INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE OCCIDENTE

Departamento de Procesos Tecnológicos e Industriales

LABORATORIO DE CINÉTICA QUÍMICA Y

BIOLOGICA

Proyecto de cinética

“ESTUDIO CINETICO SOBRE LA HIDROLISIS DE UREA EN

PRESENCIA DE UREASA.”

Profesores:

Nicolás Hernández Gil

José Orozco González Aréchiga

Alumno:

Carlos Alberto Barajas González IQ693623

06/05/2016
Cinética Química
Primavera 2016
Resumen
Se estudió la cinética de la hidrolisis de la urea por medio de la enzima ureasa. La ureasa fue
preparada con el reactivo Jack Bean Meal el proceso de la preparación de la urea se encuentra el
anexo II. Se prepararon soluciones de fenol con nitroprusiato de sodio y NaOH con hipoclorito
de sodio, de igual manera se encuentran las instrucciones en el anexo II.

Se prepararon soluciones de urea a diferentes concentraciones donde evaluamos a 30°C con una
oscilación de +-1°C, usamos la técnica de espectrofotometría para evaluar el % de transmitancia
y por medio de la ecuación abs = 2 – Log (%T) obtuvimos la absorbancia que estas soluciones
poseían, donde por medio de una curva de calibración se obtuvo la concentración de amoniaco
de cada solución.

Se trabajo con el mecanismo de Michaelis Menten para encontrar las diferentes constantes como
k2 y km. Posteriormente se gráfica Lineweaver-Burk para obtener la regresión no lineal del
sistema trabajado estos resultados se pueden observar en la sección de resultados y discusión.

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Introducción

Las enzimas son conocidas como catalizadores biológicos, estás tienen proteínas de
alto peso molecular por lo que pueden acelerar fuertemente las reacciones con
especificidad exquisita. Las enzimas disminuyen la energía de activación de la reacción
por lo que toma menos tiempo en realizarse la reacción sin afectar el producto final de
la reacción.

Al reactivo en los procesos enzimáticos se le conoce como sustrato [S] que en este caso
el sustrato es urea. Las enzimas trabajan estabilizando el estado de transición del
complejo-ES; disminuyen la energía de activación. El incremento de velocidad aumenta
en un orden de 1010 a 1020[ CITATION Jos16 \l 2058 ].

La constante de reacción conocida como “k” puede incrementarse si la disminución en

la entalpía de activación o aumentando la entropía de activación, la “k” se refiere al
incremento de la velocidad de reacción.

El mecanismo de la acción enzimática tiene como efecto que aumenta el tiempo de

residencia de los sustratos reactivos donde favorece a que la probabilidad de choques
sea eficaz.

El mecanismo de Michaelis Menten explica cómo funcionan las reacciones enzimáticas.

Figura 1. Mecanismo de Michaelis Menten

La enzima con el sustrato forman el complejo enzima-sustrato; donde la cinética de las

reacciones quedaba como lo muestra la Figura 1. A partir del equilibrio que se forma
del complejo enzima-sustrato del mecanismo y de la suposición de que el paso limitante
es la descomposición del complejo ES, donde se llega a la ecuación de Michaelis
Menten:

Ecn.1

Km es la constante de Michaelis Menten que define la concentración de sustrato para la

velocidad inicial es igual a la mitad de la velocidad máxima.

Al momento de la linealización de este modelo se utiliza la gráfica de Lineweaver-Burk

por lo que se gráfica 1/ [S] vs 1/R.

La ecuación química con la que se trabajó para la hidrolisis de urea en presencia de

ureasa es la siguiente:

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H 2 NCON H 2 +3 H 2 O⃗
ureasaC O 2 +2 N H 4 OH

Objetivo

El objetivo principal de este estudio cinético es investigar cómo se comporta la cinética

enzimática de la hidrolisis de urea en presencia de ureasa. Como también encontrar los valores
de km y k2 del sistema trabajado.

