UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE BIOLOGIA Y MICROBIOLOGIA

PRCTICA DE LABORATORIO N 05

RECUENTO DE Salmonella

PRESENTADO POR:
VICTOR VENEGAS CUAILA 2012-36129

CURSO
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

DOCENTE
DR. CESAR JULIO CACEDA QUIROZ

TACNA PER
2017
 DETECCIN DE Salmonella

1. INTRODUCCIN
El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae,
integrada por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen,
por lo tanto, las caractersticas generales de las enterobacterias: son
fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasas negativo,
reducen nitratos a nitritos y suelen ser mviles; representa una
excepcin Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum, siempre
inmvil.
La Salmonella es una bacteria que puede causar una infeccin
gastrointestinal conocida como salmonelosis. Esta infeccin puede
ocurrir en los humanos y animales. Son viables en diferentes
condiciones ambientales sobreviven a la refrigeracin y congelacin,
mueren por calentamiento (mayor a los 70C). La mayora de las
personas infectadas dura entre cuatro a siete das. La persona puede
enfermar lo suficiente como para requerir hospitalizacin. Las
complicaciones graves y la muerte son raras, y ms probablemente
suceden en las personas muy jvenes, muy viejas y en las que tienen
otros problemas de salud.
La Salmonella debera ser considerada como potencialmente
patgena para el hombre. La nica va de entrada de estos
microorganismos en el cuerpo humano es la oral, por lo que es de
suma importancia el anlisis de los alimentos para detectar su
presencia.
2. FUNDAMENTO
i. Enriquecimiento no selectivo: se utiliza cuando se cree que un
tratamiento (deshidratacin, irradiacin o congelacin), o ciertas
condiciones (bajo pH), hayan lesionado las salmonelas en los
alimentos.
ii. Enriquecimiento selectivo: estimula la multiplicacin de las
salmonelas y reduce o inhibe el crecimiento de los organismos
competitivos, tales como los coliformes, Proteus y Pseudomonas,
cuyo crecimiento superara al de las salmonelas. La Comisin
recomienda el uso de caldo selenito-cistina y de caldo tetrationato
verde brillante, ambos incubados a 43C. El caldo tetrationato junto
con el tiosulfato inhibe los coliformes mientras que las bacterias
reductoras de tetrationato como Salmonella y Proteus pueden
crecer sin dificultad. Las sales biliares inhiben a todos los Mos
intestinales acompaantes y el verde brillante inhibe la flora Gram
positiva.
iii. Siembra en Medios Selectivos y Diferenciales:
Agar MacConkey: es un medio selectivo y diferencial para aislar
Mos fermentadores y no fermentadores, de baja selectividad para
usar con inculos pequeos. Las sales biliares y el cristal violeta
inhiben Mos Gram positivos. La presencia de lactosa permite el
desarrollo de las cepas lac (+), que se manifiesta por el viraje del
indicador debido a la produccin de cido, luego se absorbe el rojo
neutro dando color rojo a la colonia y un halo por la precipitacin
de las sales biliares por acidez del medio.
Las bacterias no fermentadoras de lactosa (Salmonella Typhi, S.
Paratyphi, Shigella dysenteriae), no alteran el medio, dando
colonias incoloras y transparentes.
Agar SS (Salmonella-Shigella): es un medio selectivo para
Salmonella y Shigella a partir de materia fecal, alimentos y
animales, sirve para diferenciar fermentadores de lactosa de los no
fermentadores. La presencia de verde brillante a alta concentracin
de tiosulfato y el citrato inhiben la flora acompaada. Los que
fermentan lactosa producen cido que en presencia del rojo neutro
 propicia colonias de color rojo, los que no fermentan lactosa forman
colonias incoloras El Tiosulfato y la sal de hierro ponen en
evidencia la formacin de sulfuro de hierro. La degradacin de la
lactosa a cido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo.
iv. Pruebas Bioqumicas
Agar Triple Azcar Hierro (TSI): es un medio diferencial,
compuesto de tres azcares: Glucosa, lactosa y sacarosa. El color
original de este medio es rojo ladrillo. El hierro es el indicador para
poner en evidencia la produccin de hidrogeno sulfurado (H 2S), la
produccin de H2S se manifiesta por color negro en el medio se
simboliza de acuerdo a la intensidad de 1 + 4 +.La presencia de
gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio o por lo que
el medio se elevada, se simboliza segn su intensidad de 1 + 4
+. La acidez se pone de manifiesto por su cambio al color amarillo,
se simboliza con la letra A. La alcalinidad en este medio se
manifiesta por su cambio al color grosella, se simboliza con la letra
K. El ataque de glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte
inclinada (K) y acidez en el fondo (A), se simboliza K/A. El ataque
de lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total del medio
al color amarillo, se simboliza A/A. Los Mos que no atacan ninguno
de los azcares, el color del medio, a pesar del crecimiento
bacteriano, es casi igual y se simboliza N/N.
Agar Lisina Hierro (LIA): Puede utilizar la lisina del medio LIA, por
los mecanismos de descarboxilacin, desaminacin o bien ser
negativos frente a este aminocido. Para diferenciar estas
reacciones el medio tiene en su composicin glucosa y el indicador
azul de bromocresol. El color original del medio es ligeramente
azulado. La descarboxilacin de la lisina produce alcalinidad en
todo el medio, por lo que tanto, el color azulado se intensifica, se
simboliza K/K y se considera como Lisina Positiva. La
desaminacin empieza en la parte inclinada variando esta porcin
al color rojo ladrillo, el fondo se tornar amarillo y se interpreta
como Lisina Negativa, se simbolizar R/A. Si no se produjera
ninguna de las dos reacciones descarboxilacin o desaminacin el
 medio LIA se observar azulado en la parte inclinada y amarillo en
el fondo por fermentacin de la glucosa, se simbolizar K/A puede
presentarse amarillo en su totalidad, es A/A. Estas dos lecturas se
interpretan como Lisina Negativa. Si no ha variado el color del
medio, a pesar del crecimiento bacteriano, se simbolizar N/N. Se
presenta por la acidez, producto del ataque a la glucosa, se
neutraliza por la alcalinidad producida por la decarboxilacin o bien
por que el grmen ha sido incapaz de utilizar la glucosa. Por lo
tanto no correspondern a la familia Enterobacteriaceae.
3. OBJETIVO
Realizar la deteccin de Salmonella sp. en una muestra determinada
(Huevos crudos) y hacer la confirmacin con las pruebas bioqumicas.
4. MATERIALES Y MTODO
4.1 MATERIALES
4.1.1 MATERIAL
Matraz de 250 y 500ml Tubos de ensayo
Placas Petri de 100 x 15 mm.
Pipetas de 1 ml.
Aguja y Asa de Kolle
Esptula
Papel Kraft
4.1.2 EQUIPOS
Estufa a 35 37C.
Balanza.
Cocina elctrica.
4.1.3 MEDIOS DE CULTIVO
Agua Peptonada Tamponada.
Caldo tetrationato sin distribuir y en tubos con 10 ml.
Agar SS
Agar MacConkey
Agar triple azcar hierro (TSI) inclinado.
Agar lisina hierro inclinado (LIA).
4.2 MTODO
 4.2.1 AISLAMIENTO DE SALMONELAS
Esta parte incluye tres etapas fundamentales:
a) ENRIQUECIMIENTO PREVIO DE SALMONELAS
(FDA, 2 007)

