INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y FÍSICA DE ADN

RECOMBINANTE

González Judd Pablo Miguel

Hernández Acatitla Edwin Arturo
Grupo: 5QV1 Sección: 1
Equipo: 5

Objetivos:

 Obtener ADN de doble cadena de cualquiera de los plásmidos pUC19, pBS o

pCR2.1TOPO (recombinantes y no recombinantes).
 Obtener células competentes de Escherichia coli y transformarlas.
 Diferenciar un vector recombinante de uno no recombinante por pruebas
fenotípicas y por pruebas de restricción.

Materiales y métodos:

Confróntese el manual de laboratorio EXPERIMENTOS EN GENÉTICA MICROBIANA,

para revisar el protocolo seguido en la realización de la práctica, el cual se siguió
como se cita (cfr. Referencias bibliográficas) excepción hecha de la obtención de
células competentes, que por motivos de tiempo, fue realizada por los profesores
del laboratorio de genética microbiana, quienes, cabe señalarse proporcionaron
también todos los cultivos y soluciones con las que se trabajó.

El ADN plasmídico recombinante aislado, fue del plásmido pCR2.1TOPO y el no

recombinante del plásmido pCR2.1TOPO-ape.

Resultados:

Habiendo realizado la extracción de ambos plásmidos; recombinante y no

recombinante, individualmente, a partir de células de Escherichia coli DH10β por el
método de la lisis alcalina, según el protocolo indicado, el ADN obtenido se utilizó
para la transformación de E. coli. y para el análisis por restricción del mismo,
obteniéndose los resultados expuestos a continuación:
Cuadro n° 1: Efecto de la transformación de células de E. coli DH10β con plásmidos recombinantes
y no recombinantes sobre el desarrollo y el fenotipo del cultivo.

Medio Cepa sembrada crecimiento Color de las

colonias*
Luria DH10β competentes ++++ Blancas
L-AP DH10β competentes + Blancas
L-AP DH10β+pCR2.1-TOPO ++ Azules
L-AP DH10β+pCR2.1-TOPO +++ Azules
L-AP DH10β+pCR2.1-TOPO-ape + Blancas
L-AP DH10β+pCR2.1-TOPO -ape ++ Blancas

Tras la transformación del cultivo con el ADN plasmídico, se adicionó al cultivo bacteriano IPTG y X-gal, para
evidenciar la naturaleza de las células transformadas, lo cual se puso de manifiesto cultivando éstas, en placas
con medio rico. *El color de las colonias se refiere al color, que en su caso se produjo por la reacción
cromogénica entre en cultivo y el complejo IPTG/X-gal, en las colonias de un cultivo, esto referente a la
mayoría de las colonias, no a su totalidad.

Para el análisis por restricción, tras la digestión, con las enzimas de restricción
BamH1 Y EcoR1, se corrió una electroforesis en gel de agarosa al 1%, en el que se
corrió simultáneamente, a las muestras, un marcador de peso molecular (ADN del
bacteriófago λ, digerido con HindIII), cuya relación, tamaño-corrimiento en el gel,
se muestra en el cuadro n° 2 y que fue usado como marco de referencia para la
determinación del tamaño de los fragmentos del ADN plasmídico tras la
restricción.

Cuadro n° 2: Tamaño y distancias recorridas por los fragmentos de restricción (con Hind III) del
bacteriófago λ en electroforesis en gel de agarosa al 1%

Banda Tamaño (pb) Log del tamaño Distancia (cm)

1 23,130 4.36 4
2 9,416 3.97 4.5
3 6,557 3.81 5
4 4,361 3.63 6
5 2,322 3.36 7.2
6 2,027 3.30 7.5
7 564
8 125
De acuerdo a la bibliografía, el ADN del bacteriófago λ tratado con Hind III, exhibe 8 bandas, correspondientes a
8 fragmentos de ADN, de distintos tamaños, sin embargo, se detectaron en el análisis por electroforesis, solo 6
de estos, cuyos resultados son los que se exponen.
Respecto al análisis propiamente, de los fragmentos obtenidos por restricción de los
plásmidos aislados, se muestran los resultados en el cuadro n° 3, el gel resultante del
análisis por electroforesis, se ilustra, como tal, en la figura 1. Aunque cabe resaltarse, que
el obtenido por nuestro equipo no pudo ser utilizado, por lo que se exponen resultados
facilitados por el equipo 6 del mismo grupo de trabajo (el electroferograma obtenido por
nuestro equipo, se adjunta en el anexo 1).