Procedimiento experimental
Primero se generó una curva de calibración de amoniaco ya que es el producto que se pretende
conocer cuánto se generó. Se preparó la solución madre a 1M, a partir de la solución madre se
diluyo a 0.1, 0.08, 0.06, 0.04 y 0.02M.

Una vez listos los reactivos y las disoluciones de amoniaco se elaboró la curva de calibración.
Donde a cada disolución de amoniaco se le agregaron 2ml del reactivo 1 y del reactivo 2.
Después las disoluciones fueron incubadas a una temperatura de 50°C durante 10 minutos.
Finalizando los 10 minutos se buscó la longitud de onda adecuada en OCEAN OPTICS, donde
se encontró que la mejor longitud de onda fue de 650nm.

S utilizó el espectrofotómetro marca Bacharach Coleman 35 donde medimos %T y por medio

de la ecuación; Abs = 2-LOG (%T) obtuvimos la absorbancia de cada disolución ya
mencionadas, este procedimiento se realizó a 650nm. Antes de empezar a medir el % de
transmitancia se calibro con el tubo hach que solo contenía agua bidestilada asegurando que él
% de transmitancia fuera de 100.

Una vez formada la curva de calibración se preparó la solución madre 0.1M de urea donde se
agregó 4ml de esta solución, 2ml de reactivo 1 y 2, 40µl de ureasa. Esto se hizo para 5 tubos
hach donde se mantuvieron en baño María a 30°C (+-1°C) a 1, 3, 5, 7 y 9 min, terminando el
tiempo ya mencionado se midió %T de cada tubo hach.

A partir de la solución madre de 0.1M se prepararon otras disoluciones de 0.08, 0.06, 0.04, 0.02,
0.008 y 0.006M. A la solución de 0.08M se agregó 3.2ml de la disolución, 0.8ml del buffer y
2ml del reactivo 1 y 2, después se repiten los mismos pasos del baño maría y el %T. Para 0.06M
se agregaron 2.4ml de urea y 1.6ml de buffer las cantidades de los reactivos se mantienen fijas
todo el tiempo. Y se repite el mismo procedimiento que los demás y así hasta 0.006M. Por lo
que se mantiene la relación entre urea y buffer 1:5.

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Resultados y discusión
Se trabajó con los datos que arrojaron las disoluciones de 0.1, 0.08, 0.06, 0.04 y 0.02M ya que
en las disoluciones de 0.008 y 0.006M se percibía ruido en los datos y otro de los motivos fue
que el espectrofotómetro con el que se trabajo es decir el Bacharach Coleman 35 oscilaba
mucho al momento de la medición de % de transmitancia.

650 nm
NH3 (M) %T Absorbancia
0,00 0,00 ----
0,02 77,70 0,11
0,04 63,70 0,20
0,06 51,00 0,29
0,08 39,70 0,40
0,10 34,20 0,47
Tabla 1. Datos obtenidos de la curva de calibración

La tabla 1 muestra los datos que se obtuvieron dé % de transmitancia por el espectrómetro

Bacharach Coleman 35, la absorbancia se obtuvo a partir de la ecuación Abs = 2-LOG (%T).

0.50
0.45 f(x) = 4.59 x + 0.02
0.40 R² = 1
0.35
Absorbancia

0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
[NH3] M

Gráfica 1. Curva de calibración

La gráfica 1 arroja la ecuación que genero la curva de calibración con un ajuste de datos muy
buenos para el sistema ya que la R2 fue de 0.9951 y dando la ecuación y = 4.5907x + 0.0176
donde más adelante se usa esta ecuación para encontrar la concentración de urea que se produjo.

  0.1 M 0.08 M 0.06 M 0.04 M 0.02 M

T (s) [NH3] M [NH3] M [NH3] M [NH3] M [NH3] M
0,00 -0,0038 -0,0038 -0,0038 -0,0038 -0,0038
60,00 0,0279 0,0356 0,0368 0,0144 0,0092
180,00 0,0531 0,0440 0,0446 0,0369 0,0121
300,00 0,0593 0,0469 0,0461 0,0417 0,0138
420,00 0,0656 0,0527 0,0492 0,0411 0,0189
540,00 0,0688 0,0510 0,0589 0,0385 0,0215
Tabla 2. Datos de concentración de amoniaco con respecto al tiempo.