Cuadro N 01: Mtodos de enriquecimiento previo para salmonelas.

Producto Caldo de preenriquecimiento

Huevos completos desecados, yemas Caldo lactosa o agua de peptona
de huevo desecadas, clara de huevo tamponada.
desecadas, huevos lquidos
pasterizados y congelados, mezclas
preparadas en polvo, galletas, frmula
para nios, huevos crudos, carnes
crudas, pasta conteniendo huevo,
tintes y sustancias colorantes.
Levadura desecada (inactivada) Agua destilada
Leche en polvo descremada y leche Agua destilada con 2 ml de solucin al
en polvo entera 1% de verde brillante por litro.
Caramelos y bombones Leche en polvo reconstituida con
verde brillante
Sub productos grasos animales Caldo lactosa con 1% de Tergitol o
fundidos, coco. agua de peptona tamponada con
0.22% de Tergitol.
Fuente: ICMSF, 2000.

Preparacin de Muestra: Huevo entero

Pesar aspticamente 25 g de la muestra en un

recipiente estril de boca ancha o en otro recipiente
apropiado y agregar 225 ml de Agua Peptona
Tamponada. Agitar suavemente hasta disolucin sin
grumos.

Dejar 60 minutos + 5 minutos a temperatura

ambiente, incubar 24 h + 2 h a 35C.
 b) ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO DE
SALOMONELLAS (ICMSF, 2 000)
Pasar 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a 10 ml.
de caldo Tetrationato verde brillante. Incbese a 43 +
0.05C durante 24 horas.
c) SIEMBRA EN PLACA EN MEDIO DE AGAR
SELECTIVO PARA SALMONELAS (ICMSF, 2 000)

