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Celda
Volumen 126, Número 4 , 25 de agosto de 2006 , páginas 663-676

Artículo

Inducción de células madre pluripotentes a partir de cultivos de fibroblastos embrionarios y

adultos de ratón por factores definidos
Kazutoshi Takahashi 1, Shinya Yamanaka 1 , 2
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https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024 Obtenga derechos y contenido

Bajo una licencia de usuario de Elsevier archivo abierto

Referido por Kit T. Rodolfa, Kevin Eggan

Una lógica transcripcional para la reprogramación nuclear

Cell, Volumen 126, Número 4, 25 de agosto de 2006, páginas 652-655

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Resumen

Las células diferenciadas pueden reprogramarse a un estado de tipo embrionario mediante la transferencia de contenido nuclear a los
ovocitos o mediante fusión con células madre embrionarias (ES). Poco se sabe sobre los factores que inducen esta reprogramación. Aquí,
demostramos la inducción de células madre pluripotentes a partir de fibroblastos embrionarios o adultos de ratón mediante la introducción
de cuatro factores, Oct3 / 4, Sox2,c-Mycy Klf4, en condiciones de cultivo de células ES. Inesperadamente, Nanog era prescindible. Estas células,
que denominamos células iPS (células madre pluripotentes inducidas), exhiben la morfología y las propiedades de crecimiento de las células
ES y expresan genes marcadores de células ES. Trasplante subcutáneo de células iPS en ratones desnudosresultó en tumores que contenían
una variedad de tejidos de las tres capas germinales . Después de la inyección en blastocistos , las células iPS contribuyeron al desarrollo
embrionario de ratón . Estos datos demuestran que las células madre pluripotentes pueden generarse directamente a partir de cultivos de
fibroblastos mediante la adición de solo unos pocos factores definidos.

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Introducción
Las células madre embrionarias (ES), que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos de mamíferos , tienen la capacidad de crecer
indefinidamente mientras mantienen la pluripotencia y la capacidad de diferenciarse en las células de las tres capas germinales ( Evans y
Kaufman, 1981 , Martin, 1981 ) Las células ES humanas podrían usarse para tratar una serie de enfermedades, como la enfermedad de
Parkinson , la lesión de la médula espinal y la diabetes ( Thomson et al., 1998 ). Sin embargo, existen dificultades éticas con respecto al uso de
embriones humanos., así como el problema del rechazo de tejidos después del trasplante en pacientes. Una forma de sortear estos problemas
es la generación de células pluripotentes directamente de las propias células de los pacientes.

Las células somáticas se pueden reprogramar transfiriendo su contenido nuclear a los ovocitos ( Wilmut et al., 1997 ) o mediante fusión con
células ES ( Cowan et al., 2005 , Tada et al., 2001 ), lo que indica que los huevos no fertilizados y las células ES contienen factores que pueden
conferir totipotencia o pluripotencia a las células somáticas. Presumimos que los factores que juegan un papel importante en el
mantenimiento de la identidad de las células ES también juegan un papel fundamental en la inducción de la pluripotencia en las células
somáticas.

Varios factores de transcripción, incluidos Oct3 / 4 ( Nichols et al., 1998 , Niwa et al., 2000 ), Sox2 ( Avilion et al., 2003 ) y Nanog ( Chambers et
al., 2003 , Mitsui et al., 2003 ), funcionan en el mantenimiento de la pluripotencia tanto en embriones tempranos como en células ES. Varios
genes que se regulan con frecuencia en tumores, como Stat3 ( Matsuda et al., 1999 , Niwa et al., 1998 ), E-Ras ( Takahashi et al., 2003 ), c- myc (
Cartwright et al., 2005 ), Klf4 ( Li et al., 2005 ) y β-Se ha demostrado que la catenina ( Kielman et al., 2002 , Sato et al., 2004 ) contribuyen al
mantenimiento a largo plazo del fenotipo de células ES y la rápida proliferación de células ES en cultivo. Además, hemos identificado varios
otros genes que se expresan específicamente en las células ES ( Maruyama et al., 2005 , Mitsui et al., 2003 ).

En este estudio, examinamos si estos factores podrían inducir la pluripotencia en las células somáticas. Al combinar cuatro factores
seleccionados, pudimos generar células pluripotentes, que llamamos células madre pluripotentes inducidas (iPS), directamente de cultivos de
fibroblastos embrionarios o adultos de ratón .

Resultados
Seleccionamos 24 genes como candidatos para los factores que inducen la pluripotencia en las células somáticas , en base a nuestra hipótesis
de que dichos factores también juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la identidad de las células ES (consulte la Tabla S1 en
los Datos suplementarios disponibles con este artículo en línea). Para β-catenina , c-Myc y Stat3 , utilizamos formas activas, S33Y-β-catenina (
Sadot et al., 2002 ), T58A-c-Myc ( Chang et al., 2000 ) y Stat3-C ( Bromberg et al., 1999 ), respectivamente. Debido al efecto negativo reportado
de Grb2 sobre la pluripotencia ( Burdon et al., 1999 , Cheng et al., 1998), incluimos su mutante dominante negativo Grb2ΔSH2 ( Miyamoto et
al., 2004 ) como 1 de los 24 candidatos.

Para evaluar estos 24 genes candidatos, desarrollamos un sistema de ensayo en el que la inducción del estado pluripotente podría detectarse
como resistencia a G418 ( Figura 1 A). Insertamos un β geo casete (una fusión de la β-galactosidasa y neomicina genes de resistencia) en el
ratón Fbx15 de genes por recombinación homóloga ( Tokuzawa et al., 2003 ). Aunque expresado específicamente en células ES de ratón y
embriones tempranos, Fbx15 es prescindible para el mantenimiento de la pluripotencia y el desarrollo del ratón. Células ES homocigotas para
la construcción de βgeo knockin ( Fbx15 β geo / β geo) fueron resistentes a concentraciones extremadamente altas de G418 (hasta 12 mg / ml),
mientras que las células somáticas derivadas de ratones Fbx15 β geo / β geo fueron sensibles a una concentración normal de G418 (0.3 mg / ml).
Esperábamos que incluso la activación parcial del locus Fbx15 resultaría en resistencia a las concentraciones normales de G418.
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Figura 1 . Generación de células iPS a partir de cultivos MEF a través de 24 factores

(A) Estrategia para evaluar los factores candidatos.

(B) Se observaron colonias resistentes a G418 16 días después de la transducción con una combinación de 24 factores. Las células se tiñeron
con cristal violeta .

(C) Morfología de las células ES, células iPS (iPS-MEF24, clon 1-9) y MEF. Barras de escala = 200 μm.

