Acidos Nucleicos PDF

...
c A p I T u L o 6
ACIDOS NUCLEICOS Y
. SUS COMPONENTES
acidos nucleicos desempeiian varias funciones en los or-

~ ·~.n11~il~ntes de bajo peso molecular de los acidos nucleicos son
i"'nplliiU):lellijeYutifu~os~ las reacciones metab6licas. Cuando forman complejos
ac:t~:1O~. nucleicos de alto peso molecular proporcionan estruc-
\Ia~IPU.J""\,J'''. ' Sin embargo, la funci6n unica y primordial
como dep6sitos y transmisores de la informaci6n
que las celulas funcionen de acuerdo con pa-
kd!at'~:nueVliS celulas que funcionen en forma similar
~IliCl~jliJe'V1l/JfI.u~~~, a los planes codificados en el acido nucleico.
'Jiit;\i ...Ah' ~r.~jia.Jtr.aj~.~w~..tFti.:.~~~! en una molecula de acido nucleico en una
r(ti"'tt.uq~.a."plP.lltGl_..Jlt~_*_~. Cuatro unidades distintas constituyen cada

bb~:im.l&ruIjJijJ.J":ijij~qoJ..t~""'ldll~iJ~ informaci6n. Cada una de las unidades
molecula de acido nucleico es lineal
·!O!rrblBlsemejan las letras de una pagina im-
de computadora. Dada la ma-
interpretarse, de la misma manera
La celula interpreta la infor-
como secuencias de ami-
de secuencias definidas
molecula de protef-
las caracterfsticas
simb6lica. C6mo
de la parte
covalentes de
231
232 Acidos nucleicos y sus componentes
ala funcion de los acidos nucleicos . La formacion de estos enlaces es especialmen-

te importante en la transferencia de la informacion genetica durante los procesos
de sfntesis de protefnas y acidos nucleicos.
6.1 COMPONENTES Y ORGANIZACION DE lOS

ACiDOS NUClEICOS
La unidad monomerica de una molecula de acido nuclei co es un residuo de nucleo-
tido. El nucleotido, a su vez, tiene tres componentes facilmente reconocibles:
Un azucar.
Una base purfnica 0 pirimidfnica.
Una fraccion esterificada de acido fosforico.
El azucar es ribosa 0 desoxirribosa y divide a los acidos nucleicos en dos grupos

principales. El acido ribonucleico (RNA) tiene como azucar a la D-ribosa en la
configuracion de furanosa, mientras que el acido desoxirribonucleico (DNA), como
su nombre 10 indica tiene el azucar D-2-desoxirribosa, tambien en la configuracion
de furanosa.
{3-D-Ribofuranosa {3-D-2-Desoxirribofuranosa
Los nombres sistematicos de las bases purfnicas y pirimidfnicas derivan de los

compuestos precursores, purina y pirimidina. La adenina (6"aminopurina) y la gua-
nina (2-amino-6-oxopurina) son las dos bases purfnicas comunes tanto del DNA como
del RNA.
NH2 o
~;YNJH
H~.,J-N
HN:J=N\
A
I
N
FH
N H H2N N H
Adenina Guanina
(6-aminopurina) (2-amino-6-oxopurina)
Las bases pirimidfnicas comunes del RNA son la citosina (2-oxo-4-amino-

pirimidina) y el uracilo (2,4-bis-oxopirimidina), mientras que el DNA tiene citosina
y timina como pirimidinas predominantes. Muchas otras bases purfnicas y pirimidf-
nicas se presentan en moleculas especfficas de acido nucleico. La mayorfa de ellas
son raras. Una pirimidina no tan rara es la 5-metilcitosina que constituye el 7% de
las bases del DNA de algunas plantas y hasta e13% de las bases en otros DNA eucario-
ticos. La N-6-metiladenina se encuentra en cantidades menores en los DNA euca-
rioticos, en tanto que en algunos DNA procarioticos estan presentes la 5-meti1citosina
Componentes y organizaci6n de los 6cidos nucleicos 233
y la N-6-metiladenina. Asimismo, se conocen otras bases organicas menos comu-
nes, algunas de las cuales se estudian aquf.
Una base purfnica 0 pirimidfnica unida a la D-ribofuranosa forma un ribonu-
cleosido. EI enlace N-tJ-glicosfdico une el carbo no 1 de la ribosa con el nitrogeno
9 de una base purfnica 0 el nitrogeno 1 de una base pirimidfnica. Para distinguir
los sistemas de numeracion de las bases y de los azucares, los atomos de carbono
del azucar se indican con apostrofos: C-l', C-2', hasta C-5'. Puede considerarse
que el enlace glicosfdico se ha formado por eliminacion de una molecula de agua
derivada del hidroxilo hemiacetalico del azucar y el proton unido al atomo de N de
la base. Los desoxinucleosidos tienen estructuras similares. Ambos tipos de nucleo-
sidos tienen la configuracion tJ, la cual se caracteriza por tener la base y el C-5'
del azucar en el mismo lado del anillo furanosido del D-azUcar.
~: C/
0
H
I
I N~O
N
N~O
H H
Pirimidina Citosina Uracilo
Timina
(0
HN-CH3
NJlN-::
H
N·6-Metiladenina
OH OH OH H
Guanosina Desoxirribosi l·5-metilcitid fna
(9-{3-D·Ri bofuranosil (1-{3-D-2-Desoxi rribofu ran osil-
guanina) 5-metilcitosina
Por acuerdo, la l-/3-D-ribofuranosiltimina se denomina ribotimidina.
Desoxirribotimidina Ribotimidina
En la tabla 6.1 se dan los nombres de algunas bases purfnicas y pirimidfnicas

y sus ribonucleosidos y desoxirribonucleosidos correspondientes. Observese que el
sufijo -osina no se utiliza consistentemente en esta nomenclatura aceptada y que la
ribotimidina y la desoxiuridina son , raras .
Un nucle6tido es un nucleosido fosfato, un nucleosido esterificado con acido fos-
forico. Uno 0 mas de los tres hidroxilos, 2' , 3' 0 5 ' pueden estar esterificados.
Sin embargo, los nucleotidos mas comunes son los nucleosido-5' -fosfatos. En la
tabla 6.2 se dan las abreviaturas comunes para los nucleosido-5' -fosfatos y los
desoxinucleosido-5' -fosfatos.
Los nombres alternativos para el AMP son acido adenflico 0 adenilato; los nom-
bres alternativos para el dCMP son acido desoxicitidflico y desoxicitidilato y asf
sucesivamente. Los adenosfn-2' -monofosfatos y adenosfn-3' -monofosfatos se co-
nocen a veces como 2' -adenilato y 3' -adenilato. Sin embargo, en el caso de estos
y otros nucleotidos, las abreviaturas de la tabla 6.2 se reservan para los nucleosi-
do-5' -fosfatos. Otra designacion para e15' -adenilato es pA, mientras que el 3' -ade-
nilato tiene la abreviatura Ap. La desoxiadenosina-5' -fosfato se abrevia como pdA.
TABLA 6.1 Nombres de nucle6sidos

Desoxirribo-
Base Ribonucleosido Srmbolo nucleosido Srmbolo
Adenina Adenosina A 2' -desoxirribosiladenina
0 dA
desoxiadenosina
Guanir.a Guanosina G 2' -desoxirribosilguanina
0 dG
desoxiguanosina
Citosina Citidina C 2' -desoxirribosi1citosina
0 dC
desoxicitidina
Uracilo Uridina U 2' -desoxirribosiluracilo
0 dU
desoxiuridina
Timina Ribotimidina rT 2' -desoxirribosiltimina
0 dT
desoxitimidina
Nucleosido difosfato y nucleosido trifosfato; nucleotidos dclicos 235
TABLA 6.2 Abreviaturas para los nucleosido-5' -fosfatos
Base Ribonucle6tido Desoxirribonucle6t1do
Adenina AMP dAMP
Guanina GMP dGMP
Citosina CMP dCMP
Uracilo UMP dUMP
Timina rTMP dTMP
o
i
- O-p - O
I I
0 - CH2
OH H OH OH
Timidina-5' -fosfato Uridina-3 ' -fosfato
(dTMP)
0-
0-
I
O--p-O -
I I
-O-p--O o
I I
0-CH2 CH2
0-
I
OH O-p-O- OH OH
!
o
Adenosina-2,5' -bi-fosfato Guanosina-5' -fosfato
(GMP)
6.2 NUCLEOSIDO DIFOSFATO Y NUCLEOSIDO

TRI FOSFATO; N UCLEOTI DOS cicLiCOS
Como se indico anteriormente, la nomenclatura "bi-fosfato" se refiere a un nu-

cle6sido que tiene dos de sus grupos hidroxilo individualmente fosforilados. EI grupo
hidroxilo 5' de los nucleosidos puede esterificarse tambien para formar anhfdridos
fosforicos: pirofosfato y trifosfato. Estos originan, respectivamente, nucle6sido difos-
fatos (no hi-fosfatos) y nucleosido trifosfatos.
o 0 o 0 0
i i i ii
HO - P-O -P -O - - 0- p - o- p-o - P- OH
I I I I I
0- 0- 0- 0- 0-
Pi raloslato Trifoslato
El adenosin trifosfato (A TP) funciona como la moneda energetica de la celula y es

con mucho el compuesto mas importante a este respecto, como se sefiala en el capi-
tulo 9. Los fosfatos del ATP se designan como a, {3 y ,,/, como se indica.
a
o 0 000
i i iii
-O-p-O-P-O -o-p-o-p-o-p-o
I I I I I I I
0- 0 - CH 2 0- 0- 0- CH 2
OH OH OH OH
Adenos(n difosfato Adenos(n trifosfato
La hidr61isis de cualquiera de los enlaces de anhidrido fosf6rico es terrnodinamica-

mente una reacci6n muy favorecida a un pH neutro, liberando casi mas de dos veces
la energia de la reacci6n de hidr61isis de un ester de acido fosf6rico comun, como
es la hidr6lisis del AMP en adenosina y fosfato inorganico. Las dos reacciones de
hidr6lisis de anhidrido fosf6rico son:
ATp4 - + H20 ~ ADp3- + HPO~ - + W

ATp4- + H20 ~ AMp2- + HP20 ~- + H+
En el cuerpo humano, casi 2 kg de ATP se hidrolizan por dia en estas dos reaccio-
nes, y una cantidad similar es sintetizada. La mayor parte de la hidr61isis del ATP
se acopla a otras reacciones para utilizar la energia que se alrnacen6 en esta molecula
energetica. El resultado es que la hidr6lisis del ATP se utiliza para' 'impulsar" otras
reacciones bioquimicas que de otra manera sedan termodinamicamente desfavora-
bles. Se desconoce aun la contribuci6n relativa de todos los factores a la energia
de hidr61isis favorable del ATP. Sin embargo, la alta densidad de carga negativa del
ATP respecto a sus productos de hidr61isis y la estabilizaci6n de los productos por
resonancia son factores importantes en este punto (v ease tambien el capitulo 9). No
obstante, el ATP es una molecula estable en soluci6n acuosa a un pH neutro y en
ausencia de enzimas que 10 utilicen como sustrato. Esta es una caracteristica impor-
tante en su funci6n como moneda energetica. Los trifosfatos de todos los nuc1e6si-
dos y desoxinuc1e6sidos comunes tambien son importantes: son, respectivamente,
los precursores para la sintesis de RNA y DNA.
Se han estudiado ampliamente dos clases de fosfodiesteres cfc1icos de nucle6si-
dos. Los fosfodiesteres 3 ':5 -cfclicos de adenosina y guanosina son intermediarios
I
importantes en la acci6n de algunas hormonas. Los fosfodiesteres 2 ':3 I cfc1icos de

nucle6sidos son intermediarios en la hidr6lisis del RNA (vease la secci6n 6.4).
Estructura covalente del RNA y el DNA 237
ICH,
o
I
o<-p--o OH
I
0-
Adenosin-3': 5' -fosfato Citidin-2 ': 3' -fosfato

ciclico ciclico
6.3 ESTRUCTURA COVAlENTE DEL RNA Y El DNA

La columna vertebral de una molecula de acido nuclei co es una cadena de residuos
de azucar y fosfato alternados que resultan de la formaci6n de enlaces fosfodiester
3' -5' entre los residuos de nucle6tidos. EI termino "residuo de nucle6tido" es
mas apropiado que el de "nucle6tido" debido a que la estructura ya no es estricta-
mente la de un nucle6tido. Puede considerarse que la molecula de agua se ha dividi-
do en el proceso de formaci6n del enlace covalente, de modo que un residuo de
nucle6tido tiene un atomo de oxfgeno y dos atomos de hidr6geno menos que el nu-
cle6tido correspondiente. Otro termino para los residuos de nucle6tido 3' - 5' po-
limerizados es el de "polinucle6tido". Con frecuencia, el termino polinucleotido
implica un polimero sintetico de secuencia de nucle6tidos indeterminada 0 de un
solo tipo de residuo, como el acido poliadenflico [abreviado poli(A»). EI termino
acido nucleico implica un polinucle6tido de tamafio y secuencia de nucle6tidos de-
finidos, en particular cuando se afsla de una fuente natural. Un oligonucleotido
es, en efecto, una molecula formada por s610 algunos residuos de nucle6tido.
En la figura 6. 1 se muestra la estructura de cadenas de polinucle6tido representa-
da por dos oligonucle6tidos. Debido a que los acidos nucleicos son polfmeros linea-
les con un solo tipo de enlace internucleotfdico, la estructura covalente se representa
inequfvocamente mediante cualquiera de varias formas simb6licas. En una de estas
formas simb6licas, el azucar del residuo de nucle6sido se representa mediante una
linea vertical, con el C-l' arriba y el C-5' abajo .
G A U C A T C
OH H
OH OH
p
a a
pGpApUpC pdGpdApd TpdCp
a a
pG- A- U -C pdG-dA - dT -dCp
Extrema 5'
I
o
I 5'
O=P-O-CH
I 2
0-
5'
Na+
O=P-O-CH
r ,.
OH
Htc
H N 0 Citasina
I 2
0-
OH
r ,.
Q=P-O-CH
I 2
Guanina
0-
Na+
OH
Hi: , /H
I
o
N
H N~O Uracila
3'
Na+
etc. OH
Extrema 3'
(a)
FIGU RA 6,1 Estructura de: 0) un tetrorribonucleotido y b) un tetrodesoxirribonucleo-

tido mostrando 10 estructura lineal formada por los enlaces 3' - 5' fosfodiester entre
residuos de ribonucleotido y de desoxirribonucleotido, Se representa 10 forma ioni-
co con sodio, aunque los controiones de un 6cido nucleico se intercambian f6cilmente
con otros cationes del medio,
Estructuro covalente del RNA y el DNA 239
I;:xtremo 5'
5'
r ,
0 = P- 0 - CH 2
I
Citosina
0-
Na+
r ,
0=P- 0 - CH 2
Guanina
I
0-
r ,
0 = P- 0-CH 2
Timina
I
0-
3'
Na+
etc. H
Extremo 3 '
(b)
FIGURA 6.1 (continuaci6n)
El residuo de nucleosido mismo es una Ifnea con la abreviatura de una sola letra
del nucleosido escrita arriba del mismo . (Alternativamente, dicha letra sola puede
representar al nucleosido. Una "p " mimiscula 0 un guion denota un enlace fosfo-
diester. Un grupo fosforilo terminal (acido fosforico esterificado) tambien se indica
mediante una letra p.
Es evidente a partir de la estructura representada en la figura 6.1 que la cadena

de polinuc1e6tidos no es simetrica. Tiene una direcci6n definida a 10 largo de la cade-
na. EI extrema de la cadena que tiene un grupo libre 3' -OH 0 3' -fosforilo 0
algun otro grupo distinto al enlace fosfodiester comun se designa como extremo 3 I •
La caracterfstica del extrema 5' es que el residuo terminal no tiene el grupo 5' for-
mando parte del enlace fosfodiester comun.
Las estructuras abreviadas de polinuc1e6tidos y oligonuc1e6tidos siempre deben
escribirse con el extrema 5' a la izquierda y el extrema 3' a la derecha, a menos
que la estructura se designe de otra forma. Para abreviar las secuencias largas, los en-
laces fosfodiester no se representan, aunque en general los grupos terminales sf. Una
"d" en el extrema 5' indica una secuencia que consta por completo de residuos de
desoxirribonuc1e6tidos . Ejemplo de un oligorribonuc1e6tido es HO-UACACAU-
CUCAACUCp de un oligodesoxirribonuc1e6tido , pdCATGTCCCATG-OH. Esta
norma tambien es util para representar mononuc1e6tidos. El AMP es pA y
la desoxicitidina-3' -fosfato es dCp. Sin embargo, los nuc1e6sido-2' -fosfatos no se
representan siguiendo las reglas de este acuerdo .
Una sola molecula de RNA puede tener mas de 10 000 residuos de nuc1e6tido
en su estructura. Las moleculas de DNA pueden ser mucho mas grandes, como se
menciona en la secci6n 6. 10. El que las moleculas de DNA puedan ser mucho mas
grandes que las moleculas de RNA se debe en parte a la mayor estabilidad del DNA,
un tema que se estudia en la siguiente secci6n. La electroforesis en gel es, con mu-
cho, la tecnica que mas se utiliza para estimar el tamano de las moleculas de acido
nuc1eico. La carga de las moleculas de acido nuc1eico es el tema que se trata en
el recuadro 6.A, mientras que la electroforesis en gel de los acidos nuc1eicos se des-
cribe en el recuadro 6.B.
RECUADRO 6.A FORMAS TAUTOMERICAS Y REACCIONES DE LOS

