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Combined USP30 NF25 Vol1 Spa PDF
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NF 25 FORMULARIO NACIONAL
OBSERVACIONES Y ADVERTENCIAS
En relación con los Derechos de Patentes o Marcas de los EE.UU.
La inclusión en la Farmacopea de los Estados Unidos o en el Formulario Nacional de una monografı́a sobre cualquier fármaco respecto al
cual puedan existir derechos de patentes o de marcas no se considerará, ni pretende ser, una garantı́a de derecho o privilegio protegido por
dicha patente o marca, ni una autoridad para ejercer dicho derecho o privilegio. Tales derechos y privilegios están adjudicados al propietario de
la patente o marca y ninguna otra persona podrá ejercerlos sin permiso expreso, autoridad o licencia otorgados por el propietario de dicha
patente o marca.
Contenido
VOLUMEN 1
Misión y Prefacio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v Capı́tulos Generales
Ver página 31 para detalles del contenido
Pruebas y Valoraciones Generales . . . . . . . . . .. . 34
Integrantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones . . 34
Funcionarios (2005–2010) . . . . . . . . . . . . . . . .. xi Equipos para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . .. . 76
Junta Directiva (2005–2010) . . . . . . . . . . . . . . .. xi Pruebas Microbiológicas . . . . . . . . . . . . . . . .. . 85
Consejo de Expertos (2005–2010) . . . . . . . . . . .. xi Pruebas y Valoraciones Biológicas . . . . . . . . . .. . 111
Comité Ejecutivo del Consejo de Expertos (2005– Pruebas y Valoraciones Quı́micas . . . . . . . . . . .. . 151
2010) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii Pruebas y Determinaciones Fı́sicas . . . . . . . . . .. . 240
Comités de Expertos (2005–2010) . . . . . . . . . . . . xii Información General . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 428
Comités de Expertos en Información (2005–2010) . . xiv Suplementos Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 785
Paneles Asesores Ad Hoc (2005–2010) . . . . . . . . . xv
Colaboradores durante el perı́odo 2005–2010 . . . . . xvii
Miembros de la United States Pharmacopeial Reactivos, Indicadores y Soluciones . . . . . . . . 817
Convention, 30 de junio de 2005 . . . . . . . . . .. xix Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 818
Indicadores y Papeles Indicadores . . . . . . . . . . . . 885
Soluciones . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 886
Preámbulos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiv Soluciones Amortiguadoras . . .. . . . . . . . . . . . 886
Acta Constitutiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxiv Soluciones Colorimétricas . . . .. . . . . . . . . . . . 887
Constitución y Estatutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxv Soluciones Reactivo . . . . . . .. . . . . . . . . . . . 888
Normas, Procedimientos y Polı́ticas . . . . . . . . . . . xxxviii Soluciones Volumétricas . . . . .. . . . . . . . . . . . 895
NF 25 USP 30
Incorporaciones Monografı́as
Artı́culos Incorporados a NF 25 mediante Monografı́as Oficiales de USP 30, A–H . . . . . . . . . 1381
Suplementos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1142
Revisiones que Aparecen en NF 25 Ausentes
en NF 24 y sus Suplementos . . . . . . . . . . . . . . 1142 Índice
Índice Combinado de USP 30 y NF 25 . . . . . . . . . I-1
Excipientes
Excipientes USP y NF, Agrupados por Categorı́a . . . 1143
VOLUMEN 3
Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales del NF . . . . . . 1149 Guı́a de los Capı́tulos Generales . . . . . . . . . . . v
Monografı́as Advertencias
Monografı́as Oficiales de NF 25 . . . . . . . . . . . . . 1151 Advertencias y Requisitos Generales de la USP . . . . 2585
Índice
Índice Combinado de USP 30 y NF 25 . . . . . . . . . I-1 USP 30
VOLUMEN 2 Monografı́as
Monografı́as Oficiales de USP 30, I–Z . . . . . . . . . 2601
Misión y Prefacio
USP 30–NF 25
Este apartado brinda información sobre la Convención de la avances de las ciencias analı́ticas y metrológicas. Ası́ como
Farmacopea de los Estados Unidos (USP), ası́ como también evolucionan éstas y las ciencias afines, lo mismo sucede con la
información general sobre la 30a revisión de la Farmacopea de los USP y el NF.
Estados Unidos (USP 30) y de la 25a edición del Formulario
Nacional (NF 25). Las Advertencias y Requisitos Generales (página USP 30–NF 25
1) contienen información oficial adicional sobre los usos especı́ficos
de estos textos. El texto de los compendios USP 30–NF 25 será oficial a partir del
18 de mayo de 2007, a menos que se indique algo diferente. Los
DECLARACIÓN DE LA MISIÓN compendios USP–NF contienen monografı́as de sustancias y
preparaciones (productos) oficiales. Los términos sustancia oficial
Los compendios USP–NF se publican para cumplir con la misión y preparación oficial se definen en las Advertencias Generales de
de la USP cuya definición es: promover la salud pública y beneficiar esta Farmacopea. Los compendios USP 30–NF 25 contienen
a los profesionales de la salud y a los pacientes difundiendo normas normas con fundamento cientı́fico para fármacos, productos
oficiales e información desarrolladas por sus voluntarios sobre biológicos, suplementos dietéticos y excipientes empleados en
medicamentos, otras tecnologı́as para el cuidado de la salud y formas y productos farmacéuticos. Salvo escasas excepciones,
prácticas relacionadas que se emplean para preservar y mejorar la todos los artı́culos sobre los que existen monografı́as en los
salud y promover una asistencia médica óptima. compendios USP 30–NF 25 se comercializan legalmente en los
Las actividades oficiales de la USP promueven la disponibilidad de Estados Unidos o están contenidos en artı́culos que se comercializan
productos terapéuticos seguros, eficaces y de buena calidad para legalmente.
todos los consumidores, a través del trabajo conjunto con numerosos Una monografı́a de los compendios USP–NF de una sustancia
voluntarios y partes interesadas de todo el mundo. o preparación oficial incluye la definición del artı́culo, las
condiciones de envasado y almacenamiento, otros requisitos y una
HISTORIA especificación. La especificación consiste en una serie de pruebas
universales (descripción, identificación, impurezas, valoración) y
En la Cámara de Senadores del Capitolio de los Estados Unidos, pruebas especı́ficas, uno o más procedimientos analı́ticos para cada
once médicos se reunieron el 18 de enero de 1820 para establecer una prueba y criterios de aceptación. Los ingredientes se definen como
farmacopea para los Estados Unidos. Estos profesionales buscaban fármacos o excipientes. Un excipiente es todo componente, distinto
crear un compendio de los mejores productos terapéuticos, darles de la sustancia o las sustancias activas, agregado intencionalmente
nombres útiles y proporcionar recetas para su preparación. Casi un a la formulación de una forma farmacéutica. Los excipientes no son
año después, el 15 de diciembre de 1820, se publicó la primera necesariamente inertes. Los fármacos y excipientes pueden ser
edición de la Farmacopea de los Estados Unidos. El prefacio de la sintéticos, semi-sintéticos, obtenidos de la naturaleza (fuente natural)
edición de 1820 establece que "el objetivo de una Farmacopea es o fabricados empleando tecnologı́a recombinante. Las moléculas de
seleccionar entre las sustancias que tienen un poder medicinal, mayor tamaño y las mezclas que requieren una prueba de potencia
aquéllas cuya utilidad esté plenamente establecida y mejor por lo general se denominan como artı́culos biológicos o biotecno-
comprendida, y a partir de ellas formar preparaciones y compuestos lógicos.
que por su eficacia presenten una mayor ventaja. Debe distinguir, Los compendios USP 30–NF 25 contienen aproximadamente
asimismo, esos artı́culos mediante nombres convenientes y es- 4100 monografı́as y más de 200 Pruebas y Valoraciones Generales
pecı́ficos a fin de evitar problemas o incertidumbre entre médicos y (Capı́tulos Generales numerados hasta 1000) y Capı́tulos de
farmacéuticos". Actualmente, esta misión sigue siendo la misma Información General (numerados a partir de 1000). Los Capı́tulos
para la USP. Generales explican los procedimientos que se citan con frecuencia,
Con el tiempo, la naturaleza de la Farmacopea de los Estados a veces con criterios de aceptación, con el fin de compilar en un solo
Unidos (USP) pasó de ser un compendio de recetas a un compendio lugar información repetitiva que aparece en muchas monografı́as.
de normas de productos farmacéuticos. Cambió también el Las monografı́as y Capı́tulos Generales, nuevos y revisados, y el
cronograma de publicación ya que desde 1820 hasta 1942 la USP material obsoleto que ha sido eliminado de esta edición se indican en
se publicó cada 10 años, mientras que desde 1942 hasta 2000 cada la página xli, en el apartado Incorporaciones.
5 años y a partir de 2002 la publicación sale anualmente. Organización de los Compendios USP 30–NF 25—Dado el
En 1888, la American Pharmaceutical Association (Asociación crecimiento de su contenido, los compendios USP 30–NF 25 se
Farmacéutica de los Estados Unidos) publicó el primer formulario publican en tres volúmenes. El Volumen 1 incluye secciones de
nacional bajo el tı́tulo Formulario Nacional de Preparaciones No introducción (Misión y Prefacio, Integrantes, Colaboradores,
Oficiales (NF, por sus siglas en inglés). Tanto la USP como el NF Miembros, Preámbulos [anteriormente denominados Apéndices],
fueron reconocidos en la Ley Federal de Alimentos y Medicamentos Incorporaciones y Lista Detallada, y Comentarios). Asimismo,
de los Estados Unidos de 1906, y nuevamente en la Ley Federal de incluye Advertencias y Requisitos Generales de la USP, Capı́tulos
Alimentos, Medicamentos y Cosméticos de 1938. En 1975 la USP Generales, Capı́tulos de Suplementos Dietéticos, Reactivos, Tablas
adquirió el National Formulary (NF) y ambos compendios se de Referencia, Monografı́as de Suplementos Dietéticos, Adverten-
comenzaron a publicar en un único volumen titulado USP–NF. cias Generales del NF, Excipientes y Monografı́as del NF. El
En la actualidad, la USP continúa desarrollando los compendios Volumen 2 incluye monografı́as de la USP de la letra A hasta la L y
USP–NF mediante el trabajo del Consejo de Expertos, publicando el Volumen 3 incluye monografı́as de la USP de la letra M hasta la Z.
una obra que proporciona normas para artı́culos basados en los Cada volumen contiene un ı́ndice completo. Las monografı́as de
fármacos y preparaciones, con la excepción de los suplementos
dietéticos, aparecen en el primer apartado de la USP. Las
vi Misión y Prefacio USP 30
monografı́as de suplementos dietéticos aparecen en un apartado oficial de la revisión con el Suplemento o PF correspondiente. Por
separado de la USP. Los Capı́tulos Generales especı́ficos para los ejemplo, un subı́ndice cuadrado negro seguido del número 1 indica
suplementos dietéticos se incluyen por orden numérico con los que la revisión será oficial por medio del Primer Suplemento. NOTA—
demás Capı́tulos Generales en la USP. Las monografı́as de Cuando los Anuncios de Revisión Intermedia se incorporan en el
excipientes se presentan por lo general en el NF, pero pueden Suplemento o en la edición anual siguiente, los cı́rculos negros se
también aparecer en la USP, con la referencia cruzada correspon- reemplazan por el cuadrado negro y el número del Suplemento o por
diente cuando también son fármacos. En la página 1143 aparece una el triángulo y el número de la edición anual correspondiente. La tabla
tabla de los excipientes organizados por categorı́a funcional. siguiente indica los sı́mbolos y las fechas oficiales para los Anuncios
Revisiones—Los compendios USP–NF se revisan en forma de Revisión Intermedia y los Suplementos de los compendios USP
continua. Las revisiones se presentan anualmente, en los Suplemen- 30–NF 25:
tos semestrales, en los Anuncios de Revisión Intermedia (Interim
Revision Announcement, IRA) y en los Boletines de Revisión USP 30–NF 25
(Revision Bulletins, en el sitio web de la USP). Documento de Revisión
Suplementos—El Primer Suplemento de los compendios USP Anuncio de
30–NF 25 se publicará en febrero de 2007 y será oficial a partir de Revisión
agosto de 2007. El Segundo Suplemento se publicará en junio de Suplemento Intermedia Fecha Oficial Sı́mbolos
2007 y será oficial en diciembre de 2007. Los usuarios de los 1 18 de febrero, .y
.1
materiales impresos de la USP deben conservar los Suplementos y 2007
mantener vigentes sus suscripciones al Pharmacopeial Forum (PF) 2 18 de abril, 2007 .y
.2
a fin de contar con información actualizada. La versión online se 3 18 de junio, .y
.3
actualiza con cada Suplemento o con la revisión anual. Cada vez que 2007
se publica una nueva edición o suplemento durante la suscripción 1 18 de agosto, &
y&1S (USP30)
vigente, se hará entrega de un CD–ROM nuevo. El Índice de cada 2007
Suplemento es acumulativo e incluye citas de la revisión anual y, en 4 18 de agosto, .y
.4
el caso del Segundo Suplemento, citas del Primer Suplemento. Los 2007
dos Suplementos se incluyen en la siguiente edición anual, junto con 5 18 de octubre, .y
.5
las nuevas revisiones oficiales que hayan sido adoptadas con 2007
posterioridad al Segundo Suplemento de la edición previa de los 2 18 de diciembre, &
y&2S (USP30)
compendios. 2007
Anuncios de Revisión Intermedia (IRA)—Los IRA contienen 6 18 de diciembre, .y
.6
revisiones que se oficializan en el intervalo comprendido entre la 2007
publicación de la revisión anual y los Suplementos, y por
consiguiente ofrecen un mecanismo expedito para oficializar las
revisiones. Aparecen en la publicación bimestral de la USP, Nombres Quı́micos y Números de Registro CAS—Los
Pharmacopeial Forum (PF), y la fecha oficial se indica en la subtı́tulos quı́micos que aparecen en las monografı́as son los
publicación. Posteriormente se incorporan en el siguiente Suple- nombres empleados en los ı́ndices del Chemical Abstracts Service
mento o revisión anual aunque sus fechas oficiales puedan preceder (Servicio de Resúmenes Quı́micos; CAS por sus siglas en inglés) de
la fecha oficial de dicha publicación. Los suscriptores de los la American Chemical Society (Sociedad Quı́mica de los Estados
compendios USP–NF pueden solicitar una reimpresión de cada IRA. Unidos). Sólo se incluyen en las monografı́as cuyos tı́tulos
Pharmacopeial Forum (PF)—Cada PF contiene varios aparta- especifican sustancias que constituyen entidades quı́micas definibles.
dos. El apartado Polı́ticas y Anuncios (Policies and Announcements) El primer subtı́tulo es la forma invertida del nombre quı́mico
brinda información sobre plazos para la presentación de publica- sistemático desarrollado por el CAS. Se presenta de acuerdo con las
ciones y comentarios, noticias de la USP y resúmenes de temas reglas establecidas con el transcurso de los años por la International
tratados por el Consejo de Expertos y sus Comités de Expertos. Las Union of Pure and Applied Chemistry (Unión Internacional de
propuestas de revisión se presentan como Revisiones Preliminares de Quı́mica Pura y Aplicada; IUPAC, por sus siglas en inglés) y por la
la Farmacopea (Pharmacopeial Previews) o como Revisiones en International Union of Biochemistry (Unión Internacional de
Proceso (In-Process Revisions). Las Revisiones Preliminares se Bioquı́mica), y según se emplea en las publicaciones actuales de
centran en monografı́as y Capı́tulos Generales que están en una los Chemical Abstracts (Resúmenes Quı́micos; CA, por sus siglas en
primera etapa de consideración. También presentan monografı́as inglés). (N.T. En la presente edición en español, los primeros
nuevas para artı́culos polémicos que requieran de un perı́odo de subtı́tulos de los nombres quı́micos se conservan en inglés para
debate público más prolongado. Según el debate público, una facilitar la búsqueda de información adicional en la bibliografı́a
propuesta de Revisión Preliminar puede avanzar o no a la etapa de internacional). El segundo subtı́tulo, expresado en la forma no
revisión en proceso. Las Revisiones en Proceso representan invertida, es del tipo sistemático utilizado anteriormente en los CA.
borradores de revisiones que se espera alcancen la condición de Es idéntico, o muy similar, al nombre quı́mico aprobado y empleado
oficiales, y que necesitan la revisión final y aprobación del por la IUPAC y por la Organización Mundial de la Salud (OMS). La
Comité de Expertos pertinente. IUPAC utiliza ampliamente nombres y términos calificativos no
El PF también incluye Propuestas Pendientes y Canceladas sistemáticos y semisistemáticos (a menudo denominados ‘‘tri-
(Pending and Canceled Proposals) y contiene una sección sobre viales’’), los cuales dificultan su búsqueda en medios electrónicos.
Armonización (Harmonization). La sección Estı́mulos al Proceso de Por el contrario, los nombres CAS son totalmente sistemáticos para
Revisión (Stimuli to the Revision Process) presenta informes la mayorı́a de las sustancias y pueden encontrarse electrónicamente
o declaraciones de organismos oficiales, artı́culos cientı́ficos con más facilidad. A menudo, los dos subtı́tulos antes mencionados
pertinentes a los temas de los compendios, comentarios generales son idénticos y, en ocasiones, se suministra un sinónimo CAS
de partes interesadas y resúmenes de comentarios recibidos en a modo de tercer subtı́tulo. Las monografı́as con subtı́tulos quı́micos
respuesta a iniciativas sobre polı́ticas. El PF concluye con secciones generalmente incluyen también los números de registro CAS. Estos
que contienen Nomenclatura, Índice y Reactivos para Cromato- números en itálicas y entre corchetes funcionan de manera
grafı́a utilizados en los compendios USP–NF y en el PF. Cada independiente de la nomenclatura como indicadores numéricos
publicación del PF también proporciona un ı́ndice acumulativo para invariables de sustancias quı́micas singulares, no ambiguas, en el
el año calendario correspondiente. registro CAS y, por consiguiente, son convenientes y gozan de un
uso difundido.
Sı́mbolos que Indican Cambios en el Texto Oficial—Se trata de
los sı́mbolos que identifican el comienzo y el final de cada revisión. Edición en Español de los Compendios USP 30–NF 25—En
En los Suplementos, un superı́ndice cuadrado de color negro marca 2006, la USP inició la publicación de la edición oficial en español de
el inicio de cada revisión y un subı́ndice cuadrado de color negro los compendios USP–NF. El mantenimiento de esta edición sigue el
marca el final de la revisión. Se utilizan cı́rculos negros para los seis mismo enfoque de revisión que la edición en inglés.
posibles Anuncios de Revisión Intermedia anuales que se publican en
el PF. Junto al subı́ndice hay un número que relaciona la fecha
USP 30 Misión y Prefacio vii
Presentaciones Impresas y Electrónicas—Todas las publica- una amplia contribución voluntaria de materiales y de datos de
ciones de la USP están disponibles en forma impresa. Además, los prueba pertinentes por parte de fabricantes de productos farmacéu-
compendios USP–NF y sus dos Suplementos anuales se encuentran ticos. La USP oficializa este material no oficial a través de
disponibles en discos compactos (CD) y en formato electrónico en meticulosos estudios de caracterización y de pruebas realizadas en
Internet. La versión en CD brinda a los usuarios acceso directo a los colaboración, seguidos por una etapa de revisión y, si resultara
compendios USP–NF en sus computadoras. El formato electrónico apropiado, por la aprobación del Comité de Estándares de Referencia
en Internet permite a usuarios individuales registrados acceder a este del Consejo de Expertos.
formato online a través de la Internet. Ambos formatos electrónicos
proporcionan un acceso rápido y sencillo al contenido oficial de los ÓRGANOS DE GOBIERNO, ESTABLECIMIENTO DE
compendios USP–NF con múltiples opciones de búsqueda. Los NORMAS Y DE ADMINISTRACIÓN DE LA USP
formatos electrónicos se actualizan en forma acumulativa para
integrar el contenido de los Suplementos. También se encuentran En la USP, los órganos de gobierno, de establecimiento de normas
disponibles versiones de consulta electrónica del PF y del y de administración incluyen la Convención de la USP, la Junta
Diccionario USP (ver más adelante). Directiva, el Consejo de Expertos y sus Comités de Expertos,
Paneles Asesores y personal. Otros cuerpos de voluntarios incluyen
OTRAS PUBLICACIONES RELACIONADAS A LOS Foros de Partes Interesadas, Equipos de Proyecto y Cuerpos de
COMPENDIOS USP–NF Asesoramiento, que actúan en calidad de asesores brindando su
opinión a los órganos de gobierno, establecimiento de normas y de
Reactivos para Cromatografı́a—Esta extensa referencia ofrece administración de la USP.
información detallada necesaria para llevar a cabo los procedimien- Convención de la USP—La dirección y las prioridades de la USP
tos cromatográficos incluidos en los compendios USP–NF. Reactivos están determinadas por más de 400 miembros acreditados de la
para Cromatografı́a (Chromatographic Reagents) incluye las Convención, divididos en nueve categorı́as (página xix). Se invita
marcas comerciales de los reactivos para columna citados en todas a las organizaciones que reúnan las condiciones necesarias para cada
las propuestas de procedimientos analı́ticos nuevos o revisados para categorı́a a que designen a un representante. La composición de la
cromatografı́a de gases o de lı́quidos publicados en el PF desde Convención se determina de manera tal de asegurar una representa-
1980. Reactivos para Cromatografı́a también ayuda a llevar un ción adecuada de aquellos sectores del sistema de salud que se ven
registro de los reactivos para columna que se emplearon para validar influenciados por las actividades de la USP y que, a su vez, influyen
los procedimientos analı́ticos oficializados. El listado de reactivos en ella. Darrell R. Abernethy, M.D., Ph.D., Jefe del Laboratorio de
para columna con sus marcas se actualiza bimestralmente en el PF. Investigación Clı́nica en el National Institute on Aging, es el
USP Pharmacists’ Pharmacopeia—Los compendios USP–NF Presidente de la Convención de la USP durante el perı́odo 2005–
están principalmente dirigidos a los fabricantes de productos 2010. Los miembros de la Convención eligen al Presidente, el
farmacéuticos y suplementos dietéticos aunque también contienen Tesorero y a otros miembros de la Junta Directiva como también al
muchas monografı́as y texto relacionado útil para los profesionales Consejo de Expertos. También votan las resoluciones que guı́an la
que practican la preparación magistral. Para adaptarse mejor a las polı́tica cientı́fica de la USP y las iniciativas referidas a la salud
necesidades de estos profesionales y, en forma más amplia, a las pública y actualizan, conforme a las necesidades, la Constitución y
necesidades en el ámbito de la farmacia, la USP ha puesto los Estatutos de la USP. Se planea realizar posiblemente la próxima
a disposición la USP Pharmacists’ Pharmacopeia. Esta farmacopea reunión de la Convención de la USP durante la primavera de 2010 en
ofrece información oficial abreviada de los compendios USP–NF Washington, D.C.
pertinente a la farmacia, y otra información autorizada. La primera se Junta Directiva—La Junta Directiva de la USP tiene a su cargo la
refiere a normas para artı́culos oficiales, mientras que la última gestión de los asuntos comerciales, las finanzas y los bienes de la
ofrece información general de utilidad para los profesionales. Ambos USP. Durante los cinco años que dura su gestión, esta Junta define la
textos se desarrollan siguiendo las normas y procedimientos del dirección estratégica de la USP mediante decisiones que atañen
Consejo de Expertos. La USP Pharmacists’ Pharmacopeia a operaciones y polı́ticas clave. Un listado con los nombres de los
está disponible en dos formatos: impreso y electrónico en Internet. miembros de la Junta Directiva para el perı́odo 2005-2010 figura en
Diccionario de la USP—El USP Dictionary of USAN and la página xi.
International Drug Names (Diccionario de la USP de USAN y Consejo de Expertos—El Consejo de Expertos es el órgano que
Denominación Común Internacional) ofrece, en un solo volumen, establece las normas de la USP. Está compuesto por los presidentes
los Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus de los 56 Comités de Expertos, elegidos por términos de cinco años
siglas en inglés) para los fármacos; los nombres USP–NF oficiales; por los miembros de la Convención de la USP. Un Comité de
las denominaciones comunes, los nombres comerciales y quı́micos; Nombramiento, compuesto por el Presidente del Consejo de
las fórmulas gráficas; las fórmulas y los pesos moleculares; los Expertos, el Presidente de la Convención y el Vicepresidente del
números de registro CAS y las designaciones por código; los Comité de Nombramiento para el Consejo de Expertos, nomina a los
fabricantes de fármacos; y las categorı́as farmacológicas y individuos que posteriormente son elegidos por los miembros del
terapéuticas. El Diccionario contribuye a asegurar la precisión en Consejo de Expertos para servir como miembros de los Comités de
lo siguiente: el etiquetado de los productos; informes, artı́culos y Expertos. Los presidentes y miembros de los comités son en total
correspondencia; solicitudes reglamentarias de la FDA y prospectos más de 600 voluntarios de todas partes del mundo. Los cuarenta
de productos farmacéuticos. Se publica anualmente (última edición, Comités de Expertos en Normas son responsables del contenido de
abril de 2006) y está reconocido por la FDA como la fuente oficial los compendios USP–NF y de las publicaciones afines (ver Figura
para nombres de medicamentos establecidos. (Ver el apartado 1) y se han agrupado en Grupos de Colaboración por temas de
Nomenclatura más adelante.) interes común. Los Comités de Expertos en Información se abocan al
Catálogo de Estándares de Referencia—El empleo de los desarrollo de Guı́as Modelo para la Ley de Modernización de
Estándares de Referencia USP-NF oficiales promueve la calidad Medicare y otras actividades sobre información. El Comité Ejecutivo
uniforme de los fármacos y respalda las pruebas realizadas, por todas del Consejo de Expertos (ver página xii) imparte las directivas
las partes involucradas, de todos los artı́culos fabricados y los generales, constituye un órgano de apelación y cumple otras
preparados magistrales. La publicación en la que se lista el conjunto funciones que respaldan las operaciones del Consejo.
de Estándares de Referencia USP–NF oficiales se puede acceder Paneles Asesores del Consejo de Expertos—El Presidente del
a través del sitio web de la USP, www.usp.org, y se puede solicitar Consejo de Expertos puede nombrar paneles asesores que colaboren
en forma impresa al Personal de Ventas y Comercialización de la con el Consejo de Expertos en la toma de decisiones cientı́ficas
USP llamando al 1-301-816-8237. El listado identifica artı́culos e implementación de nuevas directivas de la USP relacionadas con
nuevos, lotes de reemplazo, lotes de un solo artı́culo que son los compendios USP–NF. La lista de los Paneles Asesores se
oficiales simultáneamente, lotes eliminados de la condición oficial y encuentra en la sección sobre Integrantes (página xv). Esta lista
una lista preliminar de artı́culos que serán adoptados eventualmente. cambia frecuentemente cuando los paneles asesores terminan su
Se incluye información sobre las órdenes de compra y se sugieren gestión y los nuevos paneles comienzan sus deliberaciones.
nombres de distribuidores que puedan facilitar la disponibilidad
internacional de estos artı́culos. Este programa se ve beneficiado por
viii Misión y Prefacio USP 30
ción y falsificación de etiquetado que se establecen en la Ley FD&C. los compendios USP–NF referidas a las preparaciones magistrales se
Estas disposiciones le otorgan amplia autoridad a la FDA para pueden imponer tanto a nivel federal como estatal; por ejemplo, una
prevenir el ingreso de determinados productos en el mercado de los preparación magistral recetada por un médico y que figure en una
Estados Unidos o para retirarlos de circulación, basándose en las monografı́a de los compendios USP–NF, cuando se analice, debe
normas establecidas en los compendios USP–NF. ajustarse a lo estipulado en dicha monografı́a.
La identidad de un artı́culo oficial, como su nombre lo indica, se Nomenclatura—En los Estados Unidos, la FDA tiene autoridad
establece si cumple en todos los aspectos con los requisitos de la para establecer los nombres de los ingredientes y productos
monografı́a correspondiente y otras secciones pertinentes de los farmacéuticos y determinar los nombres propios de productos
compendios. La Ley FD&C estipula que un artı́culo puede diferir en biológicos. Sin embargo, en la mayorı́a de los casos, la FDA ejecuta
potencia, calidad o pureza si esta diferencia se indica en la etiqueta esta tarea trabajando con el United States Adopted Names (USAN)
del artı́culo. Las preparaciones oficiales (un producto farmacéutico, Council (Consejo de Nombres Adoptados en los Estados Unidos)
un suplemento dietético, incluidos los suplementos nutricionales, para determinar los nombres de los fármacos y sustancias biológicas,
o un dispositivo terminado) pueden contener ingredientes adicio- y con la USP para determinar los nombres de los productos
nales adecuados. (Ver Advertencias Generales). farmacéuticos. La supervisión de los nombres comerciales y
Medicamentos—El objetivo de la USP es tener monografı́as de nombres propios es responsabilidad de la FDA, en su trabajo con
sustancias y preparaciones (productos) en los compendios USP–NF los solicitantes.
para todos los medicamentos aprobados por la FDA. La USP El programa del Consejo de la USAN comenzó en 1961
también elabora monografı́as para productos terapéuticos no proporcionando los nombres de los ingredientes de los medicamen-
aprobados por la FDA; por ej., medicamentos anteriores a 1938, tos antes de su comercialización. La USP participa en esta actividad
suplementos dietéticos y preparaciones magistrales. Si bien la junto con la American Medical Association (Asociación Médica de
presentación de la información necesaria para que el Consejo de los Estados Unidos), la American Pharmacists Association (Asocia-
Expertos elabore una monografı́a es voluntaria, el cumplimiento de ción de Farmacéuticos de los Estados Unidos) y la FDA. Las
lo estipulado en una monografı́a de los compendios USP–NF, si se conclusiones del Consejo se incorporan, junto con otros nombres
encuentra disponible, es obligatorio. para los medicamentos (entre ellos, los nombres genéricos, de marca
Productos Biológicos—En los Estados Unidos, aunque algunos y quı́micos, y las designaciones establecidas por los códigos), en el
productos biológicos se encuentran regulados por las disposiciones USP Dictionary of USAN and International Drug Names. Desde
de la Ley de Servicios de Salud Pública (PHSA, por sus siglas en 1988, esta publicación ha sido reconocida por la reglamentación
inglés), las disposiciones de la Ley FD&C también se aplican a estos federal como la fuente de nombres establecidos para fármacos en los
productos. Por esta razón, los productos aprobados por la PHSA Estados Unidos.
deben cumplir con las disposiciones referentes a adulteración y La FDA puede establecer los nombres de productos farmacéuticos
falsificación de etiquetado que se establecen en la Ley FD&C en los pero, a menudo, éstos son determinados en forma conjunta con la
Artı́culos 501(b) y 502(g) y, por consiguiente, deben ajustarse a las USP en las actividades desarrolladas por el Comité de Expertos en
monografı́as oficiales de USP–NF. Nomenclatura del Consejo de Expertos. Los nombres desarrollados
Dispositivos Médicos—El Artı́culo 201(h) de la Ley FD&C por este Comité se emplean como tı́tulos de las monografı́as
define como dispositivo a un instrumento, aparato, artı́culo similar, pertinentes y de esa manera son reconocidos como "nombres
o componente de los mismos, reconocido en los compendios USP– establecidos" para los productos farmacéuticos en el Artı́culo
NF. El Artı́culo 502(e) de la Ley FD&C, en ausencia de una 502(e)(3) de la Ley FD&D. El Comité de Nomenclatura de
designación de la FDA, define el nombre establecido de un Medicamentos de la USP se formó en 1986 para complementar los
dispositivo como el tı́tulo oficial en un compendio oficial. A pesar Comités Ejecutivos del Departamento de Desarrollo de Normas y el
de estas disposiciones reglamentarias, no se cuenta con un Departamento de Información, y para evitar incongruencias respecto
reconocimiento de la autoridad de la USP para establecer normas a la nomenclatura. Después de la reunión de la Convención de la
y de su capacidad para definir un dispositivo médico comparable al USP celebrada en el año 2000, la responsabilidad de idear y, cuando
que existe para otros productos terapéuticos regulados por la FDA. sea necesario, revisar los requisitos de etiquetado ha sido delegada
De acuerdo con la Ley de Modernización de la Administración de a este Comité, que actualmente se denomina Comité de Expertos en
Alimentos y Medicamentos de 1997, el Center for Devices and Nomenclatura. Las tareas del Comité no se superponen con las del
Radiological Health (Centro para Dispositivos y Salud Radiológica) Consejo de la USAN; en todo caso esas tareas son complementarias
reconoce normas nacionales e internacionales, entre las que se y abordan la normalización de los nombres del compendio, en
incluyen algunas pruebas y valoraciones de la USP para dispositivos particular los nombres de las formas farmacéuticas y los nombres de
médicos. productos farmacéuticos combinados.
Suplementos Dietéticos—Las enmiendas de la Ley de Salud y
Educación sobre Suplementos Dietéticos de 1994 a la Ley FD&C ACTIVIDADES INTERNACIONALES
designan a la USP y al NF como los compendios oficiales para
suplementos dietéticos. Las enmiendas establecen que puede Grupo de Debate Farmacopeico—La USP armoniza las
considerarse que un suplemento dietético lleva un etiquetado falso monografı́as de excipientes farmacopeicos y los Capı́tulos Generales
cuando dicho suplemento está considerado en una monografı́a en un en el Grupo de Debate Farmacopeico (PDG, por sus siglas en
compendio oficial y se presenta como un artı́culo que cumple con inglés). Este grupo incluye representantes de la Farmacopea
esta monografı́a pero, en realidad, no se ajusta a los requisitos. Se Europea, de la Farmacopea Japonesa y de la Farmacopea de los
debe aseverar que un suplemento dietético cumple con una Estados Unidos, y de la OMS (como observador). De acuerdo con la
monografı́a sobre un suplemento dietético de los compendios definición del PDG, ‘‘un capı́tulo general farmacopeico u otro
USP–NF para que se apliquen las normas farmacopeicas. En esto documento farmacopeico está armonizado cuando una sustancia o un
difiere de un producto farmacéutico, para el cual la conformidad con producto farmacéutico, que se analiza según el procedimiento
la monografı́a es obligatoria sin necesidad de aseverarlo. armonizado del documento, arroja los mismos resultados y se llega
Preparaciones Magistrales—Las monografı́as sobre este tipo de a la misma decisión respecto de aceptarlo o rechazarlo’’.
preparaciones proporcionan información o normas aplicables a la El Capı́tulo de Información General h1196i, Armonización
preparación magistral. Preparación magistral implica la preparación, Farmacopeica, provee información acerca de lo siguiente: (1) la
mezcla, ensamblaje, envasado o etiquetado de un fármaco Declaración de Polı́ticas del PDG; (2) los Procedimientos de
o dispositivo u otro artı́culo, como resultado de la orden de un Trabajo del PDG ; (3) un debate; (4) un informe de estado; y (5) un
médico o anticipándose a dicha orden en base a patrones de glosario.
prescripción de rutina observados en forma regular. Las normas en
USP 30 Integrantes / Comités xi
Integrantes
Funcionarios de la Convención de la USP, Junta Directiva
y el Consejo de Expertos, Comités de Expertos y Órganos
Afines
Desarrollo de Monografı́as: Pulmonar y Esteroides (MD PS) Uso Seguro de Medicamentos (SMU)
MICHAEL A. CUTRERA, M.S., Presidente MICHAEL D. MURRAY, PHARM.D., Presidente
Quanyin Gao, Ph.D.; Sándor Görög., Ph.D.; Peter C. Ruenitz, Suzanne C. Beyea, Ph.D., R.N.; Maureen Cabill BSN, MSN;
Ph.D.; Michael J. Skibic, B.S., M.S.; Saleh A. Turujman, Ph.D.; William Elliot, M.D.; Elizabeth A. Flynn, Ph.D., R.Ph.; Howard
Terry D. Wilson, Ph.D. E. Greenberg, M.D.; Matthew C. Grissinger, B.S.; Mark L. Horn,
M.D.; William N. Kelly, Pharm.D.; Gerald McEvoy, Pharm. D.;
Nomenclatura (NOM) Ronald A. Nosek, R.Ph., M.S.; Marjorie A. Phillips, M.S. R.Ph.;
Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Deborah Simmons, R.N.,
THOMAS P. REINDERS, PHARM.D., Presidente M.S.N., CCRN, CCNS; Carl A. Sirio, M.D.; John Straumanis,
Loyd V. Allen, Jr., Ph.D.; Mary B. Baker, Pharm.D.; Dawn M. M.D.; Mark Sullivan, Pharm.D.; Kathleen Uhl, M.D.
Boothe, D.V.M., Ph.D.; Herbert S. Carlin, D.Sc.; Mrunal S.
Chapekar, Ph.D.; Edward M. Cohen, Ph.D.; Stephanie Y. Estadı́stica (STAT)
Crawford, Ph.D.; Everett Flanigan, Ph.D.; Thomas S. Foster,
Pharm.D.; Michael J. Groves, Ph.D.; William Heller, Ph.D.; ROBERT C. CAPEN, PH.D., Presidente
David F. Long, Ph.D.; Ginette A. Pepper, Ph.D.; Jerry Phillips, Robert F. Dillard, M.S.; Kristi L. Griffiths, Ph.D.; Anthony G.
B.S.; Philip D. Walson, M.D.; Chao-Mei Yu, Ph.D. Okinczyz, M.P.H., M.B.A.; Trace W. Searls, Ph.D.; Robert
Singer, M.S.; Charles Y. Tan, Ph.D.; Lynn D. Torbeck, M.S.
Envasado y Almacenamiento (P&S)
Preparaciones Magistrales Estériles (SCC)
CARYL JEANNE TABORSKY, B.S., Presidente
Clint Bullock, B.S.; Joe Ciezkowski, B.S., M.S.; Steven M. DAVID W. NEWTON, PH.D., Presidente
Cobb, B.S.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Mary G. Foster, Samuel C. Augustine, Pharm.D.; Mary B. Baker, Pharm.D.;
Pharm.D.; Judith Haber, B.A.; Edward L. McKinley, B.S.; James F. Cooper, Pharm.D.; Donald J. Filibeck, Pharm.D.; Larry
Regina Peacock, R.Ph., Ph.D.; Angi S. Rosenberry, B.A. W. Griffin, B.S.; Kenneth L. Hughes, B.S.; Eric S. Kastango,
M.B.A.; Keith H. St. John, M.S.; Laura A. Thoma, Pharm.D.;
Productos Parenterales: Industriales (PPI) Lawrence A. Trissel, B.S.; James Wagner
STEVEN NAIL, PH.D., Presidente Medicamentos Veterinarios (VET)
Michael J. Akers, Ph.D.; D. Scott Aldrich, B.S.; James C.
Boylan, Ph.D.; David F. Driscoll, Ph.D.; Linda Felver, Ph.D.; MARK G. PAPICH, D.V.M., M.S., Presidente
Michael J. Groves, Ph.D.; Dana M. Guazzo, Ph.D.; Mary Joan Dawn M. Boothe, D.V.M., Ph.D.; Carol A. Davis, Ph.D.; Arthur
Hampson-Carlin, B.S., M.B.A.; Stephen E. Langille, Ph.D.; J. Faulkner, M.S.; Brian J. Fichter, Pharm. D., R.Ph.; Todd P.
Russell E. Madsen, M.S. Foster, Ph.D.; Krishan Kumar, Ph.D.; Luis Ocampo, D.V.M.;
Cathy L. Wood, B.S.
Formas Farmacéuticas (PDF)
Información sobre Medicina Veterinaria (VMI)
DAVID F. LONG, PH.D., Presidente
Kenneth S. Alexander, Ph.D.; Paul M. Bummer, Ph.D.; Pramod PATRICIA M. DOWLING, D.V.M., Presidente
K. Gupta, Ph.D.; Ralph A. Heasley, Ph.D.; Keith Marshall, Terrence P. Clark, D.V.M., Ph.D.; Ronette Gehring, B.V.Sc.,
Ph.D.; Kathi Rinesmith, R.Ph., M.S.; Allen Rudman, Ph.D.; J. MmedVet, MRCVS; Dinah G. Jordan, Pharm.D.; Vernon ‘‘Cory’’
Howard Rytting, Ph.D.; Thomas R. Tice, Ph.D. Langston, D.V.M., Ph.D.; Katrina L. Mealey, D.V.M., Ph.D.;
Mark G. Papich, D.V.M., M.S.; M. Gatz Riddell, D.V.M., Ph.D.
