GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

SECUENCIACIÓN
Genética Medica
Integrantes:

 Ala Vallejos Leydi Micaela

 Churahuanca Vargas Andy

 Guevara Elwin Lorien

 Herrera Chura Yesenia Marahi

 Herrera Vargas Dayana Miriam

 Huanca Quispe Rosa María

 Mamani Alejandra Laura

 Mamani Jorge Fabio

 Quispe Mamani Oliver Bernabe

 Machaca Pérez Albert

Docente: olahir

Paralelo 1

Semestre 4°

Gestión 2019

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DEDICATORIA

Dedicado a todos aquellos que

hicieron posible para que llegáramos
a este punto sin su apoyo no lo
hubiéramos logrado.

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AGRADECIMIENTO

Agradecemos cordialmente al Dr. Olair

por ser nuestra guía en todo este
proceso de enseñanza, a nuestros
familiares por el apoyo y la paciencia en
el largo trayecto que exige nuestra
carrera.

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

RESUMEN

Uno de los avances más importantes en el desarrollo de la medicina

personalizada es sin duda la capacidad de leer lo que expresan nuestros genes.
Uno de los pioneros fue Fred Sanger, pionero en la secuenciación de ADN el
primer científico que desarrollo una técnica para leer nuestra información genética,
Frederick Sanger ganó el premio nobel de química en dos ocasiones. Los avances
de estas nuevas tecnologías de secuenciación del ADN permitirán grandes
avances en medicina por ejemplo podemos tratar las enfermedades con
farmacogenomica, adaptando las terapias a los pacientes según su información
genética. Desde tiempos muy remotos muchos científicos aportaron a su
identificación de la estructura del ADN y su composición, las bases moleculares de
la secuencian son una cadena desordenada de adenina, guanina, citosina, timina,
y uracilo de la cual para complementar se ponen diferentes tipos de nucleótidos
estos son los puntos más importantes del ADN y ARN para determinar la
secuencia de nucleótidos de un fragmento de diferentes longitudes, los
mecanismos de secuenciación tenemos por ejemplo el método de método de
sangre o de los dideoxinucleotidos se basa en sintetizar de forma secuencial una
hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple que se utiliza como
molde, en presencia de ADN polimerasa, los cuatro prime-deoxinucleotidos que
componen la secuencia de ADN. Se lleva acabo cuatro reacciones distintas en
tubos diferentes cada uno de los tubos va a contener una mezcla que contiene la
misma cadena molde, los tipos de secuenciación son secuenciación química que
es una nueva técnica de secuenciación molecular de ADN el procedimiento
determina la secuencia nucleótido de un ADN y otro es la secuenciación
enzimática, secuenciación con terminadores fluorescentes, secuenciación
automática, estos se utilizaron en el proyecto genoma humano. Otros métodos
que se aplicaron fue la aplicación de la secuenciación en genética consistió en el
análisis del genoma humano y su aplicación en pruebas genéticas en la medicina
y esto se llevara a cabo su posterior aplicación

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN................................................................................................7
2. JUSTIFICACIÓN.................................................................................................8
3. OBJETIVOS........................................................................................................8
3.1. OBJETIVO GENERAL..................................................................................8
3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS........................................................................9
4. MARCO TEÓRICO.............................................................................................9
4.1. HISTORIA.....................................................................................................9
4.2. BASES MOLECULARES DE LA SECUENCIACIÓN................................11
4.3. MECANISMOS DE SECUENCIACIÓN......................................................11
4.3.1. El método de sanger o de los dideoxinucleotidos...............................11
5. TIPOS DE SECUENCIACIÓN.......................................................................13
5.1. Secuenciación química..............................................................................13
5.2. Secuenciación enzimática..........................................................................14
5.3. Secuenciación con terminadores fluorescentes (dye‐terminator
sequencing)..........................................................................................................18
5.4. Secuenciación automática.........................................................................19
6. Proyecto Genoma humano:...........................................................................19
6.1. MÉTODO DE WHOLE GENOME SHOTGUN...........................................21
6.2. Métodos de secuenciado masivo...............................................................22
6.3. Pirosecuenciación:.....................................................................................22
6.4. El método consiste en 4 pasos:.................................................................23
6.5. PCR en emulsión (emPCR):......................................................................23
6.6. Illumina:......................................................................................................25
6.7. REACCIÓN DE LA SECUENCIACIÓN......................................................26
6.8. Amplificación y Reacción de secuenciación:.............................................26
6.9. Otros métodos............................................................................................28
6.10. APLICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓN EN GENÉTICA......................28
7. CONCLUSIÓN..................................................................................................30
8. ANEXOS...........................................................................................................31
9. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................32

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GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

INDICE DE ILUSTRACION

1. GRÁFICO Nº 1……………………………………………………………......12
2. GRÁFICO Nº 2…………………………………………………………...…...13
3. GRAFICO Nª 3…………………………………………………………......…14
4. GRAFICO Nº 4…………………………………………………………..….…15
5. GRAFICO Nº 5…………………………………………………….…….…….16
6. GRAFICO Nº 6……………………………………………………….…….….17
7. GRAFICO Nº7……………………………………………………….…….…..18
8. GRAFICO Nº 8…………………………………………………………….…..20
9. GRAFICO Nº 9…………………………………………………………….…..21
10. GRAFICO Nº 10…………………………………………………………….…24
11. GRAFICO Nº 11…………………………………………………………….…25
12. GRAFICO Nº 12…………………………………………………………….…27
13. GRAFICO Nº 13…………………………………………………………....…28
14. GRAFICO Nº 14……………………………………………………………....28
15. GRAFICO Nº 15………………………………………………………………29

