UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE FÍSICA

FÍSICA ATÓMICA Y MOLECULAR

FOSFORESCENCIA Y
FLUORESCENCIA

Autores: Romero Herrera, Fernando Jesús

Santisteban Guardamino, Mauricio Francisco

Verastegui Llatas, Eduardo Daniel

Investigación Formativa
ÍNDICE:
1. Introducción…………………………………………………………………….. 2

2. ¿Qué es la Luminiscencia?.................................................................................... 4

2.1. Clasificación/Tipos……………………………………………………...…. 4

2.2. Fotoluminiscencia………………………………………………………….. 4

2.3. Principios de Fluorescencia y Fosforescencia……………………………… 5

2.3.1. Fosforescencia……………………………………………………….... 6

2.3.2. Fluorescencia……………………………………………………..…… 6

2.3.3. Diagrama de Jablonski……………………………………………….... 7

2.3.4. Factores que afectan en la fluorescencia y fosforescencia…………….. 8

2.3.5. Métodos para determinar rendimientos cuánticos de fluorescencia…... 10

3. Espectroscopía de Fluorescencia Molecular…………………………………… 12

3.1. Amortiguación de la Fluorescencia……………………………………….. 12

3.2. Instrumentos de medición…………………………………………………. 13

4. Aplicaciones de la Fluorescencia……………………………………………… 16

4.1. Microscopio de Fluorescencia…………………………………………….. 17

4.2. Fluorescencia de Rayos X………………………………………………… 18

4.3. Diagnóstico en la detección de tumores………………………………….... 18

4.4. Espectroscopía Raman………………………………………………….… 19

5. Conclusión…………………………………………………………………..… 21

6. Referencias Bibliográficas…………………………………………..………… 22

7. Responsabilidad y Proyección Social Universitaria………………………….... 24

1
1. INTRODUCCIÓN

El primero en describir el fenómeno de fluorescencia fue Nicolás Monarde (Sevilla, 1508

-1588) en el año 1565, al observar el extraordinario color azul intenso de un extracto
procedente de madera al ser iluminada con luz solar, y contraposición a la casi
transparencia que presentaba al ser observada con la luz de una lámpara.

Al comienzo del siglo XVIII los mineralogistas Clarke y Herschel describieron la

fluorescencia detectada en los minerales bajo estudio, fluorita por parte de Clarke en el
año 1819, y años más tarde, David Brewster y John Herschel hicieron lo mismo con la
clorofila y quinina respectivamente.

Aunque como hemos visto, este fenómeno había sido estudiado por varios científicos, no
fue hasta 1852, en que el físico inglés Sir George Stokes usando filtros y prismas para
separar las diversas longitudes de onda de la luz demostró que una parte del espectro de
la luz incidente era absorbida, transformada y emitida por la solución en forma de una luz
azul de mayor longitud de onda. Su trabajo se basó en el estudio la fluorita y los cristales
de sales de uranio. Observó que los materiales tenían el poder de convertir la radiación
ultravioleta invisible en radiación de longitud visible. Al fenómeno observado le dio el
nombre de fluorescencia, derivado del mineral fluorita.

Durante los últimos 20 años se ha producido un considerable aumento en el uso de la

fluorescencia en técnicas biológicas. A día de hoy, es uno de los métodos más utilizados
en campos de la salud, tales como biotecnología, citometría de flujo, diagnóstico de
enfermedades, secuenciación de ADN o análisis genético, debido principalmente a su alta
sensibilidad. Además, los recientes avances en el uso de instrumentación analítica de
campo han permitido el análisis in-situ (“en el sitio” o “en el lugar”), como por ejemplo,
la medida de fluorescencia inducida por láser (LIF) en el monitoreo de la calidad
bacteriana del agua mediante ensayos cromogénicos y fluorogénicos para la detección y
rastreo de indicadores patógenos a escala sinóptica, ofreciendo fluoróforos y cromóforos
con alta eficiencia cuántica acoplados mediante sustratos o impresos en filmes
poliméricos, en donde se emplean sondas inoculadas que poseen fluoróforos con alta
eficiencia cuántica y que sirven como centinelas. Una vez estimulados, son introducidos
a lo largo de una cuenca o depósito proporcionando de forma eficaz datos sobre la
detección de patógenos en el agua y en los suelos. (Anderson, Fischer, Smith, Webb, &
Dennis, 2003).

2
La espectroscopía de fluorescencia, ha permitido medir parámetros de calidad de
productos lácteos consumidos en la dieta diaria durante su consumo y almacenamiento.
Ejemplificado en el trabajo de Andersen & Mortensen (2008) en donde se evalúan
cambios inducidos por el procesamiento de productos lácteos y oxidación inducida por la
luz, además de ofrecer perspectivas de esta técnica analítica en relación con la
investigación futura, desarrollo y la aplicación dentro de la industria lechera.

