Manual Biología Molecular 2019 PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE CIENCIAS MORFOLÓGICAS AGROPECUARIAS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
MVZ
ELABORADO POR:
Carlos Ignacio Soto Zárate
Revisado por:
Ma. Rosario Martínez Calles
Germán I. Garrido Fariña
Enero de 2018
Trabajo realizado con el apoyo del Programa UNAM-DGAPA-PAPIME PE 205717

ÍNDICE
Práctica Nombre de la práctica Página

1 Midiendo, pipeteando y trabajando en condiciones de esterilidad 3
2 Ensayo de enzimas de restricción para analizar el polimorfismo de

globina beta S mediante RFLP (Laboratorio virtual Cibertorio) 11
3 Diagnóstico genético de drepanocitosis mediante RFLP (Laboratorio
virtual Cibertorio) 15
4 Extracción de ADN genómico con fenol/cloroformo y precipitación con
alcohol 17
5 Extracción de ARN total con Trizol 21
6 Determinación de la concentración de ADN y ARN por 22

espectrofotometría
7 Resolución de fragmentos de ADN 23
8 Cultivo Bacteriano 26
9 Transformación de Escherichia coli con ADN plasmídico 32
10 Obtención de ADN plasmídico 35
11 Análisis del plásmido pCDNA3 con enzimas de restricción 39
12 Detección de una inserción Alu por PCR 44
Bibliografía Consultada 48
2
Práctica 1
Midiendo, pipeteando y trabajando en condiciones de esterilidad
Introducción
Esta práctica introduce a las técnicas de pipeteo y pipeteo en esterilidad, técnicas usadas a
través del curso. Dominar estas técnicas es sumamente importante para obtener buenos
resultados en el resto de las prácticas. La mayoría de los laboratorios usan volúmenes muy
pequeños de ADN y reactivos. Esto requiere el uso de una micropipeta ajustable que pueda
medir volúmenes tan pequeños como 1 microlitro.
Muchos de los experimentos también requieren del crecimiento de Escherichia coli en un medio
de cultivo que también provee un ambiente ideal para otros microorganismos. Por lo tanto es
importante mantener las condiciones de esterilidad, minimizar la oportunidad de contaminar un
experimento con bacterias u hongos foráneos. Las condiciones de esterilidad deben ser
mantenidas siempre que las células bacterianas vivas vayan a ser reusadas en cultivos
posteriores. Se debe usar material estéril para todo lo que entra en contacto con un cultivo
bacteriano; medio nutritivo, soluciones, pipetas, puntas, asas de inoculación y esparcidores,
frascos, tubos y placas de cultivo.
Recuerda esta regla: Usar técnica estéril si la bacteria viva es necesaria al final de una
manipulación (cultivo general y transformaciones). Por el contrario, la técnica estéril no es
necesaria si la bacteria será destruida por las manipulaciones durante el experimento.
Conversiones métricas
Se tiene que familiarizar con las unidades métricas de medida y sus conversiones. Nos
concentraremos en las medidas de líquidos basadas en el litro, pero los mismos prefijos (mili- y
micro-) también se aplican a las medidas en gramos. Las dos medidas más usadas en biología
molecular son el mililitro (ml) y el microlitro (l).
1 ml = 0.001 litro 1,000 ml = 1 litro

1 l = 0.000001 1,000,000 l = 1 litro
Estructura de la micropipeta
Una micropipeta consta de las siguientes partes:
Embolo: girándolo suavemente sirve para seleccionar el volumen que se va a tomar. Se auxilia de
un seguro para no perder el volumen seleccionado. También sirve para tomar y depositar el
líquido que se está dispensando.
Control de volumen: el volumen también se puede seleccionar en estos discos negros.
Ventana de volumen: es una ventanita de color negro o blanco que se localiza a un costado de la
micropipeta, sirve para observar de manera numérica el volumen seleccionado.
Botón para quitar punta: es el botón cercano al embolo y al presionarlo libera la punta de la
micropipeta.
Eyector de puntas: sirve para empujar la punta hacia abajo y liberarla de la micropipeta.
3
Puntas: sirven para recoger el volumen de líquido a medir y son de diferentes tamaños, están
relacionadas con el volumen y el tipo de micropipeta. Generalmente para P (pipeta) 1000 las
puntas son azules, para P200 son amarillas y para P20 son blancas.
Figura 1. Esquema que muestra las partes de una micropipeta. Tomada de

https://www.google.com.mx/search?q=estructura+de+una+micropipeta&newwindow=1&biw=1024&bih=499&tbm=isch&source
=lnms&sa=X&ved=0ahUKEwja3fDwtqXOAhUr0oMKHeIMAwsQ_AUICCgB&dpr=1#imgrc=3hzXpvCS-5sDsM%3A
Manejo de la micropipeta
Antes de usar la micropipeta debemos cerciorarnos que tenga graduado el volumen requerido, la
punta correcta y que no tenga el seguro del embolo.
1 Unidades de Millar
0 Centenas
0 Decenas
0 Unidades
Figura 2. Se muestra la ventana de graduación de P1000, marcando 1000 µl.
4
El rango de volumen de las micropipetas varía con el fabricante. Las más usadas son; una
micropipeta de volumen pequeño (0.5-10 l o 1-20 l o 2-20 l) y una micropipeta de gran
volumen (100-1000 l). Aunque también se cuenta con una micropipeta de rango medio (10-
100 l o 20-100 l o 20-200 l o 20-300 l).
Los rangos resaltados en negritas corresponden a las micropipetas que vamos a utilizar en este
curso.
Toma las siguientes precauciones al momento de usar una micropipeta:

Nunca rotar el ajustador de volumen más allá del rango inferior o superior de la pipeta.
Nunca usar la micropipeta sin la punta en su lugar; esto puede arruinar el pistón.
Nunca invertir o dejar la pipeta sobre la mesa con una punta llena; el líquido podría entrar
dentro del pistón.
Nunca liberar violentamente el émbolo después de vaciar el líquido; esto podría dañar el pistón.
Nunca meter el cono de la pipeta en líquido.
Nunca flamear la punta de la micropipeta.
Nunca reusar una punta.
Pipetas de 10 ml
Las pipetas de plástico, pre-esterilizadas y desechables son una buena opción, aunque un poco
cara. En nuestro curso utilizaremos pipetas de 10 ml envueltas individualmente en papel estraza
y esterilizadas en olla de presión. Estas pipetas deben ser abiertas al momento de ser usadas.
Para esto; cortar el papel estraza en el extremo en donde se encuentra la cinta testigo y
descubre este extremo de la pipeta, inserta este extremo en el pipeteador o en el bulbo y ten
precaución de no tocar ninguna parte de la pipeta y de que ésta no toque ninguna superficie.
Retirar el resto del papel estraza justo antes de usarla.
Flamear o no flamear
Los científicos están en desacuerdo sobre si es necesario flamear las pipetas y las bocas de los
tubos como parte de la técnica de esterilidad. Al flamear se mata algunos de los microbios que
tienden a acumularse en el borde del tubo. También se calienta el aire en la boca del
contenedor, creando una corriente de convección que evita que los microorganismos lleguen
dentro del contenedor. Aun así, el efecto de flamear puede ser primariamente psicológico, si se
están usando suministros recién esterilizados y las manipulaciones son realizadas rápidamente.
Especialmente cuando son usados suministros envueltos individualmente, el flameo puede ser
omitido sin temor de comprometer la esterilidad. El flameo no es recomendable para utensilios
plásticos porque se queman fácilmente.
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Midiendo, pipeteando y trabajando en esterilidad
Reactivos
Solución I 3 ml
Solución II 3 ml
Solución III 3 ml
Solución IV 3 ml
Materiales
Micropipeta y puntas de 1000 l (Puntas azules)
Micropipeta y puntas de 300 l (Puntas amarillas)
Micropipeta y puntas de 10 l (Puntas blancas)
Pipetas de 10 ml
Pipeteador o bulbo
Tubo Falcon de 50 ml
Tubo Falcon de 15 ml
Tubos Eppendorf de 1.5 ml
Contenedor para desechar las puntas
Marcador permanente (Sharpie)
Mechero
Gradilla
Uso general de la micropipeta

1. Rotar el ajustador de volumen a la medida deseada. Notar el cambio en la longitud del
émbolo conforme el volumen cambia. Asegúrese de localizar adecuadamente el punto decimal
cuando estás leyendo el volumen seleccionado.
2. Colocar firmemente la punta adecuada al tamaño de la micropipeta.
3. Al momento de tomar el líquido, siempre sostener la micropipeta firmemente entre tu pulgar
y el índice. Cerciorarse de que hubo un cambio en el nivel del líquido en la punta de la pipeta.
No pipetear con el tubo de prueba dentro de la gradilla. Si no tienes otra persona, tú mismo
sostén el tubo mientras pipeteas.
4. Cada tubo debe ser sostenido en la mano durante cada manipulación. Abre la tapa del tubo
ejerciendo presión con tu pulgar sobre la lengüeta del tubo. Durante las manipulaciones, toma
el cuerpo del tubo (más que la tapa) para proveer un mayor control y evitar contaminación de la
boca del tubo.
5. Para mejor control, comprime la micropipeta en la palma de tu mano y enreda tus dedos
alrededor del barril; trabaja el pistón con el pulgar. Mantén la micropipeta casi vertical cuando
la estés llenando.
6. La mayoría de las pipetas tienen un émbolo de dos posiciones. Presionando al primer tope se
mide el volumen deseado. Presionando hasta el segundo tope se introduce un volumen
adicional de aire para expulsar cualquier resto de solución de la punta. Notar estas dos
posiciones.
7. Para tomar la muestra de un tubo:
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a. Presiona el émbolo al primer tope y sostenlo en esta posición. Introduce la punta en la
solución y recoge el líquido dentro de la punta, liberando gradual y suavemente el émbolo.
Asegúrese de que la punta permanece dentro de la solución mientras se está liberando el
émbolo.
b. Deslice la punta de la pipeta a lo largo de la pared interna del tubo para eliminar cualquier
exceso de líquido adherido a la superficie externa de la punta.
c. Checar que no haya un espacio de aire en el extremo de la punta. Para evitar futuros errores
de pipeteo aprende a reconocer los niveles aproximados a los cuales se llena la punta de la
pipeta con volúmenes particulares.
d. Si notas espacio en la punta de la pipeta o burbujas de aire dentro de la muestra, expele de
nuevo y con mucho cuidado, la muestra al tubo original. Luego, has que toda la muestra vaya al
fondo del tubo por medio de suaves golpeteos o bien pulsando el tubo en una microcentrífuga.
8. Para expulsar la muestra:

a. Tocar con la punta de la pipeta la pared interna del tubo donde se va a depositar la muestra.
Esto crea un efecto capilar que ayuda a que el líquido fluya fuera de la punta.
b. Presionar lentamente el émbolo hasta el primer tope para expulsar la muestra. Presionar
hasta el segundo tope para terminar de depositar el resto de la muestra. Sostener el émbolo en
esta posición.
c. Sacar la pipeta fuera del tubo con el émbolo presionado para evitar succionar de manera
accidental algo de líquido.
d. Retirar la punta y depositarla en el contenedor apropiado. La punta es expulsada presionando
un botón independiente llamado botón de expulsión.
9. Para evitar contaminación cruzada:

a. Siempre agrega las cantidades apropiadas de un mismo reactivo secuencialmente a todos los
tubos de reacción.
b. Libera cada gota de reactivo en una nueva localización de la pared interna, cerca del fondo
del tubo. En esta forma, la misma punta puede ser usada para pipetear el reactivo dentro de
cada tubo de reacción.
c. Usar una punta nueva para pipetear cada nuevo reactivo.
d. Si la punta se llega a contaminar, cambiar por una nueva.
Práctica con la micropipeta de volumen pequeño

Este ejercicio simula la preparación de una mezcla de reacción.
1. Con un marcador permanente etiqueta tres tubos ependorf (A, B y C).
2. Usa la siguiente tabla para preparar las soluciones que se te piden
Tubo Solución I Solución II Solución III Solución IV

A 3 l 5 l 2 l ---
B 4 l 4 l --- 2 l
C 3 l 3 l 2 l 2 l
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3. Selecciona en la micropipeta el volumen indicado en la tabla para la solución I y agrégala a
cada tubo de reacción.
4. Usa una punta nueva para agregar el volumen apropiado de la solución II en un punto limpio
de los tubos A, B y C.
5. Usa una punta nueva para agregar 2 l de la solución III a los tubos A y C.
6. Usa una punta nueva para agregar 2 l de la solución IV a los tubos B y C.
7. Cierra los tubos. Mezcla los reactivos; golpeando suave pero firmemente la mesa con el fondo
del tubo o bien con la ayuda de una microcentrífuga.
8. Un volumen total de 10 l de reactivos fueron añadidos a cada tubo de reacción. Para checar
tus medidas, selecciona la pipeta en 10 l y muy cuidadosamente recoge el contenido de cada
tubo.
¿Está la punta apenas llena?
¿Queda un poco de líquido en el tubo? Esto indica que se realizó una sobremedición.
c. Después de recoger todo el líquido, ¿Queda un pequeño espacio en el extremo de la punta?
Esto indica que se hizo una submedición.
9. Si varias medidas fueron incorrectas, repetir el ejercicio hasta obtener resultados correctos.
Práctica con la micropipeta de volumen medio

Este ejercicio simula la preparación de una mezcla de reacción.
1. Con un marcador permanente etiqueta tres tubos ependorf (D, E y F).