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1. INTRODUCCIÓN
Uno de los avances más importantes en el desarrollo de la medicina personalizada
es sin duda, la capacidad de leer y comprender lo que dicen o expresan nuestros
genes. En otras palabras, realizar la secuenciación del ADN ha permitido no solo
conocer nuestra información genética, sino también predecir cuál es el riesgo de
padecer ciertas enfermedades o incluso, adaptar ciertos tratamientos en función
de nuestro genoma.

Fred Sanger, pionero en la secuenciación de ADN el primer científico que

desarrolló una técnica para poder leer nuestra información genética fue Frederick
Sanger, que recibió el Premio Nobel de Química en dos ocasiones (siendo la
cuarta persona en el mundo en conseguirlo, tras Marie Curie, Linus Pauling y John
Bardeen). Casi al mismo tiempo que Fred Sanger, dos investigadores (Allan
Maxam y Walter Gilbert) desarrollaron un método alternativo para la secuenciación
del ADN. De hecho, sus primeros resultados fueron publicados antes que el
artículo de Nature de Sanger, pero a la postre la mayor parte de laboratorios
elegirían el método de este último debido a su alta eficiencia.

Los problemas asociados al método de Sanger para realizar la secuenciación de

ADN eran variados, aunque como hemos dicho, ha tenido una importancia crucial
en la historia de la ciencia. Sin embargo, los investigadores cada vez buscan leer
el genoma de manera más rápida y barata, como comentábamos antes. Para ello
no podían permitirse hacer la secuenciación del ADN a trozos, sino que sería
mejor tratar de realizar la lectura de los genomas de manera completa. La
secuenciación masiva permitirá el despegue de la medicina personalizada.

Con este objetivo, han nacido las conocidas como técnicas de secuenciación
masiva, más conocidas en inglés como next-generation sequencing (NGS). Como
explican en este artículo sobre secuenciación del ADN, las nuevas plataformas se
distinguen por su capacidad de secuenciar millones de fragmentos de ADN de
forma paralela a un precio mucho más barato por base.

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

Los avances de estas nuevas tecnologías de secuenciación del ADN permitirán

grandes avances en la medicina. Por ejemplo, podremos tratar las enfermedades
con farmacogenómica, adaptando las terapias a los pacientes según su
información genética.

2. JUSTIFICACIÓN

El presente tópico se realizó con el fin de recabar información sobre el tema de la

secuenciación, para su mejor comprensión analizando y comprendiendo la historia
y el recorrido que tuvo, mejorando cada concepto y los distintos métodos que se
inventaron cada año para poder llegar así a un método fácil y económico para los
pacientes. Por lo tanto la secuenciación es muy importante ya que nos permite
relacionar enfermedades que estén ligadas a genes y que con el tiempo
probablemente una solución a una enfermedad. Así mismo es importante conocer
e informarse de todos esos procesos y tipos de secuenciación. De igual manera,
algunas investigaciones nos ayudaron a demostrar que estas secuenciaciones
ayudaran al campo medico ya que estos se basan en el campo médico,
descifrando el código genético en las bases nitrogenadas que estos también nos
ayudan a contribuir con las enfermedades degenerativas como el cáncer estas
secuenciaciones al descifrar el código genético son aun avances que recién inician
y lo cual nos llevara a resultados excelentes en el campo médico.

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

 Determinar la aplicación, usos y funciones de la secuenciación en el campo

de la genética, basados en la recopilación de datos científicos que nos
permitan sentar los fundamentos necesarios para su comprensión.

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3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Examinar información obtenida de diferentes fuentes, que nos permitirán

conocer las bases del desarrollo de la secuenciación.

 Dar a conocer las bases fundamentales de la secuenciación para

comprender el sentido de su estudio.

 Informar al lector sobre las aplicaciones y los usos de la secuenciación en

base a la información obtenida de diferentes fuentes científicos, con el fin
de recabar datos informativos para la identificación de la aplicación, usos y
funciones del mismo.

4. MARCO TEÓRICO

4.1. HISTORIA

Para poder de manera más detallada acerca de cómo nace la secuenciación

iremos recopilando las fechas más relevantes:

1871 Johan Friedrich Miescher descubre unas moléculas ricas en fosfatos las
cuales denominó como Nucleínas, para esto analizó restos médicos y esperma de
salmones.

Hasta este momento se pensaba que las moléculas de la herencia eran las
proteínas.

1952 Rosalind Franklin y Maurice Wilkins desarrollan estudios de cristalografía de

rayos X del AND.

1953 James Watson y Francis Crick "proponen" el modelo de la doble hélice del
AND.

1958 Matthew Meselson y Franklin Stahl contradicen a Watson y Crick con

respecto al proceso de replicación.

