Baseestructuralde la informacióncelular:

DI{A, cromosomasy el núcleo

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T-r
-En lo cue hemostratadohastael momento sobrela es-
tructura y la función celular,ha existidosiempre,de for-
ma implícita,un sentidodel orden,del controly de lo pre-
visible.Hemosllegadoa esperarquelos orgánulosy otras
estructurascelulares tenganuna aparienciay funciónpre-
visibles,que las rutas metabólicasse realicende manera
ordenadaen lugaresintracelulares específicosy queel con-
junto de las actividadescelularesserealicede una forma
extraordinariamente cuidadosa,controlada,eficazy here-
dable.
Talesexpectativasexpresannuestraconfianzaen quelas
célulasposeanun conjuntode <instrucciones) que especi-
fiquensu estructura,dictensusfuncionesy regulensusac-
tividades,y que estasinstruccionesse puedantransmitir
fielmentea lascélulashijas.Hacemásdecienaños,el mon-
je agustinoGregorMendeldesarrollóreglasque trataban
sobrelos patronesde herenciaque observóen plantasde
guisantes, aunqueél teníapocasnocionesde lasbasescelu-
lareso moleculares de estasreglas.Estosestudiosconduje-
ron a Mendel a concluir que la información hereditariase
transmitíaen forma deunidadesdiferenciadas queen la ac-
tualidad llamamos genes. Actualmente, sabemos también
que los genesconsistenen secuencias de ADN que codifi-
can productosfuncionalesque normalmenteson cadenas
proteicas,pero que en algunoscasospuedensermoléculas
de RNA que no codificanproteínas.
La Figura18.1presentaun avancede cómo el DNA lle-
va a cabosu papelde instructorcelulary cómo al mismo
tiempoproporcionael marcoparadescribircómoseorga-
niza estegrupo de capítulossobreel flujo de información.
La figura destacael hechode que la información que lleva
el DNA fluye entregeneraciones de célulasy dentrode cada
célulaindividual. Duranteel primero de estosdosprocesos
(Figura18.1a),lainformaciónalmacenada en lasmolécu-
las de DNA de una célulasesometeal procesode la repli-
cación,generandodos copiasde DNA que sedistribuyena
las célulashijas cuandola célulasedivide. Los tres capítu-
los inicialesde estasección,estánenfocadoshacialas es-
tructurasy acontecimientos asociados con esteaspectodel
flujo dela información.Estecapítulocubrela organización
estructuraldel DNA y loscromosomas en los queseempa-
queta;tambiéntratasobreel núcleo,queesel orgánuloque
alojaa los cromosomasde lascélulaseucariotas.El Capítu-
lo 19trata sobrela replicacióndel DNA y la divisióncelu-
lar, mientrasque el Capítulo 20 consideralos aconteci-
mientoscelularesy molecularesasociadoscon el flujo de la
informaciónentregeneraciones de organismos con repro-
ducción sexual(incluyendolos trabajosde Mendel y su
basecromosómica).
La Figura18.lb resumecómola informaciónqueresi-
de en el DNA seutiliza dentrode la célula.Lasinstruccio-
nesalmacenadas en el DNA seutiLizanen un procesode dos
etapasdenominadastranscripcióny traducción.Durantela
transcripción,el RNA sesintetizaen una reacciónenzimá-
tica quecopiainformacióna partir del DNA. Durantela tra-
ducción,la secuenciade basesde las moléculasde RNA
mensajeroresultanteseutiliza para determinarla secuen-
ciade aminoácidosdelasproteínas.Además,la información
que inicialmentesealmacenabaen secuencias de basesde
DNA seutiliza finalmentepara codificarla síntesisde mo-
léculasde proteínaespecíficas. Sonlasproteínasparticula-
ressintetizadaspor una célulalas que finalmentedetermi-
nan la mayoríadelascaracterísticas estructurales de ésta,así
como las funciones que La
realiza. transcripción y la tra-
ducción, que juntas constituyen la expresión de la infor-
mación genética, los
son temas de los Capítulo s 2I a 23.

dela información
Baseestructural celular: y el núcleo
DNA,cromosomas 557
 -- Núcleos Figura18.1 El flujo de informaciónen las
/r--->< citoolasma
células, El diagrama caracterizalas células
( (,*,,-,4)-- eucariotas,aunque la replicación del DNA, Ia
\\ DNA /I división celular,la transcripción y la traducción
\\---,// son procesosque también sucedenen las células
Núcleos procariotas. (a) La información genética
Replicación del codificada en las moléculasde DNA se
DNA (síntesis Citoplasma transmite a las sucesivasgeneracionescelulares
de DNA)
por la replicación del DNA y por la división
celular (en las célulaseucariotaspor medio de Ia
mitosis).EI DNA primero seduplicay después
sedivide equitativamente entre las dos células
hijas. De estaforma se aseguraque cada célula

A>\
División
hija tenga la misma información genéticaque la
\_,_l_, célula de la que procede.(b) En cadacélula,la
información genéticacodificada en el DNA se
Traducción (síntesis* expresamediante el procesode la transcripción

vv
(e Proteínas) (síntesisde RNA) y Ia traducción (síntesisde
,,,o,"-,** proteína). La transcripción implica el uso de
segmentosespecíficosdel DNA como moldes
para la síntesisde RNA mensajeroy otras
moléculasde RNA. La traducción esel proceso
(a) Flujode información genéticaentre (b) Flulode información genéticaen el interior por el cual los aminoácidosseensamblánen
generaciones celulares de una célula:expresiónde la información una secuenciadictadapor Ia secuenciade
qenét¡ca nucleótidosdel RNA mensajero.

Abrimosestecapítulodescribiendoel descubrimiento tir de una fuentemásagradable, el espermade salmón.El

del DNA, la moléculacuyopapelinformativo,subyaceen el espermade pescadopuedepareceruna fuentede material
centrode estegrupo de seiscapítulos. poco usual,hastaque caigamosen la cuentade que el nú-
cleosuponemás del 90o/o de la masade una célulaesper-
máticatipicay de que,además,el DNA suponela mayoría
Naturaleza química del material dela masadelascélulasespermáticas. Porestarazón,Mies-
genético cherinicialmentecreyó,que el DNA estabaimplicadoen
la transmisióndela informaciónhereditaria.Sinembargo,
CuandoMendelpostulópor primeravezlaexistenciadelos pronto rechazóestaidea,debidoa que sustécnicasprimi-
genes,no conocíala identidadde la moléculaque lesper- tivas de medida sugirieronde forma incorrectaque los
mitía almacenary transmitir la informaciónheredada.Pero óvulosconteníanmuchomásDNA quelos espermatozoi-
unos años más tarde,estamoléculafue descubierta,sin des.Dedujoque el espermatozoide y el óvulo debíancon-
querer,por fohannFriedrichMiescher,un médicosuizo.En tribuir aproximadamente con cantidadesigualesa Ia in-
1869,cuandoMiescherestudiabacélulasen división.in- formaciónhereditariaque setransmitea la descendencia,
formó sobreel descubrimiento queahora y por esto,le parecióque el DNA no podríatransmitir la
de una sustancia
conocemoscomo DNA, justo unos añosantesde que el informaciónhereditaria.AunqueMiescherseequivocócon
biólogo celularWalter Flemmingobservase por primera respectoal papeldel DNA, a principiosde 1880un botá-
vezlos cromosomas al microscopio. nico llamado Eduard Zachariasinformó de cue la extrac-
ción del DNA de lascélulascausabala desapiriciónde la
El descubdmiento del DNApor Mieschercondujoa tinción de los cromosomas. Puestoquelasevidencias em-
propuestascontradictorias pezaban a sugerir el papelde los cromosomas en la trans-
sobrela naturalezaquÍmica
de los genes misión deIa información hereditaria,Zacharias y otros in-
vestigadores infirieron queel DNA erael materialgenético.
Miescherestabainteresadoen estudiarla químicadel nú- Estavisión prevalecióhastaprincipios de 1900,cuando
cleo,ya que la mayoriade los científicossuponíaque era unos experimentosde tinción interpretadosincorrecta-
dondesesituabael materialgenéticocelular.En susexpe- mentecondujerona la conclusiónfalsade quela cantidad
rimentosiniciales,Miescheraislónúcleosde glóbulosblan- de DNA cambiabadramáticamenteen el interior celular.
cosde la sangreobtenidosa partir de pus procedentede Puestoque se esperabaque las célulasmantuvieranuna
vendasquirúrgicas.Unavez extraídoslos núcleoscon ál- cantidadconstantede la sustanciaqueguardasusinstruc-
cali,descubrióuna sustanciainusual,a la que denominó cioneshereditarias, estasobservaciones erróneasconduje-
<nucleína> y de la que ahorasabemosque es,en gran me- ron a rechazarla idea de que el DNA transmitía Ia infor-
dida,DNA. Mieschercontinuóestudiandoel DNA a par- mación genética.

558 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celular:
DNA,cromosomas
v el núcleo
 El resultado es que entre 19i0 y I940,1a mayoría de los
científicos pensaban que los genesestabanformados por
proteínas, más que por DNA. Los bloques químicos que
construyentanto las proteínascomo los ácidosnucleicosse
identificaron a principios de la décadade 1900,percibién-
dose a las proteínas como estructurasmás complejasy por
tanto más probables para almacenarla información gené-
tica. Se defendíaque las proteínas estabanconstruidaspor
20 aminoácidos diferentes que se podían ensamblar en un
enorme número de combinaciones, generando, de ese
modo, la diversidad de la secuenciay la complejidad espe-
rada en una molécula que almacenay transmite la infor-
mación genética.Por el contrario, el DNA se percibía de
forma general como un polímero que consistíaen Ia mis-
ma secuenciade cuatro bases(es decir, el tetranucleótido
-ATCG-) repetido una y otra vez, faltándole además,la
variabilidad esperadaen una molécula genética.De este
simple polímero seesperabaque sirviera meramente como
un soporte estructural para los genes,que estaban,en cam-
bio, formados por proteínas. Esta visión prevaleció hasta
que dos líneas de evidencia resolvieron el asunto a favor del
DNA como material genético,como describiremosa con-
tinuación.
queel DNAes e¡mater¡alSenético
Averydemostró
delasbacterias
Unagransorpresa queestaban
a losbiólogos
esperaba es-
tudiando las moléculasproteicaspara determinar cómo la
información genéticase almacenay setransmite. Los ante-
cedenteslos proporcionó en 1928 el médico británico Fre-
derick Griffith, que estabaestudiando una cepapatógena de
una bacteria, llamada (neumococo) que causa una neu-
monía fatal en animales. Griffith descubrió que esta bacte-
ria (llamada Streptococus pneumoniae)existeen dos formas
denominadascepaSy cepaR. Cuando creceen un medio de
agar sólido, Ia cepaS produce coloniaslisasy brillantes de-
bido al moco, cubierta polisacáridaque secretacadacélula,
mientras que la cepaR carecede la capacidadpara fabricar
la cubierta mucosay por tanto produce coloniasque mues-
tran un límite rugoso.
Cuando seinyectaen ratones,la cepaS bacteriana(pero
no la cepa R) desencadenauna neumonía fatal.La capaci-
dad para causarla enfermedad está directamente relacio-
nada con la presenciadel polisacárido en la cubierta de la
cepa S, que protege a la bacteria del ataque del sistemain-
mune del ratón. Uno de los descubrimientosmás intrigan-
tes de Griffith fue el que la neumonía también se podía in-
ducit inyectando a los animales una mezcla de bacterias
vivas de Ia cepaR con bacteriasmuertas de la cepaS (Figu-
ra 18.2).Este descubrimiento fue sorprendenteporque ni
los organismosvivos de la cepaR ni los organismos muer-
tos de la cepaS causabanneumonía si se inyectabansolos.
Cuando Griffith rcalizó la autopsia de los animales a los que
había inyectado la mezcla de cepa R viva con cepa S muer-
ta estabanrepletos de bacteriasvivas de la cepaS. Puestoque
a los animales no se les había inyectado ninguna bacteria
viva de la cepaS, concluyó que las bacteriasde la cepaR no

El ratónmuere El ratónse mantienesano El ratónse mantienesano El ratónmuere

(a) BacteriasvivasS (lisas) (b) Bacteriasvivas R (c) BacteriasS muertaspor (d) BacteriasR vivas
(rugosas) calentamiento mezcladascon
hr¡ioriac Q nnr

Figura18.2 El experimentode Griffithsobrela transformación genéticadel neumococo. Lascolonias calentamrento

S (lisas)de Ia bacterianeumococo(Streptococus pneumoniae)son patógenasen ratones.Las colonias
R (rugosas)no. (a) La inyección de bacteriasS vivas en un ratón produce el desarrollo de neumonía
y la muerte. (b) La inyección de bacteriasR vivas mantiene al ratón sano.(c) Las bacteriasS muertas
por calentamiento no tienen ningún efecto cuando seinyectan solas.(d) Cuando se inyecta una
mezcla de bacteriasde la cepaR vivas y bacteriasde 1acepaS muertas por calentamiento,el
resultado es neumonía y muerte. (e) El descubrimiento de que la cepaS de bacteriaspatógenasvivas (e) BacteriasS vías en la
se recobrabaa partir de la sangredel ratón del apartado d,le sugirió a Griffith que algún factor sangrede un ratónmuerto
químico procedentede las célulasS muertas por calentamiento,era capazde causarun cambio
heredable(transformación) de las bacteriasR no patógenasen bacteriasS patógenas.El factor
químico se identificó posteriormente como el DNA.

química
Naturaleza genético 559
delmaterial
patógenas,se habían convertido de alguna forma en bacte- produccióndevirus. ¿Cuálesla naturalezaquímicadel ma-
rias de la cepaS, patógenas,debido probablemente,a algu- terial inyectado?En 1952,Nfred Hersheyy Martha Chase
na sustancia presente en las bacterias de la cepa S (muertasdiseñaronun experimentopara dirimir estacuestión.Sólo
por calentamiento) con las que se habían inyectado las de existendosposibilidades ya queel virus T2 estáformadoso-
la cepa R. Él denominó a este fenómeno transformación lamentepor dosclasesde moléculas:DNA y proteínas.Para
genética y se refirió a la sustancia activa (aunque todavía distinguir entre estasdos alternativas,Hersheyy Chasese
desconocida)de las bacteriasde la cepa S como <el princi- aprovecharondel hechode que las proteínasdel virus T2,
pio transformante>. como la mayoríade lasproteínas,contienenazufre(en los
Los descubrimientos de Griffith dispusieron el escena- aminoácidosmetioninay cisteína)pero no fósforo,mien-
rio de 14 años de trabajo de Oswald Avery y de sus colegas trasqueel DNA viral contienefósforo(en su esqueletoazi-
en el Instituto Rockefeller de Nueva York. Estos investiga- car fosfato) pero no aztfre. Hersheyy Chaseprepararon
dores continuaron con los trabajos sobre la transforma- ademásdoslotesde partículasdel fagoT2 (a los quesede-
ción bacteriana hasta su conclusión más lógica, pregun- nominan fagosintactos)con distintostipos de marcajera-
tándose qué componente de la cepa S muerta por dioactivo.En uno de los lotessemarcaronlasproteínasdel
calentamiento era el responsable de la actividad transfor- fagocon "^S^; .tt el otro lote el DNA del fagosemarcabacon
mante. Fraccionaron extractos de la cepa Sbacteriana exen- el isótopo"P.
tos de célulasy descubrieronque sólo la fracción de los áci- Usandode estaforma los isótoposradiactivos, Hershey
dos nucleicos era capaz de causar la transformación. y Chaselocalizaronel destinotanto de las proteínascomo
Además, la actividad se eliminaba de manera específicapor del DNA, duranteel procesode infección(Figura18.3a).
tratamiento con desoxirribonucleasa,una enzima que de- Empezaronel experimentomezclandoel fago radiactivo
grada el DNA. Ésta y otras evidencias les convencieron de con célulasbacterianasintactas,permitiendoasí que las
que Ia sustancia transformante del neumococo era el DNA, partículasdel fagoseadhiriesena la superficiede las célu-
una conclusión publicada por Aver¡ Colin Macleod y lasbacterianase inyectasensu materialgenéticoa las célu-
Maclvn McCartv en 1944. las.En estepunto Herseyy Chasedescubrieron quelascu-
Éita es la primera afirmación rigurosamente documen- biertasproteicasvacías(o <fantasmas> de fagos)sepodían
tada,d, respectode que el DNA pudiera portar información retirar deforma efectivadela superficiede lasbacterias,agi-
tandola suspensión
genética.Pero, a pesar del rigor de los experimentos, la asig- conunabatidoraconvencional y recu-
nación del papel genético al DNA no obtuvo una aceptación perandolascélulasbacterianas por centrifugación. Midie-
inmediata. El escepticismo sedebía en parte a la convicción ron, entonces,la radiactividaden el líquido sobrenadante y
persistente y extendida ampliamente de que al DNA le fal- en el precipitadode bacteriasdel fondo del tubo.
taba Ia complejidad necesariacomo para desempeñartal Los datosrevelaronque la mayoria de132P (650lo)que-
papel.Además,muchos científicosse cuestionabansi la in- dabaen lascélulasbacterianas, mientrasquela mayoríadel
formación genéticaen las bacteriasestaríarelacionadacon "S 1800/o¡ seliberabaal mediocircundante(Figura18.3b).
la herencia en otros organismos. Sin embargo, la mayoría de Puestoqueel 32Pmarcabael DNA viral y el 3sSmarcabalas
las dudas que quedaban se acallaron ocho años después proteínasvirales,Herseyy Chaseconcluyeronque era el
cuando sedemostró que el DNA era también el material ge- DNA del fagoT2, y no las proteínas,lo que habíasido in-
nético de un virus, el bacteriófasoT2. yectadoa las célulasbacterianas, y por tanto,deberíafun-
cionarcomo materialgenético.Estasconclusiones fueron
respaldadas por la siguienteobservación: cuandolasbacte-
Hershey y Chasedemostraron queel DNAes el mater¡al
genét¡co rias radiactivasinfectadasseresuspendían en un medio lí-
de losvirus
quido frescoy seincubabandurantemástiempo,el 32Pse
Losbacteriófagos, o fagosparaabreviar, sonvirusquein- transferíaa algunade las partículasde los fagosde la des-
fectanabacterias. Hansidoobjetodeestudiocientíficodes- cendencia, peroel "S, no.
de 1930y muchosdenuestros primerosconocimientos de Comoresultadodelos experimentos quehemosdescri-
genéticamolecularprocedende experimentosqueimplican to, a principiosde Ia décadade 1950,lamayoríade losbió-
a estosvirus.El Anexo 18Adescribela anatomíay el ciclo logosaceptaban la ideade quelos genesestabanformados
de replicaciónde algunosfagosy destacasusventajaspara por DNA, perono por proteína.Desafortunadamente, el vi-
estudiosgenéticos. sionarioOswaldAver¡ máximo responsable de dar un giro
Uno de los fagos,que infectana la bacteriaEscherichia a la visión existentesobrela función de DNA, nunca reci-
coll,estudiados mása fondo esel bacteriófagoTl2.Duran- bió subien merecidoreconocimiento. El Comitédel Premio
te la infección,estevirus seune a la superficiede la célula Nobeldebatiósobreel trabajodeAver¡ perodecidióqueno
bacteriana,y le inyectasu material.Pocodespués,la célula habíahechosuficiente.Quizásla nataralezamodestay sin
bacterianaempiezaa producir miles de nuevascopiasdel pretensionesde Averyfue la causantede estafalta de reco-
virus.Esteescenariosugiereque el materialinyectadoen la nocimiento.Después dela muertedeAveryen 1955,el bio-
célulabacteriana porta la información genéticaque guíala químico Erwin Chargaff escribió en su tributo: <Era un

s60 Capitulo
18 Baseestructural
dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
 F, -tr ft?:Jl3'H:"('"ntasmas)
Proteína
marcaoa
con'"5

¡A
Bacteria ¡F,f-¡b
I lamr\/^rñ4rtó

de la radiactividad
está en el líquido @)
Y
*^F F wsl
._ %,
o {^^^^ñ^,^^¡^^
Mezclade bacteriascon
tdvv> il rdr uduuü
radiactivamente; los
Agitaciónen un agitadorpara
separarlos fagos del exteriorde
la célulabacterianade su
Q- Centrifugación:
radiactividad
medidade la
en el precipitado
I v"oiou
o"tu
raolacltvtoao
en la descendencia
v en el líouido
fagos infectana las conten¡do de los fagos
célulasbacterianas

Proteína
marcaoa
con "'H

CD-o
\ ^g_

dr
é/],l'F
'
Lf"
La mayoríade la
radioactividadestá
en el precipitado
ry4) -q
PartÍculasdel fago
(pellet) radiactivas
(a) El experimento
de Hershey-Chase

E 1oo
a
o^^
aóu 80%
ñ
.: La homogenización eliminael B0%
s60 de las célulasmarcadascon 35S
O ¡n
o+u 357"
.b
@ La mayoríadel 32P(65%)
,20 se mantieneen las células
(d
intactas
6 012345678
F
(min)
Tiempode agitaciónen el homogenizador
del apartadoa, paso3
(b) Datosexperimentales
35S(para
Figura18.3 Expeilmentode Hershey{hase:el DNAcomo matedalgenéticodel fago T2. (a) O Seutilizan fagosT2 marcadosbien con
marcar proteínas)bien con 32P (para marcar DNA) para infectar bacterias.Los fagosseadsorbena la superficiecelulare inyectansu DNA. @ La
agitaciónde las célulasinfectadasen un agitador elimina la mayoría de 3sSde las células,mientras que la mayoria de32Psemantiene.@ La
centrifugaciónhaceque las célulasformen un precipitado;cualquier partícula libre del fago,incluyendo los fantasmasque quedanen el líquido
sobrenadante.@ Cuando las célulasde todos los precipitadosseincuban, el DNA del fago dirige en ellasla síntesisy finalmente la liberación de
nuevaspartículasdel fago.Algunos de estosfagoscontienen32Pen su DNA (ya que el antiguo DNA marcado del fago,seha empaquetadoen
algunade las nuevaspartículas),pero ninguna contiene35Sen las proteínasde su cubierta. (b) El gráfico muestra el grado en que se retiran tanto
el35Scomo el 32Pde las célulasintactasen el paso 3, en función del tiempo de agitación.Unos pocosminutos de agitaciónson suficientescomo
para retirar la mayoría (80o/o)del 3sS,mientras que en esemismo tiempo semantiene la mayoría (650/o)del3zPde las células.

química
Naturaleza genétlco 5 6 1
delmaterial
A ne x o
F¡.COS:SISTEMA MoDELo PARA ESTUDIAR GENES
Desdesu inicio a mediadosdel sigloxx, la genéticaempleóuna
ampliavariedadde organismoscomo materialde
experimentación.Inicialmente,centró su atenciónsobre
animalesy plantas,como los guisantesde Mendely lasmoscas
de la fruta popularizadaspor investigadores posteriores.Sin
embargo,alrededorde 1940,comenzarona probarsebacteriasy
virus, proporcionandoa los biólogossistemasexperimentales
que revolucionaronliteralmentela cienciade Ia genética
llevándolaal nivel molecular.
Los bacteriófagoshan sido especialmente importantes.Los
bacteriófagoso fagospara acortar,son virus que infectana
célulasbacterianas. Es fácil obtenergrandescantidadesde
partículasde fagosen un corto periodo de tiempo,1oque
facilita enormementeel muestreode mutantes-fagos con
variacionesheredables- que de estaforma hacenposibleque
los genetistasidentifiquengenesen particular.Algunosde los
fagosestudiadosen mayor profundidadson el bacteriófagoT2,
el T4 y el T6 (los denominadosT-pares)que infectana la
bacteriaE. colí.Lostres fagosT-parestienen estructuras
similares,que son bastanteelaboradas. El fagoT4 semuestraen
la Figura 18A.1.La cabezadeIfagoesuna cápsulaproteicaque
tiene forma de icosaedrohueco(un objeto de 20 caras)relleno
de DNA. La cabezaseune a :unacolaproteica,que consisteen
F65 nm-
Cabeza
225 nm
Núcleode la cola
Vainade la cola
Placabasal
Fibrasde la cola
Figum18A.1 Estructura delfagoT4. La imagenidentificalos
componentes estructurales
principalesde estefago,no todosson
visiblesen la micrografta(MET).
562 Capitulo
18 Baseestructural
de la información
celular:
DNA,cromosomas
w núcleode Ia colahuecorodeadopor una yaina contráctllde
la colay quetermina eíura placabasalhexagonal a la que se
lunet seisfibras de la cola.
La Figura 18A.2representalos principalesacontecimientos
en el ciclo de replicacióndel fagoT4. Los esquemas no son a
escala;la bacteriaesproporcionalmentemásgrande,como
indica la micrografiaelectrónica.El procesoempiezacon la
adsorciónde una partículade fagoa la paredde una célula
bacteriana.Cuandoel fagocolisionacon la célula,seaplastade
modo que su placabasalseanclaa un receptorproteico
específicode la pared(Figura l8L.2a, O ).fo siguienteesque
la vaina de la cola,secontraedirigiendo a la cola centralhuecaa
travésde la paredbacteriana.La porción centralde la cola
forma una agujaa travésde la que el DNA del bacteriófagose
inyectaen la bacteria(@ ). Una vezque esteDNA ha alca¡zado
Ia célulabacteriana,la información genéticadel fagose
transcribey setraduce( @ ). Estoda lugara unaspocas
proteínasclaveque alteranla maquinariametabólicade la
célulahuéspeden beneficiodel fago,que consistenormalmente
en su rápidamultiplicación.Puestoque el fagoconsiste
simplementeen una moléculade DNA rodeadopor una
cubiertaproteica(su cápsida),lamayoríade la actividad
metabólicade la célulainfectadaestácanalizadahaciala
replicacióndel DNA del fagoy haciaIa síntesisde lasprotelnas
de la cápsida.El DNA del fagoy lasproteínasde la cápsidase
autoensamblanen cientosde nuevaspartículasdel fago (@ ).
En aproximadamentemediahora, la célulainfectadaselisa (se
abrengrietas),Iiberandoal medio lasnuevaspartículasdel fago.
( @ ). ehora cadanuevofagoinfectaotra célulabacteriana,
haciendoposiblela obtenciónde enormespoblacionesdel fago
-tantas como 10" partículasdel fagopor mililitro de cultivo
de bacteriasinfectadas-.
Paradeterminarel número de partículasde fagoen una
muestra,un volumen medido semezclacon bacteriascreciendo
en medio líquido parapermitir la adsorciónde los fagosa la
bacteria.Lamezclaseextiendeen un medio nutritivo sólido
(que contieneagar)en una placade Petri.En la incubación,la
bacteriasemultiplica paraproducir un <césped> de células
sobrela superficiedel medio nutritivo. Así,en cualquierlugar
que una partículavírica hayainfectadouna célulabacteriana,
una manchaclaraapareceráen el céspeddebido a que las
célulasbacterianashan muerto por Ia poblacióndel fagoen
multiplicación.Estasmanchasclarassedenominanplacas.El
número de placasque aparecenen el céspedbacteriano
representanel número de partículasde fagoen la mezcla
original de bacterias-fagos, siempreque el número inicial de
fagossealo suficientementepequeñocomo para asegurarque
cadauno va a dar lugar a una placaseparada. La Figura 18A.3
muestralasplacasformadaspor el bacteriófagoT4en el césped
de célulasde E. coli.
El cursode los acontecimientosmostradosen la Figura
18A.2asedenomina crecimientolíticoy escaracterísticode un
fagovirulento.El crecimientolítico tiene como resultadoIa lisis
de la célulahuéspedy la producciónde una progeniede muchas
partículasde fago.En comparación,an fago temperadopaedeo
Vel núcleo
 Figura184.2 El ciclo litico de vida de un fago
T-pat (a) El ciclo de replicación de un fago
T-par, empiezacuando una partícula del
fago @ seadsorbeen la superficiede una
tr* célulabacterianae @ inyecta su DNA en Ia
üri célula.(Q El DNA del fago sereplica en Ia
célula huéspedy codifica la producción de
b
c las proteínasdel fago.@ Estoscomponentes
fqr se.ensamblan en nuevasparticulasde fago.
(! Normalmente,la célulahuéspedselisa,
I Adsorción.de la .\ Iiberando las partículasde fago de la
parucura oe rago t'. I
e n l ac é l u l a '. t descendenciaque pueden infectar a más
huésped al bacterias.Esteprocesode replicación es
típico del crecimiento lítico de muchos
--l7m- fagos.(b) Micrograffa electrónicade una
bacteriacon partículasde fago pegadasa su
(b) Bacteria
con partículas
de fagounidas superficie (MET).