D 80 l 100 l 20 l ---
E 80 l 100 l --- 20 l
F 80 l 80 l 20 l 20 l
3. Selecciona en la micropipeta los volúmenes adecuados de las soluciones I-IV para agregar a
los tubos D, E y F. Sigue el mismo procedimiento como en la práctica anterior.
4. Un total de 200 l de reactivos fueron añadidos a cada tubo de reacción. Para checar lo
correcto de tus medidas, selecciona en la pipeta 200 l y muy cuidadosamente recoge el
contenido de cada tubo.
a. ¿Está la punta apenas llena?
b. ¿Queda un poco de líquido en el tubo?
5. Si tus mediciones fueron incorrectas, repite el ejercicio hasta obtener resultados correctos.
Práctica con la micropipeta de volumen grande

Es más fácil hacer mediciones erróneas cuando se usa una micropipeta de gran volumen. Si el
émbolo no es liberado lentamente, se puede formar una burbuja de aire o la solución puede ser
arrastrada dentro del pistón.
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1. Con un marcador permanente etiqueta tres tubos ependorf (G, H e I).

G 100 l 200 l 150 l 550 l
H 150 l 250 l 350 l 250 l
I 200 l 300 l 400 l 100 l
3. Selecciona en la micropipeta los volúmenes adecuados de las soluciones I-IV para agregar a
los tubos G, H e I. Sigue el mismo procedimiento como en las prácticas previas.
4. Un total de 1000 l de reactivos fueron añadidos a cada tubo de reacción. Para checar lo
correcto de tus medidas, selecciona en la pipeta 1000 l y muy cuidadosamente recoge el
contenido de cada tubo.
a. ¿Está la punta apenas llena?
b. ¿Queda un poco de líquido en el tubo?
5. Si tus mediciones fueron incorrectas, repetir el ejercicio hasta obtener resultados correctos.
Uso de la pipeta de 10 ml
Las siguientes instrucciones incluyen flamear la pipeta y la boca del tubo. Es mejor aprender a
flamear y luego omitir el flameo cuando la seguridad o la situación lo amerite. Estas
instrucciones también asumen el pipeteo por una persona, lo cual es más difícil. El proceso es
mucho más fácil cuando se trabaja en equipo; una persona maneja la pipeta mientras la otra
remueve y reemplaza las tapas de los tubos.
La clave para una técnica exitosa es hacerlo rápido y eficientemente. Antes de comenzar,
despeja la mesa de trabajo y arregla tubos, pipetas y medio de cultivo. Localiza el mechero en
una posición central para evitar pasar las manos sobre el mechero con el fin de alcanzar algo.
Afloja las tapas de los tubos para que estén listos para una fácil remoción. Recuerda que entre
más tiempo esté destapado un tubo, existe una mayor oportunidad de que se contamine. No
colocar un tapón estéril sobre una superficie no estéril.
Se considera que una pipeta ya no está estéril si la punta o alguna de sus partes más bajas
entran en contacto con cualquier parte del ambiente (mesa, manos o ropa). Cuando hay
sospecha de contaminación, descartar la pipeta e inicia con otra pipeta estéril. Planea los pasos
a desarrollar, organiza tu área de trabajo y trabaja rápidamente.
Precaución
Siempre usar un pipeteador o un bulbo para pipetear soluciones. Nunca pipetear con la boca;
este método no es estéril y puede ser peligroso.
9
Práctica con la pipeta de 10 ml
1. Enciende la flama del mechero.
2. Tomar una pipeta de 10 ml estéril e insertar el extremo correspondiente en un pipeteador o
en un bulbo. Recuerda manejar sólo el extremo superior de la pipeta, evita tocar los dos tercios
inferiores.
3. Remover el resto del papel estraza y rápidamente pasar los dos tercios inferiores de la pipeta
varias veces sobre la flama. Asegúrate de flamear cualquier parte de la pipeta que entrará en el
contenedor estéril. La pipeta deberá llegar a estar caliente pero no tanto como para llegar a
romperse cuando se sumerja en la solución.
4. Tomar, con tu mano libre, el tubo Falcon de 50 ml que contiene la solución V y retirar la tapa,
usando el meñique de la mano que está sosteniendo el pipeteador. No colocar la tapa sobre la
mesa.
5. Rápidamente pasar la boca del tubo Falcon a través de la flama varias veces, debes ser
cuidadoso de no calentar en exceso.
6. Tomar 5 ml de la solución V.
7. Reflamear la boca del tubo y recolocar el tapón.
8. Remover el tapón del tubo Falcon estéril con el meñique de la mano que está sosteniendo al
pipeteador. Rápidamente flamear la boca del tubo.
9. Depositar el líquido dentro de este tubo. Reflamear la boca del tubo y recolocar el tapón.
10. Incubar y revisar por posible contaminación al día siguiente.
10
Práctica 2
Ensayo de enzimas de restricción para analizar el polimorfismo de globina beta S
mediante RFLP
(Práctica en laboratorio virtual Cibertorio)
Fundamento:
La anemia drepanocítica (anemia de células falciformes) se origina por la mutación de un solo
nucleótido en el gen de globina beta humana. Esto genera en la población un polimorfismo, definido por
la presencia del alelo normal o el mutado, en cada uno de los dos cromosomas 11 homólogos.
Pretendemos estudiar el posible diagnóstico genético de esta enfermedad a través de un polimorfismo
RFLP, es decir, mediante restricción y electroforesis.
Como material de partida disponemos de muestras de DNA (virtuales) correspondientes a una parte
de ese gen, para las dos variantes (normal, AA o WW, y drepanocítica, SS).
Por lo tanto, vamos a estudiar un locus que corresponde a una parte del gen de globina beta y que
contiene el punto polimórfico.
Más información (no necesaria para la práctica):
Concretamente, las muestras comprenden el exón 1, el intrón A, el
exón 2 y parte del intrón B.
Recuerda que el polimorfismo se sitúa en el exón 1.
Aclaración de la nomenclatura:
A la hemoglobina normal del adulto, 2 2 , se la llama habitualmente
hemoglobina A; de ahí el nombre A para el alelo normal de la globina beta aquí
estudiado. También se representa como W, de wild type (tipo silvestre).
La hemoglobina de las células falciformes (sickle cells), 2  S2 , se denomina
hemoglobina S.
Bibliografía:
 J. Luque y A. Herráez (2001) Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética,
págs. 381-383. Ediciones Harcourt / Elsevier España, Madrid.
Cómo comenzar:
El laboratorio virtual funciona dentro de una página web, por lo que debes comenzar abriendo el
navegador de internet (Internet Explorer o Firefox).
Una vez que se abra el programa, debes buscar la página de Cibertorio:

Puede estar en los “Favoritos” o “Marcadores”; si no, visita http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/
11
Práctica:
Búsqueda de una enzima de restricción adecuada para detectar el polimorfismo
Objetivo:
Encontrar una enzima de restricción que corte de forma diferente los alelos normal (W o A) y mutado
(S) del gen de globina beta.
Materiales virtuales:
Software:
• Laboratorio virtual de biología molecular “Cibertorio”
Reactivos virtuales:
• Enzimas de restricción (deben comprarse en BobCoTM, como se explica más adelante)
• Grupo de muestras para diagnóstico genético (también comprado en BobCoTM), que contiene las siguientes
muestras de DNA:
• DNA del gen de globina  de una persona homocigótica normal (representada como AA o WW).
• DNA del gen de globina  de una persona homocigótica falciforme (representada como SS).
• Cuatro muestras de DNA de pacientes cuyo genotipo se pretende averiguar (designadas Pt1, Pt2, Pt3 y
Pt4); en esta práctica no las usaremos.
• Marcador de masa molecular de DNA (gratuito, de BobCoTM)
• Tampón universal de restricción 10x (gratuito, de BobCoTM)
• Agua
• Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 L
• Agarosa
• Tampón de electroforesis TBE (Tris/Borato/EDTA)
• Bromuro de etidio
• Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, cianol-xileno y glicerol)
Instrumentación virtual:
• Micropipeta variable hasta 100 L
• Incubador con regulación de temperatura BobCo Temp-O-MaticTM
• Cubeta de electroforesis horizontal en agarosa BobCo Gel-O-MaticTM
• Fuente de corriente continua BobCo 1000ZXTM (de 10 a 1000V)
• Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)
• Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV
Procedimiento:
Comienza pulsando en el botón “Iniciar Cibertorio”. Aparecerá un aviso requiriendo que se haga un
pedido de enzimas; acéptalo.
1) Investiga la página del Catálogo en línea. Anota el tamaño en pares de bases de los componentes del
patrón de tamaños (Escalera de DNA) que emplearás más adelante para la electroforesis.
2) Pulsa el enlace para acceder al “Formulario de pedido”. Rellena los datos solicitados (esto es una
simulación de una situación real, no es importante lo que escribas mientras no cambies la contraseña) .
3) Selecciona las 4 enzimas que te han asignado y el “Grupo de muestras para diagnóstico genético”.
4) Pulsa el botón “Enviar el pedido”. Espera a que se actualice la pantalla y aparezca el laboratorio
simulado (tubos, pipeta, etc.).
12
Uso de la micropipeta virtual
Para seleccionar el tubo sobre el que quieres actuar
debes pulsar sobre él con el ratón (no sobre la tapa ni
la etiqueta); se abrirá su tapa y la pipeta se desplazará
a él. Haciendo clic en el pulsador superior del émbolo
consigues que se desplace, expulsando o aspirando
alternativamente el contenido de la punta. El volumen
que se quiere pipetear se establece pulsando con el
ratón sobre la rueda de ajuste (mitad izquierda
disminuye, mitad derecha aumenta) o escribiendo en la
casilla del indicador de volumen (no pulses la tecla
Enter).
El intervalo de trabajo de la micropipeta es de 1 a
100 μL, en pasos de 1 μL.
Para evitar contaminación, se deben cambiar las
puntas cada vez que se cambia de muestra. La punta
se expulsa haciendo clic con el ratón sobre la palanca
expulsora de puntas o sobre el cubo de basura.
Se consigue una punta nueva haciendo clic sobre la
caja de puntas.
Posibles problemas:
Dependiendo de la configuración de seguridad del navegador, es posible que se bloquee el acceso al impreso
de pedido hasta que aceptes un aviso similar a éste:
Si, por algún error, necesitas empezar de nuevo con tubos limpios, pulsa el botón correspondiente, situado a la
izquierda de la caja de puntas.
Tras pulsar con el ratón sobre tubo, pipeta, etc., deja tiempo para que ocurra lo que sea. No seas impaciente.
Al pulsar el émbolo de la pipeta, el cursor-mano no desaparece: mueve el puntero del ratón fuera de la pipeta.
Si quieres ver mejor el líquido que hay dentro de un tubo, puedes hacer que la pipeta salga del tubo pulsando
de nuevo en el tubo.
5) Prepara las mezclas de reacción para ensayar la restricción de las dos muestras de DNA (AA y SS)
con cada una de las cuatro enzimas asignadas. Para ello, seguir la siguiente tabla:
Componente Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Agua 25 l 25 l 25 l 25 l 25 l 25 l 25 l 25 l 25 l 25 l
DNA AA 10 l 10 l 10 l 10 l 10 l ----- ----- ----- ----- -----
DNA SS ----- ----- ----- ----- ----- 10 l 10 l 10 l 10 l 10 l
Buffer 4 l 4 l 4 l 4 l 4 l 4 l 4 l 4 l 4 l 4 l
Enzima BamHI Bsu36I EcoRI HindIII ----- BamHI Bsu36I EcoRI HindIII -----
(1 l/tubo)
Los tubos 5 y 10 actúan como control negativo ya que contienen una muestra de DNA sin
enzima.
Nota: de las 78 enzimas disponibles en el programa, 57 no cortan en esa región del DNA y, entre las 21 que
sí cortan, sólo 3 ven afectada su secuencia blanco por la mutación y, por ello, sirven para estudiar este
polimorfismo. Esto ilustra la baja probabilidad de que se pueda detectar mediante análisis de restricción un
polimorfismo causado por la mutación de un único nucleótido.
13
6) Pon en marcha la reacción de restricción pulsando en el botón “Incubar” (está en la parte central inferior,
bajo el cronómetro). Transcurrido el tiempo virtual requerido, se ha completado la reacción. Aparece un
mensaje que te informa de lo que se ha añadido en cada tubo; verifica que coincide con lo que pretendías.
7) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el módulo “Laboratorio de
electroforesis”. Pulsa el botón “Autocargar”, que hará que las muestras
preparadas en la digestión anterior se transfieran a los pocillos del gel
virtual. En el pocillo nº 13 se carga automáticamente una mezcla de
patrones de tamaño.
Los pocillos tras la carga se ven azules debido a los colorantes añadidos rutinariamente a las
muestras (azul de bromofenol y cianol-xileno), para facilitar que se vean primero éstas y luego
el frente de avance. También se ha añadido un agente denso (p.ej. glicerol, sacarosa o ficoll)
que hace que la muestra se deposite al fondo del pocillo. Los geles de agarosa como éste se
usan generalmente en posición horizontal.
La “autocarga” es una característica única de los geles BobCoTM; en la vida real las muestras
se deben transferir laboriosamente a mano desde los tubos a los pocillos con una micropipeta.
8) Ajusta en la fuente de corriente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2,5 horas virtuales. Conecta la
corriente para comenzar la electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de
tener puestas tus gafas o careta virtuales de protección) y apagar las luces de la habitación virtual para ver
cómo va avanzando el DNA y separándose las bandas.
En cualquier electroforesis, si la fuente de corriente de la que dispones no indica la intensidad