Aguas para Uso Farmacéutico (PW)
ANTHONY C. BEVILACQUA, PH.D., Presidente
Max S. Lazar, B.A.; Nrapendra Nath, Ph.D.; Carl C. Roe, B.S.;
Bruno Rossi; Rostyslaw O. Slabicky, B.S.; Teri C. Soli, Ph.D. Comités de Expertos en Información
Información Radiofarmacéutica (RI)
(2005–2010)
Comité de Expertos en Cardiologı́a
CAROL S. MARCUS, M.D., PH.D., Presidente
Jorge R. Barrio, Ph.D.; R. Edward Coleman, M.D.; Alvin J. SARAH A. SPINLER, Pharm.D., Presidente
Lorman, J.D.; Donald M. Lyster, Ph.D.; James A. Ponto, M.S.; Joseph R. Carver, M.D.; Mark Cziraky, Pharm.D.; Cynthia
Laura L. Ponto, Ph.D.; Barry A. Siegel, M.D.; Edward B. Kirman, Pharm.D.; Nancy M. Allen LaPointe, Pharm.D.;
Silberstein, M.D.; James B. Stubbs, Ph.D., Mathew Thakur, Alexander Shepherd, M.D., Ph.D.; Barbara S. Wiggins, Pharm.D.
Ph.D.
Comité de Expertos en Dermatologı́a
Radiofármacos y Agentes para Imágenes Médicas (RMI) DENNIS P. WEST, Ph.D., F.C.C.P.
BONNIE B. DUNN, PH.D., Presidente Robert J. Anderson, J.D.; Frederick A. Curro, D.M.D., Ph.D.;
Thomas E. Boothe, Ph.D.; Patricia E. Cole, M.D., Ph.D.; Joseph Steven R. Feldman, M.D., Ph.D.; Ali Moiin, M.D.
C. Hung, Ph.D.; Ravindra K. Kasliwal, Ph.D.; Hank Kung,
Ph.D.; Jerome M. Lewis, M.D., Ph.D.; Steve Zigler, Ph.D.
USP 30 Integrantes / Comités xv
Colaboradores durante el
perı́odo 2005–2010
Lista de los participantes que aportaron información para el desarrollo o revisión de
Capı́tulos Generales o monografı́as de los compendios USP–NF durante el proceso
del establecimiento de normas USP, que no se mencionaron en otra parte de los
compendios.
University of Texas at Austin College of Pharmacy, Salomon A. Organizaciones Cientı́ficas y Profesionales Estatales y
Stavchansky, Ph.D. Nacionales
University of Utah College of Pharmacy, John W. Mauger, Ph.D. Academy of Managed Care Pharmacy, Marissa C. Schlaifer, R.Ph.
Shenandoah University Bernard J. Dunn School of Pharmacy, American Academy of Allergy, Asthma and Immunology, Lanny J.
Regina F. Peacock, Ph.D. Rosenwasser, M.D.
Virginia Commonwealth University/Medical College of Virginia American Academy of Clinical Toxicology, Inc., Edward P.
School of Pharmacy, Joanne Peart, Ph.D. Krenzelok, Pharm.D.
University of Washington School of Pharmacy, Gary W. Elmer, American Academy of Family Physicians, Charles E. Driscoll, M.D.
Ph.D. American Academy of Neurology, Thomas N. Chase, M.D.
Washington State University College of Pharmacy, Danial E. Baker, American Academy of Nurse Practitioners, Jan Towers, Ph.D., NP-C
Pharm.D. American Academy of Ophthalmology, Joel S. Mindel, M.D., Ph.D.
West Virginia University School of Pharmacy, Arthur I. Jacknowitz, American Academy of Pediatrics, Richard L. Gorman, M.D.
Pharm.D. American Academy of Physician Assistants, Robert J. McNellis,
University of Wisconsin School of Pharmacy, Melvin H. Weinswig, M.P.H., PA-C
Ph.D. American Academy of Veterinary Pharmacology and Therapeutics,
University of Wyoming School of Pharmacy, Kurt Dolence, Ph.D. Cory Langston, D.V.M., Ph.D., DACVCP
American Association of Colleges of Nursing, Ellen Rudy, Ph.D.
Asociaciones Farmacéuticas Estatales American Association of Colleges of Osteopathic Medicine, Anthony
Alabama Pharmacy Association, William S. Eley, II J. Silvagni, D.O., Pharm.D.
Alaska Pharmacy Association, Roger Penrod, R.Ph. American Association of Colleges of Pharmacy, Kenneth W. Miller,
Arizona Pharmacy Association, Edward P. Armstrong, Pharm.D. Ph.D.
Arkansas Pharmacists Association, Kristen G. Riddle, Pharm.D. American Association of Critical-Care Nurses, Barbara A. Johnston,
California Pharmacists Association, R. David Lauper, Pharm.D. Ph.D.
Colorado Pharmacists Association, Val Kalnins, R.Ph. American Association of Pharmaceutical Scientists, Eugene F. Fiese,
Connecticut Pharmacists Association, Peter J. Tyczkowski, M.B.A., Ph.D.
R.Ph. American Association of Pharmacy Technicians, Inc., Douglas E.
Delaware Pharmacists Society, Kenneth Musto, R.Ph. Scribner
Washington D.C. Pharmaceutical Association, Herbert Kwash, American Association of Poison Control Centers, Rose Ann G.
R.Ph. Soloway, R.N., M.S.Ed., DABAT
Florida Pharmacy Association, Michael A. Mone, B.S., J.D. American Chemical Society, David A. Fay, Ph.D.
Georgia Pharmacists Association, Oren Harden, Jr., R.Ph. American College of Cardiology, William E. Boden, M.D., FACC
Hawaii Pharmacists Association, Ronald T. Taniguchi, Pharm.D. American College of Clinical Pharmacy, C. Edwin Webb, Pharm.D.
Idaho State Pharmacy Association, Edward Reddish, B.S. American College of Obstetricians and Gynecologists, Marilynn C.
Illinois Pharmacists Association, Ronald W. Gottrich, R.Ph. Frederiksen, M.D.
Indiana Pharmacists Alliance, Bonnie K. Brown, Pharm.D. American College of Physicians, David A. Flockhart, M.D., Ph.D.
Iowa Pharmacists Association, Thomas R. Temple, R.Ph., M.S. American Dental Association, Clifford W. Whall, Ph.D.
Kentucky Pharmacists Association, Joel Thornbury, R.Ph. American Dental Education Association, Vahn A. Lewis, Ph.D.
Louisiana Pharmacists Association, Maurice L. Gold, R.Ph. American Dietetic Association, Mary H. Hager, Ph.D., R.D.
Maryland Pharmacists Association, Matthew G. Shimoda, Pharm.D. American Gastroenterological Association, Jennifer A. Conte
Massachusetts Pharmacists Association, Steven D. Geoffroy, R.Ph. American Geriatrics Society, Jerry Gurwitz, M.D.
Michigan Pharmacists Association, Joseph Ringer, M.B.A. American Medical Association, Joseph W. Cranston, Ph.D.
Minnesota Pharmacists Association, Julie K. Johnson, R.Ph. American Nurses Association, Inc., Rita Munley Gallagher, Ph.D.,
Mississippi Pharmacists Association, Ronnie Bagwell R.N.
Missouri Pharmacy Association, Mary W. Patton, R.Ph. American Optometric Association, Jimmy D. Bartlett, O.D.
Montana Pharmacy Association, Lori Morin, M.B.A., R.Ph. American Organization of Nurse Executives, Maureen Cahill,
Nebraska Pharmacists Association, Maurice L. Russell, B.S. A.P.N./C.N.S., A.O.C.N.
New Mexico Pharmaceutical Association, William G. Troutman, American Osteopathic Association, Max T. McKinney, D.O.
Pharm.D. American Pharmacists Association, Robert D. Gibson, Pharm.D.
New Hampshire Pharmacists Association, Elizabeth A. Gower- American Podiatric Medical Association, Pamela J. Colman, D.P.M.
Robertson, R.Ph. American Psychiatric Association, John C. Urbaitis, M.D.
New Jersey Pharmacists Association, Steve H. Zlotnick, Pharm.D. American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics,
Pharmacists Society of the State of New York, Craig M. Burridge Sally U. Yasuda, Pharm.D.
North Carolina Association of Pharmacists, Stephen F. Eckel, American Society for Healthcare Risk Management, Monica Berry,
Pharm.D. J.D.
North Dakota Pharmaceutical Association, Patricia A. Hill, Ph.D. American Society for Pharmacology and Experimental Therapeu-
Ohio Pharmacists Association, Amelia S. Bennett, R.Ph. tics, Kenneth L. Dretchen, Ph.D.
Oklahoma Pharmacists Association, Wiley L. Williams, J.D. American Society for Quality, Donald C. Singer, M.S.
Oregon State Pharmacists Association, Tom Holt American Society of Clinical Oncology, Michael B. Troner, M.D.
Pennsylvania Pharmacists Association, Edward J. Bechtel, R.Ph. American Society of Consultant Pharmacists, Thomas R. Clark,
Colegio de Farmacéuticos de Puerto Rico, Benjamin Perez R.Ph.
South Carolina Pharmacy Association, James R. Bracewell American Society of Gene Therapy, Kenneth Cornetta, M.D.
South Dakota Pharmacists Association, Monica Jones American Society of Health-System Pharmacists, Henri R. Manasse,
Texas Pharmacy Association, Eric H. Frankel, Pharm.D., MSE, Jr., Ph.D., Sc.D.
BCNSP American Type Culture Collection, Joseph B. Perrone, Sc.D.
Utah Pharmaceutical Association, Reid L. Barker American Veterinary Medical Association, Dawn M. Boothe,
Vermont Pharmacists Association, Marc Cote, R.Ph. D.V.M., Ph.D.
Virginia Pharmacists Association, Marianne R. Rollings, R.Ph. AOAC International, E. James Bradford, Ph.D.
Washington State Pharmacists Association, Rodney D. Shafer, R.Ph. Association of American Medical Colleges, Raymond L. Woosley,
Pharmacy Society of Wisconsin, Judith E. Thompson, R.Ph., M.S. M.D., Ph.D.
Wyoming Pharmacy Association, Mindy Rasmussen, B.S. Association of Food and Drug Officials, Karen Tannert, R.Ph.
Drug Information Association, Judith Weissinger, Ph.D.
Federation of State Medical Boards of the United States, Inc., Dale
L. Austin, M.A.
Infusion Nurses Society, Mary Alexander, CRNI
International Academy of Compounding Pharmacists, E. Eldon
Armstrong
xxii Miembros / Integrantes USP 30
National Community Pharmacists Association, Kenneth L. Riddle, National Consumers League, Rebecca Burkholder, J.D.
Pharm.D. National Organization for Rare Disorders, Diane E. Dorman
National Medical Association, Randall W. Maxey, M.D., Ph.D.
National Pharmaceutical Association, Barry A. Bleidt, Ph.D., Asociaciones de Fabricantes Nacionales, Extranjeros,
Pharm.D. Internacionales y Afiliados
New Jersey Pharmaceutical Quality Control Association, Herbert American Herbal Products Association, Steven J. Dentali, Ph.D.
Letterman, Ph.D. American Hospital Association, Donald M. Nielsen, M.D.
Oncology Nursing Society, Barbara B. Rogers, CRNP, MN, Biotechnology Industry Organization, Sara L. Radcliffe, M.P.H.
A.O.C.N. Compressed Gas Association, Carl T. Johnson
Regulatory Affairs Professionals Society, Sherry L. Keramidas, Consumer Healthcare Products Association, Douglas W. Bierer,
Ph.D., CAE Ph.D.
Council for Responsible Nutrition, V. Annette Dickinson, Ph.D.
Entidades Gubernamentales Generic Pharmaceutical Association, Gordon R. Johnston, R.Ph.
Agency for Healthcare Research and Quality, Lynn A. Bosco, M.D. Healthcare Distribution Management Association, Lisa D. Clowers
Centers for Disease Control and Prevention, Christopher K. Allen, International Pharmaceutical Excipients Council of the Americas,
R.Ph., M.P.H. David R. Schoneker, M.S.
FDA Center for Biologics Evaluation and Research, Christopher C. Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations,
Joneckis, Ph.D. Jerod M. Loeb, Ph.D.
FDA Center for Devices and Radiological Health, Marilyn M. National Association of Chain Drug Stores, Mary Ann Wagner, B.S.
Lightfoote, M.D., Ph.D. Nonprescription Drug Manufacturers Association of Canada, David
FDA Center for Drug Evaluation and Research, Yana R. Mille S. Skinner
FDA Center for Food Safety and Applied Nutrition, Susan Walker, Parenteral Drug Association, Jennie K.H. Allewell, B.Sc.
M.D. Pharmaceutical Care Management Association, Greg S. Johnson,
Health Canada, Sultan Ghani, B.S., M.Ph. B.A.
National Center for Complementary and Alternative Medicine, Jane Pharmaceutical Research and Manufacturers of America, Janeen
F. Kinsel, Ph.D., M.B.A. Kincaid, B.S.
National Institute of Standards and Technology, Robert L. Watters, Pharmaceutical Research and Manufacturers of America Science
Ph.D. and Regulatory Section, Alan R. Goldhammer, Ph.D.
National Institutes of Health, Joseph F. Gallelli, Ph.D. The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Gerald N.
Therapeutic Goods Administration of Australia, Larry Kelly, Ph.D. McEwen, Ph.D., J.D.
United States Air Force, Phil L. Samples, Pharm.D. World Self-Medication Industry, David Webber
United States Army Office of the Surgeon General, W. Michael
Heath, M.B.A., B.S. Miembros "At Large"
United States Department of Health and Human Services, Arthur J. Lowell J. Anderson
Lawrence, Ph.D., R.Ph., M.B.A. Judy P. Boehlert, Ph.D.
United States Food and Drug Administration, Jeffrey Shuren, M.D., Frank B. Cerra, M.D.
J.D. Jordan L. Cohen, Ph.D.
United States Navy Bureau of Medicine and Surgery, Elizabeth A. Frank L. Douglas, M.D., Ph.D.
Nolan Thomas S. Foster, Pharm.D.
United States Public Health Service, Patrick J. McNeilly, Ph.D. Dennis K.J. Gorecki, Ph.D.
Judith A. Oulton
Organizaciones de Ciencias de la Salud, Otras Organizaciones Mark V. Pauly, Ph.D.
Afines y Farmacopeas Extranjeras Eugene M. Pfeifer, J.D.
Farmacopea Nacional Argentina, Hela Beltramini, Bioquı́mica y David G. Schulke
Farmacéutica Sally S. Seaver, Ph.D.
Association of Faculties of Pharmacy of Canada, Raimar Loben- Alexander M. M. Shepherd, M.D., Ph.D
berg, Ph.D. Michael R. Taylor, J.D.
Comisión de la Farmacopea Brasileña, Celso F. Bittencourt, Ph.D. Harold H. Wolf, Ph.D.
Canadian Pharmacists Association, Jeff Poston, Ph.D.
Comisión de la Farmacopea de la República Popular de China, Funcionarios
Wang Guorong, M.S. Darrell R. Abernethy, M.D., Ph.D.
European Directorate for the Quality of Medicines Council of Larry L. Braden, R.Ph.
Europe, Caroline Larsen Le Tarnec D. Craig Brater, M.D., FACP
European Federation of Pharmaceutical Scientists, Hendrik de
Jong, Ph.D. Junta Ejecutiva
Federation Internationale Pharmaceutique, Vinod P. Shah, Ph.D. Carolyn H. Asbury, Ph.D., ScMPH
International Society for Pharmacoepidemiology, Judith K. Jones, Rene H. Bravo, M.D.
M.D., Ph.D. Carmen A. Catizone, M.S., R.Ph.
Organización Panamericana de la Salud, Joxel Garcia, M.D., Ellen M. Cosgrove, M.D.
M.B.A. Duane M. Kirking, Pharm.D., Ph.D.
Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mary Anne Koda-Kimble, Pharm.D.
Mexicanos, Carmen Becerril, Quı́mica. John W. Mauger, Ph.D.
Royal College of Physicians and Surgeons of Canada, Michel June E. Osborn, M.D.
Brazeau, M.D.
Russian Center for Pharmaceutical and Medical Technical Infor- Miembros del Comité
mation (PHARMEDINFO), Galina Shashkova John H. Block, Ph.D.
Barbara A. Durand, Ed.D.
Organizaciones de Consumidores y Representantes del Interés Thomas M. Schafer, M.B.A.
Público Gillian R. Woollett, D.Phil., M.A.
American Diabetes Association, Nathaniel G. Clark, M.D., M.S.,
R.D. Miembros Honorarios
Center for Science in the Public Interest, David G. Schardt, M.S. Lee Anderson, Ph.D.
Citizens for Public Action on Blood Pressure and Cholesterol, Inc., Kenneth N. Barker, Ph.D.
Gerald J. Wilson, M.A., M.B.A. Donald R. Bennett, M.D., Ph.D.
Consumers Union, Christopher J. Hendel John V. Bergen, Ph.D.
USP 30 Integrantes / Miembros xxiii
Acta Constitutiva
En mayo de 1900 la Convención le ordenó a la Junta Directiva Distrito, por lo que fue necesario designar representantes que
que constituyera la asociación de la USP conforme a la legislación cumplieran con tal requisito. No obstante, se procedió a elaborar el
del Distrito de Columbia (Estados Unidos de América). La creación Acta Constitutiva, que se firmó e inscribió definitivamente el 11 de
de la asociación se vio retrasada debido a que la legislación del julio de ese mismo año. A continuación figura el texto del certificado
Distrito de Columbia exigı́a que la mayorı́a de los funcionarios original:
firmantes del Certificado de Constitución fueran residentes del
Certificado de Constitución
Por el presente, los suscriptos, ciudadanos de los Estados Unidos, mayores de edad y en su mayorı́a ciudadanos del Distrito de Columbia,
constituyen una asociación que se denominará The United States Pharmacopeial Convention, según lo dispuesto en los artı́culos 545 a 552
inclusive, de las Leyes Revisadas de los Estados Unidos para el Distrito de Columbia y su enmienda aprobada por Ley del Congreso, aprobada
el dı́a 23 de abril de 1884.
Esta Asociación se constituye por un plazo de novecientos noventa y nueve años. Su objeto es promover y fomentar la ciencia y el arte de la
medicina y la farmacia mediante la realización de investigaciones, experimentos y otros procedimientos adecuados destinados a seleccionar y
denominar materiales que puedan utilizarse apropiadamente como medicamentos y fármacos, incluyendo fórmulas para su preparación;
establecer normas y directivas uniformes para quienes practican la medicina y la farmacia en los Estados Unidos, que les permitan determinar
con exactitud la identidad, el contenido y la pureza de tales medicamentos y fármacos, y otros propósitos afines y similares; e imprimir y
distribuir en general, a intervalos adecuados, las mencionadas fórmulas y los resultados de dichas selecciones, denominaciones y
determinaciones de ı́ndole similar, entre los miembros de esta Asociación, farmacéuticos y médicos generalmente de los Estados Unidos, ası
como entre quienes tengan interés en la farmacia y en la medicina.
La administración y control de los asuntos, fondos y bienes de la Asociación durante su primer año de existencia estarán a cargo de una Junta
Directiva, integrada por los siete miembros siguientes:
En fe de lo cual firmamos y sellamos el presente documento este séptimo dı́a del mes de julio del año 1900.
Constitución y Estatutos
The United States Pharmacopeial Convention
ESTATUTO Sección 9
Capı́tulo I—Presidente El Presidente ocupará su cargo durante un perı́odo de cinco años y
continuará desempeñándose en esa posición hasta que su sucesor
Sección 1 haya sido elegido y asumido el cargo.
El Presidente presidirá todas las reuniones de la United States Sección 10
Pharmacopeial Convention, en adelante mencionada como Pharma-
copeial Convention. Si el Presidente estuviera ausente o no pudiera Si el cargo de Presidente quedase vacante, la Junta Directiva
presidir una reunión, la Junta Directiva designará un Presidente deberá elegir un nuevo Presidente entre los miembros de la
interino para que la presida. Pharmacopeial Convention.
Sección 2 Sección 11
En ocasión de una reunión ordinaria, el funcionario que ocupe la Si el Presidente estuviera temporalmente discapacitado o ausente
presidencia pronunciará un discurso. o si estuviera imposibilitado para cumplir sus funciones, la Junta
Directiva podrá designar a un miembro de la Pharmacopeial
Sección 3 Convention como Presidente interino para que actúe en su lugar.
El funcionario que ocupe el cargo de Presidente podrá solicitar a Capı́tulo II—Presidente Saliente
un miembro determinado que tome la palabra durante un debate
Sección 1
Sección 4
El Presidente Saliente es quien haya ocupado la presidencia
Al menos seis meses antes de la fecha de la reunión ordinaria de la inmediatamente antes que el Presidente en funciones.
Pharmacopeial Convention y, sujeto a la recomendación y el
consentimiento de la Junta Directiva, el Presidente deberá designar
a cinco miembros de la Convención para integrar el Comité de Sección 2
Nominaciones de Funcionarios e integrantes de la Junta Directiva,
dos de los cuales deberán ser integrantes de la Junta Directiva, uno El Presidente Saliente será integrante ex oficio de la Junta
de ellos en representación de las ciencias farmacéuticas y el otro en Directiva.
representación de las ciencias médicas.
Sección 3
Sección 5
Si el Presidente Saliente no pudiera actuar como tal, el cargo
Sujeto a la recomendación y consentimiento de la Junta Directiva, quedará vacante.
el Presidente deberá designar a cinco miembros de la Convención
para integrar el Comité de Nominaciones para el Consejo de Capı́tulo III—Vicepresidente–Director Ejecutivo
Expertos, ninguno de los cuales podrá ser integrante del Consejo de
Expertos, de los Comités de Expertos o de la Junta Directiva, Sección 1
empleado asalariado o funcionario de la Pharmacopeial Convention.
El Vicepresidente Ejecutivo cumplirá las funciones de Director
Sección 6 Ejecutivo de la Convención. El Vicepresidente–Director Ejecutivo
será miembro ex oficio de la Junta Directiva sin derecho a voto. El
Compete al Presidente designar a los integrantes de todos los Vicepresidente–Director Ejecutivo desempeñará sus funciones
comités de la Convención para los que no haya disposiciones dentro del marco de las polı́ticas y programas que él mismo hubiese
especı́ficas en el presente Estatuto. determinado previa consulta con la Junta Directiva.
Sección 7 Sección 2
Al menos un año antes de la fecha de la reunión ordinaria de la El Vicepresidente–Director Ejecutivo será miembro ex oficio y
Pharmacopeial Convention, el Presidente, por intermedio del presidente del Consejo de Expertos y del Comité Ejecutivo del
Secretario, deberá enviar por correo a todos los miembros una Consejo de Expertos.
convocatoria a la reunión, y una solicitud para todas las
organizaciones que, según lo dispuesto en la Constitución, cumplen Sección 3
con los requisitos para contar con representantes en la reunión, para
que preparen la autorización para su delegado si aún no lo hubieran El Vicepresidente–Director Ejecutivo creará el Consejo de
hecho. Al menos seis meses antes de la fecha de la reunión ordinaria, Expertos según lo dispuesto en el Capı́tulo VII del presente Estatuto
se enviará por correo una segunda convocatoria a todos los y designará cualquier órgano asesor especial que fuera necesario
miembros, y la solicitud de autorización para un delegado, si no lo para el correcto funcionamiento del Consejo.
hubieran nombrado y un delegado suplente. El presidente solicitara
asimismo a las publicaciones médicas y farmacéuticas, y a otras Sección 4
publicaciones apropiadas, que publiquen el anuncio de la reunión.
El Vicepresidente–Director Ejecutivo estará a cargo de los trabajos
Sección 8 y dispondrá la preparación del texto definitivo de la United States
Pharmacopeia (USP o Farmacopea de los Estados Unidos de
El Presidente será integrante ex oficio de la Junta Directiva y de América), el National Formulary (NF o Formulario Nacional), de
todos los comités, a excepción del Consejo de Expertos y sus cualquier otra publicación oficial y de sus suplementos.
Comités de Expertos.
USP 30 Constitución y Estatutos / xxix
Sección 2 Sección 3
El Tesorero deberá presentar anualmente a la Junta Directiva los La Junta Directiva estará facultada para resolver asuntos por
estados financieros auditados. Durante cada reunión ordinaria de la correspondencia, incluidos medios electrónicos o de otra ı́ndole,
Pharmacopeial Convention, el Tesorero deberá presentar estados según lo dispongan las reglas dictadas por la Junta. Cuando una
financieros completos correspondientes al perı́odo transcurrido desde moción se realice por dichos medios, no se requerirá una moción que
la reunión ordinaria precedente. la secunde.
Sección 3 Sección 4
El Tesorero será integrante ex oficio de la Junta Directiva. La Junta Directiva se reunirá todos los años, en la fecha y en el
lugar que ésta establezca. Se convocará una reunión extraordinaria
Sección 4 de la Junta Directiva por petición por escrito de al menos cuatro
integrantes. El Presidente estará facultado para convocar una reunión
Si el Tesorero estuviera temporalmente discapacitado o ausente, la extraordinaria toda vez que lo estime necesario. El quórum de las
Junta Directiva podrá nombrar un Tesorero Interino para que actúe reuniones estará constituido por seis integrantes de la Junta Directiva
en su lugar. con derecho a voto.
Sección 5 Sección 5
El Tesorero continuará desempeñándose en ese cargo hasta que su Los integrantes de la Junta Directiva podrán participar en las
sucesor haya sido elegido y asumido sus funciones. reuniones extraordinarias por medio de una conferencia telefónica u
otro medio de comunicación similar que permita a todos los
Sección 6 participantes escucharse o percibir los comentarios mutuos al mismo
tiempo. Se considerará que la participación por estos medios en una
No podrá presentarse como candidato a Tesorero ninguna persona reunión equivale a la participación en persona. Estas reuniones se
que, al levantarse la reunión ordinaria, haya actuado como Tesorero llevarán a cabo según las reglas que adopte la Junta Directiva.
durante dos perı́odos consecutivos.
Sección 6
Sección 7
Si el cargo de Tesorero quedase vacante, la Junta Directiva debe- (a) Los integrantes de la Junta Directiva elegidos por los miembros
rá nombrar a alguno de los miembros de la Convención para ocupar de la Convención no recibirán compensación alguna por sus
el cargo. servicios. Sin embargo, se les reintegrará de los fondos de la
Convención de la Farmacopea los gastos por viajes y otros
desembolsos necesarios en los que pudieran incurrir durante el
Capı́tulo VI—Junta Directiva desempeño de sus funciones.
Sección 1 (b) Si durante su mandato como integrante de la Junta Directiva,
alguna persona tiene intereses financieros que entraran en
La Junta Directiva está conformada por ocho miembros de la conflicto o aparentaran entrar en conflicto con sus funciones y
Pharmacopeial Convention elegidos por votación mayoritaria responsabilidades, no podrá votar en los asuntos relacionados
durante la reunión ordinaria, además del Presidente, el Presidente con tales intereses financieros. Se presume que los intereses de
Saliente y el Tesorero como miembros ex oficio, y el Vice- los empleados coinciden con los de su empleador.
presidente–Director Ejecutivo, quien actuará como miembro ex
oficio de la Junta Directiva sin derecho a voto. (c) Si parece haber o puede percibirse un conflicto de intereses,
cualquier funcionario o integrante de la Junta Directiva
De los ocho integrantes de la Junta Directiva elegidos por la podrá excusarse de las deliberaciones de la Junta Directiva.
Convención, dos deberán ser representantes de las ciencias Cualquier funcionario o integrante de la Junta Directiva
farmacéuticas, dos de las ciencias médicas, uno será representante podrá ser eximido de participar de una deliberación mediante
del público y tres actuarán sin restricción alguna independientemente el voto favorable de al menos dos tercios de los integrantes de la
de su afiliación. Junta Directiva, excluyéndose a sı́ mismo, y se hará constar en
el acta de la reunión que dicho funcionario o miembro ha sido
A excepción del Vicepresidente–Director Ejecutivo, los inte- eximido de participar de las deliberaciones.
grantes de la Junta Directiva no serán integrantes del Consejo de
Expertos o de sus Comités de Expertos. Sección 7
No podrá presentarse como candidato a la Junta Directiva ninguna Excepto los casos que se indican a continuación, la Junta
persona que, al levantarse la reunión ordinaria, haya desempeñado Directiva deberá administrar y controlar los asuntos, los fondos y los
durante dos perı́odos consecutivos un cargo electo en la Junta bienes de la Pharmacopeial Convention.
Directiva, un cargo de funcionario electo o cualquier combinación de
dichos cargos. La Junta Directiva podrá invertir los fondos de la Pharmacopeial
Convention, autorizar el pago de todas las sumas de dinero
adeudadas por servicios prestados, realizar negocios financieros o
de otra ı́ndole a favor de los intereses de la Pharmacopeial
USP 30 Constitución y Estatutos / xxxi
Sección 21 Sección 31
En ocasión de cada reunión ordinaria de la Pharmacopeial La Junta Directiva podrá designar representantes de la Conven-
Convention, el Presidente de la Junta Directiva deberá presentar ción de la USP ante otras organizaciones y autorizar a la Convención
un informe de las actividades de la Junta. de la USP a participar en otras organizaciones en calidad de
organización.
Sección 22
Sección 32
La Junta Directiva deberá recibir del Secretario las actas de las
reuniones ordinarias y extraordinarias de la Pharmacopeial Conven- La Junta Directiva deberá adoptar normas y procedimientos según
tion y disponer su publicación. los cuales administrará los asuntos, fondos y bienes de la
Pharmacopeial Convention, ası́ como cualquier conflicto de intereses
Sección 23 entre sus miembros. Dichas normas y procedimientos deberán ser
puestos a disposición de los miembros de la Convención y el
La Junta Directiva deberá recibir y examinar todas las propuestas público.
de enmienda a la Constitución y el Estatuto y elaborar recomenda-
ciones al respecto según su criterio y en cumplimiento de las Sección 33
disposiciones de la Constitución y el Estatuto.
Todo funcionario de la Convención puede presentar su renuncia
Sección 24 en cualquier momento mediante notificación al Secretario, quien
deberá comunicar inmediatamente dicha renuncia a la Junta
La Junta Directiva deberá cubrir las vacantes que se produzcan Directiva. Toda renuncia entrará en vigencia a partir de la fecha en
para completar los mandatos de los ocho cargos electivos de la Junta que se realice, salvo que especifique una fecha posterior.
Directiva, los cargos de Presidente y Tesorero, de los miembros de la
Pharmacopeial Convention y el cargo de Vicepresidente–Director Capı́tulo VII—Consejo de Expertos y Comité Ejecutivo del
Ejecutivo según se establece en el presente Estatuto. Consejo
Sección 25 Sección 1
Todo funcionario o integrante de la Junta Directiva podrá ser El Consejo de Expertos estará integrado por personas fı́sicas
separado del cargo con causa justificada mediante el voto favorable debidamente calificadas, elegidas por la Convención, primordial-
de al menos dos tercios de los integrantes de la Junta Directiva, mente provenientes de paı́ses que utilicen los compendios USP–NF
exceptuando a dicho funcionario o integrante del cómputo. como compendios oficiales, junto con el Vicepresidente–Director
Ejecutivo, que será integrante ex oficio. Los integrantes del Consejo
Sección 26 de Expertos deberán ser elegidos durante la reunión ordinaria o por
votación por correo o medios electrónicos en los perı́odos entre las
La Junta Directiva deberá aprobar el número y tipos de comités de reuniones, por mayorı́a de los votos emitidos por los miembros de la
expertos que se consideren necesarios para las tareas del Consejo de Pharmacopeial Convention, según lo dispuesto en el presente
Expertos. Estatuto.
Sección 27 Sección 2
Si se determinara que es necesario contar con conocimientos que (b) Luego de una reunión ordinaria, el Vicepresidente–Director
no ofrecen las divisiones existentes, el Presidente del Consejo de Ejecutivo, con la aprobación de la Junta Directiva,
Expertos, previa consulta con el Comité Ejecutivo y la Junta podrá organizar el Consejo de Expertos en divisiones
Directiva, y con su aprobación, determinará el número y tipos de apropiadas, considerando, entre otros factores, las caracterı́sti-
Comités de Expertos adicionales necesarios. cas distintivas del trabajo, el número de comités que tendrı́a
cada división y la eficacia en el trabajo. Previa consulta con el
Comité Ejecutivo del Consejo de Expertos, el Vicepresidente–
Sección 29 Director Ejecutivo establecerá los parámetros operativos para
cada división.
La Junta Directiva deberá aprobar el número de personas que se
elegirán para integrar cada Comité de Expertos. (c) En el presente Estatuto, toda referencia a una división o a
Comités Ejecutivos de División supondrá que el Vicepresi-
Sección 30 dente–Director Ejecutivo ha efectuado una división del Consejo
de Expertos según las disposiciones de la presente sección.
Durante el perı́odo comprendido entre las reuniones ordinarias de Dichas referencias no serán aplicables si el Consejo de Expertos
la Pharmacopeial Convention, la Junta Directiva podrá, a su criterio, no ha sido dividido.
enviar a los miembros de la Convención una propuesta para
someterla a votación. En tales casos, para lograr una votación válida, Sección 3
deberán votar al menos ciento treinta miembros y la propuesta se
aprobará por votación mayoritaria. La Junta Directiva deberá dictar Previa consulta con el Comité Ejecutivo, el Presidente del Consejo
normas para asegurar que haya oportunidades adecuadas para de Expertos podrá disponer que dos o más Comités de Expertos de
realizar comentarios ası́ como justicia y confidencialidad en la distintas divisiones trabajen como grupos coordinados multidiscipli-
votación. narios en función de la similitudes tecnológicas existentes o según
otros criterios cientı́ficos.
USP 30 Constitución y Estatutos / xxxiii
Sección 9
(a) Cada integrante electo del Consejo de Expertos presidirá un
Comité de Expertos. Cada Comité de Expertos funcionará hasta Si el Consejo de Expertos se organizara en divisiones, según se
la elección de un comité sucesor, o hasta la fecha que indique el dispone en la Sección 2 de este Capı́tulo, el Presidente del Consejo
Presidente del Consejo de Expertos. de Expertos designará un presidente de un comité ejecutivo de
división, previa consulta con los presidentes de los Comités de
(b) Con vigencia a partir de la reunión ordinaria del año 2010, el Expertos de dicha división. El Presidente de la división, previo
presidente de un Comité de Expertos solo podrá ocupar dicho asesoramiento y con el consentimiento de los Presidentes de la
cargo durante dos perı́odos consecutivos. Los integrantes del división, designará a los integrantes de un Comité Ejecutivo de
Consejo de Expertos que hayan ocupado la presidencia de un División entre los presidentes de los Comités de Expertos que
Comité de Expertos durante dos perı́odos consecutivos sólo formen dicha división. El Presidente del Comité Ejecutivo de
podrán postularse para su reelección como integrantes del División, con el previo asesoramiento y consentimiento del
Consejo de Expertos si se postulan como presidentes de otro Comité Ejecutivo de División, designará los reemplazantes para
comité de expertos del Consejo de Expertos (no se permitirán los puestos vacantes del Comité Ejecutivo de División.
postulaciones a la presidencia de un Comité de Expertos si
dicho Comité ha cambiado de nombre). Sección 10
Sección 5 El Comité Ejecutivo del Consejo de Expertos estará integrado por
un máximo de quince personas designadas por el Presidente del
Consejo de Expertos entre los integrantes del Consejo.
(a) Cada Comité de Expertos estará integrado por personas fı́sicas
elegidas por los presidentes de los Comités de Expertos de la Sección 11
división o divisiones en las que funciona el comité. Un comite
integrado por el Presidente, el Vicepresidente del Comité de El Consejo de Expertos y el Comité Ejecutivo del Consejo
Nominaciones para el Consejo de Expertos, el Presidente del dictarán normas y adoptarán procedimientos que no estén en
Consejo de Expertos y el Presidente del Comité de Expertos conflicto con la Constitución y los Estatutos para garantizar la
nombrará a las personas fı́sicas que cumplan con los requisitos exactitud e integridad del contenido de la USP, el NF y de las demás
para ser elegidos como integrantes de un Comité de Expertos. publicaciones oficiales, y para proporcionar una notificación
En la medida de lo posible y lo necesario, dicho Comité de adecuada y brindar al público la oportunidad de realizar comentarios
Nominaciones para los Comités de Expertos seleccionará a dos y examinar plenamente y de manera imparcial todos los cambios y
candidatos para cada cargo del Comité de Expertos de la lista de adiciones propuestos a dichos contenidos en la medida en que sean
expertos calificados enviada por el Comité de Nominaciones necesarios para garantizar el fiel cumplimiento de sus respectivas
para el Consejo de Expertos. funciones. Cada División y cada Comité de Expertos podrá dictar
normas y adoptar procedimientos para su funcionamiento, siempre
(b) El presidente saliente de cada Comité de Expertos integra- que sean coherentes con las reglas y procedimientos del Consejo de
rá dicho Comité de Expertos sin que sea necesaria su Expertos. Antes de su adopción, las normas y procedimientos
nominación o elección salvo que se haya postulado para su propuestos por el Consejo de Expertos deberán ponerse a disposición
reelección al Consejo de Expertos. de los miembros de la Pharmacopeial Convention para que emitan
sus comentarios. Los Comités deberán enviar las normas y los
Sección 6 procedimientos propuestos a la Junta Directiva para su revisión y
realizar observaciones sobre las propuestas efectuadas por la Junta
A solicitud del Presidente de uno de los Comités de Expertos o Directiva sobre la base de dicha revisión.
por su propia iniciativa, el Presidente del Consejo de Expertos
podrá designar un Panel Asesor ad hoc. Dicho Panel Asesor ad hoc Sección 12
será presidido por un integrante del Comité de Expertos que lo ha
creado. La misión del Panel Asesor ad hoc estará claramente definida Previa consulta con los Comités Ejecutivos de División, el
y el Panel quedará disuelto una vez cumplido su cometido. Presidente del Consejo de Expertos delimitará el alcance de las
decisiones tomadas en el seno de cada división, según los parámetros
Sección 7 establecidos por el Comité Ejecutivo del Consejo de Expertos. Cada
uno de los Comités de Expertos funcionarán como órganos
Durante su mandato como integrante de un Comité de Expertos, cientı́ficos de toma de decisiones con respecto al contenido de la
ninguna persona que tenga intereses financieros que estén en USP, el NF y de las demás publicaciones oficiales, sobre la base de
conflicto, o parezcan estar en conflicto, con sus tareas y los principios establecidos en la última reunión de la Pharmacopeial
responsabilidades podrá votar en los asuntos relacionados con Convention.
dichos intereses. Se presume que los intereses de los empleados
coinciden con los de su empleador. A excepción del Vicepresidente– Sección 13
Director Ejecutivo, ningún integrante del Comité recibirá compensa-
ción alguna por sus servicios salvo autorización en contrario de la El Consejo de Expertos presentará un informe en la reunión
Junta Directiva. Sin embargo, se les reintegrará con fondos de la ordinaria de la Pharmacopeial Convention por intermedio del
Pharmacopeial Convention los gastos por viajes y otros desembolsos Vicepresidente–Director Ejecutivo.
necesarios en que incurran durante el desempeño de sus funciones.
xxxiv / Constitución y Estatutos USP 30
Los integrantes del Comité de Admisión conservarán su calidad de la reunión ordinaria de la Pharmacopeial Convention anterior, o
miembros de la Pharmacopeial Convention hasta que se designen sus según lo dispuesto en la Constitución y el Estatuto, serán
sucesores. considerados miembros ex oficio de la Pharmacopeial Convention.
El Comité de Admisión y las personas seleccionadas por la Junta
Sección 2 Directiva como miembros generales serán miembros de la Conven-
ción.
El Comité de Admisión identificará a las organizaciones
habilitadas para designar un delegado y realizará recomendaciones Sección 3
al respecto, que presentará a la Junta Directiva para su consideración.
Dichas recomendaciones se elaborarán en función de las pautas Los candidatos seleccionados por el Comité de Nominaciones de
dictadas por la Convención en las reuniones ordinarias previas. El Funcionarios e integrantes de la Junta Directiva y los candidatos a
Comité de Admisión adoptará los procedimientos y criterios los cargos de Presidente y Tesorero serán considerados miembros de
necesarios para garantizar un examen justo y ordenado en el proceso la Pharmacopeial Convention para la reunión ordinaria una vez que
de identificación y recomendación de organizaciones habilitadas sus nombres hayan sido presentados como candidatos, según lo
para designar delegados. La Junta Directiva deberá aprobar dichos dispuesto en (g) de la Sección 1 del Capı́tulo IV del Estatuto, estén o
procedimientos. El Comité de Admisión deberá informar a la Junta no presentes.