Pasar una asada del medio de enriquecimiento

selectivo a la superficie de una placa de cada uno de
los dos medios de agar selectivo (Agar SS Y Agar
MacConkey) y extender de tal manera que se
obtengan colonias aisladas.
Incubar las placas de Agar SS durante 24 horas a 35-
37 C. Las colonias tpicas de Salmonella son
incoloras y en el medio se evidencia un color oscuro
evidenciando el sulfuro.
Incubar las placas de agar MacConkey a 35-37C
durante 48 horas. Las colonias tpicas de Salmonella
son incoloras, transparente.
4.2.2 EXPLORACION BIOQUMICA PARA LA
IDENTIFICACIN DE SALMONELAS (FDA, 2 007)
TSI y LIA: Picar suavemente el centro de la colonia con
aguja de inoculacin e inocular el TSI por puncin en el
fondo y estriar el pico de flauta.
Sin flamear inocular el LIA por puncin en el fondo 2
veces y estriar el pico de flauta. Como la reaccin de la
lisina decarboxilasa es estrictamente anaerbica, el LIA
debe tener un fondo profundo (4cm). Guardar las placas
a 5C 8C.
Incubar el TSI y LIA a 35C durante 24 h + 2 h. Tapar los
tubos sin apretar para mantener condiciones de
aerobiosis y prevenir la excesiva produccin de H2S.
LECTURA DE PRUEBAS BIOQUMICAS
TSI: Diferenciacin de enterobacterias, en base a la
fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la
produccin de cido sulfhdrico.
COLOR: Amarillo-Naranja (fondo cido) y
Rojo (pico de flauta alcalino).
INDICADOR: ROJO DE FENOL
SUSTRATO: AGAR
Salmonella spp. : K/A
H2S (+)
GAS (+)
LIA: Especialmente Salmonella spp., basado en la
descarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico
COLOR: Purpura (fondo alcalino)
INDICADOR: PURPURA DE
BROMOCRESOL
SUSTRATO: AGAR
Salmonella spp.: K/K
H2S: (+)
GAS: (-)
Descartar como no Salmonella los cultivos que dan fondo
cidos en LIA y pico de flauta y fondo cidos en TSI.
 Cuadro N02: Interpretacin para otras pruebas Bioqumicas y
serolgicas
Resultado para
Resultado Salmonella spp
Prueba
(a)

Positivo Negativo
Glucosa (TSI) fondo amarillo fondo rojo (+)
Lisina decarboxilasa
fondo violeta fondo amarillo (+)
(LIA)
H2S (TSI y LIA) ennegrecimiento sin ennegrecimiento (+)
Ureasa rojo- violeta sin cambio de color (-)
Caldo lisina
violeta amarillo (+)
decarboxilasa
Caldo dulcitol rojo sin gas y sin cambio
amarillo y/o gas (+) (b)
fenol de color
Caldo KCN crecimiento sin crecimiento (-)
Caldo malonato azul sin cambio de color (-) (c)
color rojo fuerte en color amarillo en la
Indol (-)
la superficie superficie
Antisuero polivalente
aglutinacin sin aglutinacin (+)
flagelar
Antisuero polivalente
aglutinacin sin aglutinacin (+)
somtico
Caldo lactosa rojo sin gas y sin cambio
amarillo y/o gas (-) (c)
fenol de color
Caldo sucrosa rojo sin gas y sin cambio
amarillo y/o gas (-)
fenol de color
Voges Proskauer rosa a rojo sin cambio de color (-)
Rojo de metilo rojo amarillo (+)
sin crecimiento, sin
Citrato de Simmons crecimiento, azul V
cambio de color
Fuente: FDA, 2 007
(a) (+): 90% o ms positivo en 1 o 2 das, (-): 90% o ms negativo en 1 o 2 das,
V: variable
(b) La mayora de las S. arizonae son negativas
(c) La mayora de las S. arizonae son positivas

ESQUEMA DEL PROTOCOLO

1. ENRIQUECIMIENTO PREVIO DE SALMONELAS

DIA 1

25 g de Agua Incubar a 35-37C,

muestra Peptonada 18-24 horas
Tamponada
225ml

2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO DE SALMONELAS

DIA 2
1 ml del cultivo preenriquecido
en 10 ml de

Caldo Selenito Caldo Tetrationato

cistina verde brillante

Incbese a 43 + 0.05 C / 24 h

DIA 3 Agar MacConkey

Agar SS
Colonias tpicas de
Colonias tpicas de
Salmonelas son incoloras Salmonelas son
y en el medio se evidencia amarillas
un color oscuro
evidenciando sulfuro.
5. EXPRESIN DE RESULTADOS
De acuerdo a los resultados de la interpretacin indicar presencia o
ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada (por
gramos o mililitros para muestras lquidas).
6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

ICMSF. (2000). Microorganismos de los Alimentos 1. Su significado y

mtodos de enumeracin. Zaragoza (Espaa): ACRIBIA S.A.

Bacteriological Analytical Manual. Chaper 5, Salmonella. December

2007.Edition. FDA U.S. Food and Drug Administration.