PROTONES DE NUCLEOSIDOS Y NUCLEOTIDOS
En las f6rmulas estructurales de este capitulo se representan las bases de nucle6sido en la forma taut6mera
que parece predominar de acuerdo a los amilisis espectrosc6picos: las formas ceto (>C=O) y amino
(-NH-). Estas form as predominan sobre las formas enol (~ C-OH) e imino (=N-), que se muestran
aqui para la timid ina (estructuras a la derecha y a la izquierda) y para la guanosina (estructura de la derecha).
Tim idina
<t
o Oli
I'j ..)< H "
p "~'I/ .~'-- ''; N
": r~ Jl )....
.' '--y/
N ' NH
<-.--+
N
i I
'NANH
12 1 <
R R.
Guanosina
Estructura covalente del RNA y el DNA 241
Las fonnas ceto y amino se ajustan al esquema de Watson y Crick del apareamiento de bases del DNA
de doble cadena (seccion 6.5), pero no asf las fonnas enol e imino. Aunque la energfa de las fonnas enol
e imino es mayor que la de las fonnas ceto y amino, la diferencia de energfa no es muy grande, de modo
que estas dos ultimas formas pueden tener importancia biologica. Los rearreglos tautomericos requieren
la transferencia intramolecular de protones y, en consecuencia, los equilibrios tautomericos de dichas
formas deben ser independientes del pH.
Sin embargo, los nucle6sidos, nucleotidos y residuos de nucleotido presentan reacciones protonicas im-
portantes. Las reacciones mas importantes de asociacion y disociacion de protones en las bases de los
nucleosidos se muestran casi al tennino de este recuadro.
Al igual que la uridina, la timid ina disocia un proton con pKa de casi 9.2 . En las reacciones de disocia-
cion acida de la guanosina, tirnidina y uridina, se esperarfa que la carga negativa se distribuyera desde el
nitrogeno del anillo hasta el oxfgeno del grupo ceto. Los valores de pKa de las bases son casi 0.3 unida-
des mayores en el polinucleotido que en el nucleosido debido a las cargas negativas aportadas por los enla-
ces fosfodiester, 10 cual se describe a continuacion. Es decir, cada grupo protonado se convierte en un
acido mas debil.
Las reacciones de disociacion de los protones del acido fosforico y de los esteres del acido fosforico se
han descrito ya en la seccion 1. 13. De las tres disociaciones protonicas del acido fosforico, solo una queda
en un enlace fosfodiester, y tiene un pKa menor de 1. En una cadena de polinucleotidos, la base que se
Adenosina
f)w ~ "\2 ·~N~'O

~N/ ~O f(
I I
R R
Uridina
protona mas facilmente es la citocina, con un pKa de aproximadamente 4 .5. La disociaci6n de un proton
de una base de guanina, uracilo 0 timina sera semicompleta solo a un pH de alrededor de 9.5. Por 10
tanto, a un pH neutro, habra por cada residuo de nucle6tido una carga neta de -1 que proviene del enlace
fosfodiester disociado. A un pH neutro, la ionizacion de las bases virtualmente no contribuye en este aspecto.
RECUADRO 6.B ELECTROFORESIS EN GEL DE LOS

ACIDOS NUCLEICOS
Tanto el tamafio como la carga de una protefna, un acido nucleico 0 cualquier otra molecula ionizada afec-
tan su movilidad electroforetica en un gel. Por supuesto, el aumento en el valor de la carga electrica aumenta
la movilidad de la molecula ionizada si otros factores se mantienen constantes. En el recuadro 3.E se des-
cribe como un gel retrasa el movimiento de diferentes moleculas de protefna, de modo que, en general,
cuanto mayor es la molecula, mas lento es su movimiento. En el recuadro 3.F se describen dos metodos
mediante los cuales se determinaron los efectos de: 1) la carga ionica de una protefna y 2) la resistencia
de esta al transporte a traves del gel; dichos metodos consisten en: hacer variar la concentracion del gel de
poliacrilamida y emplear el detergente SDS para transformar las protefnas en una forma desnaturalizada
en la cualla carga del detergente supera con mucho la carga de las protefnas. Estos procedimientos per-
miten estimar el peso molecular de la protefna sin requerir informacion exacta sobre su carga ionica.
Contrariamente a los requerimientos para las protefnas , el tamafio de una molecula de acido nucleico
puede determinarse a partir de su movilidad electroforetica en un solo tipo del gel y sin el uso de de-
tergente.
EI que dichas estimaciones del peso molecular sean posibles es una consecuencia directa de la relacion
simple que existe entre el numero de residuos de nucleotido de una molecula de acido nucleico y su carga
a un pH neutro: una carga negativa por cada residuo de nucleotido (v ease el recuadro 6.A). En el RNA,
por ejemplo, la masa de un residuo de ribonucleotido, sin tomar en cuenta el contraion necesario (por
ejemplo, sodio), varia de 304 para el citidilato hasta 344 para el guanilato. Esto significa que para los
RNA de composicion de bases solo aproximadamente similar, el peso molecular es casi proporcional al
numero de residuos de nucleotido. De esta manera, la relacion entre carga y masa para una serie de mo-
leculas de RNA, 0 bien para una serie de moleculas de DNA, es casi constante; asimismo el orden del
movimiento de las zonas en la electroforesis en gel sera el orden opuesto de los pesos moleculares, siem-
pre que las moleculas que se esten analizando tengan conformaciones similares.
Un grupo de moleculas de acido nuc\eico que tienen conformaciones seguramente similares son los DNA
lineales de doble ftIamento; por ejemplo, los acidos nucleicos obtenidos mediante el rompimiento de gran-
des moleculas de DNA con endonucleasas de restriccion (recuadro 6.D). Los fragmentos de DNA de 600
pares de bases (0 menos) pueden analizarse en geles de poliacrilamida con una concentracion del 4 al 20%
en un aparato como el que se representa en el recuadro 3. E 0 en un aparato de gel horizontal llamado
con frecuencia "gel submarino" debido a que el gel se encuentra inmerso en una substancia amortiguadora
depositada en un recipiente. No se requiere ni utiliza un sistema discontinuo de soluciones amortiguado-
ras; la misma solucion amortiguadora esta presente en el gel y los recipientes. No obstante, se observan
zonas muy bien definidas y se logra una gran resolucion debido a la concentraci6n de la muestra que existe
cuando el movimiento de las moleculas de DNA altamente cargadas disminuye radicalmente conforme
dichas moleculas llegan al gel. La foto de la siguiente pagina (cortes fa de los laboratorios BioRad) corres-
ponde a zonas de DNA resueltas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y localizadas mediante
tincion con iones de plata.
Algunas de las zonas de la fotograffa tienen menos de 1 nanogramo de DNA. Asimismo, el DNA puede
detectarse, mas rapidamente pero con una sensibilidad ligeramente reducida, tifiendolo con bromuro de
etidio. Este compuesto se une al DNA en un proceso llamado intercalaci6n, inserci6n entre pares de ba-
ses. En este ambiente de baja polaridad, el bromuro de etidio es altamente fluorescente, por 10 que las
zonas de DNA se detectan mediante fotograffa de luz visible del gel iluminado con luz ultravioleta .
--
Estructuro covo/ente del RNA y el DNA 243
Los fragmentos grandes de DNA no penetran en el gel, aun cuando se utilicen los geles de poliacrilamida
mas diluidos, que son los mas practicos de preparar. Sin embargo, los poros mas grandes de los geles
de agarosa resuelven las moleculas de DNA mas grandes. La agarosa es el componente del medio de culti-
vo bacteriol6gico agar-agar que da a un gel agar-agar su consistencia. Los geles de agarosa no se forman
por polimerizaci6n. En su lugar, los enlaces no covalentes que se forman entre las cadenas de polisacarido
determinan la formaci6n del gel. En la grafica que aquf se muestra (Fuente: T. Maniatis, E . F. Fritsch
y J . Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1982, con autoriza-
ci6n) se aprecia la dependencia de la distancia recorrida durante la electroforesis con respecto al mimero
de pares de bases en la moIecula y la concentraci6n del gel de agarosa. Las zonas de DNA existentes
en el gel de agarosa se detectan de modo frecuente mediante tinci6n con bromuro de etidio.
Bromuro de etidio Glioxal
La escala de tamafios de las moleculas de DNA lineales de doble cadena que puede resolverse en geles
de poliacrilamida y agarosa va de 10 a 20 000 pares de bases, aunque la escala util de cualquier gel deter-
minado es s610 un factor de algunas decenas. Ciertas tecnicas especiales de electroforesis permiten resol-
ver incluso moleculas de DNA mas grandes.
EI tamafio de las moleculas de RNA y DNA de una sola cadena tambien puede determinarse a partir de
sus movilidades e1ectroforeticas en geles. Sin embargo, la estimaci6n confiable requiere que las moleculas
de tamafio desconocido y los estandares apropiados de peso molecular de DNA 0 RNA se coloquen en
conformaciones similares . Esto se lleva a efecto incorporando soluciones concentradas de urea 0 formami-
da al gel y realizando la electroforesis a una temperatura elevada, 0 bien formando derivados del acido
nucleico de una sola cadena con un aldehfdo como el formaldehfdo 0 el glioxal. Los aldehfdos forman
derivados con las bases del acido nucleico y evitan la formaci6n de puentes de hidr6geno entre ellas.
Distancia reeorrida (em)
6.4 ANALISIS DE LA ESTABILIDAD Y LA SECUENCIA

DE NUCLEOTIDOS DE LOS ACiDOS NUCLEICOS
Quiza el analisis mas importante de la estructura covalente (distinta de la conforma-
cion) de un acido nucleico sea la proporcion de bases organicas. Esta es el mlmero
relativo de moleculas de cada tipo de residuo de nucleotido en el acido nucleico.
El analisis de la proporcion de bases requiere un metoda para resolver cuatro clases
de nucleotidos, nucleosidos 0 bases y un metodo para obtenerlos depuradamente
por hidrolisis del acido nucleico sin que ocurra una reaccion secundaria importante.
Si el RNA se expone a NaOH O.3Mpor 18 horas a 37°C, se convierte cuantitativa-
mente en nucleosido-2' -fosfatos y nucle6sido-3' -fosfatos, abreviados colectivamente
como nucleosido-(2' ,3 )-fosfatos. Como se indica en la figura 6.2, el mecanismo
I
de esta reaccion tiene el grupo 2 -alcoxido (R-O-) que se forma en solucion fuer-
I
temente alcalina, rnisma que ataca al atomo de fosforo. La mayorfa de los enlaces
fosfodiester de los intermediarios 2 3 -cfclicos persisten en condiciones que rom-
I : I
pen la mayorfa de los enlaces fosfodiester, de modo que los nuc1eosido-2 3 fosfatos
I : I -
cfclicos son los primeros nucleotidos observados en el curso de la reaccion. Notese

que esta parte de la reaccion constituye el rompimiento de la cadena de polinucle6ti-
dos (rnigracion del grupo fosforilo) sin que ocurra hidrolisis.
Los nucleotidos con grupos fosfodiester 2':3' -cfclicos se abrevian como A> p,
G> p, etc. para indicar el fosfodiester cfclico . Durante la incubacion prolongada
con una base, el ataque del ion hidroxilo hidroliza los enlaces fosfodiester cfc1icos
para dar los dos tipos de fosfomonoesteres en cantidades casi iguales. Si las condi-
ciones de hidrolisis fueran significativamente menos vigorosas que como se acaba
de indicar, el analisis subsecuente de proporcion de bases serfa obstaculizado por
una mezc1a de productos demasiado compleja, estando presentes tanto monoesteres
como diesteres cfc1icos. Condiciones significativamente mas vigorosas causarfan al-
guna desaminacion del citidilato para producir uridilato, 10 que invalidarfa tambien
el analisis.
Los enlaces fosfodiester del RNA tambien son hidrolizados en solucion acida
por un mecanismo que inc1uye tambien al grupo 2' -hidroxilo, pero que difiere del
mecanismo que describe la hidrolisis por bases. Las reacciones colaterales impiden
Analisis de 10 estobilidod y 10 secuencio de nucle6tidos de los acidos nucleicos 245
,,
t/'I
o --P-o
o OH
I - - - - - +l etc.
o
I
t/' 0" [=.0.-:-

p-o
/ \
0 0-
CH
H0t/,
I
2
0\ OH
P,,
HOCQ
0 B
--
ow
HOH
2
OH OP03"
(6 3 ' ·fosfato)
FIGURA 6.2 Mecanismo de hidrolisis del RNA por una base. El rompimiento del enlace
fosfodi ester de una cadena origina un nuevo grupo 5' -OH Y un enlace 2':3' fosfo-
diester dclico, respectivamente, en los extremos de los dos fragmentos de polinucleo-
tido que se forman . La ruptura de los enlaces fosfodiester. dclicos catalizada por la
base es una reaccion mas lenta . Por consiguiente, en una etapa intermedia de la serie
de reacciones de hidrolisis, pueden recuperarse nucleosido-2':3' -fosfato dclicos en
forma abundante. El producto final es una mezcla de nucleosido-(2' ,3' )-monofosfatos.
la recuperaci6n total de las bases de los nude6tidos, por 10 que la reacci6n no es

util para efectuar el amilisis exacto de la proporci6n de bases. Debido al grupo
2' -hidroxilo, el RNA es menos estable a la hidr61isis que el DNA, a todos los valo-
res de pH.
Como se indic6 anteriormente, la falta de un grupo 2' -OH hace que el DNA
sea mucho mas estable que el RNA en base diluida. En soluci6n acida, el DNA es
despurinado, es decir, los enlaces N-glicosfdicos de la guanina y adenina son hidroli-

zados y las bases libres son liberadas. Las'tondiciones mas vigorosas de la hidr6lisis
catalizada por acido convierten el DNA en aeido fosf6rico, productos de degradacion
de la desoxirribosa, bases libres y otros produetos. Por esta raz6n, la degradaci6n del
DNA en desoxirribonucle6tidos para realizar el analisis de proporci6n de bases sue-
Ie realizarse con enzimas. La degradaci6n completa del RNA en nucle6tidos (pN
o Np) tarnbien puede lograrse mediante hidr61isis catalizada enzimaticamente. En
los tres siguientes parrafos se describen los mecanismos de acci6n de algunas de
estas nucleasas.
Las enzimas que catalizan la hidr6lisis del DNA se denominan desoxirribonuclea-
sas, abreviadas DNasas, mientras que las que catalizan la hidr61isis del RNA son
ribonucleasas 0 RNasas. Las nucleasas catalizan la hidr61isis del RNA 0 DNA; no
obstante, "nucleasa" es tarnbien un termino generico ya sea para una RNasa 0 una
DNasa. Asimismo, las fosfodiesterasas atacan tarnbien DNA 0 RNA Yalgunos otros
fosfodiesteres. Las nucleasas y muchas RNasas presentan poea 0 ninguna espeeifi-
cidad con respecto al residuo de nucle6tido en el eual rompen la cadena de polinu-
cle6tidos. Por ejemplo, la incubaci6n con ribonucleasa T2 degrada el RNA en
nucle6sido-3' -fosfatos, mientras que la incubaci6n con nucleasa PI degrada el RNA
(0 DNA) en nucle6sido-5' -fosfatos. Sin embargo, la ribonucleasa T 1 s610 rompe
en ellado 3' de los residuos de guanilato. Los productos de la digesti6n son oligo-
nucle6tidos con el extremo 3' ... Gp y sin residuos internos de guanilato.
El fosfodiester clclico es un intermediario en la reacci6n catalizada por las ribo-
nucleasas que dejan grupos 3' -fosforilo como producto final. Esto implica al grupo
2' -hidroxilo en el mecanismo de hidrolisis, de la misma forma que en la hidrolisis
catalizada por iones hidroxilo. Las enzimas como la fosfodiesterasa del bazo rom-
pen el RNA 0 el DNA en nucle6sido-3' -fosfatos y, de esta manera, no utilizan el
grupo 2' -hidroxilo en su mecanismo de reacci6n. Este resultado estuvo entre las
primeras pruebas a favor de los enlaces fosfodiester 3' - 5' y no los enlaces 2' - 5'
en el RNA. Entre los metodos preferidos para degradar el DNA en desoxirribonu-
cle6tidos esm la digestion por DNasa y nucleasa PI pancreaticas. La primera rompe
el DNA en oligodesoxirribonucle6tidos con grupos 5' -fosforilo y la nucleasa PI com-
pletan la hidr6lisis hasta compuestos tipo dpNs. Los productos de cualquiera de es-
tos procesos de digestion pueden analizarse mediante cromatograffa para deterrninar
la proporcion de bases.
La clave del contenido de informacion de una molecula de acido nucleico no es,
en efecto, la proporcion de bases, sino la secuencia exacta de residuos de nucleoti-
dos en ella. Para deterrninar las secuencias de los residuos de nucle6tidos del RNA
o el DNA, se han creado varios metodos. Los metodos para el DNA son mas efica-
ces y confiables que los utilizados para el RNA. En el recuadro 6.C se describen
los dos metodos que se utilizan mas ampliamente para determinar la secuencia de
nucle6tidos de las moleculas de DNA.
RECUADRO 6.C DETERMINACION DE LA SECUENCIA DE