o gB'niiu,.

effi
Replicación
DNAdelfago
del

y síntesisde las
proteínasdel fago

a,€f?w-t@ v
.-b e¡eq¡B^ Figura184.3 Placasdefagoen un céspedde bacterias. Sehan
formadoplacasde fagosobreun céspedde E. coliinfectadas
conel
fagoT4.Cadaplacaprocededela reproducciónde unaúnica
I Ensamblaje
oer I partículade fagodeIa mezclaoriginal.
roscomponenres
I
delfago
*
bien producir crecimientolítico, como haceun fagovirulento, o
integrarsu DNA en el cromosomabacterianosin causarningrin
daño inmediato a la célulahuésped.Un ejemplode fago
temperadoespecialmente bien estudiado,esel bacteriófago},
(lambda),quejunto con los fagosT-pares,infectaa las células
Liberaciónde de E. coli.En el estadointegradoo estadolisogénico,el DNA de
I un fagotemperadosedenominaprofago.Elprofagosereplica
nuevaspantcutas
del fago con lisis junto con el DNA bacteriano,a menudo a travésde muchas
cerurar generaciones de célulashuésped(Figura18A.4).Duranteeste
tiempo,los genesdel fago,aunquepotencialmenteletales,para
(a) Replicación
el huésped,estáninactivoso reprimidos.Sin embargo,bajo
del fago
ciertascondiciones,el DNA del profagoseescindedel
cromosomabacterianoy entra otravezen el ciclo lítico,
produciendoprogeniede partículasde fagoy lisandoIa célula
huésped.

química
Naturaleza genético 563
delmaterial
Anexo
lJna razónpor la que los fagosson tan atractivosparalos
genetistasesporque el pequeñotamañode susgenomas(que
puedeserde DNA o de RNA) hacerelativamentefacil de
identificary estudiarsusgenes.El genomadel bacteriófago,1,es
una moléculade DNA sencillaque contienemenosde 60 genes,
comparadocon los variosmiles de genesde una bacteriacomo
E. coli.Otros fagosson todavíamáspequeños;en algunoscasos,
contienenmenosde una docenade genes.Debido a sus
genomassencillos,su rápida multiplicacióny el enorme
número de progenieque sepuedeproducir en un pequeño
volumen de medio de cultivo,los bacteriófagosestánentrelos
<organismos> mejor conocidos.Además,también tienen otros
beneficiosprácticos.Puestoque los fagosson capacesde
destruirbacterias,algunasempresasde biotecnologíaestán
investigandoen el desarrollode fagosmodificadosque podrían
serútiles paratratar infeccionesbacterianasen humanos,
especialmente en aquelloscasosen los que lasbácteriassehan
hechoresistentes a los antibióticos.
Figura18A.4 Estadolisogénicode un profagodentrode un
cromosoma bacteliano.El DNA inyectadopor un fagotemperado
sepuedeintegraren el DNA de un cromosomabacteriano, El DNA
delfagointegrado,denominadoprofago,sereplicajunto conel
DNA bacterianocadavezquela bacteriasereproduce.
hombre tranquilo; habríahonrado más al mundo, si el
mundo le hubierahonradomása él>.
¿Porquélos trabajosde Hershey-Chase recibieronuna
acogidamás cálidaque los trabajospreviosde Avery sobre
aunquelos dos condu-
la transformaciónde lasbacterias,
jeron a lasmismasconclusiones?La principalrazónparece
habersidosimplementeel pasodel tiempoy el cúmulode
evidencias circunstanciales
adicionalesdespuésdela publi-
caciónde Averyde 1944.Quizásla evidenciamás impor-
tante fue que el DNA tiene una estructuralo suficiente-
mente variablecomo para ser el materialgenético.Esta
evidenciaprocedíade estudiossobrela composicióndeba-
sesdel DNA, comoveremosdespués.
Lasreglasde ChatgaffrevelanQUeA = T y queC = G
A pesarde la reacciónde indiferenciacon la que inicial-
mente se recibió el trabajo de Aver¡ ésteejerció una in-
fluenciatrascendentalen otros científicos.Entre ellosesta-
ba Erwin Chargaff,queestabainteresadoen la composición
debasesdel DNA. Entre 1944yl9\2,Chargaffutrlizabamé-
564 18 Baseestructural
Capítulo dela información
celular:
DNA,cromosomas
rt.tugose.unea la
O
cetutanuespeo Fago
e inyectael DNA temperato
Cromosoma
bacteriano
(DNA)
Célulabacteriana
El DNA del fago se
integradentrodel
cromosomabacteriano,
convirtiéndoseen
profago
I La bacteria
se proouce
connormalidad
todos cromatográficospara separary cuantificar las canti-
dadesrelativas de las cuatro basesen el DNA -adenina (A),
guanina (G), citosina (C) y timina (T)-. De estosanálisis
surgieron varios descubrimientos importantes, Primero de-
mostró que el DNA aislado a partir de diferentes tipos ce-
lulares de especiesdadas, tenían el mismo porcentaje de
cada una de las cuatro bases(Tabla 18.1),y que estepor-
centajeno varía con el individuo, el tejido, la edad y el es-
tado nutricional o el medioambiente. Esto es exactamente
lo que podría esperarsede la sustanciaquímica que alma-
cenainformación genética,ya que de las célulasde una es-
pecie dada se esperaque tengan una información genética
similar. Sin embargo, Chargaff descubrió que la composi-
ción de basesdel DNA, varía entre especies.Esto se obser-
va, examinando Ia última columna de la Tabla 18.1, que
muestra las cantidadesrelativasde las basesA y T con res-
pecto a las cantidades relativas de G y C en los DNAs de va-
rios organismos.La comparación de estosdatos le reveló a
Chargaff que las preparaciones de DNA de especiesrela-
cionadas estrechamentetienen una composición de bases
similar, mientras que aquéllasde especiesdiferentes tienden
y el núcleo
 Tabla18.1 Gomposición
debasesdelDNAdevariosorígenes
Númerode cada tipo de nucleétido* Proporciónde nucleótidos**
Origen del DNA A A/T c/C (A+r)/(G+c)
Timo bovino )9, L 28,4 2t,1 22,r 1,00 0,95 1,31
Hígado bovino 28,1 28,4 2t,0 0,99 r,07 1,30
Riñón bovino 28,3 28,2 22,6 ,no 1,00 1,08 1,30
Cerebro bovino 28,0 28,1 )) 1 2t,6 1,00 1,03 r,28
Hígado humano 30,3 ?o? 19,5 19,9 1,00 0,98 1,53
Langosta )q? 20,5 20,7 1,00 1,00 1,41
Erizo de mar 32,8 32,1 t7,7 17,3 1,02 1.,02 1,85
l1Arñéñ A. +,i-^ )77 27,1 22,7 22,8 1,01 1,00 1,19
Cangrejomarino 47,3 2,7 2,7 I,00 1,00 7,s0
Aspergillus(moho) 25,0 )19 25,1 25,0 1,00 1,00 1,00
Saccharomycescerevisiae (levadura) t) q t8,7 17,l 0,9s 1,09 1,79
Clostr idiu m (bacteria) 1A O 36,3 14,0 12,8 r,02 r,09 2,73
{ Los valores de estas cuatro columnas
son el núme¡o aproximado de cada tipo de nucleótido encontrado por cada 100 nucleótidos de DNA
** Las proporciones de AiT y
de G/C no son todas exactamente 1,00 debido al error experimental.

a exhibir composicionesde basesbastantedistintas.Una vez Watsony Cilck descubrieron

más, esto es lo que se esperaríade una molécula que alma-
cena información genética,
Sin embargo,la observaciónmás sorprendentede Char-
gaff fue su descubrimiento de que para todas las muestras
de DNA examinadas,el número de adeninasera igual al nú-
mero de timinas (A : T), y el número de guaninasigual al
número de citosinas (G : C): esto significaba que el nú-
mero de purinas era igual al número de pirimidinas (A +
G : C + T). El significado de estasequivalencias,conoci-
das como las reglas de Chargaff, era un enigma y así se
mantuvo hastaque en 1953Watson y Crick establecieronel
modelo de la doble hélice de DNA.
La estructura del DNA
A medida que la comunidad científica aceptabagradual-
mente las conclusionesde que el DNA almacenabala in-
formación genética,comienza a surgir un nuevo grupo de
preguntas relacionadascon la manera en la que el DNA
realizasu función genética.Uno de los primeros temas que
surge es la cuestión sobre cómo se replica el DNA de una
forma tan precisaque las copias duplicadasde la informa-
ción genéticase pueden pasar de una célula a otra durante
la división celular,y de los padres a la descendencia.Con-
testar a esta pregunta requiere el conocimiento de la es-
tructura tridimensional del DNA, que fue proporcionada en
1953 cuando Watson y Crick formularon su modelo de la
doble hélice del DNA. Hemos descrito la estructura de la
doble héliceen el Capítulo 3 y su descubrimientoen elAne-
xo 3A, pero volvemos a ello ahora, para revisarlo y ver al-
gunos detallesen profundidad.
queel DNAes unadoblehélice
En 1952,James Watsony FrancisCrick formabanpartedel
pequeñogrupo de científicosque estabanconvencidos de
que el DNA era el materialgenéticoy de que el conoci-
mientode su estructuratridimensionallesproporcionaría
pistasvaliosassobrecómo funcionaba.Tiabajandoen la
Universidadde Cambridge,en Inglaterra,seaproximaron
al rompecabezas construyendo modelosen alambrede es-
tructurasposibles. Duranteaños,sepensaba queel DNA era
un polímerolargocon un esqueleto de azúcares repetidos
(desoxiribosas) y unidadesde fosfatoy una basenitroge-
nadaunida a cadaazucar.Paraconstruirsu modeloWatson
y Crick sebasaronen quea pH fisiológicolasbasesA, G, C
y T existenen unasformasparticularesque permitenla
formacióndepuentesde hidrógenoespecíficos entrepare-
jas.Sinembargo,la evidenciaexperimental másimportan-
te,vino del patrónde difracciónde rayosX del DNA obte-
nido por RosalindFranklin,que estabatrabajandoen el
King'sCollegede Londres.La imagende Franklinindicaba
queel DNA erauna estructurahelicoidal,y basándose enla
información proporcionadapor estaimagen,Watsony
Crick propusieronfinalmenteun modelode DNA quecon-
sistíaen dos hebrasentrelazadas, una doble hélice.
En la doblehélicedeWatsony Crick,ilustradaen la Fi-
gura 18.4,losesqueleto s de azicarfosfatodelasdoshebras
estánen el exteriordela hélice,y lasbasesmiran haciael in-
terior,haciael centrode la hélice,formandolos escalones
de una escalera circulara la que separecela estructura.La
héliceesdextrógira,estosignificaquela hélicesecurva<ha-
cia arribo y haciala derecha(fíjeseen queestoescierto,in-
clusosi seponeel diagramaal revés).Contienediezpares
denucleótidospor vueltay avanza0,34 nm por cadapar de
nucleótidos. Consecuentemente cadavueltacompletadela

Laestructura
delDNA 565
 5'
Extremo
I Extremo
3'
o I
t5'
O: P-O-CHz
o-
o-
I
o HrC-O-P:O
Adenina Timina

o
I
q O: P-O-CHz o ,u,.--¡* cr)
o
o
o.
N-H """.".. N o- ¡o
-[ o.
I c
HrC-O- P:O .o
l
(¡ o O
O

I
Timina Adenina q)

o
3,4 I
nm
I o- o-

II o " ' " . ' . " . " .H - N

Citosina
\
HrC-O- P:O
/w
I

I I
HrC-O- P:O
s',o
o-

I
Purina Extremo
5'
(a) Doblehélice (b) Orientación de las hebras
antiparalela

Figura18.4 La doblehélicede DNA. (a) Estaimagenesquemáticamuestralas cadenasde azicar fosfatodel esqueletode DNA, Ios paresde
basescomplementarias,elsurcomayorymenoryotrasdimensionesimportantes.A:Adenina,G:Guanina,T:Timina,P:FosfatoyS
: Azicar (deoxiribosa).(b) Una de las hebrasde la moléculade DNA estáorientadaen dirección5' + 3' mientrasque su hebra
complementariaestáorientadaen la direcciónopuesta5' + 3' . Estediagramatambién muestralos puentesde hidrógenoque conectanlos
paresde basesAI y GC.

héliceañade3,4 nm a la longitud de la molécula, EI diáme- determina la secuenciade basesde la cadenaopuesta;ade-

tro de Ia hélice es de 2 nm. Estadistancia es demasiadope-
queña para dos purinas y demasiadogrande para dos piri-
midinas, pero se ajusta bien para una purina y una
pirimidina, de acuerdo con las reglasde Chargaff.En otras
palabras,se necesitael par purina-pirimidina por conside-
raciones estéricas.Las dos hebras se sostienenpor puentes
de hidrógeno entre las basesde hebras opuestas.Además,los
puentesde hidrógeno que mantienen juntas las dos hebras
de la doble hélice sólo ajustan cuando seforman entre la base
adenina (A) en una de las cqdenasy timina (T) en la otre, o
entre la baseguanina (G) en una cadenay citosina (C) en la
otra.Esto significa que la secuenciade basesen una cadena
más, se dice que las dos cadenasde la doble hélice de DNA
son complementarias. Esemodelo explica por qué Chargaff
había observadoque las moléculasde DNA contienen can-
tidadesigualesde las basesA y T que de las basesG y C.
La implicación más profunda del modelo de Watson y
Crick esque sugiereun mecanismopor el que las célulasre-
plican su información genética:simplemente, las dos hebras
de la doble hélice de DNA se separanantes de la división,
de manera que cadahebra funciona como un molde que di-
rige la síntesisde una nueva hebra de DNA, usando las re-
glasdel emparejamientode bases.En otras palabras,la base
A en la hebra molde definiría la inserción de Ia baseT en la

566 18 Baseestructural
Capitulo dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
hebradenuevaformación,la baseG especifica la inserción
de la baseC, la baseT concretala inserciónde la baseA, y
IabaseC implicaríala insercióndela baseG.En el siguien-
te capítulo,trataremoslasevidenciasexperimentales parael
mecanismopropuestoy describiremos lasbasesmolecula-
resde la replicacióndel DNA en detalle.
En la Figura18.4seilustranvariasde lascaracterísticas
másimportantesdela doblehélicede DNA. Porejemplo,la Surco
mayof
forma en la que giran lasdos hebrascreaun surcomayory
vn surcomenonEstossurcosdesempeñan un papelimpor-
tanteen lasinteraccionesdel DNA convariasde moléculas.
Otra característica importanteesla orientaciónantiparale-
la de las dos hebrasde DNA, que se ilustra en la Figura Surco
menor
18.4b.Estediagramamuestraque,a medidaque nos des-
plazamosa lo largo de una de las hebrasen una dirección
dada,los nucleótidossucesivos estánunidospor enlacesfos-
fodiésterque unen el carbono5' de un nucleótidoal car-
bono 3' delsiguientenucleótido;deunacadenadeestetipo
sedicequetieneuna orientación5' -+ 3'. Perosi semueve
a lo largode la otra hebraen la mismadirección,el orden
delos enlaces exhibeuna orientación3' --.>5'. En otraspa-
labras,los enlaces fosfodiésterde lasdoshebrasseorientan
en direcciones opuestas.Lasdiferentes orientaciones de las (a) DNA B (b) DNA Z
dos hebrasson una característica que tieneimplicaciones
Figura18.5 Folmasaltelnativasde DNA. (a) En la forma B del
importantestanto parala replicacióncomo parala trans- DNA, el esqueletode azicar fosfato forma una doble hélice
cripcióndel DNA comoveremosen los Capítulos19y 2I. suavementedextrógira. (b) En el DNA Z, el esqueletoforma una
La hélicedextrógirade Watsony Crick es una versión héliceen zigzag,Ievógta.Seutiliza el color para destacarel
idealizadade Io que sedenominaB-DNA (Figura18.5a). esoueletodel DNA.
Perolasdobleshélicesde B-DNA queseforman de mane-
ra natural sonmoléculasflexiblesque a menudosedesvían
de esteideal,con formasy dimensiones exactas quedepen-
El DNApuedetransformarse
en formasrelajadas
den de Ia secuencia local de nucleótidos. Además,aunque
y superenfolladas
el B-DNA esindudablemente la forma principaldel DNA
en lascélulas,tambiénpuedenexistirotrasformas,quizás En muchassituaciones el DNA de doblehélicepuedegirar
dispuestas en pequeñossegmentos intercalados en molé- sobresí mismo paraformar DNA superenrollado.Aunque
culasmayoritariamente de B-DNA. De estasformasalter- ahorasesabequeesuna propiedaddel DNA extendidaam-
nativas,lasmásimportantessonA-DNA y Z-DNA. La for- pliamente,el superenrollamiento seidentificópor primera
ma A-DNA tiene una configuraciónen hélicedextrógira i"t el DNA de ciertosvirus pequeñosque contenían
queesmáscortay másgruesaquela formaB-DNA.La for- "n
moléculas de DNA circularque sedisponenen buclesce-
ma A-DNA sepuedecrearde maneraartificialdeshidra- rrados.Lasmoléculasde DNA circulartambiénsehan en-
tandoel B-DNA,perosedesconoce queexistaen condicio- contradoenbacterias, mitocondriasy cloroplastos. Aunque
nescelularesnormales.Como muestrala Figura 18.5bIa el superenrollamientono estárestringidoal DNA circular,
formaZ del DNA esuna doblehélicelevógira.Sunombre esmuchomásfácilde estudiaren estasmoléculas.
derivadel patrónen zig-zagquesiguesu esqueleto de azú- Una moléculade DNA puedeir haciaatráso haciade-
car fosfato,y es más largay delgadaque Ia forma B del lanteentreel estadode superenrollamiento y el estadode
DNA. La forma Z del DNA surgecon mayor facilidad en no superenrollamiento, o estadorelajado.Paraentender
aquellasregionesdel DNA quecontieneno bien purinasal- estaidea básica,podría desarrollarel siguienteejercicio.
ternandocon pirimidinaso bien citosinasmetiladas(si- Empiececonun trozode cuerdaqueconsistaen doshebras
tuaciónqueseproduceen el DNA cromosómico; yéaseCa- quegirenjuntasformandouna hélicedextrógira;ésteesel
pítulo 23). equivalentea una moléculade DNA linealrelajada.Unir los
Aunquela significaciónbiológicadelaformaZdel DNA extremosde la cuerdano cambianada;la cuerdaahoraes
no se conocecon exactitud,algunasevidenciassugieren circularperotodavíaestáen el estadorelajado.Perosi an-
que pequeñostramosdel DNA pasande maneratransito- tesde sellarlos extremos,sele da a la cuerdauna l'uelta ex-
ría ala configuraciónZ como partedel procesomediante tra en Ia direcciónen la cuallashebrasestánentrelazadas,
el cual seactivala expresiónde ciertosgenes. la cuerdaentraen un superenrollamiento positivo.Encam-

Laestructura
delDNA 567
bio, si antes de sellar los extremos,a la cuerda se le da una
vuelta extra en la dirección opuesta,la cuerda entra en un
superenrollamiento negativo.De manera similar, una mo-
lécula de DNA relajadase puede convertir en una molécu-
la de DNA con un superenrollamiento positivo girándola
en la misma dirección en la que estáenrollada y en una mo-
lécula de DNA con un superenrollamiento negativo girán-
dola en la dirección opuesta (Figura 18.6a).Las moléculas
de DNA circular que se encuentran en la naturaleza, in-
Superenrollamiento DNA relalado Superenrollamiento
negativo posrtrvo
(a)
Figura18.6 Convetsión de DNArelajadoy supetenrollado.
(a) Diagrama de una molécula de DNA circular relajado y su
conversiónhacia formas superenrolladaspor el giro en la misma
dirección en la que la doble hélice estáenrollada
(superenrollamiento positivo). (b) Micrograffas electrónicasde
moléculas de DNA circular de un bacteriófagodenominado PM2,
con una molécula relajadaa la izquierda, y una molécula con
superenrollamiento negativo a la derecha(METs).
s68 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celular:
DNA,cromosomas
cluyendo el de bacterias,virus y orgánulos eucariotas están
de manera invariable superenrrolladasnegativamente.(La
Figura i8.6b muestra una molécula de DNA circular de un
fago relajada y una molécula similar con superenrolla-
miento negativo.)
El superenrollamiento se produce también en molécu-
las de DNA lineal, cuando las regiones de la molécula están
ancladasa alguna estructura celular de manera que no pue-
da rotar libremente. En un momento dado, porciones sig-
nificativas del DNA lineal del núcleo de las células eucario-
tas pueden estar superenrolladas, y cuando el DNA se
empaqueta en los cromosomas en el momento de la divi-
sión celular,el superenrollamientomasivo ayuda a hacer al
DNA más compacto.
El superenrollamientoinfluye tanto en la organización
espacialcomo en el estadode energíadel DNA y afectaa la
capacidadde una molécula de DNA para interactuar con
otras moléculas.El superenrollamientopositivo implica un
enrollamiento muy apretado de la doble hélicey por tanto
sereducenlas oportunidadespara interaccionar.Por el con-
trario, el superenrollamiento negativo estáasociadocon el
desenrollamientode la doble hélice,que aumenta el acceso
de sushebras a las proteínasimplicadas en Ia replicación o
en la transcripción del DNA.
La interconversión entre la forma relajada y Ia forma
superenrolladadel DNA estácatalizadapor enzimasdeno-
minadas topoisomerasas, que seclasifican en tipo I o en tipo
/L Ambos tipos catalizanla relajación del DNA superenro-
llado, pero las enzimas de tipo I Io hacen introduciendo
cortestransitorios en una sola hebra del DNA mientras que
las enzimasde tipo II introducen rupturas transitoriasen la
doble hebra de DNA. En la Figura 18.7 se ilustra Ia forma
en la que estos cortes temporales afectan al superenrolla-
miento del DNA. Las topoisomerasasde tipo I inducen Ia
relajación cortando una hebra de la doble hélice, permi-
tiéndole al DNA rotar y a la hebra no cortada pasara través
del agujero antesde que la hebra rota sevuelva a sellar.Por
el contrario, las topoisomerasasde tipo II inducen la rela-
jación cortando las dos hebras de DNA y pasando un seg-
mento de Ia doble hélice no cortada a través de la ruptura
antesde que seasellada.A diferenciade la reacciónde la en-
zima tipo I, la acción de las topoisomerasasde tipo II re-
quiere energía derivada de la hidrólisis de AIP.
Las topoisomerasasde tipo I y de tipo II seutilizan para
eliminar superenrollamientosdel DNA. Además, los pro-
cariotas tienen una topoisomerasade tipo II denominada
DNA girasa que puede inducir tanto la relajación como el
superenrollamiento del DNA. Como aprenderemosen el
Capítulo 19, la DNA girasaes una de las enzimas implica-
das en la replicación del DNA. Puede relajar el superenro-
llamiento positivo que resulta del desenrollamiento parcial
de una doble hélice, o puede introducir activamentevuel-
tas negativasque promuevan la separación de las hebras,fa-
cilitando ademásel accesoa otras proteínasimplicadas en
la replicación del DNA. La DNA girasa requiere AIP para
y el núcleo
 ffi
K
v
Corteen una solahebra
..........................................*
Se sueldael corte

5ffi
ÓW
El DNA rotay la
hebra intactapasa
a travésdel orificio
K \ \A¡ijs
\\/
^
DNA

TopoÍsomerasall
La doblehéliceintacta
pasaa travésdel orificio
que posteriormentese sel{a
\
,rv

d o b l eh e b r a

Figura18.7 Reacciones catalizadaspor la topoisomerasa I y ll, (Arriba) La topoisomerasaI elimina los superenrollamientos porque rompe
d e m a n e r a t r a n s i t o r i a u n a h e b r a d e l a d o b l e h é l i c e d e D N A v p a s a l a h e b r a n o c o r t a d a a t r a \ ¡ é s d e l a r( uApbtaujroa).L a t o p o i s o m e r a s a l l
elimina superenrollamientos porque corta de maneratransitorialas dos hebrasde la doble hélicede DNA y pasauna región no cortadade la
doble hélicede DNA a travésdel orificio. La DNA girasaesuna topoisomerasaII que utiliza estemecanismopara eliminar
superenrollamientos positivosy para introducir superenrollamientos negativos.

generar el superenrollamiento, pero no para relajar una
molécula ya suDerenrollada.
LasdoshebrasdeunadoblehélicedeDNAse pueden
pordesnaturalización
separar y volvera unirsepol
renaturalización
Debidoa quelasdoshebrasdela doblehélicedeDNA se
mantienen unidas por enlacesno covalentesrelativamente
débiles,las dos hebraspueden separarsecon facilidad bajo
condicionesadecuadas.Como veremosen los próximos ca-
pítulos,la separaciónde las hebrasesparte integral tanto de
la replicación del DNA como de la síntesisde RNA. La se-
paración de las hebrastambién se puede inducir de mane-
ra experimental teniendo como resultado la desnaturali-
zación del DNA; el proceso inverso, que restableceuna
doble hélice a partir de hebras separadasde DNA, se deno-
mina renaturalización del DNA.
Una forma de desnaturalizarDNA en el laboratorio es
aumentando la temperatura. Si esto se hace lentamente,el
DNA retiene su estadode doble hebra, o nativo, hasta que
se alcanzauna temperatura crítica, en esepunto la doble he-
bra se desnatsralizarápidamente, o se <funde), en sus he-
bras componentes.El procesode fusión esfácil de monito-
rizar debido a que el DNA de doble cadenay el DNA de ca-
dena sencilla difieren en sus propiedadesde absorción de
Iuz. Todo el DNA absorbela luz ultravioleta, con un máxi-
mo de absorción de alrededor de 260 nm. Cuando la tem-
peratura de una solución de DNA se aumenta lentamente,
Ia absorbancíaa260nm semantiene constantehastacue la
doble hélicecomienza a fundirse en sushebrascomponen-
tes.A medida que las hebras se separan,la absorbanciade
Ia solución aumenta rápidamente debido a la elevadaab-
sorción intrínsecadel DNA de cadenasencilla(Figura 18.8).
Se denomina temperatura de fusión del DNA (T^) la
temperatura a la cual se alcanzala mitad del cambio de ab-
sorbancia. El valor de la temperatura de fusión refleja Ia
fuerzacon la que semantiene unida la doble hélicede DNA.
Por ejemplo, lapareja de basesGC, que se mantienen uni-
das por tres puentesde hidrógeno, son más resistentesa la
separaciónque la pareja de basesAT, que sólo tienen dos
puentesde hidrógeno (véaseFigura18.4b).Además,latem-
peratura de fusión aumenta en proporción directa al nú-
mero relativo de paresde basesGC en el DNA (Figura 18.9).
Asimismo, las moléculas de DNA en las que las dos hebras
estánemparejadascorrectamenteen cada posición se fun-
dirán a temperaturasmás elevadasque el DNA en el que las
dos hebras no seanperfectamentecomplementarias.