El método de fluorescencia de hibridación in-situ se ha convertido en una poderosa

técnica para la investigación biomédica. Este método se basa en la detección y
localización de secuencias específicas de ADN o ARN dentro de las células o tejidos,
mediante una sonda que se coloca directamente sobre la muestra, material genético como
cromosomas, secciones histológicas bebidas en parafina, que previamente han sido
tratadas con una enzima que facilita la introducción de la sonda al ADN nuclear,
previamente desnaturalizado por el calor. La sonda ligada a una sustancia fluorescente,
se agrega para la hibridación, la cual sucede si está presente el ADN complementario de
la sonda. La emisión fluorescente se observa mediante microscopía de fluorescencia. (Vo-
Dinh, 2014).

3
2. ¿QUÉ ES LA LUMINISCENCIA?

Es el proceso por el cual un material genera radiación no térmica, es decir emite luz sin
realizar combustión (proceso contrario a la incandescencia), tras la absorción de energía.
Este proceso empieza cuando los electrones del material reciben energía, se excitan y
saltan hacia las orbitas externas. Tras regresar a sus orbitas, los electrones emiten un fotón
de luz. Este proceso puede durar poco menos de 0.0001 s, o llegar a ser intermitente, por
lo que podría llegar a durar horas.

2.1. CLASIFICACIÓN/TIPOS

La luminiscencia se clasifica según el tipo de energía que reciban los electrones, de

esta forma tenemos:

❖ Quimioluminiscencia: Causada por reacciones químicas.

❖ Magneto luminiscencia: Causada por campos magnéticos.

❖ Bioluminiscencia: Única de los organismos vivos, resultado de la reacción

química de enzimas y otras sustancias presentes en dichos seres.

❖ Roengten luminiscencia: Causada por rayos 𝑥 de alta energía.

❖ Triboluminiscencia: Causada tras la ruptura de los enlaces químicos de ciertos

materiales, debido a diferentes procedimientos.

❖ Cátodo luminiscencia o Electroluminiscencia: Causada debido a descargas

eléctricas en un entorno de gases.

❖ Ánodo luminiscencia e iono luminiscencia: Causada por la acción de iones

positivos sobre la sustancia (ánodos).

❖ Fotoluminiscencia: Causada por la luz.

❖ Sonoluminiscencia: Causada por ondas sonoras de ultra altas frecuencias o

ultrasonidos.

2.2. FOTOLUMINISCENCIA

Como ya se ha mencionado, la fotoluminiscencia es el resultado de la absorción de la

luz por parte de los electrones de un material, absorción que poseerá un exceso de

4
 energía conocido como foto-excitación y culminará con la liberación de energía
lumínica o fotoluminiscencia.

Dependiendo de cuánto dure la emisión de luz, se hablará de Fluorescencia o

Fosforescencia. En la Fluorescencia, la energía absorbida es liberada inmediatamente;
mientras que en la Fosforescencia, la energía se almacena y se emite poco a poco, aún
si la fuente ya ha cesado.

2.3. PRINCIPIOS DE FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Como lo explica Escudero (2018), toda molécula posee electrones, que forman parejas
por orbital, lo que se denomina estado basal (observar la figura), estado para el cual el
momento magnético es nulo (𝑆0 ). Cuando los electrones se excitan pasan de un orbital
a otro que posea mayor energía.

Si mantiene su estado de spin, se dice que el par electrónico se encuentra en

un estado de singlete excitado, siendo denotado como 𝑆1 . A este proceso se
le denomina transición singlete singlete. Por el contrario, si el electrón cambia
su spin, entonces diremos que el par electrónico se encuentra en estado de
triplete excitado, en el que se presentan los spines paralelos. Este estado se
conoce como triplete debido a que corresponde a tres estados de igual energía.
De acuerdo con la regla de Hund, este último estado presenta una menor
energía que su singlete correspondiente.

(Escudero, 2018, p. 3)

Figura 1. Estados de un orbital en una molécula

5
2.3.1. FOSFORESCENCIA

La fosforescencia es la emisión de luz de estados de triplete excitados, en los

cuales el electrón en el orbital excitado tiene la misma orientación de spin que el
electrón del estado fundamental. La transición al estado fundamental esta
“prohibida” y la emisión es lenta, pudiendo darse en orden de milisegundos o
segundos.

De esta forma, la sustancia puede emitir luz incluso por horas luego de cesar la
fuente, por lo que se podría decir que este tipo de sustancia presenta la capacidad
de almacenar la energía por un corto período de tiempo.

Encontramos ejemplos de este proceso en aquellos objetos que se iluminan en la

oscuridad o en las pantallas de televisión o monitores, en donde un haz de
electrones barre la pantalla con una determinada frecuencia (50 o 60 Hz).