Cuadro n° 3. Tamaño y distancias recorridas por cada plásmido y sus respectivos fragmentos de
restricción (con EcoR1 y BamH1)

Tamaño del
ADN/Tratamiento Fragmentos Distancia (cm) Log del tamaño
fragmento (pb)
pCR2.1-TOPO/BamH1 1 6.5 3.55 3548
pCR2.1-TOPO/Eco R1 1 6.5 3.55 3548
1 6 3.63 4265
pCR2.1-TOPO
2 7.3 3.38 2398
pCR2.1-TOPO-ape/ BamH1 1 6 3.63 4265
pCR2.1-TOPO-ape/ EcoR1 1 5.9 3.55 3548
1 4.1 4.3 1995
pCR2.1-TOPO-ape 2 5.3 3.7 5011
3 6.6 3.5 3162

Figura n° 1. Gel obtenido en el análisis por electroforesis, de los plásmidos y los plásmidos
tratados con enzimas de restricción.
El llenado de los pozos se hizo, en el orden siguiente: 1.pCR2.1Topo/BamH1 2.pCR2.1Topo/EcoR1
3.pCR2.1Topo. 4.Marcador de peso molecular 5.pCR2.1Topo-ape/BamH1 6.pCR2.1Topo-ape/EcoR1
7. pCR2.1Topo-ape. Para el revelado de trató el gel con bromuro de etidio, en el regulador de corrimiento, para
luego exponerlo a luz ultravioleta.

El tamaño de los fragmentos de restricción obtenidos de cada plásmido se obtuvo

por interpolación sobre un gráfico construido por correlación
Log. del tamaño-Distancia recorrida en el gel con respecto a los fragmentos del
bacteriófago (cfr. Cuadro n° 2), este constituye la figura n° 2.

7.5

7 Distancia (cm)
distancia recorrida (cm)

6.5 TOPO Bam

6 TOPO Eco R1
TOPO
5.5
TOPO
5
TOPO ape Bam
4.5 TOPO ape Eco R1
4 TOPO ape

3.5 TOPO ape

TOPO ape
3
3 3.5 4 4.5 5
logaritmo del tamaño

Figura n° 2.Relación tamaño-corrimiento por cada plásmido y sus respectivos fragmentos de

restricción (con EcoR1 y BamH1), respecto al digerido de λ, con HindIII.

Discusión de resultados:

Con los datos anteriores puede analizarse el trabajo realizado respecto al trabajo mismo,
según la concordancia de los datos obtenidos y con respecto a los objetivos, es decir
respecto a la posibilidad de obtener ADN, de los plásmidos y a diferenciarlos fenotípica y
físicamente, como recombinante y como no recombinante, así como a la transformación
de E. coli, todas operaciones que se concretaron y que de una u otra forma podrían hablar
de una práctica exitosa.

Sin embargo de manera particular conviene hacer algunas consideraciones, por ejemplo,
respecto a la obtención del ADN, donde la técnica siempre que sea comprendida y por lo
tanto aplicada al pie de la letra no presenta gran dificultad operativa, por lo que los
errores que pudieran presentarse difícilmente pudieran achacarse al operario, a menos
claro, que este no se hubiera familiarizado de antemano con la técnica, no la
comprendiera o fuese en extremo descuidado. Lo cual parece haberse cumplido, dado
que, al analizar por electroforesis las muestras correspondientes al plásmido estas,
exhibieron más de una banda que era lo esperado, al no haberse tratado con enzimas de
restricción, lo que permite pensar o en su degradación o en la formación de isoformas
durante la extracción, opción más factible porque el ADN siempre se manipuló con
guantes para evitar su contacto con nucleasas y se trabajó en general en frio, para que
aún ante una enzima, esta estuviera inactivada por las bajas temperaturas., así la fuerza
mecánica durante la extracción puede considerarse, fue demasiada, por lo que parte de
los plásmidos extraídos, pasaron de su forma superenrrollada a una circular laxa y para el
caso particular de la muestra de pCR2.1-Topo-ape, incluso a una lineal (presencia de 3
bandas).

Esto pudiera corregirse una vez identificado el error, repitiendo en el futuro la extracción
con precauciones mucho mayores. Respecto a la cantidad de ADN obtenida, si bien, no se
determinó con exactitud, esta fue suficiente, como para procesar las muestras, tanto por
restricción como por transformación, respecto a la pureza que tampoco se determinó con
exactitud se apreciaba la presencia, casi constante de ARN, como bandas muy ligeras y de
gran corrimiento, con una marcada fluorescencia en el UV, este ARN, si bien no interfirió,
casi nunca (véase adelante) con los resultados, habla de deficiencias en la extracción.
Misma que dado lo anterior, podría hacerse siguiendo algún otro método, como el “Quick
Gene” (Desarrollado por Fujifilm Ltd, para su uso en el llamado “Kit S”), en el que se usen
RNAsas, para obtener ADN de alta pureza.