Laestructura
delDNA 569
 Cadenas
de DNA Enfriarhasta20'C
E
c
(o Actode nucleación
14
o cremallera)
E .F
c
ñ 1A
@ O
N
(É O I,J

.F (Ú
C DNA renatu-
6.^ € .t .. DNA vado
ó
4) |,1
a nattvo
-o
'ó < 1.1
c
(g
_o
o
a
_o
40 5 0 6 0 7 0 B 0 9 0 1 0 0 0 30 60
1n Temperatura ('C) Tiempo(minutos)

Figura18.10 Desnaturalización y renaturalización

del DNA, Si una
70 B0 90 100 soluciónde DNA nativo (de dobie cadena)secalientalentamente
('C)
Temperatura bajo condicionescont¡oladascuidadosamente, el DNA <sefunde>
en un estrechorango de temperaturas,con un aumentode la
Figura18.8 Peúil de desnaturalización témica del DNA. A medida absorbanciaa260 nm. Cuando sedeja enfriar la solución,las
que la temperaturade una soluciónde DNA de doble cadena hebrasde DNA separadas sereasociansiguiendouna cinéticaque
(nativo) seaumenta,sealcanzaun punto en el cual la energíadel dependede la concentracióninicial. Lascadenascomplementarias
calor causaque el DNA sedesnaturalicerápidamente.La colisionanaleatoriamemente en el acto de nucleaciónque es
conversiónen cadenassencillasva acompañadade un aumento seguidopor un rápido <cierreen cremallera,de las parejasde
característicode la absorbanciade la I,¡z a 260 nm. La temperatura nucleótidosadyacentes. La reasociaciónrequierecantidades
a Ia cual seproduceel punto medio de esteaumento sedenomina variabiesde tiempo que dependende la concentraciónde DNA en
temperaturade fusión T^.Para la muestrarepresentada, ei valor de la solucióny de la longitud de las cadenasde DNA.
T, esde aproximadamente87'C

tos para identificar ácidos nucleicos, basada en la capacidad

El DNA desnaturalizadose puede renaturalizardis-
de las cadenas sencillas de unirse, o hibridar, con secuencias
minuyendola temperaturapara permitir el restableci-
de basescomplementarias.La hibridación de los ácidosnu-
mientodelospuentesdehidrógenoentrelasdoshebras(Fi-
gura 18.10).La capacidadde renatunalizar los ácidos cleicos se puede aplicar a interaccionesentre DNA-DNA,
DNA-RNA e incluso RNA-RNA. Por ejemplo, en la hibrida-
nucleicostieneuna granvariedadde aplicaciones científi-
ción DNA-DNA, el DNA que se examina se desnaturalizay
cas.Lo queesmásimportante,formala basedeIa hibrida-
se incuba con un fragmento radiactivo de DNA de cadena
ción de los ácidosnucleicos,una familiade procedimien-
sencilla, denominado sonda, cuya secuenciaes comple-
mentaria a la secuenciade basesque se trata de detectar.
E Las secuenciasde ácido nucleico no necesitanser per-
100
z fectamente complementarias para poder hibridar. Cam-
o
M. phlei biando la temperatura,la concentraciónde salesy el pH uti-
ñ 80
(Ú lizado durante la hibridación se permite que tenga lugar el
Serratia
.C
@ emparejamientoentre secuenciasque presentannumerosas
o
O 60 E. coli basesmal emparejadas.En estascondiciones,esposible de-
+ tectar secuenciasde DNA relacionadas entre sí pero no
(d Neumococo Timode
'-c idénticas.Este abordaje es útil para identificar familias de
Cü
40 ternera
l Levaoura genesrelacionadosen un tipo de organismo dado y entre di-
O)
Esperma
c ferentestipos de organismos.
c) 20 de salmón
o
p
C
BacteriófagoT4
E 0L La organizacíón del DNA
O 60 B0 90 100
en genomas
Figura18.9 Latemperaturade fusióndependede la composición de Hasta ahora, hemos considerado varias propiedades del
basesdel DNA, La temperatura de fusión del DNA aumenta
DNA, tanto físicascomo químicas.Pero,como biólogos ce-
linealmente con su contenido de G * C, como seilustra por la
relación entre 7- y el contenido de G + C para muestrasde DNA lulares,estamosinteresadosde forma prioritaria en su im-
de varios orqanismos. portancia para la célula. Además, queremos saber cuánto

570 18 Baseestructural
Gapitulo de la información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
a-

DNA tienenlascélulas,cómo y dóndesealmacena,y cómo

utilizan la información genéticaque contienen.Empezare- o
'Eo
mos por preguntarnospor la cantidadde DNA presente,ya 1 0 0G b
que estodeterminarála máxima cantidadde información c

que una célulapuedeposeer. E

o 1 0G b
c
El genomade un organismoo de un virus comprende o
o)
el DNA (o para algunosvirus, RNA) que contieneuna co- o '1
o Gb
pia completade toda la información genéticade eseorga- a
c)
a
nismo o virus. Paramuchosvirus y procariotas,el genoma -o
resideen una únicamoléculao en númeropequeñode mo- !
0) 100tvtb
léculasde DNA lineal o circular.Lascélulaseucariotastie- a
o

nen un genomanuclear,un genomamitocondrial y en el o

1 0M b
c)
casode plantasy algas,también un genomacloroplástico. !
I
Losgenomasde mitocondriasy cloroplastossonmoléculas o
E lMb
sencillasde DNA, normalmentecircular,que separecena .l
g
los de las bacterias.El genomanucleargeneralmentecon- (s
E
sisteen multiplesmoléculasde DNA dispersasen un juego c 1 0 0K b
a)
haploidede cromosomas.(Como estudiaremoscon mayor o)
a)
detalleen el Capítulo20,un juegohaploidede cromosomas !
o
¡c 1 0K b
consisteen un representante de cadatipo de cromosomas, (Ú
E
mientras que un juego diploid¿consisteen dos copiasde .(Ú
cadatipo de cromosoma,una copiade la madrey otra del 1Kb
padre.Cadaespermatozoide y cadaóvulo tienen un juego Fgura 18.11 Relaciónentre el tamaño del genomay el tipo de
haploidede cromosomas, mientrasque la mayoríade los otganismo. Para cadagrupo de los organismosque se muestran, la
otrostiposde célulaseucariotas sondiploides.) barra representael rango aproximado del tamaño del genoma,
medido como el número de paresde nucleótidos por genoma
haploide.Seusael mismo color (morado) para los grupos que
aumentacon la
Eltamañodelgenomanormalmente incluyen miembros del reino animal.
del organismo
comple¡¡dad
El tamañodel genomanormalmentese expresacomo el las célulaseucariotastienen bastantecantidadde DNA (al
número total de basesnucleotídicas emparejadas o pares menosen teoría)como para codificarcientosde milesde
de bases (pb). Por ejemplo,
la molécula de DNA circular proteínas.Peroun examenmásexhaustivode los datosre-
que constituye el genoma de una célula de E. coli tiene velacaracterísticas sorprendentes. La másnotablede ellas,
4.639.22Ipb. Puestoqueestosnúmerostiendena serbas- es que el tamaño del genomade los eucariotaspresenta
tante largos,lasabreviaturas Kb (Kilobases), Mb (Mega- grandesvariacionesque no secorrelacionan con ninguna
bases)y Gb (Gigabases)seutilizan para referirsea miles, diferenciaconocidaen cuantoa la complejidaddel orga-
milloneso billonesde paresde bases,respectivamente. De nismo. Por ejemplo,algunosanfibiosy plantas,tienen ge-
estamanera,el tamañodel genomade E. colisepuedeex- nomasgigantescos quesondecenaso inclusocientosdeve-
presarsimplementecomo4,6Mb. En la Figura18.I I sere- cesmayoresquelos de otrasespecies demamíferos,anfibios
sumeel rangode tamañosde genomasobservados en va- o plantas.
rios gruposde organismos.Estosdatosrevelanla existencia Por ejemplo,Trillium,esun miembrodela familia delos
de una gamade casiocho órdenesde magnituden el ta- lirios que no tiene necesidades evidentescomo para pre-
mañodel genoma,queva desdeunospocosmilesdepares sentarcantidadesexcepcionales de información genética.
de basesparael virus mássimplea másde cienbillonesde Sin embargo, el tamaño de su genoma esmásde 20 vecesel
paresde basesparaciertasplantasy anfibios.En términos de la planta del guisantey 30 veces el de los humanos.Ade-
de longitudtotal de DNA, estocorresponde a un rangode más,una ameba con una única célula tiene un genomaque
menosde 2 ¡tmde DNA para un virus pequeño,como el tiene200vecesel tamaño del genoma humano. No tenemos
SV40,a aproximadamente 34 metrosde DNA (¡másde 30 ni ideade por qué lasplantas de la familia de los lirios y las
metros!)paraciertasplantas,tal comoIa flor silvestreTri- amebasposeentanto DNA. Supresenciadestacael hechode
llium. quela mayoríade los genomaseucarióticosportan grandes
Hablandoen términosgenerales, el tamañodel genoma cantidadesde DNA de función desconocida. un fenómeno
aumentacon la complejidaddel organismo.Losvirus con- sobreel quetrataremosen breve.Como análisisfi.nal,el ta-
tienen suficientesácidosnucleicoscomo para codificarso- maño del genomaes menosimportante que el número e
lamenteunaspocaso unaspocasdocenasde proteínas, las identidad de los genesfuncionalesy de las secuenciasde
bacteriaspuedencodificarunospocosmilesde proteínasy DNA que controlansu expresión.

delDNAengenomas 577
Laorgnización
Lasenzimasde restdccióncortanlas moléculasde DNA Separación de losfiagmentos de restlicciónmediante electrofo
por sitios específicos tesisen gel. Incubar una muestrade DNA con una enzi-
ma de restricciónespecífica produceuna colecciónde frag-
Puestoque las similitudesy diferenciasheredablesque se
mentos de restricción de tamaños diferentes. Para
observanentre los organismosderivan de su DNA, pode-
determinar el número y longitudesde talesfragmentosy
mos esperarque el estudiode lasmoléculasde DNA pro-
paraaislarfragmentosindividualesparaestudiosposterio-
duzcaimportantesavances biológicos.Laspistasparamul-
res,debemosser capaces de separarunos fragmentosde
titud de misterios--desde el control de la expresióngénica
otros. La técnica de elecciónpara estepropósito esla elec-
en la célulahastala evoluciónde nuevasespecies- debe-
troforesis en gel, esencialmente el mismo método ',fiiliza-
rían encontrarseenla secuencia denucleótidosdel DNA ge-
do paraseparar proteínas y polipéptidos(véaseFigwa7.22).
nómico.Sin embargo,lamayoría de lasmoléculasde DNA
sondemasiado grandesparaserestudiadas intactas.De he- De hecho,el procedimientopara el DNA es incluso más
cho,hastaprincipiosdelos años70,el DNA erala molécu- simple que para proteínas,debido a que las moléculasde
la biológica más difícil de analizarbioquímicamente.El DNA tienen una carganegativainherente(debido a sus
DNA eucarióticoparecíaserespecialmente intimidatorio, grupos fosfato) y por tanto no necesitasertratadacon un
dado el tamañode la mayoríade los genomaseucarióticos, detergente cargado negativamentepara hacerque semue-
y no seconocíaningún métodoparacortarel DNA en si- van hacia el ánodo. Los pequeños fragmentos deDNA, nor-
tios específicosparaobtenerfragmentosreproducibles. La malmente se separan en geles de poliacrilamida, mienftas
posibilidadde seralgunavez,capazde identificar,aislar,se- que los fragmentos más grandes seseparan en geles máspo-
cuenciaro manipulargeneseucarióticos específicos,pare- rosos hechos del polisacárido agarosa.
cía improbable.Sin embargo,en menosde una década,el La Figura18.12ilustrala separación de fragmentosde
DNA seha convertidoen una de las moléculasbiológicas restricción de diferentes tamaños por electroforesis en gel.
con las que esmássencillotrabajar. Las muestras de DNA se incuban primero con la enzima de
Estegranpasoadelanteseha hechoposiblepor el des- restriccióndeseada; en la figura se utilizan tres enzimas de
cubrimiento de las enzimasde restricción, que son enzi- restriccióndiferentes. Lasmuestrassecolocanentoncesen
mas,aisladas a partir debacterias,quecortanlasmoléculas un extremodel gel en compartimentosseparados (upoci-
de DNA extrañoen sitiosespecíficos. (El Anexo 18Bdes- llos>).Posteriormente, y con el ánodosituadoen el extre-
cribe el papelbiológico de las enzimasde restriccióny al- mo opuestoa dondeseencuentranlasmuestras, sele apli-
gunosdetallesacercadelos sitiosenlos quecortan;aqulnos ca al gel un potencialeléctrico.Debido ala carganegativa
centraremos en su uso comoherramientas analíticas.) de susgruposfosfatos,losfragmentosdeDNA migraránha-
La acciónde corte de una enzimade restriccióngenera ciael ánodo.Losfragmentosmáspequeños(esdeci¡ aqué-
un grupo específico de fragmentosde DNA denominados llos con el pesomolecularmásbajo) semoveránen el gel
fragmentosde restricciónCadaenzimade restricciónrom- con relativa facilidady por tanto migrarán rápidamente,
pe DNA de doblecadenasóloen aquelloslugaresdondeen- mientrasquelos fragmentosmásgrandessemoveránmás
cuentrauna secuencia específica a la que reconoce,deno- lentamente.La corrientese mantienehastaque los frag-
minada sitio de restricción, que tiene normalmenteentre mentosesténbien separados en el gel.EI resultadofinal son
cuatro y seisnucleótidosde longitud (aunquepuedenser una seriede fragmentosde DNA que sehan separadoba-
ochoo más).Porejemplo,ésteesel sitio de restricciónque sándose en diferencias de tamaño.
reconocela enzimade restricciónde E. coll,denominada Losfragmentosde DNA en el gelsevisualizano tiñen-
EcoRI,másampliamenteutilizada: do o utilizandoDNA marcadoradiactivamente. Una téc-
nica de tinción común implica empapar el gel en el colo-
5'G'A A T-T-c 3' rantebromurodeetidio, que seune al DNA y fluoresce en
3, C-T-T-A-A-G 5' naranjacuandoseexponealal:uzultravioleta.Si los frag-
mentosde DNA son radiactivos,su localizaciónsepuede
Lasflechasindican dóndecorta EcoRIal DNA. Estaen- determinarpor autorradiografta,una técnicaparadetec-
zimade restricción,como muchasotras,haceun corte es- tar moléculasradiactivasrevistiendola muestracon pelí-
calonadoen la doble hebrade la moléculade DNA. como culafotográfica.Cuandoserevelala película,produceun
sepuedever en la Figura188.lb (Anexo18B). autorradiogramaqve estámásoscuroallí dondela radiac-
La frecuenciacon la que los sitios de restricciónapare- tividad ha interaccionadocon la película.Despuésde lo-
cen en el DNA estal que una enzimade restriccióndada, calizarde estaforma los fragmentosindividualesde DNA,
romperáel DNA en fragmentosquevan,desdeunospocos sepuedenextraerdel gelparaserestudiados con posterio-
cientosde paresdebasesdelongitud, a unospocosmilesde ridad.
paresde bases.Los fragmentosde estostamañosson,con
mucho, más fácilesde manipular posteriormenteque las Mapade restricc¡ón.¿Cómodetermina el investigadorel
moléculasdeDNA, enormementelargas,a partir delascua- orden en el que un conjunto de fragmentosde restricción
lessehan generado. sedisponeen una moléculade DNA?Una aproximaciónal

572 18 Baseestructural
Capitulo dela información y el núcleo
DNA,cromosomas
celular:
-

ffifi Mezclade DNA

UU
de diferentes
Cátodo tamaños

-É: Fragmentosmás
largos

tt ttt l __-____>

iiü
Gel Fragmentosmás
cortos
Placas
de vidrio

Anodo Gel migrado

(a) (b) (c)

Fitwa L8.L2 Electrofolesisen gel del DNA, (a) Los tres tubos de ensayocontienen mezclasde fragmentos de DNA producidos por la
incubación de muestrasde DNA con diferentesenzimasde restricción. Parafraccionar una preparación de DNA que contiene fragmentos de
varios tamaños,sedepositauna pequeñamuestrade Ia preparaciónen la parte superiordel gel.Entonces,seaplicaun potencialeléctricode
varios cientos de voltios a través del gel, de forma que el ánodo (electrodo positivo) estáen la parte inferior del gel y el cátodo (electrodo
negativo)en la parte superior.(b) Los fragmentosde DNA de la muestradepositadamigran haciael ánodo,desplazándose más rápidamente
Ios fragmentoscortos que los largos.(c) Despuésde un tiempo suficientepara que seseparenlos fragmentos,seretira el gel y setiñe con un
colorante como el bromuro de etidio que se une a los fragmentos de DNA y les hace fluorescentesbajo la luz ultravioleta. Como alternativa,
puedeusarsela autorradiografiaparalocahzar las bandasde DNA en el gel si el DNA seha marcadoradiactivamente.

estudio implica tratar al DNA con dos o más enzimas de Existenprocedimientos

restricción, solaso combinadas,seguido de una electrofo-
resisen gel para determinar el tamaño de los fragmentosde
restricción resultantes.La Figura 18.13muestra cómo fun-
cionaría para una molécula sencillade DNA tratada con las
enzimasde restricción EcoRIyHaeIII. En esteejemplo,cada
enzima de restricción de forma individual corta el DNA en
dos fragmentos,indicando que el DNA sólo contiene un si-
tio de restricción para cada enzima. Basándonossolamen-
te en esta información, se pueden proponer dos posibles
mapas de restricción (véanselosmapasA y B en la parte de
abajo de Ia Figura 18.13).Para determinar cuál de los dos
mapas es el correcto se debe realizar un experimento en el
que la molécula de DNA de partida se debe cortar simultá-
neomente con EcoRI y HaeIIl. El tamaño de los fragmentos
producidos por la digestiónsimultáneacon las dos enzimas
revelaque el mapa A debe ser el correcto.
En la práctica, los mapas de restricción implican datos
que son considerablemente más complejos que en nuestro
sencillo ejemplo. En esassituaciones,losfragmentos de DNA
producidos por cadaenzima de restricciónpuedenseraisla-
dos ffsicamente-cortando el gel,por ejemplo, en porciones
y extrayendo el DNA de cada porción-. Los fragmentos
aisladosse cortan de manera individual con la segunda en-
zimade restricción, permitiendo así el análisispor separado
de los sitios de corte en cada fragmento. El Problema 18.4
aporta un ejemplo de cómo se emplea este abordaje para
construir un mapa de restricción, que representela locali-
zación de todos los sitios de restricción en el DNA original.
rápidosparasecuenciarDNA
Casial mismotiempoquesedesarrollaron lastécnicaspara
prepararfragmentosderestricciónseidearondosmétodos
parasecuenciarDNA rápidamente-es decir,paradeter-
minar el ordenlinealde lasbasesen el DNA-. Uno de los
métodosfue concebidopor Allan Maxany Walter Gilbert,
y el otro por FrederickSangery colaboradores. El método
de Maxam-Gilbert,denominadoel métodoquímico,estaba
basadoen el uso de compuestos químicos(no proteicos)
que cortan el DNA de manerapreferenteen basesespecífi-
cas,mientrasque el procedimientode Sanger,denominado
el métodode terminacióndecadena,utiliza dideoxinucleóti-
dos(nucleótidos a losquelesfaltaun grupohidroxiloen 3')
que interfierencon la síntesisenzimáticanormaldel DNA.
Nos centraremosen el métodode Sangerdebidoa queesel
métodoqueseha adaptadoparasu usoen máquinasauto-
máticasque seempleanactualmente en la mayoríade las
tareasde secuenciación de DNA.
En esteprocedimiento,seempleaun fragmentode DNA
de cadenasencillacomo molde para guiar la síntesisde
nuevashebrasdeDNA complementario. La síntesisde DNA
se realizaen presenciade deoxinucleótidos dATR dCTR
dTTP y dGTPque sonlos sustratosnormalesquepropor-
cionanlasbases A, C, T y G a lascadenasde DNA en creci-
miento.Tambiénseincluyen,aunqueen menor concentra-
ción, los cuatro dideoxinucleótidos marcadoscon un
colorante(ddlLIR ddCTR ddTTR ddcTP) a los quelesfal-
ta el grupo hidroxilo unido al carbono 3' de los deoxinu-

delDNAengenomas
Laorganización ),/ J
Anexo

Lns TNZIMAS DE RESTRICCIóN EN DETALLE

Lasenzimasde restricciónson un tipo de endonucleasa (una I
enzimaque corta internamenteel DNA) que seencuentranen ,,l-Gdddls, Haettt u,lcel fccl..
" l c c1e el u
muchasbacterias.Estasenzimasa¡rdan a lasbacteriasa a ' lC CI I G Gl s '
protegersecontrala invasiónpor moléculasde DNA extrañas,
particularmentepor el DNA de bacteriófagos. De hecho,el
nombre de enzimade <restricción>procededel descubrimiento eol s' -
ol-óccre-e smat vlErc I lEee l"
de que estasenzimasrestringenlacapacidaddel DNA foráneo s ' lG G G C C1C5 ' g ' I G G IGI C C Cl s '
para apoderarsede la maquinariade transcripcióny de t
traducciónde la célulabacteriana. porenzimasque producenextremos
(a) Digestión romos
Paraprotegersu propio DNA de serdegradado,la célula
bacterianatiene enzimasque añadegruposmetilo (-CH3) a
nucleótidosespecíficos que de otra forma, seríanreconocidos I
por suspropiasenzimasde restricción.Una vezmetilados,los s.lonRrró].' EcoRl u,[ol lnF1rTls.
nucleótidosya no son reconocidospor lasenzimasde .,lcrrnnelu' s'lCrrAA
I lels'
restricción,de maneraque el DNA bacterianono esatacadopor t
suspropiasenzimasde restricción.Sedice de lasenzimasde
restricciónque forman parte del sistemade 3. Nor| u.[ecl lerc¡ccclg,
metilación/restricción de la célula: el DNA efiraño serompe s' o ' I C G C C GI G I C Gl s '
por la acciónde las enzimasde restricción,mientrasque el
genomabacterianopreviamenteseprotegepor metilación.
Lasenzimasde restricciónrecibensu nombre a partir de la porenzimasque producenextremos
(b) Digestión cohesivos
bacteriade la que seobtienen.Cadanombre enzimáticoderiva FigwatSB.L Digestión delDNAporlasenz¡mas de restricción. (a)
de la combinaciónde la primera letra del génerode la bacteria Haellly Srn¿Isonejemplosde enzimasde restricciónquecortan
con lasdos primerasletrasde la especiebacteriana.La cepade la lasdoshebrasdelDNA en el mismositio,generando fragmentos
bacteriatambiénsepuedeinücar, y si sehan aisladodos o más con extremosromos.(b) EcoRIy No/I sonejemplosde enzimasque
enzimasapartír de la misma especie,las enzimassenumeran cortanel DNA de maneraescalonada, generando fragmentoscon
(usandonúmerosromanos)por orden de descubrimiento. Un <ingeniero>
extremoscohesivos. genéticopuedeutilizarestos
Además,Ia primera enzimade restricciónaisladaa partir de la extremospegajososparaunir fragmentosde DNA de orlgenes
cepaR de E. colisedesignacomo EcoRI,mientrasque Ia terce.ra diferentescomoexplicaremos en el Capltulo20.
enzimaaisladaa partir de Hemophilusaegyptiussedenomina
HaeIIl.
Lasenzimasde restricciónson específicas del DNA de escalonadasiempredejan extremospegajosos(también
doble cadenay digierenlas dos cadenas.Cadaenzimade llamadosextremoscohesiuos). Estostérminos derivandel hecho
restricciónreconoceuna secuenciaespecíficade DNA que de que la cola de cadenasencilladel extremode cadauno de
normalmentetiene una longitud de cuatro o seis(pero puede esosfragmentospuedeemparejarsusbasescon cualquier
ser ocho o más) paresde nucleótidos.Por ejemplo,la enzima extremode cualquierotro fragmentogeneradopor la misma
HaelIl reconoceIa secuenciade tetranucleótidosGGCC y enzíma,causandoque los fragmentossepeguenunos a otros
rompe la doble hélicede DNA como semuestraen la Figura por puentesde hidrógeno.Lasenzimasque generantales
18B.la.Los sitios de restricciónde otras enzimasde restricción fragmentosson particularmenteprácticasya que sepueden
seresumenen Ia Tabla188.1.Algunasenzimasde restricción emplearde maneraexperimentalpara crearmoléculasde DNA
como HaelIl, cortan las dos hebrasen el mismo punto, recombinante,como veremosen el Capítulo 20.
generandofragmentosde restricciónde extremosromos.Otras Los sitiosde restricciónparala mayoríade lasenzimasde
enzimasde restriccióndigierenlas dos hebrasde manera restricciónsonpalíndromos,lo que significaque la secuenciase
escalonada, generandocolascortasde cadenasencillao leeigual en cualquierdirección.(La palabrainglesaradaresun
salientes,en ambosextremos.EcoRIesun ejemplode estetipo palíndromo,por ejemplo.)La naturalezapalindrómicade un
de enzimas;reconocela secuenciaGAAITC y corta la molécula sitio de restricciónsedebea su doble simetríade rotación,lo
de DNA de maneracompensada,dejandouna colaAATT en que significaque rotando la secuenciade doble cadena180"en
ambosfragmentos(Figural88.1b).Losfragmentosde el plano del papel,seproduceuna secuenciaque selee igual que
restriccióngeneradospor enzimascon estepatrón de ruptura antesde Ia rotación.Los sitiosde restricciónpalindrómicos

cleótidosnormales.Cuando un dideoxinucleótidose in- tesdetiempodebidoa la ausenciadel grupo hidroxilo en 3',

corporaa una cadenade DNA en crecimiento,en lugar de que haceimposiblela formación del enlacecon el siguien-
de DNA sedetienean-
un deoxinucleótidonormal,la síntesis te nucleótido.De estaforma, seproducirán seriesde frag-