2.3.2. FLUORESCENCIA

En el caso de la fluorescencia, la transición es singlete-singlete. Los electrones

pierden un poco de energía debido a la vibración de las moléculas, liberando la
energía en forma de luz en una emisión instantánea, de orden de 108 𝑠 −1 . Este
proceso es común en moléculas aromáticas, como la quinina que está presente en
la tónica, y fue observado por primera vez por Sir John Frederick William
Herschel. Como nos lo explica Escudero (2018):

Si se observa un vaso de tónica expuesto a la luz solar, se puede observar

un ligero resplandor azul sobre la superficie. Esto se debe a la excitación
de la quinina por parte de la luz ultravioleta del sol. Una vez excitada la
molécula, volverá a su estado fundamental, emitiendo esa franja azul
visible en una longitud de onda próxima a los 450 nm.
(pág. 4)

Este fenómeno es predominante de moléculas, mientras que en los átomos no

suele producirse, con la excepción del grupo de los lantánidos, ya que para que se
dé las transiciones electrónicas deben ser entre orbitales f. Las radiaciones
fluorescentes que son emitidas por los compuestos orgánicos se suelen dar entre
los 300 a 650 𝑛𝑚.

6
2.3.3. DIAGRAMA DE JABLONSKI

Es una representación gráfica del proceso fotolumínico. En la figura 2, podemos

identificar 𝑆0 como el estado fundamental o de menor energía para el cual nuestra
molécula presenta estabilidad. Los estados singlete se representan con 𝑆, mientras
que los estados triplete con 𝑇. Además, cada nivel electrónico presentará diversos
niveles vibracionales.

Tras absorber la radiación electromagnética, la molécula entrará en un estado de

vibración o excitación, por lo que para regresar al estado fundamental existirán
distintos mecanismos de relajación:

• Relajación vibracional (𝑵𝒓): proceso ocasionado por las colisiones entre

las moléculas excitadas (soluto) y las moléculas del disolvente, las cuales
reciben una transferencia de energía por parte del soluto para éste último
regresar al estado fundamental. Esta transferencia se evidencia por un
incremento en la temperatura del medio.

El proceso es eficiente, ya que todo el exceso de energía en las moléculas

excitadas se pierde en un tiempo de 10−13 a 10−11 segundos.

Figura 2. Diagrama de Jablonski

• Conversión interna (𝑰𝒄): es un proceso de relajación no radiativo (no se

emiten fotones), la energía emitida se convierte en calor. Puede ocurrir entre
niveles excitados y el fundamental o entre niveles vibracionales de un estado
excitado.

7
 • Conversión externa: procesos de interacción y transferencia de energía
entre la molécula excitada y el disolvente u otros solutos que ocurre al
desactivarse un estado excitado.

• Cruce entre sistemas (𝑰𝒔𝒄): Similar a la conversión interna, en el que es

obligatorio el cambio de multiplicidad en el estado excitado. Generalmente
se da en presencia de átomos pesados o especies paramagnéticas, en donde
los acoplamientos se incrementan favoreciendo de esta forma el cambio de
espín.

La fluorescencia es un proceso radiactivo (emisión de fotones) de relajación entre

el primer estado singlete excitado y cualquier estado vibracional del estado
fundamental.

2.3.4. FACTORES QUE AFECTAN EN LA FLUORESCENCIA Y

FOSFORESCENCIA

Que una sustancia emita fluorescencia o fosforescencia dependerá de varios

factores, entre los que se puede destacar:

• Rendimiento cuántico. Relación entre el número de moléculas

fluorescentes o fotones emitidos sobre el número de moléculas excitadas
o fotones absorbidos.
La siguiente fórmula, que representa al rendimiento cuántico, será de
utilidad para el siguiente capítulo al igual que sus componentes.
𝑘𝐹 𝜏
𝜑𝐹 = =
𝑘𝐹 + 𝑘𝑁 𝜏0

• Estructura molecular. Uno de los requisitos que permite que una

sustancia emita fluorescencia es el poseer un coeficiente de extinción
molar alto.
Además, se encuentra que una alta rigidez estructural es un factor clave
que favorece la fluorescencia debido a que al limitarse las vibraciones, se
minimiza la degradación energética por colisiones.

8
 • Temperatura. La fluorescencia disminuye, en la mayoría de las
moléculas, al aumentar la temperatura ya que así aumenta la frecuencia de
las colisiones y, con ello, la probabilidad de desactivación por fenómenos
no radiantes.

• Efecto de la concentración. La intensidad de emisión de fluorescencia

(𝐼𝑓 ) se define como:
𝐼𝑓 = 𝐾(𝐼0 − 𝐼)

Donde 𝐼0 es la intensidad de radiación del haz que incide sobra una

disolución y 𝐾 es una constante que depende de la eficacia cuántica del
proceso de fluorescencia.
Sea la Ley de Beer:
𝐼
= 10−𝜀𝑏𝑐
𝐼0

Donde 𝜀 es la absortividad molar y 𝑐 la concentración de la especie

fluorescente. Se puede sustituir en 𝐼𝑓 :

𝐼𝑓 = 𝐾𝐼0 (1 − 10−𝜀𝑏𝑐 )

Y desarrollando el término exponencial como una serie de McLaurin:

𝐼𝑓 = 2,3𝐾𝐼0 𝜀𝑏𝑐

Donde, al ser 𝐼0 una constante, podemos simplificar la expresión en:

𝐼𝑓 = 𝐾̇ 𝑐

Cabe resaltar que cuando 𝑐 es lo suficientemente grande como para que la

absorbancia (𝜀𝑏𝑐 ) multiplicada por 2,3 sea mayor que 0,05, los términos
de mayor orden en la serie de McLaurin no serán despreciables y se
perderá la linealidad conseguida. Por lo tanto, la concentración máxima
será:
0,05
𝑐𝑚á𝑥 =
𝜀𝑏

2.3.5. MÉTODO PARA DETERMINAR RENDIMIENTOS CUÁNTICOS DE

FLUORESCENCIA

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Para determinar el rendimiento cuántico de fluorescencia, podemos utilizar tanto
el método absoluto como el método relativo o indirecto. El primero permite
determinar el rendimiento para especies en disolución y compuestos en fase
sólida, mientras que el segundo únicamente es válido para especies de disolución.
Además, podemos mencionar que el primero no es muy popular ya que requiere
de instrumentos con alto requerimiento tecnológico, por lo que es necesario
realizar una gran inversión económica. En contraste, el segundo método es más
accesible, ya que se basa en el uso de instrumentos de menor costo (en
comparación) y patrones con rendimientos cuánticos ya estudiados como
referencia.

El método absoluto tiene como objetivo determinar los valores de:

𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑒𝑚𝑖𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠
𝜑𝐹 =
𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑖𝑑𝑜𝑠

Para ello hace uso de una esfera integradora (Figura 3), ya que la emisión de
fluorescencia de una especie no se encuentra polarizada y por ende se emite en
todas las direcciones, por lo que para medir la totalidad de fotones emitidos se
hace uso de esta esfera formada por material fluoropolimérico que tiene como
principal característica el tener una elevada reflectancia (alrededor del 95%). Esta
característica provoca que la luz que entra en la esfera solo pueda o ser absorbida
por la muestra o ser recolecta por el detector del espectrofluorímetro.

Figura 3. Esquema de una esfera integradora

10
El número de fotones absorbidos por la muestra (por unidad de tiempo) se
determinará al restar el número de fotones que se emite (fuente de luz) y el número
de fotones que llega al detector.

Por otro lado, la determinación del rendimiento cuántico por medio del método
indirecto está basada en una comparativa entre la emisión de fluorescencia de la
muestra y la emisión de un material considerado como patrón. Entonces, el
método nos dice que la fracción de luz emitida por la muestra y el patrón deben
ser iguales al ser ambos sometidos a las mismas condiciones de excitación y
apertura de rendija de los monocromadores de excitación y emisión.

Cabe resaltar que el rendimiento cuántico de fluorescencia de una especie no

dependerá de la concentración en la que ésta se encuentre, aunque sí de la longitud
de onda de excitación con la cual se registre el espectro de emisión de
fluorescencia, de forma indirecta, por lo que se concluye que el rendimiento
cuántico máximo de una especie se determina en base a la longitud de onda
máxima de excitación del compuesto. (García, 2015, p. 14)

11
3. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR

La probabilidad de que se produzca una emisión espontánea (probabilidad por unidad de

tiempo 𝑘𝐹 ) desde un estado excitado es directamente proporcional a la probabilidad de
absorción, y estrechamente relacionada con la transición del electrón. De esta forma, el
intervalo medio que el electrón permanece en el estado excitado será:

1
𝜏0 =
𝑘𝐹

Que es igual al tiempo natural de vida de fluorescencia, o el tiempo de emisión

fluorescente de ser éste la único mecanismo de relajación o proceso de desactivación. No
obstante, al considerar el escenario no ideal, se denomina 𝜏 al tiempo de vida de
fluorescencia:

1 1
𝜏= =
𝑘 𝑘𝐹 + 𝑘𝐼 + 𝑘 𝑇 + 𝑘𝐸 + 𝑘𝑃𝐷 + 𝑘𝐷

En donde se considera en el denominador los procesos que compiten mediante sus

constantes de velocidad, siendo 𝑘𝐹 la constante de velocidad del proceso de emisión
fluorescente, 𝑘𝐼 para la conversión interna, 𝑘 𝑇 para el cruce entre sistemas, 𝑘𝐸 para la
conversión externa, 𝑘𝑃𝐷 para predisociación y 𝑘𝐷 para disociación. De esta forma, el
tiempo de vida de fluorescencia será:

1
𝜏=
𝑘𝐹 + 𝑘𝑁

Donde 𝑘𝑁 es la constante de velocidad para los parámetros no radiante.

Una vez cesada la fuente de excitación, la intensidad de la fluorescencia 𝐹𝑡 decaerá

exponencialmente:
𝐹𝑡
𝐹𝑡 = 𝐹0 𝑒 −(𝑘𝐹 +𝑘𝑁)𝑡 ⟹ = 𝑒 −𝑡/𝜏
𝐹0

Donde 𝐹0 es la intensidad inicial de la radiación fluorescente a un tiempo 𝑡 = 0

(arbitario). (Del Castillo, 1996, p. 45)

3.1. AMORTIGUACIÓN DE LA FLUORESCENCIA

Al encontrarse en presencia de ciertas moléculas, la molécula fluorescente puede

disminuir la señal de fluorescencia que emitiría en ausencia de ellas. Este fenómeno

12
 es conocido como amortiguación de la fluorescencia. La disminución de la señal de
fluorescencia también puede deberse al efecto de un filtro interno o un fenómeno de
autoabsorción.