(D) Curvas de crecimiento de células ES, células iPS (iPS-MEF24, clones 2-1–4) y MEF. Se pasaron 3 x 10 5 células cada 3 días en cada pocillo de
placas de seis pocillos.

(E) Análisis por RT-PCR de genes marcadores de células ES en células iPS (iPS-MEF24, clones 1-5, 1-9 y 1-18), células ES y MEF. Nat1 se utilizó
como control de carga.

(F) Secuenciación genómica de bisulfito de las regiones promotoras de Oct3 / 4 , Nanog y Fbx15 en células iPS (iPS-MEF24, clones 1-5, 1-9 y 1-
18), células ES y MEF. Los círculos abiertos indican dinucleótidos CpG no metilados , mientras que los círculos cerrados indican CpG
metilados.

Introdujimos cada uno de los 24 genes candidatos en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de embriones Fbx15 β geo / β geo por transducción
retroviral ( Morita et al., 2000 ). Las células transducidas se cultivaron luego en células alimentadoras de STO en medio de células ES que
contenía G418 (0,3 mg / ml). Sin embargo, no obtuvimos colonias resistentes a los medicamentos con un solo factor, lo que indica que ningún
gen candidato era suficiente para activar el locus Fbx15 ( Figura 1 B; ver también la Tabla S2 , que resume todos los experimentos de
transducción en este estudio) .

En contraste, la transducción de los 24 candidatos juntos generó 22 colonias resistentes a G418 ( Figura 1 B). De los 12 clones para los cuales
continuamos cultivando bajo selección, 5 clones exhibieron una morfología similar a las células ES, incluyendo una forma redonda, nucleolos
grandes y citoplasma escaso ( Figura 1 C). Repetimos los experimentos y observamos 29 colonias resistentes a G418, de las cuales

seleccionamos 6 colonias. Cuatro de estos clones poseían propiedades de morfología y proliferación similares a las células ES ( Figura 1 D). El
tiempo de duplicación de estas células (19.4, 17.5, 18.7 y 18.6 h) fue equivalente al de las células ES (17.0 h). Designamos estas células iPS-
MEF24 para "células madre pluripotentes inducidas por MEF por 24 factores".El análisis por PCR de transcripción inversa (RT-PCR) reveló
que los clones iPS-MEF24 expresaban marcadores de células ES, incluidos Oct3 / 4 , Nanog , E-Ras , Cripto , Dax1 y Zfp296 ( Mitsui et al., 2003 ) y
Fgf4 ( Yuan et al., 1995 ) ( Figura 1 E). La secuenciación genómica de bisulfito demostró que los promotores de Fbx15 y Nanog estaban
desmetilados en células iPS ( Figura 1 F). Por el contrario, el 4 de octubreEl promotor permaneció metilado en estas células. Estos datos indican
que alguna combinación de estos 24 factores candidatos indujo la expresión de genes marcadores de células ES en cultivo MEF.

A continuación, para determinar cuáles de los 24 candidatos fueron críticos, examinamos el efecto de la retirada de factores individuales del
conjunto de genes candidatos transducidos en la formación de colonias resistentes a G418 ( Figura 2 A). Identificamos 10 factores (3, 4, 5, 11,
14, 15, 18, 20, 21 y 22) cuya retirada individual del grupo de transducción masiva no produjo formación de colonias 10 días después de la
transducción y menos colonias 16 días después de la transducción . La combinación de estos 10 genes solo produjo más colonias similares a
las células ES que la transducción de los 24 genes ( Figura 2 B).
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La Figura 2 . Reduciendo los factores candidatos

(A) Efecto de la eliminación de factores individuales del conjunto de 24 factores transducidos en la formación de colonias resistentes a G418.
Los MEF Fbx15 β geo / β geo se transdujeron con los factores indicados y se seleccionaron con G418 durante 10 días (columnas blancas) o 16 días

(columnas negras).

(B) Efecto de la eliminación de factores individuales de los 10 factores seleccionados sobre la formación de colonias resistentes a G418 16 días
después de la transducción.

(C) Efecto de la transducción de grupos de cuatro, tres y dos factores en la formación de colonias resistentes a G418 16 días después de la
transducción.

(D) Morfologías de iPS-MEF4 (clon 7), iPS-MEF10 (clon 6) e iPS-MEF3 (clon 3). Barras de escala = 200 μm.

Luego examinamos la formación de colonias después de la retirada de factores individuales del grupo de 10 factores transducidos en MEF (
Figura 2 B). Las colonias resistentes a G418 no se formaron cuando se eliminó Oct3 / 4 (factor 14) o Klf4 (factor 20). La eliminación de Sox2
(factor 15) resultó en solo unas pocas colonias resistentes a G418. Cuando eliminamos c-Myc (factor 22), emergieron colonias resistentes a
G418, pero tenían una morfología más plana, no similar a las células ES. La eliminación de los factores restantes no afectó significativamente
el número de colonias. Estos resultados indican que Oct3 / 4, Klf4, Sox2 y c-Myc juegan un papel importante en la generación de células iPS a
partir de MEF.

La combinación de los cuatro genes produjo una serie de colonias resistentes a G418 similares a las observadas con el conjunto de 10 genes (
Figura 2 C). Continuamos el cultivo de 12 clones para cada transducción y pudimos establecer 4 clones iPS-MEF4 y 5 iPS-MEF10. Además,
podríamos generar células iPS (iPS-MEF4wt) con c-Myc de tipo salvaje en lugar del mutante T58A ( Tabla S2 ). Estos datos demuestran que las
células iPS pueden ser inducidas por el cultivo MEF mediante la introducción de cuatro factores de transcripción, Oct3 / 4, Sox2, c-Myc y Klf4.