Directiva, al menos una vez al año, sobre la integración de la
Pharmacopeial Convention y sobre las actividades del co- Sección 4
mité durante el perı́odo transcurrido desde el último informe.
Todo miembro de la Pharmacopeial Convention designado por
Sección 3 una organización mencionada en la Constitución continuará siendo
miembro, en tanto no fallezca, renuncie o deje de cumplir con los
El Comité de Admisión también analizará minuciosamente las requisitos dispuestos en la Sección 6 del Artı́culo II de la
credenciales de todos los delegados, o delegados suplentes en Constitución, o hasta que su sucesor haya sido autorizado por la
ausencia de los primeros. No se aceptarán credenciales en blanco en organización habilitada y sus credenciales hayan sido aceptadas por
las que los nombres de los delegados y delegados suplentes se el Comité de Admisión. El mandato de los miembros nombrados por
consignarán con posterioridad por una persona que no sea un las organizaciones designadas por la Junta Directiva se exten-
funcionario debidamente constituido de la organización habilitada derá hasta seis meses después de la reunión ordinaria.
que los designó. Los formularios de acreditación presentados por
primera vez en una reunión se verificarán de forma independiente Sección 5
antes de su aceptación. Inmediatamente antes de la apertura de la
reunión ordinaria de la Pharmacopeial Convention, el Comité de- Un miembro no podrá representar a más de una institución de
berá suministrar al Secretario de la Pharmacopeial Convention una enseñanza, una organización o una dependencia del Gobierno
lista de los delegados cuyas credenciales fueron aprobadas por el Federal que hayan sido designadas.
Comité y una lista de los delegados suplentes aprobados como
sustitutos de los delegados ausentes. Sección 6
Sección 4 Los miembros podrán ser expulsados por conducta indebida o por
violación de la Constitución y el Estatuto mediante el voto favorable
El Comité de Admisión deberá informar a la Pharmacopeial de al menos dos tercios de los miembros presentes con derecho a
Convention acerca de todas las credenciales que no hayan sido voto.
aceptadas. Las decisiones tomadas por el Comité de Admisión en
aprobación o rechazo de las credenciales de una persona se anularán Sección 7
solamente por voto mayoritario de los miembros de la Pharmaco-
peial Convention. Las renuncias de los miembro de la Pharmacopeial Convention se
presentarán por escrito al Secretario de la Convención, quien
Sección 5 deberá acusar recibo por escrito de las mismas e informar
debidamente a la Junta Directiva.
El Comité de Admisión deberá presentar a la Pharmacopeial
Convention un informe acerca de la integración de la Convención y Capı́tulo XIII—Comité de Escrutinio
las actividades del Comité durante el perı́odo posterior a la última
reunión ordinaria. Asimismo, el Comité de Admisión
deberá suministrar al Comité de Resoluciones guı́as respecto a los Sección 1
tipos de instituciones y entidades a las que se deberı́a invitar a
designar delegados para la reunión ordinaria siguiente. El Comité de Escrutinio estará compuesto por un máximo de seis
integrantes, designados por el Presidente. El Presidente designará a
los integrantes del Comité y nombrará a su presidente al menos
Capı́tulo XII—Miembros noventa dı́as antes de la reunión ordinaria de la Pharmacopeial
Convention. Los integrantes del Comité se desempeñarán en su
Sección 1 cargo hasta que se haya designado a sus sucesores, conforme al
presente Estatuto. El Secretario de la Pharmacopeial Convention se
Cada delegado deberá presentar sus credenciales al Comité de desempeñará asimismo como secretario del Comité. Los integrantes
Admisión, y sujeto al informe de dicho Comité acerca de la del Comité de Escrutinio conservarán su calidad de miembros de la
aprobación de sus credenciales, el delegado recibirá su acreditación Pharmacopeial Convention hasta que se designe a sus sucesores.
y ocupará su lugar como miembro. Si un miembro no asiste a la
reunión ordinaria, el delegado suplente deberá presentar sus Sección 2
credenciales de Delegado Suplente al Comité de Admisión y,
sujeto al informe de la aceptación de sus credenciales, que- Compete al Comité asegurar la distribución y recolección de
dará acreditado como miembro para esa reunión ordinaria. papeletas para votar y el escrutinio de los votos, ası́ como el informe
del resultado de la votación a la Convención. El informe del
Sección 2 escrutinio se registrará en forma completa en las actas de cada
reunión ordinaria o en las actas de la organización.
Los Funcionarios de la Pharmacopeial Convention, los integrantes
de la Junta Directiva y los Presidentes de los Comités que deban
presentar informes en la reunión ordinaria y actúen por mandato de
USP 30 Constitución y Estatutos / xxxvii
Normas, Procedimientos y
Polı́ticas
Normas y Procedimientos
del Consejo de Expertos para el perı́odo 2005–2010
Las Normas y Procedimientos que anteriormente se encontraban en esta sección están ahora disponibles en el sitio electrónico:
http://www.usp.org/aboutUSP/governance/policies/RulesandProcedures. Las Normas y Procedimientos han sido revisados y entraron en
vigencia a partir del 18 de septiembre de 2006.
Polı́ticas
Las polı́ticas de la USP que anteriormente se encontraban en esta sección están ahora disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/
aboutUSP/governance/policies/
FARMACOPEA DE
LOS ESTADOS UNIDOS
USP 30 DE AMÉRICA
Oficial desde el 18 de mayo de 2007
TRIGÉSIMA
EDICIÓN
# 2006 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos los derechos reservados.
USP 30 Incorporaciones xli
Incorporaciones
Artı́culos Incorporados a USP 30 mediante Suplementos
MONOGRAFÍAS DE USP
Aprotinina Gabapentina
Aprotinina, Inyección Gliburida y Clorhidrato de Metformina, Tabletas
Bromhidrato de Citalopram Maleato de Fluvoxamina, Tabletas
Cladribina Ritonavir
Fenofibrato Vapor Puro
h62i Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de h1112i Determinación de Actividad de Agua en Productos Farma-
Microorganismos Especı́ficos céuticos No Estériles
h1072i Desinfectantes y Antisépticos h1117i Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológico
h1092i Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación h1223i Validación de Métodos Microbiológicos Alternativos
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS
MONOGRAFÍAS DE USP
Carbonato de Magnesio, Ácido Cı́trico y Citrato de Potasio Ondansetrón, Tabletas de Desintegración Oral
para Solución Oral
Citalopram, Tabletas Pamidronato Disódico
Clorhidrato de Benazepril Pamidronato Disódico para Inyección
Prednicarbato
Clorhidrato de Nefazodona Tartrato de Tilosina
xlii Incorporaciones USP 30
Los siguientes cambios de tı́tulos serán oficiales a partir del 18 de agosto de 2007
Tı́tulo Nuevo Tı́tulo Anterior
h61i Examen Microbiológico de Productos No Estériles:
Pruebas de Recuento Microbiano h61i Pruebas de Lı́mites Microbianos
h62i Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de
Microorganismos Especı́ficos
h1111i Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios h1111i Atributos Microbiológicos de Productos Farmacéuticos No
de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas Estériles
y Sustancias de Uso Farmacéutico
Comentarios
Comentarios—Con frecuencia, las propuestas de revisión que se COMENTARIOS A MONOGRAFÍAS PARA LOS
publican en el Pharmacopeial Forum suscitan comentarios públicos COMPENDIOS USP 30–NF 25
que se remiten al Comité de Expertos correspondiente para su
revisión y respuesta. Algunas propuestas de revisión pueden llegar
a convertirse en texto oficial con pequeñas modificaciones, según Bromuro de Pancuronio (página 3152 de USP 30–NF 25). Esta
fueran necesarias, sin que requieran una revisión pública adicional. nueva monografia se basa en la propuesta publicada en PF 32(1),
En tales casos, se publica un resumen de los comentarios recibidos y para adoptar la nueva monografia de esta sustancia, para la que no
las respuestas del Comité en el apartado Comentarios del habı́a existido ninguna previamente. A continuación, se presentan
Suplemento o en la edición anual en la que se oficializa la revisión. los comentarios que se recibieron acerca de la monografia propuesta
En el caso de las propuestas que requieren una revisión adicional y para Bromuro de Pancuronio.
una nueva publicación en el Pharmacopeial Forum, se incluye un Referencia: PF 32(1) [Enero–Febrero de 2006], página 130.
resumen de los comentarios y las respuestas del Comité en la Comentario: Se solicitaron los siguientes cambios en la prueba
información que acompaña a cada artı́culo. de Compuestos relacionados.
El apartado Comentarios no forma parte del texto oficial de la En el apartado Procedimiento, cambiar la solución de rociado
monografı́a. En todo caso, explica los fundamentos de la respuesta especificada: ‘‘solución de nitrato de sodio– de 20 g por L’’ por la
del Comité a los comentarios del público. Si existen diferencias entre solución correcta: ‘‘solución de nitrito de sodio de 20 g por L’’.
el contenido del apartado Comentarios y la monografı́a oficial, el Agregar una importante oración que fue omitida en el Procedi-
texto de la monografı́a oficial prevalece. En caso de controversias miento: ‘‘Desarrollar en una cámara no saturada y sin recubrimiento
o problemas de interpretación prevalece el texto oficial, indepen- interno hasta un recorrido de 8 cm’’.
dientemente de lo expresado en el apartado Comentarios. Respuesta: El Comité de Expertos en Desarrollo de Monografı́as:
Cuando resulta oportuno, el apartado Comentarios incluye, por Pulmonar y Esteroides (MD PS) revisó y aprobó los cambios
separado, las discusiones acerca de las propuestas referidas a la solicitados. La solución para rociado en la prueba de Compuestos
armonización internacional de la USP, la Farmacopea Europea y la relacionados ha sido cambiada a ‘‘solución de nitrito de sodio de
Farmacopea Japonesa con el fin de destacar esas propuestas. 20 g por L’’ y en el apartado Procedimiento de la misma prueba, se
agregó la oración ‘‘Desarrollar en una cámara no saturada y sin
recubrimiento interno hasta un recorrido de 8 cm’’.
USP 30 Advertencias Generales 1
Advertencias y Requisitos
Generales
Aplicables a las Normas, Pruebas,
Valoraciones y Otras Especificaciones
de la Farmacopea de los Estados Unidos
Las Advertencias y Requisitos Generales (de ahora en adelante interfiere con las pruebas o valoraciones establecidas, se le de-
denominados Advertencias Generales) y los requisitos generales que berá asignar un nombre diferente y totalmente distinto de cualquier
aparecen en los Capı́tulos Generales suministran, en forma otro nombre reconocido por la Farmacopea.
resumida, las guı́as básicas para la interpretación y aplicación de Los artı́culos que se incluyen en este texto se reconocen como
normas, pruebas, valoraciones y otras especificaciones de la oficiales y los estándares establecidos en las monografı́as se aplican
Farmacopea de los Estados Unidos, eliminando de este modo la solamente cuando dichos artı́culos se destinan o se etiquetan para
necesidad de repetir a lo largo del libro requisitos pertinentes uso medicinal, como suplementos nutricionales o dietéticos o dis-
a numerosos casos. Cuando no haya una expresión especı́fica que positivos médicos y cuando se compran, venden o dispensan para
señale lo contrario, se deben aplicar los requisitos establecidos en las este propósito o se etiquetan de conformidad con esta Farmacopea.
Advertencias Generales y Capı́tulos Generales. Se considera que un artı́culo está reconocido en esta Farmacopea
Cuando hubiera excepciones a las Advertencias Generales o los cuando se publica su monografı́a ya sea en la Farmacopea misma,
Capı́tulos Generales, prevalece el texto de las monografı́as los suplementos, apéndices u otras revisiones interinas y se le asigna
individuales, las cuales contienen las instrucciones especı́ficas o lo una fecha oficial de reconocimiento, en forma especı́fica o general.
que se pretende cambiar. Para recalcar la existencia de tales Para distinguir los diferentes tipos de artı́culos para los cuales
excepciones, en ciertas partes de las Advertencias Generales o de existen monografı́as se usa la siguiente terminologı́a: una sustancia
los Capı́tulos Generales se establece especı́ficamente la expresión: oficial es un fármaco activo, un nutriente reconocido, un ingrediente
‘‘a menos que se especifique algo diferente’’. En las monografı́as de un suplemento dietético, un ingrediente farmacéutico (ver
individuales, y cuando existan diferencias con respecto a la también el NF 25) o un componente de un dispositivo terminado
Advertencias Generales o a los Capı́tulos Generales, se sobreen- para el cual el tı́tulo de la monografı́a no incluye indicación alguna
tiende que el texto aplicable es el texto especı́fico empleado en las sobre la naturaleza de la forma terminada; una preparación oficial es
normas, pruebas, valoraciones y otras especificaciones de la un medicamento, un suplemento nutricional, un suplemento dietético
monografı́a individual, aunque no se haga mención expresa de la o un dispositivo terminado. Puede ser una preparación total
excepción. o parcialmente terminada (p.ej. un sólido estéril que debe ser
reconstituido en solución para su administración) o el producto de
una o más sustancias oficiales formuladas para su uso por pacientes
TÍTULO o consumidores; un artı́culo es un producto para el cual existe una
monografı́a, ya sea una sustancia oficial o una preparación oficial.
El tı́tulo completo de esta publicación, incluidos sus suplementos, Indicación de Conformidad con las Normas Oficiales—Cuando se
es: Farmacopea de los Estados Unidos de América, Trigésima usan las siglas ‘‘USP’’, ‘‘NF’’ o ‘‘USP–NF’’ en la etiqueta de un
Revisión. Este tı́tulo puede abreviarse a Farmacopea de los Estados artı́culo para indicar que el artı́culo cumple con las normas
Unidos, Trigésima Revisión o con la sigla en inglés USP 30. La farmacopeicas, las siglas deben aparecer junto al nombre oficial
Farmacopea de los Estados Unidos, Trigésima Revisión reemplaza del artı́culo o, si corresponde, junto a los ingredientes contenidos en
a todas las revisiones anteriores. Cuando se emplea las siglas éste. Las siglas no deberán aparecer dentro de sı́mbolos, como por
‘‘USP’’, sin ningún otro agregado, la misma se refiere a la USP 30 y ejemplo cı́rculos, cuadrados, etc., y estarán en letras mayúsculas.
a sus suplementos durante el tiempo que esta Farmacopea Si se declara que un suplemento dietético es un producto oficial o si
permanezca en vigencia. Los mismos tı́tulos, sin ninguna distinción, se lo representa como tal, y la USP determina que esa aseveración no
se aplican tanto a la presentación impresa como a la electrónica de fue hecha de buena fe, la polı́tica de la USP establece que se inicie
estos contenidos. una acción legal.
Productos no Comercializados en los Estados Unidos—Siempre
ha existido interés en la USP fuera del territorio de los Estados
‘‘OFICIAL’’ Y ‘‘ARTÍCULOS OFICIALES’’ Unidos. Algunas veces, se pueden adoptar monografı́as de artı́culos
cuya comercialización no es legal en los Estados Unidos como un
El empleo o referencia a la palabra ‘‘oficial’’ en esta Farmacopea servicio a las autoridades de otros paı́ses en donde se reconocen y
es sinónimo de ‘‘Farmacopeico’’, ‘‘USP’’ o ‘‘del compendio’’. aplican las normas de la USP. La aparición de tales monografı́as no
La designación ‘‘USP’’, acompañando al tı́tulo oficial en la concede ningún derecho de comercialización de ningún tipo, y
etiqueta de un artı́culo o en cualquier otro lugar, indica que hay una cualquier duda referente a la condición legal del artı́culo en los
monografı́a en la USP y que el artı́culo cumple con todas las normas Estados Unidos deberá verificarse con la Administración de
aplicables de la USP. La designación ‘‘USP’’ en la etiqueta de un Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos de América
artı́culo no debe ni puede interpretarse como aval o reconocimiento (U.S. Food and Drug Administration, FDA).
por parte de la USP; asimismo, la incorporación del material Suplementos Nutricionales y Otros Suplementos Dietéticos—La
informativo de la monografı́a de la USP en el etiquetado del designación ‘‘USP’’ en una preparación oficial que contiene uno
fabricante, tampoco debe ni puede interpretarse como una o más nutrientes o ingredientes dietéticos reconocidos, o el uso de la
confirmación por parte de la USP de que tal artı́culo cumple con sigla ‘‘USP’’ junto con el tı́tulo de tales preparaciones de
las normas de la USP. Se puede indicar que un artı́culo cumple con suplementos nutricionales o dietéticos, puede hacerse sólo si la
las normas u otros requisitos de la USP sólo cuando el artı́culo preparación cumple con todos los requisitos aplicables contenidos en
está reconocido en la USP. Las normas se aplican por igual a los la monografı́a individual y en los capı́tulos generales. Cualquier
artı́culos con nombres oficiales o artı́culos con nombres derivados expresión que modifique o limite esta representación deberá estar
por transposiciones de las palabras que componen los tı́tulos acompañada por una aseveración que indique que el artı́culo ‘‘no es
oficiales, o por transposición en el orden de los nombres de dos USP’’, y se deberá indicar en qué forma el artı́culo difiere de las
o más ingredientes activos en los nombres oficiales, ya sea que se normas de contenido, calidad o pureza cuando se lo analiza mediante
adjunte o no la designación ‘‘USP’’. Los nombres que se consideren las pruebas y valoraciones establecidas en los compendios. En tales
sinónimos de nombres oficiales no podrán ser utilizados como artı́culos no se deberá declarar ni sugerir, que algún ingrediente
nombres oficiales. adicional no reconocido por la Farmacopea y al que se atribuye valor
Aunque en la actualidad la Farmacopea de los Estados Unidos y nutricional posee calidad o reconocimiento USP. Si una preparación
el Formulario Nacional se publican en un solo tomo, cada texto no cumple con todos los requisitos aplicables pero contiene como
constituye por sı́ mismo un compendio separado. La designación ingredientes suplementos dietéticos o nutrientes reconocidos por la
USP–NF o una combinación similar puede usarse en las etiquetas, USP, no se puede indicar en la etiqueta del artı́culo que los nutrientes
siempre que dichas etiquetas también lleven una frase tal como o ingredientes individuales cumplen con las normas USP, o son de
‘‘cumple con las normas del NF publicadas por la USP’’, indicando calidad USP sin indicar en la misma etiqueta que el artı́culo en
cuál de los dos compendios es el que corresponde aplicar. sı́ mismo no cumple con las normas USP.
Cuando se determine que un artı́culo difiere en las normas de
contenido, calidad o pureza al aplicar las pruebas y valoraciones que
le correspondan en la Farmacopea, estas diferencias deben indicarse
en forma clara en la etiqueta. Si un artı́culo no cumple con la
identidad estipulada en la USP o se le ha agregado una sustancia que
4 Advertencias Generales USP 30
Los pesos atómicos utilizados para calcular pesos moleculares y Cuando en estos compendios se expresen lı́mites en forma
los factores en las valoraciones y en otras partes donde éstos numérica, los lı́mites superior e inferior de un intervalo incluyen
aparezcan, son los recomendados en 1997 por la Comisión de Pesos a los valores extremos y todos sus valores intermedios, pero no a los
Atómicos y Abundancias Isotópicas de la Unión Internacional de valores fuera de dichos lı́mites. Los lı́mites que se expresan en las
Quı́mica Pura y Aplicada (IUPAC, por sus siglas en inglés). Las definiciones y pruebas de las monografı́as se consideran valores
fórmulas quı́micas aparte de las que aparecen en las Definiciones, significativos hasta el último dı́gito señalado, independientemente de
pruebas y valoraciones, se proporcionan para fines de información y que dichos valores se expresen en porcentajes o en números
cálculo. El formato dentro de una monografı́a dada es tal que, absolutos.
después del tı́tulo oficial, aparece en primer lugar el texto Equivalencias en Procedimientos Volumétricos—Las instruc-
primordialmente informativo y a continuación, el texto donde se ciones de los procedimientos volumétricos concluyen con la
incluyen los requisitos, y esta última sección está señalada con el equivalencia entre el peso del analito y cada mililitro de solución
sı́mbolo de doble flecha » en negrilla. (En el Prefacio se indica que volumétrica estandarizada. En tales equivalencias, se entenderá que
las fórmulas gráficas y la nomenclatura quı́mica se presentan como el número de cifras significativas en la concentración de la solución
material informativo en las monografı́as individuales.) volumétrica se corresponde con el número de cifras significativas en
el peso del analito. Siempre que corresponda, se harán correcciones
con un blanco en las valoraciones volumétricas (ver Volumetrı́a
ABREVIATURAS h541i).
Tolerancias—Los lı́mites especificados en las monografı́as de los
El término ER se refiere a un Estándar de Referencia USP tal artı́culos farmacopeicos se establecen para su uso como medica-
como se establece bajo el encabezado Estándares de Referencia en mentos, suplementos nutricionales o dietéticos, o dispositivos
estas Advertencias Generales. (ver también Estándares de Referen- médicos, excepto que se indique algo diferente. Las fórmulas
cia USP h11i para una discusión completa acerca de materiales de moleculares de los ingredientes activos que se usan en las
referencia). definiciones de artı́culos farmacopeicos para determinar el requisito
Los términos SC y SR corresponden a Solución Colorimétrica y de contenido tienen por objeto representar las entidades quı́micas, tal
Solución Reactivo, respectivamente (ver Reactivos, Indicadores y como aparecen en el nombre quı́mico completo, con una pureza
Soluciones). El término SV corresponde a Solución Volumétrica absoluta (100 por ciento).
como figura en el subtı́tulo Soluciones en las Advertencias Una forma farmacéutica se formulará con la intención de
Generales. suministrar el 100 por ciento de la cantidad de cada ingrediente
El término PF se refiere al Pharmacopeial Forum, publicación declarado en la etiqueta. Las tolerancias y lı́mites establecidos en las
periódica acerca del desarrollo de normas y revisión de los Definiciones de las monografı́as para artı́culos farmacopeicos,
compendios oficiales (ver Pharmacopeial Forum en estas Adver- consideran los errores analı́ticos y las variaciones inevitables en la
tencias Generales). fabricación y la preparación magistral, como ası́ también el deterioro
A continuación aparece una tabla en orden alfabético con el hasta un grado considerado aceptable en condiciones prácticas.
listado de las abreviaturas de los nombres de numerosas institu- Cuando debido a requisitos legales aplicables, se requiera que la
ciones, organizaciones y publicaciones que se utilizan a lo largo del cantidad mı́nima de una sustancia presente en un suplemento
texto de la USP y el NF. nutricional o dietético sea mayor que el lı́mite inferior permitido por
la monografı́a, el lı́mite superior de la monografı́a debera
Abreviatura Institución, Organización o Publicación incrementarse en una cantidad correspondiente
AAMI Association for the Advancement of Las tolerancias especificadas se basan en atributos de calidad tales
Medical Instrumentation que pudieran considerarse caracterı́sticos de un artı́culo producido
ACS American Chemical Society con materias primas adecuadas y de acuerdo con los principios
ANSI American National Standards Institute reconocidos de buenas prácticas de fabricación.
AOAC AOAC International (anteriormente, La existencia de lı́mites o tolerancias farmacopeicas no constitu-
Associ- yen razón para aseverar que una sustancia oficial cuya pureza se
ation of Official Analytical Chemists) aproxima al 100 por ciento ‘‘excede’’ la calidad indicada por los
ASTM American Society for Testing and Materials requisitos farmacopeicos. De igual manera, el hecho de que un
ATCC American Type Culture Collection artı́culo se haya preparado con tolerancias más estrechas que las
CAS Chemical Abstracts Service especificadas en la monografı́a no constituye una razón válida para
CFR U.S. Code of Federal Regulations aseverar que el artı́culo ‘‘excede’’ los requisitos farmacopeicos.
EP European Pharmacopoeia Interpretación de los Requisitos—Los resultados analı́ticos
EPA U.S. Environmental Protection Agency observados en el laboratorio (o los calculados a través de
FCC Food Chemicals Codex determinaciones experimentales) se comparan con los lı́mites
FDA U.S. Food and Drug Administration establecidos para determinar si existe conformidad con los requisitos
HIMA Health Industry Manufacturers Association de las pruebas o valoraciones farmacopeicas. Por lo general, los
ISO International Organization for Standardi- resultados observados o calculados tendrán más cifras significativas
zation que las que figuran en el lı́mite establecido y en consecuencia el
IUPAC International Union of Pure and Applied valor de informe debe redondearse al mismo número de cifras
Chemistry significativas expresadas para el lı́mite según el siguiente procedi-
JP Japanese Pharmacopoeia miento. Los cálculos intermedios (por ejemplo la pendiente de la
NIST National Institute of Standards curva de linealidad en Validación de Procedimientos Farmacopeicos
and Technology h1225i) pueden redondearse para propósitos informativos, pero los
USAN United States Adopted Names valores originales (sin redondear) deben usarse en todos los cálculos
OMS (WHO) Organización Mundial de la Salud (World adicionales en los que se requieran. El redondeo no deberá efectuarse
Health Organization) antes de realizar los cálculos correspondientes para obtener el valor
de informe. [NOTA—Los lı́mites son números fijos y por lo tanto no
deben redondearse.]
Declaraciones Abreviadas en las Monografı́as—En varias partes Un valor de informe se obtiene frecuentemente combinando
de las monografı́as, se suelen utilizar oraciones incompletas para valores de varias determinaciones individuales. El valor de informe
lograr un lenguaje conciso y directo. Cuando las pruebas de lı́mite es el resultado final de un procedimiento completo de medición
aparecen abreviadas, debe entenderse que los números de los o determinación como se ha documentado y es el valor que se
capı́tulos (indicados entre paréntesis angulares) designan los compara con el criterio de aceptación. En la mayorı́a de los casos, los
procedimientos respectivos a seguir y que los valores especificados usuarios internos o externos usan el valor de informe como
después de los dos puntos son los lı́mites requeridos. documentación.
USP 30 Advertencias Generales 5
Cuando se requiere redondear una cifra, considerar solamente el Anuncio de Revisión Intermedia (Interim Revision Announcement)
dı́gito que se encuentra a la derecha del último lugar decimal en la (si existiera)—Revisiones oficiales y sus fechas de vigencia,
expresión del lı́mite. Si este dı́gito es menor de 5, éste se elimina sin anuncios de disponibilidad de nuevos Estándares de Referencia
cambiar el dı́gito que lo precede. Si dicho dı́gito es mayor de USP y anuncios de valoraciones o pruebas aún no oficiales por falta
5 o igual a 5, se elimina y el dı́gito anterior se aumenta en uno. de Estándares de Referencia USP.
Revisiones en Proceso (In-Process Revision)—Monografı́as
Ejemplos de cómo Redondear Valores Numéricos para nuevas o revisadas o los capı́tulos que se proponen para adopción
Compararlos con los Requisitos oficial como normas de la USP o del NF.
Requisitos Valor sin Valor Revisiones Preliminares de la Farmacopea (Pharmacopeial
Farmacopeicos Redondear Redondeado Cumple Previews)—Posibles revisiones o monografı́as y capı́tulos nuevos
Lı́mite de Valora- que están en una etapa preliminar de desarrollo.
ción 98,0% 97,96% 98,0% Sı́ Estı́mulos al Proceso de Revisión (Stimuli to the Revision
97,92% 97,9% No Process)—Informes, declaraciones, artı́culos o comentarios que se
97,95% 98,0% Sı́ relacionan con temas de la Farmacopea.
Lı́mite de Valora- Nomenclatura—Artı́culos y anuncios pertinentes a los temas de
ción 5101,5% 101,55% 101,6% No nomenclatura de los compendios y las listas de nuevos nombres
101,46% 101,5% Sı́ sugeridos para la publicación United States Adopted Names (USAN)
101,45% 101,5% Sı́ y para la Denominación Común Internacional (DCI) de las
Prueba de Lı́- Sustancias Farmacéuticas.
mite 50,02% 0,025% 0,03% No Estándares de Referencia Oficiales (Official Reference
0,015% 0,02% Sı́ Standards)—Catálogo con la información sobre lotes existentes de
0,027% 0,03% No Estándares de Referencia USP que incluye información para
Prueba de Lı́- adquirirlos junto con los nombres y direcciones de los proveedores
mite 53 ppm 0,00035% 0,0004% No a nivel internacional.
0,00025% 0,0003% Sı́
0,00028% 0,0003% Sı́
SUPLEMENTOS
Cuando en una prueba o valoración se indique un artı́culo de la Cuando la monografı́a de un preparado exige un ingrediente
Farmacopea y no un Estándar de Referencia USP como material de expresado como sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente
referencia, se deberá utilizar una sustancia que satisfaga todas las antes de utilizarlo, siempre que se haga la debida corrección para el
especificaciones indicadas para dicho artı́culo en la monografı́a agua u otras sustancias volátiles presentes en la cantidad utilizada.
oficial. A menos que se exceptúe especı́ficamente en esta Farmacopea, la
Los requisitos para las nuevas normas, pruebas o valoraciones de identidad, el contenido, la calidad y la pureza de un artı́culo oficial
la USP o del NF, para las cuales se especifique el uso de un Estándar están determinados por la definición, las propiedades fı́sicas,
de Referencia USP nuevo, no entran en vigencia hasta que dicho pruebas, valoraciones y otras especificaciones relativas al artı́culo,
Estándar de Referencia USP esté disponible. La disponibilidad de los ya sea que las mismas se incorporen en la monografı́a respectiva, en
Estándares de Referencia USP nuevos y las correspondientes fechas las Advertencias Generales o en los Capı́tulos Generales.
oficiales de las normas, pruebas o valoraciones de la USP o del NF Agua—El agua que se utiliza como ingrediente en preparaciones
se comunican por medio de los Suplementos o de los Anuncios de oficiales debe satisfacer los requisitos establecidos para Agua
Revisión Intermedia contenidos en el Pharmacopeial Forum. Purificada, Agua para Inyección o para alguna de las formas
estériles de agua, según se establece en alguna de las monografı́as de
esta Farmacopea.
UNIDADES DE POTENCIA Para la preparación de sustancias oficiales, se puede usar agua
potable que reúna los requisitos establecidos por la Oficina de
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas completa- Protección del Medio Ambiente del Gobierno de los Estados Unidos
mente por medios quı́micos y fı́sicos, puede ser necesario expresar la (U.S. Environmental Protection Agency; EPA, por sus siglas en
actividad en unidades de potencia biológica, definidas por un inglés).
estándar de referencia designado como patrón oficial. Alcohol—Todos los porcentajes de alcohol, tales como los
Las unidades de potencia biológica definidas por la Organización establecidos en Contenido de alcohol, son porcentajes en volumen
Mundial de la Salud (OMS) mediante Estándares Biológicos de C2H5OH a 15,568. Cuando se hace referencia a ‘‘C2H5OH’’,
Internacionales y mediante Preparaciones Biológicas Internacionales significa la entidad quı́mica, considerada con un contenido absoluto
de Referencia se denominan Unidades Internacionales (UI). Las (100 por ciento).
unidades definidas mediante Estándares de Referencia USP, son
Unidades USP y las monografı́as individuales se refieren a éstas. A Alcohol—En formulaciones, pruebas y valoraciones donde se
menos que se indique algo diferente, las Unidades USP son requiera ‘‘alcohol’’, se debe utilizar el artı́culo de la monografı́a
equivalentes a las Unidades Internacionales correspondientes, Alcohol.
cuando existan. Tal equivalencia se establece, por lo general, Alcohol Deshidratado—Cuando se cite ‘‘alcohol deshidratado’’
basándose exclusivamente en la valoración farmacopeica para la (alcohol absoluto) en pruebas y valoraciones, se debe utilizar el
sustancia. artı́culo descrito en la monografı́a Alcohol Deshidratado.
Para los productos biológicos, existan o no Unidades Internacio- Alcohol Desnaturalizado—Hay formulaciones especiales para
nales o Unidades USP (ver Productos Biológicos h1041i), las alcohol desnaturalizado disponibles para su uso de acuerdo a los
unidades de potencia se definen mediante los correspondientes estatutos federales y reglamentaciones de la Oficina de Recaudación
Estándares de los Estados Unidos establecidos por la FDA. de Impuestos del Gobierno de los Estados Unidos (Internal Revenue
Service; IRS, por sus siglas en inglés). Una formulación adecuada de
alcohol desnaturalizado puede sustituir al Alcohol en la fabricación
INGREDIENTES Y PROCESOS de preparaciones farmacopeicas para uso interno o para uso tópico,
siempre que el desnaturalizante sea volátil y no quede en el producto
Los medicamentos y los dispositivos terminados oficiales se terminado. Un producto terminado destinado a aplicación tópica
elaboran con ingredientes que cumplen los requisitos indicados en sobre la piel puede contener alcohol especialmente desnaturalizado,
las monografı́as oficiales siempre que se proporcionen las mono- siempre que el desnaturalizante sea un ingrediente normal o una
grafı́as correspondientes (ver también NF 25). Generalmente, los sustancia agregada permitida; en ambos casos, el desnaturalizante se
suplementos nutricionales y dietéticos se preparan a partir de debe identificar en la etiqueta de la preparación tópica. Cuando se
ingredientes que cumplen con los requisitos de sus monografı́as indique un proceso en la monografı́a individual, la preparación hecha
oficiales, excepto que se pueden usar sustancias de grado alimenticio con alcohol desnaturalizado debe ser idéntica a la que se obtiene por
de calidad aceptable en caso de que hubiera una diferencia. el proceso indicado.
Las sustancias oficiales se preparan según principios reconocidos Sustancias Agregadas—Una sustancia oficial, a diferencia de un
de buenas prácticas de fabricación y con ingredientes que cumplen preparado oficial, no contiene sustancias agregadas salvo las
con las especificaciones establecidas para asegurar que las sustancias permitidas especı́ficamente en la monografı́a individual. Si se
resultantes cumplan con los requisitos establecidos en las mono- permite tal adición, la etiqueta debe indicar el nombre o los nombres
grafı́as oficiales (ver también Impurezas y Sustancias Extrañas en y la cantidad o las cantidades de las sustancias agregadas.
Pruebas y Valoraciones). A menos que se especifique algo diferente en la monografı́a
Los preparados para los que se indique una composición completa respectiva o en cualquier otra parte de las Advertencias Generales,
en esta Farmacopea deben contener únicamente los ingredientes pueden añadirse sustancias adecuadas tales como agentes antimi-
indicados en las fórmulas, a menos que se exceptúen especı́ficamente crobianos, bases, transportadores, recubrimientos, colorantes, sabo-
en este texto o en las monografı́as respectivas. Sin embargo, puede rizantes, conservantes, estabilizantes y vehı́culos a una preparación
haber desviaciones en los procesos especificados o en los métodos de oficial para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para
preparación, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre que facilitar su preparación. Tales sustancias son consideradas como
el preparado cumpla con los estándares pertinentes descritos en este inadecuadas y su uso está prohibido a menos que se pruebe lo
texto y se prepare siguiendo el proceso especificado. siguiente: (a) que son inocuas en la cantidad utilizada; (b) que no
Las tolerancias especificadas en las monografı́as individuales y en exceden la cantidad mı́nima requerida para lograr el efecto deseado;
los capı́tulos generales para preparados farmacéuticos se basan en los (c) que su presencia no afecta la biodisponibilidad, la eficacia
atributos de calidad que se espera que podrı́an caracterizar un terapéutica o la seguridad de la preparación oficial y (d) que no
artı́culo preparado a partir de fármacos e ingredientes a granel de interfieren con las pruebas o valoraciones prescritas para determinar
acuerdo con los procedimientos establecidos o con los principios el cumplimiento con las normas de la Farmacopea.
reconocidos de buenas prácticas farmacéuticas descritos en esta Suplementos Nutricionales y Dietéticos—A menos que se
Farmacopea (ver Preparación Magistral—Preparaciones No Estéri- especifique algo diferente en la monografı́a individual o en otra
les h795i, y otras fuentes. parte de las Advertencias Generales y siempre que sean compatibles
Las monografı́as de preparados magistrales que se elaboran con los requisitos reglamentarios aplicables, pueden agregarse
conforme a una receta médica, pueden contener métodos de sustancias apropiadas tales como bases, transportadores, recubri-
valoración. Dichos métodos de valoración no han sido concebidos mientos, colorantes, saborizantes, conservantes y estabilizantes a una
para evaluar una preparación magistral antes de su dispensación. preparación de suplementos nutricionales o dietéticos para mejorar
Estos métodos se destinan para uso oficial en caso de que exista duda su estabilidad, utilidad o apariencia, o para facilitar su preparación.
o controversia acerca del cumplimiento con las normas oficiales.
USP 30 Advertencias Generales 7
Dichas sustancias se considerarán adecuadas y serán permitidas, Baño de Agua—Cuando se indique el uso de un baño de agua sin
a menos que interfieran con las valoraciones y pruebas prescritas mencionar la temperatura, se entiende un baño de agua hirviendo
para determinar el cumplimiento con las normas de la Farmacopea. vigorosamente.
Ingredientes Adicionales—Se pueden agregar ingredientes adicio- Impurezas y Sustancias Extrañas—Las pruebas para determinar
nales, incluyendo excipientes, a las preparaciones de suplementos la presencia de sustancias extrañas e impurezas se establecen para
nutricionales que contengan nutrientes reconocidos, siempre que limitarlas a cantidades que no sean objetables en las condiciones
sean compatibles con los requisitos reglamentarios aplicables y que normales de empleo (ver también Impurezas en Artı́culos Oficiales
no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescritas para h1086i).
determinar el cumplimiento de los estándares de la Farmacopea. Si bien uno de los objetivos primordiales de la Farmacopea es
Gases Inertes Contenidos en el Envase—El aire contenido en el asegurar al usuario la identidad, el contenido, la calidad y la pureza
envase de una preparación oficial para administración parenteral de los artı́culos oficiales, resulta prácticamente imposible incluir en
puede extraerse o reemplazarse por dióxido de carbono, helio cada monografı́a una prueba para determinar la presencia de cada
o nitrógeno, o una mezcla de estos gases, sin que sea necesario impureza, contaminante, o adulterante que pudiera estar presente,
declararlo en la etiqueta. incluyendo contaminantes microbianos. Estos pueden aparecer
Colorantes—Se pueden emplear sustancias agregadas exclusiva- cuando se cambia el proceso, por un cambio en el origen del
mente para impartir color a las preparaciones oficiales, excepto para material, o introducirse por factores externos. Además de efectuar las
aquellas destinadas a la administración parenteral u oftálmica, pruebas prescritas en las respectivas monografı́as, se deben aplicar
siempre que cumplan los reglamentos de la FDA para el uso de otras pruebas adecuadas para detectar tales eventos puesto que su
colorantes, y que sean adecuadas en todos los otros aspectos. (Ver presencia no concuerda con las buenas prácticas de fabricación y las
Sustancias Agregadas en Inyectables h1i.) buenas prácticas farmacéuticas.
Ungüentos y Supositorios—En la preparación de ungüentos y Otras Impurezas—Las sustancias oficiales pueden obtenerse por
supositorios, se pueden variar las proporciones de las sustancias que más de un proceso y por ello pueden contener impurezas que no han
constituyen la base para mantener la consistencia adecuada en sido consideradas durante la preparación de las pruebas y
diferentes condiciones climáticas, siempre que no se varı́e la valoraciones de la monografı́a. Cuando una monografı́a incluye
concentración de los ingredientes activos y que no se afecte la una valoración cromatográfica o una prueba de pureza, basada en
biodisponibilidad, la eficacia terapéutica o la seguridad de la cromatografı́a (diferente de una prueba para impurezas orgánicas
preparación. volátiles) y no se especifica la detección de tales impurezas
(exceptuando los disolventes), se debe expresar la cantidad
e identidad de la impureza, si fueran ambas conocidas, bajo el
encabezado Otra(s) Impureza(s) en el etiquetado (o certificado de
Cambio en la redacción: análisis) de la sustancia oficial.
