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Catálogo # 06-3110 Alcalasa ® 2.4 L FG

Nota: Vendido en colaboración con Novozymes A / S solo para fines de investigación.

Alcalasa ® 2.4 L FG actúa como una esterasa, permitiéndole catalizar las hidrólisis estereoselectivas de algunos ésteres. Alcalasa ® 2.4 L FG también hidroliza eficientemente
amino ésteres, que incluye amino ésteres heterocíclicos. Otras aplicaciones incluyen la hidrólisis de proteínas y las reacciones de transesterificación y tranpeptidación. Las
condiciones óptimas de reacción son pH 7-9, a una temperatura de 30-65 ° C.

Actividad declarada 2.4 AU-A / g. Serina endoproteasa que hidroliza los enlaces peptídicos internos. El color puede variar de un lote a otro. La intensidad del color no es una
indicación de actividad enzimática. El embalaje debe mantenerse intacto, seco y alejado de la luz solar. Siga las recomendaciones y use el producto antes de la fecha de
caducidad para evitar la necesidad de una dosis más alta.

Otros productos de Endoproteasas ofrecidos por Strem: Productos de lipasa ofrecidos por Strem:

06-3112 Alcalase® 2.5 L 06-3137 06-3123 Novozym® 435 06-3155 Lipozyme® TL IM

Savinase® 12 T 06-3150 06-3120 Lipozyme® RM 06-3105 Lipozyme® CALB L
Savinase® 16 L 06-3115 06-3118 Palatase® 20000 L 06-3140 Lipozyme® TL
Esperase® 8.0 L 06-3160 100 L 06-3125 Resinase® HT 06-3135 Novozym®
Neutrase® 0.8 L 51032 06-3100 Novocor® AD L 96-0220 Kit de
96-0224 Cribado de endoproteasa de novozimas detección de lipasa Novozymes
Kit (contiene 6 enzimas
endoproteasas)

(contiene 9 enzimas lipasa)

Productos de proteasa Novozymes

Almacenamiento

Los kits deben almacenarse de manera óptima a 0-10 • C / 32-50 • F. Si se almacena por encima de 25 • C / 77 • F las muestras deben usarse

dentro de los 3 meses.

Introducción

Las proteasas (EC 3.4.21.62) pertenecen a la clase de enzimas conocidas como hidrolasas, que catalizan la hidrólisis de

varios enlaces en presencia de agua. Las proteasas también se denominan peptidasas o proteinasas. Las proteasas

catalizan la proteólisis de enlaces peptídicos en polipéptidos, proteínas e hidrólisis selectiva de ésteres carboxílicos y

aminoésteres. Existen diferentes clases de proteasas, es decir, serina, treonina, cisteína, aspartato, ácido glutámico y

metaloproteasas.

Figura 1. Proteólisis de un enlace peptídico.

1
 Descripción y condiciones de uso óptimas.

Número de Producto CE No. Especificidad Formato Condiciones Actividad Solicitud

catálogo de óptimas de la unidad

Strem

06-3110 Alcalase® 2.4 L FG 3.4.21.62 Serina
endopeptidasa
(principalmente subtilisina
UNA)
Líquido 30-65 ° C, 2.4 AU-A / g Hidrólisis estereoselectiva de
pH 7-9 aminoésteres y ésteres selectivos;
adecuado para la hidrólisis de proteínas;
utilizado en transesterificación y
transpeptidación.

06-3112 Alcalase® 2.5 L 3.4.21.62 Serina
endopeptidasa
(principalmente subtilisina
UNA)
Líquido 30-65 ° C, 2.5 AU-A / g Hidrólisis estereoselectiva de
pH 7-10 aminoésteres y ésteres selectivos;
adecuado para la hidrólisis de proteínas;
utilizado en transesterificación y
transpeptidación.

06-3137 Savinase® 12 T 3.4.21.62 Serina Granulado 30-70 ° C, 12 KNPUS / Hidrólisis estereoselectiva de aminoésteres
endopeptidasa pH 8-10 g y ésteres selectivos; adecuado para la
(principalmente subtilisina hidrólisis de proteínas, la hidrólisis de
UNA) amidas filtradas

06-3150 Savinase® 16 L 3.4.21.62 Serina Granulado 30-70 ° C, 16 KNPUS / Hidrólisis estereoselectiva de aminoésteres
endopeptidasa pH 8-10 g y ésteres selectivos; adecuado para la
(principalmente subtilisina hidrólisis de proteínas, la hidrólisis de
UNA) amidas filtradas

06-3115 Esperase® 8.0 L 3.4.21.62 Serina Líquido pH 8-12.5 8 KNPU-E / g Hidrólisis de péptido interno
endopeptidasa cautiverio; caracterizado por un
(principalmente subtilisina excelente rendimiento a temperatura y
UNA) pH elevados.

06-3160 Neutrasa 0.8 L 3.4.22 Metaloprotease Liquid 40-50 ° C, 0.8 AU / g Resolución cinética de los aminoésteres.

pH 7

* * K = Kilo, AU = Unidad Anson, NPU = Unidad de Novo Proteasa, 1 AU = 1NPU, ASNU = Unidad de Asparaginace, USP = Unidad de actividad de tripsina utilizando el Estándar de referencia de tripsina

cristalizada de USP

La actividad se determina en relación con un estándar de proteasa A. El resultado se da en las mismas unidades que el estándar.

1 ASNU es la cantidad de enzima que produce 1 µmol de amoníaco por minuto en las condiciones de reacción estándar.

Procedimiento de cribado

A continuación se enumera el equipo recomendado para realizar las pantallas, sin embargo, el sistema de pH-stat proporciona

resultados más consistentes.