(miliamperios), es importante que te asegures de que está circulando la corriente. Observa cómo de ambos
electrodos se desprenden burbujas, efecto de la electrólisis del tampón. También verás que las bandas
azules de ambos colorantes avanzan por el gel (al igual que lo hacen las del DNA, si enciendes la luz UV).
Si se usan voltajes superiores, las muestras avanzarán más rápido por el gel, pero los voltajes elevados
producen corriente de alta intensidad y un calentamiento excesivo del gel que, aparte de afectar a la
muestra (por ej., desnaturalizando el DNA), puede llegar a fundir la agarosa. A diferencia de los geles
reales, los geles BobCoTM nunca se funden, por lo que el único inconveniente de usar un voltaje muy alto
puede ser que las muestras se pierdan por la parte inferior del gel antes de que te des cuenta.
9) Una vez completada la electroforesis, interpreta los resultados obtenidos:

Decide cuál de las enzimas es la adecuada para investigar el polimorfismo de la globina.
Justifica la enzima elegida y dibuja un esquema de cómo han quedado las bandas.
Este reporte lo debes de entregar a tu maestro.
10) Por comparación con el avance de las bandas del patrón (“escalera de DNA”), calcula el tamaño en
pares de bases que tienen los fragmentos de restricción obtenidos del DNA de las muestras. (Este
cálculo puede hacerse de forma precisa mediante una curva de calibrado, o bien de forma
aproximada por comparación visual del avance.)
Para medir el avance de cada banda puedes usar la regla disponible en la pantalla. (Arrastra la
regla usando el ratón y sitúala de modo que el cero coincida con los pocillos)
Para estimar el tamaño (n de pares de bases) del DNA de cada banda, construye una curva
de calibrado con log (n pb) frente a distancia migrada, empleando los patrones que se hayan
separado bien y que avancen en la misma zona a la que han llegado tus muestras (por ej.,
los 6 patrones más pequeños).
Representa la curva de calibrado y utilízala para calcular los tamaños.

Esto también debe formar parte del reporte.
14
Práctica 3
Diagnóstico genético de drepanocitosis mediante RFLP
Objetivo:
Empleando una enzima de restricción elegida previamente, que corta de forma diferente los alelos
normal y mutado del gen de la beta globina, realizar el diagnóstico genético de cuatro pacientes.
Materiales virtuales:
Software:
• Laboratorio virtual de biología molecular “Cibertorio”
Reactivos virtuales:
• Enzimas de restricción (deben comprarse en BobCoTM, como se explica más adelante)
• Grupo de muestras para diagnóstico genético (también comprado en BobCoTM), que contiene las siguientes
muestras de DNA:
• DNA del gen de globina  de una persona homocigótica normal (representada como AA o WW).
• DNA del gen de globina  de una persona homocigótica falciforme (representada como SS).
• Cuatro muestras de DNA de pacientes cuyo genotipo se pretende averiguar (designadas Pt1, Pt2, Pt3 y
Pt4).
• Marcador de masa molecular de DNA (gratuito, de BobCoTM)
• Tampón universal de restricción 10x (gratuito, de BobCoTM)
• Agua
• Puntas de pipeta amarillas, capacidad de 1 a 100 L
• Agarosa
• Tampón de electroforesis TBE (Tris/Borato/EDTA)
• Bromuro de etidio
• Colorante de carga de muestras en el gel (contiene azul de bromofenol, xileno-cianol y glicerol)
Instrumentación virtual:
• Micropipeta variable hasta 100 L
• Incubador con regulación de temperatura BobCo Temp-O-MaticTM
• Cubeta de electroforesis horizontal en agarosa BobCo Gel-O-MaticTM
• Fuente de corriente continua BobCo 1000ZXTM (de 10 a 1000V)
• Transiluminador ultravioleta (acoplado a la cubeta)
• Pantalla y gafas de seguridad protectoras contra UV
Procedimiento:
Debes haber realizado previamente la práctica “ensayo de enzimas de restricción”. Ahora, utilizando
únicamente la enzima adecuada para detectar este polimorfismo (seleccionada en la práctica anterior),
realizarás el análisis de cuatro muestras de pacientes a los que hay que diagnosticar si son portadores
del alelo causante de la drepanocitosis.
1) Si no lo has hecho ya, sigue las instrucciones de la práctica de ensayo de enzimas para comprar
muestras y enzimas en el impreso de pedido en línea de BobCo, así como para usar el
laboratorio virtual.
2) Prepara una tabla con los reactivos y la cantidad de cada uno que necesitarás para cada tubo:
tubo nº 1 2 3 4 5 6
vol. de agua 50 50 50 50 50 50
vol. de tampón 8 8 8 8 8 8
tipo de muestra SS AA Pt1 Pt2 Pt3 Pt4
vol. de muestra 22 L 22 L 22 L 22 L 22 L 22 L
volumen total 80 L 80 L 80 L 80 L 80 L 80 L
Prepara los 6 tubos de ensayo con el contenido indicado en la tabla.

A continuación, transfiere la mitad del contenido de cada tubo (40 L) al tubo situado debajo de él
(es decir, del tubo 1 al 7, del 2 al 8, etc.). Así has creado duplicados de cada tubo, uno quedará
como control y al otro añadiremos enzima de restricción.
15
A los tubos 7 a 12 añade ahora 1 L de la enzima de restricción que seleccionaste en la
práctica anterior (“ensayo de enzimas de restricción”).
3) Pon en marcha la reacción de restricción pulsando en el botón
“Comenzar”. Transcurrido el tiempo virtual requerido, se ha completado
la reacción.
4) En el menú principal de Cibertorio, selecciona el módulo “Laboratorio
de electroforesis”. Pulsa el botón “Autocargar”, que hará que las 12
muestras preparadas en la digestión anterior se transfieran a los 12 primeros pocillos del gel
virtual; en el pocillo nº 13 se carga automáticamente una mezcla de patrones de tamaño
(“escalera de DNA”).
5) Ajusta en la fuente el voltaje a 200 voltios y el tiempo a 2,5 horas virtuales. Conecta la corriente
para comenzar la electroforesis. Mientras progresa, puedes encender la luz UV (asegúrate de tener
puestas tus gafas o careta virtuales de protección) y apagar las luces de la habitación virtual para ver
cómo va avanzando el DNA y separándose las bandas.
6) Una vez completada la electroforesis, dibuja un esquema de la posición de las bandas e
interpreta los resultados obtenidos: ¿cuál es el genotipo de los cuatro pacientes? ¿Serán
portadores o desarrollarán la enfermedad?
Preguntas para evaluar los resultados:
Para hacer esta evaluación necesitas haber anotado la clave que te asigna el sistema al hacer un
pedido (una clave de 2 dígitos o letras que se muestra en la pantalla "Gracias por formalizar su pedido",
bajo el botón "confirmar el pedido y recibir los reactivos")
Escribe aquí la clave asignada a tu experimento:_____
1. ¿Cuántos genotipos diferentes has encontrado en el conjunto de 6 muestras (2 patrones y 4

pacientes)?
______
Pt1 Pt2 Pt3 Pt4
2. Deduce el genotipo de los pacientes:
3. Pacientes que probablemente desarrollen anemia
drepanocítica:
4. Pacientes que no desarrollarán la enfermedad pero la pueden
transmitir a su descendencia:
16
Práctica 4
EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO CON FENOL/CLOROFORMO Y PRECIPITACIÓN
CON ALCOHOL
Introducción
Es uno de los métodos más comúnmente usados y útiles para el aislamiento y concentración de
ADN y ARN a partir de soluciones acuosas, la extracción con fenol/cloroformo es seguida por la
precipitación con etanol. El fenol usado en este protocolo es amortiguado para evitar que los
productos oxidados del fenol dañen a los ácidos nucleicos. Se debe tener cuidado ya que el fenol
puede producir severas quemaduras en la piel y puede dañar la ropa. En el método presentado
se recomienda la solución fenol/cloroformo (50/50%) para la extracción. En la mayoría de los
casos, esta mezcla provee una buena desnaturalización de las proteínas y una fuerte interfase
entre la fase acuosa y la fase orgánica. Si existe problema por la presencia de una gran cantidad
de espuma durante la extracción, se puede agregar alcohol isoamílico para obtener la siguiente
proporción fenol/cloroformo (50/49%) y alcohol isoamílico (1%).
Durante la precipitación con etanol, las sales y otros solutos como residuos de fenol y cloroformo
se mantienen en solución mientras que los ácidos nucleicos forman un precipitado blanco que
puede ser fácilmente colectado por centrifugación. Para una eficiente precipitación, la
concentración del ácido nucleico debe ser de al menos 10 g/mL. Concentraciones menores
pueden ser precipitadas, pero la cantidad recuperada será muy baja. Para facilitar la precipitación
de concentraciones bajas de ácidos nucleicos, se puede incubar el precipitado a -20°C por 4 horas
o por toda la noche y centrifugar por 30 min.
Obtención de ADN de hígado de pollo
Métodos
Obtención y lisis del órgano
1. Obtener un hígado fresco de pollo.
2. Disecar el hígado y rápidamente obtener trozos pequeños con tijeras (0.2-0.3 g).
3. A tubo Eppendorf-1.5 ml; 400 L de regulador de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 20 mM,
EDTA 1mM, SDS 0.0312%)
4. Macerar con lanceta hasta lograr la disgregación completa del tejido.
Extracción de ADN con Fenol/Cloroformo

5. Agregar un volumen de fenol/cloroformo (50:50) igual al volumen inicial de la solución (0.4 ml).
Mezclar las fases con movimientos repetidos de inversión durante 10 seg.
6. Separar las fases en la microcentrífuga (12,000 rpm) por 2 min. La fase orgánica es la que se
ubica en la parte inferior del tubo debido a su mayor densidad, además de su característico color
amarillo.
7. En la parte superior se va a encontrar la fase acuosa. Con una micropipeta recuperar con mucho
cuidado esta fase acuosa.
17
8. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf-1.5 mL limpio. Evitar arrastrar parte de la
interfase y sobre todo no transferir nada de la fase orgánica.
Si se aprecia un precipitado blanco en la interfase se deben repetir los pasos 5-8 sobre la fase
acuosa recuperada.
Precipitación con etanol