Otros factores de variación que pudieran introducirse en la técnica sería la preparación y

el manejo de los reactivos de la extracción, algunos de los cuales son lábiles o sensibles
como el SDS (solución II BD) que no debe de almacenarse a bajas temperaturas porque
en tales condiciones precipita, igualmente si el pH o la concentración de los reactivos no
se ajustara, se introducirían variaciones que podrían hacer de la extracción ineficiente,
dejando proteínas que al asociarse con el ADN, interferirán en su corrimiento
electroforético.

Respecto a la transformación de las bacterias los resultados obtenidos son congruente con
lo esperado puesto que las células competentes por si solas, crecen considerablemente
(control positivo), mientras que con el plásmido crecen en menor medida, pero en medios
con ampicilina., lo que habla en 1° lugar de una transformación exitosa, puesto que para
que la cepa utilizada creciera en tales medios debería adquirir una resistencia ante la
ampicilina, la cual estaba contenida también en el plásmido.

Aquí conviene mencionarse que el control negativo, las células competentes sobre medio
con ampicilina, crecieron, aunque en mucho menor medida que cualquier otro cultivo, lo
cual es un resultado anómalo, atribuible a una contaminación ambiental, o por parte del
operario con bacterias resistentes a la ampicilina y al menos en apariencia de la misma
especie, otra posibilidad que explique estos resultados es una mutación, por la que
algunas de las células del cultivo original, a lo largo de las resiembras o de
manipulaciones inadecuadas, haya adquirido una resistencia, cuestión, no tan poco
probable dado que la cepa en cuestión Es F- RecA1, por lo que es capaz de adquirir por
conjugación o por recombinación genes ajenos, aunque para afirmar esto debieran de
conducirse algunas pruebas adicionales dado que si esto ocurrió sería esperable que otro
equipo exhibiera estos resultados, así que por el momento la conclusión más factible,
habla de una contaminación.

Los demás resultados permanecen congruentes a lo esperado puesto que las células con
pCR2.1-TOPO exhiben su carácter de recombinantes al generar color fruto de la
degradación del X-gal, (favorecido por el falso inductor de la galactosidasa el IPTG, véase
el mecanismo de la reacción cromogénica en el anexo 2.), mientras que las células
conteniendo a pCR2.1-TOPO-ape, no lo hacen al estar en medio de gen de la
galactosidasa el inserto -ape-, correspondiente al gen de la aminopeptidasa de Ustilago
maydis. Igual congruencia con un proceso de transformación, exhibe el hecho de que se
aprecien más colonias donde se inoculó más ADN, es decir a mayor ADN agregado, hubo
un mayor número de células transformadas.

Esto habla además de la adecuada formación de competentes, por tratamiento con cloruro
de calcio y choque térmico, lo que valida la metodología utilizada, al menos en este punto.

Ahora bien, con respecto a la restricción no se obtuvieron resultados como los esperados,
en todas las determinaciones, primero por que como equipo de trabajo las condiciones de
electroforesis fueron inadecuadas y el ADN, fue expulsado del gel, tras un tiempo
prolongado de corrimiento, cuestión que se puede corregir, siguiendo la banda del
regulador de carga de color azul en su primera porción, la menos densa, en lugar de la
segunda, que puede ir por arriba del ADN, en el corrimiento. Con respecto al gel que se
analizó a falta del nuestro aparecieron, como se dijo ya bandas respectivas a las
isoformas del plásmido, mientras que para las muestras tratadas con ECOR1 donde se
esperaban 2 bandas, no se apreció, más que una salo que sugiere que en las condiciones
de trabajo, la enzima no realizó más que un corte, que linealizó al ADN, este corte que es
el mismo se espera de BamH1, permite corroborar que el plásmido en cuestión es el de
interés pCR2.1-Topo porque su tamaño calculado, se aproxima a las 3.9Kb reportadas
para el mismo, donde el tamaño calculado fue de 3.5 Kb., sin embargo, para la muestra
de pCR2.1-Topo-ape, se esperaba un tamaño de unas 5Kb, que no fue exhibido, lo que
puede deberse a que el fragmento más corto del inserto, que si pudo haber sido cortado
se salió del gel o fue enmascarado por el ARN abundante (no se muestra en la imagen).
Solo las muestras tratadas con BamH1, corroboran parcialmente los datos esperados al
mostrar en el gel una sola banda, correspondiente a que BamH1, solo realiza un corte en
el ADN, que lo linealiza y que para pCR2.1-Topo muestra el tamaño de casi 4 Kb del
plásmido mientras que para pCR2.1-Topo muestra también un solo fragmento pero de
mayor tamaño 4.2Kb.