La presencia en una sustancia oficial de cualquier impureza no
declarada en el etiquetado constituye una desviación de la norma si
el contenido fuera de 0,1% o mayor. Cuando estuvieran presentes
PRUEBAS Y VALORACIONES impurezas como resultado de cambios en los procesos u otra
situación de ocurrencia regular e identificable, se deben enviar a la
Aparatos—En las pruebas o valoraciones, la especificación de un USP las pruebas adecuadas para cuantificar y detectar impurezas no
tamaño o tipo definido de recipiente o de aparato es sólo una etiquetadas con el fin de incluir esas pruebas en las monografı́as
recomendación. Cuando se indique el uso de matraces volumétricos individuales. De lo contrario, la impureza deberá identificarse
u otros instrumentos para medir, clasificar o pesar, se deben emplear preferentemente por su nombre y la cantidad deberá informarse bajo
estos equipos, u otros que posean, al menos, una exactitud el encabezado Otras Impurezas en el etiquetado (o certificado de
equivalente. (Ver también Termómetros h21i, Aparatos Volumétricos análisis) de la sustancia oficial. La suma de las Otras Impurezas
h31i y Pesas y Balanzas h41i). Cuando se indique el uso de combinada con las impurezas detectadas por los métodos de la
recipientes con protección actı́nica, de vidrio inactı́nico, o resistentes monografı́a no excede del 2,0% (ver Impurezas Comunes h466i),
a la luz, se podrán utilizar recipientes transparentes que se hayan a menos que en la monografı́a se establezca algo diferente.
recubierto o envuelto adecuadamente para hacerlos opacos. Las categorı́as de fármacos excluidas de los requisitos de Otras
Cuando en una prueba o valoración se especifique el uso de un Impurezas son las siguientes: productos de fermentación y derivados
instrumento para una medición fı́sica con su nombre distintivo, tal semisintéticos obtenidos a partir de ellos, radiofármacos, productos
como un espectrofotómetro, puede emplearse otro instrumento de biológicos y derivados de la biotecnologı́a, péptidos, productos
exactitud y sensibilidad mayor o equivalente. Para obtener botánicos y productos crudos de origen animal o vegetal. No debe
soluciones con concentraciones adaptables a los intervalos de incluirse ninguna sustancia conocida como tóxica en Otras
trabajo del instrumento que se utiliza, se pueden preparar soluciones Impurezas.
con concentraciones proporcionalmente mayores o menores, respe- Disolventes Residuales—Los requisitos se estipulan en el
~
tando los disolventes especificados para el procedimiento y sus capı́tulo Disolventes Residuales~USP30 h467i junto con la informa-
proporciones. ción del capitulo Impurezas en Artı́culos Oficiales h1086i. En
Si se mencionara una marca o un proveedor de un material, un consecuencia, la prueba de disolventes residuales se aplica a todos
instrumento o una pieza de equipo, o el nombre y la dirección de un los fármacos, excipientes y productos, aunque la prueba no
fabricante o distribuidor (por lo general pueden aparecer como notas esté indicada en la monografı́a individual. Los requisitos conforman
al pie de página), esta información se brinda sólo por conveniencia y lo dispuesto en la guı́a ICH correspondiente a este tema. Los
no implica aprobación, endoso o certificación. Se pueden utilizar disolventes que se emplean durante los procesos de fabricación son
artı́culos de igual o mejor desempeño, siempre que se hayan de calidad adecuada. Por otra parte, se toma en consideración la
validado estas caracterı́sticas. toxicidad y el nivel residual de cada disolvente; y los lı́mites para los
Cuando se indique el uso de una centrı́fuga, las instrucciones disolventes se fijan conforme a los principios definidos y los
~
presuponen el empleo de un aparato de un radio aproximado de 20 requisitos especificados en Disolventes Residuales,~USP30 h467i
centı́metros (8 pulgadas) y una velocidad suficiente para clarificar la según los métodos generales indicados en dicho capı́tulo u otros
~
capa sobrenadante en 15 minutos, a menos que se indique algo métodos adecuados. (Oficial a partir del 18 de julio~USP30 de 2007)
diferente. Procedimientos—Los procedimientos de prueba y valoración son
A menos que se especifique algo diferente, cuando se hace para determinar si un fármaco cumple con las normas farmacopeicas
referencia al diámetro de tubos y columnas cromatográficas, se de identidad, contenido, calidad y pureza.
entiende el diámetro interno (DI). En el caso de otros tipos de tubos Al aplicar los procedimientos de prueba y valoración de esta
y tuberı́as, el diámetro especificado se refiere al diámetro externo Farmacopea, se espera que se sigan las normas de seguridad propias
(DE). de un laboratorio. Esto incluye la utilización de medidas de
Baño de Vapor—Cuando se indique el uso de un baño de vapor, precaución, equipos de protección y prácticas de trabajo adecuadas
puede usarse la exposición al vapor vivo fluente u otra forma de para las sustancias quı́micas y procedimientos utilizados. Antes de
calor regulado, a una temperatura equivalente a la del vapor fluente. realizar cualquier valoración o procedimiento descrito en esta
8 Advertencias Generales USP 30
Farmacopea, la persona que vaya a trabajar en ellos debe tener mente como sea posible, se mezclarán y se pesarán exactamente.
conocimientos sobre los peligros asociados con las sustancias Para la valoración, se pesa con exactitud una porción de dicha
quı́micas, los procedimientos y medios de protección contra dichos mezcla que sea representativa del contenido total de las Cápsulas. El
peligros. Esta Farmacopea no tiene como objetivo describir tales resultado de la valoración se relaciona con la cantidad de ingrediente
peligros o medidas de protección. activo por Cápsula, multiplicando ese resultado por el peso promedio
Cada artı́culo de este compendio que se encuentre en el mercado, del contenido de las Cápsulas y dividiendo por el peso de la porción
deberá estar constituido de tal manera, que cuando se lo examine de tomada para la valoración.
acuerdo con estos procedimientos de prueba y valoración, cumpla Si la definición en la monografı́a indica que las tolerancias ‘‘se
con todos los requisitos contenidos en la monografı́a que lo define. calculan con respecto a la sustancia (extracto o materia) seca
Sin embargo, no debe inferirse que la aplicación de todos los (anhidra o incinerada)’’, en general las instrucciones para secar
procedimientos analı́ticos de la monografı́a a muestras de cada uno o incinerar la muestra antes de efectuar la valoración no figuran en el
de las partidas de producción es un prerrequisito necesario para procedimiento de Valoración. Si la monografı́a indica una prueba
asegurar el cumplimiento con las normas de la Farmacopea antes de para Pérdida por secado, Agua o Pérdida por incineración, es
liberar las partidas para su distribución. Los datos obtenidos a partir posible efectuar las pruebas o valoraciones a la sustancia sin secar
de los estudios de validación de procesos de fabricación y de o sin incinerar y los resultados se pueden calcular con respecto a la
controles durante el proceso pueden, a veces, conferir mayores sustancia seca, anhidra o incinerada, respectivamente. A menos que
garantı́as sobre una partida, en lo que se refiere al cumplimiento de la monografı́a especifique algo diferente, los resultados se pueden
los requisitos de una monografı́a en particular, que la información calcular con respecto a la sustancia ‘‘tal como se encuentra’’. Si la
obtenida del examen de unidades terminadas de esa partida. humedad o la presencia de material volátil pudieran interferir en el
Basándose en tales garantı́as, el fabricante puede omitir los procedimiento, en la monografı́a individual se indica que es
procedimientos analı́ticos de la monografı́a al juzgar el cumpli- necesario secar la sustancia con anterioridad, paso que es obligatorio.
miento de la partida con las normas de la Farmacopea. Si en una monografı́a se incluye una prueba de Pérdida por
Los procedimientos automatizados que emplean los mismos secado o Agua, la expresión ‘‘previamente secado’’ sin otro
fundamentos quı́micos que los dados en las monografı́as para calificativo significa que la sustancia debe secarse según se indica
pruebas y valoraciones se reconocen como equivalentes en su en las secciones Pérdida por secado o Agua (determinación
capacidad para determinar el cumplimiento de las normas. Lo mismo gravimétrica).
se aplica a la inversa, cuando en una monografı́a se describe un A menos que se especifique de otro modo en la prueba
procedimiento automatizado, los procedimientos manuales que o valoración de la monografı́a individual, o en un capı́tulo general,
emplean los mismos principios quı́micos se reconocen como los Estándares de Referencia USP deben secarse, o usarse sin secar,
equivalentes para determinar el cumplimiento de las normas. El según las instrucciones especı́ficas establecidas en el capı́tulo
cumplimiento también puede determinarse por medio de métodos Estándares de Referencia USP h11i y en la etiqueta del Estándar
alternativos seleccionados por sus ventajas en cuanto a exactitud, de Referencia. Cuando las instrucciones de la etiqueta difieran de los
precisión, sensibilidad, selectividad o adaptabilidad a la automatiza- detalles que aparecen en el capı́tulo, prevalece el texto de la etiqueta.
ción o a la reducción de datos por medio de una computadora o en Cuando se indiquen las cantidades apropiadas que deban tomarse
otras circunstancias especiales. Dichos procedimientos automatiza- en pruebas o valoraciones, el término ‘‘aproximadamente’’ indica
dos o métodos alternativos deberán validarse. Sin embargo, debido una cantidad que puede variar hasta en 10% respecto del peso
a que los estándares y los procedimientos están interrelacionados, si o volumen especificado. Sin embargo, el peso o volumen que se
surgieran diferencias o en el caso de controversia, solamente el toma debe ser determinado con exactitud y el resultado calculado
resultado obtenido por el procedimiento dado en esta Farmacopea con referencia a la cantidad exacta que se tomó. La misma tolerancia
será el que prevalezca. se aplica a dimensiones especı́ficas.
Cuando se llevan a cabo los procedimientos de prueba o valora- Cuando se indique el uso de una pipeta para medir una muestra
ción, se tomará un número de unidades de dosificación no menor que o una alı́cuota para efectuar una prueba o valoración, la pipeta debe
el número especificado para el análisis. Se pueden tomar cantidades cumplir con los requisitos establecidos bajo el tı́tulo Aparatos
de las sustancias de prueba, de valoración y del Estándar de Volumétricos h31i y deberá utilizarse de manera que el error no
Referencia que sean proporcionalmente mayores o menores que los exceda del lı́mite establecido para una pipeta de su tamaño. Cuando
pesos y volúmenes especificados, siempre que las medidas se se especifica una pipeta, ésta puede substituirse por una bureta
efectúen, por lo menos, con una exactitud equivalente, y también, adecuada que cumpla los requisitos especificados en Aparatos
que los pasos siguientes, tales como diluciones, se ajusten para Volumétricos h31i. Cuando se indica el uso de una pipeta calibrada
proporcionar concentraciones equivalentes a las prescritas y que ‘‘para contener’’, ésta se puede sustituir por un matraz volumétrico
dichos pasos se efectúen de manera tal que produzcan, por lo menos, apropiado.
una exactitud equivalente. Para minimizar el impacto ambiental o el Las expresiones tales como ‘‘25,0 mL’’ y ‘‘25,0 mg’’ que se
contacto con materiales peligrosos, también se pueden cambiar utilizan respectivamente para medidas volumétricas o graviméticas,
proporcionalmente los aparatos y productos quı́micos especificados indican que la cantidad debe ser medida o pesada ‘‘con exactitud’’
en los procedimientos farmacopeicos. dentro de los lı́mites establecidos en Aparatos Volumétricos h31i
Cuando en una prueba o valoración se indique que se debe o en Pesas y Balanzas h41i.
examinar una cierta cantidad de sustancia o un número dado de Por lo general, el término ‘‘transferir’’ se usa para indicar una
unidades de dosificación, la cantidad especificada o el número manipulación cuantitativa.
indicado es la cantidad mı́nima (determinación unitaria) y se elige El término ‘‘concomitantemente’’ usado en expresiones tales
solamente basándose en la facilidad de la manipulación analı́tica. No como ‘‘determinar concomitantemente’’ o ‘‘medido concomitante-
se pretende limitar la cantidad total de sustancia o el número de mente’’ en las instrucciones de pruebas y valoraciones denota que las
unidades sometidas a valoración o prueba, o que deban analizarse de determinaciones o medidas deben efectuarse en sucesión inmediata.
acuerdo a los principios de buenas prácticas de fabricación. Ver también Uso de Estándares de Referencia en Espectrofotometrı́a
Cuando se indique en una valoración para Tabletas ‘‘pesar y y Dispersión de Luz h851i.
reducir a polvo fino no menos de’’ un cierto número de Tabletas, Agua—En las pruebas y valoraciones en que se indique agua,
generalmente 20, se entiende que se contará el número de Tabletas deberá usarse Agua Purificada a menos que se especifique algo
a ser pesadas y pulverizadas. Para la valoración, se pesa con diferente. Para ciertas clases de agua tal como‘‘Agua exenta de
exactitud una porción de tabletas pulverizadas representativa del dióxido de carbono’’, ver la introducción de la sección Reactivos,
total. El resultado de la valoración se relaciona con la cantidad de Indicadores y Soluciones. Para Agua de Alta Pureza, ver el capı́tulo
ingrediente activo por unidad, multiplicando el resultado por el peso Envases h661i.
promedio de las Tabletas y dividiendo por el peso de la porción Agua y Pérdida por Secado—Cuando el agua de hidratación o el
tomada para la valoración. agua adsorbida de un artı́culo de la Farmacopea se determina por el
De manera similar, cuando en una valoración de Cápsulas se método volumétrico, la prueba generalmente aparece bajo el tı́tulo
indique que se deberá vaciar, tan completamente como sea posible, Agua. Los lı́mites expresados en las monografı́as en porcentajes se
el contenido de no menos de cierto número de Cápsulas, normal- calculan con referencia a la proporción peso por peso, a menos que
mente 20, se infiere que se deberá abrir cuidadosamente un número se especifique algo diferente. Cuando la determinación se hace por
contado de Cápsulas cuyos contenidos se vaciarán tan completa- secado en condiciones especı́ficas, la prueba generalmente aparece
USP 30 Advertencias Generales 9
bajo el tı́tulo Pérdida por secado. Sin embargo, con frecuencia el identificación prescrita, indica que el artı́culo puede estar mal
tı́tulo Pérdida por secado aparece en las monografı́as donde se sabe etiquetado. Otras pruebas o especificaciones en la monografı́a
que la pérdida de peso representa constituyentes volátiles residuales, a menudo contribuyen a establecer o confirmar la identidad del
tales como disolventes orgánicos, además del agua. artı́culo examinado.
Cepas Microbianas—Cuando se cita una cepa microbiana y se la Secado hasta Peso Constante—La especificación ‘‘secado hasta
identifica por el número del catálogo ATCC, la cepa especı́fica se peso constante’’ significa que deberá continuarse el secado, hasta que
empleará directamente o, si se hacen cultivos sucesivos, no se dos pesadas consecutivas no difieran en más de 0,50 mg por gramo
emplearán más de cinco transferencias a partir de la cepa original. de sustancia tomada, haciendo la segunda pesada después de una
Desecador—La expresión ‘‘en un desecador’’ especifica el uso de hora adicional de secado.
un recipiente perfectamente cerrado, de tamaño y diseño adecuados, Soluciones—A menos que se indique algo diferente en la
que mantiene una atmósfera de bajo contenido de humedad mediante monografı́a respectiva, todas las soluciones utilizadas en pruebas y
gel de sı́lice u otro desecante adecuado. valoraciones se prepararán con Agua Purificada.
Un ‘‘desecador al vacı́o’’ es un desecador que mantiene la La expresión ‘‘(1 en 10)’’ significa que 1 parte medida en volumen
atmósfera de baja humedad a una presión reducida de no más de 20 de un lı́quido debe diluirse con, o que 1 parte de un sólido en peso
milı́metros de mercurio, o a la presión indicada en la monografı́a debe disolverse en, suficiente diluyente o disolvente para que el
individual. volumen de la solución final sea de 10 partes medidas en volumen.
Determinación de Blancos—Cuando se indique que se debe hacer La expresión ‘‘(20 : 5 : 2)’’ significa que los números respectivos
‘‘cualquier corrección necesaria’’ por medio de una determinación de partes, medidas en volumen, de los lı́quidos señalados deben
con un blanco, tal determinación se hará utilizando las mismas mezclarse, a menos que se indique algo diferente.
cantidades, de los mismos reactivos, tratados de la misma manera La anotación ‘‘SV’’ después de una solución volumétrica
que la solución o mezcla que contiene la porción de sustancia en especı́fica indica que tal solución está estandarizada de acuerdo
análisis, pero omitiendo dicha sustancia. a las instrucciones dadas en la monografı́a respectiva o bajo el tı́tulo
Diluciones—Cuando se indica que una solución debe ser diluida Soluciones Volumétricas de la sección Reactivos, Indicadores y
‘‘cuantitativamente y en etapas’’, una porción medida con exactitud Soluciones y, de esta manera, se diferencia de soluciones de
será diluida añadiendo agua u otro disolvente en la proporción normalidad o molaridad aproximada.
indicada, en uno o más pasos. Al elegir los aparatos a utilizar, se Cuando en una prueba o valoración se indica el uso de una
deberá tener en cuenta que generalmente los aparatos volumétricos solución estandarizada con una concentración especı́fica, se pueden
de volumen pequeño se asocian con errores relativamente mayores. emplear soluciones con otras normalidades o molaridades, siempre
(Ver Aparatos Volumétricos h31i). que se considere la diferencia en concentración y no se aumente el
error de la medida.
Filtración—Cuando se indica ‘‘filtrar’’ sin otro calificativo, se
entiende que el lı́quido será filtrado a través de un papel de filtro Temperaturas—A menos que se indique algo diferente, todas las
adecuado o a través de un dispositivo equivalente hasta que el temperaturas en esta Farmacopea se expresan en grados centı́grados
filtrado sea transparente. (Celsius) y todas las mediciones se hacen a 258. Cuando se
especifica calor moderado, se indica toda temperatura no mayor de
Inapreciable—Este término indica una cantidad que no excede de 458 (1138 F). Ver Temperatura de Almacenamiento, en Conserva-
0,50 mg. ción, Envase, Almacenamiento y Etiquetado para otras definiciones.
Incineración hasta Peso Constante—La especificación ‘‘incinerar Tiempo Lı́mite—Al efectuar pruebas y valoraciones se aguardarán
hasta peso constante’’ significa que deberá continuarse la incinera- 5 minutos para que se produzca la reacción, a menos que se
ción a 800 + 258 a menos que se indique algo diferente, hasta que especifique algo diferente.
dos pesadas consecutivas no difieran en más de 0,50 mg por gramo
de sustancia tomada, haciendo la segunda pesada después de un Vacı́o—El término ‘‘al vacı́o’’ especifica la exposición a una
perı́odo de 15 minutos de incineración adicional. presión menor de 20 mm de mercurio, a menos que se indique algo
diferente.
Indicadores—Cuando se especifique el uso de una solución Cuando en una monografı́a en particular se indique secar al vacı́o
reactivo (‘‘SR’’) como indicador en una prueba o en una valoración, sobre un desecante, se debe utilizar un desecador al vacı́o o una
se añadirán aproximadamente 0,2 mL ó 3 gotas, a menos que se pistola para secado al vacı́o u otro instrumento apropiado para
indique algo diferente. secado al vacı́o.
Logaritmos—Los logaritmos empleados en las valoraciones son Resultados de Pruebas, Estadı́sticas y Normas—La interpreta-
logaritmos en base 10. ción de los resultados de pruebas y valoraciones oficiales requiere
Medidas de Presión—El término ‘‘mm de mercurio’’ usado en una comprensión de la naturaleza y el estilo de las normas
relación con mediciones de presión sanguı́nea, presión dentro de un farmacopeicas, además del entendimiento de los aspectos cientı́ficos
aparato o presión atmosférica, se refiere al uso de un manómetro y matemáticos del análisis de laboratorio y la garantı́a de calidad en
o un barómetro calibrado en términos de la presión ejercida por una laboratorios analı́ticos.
columna de mercurio de la altura indicada. A veces se confunden las normas oficiales con pruebas para la
Olor—Los términos ‘‘inodoro’’, prácticamente inodoro’’, ‘‘con un liberación y con planes de muestreo estadı́stico. Las normas
débil olor caracterı́stico’’, o expresiones semejantes, se aplican al farmacopeicas definen las caracterı́sticas de un artı́culo aceptable y
examen después de la exposición al aire durante 15 minutos de un establecen los procedimientos de prueba para demostrar conformi-
envase recientemente abierto del artı́culo (envases que contengan no dad con los requisitos. Estas normas son aplicables en cualquier
más de 25 g) o de una porción de aproximadamente 25 g del artı́culo momento de la vida del producto, desde su producción hasta su
(en caso de envases más grandes) que ha sido trasladado de su consumo. Las especificaciones de liberación del fabricante y la
envase a un recipiente abierto, con una capacidad aproximada de 100 conformidad con las buenas prácticas de fabricación, por lo general,
mL. La asignación de un olor es sólo descriptiva y no debe se desarrollan y se siguen para asegurar que el artı́culo cumplirá en
considerarse como una norma de pureza para un lote particular de un forma efectiva las normas de la Farmacopea hasta la fecha de su
artı́culo. caducidad, siempre que se almacene de acuerdo con las instrucciones
Peso especı́fico—A menos que se indique algo diferente, la base dadas al respecto. Por lo tanto, cualquier muestra analizada desde el
del peso especı́fico es 258/258; es decir, la relación entre el peso de punto de vista de cumplimiento comercial o reglamentario de-
un volumen determinado de una sustancia en el aire a 258 y el peso berá cumplir con los requisitos indicados en la monografı́a para ese
de un volumen igual de agua a la misma temperatura. artı́culo.
Las pruebas y valoraciones de esta Farmacopea se aplican a una
Pruebas de Identificación—Las pruebas de la Farmacopea que sola muestra, o sea, una determinación unitaria, que es la muestra
figuran después del subtı́tulo Identificación se suministran como una mı́nima sobre la que se deben determinar los atributos de un artı́culo
ayuda para verificar la identidad de los artı́culos tal como aparecen farmacopeico. Algunas pruebas, como por ejemplo las de Disolución
indicados en la etiqueta de sus envases. Aunque tales pruebas sean y de Uniformidad de unidades de dosificación, requieren múltiples
especı́ficas, no son necesariamente suficientes para establecer la unidades de dosificación junto con un esquema de decisión. Aunque
prueba de identidad; sin embargo, cuando un artı́culo tomado de un se empleen múltiples unidades de dosificación, estas pruebas son en
envase etiquetado no satisface los requisitos de una prueba de realidad determinaciones unitarias de los correspondientes atributos
10 Advertencias Generales USP 30
Envase Bien Cerrado—Un envase bien cerrado protege al Ley de Envasado para la Prevención del Envenenamiento—
contenido de la introducción de sólidos extraños y de la pérdida Esta ley se la conoce como Poison Prevention Packaging Act
del artı́culo bajo las condiciones usuales o acostumbradas de manejo, o PPPA, por sus siglas en inglés (consultar el sitio www.cpsc.gov/
transporte, almacenamiento y distribución. businfo/pppa.html). En esta ley se dispone que la gran mayorı́a de
Envase Impermeable—Un envase impermeable protege al con- los medicamentos de administración por vı́a oral de venta bajo
tenido de la contaminación causada por lı́quidos, sólidos o vapores receta, los medicamentos de administración por vı́a oral controlados,
extraños; de la pérdida del artı́culo; y de la eflorescencia, ciertos medicamentos de administración por una vı́a distinta de la
delicuescencia o evaporación bajo condiciones usuales o acostum- oral y venta bajo receta, ciertos suplementos dietéticos y varios
bradas de manejo, transporte, almacenamiento y distribución. medicamentos de venta libre para uso por seres humanos, deben
Además, se puede volver a cerrar de forma impermeable una vez tener un envase especial para proteger al público de lesiones o de
abierto. Cuando se especifique un envase impermeable, éste puede enfermedades causadas por el uso incorrecto de estas preparaciones
sustituirse por un envase hermético para una sola dosis de un (16 CFR } 1700.14).
artı́culo. El envase primario de las sustancias reguladas por la PPPA debe
Un cilindro de gas es un envase metálico, diseñado para mantener cumplir con las normas de los envases especiales (16 CFR } 1700.15
un gas a presión. Como medida de seguridad se recomienda el y 16 CFR } 1700.20). Las disposiciones de la PPPA con respecto
sistema de encaje pareado ‘‘Pin-Index’’ para dióxido de carbono, a los envases especiales aplican a todos los tipos de envase, incluidos
ciclopropano, helio, óxido nitroso y oxı́geno envasados en cilindros los que tienen cierres reutilizables, los que no se cierran y los de
de Tamaño E o menores. (N. del T. Pin-Index es un sistema de dosis única.
seguridad que impide llenar un cilindro destinado a un gas con otro No se requieren envases especiales para los medicamentos que se
gas diferente. Consiste en una combinación de orificios a diferentes administran en hospitales a pacientes hospitalizados. El fabricante
alturas sobre las válvulas de los cilindros que encajan con espigas o la empresa que envasa los medicamentos de venta bajo receta
a alturas correspondientes en las tuberı́as de llenado). a granel no necesitan usar envases especiales si el farmacéutico los
reenvasará. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados
NOTA—Cuando en una monografı́a se especifique el envasado y
por la PPPA se pueden dispensar en envases inseguros para niños si
almacenamiento en un envase impermeable o bien cerrado, el el comprador lo solicita o si la receta original ası́ lo indica (15 U.S.C.
envase usado para dispensar el artı́culo prescrito cumple con los } 1473).
requisitos en Envases—Permeabilidad h671i. Los fabricantes o las empresas envasadoras de medicamentos de
venta libre reglamentados por la PPPA están autorizados para
Envase Hermético—Un envase hermético es aquel que impide la envasar un tamaño especial en envases inseguros para niños siempre
penetración del aire o cualquier otro gas en las condiciones usuales que provean el tamaño de venta habitual en envases especiales. Los
o acostumbradas de manejo, transporte, almacenamiento o distribu- envases inseguros para niños requieren etiquetado especial (18 CFR
ción. } 1700.5).
Envase Unitario—Un envase unitario es un envase diseñado para Se describen distintos tipos de envases seguros para niños en la
contener una cantidad de producto destinada para administrarse en Norma Internacional ASTM D-3475, Clasificación Normalizada de
una dosis única o un dispositivo para su empleo inmediato una vez Envases Seguros para Niños. Los ejemplos se incluyen para facilitar
abierto. Preferiblemente, el envase primario y/o secundario, o el la comprensión y el alcance de cada categorı́a de la clasificación.
empaque protector deberán estar diseñados de forma tal que se Temperatura y Humedad de Almacenamiento—En algunas
evidencie cualquier alteración en el contenido. Cada envase unitario monografı́as, se establecen instrucciones especı́ficas sobre la
deberá etiquetarse indicando la identidad, cantidad y/o concentración, temperatura y la humedad para el almacenamiento y la distribución
el nombre del fabricante, el número de lote y la fecha de caducidad de los artı́culos farmacopeicos (incluido su transporte al consumidor)
del artı́culo. cuando los datos de estabilidad indican que el almacenamiento y la
Envase Monodosis (ver también Envases para Inyecciones en distribución a una temperatura por debajo o por encima ası́ como una
Inyectables h1i)—Un envase monodosis es un envase unitario para humedad por encima de la recomendada producen resultados
artı́culos que se administran solamente por vı́a parenteral. Debe estar indeseables. Tales instrucciones se aplican en general, excepto
etiquetado como envase monodosis. Ejemplos de envases monodosis cuando la etiqueta de un artı́culo en particular indique una
son jeringas prellenadas, cartuchos, envases sellados por fusión y temperatura de almacenamiento diferente basada en estudios de
envases con cierres sellados, cuando se los etiquete como tales. estabilidad para esa formulación. Cuando no se especifiquen
Envase de Dosis Única—Un envase de dosis única es un envase instrucciones o lı́mites de almacenamiento en la monografı́a
unitario para artı́culos destinados a ser administrados directamente individual, pero la etiqueta del artı́culo establece una temperatura
desde el envase por cualquier vı́a, excepto la parenteral. de almacenamiento basada en estudios de estabilidad de la
Envase de Unidad de Uso—Un envase de unidad de uso es un formulación en particular, tales instrucciones de almacenamiento
envase que contiene una cantidad especı́fica de producto y que son las que se deben aplicar (ver también Estabilidad Farmacéutica
está destinado a dispensarse como tal, sin ninguna modificación h1150i). Las condiciones de almacenamiento se definen de acuerdo
posterior, excepto por la adhesión de una etiqueta adecuada. El a los siguientes términos.
envase de unidad de uso debe etiquetarse como tal. Congelador—Es un lugar con una temperatura mantenida
Envase de Unidades Múltiples—Un envase de unidades múltiples termostáticamente entre –258 y –108 (–138 y 14 8F).
es aquel que permite la extracción de porciones sucesivas del Frı́o—Temperatura que no exceda de 88 (46 8F). Un refrigerador
contenido sin cambios en la concentración, calidad o pureza de la es un lugar frı́o con una temperatura que se mantiene termostática-
porción remanente. mente entre 28 y 88 (368 y 46 8F).
Envases Multidosis (ver también Envases para Inyecciones en Fresco—Temperatura entre 88 y 158 (468 y 59 8F). Cuando se
Inyectables h1i)—Un envase multidosis es un envase que contiene indique que un artı́culo debe conservarse en un lugar fresco, puede
unidades múltiples de artı́culos que se administran solamente por vı́a almacenarse o distribuirse, alternativamente, en un refrigerador,
parenteral. a menos que se indique algo diferente.
12 Advertencias Generales USP 30
Temperatura Frı́a Controlada—Esta temperatura se define como namiento a temperatura ambiente controlada, protección de la
la temperatura mantenida termostáticamente entre 28 y 88 (368 y 46 humedad y, si fuera necesario, también de la luz. Durante el
8F), permitiéndose experimentar desviaciones entre 08 y 158 (328 y transporte y la distribución, se protegerá a los artı́culos de la
59 8F) durante el almacenamiento, transporte y distribución, de tal humedad, el congelamiento y el calor excesivo, y si fuera necesario,
manera que la temperatura cinética media (TCM) calculada y también de la luz. Se exceptúan de cumplir con estos requisitos a los
permitida no es más de 88 (46 8F). Se permiten elevaciones pasajeras ingredientes farmacéuticos activos.
de temperatura hasta los 258 (77 8F) si el fabricante ası́ lo indica y Etiquetado—El término ‘‘etiquetado’’ se refiere a todas las
siempre que dichas elevaciones no duren más de 24 horas, a menos etiquetas o marbetes y demás materiales escritos, impresos o gráficos
que los datos de estabilidad o las instrucciones del fabricante que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artı́culo,
indiquen algo diferente. sobre o dentro del empaque o envoltorio del envase primario, con
Temperatura Ambiente—La temperatura predominante en un área excepción de los embalajes externos destinados al transporte. El
de trabajo. término ‘‘etiqueta’’ designa la parte del etiquetado que se encuentra
Temperatura Ambiente Controlada—Una temperatura que se sobre el envase primario.
mantiene termostáticamente entre 208 y 258 (688 y 77 8F) prevalente Los envases para el transporte que contengan un solo artı́culo se
por lo general en el ambiente habitual de trabajo; que resulta en una etiquetan por lo menos con la identificación del producto (excepto
temperatura cinética media de no más de 258; y que permite los artı́culos controlados), el número de lote, la fecha de caducidad, y
desviaciones entre 158 y 308 (598 y 86 8F), experimentadas en las condiciones de almacenamiento y distribución, salvo que dicho
farmacias, hospitales, bodegas y depósitos. Siempre y cuando la envase sea también el envase primario o la parte exterior del
temperatura cinética media permanezca en el intervalo permitido, se empaque destinado al consumidor.
permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a los Además de los requisitos de etiquetado establecidos en esta
408, siempre que dichas elevaciones no duren más de 24 horas. Se Farmacopea, los artı́culos están sujetos al cumplimiento de otras
pueden permitir elevaciones de temperatura superiores a los 408 si el normas de etiquetado que puedan promulgar entidades guberna-
fabricante ası́ lo indica. Los artı́culos pueden etiquetarse para su mentales.
almacenamiento a ‘‘temperatura ambiente controlada’’ o ‘‘hasta Cantidad de Ingrediente por Unidad de Dosificación—El
258’’, u otra referencia escrita que se base en la misma temperatura contenido de un producto farmacéutico se expresa en la etiqueta
cinética media. La temperatura cinética media es un valor calculado del envase en términos de microgramos, miligramos o gramos,
que puede emplearse como la temperatura de almacenamiento o como porcentaje del fármaco o su parte terapéuticamente activa, de
isotérmica que simula los efectos no isotérmicos de las variaciones acuerdo con lo expresado en el tı́tulo, a menos que se indique algo
de temperatura de almacenamiento. (Ver también Estabilidad diferente en la monografı́a individual. Los nombres y cantidades
Farmacéutica h1150i). equivalentes del fármaco y su parte activa se indican en el
Un artı́culo para el que se indique almacenamiento a Temperatura etiquetado.
Ambiente Controlada alternativamente puede almacenarse o distri- Los artı́culos farmacopeicos en cápsulas, tabletas u otras unidades
buirse en un lugar fresco, a menos que se indique algo diferente en la de dosificación deberán etiquetarse de forma tal que expresen la
monografı́a individual o en la etiqueta. cantidad de cada ingrediente activo o nutriente reconocido contenido
Cálido—Cualquier temperatura entre 308 y 408 (868 y 104 8F). en cada unidad; excepto en los casos de soluciones o suspensiones
orales envasadas en dosis únicas, ya sea que éstas se suministren
Calor Excesivo—Cualquier temperatura por encima de los 408 como preparaciones lı́quidas o preparaciones lı́quidas reconstituidas
(104 8F). a partir de sólidos por el agregado de un volumen dado de un
Protección contra la Congelación—Cuando, además del riesgo de diluyente especı́fico, para los cuales la etiqueta indicará la cantidad
rotura del recipiente, la congelación de un artı́culo ocasionara la de cada ingrediente activo o nutriente reconocido extraı́ble en las
pérdida de contenido o potencia, o la alteración destructiva de sus condiciones indicadas en Volumen de Entrega h698i. Para los
caracterı́sticas, la etiqueta del envase indica las instrucciones productos farmacéuticos que no se dosifican en forma de unidades,
apropiadas para proteger al artı́culo de su congelación. se expresará en el etiquetado la cantidad de ingrediente activo por
Lugar Seco—El término ‘‘lugar seco’’ se refiere a un sitio con una mililitro o por gramo, o el porcentaje de cada ingrediente (ver
humedad relativa promedio que no exceda de 40% a Temperatura Medidas Porcentuales), excepto los lı́quidos, o los sólidos que se
Ambiente Controlada, o la presión de vapor de agua equivalente reconstituyan para producir lı́quidos orales; éstos se pueden etiquetar
a otras temperaturas. La determinación puede hacerse por medición alternativamente en términos de la cantidad de ingrediente activo por
directa en el lugar o basarse en informes de condiciones climáticas. 5 mL del lı́quido o del preparado reconstituido. A menos que se
La determinación se basa por lo menos en 12 mediciones espaciadas especifique algo diferente en una monografı́a o en un capı́tulo, tales
equitativamente y tomadas ya sea durante una estación del año, indicaciones de contenido o de cantidad se declararán sólo en
durante un año, o si los registros lo demostrasen, durante el perı́odo unidades métricas (ver también Unidades de Potencia en estas
de almacenamiento del artı́culo. Puede haber valores de hasta 45% Advertencias Generales).
de humedad relativa siempre que el promedio sea de 40%. Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una Cantidad—Con el fin
Se considera un lugar seco a un envase para almacenamiento que de minimizar la posibilidad de errores en la dispensación y la
haya sido validado para proteger el artı́culo del vapor húmedo, administración de medicamentos, cuando la cantidad de ingrediente
incluyendo el almacenamiento a granel. activo se exprese en números enteros, se debe indicar sin coma
Almacenamiento en Condiciones No Especificadas—Cuando decimal seguida de ceros (por ejemplo: indicar 4 mg y no 4,0 mg).
no se especifiquen lı́mites o instrucciones en la sección Envasado y La cantidad de ingrediente activo que sea un número decimal menor
almacenamiento de las monografı́as individuales o en el etiquetado de uno se escribirá con un cero antes de la coma decimal (por
del artı́culo, las condiciones de almacenamiento incluirán almace- ejemplo: 0,2 mg y no ,2 mg).
USP 30 Advertencias Generales 13
Etiquetado de Sales de Fármacos—Es un principio establecido Codes and Guidelines of the OTC Medicines Industry de la
que los artı́culos farmacopeicos deben tener un solo nombre oficial. Nonprescription Drug Manufacturers Association (NDMA, por sus
Con el objeto de ahorrar espacio en las etiquetas y dado que los siglas en inglés).]
sı́mbolos quı́micos de las sales inorgánicas más comunes son Las monografı́as para ciertas preparaciones establecen cómo
conocidos por los profesionales como sinónimos de sus formas determinar la fecha de caducidad que aparecerá en la etiqueta. En
escritas, se permiten las siguientes alternativas para el etiquetado de ausencia de una disposición especı́fica en las monografı́as
productos oficiales que son sales: HCl para clorhidrato, HBr para individuales de un producto farmacéutico o un suplemento
bromhidrato, Na para sodio y K para potasio. Los sı́mbolos Na y K nutricional, la etiqueta debe llevar una fecha de caducidad asignada
se usan para abreviar el nombre de las sales de ácidos orgánicos para dicha formulación y empaque en particular, con la siguiente
cuando en la denominación oficial estos metales aparecen como excepción: no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso
sódico/a y potásico/a (con el metal al final de la denominación oficial de medicamentos o suplementos nutricionales destinados a la venta
en inglés); sin embargo estos sı́mbolos no deben utilizarse cuando se sin receta médica, en cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones
usa la preposición ‘‘de’’ en el nombre oficial, es decir cuando se de dosificación y cuando los artı́culos sean estables durante un
denominan oficialmente ‘‘de sodio’’ o ‘‘de potasio’’ (con el metal al perı́odo no inferior a 3 años, siempre que se almacenen bajo las
comienzo de la denominación oficial en inglés), (por ejemplo, condiciones prescritas.
Fenobarbital Sódico, que se denomina Phenobarbital Sodium en En el caso de artı́culos oficiales que deban exhibir una fecha de
inglés, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se de- caducidad, tales artı́culos deben dispensarse en un envase, o a partir
berá escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de Sodio, el de un envase, etiquetado con fecha de caducidad, y la fecha de
cual se denomina Sodium Salicylate en inglés). dispensación del producto debe ser anterior a la fecha de caducidad.
Etiquetado de los Productos con Vitaminas—La etiqueta de los La fecha de caducidad identifica el perı́odo de tiempo durante el cual
productos farmacéuticos oficiales indica su contenido de vitaminas se estima que el producto cumple con los requisitos de la monografı́a
expresado en unidades métricas por unidad de dosificación. Los de la Farmacopea, siempre que se conserve en las condiciones de
contenidos de vitamina A, D y E también se pueden expresar en almacenamiento indicadas. La fecha de caducidad limita el tiempo
Unidades USP. Las cantidades de vitamina A expresadas en durante el cual un producto puede ser dispensado o usado. En los
unidades métricas se refieren a las cantidades equivalentes de retinol casos en que se indica sólo el mes y el año de caducidad, se entiende
(alcohol de vitamina A). La etiqueta de los suplementos nutricio- que la fecha se refiere al último dı́a del mes indicado. La fecha de
nales deberá incluir los números identificatorios de lote, de control lı́mite de uso es la fecha después de la cual no se puede utilizar un
o de partida. artı́culo. Basándose en la información provista por el fabricante y las
Advertencias y Requisitos Generales de esta Farmacopea, el
Etiquetado de Productos Botánicos—La etiqueta de una hierba dispensador colocará una fecha de lı́mite de uso adecuada en la
u otro producto botánico destinado a usarse como suplemento etiqueta del envase del medicamento recetado para limitar el uso del
dietético contiene la leyenda ‘‘Si está embarazada o en perı́odo de artı́culo por parte del paciente. La fecha de lı́mite de uso colocada en
lactancia, consulte a un profesional de la salud antes de usar este la etiqueta no debe ser posterior a la fecha de caducidad del envase
producto’’. del fabricante.