Ninguna combinación de dos factores podría inducir la formación de colonias resistentes a G418 ( Figura 2DO). Dos combinaciones de tres
factores: Oct3 / 4, Sox2 y c-Myc (menos Klf4) o Klf4, Sox2 y c-Myc (menos Oct3 / 4) generaron una colonia pequeña y única en cada caso, pero
no pudieron mantenerse en la cultura Con la combinación de Oct3 / 4, Klf4 y Sox2 (menos c-Myc), observamos la formación de 36 colonias
resistentes a G418, que, sin embargo, exhibieron una morfología plana, sin células ES. Con la combinación de Oct3 / 4, Klf4 y c-Myc (menos
Sox2), observamos la formación de 54 colonias resistentes a G418, de las cuales seleccionamos 6. Aunque los 6 clones se pudieron mantener
en varios pasajes, la morfología de estas células (iPS-MEF3) diferían de las de las células iPS-MEF4 e iPS-MEF10, y las colonias iPS-MEF3
exhibían superficies rugosas ( Figura 2RE). Estos datos indican que la combinación de Oct3 / 4, c-Myc y Klf4 puede activar el locus Fbx15 , pero
el cambio inducido por estos tres factores por sí solo es diferente del observado en las células iPS-MEF4 o iPS-MEF10.
Realizamos RT-PCR para examinar si los genes marcadores de células ES se expresaron en células iPS ( Figura 3 A). Utilizamos cebadores que
amplificarían las transcripciones del gen endógeno, pero no las transcripciones del transgen . Los clones iPS-MEF10 e iPS-MEF4 expresaron
la mayoría de los genes marcadores, con la excepción de Ecat1 ( Mitsui et al., 2003 ). La expresión de varios genes marcadores, incluido Oct3 / 4
, fue mayor en los clones iPS-MEF4-7, iPS-MEF10-6 y iPS-MEF10-7 que en los clones restantes. Sox2 solo se expresó en iPS-MEF10-6. El clon
iPS-MEF4wt también expresó muchos de los genes marcadores de células ES ( Figura S1) Los análisis de inmunoprecipitación de cromatina
mostraron que los promotores de Oct3 / 4 y Nanog habían aumentado la acetilación de la histona H3 y disminuido la dimetilación de la lisina
9 de la histona H3 ( Figura 3 B). Los dinucleótidos CpG en estos promotores permanecieron parcialmente metilados en células iPS ( Figura 3
C). Las células iPS-MEF4 e iPS-MEF10 fueron positivas para fosfatasa alcalina y SSEA-1 ( Figura 3 D) y mostraron alta actividad de telomerasa (
Figura S2 ). Estos resultados demuestran que las células iPS-MEF4 e iPS-MEF10 son similares, pero no idénticas, a las células ES.

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Figura 3 . Perfiles de expresión génica de células iPS

(A) Análisis por RT-PCR de genes marcadores ES en células iPS, células ES y MEF. Utilizamos conjuntos de cebadores que amplificaron las
transcripciones endógenas pero no transgénicas.

(B) Los promotores de Oct3 / 4 y Nanog fueron analizados por ChIP para determinar el estado de dimetilación de lisina 9 de histona H3 y el
estado de acetilación de histona H3 en células ES, MEF y células iPS (MEF4-7 y MEF10-6). Los datos se cuantificaron por PCR en tiempo real.
Se muestran los promedios y las desviaciones estándar de los valores relativos en comparación con las celdas ES (n = 3). ∗ p <0,05; ∗∗ p <0.01 en
comparación con los MEF.

(C) Los promotores de Oct3 / 4 , Nanog y Fbx15 se analizaron con secuenciación genómica de bisulfito para determinar el estado de metilación
del ADN en iPS-MEF4-7 e iPS-MEF10-6. El estado de metilación del ADN de estos promotores en células ES y MEF se muestra en la Figura 1
F.

(D) Los clones iPS-MEF4-7 e iPS-MEF10-6 se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra SSEA-1 (480, Santa Cruz) o con un kit de
fosfatasa alcalina (Sigma). Barras de escala = 500 μm (SSEA1) y 1 mm (AP).

En los clones iPS-MEF3, Ecat1 , Esg1 y Sox2 no se activaron ( Figura 3 A). Se indujo a Nanog , pero en menor medida que en los clones iPS-
MEF4 e iPS-MEF10. Oct3 / 4 se activó débilmente en iPS-MEF3-3, -5 y -6 pero no se activó en los clones restantes. Por el contrario, E-Ras y
Fgf4 se activaron de manera más eficiente en iPS-MEF3 que en iPS-MEF10 o iPS-MEF4. Estos datos confirman que las células iPS-MEF3 son
sustancialmente diferentes de las células iPS-MEF10 e iPS-MEF4.

Comparamos los perfiles globales de expresión génica de células ES, células iPS y Fbx15 β geo / β geo MEF utilizando microarrays de ADN ( Figura 4
A). Además, examinamos Fbx15 β geo / β geo MEF en los que los cuatro factores se habían introducido sin selección de G418, MEF inmortalizados
que expresan K-RasV12 y células NIH 3T3 transformadas con H-RasV12. El análisis de correlación de Pearson reveló que las células iPS se
agrupan estrechamente con las células ES pero por separado de los fibroblastos y sus derivados ( Figura 4 A). Los análisis de microarrays
identificaron genes que comúnmente estaban regulados en células ES y células iPS, incluido Myb, Kit , Gdf3 y Zic3 (grupo I, Figura 4 B y Tabla
S3 ). Otros genes se regulan de manera más eficiente en las células ES, iPS-MEF4 e iPS-MEF10 que en los clones iPS-MEF3, incluidos Dppa3 ,
Dppa4 , Dppa5 , Nanog , Sox2 , Esrrb y Rex1 (grupo II). Una expresión más baja de estos genes puede explicar la falta de pluripotencia en las
células iPS-MEF3. Además, encontramos genes que estaban regulados de forma más prominente en las células ES que en las células iPS,

incluidos Dnmt3a , Dnmt3b , Dnmt3l., Utf1 , Tcl1 y el gen del receptor LIF (grupo III). Estos datos confirman que las células iPS son similares,
pero no idénticas, a las células ES.
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La Figura 4 . Análisis de expresión génica global por microarrays de ADN

(A) Se realizó un análisis de correlación de Pearson de 10.517 sondas para agrupar células ES, células iPS (MEF4-7, MEF10-6, MEF3-2 y MEF3-
3), MEF, MEF que expresan los cuatro factores, MEF inmortalizados que expresan K- RasV12 y células NIH 3T3 transformadas por H-RasV12.
El rojo indica una expresión aumentada en comparación con los niveles medios de las ocho muestras, mientras que el verde significa una
expresión disminuida.

(B) Genes regulados al alza en células ES y / o iPS. Los genes en el grupo I son genes upregulated en células ES y células iPS. Los genes en el
grupo II se regulan más en las células ES, iPS-MEF4-7 e iPS-MEF10-6 que en las células iPS-MEF3. Los genes en el grupo III se regulan más
en las células ES que en las células iPS. Las listas de genes se muestran en las Tablas S3 – S5 .

