ESCUELA DE

QUÍMICA

ESPECTROMETRÍA DE
FLUORESCENCIA MOLECULAR

El fenómeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie química es

excitada por medio de radiación electromagnética y como consecuencia la
especie pierde la energía adquirida reemitiendo esta en forma parcial o total.
Esto es, parte de la energía adquirida por la especie química se reemite en
forma de choques moleculares y parte en forma de energía luminosa o el total
de la energía adquirida se reemite en forma de radiación. La fluorescencia y la
fosforescencia son dos manifestaciones diferentes del fenómeno
fotoluminiscente. Estos dos efectos difieren entre sí en el mecanismo a través
del cual son producidos, además del tiempo de duración de la
fotoluminiscencia una vez que ha cesado de excitarse la muestra con radiación
electromagnética. La fluorescencia cesa casi inmediatamente después de que a
la muestra se le suspende la radiación, mientras que la fosforescencia puede
durar varios segundos o minutos en iguales circunstancias. La fluorescencia no
está restringida a un estado físico determinado de la materia, esta puede
existir en: gases, sólidos o líquidos.

Jairo Jovan Calderón Caicedo.

 ESCUELA DE QUÍMICA Martes, 05 de febrero de

ESPECTROMETRÍA DEFLUORESCENCIA
OBJETIVOS

1. Este experimento trata de demostrar la  espectrometría de fluorescencia,

como un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la
fluorescencia de una muestra.

2. Determinar correlaciones entre las medidas de intensidad con respecto a

las longitudes de onda que se aplican a una muestra para determinar la
energía necesaria que requiere una molécula para pasar de estados
excitados a estado basal y viceversa.

*ESTADOS EXCITADOS

Cuando se forma un enlace entre dos átomos en una molécula, los orbitales atómicos de cada
uno de los átomos que forman el enlace generan dos orbitales: uno enlazante de baja energía
y otro antienlazante de energía mucho mayor. Cuando la molécula no está excitada, los
electrones que forman un enlace específico se encuentran ocupando los orbitales enlazantes,
debido a que estos son de energía menor y por lo tanto de esta manera la molécula es más
estable. Asociados a cada nivel electrónico se encuentran diferentes niveles vibracionales, por
lo que cuando una molécula es irradiada con energía de cierta frecuencia o longitud de onda
esta puede pasar a diferentes niveles vibracionales de alguno de los estados excitados So y S1
(Figura 1).

SPÍN DEL ELECTRON.- La mayoría de las moléculas poseen un número par de electrones. Estos
dos electrones poseen diferente giro o diferente spin cuando están en el estado basal. En esta
situación se dice que los electrones están apareados y el momento magnético producido por el
spin es cancelado, siendo la molécula diamagnética. Cuando los pares electrónicos se

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encuentran apareados se le llama estado singulete. So y S1 son el primero y segundo estado

excitado de un singulete. Otra posibilidad es que durante el proceso de transferencia del
electrón del estado basal al estado excitado cambie su spin y en este caso los dos electrones
tienen el mismo giro.
Tal estado en espectroscopia se conoce como triplete y en este caso la molécula es
paramagnética ya que el vector magnético creado por el giro de los dos electrones no se
Espectrometría Lectura N° 8 anula sino que se suma y da un valor neto de momento cuántico
magnético de spin. Estos estados se pueden representar de la manera siguiente:

La excitación de esta molécula puede tener lugar por absorción de dos bandas de radiación,
una centrada alrededor de la longitud de onda λ1 (S0→ S1) y la segunda alrededor de la
longitud de onda más corta λ2 (S0→S2). El paso directo de la molécula de un estado singulete
basal S0 a un triplete excitado T1 no ocurre debido a que ciertas transiciones están prohibidas
por las Leyes cuánticas, pero es posible tener la molécula en un triplete excitado a través de
una transición indirecta como se explicará posteriormente.

*PROCESOS DE DESACTIVACIÓN
Una vez que la especie ha sido excitada a niveles energéticos superiores, la desactivación o
pérdida de la energía en exceso se puede efectuar a través de diferentes procesos. El camino
más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado
excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es rápida con respecto a los procesos
sin radiación, se observa tal emisión. En la mayor parte de las especies químicas, la
desactivación por relajaciones no radiactivas (choques moleculares de la especie excitada con
el solvente) es la ruta cinéticamente favorecida, ya que el número de especies fluorescentes es
muy pequeña en comparación con las especies no fluorescentes. El fenómeno de fluorescencia
está restringida a un número relativamente pequeño de sistemas que poseen características
estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de relajación o
desactivación sin radiación se reduzca hasta el punto que la reacción de emisión puede
competir cinéticamente. Los procesos que son posibles de ocurrir en una molécula que tiene
niveles de energía similares a los mostrados en la Figura 1 son los siguientes:

1.) CONVERSIÓN EXTERNA.

Este es el proceso que ocurre más frecuentemente en las especies atómicas y moleculares.
Durante este proceso y el exceso de energía que tiene la especie excitada se pierde por
choques moleculares entre la especie excitada y el solvente, el resultado neto es una
transferencia de energía de la especie excitada a las moléculas vecinas y un incremento
mínimo en la temperatura del solvente.
2.) CONVERSIÓN INTERNA.
En este proceso una molécula excitada pasa del estado electrónico más alto al estado
electrónico más bajo ocasionando una serie de relajaciones vibracionales sin emisión de
radiación, se favorece cuando dos niveles electrónicos son de energía similar y puede ocurrir
un traslapamiento. En estas circunstancias la fluorescencia tiene lugar sólo a λ3. A pesar de
que la radiación de longitud de λ1 o λ2 fue la responsable de la excitación.

