UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTO

BIOLOGÍA MOLECULAR

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Uno de los avances más importantes en los inicios del estudio de la biología molecular fue el
descubrimiento, identificación y el aislamiento de las diferentes enzimas especialmente las
enzimas de restricción, las cuales han sido una herramienta fundamental para la realización de
diversos estudios , ya que surgió de la necesidad de cortar largas cadenas de ADN genómico para
manipulación y análisis en fragmentos más pequeños, lo que permitió desarrollar la metodología
del ADN recombinante, la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción y la clonación de la secuencia de ADN, además de investigaciones clínicas para el
diagnóstico de enfermedades.

Para el año de 1960 Stewart Linny y Werner Arber descubrieron estas enzimas al estudiar de
que la degradación y metilación del ADN en bacterias se debía a un fenómeno de defensa del
hospedador en contra de bacteriófagos, es por esto que aislaron cepas de E. coli, donde
obtuvieron evidencias de que las endonucleasas metilaban moléculas de ADN y que además
podían cortar un enlace fosfodiéster del ADN no metilado.

Estas endonucleasas se conocen comúnmente como enzimas de restricción debido a que

impiden la permanencia de un ADN exógeno en la célula bacteriana que produce dicha enzima,
estas se caracterizan ya que es capaz de reconocer una secuencia de cuatro a seis pares de bases
y cortan específicamente en ambas cadenas de la molécula de ADN, este lugar de corte se
denomina diana de restricción.

Este sistema enzimático de defensa en contra de la invasión de ADN exterior o sistema de

restricción-modificación utilizado por las bacterias para protegerse de ataques de bacteriófagos,
ha permitido eliminar las secuencias ajenas del genoma donde el ADN propio no sufre ningún
daño por parte de las enzimas de restricción del organismo, este sistema fue descubierto en el
año 1968. Años más tarde en 1970 se caracterizó por primera vez una enzima que fue aislada
de la bacteria Haemophilus influenzae nombrada Hind I, en honor a Daniel Hamilton.

EL sistema de restricción - modificación consta de dos parte; la primera conocida como

restricción lo cual permite a la bacteria esencialmente protegerse del ADN exterior para evitar
la promiscuidad en los intercambios genéticos, adquiriendo inmunidad frente a bacteriófagos y
la segunda denominada modificación que consiste en la incorporación de grupos metilos en
especificas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual es catalizado por una
metilasa específica, dando paso a la existencia de varios mecanismos de estos tipos, de los cuales
los principales es el tipo I y II.

El M-R tipo I fueron los primeros en ser estudiados, en donde las actividades de modificación y
las de restricción están realizadas por un complejo multiproteíco, es decir, que los dos tipos de
actividades se dan por la misma proteína. Este mecanismo presenta características principales
como el reconocimiento de secuencias grandes que no presentan ninguna simetría, además la
restricción requiere de ATP como energía, mientras que el mecanismo M-R de tipo II, cada
subunidad del dímero reconoce la misma secuencia de las partes contempladas del palíndromo
permitiendo realizar un corte en un lugar específico, esta se caracteriza por lo que las dos
actividades las realizan diferentes proteínas, además no utilizan ATP, sino solo iones de Mg++
para funcionar y utiliza una metilasa que suele ser una proteína monomérica que se encarga de
introducir grupos metilos en una adenina o guanina, dentro de los sitios de reconocimiento.

Existen tres sistemas de enzimas de restricción de acuerdo a su estructura y función, siendo la

primera denominada Tipo I, esta es una sola enzima de tres subunidades que es capaz de
reconocer la secuencia especifica de ADN, la corta (restricción) y la metila (modificación), pero
la restricción no curre en el sitio de reconocimiento sino que se da al azar es decir, rio arriba o
rio abajo, utilizando el mecanismo M-.R tipo I. El Tipo II, se diferencia del primero ya que solo
tiene actividad de restricción y ocurre en el sitio de reconocimiento específicamente, utilizando
el mecanismo M-R tipo II ya que solo requiere Mg++ y no ATP. Estos tipos de enzimas son muy
utilizadas en la clonación de genes ya que permite romper el ADN en sitios específicos y así poder
recuperar secuencias conocidas.