Con los tamaños aproximados debe de tenerse cuidado, de hacer conclusiones categóricas
pues la conducta del digerido de λ, no es adecuada para usarse como una curva tipo, pues
sus fragmentos no crecen a intervalos constantes de tamaño, ni se comportan en la
gráfica de forma lineal (el ajuste a la linealidad, tampoco es adecuado, pues al hacerlo el
coeficiente de correlación R es igual a 0.9339, cuando analíticamente se recomienda, que
para hacer correlaciones R sea igual o mayor a 0.995), así es que se mantienen los
tamaños como aproximaciones, y si se quisiera determinar estos con exactitud convendría
utilizar marcadores sintéticos de peso molecular o recurrir a técnicas fisicoquímicas.

En general, este análisis debiera de repetirse prestando especial cuidado a las condiciones
del corrimiento entre ellas el voltaje aplicado, su homogeneidad sobre el gel y el tiempo
de corrimiento.

A este mismo respecto la electroforesis esta apareceré como una técnica poderosa de
análisis, siempre que se elijan las condiciones óptimas para cada análisis, por lo que tanto
la concentración de agarosa en el gel, como el voltaje y el tiempo sean adecuados y estos
aunque se refieran en la literatura se comprueben experimentalmente, algunas
acotaciones se han hecho ya, al hablar de la restricción.

Por lo demás, los errores introducidos en las determinaciones, por los instrumentos y
equipos serían muy difíciles de detectar dado que las magnitudes de medida utilizadas
escapan a la percepción humana, sin embargo, estos errores pudieran evitarse dando al
equipo su mantenimiento preventivo y cuidando al máximo las condiciones de trabajo,
para usarlo de la mejor manera.

Como perspectivas de este trabajo sería interesante el aislar plásmidos distintos y

caracterizarlos de la misma forma en que se hizo en la práctica, para saber si todo el ADN
recombinante se comporta de la misma manera, aquí mismo sería importante el poder
aplicar la metodología de extracción de ADN plasmídico en otras prácticas, pues como se
dijo ya, reviste algunos problemas como la obtención de isoformas del mismo, por lo que
la práctica permitiría mejorar la técnica y con el tiempo proponer una técnica modificada,
que permita obtener ADN plasmídico, de alta calidad y en las máximas concentraciones
posibles. Igualmente sería conveniente el repetir los experimentos de restricción con una
mezcla de BamH1 y EcoR1 y con enzimas distintas a las probadas, para construir un perfil
de restricción más completo e incluso hacer un mapeo de los genes de interés o del
inserto en el caso de pCR2.1-Topo-ape.
Igualmente el expresar todos los resultados de la transformación en términos
cuantitativos permitiría hacer comparaciones fiables y conclusiones de tipo estadístico. Lo
mismo aplica para la extracción de ADN, que convendría, para comparar, expresar en
términos de pureza y cantidad obtenida.

Finalmente:

La presente práctica puede verse como el culmine del curso experimental de genética
microbiana, pues para su realización, se integraron muchos de los conocimientos y
técnicas revisadas a lo largo del curso, en ella se pretendió aislar y caracterizar el ADN
recombinante, molécula quimérica que si bien basada en ADN natural, ha sido modificada
por el hombre, y que en la actualidad goza de una importancia enorme, por permitir, al
insertarse en otros organismos el obtener múltiples productos de interés industrial
(especialmente farmacéutico), así mismo, el manejo de las técnicas de trabajo con esta
molécula ha permitido, avances enormes en las ciencias de la vida y la salud al permitir la
caracterización de las especies biológicas y la descripción detallada de muchas de sus
funciones genéticas y metabólicas, sin embargos y aunque no es objetivo de la práctica,
cabe señalarse, las precauciones que en el futuro y desde el presente se habrá de
adoptar, para evitar la liberación al medio ambiente de ADN y/o organismos
genéticamente modificados, lo cual podría causar graves daños ecológicos al alterar la
biodiversidad por introducción de nuevas especies y desplazamiento de otras, quizás aún
no conocidas por el hombre.