574 18 Baseestructural
Gapítulo de la información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
 Tabla188,1 Enzimas de usocomúny secuencias
de restricción quereconocen

Enzima Organismo
deorigen Secuencia
de reconocimiento*
ü
'4val Anabenavariabilis 5' C-Pi-C-G-Pu-G 3'
3' C-Pu-C-C-Pi-C 5'
1
J
BamHl Bacillusamylolíquefaciens 5,G-G-A-T-C-C3'
3' C-C-T-A-G-G 5'
t
J
EcoRI Escherichia
coli 5' CrA-A-T-T-C 3'
3' C-T-T-A-A-G 5'
t

Haelll Hemophilusaegyptius 5'c-éc-c3'

3,C-C-G-G 5'
f
ü
Hindlll Hemophilusinfluenzae 5,A-A-G-C-T-T 3'
3'T-T-C-G-A-A s',
I
J
Psd Prot i denciastuartii | 64 5, C-T-G-C-A-G 3'
3',G-A-C-G-T-C s',
t
J
Pvul Proteusvulgaris s'G--4-A-T-C-G 3',
3,(H-T-A-G-C5'
t
J
Pvull Proteustulgaris 5'c-A-G.{-T-C3',
3' G-T-C-G-A-C 5'
I
J
Sall Streptomyces
albusG 5' C-T-C-G-A-C 3'
3'C-A-G-C-T-G 5'
I
* Lasflechasen los sitiosde reconocimiento,indican los puntos €n los que lasenzimasde restriccióndigierenlas
dos hebrasde la moléculade DNA. Pi : Pirimidina (C o T), Pu : Pu¡ira (G o A).

tienenIa misma secuenciade basesen lasdos hebrascuandose
lee cadahebraen dirección5' --->3' .
La frecuenciacon Ia que un sitio de restricciónen
particular,apareceen una moléculade DNA, sepuedepredecir
de maneraestadística. Por ejemplo,en una moléculade DNA
que contienecantidadesigualesde las cuatro bases(A, T, G y
C) podemospredecirque,aproximadamente, seproduceun
sitio de reconocimientocon cuatro paresde nucleótidoscada
256 (esdecir,4a),mientrasqueIa frecuenciaprobableparaun
sitio de seisnucleótidosesuna de cada4.096naresde
nucleótidos(esdecir,46).Además,lasenzimaide restricción
tienden a digerir el DNA en segmentosque normalmente
varíanen longitud de varios cientosa variosmiles de paresde
nucleótidos,esencialmente segmentos del tamañode genes.
Estossegmentossedenominanfragffientosde restricciónPuesto
que cadaenzimade restricciónrompeen una secuencia de
nucleótidosinicay específica,siemprecortaríLuna molécula
dadade DNA de una manerapredecible, generandoun
conjunto de fragmentosde restricciónreproducibles.Esta
propiedadhacede las enzimasde restricciónherramientasmuy
poderosas paragenerarpiezasde DNA de tamañosmanejables
parasu posteriorestudio.

mentosde DNA incompletoscuyostamañosproporciona- La Figura18.14ilustracómo funcionaesteprocedi-

rán informaciónrelativaa la secuencia
lineal delasbasesen miento.En el paso@, sepreparauna mezclade reacción
CIDNA. que incluyelos dideoxinucleótidosddlffR ddCTR ddTTP

delDNAengenomas 575
Laorganización
 DNA sin Eco Rl Haelll EcoRl+ Haelll
cortar Tamañode los
c .\
fragmentos(Kb)
7,0
qq
4,5
3,0
tq
t,c
o que los fragmentos más cortos migrarán en el gel más rá-
Mapas de restricción posibles
EcoRl
0 2 , 5K b 5 , 5K b 7 , 0K b
FcoRl Hael I
MapaB
tt
o 4 , 5 K b 5 , 5K b 7 , 0K b
Figura18.13 Mapasde restricción. En esteejemplohipotético,se
determinala localizaciónde los sitiosde restricciónde EcoRIy
HaeIll en un fragmentode DNA de 7,0 Kb de longitud. EI
tratamientode EcoRIcorta el DNA en dos fragmentosque miden
2,5 Kb y 4,5 Kb lo que indica que seha cortadoel DNA en un solo
punto localizadoa 2,5 Kb de uno de los extremos.El tratamiento
con HaelII corta el DNA en dos fragmentos que miden 1,5 Kb y
5,5 Kb lo que indica que seha cortadoel DNA en un solo punto
Iocalizadoa 1,5Kb de uno de los extremos.Sepuedenproponer
dos mapasde restricciónposiblesbasándosesólo en esta
información. Si el mapa A fuesecorrecto,la digestiónsimultánea
del DNA con EcoRIy HaeIII deberíadar tres fragmentos de 3,0 Kb,
2,5 Kb y 1,5Kb. Si el mapa B fuesecorrecto,la digestiónsimultánea
del DNA con EcoRIy HaeIII deberíagenerar tres fragmentos de
4,5 Kb, 1,5Kb y 1,0Kb. Los datosexperimentales revelanque el
mapa A debeserel correcto.
y ddGTR cada uno marcado con un marcador fluorescen-
te de distinto color. Ej., ddATP : rojo, ddCTP : azttl,
ddTTP : naranja y ddGTP : verde.Estosdideoxinucleó-
tidos coloreadosse mezclan con los deoxinucleótidos,sus-
tratos naturalespara la síntesisde DNA y a la molécula de
DNA de cadenasencillaque seva a secuenciary junto a un
cebador(primer) corto de DNA de cadenasencillacomple-
mentario al extremo 3' de la hebra de DNA que se va a se-
cuenciar.Cuando se añadela DNA polimerasa,éstacatali-
za la unión de los nucleótidos,uno a uno, al extremo 3' del
cebador,produciendo una hebra de DNA en crecimiento
complementaria al molde de DNA cuya secuenciase está
determinando. La mayoría de los nucleótidos que se inser-
tan son deoxinucleótidos normales debido a que son los
sustratospreferidos por la DNA polimerasa.Sin embargo,
s76 18 Baseestructural
Capítulo dela información y el núcleo
DNA,cromosomas
celular:
frecuentemente y al azar,un dideoxinucleótido coloreado se
inserta en vez de su equivalente normal. Cadavez que sein-
corpora un dideoxinucleótido sedetienela síntesisde DNA
para esa hebra en particular. Por lo tanto, se genera una
mezcla de hebras de longitudes variadas. Cada una de las
hebras,contieneuna basecoloreadaen el extremo donde se
ha detenido la síntesisantesde tiempo como consecuencia
de la incorporación de un dideoxinucleótido (paso @).
Posteriormente,la muestra sesometea electroforesisen
un gel de poliacrilamida, que permitirá que los fragmentos
de DNA recién sintetizadosse separen unos de otros, ya
pidamente que los fragmentos más largos (paso @ ). A me-
dida que se desplazanen el gel, una cámara especialdetec-
ta los colores de los diferentes fragmentos según van
pasando.El paso @ muestra cómo esainformación permi-
te determinar la secuenciade basesdel DNA. En esteejem-
plo en particular, el fragmento de DNA más corto es azul y
el siguiente fragmento más corto es verde. Como el azul
y el verde son los colores de ddCTP y de ddGTP, respecti-
vamente,las dos primeras basesañadidasal cebadordeben
haber sido C seguidade G. En los secuenciadoresautomá-
ticos,esainformación serecogepara cientosde basesen fila
y si se introduce en un ordenador permite determinar rá-
pidamente la secuenciacompleta del fragmento de DNA
inicial.
losgenomas
denumerosos
Sehansecuenciado
ofganismos
El significado de la técnica que acabamosde describir ape-
nas se puede estimar.Ahora, la secuenciaciónde DNA es
algo frecuentey automatizado que se aplica de manera ru-
tinaria no sólo para genesindividuales sino también para
genomas enteros.Aunque las máquinas que secuencian
DNA sóIo determinan la secuenciade fragmentoscortos de
DNA, de unas 500 a 800 basesde largo, uno a uno, los pro-
gramas de ordenador buscan secuenciasde solapamiento
entre esosfragmentos y de esemodo es posible ensamblar
datos de cientos o miles de fragmentos de DNA en grandes
tramos que puedenalcanzarlongitudesde millones de bases.
Muchos de los éxitos iniciales en la secuenciacióndel
genoma están relacionadoscon bacterias,ya que éstaspo-
seen genomas relativamente pequeños, normalmente de
unos pocos millones de bases.Ahora están disponibles las
secuenciascompletasdel DNA de más de 100 bacteriasdi-
ferentes,incluyendo aquellasque causanvariasenfermeda-
des en los humanos. De hecho, los aparatosde secuencia-
ción son tan eficacesque recientemente,un instituto de
investigacióninformó de que había sido capazde secuen-
ciar el genoma de 15 bacteriasdiferentesien un mes! Pero
la secuenciaciónde DNA también se ha aplicado con éxito
en genomasmás grandes,incluyendo los organismos más
importantes para la investigación biológica (Tabla 18.2).
Por ejemplo, Ios científicos han completado la secuencia
 Secuenciadesconocida Figura18.14 Secuenciación del DNA.
La técnica de terminación de Ia cadena
M o l d ed e D N A 3 ' - 4 A C A G C T T C A G T , . . , . . . . , . . . . . . . . 5 ' que seilustra aquí, que emplea
Cebador(primer) F_TTGTI dideoxinucleótidos marcadoscon un
colorante, seha adaptado para su uso
Incubaciónde DNA de cadenasencilla en máquinas secuenciadoras
de secuenciadesconocida(hebra automáticasde alta velocidad.Auncue
f DNA polimerasa esteejemplo resumesolamentelos
de arriba)en una mezclade reacción
+ dATP,dCTP,dTTP,dGTP resultadosobtenidos para las primeras
que contieneun cebador,la DNA
polimerasa,deoxinucleótidos + ddATP', ddCTPO,ddTTP' ddGTP' ocho basesde Ia secuenciade DNA, los
y dideoxinucleótidos
marcados experimentosde estetipo determinan
con colorante generalmentesecuenciasde fragmentos
de DNA de 500-800basesde longitud.
ls':TTofcoAAGrcA. Los cuatro pasosprincipales implicados
en el procedimientosedescribencon
ll-iie iccAAGrc.
Productos
de la reacción mayor detalle en el texto.
O
coloreadaque se formancada l s '- r r e i c c A A G r .
vez que la síntesisde DNA o
lí_lie trccnne
se terminade formaprematura F;-rreis64ao
por la incorporaclónde un
dedeoxinucleótido marcado fficcn'
con cotoranle E;-iie il66o
E_rroil6o

o Los fragmentosse separan

ññr alé^irñf^racic on nol

O La cámaradetecta

/\AA/\AAA
losf ragmentoscoloreados
a medidaque se desplazan
en el gel, permit¡endoasí
representar la secuenc¡a
oe Dases

Tabla18.2 Ejemplos genomas

dealgunos secuenciados genómica de Ia levadura Saccharomices cereyisiae(12,1 mi-
Tamaño Número
estimado llones de bases),de la lombriz Caenorhabditiselegans(97
0rEan¡smo delgenoma degenes millones de bases),de la planta de Ia mostaza Arabidopsis
thaliana (125 millones de bases)y de la mosca de la fruta
Bacteria Drosophila melanogaster( 180 millones de bases).
Mycophsma genitalium 0,6Mb 470 Para nosotros, como sereshumanos, el logro más im-
Haemophilus inlluenza 1,8Mb r.740 portante de la secuenciacióndel DNA es,por supuesto,el
Streptococcusp neumoniae 2,2llb 2.240 genoma humano. ¿Cómo ha sido de impresionante esede-
Escherichia coli 4,6Mb 4.405 safío?Para contestara esacuestión necesitamossaber que
Levadura (5. cerevisiae) 1 2 , 1M b 6.200 el genoma nuclear humano contiene alrededorde 3,2 billo-
Lombriz redonda (C. elegans) 97 Mb 19.700
nes de basesque es aproximadamente 1.000vecesmás que
el DNA que está presente en una célula de E. coli. Una ma-
P l a n t ad e fa m o s t a z a( A . t h a l i a n a ) 12sMb 25.500
nera de entender la magnitud de semejantedesafio es apun-
Mosca de la fruta (D. melanogaster) 180Mb 13.600
tar que a principios de los 90, cuando los esfuerzospara se-
Ratón (Mas musculus) 2.s00Mb 30.000
cuenciargenomasempezarona ir en serio,el laboratorio de
Humano (H. sapiens) 3.200Mb 30.000 FrederickBlattner necesitócasiseisañosDaradeterminar la

delDNAengenomas 577
Laorganización
secuencia debasescompletadel genomadeE. coli.Aestave- mayoriadelasfuncionescelulares,ahoralos científicosmi-
locidad,la secuenciacióndel genomahumano completole ran másalládel genomaparaestudiarel proteoma -la es-
habríasupuestoa un únicolaboratorio¡unos6.000añoslEn tructuray propiedades de cadaproteínaproducidapor el
consecuencia, en 1990,los científicosacordaronelProyecto genoma-. La complejidaddel proteomade un organismo
sobreel GenomaHumano,un esfuerzode cooperaciónin- esconsiderablemente mayorquela desu genoma.Porejem-
ternacionalque implicabaa cientosde científicosquecom- plo, sepiensaque los aproximadamente 30.000genesque
partieron susdatosen un intento de determinarla secuen- sehan encontradoen las célulashumanas,son capacesde
cia completadel genomahumano.A finalesde los 90, una producirentre200.000ymás de un millón deproteínas. La
compañíacomercial,CeleraGenomics,abordótambién el razón por la cual las células pueden producir tantas pro-
asunto.Comoresultadodeestosesfuerzos, en abrilde2003, teínasa partir de un númeromáspequeñode genessetra-
se determinóla secuenciacompletadel genomahumano, taráen el Capítulo23.Esencialmente, reflejael hechode que
aproximadamente dos añosantesde lo previsto. un gen individual sepuedeleer de múltiples formas para
producir versionesdiferentesde su producto proteico,y
quelasproteínasresultantesestánsujetasa modificaciones
El campode la bioinformática ha emergidoparadesciflal
bioquímicasquepuedenalterarde manerasignificativasus
genomasy ploteomas
propiedades estructurales y funcionales.
Sin duda,secuenciarel genomahumano ha sido una de las Identificarel enormenúmerode proteínasproducidas
hazañas queha coronadola biologíamoderna,no sólode- por el genomaha sidomásfácilpor la espectrometría dema-
bido a su magnitudy dificultad sino también a su impacto sasde altavelocidad,una técnicaextremadamente sensible
potencialsobrenuestrosconocimientos sobrela evolución, que utiliza camposmagnéticosy eléctricospara separar
fisiologíay enfermedad humana.E incluso,desenmarañar proteínaso fragmentosdeproteínas, basándose en diferen-
Ia secuencia debaseserala parte<fácil>. Ahoravienela par- ciasde masay carga.Una aplicacióndela espectrometría de
te difícil queesdarleforma al significadode estasecuencia masasesidentificarlospéptidosderivadosde proteínasse-
de 3 billonesdeA.,, G.,,C.. y T.,. Por ejemplo,¿quétramos paradaspreviamentepor electroforesis en gel y digeridas
del DNA corresponden a genes,cuándoy en quétejidosse posteriormente conproteasas específicas,
comola tripsina.
expresanesosgenes,qué clasede proteínascodificanesos Comparandolos datosresultantescon lasmasasdelos pép-
genesy cómo interactúanesasproteínascon otrasy cómo tidos que se producirían,segúnel pronósticode las se-
funcionan? cuenciasde DNA presentes en lasbasesde datosgenómicos,
La perspectivade analizareseenormetorrentede datos sepuedenidentificarproteínasproducidaspor genesdere-
condujo a la identificaciónde una nuevadisciplina,deno- cientedescubrimiento. Otrastécnicashacenviableel estu-
minadabioinformática, que la los
aúna cienciade ordena- dio de interacciones y propiedades funcionalesen el enor-
dorescon Ia biologlaen un intento de darlesentidoa todo me número de proteínas que se encuentran en un
esto.Por ejemplo,Ios programas que
informáticos analizan proteoma. Por ejemplo, es posible inmovilizar milesdepro-
el DNA por tramos quepodrían codificarsecuenciasdeami- telnas diferentes (u otras moléculas que se unen a proteínas
noácidos,seutilizanparaestimarel númerodegenesqueco- específicas) como minúsculas manchas en un trozo de vi-
dificanproteínas.Estosan¿íIisis sugierenla presenciadeunos drio más pequeño que un porta. Las microcolecciones pro-
30.000genesque codificaríanproteínasen el genomahu- teicas restltantes (o ochips, de proteínas) se pueden usar
mano,aproximadamente dela mitad, no seconocíasu exis- para estudiar varias propiedades proteicas tales como Ia ca-
tenciaantesde la secuenciación del genoma.Lo más fasci- pacidad de cada mancha individual para unirse a otras mo-
nante de estaestimación,es que esto significa que los léculasañadidasa la solucióncircundante.
humanos¡tienensolamenteel dobledelos genesquetienen Ademásde lasproteínasa lasque codifica,otra caracte-
laslombriceso las moscas!El analisispor ordenadortam- rísticaimportantedel genomahumanoesla maneraen la
bién ha reveladoquesolamenteel 1 o el 2o/odelgenomahu- quela secuencia debasesdifiereentrepersonas. La secuen-
mano codificaproteínasnormalmente.Mientras que el cia del genomahumanopublicadaesen realidadun mo-
DNA restantecontieneelementosreguladoresimportantes saicoobtenidoa partir del DNA aisladode 10individuosdi-
así como algunosgenesque codificanpara productosdel ferentes. En la práctica, el 99,7o/ode lasbasesde su genoma
RNA envezdeproteínas,la mayoríaparececonsistirenDNA seajustaránperfectamente a estasecuencia publicadao con
<basura> sin función aparente.(Leapor ejemplo,las discu- la secuenciade basesdel DNA de su vecinode la puerta de
sionessobreel DNA repetidoen la siguienteseccióny sobre al lado.Peroel 0,37orestantede lasbasespuedevariar de
losintronesen el Capítulo21.)Mientrasquela significación una personaa otra, creandocaracterísticas que nos hacen
de todo esteDNA no estáclara,algunasevidenciassugieren individuosúnicos.Estasvariaciones en la secuencia de ba-
que su presenciapuedeaumentarla capacidaddel genoma sesentre individuos se denominanpolimorfismos de un
de evolucionara lo largo del tiempo. único nucleótido,o SNPs(quesepronuncia<snips>). Aun-
Puestoquela función de la mayoríadelos genesespro- queel 0,30lo no suenaa mucho,el 0,30lo multiplicadopor 3,2
ducir proteínasy estasproteínasson las responsables de la billonesde basesdel genomahumanoproduceun total de

578 Capitulo
18 Baseestructural
de la información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
aproximadamente10 millones de SNPs.Los científicosya
han creadouna basede datosquecontieneIa mayoríadelos
SNPsmáscomunes;estaspequeñasvariacionesgenéticas se
creeque son importantesya que puedeninfluir probable-
mente en cómo seva a ver ustedafectadopor una enfer-
medaden particularo en cómo responderíaa un trata-
mientoconcreto.
El impactode estecuerpode datosgenéticosen creci-
miento seva haciendoevidentecon descubrimientos rela-
cionadosconla basegenéticademuchasenfermedades hu-
manas-desde el cáncerde mamay el de colon hastala
diabetesy la enfermedadde Alzheimer- sobrelas que se
estáinformandoa un ritmo queaumentarápidamente. Es-
tos descubrimientos prometenrevolucionarla prácticamé-
dicafutura,ya quela capacidadparaidentificargenesdeen-
fermedadese investigarsu función haceposibleconcebir
intervencionesmédicasquealiviene inclusoprevenganen-
fermedades.
Perola capacidadde identificar genespotencialmente
perjudicialestambién aumentalas preocupacioneséticas,
debidoa quetodosnosotrosprobablemente portamosunas
pocasdocenasde genesque nos exponena algunosriesgos.
Existela posibilidaddequea esainformaciónsele dé un mal
uso-por ejemplo,ladiscriminacióngenéticaa individuos
o gruposde personaspor partede lascompañíasde segu-
ros,empleadores o agencias gubernamentales-.Además,
el conocimientoen detalledelgenomahumanoaumentael
potencialde utilizartécnicasde DNA recombinante(véase
Capítulo20) paraalterarlosgenesdela gente,no sólopara
corregirenfermedades en tejidoscorporalesque no fun-
cionancorrectamente sinotambiénparacambiarIosgenes
delosespermatozoides y delosólrrlos,y por extensión
para
alterarla composicióngenéticade generaciones futuras.
Cómousaresascapacidades y cómodeberíanregularse son
cuestionesque afectanclaramentea la comunidadcientífi-
caperotambiéna todala sociedaden su conjunto.
por calentamiento. Sebajó entoncesla temperaturapara
permitir que los fragmentosde cadenasencillaserenatu-
ralizasen.La velocidadde renaturalizacióndependede la
concentraciónde cadatipo de secuenciade DNA indivi-
dual; cuantomás alta seala concentraciónde una secuen-
cia de DNA dada,mayor esla probabilidadde que colisio-
ne al azar con una hebra complementariacon la que se
puedareasociar. ¿Cómosepuedencompararlaspropieda-
des de renaturalizaciónde las diferentesclasesde DNA?
Como ejemplo,vamosa considerarel DNA derivadode
una célulabacterianay de una célulatípicademamíferoque
contienemil vecesmásde DNA. Si estadiferenciaen el con-
tenidode DNA reflejadiferencias del ordendemil vecesen
cuantoa lassecuencias deDNA presentes, entonces el DNA
bacterianosedeberíarenaturalizar1.000vecesmásdepri-
saque el DNA de mamífero.El fundamentosubyacente en
el quesebasaestapredicciónesquecualquiersecuencia de
DNA en particular,deberíaestarpresenteen una concen-
tración mil vecesmásbaja en Ia muestrade DNA de ma-
mífero debidoa que hay mil vecesmásde tipos de secuen-
ciaspresentes, de maneraque cadasecuencia en particular
representa una fracciónmás pequeña de Ia población total
de secuencias.
De hecho,cuandoBritteny Kohnerealizaronsusestu-
dioscomparandola velocidadderenaturalización delDNA
de mamíferoscon respectoa bacterias,los resultadosno
fueronexactamente losesperados. En Ia Figura18.15sere-
sumenlos datosobtenidosparala renaturalización del DNA
de una terneray el de E. coli;la renaturalización serepre-
sentacomouna función dela concentracióninicial de DNA
multiplicadopor el tiempo transcurrido.Esteparámetrode
la concentración de DNA por el tiempo,o Cor,seempleaen
lugarde solamente el tiempo,porquepermitela compara-
ción directade los datosobtenidosa partir de reacciones
realizadasa diferentesconcentraciones de DNA. Cuandose
representan los gráficosde estaforma,los datosrevelanque

Lassecuenciasrepetidasdel DNAexplicanparc¡almente DNA de E coll

elgran tamañode los genomaseucar¡ót¡cos ¡o n
.N
Ademásde las dificultadescreadaspor los estudiosde se- E
-¿u
cuenciacióndel DNA, el enormetamañodel genomahu- DNAde ternera
c
manoplanteauna cuestiónmásimportante:¿Sonlasgran- 0)
descantidadesde DNA que seencuentranen lascélulasde <40
z
los humanosy de otroseucariotas superiores simplemente ó
un reflejodelasnecesidadesdelos milesdevecesmásde ge- o60
-(Ú'
c)
nesde los que estánpresentes o
en las célulasbacterianas E
hay otros factorestambién en juego?Al final de la década oon
OUW

de 1960seprodujoun granpasoadelanteparacontestara o_
estacuestión.cuandolos estudiosde renaturalización del 100 3
ío 1o-2 0.1 1 10 1o2 103 104
DNA llevadosa cabopor Roy Britten y David Kohne con-
dujeronal descubrimientode las secuencias repetidasdel C6r(concentración
de DNA x tiempo)
DNA. Figura18.15 Renatunlizaciónde DNAde temetay de E coli. El
En los experimentosde Britten y Kohne,el DNA secor- DNA de terneraquesereasocia másrapidamentequeel DNA
tó en pequeñosfragmentosy sedisocióen hebrassencillas bacterianoconsisteen secuencias
repetidas.