La interacción del amortiguador (𝐴) con la molécula excitada se produce después de

haber experimentado la relajación vibracional, y puede ocurrir antes de emitir
fluorescencia, lo que se traduce en una disminución de la señal de fluorescencia. El
tiempo de vida entonces será:

1
𝜏=
𝑘𝐹 + 𝑘𝑁 + 𝑘𝐴

Y el rendimiento cuántico de fluorescencia:

𝑘𝐹
𝜑𝐹 =
𝑘𝐹 + 𝑘𝑁 + 𝑘𝐴

Además, ya que la intensidad de fluorescencia es proporcional al rendimiento cuántico,

la relación entre ésta y la señal de fluorescencia en presencia del amortiguador, a una
concentración determinada, será:

𝐹 𝑘𝐹 + 𝑘𝑁 + 𝑘𝐴 𝑘𝐴
,
= =1+ = 1 + 𝑘𝐴 𝜏
𝐹 𝑘𝐹 + 𝑘𝑁 𝑘𝐹 + 𝑘𝑁

Relación que es conocida como ecuación de Stern-Volmer, y permite hallar 𝑘𝐴 que es

la constante de velocidad de la reacción de amortiguación. (Del Castillo, 1996, p. 46)

3.2. INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN

Todo instrumento capaz de medir las señales de intensidad fluorescente de una muestra
está compuesto por una fuente de luz de radiación, la cual pasa a través de un filtro o
monocromador e incide sobre la muestra. Como sabemos, parte de la luz será
absorbida provocando el fenómeno de fluorescencia, cuya luz es emitida
omnidireccionalmente. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro
o monocromador, llegando a un detector (generalmente a 90º con respecto a la luz
incidente). Si este sistema usa filtros, el instrumento es conocido como fluorímetro, si
usa monocromadores, será un espectrofluorímetro. (existen híbridos con un filtro de
excitación y un monocromador de emisión)

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 Figura 4. Diagrama esquemático de instrumento de medición de fluorescencia

Siguiendo la secuencia de la Figura 4, se puede usar un espectrofluorímetro para

obtener los espectros de excitación (o absorción), al mantener constante la longitud de
onda de emisión mientras se barre la longitud de onda de excitación, o los espectros
de emisión (o fluorescencia), manteniendo fija la longitud de excitación, de un material
luminiscente o fluoróforo.

A continuación se presenta una descripción de cada componente de un

espectrofluorímetro, de acuerdo con Ruales (2015):

• Fuente de luz: Determina la cantidad de luz y el rango espectral disponible

que incidirá en la muestra. La más utilizada es la lámpara de arco de xenón de
alta presión, debido a que posee un espectro de luz continua de alta intensidad
(230 – 1700 𝑛𝑚) además de la potencia eléctrica que consume (150 𝑊,
450 𝑊, 1000 𝑊). Otra opción es la lámpara de tungsteno brillante, la cual
presenta una fuente de banda ancha con una excelente estabilidad.

• Monocromador: Se utilizan para descomponer la luz policromática (blanca)

mediante prismas o redes de difracción (la mayoría de espectrofluorímetro
utilizan redes de difracción). Además, poseen anchuras de rendijas (entrada y

14
 salida) variables y la intensidad de la luz que pasa por el monocromador será
aprox. proporcional al cuadrado de la anchura de la rendija de entrada. Los
parámetros más importantes de un monocromador son la dispersión (𝑛𝑚/𝑚𝑚)
y el nivel de luz transmitida por el monocromador.

• Filtro óptico: Debido a la interferencia por dispersión y desviación de la luz,

a veces es necesario utilizar filtros ópticos, en adición al monocromador, para
minimizar éstas fuentes de error. Además, si se conoce las propiedades
espectrales del material fluorescente, para obtener la máxima sensibilidad
debemos usar filtros en vez de monocromadores. Existen muchos tipos de
filtros, como los filtros de paso largo, que transmiten todas las longitudes de
onda superiores a cierta longitud en particular; los filtros de banda, que dejan
pasar únicamente una banda determinada del espectro; y los filtros de corto
paso, que dejan pasar el espectro por debajo de una longitud de onda
determinada.

• Compartimiento de la muestra: Son celdas de un 1 𝑐𝑚 de espesor, que se

caracterizan por tener las cuatro caras lisas y su contenedor ser termoestable.
Generalmente son de cuarzo, aunque si la longitud de onda de excitación y la
de fluorescencia sobrepasan los 300 𝑛𝑚, se pueden utilizar como material
vidrio óptico o plástico.