1977 Allan Maxam y Walter Gilbert, y Frederick Sanger y otros, modificando

métodos para la determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN.

pá g. 9
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1978 F. Sanger y su equipo informan sobre la secuencia genómica completa del

virus øX174.

1979 Kary B. Mullis le vende el alma al diablo y crea la reacción en cadena de la

polimerasa, en 1993 recibe el Nobel en Química.

1981 Se reporta la secuencia del genoma de la mitocondria humana.

1983 (Su profesor no había nacido) Marvin Carruthers y Leroy Hood modificaron
un método para secuenciar automáticamente fragmentos de ADN de 5 a 75 pares
de bases.

1986 Leroy Hood y Lloyd Smith detectaron el primer secuenciador automático, que
usa un láser que reconoce los marcadores de fluorescencia en el ADN.

1990 Tres grupos controlados automáticamente el método de electroforesis

capilar, que optimiza la automatización de los métodos de secuenciación del ADN.

1995 Se reporta la primera secuencia completa del genoma de un organismo vivo,

el de la bacteria Haemophilus influenzae.

1996 Se reporta la primera secuencia del genoma de un eucarionte, el de la

levadura Saccharomyces cerevisiae.

1998 Se reporta la primera secuencia del genoma de un animal; el de

Caenorhabditis elegans.

1999 Se reporta la secuencia nucleotídica del cromosoma humano 22.

2000 Se reporta la primera secuencia del genoma de una planta, el de Arabidopsis

thaliana.

2001. Se reporta por dos grupos en forma simultánea, la secuencia nucleotídica

del genoma humano.

2002. Se reportan las secuencias nucleotídicas de los genomas del ratón

(Musmusculus) y del arroz (Oryza sativa).

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4.2. BASES MOLECULARES DE LA SECUENCIACIÓN

Es una cadena desordenada de adenina, guanina, citosina, timina y uracilo, de la

cual para complementar se ponen diferentes tipos de nucleótidos.

A esto se le conoce como los puntos más importantes del ADN o ARN para
determinar la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN o ARN. En la
secuenciación de Sanger, el ADN blanco es copiado muchas veces y se hacen
fragmentos de diferentes longitudes.

Así de esta manera la secuencia informara la clase de información genética que

se transporta en un segmento específico de ADN. Además, y de manera muy
importante, los datos de las secuencias pueden resaltar los cambios en un gen
que pueden causar enfermedades.

En la doble hélice de ADN, las cuatro bases químicas se unen siempre con la
misma pareja para formar "pares de bases". Adenina (A) siempre forma pareja con
timina (T); citosina (C) siempre forma pareja con guanina (G). Este
emparejamiento es la base para el mecanismo mediante el que las moléculas de
ADN se copian cuando las células se dividen, y también es la base para los
métodos usados en la mayoría de los experimentos de secuenciación de ADN. El
genoma humano contiene alrededor de tres mil millones de pares de bases que
detallan las instrucciones para crear y mantener a un ser humano.

4.3. MECANISMOS DE SECUENCIACIÓN

4.3.1. EL MÉTODO DE SANGER O DE LOS DIDEOXINUCLEOTIDOS

Se basa en sintetizar de forma secuencial una hebra de ADN complementaria a

una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en presencia de ADN
polimerasa, los cuatro dos prima-deoxinucleotidos que componen la secuencia de
ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP,
ddCTP y ddTTP), estos últimos nucleótidos especiales o de parada, están bien
diseñados para que parescan del grupo 3 prima-OH, que permite la adición de
nucleótido consecutivo de forma que cuando uno de ellos es incorporado por la
polimerasa se interrumpe la síntesis de la nueva hebra. Esto lleva a que obtengan

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

fragmentos secuenciados de diferente tamaño según donde se incorpore los

dideoxinucleotidos de este modo y tras una simple electroforesis (separa las
biomoléculas en un campo eléctrico), y así se va a poder observar la secuencia.

PROCESO: Se lleva acabo cuatro reacciones distintas en tubos diferentes cada

uno de los tubos va a contener una mezcla que contiene la misma cadena molde
(ADN de simple cadena), el ADN polimerasa un cebador marcado reactivamente,
los cuatro nucleótidos normales (dNTP) y uno de los cuatro dideoxinucleotidos
(ddNTP). Así el cebador por complementariedad se une a la hebra molde
favoreciendo su reconocimiento por el ADN polimerasa y el inicio de la síntesis de
la nueva hebra. El ADN polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que, de forma
aleatoria, incorpora el dNTPs, por ejemplo, el ddATP (cada uno de los tubos
contiene un ddNTP distinto) y se interrumpe la síntesis. De esta forma el tubo va a
aparecer fragmentos secuenciados de diferentes tamaños e interrumpidos por el
ddNTP del mismo tipo. En el segundo tubo habrá una mezcla de fragmentos
secuenciados interrumpidos por otro ddNTP (por ejemplo, ddGTP), en el tercero
por otro (ddCTP) y en el último (ddTTP) finalmente, tras separar en función del
tamaño y gracias al cebador marcado radiactivamente, se van a poder contemplar
diferentes bandas que van a poder ser traducidas en diferentes nucleótidos.

GRAFICO Nº 1

pá g. 12
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

El método sanger se basa en sintetizar una hebra de ADN

complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza
como molde).