9. Agregar 1/10 del volumen total recuperado de Acetato de Sodio 3 M, pH 5.2. Mezclar
brevemente por inversión. Agregar 2.5 volúmenes de etanol al 100%, enfriado previamente en
hielo. Mezclar con vortex o por inversiones repetidas. Incubar en hielo por 10 min.
10. Precipitar el ácido nucleico por centrifugación a 14,000 rpm por 10 min. Si la muestra es
mayor a 10 g, el precipitado puede ser visto como un pequeño punto blanco a un lado de la
parte más baja del tubo.
11. Con una micropipeta, drenar todo el líquido del tubo.
12. Agregar 1 mL de etanol al 70%. Mezclar y colectar nuevamente el precipitado por
centrifugación a 14,000 rpm por 5 min. Decantar para eliminar el etanol.
13. Para secar el precipitado, colocar los tubos bocabajo y abiertos sobre un papel secante hasta
que la totalidad del etanol se haya evaporado (15 min aprox).
14. Agregar 200 L de TE o de agua bidestilada estéril y disolver el ADN mediante pipeteo suave.
Grandes cantidades de ácidos nucleicos son difíciles de resuspender, asegurarse de que el ADN
está completamente disuelto antes de continuar.
Comentario
Si la concentración del ácido nucleico es muy alta (más de 300 g/mL) se puede formar un
precipitado visible sin necesidad de enfriar la muestra. Una vez que se forma un precipitado
visible, no es necesario enfriar la muestra, ni esperar para colectar este precipitado por
centrifugación.
SOLUCIONES MADRE
Tris-HCl 1M pH 8
Tris-base 6.05 g
Disolver con 30 ml de agua
Ajustar a pH 8 con HCl N
Agua cbp 50 ml
Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Almacenar a TA. Estable
indefinidamente
NaCl 5 M
NaCl 29.225 g
Agua, cbp 100 ml
indefinidamente
18
EDTA 0.5 M pH 8
Ácido etilendiaminotetracético, disódico 18.61 g
Agua 80 ml
Ajustar a pH 8
Agua, cbp. 100 ml
Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Estable indefinidamente a TA.
SDS al 10%
SDS 10 g
Agua, cbp 100 ml
Disolver lentamente el SDS (grado electroforético) en 70 ml de agua, evitando la formación de
espuma y aforar. Autoclavear en un frasco de vidrio de 100 mL con tapón flojo. Almacenar a TA.
Estable indefinidamente. No es necesario filtrar
Tris HCl M pH 7.4

Tris-base 6.05 g
Disolver con 30 ml de agua
Ajustar a pH 7.4 con HCl N
Agua cbp 50 ml
indefinidamente.
SOLUCIONES DE TRABAJO
Regulador de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0.032%)
Tris H-Cl M pH 8 5 ml
NaCl 5 M 0.4 ml
EDTA 0.5 M pH 8 0.2 ml
SDS al 10% 0.32 ml
Agua cbp 100 ml
Guardar en un frasco de vidrio de 100 mL. Estable indefinidamente.
Acetato de Sodio, 3M
Acetato de sodio, trihidratado 408 g
Agua destilada 500 ml
Ajustar a pH 5.2 con ácido acético 3 M
Agua destilada, cbp. 1000 ml
TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM, pH 7.4)

Tris HCl M pH 7.4 1 ml
EDTA 0.5 M pH 8 0.2 ml
Agua estéril, cbp 100 ml
Guardar en un frasco de vidrio de 100 mL. Estable indefinidamente a TA.
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Preparación de fenol equilibrado
El fenol es muy cáustico y no debe pesarse. Para fundir los cristales calentar el recipiente original
a baño maría. Puede causar quemaduras severas por lo que se debe de usar guantes, bata y lentes
de seguridad al manipularlo. Cualquier área de la piel que tenga contacto con el fenol se debe
enjuagar con gran cantidad de agua y lavar con jabón.
1. En un vaso de precipitado de 2 litros, colocar 0.5 g de 8-hidroxiquinolina y agregar

cuidadosamente 500 mL de fenol fundido. El fenol se tornará de color amarillo.
2. Agregar 500 mL de Tris-base 50 mM pH 8, tapar el vaso con papel aluminio y agitar a baja
velocidad por 10 min en un agitador magnético a temperatura ambiente.
3. Dejar reposar para permitir que las fases se separen.
4. Aspirar la fase acuosa con una pipeta Pasteur hacia la trampa de vacío.
5. Agregar 500 mL de Tris-base 50 mM pH 8 y repetir los pasos 2-4.
6. Con tira indicadora checar el pH de la fase fenólica y si no es de 8.0, repetir los pasos anteriores.
7. Una vez alcanzado el pH de 8.0, agregar 250 mL de Tris-HCl 50 mM pH 8.0
8. Guardar en un frasco de vidrio ámbar. Almacenar a 4ºC (estable por dos meses) o a -20ºC.
20
Práctica 5
EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL CON TRIZOL
Metodología
El ARN total será aislado a partir de 100-120 mg de hígado fresco de pollo.
1. Depositar la muestra del tejido en un tubo Ependorf de 1.5 ml.

2. Agregar 1 ml de TRIzolMR (Invitrogen, Cat. 15596-026) que es un reactivo elaborado a partir de
una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina para el aislamiento de ARN
desarrollado por Chomczynsky y Sacchi (1987).
3. Disgregar el tejido con ayuda de un palillo estéril.
4. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente (TA).
5. Agregar 200 μl de cloroformo para facilitar la separación de la fase acuosa.
6. Agitar los tubos por inversión durante 1 minuto e incubar por 2 a 3 minutos a TA.
7. Centrifugar a 12,000 rpm por 15 minutos a 4º C (al finalizar este paso se debe encontrar una
fase roja inferior llamada fase de fenol-cloroformo, una fase intermedia con ADN y una fase
acuosa incolora superior con ARN).
8. Transferir la fase acuosa a un tubo Ependorf nuevo y agregar 500 μl de alcohol isopropílico con
el fin de precipitar el ARN.
9. Incubar por 10 minutos a TA.
10. Centrifugar las muestras a 12,000 rpm por 15 minutos a 4º C y eliminar el sobrenadante.
11. Levantar la pastilla de ARN que queda en el fondo del tubo con 1 ml de Etanol al 75 % frío,
mediante inversión manual vigorosa.
En este paso se puede almacenar el ARN a 4° C por una semana o a -20° C hasta por un año. Si se
va a utilizar inmediatamente continuar con los siguientes pasos.
12. Centrifugar a 10,000 rpm por 5 minutos a 4º C, eliminar el sobrenadante y permitir que el
etanol se evapore completamente.
13. Finalmente, disolver el ARN en 40 µl de agua destilada con dietil pirocarbonato (agua-DEPC)
o 0.1 mM de EDTA.
14. Para facilitar la disolución del ARN incubar el tubo a 55-60°C por 10-15 minutos.
Estas muestras deberán mantenerse en congelación para ser utilizadas en la reacción de la

transcriptasa reversa en los 10 días subsecuentes sin ningún problema.
El ARN total será cuantificado con el fin de determinar su cantidad y calidad, las lecturas se
realizarán en un espectrofotómetro de luz ultravioleta (Jenway, Genova MK3) utilizando una
longitud de onda de 260 nm. Posteriormente se analizará por electroforesis en geles de agarosa
al 1.8% y se visualizará en un transiluminador de luz ultravioleta. Debido al tamaño de los ARN
ribosomales, que son las moléculas que son visibles, se utilizará esta concentración de agarosa.
21
Práctica 6
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ADN Y ARN POR
ESPECTROFOTOMETRÍA
Metodología
1. Hacer una dilución 1:50 con el ADN y el ARN obtenido. Esto es; poner 4 l de la muestra de
ADN en 196 l de agua bidestilada estéril o TE. Mezclar por pipeteo suave. Trasferir a la cubeta
de cuarzo.
2. Obtener la lectura de la solución blanco (100 l de agua bidestilada o TE).
3. Colocar la cubeta de cuarzo con la muestra en el espectrofotómetro y leer la densidad óptica a
una longitud de onda de 260 nm.
4. Para calcular la concentración se debe considerar que 1 UA260 = 50 g/l de ADN y 40 g/l de
ARN. Hacer los cálculos correspondientes para la lectura obtenida.
5. Si se desea evaluar la pureza de la muestra, tomar una segunda lectura a 280 nm. Determinar
la razón de las lecturas obtenidas a 260/280 nm. Si esta proporción es mayor a 1.75, la absorción
observada es probablemente debida a ácidos nucleicos. Si esta proporción es menor a 1.6, puede
haber proteína u otros contaminantes (residuos de fenol u otros componentes orgánicos) en la
muestra. En este caso, se recomienda la reextracción con fenol/cloroformo y la precipitación con
etanol.
TABLA DE MANIPULACIONES
1. Diluciones para espectrofotometría
Equipo DNA (l) TE (l) Dilución
1 4 196 1:50
2 4 196 1:50
3 2 98 1:50
4 1:50
TABLA DE RESULTADOS
R1. Lecturas en el espectrofotómetro y concentración del ADN
DNA Concentración (g/ml)
(diln 1:50) A260 A280 A260/A280 Lectura F Dilución Valor Real
Equipo 1 50
Equipo 2 50
Equipo 3 50
Equipo 4 50
* 1 UA260 = 50 g/ml.
22
Práctica 7
RESOLUCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN
Introducción
La separación individual de los fragmentos de ADN o ARN se logra mediante electroforesis en
geles de agarosa. La electroforesis es una técnica que se utiliza para separar moléculas
(proteínas o ácidos nucleicos) según su movilidad en un campo eléctrico. El burbujeo de gas
hidrógeno saliendo del electrodo negativo y el oxígeno saliendo del electrodo positivo
(productos de la electrolisis del agua) son los primeros signos de que la corriente está fluyendo
a través del sistema de electroforesis. Un poco después las bandas del buffer de carga se verán
moverse dentro del gel y migrar hacia el polo positivo de la cámara de electroforesis. La banda
del buffer de carga, rápidamente, se resuelve en dos bandas; la que se mueve más rápido, de
color púrpura es azul de bromofenol y la que se mueve más lento, de color azul cielo es cianol
xileno.
La mejor separación para el análisis de ADN plasmídico se alcanza cuando el azul de bromofenol
ha migrado 40-70 mm a partir del origen.
La migración del ADN a través del gel de agarosa depende sobre todo del voltaje; a un mayor
voltaje hay una tasa más rápida de migración. Sin embargo, los voltajes altos acentúan las
imperfecciones en el gel, tales como diferencias en la densidad y grosor entre las diferentes
partes del gel. Efectos comunes incluyen bandas inclinadas o en forma de U (“se sonríen”). El
efecto inclinado ocurre más frecuentemente en los bordes del gel, donde el gel líquido se
adhiere al molde para formar un menisco, haciendo los bordes del gel más gruesos que en el
centro. La resistencia está disminuida en los bordes más gruesos de los carriles externos,
permitiendo que las moléculas de ADN de estos carriles migren más rápido que moléculas de
ADN de tamaños similares de carriles internos. También el calor generado por voltajes altos
puede fundir el gel y cambiar sus propiedades de tamizado. Por estas razones se deben evitar
los voltajes superiores a 125 v en un sistema de minigel.
Tinción con bromuro de etidio y manejo responsable

El bromuro de etidio es el reactivo más rápido, sensible y reproducible para teñir ADN. Sin
embargo, tiene actividad mutagénica y carcinogénica. Así la tinción debe desarrollarse en un
área controlada y específica. El manejo responsable de la solución diluida de bromuro de etidio
(1 mg/ml) para teñir geles minimiza los riesgos inherentes.
Observación de geles teñidos

Los geles ya teñidos son observados en un transiluminador, el cual consiste de una lámpara de
luz ultravioleta que emite luz en el rango óptimo (260-360 nm) para iluminar a los geles teñidos
con bromuro de etidio. La transiluminación (i.e.; el paso de la luz a través del gel) permite la
mejor observación posible de las bandas de ADN.
Las fotografías de los geles de ADN proveen un record permanente de los experimentos,
permitiendo el análisis de los resultados, descubrir sutilezas de interpretación y corregir errores.
Adicionalmente, el tiempo de exposición de la cámara fotográfica puede permitir la percepción
de bandas tenues o invisibles a simple vista.
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Precaución: La luz ultravioleta (UV) puede dañar la retina de los ojos, por ello nunca se debe
mirar directamente a la luz UV sino con la protección adecuada.
Práctica de electroforesis en geles de agarosa
Preparación de un gel al 1.5%