Etiquetado de Preparaciones Parenterales y Tópicas—La etiqueta Para los artı́culos que deban ser reconstituidos antes de usar, se
de una preparación para uso parenteral o tópico debe especificar el colocará en la etiqueta una fecha de lı́mite de uso apropiada que
nombre de todas las sustancias agregadas (ver Sustancias Agregadas corresponda al producto reconstituido.
en estas Advertencias Generales y bajo Etiquetado en Inyectables Para todas las otras formas farmacéuticas, en las cuales se deba
h1i) y, en caso de preparaciones para uso parenteral, también debe determinar el perı́odo de tiempo posterior a la dispensación durante
especificar sus cantidades o proporciones, excepto en el caso de el cual es prudente que un paciente conserve un medicamento
sustancias agregadas sólo para regular el pH o para lograr prescrito, el dispensador tendrá en consideración, además de
isotonicidad, para las cuales puede mencionarse simplemente su cualquier otro factor relevante, la naturaleza del medicamento; el
presencia y la razón por la cual se agregan. envase en el que fue envasado por el fabricante y su fecha de
Etiquetado de Electrólitos—La concentración y la dosificación de caducidad; las caracterı́sticas del envase del paciente, si el artı́culo se
electrólitos para terapias de reemplazo (por ejemplo, cloruro de sodio reenvasa para su dispensación; la exposición a las condiciones de
o cloruro de potasio) deberá especificarse en la etiqueta en almacenamiento esperadas o inusuales y el perı́odo de tiempo
miliequivalentes (mEq). Asimismo, la etiqueta del producto de- estimado para la duración del tratamiento. Considerando todo lo
berá indicar la cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en anterior, el dispensador colocará una fecha lı́mite de uso en la
términos de peso o concentración porcentual. etiqueta de un envase de unidades múltiples para limitar ası́ la
Etiquetado de Contenido Alcohólico—El contenido de alcohol en utilización del artı́culo por parte del paciente. A menos que se
una preparación lı́quida deberá especificarse en la etiqueta como especifique algo diferente en la monografı́a individual, o en ausencia
porcentaje (v/v) de C2H5OH. de datos sobre la estabilidad, esa fecha de lı́mite de uso no podrá ser
posterior a: (a) la fecha de caducidad indicada en el envase del
Cápsulas y Tabletas Especiales—La etiqueta de cualquier Cápsula fabricante o (b) un año a partir del momento en que se dispense el
o Tableta destinada para una administración que no sea la ingestión medicamento, lo que represente un perı́odo de conservación menor.
oral de la unidad entera, deberá tener una indicación bien visible Para formas farmacéuticas lı́quidas y sólidas no estériles que están
sobre el modo de uso. envasadas en envases unitarios y de dosis única, la fecha de lı́mite de
Fecha de Caducidad y Fecha Lı́mite de Uso—(N. del T. Las uso será de un año a partir de la fecha de envasado del medicamento
expresiones ‘‘fecha de caducidad’’, ‘‘fecha de expiración’’ y ‘‘fecha en envases unitarios o de dosis única, o a partir de la fecha de
de vencimiento’’ son equivalentes.) La etiqueta de un medicamento caducidad indicada en el envase del fabricante, lo que represente un
oficial, o de un suplemento nutricional o dietético oficial, debe perı́odo de conservación menor, a menos que los datos de estabilidad
indicar la fecha de caducidad. Todos los productos deben exhibir la o el etiquetado del fabricante indiquen algo diferente.
fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leı́da por una El dispensador debe mantener las instalaciones, donde se envasan
persona común en las condiciones normales de compra y uso. La y almacenan formas farmacéuticas, a una temperatura cinética media
fecha de caducidad debe aparecer en un lugar prominente donde no mayor de 258. El material plástico usado para envasar debe tener
contraste claramente con el fondo, grabarse en relieve con nitidez y una mejor protección que la que proporciona el cloruro de polivinilo,
debe ser fácilmente comprensible (por ejemplo, ‘‘EXP 6/89’’, ‘‘Exp. ya que este material no brinda una adecuada protección contra la
Junio de 1989’’, ‘‘Caduca 6/89’’, ‘‘Vencimiento 6/89’’). [NOTA— permeación de la humedad. Se deben mantener registros de la
Para obtener información adicional, se debe consultar Voluntary temperatura de las instalaciones donde se almacenen formas
farmacéuticas y materiales de plástico usados para envasar.
14 Advertencias Generales USP 30
Preparaciones Magistrales—La etiqueta del envase o del reci- almacenamiento mencionadas anteriormente según lo disponga el
piente que contiene una preparación magistral indica la fecha lı́mite fabricante. Si se trata de ingredientes farmacéuticos activos, que
de uso. La fecha lı́mite de uso es la fecha después de la cual no se deben someterse nuevamente a prueba antes de incorporarlos a una
puede usar la preparación magistral. Debido a que las preparaciones preparación, se puede escoger una condición menos restrictiva y más
magistrales están destinadas a administrarse inmediatamente o luego general. En estos casos, generalmente es suficiente indicar
de un perı́odo de almacenamiento corto, la fecha lı́mite de uso puede ‘‘temperatura ambiente’’ (es decir la temperatura que predomina en
determinarse basándose en criterios distintos a los utilizados para los lugares de trabajo). Esta indicación refleja que el artı́culo es
determinar la fecha de caducidad de los medicamentos fabricados. estable en intervalos amplios de temperatura. Si se trata de
La monografı́a de una preparación magistral oficial incluye, en excipientes, corresponde la frase ‘‘No se especifican requisitos de
general, un requisito de lı́mite de uso que indica el perı́odo posterior almacenamiento’’ en la sección Envasado y almacenamiento de la
a la fecha de preparación durante el cual se puede usar la monografı́a.
preparación, si las condiciones de almacenamiento son adecuadas. Debido a que la gran mayorı́a de los ingredientes farmacéuticos
Si no hubiera datos de estabilidad aplicables a un medicamento activos en los compendios USP–NF se corresponden con Estándares
o a una preparación, se indican recomendaciones de fecha lı́mite de Referencia, se debe prestar especial atención para asegurarse que
máxima de uso para preparaciones farmacéuticas no estériles en las condiciones de almacenamiento de los Estándares de Referencia
envases impermeables y resistentes a la luz, y almacenados sean las mismas a las indicadas en las monografı́as correspondientes
a temperatura ambiente controlada, a menos que se especifique de los compendios USP–NF.
algo diferente (ver Criterios de Estabilidad y Determinación de la El Comité de Expertos en Envasado y Almacenamiento
Fecha Lı́mite de Uso en Estabilidad de Preparaciones Magistrales está facultado para revisar, caso por caso, toda leyenda cuestionable
en el capı́tulo de pruebas generales Preparación Magistral— de la sección Envasado y Almacenamiento. Si la información en
Preparaciones No Estériles h795i). Envasado y Almacenamiento está incompleta, el resto de la
Guı́as para las Leyendas de Envasado y Almacenamiento en monografı́a se publica mientras se pospone temporalmente la
las Monografı́as de los Compendios USP–NF—Con el objeto de información de dicha sección.
brindar a los usuarios de USP–NF una guı́a adecuada sobre el
envasado y almacenamiento de artı́culos farmacopeicos, todas las
monografı́as de los compendios USP–NF deben incluir especifica- SUSTANCIAS DE ORIGEN VEGETAL Y ANIMAL
ciones de envasado y almacenamiento.
Cuando por algún motivo no se encuentre información de Los requisitos para sustancias de origen vegetal o animal se
almacenamiento en la sección Envasado y almacenamiento de una aplican para artı́culos tal como se los encuentra en el mercado; sin
monografı́a, la sección Almacenamiento en Condiciones No embargo, los lotes de tales sustancias que estén destinadas solamente
Especificadas en estas Advertencias Generales sirve de guı́a a la fabricación o el aislamiento de aceites esenciales, alcaloides,
provisoria. La sección Almacenamiento en Condiciones No glicósidos, u otros principios activos pueden no cumplir tales
Especificadas no pretende evitar la inclusión de información de requisitos.
almacenamiento especı́fica y apropiada en la sección Envasado y En las monografı́as individuales de materiales pulverizados de
almacenamiento de las monografı́as. origen animal o vegetal se pueden incluir caracterı́sticas mi-
La parte que se refiere al envasado especifica el envase a utilizar. croscópicas distintivas de los elementos estructurales como una
Las opciones para los distintos tipos de envase se describen en las manera de determinar la identidad, calidad o pureza.
Advertencias Generales e incluyen los siguientes: Envase Resistente Materia Extraña—Las sustancias de origen vegetal o animal
a la Luz, Envase Bien Cerrado, Envase Impermeable, Envase deben estar libres de microorganismos patógenos (ver Atributos
Hermético, Envase Unitario, Envase Monodosis, Envase de Dosis Microbiológicos de Productos Farmacéuticos No Estériles h1111i),
Única o Envase de Unidad de Uso. Para la mayorı́a de las y deben estar libres de microorganismos, insectos y otros tipos de
preparaciones farmacéuticas, el envase de dispensación determina la contaminación animal, incluyendo excreciones de animales, en un
elección (es decir, impermeable, bien cerrado, hermético, de unidad grado que sea razonablemente práctico. No mostrarán coloración
de uso, etc). Si se trata de ingredientes farmacéuticos activos, el u olor anormal, suciedad ni otras señales de deterioro.
envase de elección serı́a impermeable, bien cerrado o, si fuera La cantidad de materia inorgánica extraña en sustancias vegetales
necesario, resistente a la luz. En el caso de los excipientes, dado que o animales, estimada por el contenido de Cenizas insolubles en
generalmente se manejan en grandes volúmenes, cuyos envases son ácido, no excederá de 2 por ciento del peso de la sustancia, a menos
tambores o vagones cisterna, el envase apropiado es un envase bien que se especifique algo diferente en la monografı́a individual.
cerrado. Por lo tanto, en ausencia de información que indique la Antes de moler o pulverizar materiales vegetales, se deben
necesidad de emplear un envase de mayor protección, debe usarse eliminar piedras, polvo, terrones de tierra y cualquier otra materia
por defecto la frase ‘‘Conservar en envases bien cerrados’’ para todos inorgánica extraña por medios mecánicos u otros medios apropiados.
los excipientes. Comercialmente es poco frecuente conseguir sustancias vegetales
La parte que se refiere al almacenamiento especifica las que carezcan de materia extraña inocua adherida o mezclada, la que
temperaturas. Las opciones se describen en las Advertencias por lo general no es perjudicial. No se admite la presencia de materia
Generales y comprenden las siguientes categorı́as: Congelador, extraña o residuos que sean venenosos, peligrosos o nocivos. La
Frı́o, Fresco, Temperatura Frı́a Controlada, Temperatura Ambiente, materia extraña incluye cualquier otra parte de la planta que no sea la
Temperatura Ambiente Controlada, Cálido, Calor Excesivo y sustancia propiamente dicha.
Protección contra la Congelación. Se incluye una definición de Conservación—Las sustancias de origen vegetal o animal pueden
ambiente seco para los casos donde se requiere proteger el artı́culo protegerse de la infestación de insectos o de la contaminación
de la humedad. microbiológica por medio de agentes o procesos apropiados que no
Para la mayorı́a de las preparaciones, la elección se realiza en dejen residuos nocivos.
función de la estabilidad de la preparación determinada experi-
mentalmente, y puede usarse cualquiera de las condiciones de
USP 30 Advertencias Generales 15
Diagramas de Capítulos
Fármacos No-Complejos
Elementos Básicos
Ver Diagrama 1
<1151> Formas Farmacéuticas
Sustancias Obtenidas por <1196> Armonización Farmacopeica
Biotecnología <1225> Validación de Procedimientos
Ver Diagrama 2 Farmacopeicos
Excipientes
Ver Diagrama 3
Distribución de
Medicamentos
Medicamentos de Activos
Ver Diagrama 9
No-Complejos
Ver Diagrama 4
Microbiología
Medicamentos de Sustancias
Ver Diagrama 10
Obtenidas por Biotecnología
Ver Diagrama 5
[Nota: Esta Tabla y los
Diagramas 1-13 que se
Vacunas presentan a continuación
tienen la finalidad de ser una
Ver Diagrama 6 guía de los capítulos en esta
publicación. Es probable que
Sangre y Hemoderivados no incluyan la información
completa y no pretenden
Ver Diagrama 7 cumplir con las expectativas
de los artículos o limitar la
aplicación de las pruebas a
Productos de Terapia Génica
algún artículo en USP-NF.]
y Celular
Ver Diagrama 8
Ingredientes de Suplementos
Dietéticos
Ver Diagrama 11
Productos de Suplementos
Dietéticos
Ver Diagrama 12
Preparación Magistral
Ver Diagrama 13
Dispositivos Médicos
<691> Algodón
<861> Suturas - Diámetro
<871> Suturas - Sujeción de Agujas
18 Diagrama 1 / Guía de los Capítulos Generales USP 30
Diagrama 1
Fármacos No Complejos
Descripción Caracterización
Fisicoquímica
Envasado y Etiquetado
<521> Sulfonamidas
<541> Volumetría
Disolventes
Orgánicas Inorgánicas Residuales
<206> Aluminio
Contenido de Agua
<223> Dimetilanilina
<467> Impurezas Orgánicas Volátiles
<461> Determinación de Nitrogéno <211> Arsénico
<621> Cromatografía <541> Volumetría
<466> Impurezas Comunes <221> Cloruros y Sulfatos
<621> Cromatografía <731> Pérdida por Secado <731> Pérdida por Secado
<231> Metales Pesados
<727> Electroforesis Capilar <891> Análisis Térmico
<241> Hierro <921> Determinación de Agua
<781> Rotación Óptica
<801> Polarografía <251> Plomo
Fisioquímica
<191> Identificación - Pruebas Generales <1047> Artículos Obtenidos por Biotecnología - Pruebas
Seguridad
Impurezas
<11> Estándares de Referencia USP
<61> Pruebas de Límites Microbianos*
Relacionadas al <71> Pruebas de Esterilidad
Relacionadas al Proceso Producto <85> Pruebas de Endotoxinas Bacterianas
<1047> Artículos Obtenidos por Biotecnología - Pruebas <1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología
<1047> Artículos Obtenidos por Biotecnología - Pruebas
Excipientes
Descripción Equipamiento
<1121> Nomenclatura <16> Métodos Automatizados de Análisis
<21> Termómetros
Identificación <31> Aparatos Volumétricos
Inorgánicas
Disolventes Residuales
<621> Cromatografía
22 Diagrama 5 / Guía de los Capítulos Generales USP 30
Diagrama 5
Descripción Fisicoquímica
Vacunas
Descripción Fisicoquímica
Seguridad
Pruebas Misceláneas
<1> Inyectables
<661> Envases
<671> Envases - Permeabilidad
<788> Partículas en Inyectables
24 Diagrama 7 / Guía de los Capítulos Generales USP 30
Diagrama 7
Sangre y Hemoderivados
Descripción Fisicoquímicas
Valoración Seguridad
Pruebas Misceláneas
<1> Inyectables
<661> Envases
*ver nota al pie de página, Diagrama 10
<671> Envases - Permeabilidad
<788> Partículas en Inyectables
Guía de los Capítulos Generales / Diagrama 8 25
USP 30 Diagrama 8
Funcionalidad
Identificación
<881> Resistencia a la Tensión
<11> Estándares de Referencia USP
Agua
Valoración
<1231> Agua para Uso Farmacéutico
<621> Cromatografía
Biocompatibilidad
<726> Electroforesis
<727> Electroforesis Capilar <87> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro
<88> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
<1031> Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases
de Medicamentos, Dispositivos Médicos e Implantes
Cuestiones Microbiológicas y
de Esterilidad
<61> Pruebas de Límites Microbianos*
Cuestiones de <71> Pruebas de Esterilidad
Producción <85> Prueba de Endotoxinas Bacterianas
<1041> Productos Biológicos <161> Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos Similares
<1043> Materiales Auxiliares para Productos Celulares, Génicos y de <1050> Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos
Ingeniería Tisular Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal
<1045> Artículos Obtenidos por Biotecnología <1116> Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios y Otros Ambientes
Controlados
<1046> Productos de Terapia Génica y Celular
<1208> Pruebas de Esterilidad - Validación de Sistemas Aisladores
<1074> Guías para la Evaluación de la Seguridad Biológica de los <1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
Excipientes
<1227> Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmacopeicos
<1206> Productos Farmacéuticos Estériles para Uso Doméstico
Equipamiento
Cuestiones del Producto
<16> Métodos Automatizados de Análisis
<381> Tapones Elastoméricos para Inyectables
<21> Termómetros
<1046> Productos de Terapia Génica y Celular
<31> Aparatos Volumétricos
<1086> Impurezas en Artículos Oficiales
<41> Pesas y Balanzas
<1121> Nomenclatura
<1051> Limpieza de Materiales de Vidrio
<1151> Formas Farmacéuticas
<1251> Pesada en una Balanza Analítica
Caracterización
Distribución de Medicamentos
Fabricante
<87> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro <87> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro <1150> Estabilidad Farmacéutica
<88> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo <88> Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
<1191> Consideraciones sobre Estabilidad
<661> Envases <381> Tapones Elastoméricos para Inyectables en la Práctica de Dispensación
<671> Envases - Permeabilidad <661> Envases
<698> Volumen de Entrega <671> Envases - Permeabilidad
Paciente
Educación
USP 30 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama 10 27
Diagrama 10
Microbiología
Límites de Endotoxinas
Límites Microbianos
<85> Prueba de Endotoxinas Bacterianas
<61> Pruebas de Límites Microbianos*
Pruebas de Esterilidad
<1111> Atributos Microbiológicos de Productos Farmacéuticos no Estériles*
Ausencia de
Microorganismos Objetables
Procesamiento Aséptico
Esterilización Final
<1116> Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios
<1222> Productos Farmacéuticos con Esterilización Terminal–Liberación Paramétrica y Otros Ambientes Controlados
<1208> Pruebas de Esterilidad - Validación de Sistemas
Aisladores
Calor Húmedo
<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos
<55> Indicadores Biológicos - Pruebas de Resistencia Farmacopeicos
<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos <1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos
Farmacopeicos
Calor Seco
Montaje
<55> Indicadores Biológicos - Pruebas de Resistencia <1116> Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios y Otros
<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización Ambientes Controlados
<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos <1207> Envasado de Productos Estériles - Evaluación de
Integridad
Radiación BFS
<1116> Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios
<55> Indicadores Biológicos - Pruebas de Resistencia y Otros Ambientes Controlados
<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización
<1211> Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos FFS
<1116> Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios
y Otros Ambientes Controlados
Óxido de Etileno
SFS
<55> Indicadores Biológicos - Pruebas de Resistencia
<1035> Indicadores Biológicos para Esterilización <1116> Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios
y Otros Ambientes Controlados
<1209> Esterilización - Indicadores e Integradores Químicos y Fisicoquímicos
Diagrama 11
Botánicos No-Botánicos
Descripción Complejos
<561> Artículos de Origen Botánico
Ver Las Sustancias Obtenidas por Biotecnología
<563> Identificación de Artículos de Origen Botánico
(Diagrama 2).
<565> Extractos Botánicos
<776> Microscopía Óptica No Complejos
<1181> Microscopía Electrónica de Barrido
Identificación Minerales
<197> Pruebas de Identificación Espectrofotométrica Ver Fármacos Activos No Complejos
<201> Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (Diagrama 1).
Caracterización Fisicoquímica
Otros
Descripción Equipamientos
<1151> Formas Farmacéuticas <21> Termómetros
Identificación <31> Aparatos Volumétricos
<41> Pesas y Balanzas
<191> Identificación - Pruebas Generales
<1051> Limpieza de Material de Vidrio
<197> Pruebas de Identificación Espectrofotométrica
<1251> Pesada en una Balanza Analítica
<201> Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada
<2750> Prácticas de Fabricación para
<563> Identificación de Artículos de Origen Botánico
Suplementos Dietéticos
<621> Cromatografía
<736> Espectrometría de Masas Prueba de Desempeño
<776> Microscopia Óptica
<1216> Friabilidad de Tabletas
<851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz
<2040> Desintegración y Disolución de
<1065> Cromatografía Iónica Suplementos Dietéticos
<2091> Variación de Peso de Suplementos Dietéticos
Valoración/Contenido <2750> Prácticas de Fabricación para los
Suplementos Dietéticos
<91> Valoración de Pantotenato de Calcio
<171> Valoración de Actividad de Vitamina B12 Seguridad/Pureza
<411> Valoración de Ácido Fólico <211> Arsénico
<441> Valoración de Niacina o Niacinamida <231> Metales Pesados
<531> Valoración de Tiamina
<251> Plomo
<541> Volumetría
<261> Mercurio
<551> Valoración de Alfa Tocoferol
<451> Volumetría con Nitrito
<561> Artículos de Origen Botánico
<561> Artículos de Origen Botánico
<571> Valoración de Vitamina A
<565> Extractos Bótanicos
<581> Valoración de Vitamina D
<730> Espectroquímica de Plasma
<621> Cromatografía
<2021> Pruebas de Recuento Microbiano - Suplementos
<730> Espectroquímica de Plasma Nutricionales y Dietéticos
<851> Espectrofotometría y Dispersión de Luz <2022> Procedimientos Microbiológicos para Comprobar
la Ausencia de Microorganismos Específicos -
Suplementos Nutricionales y Dietéticos
Impurezas
<2023> Atributos Microbiológicos de los Suplementos
Nutricionales y Dietéticos no Estériles
Orgánica
Inorgánicas
Disolventes Residuales
<621> Cromatografía
30 Diagrama 13 / Guía de los Capítulos Generales USP 30
Diagrama 13
Preparación Magistral
Global Caracterización
Fisicoquímica
<795> Preparación Magistral - Preparaciones No Estériles
<797> Preparación Magistral - Preparaciones Estériles <11> Estándares de Referencia USP
<823> Radiofármacos para Tomografía de Emisión de <621> Cromatografía
Positrones - Preparación Magistral <726> Electroforesis
<1075> Buenas Prácticas de Preparación Magistral
<727> Electroforesis Capilar
<1160> Cálculos Farmacéuticos en la Preparación Magistral de
Prescripciones <736> Espectrometría de Masas
<1265> Información Escrita de los Medicamentos Recetados - Guías <761> Resonancia Magnética Nuclear
h1049i Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas h1176i Balanzas y Aparatos Volumétricos para
de Estabilidad de Productos Biotecnológicos Prescripciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 711
o Biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 536 h1177i Buenas Prácticas de Envasado . . . . . . . . . 712
h1050i Evaluación de la Seguridad Viral en Productos h1178i Buenas Prácticas de Reenvasado . . . . . . . . 714
Biotecnológicos Obtenidos de Lı́neas h1181i Microscopı́a Electrónica de Barrido . . . . . . 717
Celulares de Origen Humano o Animal . . . . . 539 h1191i Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica
h1051i Limpieza de Materiales de Vidrio . . . . . . . 549 de Dispensación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 721
h1061i Color—Medición Instrumental . . . . . . . . . 550 h1196i Armonización Farmacopeica . . . . . . . . . . . 725
h1065i Cromatografı́a Iónica . . . . . . . . . . . . . . . 552 h1207i Envasado de Productos Estériles—Evaluación
h1072i Disinfectantes y Antisépticos . . . . . . . . . . . 554 de Integridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 729
h1074i Guı́as para la Evaluación de la Seguridad h1208i Pruebas de Esterilidad—Validación de Sistemas
Biológica de los Excipientes . . . . . . . . . . . . 558 Aisladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 731
h1075i Buenas Prácticas de Preparación Magistral . . 561 h1209i Esterilización—Indicadores e Integradores
h1078i Buenas Prácticas de Fabricación para Excipientes Quı́micos y Fisicoquı́micos . . . . . . . . . . . 734
Farmacéuticos a Granel . . . . . . . . . . . . . . . 565 h1211i Esterilización y Garantı́a de Esterilidad de
h1079i Buenas Prácticas de Almacenamiento y Artı́culos Farmacopeicos . . . . . . . . . . . . . 736
Transporte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575 h1216i Friabilidad de Tabletas . . . . . . . . . . . . . . 742
h1081i Consistencia del Gel de Gelatina . . . . . . . 581 h1221i Cucharadita de Té . . . . . . . . . . . . . . . . . 743
h1086i Impurezas en Artı́culos Oficiales . . . . . . . 581 h1222i Productos Farmacéuticos con Esterilización
h1087i Disolución Intrı́nseca . . . . . . . . . . . . . . . 584 Terminal—Liberación Paramétrica . . . . . . . 743
h1088i Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas h1223i Validación de Métodos Microbiológicos
Farmacéuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 586 Alternativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 746
h1090i Guı́as para la Bioequivalencia In Vivo . . . . 592 h1225i Validación de Procedimientos Farmacopeicos 749
h1091i Etiquetado de Ingredientes Inactivos . . . . . 638 h1227i Validación de Recuperación Microbiana en
h1092i Procedimiento de Disolución: Desarrollo Artı́culos Farmacopeicos . . . . . . . . . . . . . 753
y Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 638 h1230i Agua para Uso Médico . . . . . . . . . . . . . . 755
h1101i Gotero para Medicamentos . . . . . . . . . . . 645 h1231i Agua para Uso Farmacéutico . . . . . . . . . . 756
h1111i Atributos Microbiológicos de Productos h1241i Interacciones Agua-Sólido en Sistemas
Farmacéuticos No Estériles ............ 645 Farmacéuticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 778
h1111i Examen Microbiológico de Productos No h1251i Pesada en una Balanza Analı́tica . . . . . . . . 780
Estériles: Criterios de Aceptación para Prepara- h1265i Información Escrita de los Medicamentos
ciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Recetados—Guı́as . . . . . . . . . . . . . . . . . 783
Farmacéutico (Capı́tulo Armonizado, Oficial
a partir del 18 de agosto de 2007) . . . . . . . 645
h1112i Determinación de Actividad de Agua en
Productos Farmacéuticos No Estériles . . . . . 647
Suplementos Dietéticos
h1116i Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios
y Otros Ambientes Controlados . . . . . . . . 649 h2021i Pruebas de Recuento Microbiano—Suplementos
h1117i Óptimas Práticas de Laboratorio Micro- Nutricionales y Dietéticos . . . . . . . . . . . . 785
biológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 656 h2022i Procedimientos Microbiológicos para Comprobar
h1118i Dispositivos de Monitoreo—Tiempo, Tempe- la Ausencia de Microorganismos Especı́ficos—
ratura y Humedad . . . . . . . . . . . . . . . . . 660 Suplementos Nutricionales y Dietéticos . . . . 789
h1119i Espectrofotometrı́a en Infrarrojo Cercano . . . 663 h2023i Atributos Microbiológicos de los Suplementos
h1120i Espectrofotometrı́a Raman . . . . . . . . . . . . 668 Nutricionales y Dietéticos No Estériles . . . . 793
h1121i Nomenclatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 674 h2030i Información Complementaria para Artı́culos de
h1136i Envasado—Unidad de Uso . . . . . . . . . . . 675 Origen Botánico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 796
h1146i Prácticas de Envasado—Reenvasado de Medi- h2040i Desintegración y Disolución de Suplementos
camentos Sólidos Orales en Envases Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 802
de Dosis Única . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 677 h2091i Variación de Peso de Suplementos
h1150i Estabilidad Farmacéutica . . . . . . . . . . . . . 681 Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 805
h1151i Formas Farmacéuticas .............. 683 h2750i Prácticas de Fabricación para Suplementos
h1160i Cálculos Farmacéuticos en la Preparación Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 806
Magistral de Prescripciones . . . . . . . . . . . . . . 695
h1171i Análisis por Solubilidad de Fases . . . . . . . 706
h1174i Fluidez de Polvos . . . . . . . . . . . . . . . . . 708
34 h1i Inyectables / Requisitos Generales USP 30
Capı́tulos Generales
*
El Comité de Nomenclatura de Fármacos de la USP ha adoptado
esta nomenclatura para implementarla mediante revisiones suplementarias
de USP 23-NF 18. Para los tı́tulos de las monografı́as oficiales vigentes de la
forma [FÁRMACO] Estéril que no hayan sido revisados, la siguiente
nomenclatura continúa en uso en esta Farmacopea: (1) los fármacos, o sus
soluciones o emulsiones, aptas para inyección, llevan tı́tulos de la forma
[FÁRMACO], Inyección; (2) los sólidos secos o lı́quidos concentrados que no
contengan amortiguadores del pH, diluyentes ni otras sustancias agregadas, y
que al añadir los disolventes adecuados, forman soluciones que cumplen los
requisitos para Inyecciones en todos los aspectos, se distinguen mediante
tı́tulos de la forma [FÁRMACO] Estéril; (3) las mismas preparaciones
descritas en (2) excepto que éstas contienen uno o más amortiguadores del
pH, diluyentes, u otras sustancias agregadas, se identifican por tı́tulos de la
forma [FÁRMACO] para Inyección; (4) sólidos suspendidos en un medio
lı́quido adecuado y que no son para inyección por vı́a intravenosa o intratecal,
se identifican por tı́tulos de la forma Suspensión de [FÁRMACO] Estéril; y
(5) sólidos secos que, al agregarles vehı́culos adecuados, forman preparacio-
nes que cumplen todos los requisitos para las Suspensiones estériles y se
distinguen por tı́tulos de la forma [FÁRMACO] Estéril para Suspensión.
USP 30 Requisitos Generales / h1i Inyectables 35
Definiciones Fijos h401i), tienen un Índice de Yodo entre 79 y 141 (ver Grasas y
Aceites Fijos h401i), y cumplen con los requisitos de las pruebas
ENVASE A GRANEL PARA FARMACIAS siguientes.
Materia Insaponificable—Calentar a reflujo una mezcla de 10 mL
Un Envase a granel para farmacias es un envase de una de aceite con 15 mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 6) y 30
preparación estéril para uso parenteral que contiene muchas mL de alcohol en un baño de vapor, con agitación ocasional, hasta
monodosis. El contenido está destinado para uso en programas de que la mezcla se torne transparente. Transferir la solución a un
preparación de mezclas en farmacias y está restringido a la cristalizador, evaporar el alcohol en un baño de vapor, y mezclar el
preparación de mezclas para infusión o, al llenado de jeringas residuo con 100 mL de agua: la solución resultante es transparente.
estériles vacı́as con un dispositivo de transferencia estéril. Ácidos Grasos Libres—Los ácidos grasos libres en 10 g de aceite
Luego de la reconstitución del contenido de estos envases, su no requieren más de 2,0 mL de hidróxido de sodio 0,020 N para su
cierre debe ser perforado sólo una vez usando un dispositivo de neutralización. (ver Grasas y Aceites Fijos h401i).
transferencia estéril o un equipo dispensador que permita la Los monoglicéridos o diglicéridos de ácidos grasos se pueden
dosificación medida del contenido. El Envase a granel para emplear como vehı́culos, siempre que sean lı́quidos y se mantengan
farmacias sólo se empleará en un área de trabajo adecuada, como transparentes cuando se enfrı́an a 108 y presenten un Índice de Yodo
por ejemplo una campana de flujo laminar (o un área equivalente de no mayor de 140 (ver Grasas y Aceites Fijos h401i).
aire limpio para preparación magistral). Se pueden emplear estos y otros vehı́culos no acuosos, siempre
La nomenclatura Envase a granel para farmacias se limita que sean seguros en el volumen de la Inyección administrada y
a preparaciones de las categorı́as 1; 2 ó 3 definidas previamente en siempre que no interfieran con la eficacia terapéutica de la
Nomenclatura. Los Envases a granel para farmacias, aunque preparación o con su respuesta a las valoraciones y pruebas
contengan más de una monodosis, están exentos del lı́mite de especificadas.
volumen de 30 mL para envases multidosis y del requisito de
contener una sustancia o mezcla de sustancias adecuada para Sustancias Agregadas—Se pueden agregar sustancias adecuadas
prevenir el crecimiento de microorganismos. para aumentar la estabilidad o la utilidad de las inyecciones, a menos
Cuando un envase se ofrece como Envase a granel para que se especifique algo diferente en la monografı́a individual,
farmacias, la etiqueta debe: (a) exhibir explı́citamente la frase‘‘En- siempre que sean inocuas en las cantidades administradas y no
vase a Granel para Farmacias—No usar para infusión directa’’, (b) interfieran con la eficacia terapéutica o con las respuestas a las
contener o hacer referencia a información sobre técnicas apropiadas valoraciones o pruebas especificadas. No se pueden agregar
para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una colorantes a una solución destinada a la administración parenteral
leyenda que limite el tiempo en que el envase se puede usar una vez con el único propósito de conferir color a la preparación terminada
perforado el cierre, siempre que su contenido se haya mantenido bajo (ver además Sustancias Agregadas en Advertencias Generales y
las condiciones de almacenamiento etiquetadas. Pruebas de Eficacia Antimicrobiana h51i).
Debe tenerse especial cuidado en la elección y empleo de
sustancias agregadas en las preparaciones para inyección que se
administran en un volumen superior a 5 mL. A menos que se
INYECCIONES DE GRAN Y PEQUEÑO VOLUMEN especifique algo diferente, prevalecen los siguientes lı́mites máxi-
mos: 0,01% para agentes que contengan mercurio y para compuestos
Cuando en esta Farmacopea se usa el tı́tulo Solución intravenosa tensoactivos catiónicos; 0,5% para clorobutanol, cresol, fenol y
de gran volumen se aplica a una inyección monodosis para un uso sustancias de tipo similar; y 0,2% para dióxido de azufre, o una
intravenoso, y se envasa con una etiqueta que indica un contenido de cantidad equivalente de sulfito, bisulfito, o metabisulfito de potasio
más de 100 mL. El tı́tulo Inyección de pequeño volumen se aplica o de sodio.
a una inyección que se envasa con una etiqueta que indica un A las preparaciones para inyección que se presenten en envases
contenido de 100 mL o menos. multidosis, independientemente del método de esterilización
empleado, se les debe agregar una sustancia o una mezcla de
sustancias adecuada para prevenir el crecimiento de microorganis-
PRODUCTOS BIOLÓGICOS mos, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1)
hay instrucciones diferentes en la monografı́a individual; (2) la
Las definiciones farmacopeicas de preparaciones estériles para uso sustancia contiene un radionucleido con una vida media de menos de
parenteral no se aplican generalmente en el caso de productos 24 horas; y (3) los ingredientes activos son antimicrobianos. Tales
biológicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente sustancias se emplean en concentraciones que impidan el creci-
o licencia (ver Productos Biológicos h1041i). miento o la existencia de los microorganismos en las preparaciones
para inyección. Tales sustancias cumplen además con los requisitos
de Pruebas de Eficacia Antimicrobiana h51i y Agentes Antimicro-
INGREDIENTES bianos—Contenido h341i. Los procesos de esterilización han de ser
usados aunque se empleen dichas sustancias (ver además Esterili-
Vehı́culos y Sustancias Agregadas zación y Garantı́a de Esterilidad de los Artı́culos Farmacopeicos
h1211i). Se puede extraer el aire del envase, o desplazarlo con un gas
Vehı́culos Acuosos—Los vehı́culos para inyecciones acuosas quı́micamente inerte. Cuando ası́ se lo especifique en una
cumplen con los requisitos de la Prueba de Pirógenos h151i o de la monografı́a, el etiquetado debe incluir información sobre la
Prueba de Endotoxinas Bacterianas h85i, según corresponda. El sensibilidad al oxı́geno del artı́culo.
Agua para Inyección se emplea generalmente como vehı́culo,
a menos que se especifique algo diferente en la monografı́a
individual. El cloruro de sodio se puede agregar en cantidades ETIQUETAS Y ETIQUETADO
suficientes para convertir la solución resultante en isotónica; y la
Inyección de Cloruro de Sodio, o la Solución de Ringer Inyectable, Etiquetado—[NOTA—Ver las definiciones de ‘‘etiqueta’’ y
pueden reemplazar parcial o totalmente al Agua para Inyección, ‘‘etiquetado’’ en Etiquetado en el apartado Conservación, Envasado,
a menos que se especifique algo diferente en la monografı́a Almacenamiento y Etiquetado de las Advertencias y Requisitos
individual. Para condiciones que impliquen el uso de otras Generales.]
sustancias, ver Sustancias Agregadas en este capı́tulo. La etiqueta indica el nombre de la preparación; en el caso de una
Otros Vehı́culos—Los aceites fijos empleados como vehı́culos preparación lı́quida, el contenido porcentual de fármaco o la cantidad
para inyecciones no acuosas son de origen vegetal, son inodoros de un fármaco en un volumen especı́fico; en el caso de una
o prácticamente inodoros, y no tienen ningún olor que sugiera preparación seca, la cantidad de ingrediente activo; la vı́a de
rancidez. Cumplen con los requisitos de la prueba para Parafina administración; una leyenda con las condiciones de almacenamiento
Sólida en Aceite Mineral, manteniéndose el baño frı́o a 108, tienen y de la fecha de caducidad; el nombre y el domicilio comercial del
un Índice de Saponificación entre 185 y 200 (ver Grasas y Aceites fabricante, envasador o distribuidor; y un número de lote
36 h1i Inyectables / Requisitos Generales USP 30
identificatorio. El número de lote puede proporcionar toda la historia 1. El nivel más alto de las partidas producidas durante los últimos
de fabricación del envase especı́fico, incluyendo todas las operacio- tres años.
nes de fabricación, llenado, esterilización y etiquetado. 2. El nivel más alto de las últimas cinco partidas.
Cuando una monografı́a individual permita variar las concen- 3. El nivel máximo con respecto a los niveles históricos, pero sólo
traciones de los ingredientes activos en la preparación parenteral de hasta completar la producción de las primeras cinco partidas
gran volumen, se indica la concentración de cada ingrediente después de la fecha de entrada en vigor, el 26 de julio de 2004.
nombrado en el tı́tulo oficial como si fuera parte del tı́tulo oficial, por El prospecto adjunto en los envases de todas las IGV, IPV y EFG
ejemplo, Dextrosa 5%, Inyección; o Dextrosa (5%) y Cloruro de usadas en la preparación o administración de productos para NPT
Sodio (0,2%), Inyección. debe contener una leyenda de advertencia. Esta advertencia debe
El etiquetado incluye la siguiente información si no se especifica estar incluida en la sección ‘‘Advertencias’’ del etiquetado y debe
la fórmula completa en la monografı́a individual: (1) En el caso de indicar lo siguiente: ‘‘ADVERTENCIA: Este producto contiene
una preparación lı́quida, el contenido porcentual de cada ingrediente aluminio que puede ser tóxico. El aluminio puede alcanzar niveles
o la cantidad de cada ingrediente en un volumen especificado, salvo tóxicos con la administración parenteral prolongada si existe
que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado o para deficiencia renal. Los neonatos prematuros en particular tienen
hacer isotónica la solución se pueden declarar por el nombre y una mayor riesgo por la inmadurez de sus riñones y requieren grandes
leyenda al efecto; y (2) en el caso de una preparación seca u otra cantidades de soluciones de calcio y fosfato que contienen aluminio.
preparación a la que se va a agregar un diluyente antes de utilizarla, Los estudios indican que los pacientes con deterioro renal, incluidos
la cantidad de cada ingrediente, la composición del diluyente los neonatos prematuros, que reciben niveles de aluminio por vı́a
o diluyentes recomendados [sólo el nombre o nombres, si la fórmula parenteral mayores de 4 mg a 5 mg por kg por dı́a acumulan aluminio
se especifica en la monografı́a individual], la cantidad que se va a niveles asociados con toxicidad ósea y del sistema nervioso central.
a emplear para alcanzar una concentración especı́fica de ingrediente La acumulación en los tejidos puede ocurrir incluso con niveles más
activo y el volumen final de la solución ası́ obtenida, una breve bajos de administración de productos de NPT y de soluciones para
descripción del aspecto fı́sico de la solución reconstituida, desbloqueo usadas en su administración’’.
instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solución
reconstituida y una fecha de caducidad que limite el perı́odo durante
el cual se espera que la solución reconstituida tenga la potencia ENVASADO
requerida o declarada en la etiqueta si se la ha almacenado como se
indica. Envases para Inyecciones
Los envases de Inyecciones destinadas a diálisis, hemofiltración,
o soluciones de irrigación que contienen un volumen de más de 1 L Los envases, incluyendo los cierres, para preparaciones para
se etiquetan indicando que el contenido no está destinado para la inyecciones no deben ejercer sobre el contenido ninguna acción
infusión intravenosa. fı́sica o quı́mica que pueda alterar de alguna manera la concentra-
Las Inyecciones para uso veterinario se etiquetan indicando ese ción, calidad, o pureza mas allá de los requisitos oficiales en
fin. condiciones usuales u ordinarias de manejo, transporte, almacena-
El envase se etiqueta de modo que una superficie suficiente del miento, venta y uso. Los envases deben estar hechos de un material
envase quede sin cubrir en toda su longitud o circunferencia para que permita la inspección del contenido. Por lo general, el tipo de
permitir la inspección del contenido. vidrio apropiado para cada preparación parenteral se indica en la
respectiva monografı́a. A menos que se especifique algo diferente en
la monografı́a individual, se pueden emplear envases plásticos para
Aluminio en Inyecciones de Gran Volumen (IGV), envasar las inyecciones (ver Envases h661i).
Inyecciones de Pequeño Volumen (IPV) y Envasados Para definiciones de envases monodosis y multidosis, ver Envases
Farmacéuticos a Granel (EFG) Usados en Terapia de en Advertencias y Requisitos Generales. Los envases cumplen con
los requisitos establecidos en el capı́tulo Envases h661i.
Nutrición Parenteral Total (NPT) Los envases están cerrados o sellados de tal modo que impiden la
contaminación o la pérdida del contenido. La validación de la
(a) El contenido de aluminio de las IGV usadas en la terapia de integridad del envase debe demostrar que no existe penetración de
NPT no debe exceder de 25 mg por L. contaminación por microorganismos o impurezas quı́micas o fı́sicas.