5. TIPOS
DE SECUENCIACIÓN

5.1. SECUENCIACIÓN QUÍMICA

Es una nueva técnica de secuenciación molecular de ADN el procedimiento

determina la secuencia nucleotídica de un ADN marcado radioactivamente en un
extremo, cortándolo con agentes químicos en cada una de las bases.

El corte parcial de cada base, genera un set de fragmentos marcados desde el

extremo marcado hasta la base dónde fueron clivados. Utilizando geles de
poliacrilamida y separando dichos fragmentos por tamaño, es posible determinar
la secuencia de esta molécula, este tipo de método propuesto estaba limitado por
la capacidad de resolución de los geles de poliacrilamida, y en este primer artículo
muestran la posibilidad de secuenciar 100 bases de ADN. El método utilizaba 4
reacciones químicas. Una reacción química produce cortes específicamente en
Citosinas (18M hidracina, 2M NaCl. Una reacción con 50 mM dimetil‐sulfato corta
en Adeninas y Guaninas; si luego de este tratamiento químico se calienta la
reacción a 90ºC a pH neutro, entonces se obtiene un patrón de bandas intenso
para las guaninas y tenues para las adeninas. Por el contrario, el tratamiento
posterior a un pH ácido provoca un patrón inverso (bandas intensas de adeninas y
tenues de guaninas).

GRAFICO Nº 2

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GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

se muestra el patrón de bandas obtenido durante la secuenciación de

un fragmento de 64 bases (mostrado en el artículo de 1977).
5.2.
S
ECUENCIACIÓN ENZIMÁTICA.

En diciembre de 1977 se publica el trabajo de Sanger, Nicklen y Coulson que

propone un nuevo método para determinar las secuencias de bases en una
molécula de ADN. Sanger y Coulson habían ya publicado dos años antes, un
método de secuenciación (método más‐menos) a partir del cual habían logrado
obtener dos secuencias de 70 bases del bacteriófago φX174. La dificultad en la
interpretación de los resultados y algunos errores que podían ocurrir en la
secuencia hicieron que Sanger y sus colaboradores siguieran trabajando para
mejorar los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos.

Así, el método propuesto por Sanger en 1977 se convirtió en el método más

utilizado de secuenciación de ácidos nucleicos hasta la actualidad. La
incorporación de mejoras en los aspectos tecnológicos y metodológicos
(automatización, métodos de detección, electroforesis capilar, etc.) permitieron,
como hito fundamental, la secuenciación del genoma humano (finalizado en el año
2003) por este método. En 1980 Frederick Sanger obtuvo su segundo premio
Nobel en Química por la invención de este método (ver recuadro). Recién en
2005, con la aparición de los secuenciadores 454 se dio un cambio en la
tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos. Aun así, muchas de las nuevas
tecnologías de secuenciación masiva utilizan el principio de nucleótidos
terminadores, descrito por Sanger, como veremos más adelante en los
secuenciadores de Illumina.

pá g. 14
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

El método enzimático de Sanger, utiliza un ADN polimerasa e inhibidores que

finalizan la cadena de ADN que está siendo sintetizada en lugares específicos,
particularmente utiliza dideoxinucleótidos (es decir nucleótidos que en su carbono
3´ no contienen el grupo hidroxilo. La incorporación de una base con estas
características en una molécula naciente de ADN impide que una nueva base
pueda incorporase y la síntesis de ADN es interrumpida.

GRAFICO Nº 3

Estructura de un nucleótido (ej. dATP) y un di‐

deoxinucleótido (ddATP).

GRAFICO Nº 4

pá g. 15
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

Esquema de mecanismo de síntesis de ADN (1), y (2) imposibilidad de

continuar elongación de cadena naciente luego de la incorporación de un
didoxinucleótido.

“Debido a que el ddT no contiene grupo 3’ hidroxilo, la cadena no puede continuar

extendiéndose, entonces la terminación ocurre específicamente en las posiciones
dónde dT debería haberse incorporado. Si un cebador y un molde son incubados
con ADN polimerasa en presencia de una mezcla de ddTTP y dTTP, así como los
otros tres deoxiribonucleosidos trifosfato (uno de ellos marcado radiactivamente
con 32p), se obtiene una mezcla de fragmentos todos con el mismo extremo 5´ y
con residuos ddT en el extremo 3´. Si esta mezcla es fraccionada por
electroforesis desnaturalizante en geles de acrilamida el patrón de bandas
muestra la distribución de los residuos Timina en el ADN sintetizado. Utilizando
terminadores para cada uno de los cuatro nucleótidos en reacciones
independientes, y corriendo cada mezcla en paralelo en el gel, se obtiene un
patrón de bandas a partir del cual se puede leer la secuencia de bases”.

GRAFICO Nº5

Esta imagen se encuentra en la Nobel Lecture de F. Sanger de

1980. En la misma se ejemplifica el principio del método de
dideoxinucleótidos terminadores.
pá g. 16
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

GRAFICO Nº 6

Esta imagen corresponde a la segunda figura del artículo de Sanger (PNAS, 1977). Se trata
de un autoradiografía dónde se muestra la migración de las cuatro diferentes mezclas (una
para cada dideoxinucleótido terminador utilizado). A la derecha de la imagen se leen las
secuencias de ADN (en este caso un fragmento del bacteriófago φX174. Las lecturas se
realizan de abajo (fragmentos más pequeños) hacia arriba (más grandes), de acuerdo a la
aparición de las bandas. La resolución del gel, permite separar bandas de 1 nucleótido de
diferencia en tamaño.