Examinamos la pluripotencia de las células iPS por la formación de teratoma ( Figura 5 A; Tabla S6 y Figura S3 ). Obtuvimos tumores con 5
clones iPS-MEF10, 3 clones iPS-MEF4, 1 clon iPS-MEF4wt y 6 clones iPS-MEF3 después de la inyección subcutánea en ratones desnudos . El
examen histológico reveló que 2 clones iPS-MEF10 (3 y 6), 2 clones iPS-MEF4 (2 y 7) y el clon iPS-MEF4wt-4 se diferenciaron en las tres capas
germinales , incluidos los tejidos neurales, el cartílago y el epitelio columnar. . iPS-MEF10-6 podría dar lugar a las tres capas germinales
incluso después de 30 pases ( Tabla S6 y Figura S3) Confirmamos la diferenciación en tejidos neuronales y musculares mediante
inmunotinción ( Figura 5 B) y RT-PCR ( Figura S4 ). Por el contrario, estos teratomas no expresaron el marcador trofoblasto Cdx2 ( Figura S4 ).
Los tumores iPS-MEF10-1 se diferenciaron en ectodermo y endodermo , pero no en mesodermo , y no se observaron signos de diferenciación
en tumores derivados del resto de iPS-MEF10 (7 y 10) o de iPS-MEF4-10. Estos datos demuestran que la mayoría de los clones iPS-MEF10 e
iPS-MEF4, pero no todos, muestran pluripotencia.
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La Figura 5 . Pluripotencia de células iPS derivadas de MEF

(A) Varios tejidos presentes en teratomas derivados de células iPS-MEF4-7. La histología de otros teratomas se muestra en la Figura S3 y la
Tabla S6 .

(B) Inmunotinción que confirma la diferenciación en tejidos neurales y músculos en teratomas derivados de iPS-MEF4-7.

(C) Formación in vitro de cuerpo embrioide (fila superior) y diferenciación (fila inferior). Barras de escala = 200 μm.

(D) Inmunotinción que confirma la diferenciación in vitro en las tres capas germinales . Barras de escala = 100 μm. Los anticuerpos
secundarios se marcaron con Cy3 (rojo), excepto la α-fetoproteína en iPS-MEF10-6, con la que se utilizó Alexa 488 (verde).

En contraste, todos los tumores derivados de los clones iPS-MEF3 estaban compuestos completamente de células indiferenciadas ( Tabla S6 y
Figura S3 ). Por lo tanto, aunque los tres factores (Oct3 / 4, c-Myc y Klf4) podrían inducir la expresión de algunos genes marcadores de células

ES, no pudieron inducir la pluripotencia.

Las células iPS-MEF10, iPS-MEF4 e iPS-MEF3 formaron cuerpos embrioides en platos de plástico no recubiertos ( Figura 5 C). Cuando se
cultiva en placas de cultivo de tejidos, los cuerpos embrioides de las células iPS-MEF10 e iPS-MEF4 se unen al fondo de la placa e iniciaron la
diferenciación. Después de 3 días, la inmunotinción detectó células positivas para actina de músculo liso α (marcador de mesodermo), α-
fetoproteína (marcador de endodermo) y tubulina βIII (marcador de ectodermo) ( Figura 5 D). Por el contrario, los cuerpos embrioides de las
células iPS-MEF3 permanecieron indiferenciados incluso cuando se cultivaron en platos recubiertos de gelatina ( Figura 5 C). Estos datos
confirmaron la pluripotencia de iPS-MEF10 e iPS-MEF4 y la nulipotencia de iPS-MEF3 in vitro.

A continuación, presentamos los cuatro factores seleccionados en los fibroblastos de punta de cola (TTF) de cuatro ratones Fbx15 β geo / β geo
machos de 7 semanas de edad en un fondo híbrido C57 / BL6-129. Obtuvimos 3 colonias resistentes a G418, de cada una de las cuales
pudimos establecer células iPS (iPS-TTF4). También introdujimos los cuatro factores en los TTF de una hembra Fbx15 β geo / β geo mouse
hembra de 12 semanas de edad , que también expresó constitutivamente la proteína verde fluorescente (GFP) del promotor CAGy tenía un
fondo híbrido C57 / BL6-129-ICR. De las 13 colonias resistentes a G418 obtenidas, aislamos 6 clones de los cuales pudimos establecer células
iPS (iPS-TTFgfp4, clones 1-6). Además, establecimos otro iPS-TTFgfp4 (clon 7), en el que el ADNc para cada uno de los cuatro factores estaba
flanqueado con dos sitios loxP en el transgén. Estas células eran morfológicamente indistinguibles de las células ES ( Figura 6A). RT-PCR
mostró que los clones 3 y 7 de iPS-TTFgfp4 expresaron la mayoría de los genes marcadores de células ES a niveles altos y los otros a niveles
más bajos (Figura 6B). En otro intento, utilizamos el mutante T58A o el c-Myc de tipo salvaje para la transducción y establecimos 5 clones iPS-
TTFgfp4 (clones 8-12) y 3 clones iPS-TTFgfp4wt (clones 1-3) (Figura S5 ). RT-PCR mostró que las células iPS-TTFgfp4wt también expresaban
la mayoría de los genes marcadores de células ES ( Figura S6 ).
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La Figura 6 . Caracterización de células iPS derivadas de fibroblastos de cola de ratón adultos

(A) Morfología de iPS-TTFgfp4-3 en células alimentadoras STO .

(B) Análisis por RT-PCR de la expresión del gen marcador ES en células iPS-TTFgfp4 (clones 1-5 y 7). Utilizamos conjuntos de cebadores que
amplificaron las transcripciones endógenas pero no transgénicas.

(C) Contribución de las células iPS-TTFgfp4-7 e iPS-TTFgfp4-3 al desarrollo embrionario del ratón . Las células iPS se microinyectaron en
blastocistos C57 / BL6 . Los embriones se analizaron con un microscopio de fluorescencia a E7.5 (paneles superiores, iPS-TTFgfp4-7) o E13.5
(paneles inferiores, iPS-TTFgfp4-3). Barras de escala = 200 μm (paneles superiores) y 2 mm (paneles inferiores).

(D) El embrión quimérico E13.5 se seccionó y se tiñó con anticuerpo anti-GFP (marrón). Las células se contratiñeron con eosina (azul).

Trasplantamos 2 clones iPS-TTF4 y 6 clones iPS-TTFgfp4 en ratones desnudos, todos los cuales produjeron tumores que contenían tejidos de
las tres capas germinales ( Tabla S6 y Figura S3 ). Luego introdujimos 2 clones de células iPS-TTFgfp4 (clones 3 y 7) en blastocistos C57 / BL6
por microinyección . Con iPS-TTFgfp4-3, obtuvimos 18 embriones en E13.5, 2 de los cuales mostraron contribución de células iPS positivas
para GFP ( Figura 6 C). Los análisis histológicos confirmaron que las células iPS contribuyeron a las tres capas germinales ( Figura 6 D).
Observamos células positivas para GFP en la gónada, pero no pudimos determinar si eran células germinales.o células somáticas. Con iPS-
TTFgfp4-7, obtuvimos 22 embriones en E7.5, 3 de los cuales fueron positivos para GFP. Con los 2 clones, tuvimos 27 cachorros nacidos, pero
ninguno de ellos eran ratones quiméricos. Además, las células iPS-TTFgfp4 podrían diferenciarse en las tres capas germinales in vitro ( Figura
S7 ). Estos datos demuestran que los cuatro factores seleccionados podrían inducir células pluripotentes de cultivos de fibroblastos de ratones
adultos.

