Universidad Tecnológica De Coahuila

Caracterización de materiales
Cromatografía Liquida o HPLC
Saul Iván Lopez Lopez
Dra. Leticia Arizbeth Ramírez Mendoza
Ramos Arizpe, Coahuila
19 de Marzo del 2019
 Contenido
Introducción ............................................................................................................. 3
Fundamentos teóricos ............................................................................................. 4
Partes ...................................................................................................................... 5
Investigación y aportaciones ................................................................................... 6
Conclusiones ........................................................................................................... 9
Referencias ........................................................................................................... 10
Anexos .................................................................................................................. 10
 Introducción
El método de cromatografía liquida también llamada HPLC por sus siglas en ingles
consiste en la separación de componentes en una muestra a través de una fase
móvil liquida y una fase estacionaria en la mayoría de los casos en estado solido u
otros casos en líquido, siendo este ultimo de distinta polaridad que el disolvente de
la fase móvil.
Esta técnica de caracterización es utilizada usualmente para detección de
componentes no volátiles, compuestos aromáticos, en medicina para la
identificación de medicamentos, en química forense para detección de semen
drogas o algún otro compuesto en un cuerpo y finalmente en la industria química en
general.
Es por estas razones que en el siguiente trabajo de investigación se retomaran el
tema abordado en clase titulado HPLC o cromatografía de gases y se citara un
ejemplo de esta cromatografía en el campo de investigación.
 Fundamentos teóricos
Cromatografía de líquidos.
La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna)
y una fase móvil. La fase estacionaria es silica que se ha tratado con RMe2SiCl. La
fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en
la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las
interacciones no-covalentes de lo compuestos con la columna. Estas interacciones
químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La utilización
de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a
determinar.
 Partes
Si bien es cierto que para realizar una cromatografía líquida tan solo es necesario
disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna
cromatografía de líquidos de alta eficacia, debido al pequeño diámetro de las
partículas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilización de unos
dispositivos que constituyen el cromatógrafo. Los componentes básicos de un
cromatógrafo de líquidos son (anexo 1):
 Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de
eluyentes)
 Dispositivo de inyección.
 Conducciones y conexiones.
 Detector y registrador.
 Columna
Además de estos se le puede incluir al sistema:
 Inyectores automáticos.
 Colectores de fracciones.
 Hornos termostatizados para las columnas.
 Sistemas de tratamiento de datos
 Investigación y aportaciones
A continuación, se ejemplificará la cromatografía de líquidos:
HPLC. –
En una investigación realizada por S. Muniategui y colaboradores acerca de la
separación de lípidos neutros de polen apícola mediante cromatografía liquida de
alta resolución se utiliza la técnica antes mencionada puesto es muy utilizado para
la separación de diferentes clases de lípidos esto se buscó a través de la técnica de
HPLC puesto que la técnica mas utilizada para llevar a cabo esta separación de
lípidos usualmente es el TLC pero esta técnica tiene inconvenientes en la presión y
reproductividad de las medidas así que fue por eso que se eligió la técnica HPLC
por su alta precisión y rapidez que esta tiene.
Estos investigadores indagaron en la literatura, pero al no encontrar ninguna
referencia igual se decidió utilizar referencias para otro tipo de muestras como
tejidos cereales y otras.
Para poder identificar este tipo de lípidos mediante HPLC es utilizado un detector
UV con longitudes entre 205 y 220 nm, también el detector de un detector de índice
de refracción, de masas y diode array.
También utilizaron columnas de silica a temperatura ambiente y con gradientes de
flujo para aumentar la rapidez del análisis.
En conclusión, este proyecto se utilizó para la determinación de lípidos que existen
en polen apícola que es utilizado por su alto contenido nutricional.
El estudio lo realizaron con 35 muestras de diferentes familias de abejas las cuales
fueron:
Cistaceae 43,9 % (Cistus ladaníferus L. 39,5 %); Borraginaceae (Echium sp. 10,3
%); Compositae 9,3 %; Fagaceae 8.6 % (Quercus sp. 6,8 %) y en menor
cuantía Rosaceae, Campanulaceae, Papüonaceae, Cruciferae, Papavera-ceae,
Ericaceae y otros.
Esto lo realizaron con muestras pulverizadas y en una atmosfera inerte.
El análisis se realizado según el análisis de grasa total en chocolates según la
norma UNE 34-082-76 en la cual se distinguen tres etapas las cuales son:
A. desecación de la muestra a 60° C durante 12 horas.
B. hidrólisis clorhídrica para liberar los componen-tes lipidíeos ligados.
C. extracción de los lípidos en Soxhiet, durante 4 horas con éter de petróleo.
Acontinuacion se cita texualmente todo el equipamiento que utilizaron para la
cromatografía liquida de alta resolución:
Reactivos.
Solventes calidad HPLC Lichrosolv Merck filtra-dos a través de un filtro Millipore
de 0,2 |im, dega-sificados y almacenados en atmósfera de Helio.
Patrones de lípidos Sigma Art. 178-1: Mezcla de colesterol, oleato de colesterol,
oleato de metilo, ácido oleico y trioleína; en cantidades del 20 % para cada
componente.
. Material y aparatos. Cromatógrafo de líquidos Spectra-Physics com-puesto
por:
- Bomba 8700 XR para tres gradientes.
- Inyector Rheodyne de 10 |il.
- Detector UV/VIS de longitud de onda variable Spectra-Physics 8440 XR.
- Integrador Spectra-Physics 4290.
Columna Lichrosorb Merck Si 60 de tamaño de partícula 7 |xm (25 x 0,46 cm).
Condiciones cromatográficas.
Como fase móvil se usa una mezcla de n-hexano-2-propanol-ácido acético
(100:0,5:0,1).
La detección se realiza a 206 nm y temperatura ambiente usando el siguiente
gradiente de flujo: 1-12 minutos: 1,0 ml/min; 13 min: 1,2 ml/min; 16 min: 1,5 ml/min;
20-30 min: 1,7 ml/min.
Tanto las muestras como los patrones se disuelven en el solvente de elución para
disminuir al mínimo las señales del pico de solvente.
Se inyectan directamente en el cromatógrafo cantidades de 10 ^tg de
lípídos/10 M-I de disolución.
Después de cada inyección se lava la columna con 20-25 mi de solventes de una
serie de polaridad creciente: hexano, acetona y metanol. Diariamente se reactiva
la columna con 30-40 mi de cada uno de los solventes anteriores en orden inverso.
Identificación y comprobación de las fracciones.
La identificación de los componentes lipidíeos se realiza por comparación y
coincidencia de los tiempos de retención con los de una mezcla de patrones
disueltos en la fase móvil.
Además, como comprobación fueron colectadas las distintas fracciones separadas
y desarrolladas en TLC de silicagel G 60 de 0.20 mm de espesor, previamente
activadas durante una hora a 110° C. Como líquidos de desarrollo se
emplean las siguientes mezclas en un desarrollo doble unidimensional:
a) Éter etílico-ácido acético (50:1) hasta R^= 0,4.
b) Éter de petróleo-éter etílico-ácido acético (80: 20:3).
Precisión.
La precisión de los porcentajes de área para cada uno de los componentes lipidós
separados, ha sido estudiada efectuando 8 determinaciones sobre la misma
muestra. Los coeficientes de variación se recogen en el anexo 2. La precisión
del método es suficiente si se realiza la inyección por duplicado.
Como conclusiones de la mezcla patrón y la muestra se pudo observar como se ve
en el anexo 3 y 4 respectivamente que estos estaban compuestos de:
(1) oleato de colesterol, (2) oleato de metilo, (3) trileina, (4) acido oleico y (5)
colesterol.
(1) Esteres de esteroles, carotenoides y ceras (3) triglicéridos (4) ácidos grasos
En el anexo 5 se ven las proporciones que obtuvieron en su investigación.
Y finalmente concluyeron que el HPLC es significativo para la separación de lípidos
neutros de polen apícola y puesto que no se tienen referencias de este tipo de
investigación en la literatura es muy beneficiosos para futuras investigación de este
alimento.
 Conclusiones
Como conclusiones de esta investigación y la recapitulación de esta técnica es que
esta técnica es de utilidad para identificar compuestos orgánicos como lípidos u
otros, pero no es de utilidad en gran medida para la caracterización de
nanoestructuras, pero si en gran medida para muchos otros sin fines de cosas como
ya vimos en las aplicaciones que este tiene.
Finalmente, que es un método sencillo de caracterización, pero solo aplicable a
ciertas cosas y circunstancias que se busquen de lo contrario puedes no conseguir
lo que quieres caracterizar.
 Referencias
S. Muniategui*, M. T. (1991). eparación de las clases de lípidos neutros de polen
apícola mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) .
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. , 277-280.
Valdés, P. (s.f.). Polen apícola: una alternativa de negocio. Agrimundo.

Anexos

Anexo 1

Anexo 2
Anexo 3 Anexo 4

Anexo 5