5.3. SECUENCIACIÓN CON TERMINADORES FLUORESCENTES (DYE‐TERMINATOR

SEQUENCING).

En 1986 Hood y colaboradores, en colaboración con Applied Biosystems (ABI)

publican el primer reporte de automatización de la secuenciación de ADN, que
establece la secuenciación con terminadores fluorescentes como variante del
método de Sanger. Está variante utiliza una molécula fluorescente diferente unida
a cada dideoxinucleótido, y permite realizar la reacción en un único tubo.
Asimismo, la secuencia puede ser leída a través de un computador. Las
secuencias obtenidas, con esta nueva variante eran de un largo de entre 500 y
1000 nucleótidos.

GRAFICO Nº 7

pá g. 17
GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

En esta figura se ejemplifica como en lugar de 4 carriles (uno para cada base)
(a), se corren todas las reacciones en un único carril del gel (cada color
representa una base) (b) y se desarrollan algoritmos para convertir esas señales
en “electroferogramas” que representan la secuencia de ADN (c). La flecha a la
izquierda indica la dirección de lectura 5’‐3’.

5.4. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

Con este tipo de secuenciación se demuestra el poder de la secuenciación

automática con el desarrollo de la estrategia EST (expressed sequence tag) para
el descubrimiento de genes. Esta estrategia consiste en hacer copias de ADN a
partir del ARN mensajero celular (ADNc=ADN copia) y clonarlas de forma aleatoria
para luego secuenciar. En 1991, con esta estrategia, Venter reporta 337 genes
humanos no conocidos. La base de datos de EST contiene hoy más de 43
millones de secuencias correspondientes a 1300 organismos diferentes.

6. PROYECTO GENOMA HUMANO:

La secuenciación del genoma humano se volvió un objetivo realizable una vez

establecidas las metodologías de secuenciación de ADN. La discusión formal
comenzó en 1985 en Estados Unidos. En 1990, se presentó un proyecto de 5

pá g. 18
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

años en el congreso de Estados Unidos (Human Genome Project). Se estimaba

que el proyecto duraría 15 años y el costo rondaría los 3 mil millones de dólares.
El proyecto establecía el objetivo de mapear y secuenciar diferentes organismos
modelo además de humano. Entre ellos E. coli, S. cerevisiae, C. elegans, D.
melanogaster y el ratón (Mus domesticus). El proyecto se convirtió en un esfuerzo
de colaboración internacional entre diversos centros de secuenciación en Estados
Unidos, Europa y Japón. Cada centro se focalizó en regiones particulares del
genoma, que permitieran obtener un mapa. En 1994 se publicó un mapa detallado
del genoma humano que incluía el mapeo de 5840 loci con una media de
espaciado de 0,7 cM (1 centiMorgan = 106 bases).

En 1998, el proyecto público, compitiendo ahora con la empresa Celera (propiedad

de Craig Venter) adopta los secuenciadores capilares de Applied Biosystems
(ABI3700).

En 1999 el proyecto Genoma humano había secuenciado más de mil millones de

bases y se publicó la secuencia completa de un cromosoma humano (el
cromosoma 22).

Para el mismo tiempo, Celera, comenzó a secuenciar el genoma humano con la

estrategia de “whole genome shotgun sequencing” desarrollada por C. Venter
(explicada más adelante). La secuenciación comenzó en setiembre de 1999 y en
junio de 2000 se realizó un ensamblaje inicial de las secuencias obtenidas. Los
datos de Celera permitieron el ensamblaje del genoma humano con una cobertura
de 5X (ver Cobertura). Además, se aumentó la cobertura 3X con los datos
públicos.

GRAFICO Nº 8

pá g. 19
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

Cobertura (Coverage):

La cobertura es el número promedio de secuencias que

representan a un determinado nucleótido en la secuencia total
reconstruida. Puede ser calculada a partir del largo original del
genoma (G), el número de secuencias (N) y el largo promedio de
las secuencias (L) como:

Cobertura = N x L/G

Ejemplo. Un genoma hipotético de 2000 bases, secuenciado con

24 secuencias de 350 bases de promedio de largo tiene una
cobertura de:

24 x (350/2000) = 4,2 X.

6.1. Este valor significa que el genoma fue secuenciado 4,2 veces. MÉT
ODO
Cuánto mayor cobertura, menor posibilidades de errores en la DE
secuencia final.

WHOLE GENOME SHOTGUN

El método de Whole Genome Shotgun consiste en la fragmentación al azar del

ADN de todo el genoma, clonarlo en plásmidos y secuenciar ambas hebras (el
paso de clonado luego fue eliminado). Una vez obtenidas, las secuencias se
alinean y ensamblan para formar contigs basándose en las secuencias que
solapan. El método fue utilizado por Sanger en 1982 para ensamblar el fago
lambda (48,5 kb), sin embargo, Venter fue el primero en utilizarlo para secuenciar
un genoma de mayor tamaño (H. influenzae, 1,8Mb) y proponerlo como estrategia
para secuenciar el genoma humano. Esquema de secuenciación con la estrategia
de Shotgun. Secuenciación de fragmentos errados al azar y ensamblaje de la
secuencia utilizando procesamiento informático.