Además caracterizamos la expresión de los cuatro factores y otros en las células iPS. La PCR en tiempo real confirmó que la expresión
endógena de Oct3 / 4 y Sox2 fue menor en las células iPS que en las células ES ( Figura S8 ). Sin embargo, la cantidad total de los cuatro
factores de los genes endógenos y los transgenes excedió los niveles de expresión normales en las células ES. En contraste, los análisis de
transferencia Western mostraron que las cantidades totales de proteína de los cuatro factores en las células iPS eran comparables a las de las
células ES ( Figura 7 A; Figura S8 ). Podríamos detectar las proteínas Nanog y E-Ras en las células iPS, pero a niveles más bajos que los de las
células ES ( Figuras 7 A y 7B; Figura S8) Los niveles de p53 en las células iPS fueron más bajos que los de los MEF y equivalentes a los de las
células ES ( Figura 7 A; Figura S9 ). Los niveles de p21 en las células iPS variaron en cada clon y estaban entre los de las células ES y los MEF (
Figura S9 ). Tras la diferenciación in vitro, los niveles de expresión de ARNm totales de Oct3 / 4 y Sox2 disminuyeron pero permanecieron
mucho más altos que en las células ES. En contraste, sus niveles de proteína disminuyeron a niveles comparables en células iPS y células ES (
Figura 7 B).

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La Figura 7 . Análisis bioquímicos y genéticos de células iPS

(A) Análisis de transferencia Western de los cuatro factores y otras proteínas en las células iPS (MEF4-7, MEF10-6, TTFgfp4-3 y TTFgfp4-7),
células ES y MEF.

(B) Cambios en los niveles de ARN (izquierda) y proteína (derecha) de Oct3 / 4, Sox2 y Nanog en células iPS y células ES que no se
diferenciaron en las células alimentadoras de STO (U) o se indujeron a in vitro diferenciado a través de la formación del cuerpo embrioide
(RE). Se muestran los niveles de expresión relativos en comparación con las células ES no diferenciadas. También se muestran datos de MEF y
TTF. Los niveles de ARN se determinaron con PCR en tiempo real usando cebadores específicos para transcripciones endógenas (columnas
blancas) o las comunes para transcripciones endógenas y transgénicas (columnas blancas y negras). Los niveles de expresión de ARN se
muestran en ejes logarítmicos. Los niveles de proteína se determinaron mediante transferencia Western normalizada con β-actina . Los
niveles de proteína se muestran como promedios y desviaciones estándar en ejes lineales (n = 4).∗ p <0.05 en comparación con las células no
diferenciadas.
(C) Análisis de transferencia Southern que muestran la integración de transgenes . El ADN genómico aislado de las células iPS y las células ES
se digirió con EcoRI yBamHI, se separó engel deagarosa, se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con unasonda de ADNcKlf4.

(D) Cariotipo normal del clon iPS-TTFgfp4-2.

(E) Morfología de células ES y células iPS cultivadas sin células alimentadoras. Se cultivaron mil células en placas de seis pocillos recubiertas
de gelatina durante 5 días, con o sin LIF. Barras de escala = 200 μm.

Los análisis de transferencia Southern mostraron que cada clon de iPS tiene un patrón de integración transgénica único ( Figura 7 C). Los
análisis de cariotipo de los iPS-TTFgfp4 (clones 1, 2, 3, 7 y 11) e iPS-TTFgfp4wt (clones 1-3) demostraron que 2 clones iPS-TTFgfp4 y todos los
clones iPS-TTFgfp4wt mostraron un cariotipo normal de 40XX ( Figura 7 D), mientras que los otros 3 clones iPS-TTFgfp4 fueron 39XO, 40XO
+10 y 40Xi (X). Los análisis de polimorfismos de longitud de secuencia simple (SSLP) basados en PCR demostraron que los clones iPS-MEF
tienen un fondo mixto de C57 / BL6 y 129 ( Tabla S7 ), mientras que los clones iPS-TTFgfp tienen un fondo mixto de ICR, C57 / BL6 y 129 (
cuadro S8) Finalmente, encontramos que las células iPS no podían permanecer indiferenciadas cuando se cultivaban en ausencia de células
alimentadoras, incluso con la presencia de LIF ( Figura 7 E). Estos resultados, junto con los diferentes patrones de expresión génica, excluyen
la posibilidad de que las células iPS sean meramente contaminación de células ES preexistentes. Finalmente, los subclones de las células iPS
fueron positivas para la fosfatasa alcalina y pudieron diferenciarse en las tres capas germinales in vitro ( Figura S10 ), confirmando su
naturaleza clonal.

Discusión
Se ha demostrado que Oct3 / 4, Sox2 y Nanog funcionan como factores de transcripción básicos para mantener la pluripotencia ( Boyer et al.,
2005 , Loh et al., 2006 ). Entre los tres, encontramos que Oct3 / 4 y Sox2 son esenciales para la generación de células iPS. Sorprendentemente,
Nanog es prescindible. Además, identificamos c-Myc y Klf4 como factores esenciales. Estos dos factores relacionados con el tumor no podrían
ser reemplazados por otros oncogenes, incluidos E-Ras, Tcl1, β-catenina y Stat3 ( Figuras 2 A y 2B).

La proteína c-Myc tiene muchos objetivos posteriores que mejoran la proliferación y la transformación ( Adhikary y Eilers, 2005 ), muchos de
los cuales pueden tener un papel en la generación de células iPS. Es de destacar que c-Myc se asocia con complejos de histona
acetiltransferasa (HAT), incluido TRRAP, que es una subunidad central de los complejos TIP60 y GCN5 HAT ( McMahon et al., 1998 ),
proteína de unión CREB (CBP) y p300 ( Vervoorts et al., 2003 ). Dentro del genoma de los mamíferos, puede haber hasta 25,000 sitios de unión

a c-Myc ( Cawley et al., 2004 ), muchos más que el número previsto de sitios de unión a Oct3 / 4 y Sox2 ( Boyer et al., 2005 , Loh et al. ., 2006) La
proteína c-Myc puede inducir la acetilación global de histonas ( Fernández et al., 2003 ), permitiendo así que Oct3 / 4 y Sox2 se unan a sus loci
objetivo específicos.