NUCLEOTIDOS DEL DNA
La tarea de determinar la secuencia de nucle6tidos de una molt!cula de DNA parece a primera vista ser
algo formidable, si no es que imposible, debido a que incluso los DNA mas pequefios de los virus tienen
mas de 2 000 residuos de nucle6tido. Durante arios, los bioquimicos abandonaron la esperanza de tener
incluso la capacidad de completar dicha secuencia. Dos avances revolucionaron tanto el anaIisis del DNA,
Analisis de '0 esfabilidad y '0 secuencia de nucle6fidos de los acidos nucleicos 247
que ahora se sabe que la suma de residuos de nucle6tido en las secuencias conocidas de DNA completas
y fragmentadas es del orden de algunos millones, y varios laboratorios tienen la capacidad de determinar
algunos miles de residuos de nucle6tido en una 0 dos semanas en condiciones ideales. Dichos avances
SOli: 1) la tecnica para cortar especfficamente moleculas largas de DNA en fragmentos (recuadros 6.D
y 6.E) que pueden manipularse mas facilmente que el DNA intacto y 2) los metodos para determinar rapi-
damente las secuencias de los fragmentos de DNA, tema que aqui se estudia.
Los primeros metodos que se utilizaron para determinar la secuencia de nucle6tidos del DNA y el RNA
fueron similares a los que se habian empleado para estudiar las proteinas: determinaci6n de la secuencia
de fragmentos pequefios y ordenamiento de estos utilizando las secuencias de nucle6tidos de los fragmen-
tos que se traslapaban. A diferencia de las protefnas, los acidos nucleicos s610 tienen por 10 general cuatro
tipos de unidades monomericas, 10 cual significa que se obtienen muchos oligonucle6tidos muy similares
cuando la molecula es fragmentada. Los is6meros de secuencia como dpCAGATT y dpCAAGTT son vir-
tualmente imposibles de separar. Estaba claro que se requeria un procedimiento totalmente distinto . De
hecho, dos procedimientos relacionados fueron creados por A. M. Maxam y W. Gilbert y por F . Sanger.
Ambos metodos se conocen como "secuenciamiento en escalera" a causa de la apariencia de los geles
de electroforesis a partir de los cuales se "lee" la secuencia de nucle6tidos .
EI procedimiento seguido por Maxam y Gilbert consiste en introducir primero radiactividad en s610 uno
de los extremos de la molecula de DNA. Despues de la ruptura parcial del DNA mediante cuatro reaccio-
nes quimicas, los productos de reacci6n son resueltos por electroforesis en gel de poliacrilamida (recuadro
6.B). EI gel se colocajunto a una pelicula fotografica a fin de que la localizaci6n de las zonas radiactivas
sea revel ada por la exposici6n autorradiografica cuando la pelicula se revele. A partir de este autorradio-
grama, pueden determinarse grandes tramos (hasta de 600 residuos) de la secuencia de nucle6tidos de
la molecula de DNA de acuerdo a los principios que se dan a continuaci6n.
En general, el grupo radiactivo terminal requerido por el metoda de Maxam y Gilbert toma la forma de
una porci6n marcada con 32p. Existen metodos para marcar los extremos 3' 6 5' . Por ejemplo, la enzi-
rna polinucle6tido cinasa cataliza la transferencia de un grupo fosforilo de la posici6n 'Y del ATP (secci6n
6.2) a un grupo hidroxilo 5' del DNA 0 RNA. Si el polinucle6tido que va a marcarse tiene ya un grupo
fosforilo, este es removido mediante incubaci6n previa con otra enzima, una fosfomonoesterasa. Con el
['Yjip] ATP como sustrato, la reacci6n produce un polinucle6tido "marcado" en su extremo 5' .
0- 0- 0-
I I I
- 0_32P-0-P-0-P-0-Adenosina+ HO-NpNpNp --
~ ~ ~
000
0-
I
ADP + -0_32P-0-NpNpNp
~
o
Si el fragmento de DNA es de doble cadena, la reacci6n introduce la radiactividad en cada extrema 5 ' .
Antes de que ocurran las reacciones de secuenciaci6n, las bandas son separadas mediante electroforesis
en gel en condiciones especiales, 0 bien la molecula de DNA es cortada especfficamente en un punto y
las dos moleculas parciales se separan.
Una de las reacciones de Maxam y Gilbert requiere incubar el DNA en dimetilsulfato a 20°C, a un pH
de 8, durante 10 minutos. Esto introduce un grupo metilo en la posici6n 7 de los residuos de guanilato,
pero dicha reacci6n ocurre en condiciones tan moderadas que la metilaci6n en otros puntos es insignifican-
teo Del mismo modo, se ajustan las condiciones de tal forma que s610 se forma un derivado de guanilato
de cada 20 6 30 (0 incluso 60 6 150), de acuerdo con que tan larga es la secuencia que va a determinarse
en un experimento.
OH H
Metildesoxiguanosina
La metilaci6n del guanilato destruye el canicter aromatico del sistema anular de imidazol de la guanina,
10 cual hace que el enlace N-glicosfdico sea muy labil. Cuando este enlace se rompe, el carbono I' se
convierte en un aldehfdo potencial. EI DNA, separado del dimetilsulfato y los productos de reacci6n,
se incuba durante 30 minutos a 90°C en soluci6n alcalina. En estas condiciones, tiene lugar una reacci6n
de eliminaci6n {3, misma que elimina esencialmente el residuo de desoxirribosa de la cadena de polinu-
cle6tidos y produce dos nuevos fragmentos, cada uno con un extrema fosforilado.
De los dos nuevos fragmentos, s610 uno esti marcado. A causa de que, en promedio, muy pocos residuos
de guanilato fueron metilados, cualquier par de sitios de ruptura de esta "reacci6n G" tendra una separa-
ci6n de 100 6 mas residuos de nucle6tido. Puesto que la detecci6n de los productos de reacci6n separados
se hace mediante autorradiografla posterior a la electroforesis en gel, 10 cual detecta s610 los productos
de reacci6n marcados en su extremo, se observa una distribuci6n de los oligodesoxirribonucle6tidos. Cada
oligodesoxirribonucle6tido representa, por su tamano, el mlmero de residuos de nucle6tido desde el extre-
mo 5' de la molecula de DNA original hasta un residuo de guanilato. Considerense los productos de reac-
ci6n de un fragmento de DNA especffico que ha side separado removiendo los residuos de dG como se
describi6 anteriormente.
*pdCGATATAAACGCTGGTCCATGGTTTAA
U
*pdCp + pATATAAACGCTGGTCCATGGTTTAA
'pdCGATATAAACp + pCTGGTCCATGGTTIAA
*pdCGATATAAACGCTp + pGTCCATGGTITAA
'pdCGATATAAACGCTG + pTCCATGGTTIAA
*pdCGATATAAACGCTGGTCCAT + pGTTIAA
*pdCGATATAAACGCTGGTCCATGp + pTTTAA
*pdCGATATAAACGCTGGTCCATGGTITAA
El sfmbolo *p indica el grupo fosforilo 5' radiactivo; los enlaces fosfodiester no se representan explfcita-
mente. La ultima estructura 'eS; por supuesto, el material de partida intacto (que no ha reaccionado), para
recordar que las reacciones de Maxam y Gilbert estin disenadas para ser reacciones parciales, 10 cual
significa que parte de la cantidad inicial del fragmento de DNA permanecera sin cambios una vez que
las reacciones hayan concluido.
En la reacci6n G anterior utilizada como ejemplo, se espera que las zonas radiactivas correspondan a
pdNp, pd(Np)lO, pd(Np)13, pd(Np)14, pd(Npho, pd(Npht y la molecula original. AI observar estas zonas,
el investigador concluye que existen residuos de desoxiguanilato localizados en las posiciones 2, 11, 14,
15, 21 y 22, pero en ninguna otra posici6n, con la posible e-xcepci6n de la posici6n 1.
Desafortunadamente, no todas las reacciones de Maxamy Gilbert remueven un solo tipo de residuo de
desoxinucle6tido de la molecula de DNA. Con frecuencia se utiliza la reacci6n T + C, que elimina los re-
Analisis de 10 estobilidod y 10 secuencio de nucle6tidos de los acidos nucleicos 249
siduos de desoxicitidina y desoxitimidina casi con la misma eficiencia, asf como una reaccion C y una
reaccion A > G. Esta ultima da zonas bien definidas que corresponden al rompimiento a nivel de resi-
duoS de desoxiadenilato y zonas menos claras que corresponden a la ruptura a nivel de residuos de desoxi-
guanilato. En teoda, puede deducirse la secuencia de tod9S los residuos de desoxirribonucleotido (salvo
la del extrema 5') a partir de las posiciones de las zonas formadas por la electroforesis de los productos
de las cuatro reacciones siguientes: G, A > G, C Y T + C. En la pnictica, en general no es posible
resolver los fragmentos de cinco residuos 0 menos, por 10 que deben determinarse mediante otros meto-
dos. En el siguiente esquema de este recuadro se muestra la apariencia del gel bajo la suposicion de
que se determinaron incluso los fragmentos mas pequeiios. En dicho esquema se observa tambien una
" escalera completa", que representa los productos de las reacciones en todos los residuos de desoxirribo-
nucle6tido, aunque dicha representacion rara vez es necesaria. La lectura de la secuencia a partir de dicho
esquema es pdNGATATAAACGCTGGTCCATGGTTTAA. EI estudiante debe escribir la f6rmula de
las estructuras de los oligodesoxirribonucleotidos que se esperan obtener en algunas de las zonas especffi-
cas del gel.
A>G G C T+ C
EI metodo de F. Sanger, Hamado a veces "determinacion de la secuencia con didesoxirribonucleotidos" ,

da un patron de zonas similar pero mas simple despues de Hevar a cabo la electroforesis de los productos
de reaccion, pero los fragmentos de DNA de esas zonas se obtienen de una manera totalmente distinta.
Son sintetizados enzimaticamente in vitro mediante la transcripci6n de un molde de DNA de una sola
cadena, cuyo origen esta mas alia del alcance de este texto. En primer termino, el DNA de una so-
Ia banda es hibridizado con un oligodesoxirribonucle6tido sintetico especffico (recuadro 6.F) que es
complementario del DNA de una sola cadena, en el sentido de que las dos cadenas del DNA B son com-
plementarias.
EI oligodesoxirribonucle6tido sintetico, Hamado iniciador 0 "primer", se diseiia para hibridizarse (sec-

cion 6.6) con una region del DNA de una sola cadena que es parte del extrema 3' de la porcion de la
cadena polinucleotida de interes. Por 10 comun, el DNA de una sola cadena tiene de cientos a miles de
nucle6tidos de longitud. Aquf solo se muestra una pequeiia porcion de dicha molecula de DNA hibridizada
con un iniciador.
3 '--HO--TGACCGG CAGCAAAATG--5'
~' CGATATAA ACGCTGGTCCATGGTTTAACGT CG TG AC TGGCCGTC GTTTTACACTIGAAA .. . 3'
Como se menciona en el capftulo 19, cuando dicho complejo se incuba con una DNA polimerasa depen-
diente de DNA y con desoxirribonucle6tido trifosfatos (secci6n 6.2), los residuos de desoxinucle6tido se
afiaden al extrema 3' del iniciador secuencialmente y bajo el control del molde de DNA de una sola cade-
na . EI resultado sera la sfntesis de una copia comp1ementllria 0 "transcripcion".
GCTATATTTGCGACCAGGTACCAAATTGCAGCACTGACCGGCAGCAAAATG--5'
5' . CGATATAAACGCTGGTCCATGGTTT AACGTCGTGACTGGCCGTCGTTTT AC A CTIGAAA . . . 3'
Si a dicha reacci6n se afiade un desoxirribonucle6sido trifosfato con un residuo de azucar modificado,

como la didesoxiguanosina trifosfato, la cadena terminara en el punto donde un residuo de didesoxiguani-
lato sustituya a un residuo de desoxiguanilato debido a que el primero carece de un grupo 3 ' -hidroxilo
para participar en el siguiente enlace fosfodiester.
0-
I
-O-p---O
I
o
I
- O-p---O
I
o
I
-O - P---O
I
O--CHy O
H H
Didesoxiguanosina trifosfato
De esta forma, algunas de las transcripciones seran terminadas prematuramente, pero s610 en los sitios
de inserci6n de los residuos de desoxiguanilato, es decir, los sitios de los residuos de desoxicitidilato en
el molde de DNA de una sola cadena. Al balancear la proporci6n de la didesoxiguanosina trifosfato con la
desoxiguanosina trifosfato existentes en la mezcla de reacci6n, el investigador puede controlar la longitud
promedio de las copias terminadas prematuramente. Esto corresponde a ajustar las condiciones de rompi-
miento qufmico en la reacci6n de Maxam y Gilbert para lograr el nivel apropiado de reacci6n parcial.
En el procedimiento de determinaci6n de la secuencia de didesoxirribonucle6tidos de Sanger, cuatro reac-

ciones de transcripci6n separadas se inician simultaneamente, cada una con el didesoxinucle6sido trifosfa-
to derivado de desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina. Todas las mezclas de
reacci6n tienen tambien las cuatro desoxinucle6sido trifosfatos, uno de ell os marcado con fosfato radiacti-
vo para permitir que las copias puedan detectarse mediante autorradiografia posterior a la electroforesis.
Los productos son analizados e interpretados como en el metoda de Maxam y Gilbert, excepto que es
la secuencia de la transcripci6n 10 que se determina. Tanto el metodo de Sanger y Maxam como ei
de Gilbert continuan aplicandose ampliamente, ya que cada uno de ellos tiene sus ventajas. El metodo de
Sanger requiere generalmente menos esfuerzo, mientras que el metoda de Maxam y Gilbert es menos sen-
sible a los efectos de secuencias especfficas, como las que son ricas en residuos de desoxiguanilato y deso-
xicitidilato .
-
Doble helice de los 6cidos nucleicos 251
6.5 DOBLE HELICE DE LOS ACiDOS NUCLEICOS

Por el ano de 1950, E. Chargaff habfa analizado la proporcion de bases del DNA
de varias fuentes animales y bacterianas. Aunque dichas proporciones en diferentes
moleculas de DNA variaban ampliamente, eran evidentes algunas regularidades. La
mas importante de estas fue la equivalencia molar entre el desoxiadenilato y el de-
soxitimidilato y entre el desoxicitidilato y el desoxiguanilato. La proporcion de ba-
ses podfa expresarse simplemente como el porcentaje de Gc. Es decir, un DNA
con un contenido del 40% de GC tiene desoxiadenilato, desoxicitidilato, desoxigua-
nilato y desoxitimidilato en la proporcion de 30:20:20:30 para satisfacer la regIa
de equivalencia molar de Chargaff.
Otra indicacion de la estructura regular del DNA provino de experimentos de
difraccion de rayos X, notablemente de los estudios realizados por R. Franklin y
M. Wilkins. Cuando los rayos X pasan a traves de grupos ordenados de moleculas
de DNA y posteriormente son interceptados por una pelfcula fotografica, los rayos
X difractados producen un patron regular. Aunque el patron no es una imagen de
la molecula de DNA, muestra que esta tiene una estructura definida e indica si un
determinado modelo de la conformacion de la cadena de polinucleotidos del DNA
es posiblemente valido 0 definitivamente inadecuado. La sencillez y algunas otras
caracterfsticas del patron de difraccion de rayos X de las fibras de DNA revelaron
a las personas que trabajan con cristalograffa de rayos X que la estructura del DNA
se puede representar mediante un modelo simple que es helicoidal.
A principios de la decada de 1950, los conceptos de la composicion regular de
bases y el plegamiento regular de la cadena polinucleotida parecfan oponerse a las
supuestas funciones biologicas del DNA. Asimismo, se habfa descubierto que el DNA
era un componente importante de esperma del salmon. O. T. Avery, C.M. Mac
Leod y M. McCarty habfan modificado geneticamente (transformado) bacterias,
de modo que estas elaboraban una cubierta de polisacaridos que originalmente eran
incapaces de producir. Avery y sus colaboradores demostraron en la decada de 1940
que el "principio de transformacion" era el DNA de otras cepas de bacterias que
normalmente producen la cubierta de polisacaridos. A. Hershey y M. Chase habfan
encontrado que un bacteri6fago (virus bacteriano) inyectaba su DNA, pero no su
capside de protefnas, en la bacteria hospedante para iniciar una infeccion. De esta
manera, la inerte molecula de DNA parecfa ser importante para los procesos geneti-
cos de animales, bacterias y virus. A algunos les parecfa razonable que el DNA
era la molecula de la cual esmn formados los genes. (,Como podfa(n) formarse el(los)
genes(s) de la cubierta de polisacaridos y los genes que dirigen la produccion de
nuevas partfculas del bacteriofago a partir de una molecula que de los resultados
de la cristalograffa de rayos X y de otros estudios ffsicos y qufmicos, era tan similar
sin importar su fuente biologica?
J. Watson y F. Crick conciliaron las propiedades de estructura uniforme y fun-
cion genetica diversa cuando concibieron su ahora bien conocido modelo de la es-
tructura del DNA, el modelo mas importante de una molecula biologica jamas
construido. La figura 6.3 constituye dos representaciones de este modelo. Dos ca-
denas de polinuc1eotidos se entretejen para formar la bien conocida doble helice,
en la que los residuos de fosfato y desoxirribosa, mas polares e hidrofflicos (afines
al agua), se encuentran en el exterior de la molecula. Los pares de bases menos
polares forman el interior de la molecula cilfndrica. En este modelo, los pares de
bases son aproximadamente perpendiculares al eje mayor de la molecula y estan
apilados para dar la apariencia de una escalera en espiral. Las bases de un par de
Ranura
menor
mayor
(b)
FIGURA 6.3 Dos representaciones de 10 conformaci6n B del DNA de doble cadena .