En 1995, Venter y su grupo deciden utilizar nuevas herramientas computacionales,

así como los métodos mejorados de secuenciación para realizar la primera
secuencia de un organismo de vida libre (Haemophilus influenzae). En TIGR

pá g. 20
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

analizar más de 50 genomas microbianos. Venter y alguno de sus colaboradores,

comenzaron entonces la secuenciación de genomas de mayor tamaño (mosca,
rata, ratón).

En 2006 se fundó el J. Craig Venter Institute (JCVI) por la unión de varias

organizaciones (TIGR, TCAG,

JCVSF, etc.). Se trata de una organización líder en genómica a nivel mundial con
más de 400 científicos

GRAFICO Nº 9

Esquema de secuenciación con la estrategia de shotgun.

Secuenciación de fragmentos generados al azar y ensamblaje de
la secuencia utilizando procesamiento informático.
6.2. MÉT
ODO
S DE
SECUENCIADO MASIVO

Pasaron cerca de 30 años desde la publicación del método de Sanger, hasta que
apareciera una nueva tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos que no
fuera el método de dideoxinucleotidos terminadores. La principal característica de
estas nuevas metodologías es la posibilidad de secuenciado masivo de forma
paralela, esto significa que el número de secuencias obtenidas durante una corrida
supera muchas veces el máximo de 96 secuencias por corrida que se obtienen
con los secuenciadores capilares de última generación que utilizan el método de
secuenciado de Sanger.

pá g. 21
GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

A partir del desarrollo del método de pirosecuenciación (primer método de

secuenciado masivo utilizado, 2005), surgen nuevas alternativas de secuenciación
que utilizan el mismo principio de dideoxinucleotidos terminadores en sus
protocolos, aunque con mejoras innovadoras.

Estos nuevos métodos de secuenciado masivo no ofrecen lecturas tan largas

como el método clásico de Sanger, aunque en pocos años se ha mejorado
sustancialmente el largo de las secuencias obtenidas y en algunos casos alcanzan
longitudes comparables a Sanger.

6.3. PIROSECUENCIACIÓN:

El primer método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS),

fue publicado en 2005 en Nature, y llevado al mercado por la empresa 454 (luego
adquirida por Roche). El resumen de este artículo explica: “Describimos un
método escalable, un sistema de secuenciación altamente paralelizable con un
rendimiento significativamente mayor que los instrumentos de electroforesis
capilar. El aparato permite secuenciar 25 millones de bases, con 99% de precisión
en una corrida de 4 horas” (este rendimiento es 100 veces superior a la cantidad
de bases secuenciadas en ese tiempo en un secuenciador de 96 capilares).

En el primer artículo, publican la secuenciación de novo del genoma de

Mycoplasma genitalium alcanzando cubrir el 96% del genoma y con una precisión
de 99,96% en una corrida.

6.4. EL MÉTODO CONSISTE EN 4 PASOS:

1. Fragmentación del ADN (o ARN).

2. Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos.
3. Amplificación clonal (mediante PCR en emulsión).
4. Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación
optimizado en un soporte sólido y en escala de picolitros.

Más en detalle, luego de fragmentar el ADN, se ligan oligonucléotidos adaptadores

a cada extremo del ADN. Estas secuencias adaptadoras comunes a todos los
fragmentos serán utilizadas, tanto para ligar cada fragmento a las esferas, como

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

secuencias donde se unirán los cebadores de la PCR y además presenta la

secuencia donde se unirá el cebador de secuenciación. Una vez ligados los
adaptadores, se ligan a las beads (esferas que contienen el complementario a uno
de los adaptadores en su superficie), por un método de dilución límite, de modo de
obtener un único fragmento unido a una esfera. Se busca, entonces, obtener en
cada bead un único fragmento de ADN, el mismo es amplificado mediante PCR en
emulsión.

6.5. PCR EN EMULSIÓN (EMPCR):

La PCR en emulsión permite realizar en un único tubos miles de reacciones de

PCR independientes. Una vez obtenida la librería de fragmentos que serán
secuenciados, se unen a esferas que contienen uno de los adaptadores presentes
en los fragmentos, de modo de obtener un único fragmento por esfera. Luego la
población de esferas (cada una con un fragmento de ADN) es emulsionada en una
mezcla de agua y aceite, de modo tal de obtener micelas de aceite independientes
cada uno de ellos con una única esfera y con todos los reactivos necesarios para
llevar adelante la reacción. El resultado final, son miles de microreactores dónde
se lleva adelante la reacción de PCR de forma independiente.