1. En un vaso de precipitado de 100 mL, pesar 450 mg de agarosa, posteriormente agregar 30 mL
de TBE y permitir que se hidrate por 1 min.
2. Calentar por 1 min en el horno de microondas. Se debe cuidar de que no se derrame de tal
manera que debemos detener el proceso antes de que suceda, dejar enfriar un poco, agitar con
movimientos circulares y continuar hasta completar el minuto.
3. Dejar enfriar sobre la mesa hasta que alcance unos 55°C. Mientras tanto, sellar los extremos
del molde con cinta masking-tape. Una vez fría, vaciar la agarosa fundida sobre el molde y colocar
el peine en la posición correcta. Dejar que la agarosa gelifique, lo cual se evidencia por que toma
una tonalidad blanca opaca.
4. Retirar el peine y la cinta masking-tape, colocar el molde y el gel en la cámara de electroforesis
y llenar con TBE (400 mL aprox). Se debe verificar que el nivel alcanzado por el TBE se encuentre
1 mm por arriba del gel.
Colocación de las muestras

5. Sobre un pedazo de Parafilm depositar 2 l del amortiguador de carga-10 por cada una de las
muestras que se vayan a analizar. Posteriormente colocar 6-10 l de la muestra.
6. Mediante pipeteo suave mezclar la muestra con el amortiguador de carga. Tomar la totalidad
del volumen y con mucho cuidado depositarlo en el pozo correspondiente. Proceder de la misma
manera con las muestras restantes. Tomar registro del orden en el cual fueron colocadas las
muestra. De ser el caso colocar el marcador de peso molecular para ADN.
Condiciones de Electroforesis
7. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis. Tomar en cuenta que las muestras corren del
polo negativo (negro) hacia el positivo (rojo), de tal manera que se debe corroborar que el gel
esté bien orientado. Asimismo, cerciorarse de que dichos colores coincidan entre los cables y las
terminales de la fuente de poder al conectarlos. Encender la fuente de poder, seleccionar 90
voltios y presionar el botón verde para iniciar la corrida. Permitir que corra por 1 hora.
Visualización del gel

8. Después de que transcurra el tiempo de corrida, sumergir el gel por 20 min en una solución de
Bromuro de Etidio. Al realizar este paso tomar la precaución de usar guantes de látex ya que este
reactivo tiene propiedades mutagénicas.
9. Con mucho cuidado regresar el bromuro de etidio al frasco. Enjuagar con agua corriente y llevar
al transiluminador.
10. Prender el transiluminador, observar y obtener el registro fotográfico. Cerciorarse de que esté
bien colocado el protector de acrílico antes de prender el transiluminador.
11. Al final, realizar la limpieza del transiluminador con etanol.
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TBE
Solución stock 5:
Tris base 54.0 g
Ácido bórico 27.5 g
EDTA dihidratada 3.72 g
Punto de Paro: El gel se puede guardar en una bolsa de plástico, sumergido en buffer y a 4° C,
así permanecerá en buenas condiciones por varios días.
25
Práctica 8
Cultivo Bacteriano
Introducción
Escherichia coli, es una bacteria que tiene requerimientos nutricionales simples. Crece
lentamente en un medio mínimo que contenga; 1) un origen de energía como glucosa, 2) sales
como NaCl y MgCl2, 3) la vitamina biotina, y 4) el nucleósido timidina. A partir de estos
precursores E. coli sintetiza todas las vitaminas y aminoácidos necesarios. Por otra parte, crece
rápidamente en un medio completo, como LB, en el cual el extracto de levadura y la caseína
hidrolizada proveen una fuente de vitaminas y aminoácidos.
Un cultivo bacteriano líquido pasa a través de una serie de fases de crecimiento; después de la
inoculación (30 minutos), hay una fase lag durante la cual no hay crecimiento celular. La
bacteria comienza a dividirse rápidamente durante la fase log, cuando el número de células se
duplica cada 20-25 minutos. Cuando los nutrientes en el medio son depletados, las células
paran de dividirse y entran a la fase estacionaria, con una concentración de aproximadamente
109 células/ml. Durante la fase de muerte, los productos de desecho se acumulan y las células
comienzan a morir.
El crecimiento óptimo en medio líquido se alcanza con agitación continua, lo cual airea las
células, facilita el intercambio de nutrientes y hace fluir a los productos de desecho del
metabolismo. Se puede asumir que un cultivo en medio completo ha alcanzado la fase
estacionaria, después de una incubación “overnight” con agitación continua.
Un cultivo en la fase estacionaria lucirá nuboso y turbio. Se debe desechar cualquier cultivo
“overnight” donde no hay evidencia de crecimiento vigoroso.
Todos los protocolos que involucran crecimiento, transformación y aislamiento de plásmidos
han sido probados y optimizados con dos cepas de E. coli: MM294 y JM101.
En la primera parte de esta práctica, se estriarán células de E. coli sobre placas de agar LB con la
finalidad de sembrar células aisladas. Entonces cada célula se reproducirá para formar una
colonia visible compuesta por individuos genéticamente idénticos (clona). El estriar células para
obtener colonias aisladas es el primer paso en la manipulación genética de microorganismos.
Usar células derivadas de una sola colonia minimiza la probabilidad de usar una masa celular
que ha sido contaminada con un microorganismo extraño.
Para demostrar la resistencia a antibiótico, se comparará el crecimiento de E. coli silvestre (wild-
type) con el de una E. coli que contiene un gen de resistencia a ampicilina, en un medio de
cultivo LB con ampicilina (LBA). La cepa resistente contiene el plásmido pAMP, el cual provee
una enzima que destruye a la ampicilina, permitiendo así el crecimiento de estas células.
En la segunda parte, se provee un protocolo para el crecimiento de E. coli en un cultivo en
suspensión a pequeña escala que alcanza la fase estacionaria con una incubación de toda la
noche (overnight). Los cultivos “overnight” son usados para la purificación de ADN plasmídico y
para inocular cultivos en la parte media de la fase logarítmica.
Cuando se está creciendo una cepa de E. coli que contiene un plásmido, es mejor mantener la
selección por resistencia a antibiótico usando medio LB conteniendo el antibiótico apropiado.
Así, las cepas que contienen un gen de resistencia a ampicilina deberán ser crecidas en medio LB
con ampicilina (LBA).
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La tercera parte, comienza con un cultivo “overnight” de E. coli en suspensión, el cual contiene
una alta proporción de células sanas capaces de reproducirse. El objetivo es subcultivar un
pequeño volumen del cultivo “overnight” en un gran volumen de medio nutritivo y fresco. Este
reinicio del cultivo a crecimiento cero donde, después de una corta fase lag, las células entrarán
a la fase log. Como regla general, un volumen del cultivo “overnight” (inóculo) es agregado a
100 volúmenes de medio LB fresco en un matraz Erlenmeyer. Para proveer la buena aireación
que el crecimiento bacteriano requiere, el volumen del matraz deberá ser al menos cuatro
veces el volumen total del cultivo.
I. Aislamiento de colonias individuales
Cultivos y placas
Cultivo de E. coli
2 placas LB
2 placas LB-ampicilina (LBA)
Reactivos y equipo
Asa microbiológica
Bolsa para residuos biológicamente peligrosos
Desinfectante o cloro al 10%
Mechero
Incubadora bacteriológica a 37° C
Estriar las placas e incubar

1. Con el marcador permanente identificar cada placa en la superficie inferior con tu nombre y
la fecha. Cada placa ha sido previamente identificada si es LB o LBA.
2. Sostén el asa microbiológica como un lápiz y esterilízala en la flama hasta que alcance un
color rojo intenso. Entonces pasa toda la extensión del asa a través de la flama.
3. Enfría el asa por 5 segundos. Para evitar contaminar no apoyes el asa sobre la mesa.
4. Si estás trabajando a partir de una placa:

a. Quita la tapa del cultivo con tu mano libre. No coloques la tapa sobre la mesa. Sostén la tapa
justo arriba de la placa de cultivo, esto ayuda a evitar la caída de contaminantes en la tapa o en
la placa.
b. Clava el asa varias veces dentro de un área limpia del agar para enfriar el asa.
c. Usa la punta del asa para tomar una masa celular visible de una colonia. Al sembrar ten
cuidado de no arrastrar agar. Recoloca la tapa de la placa y sigue con el paso 5.
Si estás trabajando a partir de un tubo:

a. Tomar la parte baja del tubo que contiene el cultivo entre el pulgar y los dos dedos de tu
mano libre. Quitar la tapa del tubo con el dedo meñique de la misma mano que sostiene el asa.
Evitar tocar el borde de la tapa.
b. Rápidamente pasar la boca del tubo varias veces a través de la flama.
27
c. Clavar el asa en el lado limpio del agar varias veces para enfriarla.
d. Introducir el asa varias veces dentro del cultivo. Retirar el asa, flamear la boca del tubo y
recolocar la tapa. Sigue con el paso 5.
5. Tomar la placa de cultivo, levantar la tapa sólo lo suficiente para realizar el estriado que se
describe abajo. No colocar la tapa sobre la mesa.
a. Estriado 1. Desliza la punta del asa hacia adelante y hacia atrás a través del agar para hacer un
estriado en la parte alta de la placa. Evitar arrancar el agar. Recolocar la tapa de la placa entre
estriados.
b. Estriado 2. Reflamea el asa y enfriarla clavándola en el área limpia del agar. Pasa la punta del
asa una vez a través del primer estriado y sin levantar el asa, dibuja un zigzag en un cuarto de la
suerficie del agar. Recoloca la tapa de la placa.
c. Estriado 3. Reflamea el asa y enfríala en el agar. Pasa la punta del asa una vez a través de la
última línea del segundo estriado y dibuja otro zigzag en el cuarto adyacente de la placa. Sin
volver a tocar el estriado anterior.
d. Estriado 4. Reflamea el asa y enfríala. Pasa la punta del asa una vez a través del tercer
estriado y dibuja un zigzag final en el cuarto restante de la placa.
Reflamear el asa y permite que se enfríe antes de colocarla en la mesa. Toma el hábito de
siempre flamear el asa al final de tu trabajo.
6. Colocar las placas con la cara superior hacia abajo dentro de la incubadora a 37° C e incúbalas
por 12-24 horas.
7. Realizar una adecuada limpieza:

a. Desecha apropiadamente los cultivos bacterianos.
b. Lava la mesa de trabajo con detergente SDS y cloro al 10%.
c. Lávate las manos antes de dejar el laboratorio.
II. Inocular e incubar un cultivo “overnight”

Aunque es mejor crecer un cultivo “overnight” con agitación (aireación), no es esencial cuando
se crecen células para purificar plásmidos o para inocular cultivos más grandes. Para estos
propósitos, la suspensión puede ser incubada sin agitación. Dado que estos cultivos crecen más
lentamente, incubar la suspensión por 2-3 días para obtener un número adecuado de células.
Irónicamente, un tubo Falcon de 15 ml no es la mejor elección para el crecimiento de E. coli. Es
preferible un tubo de 50 ml ya que provee una mayor superficie para la aireación. Cuando se
cultivan cepas transformadas para la obtención de plásmidos, es mejor usar medio con
antibiótico para mantener la selección. También es prudente inocular un cultivo “overnight” de
respaldo por si el primero no fuese inoculado apropiadamente.
Cultivos y medios
Placa de E. coli
Medio LB
28
Materiales y equipo
Asa de inoculación
Pipetas de 10 ml
Tubos Falcon de 50 ml, estériles
Pipeteador o bulbo
Mechero
Incubadora con agitación
Práctica de inocular un cultivo “overnight”
1. Etiqueta con tu nombre y fecha un tubo Falcon de 50 ml estéril.