(b) El prospecto del envase de las IGV usadas en la terapia de NPT Además, el envase debe ser capaz de mantener las cantidades totales
debe indicar que el producto farmacéutico no contiene más de o concentraciones relativas especificadas de solutos y vehı́culo
25 mg de aluminio por L. Debe incluirse esta información en la cuando se expone a condiciones extremas previstas en la fabricación
sección ‘‘Precauciones’’ del etiquetado de todas las IGV usadas y procesamiento, almacenamiento, transporte y distribución. Los
en la terapia de NPT. cierres para envases multidosis permiten la extracción del contenido
(c) Si la cantidad máxima de aluminio en las IPV y en los EFG es sin remover o destruir el cierre. El cierre permite la penetración de
25 mg por L o menos, en lugar de indicar la cantidad exacta de una aguja y se cierra de inmediato luego de retirarla, protegiendo el
aluminio que contiene cada uno, como en el párrafo (d), la envase de la contaminación. La validación de la integridad del
etiqueta del envase primario de las IPV y los EFG usados en la envase multidosis debe incluir una verificación de que un envase de
preparación o en la administración de inyecciones (con las ese tipo impide la contaminación por microorganismos o la pérdida
excepciones que se enumeran a continuación) y emulsiones del contenido del producto en condiciones previstas de múltiples
inyectables para NPT puede indicar lo siguiente: ‘‘No contiene entradas y usos.
más de 25 mg/L de aluminio’’. Si la IPV o el EFG es un polvo Los envases para venoclisis en tándem (piggyback containers) son
liofilizado, la etiqueta del envase primario puede indicar lo por lo general envases de infusión intravenosa empleados para
siguiente; si la IPV o el EFG es un polvo liofilizado usado en la administrar una segunda infusión a través de un conector de algún
preparación de inyecciones o emulsiones inyectables para NPT, tipo o a través de un inyector en el equipo de administración del
la etiqueta del envase primario debe indicar lo siguiente: primer lı́quido, evitándose ası́ la necesidad de inyectar en otro sitio al
‘‘Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del paciente. Los envases para venoclisis en tándem son también
prospecto adjunto, la concentración de aluminio no es más de conocidos como envases de infusión secundaria.
25mg/L’’.
(d) El nivel máximo de aluminio a la fecha de caducidad debe
indicarse en la etiqueta del envase primario de todas las IPV
o EFG usados en la preparación o administración de Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección
inyecciones y emulsiones inyectables para NPT. El contenido
de aluminio debe indicarse de la siguiente manera: ‘‘No El uso de un sistema de cierre negro en un vial (por ejemplo, una
contiene más de __ mg/L de aluminio’’. El contenido máximo tapa negra de fácil desprendimiento adherida al casquillo (tapa "flip-
de aluminio puede indicarse como el más alto de los tres niveles off") y un casquillo negro para sostener el cierre elastomérico) o el
siguientes: uso de una banda o una serie de bandas negras sobre la constricción
USP 30 Requisitos Generales / h1i Inyectables 37
en una ampolla se reserva sólo para el Concentrado de Cloruro de El volumen no es menor que el volumen declarado en el caso de
Potasio para Inyección y está prohibido su uso en cualquier otra envases examinados individualmente o, en el caso de envases de
inyección. 1 mL y 2 mL, no es menor que la suma de los volúmenes declarados
que se toman colectivamente.
Para inyecciones en envases multidosis etiquetados para producir
Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes un número especı́fico de dosis de un volumen determinado, proceder
como se indica anteriormente, empleando un número de jeringas
Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo individuales igual al número de dosis especificadas. El volumen es
neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales tal que cada jeringa descarga no menos de la dosis indicada.
con una advertencia impresa en los casquillos o en las tapas de Para inyecciones que contienen aceite, entibiar los envases, si
sobresello. Tanto el casquillo del frasco como la tapa de sobresello fuera necesario, y agitarlos bien inmediatamente antes de retirar el
deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el contenido. Enfriar entre 208 y 258 antes de medir el volumen.
mayor contraste con el color del casquillo o la tapa) la leyenda: Para inyecciones en cartuchos o jeringas prellenadas, ensamblar el
‘‘Advertencia: Agente Paralizante’’ o ‘‘Agente Paralizante’’ (depen- envase con los accesorios requeridos, como por ejemplo una aguja
diendo del tamaño del sistema de cierre). Alternativamente, la tapa o un émbolo. Siguiendo el mismo procedimiento anterior, y sin
de sobresello puede ser transparente y sin impresión, de manera que vaciar la aguja, transferir todo el contenido de cada envase a un vaso
permita la visualización de la leyenda de advertencia sobre el de precipitados tarado y seco empujando el émbolo en forma lenta y
casquillo de cierre. continua. Pesar y calcular el volumen según lo descrito ante-
riormente. El volumen de cada envase no es inferior al volumen
declarado en la etiqueta.
Envases para Sólidos Estériles Para soluciones intravenosas de gran volumen, seleccionar
1 envase y transferir el contenido a una probeta graduada seca, de
Los envases para sólidos secos destinados para uso parenteral, un tamaño tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos un
incluyendo los cierres, no interactúan fı́sica o quı́micamente con la 40% de su volumen nominal. El volumen no es inferior al volumen
preparación de ningún modo que altere la concentración, calidad declarado en la etiqueta.
o pureza más allá de los requisitos oficiales, en condiciones normales
o habituales de manejo, transporte, almacenamiento, venta y uso.
Un envase para un sólido estéril permite la adición de un Envasado y Almacenamiento
disolvente adecuado y la extracción de porciones de la solución
o suspensión resultante de tal modo que se mantiene la esterilidad El volumen de inyección en envases monodosis proporciona la
del producto. cantidad especificada de administración parenteral de una vez y en
Cuando la Valoración en una monografı́a indica un procedimiento ningún caso es mayor del suficiente para permitir la extracción y
para la Preparación de valoración, donde se deba tomar el contenido administración de 1 L.
total extraı́ble de un envase monodosis con una aguja hipodérmica y Las preparaciones para administración intrarraquı́dea, intracister-
una jeringa, se extraerá ese contenido en la forma más completa nal, o peridural se envasan sólo en envases monodosis.
posible con una jeringa hipodérmica seca, de una capacidad nominal A menos que se especifique algo diferente en la monografı́a
que no exceda de tres veces el volumen a extraer, y con una aguja individual, un envase multidosis contiene un volumen de Inyección
número 21 de longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada), tomando la suficiente para permitir la extracción de no más de 30 mL.
precaución de expeler cualquier burbuja de aire, y se la descargará en Las inyecciones envasadas para usar como soluciones de
un recipiente para dilución y valoración. irrigación, para hemofiltración o diálisis, o para nutrición parenteral
están exentas de la restricción de 1 L de los requisitos anteriores
relacionados con el envasado.
Volumen en Envase Los envases para Inyecciones envasados para uso en hemofiltra-
ción o soluciones de irrigación pueden estar diseñados para que se
Cada envase de una inyección se llena con suficiente exceso sobre vacı́en rápidamente y pueden contener un volumen de más de 1 L.
el volumen declarado o sobre el volumen que se deba extraer. Ver Las inyecciones etiquetadas para uso veterinario están exentas de
Inyecciones en Formas Farmacéuticas h1151i. los requisitos de envasado y almacenamiento en lo referente a las
limitaciones para envases monodosis y de las limitaciones de
volumen para los envases multidosis.
DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE INYECCIÓN EN LOS
ENVASES
MATERIA EXTRAÑA Y PARTÍCULAS
Seleccionar 1 o más envases si el volumen del envase es de 10 mL
o más, 3 o más si el volumen es más de 3 mL y menos de 10 mL, Todos los artı́culos destinados a la administración parenteral
o 5 o más si el volumen es 3 mL o menos. Tomar individualmente el deben prepararse de manera de excluir partı́culas según se define en
contenido de cada envase seleccionado con una jeringa hipodérmica Partı́culas en Inyecciones h788i y otras materias extrañas. Cada
seca de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el envase final de todas las preparaciones parenterales deben
volumen a medir y que lleva adosada una aguja número 21 de inspeccionarse en la medida de lo posible para detectar la presencia
longitud no menor de 2,5 cm (1 pulgada). Expeler cualquier burbuja de materia extraña y partı́culas observables (de ahora en adelante
de aire de la jeringa y la aguja, y luego descargar el contenido de la denominadas ‘‘partı́culas visibles’’) en su contenido. El proceso de
jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada inspección debe estar diseñado y calificado para asegurar que todos
"para contener" y no "para verter" los volúmenes marcados) de un los lotes de todas las preparaciones parenterales estén prácticamente
tamaño tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos 40% exentas de partı́culas visibles. La calificación del proceso de
del volumen nominal total de la probeta. Alternativamente, el inspección debe realizarse en referencia a las partı́culas en el
contenido de la jeringa se puede descargar en un vaso de rango visible de un tipo que puede surgir del proceso de fabricación
precipitados seco, tarado, calculando el volumen, en mL, como el o llenado. Debe desecharse todo envase cuyo contenido presente
peso, en g, de la Inyección tomada dividido por su densidad. Para indicios de partı́culas visibles. La inspección para detectar partı́culas
envases con un volumen nominal de 2 mL o menos, el contenido de visibles puede realizarse cuando se lleva a cabo la inspección para
una cantidad suficiente de envases pueden combinarse para obtener detectar otros defectos crı́ticos, tales como envases o sellos rotos
el volumen requerido para la medición, siempre que, para cada o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un producto
envase, se emplee un conjunto diferente y seco de jeringa y aguja. El liofilizado.
contenido de los envases de 10 mL o más se puede determinar Cuando la naturaleza del contenido o el sistema de cierre del
abriéndolos y vaciando el contenido directamente en una probeta envase permite solamente una inspección limitada del contenido
graduada o un vaso de precipitados tarado. total, la inspección del 100% de un lote debe completarse con la
38 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
inspección de contenidos reconstituidos (por ejemplo, secos) Los Estándares de Referencia se requieren especı́ficamente para
o contenidos extraı́dos (por ejemplo, de un envase ámbar oscuro) muchas valoraciones y pruebas Farmacopeicas y se suministran
de una muestra de envases del lote. únicamente para este uso; su aptitud para otras aplicaciones no
Todas las Inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis oficiales queda a exclusivo criterio del usuario. Aunque los
y las Inyecciones de pequeño volumen están sujetas a los estándares de referencia fueron introducidos originalmente para
procedimientos microscópicos o de oscurecimiento de luz y a los realizar las valoraciones biológicas de la USP X, ahora se requieren
lı́mites de partı́culas subdivisibles especificados en Partı́culas en también para muchos otros procedimientos. Esto refleja el amplio
Inyecciones h788i, a menos que se especifique algo diferente en la uso de modernos métodos cromatográficos y espectrofotométricos
monografı́a individual. Un artı́culo envasado como Inyección ya sea que requieren mediciones relativas a un estándar de referencia para
de gran volumen o de pequeño volumen cumple con los requisitos obtener resultados exactos y reproducibles.
expuestos para Inyecciones de pequeño volumen cuando la etiqueta Los Estándares de Referencia USP son sustancias seleccionadas
del envase indica que contiene 100 mL o menos, si la monografı́a por su elevada pureza, caracterı́sticas esenciales y aptitud para el
individual incluye una prueba para Partı́culas en Inyecciones h788i; propósito deseado. Cuando es necesario, las sustancias heterogéneas
cumple con los requisitos expuestos en Inyecciones de gran volumen de origen natural también se designan como ‘‘Estándares de
para infusiones monodosis cuando la etiqueta del envase indica que Referencia’’. Normalmente, éstos son los equivalentes a los
contiene más de 100 mL. Las inyecciones administradas exclusiva- estándares internacionales.
mente por vı́a intramuscular o subcutánea o envasadas y etiquetadas La FDA ha designado los estándares de referencia de antibióticos
para usar como soluciones de irrigación están exentas de los distribuidos por la USPC como idénticos a los estándares de trabajo
requisitos de Partı́culas en Inyecciones h788i. de la FDA, según los procedimientos de la FDA. La USPC
distribuye los Estándares de Referencia de los Estados Unidos y los
Estándares de Referencia USP para sustancias antibióticas. Esta
ESTERILIDAD diferencia en el etiquetado de los Estándares está en vigencia sólo
temporalmente y, finalmente, todos los viales llevarán el mismo
Pruebas de Esterilidad—Las preparaciones para inyección tı́tulo. Cuando se necesita un Estándar de Referencia USP, se puede
cumplen con los requisitos en Pruebas de Esterilidad h71i. emplear la sustancia correspondiente etiquetada como ‘‘Estándar de
Referencia de los Estados Unidos’’ y viceversa.
Los Estándares de Referencia etiquetados actualmente como
‘‘Estándares de Referencia NF’’ eventualmente se designarán y
SOLUCIONES RECONSTITUIDAS etiquetarán como ‘‘Estándares de Referencia USP,’’ conforme a la
Los sólidos secos cuyas soluciones reconstituidas se preparan para consolidación de la USP y el NF dentro de la USPC a partir del 2 de
inyección llevan tı́tulos de la forma [FÁRMACO] para Inyección. Ya enero de 1975. Mientras tanto, cuando sea necesario un Estándar de
que estas formas farmacéuticas se reconstituyen en el momento en el Referencia USP, se puede emplear la sustancia correspondiente
que las usará el profesional de salud interviniente, no se incluyen las etiquetada como ‘‘Estándar de Referencia NF’’.
pruebas y normas para la solución reconstituida para su administra-
ción en las monografı́as individuales para sólidos secos o lı́quidos
concentrados estériles. Sin embargo, a los efectos de garantizar la Referencia Visual Auténtica
calidad de las preparaciones inyectables ası́ como su correcta
administración, se proporcionan las siguientes pruebas no destruc- A diferencia de los estándares de referencia quı́mica, las
tivas para demostrar la aptitud de las soluciones reconstituidas Referencias Visuales Auténticas (AVR por sus siglas en inglés) no
cuando se preparan inmediatamente antes de usar. se emplean en los análisis quı́micos. En cambio, las AVR son
imágenes visuales utilizadas por los analistas para comparar ciertos
Totalidad y Transparencia de la Solución—Reconstituir la artı́culos de prueba y asegurar que cumplen con los requisitos
solución como se indica en el etiquetado suministrado por el farmacopeicos y se incorporan como referencia en la monografı́a. El
fabricante para la forma farmacéutica seca estéril. Comité de Expertos que aprueba una monografı́a especı́fica es el que
A: El sólido se disuelve completamente, sin dejar ningún decide la aprobación de las AVR para su inclusión en una
residuo visible como materia no disuelta. monografı́a.
B: La solución reconstituida no es significativamente menos
transparente que un volumen igual de diluyente o de Agua Purificada
contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar.
Partı́culas—Reconstituir la solución como se indica en el
Otras Sustancias de Referencia
etiquetado suministrado por el fabricante para la forma farmacéutica Como parte de su servicio, la USPC analiza y distribuye
seca estéril: la solución está esencialmente libre de partı́culas sustancias autenticadas adicionales que actualmente no son reque-
extrañas que se puedan observar en una inspección visual. ridas como Estándares de Referencia USP o NF. Éstas también se
suministran bajo supervisión del Comité de Estándares de Referencia
USP. Las sustancias adicionales se dividen en tres grupos: (1)
Estándares de Referencia USP y NF antiguos, que no son requeridos
en la USP o el NF vigente pero que aún tienen suficiente demanda;
(2) Estándares de Referencia FCC, especificados en la edición
vigente del Food Chemicals Codex; y (3) Sustancias Auténticas (AS
h11i ESTÁNDARES DE por sus siglas en inglés), que son muestras de sustancias quı́micas
altamente purificadas, incluidas las sustancias de abuso, que se
REFERENCIA USP prueban conjuntamente y se ponen a disposición como un servicio,
principalmente para los laboratorios analı́ticos, clı́nicos, farmacéu-
ticos y de investigación.
La distribución de sustancias controladas está sujeta a las
Los Estándares de Referencia USP se establecen y distribuyen con reglamentaciones y provisiones vigentes para el otorgamiento de
la autorización de la Junta Directiva de la USPC (Convención de la licencias de la Drug Enforcement Administration (DEA) del
Farmacopea de los Estados Unidos) por recomendación del Comite Departamento de Justicia.
de Estándares de Referencia USP, que aprueba la selección y aptitud Como servicio adicional, la USPC distribuye varios reactivos no
de cada lote. Las caracterı́sticas esenciales de cada lote estándar se comerciales requeridos en ciertas monografı́as USP. Estos reactivos
suelen determinar independientemente en tres o más laboratorios. El se preparan especialmente para su uso previsto y sólo los distribuira
Laboratorio de Estándares de Referencia de la USP (ver Prefacio) y la USPC hasta que estén comercialmente disponibles.
los laboratorios de la FDA participan en las pruebas de casi todos los La Organización Mundial de la Salud, organismo de las Naciones
Estándares nuevos y en el reemplazo de los existentes. Además, Unidas, mantiene un programa internacional que suministra
laboratorios de todo el paı́s, tanto académicos como industriales, estándares biológicos y sustancias quı́micas de referencia. El
participan en las pruebas. programa de la OMS se ocupa de materiales de referencia para
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 39
antibióticos, productos biológicos y agentes quimioterapéuticos. Los resultados de las valoraciones y las pruebas se determinan
Como norma, un Estándar Internacional para un material de origen mediante comparaciones entre la muestra en análisis y un Estándar
natural se discontinúa una vez que la sustancia responsable de su de Referencia USP cuyos residuos volátiles o contenido de agua se
actividad caracterı́stica se haya aislado, identificado y preparado de han eliminado o corregido de acuerdo con las instrucciones de la
forma que pueda caracterizarse completamente por medios quı́micos etiqueta. Cuando se encuentren requisitos especiales de secado para
y fı́sicos. El Comité de Estándares de Referencia USP coopera los Estándares de Referencia en apartados especı́ficos de mono-
estrechamente con la OMS para minimizar las diferencias inevitables grafı́as de la USP o del NF, éstos reemplazan las instrucciones
en las unidades de potencia reales y, en algunos casos, para habituales (ver Procedimientos en Pruebas y Valoraciones en
compartir la preparación de un estándar de referencia. Dado que Advertencias y Requisitos Generales). Si se exige secar un Estándar
algunos Estándares de Referencia USP se normalizan según los de Referencia USP antes de usarlo, se debe transferir una cantidad
Estándares Internacionales correspondientes, las Unidades USP que sea suficiente después del secado a un recipiente limpio y seco.
pertinentes y las Unidades Internacionales de potencia suelen ser No usar el envase original como recipiente de secado y no secar una
idénticas. muestra repetidas veces a temperaturas superiores a 258. Si se exige
una determinación volumétrica de agua en el momento de usar el
Estándar de Referencia, proceder según se indica en el Método I en
LOTES VIGENTES Determinación de Agua h921i. Para ello se aceptan métodos
instrumentales o microanalı́ticos. Al usar cantidades habituales,
Es responsabilidad de cada analista constatar que su suministro aproximadamente 50 mg, del Estándar de Referencia, valorar
particular de Estándar de Referencia USP esté vigente. Sólo se debe volumétricamente con una solución del Reactivo cuatro veces más
comprar la cantidad suficiente para el uso inmediato y se debe evitar diluida.
el almacenamiento a largo plazo. La sección Estándares de referencia USP de una monografı́a
Para asegurar el acceso rápido a la última información, la USPC individual de la USP o del NF o de un capı́tulo general nombra cada
publica bimestralmente el Catálogo Oficial de Estándares de Estándar de Referencia USP que se requiere para los procedimientos
Referencia y Sustancias Auténticas, ası́ como las designaciones de de prueba y valoración, y hace referencia a dicho capı́tulo para
lotes en el Pharmacopeial Forum.* Este sistema ofrece mejor control obtener información e instrucciones adicionales. La siguiente lista
y flexibilidad que las fechas de vencimiento para responder a las contiene las instrucciones para el uso y almacenamiento correctos de
revisiones del uso del Estándar de Referencia. El catálogo que cada Estándar de Referencia USP requerido. Estas instrucciones
aparece en el Pharmacopeial Forum más reciente identifica artı́culos deben ser las mismas que aparecen en la etiqueta del Estándar de
que son oficiales en la recopilación de Estándares de Referencia USP Referencia USP correspondiente. En un caso aislado, si las
al momento de su publicación. instrucciones de la etiqueta especı́fica difieren del texto que figura
En el Catálogo aparecen dos columnas para identificar los lotes en la siguiente lista, tienen prioridad las instrucciones de la etiqueta
oficiales vigentes. En una de las columnas se identifica el lote oficial del artı́culo del lote vigente. Con poca frecuencia se presenta una
que la USPC está distribuyendo en este momento. En algunos casos, situación en que, por razones cientı́ficas, es necesario cambiar de
el lote anterior aún puede considerarse oficial. Si es ası́, se identifica inmediato las instrucciones. Este cambio se puede realizar fácilmente
en la segunda columna. Normalmente, el lote anterior sigue en la etiqueta del Estándar de Referencia, pero el proceso formal de
conservando su estado oficial durante aproximadamente un año revisión del texto farmacopeico requiere más tiempo. Por lo tanto,
después de comenzar la distribución del lote vigente, a menos que se resulta especialmente importante consultar el Suplemento vigente de
determine que ya no es apto debido a un cambio en los requisitos de la USP y el NF para las revisiones oficiales de la siguiente lista.
la monografı́a o por limitaciones de estabilidad.
ER Ácido Cı́trico USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas ER Ácido Undecilénico USP—No secar. Mantener el envase
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Este herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
material es la forma anhidra del ácido cı́trico. ER Ácido Valerénico USP—No secar antes de usar. Mantener el
ER Ácido 4’-Cloro-3’-sulfamoilbenzofenona-2-carboxı́lico USP— envase herméticamente cerrado. Almacenar en un congelador.
(CAMBIO DE NOMBRE) Ver ER Compuesto Relacionado A de ER Ácido Valproico USP—No secar. Después de abrir la ampolla,
Clortalidona USP. almacenar en un envase herméticamente cerrado.
ER Ácido Clorogénico USP. ER Ácido Xantanoico USP (C14H10O3 226,23)—Secar la
ER Ácido Dehidrocólico USP—Secar la porción a 1058 durante porción a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. herméticamente cerrado.
ER Ácido Diatrizoico USP—Este material corresponde a la forma ER Ácido o-Yodohipúrico USP (C9H8INO3 305,07)—No secar
anhidra del ácido diatrizoico. Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. almacenar en un desecador. Proteger de la luz.
ER Ácido Edético USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Ácidos Ginkgólicos USP.
envase herméticamente cerrado. ER Adenina USP—Secar la porción a 1108 durante 4 horas antes de
ER Ácido Esteárico USP—No secar. Mantener el envase usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la
herméticamente cerrado. luz.
ER Ácido Etacrı́nico USP—Secar la porción a una presión que no ER Adenosina USP—Mantener el envase herméticamente cerrado y
exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 2 horas antes de usar. protegido de la luz.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar ER Agigenina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
fresco. cerrado herméticamente. Proteger de la luz. Almacenar en un
ER Ácido Etidrónico Monohidrato USP (C2H8O7P2 H2O congelador.
224,04)—No secar antes de usar. Mantener el envase hermética- ER Agnósido USP—Este material es higroscópico. Mantener el
mente cerrado y almacenar en un lugar fresco y seco. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
ER Ácido Fenilbenzimidazol Sulfónico USP—Secar una porción desecador.
a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase ER Aire–Helio USP.
herméticamente cerrado. ER L-Alanina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes
ER Ácido Fluoroquinolónico USP—No secar antes de usar. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Alantoı́na USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Ácido Fólico USP—No secar; determinar el contenido de agua cerrado.
en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Albendazol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
Proteger de la luz. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Ácido 10-Formilfólico USP—No secar. Mantener el envase ER Albuterol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un herméticamente cerrado y protegido de la luz.
refrigerador.
ER Alcohol USP—Después de abrir la ampolla, almacenar la
ER Ácido Fumárico USP—No secar antes de usar. Mantener el porción no usada en un recipiente herméticamente cerrado. Proteger
envase herméticamente cerrado. de la luz. Este material es higroscópico.
ER Ácido Glicı́rrico USP—Secar la porción a 508 durante 12 horas ER Alcohol Bencı́lico USP—No secar antes de usar. Almacenar en
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger un ambiente de gas inerte (nitrógeno o argón) entre 28 y 88.
de la luz. Almacenar en un lugar fresco. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Ácido Glutámico USP—No secar. Mantener el envase ER Alcohol Cetı́lico USP—No secar antes de usar. Mantener el
herméticamente cerrado. Almacenar a temperatura ambiente. envase herméticamente cerrado.
ER Ácido Iotalámico USP—Secar la porción a 1058 durante ER Alcohol Deshidratado USP—Después de abrir la ampolla,
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. almacenar la porción no usada en un recipiente herméticamente
ER Ácido Ioxáglico USP. cerrado. Proteger de la luz. Este material es higroscópico.
ER Ácido Maleico USP—No secar. Mantener el envase herméti- ER Alcohol Estearı́lico USP—No secar antes de usar. Mantener el
camente cerrado y protegido de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER Ácido Málico USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Alcohol Feniletı́lico USP—No secar. Después de abrir la
herméticamente cerrado y protegido de la luz. ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente cerrado.
ER Ácido Mefenámico USP—No secar. Mantener el envase ER Alcoholes de Lanolina USP—No secar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Ácido Nalidı́xico USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas ER Alendronato Sódico USP—No secar. Corresponde a la forma
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. trihidratada del alendronato de sodio. Mantener el envase herméti-
ER Ácido Palmı́tico USP—No secar. Almacenar en un refrigerador. camente cerrado. Después de abrirlo, almacenar en un desecador
Mantener el envase herméticamente cerrado. a temperatura ambiente.
ER Ácido Pamoico USP (C23H16O6 388,38)—Secar la porción ER Alfa Ciclodextrina USP—No secar antes de usar. Mantener el
al vacı́o a 1008 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado. ER Alfa Tocoferol USP—No secar antes de usar. Mantener el
ER Ácido Pentético USP—No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Después de
envase herméticamente cerrado. abrir la ampolla, extraer la muestra sin demora y almacenar la
ER Ácido Quı́nico USP—No secar antes de usar. Mantener el ampolla con la porción remanente bajo una atmósfera de gas inerte
envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Almacenar en en un recipiente herméticamente cerrado y protegido de la luz.
un congelador. ER Aliı́na USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Ácido Salicı́lico USP—No secar. Mantener el envase her- herméticamente cerrado y almacenar en un refrigerador. Después de
méticamente cerrado. abrir el envase, almacenar en un desecador en un refrigerador.
ER Ácido Sulfanı́lico USP (C6H7NO3S 173,19)—Secar la ER S-Alil-L-Cisteı́na USP—No secar antes de usar. Mantener el
porción a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase envase herméticamente cerrado. Almacenar en un congelador.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Almidón Glicolato de Sodio Tipo A—No secar. Mantener el
ER Ácido Trisalicı́lico USP (C21H14O7 378,34)—Secar la envase herméticamente cerrado.
porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el ER Almidón Glicolato de Sodio Tipo B—No secar. Mantener el
envase herméticamente cerrado. envase herméticamente cerrado.
42 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Alopurinol USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante ER Ampicilina Trihidrato USP—No secar antes de usar. Mantener
5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Almacenar
ER Alprazolam USP—No secar antes de usar. Mantener el envase en un lugar frı́o y seco.
herméticamente cerrado. ER Amprolio USP—Secar la porción a una presión que no exceda
ER Alprostadil USP—No secar antes de usar. Mantener el envase de 5 mm de mercurio a 1008 durante 3 horas antes de usar. Mantener
herméticamente cerrado y almacenar en un congelador. el envase herméticamente cerrado.
ER Alteplasa USP. ER Análogo Etilendiamina de Ciprofloxacino USP [clorhidrato
ER Altretamina USP—No secar antes de usar. Determinar de ácido 1-ciclopropil-6-fluoro-1,4-dihidro-4-oxo-7-[(2-
volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar. aminoetil)amino]-3-quinolin carboxı́lico] (C15H16FN3O3 HCl
Mantener el envase herméticamente cerrado. 341,77)—No secar antes de usar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado.
ER Amcinónida USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. ER Análogo Nitrofenilpiridı́nico de Nifedipino USP [4-(2-
nitrofenil)-2,6-dimetilpiridin-3,5-dicarboxilato de dimetilo]
ER Amfotericina B USP—Secar la porción al vacı́o a una presión (C17H16N2O6 344,33)—No secar. Mantener el envase hermética-
que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de mente cerrado. Proteger de la luz.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Análogo Nitrosofenilpiridı́nico de Nifedipino USP [4-(2-
nitrosofenil)-2,6-dimetilpiridin-3,5-dicarboxilato de dimetilo]
ER Amifostina USP—No secar. (C17H16N2O5 328,33)—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Amifostina Tiol USP [diclorhidrato de 2-[(3- mente cerrado. Proteger de la luz.
aminopropil)amino]-etanotiol] (C5H16N2SCl2 207,17)—No ER Antipirina USP—Secar la porción a 608 durante 2 horas antes
secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
un congelador.
ER Antralina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Amikacina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar fresco. Proteger de
herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un lugar la luz.
frı́o.
ER Apigenina-7-Glucósido USP—No secar. Para aplicaciones
ER Amilasa y Proteasa de Pancreatina USP—Mantener el envase cuantitativas de la USP, usar un valor de 0,88 mg de apigenina-7-
herméticamente cerrado y almacenar en un refrigerador. No abrir glucósido por cada mg de este estándar con respecto a la sustancia tal
mientras está frı́o y no secar antes de usar. como se encuentra. Mantener el envase herméticamente cerrado,
ER Amiloxato USP [metoxicinamato de isoamilo]. protegido de la luz y almacenar en un congelador.
ER 2-Amino-5-clorobenzofenona USP (C 1 3 H 10 ClNO ER Aprotinina USP.
231,68)—Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido ER Aptitud del Sistema de Aprotinina USP.
de la luz. Secar la porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de
usar. ER Aptitud del Sistema de Clorhidrato de Cefepima USP—Es
una mezcla del compuesto relacionado A de clorhidrato de cefepima
ER 3-Amino-6-cloro-1-metil-4-fenilcarbostirilo USP—(CAMBIO (cloruro de [6R-[6a,7b(E)]]-1-[[7-[[(2-amino-4-tiazolil) (metoxiimi-
DE NOMBRE) Ver ER Compuesto Relacionado B de Diazepam USP. no)acetil]amino]-2-carboxi-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-
ER Aminobenzoato Potásico USP—Secar la porción a 1058 3-il]metil]-1-metilpirrolidinio, monoclorhidrato, monohidrato;
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente (C19H25ClN6O5S2 HCl H2O 571,50); compuesto relacionado B
cerrado y protegido de la luz. de cefepima (ácido [6R-trans]-7-[[[2-[[(2-amino-4-tiazolil)
ER Aminobutanol USP (C4H11NO 89,14)—Este material es (metoxiimino)acetil]amino]-4-tiazolil](metoxiimino)acetil]amino]-3-
higroscópico. Después de abrir la ampolla, almacenar en un (1-metilpirrolidinio-1-il)metil]-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-3-en-2-
recipiente herméticamente cerrado. No secar; determinar volu- carboxı́lico, sal interna; (C25H29N9O7S3 663,75); y clorhidrato de
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. cefepima. No secar antes de usar. Mantener el envase hermética-
ER N-(Aminocarbonil)-N-[([5-nitro-2-furanil]-metileno)-amino]- mente cerrado. Almacenar en un lugar oscuro y frı́o.
glicina USP—No secar antes de usar. ER Aptitud del Sistema de Dextrano 40 USP.
ER 4-Aminofenol USP. ER Aptitud del Sistema de Dextrano 70 USP.
ER m-Aminofenol USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP—No
envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en secar. Dejar que llegue a temperatura ambiente antes de abrir la
un lugar frı́o. ampolla. Transferir el contenido no utilizado de la ampolla a un
ER Aminoglutetimida USP—Secar la porción a 1058 hasta peso recipiente herméticamente cerrado y almacenar bajo nitrógeno en un
constante antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. lugar fresco y oscuro.
ER m-Aminoglutetimida USP—No secar antes de usar. Mantener ER L- Arabinitol USP [ L- arabitol, 1,2,3,4,5-pentanopentol]
el envase herméticamente cerrado. (C5H12O5 152,15).
ER Amitraz USP—No secar. Mantener el envase herméticamente ER L-Arginina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes
cerrado. Proteger de la luz. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Amobarbital USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas ER Ascorbato de Calcio USP—No secar antes de usar. Mantener el
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Amoxapina USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas ER Ascorbato de Sodio USP—No secar. Mantener el envase
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Amoxicilina USP—No secar antes de usar. Corresponde a la ER Asparagina Anhidra USP.
forma trihidratada de la amoxicilina. Mantener el envase herméti- ER Asparagina Monohidrato USP.
camente cerrado. Proteger de la luz y almacenar en un congelador. ER Aspartamo USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Ampicilina USP—Corresponde a la forma anhidra de la herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
ampicilina. Secar la porción al vacı́o hasta peso constante sobre desecador.
pentóxido de fósforo a temperatura ambiente antes de usar. Mantener ER Acesulfamato de Aspartamo USP—No secar. Mantener el
el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar fresco y envase herméticamente cerrado.
seco. ER Aspirina USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante
ER Ampicilina Sódica USP—No secar antes de usar. Higroscópica. 5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar ER Astemizol USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante
fresco y seco. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Atenolol USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 43
ER Atovacuona USP—No secar antes de usar. ER Besilato de Atracurio USP—No secar; determinar volu-
ER Aurotioglucosa USP—Secar la porción sobre pentóxido de métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener
fósforo durante 24 horas antes de usar. Mantener el envase el envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar frı́o.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Besilato de Mesoridazina USP—No secar. Mantener el envase
ER Avobenzona USP—Secar la porción al vacı́o a 708 durante herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
4 horas antes de usar. Para aplicaciones cuantitativas, usar un valor ER Beta Alanina USP [ácido 3-aminopropiónico].
de 0,994 mg de avobenzona por mg con respecto a la sustancia seca. ER Beta Ciclodextrina USP—No secar antes de usar. Determinar
Mantener el envase herméticamente cerrado. volumétricamente el contenido de agua cuando se utilice para
ER Azaeritromicina A USP—No secar antes de usar. Mantener el análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
envase herméticamente cerrado. ER Betametasona USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Azaperona USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante mente cerrado.
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Biorreacción Positiva USP—Manejar la sustancia con cuidado.
Proteger de la luz. Preparar las muestras según se indica en los respectivos Capı́tulos
ER Azatioprina USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante Generales de Pruebas de la USP.
5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Biotina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
Proteger de la luz. herméticamente cerrado.
ER Azitromicina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Biperideno USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes
herméticamente cerrado y almacenar en un congelador. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
ER Azo-aminoglutetimida USP—Secar la porción a 1058 durante luz.
2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER 4,4’-Bis[1,2,3,6-tetrahidro-4-(2-oxo-1-benzimidazolinil)-1-
Proteger de la luz. piridil]butirofenona USP (C34H34N6O3 574,69)—Mantener el
ER Aztreonam USP—No secar antes de usar. Mantener el envase envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Secar la
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar porción al vacı́o a 708 durante 4 horas antes de usar. Material
frı́o. inestable.
ER Aztreonam de Anillo Abierto USP (C 18 H19 N 5 O 9 S 2 ER Bisacodilo USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes
453,46)—No secar antes de usar. Mantener el envase hermética- de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
mente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un congelador. ER Bisulfato de Clopidogrel USP.
Este material es extremadamente higroscópico. ER Bitartrato de Colina USP—Secar la porción al vacı́o a 658
ER Azul de Metileno USP—Secar la porción a una presión que no durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
exceda de 5 mm de mercurio a 758 durante 4 horas antes de usar. cerrado. Almacenar en un desecador. Este material es higroscópico.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Bitartrato de Dihidrocodeı́na USP—Secar la porción a 1058
ER Bacitracina Cinc USP—Secar la porción al vacı́o a una presión durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de cerrado. Proteger de la luz.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Bitartrato de Epinefrina USP—Secar la porción al vacı́o sobre
Almacenar en un lugar frı́o. gel de sı́lice durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Baclofeno USP—No secar; determinar volumétricamente el herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase ER Bitartrato de Fenilpropanolamina USP—Secar la porción
herméticamente cerrado. a 658 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Behenato de Glicerilo USP—No secar antes de usar. Mantener herméticamente cerrado y protegido de la luz.
el envase herméticamente cerrado. Almacenar a temperatura ER Bitartrato de Hidrocodona USP—Secar la porción al vacı́o
ambiente que no exceda de 358. a 1058 durante 2 horas antes de usar. [NOTA—Una vez seco, el
ER Bencilato de 3-Quinuclidinilo USP (C21H23NO3 337,42)— Bitartrato de Hidrocodona es extremadamente higroscópico.
Secar la porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Después de secar, transferir el material inmediatamente a un
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. desecador que contenga pentóxido de fósforo.] Proteger de la luz.
ER Bendroflumetiazida USP—No secar. Mantener el envase ER Bitartrato de Metaraminol USP—Secar la porción a 1058
herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. Proteger de durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
la humedad. cerrado.
ER Benzoato de Bencilo USP—No secar. Después de abrir la ER Bitartrato de Nicotina Dihidrato USP—No secar; determinar
ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente cerrado, volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar para
protegido de la luz. análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Benzoato de Betametasona USP—Secar la porción a 1058 ER Bitartrato de Norepinefrina USP—No secar. Corresponde a la
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente forma monohidratada de bitartrato de norepinefrina. Mantener el
cerrado. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Benzoato de Denatonio USP—Este material corresponde a la ER Brinzolamida USP—No secar. Mantener el envase hermética-
forma anhidra del benzoato de denatonio. Secar la porción a 1058 mente cerrado. Almacenar en un congelador.
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Bromhidrato de Cefelina USP—Secar la porción a 1058 hasta
cerrado. peso constante antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Benzoato de Metronidazol USP—Secar a 808 durante 3 horas. cerrado. Proteger de la luz.
ER Benzoato de Sodio USP. ER Bromhidrato de Citalopram USP.
ER Benzocaı́na USP—Secar la porción sobre pentóxido de fósforo ER Bromhidrato de Dextrometorfano USP—No secar; determinar
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Benzonatato USP—No secar. Después de abrir la ampolla, ER Bromhidrato de Escopolamina USP—Secar la porción a 1058
almacenar en un recipiente herméticamente cerrado y resistente a la durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
luz. cerrado y protegido de la luz.
ER 1,4-Benzoquinona USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Bromhidrato de Hidroxianfetamina USP—Secar la porción
envase herméticamente cerrado y almacenar en un refrigerador, a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase
protegido de la luz. Puede ser necesario someter el material herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
a ultrasonido para disolverlo. ER Bromhidrato de Homatropina USP—No secar. Mantener el
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
44 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Cefalexina USP—No secar antes de usar. Corresponde a la ER Cefuroxima Axetilo USP—No secar antes de usar. Para
forma monohidrato de la cefalexina. Mantener el envase herméti- aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido
camente cerrado. Para aplicaciones cuantitativas, determinar volu- de agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. cerrado, almacenar en un refrigerador y proteger de la luz.
ER Cefalotina Sódica USP—Secar la porción al vacı́o a una ER Cefuroxima Sódica USP—No secar antes de usar. Mantener el
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger lugar frı́o y seco.
de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. ER Celaburato USP—Secar la porción a 1058 durante 1 hora antes
ER Cefamandol de Litio USP—No secar antes de usar. Mantener de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en luz y almacenar en un lugar frı́o.
un lugar frı́o. ER Celacefato USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Cefapirina Benzatı́nica USP—No secar antes de usar. cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Células F1 para la Prueba de Proliferación Celular USP
ER Cefapirina Sódica USP—No secar antes de usar. Mantener el (Lı́nea celular ATCC FDCP-F1 enviada con autorización de la
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un USP)—Almacenar en un envase impermeable en un congelador.
lugar frı́o y seco. ER Cera de Candelilla USP—No secar. Mantener el envase
ER Cefazolina USP—No secar antes de usar. Para aplicaciones herméticamente cerrado.
cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua en ER Cianocobalamina USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice
el momento de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. cerrado y protegido de la luz.