Se ha demostrado que Klf4 reprime p53 directamente ( Rowland et al., 2005 ), y se ha demostrado que la proteína p53 suprime Nanog durante
la diferenciación de células ES ( Lin et al., 2004 ). Descubrimos que las células iPS mostraban niveles de proteína p53 más bajos que los de los
MEF ( Figura 7 A). Por lo tanto, Klf4 podría contribuir a la activación de Nanog y otros genes específicos de células ES a través de la represión
de p53 . Alternativamente, Klf4 podría funcionar como un inhibidor de la apoptosis inducida por Myc a través de la represión de p53 en
nuestro sistema ( Zindy et al., 1998 ). Por otro lado, Klf4 activa p21CIP1 , suprimiendo así la proliferación celular ( Zhang et al., 2000 ). Esta
función antiproliferación de Klf4 podría ser inhibida por c-Myc, que suprime la expresión de p21 CIP1 ( Seoane et al., 2002 ). El equilibrio entre
c-Myc y Klf4 puede ser importante para la generación de células iPS.

Una pregunta que queda se refiere al origen de nuestras células iPS. Con nuestro sistema de expresión retroviral , estimamos que solo una
pequeña porción de las células que expresan los cuatro factores se convirtieron en células iPS ( Figura S11 ). La baja frecuencia sugiere que las
células madre / progenitoras de tejidos raros que coexistieron en los cultivos de fibroblastos podrían haber dado lugar a las células iPS. De
hecho, se han aislado células madre multipotentes de la piel ( Dyce et al., 2004 , Toma et al., 2001 , Toma et al., 2005) Estos estudios mostraron
que ∼0.067% de las células de la piel del ratón son células madre. Una explicación de la baja frecuencia de derivación de células iPS es que los
cuatro factores transforman las células madre de los tejidos. Sin embargo, descubrimos que los cuatro factores indujeron a las células iPS con
una eficiencia comparablemente baja, incluso del estroma de la médula ósea , que debería estar más enriquecido en las células madre
mesenquimales y otras células multipotentes ( Tablas S2 y S6 ). Además, las células inducidas por los tres factores eran nulipotentes ( Tabla S6
y Figura S3 ). Los análisis de microarrays de ADN sugirieron que las células iPS-MEF4 y las células iPS-MEF3 tienen el mismo origen ( Figura
4) Estos resultados no favorecen a las células madre de tejido multipotente como el origen de las células iPS.

Hay varias otras posibilidades para la baja frecuencia de derivación de células iPS. Primero, los niveles de los cuatro factores requeridos para
la generación de células pluripotentes pueden tener rangos estrechos, y solo una pequeña porción de células que expresan los cuatro factores
en los niveles correctos pueden adquirir propiedades similares a las células ES. De acuerdo con esta idea, un mero aumento o disminución
del 50% en las proteínas Oct3 / 4 induce la diferenciación de las células ES ( Niwa et al., 2000 ). Los clones de iPS sobreexpresaron los cuatro
factores cuando se analizaron los niveles de ARN, pero sus niveles de proteína fueron comparables a los de las células ES ( Figuras 7 A y 7B;
Figura S8), lo que sugiere que los clones de iPS poseen un mecanismo (o mecanismos) que regula estrechamente los niveles de proteína de los
cuatro factores. Especulamos que se requieren grandes cantidades de los cuatro factores en la etapa inicial de la generación de células iPS,
pero, una vez que adquieren el estado de células ES, demasiados factores son perjudiciales para la autorrenovación. Solo una pequeña porción
de células transducidas muestra una expresión transgénica tan apropiada . Segundo, la generación de células pluripotentes puede requerir
alteraciones cromosómicas adicionales, que ocurren espontáneamente durante el cultivo o son inducidas por alguno de los cuatro factores.
Aunque los clones iPS-TTFgfp4 tenían cariotipos en gran medida normales ( Figura 7D), no podemos descartar la existencia de alteraciones
cromosómicas menores. La inserción retroviral específica del sitio también puede desempeñar un papel. Los análisis de transferencia
Southern mostraron que cada clon de iPS tiene ∼20 integraciones retrovirales ( Figura 7 C). Algunos de estos pueden haber causado
silenciamiento o fusión con genes endógenos. Se requerirán más estudios para determinar el origen de las células iPS.

Otra pregunta sin resolver es si los cuatro factores que identificamos juegan un papel en la reprogramación inducida por fusión con células
ES o transferencia nuclear a los ovocitos . Dado que los cuatro factores se expresan en las células ES a niveles altos, es razonable especular que
están involucrados en la maquinaria de reprogramación que existe en las células ES. Nuestro resultado también es consistente con el hallazgo
de que la actividad de reprogramación reside en el núcleo, pero no en el citoplasma , de las células ES ( Do y Scholer, 2004) Sin embargo, las
células iPS no eran idénticas a las células ES, como lo demuestran los patrones globales de expresión génica y el estado de metilación del
ADN. Es posible que nos hayamos perdido factores importantes adicionales. Uno de esos candidatos es ECAT1, aunque su expresión forzada
en células iPS no regulaba positivamente los genes marcadores de células ES ( Figura S12 ).

Más oscuros son los roles de los cuatro factores, especialmente Klf4 y c-Myc, en la reprogramación observada en los ovocitos. Tanto Klf4 como
c-Myc son prescindibles para el desarrollo del ratón previo a la implantación ( Baudino et al., 2002 , Katz et al., 2002 ). Además, c- myc no se
detecta en los ovocitos ( Domashenko et al., 1997 ). En contraste, L- myc se expresa maternamente en los ovocitos. Klf17 y Klf7 , pero no Klf4 ,
se encuentran en la etiqueta de secuencia expresadabibliotecas derivadas de huevos de ratón no fertilizados. Klf4 y c-Myc podrían
compensarse con estas proteínas relacionadas. Es muy probable que también se requieran otros factores para inducir la reprogramación
completa y la totipotencia en los ovocitos.

Es probable que los cuatro factores de los transgenes sean necesarios para mantener las células iPS ya que la expresión de Oct3 / 4 y Sox2 de
los genes endógenos se mantuvo baja ( Figura 7 B; Figura S8 ). Intentamos demostrar esto mediante el uso de transgenes flanqueados por dos
sitios loxP y obtuvimos un clon iPS (TTF4gfp4-7). Sin embargo, notamos que estas células contienen múltiples sitios loxP en múltiples
cromosomas, y, por lo tanto, la recombinación mediada por Cre causaría no solo la eliminación de los transgenes sino también
reordenamientos inter e intracromosómicos. Se requieren estudios con sistemas de expresión condicional, como el sistema mediado por
tetraciclina, para responder a esta pregunta.