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La tabla 2 muestra como en el segundo 0 la concentración de NH 3 es negativa ya que estas
concentraciones fueron obtenidas con la ecuación de la gráfica de la curva de calibración. Ya
que la ecuación es lineal y se sustituyeron los valores para obtener la concentración da negativo
pero en la práctica en el tiempo 0 no existe ninguna concentración de NH 3. Se puede observar
que en el segundo 540 de 0.08M y 0.06M se observa que estos puntos deberían de estar al revés
es decir 0.0510 M en la disolución de 0.06M NH4 y 0.0589 M en la disolución de 0.08M NH3.

0.0800
0.0700
0.0600
0.0500
NH4 [M]

0.1M
0.0400
0.08M
0.0300 0.06M
0.04M
0.0200 0.02M
0.0100
0.0000
0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00
Tiiempo (s)

Gráfica 2. Tiempo vs NH3 [M]

Los datos crudos que arroja la gráfica 2 tienden a crecer con el tiempo por lo que entre
más pase el tiempo la concentración de amoniaco va creciendo hasta que llegue al punto
donde ya no se producirá más amoniaco ya que la urea presente en la solución se ha
agotado.

0
R M/s

0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
[S]

.1 M .06 M .04 M .02 M

Gráfica 3. [S] vs R

Los datos que presenta la gráfica 3 es comparando la concentración de sustrato contra la

velocidad de reacción que existo en cada molaridad. Se observa que no aparecen los 5 puntos
para cada molaridad ya que las funciones que modelan los datos al ser derivadas mostraban
funciones complicadas. Al momento de sustituir los datos para encontrar la R de cada tubo hach
las R resultaban negativas y estos puntos fueron eliminados ya que no existen. La corrida de los

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datos 0.08M fue eliminado de la gráfica ya que mostraba mucho ruido al analizar por lo que se
perturban los ejes y mostraba irregularidad con las otras molaridades. Las corridas de 0.008M y
0.006M fueron eliminadas ya que las concentraciones eran muy pequeñas no se podían analizar
objetivamente comparando con 0.1, 0.06, 0.04 y 0.02M por lo que se eliminaron de la
comparación.

.1 M .08 M .06 M .02 M .04 M

1000000000
100000000
10000000
1000000
1/R m/s

100000
10000
1000
100
10
0 50 100 150 200 250
1/[S]

Gráfica 4. Lineweaver-Burk

La gráfica 4 linealiza los datos de concentración de sustrato contra la velocidad de reacción

llamada Lineweaver-Burk. El eje “y” se reajusto a escala logarítmica base 10, ya que la corrida
0.04M es muy alta por lo que si se deja el eje “y” con los respectivos valores, los demás datos
de las otras corridas eran incapaces de leerse.

Los datos tienen ruido y eso dificulta modelar una ecuación sencilla por lo que estos datos no
muestran mucha información a analizar. Se tiene la sospecha que el espectrofotómetro usado
oscilaba demasiado por lo que los datos no muestran las mejores mediciones.

M km k2 [ureasa]/[urea]o
0,1 0,003668 1222,35 2,75E-06
0,08 0,027557 221500 3,44E-06
0,06 3,21E-05 3728,49 4,58E-06
0,04 0,040002 0,007273 6,88E-06
0,02 2,54E-06 383,348 1,38E-05
Tabla 3. Constantes de cada corrida (km y k2)

Para obtener las constantes km k2 de cada molaridad con la ecuación 1 se llegó a los diferentes
resultados donde se puede observar que no tienen ninguna tendencia entre las constantes ya sea
km o k2.