• Detector: El más empleado es el tubo fotomultiplicador (PMT) debido a que

tiene una alta ganancia con bajo ruido. El PMT, consta de un fotocátodo
(película fina de metal) y una serie de dinodos que actúan como etapas de
amplificación. El fotocátodo se polariza con un potencial negativo entre −1 y
−2 𝑘𝑉 con respecto al ánodo y los dinodos con potenciales menores en
magnitud a éste. Esta diferencia de potenciales permite que los electrones sean
expulsados del fotocátodo hacia cada dinodo de forma secuencial hasta llegar
al ánodo del PMT.
(p. 38 – 43)

15
4. APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA

Los métodos ópticos miden las interacciones entre la energía radiante y la materia. Los
primeros instrumentos de esta clase se crearon para su aplicación dentro de la región
visible y por esto se llaman instrumentos ópticos. La energía radiante que se utiliza para
estas mediciones puede variar desde los rayos X, pasando por la luz visible, hasta las
ondas de radio.

Los métodos ópticos de análisis se pueden diseñar para medir la capacidad de un material
o de una solución para absorber energía radiante, para emitir radiación cuando son
excitados por una fuente de energía o para dispersar o difundir radiación.

Es posible clasificar los métodos ópticos en:

➢ Espectroscópicos: Son aquellos en los que existe intercambio de energía entre la

radiación electromagnética y la materia.

a) Absorción:
• niveles moleculares (UV-visible, IR, microondas)
• niveles atómicos (absorción atómica, rayos X)
b) Emisión:
• niveles moleculares (luminiscencia: fluorescencia y fosforescencia)
• niveles atómicos (espectrometría de emisión, fotometría de llama, ICP,
fluorescencia de rayos X, fluorescencia atómica)

➢ No espectroscópicos: Se caracteriza por no tener lugar intercambio de energía como

consecuencia de la interacción materia – radiación electromagnética.

a) Dispersión: turbidimetría y nefelometría.

b) Refracción: refractometría, interferometría.
c) Difracción: rayos X, electrones.
d) Rotación óptica: polarimetría, dicroísmo circular

En general, los métodos de fluorescencia son de uno a tres órdenes de magnitud más
sensibles que los métodos basados en la absorción ya que su sensibilidad puede ser
reforzada ya sea aumentando la energía del haz de excitación o por amplificación de la
señal del detector.

16
 Sabemos que existen varias sustancias que autofluorescen, y esto has sido explotado
especialmente en química, botánica, petrología, y la industria de semiconductores. Los
fluoróforo disponibles comercialmente, con espectros de excitación y emisión bien
definidos, se pueden usar para “manchar” estructuras específicas o moléculas en un
espécimen. La elección juiciosa de fluoróforos permiten la identificación de varios
objetivos mientras que los espectros de emisión se pueden separar limpiamente y
distinguirse de la autofluorescencia.

4.1. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

Este microscopio es una variante del microscopio de luz ultravioleta basada en los
principios de fluorescencia. Se utiliza para detectar sustancias con autofluorescencia o
marcadas con fluorocromos, permitiendo determinar la distribución de una sola
especie de molécula además de su cantidad y ubicación en el interior del espécimen,
información que por lo general pasa desapercibida.

Son muchas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, principalmente en las

áreas de biología y medicina:

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.
• Estudios inmunológicos.
• Mineralogía.

Figura 5. Estructura de un microscopio de fluorescencia

17
4.2. FLUORESCENCIA DE RAYOS X

La fluorescencia de rayos X (XRF) es una técnica analítica que se puede utilizar para
determinar la composición química (cualitativa y cuantitativamente) de una amplia
variedad de tipos de muestras, entre los que se encuentran sólidos, líquidos, lodos y
polvos sueltos, particularmente metales, vidrios, cerámicos y materiales de
construcción. Además, puede ser usada para determinar el espesor y la composición
de capas y recubrimientos.

El análisis elemental y químico por XRF combina alta precisión y exactitud con
preparación fácil y rápida de muestras. Y es que esta técnica se puede automatizar
fácilmente para su uso en entornos industriales de alto rendimiento. Este método de
emisión atómica permite medir la longitud de onda y la intensidad de la luz (rayos X)
emitida por átomos energizados en la muestra. La tecnología que se utiliza para la
separación (dispersión), la identificación y la medición de la intensidad del espectro
de fluorescencia de rayos X de una muestra, da lugar a dos tipos principales de
espectrómetro: sistemas de dispersión de longitud de onda y de dispersión de energía.

Como sabemos, el proceso de fluorescencia es ineficiente, y la radiación emitida es

mucho más débil que el haz de la fuente, por lo que en elementos más ligeros la energía
de esta radiación es relativamente baja y aún más si atraviesa algo de aire (atenuación).
Es por esto que para un análisis de alto desempeño, la trayectoria tubo–muestra–
detector se mantiene bajo alto vacío: a una presión residual aproximada de 10 𝑃𝑎. Esto
implica que la mayoría de las partes operativas del instrumento se han de ubicar en
una cámara de vacío grande.