Mostramos que las células iPS pueden diferenciarse in vitro e in vivo incluso con la presencia de los vectores retrovirales que contienen los
cuatro factores. Encontramos que las proteínas Oct3 / 4 y Sox2 disminuyeron significativamente durante la diferenciación in vitro ( Figura 7
B). Se ha demostrado que la expresión retroviral se suprime en las células ES y se silencia aún más tras la diferenciación mediante
modificaciones epigenéticas , como la metilación del ADN ( Yao et al., 2004 ). Es probable que los mismos mecanismos desempeñen un papel
en la represión transgénica en las células iPS, ya que expresan Dnmt3a , 3b y 3l , aunque a niveles más bajos que las células ES (Tabla S5 ).
Además, encontramos que las células iPS poseen un mecanismo (o mecanismos) que reduce los niveles de proteína de los transgenes y Nanog
( Figura 7 B; Figura S8 ). El mismo mecanismo puede mejorarse durante la diferenciación. Sin embargo, el silenciamiento de Oct3 / 4 en las
células iPS-TTFgfp4-3 no fue completo, lo que puede explicar nuestra incapacidad para obtener ratones quiméricos vivos después de la
microinyección con blastocisto de células iPS.

Un hallazgo inesperado en este estudio fue la activación eficiente de Fgf4 y Fbx15 por la combinación de los tres factores desprovistos de Sox2
ya que estos dos genes han sido regulados sinérgicamente por Oct3 / 4 y Sox2 ( Tokuzawa et al., 2003 , Yuan et al., 1995 ). También es
sorprendente que Nanog sea prescindible para la inducción y el mantenimiento de las células iPS. Un análisis más detallado de las células iPS
mejorará nuestra comprensión de la regulación transcripcional en células madre pluripotentes .

Nuestros hallazgos pueden tener aplicaciones más amplias, ya que hemos encontrado que los reporteros de transgenes con otros genes
marcadores de células ES, como Nanog , pueden reemplazar el knockin Fbx15 durante la selección (K. Okita y SY, datos no publicados). Sin
embargo, todavía no sabemos si los cuatro factores pueden generar células pluripotentes a partir de células somáticas humanas . El uso de c-
Myc puede no ser adecuado para aplicaciones clínicas, y el proceso puede requerir entornos de cultivo específicos. Sin embargo, el hallazgo es
un paso importante en el control de la pluripotencia, que eventualmente puede permitir la creación de células pluripotentes directamente de
las células somáticas de los pacientes.

Procedimientos experimentales

Ratones
Los ratones Fbx15 β geo / β geo se generaron con células RF8 ES derivadas de 129SvJae como se describió anteriormente ( Tokuzawa et al., 2003 ) y
se retrocruzaron a la cepa C57 / BL6 durante al menos cinco generaciones. Estos ratones se usaron para preparaciones primarias de
fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y fibroblastos de punta de cola (TTF). Para generar ratones Fbx15 β geo / β geo con expresión constitutiva
de GFP, se unió un ratón Fbx15 β geo / β geo (fondo C57 / BL6-129) con un ratón ICR con el transgén GFP impulsado por el promotor constitutivo
de CAG ( Niwa et al., 1991 ). Los ratones Fbx15 β geo / +, GFP / + resultantes se cruzaron para generar ratones Fbx15 β geo / β geo, GFP / GFP . Los ratones
desnudos (BALB / Jcl-nu) se compraron de CLEA.

Cultivo de células
Las células RF8 ES y las células iPS se mantuvieron en capas alimentadoras de células STO tratadas con mitomicina C como se describió
previamente ( Meiner et al., 1996 ). Como fuente de factor inhibidor de la leucemia (LIF), utilizamos medio acondicionado (dilución 1: 10,000)
de cultivos de células Plat-E que se habían transducido con un vector que codifica LIF. Las células ES e iPS se pasaron cada 3 días. Las células
de empaquetamiento Plat-E ( Morita et al., 2000 ), que también se usaron para producir retrovirus , se mantuvieron en DMEM que contenía
FBS al 10%, 50 unidades / 50 μg / ml de penicilina / estreptomicina, 1 μg / ml de puromicina (Sigma) y 100 μg / ml de blasticidina S
(Funakoshi).

Para el aislamiento de MEF, el útero aislado de ratones preñados de 13,5 días se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La
cabeza y los tejidos viscerales se eliminaron de los embriones aislados. Los cuerpos restantes se lavaron en PBS reciente, se picaron con un par
de tijeras, se transfirieron a una solución de tripsina 0,1 mM / EDTA 1 mM (3 ml por embrión) y se incubaron a 37 ° C durante 20 min.
Después de la incubación, se añadieron 3 ml adicionales por embrión de solución de tripsina 0,1 mM / EDTA 1 mM, y la mezcla se incubó a
37 ° C durante 20 min. Después de la tripsinización, se agregó una cantidad igual de medio (6 ml por DMEM embrionario que contenía FBS
al 10%) y se pipeteó varias veces hacia arriba y hacia abajo para ayudar con ladisociación deltejido. Después de la incubación de la mezcla de
tejido / medio durante 5 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Las células se recogieron por
centrifugación (200 × g durante 5 minutos a 4 ° C) y se resuspendieron en medio fresco. 1 x 10 6 células (paso 1) se cultivaron en placas de 100
mm a 37 ° C con 5% de CO 2 . En este estudio, utilizamos MEF en tres pasajes para evitar la senescencia replicativa .

Para establecer TTF, las colas de ratones adultos se pelaron, se picaron en trozos de 1 cm, se colocaron en platos de cultivo y se incubaron en
medio de inicio MF (Toyobo) durante 5 días. Las células que migraron fuera de las piezas de injerto se transfirieron a nuevas placas (pase 2) y
se mantuvieron en DMEM que contenía 10% de FBS. Utilizamos TTF en el paso 3 para la inducción de células iPS.

Infección retroviral
El día antes de la transducción, se sembraron células Plat-E ( Morita et al., 2000 ) a 8 x 106 células por placa de 100 mm. Al día siguiente, se
introdujeron vectores retrovirales basados en pMX en células Plat-E usando el reactivo de transfección Fugene 6 (Roche) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. Veintisiete microlitros de reactivo de transfección Fugene 6 se diluyeron en 300 μl de DMEM y se incubaron

durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron nueve microgramos de ADN plasmídico a la mezcla, que se incubó durante otros 15
minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, la mezcla de ADN / Fugene 6 se añadió gota a gota sobre células Plat-E. Las
células fueron incubadas durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 .