2. Con una pipeta de 10 ml, transfiere 5 ml de medio LB al tubo de 50 ml.
a. Une el pipeteador o el bulbo a la pipeta. Flamea brevemente el cuerpo de la pipeta.
b. Quita el tapón de la botella de LB, usando el dedo meñique de la mano que está sosteniendo
el pipeteador. Flamea la boca de la botella.
c. Toma 5 ml de LB. Reflamea la boca de la botella y recoloca el tapón.
d. Quita el tapón del tubo Falcon estéril. Flamea brevemente la boca de este tubo.
e. Deposita el medio LB dentro del tubo. Flamea brevemente la boca del tubo y vuélvelo a tapar.
3. En la placa de E. coli localizar una colonia bien definida (1-4 mm de diámetro).
4. Esteriliza el asa en la flama hasta que alcance un color rojo intenso. Después pasa el resto del
asa a través de la flama.
5. Enfría la punta del asa, introduciéndola varias veces en el área limpia del agar.
6. Recoge con el asa una masa celular visible de la colonia seleccionada.
7. Transfiere la colonia al tubo de cultivo.
a. Quita el tapón del tubo, usando el dedo meñique de la mano que está sosteniendo el asa.
b. Flamea brevemente la boca del tubo.
c. Sumerge la punta del asa en el medio de cultivo y agítalo para depositar la masa celular.
d. Vuelve a flamear brevemente la boca del tubo y tápalo.
8. Vuelve a flamear el asa antes de depositarla en la mesa.
9. Deja flojo el tapón del tubo de cultivo para permitir la aireación del cultivo. Fija el tapón con
“masking tape” para evitar que pueda caerse con la agitación.
10. Incuba el cultivo por 12-24 horas a 37° C en agitación.
11. Realiza una limpieza adecuada:
b. Lava la mesa de trabajo con detergente SDS y cloro al 10%
c. Lávate las manos antes de dejar el laboratorio.
29
III. Preparación de un cultivo en suspensión en la parte media de la fase log
Cultivos y medios
Cultivo “overnight” de E. coli
Medio LB, estéril
Materiales y equipo
Tubos Falcon de 50 ml, estériles
Micropipeta de 10 ml y puntas estériles
Mechero
Incubadora con agitación
Espectrofotómetro
Práctica de inocular e incubar el cultivo

1. En la campana transferir 100 l del cultivo “overnight” al tubo Falcon de 50 ml con 10 ml de
medio LB.
2. Para hacer la transferencia:
a. Flamea el cuerpo de la pipeta.
b. Quita el tapón del tubo que contiene el cultivo y flamea la boca de este tubo.
c. Retira 100 l de este cultivo. Vuelve a flamear la boca de este tubo y coloca el tapón.
d. Quita el tapón del tubo Falcon que contiene 10 ml de medio LB y flamea la boca de este tubo.
e. Deposita la muestra del cultivo “overnight” dentro del tubo Falcon con LB. Vuelve a flamear la
boca del tubo y coloca el tapón. Gira suavemente el tubo para mezclar el contenido y colócalo
en la incubadora.
3. Una hora después de la inoculación, en el área estéril, toma una muestra del cultivo y mide su
absorbancia (DO a 550 nm). Repite este procedimiento a intervalos de 20 minutos hasta que el
cultivo alcance una A550 = 0.3 - 0.4
4. Almacena el tubo de cultivo o alícuotas de 10 ml (en caso de haber realizado un cultivo más
grande) a 4° C.
b. Desinfecta el cultivo “overnight”, tubos y pipetas con cloro al 10%.
c. Lava la mesa de trabajo con detergente SDS y cloro al 10%.
d. Lávate las manos antes de dejar el laboratorio.
Medio Luria Bertani (LB)

Triptona 10 g
Extracto de levadura 5g
Cloruro de Sodio 5g
Hidróxido de Sodio 1 M 1 ml
30
Autoclavear y guardar bien tapado hasta su uso.
Placas LB
Para elaborar Medio LB sólido agregar 15 g de agar a la solución anterior.
Esterilizar por autoclave
En la campana de flujo laminar: Permitir que se enfríe un poco y verter 10 ml de esta solución a
cada caja de Petri.
Dejar enfriar sin colocar la tapa totalmente.
Tapar, identificar (LB y fecha) y guardar a 4° C.
Placas LBA
Después de esterilizar el medio LB sólido.
En la campana de flujo laminar: Permitir que se enfríe un poco y agregar la cantidad suficiente
de Ampicilina para alcanzar la concentración de 50 g/mL.
Verter 10 ml de esta solución a cada caja de Petri.
Dejar enfriar sin colocar la tapa totalmente.
Tapar, identificar (LBA y fecha) y guardar a 4° C.
Precaución: Agregar el antibiótico hasta que el medio LB sólido se haya enfriado lo suficiente
para no provocar la inactivación del mismo.
31
Práctica 9
Transformación de Escherichia coli con ADN plasmídico
Introducción
Las células E. coli se vuelven competentes para aceptar ADN plasmídico, usando un método que
no ha cambiado desde su publicación en 1970. El procedimiento comienza con células vigorosas
crecidas en suspensión. Las células son cosechadas en la parte media de la fase log por
centrifugación e incubadas en hielo con dos cambios sucesivos de cloruro de calcio.
Para que las células de E. coli sean transformadas, se requiere; que las células competentes sean
incubadas en hielo con el ADN plasmídico, que reciban un choque de calor a 42° C y ser
recuperadas en medio LB por 40-60 min a 37° C. Posteriormente, muestras de este cultivo, se
plaquean en agar LBA. El objetivo de este último paso es seleccionar a las células transformadas,
mediante la presencia del gen de resistencia a ampicilina.
Si es posible, programar la obtención de las células competentes un día antes de la
transformación con el ADN plasmídico y mantenerlas por 12-24 horas a 0° C (en hielo dentro del
refrigerador). Con esto, generalmente se incrementa la eficiencia de transformación de 5 a 10
veces. Este incremento en la eficiencia ayudará a asegurar una clonación exitosa de la molécula
recombinante.
Cultivo, medio y reactivos

Células E. coli
Plásmido
Medio LB
Placas LBA
Materiales y equipo
Micropipetas de 10 l
Tubos Falcon de 15 ml
Hielo
Etanol 95%
Contenedor para desechos
Cloro al 10%
Mechero
Dispersores
Gradilla
Incubadora a 37° C
Horno de microondas
32
I. Preparación de células competentes
Esta práctica se debe desarrollar en condiciones de esterilidad, usando tubos y puntas estériles.
1. Inocular una sola colonia de E. coli en 10 mL de LB. Crecer durante toda la noche a 37°C y en
agitación (250 rpm).
2. Inocular 1 mL del cultivo anterior en 10 mL de LB en un tubo Falcon de 50 ml. Crecer a 37°C,
con agitación (250 rpm) hasta que alcance una OD 590 de 0.375.
3. Colocar 5 mL del cultivo en un tubo Falcon-15 ml estéril y pre-enfriado. Dejar estos tubos en
hielo por 5 a 10 min. Centrifugar a 1,600g durante 7 min, a 4°C.
4. Resuspender cuidadosamente cada precipitado en 4 mL de la solución de cloruro de calcio
enfriado en hielo. Centrifugar a 1,100g por 5 min y a 4°C.
5. Resuspender cada precipitado en 4 ml de cloruro de calcio frío. Mantener a las células
resuspendidas en hielo por 30 min. Centrifugar por 5 min a 1,100g a 4°C.
6. Finalmente resuspender el precipitado en 2 mL de solución de cloruro de calcio enfriado en
hielo. Hacer alícuotas de 250 l en tubos eppendorf-500 l enfriados previamente en hielo.
Congelar inmediatamente a -70°C.
7. Almacenar las células en hielo dentro del refrigerador por 12-24 horas. Esta estacionalidad a
0° C generalmente incrementa la eficiencia de transformación de 5 a 10 veces.
b. Desinfecta el cultivo “overnight”, tubos y pipetas con cloro al 10%.
c. Lava la mesa de trabajo con detergente SDS y cloro al 10%.
d. Lávate las manos antes de dejar el laboratorio.
II. Transformación de células competentes con cloruro de calcio

Esta práctica se debe desarrollar en condiciones de esterilidad, usando tubos y puntas estériles.
1. Agregar 10 ng de ADN plasmídico (10-25 ng) en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril y colocarlo
en el hielo.
2. Rápidamente descongelar las células competentes, calentándolas entre las manos,
inmediatamente colocar 100 l en los tubos que contienen el ADN plasmídico, mezclar por
pipeteo suave y colocarlo en hielo por 10 min.
3. Dar choque de calor a las células; colocando los tubos en baño maría a 42°C por 2 min, luego
pasar rápidamente al hielo y mantenerlas en él por 10 min. Agregar 1 mL de LB a cada tubo.
Incubar por 1 hora a 37°C en agitación (250 rpm).
4. Posteriormente, sembrar diferentes diluciones en placas que contienen el antibiótico
apropiado e incubar por 12-16 horas a 37°C.
Mantener el resto a 4°C para sembrar posteriormente. La eficiencia de transformación va de 10 6

a 108 de transformantes / g de ADN.
33
Punto de paro: Se puede permitir que las células se recuperen por varias horas. Un periodo de
recuperación largo asegura el crecimiento de tantas recombinantes como es posible y puede
ayudar a compensar una baja competencia de las células.
Para evaluar la competencia de las células

Usar 10 ng de plásmido (pBR322, pUC19, pCDNA3, etc.) para transformar 100 l de células
competentes de acuerdo con el protocolo correspondiente. Plaquear alícuotas apropiadas (1, 10
y 25 l) del cultivo transformado en placas de LB/Ampicilina e incubar a 37°C toda la noche.
El número de colonias transformantes por volumen de la alícuota ( l)  105 es igual al número de
transformantes por microgramo de ADN.
Solución de Cloruro de Calcio

Combinar:
Cloruro de calcio 600 mM 100 ml
Glicerol puro 150 ml
PIPES 500 mM, pH 7.0 20 ml
Agua, cbp. 1000 ml
Esterilizar por autoclave.
34
Práctica 10
OBTENCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
Introducción
Con el crecimiento de E. coli en las placas de agar LBA observado en la práctica anterior se
demuestra la transformación a un fenotipo de resistencia al antibiótico ampicilina. Asimismo se
puede señalar que el fenotipo observado es causado por la adquisición del plásmido pCDNA3,
una molécula de ADN bien caracterizada.
En condiciones experimentales donde numerosos plásmidos recombinantes son generados por
la unión de dos o más fragmentos, el marcador de resistencia a antibiótico sólo indica cual
célula ha adquirido un plásmido portador de un gen de resistencia, pero no indica nada acerca
de la estructura del nuevo plásmido. Por lo tanto, aislar el plásmido de las células transformadas
e identificar el genotipo molecular usando análisis de restricción se vuelven procedimientos
estándar. En casos donde las moléculas recombinantes son formadas por la combinación de
fragmentos bien caracterizados, el análisis de restricción es suficiente para confirmar la
estructura de un plásmido hibrido. En otros casos, por ejemplo; en la clonación de fragmentos
de amplificación producidos por PCR o en reacciones de mutagenesis, puede ser necesario
determinar la secuencia exacta del fragmento insertado.
La obtención de plásmidos por miniprep, es un protocolo a pequeña escala usado para purificar
suficiente plásmido para realizar el análisis de restricción de las E. coli transformadas. Las células
tomadas de una colonia resistente a ampicilina se crecen en un cultivo en suspensión hasta
alcanzar la fase estacionaria. Las células contenidas en 1 ml de cultivo son cosechadas y lisadas,
y el ADN plasmídico es separado de las proteínas, lípidos y ADN cromosomal de la célula. Este
procedimiento produce 2-5 g de ADN plasmídico, en contraste a las preparaciones a gran
escala que producen 1 mg o más de plásmido puro a partir de 1 litro de cultivo.
Puntos finos de la técnica

Tener cuidado de no sobre-mezclar los reactivos; una manipulación excesiva rompe tanto al
ADN cromosomal como al plasmídico. El éxito de este protocolo depende fuertemente de
mantener el ADN cromosomal intacto, en grandes piezas que puedan ser diferencialmente
separadas del ADN plasmídico. La ruptura mecánica reduce la producción de ADN plasmídico de
alta calidad (la forma super-enrollada) e incrementa la contaminación con secuencias cortas de
ADN cromosomal.
Asegúrate de que la centrífuga estará disponible inmediatamente cuando la requieras para
desarrollar el paso 13.
Columnas para la purificación de plásmidos

Un número variable de tipos de columna son disponibles. En la mayoría de los casos, un lisado
celular se corre a través de la columna, seguido por lavados con una o más soluciones
amortiguadoras. Los plásmidos unidos serán finalmente liberados de la columna con un
amortiguador de lavado alto en sal. Sin embargo, el uso de estas columnas sigue requiriendo los
pasos de lisis con lisozima o proteinasa K, pero ahorra tiempo eliminando la precipitación con
alcohol. Un inconveniente importante es que estas columnas suelen ser caras.
35
Miniprep por lisis alcalina
Cultivo y reactivos
Cultivo “overnight” de E. coli transformada
Glucosa/Tris/EDTA (GTE)
SDS/Hidróxido de sodio (SDS/NaOH)
Acetato de sodio
Etanol al 95%
Etanol al 70%
Tris/EDTA (TE)
Materiales y equipo
Puntas azules y blancas
Tubos eppendorf de 1.5 ml
Contenedor con hielo
Contenedor de desecho
Cloro al 10%
Guantes desechables
Centrífuga
Toallas de papel
Gradilla
Práctica de obtención de ADN plasmídico por lisis alcalina