delDNAengenomas 579
Laorganización
el DNA de la ternera constade dos clasesde secuenciasque
se renaturalizan a velocidades claramente diferentes. Un
tipo de secuenciaque supone aproximadamente el 40o/odeI
DNA de ternera se renaturalizamás rápidamente (es decir,
a valores más bajos de Cor)que el DNA bacteriano.La ex-
plicación más sencilla de esteresultado inesperadoes que
el DNA de ternera contiene secuenciasde DNA repetidas
que están presentesen múltiples copias. La existenciade
copiasmúltiples aumenta la concentraciónrelativa de tales
secuencias,generando más colisiones y una velocidad de
reasociaciónmás rápida de lo que sería esperablesi la se-
cuencia estuviesepresenteen una única copia.
El 600/orestante del DNA de ternera se renaturaliza al-
rededor de mil vecesmás despacioque el DNA de E. coli,
que es el comportamiento esperadopara secuenciasque
están presentesen copia única. Esta fracción se denomina
DNA no repetido para distinguirlo de las secuenciasrepe-
tidas que serenaturalizanmás rápidamente.Las secuencias
de DNA no repetido estánpresentesen una sola copia por
genoma.Lamayoriade los genesque codifican para proteí-
nas consistenen DNA no repetido, aunque esto no signifi-
ca que todo el DNA no repetido codifique para proteínas.
En las célulasbacterianasprácticamentetodo el DNA es
no repetido, mientras que en las eucarióticaspresentan
grandes variaciones en las proporciones relativas de se-
cuenciasrepetidasy no repetidas.Esto proporciona una ex-
plicación, al menos en parte, del misterio de la cantidad apa-
rentemente excesiva de DNA en especies como Trillium;
esteorganismo contiene una proporción relativamentealta
de secuenciasde DNA repetidas.Usando las técnicasde se-
cuenciación descritasanteriormente, los investigadoreshan
determinado la secuenciade basesde varios tipos de DNAs
repetidos y los han clasificadoen dos categorías:DNA re-
petido entándemy DNArepetido disperso(Tabla18.3).
DNArepetidoen tándem, Una de las categoríasmás impor-
tantes de DNA repetido se denomina DNA repetido en tán-
dem ya que las múltiples copiassecolocan una al lado de la
desecuencias
Tabla18.3 CategoÍas repetidas
enel DNAeucariótico
I. DNA repetido en tándem, incluyendo el DNA repetido de secuenciasimple (DNA satélite)
dela mayoríade los genomasde mamíferossonde estetipo
El 10-15o/o
Longitud de cadaunidad repetida:
Númerode repeticiones por genoma:
Disposiciónde lasunidadesrepetidas:
Longitud total del DNA satéliteen cadasitio:
DNA satéliteregular:
DNA minisatélite:
DNA microsaté1ite:
II. DNA repetido disperso
E125al40o/ode la mayoríade los genomasde mamíferosson de estetipo
Longitud de cada unidad repetida:
Disposición de las unidades repetidas:
Número de repeticiones por genoma:
580 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celular:
DNA,cromosomas
otra en una fila -es decir, en tándem-. El DNA repetido
en tándem supone el 10-15o/odel genoma típico de mamí-
feros y consiste en secuenciasde DNA de muchos tipos di-
ferentes que varían tanto en la longitud de la unidad bási-
ca que serepite como en el número de vecesque estaunidad
se repite de forma sucesiva.La longitud de la unidad repe-
tida puede medir cualquier valor ente 1 y 2.000 pb más o
menos. Sin embargo,la mayor parte de las veces,la unidad
repetidaesmás corta de 10 pb; consecuentemente, estasub-
categoriase denomina DNA repetido de secuenciasimple.El
siguientees un ejemplo (se muestra solamenteuna hebra)
de una secuenciasimple de DNA repetido, formado a par-
tir de una unidad de cinco bases,GTTAC:
. . . GTTACGTTACGTTACGTTACGTTAC. . .
El número de repeticionessecuencialesde la unidad de
GTTAC puede ser tan elevado como varios cientos de mi-
Ies,en sitios seleccionadosdel genoma.
El DNA repetido en tándem del tipo de secuenciassim-
ples se denominó originalmente DNA satéIiteporque, en
muchos casos,estacomposición de basescaracterísticahace
que aparezcaen una banda satéliteque se separadel resto
del DNA genómico durante los procedimientos de centri-
fugación diseñadospara separar moléculas por densidad.
Esta diferencia en densidad surge como consecuenciade
que la adenina y la guanina difieren ligeramente en el peso
molecular, de la misma forma en que difieren Ia citosina y
la timina; por lo tanto,las densidadesde los DNAs con di-
ferente composición de bases diferirán. En los procedi-
mientos que revelanbandas satélites,el DNA genómico se
corta en pequeños fragmentos y, por tanto, Ios segmentos
de DNA de diferentesdensidadesson libres para migrar a
diferentesposicionesdurante la centrifugación.
¿Cuálesla función del DNA repetido de secuenciasim-
ple (DNA satélite)?Puesto que esassecuenciasnormal-
mente no se transcriben, se ha propuesto que podrían ser
responsablesde proporcionar propiedadesfísicasespecífi-
casa ciertasregionesdel cromosoma. En Ia mayoría de los
l-2.000pb; normalmente5-10pb paraDNA repetidode secuencia
simple
1 0 2l -o s
Tándem
105-107 pb
102-los pb
l o l - 1 0 2p b
pb
102-104
por todo el genoma
Dispersas
<copias>
101-106, no idénticas
y el núcleo
eucariotas,las regionesdel cromosomadenominadascen-
trómeros que desempeñan un papelimportante en la dis-
tribución de los cromosomasdurante la división celular
(véaseCapitulo 19)sonparticularmente ricasen repeticio-
nesde secuencia simple,y esposiblequeestassecuencias le
proporcionenal centrómeropropiedades estructuraleses-
peciales. Lostelómeros,que son secuencias de DNA loca-
lizadasen losextremosdeloscromosomas, tambiéntienen
repeticionesde secuenciasimples.En el siguientecapítulo,
aprenderemos cómo los telómerosprotegena los cromo-
somasde la degradaciónde susextremosvulnerablesdu-
rantecadaciclode replicación(véaseFigtra19.16).Loste-
lómeroshumanoscontienenentre250-1.500copiasde Ia
secuencia TTAGGG,lo cualseha conservado extraordina-
riamentea lo largo de cientosde millonesde añosde evo-
lución.Todoslos vertebrados estudiados hastael momen-
to tienen secuenciasrepetidas idénticas, e incluso los
eucariotasunicelulares poseensecuencias similares.Apa-
rentemente,talessecuencias son críticaspara Ia supervi-
venciade estosorganismos.
La longitud total del DNA satéliteencontradoen un si-
tio dadopuedevariarenormememente. LosDNAssatélites
típ_icos normalmentecaenen el rangode longitudde 105a
l0' paresdebases. El términoDNA minisatélite serefierea
regionesmáscortas,deunas102a 10sparesdebasesdelon-
gitud total,compuestas por repeticiones en tándemde en-
tre aproximadamente15y 100pb. LosDNAs rnlcrosatélites,
en los quelasunidadesrepetidastienenentreI y 4 pb, son
inclusomáscortos(entre10y 100pb por sitio),aunquenu-
merosossitiosen el genomapuedenexhibir la mismase-
cuencia.Lassecuencias cortasrepetidasqueseobservanen
el DNA minisatélitey microsatéliteson extraordinaria-
menteútilesen el laboratorioparael estudiode lashuellas
genéticasde DNA (DNA fingerprint). Esteprocedimiento
descritoen detalleen el Anexol8C usaIa electroforesis en
gelde fragmentosde restriccióndel DNA paracompararsi-
tios distintosdel genomade doso másindividuos.Esuna
manerade identificarindividuostan precisacomoel estu-
dio de la huellagenéticaconvencional.
Losinvestigadores médicoshan hechoel descubrimien-
to sorprendentede que variasenfermedades genéticasque
afectanal sistemanerviosoimplicancambiosen el DNA mi-
crosatélite.De maneramás específica, estasenfermedades
son fácilesde encontrargraciasal número excesivode se-
cuenciasde trinucleótidosrepetidasdentro de un gen que,
de no tenerestasrepeticiones,seríanormal.Un ejemplode
estefenómenodenominadoamplificaciónde tripletesrepe-
tidoslopodemosencontrarenla enfermedad deHuntington,
una enfermedad neurológica devastadora que aparecea me-
diana edad y que invariablemente es fatal. La versiónnor-
mal del gendela enfermedadde Huntington contieneel tri-
nucleótidoCAGrepetidoen tándementre11y 34veces.Sin
embargo,los genesde los individuos afectadosposeenmás
de 100copiasde esaunidadrepetidas.El síndromedelXfrá-
gil qu'eesuna causaimportantede retrasomental,yla dis-
trofia miotónica,qu'eafectaa los músculos,se encuentran
entrelasenfermedades neurológicasque seoriginan como
consecuencia de la amplificaciónde otro triplete de se-
cuenciasrepetidas.En algunade estasenfermedades, la se-
cuenciarepetidaseencuentraen una regióndel genafecta-
do que no setraduce;en otras,setraduceen un segmento
polipeptídicoque consisteen una serielarga del mismo
aminoácido.En amboscasos,la severidaddela enfermedad
secorrelacionacon el número de tripletesrepetidos.
DNArepetido disperso.La segundacategoríaprincipal dese-
cuenciasde DNA repetido,esel DNArepetido disperso.En
lugar de estardispuestoen secuencias agrupadas forman-
do un tándem,lasunidadesrepetidasde estetipo de DNA
estánesparcidas por todo el genoma.Una única unidad
tiendea tenerunalongitudde cientoso inclusodemilesde
paresde bases, y sus<copias> dispersas, quepuedenestara
cientoso a miles,normalmenteson similaresperono idén-
ticasa lasotras.EI DNA repetidodispersosuponeentreel
25 y el 40o/ode la mayoríade los genomasde mamíferos.
En humanosy otros primates,una gran porción del
DNA repetidodispersoconsisteen una familiade secuen-
ciasrelacionadas denominadas familia Alr4denominadaasl
debidoa que lasprimerassecuencias identificadas de esta
famiiiaconteníanun sitio de restricciónparala enzimade
restricciónAlul.Una únicaunidadAlu tieneuna longitud
de alrededorde 300 pb y los cientosde miles de unidades
Alu presentes en el genomahumanosuponenmásdel 10o/o
del genoma.La unidad Alu essimilar,en secuencias de ba-
ses,a un tipo especialde RNA implicadoen la síntesisde
proteínasen el retículoendoplasmático rugoso(comocom-
ponentede la partículade reconocimiento de la señal,tra-
tada en el Capítulo 22). Lassecuencias Alu estántambién
presentes en regionesquecodificanproteínasde algunosge-
nes,dondesepiensaquecontribuyena Iavariabilidadpro-
teicay a la evolución.Aunquelasrazonespor lasque el ge-
noma mantienetantascopiasde secuencias dispersas tales
comoAlu no estánclaras,aunquesabemos cómohan sur-
gido tantascopias.Lamayoriadelassecuencias dispersas re-
petidassonmiembrosdeunaclaseespecial desegmentos de
DNA quesemueveny proliferana lo largodel genomade-
jandocopiasallí dondeseparan.Losmovimientosde estos
elementosmóvilesde DNA, denominadostrasposones,
creanalteraciones genéticasde las que secreeque contri-
buyen a la adaptabilidad evolutivadel genoma.El origeny
comportamiento de los trasposones sediscutirámás am-
pliamenteen el Capítulo21.
Concluimosestasecciónsobrela organizacióndel DNA
apuntandoque aplazaremos la discusiónsobrealgunosde
los descubrimientosmásinteresantes obtenidosa partir de
la genéticamoleculary dela secuenciación del DNA -a sa-
ber,la organizacióndel DNA que constituyegenes-hasta
el Capítulo21,dondetrataremosla estructurade los genes
en detalle.
delDNAengenomas s8l
|: organización
A ne x o

L,t nusLLA GENÉrrcn pe DNA (Di{A FTNGERpRTNT)

EI análisisde los patronesfragmentosde restricciónque se
producencuandosedigiereel DNA con las enzimasde
restricciónseha aprovechadopara diversospropósitos,que
varíandesdela investigaciónen la organizaciónde los genomas
a aplicacionesprácticastalescomo el diagnósticode
enfermedades genéticaso la resoluciónde crímenescon
violencia.Lasaplicacionesprácticasdel análisisde los
fragmentosde restricción,sebasanen el hechode que no hay
dos personas(salvogemelosidénticos)que tenganun juego
exactode secuencias de basesde DNA. Aunquelas diferencias
entrelassecuencias de DNA de dos personasson muy
pequeñas,alteranIa longitud de algunode los fragmentosde
DNA producidospor lasenzimasde restricción.Estas
diferenciasen la longitud de los fragmentos,que sedenominan
polimorfismo de longitud de fragmentosde restricción
(RFLP,del inglésrestrictionfragmentlength polymorphisms)
sepuedenanalizarpor electroforesis en gel.El patrón de
fragmentosresultantesirvecomo nhuellagenética>que
identificaa los individuos de los que seha obtenidoel DNA.
En la práctica,la técnicade la huellagenéticadel DNA se
realízade tai forma que sólo seexaminaun pequeñoy selecto
grupo de bandasde fragmentosde restricción.Parailustrar este
punto,la Figura18C.1resumecómopodríautilizarsela huella
genéticadel DNA paradeterminarsi los individuos son
portadoresde un genparticularcausante de una enfermedad,
aunquepuedeque todavíano exhibansíntomasde esa
enfermedad.En esteejemplo,imagineque los individuos I, II y
III sonmiembrosde una familiaen la queescomúnel gen

DNA+
enzimas
de restricción

t_tt--t
tltl
tltl
, l¡

Fragmentos Papel
tl de restricción

V \/
V
ill
...._

o Preparaciónde fragmentos de
restricción. El DNA se extraede los
glóbulosblancosprocedentesde los
i n d i v i d u ols, l l y l l l .S e a ñ a d eu n a
enzimade restricción
muestrasde DNA oara oroducirlos
fragmentosde restricción
!- en gel. Lasmezclas I -
etectrotoresis
conlosfragmentos de restricción
de
Despuésciequeel
Transferencia.
DNAdelgelse ha desnaturalizado
caoa muestrase seoaranoor por calor.las cadenassencillasse
electroforesis.
Cada muestraforma transf¡erenpor absorcióna un papel
a lastres un patrónde bandas característico especrai.
(seríanmuchasmás bandasque las
que se muestranaqui).

Lavaoo
+

Sondas radiactivas,Se añadeuna soluciónde Autorradiografía.Despuésde que se aclare el exceso

I-
del papelde transferencia.
sondasradiactivas de sonda,se pone una hojade papelfotográfico
La sondaes una moléculade DNA de cadena sobreel papelde transferencia.
La radioactividad
sencillacomplementariaal DNA de interés. de la sondaligadalmpresionala películaformandouna
La sondasólose une a las bandasque contienen ¡magenque correspondea las bandasde DNA
el DNA complementario,por emparejamiento Las bandascontienenel DNA que hibrida
especrficas.
oe oases, con la sonoa,

Figura18C.1 Huellagenéticade DNAporanálisisconRFLP.

582 Capitulo
18 Baseestructural
de la información
celular:
DNA,cromosomas
Vel núcleo
causantede la enfermedad.Sesabeque el individuo I es
portador del gen defectuoso,pero que el individuo II no,
y queremosdeterminarel estatusgenéticode su hijo, el
individuo III.
El pasoclaveen la huellagenéticadel DNA sedenomina
Hibridación de Southern (del inglésSouthernBlotting,
desarrolladaen 1975por E. M. Southern),pero normalmenteel
procedimientode la huellagenéticaimplica variospasos
distintos.En el pasoO de Ia Figura 18C.1,el DNA obtenidoa
partir de los tresindividuos sedigierecon una enzimade
restricción.En el paso@,los fragmentosresultantesseseparan
unos de otros medianteelectroforesisen gel.Debido a que el
DNA de cadapersonarepresentaun genomacompleto,cientos
de milesde bandasaparecerlanen esteestadio,si todasse
hicieranvisibles.Aquí esdondehizo su apariciónel golpede
brillantezde Southern,con una técnicaque nos permite
distinguir lasbandasde interés.En el procesode hibridación de
Southernpaso@ sepresionacontra el gel terminado,un tipo
especialde papel<detransferencio (de nitrocelulosao nylon),
permitiendoque el patrón de fragmentosde DNA setransfiera
al papel.En @, seañadeuna sondaraüactivaa la transferencia.
La sondaessimplementeuna molécularadiactivade DNA (o de
RNA) de cadenasencillacuyasecuenciade baseses
complementariaal DNA de interés----€nestecaso,el DNA del
gen causantede la enfermedad-. La sondaseune a las
secuencias complementariasdel DNA por emparejamientode
Iasbases(el mismo procesoque ocurre cuandoel DNA
desnaturalizadoserenaturaliza).En el paso@, lasbandasque se
unen a la sondaradiactivasehacenvisiblespor
autorradiografia.Los resultadosindican que la versióndel gen
del hijo concuerdacon la del parentalsano,indiüduo II.
Los autorradiogramasde la Figura 18C.2ilustran el uso de
la huellagenéticadel DNA en un casode asesinato. Aquí, el
análisisde los RFLPdeterminaque la sangreencontradaen la
ropa del acusadoprocedede la víctima,implicando al acusado
en el asesinato. Otra aplicaciónprácticade la huellagenéticadel
DNA en el árealegalesen la determinaciónde la paternidado
de la maternidad.
Ahora, en muchasaplicacionesU. 1uhuellagenéticadel
DNA, los científicosanalizanla longitud de secuencias cortas
repetidas(DNA minisatélite)conocidascomo número variable
de repeticionesen tánden o VNTRs (del inglés,variable
number tandemrepeats).Los sitios\T{TR elegidosparahuella
genéticade DNA varíande maneraimportante su longitud
entrepersonas,debido a la diferenciaen el número de vecesque
serepiteIa unidad básicasecuencialmente.
Como resultado,el patrón de VNTRs en el DNA de una
personasepuedeutilizar para identificar únicamentea un
individuo. Por ejemplo,el DNA de tres sospechosos en un caso
de asesinatopodría tener,en cadauno de ellos,un número
diferentede copiasde la secuenciade dinucleótidosTG en un
sitio concretodel genoma;uno podríatener 19 copias,otro,2L
copiasy el tercero32 copias.Lasdiferenciasen los patronesde
los fragmentosde restricciónprocederíande las diferenciasen
Sangredel Sangreprocedente Sangrede
acusado de la ropa la víctima
\ del acusado I
\ r---------"----- l
4!¡ 0¡¡¡
D joans _sh¡ft- v
:
Figura18C.2 Huellagenética de un caso de asesinato, EI DNA se
aisló a partir de muestrasde sangredel acusadoy se compararon
por an:ílisiscon RFLR con DNA del acusadoy con DNA de la
víctima. El patrón de bandasdel DNA de la mancha de sangrese
ajusta al de la víctima, demostrando que la sangrede la ropa del
acusadoprocede de la víctima. (Cortesíade Cellmark Diagnostics,
Inc., Germantown, MD.)
el número de unidadesde TG repetidas,entre dos sitios
de restricciónque secortan,másque de la presenciao
ausenciade un sitio de corte. como sucedeen los RFLPs
tradicionales.En los casoscriminales,seexaminaen
el genomade forma rutinariaIa longitud de l3 sitios
VNTR diferentes.La posibilidad de que dos individuos
no relacionadospresentaranexactamenteel mismo perfil en
los 13 sitios esaproximadamentede una en un millón de
billones.
La utilidad de la huellagenéticade DNA seaumentapor la
reacciónen cadenade la polimerasa(PCR,del inglés,polymerase
chain reaction),una técnicaparahacermriltiplescopiasde
DNA que sedescribiráen el Capítulo 19.Empezandocon DNA
aisladoa partir de una única célula,la reacciónde PCR seutiliza
para sintetizarde forma selectivamillonesde copiasde una
secuenciadadade DNA en unaspocashoras,produciendocon
facilidadDNA suficientecomo para realizarel aniílisisde la
huellagenéticade los 13 sitiosVNTR. De estaforma, unaspocas
célulasde la piel, dejadasal tocar un bolígrafoo lasllavesde un
cochepuedenproducir el suficienteDNA paraidentificar a un
individuo.
delDNAengenomas 583
Laorganización
 Empaquetamiento del DNA
La cantidadde DNA que puedeconteneruna célulaesim-
presionante,incluso para organismoscon genomasde di-
mensionesmodestas.Por ejemplo,una célulatípica de E.
coli mide alrededorde I mm de diámetroy 2 mm de lon-
gitud,pero puedeconteneruna moléculade DNA (circu-
lar) con una longitud de unas 1.600mm -DNA suficien-
te para rodeara la célula¡másde 400 veces!-. Lascélulas
eucariotasafrontan un desafíoincluso mayor.Una célula
humana de tamañomedio contienesuficienteDNA como
paraenvolvera la célulamásde 15.000veces.De algunama-
neratodo esteDNA debeestarempaquetado eficazmenteen
las célulasde maneraque seaaccesiblea la maquinariace-
lular,tanto parala replicacióndel DNA comoparala trans-
cripción de genesespecíficos. Claramente,el empaqueta-
miento del DNA es un problema que suponeun desaffo
paratodaslasformasdevida.Observaremos primero cómo
llevana cabolos procariotasestatareade organizarsu DNA
y después consideraremos cómoabordanel mismoproble-
ma los eucariotas.
Losptocariotas
empaquetan
el DNAencromosomas
y enplásm¡dos
bacterianos
Duranteun tiemposepensóqueel genomade procariotas
como E. coli erauna molécula<desnuda> a la quele faltaba
cualquierelaboracióny que tenía sólo cantidadestriviales
de proteínasasociadaa ella.Ahora sabemosque la organi-
zacióndel genomabacterianoesmásparecidaa la organi-
zaciónde los cromosomaseucariotasde lo que se había
pensadopreviamente.Además,los genetistas bacterianosse
referíana la estructuraquecontienelo fundamentaldel ge-
nomabacterianocomocromosomabacteriano.
Ctomosomas baeterianos.Generalmente.el cromosoma
bacterianoesuna moléculade DNA circular,que contiene
algunaproteínaunida,localizadaen una regiónespecialde
la céluladenominadanucleoide(Figura18.16).Aunqueel
nucleoideno estárodeadopor membrana,el cromosoma
bacterianoque resideen estaregiónforma una masade fi-
bras con aspectofilamentoso,empaquetadade forma que
mantieneunoslímitesdiferentesentreel nucleoidey el res-
to de la célula.El DNA del cromosomabacterianoestá
superenrolladonegativamente yplegadoen una extensase-
rie debuclesquepor término mediotienenuna longitud de
20.000pb.Debidoa quelos dosextremosde cadabuclees-
tán ancladosa los componentesestructuralesque se en-
cuentran en el nucleoide,el superenrollamientode los
buclesindividuales se puede alterar sin influir en el su-
perenrrollamientode buclesadyacentes.
Sepiensaque los buclessemantienenen su sitio por el
RNA y lasmoléculasproteicas.Sehan obtenidoevidencias
del papelestructuraldel RNA en el cromosomabacteriano
a partir de estudiosque demostrabanque el tratamiento
con ribonucleasa, una enzimaquedegradael RNA,liberaal-
guno de los bucles,aunqueno relajael superenrollamien-
to. Por otro lado,los pequeñoscortesdel DNA con una to-
poisomerasa,relajan el superenrollamientopero no
desorganizan losbucles.El DNA superenrolladoqueforma
cadabucle seorganizaen paquetesde cuentasque contie-
nen pequeñasmoléculasproteicasbásicasanálogasa las
histonasdelascélulaseucariotas (delasquesetrataráen la
próximasección).
Las evidenciasactualessugierenque la moléculade
DNA estáenvueltaalrededorde partlculasde protelnabá-
sica.Inclusoa partir de Io que sabemos hastael momento,
el cromosomabacterianoconsisteen DNA superenrollado
unido a pequeñas proteínasbásicasy plegadoen dominios
conbucles.

Nucleoide

'*r':.s*

-1,,'-.'
tzs¡,;
0,25y"m
Figura18,16 El nucleoidebactefiano. La micrograffa electrónica de la izquierda muestra una célula bacteriana con un marcado nucleoide,
que esla región donde reside el cromosoma bacteriano. Cuando se rompen las célulasbacterianasselibera el DNA cromosómico de la
célula.La micrografia de la derechamuestra que el DNA liberado forma una serie de bucles que se mantienen unidos al armazín estructural
del nucleoide (METs).

584 Capitulo
18 Baseestructural
dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
Plásmidosbacterianos, Además de su cromosoma, una cé-
lula bacterianapuede contener uno o más plásmidos. Los
plásmidos son pequeñas moléculas de DNA circular que
porta genestanto para su propia replicación, como para una
o más funciones celulares(normalmente funciones no esen-
ciales).Lamayoría de los plásmidos estánsuperenrollados'
dándoles una forma compacta, condensada.Aunque los
plásmidos se replican de forma autónoma, la replicación
está normalmente en suficiente sincronía con la replica-
ción del cromosoma bacterianocomo Paraasegurarun nú-
mero de plásmidos, más o menos comparable,de una ge-
neración a la siguiente.En las célulasde E. coli,sereconocen
tres clasesde plásmidos.Los factoresF (fertilidad) estánim-
plicados en los procesosde conjugación,un procesosexual
del que trataremos en el Capítulo 20. Los factoresR (resis-
tencia)portan genesque confieren a las bacteriasresisten-
cia a las drogas. Por último, los factorescol (colicinógeno)
permiten a las bacteriassecretarcolicinas,compuestosque
matan a otras bacteriasa las que le falta el factor col. Ade-
más, aigunas cepasde E. coli contienen plásmidos crípticos,
que no tienen función conocida.
el DNAencromat¡na
empaquetan
Loseucariotas
y cf0mosomas
Cuando pasamosde las célulasprocariotasa las eucariotas,
empaquetar el DNA se vuelve más complicado. Lo prime-
ro es que estánimplicadas cantidadessustancialmentema-
yores de DNA. Cada cromosoma eucariotacontiene una
única moléculade DNA lineal de tamaño enorme.En lascé-
lulashumanas,por ejemplo,sóIottnade estasmolécuiasde
DNA puedetener l0 cm o más de largo,aproximadamen-
te unas cien vecesel tamaño de la molécula de DNA en-
contrado en un cromosoma típico bacteriano.En segundo
lugar se introduce una mayor complejidad estructural me-
diante la asociacióndel DNA eucariótico con mayor canti-
dad y número de proteínas.Cuando se une a estasproteí-
nas,el DNA seconvierte en fibras de cromatina que miden
de 10 a 30 nm de diámetro' que normalmente están dis-
persasen el núcleo. En el momento de la división celular (y
en otras situacionesespeciales),estasfibras se condensany
se pliegan en estructuras compactas,mucho mayores,en
donde sehacenreconocibleslos cromosomas individuales.
La proteína que tiene el papel más importante en la es-
tructura de la cromatina son las histonas, un grupo de pro-
teínas relativamente pequeñas cuyo contenido elevado en
aminoácidoslisina y arginina lesaporta una fuerte cargapo-
sitiva. La unión de las histonas al DNA, que estácargado ne-
gativamente,se estabilizaademáspor puentesiónicos.En la
mayoría de las células,la masa de histonas de la cromatina es
aproximadamenteigual a la masade DNA. Lashistonas sedi-
viden en cinco grupos principales, designadoscomo H1'
IH2A,H2B, H3 y H4. La cromatina contiene aproximada-
mente igual número de moléculas de histonas H2A,H2B,H3
yH4y cercade la mitad de esacantidad de moléculas del tipo
H 1. Estasproporciones son extraordinariamente constantes
entre las diferentesclasesde célulaseucariotas,independien-
temente del tipo celular o de su estadofisiológico.Además de
las histonas,la cromatina también contiene un grupo de di-
vercasproteínasno histonasque desempeñanuna gran varie-
dad de papelesenzimáticos, estructurales,y reguladores.
Losnucleosomassonla unidadbásicadela estructula
dela cromatina
El DNA contenido dentro de un núcleo típico mediría un
metro o más de longitud si estuviera completamente ex-
tendido, mientras que el núcleo en sí normalmente no mide
más de 5-10 mm de diámetro. El plegamiento de tan enor-
me longitud de DNA en un núcleo que escasiun millón de
vecesmás pequeño,supone un problema topológico signi-
ficativo. Uno de los primeros hallazgossobre el proceso de
plegamiento surgió a finales de los años 60, cuando los es-
tudios de difracción de rayosX llevadosa cabo por Mauri-
ceWilkins reveló que las fibras de cromatina purificada tie-
nen una subunidad estructural que se repite que no se
observani en el DNA ni en las histonassolas.Además,Wil-
kins concluyó que las histonasle imponen al DNA una or-
ganización estructural repetitiva. En I97 4 se proporcionó
una pista sobre cómo era la naturalezade esta estructura,
cuando Ada Olins y Donald Olins publicaron micrografías
electrónicasde las fibras de cromatina aisladasa partir de
células,de manera que se evitaban los solventesácidosem-
pleados en 1osprimeros procedirnientosrealizadospara
prepararcromatina y examinarlaal microscopio.Las fibras
de cromatina vistas de estaforma parecenuna seriede mi-
núsculas partículas ancladasuna a otra mediante un fila-
mento fino. Esta aparienciade <collar de cuentas>sugirió
que las cuentas estabanhechasde proteínas (presumible-
mente histonas) y que el fino filamento que conecta las
cuentascorresponde al DNA. Ahora nos referimos a cada
cuenta junto a su DNA asociado,con el nombre de nucle-
o s o m a ( F i g u r a1 8 . 1 7 ) .
Partículadel núcleodel nucleosoma
-o"o5til
Figura18.17 Nucleosomas.Laspartículasdel núcleo del
nucleosomaparecenestructurasen forma de cuentasespaciadas a
intervalos regularesa lo largo de las fibras de cromatina. Un
nucleosoma sedefine por incluir una partícula central o del núcleo
y un tramo de DNA que la conectaa la siguientepartícula central
(MET).
delDNA
Emoaouetamiento 585
 Basándonossolamenteen la microscopíaelectrónica
habríasido diffcil determinarsi los nucleosomas son un
componentenormal de la cromatinao un artefactogene-
rado durantela preparaciónde la muestra.Afortunada-
mente,DeanHewishy LeighBurgoyneinformaron, casial
mismo tiempo y con evidenciasindependientes, de la exis-
tenciade una estructurarepetitivaen la cromatina;descu-
brieron que los núcleosde las célulasdel hígadode rata
la digestión con nucleasay la microscopía electrónica.En
estosestudios, la cromatina se exponía brevemente ala nu-
cleasade micrococcus,una enzima bacteriana que, como la
nucleasa del hígado de rata, corta el DNA de la cromatina
a intervalos de 200 pb. Entonces, la cromatina fragmenta-
da se separabaen fraccionesde varios tamaños por centri-
fugación y se examinabaa microscopía electrónica.Se en-
contró que la fracción más pequeña contenía partículas