En 0) se ilustran el curso y las polaridades opuestas de las dos cadenas; los residuos
alternantes de azucar (desoxirribosa) y fosfato se indican como S-P~S-P-S . . . Asi-
mismo, se representan los pares de bases G :C y AT que forman el nucleo de 10 mo-
lecula. b) Modelo de esferas del DNA B, en el que se indica el curso de las dos cade-
nos de polinucle6tidos. (Cortesfa del Dr. John E. Johnson.)
bases estin en un mismo plano. De esta forma, un par de bases tiene casi el mismo
grosor de una base, es decir, 0.34 nm. Una vuelta de la h6lice tiene 10 pares de
bases, de modo que la longitud de paso (longitud de una vuelta completa) de la heli-
ce tiene 3.4 nm. N6tese que las dos cadenas de una Mlice estan orientadas en forma
antiparalela y no paralela. Es decir, la direcci6n 5' - 3' de las dos cadenas es
opuesta.
Los pares de bases son el micleo tanto conceptual como estructural del modelo.
Si se ignoran por un momento las restricciones esfericas impuestas por la cadena
de polinucle6tidos, existen decenas de formas en las que las bases del acido nuclei-
co pueden yuxtaponerse 0 apilarse en pares. Como se indica en la figura 6.4, las
caracteristicas importantes del apareamiento particular de las bases propuesto por
Watson y Crick son las siguientes:
T:A
C:G
A: T
FIGURA 6.4 Los cuatro posibles pares

de bases del modelo de Watson y Crick,
mostrando las dos probables orientacio-
nes de un par de bases G:C y de un par
G:C AT dentro de una doble helice.
1. Los ,itomos C-l' de los residuos de desoxirribosa estan separados por la mis-
rna distancia en los pares de bases A:T y C:G.
2. El lingulo formado entre una Ifnea que une los dos atomos C-l' de un par de
bases y un enlace N-glicosfdico es igual en los cuatro residuos de nucle6tido.
3. Los puentes de hidrogeno rectos y firmes determinan el apareamiento especffi-
co entre residuos dA y dT y entre residuos dC y dG.
Los pares de bases propuestos cumplieron al mismo tiempo los requisitos geneticos
y estructurales de la molecula del DNA, incluyendo las reglas de Chargaff. Las di-
mensiones similares de los dos tipos de pares de bases dispuestos en dos orientacio-
nes permiten una estructura regular, pero no imponen ninguna restriccion sobre la
secuencia de residuos de nucleotidos de una cadena. De este modo, cualquier gene
puede estar codificado en una hebra sufientemente grande de DNA y las posiciones
de los residuos de desoxirribosa y fosfato senin iguales. Sin embargo, de acuerdo
con la estructura antiparalela y el apareamiento de bases del modelo de Watson y
Crick, la secuencia de nucleotidos de una cadena determina la secuencia de nucleo-
tidos de la otra cadena del DNA. Esto es ilustrado por la siguiente estructura, escri-
ta en una notacion taquignifica, en la cual la cadena que posee la orientacion 5'
a 3' esta en primer termino:
5' pdGATCCGCG . 3'

3' dCT AGGCGCp. 5'
La estructura descrita en la figura 6.3 reune las caracterfsticas esenciales del DNA
comun, es decir, un DNA can los cuatro residuos de nucleotidos bien representa-
dos. Se designa como la "helice (3 de Watson y Crick" para diferenciarla de estruc-
turas del DNA can composicion de bases poco comun a del DNA de ambientes con
escasez de agua. La correcto de la estructura (3 fue indicado no solo par el hecho
de estar de acuerdo can las reglas de Chargaff y los requisitos geneticos para el
funcionamiento del DNA, sino tambien deb ida a que predijo acertadamente el pa-
tron de dispersion de rayos X del DNA, cuando menos en una primera aproxima-
cion. Asimismo, desde el punta de vista de la estereoqufmica resulto satisfactoria, 10
cual significa que podfa construirse un modelo molecular de esferas (figura 6.3b)
a partir de atomos de tamafio adecuado, y el modelo era consistente can las estruc-
turas conocidas de los mononucleotidos. Desde la pUblicacion de la estructura (3 en
1953, se han introducido modificaciones para hacer que esta estructura este mas
de acuerdo can los datos mas precisos de la difraccion de rayos X.
El DNA disuelto en soluciones salinas acuosas amortiguadas se comporta como
si fuera una helice (3 de Watson y Crick, salvo que parece tener 10.5 (y no 10) pares
de bases par vuelta de la dab Ie helice. El diametro de la molecula, de aproximada-
mente 2 nm, y la longitud de cada par de bases, de casi 0.34 nm, son como se habfa
predicho. Estas dimensiones hacen esperar can anticipacion una de las propiedades
mas sorprendentes del DNA, la extraordinaria relacion longitud/diametro. Por ejem-
pIa, el genoma de la bacteria Escherichia coli es una molecula sencilla de DNA
circular de aproximadamente 4.3 millones de pares de bases (4300 pares de kiloba-
ses a 4300 kb). Los cromosomas de los organismos superiores tambien parecen estar
formados de moleculas unicas de DNA. Habiendo 0 .34 nm par cada par de bases,
la longitud del canto rna del DNA de E. coli es de casi 1.5 mm, 10 que origina una
relacion entre longitud y diametro de 730 000. Dado que la molecula de DNA es
muy larga, la mfnima alteracion de la solucion puede producir regiones locales que
fluyen en diferentes direcciones. Esto produce una tension sabre la larga molecula
de DNA ala cual puede romper. Dichas fuerzas "cortantes" rompen normal mente
las moleculas de DNA del tamafio del DNA de E. coli en miles de piezas, y son
estas y no las moleculas intactas los materiales que se estudian can mas frecuencia
en el laboratorio.
Notese que aunque la doble helice lineal del DNA esta formada par dos molecu-
las lineales, covalentes y entretejidas, la norma considera a las dos moleculas como
la "molecula de DNA". Obviamente, las dos unidades covalentes de esta mo-
lecula "no covalente" se mantienen unidas entre sf por puentes de hidrogeno. La
Doble helice de los 6cidos nucfeicos 255
FIGURA 6.5 Configuracion superhelicoi-

da l del DNA circu lar ce rrad o cova len-
temente. a) 'Representacio n de un DNA
circular imaginario de solo 500 pares de
bases. Si se supone que ha y 10 pares
de bases por cada vuelta de la helice,
el DNA circu lar tendr6 50 vue ltas. b)
Forma superhelicoida l esperada para un
DNA circular de 500 pares de bases que
tiene solo 44 vueltas en la d oble helice
(a) (b) en lugar de 50. '
estructura tambi6n es establHzada por las fuerzas que se establecen entre las bases
colocadas una sobre otra para formar la "escalera en espiral" en el interior de la
molecula. Las fuerzas de repulsion electrostatica que se generan entre los grupos fos-
fodiester cargados negativamente (v ease el recuadro 6 .A) y el movimiento termico
desestabilizan la estructura. La molecula de DNA no es estatica sino que presenta
una separacion aleatoria, dinamica y localizada de las bases organicas y un rapido
restablecimiento de los pares de bases unidos por puentes de hidrogeno. EI aumento
de temperatura aumenta el movimiento termico y cambia el equilibrio a favor de la
separacion de las bases; a una temperatura bastante alta, los dos filamentos de un
fragmento de DNA lineal se desenrollan y se separan. Este proceso se denomina "fu-
sion". Los valores extremos de pH tambien desnaturalizan ("funden") el DNA. La
desnaturalizacion del DNA es un proceso reversible que se describe en la seccion 6.6.
Algunos tipos de DNA de doble cadena son circulares . EI DNA sera circular
si una de las cadenas (0 ambas) es realmente una cadena circular de residuos de
nuc1eotidos unidos por enlaces fosfodiester. Si ambas cadenas son circulares , se en-
tretejen y no pueden separarse mientras esten intactas. En la figura 6.5 se muestra
esquematicamente como las dos cadenas circulares covalentes pueden ser insepa-
rables aun cuando no esten unidas covalentemente entre sf. EI modelo de Watson
y Crick predice (y la forma lineal de un DNA de doble cadena define) el numero
de vueltas que el DNA {3 debe tener en su forma mfnima de energfa. EI numero de
vueltas es de casi una por cada 10 pares de bases. Una consecuencia importante del
DNA circular "cerrado covalentemente" es la posibilidad de que el numero real
de vueltas de la doble helice, impuesta por las dos cadenas circulares covalentes,
sea distinto del numero de vueltas en el DNA lineal correspondiente. La correspon-
dencia exacta entre el numero de vueltas de la helice y el numero de vueltas antici-
pado por el modelo de Watson y Crick para el DNA (3 dara una molecula circular
sin superenrollamientos. En contraste, la forma superenrollada de una molecula de
DNA de doble cadena, circular y cerrada covalentemente existe cuando el numero
real de vueltas de la hetice es mayor 0 menor que el numero de vueltas que habrfan
si la molecula fuera lineal. La diferencia que existe entre 1) el numero real de vuel-
tas en las cadenas del DNA y 2) el numero de vueltas que asumirfa la forma de
DNA {3 de baja energfa si no estuviera restringido por el cfrculo co valente da como
resultado el superenrollamiento del DNA. EI proceso espontaneo del superenrolla-
miento permite que el DNA tenga el numero adecuado de vueltas que ha impedido
la estructura covalente del DNA circular covalentemente cerrado .
El fenomeno del superenrollamiento puede demostrarse facilmente con una cuerda.

Ponga la cuerda sobre una mesa y una sus extremos con cinta adhesiva a fin de for-
mar un cfrculo covalente. La configuracion de la cuerda corresponde entonces a
la figura 6.5a. Ahora, remueva la cinta adhesiva. Sostenga un extremo de la cuerda y
haga que el otro extrema de una, dos, tres, etc. rotaciones completas. Sostenga la
cuerda en esta forma tensa y vuelva a unir sus extremos con cinta adhesiva. Notese
que la cuerda asume una configuracion similar a la mostrada en la figura 6.5b.
Las endonucleasas de restriccion estan entre los medios mas titiles para analizar
el DNA de doble cadena. La informacion relativa a estas enzimas muy importantes
se da en los recuadros 6.D y 6.E, donde se describe el origen y las propiedades
de dichas enzimas, asf como algunas de sus aplicaciones en el estudio y manipula-
cion de las secuencias del DNA.
RECUADRO 6.D ENDONUCLEASAS DE RESTRICCI6N Y USOS
Las endonucleasas de restricci6n son enzimas hidrolizantes del DNA que son altamente especfficas con
respecto a la secuencia de nucle6tidos en la cual cortan al DNA. Son esenciales para la construcci6n in
vitro de las secuencias quimericas del DNA, las cuales son secuencias de DNA que derivan de dos 0 mas
fuentes y se combinan en una sola molecula. EI resultado es la recombinaci6n in vitro, la parte mas impor-
tante de la tecnologia del DNA recombinante (vease el capitulo 22). Las endonucleasas de restricci6n
se descubrieron cuando se observ6 la manera sorprendente de c6mo variaba la infectividad de ciertos bac-
teri6fagos (virus que infectan a bacterias) al ser transferidos de una bacteria hospedante a otra. Por ejem-
plo, despues del crecimiento sobre la cepa C de E. coli pudo recuperarse una preparaci6n del bacteri6fago
'A de DNA. Dicho bacteri6fago fue de 1 000 a 10 000 veces mas infeccioso a la cepa C de E. coli que
ala cepa K de la misma bacteria. El bacteri6fago derivado de la cepa K de E. coli result6 bastante infec-
cioso para las cepas C 0 K, pero revertia a una forma poco infecciosa para la cepa K una vez que se repli-
caba en la cepa C. De esta manera, el bacteri6fago 'A puede ser restringido en cuanto a infectividad eficiente
de la cepa K 0 bien modificado con respecto a replicaci6n en la misma cepa a fin de presentar una gran
infectividad sobre dicho hospedante. Por otra parte, se han descubierto muchos otros sistemas de modifi-
caci6n y restricci6n .
En varios sistemas, la base de los procesos de restricci6n y modificaci6n se ha atribuido a un par de enzi-
mas: 1) una endonucleasa de restricci6n que puede destruir el DNA extrafio cuando entra a la celula bacte-
riana y 2) una enzima modificadora del DNA que modifica covalentemente al DNA de la celula que for-
ma la endonucleasa de restricci6n, por ejemplo, mediante metilaci6n de bases. Esta modificaci6n impide
que la endonucleasa de restricci6n corte el DNA de la celula. En el ejemplo del bacteri6fago 'A, la cepa
K hospedante posee un sistema de modificaci6n y restricci6n. Las pocas moleculas de DNA del bacteri6-
fago que escapan a la restricci6n se modifican y su progenie adquiere esta caracteristica, de modo que
son capaces de replicarse en la cepa K de E. coli.
La demostraci6n en un organismo de una endonucleasa que es especffica para un DNA extrafio se toma
como prueba clara de un sistema de restricci6n y modificaci6n . La investigaci6n de las endonucleasas
de restricci6n ilustra un importante principio de la investigaci6n: la dificultad que implica determinar
si dicha investigaci6n es 0 no de valor practico 0 incluso fundamental. Alguna vez se pens6 que la restric-
ci6n de los bacteri6fagos carecfa de interes practico y que era poco rundamental, pero el estudio del fen6-
menD de restricci6n llev6 al descubrimiento de una de las herramientas mas importantes de la bioquimica
moderna, las endonucleasas de restricci6n, y su aplicaci6n a nuevos procesos industriales.
Se reconocen dos clases generales, 0 tipos, de endonucleasas de restricci6n. Las del tipo II son utiles para
preparar recombinantes in vitro (capitulo 22) debido a que catalizan el rompimiento de una moJecuJa de
DNA dentro de una secuencia de nucle6tidos especffica. En la tabla que se muestra mas adelante se dan
ejemplos de endonucIeasas de restricci6n y se indica c6mo se nombran de acuerdo con el genero y especie
del organismo que se utiliza como fuente y el orden de su descubrimiento. Por ejemplo, "EcoRI" es la
primera endonucIeasa de restricci6n que pudo identificarse a partir de la cepa R de E. coli; HaeIII es
la tercera endonucIeasa de restricci6n que se descubri6 en Haemophilus aegyptius. Para todos los ejem-
plos de la tabla excepto MnII, se indica el sitio de ruptura en una sola cadena. De esta manera, para Eco-
RI, los nuevos extremos creados por rompimiento son los siguientes:
5'- GAATTC ')'

'J 5'· G-OH pAATTCC ·3'
3'- cn AAr~ -5' 3'- CTTAAp + HO - G -5'
Esta reacci6n muestra los grupos 5' -fosforilo y 3' -OH que son caracteristicos de los nuevos extremos
y la simetrfa del sitio de rompimiento. La ruptura en GI AATTC, por ejemplo, muestra el enlace fosfodies-
ter que es roto.
N6tese que la ruptura escalonada producida por las endonucIeasas de restricci6n como EcoRl y PstI da
"extremos pegajosos", los cuales tienen un potencial debil para formar hfbridos moleculares mediante
el apareamiento de bases . Esta propiedad ayuda a unir los fragmentos de DNA cuando se forman recombi-
nantes in vitro. Sin embargo , pueden unirse incIuso "extremos romos" como los producidos por la acci6n
de SmaI 0 HaeIIl (capitulo 22). La mayo ria de las endonucIeasas de restricci6n reconocen sitios simetri-
cos, es decir, sitios que son iguales despues de una rotaci6n de 180 0 , como en el ejemplo de EcoRl. Otras,
como la Acel, tienen algunos sitios que son simetricos y otros que no 10 son. Hinfl es un ejemplo de una
enzima que reconoce casi, pero no perfectamente los sitios simetricos. En contraste, el sitio donde rompe
MnII es asimetrico y carece de requerimiento alguno para las identidades de los pares de bases presentes
en las siete posiciones a la izquierda del sitio de rompimiento, indicadas por N' . Las endonucIeasas de
restricci6n son por 10 general especfficas del DNA de doble cadena; algunas que reconocen secuencias
ricas en las bases GC, como HaeIII, cortan tambien moleculas de DNA de una sola cadena. Los experi-
mentos indican que el rompimiento de los DNA de una sola cadena se debe a asociaciones estables 0 tran-
sitorias de regiones de diferentes partes de la cadena de polinucIe6tidos en una conformaci6n de doble
filamento.
Algunas endonucIeasas de restricci6n tipo II

Designacion Fuente Sitio(s) de ruptura
Acel Acinetobacter GT/AGAC
calcoaceticus GT/ATAC
GT/CGAC
GT/CTAC
HaeIII Haemophilus GGICC
aeqptius
EcoRI Escherichia G/AATTC
coli (cepa R)
Hinfl Haemophilus G/A ATC
injluenzae (cepa Rf) G/AGTC
G/ATTC
G/ATTC
MnII Moraxella 5' -CCTCNNNNNNN/NNNN
nonliquifaciens 3' -GGAGNNNNNNN/NNNN
Pstl Providencia CTGCA/G
stuarti
SmaI Seratia CCCIGGG
marsescens
La propiedad que distingue a las nucIeasas de restricci6n de otras desoxirribonucleasas es su capacidad

para romper s610 en secuencias especfficas de los pares de bases y no al azar. EI mimero de sitios de
cualquier molecula de DNA que son atacados por una endonucleasa de restricci6n depende, en promedio,
del mlmero de bases reconocidas por dicha enzima. EcoRl, PstI y SmaI tienen sitios formados por seis
pares de bases. Por ejemplo, si un DNA tuviera una composici6n de bases del 50% de GC, la probabili-
dad de tener un determinado residuo de desoxinucle6tido en un sitio dado es de 0.25. Cualquier secuencia
de dinucle6tidos dada tiene una probabilidad de 0.25 X 0.25 = 0.0625 . La probabilidad de cualquier
secuencia de seis bases es, entonces, (114)6 = 114096. Para enzimas como HaeIII y MnII, que recono-
cen una secuencia de cuatro residuos de nucle6tido, y HinfI, que reconoce una secuencia de cinco residuos
pero no impone limitaci6n alguna sobre el residuo central, la probabilidad de localizar la secuencia reco-
nocida es de 1/256. EI sitio de AccI tiene seis residuos, pero permite la ubicaci6n de cualquiera de dos
residuos de nucIe6tido en cualquiera de las dos posiciones centrales en ese sitio, 10 que da una probabili-
dad de 1/1024. La secuencia de nucIe6tidos del DNA no es, por supuesto, aleatoria, de modo que las
probabilidades caIculadas son s610 una gufa aproximada del numero de sitios esperados. Es decir, en una
secuencia de alrededor de 4 000 residuos, se esperarfa en promedio un sitio EcoRl, pero algunas secuen-
cias de 4 000 residuos tienen varios sitios EcoRI y otras carecen de ellos. En el recuadro 6.E se describe
el uso de las endonucIeasas de restricci6n en el mapeo de las secuencias de nucIe6tidos.
RECUADRO 6.E MAPEO DE LAS SECUENCIAS DEL DNA CON

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Las endonucIeasas de restricci6n son valiosas no s610 para preparar fragmentos de DNA que se van a
ensamblar para formar nuevas secuencias, sino tambien para otros procesos como la obtenci6n de frag-
mentos utilizados para el analisis de las secuencias de nucIe6tidos (recuadro 6.C) y la comparaci6n de
segmentos de DNA muy largos para encontrar similitudes que sean aparentes a partir del ordenamiento
de los sitios de la endonucIeasa de restricci6n. El "mapeo de restricci6n" es la asignaci6n de los sitios de
restricci6n de diferentes enzimas a 10 largo de la cadena polinucIe6tida. El mapeo de restricci6n puede
hacerse sin necesidad de determinar la secuencia de nucIe6tidos del DNA debido a que los sitios de los
cortes de restricci6n pueden deducirse a partir de los tamanos aparentes de los fragmentos de DNA de
doble cadena, los cuales se determinan mediante electroforesis en gel de agarosa , u ocasionalmente, en
gel de poliacrilamida (recuadro 6.B).
EI plasmido pBR322 es un cfrculo de DNA covalente de doble cadena de 4362 pares de bases. Si este
plasmido se trata con las endonucIeasas de restricci6n AccI, EcoRI y PstI (v ease el recuadro 6.D) indivi-
dualmente 0 en pares, los fragmentos lineales observados despues de la electroforesis en gel de agarosa
tienen los tamanos indicados en numero de pares de bases (pb).
AccI 1595 pb y 2767 pb

