1.

En qué se basan las separaciones por Cromatografía de Líquidos de Alta

Resolución HPLC

2. Qué tipos de cromatografía se pueden llevar a cabo en un equipo HPLC

Hay cinco métodos cromatográficos:

 Cromatografía de Reparto:

o Cromatografía en fase normal.

o Cromatografía en fase reversa.

 Cromatografía iónica.

 Cromatografía de Exclusión.

 Cromatografía de adsorción.

3. Defina los sig. Términos: a) Cromatografía en fase normal, b)cromatografía en

fase inversa, c)Cromatografía isocrática, d) cromatografía por gradiente:

a) Cromatografía de fase normal: La cromatografía de fase normal o "Normal

phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el
campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a
su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil
apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El
compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de
absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en
comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.La fuerza de
interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de
interés, sino también en factores estericos de forma que los isómeros
estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización
de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención
de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a
aumentar el tiempo de retención.
b) Cromatografía de fase inversa: La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste
en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una
de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la
silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C 18H37 o
C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza
apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más
rápidamente.
 El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente apolar a la fase
móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofobicos. La
cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina
HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se
basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas
de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la
unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofóbico está
dominado por la disminución de laenergía libre de la entropía asociada con la
minimización de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofóbico
disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el
coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y
eluye.

Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la

retención. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un
tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun
así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie
del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retención aumenta con el área de
superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del
compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus
isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmóvil, otras modificaciones de la fase móvil

pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales
inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial, y como que la
entropía de la interfase compuesto-disolvente está controlada precisamente por la
tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.

Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del

compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el
fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH,
pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria
que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del
compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en
general mejoran la separación cromatográfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las
columnas de silica normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están
formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con
bases en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica
subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no
deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las
partes metálicas del aparato de HPLC.

c) Cromatografía isocrática: condiciones experimentales constantes, lo que

significa composición constante de la fase móvil ( polaridad constante) lo
que equivale a temperatura constante en cromatografía de gases
(separación isoterma; Elución isocrática; Utiliza una fase móvil de
composición constante
d) Cromatografía gradiente; Dos o mas disolventes de polaridad distinta cuya
relación cambia a lo largo de la elución cromatográfica

4. Describir los componentes básicos de un sistema HPLC y por lo menos 4 tipos

de detectores que se utilizan

Componentes básicos en un equipo de HPLC:

De forma esquemática los componentes básicos son:

Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador

Bombeo y conducciones de la fase móvil

SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MÓVIL:

Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para

desgasificar y eliminar partículas en suspensión de los disolventes que interfieren
formando burbujas en los sistemas de detección.

SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MÓVIL:

Se usan bombas para impulsar a la fase móvil y deben cumplir los siguientes
requisitos:

 Deben vencer altas presiones.

 Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.

 Deben estar libres de pulsaciones y tener volúmenes muertos pequeños.

 Deben estar construidas de materiales resistentes a la presión y a las

agresiones químicas.

 Fácil manejo y mantenimiento.

Se utilizan tres tipos de bombas :

 Bombas recíprocas

 Bombas de desplazamiento

 Bombas neumáticas.

INYECTORES:

Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma

reproducible y adecuada.

Hay dos tipos de inyectores

 Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite

mucha presión.

 Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en

el equipo cromatográfico y existen bucles intercambiables que permiten la
elección de tamaños de muestra.

PRECOLUMNAS

Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y los

contaminantes de los disolventes. La composición del relleno debe ser semejante al
de la columna. Aunque el tamaño de partícula es mayor para minimizar la caída de
presión. En muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la columna.

COLUMNA:

Normalmente son de acero inoxidable de diámetro interno uniforme aunque en

ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.

La mayoría de las columnas de cromatografía de líquidos tienen una longitud entre

10 y 30 cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando
dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm
y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10m.

Los empaquetados más comunes son de partículas de sílice pero también se usa la
alúmina, polímeros porosos y resinas de intercambio iónico.

La columna más utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de diámetro interno,

empaquetada con partículas de 5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000
platos/metro.

Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más
rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas.
Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se
rellenan con partículas de 3 o 5 m.A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden
tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo
consumo de disolvente característica muy importante ya que los disolventes de alta
pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros.

DETECTORES:

A diferencia de la cromatografía de gases, en HPLC no existen detectores tan

universalmente aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden
cromatografía de gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en los detectores de
cromatografía de gases.

En HPLC existen dos tipos básicos de detectores:

 Los basados en una propiedad de la disolución : Que corresponden a una

propiedad de la fase móvil, como el índice de refracción, la constante
dieléctrica, la densidad...

 Los basados en una propiedad del soluto : Es decir, responden a alguna de las
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad
de difusión, que no son propias de la fase móvil.

En la siguiente tabla se presentan los detectores más comunes empleados en HPLC

y algunas de sus propiedades más importantes:
Detectores más comúnmente usados en HPLC.

Paso a hacer una breve descripción de algunos de ellos:

 Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una

columna cromatográfica. Muchos detectores de absorbancia son
dispositivos de doble haz, uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el
otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las
intensidades de los dos haces se usan detectores fotoeléctricos
contrastados. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una
representación en función del tiempo del logaritmo del cociente de las dos
señales transducidas. También se utilizan instrumentos de un solo haz, en
cuyo caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la
memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la
absorbancia.

 Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un

detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de
excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de
mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente.

 Detectores de Índice de refracción : Los detectores de índice de refracción

tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son
detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografía
de gases. Se añade que son fiables,  no dependen del caudal, son muy
 sensibles a los cambios de temperatura, y  se han de mantener a una
temperatura constante. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría
de los otros detectores, y  por lo general no se pueden utilizar en la elución
con gradiente.

 Detector de dispersión de luz: El efluyente de la columna pasa a un

nebulizador donde se convierte en una fina niebla gracias a un flujo de
nitrógeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de conducción a una
determinada temperatura de forma que se evapora la fase móvil y se
originan partículas de analito. Estas partículas pasan a través de un láser y
por un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada
perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser más
sensible que el detector de índice de refracción.

 Detectores Electroquímicos: Actualmente hay varios tipos de detectores

electroquímicos, que se basan en cuatro métodos: amperometría,
voltamperometría, coulombimetría, conductimetría.

 Detectores por espectrometría de masas : Consiste en el acoplamiento de la

cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas. De forma general
se pueden obtener tanto cromatogramas a tiempo real como reconstruidos
por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.

5. Cuál es la ingestión diaria recomendada (IDR) de Ac, Ascórbico en su bebida

comercial y qué contenido de cafeína tiene reportado. Realice cálculos para
que al preparar su muestra, ésta se interpole en la mitad de la curva de
calibración