..'¡
conteníanuna nucleasacapazde cortar el DNA en fibrasde esféricassolamente,la siguiente fracción contenía grupos de
cromatina.En un grupo de experimentos crucial,estosin-

...!
dos partículas, la siguiente fracción tenía grupos de tres
vestigadores expusieronla cromatinaa estanucleasa y pu- partículas,y así sucesivamente(Figura 18.19). Cuando se
rificaron el DNA parcialmentedegradadopara retirar las

,,.
proteínasdela cromatina.Cuandoexaminaronel DNA pu-

I
rificado,por electroforesis
en gel,encontraronun patrón de
fragmentosdistintos,en el que el fragmentomáspequeño
de DNA medíaalrededorde 200pb de longitudy los frag-
mentosrestanteseran exactamente múltiplos de 200 pb
(Figura18.18).Ya quela digestiónde DNA libre de proteí-
naspor la nucleasa,no generaba estepatróndefragmentos,
concluyeronque (1) las proteínasde la cromatinaestán
agrupadasa lo largo de la moléculade DNA con un patrón
regularque serepite a intervalosde aproximadamente200
pb,y (2) que el DNA Tocalizado entreestosgruposde pro- A
teínasessusceptible de ser digeridopor la nucleasa, pro-
porcionandofragmentosquetienenunalongitudmúltiplo
de 200pb.
Estasobservaciones plantearonla cuestiónde si losgru-
pos de proteínasde los que sehabíapostuladoque apare- .o
cíana intervalosde 200pb secorrespondían con laspartí- C
cú
_o
culasesféricas observadas en las micrograffaselectrónicas
delasfibrasde cromatina.Contestara estacuestiónreque-
ría una combinaciónde abordajes a la cuestióncomoeran

Cromatina Tamaño
(enpares
t_
Tratamiento
connucleasa
de bases)
I C

I 'o
Cromatina b
parcialmente
degradada

Eliminarlas proteínas
de la cromatina I Figura18.19 Pruebade la existenciade nucleosomas. La
Anallzarpor
Fragmentosde DNA electroforesisen gel
Figura18.18 Pruebade que las proteínasse agrupana intervalosde
200 paresde basesa lo largo de la moléculade DNAen las fibras de
clomatina, En estoserperimentos se analizaron por electroforesis
en gel fragmentos de DNA generadospor digestión con nucleasaa
partir de cromatina de hígado de rata. El descubrimiento de que los
fragmentos de DNA son multiplos de 200 pb sugiereque las
histonas seagrupan a intervalos de 200 paresa lo largo del DNA
confiriendo por ello un patrón regular de protección contra la
digestión por nucleasa.
cromatina que había sido parcialmente degradadacon nucleasade
micrococo sefraccionó por centrifugación en gradiente de
densidad (gráfico central). Los picos individuales se analizaron
entoncespor microscopía electrónica (abajo) y por electroforesisen
gel, tras eliminar las proteínas de la cromatina (arriba). El pico de la
derechaconsisteen partículas individuales de proteína asociadas
con 200 paresde baJesde DNA, el pico centralconsisteen grupos
de dos partículas asociadascon 400 paresde basesde DNA y el pico
de la izquierda consisteen grupos de tres partículas asociadascon
600 paresde basesde DNA. Esto indica que la unidad básica
repetida de la cromatina esuna partícula de proteína asociadacon
200 paresde basesde DNA.

586 Capitulo
18 Baseestructural
dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
aislabael DNA de estasfraccionesy seanalizabapor elec-
troforesisen gel,el DNA procedentedela fracciónquecon-
tenía sólo partículasmedía200 pb de largo,el DNA de la
fracción que conteníalos grupos de dos partículasmedía
a00 pb de largo,etc.De estoshallazgosse concluyóque
cadauna de las partículasesféricasobservadasen las mi-
crografíaselectrónicasestabaasociadaa 200 pb de DNA.
Estaunidad básicarepetida,que contieneaproximada-
mente 200 pb de DNA asociadocon una partículaprotei-
ca,esel nucleosoma.
está formadopor un octámero
El núcleodel nucleosoma
de histonas
Los primeros indicios sobrela organizaciónmoleculardel
nucleosomaprocedendel trabajode Kornbergy suscola-
técnicasparaensamblar
boradores,quienesdesarrollaron
nucleosomas a partir demezclas purificadasdeDNAypro-
teína.Descubrieronque sepodíangenerarfibrasde cro-
matina compuestas por nucleosomas mezclandoel DNA
conlascincohistonas.Sinembargo,cuandointentaronusar
lashistonaspurificadasde maneraindividual,descubrieron
quelos nucleosomas sóloseensamblaban cuandosehabían
purificado las histonasmediantetécnicassuavesque deja-
ban a la histonaH2A unida a la histonaH2B,y la histona
H3 unidaa la histonaH4. CuandoestoscomplejosH3-H4
yH2A-H2B semezclabancon el DNA, sereconstituíanfi-
bras de cromatinacon una estructuranucleosomalnor-
mal.Portanto,Kornbergconcluyóquelos complejosdehis-
tonas H3-H4 y H2A-H2B eran una parte integral del
nucleosoma.
Parainvestigarcon mayorprofundidadla naturalezade
las interacciones entrelas histonas,Kornbergy su colega,
JeanThomas,trataronla cromatinaaisladacon un reacti-
vo químico que forma enlacescovalentesentre moléculas
proteicaslocalizadas una al ladode otra.Despuésdel trata-
miento con estereactivo,las proteínasancladasquímica-
menteseaislarony analizaronpor electroforesisen gel de
poliacrilamida.Con respectoa los complejosproteicos,en
talesgelessehizo patenteel tamañode ocho moléculasde
histona,sugiriendoque laspartículasnucleosomales con-
tienenun octómero de ochohistonas.Unavezquesesupo
quelashistonasH3-H4 y lashistonasH2A-H2Bformaban
complejosunidos estrechamente y que estascuatro histo-
nas estabanpresentesaproximadamenteen cantidades
equivalentesen Ia cromatina,Kronbergy Thomaspropu-
sieronquelos octámerosde histonassecreabanparaman-
tenerjuntosdosdímerosH2A-}J2By dosdímerosH3-H4,
y que la doble hélicede DNA seenvolvíaentoncesalrede-
dor del octámeroresultante(Figura18.20).
Un temano tratadopor el modeloprecedenteestárela-
cionadoconla importanciadela histonaHl, queno forma
parte del octámero.Si los nucleosomasindividualesseais-
lan digiriendorápidamentela cromatinacon la nucleasade
micrococcus, la histonaHl todavíaestápresente(junto a las
.Cuenta" de nucleosoma
(B moléculasde histonas
l',Xl#1033'i'"1"*o
Figura18.20 La estructuradel nucleosomacon mayol
detalle, Cada nucleosomaconsisteen ocho moléculasde histona
(dos de cadauna de las histonas }{ZA,HZB, H3 y Ha) asociadascon
146 paresde nucleótidos de DNA y un tramo de DNA espaciador
de aproximadamente 50 paresde nucleótidos de longitud. El
diámetro de las <cuentas>del nucleosoma o partícula central es de
alrededor de l0 nm. Secree que la histona Hl (no representada)se
une al DNA espaciadory facilita el empaquetamiento de los
nucleosomasen fibras de 30 nm.
otrascuatrohistonasy a las200pb de DNA). Cuandola di-
gestiónsellevaa cabodurantemástiempo,el fragmentode
DNA sesiguedegradandohastaque alcanzauna longitud
de aproximadamente 146pb; durantelos pasosfinalesdel
procesode digestión,seliberala histonaH1. La partícula
quequedaconstade un octámerodehistonasasociadoa un
DNA de 1a6pb sedenominapartículacentralo núcleodel
nucleosoma. EI DNA quesedegradadurantela digestiónde
200a 146pb de longitud sedenominaDNA espaciador, de-
bido a queune un nucleosoma al siguiente(Figura18.20).
Puestoquela histonaHl seliberacomoconsecuencia dela
degradacióndel DNA espaciador, sepiensaque lasmolé-
culasde histonaHl estánasociadas a estaregión.La longi-
tud del DNA varíaun tantoentreorganismos, peroel DNA
asociadoal núcleo del nucleosomasiempremide cercade
146pb,lo queessuficientecomoparaenrollarsealrededor
de la partículacentralaproximadamente 1,7veces.
Los nucleosomasse empaquetanparaformatfibms de
cfomat¡nay clomosomas
La formación de nucleosomasessólo el primer pasoen el
empaquetamiento delDNA nuclear(Figura18.21).Lasfibras
de cromatinaaisladasdispuestas en <collarde cuentas>mi-
den unos 10 nm de diámetro, pero, con frecuencia,la cro-
matina de lascélulas intactasforman una fibra ligeramente
más gruesa, de unos 30 nm de espesor, denominadafibrade
cromatina de 30 nm. En preparaciones de cromatinaaisla-
da,lasformasde i0 30y nm de cromatina sepuedeninter-
convertircambiandoIa concentración de salesdela solución.
Sin embargo,la fibra de 30 nm no se forma en preparacio-
delDNA
Emoaouetamiento 587
 Doblehélicede DNA
I,.'
B ill("'
l,o.'
Hisronas==-Si "Cuenta"de
nucleosoma

(a) Nucleosomas
("collarde cuentas")

I,,.'
,rl'

fo

(b) Fibrade cromatina

de 30 nm Nucleosoma
.-----l-
AN F
J/nl
Mla!¿^n"
Dominio
en oucte

"'
l.oo
(c) Dominios
en bucle

(d) Heterocromatina

*l-- Cromátidas
J^,.,
m
{*]ffi
"'
l,ooo
(e) Cromosoma
duplicado,altamente
condensado,
de unacélulaen división

Figuta18.21 Nivelesde empaquetamiento de la cromatina, Estosdiagramasy METs muestranun modelo actualde los estadiosprogresivos
de enrollamientoy plegamientode DNA, que culminan en el cromosomaaltamentecompactadode una célu1aen división. (a) <Collarde
cuentas),una configuraciónextendidade nucleosomasformado por 1aasociaciónde DNA con cuatro tipos de histonas.(b) La fibra de
cromatinade 30 nm, representada aquí como una agrupaciónde nucleosomasestrechamente empaquetados. La quinta histona,Hl, podría
localizarseen el interior de la fibra. (c) Dominios en forma de bucle de fibras de 30 nm visiblesaquí a MET ya que un cromosomamitótico
seha desenrolladoexperimentalmente. (d) Heterocromatina,cromatinaaltamenteplegadaque esvisible como puntos diferenciadosincluso
en célulasen interfase.(e) Un cromosomareplicado(dos cromátidasunidas) de una céluiaen división,con todo el DNA del cromosomaen
forma de heterocromatina altamente comoactada.

s88 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celular:
DNA,cromosomas
v el núcleo
nesde crornatinaen lasquesehan retiradolasmoléculasde
H1, sugiriendoque la histonaHl facilita el empaqueta-
miento de los nucleosomas en fibrasde 30 nm. Sehan pro-
puestovariosmodelosparaexplicarcómo los nucleosomas
individualesseempaquetan paraformar una fibra de 30nm.
La mayoriade los primerosmodelosproponíanque la ca-
denade nucleosomas girabasobresí mismaparaformar al-
gún tipo de estructuraenrollada.Sin embargo,estudiosre-
cientessugierenque la estructurade la fibra de 30 nm es
mucho menosuniforme de lo que sugiereel modelode en-
rollamiento.En vezde esto,pareceque los nucleosomas de
la fibra de30nm seempaquetaban demanera que formaban
una estructuratridimensional,irregular,en forma de zigzag
que puedeinterdigitarsecon susfibrasvecinas.
El siguientenivel de empaquetamientode la cromatina
esel plegamientode las fibras de 30 nm en dominios con
buclesquetienenaproximadamente entre50.000y 100.000
pb de longitud.Estadisposiciónen buclessemantienepor
el acoplamiento periódicodel DNA a una red insolublede
proteínasno histónicas, que forman tn andamiajeprotei-
co al cualseunen los buclesmáslargosdel DNA. Los do-
miniosconbuclessevencon mayorclaridaden microgra-
fías electrónicasde cromosomasde célulasen división
aislados quesehan tratadoparaeliminartodaslashistonas
y la mayoríade las proteínasno histónicas(Figura 18.22).
Losbuclestambiénseobservanen cromosomas especiali- '
,t",'--_]
zadosno asociadoscon el procesode la división celular
(véasela discusiónsobrelos cromosomaspoliténicosdel figwa L8.22 Micrografiaelecfónicaquemuestrael armazón
Capítulo23).En estoscasos,los buclesde cromatinacon- proteicoquequedatraseliminarlashistonasde loscromosomas
tienen regiones<activas>de DNA -es decir,DNA que se humanos.El DNA cromosómicosemantieneunido al armazín
estátranscribiendo-. Eslógicoqueel DNA activoestéem- comounaseriedebucleslargos.La flechaseñalauna regióndonde
puedeverseclaramenteun bucledela moléculade DNA (MET).
paquetadode maneramás compactaque el DNA inactivo
debidoa que asísele facilitaríael accesoa lasproteínasim-
plicadasen la transcripcióngénica. Usando el índice de empaquetamiento del DNA sepue-
Inclusoen lascélulasen lasquelos genesseestántrans- de cuantificar la medida en la que sepliega una molécula de
cribiendode maneraactiva,cantidadessignificativas decro- DNA en la cromatina y en los cromosomas.Esteíndice de-
matinapuedenestarmuy compactadas (Figura18.21d).El termina la longitud total de una molécula de DNA exten-
grado de plegamientoen estascélulasvaria de forma con- dida dividida por la longitud de la fibra de cromatina o del
tinua. Los segmentosde cromatinacompactadosfuerte- cromosoma en el que se ha empaquetado.El enrollamien-
mentequeaparecen comopuntososcurosen lasmicrogra- to inicial del DNA alrededor de los núcleos de histona de los
fíassedenomina heterocromatina, mientrasque la forma nucleosomas reduce Ia longitud por un factor de aproxi-
de cromatinamás difusa y menos empaquetada se deno- madamente siete,y la formación de la fibra de 30 nm tiene
mina eucromatina (véaseFigura La
18.26a). heterocroma- como resultado una condensaciónde seisvecesmás. El ín-
tina más empaquetadadensamentecontieneDNA que es dice de empaquetamientode la fibra de 30 nm es por tan-
inactivotranscripcionalmente, mientrasque Ia eucromati- to de aproximadamente 7 X 6 : 42.Unplegamiento y un
na empaquetadamás laxamentese asociacon DNA que enrollamiento posterior proporcionan el índice de empa-
estásiendotranscrito activamente.La mayoriade la cro- quetamiento total de la eucromatina típica en aproximada-
matina en lascélulasactivasmetabólicamenteestánempa- mente T50.Paralaheterocromatinay para los cromosomas
quetadaslaxamente,en forma de eucromatina,pero a me- de las células en división, el índice de empaquetamiento es
dida que la célula se prepara para dividirse, toda esa todavía superior. Por ejemplo, en el momento de la división
cromatinasevuelvemuy compacta,generandoun grupo de celular, un cromosoma humano típico mide alrededor de 4-
cromosomas distinguiblesal microscopio.Debidoa queel 5 mm de longitud pero contiene una molécula de DNA que
DNA del cromosomaseha duplicadorecientemente, cada podría medir casi 75 mm si se extendierapor completo. El
cromosomasecomponede dosunidadesduplicadas deno- índice de empaquetamiento para un cromosoma de este
minadascromátidas (Figura18.21e). tipo cae en el rango de 15.000a 20.000.

Emoaouetamiento
delDNA 589
Loseucadotas tambiénempaquetan
algodesu DNAen r-:-f.i:?n.*:¡
y cloroplastos
mitocondilas
No todoel DNAdeunacélulaeucariota
estáincluidoenel
núcleo.Aunqueel DNA nuclearcontienela mayorpartede
lÍ.i:i.l:iÉ
ffi
ffi
la información genéticade la célula,las mitocondriasy los
cloroplastostambién contienenalgo de DNA, junto a la
maquinaria necesariapara replicar,transcribir y traducir
la informacióncodificadapor éste.Lasmoléculasde DNA
queresidenen lasmitocondriasy en los cloroplastos están
desprovistas dehistonasy normalmentesoncirculares(Fi- ,f.-,i
gura 18.23).En otraspalabras, separecenal genomade las :r
li
bacterias,comoseesperaría del probableorigenendosim-
biótico de estosorgánulos(tratado en el Cuadro de Texto
11A).Los genomasde las mitocondriasy los cloroplastos
tiendena serrelativamente pequeños,comparables en ta- trst'l
maño a un genomaviral. Además,ambosorgánulosson
Figura18.23 DNAmitocondrial. El DNA mitocondrial de la
semi-autónomos, capaces de codificaralgunospolipépti-
mayoría de los organismoses ci¡cular, como seve en esta
dos,pero dependendel genomanuclearpara codificarla micrografiaelectrónica.Estamoléculafue fijada durante el proceso
mayoríade ellos. de replicación.Las flechasindican los puntos en los que seestaba
Por ejemplo,el genomade las mitocondriashumanas desa¡rollandola replicacióncuando sefijó la moléculapara
MicroscopíaEiectrónica(MET).
consisteen una moléculade DNA circularque contiene
16.569paresdebasesy mide cercade 5 mm delongitud.Se
ha secuenciado completamente, y seconocensus37 genes. incluyesubunidades de NADH deshidrogenasa,citocromo
El RNA y los polipéptidoscodificadospor esteDNA son b, citocromoc oxidasay AIP sintasa(Figura18.24).
sólounapequeñafracción(deaproximadamente el50lo)del El tamaño del genomamitocondrialvaria considera-
númerode moléculasde RNA y proteínasnecesarias para blementeentreorganismos. Generalmente,
lasmitocondrias
la mitocondria.Sin embargo,éstaesuna contribuciónge- de los mamíferostienenalrededorde 16.500pb de DNA,
néticavital, entrecuyosproductosseincluyenlasmolécu- mientrasqueel DNA de lasmitocondriasde la levaduraes
lasde RNA presentes en los ribosomasmitocondriales, to- aproximadamentecinco vecesmayor y el DNA mitocon-
daslasmoléculasdel RNA de transferencianecesarias para drial de plantasesinclusomayorque eso.Sin embargo,no
la síntesisproteicamitocondrial,y 13 de las subunidades estáclaroquelosgenomasmitocondriales másgrandesco-
polipeptídicas del sistemadetransportedeelectrones. Esto difiquennecesariamente paraun númerode polipéptidos

tRNAPhE

tRNAGI,

lGenes de RNAribosómico
Figwa L8.24 El genomade la mitocondriahumana.
IGenes de RNAde transferencia La molécuia de DNA de doble cadenade la
TRNALCU lComplejo I Genes mitocondria humana escirculary contiene16.569
de la NADHdeshidrogenasa paresde bases.Estegenomacodificapara moléculasde
RNA ribosomal grandesy pequeñas,para moléculas
tRNA''E nComplejo lll Genesdel TRNALCU de RNA de transferencia(RNAI) (cadauno
CoenzimaQ-Citocromo cr tRNAS"'
TRNAGIY identificado con una abreviatura de tres letras cue
TRNAIVEI !Complejo lV Genes tRNAHI. corresponde al aminoácidoque transporta),y
de Ia citocromoc oxidasa subunidadesde varias de las proteínas que componen
IRNA''P los complejos del sistemade transporte de electrones
!Genes de la ATPsintasa mitocondriales. Los genesde los RNAt son muy cortos
TRNAAIA
tRNA^'P E DNA no codificante porque las moléculas de RNA que codifican contienen
tRNA^'V sólo alrededor de 75 nucleótidos. Obsérveseque hay
TRNACYS
dos genesde RNAI para la leucina y dos para Ia serina;
TRNATY'
éstoscodifican versionesligeramente diferentesde
RNAI para esosaminoácidos.El genoma mitocondrial
TRNASE' esextremadamentecompacto y con poco DNA no
TRNALEU TRNALYS codificante entre los senes.

s90 Capítulo
18 Baseestructural
de la información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
equivalentea esalongitud. Por ejemplo,la comparacióndel El núcleo
DNA mitocondrial de la levaduray humanos,sugiereque
la mayoríadel DNA adicionalpresenteen la mitocondriade Hastael momento,en estecapítulohemostratado al DNA
la levaduraconsisteen secuencias no codificadoras. comoel materialgenéticodela célula,al genomacomoa un
Normalmente,los cloroplastosposeenmoléculasde juegocompletode instruccionesde DNA paralascélulasde
DNA circulardeaproximadamente 120.000 bp delongitud una especie en particular,y al cromosomacomoIa manera
quecontieneunos 120genes. Ademásdel RNA ribosómico ffsicade empaquetarel DNA dentro de las células.Ahora
y detransferencia y delospolipéptidosimplicadosenla sín- llegamosal núcleo, el lugar dentro de la célula eucariota
tesisde proteínas, el genomadel cloroplastotambiéncodi- dondeselocalizany sereplicanloscromosomas y dondese
ftcaparaunnúmerode polipéptidosimplicadosde mane- transcribeel DNA que contienen.Además,el núcleoes'
ra específicaen la fotosíntesis.Éstas incluyen varios tanto el almacénde la mayoríade la información genética
componentes polipeptídicos delosfotosistemas I y II y una de la célula,como el centrode control parala expresiónde
delasdossubunidades dela ribulosa1,5-bifosfato carboxi- esainformación.
lasa,la enzimaquefija carbonoen el ciclode Calvin. El núcleoesuno de los rasgosmás prominentesy ca-
Curiosamente,la mayoríade los polipéptidoscodifica- racterísticosde las célulaseucariotas(Figura 18.25).Re-
dospor losgenomasmitocondriales o por losgenomasclo- cuerdeque el término eukaryonsignifica<núcleoverdade-
roplásticossoncomponentes deproteínasmultiméricasque ro>. La verdaderaesenciade una célulaeucariotaes su
tambiéncontienensubunidades codificadaspor el genoma núcleorodeadode membrana,que compartimentaliza las
nuclear.En otraspalabras,lasproteínasdelos orgánulosque actividadesdel genoma-tanto la replicacióncomo la
contienensubunidadescodificadasde ésteson normal- transcripción- del restodel metabolismocelular.En la si-
mente complejosproteicoshíbridos que contienenpoli- guientediscusión,primeronoscentraremos en la envuelta
péptidoscodificadosy sintetizados dentro del orgánuloy membranosaqueforma loslímitesdel núcleo.Después, des-
polipéptidoscodificadospor el genomanucleary quesesin- viaremosnuestraatenciónhacialos porosqueperforanla
tefizanpor ribosomascitoplásmicos. Estoplanteacuestio- enrrelta, haciala matriz estructuraldel interior del núcleo,
nesintrigantessobrecómo entranen el orgánulolos poli- haciala distribución de Ia cromatinay finalmentehaciaIa
péptidossintetizados enel citoplasma,un temasobreel que organización delnucleolo.La Figura18.26proporcionauna
volveremos en el Capítulo22. visión general de algunasde estasestructuras nucleares.

(a) Núcleode una célulaanimal (b) Núcleode una célulavegetal 5 ¡¿m

5pm

(a) (N) de
Figura18,25 El núcleo, El núcleo esuna característicaestructural prominente en la mayoría de las célulaseucarióticas. Núcleo
productora de insulina del páncreasde rata; de ahí la prominencia de los gránulos de secreción(SG) en
una célula animal. Esta esuna célula
(P) refleja su
el citoplasma. (b) Núcleo (N) de una céiula vegetal.Ésta esuna .é1u1"de un nódulo de ruíz de soja.La prominencia de plástidos
papel en el almacenamientode gránulos de almidón (METs).