4.3. DIAGNÓSTICO EN LA DETECCIÓN DE TUMORES

Una técnica derivada de las propiedades fluorescentes es la autofluorescencia. Ésta es

la fluorescencia endógena de un tejido causada por distintos fluoróforos como el
colágeno, elastina, triptófano y la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD). La
duración de la fluorescencia varía en función de éstos fluoróforos, y ésta es la base de
la diferenciación entre los distintos tejidos. Por ejemplo, el colágeno y la melanina
tienen semividas muy cortas (0,2 − 0,4 𝑛𝑠), mientras que la flavina tiene una semivida
larga (3,5 − 5,2 𝑛𝑠). El espectro dependerá de la longitud de la onda de excitación y
estará condicionado por la propiedades ópticas del tejido, por ejemplo, sustancias con

18
 gran capacidad de absorción, como la hemoglobina, pueden reabsorber parte de la luz
fluorescente emitida y modificar así el espectro de fluorescencia. Así mismo, la
ventaja del uso de la autofluorescencia en la delimitación del cáncer es que no es
necesario aplicar una sustancia exógena, algo que puede exigir tiempo y es
potencialmente dañino.

De esta forma, el diagnóstico mediante fluorescencia en el tejido se puede realizar

mediante el análisis de la diferencia en la autofluorescencia, entre el tejido normal y el
patológico, o bien usar la fluorescencia de una molécula patrón, que se acumula
específicamente en los tumores y presenta una emisión muy intensa.

Por ejemplo, el análisis de la piel mediante espectrofotometría consiste en barrer y

analizar la luz que se refleja en la piel tras la exposición a una fuente de luz activadora.
Esta es una técnica muy sensible para la medición cualitativa y cuantitativa de los
elementos que constituyen el tejido mediante la comparación cuantitativa entre la luz
emitida por la lesión y una referencia. La intensidad de la luz reflejada se mide en el
espectrómetro con un fotodiodo u otro tipo de sensor lumínico. Este método se
aprovecha de los cromóforos, que se localizan en la piel y que son sustancias que
absorben y reflejan la luz de distinta longitud de onda. La ventaja más importe del
diagnóstico mediante fluorescencia es que se puede emplear con facilidad para las
investigaciones in vivo. La utilización de fibra óptica permite acceder a la piel y
también a órganos internos, como el cérvix o el pulmón.

Los espectrofotómetros más habituales emplean fuentes de luz del rango ultravioleta
y visible del espectro, y algunos de estos instrumentos también funcionan en la región
del infrarrojo cercano.

4.4. ESPECTROSCOPÍA RAMAN

Se trata de un técnica de análisis estructural y químico que se utiliza para identificar

cualquier compuesto orgánico o inorgánico, con la ventaja de no tener que realizar
procedimientos previos, además de no dañar el material.

Como lo explica Escudero (2018):

Esta técnica está basada en el examen de la luz dispersada por un material al

incidir un haz de luz monocromático sobre él. Una parte de la luz es dispersada

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 inelásticamente, experimentando pequeños cambios de frecuencia, que serán
característicos del material analizado, e independientes de la frecuencia de la luz
incidente.
(pág. 6)

Esta técnica está basada en el fenómeno o efecto de dispersión Raman, efecto de

dispersión inelástica de un fotón. El fenómeno fue descrito en 1928 por el físico
Chandrasekhara Venkata Raman, tras realizar un experimento que demostraba que el
color del agua de mar era debido al efecto de dispersión de la luz al interactuar con las
moléculas de agua. Al incidir una luz monocromática con frecuencia de 𝑣0 sobre un
material a identificar, la mayoría de los fotones dispersados presentarán la misma
energía, frecuencia y longitud de onda que los fotones incidentes, o lo que conocemos
como dispersión elástica de Rayleigh. Sin embargo, una pequeña fracción de fotones,
aproximadamente 1 de 1011 fotones, presentará un cambio frecuencial, debido a un
cambio en los estados vibracionales. Estos fotones dispersados, con frecuencias +𝑣𝑟
y −𝑣𝑟 que son independientes de la radiación incidente, presentarán variaciones de
energía equivalentes a sus frecuencias. Si el fotón incidente transfiere energía a la
molécula, excitándola, cuando ésta emita al fotón dispersado, no volverá al estado
inicial, sino que quedará en uno mayor que esté permitido. El fotón emitido tendrá una
frecuencia ѵ0 − ѵ𝑟 y se producirá la dispersión Raman-Stokes. Si por el contrario, la
transferencia de energía se da de la molécula al fotón, entonces se intuye que la
molécula se encontraba en un estado vibracional de mayor energía al fundamental, por
lo que después de la transferencia, pasará a este último estado. En consecuencia, el
fotón dispersado tendrá frecuencia ѵ0 + ѵ𝑟 y se producirá lo que conocemos como
dispersión Raman anti-Stokes.

Como hemos mencionado, este efecto es aplicado en la espectroscopía Raman, puesto

que “cada material tendrá un conjunto de valores ѵ𝑟 característicos de su estructura
poliatómica y de la naturaleza de los enlaces químicos que la forman” (Escudero, 2018,
pág. 8).

A temperatura ambiente, según la ley de distribución de energías de Maxwell -

Boltzmann, el 99% de las moléculas se encuentra en el estado vibracional de menor
energía, y por tanto, la probabilidad de que ocurran transferencias de energía que den
lugar a la dispersión Raman Stokes es mucho mayor que la de la dispersión Raman
anti-Stokes.