ER Cefixima USP—Corresponde a la forma trihidratada de la ER Ciclandelato USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante
cefixima. No secar. Para aplicaciones cuantitativas, determinar 24 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar y Almacenar en un refrigerador. Proteger de la luz.
usar un valor de 986 mg de cefixima por mg con respecto a la ER Ciclofosfamida USP—No secar; determinar volumétricamente
sustancia anhidra. Mantener el envase herméticamente cerrado. el contenido de agua cuando se utilice para análisis cuantitativos.
ER Cefmetazol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar entre 28 y
herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un lugar 88.
frı́o. ER Ciclometicona 4 USP—Después de abrir, almacenar en un
ER Cefonicida Sódica USP—No secar; determinar volumétrica- recipiente herméticamente cerrado.
mente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el ER Ciclometicona 5 USP—No secar. Después de abrir la ampolla,
envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar frı́o y seco, almacenar el material en un recipiente herméticamente cerrado.
protegido de la luz.
ER Ciclometicona 6 USP—Después de abrir, almacenar en un
ER Cefoperazona Dihidrato USP—No secar antes de usar. recipiente herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Ciclopirox USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Almacenar en un refrigerador.
ER Ceforanida USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar ER Ciclopirox Olamina USP—Secar la porción al vacı́o hasta peso
frı́o. constante antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Cefotaxima Sódica USP—No secar. Mantener el envase ER 2-Ciclopropilmetilamino-5-clorobenzofenona USP—No secar
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
refrigerador. de la luz.
ER Cefotetán USP—No secar antes de usar. Para aplicaciones ER Cicloserina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que
cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua en no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar.
el momento de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, Mantener el envase herméticamente cerrado.
protegido de la luz y almacenar en un congelador. ER Ciclosporina USP—Secar la porción antes de usar en un frasco
ER Cefoxitina USP—Corresponde a la forma monohidratada. No con tapón de perforación capilar al vacı́o a una presión que no
secar. Determinar volumétricamente el contenido de agua para exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas. Mantener el
aplicaciones cuantitativas. Mantener el envase herméticamente envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un congelador. un lugar frı́o. Si los cálculos requieren un factor de pureza, usar
P = 1000.
ER Cefpiramida USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas,
determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de ER Cimetidina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar a temperatura
Almacenar en un congelador. ambiente.
ER Cefpodoxima Proxetilo USP—No secar; determinar volu- ER Cinoxacino USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante
métricamente el contenido de agua en una porción separada antes de 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Cipionato de Estradiol USP—Secar la porción a 1058 durante
Almacenar en un refrigerador. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Cefradina USP—No secar antes de usar. Corresponde a la Proteger de la luz.
forma dihidratada de la cefadrina. Mantener el envase hermética- ER Cipionato de Testosterona USP—No secar. Mantener el envase
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Ceftazidima Pentahidrato USP—No secar antes de usar. ER Ciprofloxacino USP—No secar antes de usar. Mantener el
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz, el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
aire y la humedad. Almacenar en un congelador. ER Cisplatino USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Ceftizoxima USP—No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar ER Citarabina USP—Secar la porción a una presión que no exceda
frı́o y seco. de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar. Mantener
ER Ceftriaxona Sódica USP—No secar antes de usar. Para el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido
de agua en el momento de usar. Almacenar en un refrigerador.
Mantener el envase herméticamente cerrado.
46 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Clorhidrato de Buprenorfina USP—No secar antes de usar. ER Clorhidrato de Clortetraciclina USP—No secar antes de usar.
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Bupropión USP—No secar. Mantener el Almacenar en un congelador.
envase herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. ER Clorhidrato de Cocaı́na USP—Secar la porción sobre gel de
ER Clorhidrato de Buspirona USP—No secar. Después de abrir el sı́lice durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase
envase, almacenar en un desecador. Mantener el envase hermética- herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
mente cerrado y protegido de la luz. Almacenar en un refrigerador. ER Clorhidrato de Colestipol USP—No secar antes de usar.
ER Clorhidrato de Carteolol USP—Secar la porción a 1058 Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar sobre un
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente desecante.
cerrado. ER Clorhidrato de Daunorrubicina USP—No secar antes de usar.
ER Clorhidrato de Catinona USP [clorhidrato de Para aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el
a-aminopropiofenona] (C9H11NO HCl 185,65)—Secar la contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase
porción a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
herméticamente cerrado y protegido de la luz. congelador. Dejar que se equilibre a temperatura ambiente antes de
ER Clorhidrato de Cefepima USP—No secar antes de usar. abrir.
Almacenar en un lugar frı́o. Proteger de la luz. Para aplicaciones ER Clorhidrato de Demeclociclina USP—Secar la porción al vacı́o
cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua en a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante
el momento de usar. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Cefmenoxima USP—No secar antes de usar. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o.
Para aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el ER Clorhidrato de Desacetil Diltiazem USP (C20H24N2O3S HCl
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase 408,95)—No secar.Mantener el envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado, protegido de la luz y la humedad y Proteger de la luz.
almacenar en un refrigerador. ER Clorhidrato de Deshidrocarteolol USP [clorhidrato de 5-(3-
ER Clorhidrato de Cefotiam USP—No secar antes de usar. Para ter-butilamino-2-hidroxi)-propoxicarbostirilo] (C16H22N2O3 HCl
aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido 326,82)—No secar. Usar tal como se encuentra. Mantener el envase
de agua antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, herméticamente cerrado y protegido de la luz.
protegido de la luz y la humedad y almacenar a una temperatura que ER Clorhidrato de Desipramina USP—Secar la porción al vacı́o
no exceda de 58. Preparar las soluciones inmediatamente antes de a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase
usar. herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Ciclizina USP—Secar la porción a 1208 ER Clorhidrato de Dibucaı́na USP—Secar la porción a 808
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente durante 5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz. cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Ciclobenzaprina USP—Secar la porción ER Clorhidrato de Diciclomina USP—Secar la porción a 1058
a 1058 hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. cerrado.
ER Clorhidrato de Ciclopentolato USP—Secar la porción a 1058 ER Clorhidrato de Diclonina USP—Secar la porción a 1058
durante 4 horas antes de usar. Usar las soluciones inmediatamente durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente
después de su preparación. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar fresco.
cerrado. Almacenar en un refrigerador. ER Clorhidrato de Dietilpropión USP—Secar la porción sobre gel
ER Clorhidrato de Cimetidina USP—No secar antes de usar. de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Utilizar dentro de los
ER Clorhidrato de Ciprofloxacino USP—Corresponde a la forma 2 años posteriores a la adquisición.
monohidratada del clorhidrato de ciprofloxacino. No secar; determi- ER Clorhidrato de Difenhidramina USP—Secar la porción a 1058
nar volumétricamente el contenido de agua cuando se utilice para durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado. cerrado. Proteger de la luz.
Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Difenoxilato USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Ciproheptadina USP—No secar; determinar durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
volumétricamente el contenido de agua cuando se utilice para cerrado.
análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Clorhidrato de Diltiazem USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de L-Cisteı́na USP—Corresponde a la forma durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
monohidratada del clorhidrato de L-cisteı́na. Secar la porción a una cerrado. Proteger de la luz.
presión que no exceda de 5 mm de mercurio durante 24 horas antes ER Clorhidrato de Dipivefrina USP—Secar la porción en un tubo
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. adecuado para secado al vacı́o sobre pentóxido de fósforo a 608
ER Clorhidrato de Clindamicina USP—No secar antes de usar. durante 6 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
Corresponde a la forma monohidratada. Mantener el envase cerrado.
herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar frı́o. ER Clorhidrato de Dobutamina USP—Determinar volumétrica-
ER Clorhidrato de Clomipramina USP—No secar. Este material mente el contenido de agua en el momento de usar para análisis
es higroscópico. Mantener el envase herméticamente cerrado. cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Clonidina USP—Secar la porción a 1058 hasta ER Clorhidrato de Dopamina USP—Secar la porción a 1058
peso constante antes de usar. Mantener el envase herméticamente durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. cerrado.
ER Clorhidrato de Clordiazepóxido USP—Secar la porción al ER Clorhidrato de Dorzolamida USP—No secar. Mantener el
vacı́o sobre pentóxido de fósforo a 608 durante 4 horas antes de usar. envase herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Doxapram USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Cloroprocaı́na USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. ER Clorhidrato de Doxepina USP—Secar la porción al vacı́o a 608
ER Clorhidrato de Clorpromazina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. Proteger de la luz.
48 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Clorhidrato de Doxorrubicina USP—No secar antes de usar. ER Clorhidrato de Imipramina USP—Secar la porción a 1058
Almacenar en un lugar frı́o. Proteger de la luz y dejar que llegue durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
a temperatura ambiente antes de abrir. cerrado.
ER Clorhidrato de Emetina USP—No secar antes de usar ER Clorhidrato de Isoetarina USP—Secar la porción a 1008
cuantitativamente. Determinar el contenido de sustancias volátiles durante 4 horas antes de usar.
calentando por separado una porción a 1058 hasta peso constante ER Clorhidrato de Isoproterenol USP—Secar la porción al vacı́o
para determinar el factor de corrección para uso cuantitativo. sobre pentóxido de fósforo durante 4 horas antes de usar. Mantener
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER Clorhidrato de 4-Epianhidrotetraciclina USP—Secar la ER Clorhidrato de Isoxsuprina USP—Secar la porción a 1058
porción a 608 durante 3 horas antes de usar. El material seco es durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente
extremadamente higroscópico. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o y seco. ER Clorhidrato de Ketamina USP—No secar antes de usar.
ER Clorhidrato de Espectinomicina USP—Corresponde a la Mantener el envase herméticamente cerrado.
forma pentahidratada del clorhidrato de espectinomicina. No secar ER Clorhidrato de Labetalol USP—Secar la porción al vacı́o
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
de la luz. Almacenar en un refrigerador. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Etambutol USP—Secar la porción a 1058 ER Clorhidrato de Levamisol USP—No secar. Mantener el envase
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
cerrado.
ER Clorhidrato de Levobunolol USP—Secar la porción al vacı́o
ER Clorhidrato de Eucatropina USP—Secar la porción sobre gel en un tubo adecuado para secado sobre pentóxido de fósforo a 1108
de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. cerrado y protegido de la luz.
ER Clorhidrato de Fenazopiridina USP—Secar la porción a 1058 ER Clorhidrato de L-Lisina USP—Secar la porción a 1058 durante
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente 3 horas antes de usar. Corresponde a la forma monoclorhidratada.
cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Fenilefrina USP—No secar. Mantener el ER Clorhidrato de Lincomicina USP—No secar. Corresponde a la
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. forma monohidrato del clorhidrato de lincomicina. Mantener el
ER Clorhidrato de Fenilpropanolamina USP—Secar la porción envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase lugar frı́o.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Loperamida USP—No secar. Mantener el
ER Clorhidrato de Fenmetrazina USP—Secar la porción a 1058 envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorhidrato de Maprotilina USP—Secar la porción al vacı́o
cerrado. a 808 hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase
ER Clorhidrato de Fenoxibenzamina USP—Secar la porción al herméticamente cerrado.
vacı́o a 608 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase ER Clorhidrato de Mecamilamina USP—Secar la porción a una
herméticamente cerrado. presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 1058 durante 1 hora
ER Clorhidrato de Fentermina USP—Secar la porción a 1058 antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente Almacenar en un lugar fresco y seco.
cerrado. ER Clorhidrato de Meclizina USP—No secar; determinar
ER Clorhidrato de Fexofenadina USP—No secar. Mantener el volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Flufenazina USP—Secar la porción a 658 ER Clorhidrato de Mecloretamina USP—No secar antes de usar.
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente Este material es higroscópico. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz. cerrado, protegido de la luz.
ER Clorhidrato de Fluoxetina USP—No secar antes de usar. ER Clorhidrato de Mefloquina USP.
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. ER Clorhidrato de Melfalán USP—No secar antes de usar.
ER Clorhidrato de Flurazepam USP—No secar. Mantener el Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un Almacenar en un refrigerador.
desecador. ER Clorhidrato de Meperidina USP—Secar la porción al vacı́o
ER Clorhidrato de Gemcitabina USP—No secar. Mantener el a una presión entre 20 y 40 mm de mercurio a 808 durante 4 horas
envase herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Clorhidrato de Glucosamina USP—No secar. Mantener el de la luz.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Mepivacaı́na USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Gonadorelina USP. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Clorhidrato de Guanfacina USP—Secar la porción a 1058 cerrado.
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorhidrato de Metaciclina USP—No secar.Mantener el
cerrado y protegido de la luz. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en
ER Clorhidrato de Hidralazina USP—Secar la porción a 1108 un congelador.
durante 15 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorhidrato de Metadona USP—No secar. Mantener el envase
cerrado. Almacenar en un lugar seco. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Hidromorfona USP—Secar la porción a 1058 ER Clorhidrato de Metanfetamina USP—Secar la porción a 1058
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz. cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Hidroxizina USP—[Precaución—El material ER Clorhidrato de Metformina USP—No secar. Mantener el
seco es higroscópico.] Secar la porción al vacı́o a 758 durante envase herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener alejado de los álcalis.
Almacenar en un refrigerador. ER Clorhidrato de Metildopa USP—Secar la porción a una
ER Clorhidrato de Idarrubicina USP—No secar antes de usar. presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 1008 durante 2 horas
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
congelador.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 49
ER Clorhidrato de Metilfenidato USP—Secar la porción al vacı́o ER Clorhidrato de Pramoxina USP—Secar la porción a 1058
a 608 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. cerrado.
ER Clorhidrato de Metoclopramida USP—No secar; determinar ER Clorhidrato de Prazosina USP—No secar; determinar
volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar para volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Prilocaı́na USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Metodilazina USP—Secar la porción al vacı́o durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
a 658 durante 16 horas antes de usar. Mantener el envase cerrado.
herméticamente cerrado. ER Clorhidrato de Procaı́na USP—Secar la porción sobre gel de
ER Clorhidrato de Mexiletina USP—Secar la porción a 1058 sı́lice durante 18 horas antes de usar. Mantener el envase
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente herméticamente cerrado.
cerrado. ER Clorhidrato de Procainamida USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Minociclina USP—No secar antes de usar. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. cerrado. Este material es higroscópico.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Clorhidrato de Procarbazina USP—Mantener el envase
ER Clorhidrato de Mitoxantrona USP—No secar; determinar herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar. fresco.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Este material es ER Clorhidrato de Prociclidina USP—Secar la porción al vacı́o
higroscópico. a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Clorhidrato de Molindona USP—Secar la porción a 1058 hasta herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
peso constante antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorhidrato de Promazina USP—Secar la porción a 1058
cerrado. Proteger de la luz. durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Clorhidrato de Moricizina USP—No secar. Para aplicaciones cerrado. Proteger de la luz.
cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua. ER Clorhidrato de Prometazina USP—Secar la porción a 1058
Mantener el envase herméticamente cerrado. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Clorhidrato de Nafazolina USP—Secar la porción a 1058 cerrado. Proteger de la luz.
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorhidrato de Propafenona USP—No secar. Mantener el
cerrado. Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Naftifina USP—Secar sobre pentóxido de ER Clorhidrato de Proparacaı́na USP—Secar la porción a 1058
fósforo a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. cerrado.
ER Clorhidrato de Nalorfina USP—Secar la porción al vacı́o ER Clorhidrato de Propoxicaı́na USP—Secar la porción a 1058
a 1008 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Naratriptán USP—No secar. Mantener el ER Clorhidrato de Propoxifeno USP—Secar la porción a 1058
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
congelador. cerrado.
ER Clorhidrato de Nefazodona USP. ER Clorhidrato de Propranolol USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Norfenilefrina USP. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Clorhidrato de Noroximorfona USP—No secar antes de usar. cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Protriptilina USP—Secar la porción a una
ER Clorhidrato de Nortriptilina USP—Secar la porción a 1058 presión inferior a 5 mm de mercurio a 608 hasta peso constante antes
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Pseudoefedrina USP—Secar la porción a 1058
ER Clorhidrato de Ondansetrón USP—Corresponde a la forma durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
dihidrato. No secar. Para aplicaciones cuantitativas, determinar cerrado. Proteger de la luz.
volumétricamente el contenido de agua. Mantener el envase ER Clorhidrato de Quinapril USP—No secar.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Ranitidina USP—Secar la porción al vacı́o
ER Clorhidrato de Oximetazolina USP—No secar. Mantener el a 608 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase
envase herméticamente cerrado. herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER Clorhidrato de Oxprenolol USP—No secar. Mantener el ER Clorhidrato de Ritodrina USP—Secar la porción a 1058
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Clorhidrato de Palmitato de Clindamicina USP—No secar. cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un ER Clorhidrato de Ropivacaı́na USP.
congelador. ER Clorhidrato de Selegilina USP—Secar la porción al vacı́o a 608
ER Clorhidrato de Papaverina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
cerrado. Proteger de la luz. ER Clorhidrato de Sotalol USP—No secar. Mantener el envase
ER Clorhidrato de Paroxetina USP—No secar. Corresponde a la herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
forma hemihidratada del Clorhidrato de Paroxetina. Mantener el refrigerador.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un ER Clorhidrato de Tacrina USP— No secar. Determinar
refrigerador. volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
ER Clorhidrato de Pilocarpina USP—Secar la porción a 1058 Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar a tempera-
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente tura ambiente. Proteger de la luz.
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. ER Clorhidrato de Terazosina USP—No secar. Mantener el
ER Clorhidrato de Piridoxina USP—Secar la porción al vacı́o envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase ER Clorhidrato de Tetracaı́na USP—Secar la porción al vacı́o
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. sobre pentóxido de fósforo durante 18 horas antes de usar. Mantener
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
50 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Clorhidrato de Tetraciclina USP—No secar antes de usar. ER Clorobutanol USP—No secar antes de usar. Corresponde a la
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. forma hidratada de clorobutanol. Mantener el envase hermética-
Almacenar en un lugar frı́o. mente cerrado.
ER Clorhidrato de Tetrahidrozolina USP—Secar la porción ER b-Clorogenina USP—No secar antes de usar. Mantener el
a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
herméticamente cerrado. lugar frı́o.
ER Clorhidrato de Tiagabina USP—No secar. ER Clorotiazida USP—Secar la porción a 1058 durante 1 hora
ER Clorhidrato de Tiamina USP—No secar; determinar volu- antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener Almacenar en un lugar frı́o.
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Cloroxilenol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Clorhidrato de Tiletamina USP—Secar la porción a 1058 herméticamente cerrado.
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorpropamida USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante
cerrado. 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Tioridazina USP—Secar la porción a 1058 ER (E)-Clorprotixeno USP—Mantener el envase herméticamente
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Secar la porción sobre gel de sı́lice
cerrado. Proteger de la luz. hasta peso constante antes de usar.
ER Clorhidrato de Tocainida USP—Secar la porción a 1058 ER Clorsulón USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 durante
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Tolazolina USP—Secar la porción al vacı́o ER Clortalidona USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas
sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado. ER Cloruro de Acetilcolina USP—Secar la porción a 1058 durante
ER Clorhidrato de Trazodona USP—Secar la porción a una 3 horas antes de usar. Después de abrir el envase, almacenarlo en un
presión aproximada de 50 mm de mercurio a 1058 durante 3 horas desecador y mantenerlo herméticamente cerrado. Este material es
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger extremadamente higroscópico.
de la luz. ER Cloruro de Amonio USP—Secar sobre gel de sı́lice durante
ER Clorhidrato de Trientina USP—Secar la porción al vacı́o a una 4 horas. Este material es higroscópico. Mantener el envase
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 408 durante 4 horas herméticamente cerrado. Almacenar a temperatura ambiente.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger ER Cloruro de Benzalconio USP—Después de abrir la ampolla,
de la luz y almacenar bajo un gas inerte en un refrigerador. almacenar en un recipiente herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Trifluoperazina USP—Secar la porción al ER Cloruro de Betanecol USP—Secar la porción a 1058 durante
vacı́o a 608 durante 4 horas antes de usar. 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Triflupromazina USP—Secar la porción El material seco es higroscópico. Después de secar, transferir el
a 1008 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase material inmediatamente a un desecador.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar ER Cloruro de Cetilpiridinio USP—No secar antes de usar. Para
frı́o. aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido
ER Clorhidrato de Trihexifenidilo USP—Secar la porción a 1058 de agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. ER Cloruro de Colina USP—Secar la porción al vacı́o a 658
ER Clorhidrato de Trimetobenzamida USP—Secar la porción durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
a 1058 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase cerrado. Almacenar en un desecador. Este material es extremada-
herméticamente cerrado. mente higroscópico.
ER Clorhidrato de Tripelenamina USP—Secar la porción a 1058 ER Cloruro de Edrofonio USP—Secar la porción al vacı́o sobre
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente pentóxido de fósforo durante 3 horas antes de usar. Mantener el
cerrado. Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Triprolidina USP—No secar; determinar ER Cloruro de Oxibutinina USP—Secar la porción al vacı́o a 608
volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar durante 24 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
para análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. Proteger de la luz. ER Cloruro de Pralidoxima USP—Secar la porción a 1058 durante
ER Clorhidrato de Vancomicina USP—No secar. Reconstituir 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
todo el contenido sin pesar, y enjuagar si fuera necesario, para la ER Cloruro de Succinilcolina USP—No secar; determinar
valoración. Mantener los envases no abiertos herméticamente potenciométricamente el contenido de agua en el momento de usar
cerrados. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. para análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente
ER Clorhidrato de Verapamilo USP—Secar la porción a 1058 cerrado. Almacenar en un desecador.
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Cloruro de Succinilmonocolina USP—Secar la porción al
cerrado. Proteger de la luz. vacı́o a 558 durante 16 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Clorhidrato de Xilazina USP—Secar a 1058 durante 4 horas herméticamente cerrado.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Cloruro de Tubocurarina USP—No secar. Mantener el envase
ER Clorhidrato de Xilometazolina USP—Secar la porción a 1058 herméticamente cerrado. Usar según las indicaciones de la etiqueta.
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Clorzoxazona USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
cerrado. Proteger de la luz. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Clorhidrato de Yohimbina USP—Secar la porción a 1058 ER Clotrimazol USP—No secar. Mantener el envase hermética-
durante 2 horas antes de usar. Para aplicaciones cuantitativas, usar un mente cerrado. Proteger de la luz.
valor de 0,991 mg de clorhidrato de yohimbina por cada mg de este ER Cloxacilina Benzatina USP—No secar antes de usar. Mantener
material. Mantener el envase herméticamente cerrado. el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Clorhidrato de Zolazepam USP—No secar. Mantener el ER Cloxacilina Sódica USP—No secar antes de usar. Corresponde
envase herméticamente cerrado. a la forma monohidratada de la cloxacilina sódica. Mantener el
ER 2-Cloro-3,5-dimetilfenol USP (C8H9ClO 156,61)—No envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en
secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. un congelador.
ER Clozapina USP—Secar a 1058 durante 4 horas antes de usar.
Mantener el envase herméticamente cerrado.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 51
ER Colchicina USP—No secar. Para uso cuantitativo, determinar ER Compuesto Relacionado A de Bitartrato de Hidrocodona
volumétricamente el contenido de agua y corregir por el contenido USP—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
de disolvente indicado en la etiqueta en el momento de usar. ER Compuesto Relacionado A de Brinzolamida USP [isómero
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. (S) de brinzolamida] (C12H21N3O5S3 383,52)—No secar.
Almacenar en un lugar frı́o y seco. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un
ER Colecalciferol USP—Almacenar en un lugar frı́o, protegido de congelador.
la luz. Dejar que llegue a temperatura ambiente antes de abrir la ER Compuesto Relacionado A de Bromuro de Clidinio USP
ampolla. Usar el material rápidamente y desechar la porción no [bromuro de 3-hidroxi-1-metilquinuclidinio] (C8H 16BrNO
utilizada. 222,13)—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas
ER 4,6-Colestadienol USP [colesta-4,6-dien-3b-ol] (C27H44O antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
384,64)—No secar. Transferir el contenido no utilizado a un protegido de la luz.
recipiente herméticamente cerrado y almacenar bajo nitrógeno en ER Compuesto Relacionado A de Bromuro de Propantelina USP
un lugar oscuro y fresco. [bromuro de 9-hidroxipropantelina] (C23H30BrNO4 464,39)—No
ER Colistimetato Sódico USP—Secar la porción al vacı́o a una secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Evitar el
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas contacto. Almacenar en un desecador. Proteger de la luz. Almacenar
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger bajo una atmósfera inerte.
de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. ER Compuesto Relacionado A de Bromuro de Vecuronio USP
ER Complejo de Clorofilina–Cobre Sódico USP. [3a,17b-diacetil-oxi-2b,16b-bispiperidinil-5a-androstano]
ER Compuesto Relacionado A de Aceite de Sésamo USP. (C33H54N2O4 542,79).
ER Compuesto Relacionado A de Acetato de ER Compuesto Relacionado A de Bumetanida USP [ácido 3-
Medroxiprogesterona USP [acetato de 4,5b- amino-4-fenoxi-5-sulfamoilbenzoico] (C13H12N2O5S 308,31)—
dihidromedroxiprogesterona] (C24H36O4 388,54)—No secar No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Compuesto Relacionado A de Buprenorfina USP [21-[3-(1-
ER Compuesto Relacionado A de Acetato de Melengestrol USP propenil)]-7a-[(S)-1-hidroxi-1,2,2-trimetilpropil]-6,14-endo-etano-
[17-acetato de 16-metilen-17a-hidroxi-4-pregnen-3,20-diona]—No 6,7,8,14-tetrahidrooripavina] (C29H41NO4 467,65)—No secar
secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
luz. protegido de la luz.
ER Compuesto Relacionado A de Ácido Diatrizoico USP [ácido
5-acetamido-3-amino-2,4,6-triyodobenzoico] (C 9 H 7 I 3 N 2 O 3
571,88)—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes de usar. Agregar lo siguiente:
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
~
ER Compuesto Relacionado A de Ácido Fólico USP ER Compuesto Relacionado A de Carbamazepina USP [10, 11-
[formiltetrahidrofolato de calcio]—No secar. Mantener el envase dihidrocarbamazepina].~USP30
herméticamente cerrado y protegido de la luz. ER Compuesto Relacionado A de Carbidopa USP [3-O-
ER Compuesto Relacionado A de Ácido Valproico USP [ácido metilcarbidopa] (C11H16N2O4 240,26)—No secar. Mantener el
dialilacético] (C8H12O2 140,18). [¡ADVERTENCIA! Tóxico para envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
la Reproducción, Causa Irritación.] No secar. Después de abrir, ER Compuesto Relacionado A de Ciclopirox USP [ácido-3-
almacenar en un recipiente herméticamente cerrado. Evitar el ciclohexil-4,5-dihidro-5-metil-5-isoxazolil acético] —No secar.
contacto. Almacenar en un refrigerador. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un
ER Compuesto Relacionado A de Alopurinol USP [hemisulfato refrigerador.
de 3-amino-4-carboxamidopirazol] (C 4 H 6 N 4 O) 2 H 2 SO 4 ER Compuesto Relacionado A de Claritromicina USP [6,11-di-
350,32)—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante 3 horas antes O-metileritromicina A] (C39H71NO13 762,00)—No secar antes de
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un
refrigerador.
ER Compuesto Relacionado A de Clomifeno USP [(clorhidrato
Agregar lo siguiente: de E,Z)-2-[4-(1,2-difeniletenil)fenoxi]-N,N-dietiletanamina]
(C26H29NO HCl 407,98)—No secar antes de usar. Mantener el
~
ER Compuesto Relacionado A de Amitriptilina USP (también envase herméticamente cerrado.
conocido como Dinbenzosuberona) [10,11-dihidro-5H- ER Compuesto Relacionado A de Clonazepam USP [3-amino-4-
dibenzo[a,d]ciclohepten-5-ona] (C15H12O 208,26).~USP30 (2-clorofenil)-6-nitrocarbostirilo] (C15H10ClN3O3 315,72)—No
ER Compuesto Relacionado A de Aspartamo USP [ácido 5- secar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la
bencil-3,6-dioxo-2-piperazin acético] (C13H14N2O4 262,27)—No luz.
secar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la ER Compuesto Relacionado A de Clopidogrel USP [ácido (+)-
luz. (S)-(o-clorofenil)-6,7-dihidrotieno[3,2-c]piridina-5(4H)-acético].
ER Compuesto Relacionado A de Atovacuona USP [cis-2[4-(4- ER Compuesto Relacionado A de Clordiazepóxido USP [4-óxido
clorofenil)ciclohexil]-3-hidroxi-1,4-naftoquinona]—No secar antes de 7-cloro-1,3-dihidro-5-fenil-2H-1,4-benzodiazepin-2-ona]
de usar. (C15H11ClN2O2 286,72)—Secar la porción sobre gel de sı́lice
ER Compuesto Relacionado A de Baclofeno USP [4-(4- durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
clorofenil)-2-pirrolidinona] (C10H10ClNO 195,65)—No secar cerrado y protegido de la luz.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido ER Compuesto Relacionado A de Clorhidrato de Bupropión
de la luz y almacenar en un desecador. USP [clorhidrato de 2-(ter-butilamino)-4’-cloropropiofenona]
ER Compuesto Relacionado A de Benazepril USP [ácido (3R) 3- (C13H18ClNO HCl 276,21)—No secar. Mantener el envase
[[(1R) 1-(etioxicarbonil)-3-fenilpropil]amino]-2,3,4,5-tetrahidro-2- herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
o x o - 1 H - 1 - b e n z a z e p i n - 1 - a c é t i c o , m o n o c l o r h i d r a t o ] congelador.
(C24H28N2O5 HCl 460,95)—No secar. Almacenar en un ER Compuesto Relacionado A de Clorhidrato de Dorzolamida
refrigerador. Proteger de la luz. USP [(4R,6R)-4-(etilamino)-5,6-dihidro-6-metil-4H-tieno[2,3-
ER Compuesto Relacionado A de Benzotiadiazina USP [4- b]tiopiran-2-sulfonamida-7,7-dióxido, monoclorhidrato]
amino-6-cloro-1,3-bencendisulfonamida] (C 6 H 8 ClN 3 O 4 S 2 (C10H16N2O4S3 HCl 360,91)—No secar. Mantener el envase
285,73)—Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar fresco.
de la luz. Secar la porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de ER Compuesto Relacionado A de Cloroxilenol USP [2-cloro-3,5-
usar. dimetilfenol]—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado.
52 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Compuesto Relacionado A de Clortalidona USP [Ácido 4’- ER Compuesto Relacionado A de Flumazenil USP [ácido 8-
cloro-3’-sulfamoilbenzofenona-2-carboxı́lico]—No secar. Mantener fluoro-5,6-dihidro-5-metil-6-oxo-4H-imidazol-[1,5-
el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un desecador. a][1,4]benzodiazepin-3-carboxı́lico] (C13H10FN3O3 275,24).
ER Compuesto Relacionado A de Clorzoxazona USP [2-amino- ER Compuesto Relacionado A de Fluoxetina USP [clorhidrato de
4-clorofenol] (C6H6ClNO 143,57)—Secar la porción a 1058 N-metil-3-fenil-3-[(a,a,a-(trifluoro-m-tolil)oxi]propilamina]
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente (C17H18F3NO HCl 345,79)—No secar antes de usar. Mantener el
cerrado, protegido de la luz y almacenar en un lugar frı́o y seco. envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER Compuesto Relacionado A de Clotrimazol USP [(o- ER Compuesto Relacionado A de Flurbiprofeno USP [ácido 2-(4-
clorofenil)difenilmetanol] (C19H15ClO 294,78)—No secar bifenilil)propiónico] (C15H14O2 226,28)—No secar antes de usar.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y Mantener el envase herméticamente cerrado.
protegido de la luz.
ER Compuesto Relacionado A de Dacarbazina USP [clorhidrato
de 5-aminoimidazol-4-carboxamida]—No secar antes de usar. Eliminar lo siguiente:
Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y
almacenar en un refrigerador. ~
ER Compuesto Relacionado A de Fluvastatina USP [hidroxi-
ER Compuesto Relacionado A de Desflurano USP [bis-(1,2,2,2- dieno de fluvastatina].~USP30
tetrafluoroetil)éter] (C4H2F8O 218,05)—No secar. Después de ER Compuesto Relacionado A de Furosemida USP [ácido 2-
abrir la ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente cerrado. cloro-4-N-furfurilamino-5-sulfamoilbenzoico] (C12H11ClN2O5S
Almacenar en un refrigerador. 330,74)—No secar antes de usar. Mantener el envase hermética-
ER Compuesto Relacionado A de Diazepam USP [2-metilamino- mente cerrado y protegido de la luz.
5-clorobenzofenona] (C14H12ClNO 245,71)—No secar antes de ER Compuesto Relacionado A de Gabapentina USP [2-aza-
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. espiro[4.5]decan-3-ona] (C9H15NO 153,22)—No secar.
ER Compuesto Relacionado A de Diclofenaco USP [N-(2,6- Mantener en un envase herméticamente cerrado.
diclorofenil)indolin-2-ona] (C14H9Cl2NO 278,14)—No secar. ER Compuesto Relacionado A de Gadodiamida USP
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. [monometilamida del ácido dietilentriamina pentaacético de sodio
ER Compuesto Relacionado A de Etidronato Disódico USP y gadolinio] (C15H22GdN4NaO9 582,60)—No secar antes de usar.
[fosfito dibásico de sodio pentahidrato] (Na2HPO3 5H2O Mantener el envase herméticamente cerrado.
216,04 CAS-13708-85-5)—No secar. ER Compuesto Relacionado A de Gadoteridol USP [ácido 10-(2-
ER Compuesto Relacionado A de Etodolaco USP [ácido (+)-8- hidroxipropil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7-triacético]
etil-1-metil-1,3,4,9-tetrahidropirano [3,4-b]-indol-1-acético.] (C17H32N4O7 404,46).
(C16H19NO3 273,33)—No secar antes de usar. Mantener el ER Compuesto Relacionado A de Gadoversetamida USP
envase herméticamente cerrado. [hidrógeno [8,11,14-tris(carboximetil)-6-oxo-2-oxa-5,8,11,14-
ER Compuesto Relacionado A de Etopabato USP [4-acetamido- tetraazahexadecan-16-oato(4-)]gadolinio]—No secar. Para aplica-
2-hidroxibenzoato de metilo] (C10H11NO4 209,20)—No secar ciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente
de la luz. cerrado. Este material es higroscópico. Almacenar en un refrigera-
ER Compuesto Relacionado A de Felodipino USP [metil 4-(2,3- dor.
diclorofenil)-2,6-dimetilpiridin-3,5-dicarboxilato de etilo] ER Compuesto Relacionado A de Ganciclovir USP[(RS)-2-
(C18H17Cl2NO4 382,24)—No secar. amino-9-(2,3-dihidroxi-propoximetil)-1,9-dihidro-purin-6-ona]—No
ER Compuesto Relacionado A de Fenbendazol USP [metil (1H- secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
bencimidazol-2-il)carbamato] (C9H9N3O2 191,19)—No secar. luz. Almacenar en un refrigerador.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Compuesto Relacionado A de Gemfibrozilo USP [ácido 2,2-
ER Compuesto Relacionado A de Feniltoloxamina USP dimetil-5-[2,5-dimetil-4-propen-1-il)fenoxi]valérico] (C18H26O3
[clorhidrato de 2-(2-benzilfenoxi)etilmetilamina] (C16H19NO HCl 290,40)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
277,79)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar a temperatura ambiente. [Precaución—Las soluciones
Proteger de la luz. son fotosensibles.]
ER Compuesto Relacionado A de Fenitoı́na USP [difenilglicina] ER Compuesto Relacionado A de Gliburida USP [(4-[2-(5-cloro-
(C14H15NO2 227,26)—No secar. Mantener el envase hermética- 2-metioxibenzamido)etil]bencenosulfonamida].
mente cerrado. Proteger de la luz. ER Compuesto Relacionado A de Glimepirida USP [isómero cis
ER Compuesto Relacionado A de Fenofibrato USP [(4- de glimepirida].
clorofenil)(4-hidroxifenil)metanona]. ER Compuesto Relacionado A de Glipizida USP [N-{2-[(4-
ER Compuesto Relacionado A de Fenoldopam USP [6-cloro- aminosulfonil)fenil]etil}-5-metil-pirazincarboxamida] (C14H16N4O3S
2,3,4,5-tetrahidro-1-(4-hidroxifenil)-metanosulfonato de 1-metil-3- 320,37)—No secar antes de usar. Mantener el envase
benzazepin-7,8-diol (sal)] (C17H18ClNO3 CH4SO3 415,89)—No herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la ER Compuesto Relacionado A de Haloperidol USP [4,4’-bis[4-p-
luz. Almacenar en un desecador. clorofenil)-4-hidroxipiperidin]butirofenona] (C32H36Cl2N2O3
ER Compuesto Relacionado A de Fexofenadina USP [ácido 4-[1- 567,56)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
oxi-4-[4-(hidroxidifenilmetil)-1-piperidinil]butil]-a,a-dimetil Proteger de la luz.
bencenoacético,] (C32H37NO4 499,65)—No secar. Mantener el ER Compuesto Relacionado A de Hidroxizina USP [p-
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. clorobencidrilpiperazina]—No secar; usar tal como se encuentra.
ER Compuesto Relacionado A de Flecainida USP clorhidrato de Mantener el envase herméticamente cerrado.
3-[2,5-bis(2,2,2-trifluoroetoxi)fenil]-1,5,6,7,8,8a-hexahidroimidazo- ER Compuesto Relacionado A de Hiosciamina USP [sulfato de
[1,5a]piridina] (C17H18F6N2O2 HCl 432,8). norhiosciamina o (1R,3R,5S)-8-azabiciclo[3.2.1]oct-3-il(2S)-3-
ER Compuesto Relacionado A de Fluconazol USP [2-[2-fluoro- hidroxi-2-fenilpropanoato].
4-(1H-1,2,4-triazol-1-il)fenil]-1,3-bis(1H-1,2,4-triazol-1-il)-propan- ER Compuesto Relacionado A de Inamrinona USP [5-
2-ol]. carboxamido[3,4’-bipiridin]-6(1H)-ona] (C11H9N3O2 215,21)—
ER Compuesto Relacionado A de Fludesoxiglucosa USP No secar; usar tal como se encuentra. Mantener el envase
[4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8.]hexacosano] herméticamente cerrado y protegido de la luz.
(C18H36N2O6 376,49)—Mantener el envase herméticamente ER Compuesto Relacionado A de Iodixanol USP [5-amino-N,N’-
cerrado. bis(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-triyodo-1,3-bencenodicarboxamida].
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 53
ER Compuesto Relacionado A de Iohexol USP [5-(acetilamino)- ER Compuesto Relacionado A de Mecamilamina USP [N,1,7,7-
N,N’-bis(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-triyodo-1,3- tetrametilbiciclo [2.2.1] heptan-2-amina] (C11H21N 167,29).
bencenodicarboxamida]—No secar. Mantener el envase hermética- ER Compuesto Relacionado A de Mefloquina USP [treo-
mente cerrado. Proteger de la luz. mefloquina].
ER Compuesto Relacionado A de Iopamidol USP [N,N’-bis-(1,3- ER Compuesto Relacionado A de Mesilato de Dolasetrón USP
d i h i d r o x i - 2 - p r o p i l ) - 5 - a m i n o - 2 , 4 , 6 - t r i y o d o i s o f t a l a m i d a] [clorhidrato de hexahidro-8-hidroxi-2,6-metano-2H-quinolizin-
(C14H18I3N3O6 705,03)—No secar antes de usar. Mantener el 3 (4H)-ona]—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. ER Compuesto Relacionado A de Metformina USP [1-
ER Compuesto Relacionado A de Iopromida USP—No secar. cianoguanidina]—No secar. Mantener el envase herméticamente
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. cerrado. Almacenar en un refrigerador. Mantener alejado de los
ER Compuesto Relacionado A de Ioversol USP—No secar antes álcalis.