GRAFICO Nº 10

Esquema de la PCR en emulsión. (1) Se liga a cada bead un fragmento mediante las
secuencias complementarias a uno de los adaptadores que se encuentran en la
superficie de las mismas. (2) Se realiza una emulsión (agua‐aceite) de tal forma que
en cada gota de aceite encontremos una única bead unida a un único fragmento y
encontramos además todos los reactivos necesarios para llevar adelante la PCR
(dNTPs, Polimerasa, cofactores). (3) Luego se realiza una PCR convencional, pero en
pá g. 23
cada tubo de reacción se realizan simultáneamente miles de reacciones en paralelo.
(4) Luego de n ciclos de reacción, se obtiene una amplificación clonal de cada
fragmento unido a una bead.
 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

Luego de finalizada esta reacción, se rompe la emulsión y se recuperan las beads

que presentaron amplificación. Las mismas son depositadas en la placa de
secuenciación. Esta placa (picoTiter plate), tiene 1,6 millones de pocillos, y en
cada uno de ellos sólo puede entrar un bead (Figura 11). En cada pocillo sucederá
una reacción de secuencia, por lo cual en la placa podemos decir que tenemos 1,6
millones de secuenciadores de 1 capilar, o 16000 secuenciadores de 96 capilares
aproximadamente.

GRAFICO Nº 11

Pico‐Titre plate. Arriba: esquema de deposición de esferas en

6.6. los pocillos. Abajo: micrografía electrónica de los pocillos y
ejemplo de carga de una placa.

ILLUMINA:

La segunda tecnología de secuenciación masiva que salió al mercado (2006) fue

la de Solexa (luego adquirida por Illumina). En esta tecnología, se utilizan
nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes al igual que en la
Secuenciación de Sanger. Además de la paralelización masiva (es decir la
capacidad de realizar millones de secuencias en cada corrida), la diferencia con el
método convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

obtenida la imagen, y desbloquear carbono 3’ de modo que pueda aceptar una

nueva base para continuar la reacción de secuenciación, haciendo que la
incorporación de un nucleótido terminador sea reversible. En este caso, las
longitudes obtenidas son menores que los secuenciadores 454 (en la actualidad
hasta 150 bases), sin embargo, la capacidad de realizar secuencias en paralelo es
mucho mayor que en 454 (hasta 250 millones de secuencias). Como resultado es
posible obtener hasta 6 x 1012 en una sola corrida. Para dimensionar este
número, el genoma humano tiene aproximadamente 3 x 109 bases de largo.

Al igual que el método de secuenciación de Roche, los primeros pasos consisten

en la fragmentación del ADN y ligación de adaptadores. Luego hay un paso de
amplificación (en este caso, la amplificación es en una superficie sólida: “flow cell”,
dónde también se dará luego la reacción de secuenciación).

6.7. REACCIÓN DE LA SECUENCIACIÓN

Este método no utiliza nucleótidos terminadores. En este caso, se realizan ciclos

dónde se ofrece en cada pocillo una base por vez, secuencialmente. Durante la
incorporación de una base en una molécula naciente de ADN se libera pirofosfato,
el pirofosfato liberado se convierte en luz mediante dos procesos enzimáticos. La
luz emitida en cada pocillo, dónde se incorporó la base ofrecida, es monitoreada
por la detección luminométrica de la liberación del pirofosfato durante la reacción
de síntesis. Una cámara CCD colecta los datos de cada base, en cada ciclo y en
cada posición.

En el caso de homopolimeros (tractos de secuencia con el mismo nucleótido), el

largo del homopolimero es determinado a partir de la cantidad de pirofosfato
liberado (proporcional a la cantidad de bases incorporada).

GRAFICO Nº 12

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Esquema de reacción de pirosecuenciación.

 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

6.8. AMPLIFICACIÓN Y REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN:

En el primer paso, la librería se deposita en la flow cell por complementariedad

con los adaptadores (1). Luego se produce la amplificación en puente (2 y 3) en
sucesivos ciclos (4,5,6,7,8) hasta obtener un cluster con la amplificación clonal del
fragmento inicial (8).

GRÁFICO Nº 13

Amplificación en puente.

En la reacción de secuenciación, se
bloquea uno de los adaptadores (1), y se comienza la reacción de secuenciación
desde el otro extremo (2) mediante un cebador específico

GRAFICO Nº 14

Reacción de secuenciación de Illumina.

Durante la reacción, a diferencia de

la pirosecuenciación, se ofrecen los cuatro nucleótidos terminadores marcados
cada uno con un fluorocromo diferente (1), al igual que el método de Sanger.
Luego de un lavado (2), se obtienen las imágenes y se obtiene la primera base de
cada cluster (3). Luego, se elimina el fluorocromo y se desbloquea el Carbono 3,
permitiendo que un nuevo nucleótido pueda extender la cadena de ADN naciente

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

(4). Otra vez los cuatro nucleótidos terminadores marcados son ofrecidos a los
clusters, comenzando un nuevo ciclo.

GRAFICO Nº 15

Reacción de secuenciación de Illumina. Primer ciclo de

secuenciación (1), incorporación de dideoxinucleótidos
marcados (2), adquisición de imagen (3), y lavado,
desbloqueo, y eliminación de marcado (4).

6.9.
OTROS
MÉTODOS

Algunas de estas tecnologías (SMRT, Helicos) proponen la secuenciación a partir

de una única molécula de ADN en tiempo real. Una de ellas (Pacific Biosciences)
en teoría no tiene límite en cuánto al largo de las secuencias generadas y
eventualmente podría secuenciar cromosomas enteros en una única lectura.