Veinticuatro horas después de la transducción, se reemplazó el medio. Se sembraron MEF o TTF a 8 x 10 5 células por placa de 100 mm en
alimentadores de STO tratados con mitomicina C. Después de 24 h, los sobrenadantes que contenían virus derivados de estos cultivos de Plat-
E se filtraron a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 μm (Schleicher & Schuell) y se suplementaron con 4 μg / ml de polibreno
(Nacalai Tesque). Las células objetivo se incubaron en los sobrenadantes que contenían virus / polibreno durante 4 horas hasta la noche.
Después de la infección, las células se volvieron a colocar en 10 ml de medio fresco. Tres días después de la infección, agregamos G418 a una
concentración final de 0.3 mg / ml. Los clones se seleccionaron durante 2 a 3 semanas.

Construcción de plásmidos
Para generar pMXs-gw, introdujimos un casete Gateway rfA (Invitrogen) en el sitio EcoRI / XhoI del plásmido pMXs. Los cebadores utilizados
se enumeran en la Tabla S9 . Las mutaciones en β- catenina , c- myc y Stat3 se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en
PCR . Para la expresión forzada, amplificamos las regiones codificantes de genes candidatos por RT-PCR , clonamos estas secuencias en
pDONR201 o pENTR-D-TOPO (Invitrogen) y recombinamos los plásmidos resultantes con pMXs-gw por reacción LR (Invitrogen).

Formación de teratomas y análisis histológico

Las células ES o células iPS se suspendieron a 1 x 10 7 células / ml en DMEM que contenía FBS al 10%. Ratones desnudos fueron anestesiados
con éter dietílico . Inyectamos 100 μl de la suspensión celular (1 × 10 6 células) por vía subcutánea en el flanco dorsal . Cuatro semanas después
de la inyección, los tumores se diseccionaron quirúrgicamente de los ratones. Las muestras se pesaron, se fijaron en PBS que contenía 4% de
formaldehído y se incluyeron en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina .

Secuenciación genómica de bisulfito

El tratamiento con bisulfito se realizó utilizando el kit de modificación CpGenome (Chemicon) de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla S9 . Los productos amplificados se clonaron en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Diez
clones seleccionados al azar se secuenciaron con los cebadores M13 hacia adelante y M13 hacia atrás para cada gen.

Determinación de cariotipos y SSLP por PCR

Los cariotipos se determinaron con tinción de quinacrina-Hoechst en el Centro de Monitoreo del Consejo Internacional para la Ciencia
Animal de Laboratorio (ICLAS) (Japón). Obtuvimos secuencias de cebadores de PCR para SSLP del sitio web de Mouse Genome Informatics
(The Jackson Laboratory, http://www.informatics.jax.org ). Los tamaños de alelos se aproximaron sobre la base de los tamaños de alelos
conocidos en diversas cepas endogámicas .

Análisis de Western Blot

Western blot se realizó como se describió anteriormente ( Takahashi et al., 2003 ). Los anticuerpos primarios utilizados fueron anticuerpos
monoclonales anti-Oct3 / 4 (C-10, Santa Cruz), antisuero anti-Sox2 ( Maruyama et al., 2005 ), anticuerpo policlonal anti-Klf4 (H-180, Santa
Cruz), anti- anticuerpo policlonal c-Myc (A-14, Santa Cruz), antisuero anti-Nanog ( Mitsui et al., 2003 ), antisuero anti-E-Ras ( Takahashi et al.,
2003 ), anticuerpo policlonal anti-p53 (FL- 393, Santa Cruz), y anticuerpo monoclonal anti-β-actina (A5441, Sigma).

RT-PCR para genes marcadores

Realizamos reacciones de transcripción inversa utilizando ReverTra Ace -α- (Toyobo) y el cebador oligo dT 20 . La PCR se realizó con ExTaq
(Takara). La PCR en tiempo real se realizó con Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG con ROX (Invitrogen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Las señales se detectaron con un sistema de PCR en tiempo real ABI7300 (Applied Biosystems). Las secuencias de
cebadores se enumeran en la Tabla S9 .

Microarrays de ADN
El ARN total de las células ES, las células iPS o los MEF se marcaron con Cy3. Las muestras se hibridaron con un Microarray de oligo de ratón
(G4121B, Agilent) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las matrices se escanearon con un sistema de escáner de microarrays G2565BA
(Agilent). Los datos se analizaron utilizando el software GeneSpring GX (Agilent).

Diferenciación in vitro de células iPS

Las células se cosecharon por tripsinización y se transfirieron a placas de cultivo bacteriano en el medio ES sin G418 o LIF. Después de 3 días,
las células agregadas se sembraron en placas de cultivo de tejidos recubiertas con gelatina y se incubaron durante otros 3 días. Las células se
tiñeron con anticuerpo monoclonal de actina anti-α-músculo liso (N1584, Dako), anticuerpo policlonal anti-α-fetoproteína (N1501, Dako) o
anticuerpo monoclonal de tubulina anti-βIII (CBL412, Abcam) junto con 4'-6 -diamidino-2-fenilindol (Sigma). El ARN total derivado de los
cuerpos embrioides en placa en el día 6 se usó para el análisis de RT-PCR.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina

Realizamos inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) como se describió anteriormente ( Maruyama et al., 2005 ). Los anticuerpos utilizados
en este experimento fueron el anticuerpo policlonal de conejo anti-dimetil K9 H3 (ab7312-100, Abcam) y el anticuerpo policlonal de conejo
anti-acetil H3 (06-599, Upstate). Los cebadores de PCR se enumeran en la Tabla S9 .

Análisis estadístico
Los datos se muestran como promedios y desviaciones estándar. Utilizamos la prueba t de Student para análisis de nivel de proteína y ANOVA
de un factor con la prueba post hoc de Scheffe para análisis de ChIP. Todos los análisis estadísticos se realizaron con Excel 2003 (Microsoft)
con el complemento Statcel2 (OMS).

Expresiones de gratitud
Agradecemos a Tomoko Ichisaka por la preparación de ratones y a Mitsuyo Maeda y Yoshinobu Toda por los análisis histológicos.
Agradecemos a Megumi Kumazaki, Mirei Murakami, Masayoshi Maruyama y Noriko Tsubooka por su asistencia técnica; Masato Nakagawa,
Keisuke Okita y Koji Shimozaki por sus comentarios científicos; y Yumi Ohuchi por asistencia administrativa. También agradecemos al Dr.
Robert Farese, Jr. por las células RF8 ES y al Dr. Toshio Kitamura por las células Plat-E y los vectores retrovirales pMX. Este trabajo fue
apoyado en parte por becas de investigación del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón para SY. Este
trabajo también es apoyado en parte por la Fundación de Ciencia Takeda, la Fundación de Investigación del Cáncer de Osaka, la Fundación
Inamori, el Fundación de investigación de Mitsubishi Pharma,

Datos suplementarios

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Documento S1. 12 Las figuras y 9 mesas .