Para el Tipo III, es similar al sistema de tipo I ya que utiliza una enzima oligomérica que realiza la
restricción y modificación, pero difiere de que puede romper más allá del sitio de
reconocimiento, alrededor de 25-27 bp en el ADN. Sin embargo, en la actualidad existen otros
sistemas de restricción descubiertas como el sistema de tipo IV de E. coli (Eco571).

La nomenclatura de las enzimas de restricción ha sido muy importante para identificarlas y

estudiarlas, para nombrarles se empieza con las tres letras que corresponden al nombre
científico del microrganismo, la más común es la bacteria, luego la primera letra de la cepa que
se aisló originalmente y finalmente en números romanos, el número para distinguir si hay más
endonucleasas aisladas de esa misma especie.

Para conocer como se usan estas enzimas de restricción se estudió la digestión de ADN por estas
endonucleasas denominándoles como un proceso simple, ya que se coloca el ADN en contacto
con la enzima a temperatura ideal, es decir a 37 °C, y la enzima empieza el proceso de digestión,
cortando el ADN en diversos pedazos. La cantidad de fragmentos obtenidos es establecida por
el número de sitios de restricción reconocido por la enzima utilizada, un ejemplo claro es la
EcoRI, que es capaz de cortar el ADN cada vez que encuentre la secuencia G/AATTC.

Estos fragmentos generados pueden ser analizados mediante electroforesis en agarosa, en el

cual los fragmentos de diferentes tamaños son separados, al someterse a un campo eléctrico,
donde el ADN se moverá en la dirección de polo positivo ya que el ADN es negativa por la
presencia de grupos fosfatos en su estructura, una vez obtenido la corrida por electroforesis, los
fragmentos de ADN son tratados con un colorante específico como bromuro de etidio, que
intercala estos fragmentos permitiendo la visualización cuando es expuesto a la luz ultravioleta.

Aunque la tecnología ha avanzado a lo largo del tiempo existen varios factores que son
necesarios conocer cuando se trabaja con enzimas de restricción que pueden afectar su
actividad al momento de manipularlas, algunas de ellas es la sensibilidad a la temperatura, el pH
que influye en su estabilidad y actividad, la alta pureza del ADN ya que existe varios
contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etano, EDTA entre otros que pueden inhibir
la actividad de las endonucleasas, además la presencia de las DNAsas pueden degradar cuando
están en presencia de Mg++, también algunas enzimas de restricción son inhibidas por
metilación y el buffer debe ser adecuado ya que provee las condiciones óptimas para que la
enzima pueda trabajar correctamente.

Es así que la aplicación de enzimas de restricción abierto nuevos campo en la biología molecular
como la fabricación de mapas de restricción de un plásmido o bacteriófago, también fragmentar
ADN genómico para separación en electroforesis, Southern Blot, además la generación de
fragmentos para ser usados como sondas marcadas tanto en Southern y Northern blotting y la
generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores respectivos y la más relevante
la obtención de ADN recombinante.

Una de las mencionadas es el mapa de restricción, el cual es un mapa físico de un segmento de

ADN que muestra los lugares específicos de corte con varias enzimas de restricción, solas y en
parejas, además la distancia entre pares de bases, este ADN cortado es separado en un gel de
agarosa en donde los fragmentos se organizan en forma de mapa comparando los tamaños de
fragmentos, lo cual ha permitido comparar ADNs y ver su similitud e incluso la detección de
mutaciones.