EcoRl 4362 pb
Pstl 4362 pb
AccI + EcoRl 651 pb 1595 pb y 2116 pb
AccI + PstI 1366 pb 140/ pb y 1595 pb
EcoRl + PstI 750 pb y 3612 pb
A partir de los resultados de la digesti6n del plasmido pBR322 con AccI + EcoRl, es evidente que el
unico sitio de EcoRl esta en el mas grande de los dos fragmentos de DNA obtenidos con AccI debido
a que el fragmento mas pequeno de 1595 pb resiste la digesti6n con EcoRl. Asimismo, el unico sitio de
Pstl esta en el fragmento mas grande de Accl. Los sitios de EcoRl y Pst! estan separados por 750 pb
de acuerdo con los resultados de la doble digesti6n . De esta manera, el mapa del fragmento mas grande
obtellido con AccI debe ser:
Doble he lice de los 6cidos nucleicos 259
Acel EcoRI Pstl Acel
Este mapa, combinado con el fragmento restante de 1595 pb obtenido con AccI, dani dos mapas de endo-
nudeasa de restricci6n circulares del phismido pBR322. Por acuerdo, se ha elegido uno de los mapas
para ser la base de un sistema de numeraci6n de residuos de nuc1e6tido. En el esquema que se muestra
al final de este recuadro puede observarse un mapa de endonuc1easa de restricci6n mas completo del pllis-
mido pBR322.
Con frecuencia, una endonuc1easa de restricci6n, llamese X, tendra varios sitios dentro de un fragmento
que se obtiene con una segunda endonuc1easa de restricci6n, Y, como se muestra en el mapa del plasmido
pBR322 mediante los cuatro sitios TaqI dentro del fragmento A de la Acc!. La localizaci6n inequivoca
de los diferentes sitios de la endonuc1easa de restricci6n X requerira por 10 general procedimientos mas
complicados que los que aquf se mencionan, como las digestiones parciaies con la endonuc1easa de restric-
ci6n X para dar fragmentos que tengan todavfa uno 0 mas sitios de X. Por ejemplo, la digesti6n parcial
del plasmido pBR322 con TaqI podrfa dar fragmentos que correspondan a D-EI ya E 1-E2 , y asf suce-
sivamente. El mapa de dicho plasmido ilustra tambien c6mo pueden coincidir los sitios de restricci6n de
dos enzimas. La secuencia de nucle6tidos que comienza en la base 649, CGTCGACC, tiene un sitio para
AccI [GT(A /C)(G/T)AC ], para SalI[GTCGAC] y para TaqI[TCGA]. En contraste, la secuencia en el se-
gundo sitio de AccI, empezando en la base 2244, es TGT AT ACT . Esta secuencia no posee un sitio para
Sail 0 Taql.
EI DNA de doble filamento no es la unica forma de acido nuc1eico de doble cade-

na. EI RNA de doble cadena se encuentra en pocos virus y en pequefias cantidades
en algunos hongos y plantas. Debido a las restricciones estericas impuestas por el
grupo 2' -hidroxilo, el RNA de doble filamento es forzado a adoptar una conforma-
cion denominada forma A. En esta conformacion, los pares de bases estan inclina-
dos respecto al eje de la helice, y algunos otros cambios distinguen tambien a esta do-
ble helice de la del DNA (3 . Los hfbridos de DNA y RNA formados artificialmente
y que poseen una cadena de cada tipo de polinuc1eotido, asumen tambien la confor-
macion iX, de la misma manera que el DNA de doble cadena en soluciones de alco-
hol y agua.
6.6 DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION

DE ACiDOS NUClEICOS
La fusion de una molecula de DNA aumenta su absorcion de luz ultravioleta. La

explicacion de esta observacion es que las interacciones electronicas entre las bases
apiladas reduce su capacidad para absorber la luz de longitud de onda de aproxima-
damente 260 nm . Una proporcion de bases mucho menor se encuentra en la confi-
guracion apilada en las cadenas sencillas " fundidas" que en la doble helice y la
absorbancia se aproxima al valor mas alto (mas "hipercromico"), que es caracte-
rfstico de los mononuc1eotidos individuales. En la figura 6.6a se indica como la ab-
sorbancia aumenta al aumentar la temperatura, dando curvas sigmoidales. Debido
a que los pares de bases G:C son mas estables que los pares de bases A:T, la tempe-
ratura en el punto medio de la transicion, T,1l , es mayor para los DNA con mayor
contenido porcentual de pares de bases Gc. En NaCl 0.15 My citrato de sodio 0.015
M, a un pH de 7, la relacion que existe entre el contenido de GC y Tm esta dada
por la expresion:
%GC = 2.44(Tm -69 .3)
En soluciones de menor concentracion de sales, las cargas negativas de los gru-

pos fosfodiester se repelen mas eficazmente, por 10 que el Tm disminuye para cual-
quier DNA. Las "curvas de fusion" para varios DNA en una solucion de menor
fuerza ionica se muestran en la figura 6.6b.
Como se indico en la seccion anterior, los pares de bases del RNA de doble cade-
na se encuentran inclinados a un angulo de 70° respecto al eje mayor de la molecu-
la, en lugar de los aproximadamente 90° de la Mlice del DNA (3. Dicha inclinaci6n
origina una molecula mas compacta. Por esta razon, el RNA de doble cadena es
mas estable que el DNA de doble cadena y po see un mayor valor de T,1l para el
mismo contenido porcentual de GC.
Desnoturolizoci6n y renoturolizoci6n de 6cidos nucleicos 261
1.4
Q'
LO
'"'" 1.3
'"c
·u
'"0
.D
'ci3" Cf)
.D
~'" '"
til 1.2
0 ·u
..:'"
~
c
'"0
.D
Cf)
.D
:!- 1.1
1.0
220 260 300 65° 75°

Longitud de onda (nm) Temperatura
(a) (b)
FIGURA 6.6 C urvas de fusion del DNA detectadas mediante cambios en la absorcion
de luz ultravioleta. a) Espectros del DNA de doble cadena y el correspondiente DNA
"fund ido" de una sola cadena. b) Experimento en el que se calentaron a varias tem-
peraturas tres muestras de DNA en soluciones separadas de cloru ro de sodio 0.0 15M
amortiguado y se midio la absorbancia a 260 nm . Los va lores del Tm son, respecti-
vamente, 64, 69 y 76°C para los tres tipos de DNA.
Uno de los aspectos mas importantes del modelo de Watson y Crick son sus im-
plicaciones geneticas. EI apareamiento de dos cadenas, facilitado por sus secuen-
cias complementarias, indica que una cadena aislada podrfa dirigir la sfntesis de una
nueva cadena que, despues de la sfntesis, serfa complementaria de la primera. De
hecho, las moleculas de acido nuc1eico son duplicadas y transcritas en nuevas mo-
leculas de acido nuc1eico bajo la direcci6n de una cadena que sirve como molde
o plantilla, segun las reg las del apareamiento de bases Watson y Crick que se des-
criben en el capftulo 19. A veces, la nueva cadena permanece asociada con el molde
en una doble helice, como en la duplicaci6n del DNA de doble filamento. En otros
casos, como en la sfntesis del RNA bajo la direcci6n de un molde de DNA de doble ca-
dena, la cadena que se esta sintetizando permanece aparentemente asociada con su
molde s610 por un momenta y en la regi6n en la cualla cadena esta creciendo. Los
filamentos de DNA 0 de RNA, 0 de RNA y DNA, que son complementarios, for-
maran espontaneamente una doble helice en soluci6n en condiciones propicias. Esta
capacidad que tienen dos moleculas de reconocerse sin la intervenci6n de un agente
extemo, como una enzima, ha dotado a los bioqufmicos de una herramienta analftica
de suma importancia. Con 10 anterior, es po sible discemir relaciones entre molecu-
las de acido nuc1eico muy grandes y complejas, relaciones que no podrfan estable-
cerse mediante otros analisis.
La hibridaci6n molecular, que se establece entre dos cadenas sencillas de acido
nuc1eico para formar una molecula de doble helice, es una reacci6n muy especffica
que requiere como reactivos cadenas exactamente complementarias 0, cuando me-
nos, casi exactamente complementarias . La velocidad y el grado de la reacci6n de-

pende de la concentraci6n de los dos tipos de cadenas sencillas reaccionantes y de
la duraci6n de la reacci6n. EI amilisis detallado de estas variables de la reaccion
indica que la etapa mas lenta de la reacci6n, la etapa limitante de la velocidad, esta
asociada con el encuentro adecuado de las dos cadenas, de modo que las porciones
complementarias esten alineadas. La formaci6n del resto de la helice es un proceso
muy rapido . En general, la temperatura y la concentraci6n de sales y otras condi-
ciones del disolvente se ajustan de modo que la temperatura de la reacci6n de hibri-
daci6n molecular es de casi 25°C por debajo de la temperatura a la cual la helice
se fundirfa (desnaturalizarfa) para formar cadenas sencillas. A esta temperatura, las
reacciones entre cadenas sencillas dan helices perfectamente apareadas y helices no
tan perfectamente apareadas. Las helices perfectamente apareadas son mas estables y,
debido a que las cadenas sencillas y las helices esmn en equilibrio, las helices mas
perfectas finalmente son las que predominan. A temperaturas mas bajas, las helices
imperfectas son mas estables y evitan la formaci6n eficaz de helices perfectas. A
temperaturas cercanas al punto de fusi6n, el grado de avance de la reacci6n es me-
nor, de aquf el arreglo de emplear una temperatura 25°C por debajo del valor de
la temperatura de fusi6n.
Uno de los resultados mas importantes derivados de los experimentos de hibrida-
ci6n molecular es que algunas secuencias nucleotfdicas, especialmente en el DNA
de eucariotes, se repiten cientos, miles e incluso millones de veces en el genoma del
organismo. Otras secuencias aparecen s610 una vez en el genoma. Considerese un
DNA que tenga alguna secuencia de tamaiio desconocido repetida un mlmero des-
conocido de veces. Una reacci6n de hibridaci6n molecular puede definir una canti-
dad lIamada complejidad, N. N es el mlmero de residuos de nucle6tido existentes
en una repetici6n de la secuencia repetitiva en una cadena.
La complejidad N puede ilustrarse con tipos de DNA que poseen secuencias re-
petitivas muy limitadas (0 que carecen de elIas). EI DNA de E. coli tiene casi 4.3
X 10 6 pares de bases en su genoma que, si fueran secuencias unicas, corresponde-
rfan a una complejidad de 4.3 X 10 6 . EI DNA del bacteriOfago T7 tiene alrededor
de 73000 pares de bases y su N es de 73000. Un microgramo de cualquier DNA
tendrfa aproximadamente 3 x 10 -9 moles de residuos de nucle6tido. Sin embar-
go, el numero de moles de DNA depende del tamaiio de la molecula. Un microgra-
mo de DNA del bacteriOfago T7 corresponde a 3.9 x 10 - 14 moles, mientras que
1 J.tg del DNA de E. coli tiene s610 3.4 X 10 - 16 moles . Si se combinan 0.5 J.tg
de cada DNA, existen 3 X 10 - 9 moles de residuos de nucle6tido en el valor de
1 J.tg resultante. Los DNA del bacteri6fago T7 y de E. coli no comparten amplias
secuencias de nucle6tido. Si la mezcla de DNA se disuelve en soluci6n salina amor-
tiguada y se funde y se incuba despues en condiciones de hibridaci6n, las cadenas
complementarias del DNA del bacteriOfago T7 se hibridizaran entre sf, y otro tanto
haran las del DNA de E. coli.
Sin embargo, las cadenas de DNA del bacteriOfago T7, a causa de su concentra-
ci6n molar mucho mayor, se "encontraran" entre sf con mayor rapidez y se hibri-
dizaran mas rapidamente que las cadenas de DNA de E. coli . En general, el aumento
de concentraci6n de un DNA aumentara la velocidad a la cual se hibridice, de modo
que el tiempo requerido para que la mitad del DNA de un tipo se hibridice disminui-
ra en proporci6n al incremento en la concentraci6n total de DNA. Una cantidad
util es el producto de la concentraci6n inicial del DNA fundido, Co> en moles de
residuos de nucle6tido por litro, multiplicado por el tiempo requerido para que la
rnitad del DNA se hibridice, el t1l2. Esta cantidad, Cot1/2, sera casi 115 veces mas
Desnaturalizaci6n y renatura/izacion de acidos nucleicos 263
FIGURA 6.7 Hibridaci6n del DNA de un eucariote mostrando 10 amplia voriaci6n en

el producto de 10 concen traci6n por el tiempo de hibridaci6 n requerido pora repre-
sentor todas las clases de DNA que est6n presentes. EI va lor de Co t l/2 para el DNA
de una sola copia en el ejemplo es menor de 10 3 M-s .
grande para el DNA de E. coli que para el DNA del bacteri6fago T7 . El calculo
es 3.9 X 10 - 14 moles dividido entre 3.4 X 10 - 16 moles = 115 . La conclusi6n
importante es que N es proporcional al valor de Cot1/2, valor al cualla formaci6n
de la helice para un determinado DNA en una mezcla de reacci6n es semicompleta.
Los experimentos de hibridaci6n molecular del DNA casi siempre se llevan a
cabo utilizando fragmentos en lugar de moleculas intactas. El DNA analizado en
la figura 6.7 consistfa en fragmentos de casi 400 pares de bases. Si se tratan diferen-
tes muestras de DNA para dar fragmentos del mismo tamaiio, la relaci6n entre N
y Cotl/2 para los DNA sera igual, y los valores de N corresponderan al mimero de
residuos de nucle6tido en los DNA originales intactos. El valor de Cot1/2 para E.
coli es de aproximadamente 4 Ms. En el recuadro 6.F se describen algunas aplicacio-
nes del proceso de hibridaci6n molecular del DNA.
RECUADRO 6.F HIBRIDACION MOLECULAR SOBRE UN SOPORTE SOLIDO
Mediante el uso de endonucleasas de restricci6n (recuadro 6.D) y la electroforesis en gel (recuadro 6.B)
pueden resolverse porciones especfficas de moleculas de DNA muy grandes e incluso conocerse el
orden de los fragmentos obtenidos con dichas enzimas dentro de la gran molecula de DNA (recuadro 6.E).
Por supuesto, los fragmentos de DNA individuales, pueden aislarse y determinarse su secuencia de nu-
cle6tidos (recuadro 6.C) . Con frecuencia, el amilisis de dichos fragmentos de DNA podrfa efectuarse con
mayor rapidez si se pudiera determinar facilmente las relaciones existentes entre la secuencia de nucle6ti-
dos de los fragmentos de DNA individuales y la de otros acid os nucleicos. Por ejemplo, si existiese un
RNA mensajero particular, la identificaci6n de que fragmentos de DNA derivados de la digesti6n por una
endonucleasa de restricci6n contenfan la misma secuencia de nucle6tidos llevada al aislamiento del gene
correspondiente. Lo anterior podrfa hacerse cortando las zonas de DNA correspondientes (zona por zona)
existentes en un gel e hibridizando cada una con el RNA en soluci6n (vease la secci6n 6.6). Sin embargo,
E. Southern ha introducido un metodo mas directo, menos laborioso y en general mas sensible que posee
tambien una mayor resoluci6n. Su metoda suele conocerse como "manchado de Southern" .
Una vez que los fragmentos de DNA han sido resueltos mediante electroforesis, por 10 general en gel
de agarosa, el gel se sumerge en soluci6n alcalina para desnaturalizar los fragmentos de DNA, es decir,
para separar sus cadenas in situ. Despues de la nip ida neutralizaci6n, el gel se deposita sobre un rimero
de hojas de papel fIltro empapadas en soluci6n amortiguadora. EI papel hecho de nitrocelulosa 0 algun otro
material que se une al DNA se coloca sobre el gel , y sobre esta lamina se coloca una pita de hojas de
papel filtro secas tal como se muestra a continuaci6n:
Lamina de
nitrocelulosa
La acci6n capilar arrastra la soluci6n amortiguadora a traves del gel y el papel que se une al DNA hasta
el papel filtro. Los fragmentos de DNA se unen y no pasan hasta la pita de papel filtro de mas arriba.
El resultado es esencialmente una "impresi6n por contacto" del gel en el papel que se une al DNA. El
horneado a 80°C fija permanentemente el DNA al nitrato de celulosa (nitrocelulosa) u otro soporte. La
lamina de nitrocelulosa que Ileva adheridos fragmentos de DNA se coloca en una bolsa de plastico del
tipo usado para congelar alimentos. Enseguida, se afiade DNA 0 RNA radiactivos a la bolsa en una solu-
ci6n que sea apropiada para que ocurra una reacci6n de hibridaci6n. Por ultimo, la bolsa se sella e incuba
para permitir la hibridaci6n.
Aplicar a la lamina
de nitrocelulosa,
hibridizar con el
DNA 0 el RNA
radiactivos
Enjuagar la lamina
de nitrocelulosa,
obtener el
autorradiograma
La hibridaci6n molecular s610 ocurre en aquellas porciones de las moleculas de DNA que muestran homo-
logfa suficiente (en cuanto a secuencia de nucle6tidos) con un DNA 0 RNA radiactivo, el cual se conoce
como "sonda" 0 "prueba" debido a su capacidad para localizar secuencias especfficas en la masa de
secuencias del DNA no relacionadas que estan presentes en la lamina de nitrocelulosa. Todo este procedi-
miento constituye el experimento del " manchado de Southern" que se esquematiza en la figura anterior.
Cuando el acido nucleico que es transferido a la lamina de uni6n es RNA en lugar de DNA, la tecnica
se conoce como "manchado Northern". Esta tecnologfa se ha extendido hasta las protefnas, que de mane-
ra similar pueden "imprimirse por contacto" en una lamina de nitrocelulosa. En este caso, la detecci6n
es por uni6n de moleculas de anticuerpo, y la tecnica, en la jerga dellaboratorio , se conoce como " man-
chado Western".
Closes de 6cidos nucleicos 265
N6tese que en el caso del DNA circular covalentemente cerrado la fusi6n es po-
sible. Sin embargo, debido a que las dos cadenas estan entretejidas, la hibridaci6n
o la renaturalizaci6n son casi un proceso unimolecular. El resultado es que dicho
DNA se renaturaliza demasiado rapido comparativamente con los DNA lineales mos-
trados en la figura 6.7. Las moleculas hfbridas de DNA-RNA pueden obtenerse tam-
bien mediante incubaci6n en condiciones de renaturalizaci6n. Estos hfbridos son
menos estables que los hfbridos de DNA-DNA 0 de RNA-RNA , excepto cuando
se utilizan ciertos disolventes para obtener hfbridos de DNA-DNA menos estables
que los hfbridos de DNA-RNA.
6.7 CLASES DE ACIDOS NUCLEICOS