Elnúcleo 591
El núcleoestá rodeadopor unaenvueltanuclearde doble
memblana
La existenciade una membranaalrededordel núcleosesu-
girió por primera veza finalesdel siglorux.Antesde la lle-
gadadel microscopioelectrónicoseconocíapocosobrela
estructurade estelímite membranosoya que la microsco-
pía ópticalo mostrabasolamentecomo un límite borroso
en la superficieexternadel núcleo.La microscopíaelectró-
nicadetransmisiónrevelóqueel núcleoestabarodeadopor
una envueltanuclearcompuestapor dosmembranas-la
membrananuclearinternay externa- separadas por el es-
pacio perinuclear que mide alrededorde 20-40nm de un
extremoa otro (véaseFigura 18.26b).Cadamembranatie-
ne entre7 y 8 nm de espesor y muestrala mismaaparien-
cia trilaminar que muestranla mayoríade las otras mem-
branas celulares.La membrana nuclear interna se apoya
sobreuna red de fibras de soportedenominadaslámina
nuclear(dela quesetratarámástardeen estecapítulo).La
membrananuclearexternacontinúa con el retículo endo-
plasmáticoproporcionandocontinuidad entre el espacio
perinucleary el lumen del RE.Al igual que las membranas
del RErugoso,la membranaerternaestácon frecuenciacu-
Cromatina
(a) - -
1É.m
Figura18.26 Organizaciónestructulal del núcleoy de la envuelta Porosnucleares
nuclear. (a) Micrografía electrónicadel núcleo de una célula
hepática de ratón con las característicasestructuralesprominentes
marcadas(MET). La envuelta nuclear consisteen unu dobl"
membrana perforada por poros nucleares(NP). Las estructuras
internas incluyen el nucleolo (nu), eucromatina (eu) y
heterocromatuna (he). (b) Dibujo de un núcleo típico. Las r
característicasestructuralesincluidas aquí pero no visibles en la
micrografia incluyen la lámina nuclea¡ los ribosomas en la
membrana nuclear externay la continuidad entre la membrana
nuclear externay el RE rugoso.
592 Capitulo
18 Baseestructural
dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
bierta de ribosomasimplicadosen la síntesisde proteínas.
En algunascélulas,los filamentosintermediosdel citoes-
queleto celular se extiendendesdela mdmbrana externa
haciael citoplasma,anclandoel núcleoa otros orgánuloso
a la membranaplasmática.
Una de las características
másdistintivasde la envuelta
nuclear esla presenciade aperturasespecializadas, deno-
minadaslos poros nucleares,que son especialmente fáci-
les de observarcuandoseexaminala envueltanuclearpor
criofractura(Figura18.27).Cadaporo esun canalcilíndri-
co pequeñoque seextiendea travésde ambasmembranas
dela envueltanuclear,proporcionandoasícontinuidaden-
tre el citosoly el nucleoplasma,el espaciointerior del nú-
cleo(apartede la regióndel nucleolo).La densidadde po-
ros (es decir, número por unidad de área de envuelta
nuclear)varía de forma importante con el tipo de célulay
la actividad.Un núcleode mamíferostípico,tiene entre
3.000y 4.000poros,o entre I0 y 20 porospor micra cua-
drada.
En cadaporo, las membranasinternay externade la
erurreltanuclearsefusionan,formando un canalque está
alineadocon una estructuraproteicaintrincada denomi-
Membrananuclear
externa
Membrana ,.",",," nucrear
Láminanuclear
nuclear
Nucleolo interna ]
Espacioperinuclear
Ribosomas
CrrosoL
RErugoso
(b)

Figuta L8.27 Porosnucleares. En estamicrografla de criofiactura
de la envuelta nuclear de una célula epitelial del riñón de rata se ven
numerosos poros nucleares(NP). El plano de fractura revelacaras
tanto de la membrana interna (A) como de la membrana externa
(B). Los bordes que señalanlas flechasrepresentanel espacio
perinuclear delimitado por las dos membranas (MET).
nadael compleio delporo nuclear (CPN). El diámetrodel
complejode poro en su conjunto esde unos 120nm. Tie-
ne una masaglobaldeunos 120miilonesde daltonsy cons-
ta de docenasde clasesdiferentesde subunidadespolipep-
tídicas.En las micrograftaselectrónicas,la caracterlstica
másllamativadel complejode poro esla disposiciónocto-
gonalde sussubunidades.Lasmicrografias,como las de la
Figura 18.28a,muestrananillos de ocho subunidadesdis-
puestassiguiendoun patrón octogonal.En otrasvistas,se
observaque las ocho subunidadessobresalentanto por el
lado citoplásmicocomo nucleoplásmicode la envuelta.Fí-
jeseen queseobservangránuloscentralesen algunosdelos
complejosde poro nuclearde la Figura 18.28a.Aunque
hubo un tiempo en el que sepensóque estosgránuloseran
partículasen tránsitoa travésde losporos,lasevidenciasre-
cientessugierenque son parte integrantedel complejo de
poro. Aparentementese pierden con facilidad durante el
procesamientode lasmuestrasparamicroscopía.
La Figura 18.28bilustra los principalescomponentes
del complejode poro nuclear.El examende estediagrama
revelaque el complejode poro en su conjunto tieneforma
de ruedapuestade lado en la envueltanuclear.Dos anillos
(a) Porosnuclearesen la envuelta O,25 ¡L.m
Membrana
externa
de la
envuelta
Transportador
nuctear
Fibra
Retículo
endoplásmico
Ribosomas CITOSOL
(b) Localizaciónde los poros nuclearesen la membrananuclear
Figura18.28 Estructuradel poro nuclear. (a) La tinción
negativa de una envuelta nuclear de un oocito revela el patrón
octogonal de los complejos de los poros nucleares.La flecha
señalaun gránulo central. Esta envuelta nuclear procede de un
oocito del tritón Tarichagranulosa(MET). (b) Un poro nuclear
se forma por la fusión de las membranas nuclearesinterna y
externa y estácontorneado por una intrincada estructura
proteica denominada complejo del poro nuclear. La estructura
tiene aproximadamente forma de rueda y simetría octogonal.
Dos anillos paralelos formados cada uno por ocho subunidades
(morado oscuro) delimitan el borde de la rueda. Ocho radios
(verde) conectan los dos anillos (dos de los radios se han
omitido en el dibujo) y se extienden hacia el transportador
central (rosa oscuro) en el eje de la rueda; el transportador
podría ser una estructura similar a un diafragma que se abre y
se cierra para permitir el paso de partículas de diferentes
tamaños. Las proteínas que se extienden desdeel ensamblajedel
borde y los radios hacia el espacioperinuclear probablemente
ayudan a fijar el complejo a la envuelta nuclear. Hay fibras que
se extienden por encima y por debajo del complejo formando
las del lado nucleoplásmico una cestade función desconocida,
El complejo del poro nuclear podría consistir hasta de cien
polipéptidos diferentes.
Elnúcleo 593
paralelosperfilan el borde de la rueda, cada uno consta de
las ocho subunidadesque seveían en las micrografíaselec-
trónicas.Ocho radios (en verde) seextiendendesdelos ani-
llos hacia el centro de la rueda (rosa oscuro), que forman el
gránulo central que se observabaen las micrografías elec-
trónicas.A estegránulo sele denomina normalmente trans-
portador ya que se piensa que mueve macromoléculas a
través de la envuelta nuclear. Se cree que las proteínas que
se extienden desde el borde hacia el espacio perinuclear
ayudan a anclar el complejo de poro a la enr,'uelta.Además,
las fibras se extienden desde los anillos hacia el citosol y
hacia el nucleoplasma,las que están del lado del nucleo-
plasma forman una cesta (a la que a vecesse denomina
<jaulu o <red>).
Lasmoléculasentrany salendelnúcleo
a tlavés
de losporosnucleafes
La enr,rreltanuclear es tanto la solución de un problema
como la fuente de otro. Es una manera de localizar los cro-
mosomasen una parte de la célula,y esun ejemplo de la es-
trategia general eucariota de compartimentalización. Pre-
sumiblemente, para el núcleo es ventajoso poseer una ba-
rreÍapara mantener en el interior a los cromosomasy para
dejar fuera a orgánulos como ribosomas,mitocondrias, li-
sosomasy microtúbulos. Por ejemplo, la envuelta nuclear
protege a los RNAs recién sintetizados de la actuación de los
orgánulos citoplasmáticosy de las enzimasantesde que se
haya procesadopor completo.
Al mismo tiempo que protege a los cromosomasy a las
moléculas de RNA inmaduro de la exposición al citoplas-
ma, Ia enl'uelta nuclear crea en las célulaseucariotaspro-
blemas formidables de transporte, desconocidospara los
procariotas.Todaslas enzimasy otras proteínasrequeridas
parala replicacióny transcripción del DNA en el núcleo, se
deben importar desdeel citoplasma,y todas las moléculas
de RNA y los ribosomas parcialmente ensambladosque se
necesitanpara la síntesisproteica en el citoplasmasedeben
obtener del núcleo (Figura 18.29). En respuesta a estos
problemas de transporte, se han desarrollado unos poros

Transcripcióny procesamientodel RNA Replicacióncromosómica

DNA

\e H
6/ --L- ó^+

Proteínas
necesarias
Proteínasnecesarias parala replicación
parala transcripción cromosomrca
Síntesisde proteínas

en
crecim¡eto

CITOPLASMA
g
ProteÍna
terminada

Figura18.29 Transportemaclomolecular haciay desdeel núcleo. Dado que 1ascélulaseucarióticasalmacenansu información genéticaen el
núcleo pero sintetizan proteínas en el citoplasma,todas las proteínas que senecesitanen el núcleo deben ser transportadashacia el interior
desdeei citoplasma(flechasmoradas),y todaslas moléculasde RNA y subunidadesribosómicasnecesarias para la síntesisde proteínasen el
citoplasma deben ser transportadashacia el exterior desdeel núcleo (flechasrojas). Las tres clasesde moléculasde RNAr que serequieren
para la síntesisde proteínas son el RNA ribosómico (RNAI), el RNA mensajero (RNAm) y el RNA de transferencia(RNAI).

594 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celuiar: y el núcleo
DNA,cromosomas
especializados que, prácticamente,median todo el trans- quecreaunabarrerade permeabilidad paramoléculascon
porte al interior y al exteriordel núcleo. un pesomolecular significativamentemayor de 20.000.
Parahacernosuna idea de cuántotráfico viaja a través Hastahacepoco,los investigadoresgeneralmente asumían
de losporosnucleares, consideraremos el flujo delassubu- que cadacomplejode poro nuclearteníauno solo de esos
nidadesribosomales desdeel núcleoal citoplasma. Los ri- canales. Sin embargo,ahora pareceque pueden ser8 cana-
bosomasestánparcialmenteensambladosen el núcleo les,separados 9 nm y localizadosen la periferiadel poro nu-
como dosclasesde subunidades, cadauna de lascualeses clear,entrelos radios,y quizásun canaladicionalen el cen-
un complejo de RNA y proteínas.Estassubunidadesse tro del transportador.Sepiensaque estoscanalesacuosos
muevenhaciael citoplasma y cuandosenecesitan parasin- sonpermeables al libre pasodemoléculaspequeñas e iones
tetizar proteínas,se combinan en ribosomasfuncionales (incluyendoproteínaspequeñas)debidoa que estassus-
que contienenuna subunidadde cadatipo. Una célulade tanciasatraviesanla envueltanuclearrápidamentedespués
mamíferoen crecimientoactivopuedesintetizarfácilmen- de serinyectadas enlascélulas. Además,losnucleósidos tri-
te unas20.000subunidades ribosomales por minuto.Yasa- fosfato necesariospara la síntesisde DNA y RNA proba-
bemosque una célulade estetipo tiene de unos 3.000a blementedifundenlibrementea travésde los poros,como
4.000porosnucleares, de maneraque las subunidades ri- lo hacenotrasmoléculaspequeñasnecesarias paralasru-
bosomales setransportanhaciael citoplasmaa una veloci- tasmetabólicas quefuncionanen el núcleo.
dad de aproximadamente 5-6 subunidades por minuto y
por poro.El tráficoen la direcciónopuestaes,si acaso, más Transporte act¡vodegrandesproteinas y de RNAa tlavésde los
denso.Cuando los cromosomas seestán replicando,sene- porosnucleates.Muchasde lasproteínasimplicadasen el
cesitanhistonasa una velocidad de 300.000 moléculas por empaquetamiento, replicacióny transcripcióndel DNA son
minuto.Lavelocidaddelmovimientohaciael interiordebe lo suficientemente pequeñas comoparapasara travésdeun
serademásde ¡unas100moléculasde histonapor minuto canalde 9 nm de ancho.Lashistonas,por ejemplo,tienen
ypor porolAdemásdetodo estetráficomacromolecular, los pesosmoleculares de 21.000o menosy deberíandifundir
porostambiénmedianel transportede partículas más pe- pasivamente a travésde los porosnucleares sin problemas.
queñas,moléculase iones. Sinembargo, algunasproteínasnucleares sonmuy grandes.
Lasenzimasimplicadasen la síntesisde DNA y de RNA,por
Difusiónsimplede pequeñas moléculasa tnvés de lospotosnu- ejemplo,tienensubunidades conpesosmoleculares queex-
cleares.La ideade quelasmoléculas pequeñas puedendi- ceden de los 100.000, que es demasiado grande parapasara
fundir librementeen ambossentidosa travésde los poros través de una apertura de 9 nm. Lasmoléculas de RNA men-
nuclearesrecibióapoyoexperimental, por primeravez,a sajerotambién suponen un reto,ya que abandonan el nú-
partir de estudiosen los que seinyectaronpartículasde oro cleounidasa proteínas, en forma de complejos RNA-pro-
coloidalde variostamañosen el citoplasmade células,que teína(nribonucleoproteínar) quesonbastantegrandes. Las
después, se examinaronal microscopioelectrónico.Poco subunidades ribosomales también se deben exportar hacia
después de la inyección,sepodíaver a laspartículasde oro el citoplasmadespués de habersidoensambladas en el nú-
pasandoa travésde los poros nucleareshaciael núcleo.La cleo.Claramente, el transportede todas estaspartículas a
velocidadde entradade las partículasen el núcleoestáin- travésde los poros nuclearesesun reto significativo.
versamenterelacionadacon el diámetrodela partícula-es Un buen grupo de evidenciassugierenque moléculasy
decir,cuantomásgrandeesla partículade oro, máslenta- partículastan grandes,sontransportadasactivamentea tra-
menteentraen el núcleo-. Laspartículasmayoresde 10nm vésde los porosnucleares, por un procesoselectivo. Como
de diámetro se excluyenpor completo.Puestoque el diá- el transporteactivoa travésdelasmembranasnormales,el
metro total de un complejodel poro nuclearesmayor que transporteactivoa travésde los poros nuclearesrequiere
el delaspartículasde oro, seconcluyóquelos complejosde energíae implica la unión específica delassustancias trans-
poro contienenpequeñoscanalesde difusiónacuosos a tra- portadasa proteínasdemembrana,queenestecasoforman
vésde los que semuevenlibrementelaspartículasy molé- partedel complejode poro.El mecanismomolecularsub-
culaspequeñas. yacentese entiendemejor en el casode proteínasque se
Paradeterminarel diámetrode estoscanales, los inves- transportanactivamentedesdeel citosolhaciael núcleo.Th-
tigadoresinyectaronproteínasradiactivasde varios tama- lesproteínasposeenuna o másseñalesde localizaciónnu-
ños en el citoplasmade las célulasy observaroncuánto clear (SLN),que son secuencias de aminoácidosque per-
tiempo le cuestaa dichasproteínasapareceren el núcleo.A miten quela proteínaseareconociday transportada por el
una protqínaglobularcon un pesomolecularde 20'000le complejode poro nuclear.Una SLN tiene normalmente
cuestasólounosminutosequilibrarse entreel citoplasma y una longitud de 8 a 30 aminoácidos y a menudocontiene
el núcleo,pero la mayoríade lasproteínas de 60.000 daltons prolina,asícomoaminoácidos (básicos) cargados positiva-
o másno soncasicapaces de penetraren el núcleo.Éstasy mente,comolisinay arginina.
otrasmedidas de transporte indicanquelos canalesde di- El papel que desempeñan las secuencias SLN en el
fusiónacuosos tienenunos 9 nm de diámetro,un tamaño direccionamiento de proteínashaciael núcleoseha esta-

Elnúcleo 595
blecidograciasa experimentos en dondepartículasde oro
de más de 9 nm de diámetro-demasiado grandescomo
paraatravesarlos canalesde difusiónacuososde los poros
nucleares- se cubrieroncon polipéptidosque contenían
SLN y seinyectabanen el citoplasmade ovocitosde ranas.
Despuésde estetratamiento,laspartículasde oro de hasta
26 nm de diámetrosetransportaban rápidamentea través
de los complejosde poro nuclearhaciael núcleo.Además,
el diámetromiíximo para el transporteactivoatravésde la
enrrelta nuclear parece ser 26 nm (frente a 9 nm para la di-
fusión simple). Ésteessólo uno de los numerososejemplos
en los que se ha encontrado que una secuenciacorta de
aminoácidos dirige a una molécula o a una partícula a un
sitio celular específico.
El procesopara transportar proteínascitoplásmicasha-
cia el núcleo a través de los poros nuclearesse ilustra en la
Figura 18.30a.En el paso @, una proteína citoplásmicaque
contiene una SLN es reconocida por un tipo de proteína

NUCLEO 6-DF) NÚCLEO

--7
lnan \
Carga liberada l_ GTP GTP
en el núcleo GEFT> GDP GDP

o :Mr
\-Éfi
v\\r\-/

NLS,,h proteínas
a transportar Cargaliberada
en el citosol
"carOa,,
(a) Ciclode importación (b) Ciclode exportación

Figura18'30 Transportea travésdel complejode poronucleat (a) Ciclo de importación. Lasproteínasfabricadasen el citosoly destinadas
Parasu uso en el núcleo contienenuna secuenciade locaiizaciónnuclear(SLN) que las marca como (carga) a transportara travésdel
complejode poro nuclear.O Una proteínaa transportarque contienela secuenciaSLN seune a importina y @ el cómplejoproteínaa
transportar-importinasetransportaa travésdel complejode poro nuclear.@ Ran-GTPnuclearseune a la importina deseniadenandola
liberaciónde ia proteínaa transportaren el núcleo.@ El complejo Ran-GTP-importinasetransportade vueltahaciael citosol,donde q¡ la
hidrólisis de GTP a GDP seacompañapor la liberaciónde importina. (b) Ciclo de exportación.La principal cargadeexportaciónnucleares
RN4.," lugar de proteínas,pero los RNAs se transportan generalmentehacia el exterior del núcleo mediante proteínas que contienen una
señalde exportaciónnuclear (SEN).Durante el ciclo de exportación,O Ran-GTPseune a la exportinaen el núcleo,lo que @ promueveIa
unión de la exportina a su €arga,en estecasoe1complejo RNA-proteína. @ El complejo exportina-carga-RNA-GTP se exporta a través de
los poros nucleareshacia el citosol, donde @, la exportina y su cargaseliberan de Ran, acompañadopor la hidrólisis de Gip a GDp. @ La
exportina r,'uelveentoncesa-lnúcleo, donde puede repetir el ciclo de exportación. Los cicios de imporiación y exportación seimpulsan por
un gradiente de concentración de Ran-GTP que semantiene por la presenciade un factor intercambiador de no.leótidor de guánina (ónf
del inglés, Guanine-nucleotideExchangeFactor) en el núcleo y una proteína activadora de GTPasa(GAP del inglés,GTpaseÁctivating
Protein) en el citosol.

596 Capitulo
18 Baseestructural
deIa'información
celular:
DNA,cromosomas
v el núcleo
receptoradenominadaimportina, que se une a la SLN y
rnediael movimiento de la proteínaque contienela SLN
hacia el poro nuclear,sirviendo las fibras citoplasmáticas
del poro, quizásde algunaforma, como carriles.En el paso
@, el complejoproteicoSlN-importina setransportaal
núcleopor el transportadordel centrodel complejodeporo
nuclear(CPN).Despuésde llegaral núcleo,lamoléculade
importina seasociacon la proteínaRanque seune a GTP.
Estainteracciónentreimportina y Ranprovocaquela pro-
teínaquecontienela SLNsealiberadaparasuusoen el nú-
cleo (paso@).EI complejoRan-GTP-importina setrans-
porta de vuelta a través de un poro nuclear hacia el
citoplasmalpaso@) dondela importina seliberaparasu
reutilización,acompañadade la hidrólisis de Ran unido a
GTP (paso@). Lasevidencias de queestepasode hidróli-
sisde GTR producela energíaparalaimportaciónnuclear
seobtienena partir de experimentos que muestranque el
transportenuclearsepuedeinhibir exponiendoa lascélu-
lasa análogosde GTPno hidrolizables, perono a análogos
de ATP no hidrolizables.
Parala exportaciónde materialal exteriordel núcleo,
operanmecanismoscomparables. La principal diferenciaes
que el transportehaciael exteriordel núcleoseusaprinci-
palmenteparalasmoléculasde RNA quesesintetizanen el
núcleoperoque funcionanen el citoplasma, mientrasque
la importaciónnuclearestádedicadaen gran parte,a im-
portar proteínasque se sintetizanen el citoplasmapero
funcionanen el núcleo.AunqueIa cargaprincipala trans-
portar en la exportaciónnuclear esRNA en lugar de que
proteínas, Ia exportaciónde RNA estámediadapor proteí-
nasqueseunena RNA.Estasproteínasde adaptaciéncon-
tienensecuencias de aminoácidos denominadas señales de
exportaciónnuclear(SEN),quedirigena la proteína,y por
extensiónal RNA que lleva unido, para exportarloa través
delosporosnucleares. Lassecuencias SENsereconocen por
proteínasreceptorasdel transportenucleardenominadas
exportinas,que se unen a moléculasque contienense-
cuenciasSENy mediansutransportehaciael exterior,a tra-
vésde porosnucleares, por un mecanismoquerecuerdaal
modo en que las importinastransportanmoléculascito-
plasmáticas al núcleo(Figura18.30b).
La diferenciaen la direcciónentreel transportemedia-
do por importinasy por exportinas,estáguiadopor la inter-
acciónentre Ran-GTPy estasdos clasesde moléculas,
acompañadopor un gradientede concentración de Ran-
GTP a travésde la envueltanuclear.La concentraciónde
Ran-GTPsemantieneelevadaen el interior del núcleogra-
ciasa un factor intercambiadorde nucleótidosde guanina,
(GEF),[del inglésGuanine-nucleotide ExchangeFactor]
quepromuevela unión de GTP a Rana cambiode GDP.Por
el contrario, el citosol contieneuna proteínaactivadorade
GTPasa(GAP) [del inglésGTPaseactivatingprotein] que
promuevela hidrólisisde GTPpor Ran,disminuyendoade-
más la concentraciónde Ran-GTPfuera del núcleo.Las
concentraciones relativamenteelevadasde Ran-GTPen el
núcleo tienen dos efectos:primero, la Ran-GTPnuclear
promueyeIa liberaciónde la carga,que contieneSLN,de la
importina(Figura18.30a; paso@); segundo, Ran-GTPnu-
clearpromuevela unión de la cargaque contieneSEN a la
exportina(Figura 18.30b;paso @). El resultadoneto es
que la direccióndel transportepara cualquiermoléculaa
transportarsedeterminapor el tipo de secuencia de desti-
no (SLN o SEN) que dicta si las importinas liberarán la
moléculatransportadaen el núcleoy la unirán en el cito-
plasma,o lasexportinasunirán la moléculaa transportaren
el núcleoy la liberaránen el citoplasma.
La matliznucleary la láminanuclearson esttucturas
de soportedel núcleo
Entre el 80y el 90olode la masanuclearestáconstituidapor
fibrasde cromatina,asíquesepodríaesperarqueretirarla
cromatinacausaraque el núcleosecolapsara en una masa
relativamente desestructurada.Sin embargo,a principiosde
los 70,los investigadores descubrieron quedespués de que
más del 95o/o de la cromatinasehubieraretiradopor una
combinaciónde tratamientoscon nucleasay detergente
permanecía una red fibrosainsolublequereteníapor com-
pletola forma del núcleo.Sepensabaqueestared denomi-
nada,la matriz nuclear (o nucleoesqueleto), ayudabaa
mantenerla formadel núcleoy proporcionaba un esquele-
to organizadorpara las fibras de cromatina.Sin embargo,
la existenciadela matriz nuclearno ha sidoaceptada por to-
dos los biólogoscelulares. Las fibras son sólo visiblesen
ciertasmicrografías(Figura18.31),llevandoa los escépti-
cosa cuestionarse si sonartefactosintroducidosduranteel
procesamiento de Ia muestra.
En los últimos años,evidencias adicionales han refor-
zadola idea de la existenciade una matrízestructuralque
organizalasactividadesdel núcleo.Por ejemplo,sesugiere
una conexiónestrechaentre la matriz y las fibras de cro-
matinadebidoal descubrimiento de quelaspreparaciones
de matriz nuclearaisladas,siemprecontienenpequeñas
cantidades de DNA y RNA unidasestrechamente. Lastéc-
nicasde hibridaciónde ácidosnucleicoshan reveladoque
el DNA unido íntimamentees rico en secuencias que se
transcribendeforma activaen RNA.Además,cuandosein-
cubanlascélulascon timidina-H3,un precursorradiactivo
parala síntesisde DNA, seobservaque el DNA radiactivo
recién sintetizadoestáasociado,de forma preferente,a la
matriz nuclear.Estasobservaciones sugierenque la matriz
nuclearpuedeestarimplicadaen el anclajede las fibrasde
cromatinaa localizacionesdonde el DNA o el RNA están
siendosintetizados, organizandode estemodo al DNA para
que serepliquey setranscribade forma ordenaday quizás
incluso proporcionandocarrilesque guíeny propulsenal
RNA mensajeroreciénformado hacialos poros nucleares
para transportarlosal citoplasma.
MientrasqueIa naturalezaexactayla significaciónfun-
cional de la matriz nuclearsemantienensin esclarecer. el
Elnúcleo 597
 Citoplasma

Fibrasde la
matr¡znuclear

Láminanuclear

(a) Uniónde las fibrasde la matriz 1pm (b) Vistlsuperficialde la lámina -iñ--
nucleara la láminanuclear nuclear

Figuta18.31 [a matÍz nuclea]y la láminanuclear. (a) Estamicrograffa electrónicade una parte del núcleo de una célula de mamífero
muestra una red ramificada de filamentos de la matriz nuclear atravesandoel núcleo. Estosfrlamentos parecenestarpegadosa Ia lámina
nuclear,la densacapa de filamentos que limita el lado del nucleoplasmáticode la enrrelta nuclear. (b) Vista superficial de la lámina nuclear
de un oocito de rana (METs).

núcleocontieneotra estructurafibrosacuyopapelha sido cromatinacorrespondientes a los cromosomas individua-

definido con mayor claridad.Estaestructuradenominada
la lámina nuclear,esuna red de fibras densay fina que li-
mita la superficieinterna de la membrananuclearinterna
y que ayudaa sostenera la envueltanuclear.La lámina nu-
cleartieneun espesorde entre10y 40 nm y estáconstrui-
da con filamentosintermediosfabricadoscon proteínasde-
nominadas lóminas (tratadas en mayor detalle en el
Capítulo15) . Al menosalgunosde estosfilamentosparecen
estarunidosa proteínasde la membrananuclearinterna.
Ademásde proporcionarsoporteestructuralpara la en-
vuelta nuclear,Ia lámina nuclear puedetambién propor-
cionarlugaresde anclajeparalacromatina,un temaal que
nosreferiremosen la siguientesección.
les ocupan compartimentosdiferenciadosdentro del nú-
cleo,referidoscomo <territorioscromosómicos> (Figura
18.32).Sin embargo,lasposicionesde estosterritoriosno
parecenserfijas.Varíande célulaa céluladel mismo orga-
nismoy parecencambiarduranteel ciclo devida de una cé-
lula,reflejandoquizáscambiosen Ia actividadde los genes
de los diferentescromosomas.
La envuelta nuclear ayuda a organizarla cromatina
uniendo ciertossegmentosa sitiosespecíficos de la super-

Lasfibrasde cromatinano estándispersasal azal

en el núcleo
Apartedel momentode la divisióncelular,lasfibrasde cro-
matina de una célulatiendena estarmuy extendidasy dis-
persasen el núcleo.Además,sepodríasuponerque lasfi-
bras de cromatinaque correspondena cadacromosoma
individual sedistribuyenal azary estánmuy entrelazadas
dentrodel núcleo.Quizás,de forma sorprendente, estepa-
receno serel caso.En vezde eso,la cromatinade cadacro-
mosomaaparentemente tiene su propia localización.Esta Figura18,32 Teritorios ctomosómicos. Las célulasde pulmón de
ideasepropusopor primeravezen 1885,pero laseviden- ratón se tiñen con colorantesfluorescentesligados a sondasde
ciasde que escierto en una gran variedadde célulasespe- ácidos nucleicos que hibridan específicamentecon el DNA del
rabana lastécnicasde la biologíamolecularmoderna.Re- cromosoma12 (rojo), cromosoma14 (verde)o cromosoma15
(azul). Estavista de un solo núcleo observadoa microscopía óptica
cientemente, utilizandosondasde ácidosnucleicosoue se muestra que el DNA de cada cromosoma selocaliza en una región
hibridan con el DNA de cromosomasespecíficos, varios específicadel núcleo (cada cromosoma estápresenteen dos
grupos de investigaciónhan demostradoque las fibras de copias).