El Southern Blot es otra técnica de laboratorio que es utilizada para detectar una secuencia
especifica de ADN en una muestra de sangre, donde el uso de enzimas de restricción es aplicada
para cortar una muestra de dicho ADN en fragmentos que son transferidos del gel una vez
terminada el proceso de electroforesis, donde se expone a una sola sonda de ADN marcada con
un marcador radioactivo, en donde básicamente si la sonda se une a la membrana, se dice que
la secuencia de la sonda esta presente en la muestra.

Otra aplicación mencionada es la clonación, siendo una técnica que utiliza la tecnología de ADN
recombinante, ya que permite clonar en grandes cantidades un pedazo específico, este ADN de
interés es cortado y ligado a un vector ya sea un plásmido o bacteriófago, que se puede replicar
automáticamente cuando se introduce a una bacteria en crecimiento como la bacteria modelo
E. coli, es así que tanto el ADN de interés como el vector de clonación deben ser cortados con la
misma enzima ya que así se puede unir por pareo de las bases complementarias en los
fragmentos simples de cada terminal. Existen varios ejemplos de aplicación como son los
productos biofarmacéuticos que permiten crear proteínas recombinantes como la hormona del
crecimiento humana, que es administrada en pacientes que no son capaces de sintetizarla o el
activador tisular del plasminógeno para utilizar infartos y a la vez prevenir coágulos sanguíneos.
Además, este proceso se aplica en terapia genética para proporcionar una copia normal del gen
a las células del paciente como es el caso de la fibrosis quística que ha permitido suministrar
plásmidos a los pulmones con el objetivo de que los pulmones se deteriore mas lentamente y
así a largar la vida del paciente.

El “DNA fingerprinting” sin duda es una de las aplicaciones más utilizadas ya que los análisis de
los patrones formados por los fragmentos que se produce cuando el ADN es cortado ha
permitido estudiar completamente los genomas de diversos organismos, el diagnóstico de
ciertas enfermedades genéticas hasta resolver crímenes violentos en la actualidad. Es
denominado DNA fingerprinting ya que se basa en que dos personas si nos son gemelos
idénticos, poseen una pequeña diferencia en la secuencia de nucleótidos, es así que los
fragmentos generados por las endonucleasas son de diferentes tamaños, esta diferencia
mencionada se conoce como patrones polimórficos de endonucleasas de restricción RFLP´s, por
lo que se asimila a una huella dactilar.

Un caso común de estudio de estas enzimas es en personas que son resistentes a la insulina
como la diabetes millitus, siendo una de las enfermedades con mayor impacto en la sociedad
debido a la alta frecuencia que esta se presenta en las personas y las consecuencias que acarrea
esta enfermedad. Es por esto que para la producción de insulina por parte de los pacientes que
padecen esta enfermedad, han utilizado varios mecanismos para la obtención de un ADN
recombinante con las características deseadas, y en su proceso se utiliza estas endonucleasas
de restricción para cortar un plásmido abierto y el gen deseado. De esta forma, se puede insertar
en una célula bacteriana el gen que controla la producción de la insulina humana, para
posteriormente extraer esta sustancia del cultivo y prepararla para su uso en pacientes con esta
enfermedad.

En la actualidad, se ha podido estudiar tanto la composición química y genética de mas de 5000

sistemas de restricción y metilación que ha permitido realizar ensayos útiles en investigaciones
clínicas para combatir principalmente enfermedades de alta magnitud, además del
mejoramiento de plantas y animales para el beneficio humano como productos transgénicos
que ha sido una controversia abierta para la sociedad, es por lo tanto que la tecnología ha
permitido seguir mejorando e incorporando tiendas online como REBASE o AllScience donde se
puede encontrar la información de las enzimas como el sitio de corte, la relación que existe en
la secuencia de reconocimiento además de los organismos de los cuales se aislaron,
secuenciaron y además de su estructura, que ha permitido la facilidad de uso de estas enzimas.
Es por lo que, el estudio de la biología molecular en el trascurso del tiempo ha sido uno de los
logros mas grandes del ser humano, proyectando un mejor futuro para las próximas
generaciones.

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