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250000 0.05
0.04
200000 0.04
0.03
150000
0.03
0.02
100000
0.02 k2
0.01 km
50000
0.01
0 0
2.00E-06

8.00E-06

1.40E-05
4.00E-06

6.00E-06

1.00E-05

1.20E-05

1.60E-05
[ureasa]/[urea]o

Gráfica 5. K2, Km vs Relación Ureasa-Urea

El eje “y” primario corresponde a k2 y el secundario a km. La gráfica 5 muestra que no existe
alguna tendencia entre la relación ureasa-urea contra las diferentes constantes km y k2, los datos
se muestran dispersos o en forma aleatoria.

Conclusión

Durante la experimentación observamos que la temperatura afecta consideradamente a nuestro

sistema, se trabajó con 30°C +-1°C pero hubo en ciertas corridas que la temperatura se disparó
hasta los 34°C por lo que se tuvo que volver a preparar esa solución para volver a medir la
concentración de NH3 producido. Los datos tenían mucho ruido y al momento de modelar una
ecuación que ajustará los datos, resultaban ecuaciones complicadas por lo que se sospecha que
existe cierto error en las gráficas 3 y 4.

Referencias
House, J. (2007). Principles of Chemical Kinetics. Illinois: Academic Press.

Natelson, S. (1957). Microtechniques of Clinical Chemistry for the Routine Laboratory.

Springfield: Charles C Thomas.

Orozco, J. (2016). Retrieved from Introducción a fermentación y catálisis enzimática:

http://cursos.iteso.mx/pluginfile.php/450187/mod_label/intro/6.0%20CQ6%20Int.
%20Ferment.%20y%20Cat%C3%A1lisis%20enzim%C3%A1tica%202016.pdf

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ANEXOS

Anexo I

Materiales

 Termómetro
 Kahn Shaker
 Espectrofotómetro Bacharach Coleman 35
 OCEAN OPTICS
 Termo-agitador
 Incubadora
 Gradilla de 12 tubos
 12 tubos hach
 4 pipetas de 10ml
 1 micro-pipeta de 100µl
 6 vasos precipitados de 250ml
 1 vaso precipitado de 500ml
 Matraz aforado de 25ml
 Matraz aforado de 500ml
 Matraz aforado de 1000ml
 Balanza analítica
 Kitasato
 Buchner flask
 Refrigerador
 Centrifugadora
 Fibra de vidrio

Reactivos

 Urea
 Amoniaco
 Buffer de acetatos pH 5.5
 Nitroprusiato de sodio
 Fenol
 NaOH
 Cloro comercial
 Jack Bean Meal
 Glicerina

Anexo II

Se preparó una solución buffer con pH de 5.5 de acetatos agregando 18g de acetato de sodio,
2ml de ácido acético aforando a 1 L.

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La disolución de ureasa contiene 30g de Jack Bean Meal y 50ml de H 2SO4. Esta disolución se
mezcló 20 min en Kahn Shaker, finalizado los 20 min se añadieron 150ml de glicerina como
vehículo y se mezcló agitar 15 min más. Una vez lista se reposo a 5°C aproximadamente
durante 24h. Una vez transcurrido el tiempo se puso en la centrifugadora a 20 min, donde por
ultimo esta solución se filtró 3 veces por fibra de vidrio.

Uno de los reactivos contenía 2.5g de fenol y 3mg de nitroprusiato de sodio aforando a 100ml
con agua bidestilada (reactivo 1), mientras el segundo reactivo se preparó con 2g de NaOH y
7.5ml de hipoclorito de sodio aforando a 100ml de agua bidestilada (reactivo 2). Los reactivos
se refrigeraron durante 24h a 5°C.

Anexo III

Diagrama

Se añadieron
Se prepararón 5 los respectivos Se llevo un tubo
Se agregaron Se añadieron Se midio el %
tubos hach de ml de la a 30°C durante
2ml del reactivo 40 µL de de
la solución solución como 1, 3, 5, 7 y 9
1 y 2. ureasa. transmitancia.
0.1M de urea. tambien del min.
buffer.

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