La funci6n de los acidos nuc1eicos es un tema importante de la parte III de este tex-
to. Como pr610go de dicho tema, se sedalan aquf los tipos principales de acidos
nuc1eicos. Todos los organismos hasta ahora caracterizados poseen alguna c1ase de
acido nuc1eico como material genetico. En todas las celulas, el material genetico
es el DNA, mientras que un determinado virus puede po seer cualquiera de los cua-
tro tipos de acido nuc1eico como material gen6mico: DNA 0 RNA de una sola cadena
o de doble cadena. Los acidos nuc1eicos virales se estudian en el capitulo 22.
EI DNA se encuentra en s610 un llIimero limitado de formas en celulas tanto pro-
cari6ticas (bacterias, algas verdeazules) como eucari6ticas (hongos, plantas, anima-
les). La complejidad del cromosoma de E. coli, determinada mediante analisis de
hibridaci6n molecular (secci6n 6.6), y su tamado fisico, determinado mediante mi-
croscopia electr6nica y otras tecnicas, son consistentes. Es decir, parece que el cromo-
soma procari6tico es una sola molecula de DNA larga, circular y de doble cadena. La
longitud del contorno de dicho DNA tiene mas de 1 mm, mientras que la dimensi6n
mayor de la celula bacteriana es de casi 0.001 mm. Evidentemente, el cromosoma
bacteriano debe estar bastante plegado en la celula. El DNA esta superenrollado
(vease la secci6n 6.5) y forma un complejo con protefnas y RNA, los cuales al pare-
cer contribuyen a darle una conformaci6n compacta al DNA contenido en la celula
bacteriana.
En organismos eucari6ticos, la herencia de los caracteres geneticos esta ligada,
heredandose en general ciertos caracteres juntos. Estos grupos de ligamiento co-
rresponden a los cromosomas, correlacionando una entidad ffsica que puede verse
inc1uso con el microscopio de luz, el cromosoma en metafase, con las propiedades
geneticas del organismo. Cuando menos algunos cromosomas de eucariotes contie-
nen una sola molecula de DNA muy larga. En la secci6n 6.10 se estudiara el tamado
y plegamiento del DNA en los cromosomas de las celulas eucari6ticas.
Las bacterias pueden adquirir elementos de DNA extracromos6micos llamados
pbismidos. Los plasmidos son cfrculos de doble cadena con un tamado de casi 4
a mas de 200 kb (v ease tambien el recuadro 6.E). Estas estructuras se duplican in-
dependientemente del cromosoma bacteriano. Esta existencia semiaut6noma es po-
sible debido a que el plasmido codifica parte de la informaci6n genetic a necesaria
para su duplicaci6n y, por 10 general, la celula bacteriana continua manteniendo al
plasmido debido a que este contribuye con alguna funci6n que Ie da a la bacteria
una ventaja selectiva. El ejemplo c1asico de dicha adaptaci6n es la resistencia a un
antibi6tico. Las "cepas bacterianas de hospital" que tienen la capacidad de dupli-
carse aun en presencia de varios antibi6ticos han adquirido de uno a varios plasmi-
dos de resistencia a estos farmacos. En general, los plasmidos controlan el numero de
copias del phismido que existen por celula, que puede ser de solo 1 a 3 0 30, 0 mas.
De modo usual, los phismidos de mayor tamano existen en un menor numero de
copias. Otros ejemplos de funciones codificadas por estas estructuras son: 1) for-
macion del pilus F 0 tubo de conjugacion, una estructura que facilita la transferen-
cia de plasrnidos de una celula bacteriana a otra; 2) produccion de toxinas que inhiben
o destruyen bacterias emparentadas pero que carecen de plasmidos; y 3) capacidad
para metabolizar ciertos compuestos necesarios para la nutricion de la celula bacte-
riana. Como se senala en el capitulo 22, los phismidos son elementos importantes
de la tecnologia del DNA recombinante.
Algunos de los organelos de los eucariotes, las mitocondrias y los c1oroplastos,
asi como algunos otros organelos menos comunes, llevan una existencia semiautono-
rna debido a que tienen su propio DNA. El DNA mitocondrial de las plantas, por
ejemplo, presenta un panorama complejo. A partir del numero y movilidad de las
zonas producidas por electroforesis de fragmentos de DNA obtenidos mediante en-
donuc1easas de restriccion (recuadro 6.D), de 200 000 a 2 500000 pares de bases
de DNA constituyen todas las secuencias de nuc1eotido existentes en las mitocon-
drias de varias especies vegetales. Sin embargo, el DNA mitocondrial de una deter-
rninada especie no es de tamano uniforme y puede ser una mezc1a de formas circulares
y lineales. Si en el caso del DNA mitocondrial del maiz se asigna un valor de 1.0
al numero de secuencias del DNA identificadas como unicas mediante el analisis
de fragmentos obtenidos con endonuc1easas de restriccion, las moleculas existen-
tes de DNA mitocondrial son cfrculos de aproximadamentA 0.4,0.8, 1.0, 1.4, 1.6
y 2.0 veces este tamano. Las mitocondrias de las celulas vegetales suelen tener tam-
bien moleculas pequenas de DNA tipo plasmido e inc1uso moleculas de RNA de
doble cadena.
Una celula tipica puede contener diez veces mas RNA que DNA. Tres c1ases
representan la mayor parte del RNA que puede encontrarse en las celulas de proca-
riotes 0 eucariotes: 1) RNA ribosomal, rRNA, que es el mas abundante; 2) RNA
de transferencia, tRNA; y 3) RNA mensajero, abreviado mRNA. Todas las for-
mas anteriores de RNA son sintetizadas por enzimas que copian sus secuencias de
nuc1eotidos de un molde de DNA en un proceso llamado transcripcion (capitulo
19); asimismo, todas estas formas participan en la sintesis de proteinas (capitu-
lo 20), pero en diferentes maneras: el rRNA en los ribosomas (seccion 6.10), las
partlculas en las cuales se lleva a cabo la sintesis de proteinas; el mRNA (capitulo
19) como el intermediario que transfiere la informacion genetica del DNA al ribo-
soma, donde es interpretada como secuencias de aminoacidos; el tRNA (seccion 6.8)
como parte del sistema de interpretacion, llevando aminoacidos al sitio de la sinte-
sis de proteinas y especificando que aminoacido va a incorporarse de acuerdo con
la informacion del mRNA. Otros RNA existen en menores cantidades y, entre otras
funciones, participan en la sintesis del DNA y en la ruptura y union de las secuen-
cias del RNA.
6.8 PLEGAMIENTO DE ACiDOS NUCLEICOS DE

UNA SOLA CADENA
La estructura bihelicoidal regular de la mayoria de las moleculas de DNA contrasta

con la estructura de la mayoria de las moleculas de RNA. Sin embargo, las molecu-
las de RNA que se han estudiado con detalle parecen presentar una estructura defi-
nida. Solo un metoda puede dar un panorama detallado y completo de la distribucion
Plegamiento de 6cidos nucleicos de uno solo cadena 267
tridimensional de los ,ltomos en una molecula de acido nucleico: la cristalograffa
de rayos X. La espectroscopia de resonancia magnetica nuclear da informaci6n me-
nos completa pero no obstante detallada de la conformaci6n de los acidos nucleicos.
Sin embargo, ambas tecnicas suelen utilizarse muy poco en el caso de moleculas
de mas de 100 residuos de nucle6tido.
Al igual que las proteinas, puede considerarse que los acidos nucleicos tienen
varios niveles de estructura. La estructura primaria es, en efecto, la secuencia de
los residuos de nucle6tido. Se considera que la estructura secundaria son las helices
r------------------------------------
. ------------------
3
-I
t I
5' A
I pG - - C
.. C G I
G -- C70 Brazo aa
G U I
As-- U
U A
I
Brazo 0 Brazo T
U -- A
G65 A CAe
D
I IIII I
IIII I
I
Asa V
A I
C G
t" Nucle6tido C G
constante
A u Brazo ac
O
--
Purina 0 pirimidina
constantes
I
A 'I' I
@ A
Gm
I
5' - - - - - - 1•• 3' Anticod6n
3' ......1 - - - - - - - - - - - - 5 ' Cod6n de RNAm I

___ J
FIGURA 6.8 Secuencia de nucleotidos del tRNA de fenilalanina de levadura, repre-
sentada en la configuracion de hoja de trebol. Los drculos grises son constantes en
todos los tRNA y los drculos claros indican las posiciones que son ocupadas constan-
temente ya sea por purinas 0 pirimidinas. Abreviaturas: A, adenosina; T, timidina; G,
guanosina; C, citidina; U, uridina; D, dihidrouridina; 1/1, seudouridina; Y, un nucleosido
de purina; m, metil; y m2, dimetil. Las Irneas indican puentes de hidrogeno. En esta
estructura est6n definidos cuatro brazos y un asa_
regulares que pueden formarse por apareamiento de bases entre porciones cercanas
o distantes de la cadena polinucleotida. La estructura terciaria esta representada por
el apilamiento de bases y las interacciones entre los pares de estas que unen porcio-
nes distantes de la cadena polinucleotida y no originan estructuras helicoidales re-
gulares. Las helices regulares tienen pares de bases que son principalmente del tipo
de Watson y Crick, aunque ocurre el apareamiento de bases G:U que, al parecer,
tiene una energfa apenas ligeramente menor que la del par A:U. Las interacciones
terciarias suelen resultar de los tipos mas raros de apareamiento de bases.
Se conocen las estructuras tridimensionales completas de solo unas cuantas mo-
leculas de tRNA. En la figura 6.8 aparece la secuencia de nucleotidos del tRNA
de fenilalanina de la levadura, dispuesta de tal modo que da un patron de aparea-
miento de bases amplio y que es consistente con la mayorfa de las secuencias de
los tRNA conocidos. Es decir, en la figura 6.8 se muestra la estructura secundaria
del tRNA de fenilalanina de la levadura. Notese el par de bases G: U del tallo heli-
coidal que une la region 3' con la region 5' de la estructura. Como se sefiala en
la seccion 6.1, los RNA de transferencia tienen residuos de nucleotidos raros aparte
de los cuatro residuos estandar.
Notese el contraste que existe entre las figuras 6.8 y la 6.9, esta indica la estruc-
tura tridimensional del mismo tRNA derivado de cristalografia de rayos X. Existe
el mismo apareamiento de bases, pero la conformacion de la molecula y las interac-
ciones terciarias no pueden esperarse a partir de la estructura secundaria.
r------·-------------------·------ ·· -···---·---.·--l
I 54 64 .-5' I
I ~~~ ,
1
Anticodon
_ _______ ._.____.__________._._______...J
FIGURA 6.9 Modelo esquemotico del tRNA de fenilalanina de levadura derivado
de un mapa de densidad electr6nica del tRNA cristalino . Vease 10 figura 6.8 para las
definiciones de brazos y asas de 10 estructura secundaria. (Fuente : cortesla de S. N. Kim) .
Plegamiento de 6cidos nucleicos de una sola cadena 269
FIGURA 6 . 10 Modelo de 10 estructura secundaria del RNA ribosomal 16S de E. coli .

EI plegamiento propuesto para este RNA de 1542 residuos de nucleotido se deriva
de varios datos qufmicos y biologicos. (Fuente: H. F. Noller y C. R. Woese, Science
2 12 :403 (1 981 ), con autorizacion) .
Se sabe muy poco de las estructuras tridimensionales de las moleculas de acido

nucleico mas grandes. Los metodos que se han utilizado para estudiar macromo-
leculas de RNA incluyen: 1) mediciones de la ruptura del RNA mediante (0 por
reaccion con) nucleasas y reactivos qufmicos que son sensibles a la estructura se-
cundaria de la molecula, 2) reaccion con agentes de union transversal entrecruzan-
tes y 3) observaciones de relaciones filogeneticas. Estos metodos presentan incluso
el potencial de dar informacion limitada sobre las interacciones terciarias. AI hacer
comparaciones filogeneticas, se seleccionan ejemplos del mismo tipo funcional de
RNA de varios organismos distintos. Si las moleculas tienen secuencias muy simi-
lares, entonces las pocas diferencias existentes entre ellas pueden dar claves sobre
el patron de plegamiento del RNA. Por ejemplo, al comparar dos moleculas de RNA,
un residuo A de una posicion particular en una molecula puede ser sustituido por un
residuo C en la otra. Asimismo, si en una segunda posicion de la secuencia un resi-
duo U es sustituido por un residuo G, puede esperarse que las posiciones primera
y segunda de cada una de las moleculas esten asociadas por un apareamiento de ba-
ses de Watson y Crick. En la figura 6.10 se muestra un modelo de la estructura
secundaria del RNA ribosomal de E coli.
6.9 MUTAGENESIS
La mutagenesis es la induccion de un mutante, 10 cual significa que se trata de un

organismo 0 de una molecula de acido nucleico de caracter genetico alterado. Los
mutantes se originan de alteraciones en las secuencias de nucleotidos. Los mutantes
se inducen de muchas formas. En ellaboratorio, se han inducido con mas frecuen-
cia mediante radiacion 0 tratando qufmicamente al organismo 0 su acido nucIeico,
o bien aplicando agentes mutagenos al organismo 0 a un sistema en el cual el acido
nucleico se esta duplicando. Mas recientemente, los avances en la sfntesis de oligo-
nucleotidos (recuadro 6.G) permiten controlar con precision la mutagenesis mediante
la sfntesis programada de secuencias alteradas .
Un ejemplo de reactivo mutageno es el bisulfito. EI bisulfito reacciona especffi-
camente con los residuos de citidilato del RNA y los convierte en residuos de uridi-
lato a traves ie la siguiente secuencia de reacciones:
· NH
C
HSO:3
"::N \.
I ~ •
N 0
I
R
Dos ejemplos de mutagenos in vivo son el 5-bromouracilo y la 2-aminopurina.

El bromouracilo, gracias a su equilibrio tautomerico alterado comparado con el de
Mutagenesis 271
RECUADRO 6.G SiNTESIS QUiMICA DE OLiGODESOXIRRIBONUCLEOTIDOS
La combinaci6n de las refinadas metodologfas de la qufmica organica y del DNA recombinante da al bio-
qufmico la oportunidad de producir polinucle6tidos de casi cualquier secuencia de nucle6tidos deseada, para
crear acid os nucleicos que no pueden obtenerse de fuentes naturales. Con frecuencia, el aspecto qufmico
de esta combinaci6n toma la forma de un sintetizador automatizado de 0ligodesoxirribonucle6tidos, el cual
saca ventaja de la tecnologfa del soporte s61ido similar a la que se utiliza en la sfntesis de oligopeptidos
(recuadro 3.D). Los residuos de nucle6tido qufmicamente modificados se aiiaden secuencialmente a la
cadena de polinucle6tidos, la cual esta unida por su extrema 3' a un soporte s6lido de esferas polimericas
o cristalinas. Gracias al soporte s6lido, la purificaci6n de los intermediarios de polinucle6tido entre las
etapas del proceso de sfntesis es simpiemente cuesti6n de lavar las esferas de resina. Los sintetizadores
disponibles en el mercado permiten obtener 0ligodesoxirribonucle6tidos de 50 6 incluso 100 residuos en
cantidades micromolares.
Por otra parte, se han creado varios sistemas para sintetizar enlaces fosfodiester entre los residuos de deso-
xinucle6sido. Uno de los procedimientos que se utiliza mas ampliamente, la qufmica de la fosforamidita,
no requiere esteres de fosfato como material de inicio para la sfntesis. EI atomo de f6sforo en un ester
de fosfato esta en el estado de oxidaci6n +5, mientras que un ester de fosfito esta en el estado de oxida-
ci6n + 3. Ambos se muestran a continuaci6n en el estado total mente protonado.
o o
i i
R-O-P-OH R-O-P-OH
I
OH
Ester de fosfato Ester de fosfito
Una fos foramidita es una amida de fosfito. A continuaci6n se muestra la estructura de un derivado de
fosforamidita de desoxicitidina, el cual se utiliza en la sfntesis de 0ligodesoxirribonucle6tidos.
Los grupos reactivos de los derivados de fosforamidita de desoxinucle6sido deben bloquearse qufmica-
mente para evitar qlle ocurran reacciones secundarias indeseables durante el acoplamiento que origina la
formaci6n de nuevos enlaces fosfodiester en el polinucleotido. La base citosina del derivado de fosforami-
dita de desoxicitidina es bioqueada por un grupo benzoilo, mientras que ei grupo hidroxilo 5' de este
y otros reactivos de fosforamidita de desoxinucleosido son bioqueados con un grupo de dimetoxi-tritilo
en un enlace de eter que es especiaimente labil en acido.
La serie de reacciones al terminG de este recuadro muestra las primeras etapas en la sfntesis de un oligode-
soxirribonucleotido. EI residuo de nucleosido que esta mas proximo al extrema 3' del producto final entra
a la reacci6n acoplado mediante su grupo hidroxilo 3' al soporte s6lido. La base de este nucleosido, asf
como las bases de los residuos de nucle6tido que se aiiaden subsecuentemente, excepto la timina, requie-
ren bloqueos apropiados. El grupo hidroxilo 5' del desoxinucle6sido tiene la capacidad de desplazar al
grupo bi-isopropil amido protonado de la fosforamidita en la reacci6n de acoplamiento . En la segunda
etapa, se forma un enlace fosfotriester estable mediante oxidacion con yodo del aromo de fosforo de su es-
tado + 3 al estado + 5. Los acidos suaves eliminan el grupo de dimetoxitritilo, pero no el grupo metoxi
del fosfotriester 0 los grupos bloqueadores de las bases. De esta manera, el producto unido al soporte de
la serie de reacciones posee en esta etapa un grupo hidroxilo 5' libre, con 10 cual esta listo para reaccionar
con la fosforamidita de desoxinucleosido del residuo que corresponde a la base B,,_2' La continuacion
de estos ciclos hace que la cadena de polinucle6tidos crezca en la direcci6n 3' - 5' . AI termino de la serie de
reacciones, los grupos metilo de los fosfatos y los bloqueadores de las bases de desoxirribonucleosido
se eliminan mediante incubaci6n en un disolvente organico alcalino, mientras que el polinucleotido es re-
movido de la resina tratandolo con hidr6xido de amonio. Despues de purificar el producto, el grupo
5' -dimetoxitritilo se elimina para dar el oligodesoxirribonucleotido.
OCH] H
I . I
DMTr-O~
!- 0 ---
I
;-) ----- l'-l '-- C. H,
I
H
C3 7
'
+
HO
-0-1 Soporte
s61ido
\
Bn
So porte
s61ido
DMTr-O
DMT' -
Nuc/eoproteinas 273
la timina, puede formar pares de bases con residuos A 0 G. La 2-aminopurina pue-