Otras, como Oxford nanopore e Ion Torrent (recientemente lanzada al mercado)

ofrecen novedosas soluciones y no requieren marcación fluorescente ni cámaras
registradoras de imágenes. En particular, Ion Torrent (ver recuadro J. Rothberg),
se basa en el registro de los cambios de pH producidos durante la incorporación
de bases durante la síntesis de ADN. Se trata de micropHímetros que reducen
notablemente los costos de secuenciación.

6.10. APLICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓN EN GENÉTICA

El análisis del genoma humano y la aplicación de las pruebas genéticas en

medicina se remontan a finales de los años 50 del pasado siglo. El análisis de los

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

cromosomas (citogenética) ha sido la prueba clásica para el estudio del cariotipo,

que con una resolución de 400 a 550 bandas permite detectar reordenamientos
cromosómicos y anomalías mayores de 5 a 10 megabases en cualquier lugar del
genoma. El análisis cromosómico ha permitido diagnosticar trastornos como el
síndrome de Down (trisomía 21) o el síndrome del maullido del gato (deleción del
cromosoma 5p). La determinación del cariotipo permitió incorporar el genoma en
el conocimiento médico, en la praxis clínica y en la medicina de laboratorio. Sin
embargo, a pesar de representar el genoma completo, el nivel de resolución
microscópico del cariotipo no alcanza el plano molecular de la secuencia del ADN,
lo cual limita de forma marcada su capacidad para el diagnóstico genético del
conjunto de enfermedades y síndromes genéticos. En los últimos 10 años la
capacidad de análisis genético y genómico ha avanzado espectacularmente,
pasando del análisis de los cromosomas y regiones del genoma subcromosómicas
a la determinación de la secuencia molecular del gen mediante la secuenciación
Sanger o del conjunto de genes empleando la secuenciación masiva de nueva
generación (NGS, next generation sequencing). La incorporación en el análisis del
genoma y en la medicina clínica de los microarrays de cromosomas o cariotipo
molecular permite escudriñar en las variantes genéticas de número de copia
mediante la comparación del ADN genómico del paciente con una muestra de
referencia. Ello permite detectar de forma rápida y eficiente las delaciones y las
duplicaciones

Tal vez hayas oído que se están secuenciando genomas. Por ejemplo, el genoma
humano se finalizó en 2003 después de un esfuerzo internacional de muchos
años. Pero, ¿qué significa secuenciar un genoma o incluso un pequeño fragmento
de ADN?

La secuenciación de ADN es el proceso que determina la secuencia de bases de

los nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN. Hoy en día, con el
equipo y los materiales adecuados, secuenciar un fragmento pequeño de ADN es
relativamente sencillo.

Secuenciar un genoma completo (todo el ADN de un organismo) sigue siendo una

tarea compleja. El proceso requiere romper el ADN del genoma en muchos

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 GENÉTICA MEDICA (SECUENCIACIÓN)

pedazos más pequeños, secuenciar dichos pedazos y ensamblar las secuencias

en una única y larga "secuencia consenso". Sin embargo, gracias a nuevos
métodos que se han desarrollado en las últimas dos décadas, ahora secuenciar un
genoma es mucho más rápido y menos costoso de lo que resultó en el Proyecto
Genoma Humano11start superscript, 1, end superscript.

En este artículo, revisaremos los métodos que se usan para secuenciar el ADN.
Analizaremos principalmente un método bien establecido, la secuenciación de
Sanger, pero también analizaremos nuevos métodos ("de nueva generación")

7. CONCLUSIÓN
La secuencion es un proceso que comprende diferentes etapas complejas que
tiene como objetivo final la identificación de los nucleótidos que complementan la
secuencia de una cadena de ADN.

El objetivo es llevado a cabo por diferentes tipos de secuencion, dentro del cual el
más conocido es el método de Sanger que complementa los nucleótidos sobre la
base de una cadena simple.

Dentro de los aspectos más relevantes para la aplicación de la secuencion está la

aplicación en la genética con el análisis del genoma humano, citogenética,
determinación del cariotipo, farmacogenetica, tratamiento de enfermedades
genéticas y diagnóstico genético de diferentes enfermedades genéticas. Los
procesos de determinación de la secuenciación nos permitirán estructurar los
conocimientos necesarios para las diferentes aplicaciones en la genética.

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8. ANEXOS

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9. BIBLIOGRAFÍA
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de Biología Molecular. Instituto Pasteur Montevideo.
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clinical practice: From karyotype to genome sequence. Annu Rev
Genomics Hum Genet, 16 (2015), pp. 309-326
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Grondona, R. Miró Ametller, E.F. Tizzano Ferrari, et al. Array CGH como
primera opción en el diagnóstico genético: 1.000 casos y análisis coste-
beneficio. An Pediatr (Barc), 89 (2018), pp. 3-11
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Rivera, et al. Clinical exome sequencing for genetic identification of rare
mendelian disorders. JAMA, 312 (2014), pp. 1880-1887
 Secuenciacion de los acidos nucleicos Rosalia De Necochea Campion
Juan Carlos Canul Tec Cuernavaca junio 2004.

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