Así los conocimientos experimentales aquí adquiridos, no serán suficientes a menos que
cuenten con un respaldo teórico-metodológico, fundamentado en la bioética, que permita
el decidir el mejor aprovechamiento de los conocimientos actuales en materia de genética
(en palabras de Santiago Ramón y Cajal: “Para la ciencia los medios son casi nada y el
hombre, lo es casi todo”).

Conclusiones:

 Se obtuvo ADN de doble cadena de pCR2.1TOPO y pCR2.1TOPO-ape

(plásmidos recombinantes y no recombinantes). Esto por el método de lisis
alcalina y con la generación de isoformas.
 Se obtuvo y trabajó con células competentes de Escherichia coli,
mismas que fueron transformadas a bacterias ampicilina resistentes
con el ADN del plásmidos, igualmente para las transformadas con
pCR2.1TOPO-ape se comprobó la presencia de un inserto que
inhabilita la capacidad de degradar la galactosa.
  Con lo anterior se pudo diferenciar un vector recombinante, en este
caso pCR2.1TOPO de uno no recombinante pCR2.1TOPO-ape por
pruebas fenotípicas y por pruebas de restricción.

Referencias bibliográficas:

1) Espinoza Lara A. et. Al. EXPERIMENTOS EN GENÉTICA MICROBIANA, IPN-ENCB, México 2011.

2) González de Buitrago TÉCNICAS Y MÉTODOS DE LABORATORIO CLÍNICO, 2ª ed. Ed. Masson, 2005,
España.

3) Molina N. et. Al. COMPARACIÓN DE MÉTODOS DE LISIS Y EXTRACCIÓN DE ADN DE TROFOZOÍTOS DE

Giardia Lamblia. Parasitol Latinoam 61:133-137 2006, FLAP, en
http://www.scielo.cl/pdf/parasitol/v61n3-4/art06.pdf, sitio público en internet consultado el 24/VII/11
a las 23:55 hrs.

4) J.G. y N. Sherman.: MICROBIOLOGY A LABORATORY MANUAL. Cappuccino Benjamin/Cummings Inc.

U.S.A. 1992.

5) Jiménez Sánchez A. Jiménez Martínez J. GENÉTICA MICOBIANA, Ed. Síntesis. 1998. España.

6) Karp G. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR: CONCEPTOS Y EXPERIMENTOS, 6ª ed. Ed. Mc Graw Hill,
2011, México.

7) Lodish et Al. BIOLOGÍA CELULAR MOLECULAR Ed. Médica Panamericana, 3ª edición. 2007. Argentina.

8) Sigma life sciences. MICROBIOLOGY MANUAL. Sigma-Aldrich corporation. 3th edition, 2009, U.S.A.

9) Tortora MICROBIOLOGY AN INTRODUCCIÓN. Ed. Benjamin Cummings, 9th edition, 2006, U.S.A.

10) Watson JD et Al. BIOLOGÍA MOLECULAR DEL GEN. Ed. Médica Panamericana, 5° edición 2006.
Argentina.

11) http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20N%C2%BA7%20AISLAMIENTO%20E%20I
DENTIFICACION%20DEL%20DNA.pdf sitio público en internet consultado el 1/IX/11 a las 23:55 hrs.
ANEXO N° 1. Gel de electroforesis obtenido por el equipo 5.

Figura n° 3. Gel obtenido en el análisis por electroforesis, de los plásmidos y los plásmidos
tratados con enzimas de restricción.
El llenado de los pozos se hizo, en el orden siguiente: 1.pCR2.1Topo/BamH1 2.pCR2.1Topo/EcoR1
3.pCR2.1Topo. 4. pCR2.1Topo-ape/BamH1 5.pCR2.1Topo-ape/EcoR1 6.pCR2.1Topo-ape 7.Marcador de peso
molecular.

ANEXO N° 2.Reacción cromogénica del X-gal

Figura n° 4. Reacción cromogénica entre el X-gal y la beta galactosidasa, cuando esta es inducida
por el IPTG.

EL X-gal, análogo a la galactosa, es degradado por la beta-galactosidasa, cuando esta es inducida por el IPTG,
quien no reacciona con estas, generando al compuesto 1, que copula con otra molécula del mismo compuesto,
generando al compuesto 2, de color azul. Así puede evaluarse la síntesis de beta-galactosidasa, en un cultivo de
células con un operon lac funcional o su no síntesis si alguno de los genes de dicho operon están interrumpidos
por algún inserto como es el caso del inserto –ape- en pCR2.1-TOPO-ape.