de formar pares de bases con la citosina 0 timina/uracilo.
o
B r 0 N/ H
lN~O
I
H
Bromouracilo 2·Aminopurina
La mayorfa de las mutaciones son desventajosas para un organismo y su descen-

dencia. La mutagenesis tambien esm asociada con la carcinogenesis. Por 10 tanto, los
mutagenos, aun cuando sean herramientas utiles en bioqufmica y genetica, deben
manejarse con cuidado y conservarse adecuadamente.
6.10 NUClEOPROTEiNAS
Cuando las celulas se rompen , la mayor parte del DNA y el RNA existentes en ellas
se liberan como complejos de protefna, en lugar de acidos nuc!eicos libres. Estos
complejos de nucleoproteina 0 nucleoproteinas, aunque son estables a los trata-
mientos para romper las celulas, general mente carecen de uniones covalentes entre
el acido nuc!eico y la protefna. Los bioqufmicos Haman tambien a estos complejos
ribonucleoproteinas y desoxirribonucleoproteinas. Verbigracia: la cromatina, la
desoxirribonuc!eoprotefna que representa la mayor parte de la mas a de los cromo-
somas eucarioticos, y los ribosomas, las partfculas de ribonuc1eoproteina en las cuales
se forman los enlaces peptfdicos durante la biosfntesis de protefnas. Las partfculas
virales tambien son nuc1eoprotefnas 0 las contienen . Algunas particulas virales son
las nuc!eoprotefnas mas estables que se conocen, debido quiza a su necesidad de
sobrevivir en ambientes extracelulares. A causa de la complejidad de las nucleopro-
tefnas, el estudio de dichas partfculas no solo requiere las tecnicas de la bioqufmica
de protefnas y acidos nucleicos, sino tambien otras tecnicas. A continuaci6n se des-
cribiran, como ejemplo de como pueden estudiarse las nucleoprotefnas, algunos de
los experimentos que han permitido definir parcialmente la estructura de la cromatina.
6.10.1 CROMATINA
Los anal isis ffsicos muy elaborados han revelado que, cuando menos, algunos cro-
mosomas eucari6ticos tienen una sola molecula de DNA con un peso molecular de
mas de 1010. De esta forma, en el caso de un organismo multicromosomico, va-

rias moleculas de DNA con longitudes de mas de 10 7 !Lm deben concentrarse en
el nucleo de casi lO!Lm de diametro. EI DNA no solo debe concentrarse; debe com-
pactarse en tal forma que pueda duplicarse y servir de molde para la sfntesis del
RNA (capftulo 19) sin exceder los lfmites del nucleo. La cromatina, que puede defi-
nirse funcionalmente como la desoxirribonucleoprotefna que se libera cuando el nu-
cleo se rompe, consta de casi dos terceras partes de protefna y una tercera parte
de DNA, con cantidades mas pequeiias de RNA y otros compuestos.
La porcion protefnica de la cromatina consta de un 50% de histonas, que son
protefnas basicas que se unen con firmeza al DNA y neutralizan casi una quinta
parte de la carga ionica de los grupos fosfodiester del DNA. Las histonas se dividen
en cinco grupos: HI, H2A, H2B, H3 y H4. Comparada con las demas histonas,
con peso molecular de 11 000 a 14 500, la HI es mas grande, con un peso molecu-
lar de 21 000. La HI posee tambien una relacion mucho mayor entre residuos de
lis ina y arginina 10 cual es caracteristico de otras histonas. La HI varia de una espe-
cie a otra y de tejido a tejido, mientras que la H3 y la H4 son bastante constantes
en todos los tejidos de plantas y animales e incluso en las levaduras. Las histonas
H2A y H2B muestran un grado de conservacion intermedio. Las protefnas "no his-
tonicas" restantes tienen muchos mas miembros y se presentan a una concentracion
mucho menor que las protefnas histonicas. Entre las protefnas no histonicas hay pro-
babies reguladores y catalizadores de la expresion genetica, mientras que las protef-
nas histonicas actuan quiza fundamentalmente para controlar el plegamiento de la
doble helice del DNA.
EI tratamiento de cromatina purificada con bajas concentraciones de una nuclea-
sa como la nucleasa de Micrococcus tiene un efecto notable sobre la estructura del
DNA de doble cadena aislado de la cromatina parcial mente digerida. La electrofo-
resis en gel de agarosa de cromatina tratada con nucleasa produce una "escalera"
de zonas que a primera vista asemeja las escaleras que se obtienen en los experi-
mentos para determinar las secuencias del DNA (recuadro 6.C). Sin embargo, los
"peldaiios" de esta escalera esmn separados no por diferencias de un residuo de
nucleotido, sino por incrementos de casi 200 pares de bases. Como se muestra en
la figura 6.11, se observan zonas que corresponden a 200,400,600, 800 (y asf su-
cesivamente) pares de bases.
Diferentes nucleasas dan el mismo resultado, 10 cual indica que es la conforma-
cion y disponibilidad del DNA y no la especificidad de la nucleasa el factor que
determina el patron de degradacion de la cromatina. Los tratamientos graduales y
cada vez mas vigorosos de la cromatina con nucleasas causan cambios en el patron
del DNA aislado de la cromatina tratada. La mayor parte del DNA es llevado a
la zona de 200 pares de bases y, despues de tratamientos mas fuertes con nucleasa,
incluso hacia las zonas que migran mas rapidamente. La cromatina que tiene su DNA
degradado para formar la escalera de 200 pares de bases tambien posee una compo-
sicion qufmica simple. Por cada 200 pares de bases del DNA, la cromatina tratada
tiene una molecula de histona HI y dos moleculas cada una de las histonas H2A,
H2B, H3 Y H4. Esto corresponde a la composicion de la partfcula de cromatina que
es la fuente del fragmento de DNA de 200 pares de bases, el nucleosoma.
El tratamiento adicional de los nucleosomas con nucleasa remueve entre 30 y
35 pares de bases del DNA, pero no altera la composicion de las protefnas histoni-
cas. Se considera que el DNA removido forma parte de un "eslabonador", un seg-
mento de la cadena de DNA que no esm unido firmemente a las protefnas histonicas
y al parecer une los segmentos de casi 165 pares de bases que esttin protegidos por la
- Nuc/eoproteinas 275
FIGU RA 6.11 An61isis de la escision del DNA de doble cadena de la cromatina me-
diante tratamiento moderado con nucleasa. La cromatina tratada se expuso a un sis-
tema bifOsico de fenol y agua para separar las proternas antes de realizar la
electroforesis del DNA en un gel de agarosa.
histona. La desoxinucleoproteina residual, con una molecula de HI y dos moleculas

cada una de las otras cuatro proteinas histonicas, se conoce como cromatosoma.
Un tratamiento aun mas vigoroso del cromatosoma con nucleasa reduce el conte-
nido de DNA hasta casi 147 pares de bases y libera la histona HI. El resultado es
el mideo del nudeosoma. Las fibras de cromatina, los cromatosomas y los nucleos
de nucleosoma han sido objeto de much as clases de analisis, incluyendo las extrac-
ciones diferenciales para determinar que enlaces intermoleculares resisten que di-
solventes, la union quimica entrecruzada de proteinas para determinar que proteinas
estan proximas entre si en la estructura de la desoxinucleoproteina, y la difraccion
de neutrones y de rayos X para conocer las posiciones relativas del DNA y las mo-
leculas de proteina e incluso para delinear las cadenas del DNA y las proteinas. Esta
gran diversidad de informacion ha revelado el esquema general de la estructura de
la cromatina y sus productos de degradacion con nucleasa.
Los nucleos de nucleosoma tienen una estructura sorprendente. El DNA no esta
encerrado en la estructura del nucleosoma, sino que existe como dos vueltas de una he-
lice. Esto es , en realidad, una superhelice, una helice "izquierda" de DNA B heli-
coidal de quiralidad "derecha"'formada en torno a un centro de proteina, como
se indica en la figura 6.12. El resultado es una estructura en forma de disco. La
rigidez inherente de una helice de DNA B requeriria 1500 mas pares de bases de DNA
para formar un circulo sin que se deforme excesivamente la estructura del DNA B.
Por 10 tanto, no es sorprendente que las vueltas de 100 pares de bases del nucleoso-
rna esten deformadas. Tienen "defectos" en la estructura del DNA B, irnpuestos
quiza por la interaccion del DNA y las histonas. El nucleo del nucleosoma es un
tetramero de dos histonas H3 y dos H4. Los dimeros H2A-H2B se localizan en las
"caras" de los discos. En el siguiente nivel de complejidad, el cromatosoma, la his-
tona HI parece "sellar" las dos vueltas de la superhelice de DNA. La cromatina
misma tiene otro nivel de estructura helicoidal, una helice de nucleosomas. En esta
ultima helice, cuya estructura no se conoce muy bien, el eje mayor de los cilindros
de la proteina HI (figura 6.12) probablemente es perpendicular a1 eje de la nueva
FIGU RA 6.12 Disposicion del DNA y la proterna en un nucleosoma, la unidad repe-

titiva de la cromatina. Dos vueltas de la superhelice de DNA, representadas en la ilus-
tracion como un tubo retorcido, rodean a un nucleo de proterna, como se describe
en el texto . La proterna H1 en forma de ci!indro se muestra a la derecha.
Mlice. Asimismo, niveles de plegamiento de orden min mayor contribuyen a la

capacidad del mic1eo para contener la estructura bastante larga del DNA cromos6-
mico.
6.10.2 RIBOSOMAS
El ribosoma es el mas abundante de los organelos subcelulares. Existe en la mayo-

ria de las celulas de cualquier organismo celular. Debido a su abundancia y purifi-
caci6n relativamente sencilla, los ribosomas, en particular los de los microorganismos
y el hfgado de rata, se han estudiado desde la decada de 1950. Los ribosomas se
obtienen rompiendo celulas de E. coli en soluci6n amortiguada de MgC1 2 5 mM Y
centrifugando el extracto a alta velocidad, empleando para ella tecnicas simi lares
a las descritas en el recuadro 4.B. Aproximadamente el 50% del peso seco de la
porci6n soluble de las celulas bacterianas son ribosomas, la mayorfa de los cuales
son de un tipo de partfcula denominada ribosoma 70S. Dado que esta partfcula se
afsla mediante centrifugaci6n, no es sorprendente saber que recibe este nombre por
la velocidad a la cual se sedimenta en un campo centrffugo, 70 unidades Svedberg
(vease el recuadro 4.B). EI ribosoma 70S es la estructura de la celula bacteriana
en la cual se forman los enlaces peptfdicos durante la sfntesis de protefnas (capftulo
20). Aunque es muchas veces mas complejo que una molecula de protefna 0 de tRNA,
el ribosoma posee no obstante una estructura regular que se ha analizado con exito
mediante metodos ffsicos, qufmicos y geneticos. Esta compuesto casi en su totali-
dad de RNA y protefna, con pequeiias cantidades de poliaminas como la espermidi-
na, H2N-(CH2h-NH-(CH2)4-NH2, y iones metalicos como el magnesio.
Uno de los primeros indicios que llev6 al descubrimiento de esta estructura fue
la exposici6n del ribosoma 70S a una soluci6n amortiguada de MgCI2 0.5 mM, una
concentraci6n del ion metalico bivalente que es una decima parte de la que suele
Nuc/eoproteinas 277
utilizarse para aislar dicho ribosoma. El ribosoma 70S se disoci6 en las subunidades
ribosomales 50S y 30S.
Ribosoma 70S ~ Subunidad ribosomal 50S + Subunidad ribosomal 30S

Es decir, la concentraci6n reducida del ion magnesio desplaz6 el equilibrio de la
reaccion a la derecha.
Por supuesto, debido a su funcion en la sfntesis de protefnas, los ribosomas estin
presentes en casi todas las celulas de los eucariotes. Una de las pocas excepciones
es el eritrocito maduro de los mamfferos, el cual pierde su complemento de ribo-
somas y su nueleo durante su desarrollo. Los ribosomas de los eucariotes son un
poco mas .grandes que los de los procariotes y reciben el nombre de ribosomas 80S.
Los ribosomas 80S se disocian tambien al menos parcialmente cuando disminuye la
concentracion del ion magnesio, en los ribosomas 60S y 4OS. En la tabla 6.3 se compa-
ran algunas de las propiedades de los ribosomas de las celulas procari6ticas y eucari6ti-
cas. La mayorfa de los ribosomas procari6ticos tienen propiedades muy similares; se
observa mas variacion entre los ribosomas eucarioticos. Dos organelos importantes
de los eucariotes, las mitocondrias y los eloroplastos, tienen ribosomas. Sin embar-
go, los ribosomas de estos organelos se asemejan a los ribosomas de las bacterias
en mayor grado que a los ribosomas citoplasmicos de los eucariotes, 10 que refleja
quiza un origen procariotico evolutivo de las mitocondrias y los eloroplastos.
Los ribosomas de las bacterias son los que mejor se han estudiado. Aunque los
ribosomas citoplasmicos de los organismos eucarioticos son mas grandes y mas com-
plejos que los de las bacterias, e ineluyen en ellos un tipo adicional de RNA, el
RNA 5.8S, ambos tipos de ribosomas poseen una organizacion similar en cuanto
TABLA 6.3 Ribosomas y sus componentes

Eucariotes
Procariotes (citop/asma)
Fuente 70s 80s
Peso de la partfcula 2.7 X 10 6 4.3 X 10 6
Fracci6n de RNA en la masa -57% -59%
Subunidad grande 50S 60S
Tipo de RNA 23S 26S-28S
(2904 nt, E. coli) ( - 5100 rn, hfgado de rata)
5S (120 rn) 5S(118 nt)
5.8S (150 rn)
Protefnas
Numero 32 -50
Intervalo de peso molecular 5381-24599 12 000-42 000
Subunidad pequeiia 30S 40S
Tipo de RNA 16S 18S
(1542 nt, E. coli) (1789 nt, levadura)
Protefnas
Numero 21 -30
Intervalo de peso molecular 8369-26 613 para 11 000 - 42 000
S2 hasta
S21; Sl,
61 159
Nota: m = residuos de nucle6tido; las prote(nas de lao subunidad 30S de los ribosomas de E . coli se designan can SI a 511.
a RNA y protefnas. Se han hecho muchas analogfas de estructura y funci6n entre

las protefnas de cada tipo de ribosoma. Aquf s610 se estudiani brevemente la subu-
nidad 30S del ribosoma de E. coli.
Los metodos de estudio de la estructura de la nucleoprotefna que se han aplicado
a la cromatina, en particular el entrecruzamiento qufmico (de protefna a protefna
y de protefna a RNA) tambien se han aplicado a los ribosomas. Ademas, el conoci-
miento que se tiene de los ribosomas ha sido aumentado por: 1) el estudio de mutan-
tes con protefnas ribosomales alteradas 0 incluso faltantes, 2) las observaciones, al
microscopio electr6nico, de los sitios en la superficie de los ribosomas a los cuales
se unen anticuerpos contra protefnas ribosomales especfficas y 3) la capacidad para
ensamblar subunidades ribosomales provenientes de protefnas ribosomales y RNA
ribosomal purificados. A diferencia de la estructura del nucleosoma, el acido nu-
cleico y la protefna del ribosoma parecen unirse a 10 largo de toda la partfcula, con
el RNA, en promedio, ligeramente mas al centro que las protefnas.
La subunidad ribosomal 30S de E. coli es una partfcula ligeramente alargada con
dimensiones de aproximadamente 11 X 11 X 23 nm. Como se indica en la figura
6.13, esta partfcula tiene una constriccion 0 cuello. Muchas de las funciones impor-
tantes de la subunidad 30S que se ha demostrado son necesarias para la sfntesis
de protefnas (capftulo 20) se han asociado con protefnas localizadas en una region de
dicha constriccion, a la izquierda del esquema de la figura 6.13. Se conocen las
posiciones de muchas de las 21 protefnas de esta subunidad y algunas se indican
en la figura antes mencionada. La protefna SI es notable no s610 por su gran tamano
(tabla 6.3), sino tambien porque esm unida menos firmemente a la partfcula 30S
que las otras protefnas y puede disociarse y reasociarse con la partfcula.
6.10.3 VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO

Las partfculas virales, la forma extracelular infecciosa del virus (v ease el capftulo
22), se denominan viriones. Los viriones del virus del mosaico del tabaco (VMT),
el primer virus de plantas que se estudi6 con gran detalle, poseen una estructura
FIGURA 6.13 Disposicion de algunas

de las prote!nas de la subunidad riboso-
mal 305 de la bacteria E. coli. En su ma-
yor dimension, la part!cula tiene casi 23
nm. Se indica la localizacion de algunas
de las 21 prote!nas de la subunidad 305
51, 53 y as! sucesivamente, as! como los
extremos 3' y 5' del RNA ribosomal
165. (Fuente: adaptada de H. G. Witt-
mann, Annual Reviews of Biochemistry,
Vol. 52 (1982), pp. 35-65).
Nuc/eoproteinas 279
mucho mas regular que los ribosomas. El peso de la partfcula es de casi 40 X 10 6

y consta de un 95 % de protefna y 5 % de RNA. El RNA de este virus es una sola
moh!cula de casi 6 400 residuos de nucle6tido. La protefna, Hamada protefna de
la capside del VMT, es de un tipo, con un peso molecular de 17 500. Los viriones
del VMT son cilindros rfgidos de estructura helicoidal de aproximadamente 300
nm de longitud y 18 nm de diametro, con una cavidad central 0 poro a todo 10
largo del cilindro. Este presenta una estructura uniforme en toda su longitud. El
aspecto de un segmento del VMT se muestra en la figura 6.14, la cual representa
aproximadamente el 20% de la longitud total del virus. La estructura del VMT
se conoce con detaHe gracias a los estudios de difracci6n de rayos X de los cilin-
dros y de la protefna aislada de la capside de dicho virus. En promedio existen
tres residuos de nucle6tido del RNA asociados con cada subunidad de protefna.
La estructura helicoidal del RNA aparece entre las subunidades de protefna dis-
puestas helicoidalmente, como puede observarse a la izquierda de la figura 6.14.
H. Fraenkel-Conrat y colaboradores descubrieron en la decada de 1950 c6mo
aislar la protefna de la capside y el RNA del VMT. Mezclaron estos componentes
en soluci6n amortiguadora de fosfato a pH neutro, y encontraron que las partfculas
infecciosas se formaban espontaneamente al cabo de algunas horas. Esta fue la pri-
mera demostraci6n de dicha reacci6n bio16gica de ensamblaje espontaneo. Las par-
tfculas formadas mostraron las propiedades de autenticos viriones del VMT de las
plantas, como se demostr6 mediante varias pruebas. Mucho despues, las condicio-
nes de reacci6n se modificaron para lograr el ensamblaje al cabo de unos minutos. La
reacci6n de ensamblaje se ha estudiado con bastante detalle. La protefna que reaccio-
na inicialmente con el RNA del VMT no es la protefna dispersa de la capside, sino
probablemente agregados helicoidales de casi 30 a 40 moleculas. Contrariamente
a 10 que se esperaba inicialmente, el agregado de protefnas no se une ni al extrema
3' ni al extremo 5' del RNA del VMT, sino a una secuencia especffica que se en-
cuentra a aproximadamente 15 % de la distancia entre el extremo 3' Y el extremo
5', cerca del residuo 5 500.
5' ... GA\. G I\,

