de áreas contadas (por ejemplo, 3) significa el número
de segmentos contados dentro de una cuña. La placa espiral deposita la
muestra en la placa de agar de la misma manera cada vez. La grilla
relaciona las colonias en la placa espiral con el volumen en el que
estaban contenidas. Cuando las colonias se cuentan con rejilla, el
volumen de muestra aumenta a medida que el conteo comienza en el
borde exterior de la placa y avanza hacia el centro de la placa.

2.6.2 Calibración. El volumen de muestra representado por varias partes

de la cuadrícula de conteo se muestra en el manual del operador que
acompaña a la bandeja espiral. Las constantes del área de la rejilla han
sido verificadas por el fabricante y son precisas. Para verificar estos
valores, prepare 11 concentraciones bacterianas en el rango de 10 6 -
10 3células / ml haciendo diluciones 1: 1 de suspensión bacteriana (use
un antiséptico). Plate all Incubar ambos juegos de placas durante 48 ± 3
ha 35 ± 1 ° C. Calcule las concentraciones para cada dilución. Cuente las
placas en espiral sobre la superficie de la rejilla, usando la regla de
 recuento de 20 (descrita en H, a continuación), y registre el número de
colonias contadas y el área de la cuadrícula sobre la que se
contaron. Cada recuento de colonias espirales para un área de cuadrícula
particular, dividido por recuento aeróbico / ml para las correspondientes
concentraciones bacterianas plateadas en espiral, indica el volumen
depositado en esa área de cuadrícula particular. Usa la siguiente fórmula:

2.7 Verificación

Para verificar el volumen total dispensado por la bandeja espiral, pese la

cantidad dispensada desde la punta del lápiz. Recoger el vaso de
precipitados de plástico de 5 ml tarado y pesar sobre el equilibrio analítico
(± 0,2 mg).
Figura 1. Placa de 10 cm, área (3b)

2.8 Examen y reporte de conteos de placas espirales.

Regla de recuento de 20. Después de la incubación, centre la placa espiral

sobre la rejilla ajustando los brazos de sujeción en el visor. Elija cualquier
cuña y comience a contar colonias desde el borde exterior del primer
segmento hacia el centro hasta que se cuenten 20 colonias. Complete
contando las colonias restantes en el segmento donde ocurre la 20ª
colonia. En este procedimiento de conteo (Fig. 1) se refieren a segmentos de
área desde el borde exterior de la cuña hasta la línea de arco
designada. Cualquier irregularidad de conteo en la composición de la muestra
se controla contando los mismos segmentos en la cuña opuesta y registrando
los resultados. El ejemplo de placa inoculada en espiral (figura 1) demuestra
el método para determinar el recuento microbiano. Se contaron dos
segmentos de cada cuña en lados opuestos de la placa con 31 y 30 colonias,
respectivamente. El volumen de muestra contenido en los segmentos
oscurecidos es 0.0015 ml. Para estimar el número de microorganismos, divida
el recuento por volumen contenido en todos los segmentos contados. 

Si 20 CFU no están dentro de los 4 segmentos de la cuña, cuente CFU en

toda la placa. Si el número de colonias excede 75 en el segundo, tercer o
cuarto segmento, que también contiene la 20ª colonia, la cantidad estimada
de microorganismos generalmente será baja debido al error de coincidencia
asociado con el hacinamiento de las colonias. En este caso, cuente cada
segmento circunferencialmente adyacente en las 8 cuñas, contando al menos
50 colonias, por ejemplo, si los primeros 2 segmentos de una cuña contienen
19 colonias y el tercer segmento contiene las 20 y 76 (o más) colonias de
conteo en todos los segmentos primero y segundo circunferencialmente
adyacentes en las 8 cuñas. Calcule el volumen contenido en segmentos
contados de cuñas y divídalo en el número de colonias.

Cuando se cuentan menos de 20 colonias en la placa total, informe los

resultados como "menos de 500 SPLC estimados por ml". Si el recuento de
colonias excede 75 en el primer segmento de cuña, informe los resultados
como "más de 500,000 SPLC estimados por ml". No cuente las placas
espirales con una distribución irregular de colonias causada por errores de
dispensación. Informe los resultados de tales placas como accidente de
laboratorio (LA). Si el esparcidor cubre toda la placa, deseche la placa. Si el
esparcidor cubre la mitad del área de la placa, cuente solo las colonias que
están bien distribuidas en las áreas libres de esparcidores.

Compute el SPLC a menos que esté restringido por la detección de

sustancias inhibitorias en la muestra, crecimiento excesivo del esparcidor o
accidentes en el laboratorio. Redondee recuentos como se describe en ID,
arriba. El informe cuenta como SPLC o SPLC estimado por ml.