1. Inocular 10 mL de medio LB estéril con una sola colonia bacteriana y dejar crecer hasta
saturación a 37° C (cultivo “overnight”).
2. Agitar el cultivo para resuspender las células E. coli y colocar 1 mL del cultivo en tubo
eppendorf-1.5 mL .
3. Cerrar el tubo y centrifugar (12,000 rpm) por 1 minuto.
4. Eliminar el sobrenadante en el contenedor de desechos para su desinfección posterior. Tener
cuidado de no deshacer el paquete celular. Invertir el tubo y tocar la boca con una toalla de papel
limpia para eliminar tanto como sea posible del sobrenadante restante.
5. Resuspender el paquete celular en 100 l de la solución Glucosa/Tris/EDTA (GTE), enfriada
previamente en hielo y dejar reposar por 5 min a temperatura ambiente.
6. Agregar 200 l de la solución NaOH/SDS, mantenida a temperatura ambiente. Cerrar el tubo
y mezclar con movimientos rápidos de inversión, hasta cinco.
7. Mantener en hielo durante 5 min. La suspensión se tornará relativamente clara.
8. Agregar 150 l de acetato de sodio 3M pH 5.2, enfriado en hielo. Cerrar el tubo y mezclar con
movimientos rápidos de inversión, hasta cinco. Un precipitado blanco aparecerá de inmediato.
9. Mantener el tubo en hielo durante 5 min.
10. Centrifugar (12,000 rpm) durante 3 min para empaquetar el precipitado.
36
11. Transferir 400 l del sobrenadante a un tubo eppendorf-1.5 ml nuevo. Evitar tocar el
precipitado. Descartar los tubos que contienen el precipitado.
12. Agregar 400 l de etanol al 95%. Tapar el tubo y mezclar por inversión. Dejar reposar por sólo
2 min a temperatura ambiente.
13. Centrifugar (12,000 rpm) durante 5 min a temperatura ambiente para empaquetar los ácidos
nucleicos. Colocar los tubos de tal forma que la lengüeta de la tapa quede dirigido hacia la parte
externa del rotor. Así el ácido nucleico precipitado se verá como un punto blanco en la superficie
interna del fondo del tubo.
14. Eliminar el sobrenadante. Tenga cuidado de no romper el precipitado. Eliminar tanto alcohol
como sea posible ayudándose con una toalla de papel.
15. Agregar 1 mL de etanol al 70%, cierra la tapa y golpea el tubo varias veces para lavar bien el
paquete.
16. Centrifugar (12,000 rpm) durante 5 min a temperatura ambiente para recolectar los ácidos
nucleicos.
17. Eliminar el sobrenadante. Tenga cuidado de no romper el precipitado y eliminar tanto alcohol
como sea posible ayudándose con una toalla de papel.
18. Abrir el tubo y colocarlo boca-abajo sobre una toalla de papel, permitir que se seque el
paquete de ácidos nucleicos a temperatura ambiente por el tiempo necesario. Este
procedimiento puede acelerarse con la ayuda de una secadora de pelo o con una lámpara.
19. Asegurarse de que los paquetes de ácido nucleico están secos y que todo el etanol se ha
evaporado antes de pasar al siguiente paso. Revisar a contra luz y cerciorarse de que no queda ni
una sola gota de alcohol en el tubo. El ácido nucleico aparecerá como un punto blanco rugoso, si
es que es visible. Olfatee la boca del tubo, si el etanol se está aún evaporando percibirá el olor a
alcohol.
20. Resuspender el precipitado en 30 l de TE y almacenar como se indica en el siguiente
protocolo. Para realizar una reacción de restricción usar de 2.5 a 5.0 l de esta solución.
21. Realiza una limpieza adecuada.
a. Desecha apropiadamente los tubos de cultivo, toallas de papel y puntas de micropipeta que
entraron en contacto con los cultivos bacterianos.
b. Desinfecta el cultivo overnight, puntas y sobrenadante del paso 4 con cloro al 10%
c. Lava la mesa de trabajo con detergente SDS y cloro al 10%
d. Lava tus manos antes de salir del laboratorio.
Almacenamiento de plásmidos de ADN

1. Para un almacenamiento de corto plazo los plásmidos pueden ser mantenidos en cepas
bacterianas que han sido crecidas en placas selectivas a 4°C. Para un almacenamiento de largo
plazo, estas cepas bacterianas deben congelarse para lo cual se puede usar una solución basada
en glicerol o DMSO y guardar a -70°C o en nitrógeno líquido.
2. Los plásmidos de ADN se pueden almacenar en TE a 4°C (corto plazo) y a -20°C o a -70°C para
un almacenamiento de largo plazo.
37
Glucosa/Tris/EDTA (GTE)
Glucosa 50 mM
Tris-HCl, pH 8.0 25 mM
EDTA 10 mM
Esterilizar por filtración, alicuotar y almacenar a -20°C.
Solución de NaOH/SDS
Hidróxido de Sodio 0.2 M
SDS 1%
Preparar cuando se vaya a utilizar a partir de las soluciones madre (NaOH 10 M y SDS 10%).
38
Práctica 11
Análisis del plásmido pBR322 con enzimas de restricción
Introducción
Esta práctica introduce al análisis genotípico de ADN usando enzimas de restricción y
electroforesis en geles de agarosa.
Para el análisis de restricción, una muestra del plásmido aislado previamente y una muestra
control del mismo son restringidos con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Las dos
muestras son corridas en el mismo gel de agarosa y los productos de la restricción son teñidos y
visualizados.
Las muestras del ADN digerido serán cargadas en los pozos de un gel de agarosa al 2%. Entonces
se aplica un campo eléctrico a través del gel que causa que los fragmentos de ADN se desplacen
desde su origen (el pozo) a través de la matriz del gel hacia el electrodo positivo. La matriz del
gel actúa como una malla a través de la cual las moléculas de ADN más pequeñas migran más
rápido que las más grandes; los fragmentos de restricción de diferentes tamaños se separan en
bandas distintas durante la electroforesis. El patrón característico de las bandas producido por
cada enzima de restricción se hace visible por la tinción de las bandas con un reactivo que se
une al ADN.
Se observa que el ADN purificado tiene una “huella” de restricción idéntica al plásmido original.
Los fragmentos de restricción del ADN plasmídico obtenido en la miniprep migran junto con los
fragmentos del plásmido original. Esto provee una prueba genotípica de que las moléculas de
pCDNA3 fueron exitosas para transformar a E. coli. Un control negativo, debe ser incubado sin
restricción y debe permanecer intacto.
Almacén y manejo de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, como muchas enzimas, son más estables a temperaturas frías y
pierden su actividad si son calentadas por cualquier lapso de tiempo. Debido a que el
mantenimiento de estas enzimas en buenas condiciones es crítico para el éxito de los
experimentos de este curso, atienda a la siguiente guía para el manejo de las enzimas.
1. Siempre almacene las enzimas en un congelador que mantenga una temperatura estable
entre -10 y -20° C. Tratar de que las enzimas se encuentren dentro de una caja de poliuretano
para que les ayude a mantener una temperatura constante.
2. Retire las enzimas del congelador directamente en hielo. Asegúrese de que los tubos se
introducen en el hielo y que no quedan sólo sobre el hielo. Mantenga a las enzimas en hielo
mientras estén en uso y regréselas inmediatamente al congelador después de terminar.
3. Cuando se tiene una gran cantidad de enzima, es bueno hacer alícuotas de 50-100 l en tubos
Eppendorf de 1.5 ml. Identificar claramente cada tubo con los datos de la enzima, concentración
(unidades/l) y fecha de recibida. Asegúrate de terminar una alícuota antes de abrir otra.
Almacén del ADN plasmídico y del amortiguador de restricción

El ADN plasmídico purificado es normalmente almacenado en el refrigerador (4° C). También
puede ser almacenado en el congelador (-20° C) por largos lapsos de tiempo (meses, años). Sin
39
embargo, no es aconsejable almacenar el ADN en el congelador en momentos de uso activo; los
cristales de hielo formados durante la congelación “nickearán” y degradarán al ADN. El daño por
congelación es particularmente relevante a los plásmidos usados para transformación; los
plasmidos linearizados o “nickeados” no transforman tan bien como la forma superenrrollada.
El amortiguador de restricción se mantiene mejor almacenado en congelación y no se afecta
con los ciclos de congelación-descongelación.
Amortiguadores (Buffers)
Muchos tipos de amortiguadores serán usados en este curso; buffer de restricción, buffer de
ligación, buffer de PCR, buffer de electroforesis, buffer de hibridación y diferentes buffers de
lavado. Cada uno tiene una composición química diferente y un uso. Siempre asegúrate de que
estés usando el amortiguador (buffer) adecuado.
El amortiguador TBE (Tris-Ácido bórico-EDTA) de electroforesis puede ser usado varias veces.
Colecta el buffer usado y almacénalo en un gran recipiente.
Los diferentes grupos de enzimas de restricción operan bajo diferentes condiciones de sal y pH.
Para una actividad óptima, asegúrate de usar el amortiguador apropiado.
Dilución del ADN

El ADN para uso inmediato se puede diluir en agua bidestilada o desionizada. Sin embargo,
deberá ser diluido con amortiguador TE (Tris-EDTA) si lo que se requiere es un almacenaje más
largo. El EDTA en el buffer, une cationes divalentes como Mg ++, que son cofactores para las
nucleasas que van a degradar al ADN. Siempre diluir el ADN a la concentración especificada en
el protocolo.
1. Determinar el volumen total de ADN de acuerdo al número de repeticiones y al volumen

necesario en cada repetición.
(10 experimentos) x (20 l de ADN) = 200 l de ADN
2. Sustituye este número en la formula C1V1 = C2V2, junto con la concentración final deseada de
ADN y la concentración stock de ADN. Despejar para V1, el volumen del stock de ADN necesaria
para hacer la dilución.
(C1, stock ADN) (V1) = (C2, concentración final de ADN) (V2, volumen total)
(0.5 g/l) (V1) = (0.1 g/l) (200 l)
V1 = (0.1 g/l) (200 l) / (0.5 g/l) = 40 l de la solución stock de ADN
3. Agregar agua o TE para completar el volumen total de la solución final.