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*EFICACIA CUÁNTICA Y TIPO DE TRANSICIÓN

Empíricamente se observa que el comportamiento fluorescente lo presentan con más
frecuencia compuestos en los que la transición es el tipo π , π ’ ya que tales transiciones
presentan tiempos de vida promedio más cortos y no aquellos compuestos en los que la
transición de menor energía es del tipo n, π ’; esto es, la eficacia cuántica es mayor para
π' ,π
transiciones
TOMA DE DATOS
 Tipografía de los datos error encontrados en la medición de transiciones
DATOS QUE GENERAN ERROR EN EL ANALISIS DE DATOS
Trans S0 to S2; 4.10^5 Dilution vs Trans S0 to S2; 4.10^5 Dilution vs
Wavelength Wavelength
X Y X Y
2,84351E13 -1,57494E14 2,52351E13 -1,33927E14
3,22189E13 -1,66451E14 2,90189E13 -1,29489E14
3,26243E14 -1,60734E14 2,94243E14 -1,30652E14
3,61378E13 -1,82788E14 3,29378E13 -1,56479E14
3,64081E13 -3,17141E14 3,32081E13 -1,36245E12
4,00568E14 -1,59809E14 3,68568E14 -9,04633E14
4,05973E14 -1,43443E14 3,73973E14 -3,71961E14
4,42459E11 -2,6343E14 4,10459E11 -2,35488E14
4,46513E14 -2,37629E14 4,14513E14 -2,01325E13
4,81649E13 -6,55734E14 4,49649E13 -4,15672E14
4,84351E13 -5,82012E14 4,52351E13 -3,70351E14
5,20838E14 -3,0578E14 4,88838E14 -1,92567E14
5,24892E13 -2,62681E14 4,92892E13 -1,79021E14
-- -- 5,3073E13 -1,26075E14
-- -- 5,34784E14 -1,33974E14

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ANÁLISIS DE LOS DATOS

A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la
concentración del fluoróforo.

A diferencia de la espectrometría visible o ultravioleta 'estándar', los espectros independientes

del dispositivo no son fáciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los
espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir,
independiente de la máquina. 

Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relación al instrumento o a la

muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de
partida, la intensidad de las fuentes de luz y las características de la longitud de onda varían
con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lámpara tiene una intensidad
constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador
después del filtro o monocromador de excitación, para dirigir una porción de luz a un detector
de referencia.

Además, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisión de los monocromadores y los

filtros, ya que también puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisión del
monocromador varía dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razón por la que debe
colocarse un detector de referencia después del filtro o monocromador de excitación. El
porcentaje de fluorescencia recogido por el detector también depende del sistema. Por otra
parte, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía
entre los diferentes detectores, según la longitud de onda y el tiempo.

La corrección de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estándar" del espectro
es un proceso tedioso, que sólo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Es
el caso de las mediciones de rendimiento cuántico o cuando se encuentra la longitud de onda
con la mayor intensidad de emisión, por ejemplo.

Como se mencionó anteriormente, también surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto,

algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta también. En primer lugar, la
fotodescomposición puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersión
de la luz también debe tenerse en cuenta. Los tipos más importantes de dispersión en este
contexto son la dispersión de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersión de
Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión
Raman la luz cambia a longitudes de onda más largas. La dispersión de Raman es el resultado
de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. A partir de este estado
virtual, las moléculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los
espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de número de onda constante en
relación con la excitación; por ejemplo, en el agua el pico aparece a un número de onda 3600
cm-1 inferior a la luz de excitación.

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Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorción, que
ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en
la que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones
emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidas de nuevo. Otro efecto del filtro interno se
produce a causa de las altas concentraciones de absorción de las moléculas, incluyendo el
fluoróforo. El resultado es que la intensidad de excitación de la luz no es constante a lo largo
de la solución. Como resultado, sólo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los
fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos del filtro interior cambian
el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el
espectro de emisión de luz fluorescente.

INSTRUMENTOS
En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de
instrumentos:

* Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz

fluorescente.
* Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar
la luz incidente y la luz fluorescente.

La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e

incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y
algunas de las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz
fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa
a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a
menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el
riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector.

Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación,

incluyendo el láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de
mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de
longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el
monocromador de excitación o el filtro. La desventaja de este método es que la
longitud de onda de un láser no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de
mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de
longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión
continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia
suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm.

En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador

transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de
monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en
una rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El
monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para
permitir mediciones de anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno
después del monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de
emisión o filtro.

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BIBLIOGRAFÍA
  [1] J. Bertrán y J. Núñez. Química Física. Ariel Ciencia, 2004.
[2] Ira N. Levine. Fisicoquímica. McGraw-Hill, Madrid, 2004.
[3] M. Diaz Peña and A. Roig. Química Física, volumen 2. Alahambra Universidad, 1972.
[4] A. Requena and J. Zúñiga. Espectroscopía. Pearson Educación, 2003.
[5] N.J. Turro. Modern Molecular Photochemistry. Benjamin Cummings, 1978.
[6] N.J. Turro. Modern Molecular Photochemistry. University Science Books, 1991.
[7] B. Valeur. Molecular Fluorescence. Wiley-VCH, 2001.