598 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
ficie interna de la envuelta, asociados estrechamente a los Fibrillas Gránulos
poros nucleares.Los segmentosde cromatina que se unen
de esta forma están muy compactados -es decir, son hete-
rocromatina-. En las micrografias electrónicas,estemate-
rial aparececomo una capa oscura irregular alrededor de la
periferia nuclear, como se ve en la Figura 18,26a.La mayo-
riaparece ser del tipo denominado heterocromatina cons-
titutiva, que apareceen una forma altamente condensada,
prácticamente todo el tiempo, en todas las células del orga-
nismo. El DNA de la heterocromatina constitutiva consiste
en DNA repetido de secuenciasimple (recuerdeque éstas
son secuenciascortas que se repiten en tándem y que no se
transcriben). El centrómero y el telómero son dos regiones
importantes del cromosoma compuestas por heterocro-
matina constitutiva. En muchos casos,los telómeros del
cromosoma -5ssusnsi¿s de DNA altamente repetidaslo-
calizadasen los extremos de los cromosomas- se unen a
la envuelta nuclear en momentos diferentes a los de la di-
visión celular.
A diferencia a la heterocromatina constitutiva, la hete-
rocromatina facultativa varía con las actividades concretas
realizadaspor la célula. Incluso, difiere de tejido a tejido, e
incluso puede variar a vecesen una célula dada. La hetero-
cromatina facultativa parece representar las regiones del F--
cromosoma que se han inactivado específicamenteen un 1
"'r------
tipo celular concreto.Normalmente la cantidad de hetero- Figura 18.33 Elnucleolo.El nucleoloesunaestructura
cromatina facultativa es baja en las células embrionarias intranuclear prominente. Esunamasadefibrillasy gránulos. Las
pero puede ser importante en células muy diferenciadas.La fibrillassonDNA y RNAI;los gránulossonsubunidades
formación de heterocromatina facultativa puede ser además ribosomales de recienteformación.Aqul semuestrael nucleolode
unaespermatogonia, una célulaqueda lugara losespermatozoides
una manera fundamental de inactivar bloques enteros de (MET).
información genéticadurante el desarrollo.

riormente exportadasa travésde los poros nucleareshasta

El nucleoloestáimplicadoen la fomaciónde los ribosomas el citoplasma.Debido a su papel en la síntesisde RNA, los
Un componenteestructuralrelevantedel núcleoeucariota nucleolos se marcan radiactivamente con intensidad cuan-
esel nucleolo,la fábricade ribosomasde la célula.Lascé- do las células se exponen a precursores de RNA radiactivos
lulas eucarióticastípicascontienenuno o dos nucleolos, (Figura 18.34).
pero la presenciade más no es infrecuente;en ciertassi- La primera evidencia que asociaba al nucleolo con la
tuaciones,cientoso inclusomilespuedenestarpresentes. formación de los ribosomasfue aportadaa principios de los
Normalmente,el nucleolo es una estructuraesféricaque años 60 por Robert Perr¡ que empleó un microhaz de luz
mide variasmicrasde diámetro,pero seobservangrandes ultravioleta para destruir el nucleolo de células vivas. Tales
variacionesen forma y tamaño.Debidoa su grantamaño células perdieron su capacidad para sintetizar rRNA, sugi-
relativo,los nucleolosseven fácilmenteal microscopioóp- riendo que el nucleolo está implicado en la producción de
tico y seobservaron por primeravezhacemásde 200años. ribosomas.Surgieron evidencias adicionalesa partir de es-
Sin embargo,los componentes del nucleolo tudios realizados
estructurales por Donald Brown y |ohn Gurdon en la
no se identificaron con claridad hastaIa llegadadel mi- rana de uñas africana, Xenopus laevis. Através de cruces ge-
croscopioelectrónicoen los años50.En micrografías elec- néticos es posible producir embriones de Xenopus a cuyas
trónicasde cortesfinos,cadanucleoloaparececomoun or- células les faltan los nucleolos. Brown y Gurdon descubrie-
gánulo sin membranaque consisteen fibrillas y gránulos ron que tales embriones, denominados mutantesanucleo-
(Figura18.33).LasfibrillascontienenDNA que estásien- lados, no podían sintetizar rRNA y por tanto morían du-
do transcrito en RNA ribosómico(rRNA), el componente rante el desarrollo temprano, implicando otra vez al
RNA de los ribosomas.Los gránulosson moléculasde nucleolo en la formación de ribosomas.
rRNA empaquetadoscon proteínas(importadasdesdeel Si el rRNA se sintetiza en el nucleolo, entonces las se-
citoplasma)paraformar subunidades ribosomales.Como cuencias de DNA que codifican para este RNA deben resi-
hemosvistoantes.lassubunidades ribosomalessonposte- dir también en el nucleolo. Esta predicción se ha verificado

Elnúcleo 599
 Nucleolos
r4
.$;.
# rr'
r +
: qI
--1olrr-
Figura18.34 El nucleoloes un lugarde sÍntesisde RNA, Para
demostrar el papel 9el nucleolo en la slntesisdel RNA, sele inyectó
a una rata citidina-'H, un precursor de RNA marcado
radiactivamente.Cinco hoias más tarde, se retiró el tejido hepático
y se sometió a una autorradiografia. Los puntos_negrossobre los
núcleosde estaautorradiograffaindican que el'H seconcentraen
el nucleolo (MET).
mostrandoque los nucleolosaisladoscontienenuna re-
gión organizadoradel nucleolo (NOR del inglésnucleolus
organizerregion),un tramo de DNA que lleva copiasmúl-
tiplesde los genespara rRNA. Estosgenesmúltiplespara
rRNA aparecenen todos los genomase incluso son un
ejemplosignificativode DNA repetidoque porta informa-
ción genética.El númerodecopiasdelos genesderRNA va-
ría de forma significativaentre especies,
las célulasanima-
les,a menudo,contienencientosde copiaspero las células
deplantasnormalmentecontienenmilesde copias.Lasco-
piasmúltiplesseagrupanen uno o másNOR, quepueden
residiren másde un cromosoma;en cadaNOR, lascopias
múltiplesdel gen se disponenen tándem.Un único nu-
cleolopuedecontenergenesde rRNA derivadosde másde
un NOR. Por ejemplo,el genomahumano tiene cinco
NORspor cromosomahaploide,o diezpor núcleodiploi-
de,cadauno localizadocercadel extremode un cromoso-
ma diferente.Peroenvezde dieznucleolosseparados, el nú-
cleo humano típico tiene un único nucleolograndeque
contienebuclesde cromatinaderivadosde diez cromoso-
masseparados.
600 18 Baseestructural
Capitulo de la información
celular:
DNA,cromosomas
El tamañodel nucleoloestárelacionadocon su nivel de
actividad.En lascélulasquetienenuna elevadatasade sín-
tesisde proteínasy por tanto necesidad de muchosriboso-
mas,los nucleolostiendena sergrandesy cuentancon en-
tre un 20y un25o/odelvolumentotaldel núcleo.En células
menosactivas,los nucleolossonmuchomáspequeños. La
principal diferenciaesla cantidadde componentegranular
presente.Las célulasque producen muchos ribosomas
transcriben, procesan y empaquetan grandescantidades de
rRNA y tienennivelesmásaltosde subunidadesribosoma-
lesparcialmente completas y estables disponiblesen el nu-
cleolo,a lo que debe su destacadocomponentegranular.
El nucleolodesaparece durantela mitosis,por Io menos
en lascélulasde plantassuperiores y de animales.A medi-
da que la célulaseaproximaa la división, la cromatinase
condensa en cromosomas compactos, estehechova acom-
pañadopor la reduccióny posteriordesaparición del nu-
cleolo.Esto se ajustaperfectamentea nuestrosconoci-
mientos actualessobre la composicióny función del
nucleolo:los buclesde cromatinadel nucleoloextendidos
dejande sertranscritosa medidaque seenrollany seplie-
gany cualquierproteínaribosomalo rRNA remanentese
dispersao sedegrada. A medidaquela mitosistermina,la
cromatinasedesenrolla, las regionesNOR forman bucles
otra vez,y la síntesisde rRNA continúa.En lascélulashu-
manas,esla únicaocasiónenla quelasl0 regionesNOR de
los núcleosdiploidesson evidentes; a medidaqueIa sínte-
sisde rRNA empiezaotravez,sehacenvisiblesdiezpeque-
ños nucleolos,cercadel extremode cadauno de los diez
cromosomas. A medidaqueestosnucleolossehacengran-
des,sefusionanrápidamente en el únicogrannucleoloque
seobservaen lascélulas humanas queno estánen proceso
de división.
Aunquesu función principal estáclaramenterelaciona-
da con la producciónde ribosomas,el nucleolocontieneal-
gunasmoléculascuyapresenciasugiereun papelenotrasac-
tividadesadicionales, talescomo la exportacióndesdeel
núcleo,la modificaciónquímica de pequeñosRNAs,e in-
cluso el control de Ia división celular.Los microscopistas
también han identificadovarios tipos de cuerposnucleares
pequeñosque,como el nucleolo,son estructurasno rodea-
daspor membranacompuestas por pequeñasfibrasy/o grá-
nulos con configuraciones peculiares.Sehan caracterizado
variostiposde cuerposnucleares, cadauno contieneun gru-
po diferentede proteínasresidentes. Aunquelos detallesno
seconocenbien,sepiensaquelos cuerposnuclearesdesem-
peñandiversospapelesrelacionados con el procesamientoy
manejode moléculasde RNA producidasen el núcleo.
y el núcleo
El descubrimientodel DNA seremontaa
Ios primeros estudiosde Miescher,pero
no fue hastamediadosdel siglo xx cuan-
do los experimentosen bacteriasde tipo
neumococoy experimentosen el bacte-
riófago T12 revelaroncon claridadque el
DNA era el material genético.A estetra-
bajo le siguióel esclarecimiento por Wat-
sony Crick de la estructuraen doblehéli-
ce del DNA, uno de los puntos de
referenciade la biología del siglo xx. Los
puentesdehidrógenoquemantienenuni-
daslas dos hebrasde la doble hélicesólo
ajustancuandola baseA seemparejacon
T,y la baseG seemparejacon C. Debidoa
quelasdoshebrassemantienenjuntaspor
puentesno covalentesrelativamentedé-
biles,lasdoshebrassepuedensepararfá-
cilmentedurantela replicacióndel DNAy
la síntesisde RNA.
Los biólogos moleculareshan des-
arrollado diversasherramientaspodero-
sasparaestudiarel DNA. Por ejemplo,las
enzimasde restricciónaisladasa partir de
bacterias,se puedenusar para cortar el
DNA en fragmentosreproducibles, lo su-
ficientementecortos como para ser fácil-
mentemanipulablesen el laboratorio.En
estecapítulo,describimoscómo el uso de
lasenzimasde restricciónhacemássenci-
llo el estudiode la estructurade lasmolé-
culasde DNA muy largas.Más tarde,en el
Capítulo20,veremos cómolasenzimasde
restricciónsontambiénIa claveparahacer
DNA recombinante.
EI DNA (o RNA para algunosvirus)
que constituyeun juego completode la
informacióngenéticade un organismose
denominasu genoma.Parala mayoríade
virusy procariotas, el genomaconsisteen
una moléculade DNA sencillao en un
número pequeñode ellas.Los eucariotas
tienen un senomanucleardividido entre
múltiples cromosomas,cadauno de ellos
tiene una molécula de DNA muy larga.
Loseucariotastambiéntienenun genoma
mitocondrial,y en el casode lasplantasun
genomacloroplástico. Losbiólogosmole-
culareshan desarrolladodiversasherra-
mientaspoderosasparaestudiarlos geno-
mas. Por ejemplo, las enzimas de
restricciónaisladasde lasbacterias,sepue-
den usarpara cortar el DNA en fragmen-
tos reproduciblesque son lo suficiente-
mente cortos como para ser fácilmente
manipulablesen el laboratorio.Lastécni-
casde secuenciación automáticade DNA
han permitido a los científicosdetermi-
nar la secuencia de basescompletade los
genomasde numerososorganismosdesde
Iasbacterias a loshumanos.Unade lasca-
racterísticasmás llamativasde los geno-
masnucleares de los eucariotas,
especial-
mentedelos organismosmulticelulares, es
la enormefracciónde DNA que no codi-
fica para RNA ni para síntesisde proteí-
nas.La mayoríade DNA no codificante
consisteen secuencias repetidas.
Secono-
ce relativamentepoco sobrelasfunciones
del DNA repetido,pero algunade estasse-
cuenciaspuededesempeñar un papeles-
tructural en el cromosoma,y otraspueden
proporcionarfuentesdevariabilidadevo-
Iutiva parael genoma.
La enormelongitud de las moléculas
de DNA presenteen lascélulas(e incluso
en losvirus) necesita de un embalajecon-
siderable).Tantoen losprocariotascomo
en el núcleode las céiulaseucariotas,el
DNA forma complejosconproteínas,pero
esteempaquetamientoes más elaborado
en eucariotas. La unidadbásicaestructu-
ral del cromosomaeucariotaesel nucleo-
soma,queconsisteen una pequeñalongi-
tud de DNA enrollado alrededorde una
partícula proteica construidaa partir de
ocho moléculasde histonas.Hileras de
nucleosomas(<cuentasen un collar>)se
empaquetanjuntasparaformar una fibra
de cromatinade 30 nm, que puedeseguir
curvándosey plegándose.Cuanto mayor
seael empaquetamientodel DNA, menos
probablees que ésteseaactivotranscrip-
cionalmenteen la célula.En lascélulasque
no estánen división y que estántranscri-
biendoDNA de maneraactiva,Ia mayoría
de la cromatinaestáen una forma relati-
vamenteextendida,y bastantedifusa de-
nominada eucromatina.Sin embargo,
otras porcionesde Ia cromatina estánen
un estadoaltamentecondenSado denomi-
nado heterocromatina. Durante Ia divi-
sión celular,todala cromatinasecompac-
ta formando cromosomasdiferenciados
visiblescon el microscopioóptico.
Los cromosomaseucariotas selocali-
zan en el núcleo.La envueltanuclear de
doblemembranaestáperforadapor poros
nucleares que medianel transportebidi-
reccionalde materialesentre el nucleo-
plasmay el citosol.Dentrode cadaporo se
encuentrauna estructuraproteicaelabo-
rada,denominadacomplejodel poro nu-
clear.Losionesy pequeñasmoléculascon
un tamañohasta9 nm de diámetro,di-
funden pasivamentea través de canales
acuososen el complejodel poro; laspar-
tículasmayoressetransportanactivamen-
te a su través;los porosnuclearescontro-
Ianademásel movimientohaciael interior
de lasproteínasque seusanen el núcleoy
el movimiento haciael exteriordel RNAy
delassubunidades ribosomales.Sepiensa
que una red estructuralde fibras, deno-
minada matriz nuclearestáimplicadaen
Ia localizaciónde otras actividadesnu-
cleares,talescomo la replicacióndel DNA
y Ia produccióndel RNA mensajero,a zo-
nasdiferenciadasdel núcleo.

Problemas
Losproblemas
demayor
dificultad conun ..
estánmarcados (a) El DNA de doble hebracontienecantidadesigualesde las
basesA y T, e igualescantidadesde lasbasesG y C, pero Ia
18.1 El material genético.Marque cadauna de las siguientes
significaciónde estasequivalenciasesun misterio.
aseveraciones relativasa la nattralezaquímicadel material
genéticocon una A si la afirmaciónserealizóalgunasdécadas (b) El materialgenéticode organismossuperioreses
antesde 7944,conuna I si perteneceaI ínterin 1944-1952,con probablementeproteínaen su mayoría.
una P si seajustamás al periodoposteriora 1952,o con una N si (c) EI DNA esel materialgenéticotanto de lasbacteriascomo
nuncafueun conceptoampliamenteaceptado. de susfagos.

Problemas 601
(d) EI DNA esquímicamentedemasiadosimplecomo para ser
consideradoIa información genéticade cualquiercélula.
(e) La nucleínaesun componenteimportante del citoplasma.
(0 El DNA puedeserel materialgenéticode lascélulas
bacterianas,pero todavíaesun asuntopendientesu
significadoen organismos superiores.
(g) Lascepaslisas(S) de neumococoson capacesde convertira
lascepasrugosas(R) no patógenas) en cepasS patógenas,
pero todavíano sabemosqué componentede lascélulasS
causaesatransformación.
(h) rJnavezadsorbidoen una célulahuésped,el bacteriófago
inyectasusproteínasa la bacteria.
18.2 Conocimientosprevios.Prácticamentecada
experimentorealízadopor los biólogossecimentó en
conocimientosprocedentesde experimentosprevios.
(a) ¿Quésignificadotuvo para Averyy cols.,el descubrimiento
(realizadoert 1932por |. L. Alloway) de que la misma clase
de transformaciónde célulasR en célulasS que Grifñth
observóen ratones,sepodíatambiéndemostrarcon
célulasde neumococoaisladasen cultivo?
(b) ¿QuésignificóparaHersheyy Chasela siguienteexplicación
(realizadaen 1951por R. M. Herriott)?nUn virus puede
funcionarcomo una pequeñaagujahipodérmicallenade
principiostransformantes; el virus,como tal, no entranunca
en lascélulas;solamenteIa colacontactacon el huéspedy
quizás,realizaenzimáticamente un pequeñoagujeroen la
membranaexternay entoncesel ácidonucleicodelacabeza
delvirus fluyehaciael interior de la célulo.
(c) ¿QuésignificaronparaWatsony Crick los datosde sus
colegas de Cambridgede la maneratan particularen la que
sedisponíanA, G, C y T a pH fisiológicopermitíala
formációnde puentesde hidrógenoespecíficos?
(d) ¿Cómolos descubrimientos de Hersheyy Chaseayudan
a explicarun informe preliminar (de T. F.Andersony
R. M. Herriot) en el que,al suspender partículasviralesen
aguadestiladaantesde añadirlosa un cultivo bacteriano,el
bacteriófago Tl2 seabreviolentamente, por ósmosis, y
pierdesu capacidadde reproducirse?
18.3 Estructura del DNA. Examinecon detenimientoIa doble
hebrade la moléculade DNA que semuestray fíjeseen que
presentauna doblesimetríade rotación:
3, A-G-C-G-C-T-A-T-A-G-C-G-C-T
5' T-C-G-C-G-A-T-A-T-C-G-C-G-A 3'
(0 En una cadenasencillade estamolécula,seríaimposible
determinarcuál esel extremo3' y cuálel extremo5'.
18.4 Mapasde restricción de DNA. El genomade un
bacteriófagoreciéndescubiertoesuna moléculade DNA lineal
con una longitudde 10.500paresde nucleótidos. Seincubóuna
muestrade eseDNA con una enzimade restricciónX y otra
muestracon la enzimade restricciónY. Por electroforesis
en gel,
sehan determinadolaslongitudes(en miles de paresde bases)
de los fragmentosde restricciónproducidospor lasdos enzimas
como sigue:
EnzimaX: FragmentoX-l : 4,5; X-2 : 3,6; X-3 : 2,4
E n z i m a Y : F r a g m e n t o Y - l : 5 , 2 ; Y - 2 : 3 , 8 ; Y - 3: 1 , 5
Lo siguiente,esque los fragmentosobtenidosen Ia reaccióncon
la enzimaX seaíslany setratan con la enzimaY,y los
fiagmentosde la reacciónde la enzimaY setratan con la
enzimaX. Los resultadosson los siguientes:
Losfragmentosde X tratadosconY X- 1 --+4,5 (no cambia)
X-2---+2,1 + 1,5
X-3 --+ I,7 + 0,7
LosfragmentosdeY tratadosconX: Y-1--+4,5 + 0,7
Y-)--+)1+17
v ¡- i,s (no cambia)
Dibuje un mapa de restriccióndel DNA del fago,indicandola
posiciónde todoslos sitiosde restricciónde la enzimaX y de la
enzimaY,y Ia longitud del DNA entre ellos.
18,5 Secuenciacióndel DNA. Ha aisladoel fragmentode
DNA del Problema18.3perono sabesu secuencia completa.
Conociendola especificidad de la enzimade restricciónusada,
puedesaberlas cuatroprimerasbasesdel extremode la
izquierday ha preparadoun primer (cebador)de DNA de
cadenasencillade secuencia 5' T-C-G-C 3'. Expliquecómo
determinaríael restode la secuenciautilizando
dideoxinucleótidos marcadoscon colorantes. Dibujeel patrón
de gelque seobservaría, indicandola secuencia debasesde
DNA de cadabanday el patrónde coloresquedetectaría la
cámaraen un secuenciador de DNA.
.18,6 Fusióndel DNA. En la Figura18.35semuestranlas
curvasde fusión para dos muestrasde DNA que se
desnaturalizarontérmicamenteen lasmismascondiciones.
5'
E
c

(a) Marquecadauna de lassiguientes aseveracionescon unaV N

o
si esverdaderoo con una F si esfalso. o
'F
(b) No existeforma de distinguir el extremoderechode la o
q)
doble hélicedel extremoizquierdo.
.(Ú
(c) Si una soluciónde estasmoléculassecalientahasta O
c
cadamoléculade cadenasenciliade la
desnaturalizarlas,
(Ú
_o
solución seríacapazde hibridar con una de cadados @

moléculas.
(d) Si la molécula se corta en dos mitades por su punto medio,
75 80 85
sería posible distinguir Ia mitad izquierda de la mitad
derecha.
('C)
Temperatura
(e) Si las dos cadenassencillas se separan, no sería posible Figum18.35 Desnaturalización
térmicadedosmuestras
de DNA.
distinguir una hebra de la otra. (VéaseProblema
18.6.)

602 18 Baseestructural
Capitulo deIainformación
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas
(a) ¿Quéconclusiones sesacancon respectoa la composición
de basesde lasdos muestras?Explíquelo.
(b) ¿Podríaexplicarla excesiva
pendientede la curva de fusión
de la muestraA?
(c) La formamiday Ia ureasonagentes
conocidospor formar
puentesde hidrógenocon purinasy pirimidinas.¿Qué
efectos,si esque hay alguno,tendríasobrelascurvasde
fusión,la inclusiónen la mezclade incubación,de
pequeñascantidadesde formamida o de urea?
.18,7 Renaturalizacióndel DNA. Sele dan dos muestrasde
DNA. cadauna de lascualesfundea92"C cuandoserealizauna
desnaturalización térmica.Despuésde desnaturalizarel DNA,
mezclalasdos muestrasjuntas y enfríala muestrapara permitir
a lashebrasde DNA que sereasocien.Cuandoel DNA
nuevamente reasociado sedesnaturaliza por segundavez,Ia
muestrafundea 85'C.
(a) ¿Cómopodríaexplicarla disminuciónde la temperatura
de fusiónde 92"C a 85 "C?
(b) ¿Quéclasede experimentorealizaríapara explicarsu
hipótesis?
(c) Si el DNA nuevamente ha fundido a92"C en
reasociado
extraeríacon respectoa la
vezde a 85 "C, ¿quéconclusiones
secuenciade basesde lasdosmuestrasde DNA iniciales?
.18.8 Nucleosomas.Realizaun experimentoen el que aísle
cromatinaa partir de espermatozoidesde erizode mar y los
digierebrevemente con nucleasade micrococo.Cuando
desaparecen lasproteínasy el DNA purificadoresultante,se
analízapor electroforesis
en gel,observauna seriede
fragmentosde DNA quetienenuna longitud,en paresde bases,
múltiplosde 260 (esdeci,260pb, 520pb,780pb,y así
sucesivamente).
(a) Aunqueestosresultados difierenen algunamedidade los
resultados típicostratadosen el capítulo,expliquepor qué
todavíaapuntana la posibleexistencia de nucleosomas en
estetipo celular.
(b) ¿Quésepuedeconcluircon respectoa la cantidadde DNA
asociada a cadanucleosoma?
(c) Si la cromatinaseanalizainmediatamentedespués de Ia
digestióncon nucleasade micrococopor centrifugación en
gradientede densidad,describaquéesperaría
ver.
(d) Supongaquerealizaun experimentoen el quela cromatina
sedigiereduranteun periodomuchomáslargode tiempo
con nucleasa de micrococoantesde retirarlasproteínasde
la cromatina.Cuandola preparaciónde DNA resultantese
atalizapor electroforesis,todo el DNA apareceen forma de
fragmentosde 146pb de longitud.¿Quéle sugierecon
respectoa la longitud del espaciadorde DNA en estetipo
celular?
Bibliografía recomendada
Lasreferencias
conimportancia
histórica con.
estánmarcadas
Naturalezaquímicadelmaterialgenético
.Aver¡ O. T.,C. M. Macleod y M. McCarty.Studieson the che-
mical nature of the substanceinducins transformationof
18.9 Estructura y función nuclear.Indique lasconsecuencias
paraIa función y la estructuranuclearde cadauna de las
siguientesobservaciones experimentales.
(a) La sacarosa atraviesala envueltanucleartan rápidamente
que su velocidadde movimiento no sepuedemedir con
precisión.
(b) Laspartículasde oro coloidalcon un diámetro de 5,5 nm
seequilibranrápidamenteentreel núcleoy el citoplasma
cuandoseinyectanen una ameba,pero laspartículasde
oro con un diámetrode 15nm no lo hacen.
(c) A veces, los complejosdel poro nuclearsetiñen con fuerza
pararibonucleoproteínas.
(d) Si laspartículasde oro de hasta26 nm de diámetrose
cubrencon un polipéptidoque contieneuna señalde
Iocalízaciónnuclear(SLN) y seinyectanen el citoplasma
de una célulaviva,setransportanal núcleo.Sin embargo,si
seinyectanen el núcleo,sequedanallí.
(e) Cuandoseanalizanpor electroforesis, muchasde las
proteínasde la envueltanuclearparecenserlasmismasa
lasencontradas en el retículoendoplásmico.
(f) Lasproteínasribosomales sesintetizanen el citoplasma
pero seempaquetancon el rRNA, en subunidades
ribosomales en el núcleo.
(C) Si los nucleolosseirradiancon un microhazde luz
ultravioleta,seinhibe la síntesisdel RNA ribosómico.
(h) El tratamientode los núcleoscon el detergente no iónico X-
100disuelveIa envueltanuclearpero dejael núcleointacto.
18,10 Transportenuclear.¿Quédeterminasi una partícula
proteicaserátransportadaactivamente, haciael interior del
núcleo,haciael exteriordel núcleo,o hacianingunode los dos
lados?Expliqueel mecanismoimplicado.
18.11 Nucleolo.Indiquesi cadauna de lassiguientes
aseveraciones esverdadera(V) o falsa(F).Si esfalsa,reescriba
la
frase,parahacerlaverdadera.
(a) Losnucleolossonestructuras rodeadasde membrana
presentes en los núcleoseucariotas.
(b) Lasfibrillasque seobservanen lasmicrografías
electrónicasde los nucleoloscontienenDNA y RNA.
(c) El DNA de los nucleolosporta los genesde lost-RNAsde
la célula,queestánpresentes en gruposde copiasmúltiples.
(d) Un úniconucleolosiemprecorresponde con una única
regiónorganizadora nucleolar(NOR).
(e) Cuandoa la célulasele proporcionanribonucleótidos
marcadosradiactivamente, los nucleolosaparecen
marcadosfuertemente.
(f) En animalesy plantas,Ia desaparicióndel nucleolodurante
la mitosis,estárelacionadacon el cesede la síntesis
de
ribosomas.
pneumococcal types. Induction of transformation by a des-
oxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus
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a recomendada 603
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604 Capítulo
18 Baseestructural
dela información
celular: y el núcleo
DNA,cromosomas