40 l stock ADN + 160 l agua o TE = 200 l de solución final
El plásmido pCDNA3
Es un plásmido producido artificialmente para ser usado rutinariamente en experimentos de
ADN recombinante. Para ser útil como vector, los sitios de corte de varias enzimas de restricción
tuvieron que ser correctamente determinados, especialmente en relación a secuencias
funcionales, tales como el origen de replicación y genes de resistencia a antibióticos. El mapa de
40
restricción es también el primer paso al caracterizar un fragmento de ADN que ha sido ligado a
un vector, proveyendo los datos necesarios para aplicaciones tales como secuenciación de ADN,
localización de genes y mutagenesis sitio-dirigida.
La meta es determinar el número y posición relativa de los sitios de corte para dos enzimas de
restricción EcoRI y HindIII.
Para esto, muestras de pCDNA3 son incubadas a 37° C en reacciones de restricción y cada
muestra es cargada en un pozo separado de un gel de agarosa. Después de la electroforesis, el
gel es teñido y fotografiado.
Los datos de las digestiones simples indican el número de sitios de corte para cada enzima; la
digestión doble permite mapear los sitios de restricción en relación a las enzimas utilizadas.
Figura 3. Mapa de restricción del plásmido pCDNA3.
Reactivos
ADN del plásmido pCDNA3
Enzima de restricción: EcoRI y HindIII.
Amortiguador de restricción
Agua bidestilada
Buffer de carga
Agarosa 2%
Buffer TBE, 1x
Bromuro de etidio (1 g/ml)
41
Materiales y equipo
Micropipetas de 10 l y puntas blancas
Micropipetas de 200 l y puntas amarillas
Papel aluminio
Vaso de precipitado de 100 ml
Guantes desechables
Cámara de electroforesis
Cámara fotográfica
Cinta masking tape
Parafilm
Fuente de poder
Gradilla
Transiluminador
Horno de microondas
Baño seco
Reacción de restricción
1. Marca los tubos eppendorf de 0.5 ml en los cuales se realizarán las restricciones.
E = EcoRI
H = HindIII
N = sin enzima
2. Colocar en cada tubo Eppendorf-0.5 mL, mantenido en hielo, los siguientes reactivos:
- Amortiguador 10 apropiado (varía con cada enzima) 2 l
- ADN (0.1-0.5 g) 2 l
- Agua 14 l
3. Agregar de 3-20 unidades de la enzima de restricción 1-2 l
Es muy recomendable cuantificar el ADN plasmídico que se desea restringir para manejar una
concentración adecuada de la enzima de restricción.
4. Al realizar esta mezcla de reacción, tocar la pared interna del tubo con la punta de la pipeta,
tan cerca del fondo como sea posible, para poder depositar estos volúmenes tan bajos.
5. Tener cuidado de agregar 1 l de agua destilada al tubo N en lugar de la enzima de
restricción.
6. Mezclar suavemente, No dar vortex.
7. Incubar en el baño seco a la temperatura señalada por el fabricante (generalmente 37° C) por
1 hora (con cantidades pequeñas de ADN las incubaciones suelen ser más cortas).
8. Realizar la inactivación de la enzima a 65° C por 20 min.
9. Al terminar, correr una alícuota del ADN no restringido y del restringido en un gel de agarosa.
42
10. Si la totalidad del ADN aparece restringido en el gel, entonces el resto de la muestra puede
ser purificada (fenol/cloroformo) para ser tratada con otra enzima de restricción o bien correr la
totalidad de la muestra y ser recuperada del gel.
Punto de Paro: Después de la inactivación de la enzima, congelar las reacciones a -20° C hasta
que se pueda continuar con la práctica.
43
Práctica 12
Detección de una inserción Alu por PCR
Introducción
En esta práctica, la PCR será usada para amplificar una corta región del cromosoma 8, para
buscar la inserción de una secuencia corta de ADN llamada Alu dentro del gen activador del
plasminógeno tisular (TPA). Aunque el ADN de varios individuos es más parecido que diferente,
muchas regiones de los cromosomas humanos exhiben una gran cantidad de diversidad. Tales
secuencias variables son denominadas “polimórficas” y proveen las bases para el diagnóstico de
enfermedades genéticas, identificación forense y pruebas de paternidad.
La familia Alu de elementos de ADN cortos, repetidos e interpuestos están distribuidos en los
genomas de los primates. Los elementos Alu son de 300 pb de longitud aprox., y su nombre
deriva de un solo sitio de reconocimiento de la endonucleasa AluI localizado cerca de la mitad
del elemento Alu. En los últimos 6.5 millones de años, el elemento Alu se ha amplificado vía un
proceso de transposición mediado por ARN hasta un número de copias de casi 500,000
(comprenden un 5% del genoma humano).
Un estimado de 500-2,000 elementos Alu están restringidos mayormente al genoma humano.
Uno de estos elementos, llamado TPA-25, está dentro de un intrón del gen activador del
plasminógeno tisular. Esta inserción es dimórfica; está presente en algunos individuos y no en
otros. Debido a que la secuencia Alu está dentro de un intrón no afecta la expresión del gen TPA
y es fenotípicamente neutral. La PCR se puede usar para buscar individuos con la presencia (o
ausencia) de la inserción TPA-25.
En esta práctica, los iniciadores utilizados, flanquean el sitio de inserción y son usados para
amplificar un fragmento de 400 pb cuando TPA-25 está presente y uno de 100 pb cuando está
ausente. Cada uno de los tres genotipos posibles; homocigotos para la presencia de TPA-25
(fragmento de 400 pb), homocigotos para la ausencia de TPA-25 (fragmento de 100 pb) y los
heterocigotos (fragmentos de 400 y 100 pb), serán distinguidos después de realizar la
electroforesis en gel de agarosa.
La muestra del molde de ADN provendrá de varios miles de células obtenidas mediante lavado
bucal con solución salina (procedimiento no invasivo y sin sangre). Las células son colectadas
por centrifugación y resuspendidas en una solución con resina “Chelex”. Las células serán
lisadas por ebullición y centrifugadas para remover los desechos celulares. Una muestra del
sobrenadante que contiene el ADN genómico servirá para realizar la prueba.
Para comparar los genotipos de varios individuos, alícuotas de la muestra amplificada serán
cargados en los pozos de un gel de agarosa, junto con el marcador de tamaño de ADN y un
control no amplificado.
Una banda borrosa puede ser visible en la parte baja del gel. Esta banda es llamada dímero de
iniciadores y no es un alelo humano amplificado, resulta de una asociación entre los iniciadores,
dando origen a un producto de amplificación (primer-primer). El control no amplificado no
deberá presentar banda.
Una o dos bandas son visibles en cada muestra amplificada, indicando que un individuo es
homo- o heterocigoto para la inserción Alu.
44
Reactivos
Chelex
Cloruro de sodio 0.9%
Mezcla de reacción de PCR
MgCl2 25 mM
Agua bidestilada
Buffer de carga
Agarosa
Buffer TBE
Bromuro de Etidio
Materiales y Equipo
Micropipeta de 1000 l
Puntas azules, amarillas y blancas
Tubos Falcon de 15 ml
Tubos para PCR
Guantes desechables
Termociclador
Horno de microondas
Vaso desechable (copa)
I. Aislamiento del ADN genómico

1. Identificar con tu nombre el tubo Falcon de 15 ml que contiene 5 ml de solución salina.
2. Enjuagar vigorosamente tu boca con todo el contenido del tubo Falcon por 10 segundos.
Conservar el tubo Falcon pues se usará nuevamente en el siguiente paso.
3. Expulsar la solución salina en el vaso desechable y, cuidadosamente, vertir el contenido al
mismo tubo Falcon de 15 ml.
4. Cerrar el tubo Falcon de 15 ml y colócarlo en la centrífuga en una configuración balanceada.
Centrifuga a 500-1000 x g por 10 min para empaquetar las células en el fondo del tubo.
5. Tener cuidado de no deshacer el paquete celular, retirar y desechar la mayor cantidad posible
del sobrenadante. Colocar el tubo en hielo.
6. Agregar 500 l de Chelex al 10% al paquete celular.
7. Resuspender las células en el Chelex por medio de varios pipeteos suaves. Cerciorarse de que
se han deshecho todos los grumos celulares.
8. Tranferir 500 l de las células resuspendidas a un tubo eppendorf de 1.5 ml marcado con tu
nombre.
9. Poner el tubo en agua en ebullición por 10 minutos.
10. Después, retirar el tubo con la ayuda de unas pinzas de disección, y poner a enfriar el tubo
en hielo.
45
11. Colocar el tubo en la centrífuga en una configuración balanceada. Centrifugar a 1000 x g por
30 seg para empaquetar el Chelex en el fondo del tubo.
12. Transferir 200 l del sobrenadante a un tubo eppendorf de 1.5 ml marcado con tu nombre y
colócarlo en hielo. Tener cuidado de transferir exclusivamente el sobrenadante.
Punto de paro: Se puede almacenar el sobrenadante en hielo o congelar hasta que se pueda
continuar. Las muestras pueden almacenarse por semanas a -20° C.
2. Reacción de PCR
1. Identificar los tubos para PCR que se van a utilizar.
2. En un tubo eppendorf de 1.5 ml, se prepara una mezcla de reacción común para todas las
reacciones que se van a realizar en un momento determinado. Usar la siguiente tabla como un
“checklist” al momento de agregar los reactivos. Usa una punta nueva para cada reactivo.
M1. Contenidos de 1 y 7 (n+1) mezclas de PCR

1 mezcla 7 mezclas
Componente Concn final (l) (l)
Amortiguador 10 1x 5.0 35.0
MgCl2 25 mM 1.25 mM 2.5 17.5
4 dNTPs 5 mM 250 M 2.5 17.5
Iniciador 1 (50 ng/l) 1 ng/l 2.0 14.0
Iniciador 2 (50 ng/l) 1 ng/l 2.0 14.0
Taq polimerasa (5 U/l) 2.5 U/50 l 0.5 3.5
Agua -- 34.5 241.5
Volumen total -- 49 343
3. Distribuir 49 l de la mezcla de reacción en cada uno de los tubos para PCR.
En el área para ADN problema:

4. Agregar las muestras de ADN problema (1 l), usando una punta nueva en cada muestra.
5. Cerrar firmemente cada uno de los tubos y colocarlos en el termociclador. Rechecar el
programa de amplificación y entonces presionar “Start”.
6. Al terminar la reacción; analizar los productos de amplificación en un gel de agarosa.
7. Almacenar la cantidad sobrante de las mezclas de PCR a -20°C.
46
Programa del termociclador Genius:
Ciclos Temperatura Tiempo

1 94° C 2 min
30 94° C (Desnaturalización) 1 min
58° C (Apareamiento) 2 min
72° C (Amplificación) 2 min
1 72° C 5 min
*Programa Alu.
3. Electroforesis
Para hacer el gel de agarosa y realizar la electroforesis seguir las instrucciones contenidas en la
práctica correspondiente (página 16).
SOLUCIONES MADRE
Componentes del kit de PCR (Invitrogen®)
MgCl2 25 mM
Taq polimerasa 5 U/mL
Amortiguador 10 (KCl 100 mM, Tris-HCl 200 mM pH 8.8, (NH4)2SO4 100 mM, Triton X-100 10%,
BSA 100 g/mL)
DNA ladder (100 pb, Invitrogen®)
TBE 1
TBE 5 80 ml
Agua, cbp. 400 ml
TABLAS DE MANIPULACIONES
M1. Electroforesis
Carril DNA Carril DNA

1 100 pb 6
2 7 H2O
3 8
4
5
47
Bibliografía Consultada
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Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proceedings of the National
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10. Luque CJ. Herráez SA. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética. 1ª ed.
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Molecular Biology 53: 159.
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small number of cells. Amplifications 1,3: 11.
16. Laboratorio Virtual de Biología Molecular de la Universidad de Alcalá de Henares.
biomodel.uah.es/lab/inicio.htm
48

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE CIENCIAS MORFOLÓGICAS AGROPECUARIAS

Trabajo realizado con el apoyo del Programa UNAM-DGAPA-PAPIME PE 205717

Práctica Nombre de la práctica Página

2 Ensayo de enzimas de restricción para analizar el polimorfismo de

6 Determinación de la concentración de ADN y ARN por 22

9 Transformación de Escherichia coli con ADN plasmídico 32

10 Obtención de ADN plasmídico 35

11 Análisis del plásmido pCDNA3 con enzimas de restricción 39

12 Detección de una inserción Alu por PCR 44

1 ml = 0.001 litro 1,000 ml = 1 litro

Figura 1. Esquema que muestra las partes de una micropipeta. Tomada de

Figura 2. Se muestra la ventana de graduación de P1000, marcando 1000 µl.

Toma las siguientes precauciones al momento de usar una micropipeta:

Uso general de la micropipeta

8. Para expulsar la muestra:

9. Para evitar contaminación cruzada:

Práctica con la micropipeta de volumen pequeño

Tubo Solución I Solución II Solución III Solución IV

Práctica con la micropipeta de volumen medio

Tubo Solución I Solución II Solución III Solución IV

Práctica con la micropipeta de volumen grande

Tubo Solución I Solución II Solución III Solución IV

Una vez que se abra el programa, debes buscar la página de Cibertorio:

En cualquier electroforesis, si la fuente de corriente de la que dispones no indica la intensidad

9) Una vez completada la electroforesis, interpreta los resultados obtenidos:

Representa la curva de calibrado y utilízala para calcular los tamaños.

Prepara los 6 tubos de ensayo con el contenido indicado en la tabla.

Preguntas para evaluar los resultados:

Escribe aquí la clave asignada a tu experimento:_____

1. ¿Cuántos genotipos diferentes has encontrado en el conjunto de 6 muestras (2 patrones y 4

Obtención de ADN de hígado de pollo

Extracción de ADN con Fenol/Cloroformo

Precipitación con etanol

Tris HCl M pH 7.4

TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM, pH 7.4)

1. En un vaso de precipitado de 2 litros, colocar 0.5 g de 8-hidroxiquinolina y agregar

1. Depositar la muestra del tejido en un tubo Ependorf de 1.5 ml.

Estas muestras deberán mantenerse en congelación para ser utilizadas en la reacción de la

Tinción con bromuro de etidio y manejo responsable

Observación de geles teñidos

Práctica de electroforesis en geles de agarosa

Preparación de un gel al 1.5%

Colocación de las muestras

Visualización del gel

I. Aislamiento de colonias individuales

Estriar las placas e incubar

4. Si estás trabajando a partir de una placa:

Si estás trabajando a partir de un tubo:

7. Realizar una adecuada limpieza:

II. Inocular e incubar un cultivo “overnight”

Práctica de inocular un cultivo “overnight”

1. Etiqueta con tu nombre y fecha un tubo Falcon de 50 ml estéril.

Práctica de inocular e incubar el cultivo

Medio Luria Bertani (LB)

Cultivo, medio y reactivos

II. Transformación de células competentes con cloruro de calcio

Mantener el resto a 4°C para sembrar posteriormente. La eficiencia de transformación va de 10 6

Para evaluar la competencia de las células

Solución de Cloruro de Calcio

Puntos finos de la técnica