20
5. CONCLUSION

En este trabajo se describieron las propiedades, características y aplicaciones de la

fosforescencia y fluorescencia. Centrándonos en la fluorescencia, se recopiló información
del proceso fotolumínico, los factores que lo afectan y el instrumento que se utiliza para
medirlo. Además, se enfocaron sus aplicaciones hacia el área de la medicina, en donde
los principios de fluorescencia se utilizan para determinar si un tejido presenta alguna
patología. Particularmente, se describió la alternativa de diagnóstico que utiliza el
fenómeno de fluorescencia para la detectar tumores. Por otro lado, descubrimos que para
la microscopía, la fluorescencia es el tipo más útil de luminiscencia, siendo de gran ayuda
para el experimentador a la hora de caracterizar la cantidad y localización de una molécula
dentro de una célula, además de admitir más de un fluoróforo por lo que se podría detectar
varias moléculas diferentes en lugar de una por vez.

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6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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fotoluminiscencia y procesos similares”. Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y
Electrónica. Recuperado de
https://inaoe.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1009/1581/1/PanohayaGF.pdf
• Escudero, L. (2018). Principios de Fluorescencia. Trabajo de Fin de Grado, Facultad de
Farmacia, Universidad Complutense. Madrid, España. Recuperado de
http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/LUIS%20ALFONSO%20ESCUDERO
%20BALLESTEROS.pdf
• Harris, D. (2016). Análisis Químico Cuantitativo. 3º Ed. Editorial Reverté. W.H.
Freeman and Company.
• Anderson, Fischer, Smith, Webb, & Dennis (2003). In Situ Detection of Pathogen
Indicators Using Laser – Induced Fluorescence. Paper 4. Virginia Commonwealth
University, Department of Biology, USA. Recuperado de
https://opensiuc.lib.siu.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1003&context=ucowrconfs_2
003
• Andersen, C. & Mortensen, G. (2008). Fluorescence Spectroscopy: A rapid tool for
analyzing dairy products. University of Copenhagen, Department of Food Science,
Denmark. Journal of Agricultural and food chemistry. American Chemical Society.
Recuperado de https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jf072025o
• Vo-Dinh, T. (2014). Biomedical Photonics Handbook. 2nd Edition. Oak Ridge National
Laboratory, Tennessee, USA. Recuperado de
http://library.nuft.edu.ua/ebook/file/Vo-Dinh2003.pdf
• Del Castillo, B. (1996). El largo camino de los Métodos Luminiscentes en Análisis
Farmacéutico. Real Academia Nacional de Farmacia, Madrid. Recuperado de
https://www.ranf.com/wp-content/uploads/academicos/discursos/numero/benito.pdf
• García, A. (2015). Determinación de Rendimientos Cuánticos de Fluorescencia por
Métodos Indirectos. Trabajo Fin de Máster en Ciencias Analíticas y Bioanalíticas.
Universidad de Oviedo. Recuperado de
https://digibuo.uniovi.es/dspace/bitstream/handle/10651/32363/TFM_Andrea%20Garc
%C3%ADa.pdf?sequence=6&isAllowed=y#:~:text=El%20fundamento%20del%20m
%C3%A9todo%20indirecto,desconocida%20y%20para%20el%20patr%C3%B3n.

22
• Ruales, A. (2015). Diseño, Construcción y Automatización de un Espectrofluorímetro:
Aplicación en el Análisis de Riboflavina en Multivitamínicos. Tesis de Grado
Licenciado en Química. Universidad San Francisco de Quito, Colegio de Ciencias e
Ingeniería. Recuperado de https://repositorio.usfq.edu.ec/handle/23000/4381

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PROYECCIÓN Y RESPONSABILIDAD SOCIAL UNIVERSITARIA
¿Usted cree que su trabajo genere algún impacto en la sociedad o en un grupo de la
sociedad?
Como hemos podido encontrar, el fenómeno de fluorescencia presenta múltiples
aplicaciones. Tener la capacidad de determinar si una sustancia se encuentra presente por
medio del espectro que ésta genera al ser irradiada por una fuente luminosa ha dado pie a
la invención de varios instrumentos, como el microscopio de fluorescencia, y la creación
de nuevas técnicas como la fluorescencia de rayos X.
Y aunque el presente trabajo esté orientado más a sus aplicaciones en el análisis químico
y el campo de la medicina, los principios de la fluorescencia derivan en herramientas que
utilizamos día a día como lo son los focos fluorescentes o la detección de billetes falsos.
En el caso de la fosforescencia, sus aplicaciones van desde la pintura que se ilumina en
la oscuridad hasta el determinar especies orgánicas como los ácidos nucleicos,
aminoácidos, pesticidas o hidrocarburos del petróleo.
Es por todo esto que podemos decir, con seguridad, que los fenómenos de fosforescencia
y fluorescencia han tenido un gran impacto en la sociedad, y seguirán surgiendo nuevos
instrumentos que perfeccionen la forma en cómo medimos las emisiones, y nuevas
técnicas que implementen la teoría de la luminiscencia para resolver alguna problemática
del momento.

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