Equipo simple Equipo avanzado

Recipiente de reacción (p. Ej., 25 ml de fondo redondo o matraz Recipiente de reacción del termostato (p. Ej., 25 ml)

Erlenmeyer o tubos de ensayo)

Medidor de pH o papel de pH (rango 5-9) Sistema de autotitador / pH-stat (medidor de pH, bureta
automática / embudo de adición)

Bureta o embudo de adición calibrado Dispositivo de grabación (p. Ej., Plotter x / y)

2
 Mezclador de hélice o aguja magnética Mezclador de hélice

Preparación de tampón

0.1M Pota s pulido de fosfato de sium er a los 25 o C 0.1M de sodio PAGS tampón de fosfato a 25 o C

pH Volumen de 1M K 2 HPO Volumen de 1M KH 2 correos pH Volumen de 1M Na 2 HPO Volumen de 1M NaH 2 correos

4( ml) 4( ml) 4( ml) 4( ml)

5.8 8.5 91,5 5.8 7,9 92,1

6.0 13,2 86,8 6.0 12,0 88,0

6.2 19,2 80,8 6.2 17,8 82,2

6.4 27,8 72,2 6.4 25,5 74,5

6.6 38,1 61,9 6.6 35,2 64,8

6.8 49,7 50,3 6.8 46,3 53,7

7.0 61,5 38,5 7.0 57,7 42,3

7.2 71,7 28,3 7.2 68,4 31,6

7.4 80,2 19,8 7.4 77,4 22,6

7.6 86,6 13,4 7.6 84,5 15,5

7.8 90,8 9.2 7.8 89,6 10,4

8.0 94,0 6.0 8.0 93,2 6.8

Diluir soluciones madre combinadas de 1M a 1 L con H destilada 2 O. Diluya las soluciones madre combinadas de 1M a 1 L con H2O destilada.

Principios del método analítico.

Monitoreo de reacción en proceso:

Dependiendo del sustrato y del producto, se pueden usar diferentes métodos para el monitoreo de la reacción en el proceso.

• La cromatografía de capa fina (TLC) es un método simple para controlar el progreso y la finalización de la reacción.

• Para estimar cuantitativamente la formación del producto y el consumo de reactivo, se puede utilizar HPLC o GC para el

monitoreo.

• Se recomienda HPLC quiral para estimar la pureza quiral o el consumo de isómeros de la mezcla racémica.

• La pureza quiral final se puede obtener analizando el producto aislado usando una columna quiral apropiada.

Los parámetros clave para el exceso enantiomérico (ee) y la enantioselectividad (E) se pueden calcular a partir de las áreas en HPLC

quiral:% ee = ((RS) / (R + S)) × 100 donde R y S representan el isómero óptico individual en la mezcla (y R + S = 1), donde R = área para el

isómero R y S = área para el isómero S.

3
 Resolución cinética

Ejemplo 1. Resolución cinética por hidrólisis del éster amino racémico / éster racémico simple 1, 2

NH 2 NH 2

+
R1 OH R1 O2

NH 2
O O
R1 O2 Proteasa
o
O
NH 2 NH 2

R1 O2
+ R1 OH

O O

• El éster amino racémico / éster racémico simple (1-2 mmol) se solubiliza en tampón de fosfato de potasio (0,1
M, 10 ml, pH 7,5) y la mezcla de reacción se homogeneiza por agitación.

o Para sustratos líquidos, se formará emulsión o suspensión.

o Para sustratos sólidos, la solución se prepara agregando 10% v / v de solvente orgánico *

• Se agrega a la mezcla de reacción la enzima proteasa (50% p / p para enzima sólida o 10-20% v / v wrt para tampón
para enzima líquida).
• La mezcla de reacción se mantiene a pH 7,5 ajustando con NaOH 1N.
• La temperatura de reacción típica es de 25-30 o C y el tiempo de reacción es de 24-48 horas, dependiendo del sustrato.

• El producto de reacción se recupera por extracción o filtración.

* * isopropanol (IPA), terc-butanol, tetrahidrofurano (THF) o acetonitrilo.

La resolución cinética del amino éster racémico se puede convertir en una resolución cinética dinámica que conduce a la formación de

cantidades catalíticas de aldehídos que conducen a la formación de uno de los aminoácidos quirales con buenos rendimientos. 2

44
 Ejemplo 2 Resolución cinética por hidrólisis del éster carboxílico racémico
R2 R2

+
R1 OH R1 O3

R2
O O
R1 O3 Proteasa
o
Tampón de fosfato
O
R2 R2

R1 O3
+ R1 OH

O O

• El éster racémico (1-2 mmol) y el tampón de fosfato de potasio (0.1 M, pH 7.0, 5 mL) se homogenizan por
agitación.
• La enzima proteasa (50% p / p con respecto al sustrato para enzima sólida o 10-20% v / v con respecto a la mezcla de
solvente para enzima líquida) se agrega bajo agitación.
• La mezcla de reacción se mantiene a pH 7,0-9,0 ajustando con NaOH 1N.
• La temperatura de reacción típica es 20-35 o C y el tiempo de reacción es de 24-48 horas, dependiendo del sustrato.

• El producto de reacción se recupera por extracción o filtración.

Referencias

1) S T. Chen, W.-H. Huang, K.-T. Wang J. Org. Chem 1994, 59, 7580-7581.

2) DA Schichl, S. Enthaler, W. Holla, T. Riermeier, U. Kragl y M. Beller EUR. J. Org.

Chem 2008, 3506–3512

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