G /,
GAAGA / \
GACG AGGG--CCCAU GAACUUA--CA A I
CUGU UCCC
I \/
GGUA--CUUGAGU GU G \/ \. I
3' ... AG A U A A UGCU
G A
I
UAG
I
residua 5500
La figura 6.15 es un esquema del complejo inicial entre el RNA Y el agregado de

protefnas de la caps ide del VMT. Una consecuencia interesante de estos mecanis-
mos de iniciaci6n es que el extremo 5' del RNA debe pasar a traves del poro central
del cilindro del VMT conforme se van uniendo mas protefnas de la capside. El com-
plejo de RNA y protefnas de la figura 6.15b y c es helicoidal, y la conformaci6n
helicoidal del RNA se muestra en el esquema, abajo del diagrama del complejo de
iniciaci6n. N6tese que la porci6n del RNA que esta conectada al extremo 5' pasa
a traves del poro central del complejo de ribonucleoprotefna. De esta manera, el
RNA pasa gradualmente a traves del poro, de modo que el extremo denominado
5' de esta molecula se mueve hacia arriba en el esquema de la figura 6.15. Final-
mente, el extremo del cilindro del virus que protege al extremo 5' del RNA sera
FIGURA 6.14 Estructura de las partfcu las del virus del mosaico del tabaco. Se
representa 10 helice "derecha" de RNA y protefna, en 10 que coda molecula de
protefna de 10 c6pside tiene el aspecto de un zueco y el RNA tiene 10 forma de un
collar de cuentas, una cuenta por coda residuo de nucle6tido. (Fuente: modificado
de P.J.G. Butler, Journal of General Virology, Vol. 65 (1984), pp . 253-279 con auto-
rizaci6n).
+ Proteina
agregada de la
capside del VMT
3'
5'
3'
5'
3'
5' 5'
(a) (b) (c)
FIGURA 6.15 Primeras etapas del mecanisme de ensamble del virus del mosaico del
tabaco. Parte de la molecula de RNA de este virus se muestra en a), que corresponde
a una regi6n que tiene cosi 1100 residuos de nucle6tido a partir del extremo 3' . Esta
regi6n reocciono con el ogregodo de protefnos de 10 c6pside del VMT para iniciar
el ensamble de 10 partfcu la viral, como se indica en b). Conforme avanza el ensam-
ble, un mayor numero de protefnas se anade al complejo en ellado distante al obser-
vad~r en b), dando el resultado observado en c).
Actividades cataliticas y de otro tipo del RNA 281
el extremo mas distante al observador en (c), una vez que el RNA ha pasado total-
mente a traves del poro.
El sistema del VMT ilustra varios principios. Al utilizar muchas copias de un
solo tipo de protefna de la capside, el virus produce una estructura grande y estable
y protege al RNA existente en el diffcil ambiente extracelular mediante la participa-
ci6n de un solo gene, el gene de la protefna de la capside. Esta protefna no s610
es capaz de proteger al RNA, sino de reconocer tambien una secuencia particular
de residuos de nucle6tido en este acido para iniciar el proceso de ensamblaje, el
cual es facilitado por un cambio complejo en la conformaci6n de la protefna. El RNA
controla tambien la reacci6n de ensamblaje, puesto que debe plegarse de tal forma
que s610 exista un origen de ensamblaje. Dos orfgenes no serfan compatibles con
el movimiento del RNA del VMT a traves del poro central de la ribonucleoprotef-
na. La reacci6n es esponillnea y no requiere gasto alguno de energfa 0 facilitaci6n
por una enzima, 10 cual demuestra que el RNA y la protefna de la capside libres
estan a un nivel de energfa mayor que el cilindro del VMT ensamblado y pueden
facilitar sus propias reacciones de ensamblaje.
6.11 ACTIVIDADES CATALiTICAS Y DE OTRO TIPO DEL RNA

Como ya se mencion6 en el capftulo 4, la gran mayorfa de los catalizadores bio16gi-
cos son protefnas. Las moleculas del RNA ribosomal no s610 contribuyen a la es-
tructura, sino tambien al funcionamiento de los ribosomas durante la sfntesis de
protefnas, como se describe en el capftulo 20, y otras moleculas de RNA presentan
reactividades qufmicas especfficas asociadas a protefnas. S610 algunas moleculas de
RNA muestrandichas reactividades en ausencia de protefnas. La enzima ribonuclea-
sa P de las bacterias cataliza la ruptura de una molecula de RNA que posee las se-
cuencias de nucle6tidos de una 0 mas moleculas de tRNA, asf como tambien otras
secuencias. Los productos son RNA de transferencia y fragmentos de RNA que con-
tienen las secuencias adicionales.
La ribonucleasa Pesta formada por una cadena polipeptfdica de peso molecular
de 17 000 Yuna molecula de RNA de 400 residuos de nucle6tido. Ambas moleculas
son necesarias para la actividad de la ribonucleasa P en condiciones fisio16gicas.
Sin embargo, si la concentraci6n del ion magnesio aumenta a mas de 100 mM, valor
que es varias veces la concentraci6n fisio16gica, la porci6n de RNA, el RNA de
la RNasa P, cataliza la reacci6n de la ribonucleasa P utilizando moleculas precurso-
ras autenticas de tRNA como sustratos. Es decir, se rompe un enlace fosfodiester, y
es este mismo enlace el que es atacado por la ribonucleasa P completa. Se descono-
ce el mecanismo de esta reacci6n. Sin embargo, es evidente que no se requiere pro-
tefna alguna para la reacci6n que ocurre a alta concentraci6n de magnesio y que
el RNA de la RNasa P actua como un verdadero catalizador, convirtiendo muchos
moles de sustrato en producto sin que experimente modificaci6n alguna. La reacci6n
presenta dependencia hiperb6lica (en cuanto a su cinetica) respecto de la concentra-
ci6n de sustrato y un pH 6ptimo. De esta forma, es razonable suponer que la cade-
na polipeptfdica de peso molecular de 17 000 de la ribonucleasa P nativa funciona
principalmente para estabilizar una conformaci6n activa del RNA de la RNasa P,
en vez de catalizar la reacci6n que es caracterfstica de la enzima.
Asimismo, se ha estudiado ampliamente una reacci6n de "autoempalme" del
RNA. El RNA ribosoma126S del protozoario Tetrahymena se forma como precur-
sor que tiene una secuencia de 413 nucle6tidos insertos en 10 que serfa el rRNA
G A C
G
U U C
o A
G C U AA A
AA
A T r t-v
~
».
"
1"\
GAACU AACU GUGGUUCC GGUU ACACCU CUCC GAGCAG AAGA AGAAGGCGG-
~
C '"
u
11111
CUUGG-UUGA-CGCCAAGG
1111 11111 III III
CCGA UGUGGG
I 111111 1111
GGGG UUCGUU UUCU
I 11111 1 111 111111111
UUUUUCGCC '"
C
1"\
m-
U~ C~
¥
i';"
C U C A C C CA A AA o
U G U U 300 '"
'<
~ ~ C '"c
'"
1"\
o
r @ 3
A "0
o
G A A A ~ '"
C1>
AG GC G A G C AC A A AC A '"
it
'"
CUCGG G A GC UUCAG UCC-CCGGG CUGG A GCGA UGGC AAAGG GGUGGGG GUG
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
GAGCC-CUCG-AAGUC AGG GGCCC GGCUUCGCU-GUCG UUUCC CCGCUCC CAC
A
A A
A'eU A
U U
C CG ~ C C
C 270 CA 240
50
A
A U
C A C AC U U CC C U
CC G C GG CG AGGAG CCCG GAAA AGGGU
~ ----e
'
II 1111 II 11111 1111 11 1 1 1111

GG CGCC GC UCCUU GGGC CUUU UCCCA
CA A C GC C U UU C U C
\ C G C
u
e
FIGURA 6.16 Secuencia de nudeotidos y probable estructura secundaria del viroide del tuberculo fusiforme de 10 papa. Con fines de daridad
se representa el asa de RNA de 359 residuos en tres Irneas. Las Irneas verticales muestran el apareamiento de bases y 10 numeracion de
los residuos se indica a intervalos de 30.
Problemas de repaso 283
26S maduro. Este precursor reacciona con la guanosina y origina que la " secuencia
intermedia" de 413 residuos (vease la secci6n 19.17) sea eliminada; despues los
extremos del RNA 26S se unen para producir rRNA 26S intacto. No se requiere
protefna alguna para que se efectue esta reacci6n espontinea in vitro.
Es indudable que los RNA facilitan mucho menos reacciones bioqufrnicas que
las protefnas catalfticas, las enzimas. Sin embargo, es posible especular que esto
pudo no haber sido el caso en todas las etapas de la evoluci6n de la vida en la Tie-
rra. Si tuviera que seleccionarse un tipo de molecula como la molecula primordial
de la vida de entre las macromoleculas biol6gicas que se conocen hoy en dfa, dicha
molecula serfa el RNA. El RNA es la unica macromolecula que puede ser tanto
catalftica como portadora de informaci6n (vease el capftulo 19).
Los viroides son los agentes infecciosos mas pequefios que se han caracterizado.
Son cfrculos de RNA covalente, por 10 general de 400 6 menos residuos de nucle6-
tido, no cubiertos por protefnas de la capside. Infectan a plantas, se duplican en
las celulas que han infectado yproducen copias de sf rnismos mediante un mecanismo
que no implica al DNA, sino al proceso de transcripci6n de cadenas complementa-
rias de RNA (vease la secci6n 19.1). En la figura 6.16 se muestra la secuencia de
nucle6tidos y la estructura secundaria probable del primer viroide que se estudi6
ampliamente, el viroide del tuberculo fusiforme de la papa (VTFP). Este viroide
tiene la capacidad de infectar papa, tomate y algunas otras plantas, asf como de du-
plicarse y causar enfermedad. Sin embargo, se desconoce aun el mecanismo por
el cual este agente infeccioso con una estructura de s610 359 residuos de nucle6tido
lleva a cabo todos estos procesos.
BI BLiOGRAFiA
1. R.L.P. Adams, R. H. Burdon, A.M. Campbell, D.P.Leader, and R.M. S. Smellie , The Bio-
chemistry of the Nucleic Acids, 9th ed. London: Chapman and Hall, 1981.
2. V.A. Bloomfield, D.M. Crothers, and 1. Tinoco, Physical Chemistry of Nucleic Acids.
New York: Harper and Row, 1974.
3. R. W. Old and S. B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Gene-
tic Engineering. Los Angeles, Calif.: University of California Press, 1981 .
PROBLEMAS DE REPASO
1. Esquematizar las estructuras de las siguientes moleculas:
a) 5-hidroximetilcitosina
b) 5-0-metilguanosina
c) N-l-metiladenosina
l,Que porci6n de azucar, si ese es el caso, tienen cada uno de estos compuestos?
2. Determinar la carga i6nica a un pH de 8 de los siguientes compuestos:
a) Adenosina
b) AMP
c) ADP
d) Adenosfn-2' :3'-fosfato cfclico
e) pdApdC
3. i,CuaJ es mas resistente a la degradacion a un pH de 11, el DNA 0 el RNA? i,Cual de

los dos es mas resistente a la degradacion a un pH de 3?
4. Comparar los pares de bases A:T y C:G del DNA de doble cadena con respecto a:
a) Grosor en direccion perpendicular al plano de las bases

b) Estabilidad de los pares de bases a un pH de 12.5
c) Numero de puentes de hidrogeno
d) Distancia entre los aromos C-l'
5. Se ha determinado que una muestra de DNA de doble cadena contiene 19% de timidila-
to como residuos de nucleotido. i,Cual debe ser el porcentaje de pares de bases G:C
de este DNA? i,Como cambia la temperatura de fusion de un DNA de doble cadena con
la composicion de bases?
6. Determinar la formula (secuencia de nucleotidos) de un oligodesoxirribonucleotido que
deba formar un complejo de bases perfectamente apareadas con CpCtfipUtfipUpCpc.
7. l.Cuales son las dos fuerzas 0 enlaces que contribuyen considerablemente a la estabili-
dad de las estructuras especfficamente plegadas del DNA y el RNA?
8. Comparar las moleculas de RNA y DNA de doble cadena en cuanto a las siguientes
propiedades:
a) Estructura de las unidades monomericas

b) Disposicion de los pares de bases respecto al eje de la Mlice
c) Temperatura de fusion
9. i,Que tipos de moleculas de RNA constituyen la mayor parte del RNA de una celula tfpica?
10. i,Que informacion ha contribuido a entender el plegamiento de las moleculas de RNA
de "una sola cadena"?
11. Mencionar tres estructuras de nucleoprotefna. i,Que tipos de fuerzas y enlaces es proba-
ble que estabilicen dichas estructuras?

Acidos Nucleicos PDF

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Acidos Nucleicos PDF

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

...

acidos nucleicos desempeiian varias funciones en los or-

r(ti"'tt.uq~.a."plP.lltGl_..Jlt~_*_~. Cuatro unidades distintas constituyen cada

ala funcion de los acidos nucleicos . La formacion de estos enlaces es especialmen-

6.1 COMPONENTES Y ORGANIZACION DE lOS

El azucar es ribosa 0 desoxirribosa y divide a los acidos nucleicos en dos grupos

Los nombres sistematicos de las bases purfnicas y pirimidfnicas derivan de los

Las bases pirimidfnicas comunes del RNA son la citosina (2-oxo-4-amino-

Por acuerdo, la l-/3-D-ribofuranosiltimina se denomina ribotimidina.

En la tabla 6.1 se dan los nombres de algunas bases purfnicas y pirimidfnicas

TABLA 6.1 Nombres de nucle6sidos

6.2 NUCLEOSIDO DIFOSFATO Y NUCLEOSIDO

Como se indico anteriormente, la nomenclatura "bi-fosfato" se refiere a un nu-

El adenosin trifosfato (A TP) funciona como la moneda energetica de la celula y es

La hidr61isis de cualquiera de los enlaces de anhidrido fosf6rico es terrnodinamica-

ATp4 - + H20 ~ ADp3- + HPO~ - + W

importantes en la acci6n de algunas hormonas. Los fosfodiesteres 2 ':3 I cfc1icos de

Adenosin-3': 5' -fosfato Citidin-2 ': 3' -fosfato

6.3 ESTRUCTURA COVAlENTE DEL RNA Y El DNA

FIGU RA 6,1 Estructura de: 0) un tetrorribonucleotido y b) un tetrodesoxirribonucleo-

FIGURA 6.1 (continuaci6n)

Es evidente a partir de la estructura representada en la figura 6.1 que la cadena

RECUADRO 6.A FORMAS TAUTOMERICAS Y REACCIONES DE LOS

f)w ~ "\2 ·~N~'O

RECUADRO 6.B ELECTROFORESIS EN GEL DE LOS

Bromuro de etidio Glioxal

Distancia reeorrida (em)

6.4 ANALISIS DE LA ESTABILIDAD Y LA SECUENCIA

cfclicos son los primeros nucleotidos observados en el curso de la reaccion. Notese

t/' 0" [=.0.-:-

la recuperaci6n total de las bases de los nude6tidos, por 10 que la reacci6n no es

despurinado, es decir, los enlaces N-glicosfdicos de la guanina y adenina son hidroli-

RECUADRO 6.C DETERMINACION DE LA SECUENCIA DE

EI metodo de F. Sanger, Hamado a veces "determinacion de la secuencia con didesoxirribonucleotidos" ,

EI oligodesoxirribonucle6tido sintetico, Hamado iniciador 0 "primer", se diseiia para hibridizarse (sec-

Si a dicha reacci6n se afiade un desoxirribonucle6sido trifosfato con un residuo de azucar modificado,

En el procedimiento de determinaci6n de la secuencia de didesoxirribonucle6tidos de Sanger, cuatro reac-

6.5 DOBLE HELICE DE LOS ACiDOS NUCLEICOS

FIGURA 6.3 Dos representaciones de 10 conformaci6n B del DNA de doble cadena .

FIGURA 6.4 Los cuatro posibles pares

5' pdGATCCGCG . 3'

FIGURA 6.5 Configuracion superhelicoi-

El fenomeno del superenrollamiento puede demostrarse facilmente con una cuerda.

RECUADRO 6.D ENDONUCLEASAS DE RESTRICCI6N Y USOS

5'- GAATTC ')'

Algunas endonucIeasas de restricci6n tipo II

La propiedad que distingue a las nucIeasas de restricci6n de otras desoxirribonucleasas es su capacidad

RECUADRO 6.E MAPEO DE LAS SECUENCIAS DEL DNA CON

AccI 1595 pb y 2767 pb

Acel EcoRI Pstl Acel

EI DNA de doble filamento no es la unica forma de acido nuc1eico de doble cade-

6.6 DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION

La fusion de una molecula de DNA aumenta su absorcion de luz ultravioleta. La

%GC = 2.44(Tm -69 .3)

En soluciones de menor concentracion de sales, las cargas negativas de los gru-

220 260 300 65° 75°

nos, casi exactamente complementarias . La velocidad y el grado de la reacci6n de-

FIGURA 6.7 Hibridaci6n del DNA de un eucariote mostrando 10 amplia voriaci6n en

RECUADRO 6.F HIBRIDACION MOLECULAR SOBRE UN SOPORTE SOLIDO

6.7 CLASES DE ACIDOS NUCLEICOS

6.8 PLEGAMIENTO DE ACiDOS NUCLEICOS DE

La estructura bihelicoidal regular de la mayoria de las moleculas de DNA contrasta