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de ER Compuesto Relacionado A de Meticlotiazida USP [4-amino-
la luz. 6-cloro-N3-metil-m-bencenodisulfonamida] (C7H10ClN3O4S2
ER Compuesto Relacionado A de Ioxilán USP [ácido 5-amino- 299,76)—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas
2,4,6-triyodo-3 N-(2-hidroxietil)carbamoı́l benzoico] (C10H9I3N2O4 antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
601,90)—Secar a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el protegido de la luz.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Compuesto Relacionado A de Metilfenidato USP [clorhidrato
ER Compuesto Relacionado A de Irbesartán USP [ácido 1- del ácido a-fenil-2-piperidinacético] (C13H17NO2 HCl 255,75)—
pentanoilamino-ciclopentanocarboxı́lico [2’-(1H-tetrazol-5-il)- No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
bifenil-4-ilmetil]-amida] C25H30N6O2 446,54. ER Compuesto Relacionado A de Metoprolol USP [(+)1-
ER Compuesto Relacionado A de Isoflurano USP [éter de 1- etilamino)-3-[4-(2-metoxietil)fenoxi]-propan-2-ol] (C14H23NO3
cloro-2,2,2-trifluoroetilclorodifluorometilo] (C3HCl2F5O 219,49). 253,34)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado A de Isradipino USP [4-(4- Proteger de la luz. Almacenar en un congelador.
benzofurazanil)-2,6-dimetil-3,5-piridinodicarboxilato de isopropilo ER Compuesto Relacionado A de Milrinona USP [1,6-dihidro-2-
y metilo] (C19H19N3O5 369,38)—No secar. Mantener el envase metil-6-oxo-(3,4’-bipiridin)-5-carboxamida] (C 12 H 11 N 3 O 2
herméticamente cerrado. Proteger de la luz y almacenar en un 229,23)—No secar. Este material es higroscópico. Mantener el
congelador. envase herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado A de Ketamina USP [1-[(2- ER Compuesto Relacionado A de Mononitrato de Isosorbida
clorofenil)(metilimino)metil]ciclopentanol] (C 13 H 16 NOCl USP. [1,4 : 3,5-Dianhidro- D -glucitol 2-nitrato] (C 6 H 9 NO 6
237,73)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. 191,14).
Proteger de la luz. [Precaución—Proteger la solución de la luz y ER Compuesto Relacionado A de Nabumetona USP [1-(6-
usar inmediatamente después de su preparación]. metoxi-2-naftil)-but-1-en-3-ona] (C15H14O2 226,27)—No secar.
ER Compuesto Relacionado A de Lansoprazol USP [2-[[[3- Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
metil-4-(2,2,2-trifluoroetoxi)-2-piridil]metil]sulfonil]bezimidazol] Almacenar en un refrigerador.
(C16H14F3N3O3S 385,36)—No secar. Mantener el envase ER Compuesto Relacionado A de Naltrexona USP [clorhidrato
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar de N-(3-butenil)-noroximorfona] (C20H23NO4 HCl 377,87)—No
frı́o. secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
ER Compuesto Relacionado A de Letrozol USP [4,4’-(1H-1,3,4- protegido de la luz.
triazol-1-ilmetilen)dibenzonitrilo] (C17H11N5 285,31)—No secar. ER Compuesto Relacionado A de Naratriptán USP [clorhidrato
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. de 3-(1-metilpiperidin-4-il)-1H-indol] (C14H18N2 HCl 250,8)—
ER Compuesto Relacionado A de Levocarnitina USP [cloruro de No secar.
3-carboxi-N,N,N-trimetil-2-propen-1-aminio] (C7 H 14 ClNO 2 ER Compuesto Relacionado A de Nefazodona USP [1-(3-
179,65)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. cloropropyl)-4-(clorofenil)piperazina] (C13H18Cl2N2 273,20).
Almacenar en un lugar seco. ER Compuesto Relacionado A de Neotamo USP [N-[3,3-
ER Compuesto Relacionado A de Levodopa USP [3-(3,4,6- dimetilbutil)-L-a-aspartil]-L-fenilalanina].
trihidroxifenil)alanina] (C9H11NO5 213,19)—No secar. Mantener ER Compuesto Relacionado A de Nevirapina USP [5,11-dihidro-
el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. Almacenar 6H-11-etil-4-metil-dipirido[3,2-b: 2’,3’-e][1,4]diazepin-6-ona]
en un lugar fresco y seco. (C14H14N4O 254,29)—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Compuesto Relacionado A de Loratadina USP [8-cloro-6,11- mente cerrado.
dihidro-11(4-piperidiliden)-5H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b] piridina] ER Compuesto Relacionado A de Nimodipino USP [(2,6-dimetil-
(C19H19ClN2 310,83)—No secar. Mantener el envase hermética- 4-(3-nitrofenil)piridin-3,5-dicarboxilato de 2-metoxietil-1-metiletilo]
mente cerrado. Proteger de la luz. (C21H25N2O7 416,42).
ER Compuesto Relacionado A de Lorazepam USP [7-cloro-5-(o- ER Compuesto Relacionado A de Nitrofurantoı́na USP [N-
clorofenil)-1,3-dihidro-3-acetoxi-2H-1,4-benzodiazepin-2-ona] (aminocarbonil)-N-[([5-nitro-2-furanil]metilen)amino]glicina]—No
(C17H12Cl2N2O3 363,20)—No secar. Mantener el envase secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
herméticamente cerrado y protegido de la luz. luz.
ER Compuesto Relacionado A de Lovastatina USP [[dihidro- ER Compuesto Relacionado A de Nitrofurazona USP [ 5-nitro-2-
lovastatina] [éster 2-metil-, 1,2,3,4,4a,7,8,8a-octahidro-3,7-dimetil- furfuraldazina] (C10H6N4O6 278,18)—Secar la porción a 1058
8-[2(tetrahidro-4-hidroxi-6-oxo-2H-piran-2-il)-etil]-1-naftalenı́lico durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente
del ácido butanoico [1S-[1a(R*),3a,7b,8b(2S*,4S*),-8ab]]-] cerrado. Proteger de la luz.
(C24H38O5 406,56)—No secar. Este material es higroscópico.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Compuesto Relacionado A de Norgestimato USP.
Almacenar en un refrigerador. ER Compuesto Relacionado A de Ofloxacino USP [ácido 9-
ER Compuesto Relacionado A de Mafenida [4- fluoro-3-metil-7-oxo-10-(piperazin-1-il)-2,3-dihidro-7H-
formilbencenosulfonamida] C7H7NO3S 185,20—Secar la porción pirido[1,2,3-des]-1,4-benzoxazina-6-carboxı́lico].
al vacı́o a 608 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase ER Compuesto Relacionado A de Ondansetrón USP
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. [3[(dimetilamino)metil]-1,2,3,9-tetrahidro-9-metil-4H-carbazol-4-
ER Compuesto Relacionado A de Mangafodipir USP ona]—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
[dipiridoxal monofosfato de manganeso(II) sal de sodio]—No Proteger de la luz.
secar. Higroscópico. Después de abrir el vial, almacenar en un ER Compuesto Relacionado A de Oxandrolona USP [(7,8-
desecador herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. didehidro-oxandrolona) o (17b-hidroxi-17a-metil-2-oxa-5a-androst-
7-en-3-ona)].
54 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Compuesto Relacionado B de Iopamidol USP [5- vacı́o a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 508 sobre
glicolamido-N,N’-bis[2-hidroxi-1-(hidroximetil)etil]-2,4,6- pentóxido de fósforo durante 2 horas antes de usar. Mantener el
triyodoisoftalamida] (C16H20I3N3O7 747,07)—No secar. Mantener envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y a temperatura ER Compuesto Relacionado B de Prilocaı́na USP [(ER)-N-(4-
ambiente. metilfenil)-2-(propilamino)propanamida] (C13H20N2O 220,31)—
ER Compuesto Relacionado B de Iopromida USP [5-(acetila- No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
mino)-N,N’-bis(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-triyodo-N-metil-1,3-ben- luz. Almacenar en un refrigerador.
cenodicarboxamida]—No secar. Mantener el envase herméticamente ER Compuesto Relacionado B de Probucol USP [4,4’-
cerrado. (ditio)bis(2,6-di-terc-butilfenol)] (C28H42O2 474,78)—No secar.
ER Compuesto Relacionado B de Ioversol USP—No secar antes Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de ER Compuesto Relacionado B de Propofol USP [2,6-
la luz. diisopropilbenzoquinona]—No secar. Mantener en envases imper-
ER Compuesto Relacionado B de Isoflurano USP [éter de 2,2,2- meables y resistentes a la luz bajo un gas inerte. Almacenar en un
trifluoroetildifluorometilo] (C3H3F5O 150,05)—No secar antes refrigerador.
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la ER Compuesto Relacionado B de Propoxifeno USP [a-d-2-
luz. [Precaución—Lı́quido extremadamente volátil. Enfriar el Acetoxi-4-dimetilamino-1,2-difenil-3-metilbutano] (C21H27NO2
contenido antes de abrir la ampolla.] 325,45)—No secar antes de usar. Mantener el envase hermética-
ER Compuesto Relacionado B de Levodopa USP [3- mente cerrado y protegido de la luz.
metoxitirosina] (C10H13NO4 211,22)—No secar. Mantener el ER Compuesto Relacionado B de Quinapril USP [ácido [3S-
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un [2[R*(R*)],3R*]]] 2-[2-[(1-carboxi-3-fenilpropil)amino]-1-
lugar fresco y seco. oxopropil]-1,2,3,4-tetrahidro-3-isoquinolincarboxı́lico. (C23H26N2O5
ER Compuesto Relacionado B de Loratadina USP [8-cloro-6,11- 410,47)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
dihidro-11(N-metil-4-piperiniliden)-5H-benzo[5,6]ciclohepta[1,2-b] Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
piridina] (C20H21ClN2 324,88)—No secar. Mantener el envase ER Compuesto Relacionado B de Ramipril USP [ácido
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. (2S,3aS,6aS)-1-[(S)2-[[(S)1-(metiletoxi)carbonil-3-
ER Compuesto Relacionado B de Lorazepam USP [2-amino- fenilpropil]amino]-1-oxopropil]-octahidrociclopenta[b]pirrol-2-
2’,5-diclorobenzofenona] (C13H9ClNO 266,13)—No secar antes carboxı́lico] (C24H34N2O5 430,54)—No secar. Mantener el envase
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de herméticamente cerrado.
la luz. ER Compuesto Relacionado B de Ranitidina USP [N,N’-bis[2-
ER Compuesto Relacionado B de Mangafodipir USP [[[5-[(dimetilamino)metil]-2-furanil]metil]tio]etil]-2-nitro-1,1-
[dipiridoxal difosfato mono sobrealquilado de manganeso(II) sal etendiamina]—Mantener el envase herméticamente cerrado y
de sodio]—No secar. Higroscópico. Después de abrir el vial, protegido de la luz. No secar antes de usar.
almacenar en un desecador herméticamente cerrado. Almacenar en ER Compuesto Relacionado B de Repaglinida USP [ácido 3-
un refrigerador. etoxi-4-etoxicarbonilfenilacético] (C13H16O5 252,27)—No secar.
ER Compuesto Relacionado B de Metformina USP [1- ER Compuesto Relacionado B de Ropivacaı́na USP [clorhidrato
metilbiguanida] (C3H9N5 115,14). de (R)-ropivacaı́na, monohidrato; clorhidrato de (2,6-dimetilfenil)-
ER Compuesto Relacionado B de Metoprolol USP [(+)1-cloro- amida del ácido (R)-(–)-1-propilpiperiden-2-carboxı́lico,
2-hidroxi-3-[4-(2-metoxietil)fenoxi]-propano] (C12 H 17 ClO 3 monohidrato] (C17H26N2O 328,89).
244,71)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Compuesto Relacionado B de Sevoflurano USP [1,1,1,3,3,3-
Proteger de la luz. Almacenar en un congelador. hexafluoro-2-metoxi-propano]—No secar. Después de abrir la
ER Compuesto Relacionado B de Naratriptán USP [metilamida ampolla, almacenar el material en un recipiente herméticamente
oxalato del ácido 2-[3-(1-metil-1,2,3,6-tetrahidropiridin-4-il)-1H- cerrado. Almacenar en un refrigerador.
indol-5-il]etanosulfónico] (C17H23N3O2S C2H2O4 423,5)—No ER Compuesto Relacionado B de Sotalol USP [N-(4-
secar. formilfenil)metanosulfonamida] (C8H9NO3S 199,23)—No
ER Compuesto Relacionado B de Nefazodona USP [2-(3-(4- secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en
(clorofenil)-1-piperazinil)propil)-5-etil-2,4-dihidro-4-(2-fenoxietil)- un refrigerador.
3H-1,2,4-triazol-3-ona] (C25H32ClN5O2 470,01). ER Compuesto Relacionado B de Terazosina USP [1-(4-hidroxi-
ER Compuesto Relacionado B de Nevirapina USP [5,11-dihidro- 6,7-dimetoxi-2-quinazolinil))-4-[(tetrahidro-2-
4-metil-6H-dipirido[3,2-b: 2’,3’-e][1,4]diazepin-6-ona] furanil)carbonil]piperazina] (C19H24N4O5 388,42)—No secar.
(C12H10N4O 226,23)—No secar. Mantener el envase hermética- Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
mente cerrado. ER Compuesto Relacionado B de Tinidazol USP [1-(2-etil-
ER Compuesto Relacionado B de Ondansetrón USP [6,6’- sulfoniletil)-2-metil-4-nitroimidazol] (C8H13N3O4S 247,28)—No
metilen bis-[(1,2,3,9-tetrahidro-9-metil-3-[(2-metil-1H-imidazol-1- secar.
il)-metil]-4H-carbazol-4-ona]. ER Compuesto Relacionado B de Tioconazol USP [clorhidrato de
ER Compuesto Relacionado B de Oxandrolona USP [(anhidro- 1-[2,4-dicloro-b-[(2,5-dicloro-3-tenil)oxi]fenetil]imidazol]
oxandrolona) o (17b-17-dimetil-2-oxa-18-nor-5a-androstan-3-ona)]. (C16H12Cl4N2OS HCl 458,62)—No secar antes de usar. Mantener
ER Compuesto Relacionado B de Oxibutinina USP [éster el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
metı́lico del ácido fenilciclohexilglicólico, o CHMME (éster metı́lico ER Compuesto Relacionado B de Tizanidina USP [N-
del ácido ciclohexil mandélico)]—No secar. Mantener el envase acetiltizanidina] (C11H10ClN5OS 295,75).
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Compuesto Relacionado B de Tolcapona USP [4-hidroxi-3-
ER Compuesto Relacionado B de Paclitaxel USP [10-deacetil-7- metoxi-4’-metil-5-nitrobenzofenona] (C15H13NO5 287,27)—No
epipaclitaxel]—No secar. Mantener el envase herméticamente secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. luz.
ER Compuesto Relacionado B de Paroxetina USP [clorhidrato de ER Compuesto Relacionado B de Torsemida USP [N-[(n-
trans-4-fenil-3-[(3,4-metilendioxi)fenoxi]metilpiperidina]—No butilamino)carbonil]-4-[(3-metilfenil)amino]-3-piridinsulfonamida]
secar. Esta es una sal clorhidratada. Mantener el envase hermética- (C17H22N4O3S 362,45)—No secar antes de usar. Mantener el
mente cerrado. Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Compuesto Relacionado B de Prazicuantel USP [2- ER Compuesto Relacionado B de Triclosán USP [2,8-
(ciclohexilcarbonil)-2,3,6,7-tetrahidro-4H-pirazino [2,1- diclorodibenzo-p-dioxina] (C12H6Cl2O2) 253,09.
a]isoquinolin-4-ona] (C19H22N2O2 310,40)—Secar la porción al
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 57
ER Compuesto Relacionado C de Tizanidina USP [1- ER Compuesto Relacionado F de Bromuro de Vecuronio USP
acetilimidazolidina-2-tiona] (C5H8N2OS 144,20). [bromuro de piperidinio, 1-[(2b,3a,5a,16b,17b)-17-acetiloxi-3-
ER Compuesto Relacionado C de Torsemida USP [N- hidroxi-2-(1-piperidinil)androstan-16-il]-1-metilo] (C32H55BrN2O3
[(etilamino)carbonil]-4-[(3-metilfenil)amino]-3-piridinsulfonamida] 595,69).
(C15H18N4O3S 334,39)—No secar antes de usar. Mantener el ER Compuesto Relacionado F de Citalopram USP [clorhidrato
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. de dimetil-(1-metil-3,3-difenil-alil)-amino] (C18H21NHCl 286.64).
ER Compuesto Relacionado F de Clorhidrato de Bupropión
USP [1-(3-clorofenil)-1-hidroxi-2-propanona] (C 9 H 9 O 2
Agregar lo siguiente: 184,62)—No secar. Proteger de la luz. Almacenar en un congelador.
Después de abrir la ampolla, almacenar en un recipiente herméti-
~
ER Compuesto Relacionado C de Valsartán USP [Éster camente cerrado.
bencı́lico (S-N-valeril-N-([2’-(1H-tetrazol-5-il)bifen-4-il]metil)- ER Compuesto Relacionado F de Flurazepam USP [7-cloro-5-(2-
valina] (C31H35N5O3 525,64)—No secar.~USP30 fluorofenil)-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-ona] (C15H10Cl
ER Compuesto Relacionado C de Zidovudina USP [timina] FN2O 288,71)—Mantener el envase herméticamente cerrado y
(C5H6N2O2 126,12)—No secar antes de usar. Mantener el envase protegido de la luz. Secar la porción al vacı́o sobre gel de sı́lice a 608
herméticamente cerrado y protegido de la luz. durante 4 horas antes de usar.
ER Compuesto Relacionado C de Zileutón USP [1-Benzo-[b]tien- ER Compuesto Relacionado F de Paroxetina USP [trans(–)-1-
2-iletanona] (C10H8OS 176,24)—No secar. Mantener el envase metil-3-[1,3-benzodioxol-5-iloxi)metil]-4-(fluorofenil)piperidina]
herméticamente cerrado. Almacenar a temperatura ambiente bajo (C20H22FNO3 343,39)—No secar. Mantener el envase herméti-
nitrógeno. Proteger de la luz. camente cerrado. Proteger de la luz.
ER Compuesto Relacionado D de Benazepril USP [ácido (3-(1- ER Compuesto Relacionado G de Benazepril USP [Etil éster del
etioxicarbonil-3-ciclohexil-(1S)-propil)amino-2,3,4,5-tetrahidro-2- ácido (3-(1-etoxicarbonil-3-fenil-(1S)-propil)amino-2,3,4,5-
oxo-1H-1-(3S)-benzazepin)-1-acético]. tetrahidro-2-oxo-1H-1-(3S)-benzazepin)-1-acético].
ER Compuesto Relacionado D de Bromuro de Vecuronio USP ER Compuesto Relacionado G de Paroxetina USP [clorhidrato
(C26H41NO3 415,61). de (+)trans-3-[(1,3-benzodioxol-5-iloxi)metil]-4-(4’’-fluorofenil-4’-
fenil)piperidina] (C25H24FNO3 405,46).—No secar. Mantener el
ER Compuesto Relacionado D de Citalopram USP [clorhidrato envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
de 1-(4-fluorofenil)-1-(3-(metilamino)propil)-1,3-
dihidroisobenzofurano-5-carbonitrilo] (C19H19FN2O HCl 346,83). ER Compuesto Relacionado N de Eritromicina USP [N-
desmetileritromicina A] (C36H65NO13 719,91)—No secar antes
ER Compuesto Relacionado D de Gabapentina USP [ácido (1-(3- de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la
oxo-2-aza-espi ro[4 .5 ]dec-2-i lmetil) -ciclohexil)-acéti co ] luz y almacenar en un congelador.
(C18H29NO3 307,43).
ER Compuestos Relacionados de Clorhexidina USP—No secar.
ER Compuesto Relacionado D de Glimepirida USP [isómero 3 de Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
glimepirida]. Almacenar en un refrigerador.
ER Compuesto Relacionado D de Iodixanol USP [5-[acetil(2- ER Condroitina Sulfatada Sódica USP—Secar la porción a 1058
hidroxi-3-metoxipropil)amino]-N,N’-bis(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6- durante 4 horas justo antes de usar. [NOTA—Una vez seco, este
triyodo-1,3-bencenodicarboxamida]. material es extremadamente higroscópico. Pesar rápidamente,
ER Compuesto Relacionado D de Lorazepam USP [ácido 6- evitando la humedad del ambiente.] Mantener el envase hermética-
cloro-4-(o-clorofenil)-2-quinazolincarboxı́lico] (C15H8Cl2N2O2 mente cerrado.
319,15)—No secar antes de usar. Mantener el envase hermética- ER Copolı́mero de Ácido Metacrı́lico, Tipo A USP—Secar la
mente cerrado. Proteger de la luz. porción a 1108 durante 6 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Compuesto Relacionado D de Metoprolol USP [(+) N,N- herméticamente cerrado.
bis[2-hidroxi-3-[4-(2-metoxietil)fenoxi]propil](1-metiletil)amina] ER Copolı́mero de Ácido Metacrı́lico, Tipo B USP—Secar la
(C27H41NO6 475,62)—No secar. Mantener el envase hermética- porción a 1108 durante 6 horas antes de usar. Mantener el envase
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un congelador. herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado D de Ondansetrón USP [1,2,3,9- ER Copolı́mero de Ácido Metacrı́lico, Tipo C USP—Secar la
tetrahidro-9-metil-3-metilen-4H-carbazol-4-ona]—No secar. Man- porción a 1108 durante 6 horas antes de usar. Mantener el envase
tener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. herméticamente cerrado.
Almacenar en un refrigerador.
ER Copolı́mero de Metacrilato de Amonio, Tipo A USP—Secar
ER Compuesto Relacionado D de Ramipril USP [(2S)2- la porción al vacı́o a 808 durante 5 horas antes de usar. Mantener el
[(3S,5aS,8aS, 9aS)-3-metil-1,4-dioxodecahidro-1H- envase herméticamente cerrado.
ciclopenta[e]pirrolo[1,2-a]pirazin-2-il]-4-fenil-butanoato de etilo].
ER Copolı́mero de Metacrilato de Amonio, Tipo B USP—Secar
ER Compuesto Relacionado E de Benazepril USP [ácido 3- la porción al vacı́o a 808 durante 5 horas antes de usar. Mantener el
amino-2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-1H-1-(3S)-benzazepin-1-acético]. envase herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado E de Gabapentina USP [ácido ER Copovidona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
carboximetil-ciclohexancarboxı́lico] (C9H14O4 186,21). antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado E de Iodixanol USP [5-[[3-[[3- ER Corticotropina USP—No secar antes de usar. Almacenar a una
[[(2,3-dihidroxipropil)amino]carbonil]-5-[[amino]carbonil]-2,4,6- temperatura de 08 o inferior.
triyodofenil](acetilimino)]-2-hidroxipropil]-(acetilimino)]-N,N’-
bis(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-triyodo-1,3-bencenodicarboxamida]. ER Creatinina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado E de Lorazepam USP [6-cloro-4-(o-
clorofenil)-2-quinazolı́n metanol] (C15H10Cl2N2O 305,16)—No ER Cromolı́n Sódico USP—No secar; determinar volumétrica-
secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. mente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el
Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER Compuesto Relacionado E de Paroxetina USP—(CAMBIO DE ER Crospovidona USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante
NOMBRE ) Ver ER Mezcla de Compuesto Relacionado E de 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Paroxetina USP. Almacenar en un desecador después de retirarla de la bolsa
hermética. Este material es higroscópico.
ER Compuesto Relacionado F de Benazepril USP [ácido terc-
butil-3-amino-2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-1H-1-(3S)-benzazepin-1- ER Crotamitón USP—No secar antes de usar. Después de abrir la
acético]. ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente cerrado,
protegido de la luz en un desecador.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 59
ER Dihidroxiacetona USP—No secar. Mantener el envase ER Enantato de Testosterona USP—No secar antes de usar.
herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Dilaurato de Propilenglicol USP. Almacenar en un lugar frı́o. Dejar que se equilibre a temperatura
ER Dimenhidrinato USP—Secar la porción al vacı́o sobre ambiente antes de abrir el vial.
pentóxido de fósforo durante 24 horas antes de usar. Mantener el ER Endotoxina USP—[Precaución—El contenido es pirógeno.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Manejar los viales y su contenido con sumo cuidado para evitar la
ER Dimetil Sulfóxido USP—No secar. Después de abrir, almacenar contaminación.] Reconstituir todo el contenido; usar la solución
en un recipiente resistente a la luz y herméticamente cerrado. Este dentro de los 14 dı́as siguientes. Almacenar el vial cerrado y la
material es extremadamente higroscópico. solución en un refrigerador.
ER Dinitrato de Isosorbida Diluido USP—[Precaución—El ER Enflurano USP—No secar. Después de abrir la ampolla,
material sin diluir es explosivo por percusión o calor excesivo.] almacenar en un recipiente herméticamente cerrado, resistente a la
Se trata de una mezcla que contiene 25% de dinitrato de isosorbida luz. Evitar la exposición al calor excesivo.
en manitol. No secar antes de usar. Mantener el envase hermética- ER Ensulizol USP—(CAMBIO DE NOMBRE) Ver ER Ácido Fenilben-
mente cerrado. Evitar la exposición al calor excesivo. zimidazol Sulfónico USP.
ER Dinoprost Trometamina USP—No secar antes de usar. ER Enzacameno USP.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Epilactosa USP—Secar la porción a 708 durante 4 horas antes
ER Dinoprostona USP. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Dioxibenzona USP—Secar la porción a 408 y a 5 mm de ER Equilina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
mercurio durante 2 horas antes de usar. Almacenar herméticamente herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
cerrado, protegido de la luz y en un lugar fresco. frı́o.
ER Dipiridamol USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas ER Ergocalciferol USP—Almacenar en un lugar frı́o, protegido de
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger la luz. Dejar que llegue a temperatura ambiente antes de abrir la
de la luz. ampolla. Usar el material sin demora y desechar la porción no
ER Dipropionato de Alclometasona USP—No secar antes de usar. utilizada.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Ergosterol USP (C28H44O 396,66)—No secar antes de usar.
ER Dipropionato de Beclometasona USP—Secar la porción Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y el
a 1058 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase aire y almacenar en un refrigerador. Dejar que se equilibre
herméticamente cerrado. a temperatura ambiente antes de abrir.
ER Dipropionato de Betametasona USP—Secar la porción a 1058 ER Ergotaminina USP—No secar; usar tal como se encuentra.
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
cerrado. Almacenar en un lugar frı́o.
ER Diritromicina USP. ER Eritritol USP [meso-eritritol, 1,2,3,4-butanotetrol] (C4H10O4
122,12).
ER 2,4-Disulfamil-5-trifluorometilanilina USP (C7H8F3N3O4S2
319,29)—Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido ER Eritromicina USP—No secar antes de usar, a menos que se
de la luz. Secar la porción al vacı́o sobre gel de sı́lice durante 4 horas especifique algo diferente. Dejar que se equilibre a temperatura
antes de usar. ambiente antes de abrir la ampolla. Higroscópica. Después de abrir,
pesar las porciones inmediatamente, evitando el exceso de humedad,
ER Disulfiram USP—No secar antes de usar. Mantener el envase y desechar el material restante. Almacenar el material sin abrir en un
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. congelador.
ER Disulfuro de Amifostina USP [tetraclorhidrato de N,N-(ditiodi- ER Eritromicina B USP—No secar antes de usar. Mantener el
2,1 etandiı́l)bis 1,3-propandiamina] (C10H30N4S2Cl4 412,32)— envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en
No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un congelador.
un congelador.
ER Eritromicina C USP—No secar antes de usar. Mantener el
ER Disulfuro de Captopril USP—No secar antes de usar. Mantener envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en
el envase herméticamente cerrado. un congelador.
ER Disulfuro de Penicilamina USP (C10H20N2O4S2)—No secar ER Escina USP.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Escopoletina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Docusato Cálcico USP—No secar; determinar volumétrica- mente cerrado. Almacenar en un refrigerador. Proteger de la luz.
mente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el
envase herméticamente cerrado. Este material es higroscópico. ER Escualano USP—No secar antes de usar. Después de abrir la
ampolla, transferir el contenido a un envase herméticamente cerrado.
ER Docusato Potásico USP—No secar; determinar el contenido de
agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente ER Espironolactona USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
cerrado. Almacenar en un lugar seco. Este material es higroscópico. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Docusato Sódico USP—No secar; determinar volumétricamente ER Estanozolol USP—Secar la porción a una presión que no
el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase exceda de 5 mm de mercurio a 1008 hasta peso constante antes de
herméticamente cerrado. Almacenar en un desecador. usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Droperidol USP—Secar la porción al vacı́o a 708 durante ER Estavudina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
4 horas antes de usar. Almacenar bajo nitrógeno. Mantener el envase mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un congelador.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar ER Estearato de Eritromicina USP—No secar antes de usar.
fresco. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Edetato Cálcico Disódico USP—No secar antes de usar. Este Almacenar en un lugar frı́o.
material es higroscópico. Mantener el envase herméticamente ER Estearato de Metilo USP—No secar antes de usar. Mantener el
cerrado. Almacenar en un refrigerador. envase herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador.
ER Edetato Disódico USP—No secar. Mantener el envase ER Estearato de Polioxilo 40 USP—No secar antes de usar.
herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Enalaprilat USP—No secar; determinar volumétricamente el ER Estearil Fumarato de Sodio USP—No secar antes de usar.
contenido de agua en el momento de usar para análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Someter a ultrasonido para disolver, si fuera necesario. Mantener el ER Estolato de Eritromicina USP—No secar antes de usar.
envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un lugar frı́o.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 61
ER Estradiol USP—No secar; corresponde a la forma hemihi- ER Extracto en Polvo de Ginseng Americano USP.
dratada de estradiol. Determinar volumétricamente el contenido de ER Extracto en Polvo de Ginseng Asiático USP—No secar;
agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de
cerrado. Proteger de la luz. usar para análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente
ER Estriol USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de cerrado. Este material es higroscópico.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Extracto en Polvo de Hierba de San Juan USP.
ER Estrona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de ER Extracto en Polvo de Trébol Rojo USP—No secar. Mantener
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en
ER Estropipato USP—Secar la porción a 1058 durante 1 hora antes un refrigerador.
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Famotidina USP—Secar la porción a una presión entre 1 y
ER Etclorvinol USP. 5 mm de mercurio a 808 durante 5 horas antes de usar. Mantener el
ER Éter Polioxil 10 Estearı́lico USP. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Éter Polioxil 10 Oleı́lico USP. ER Felodipino USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Éter Polioxil 20 Cetoestearı́lico USP. mente cerrado y protegido de la luz.
ER Éter Polioxil Laurı́lico USP. ER Fenbendazol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Éter Sevometı́lico USP [1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metoxi- de la luz.
propano]—No secar.
ER L-Fenilalanina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
ER Etidronato Disódico USP—No secar antes de usar. Mantener el antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar fresco y
seco. ER Fenilbutazona USP—Secar la porción al vacı́o a una presión de
30 + 10 mm de mercurio a 808 durante 4 horas antes de usar.
ER Etil Vainillina USP—Secar la porción sobre pentóxido de Mantener el envase herméticamente cerrado.
fósforo durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER 5-Fenilhidantoı́na USP—No secar antes de usar. Mantener el
envase herméticamente cerrado.
ER Etilcelulosa USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. ER Fenilpropanodiol USP [1-fenil-1,2-propanodiol] (C9H12O2
152,19)—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
ER Etilparabeno USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante protegido de la luz.
5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Fenitoı́na USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Etilsuccinato de Eritromicina USP—No secar antes de usar. cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Fenitoı́na Sódica USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Etinil Estradiol USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger ER Fenobarbital USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
de la luz. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Etionamida USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Fenofibrato USP.
herméticamente cerrado. ER Fenol USP.
ER Etodolaco USP—No secar antes de usar; determinar volu- ER Fenoprofeno Cálcico USP—Corresponde a la forma dihidra-
métricamente el contenido de agua en el momento de usar para tada del fenoprofeno cálcico. No secar antes de usar; determinar
análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado. volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar para
ER Etopabato USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y ER Fenoprofeno Sódico USP—Corresponde a la forma dihidratada
almacenar en un lugar fresco y seco. del fenoprofeno sódico. No secar antes de usar; determinar
ER Etopósido USP—No secar antes de usar. Determinar volu- volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener para análisis cuantitativos. Mantener el envase herméticamente
el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. cerrado.
ER Etosuximida USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Fenoxietanol USP. [2-fenoxietanol]—No secar. Mantener el
mente cerrado. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Etotoı́na USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Fenpropionato de Nandrolona USP—Secar la porción en un
herméticamente cerrado. tubo adecuado para secado al vacı́o sobre pentóxido de fósforo como
desecante a 808 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Extracto de Ginseng Asiático USP. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Extracto de Pino Marı́timo USP—No secar. Mantener el ER Fensuximida USP—Secar la porción al vacı́o a 508 durante
envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Extracto de Piretro USP. ER Finasterida USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Extracto de Tomate con Licopeno USP. herméticamente cerrado.
ER Extracto en Polvo de Cardo Mariano USP—No secar antes de ER Fitonadiona USP—Este material se descompone si se expone
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. a la luz solar. No secar antes de usar. Mantener el envase
Almacenar en un refrigerador. herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
ER Extracto en Polvo de Cimicı́fuga Racemosa USP—No secar. refrigerador.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un ER Floxuridina USP—Secar la porción al vacı́o sobre gel de sı́lice
refrigerador. Este material es higroscópico. a 608 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Extracto en Polvo de Eleuterococo USP—No secar. Para herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido ER Flucitosina USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
de agua en el momento de usar. Almacenar en un refrigerador. Este de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
material es higroscópico. ER Fluconazol USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Extracto en Polvo de Equinácea angustifolia USP—No secar. mente cerrado y evitar la exposición a más de 70% de humedad
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. relativa. Proteger de la luz.
ER Extracto en Polvo de Equinácea pálida USP. ER Fludesoxiglucosa USP—No secar. Mantener el envase
ER Extracto en Polvo de Equinácea purpúrea USP—No secar. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Flumazenil USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Extracto en Polvo de Ginkgo USP. mente cerrado. Proteger de la luz.
62 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Flunisolida USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Fosfato Sódico de Betametasona USP—No secar. Determinar
3 horas antes de usar. Este estándar seco corresponde al hemihidrato volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
de flunisolida. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar
ER Flunixino Meglumı́nico USP—Secar la porción a 1058 durante seco. Este material es higroscópico.
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Fosfenitoı́na Sódica USP—No secar. Para aplicaciones
ER Fluocinónida USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Fluoresceı́na USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante Proteger de la luz.
16 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Fructosa USP—Secar la porción al vacı́o a 708 durante 4 horas
ER L-Fluorodopa USP. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
de la luz.
ER Fluorometolona USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Ftalato de Dibutilo USP—No secar. Después de abrir la
Proteger de la luz. ampolla, almacenar los materiales en un recipiente herméticamente
cerrado.
ER Fluorouracilo USP—Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido
de fósforo a 808 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase ER Ftalato de Dietilo USP—No secar antes de usar. Mantener el
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER Fluoruro de Sodio USP—No secar. Mantener el envase ER Ftalato de Hipromelosa USP—No secar antes de usar.
herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Fluoximesterona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas ER Fumarato de Bisoprolol USP—Secar la porción a 608 durante
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger 3 horas antes de usar. Proteger de la luz. Mantener el envase
de la luz. herméticamente cerrado.
ER Flurandrenolida USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 ER Fumarato de Clemastina USP—No secar. Mantener el envase
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. ER Fumarato de Metoprolol USP—Secar la porción al vacı́o a 608
ER Flurbiprofeno USP—No secar. Mantener el envase hermética- durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
mente cerrado. cerrado y protegido de la luz.
ER Flurbiprofeno Sódico USP—Secar la porción al vacı́o a una ER Fumarato de Tiamulina USP—No secar. Mantener el envase
presión que no exceda 1 mm de mercurio sobre pentóxido de fósforo herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
en un tubo adecuado para secado a 608 durante 18 horas antes de ER Furazolidona USP—Secar la porción a 1008 durante 1 hora
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Flutamida USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante de la luz.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y ER Furoato de Diloxanida USP—Secar la porción a 1058 hasta
protegido de la luz. peso constante antes de usar.
ER o-Flutamida USP [2-metil-N-[6-nitro-3- ER Furoato de Mometasona USP—Secar la porción a 1058
(trifluorometil)fenil]propanamida] (C11H11F3N2O3 276,22)—No durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. cerrado.
Proteger de la luz. ER Furosemida USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
ER Fluvastatina para Aptitud del Sistema USP [fluvastatina antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
sódica y antiisómero de fluvastatina sódica]. de la luz.
ER Fluvastatina Sódica USP. ER Gabapentina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER 4-Formilbencenosulfonamida USP—(CAMBIO DE NOMBRE) Ver mente cerrado.
ER Compuesto Relacionado A de Mafenida USP. ER Gadodiamida USP—No secar antes de usar. Para aplicaciones
ER Formononetina USP—No secar. Mantener el envase herméti- cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua en
camente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. el momento de usar y usar un valor de 0,989 mg de gadodiamida por
mg con respecto a la sustancia anhidra. Mantener el envase
ER Fosfato de Antazolina USP—Secar la porción a 1058 durante herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. desecador en un lugar frı́o.
ER Fosfato de Clindamicina USP—No secar. Mantener el envase ER Gadopentetato Monomeglumı́nico USP.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
fresco y seco. ER Gadoteridol USP.
ER Fosfato de Cloroquina USP—Secar la porción a 1058 durante ER Gadoversetamida USP—No secar. Para aplicaciones cuantita-
16 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. tivas, determinar volumétricamente el contenido de agua en el
momento de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Este
ER Fosfato de Codeı́na USP—Corresponde a la forma hemihi- material es higroscópico. Almacenar en un lugar frı́o.
dratada del fosfato de codeı́na. Secar la porción a 1058 durante 18
horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Galactitol USP [dulcitol] (C6H14O6 182,17).
Proteger de la luz. ER Galactosa USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Fosfato de Dexametasona USP—Este material corresponde al cerrado.
Fosfato Ácido de Dexametasona. Secar la porción a una presión que ER Galato de Propilo USP—Secar la porción a 1058 durante
no exceda de 5 mm de mercurio a 408 hasta peso constante antes de 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz y evitar el contacto con metales.
ER Fosfato de Disopiramida USP—Secar la porción a 1058 ER Gamma Ciclodextrina USP.
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Ganciclovir USP—Secar la porción al vacı́o a 808 durante
cerrado. Proteger de la luz. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
ER Fosfato de Fludarabina USP—Mantener el envase hermética- protegido de la luz. Almacenar en un refrigerador. Este material es
mente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un desecador en higroscópico.
un refrigerador. ER Gel de Hidróxido de Aluminio Desecado USP—No secar
ER Fosfato de Hidrocortisona Trietilamina USP (C21H31O8P antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
C6H15N 543,64)—Secar la porción al vacı́o a 608 durante 3 horas ER Gemfibrozilo USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Fosfato de Primaquina USP—Secar la porción a 1058 durante ER Gitoxina USP (C41H64O14 780,96)—No secar antes de usar.
2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 63
ER Gliburida USP—Secar la porción a 1058 durante 6 horas antes ER Hemisuccinato de Prednisolona USP—Secar la porción al
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. vacı́o a 658 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Glicerina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado. ER Hemoglobina USP.
ER Glicina USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes de ER Heparina Sódica USP—Almacenar en un lugar fresco y no
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. congelar.
ER Glicopirrolato USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Hetacilina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
mente cerrado. herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar frı́o.
ER Glimepirida USP. ER Hexacetónido de Triamcinolona USP—Secar la porción al
ER Glipizida USP—No secar antes de usar. Mantener el envase vacı́o a 608 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado y protegido de la luz. herméticamente cerrado.
ER Glucagón USP—Ver la potencia en la bolsa hermética exterior. ER Hexaclorofeno USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas
No secar. Almacenar a –208 antes de abrir, dejar que llegue antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
a temperatura ambiente y preteger del aire y la humedad después de de la luz. Almacenar en un lugar fresco y seco.
abrir. ER Hexacosanol USP.
ER Gluceptato de Calcio USP—Corresponde a la forma alfa del ER Hexilenglicol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
Gluceptato de Calcio. Secar la porción al vacı́o a 608 durante 16 herméticamente cerrado.
horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Hexilresorcinol USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice
ER Gluceptato de Eritromicina USP—No secar antes de usar. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un cerrado.
congelador. ER Hialuronidasa USP—Esta sustancia es una mezcla de
ER Gluconato de Potasio USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 hialuronidasa y lactosa. No secar antes de usar. Mantener el
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar fresco y
cerrado. seco, preferentemente refrigerado en un desecador.
ER Gluconato de Quinidina USP—Secar la porción a 1058 durante ER Hiclato de Doxiciclina USP—No secar antes de usar. Mantener
1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en
Proteger de la luz. un lugar frı́o.
ER N4-Glucósido de Sulfametoxazol USP—No secar; usar tal ER Hidrato de Terpina USP—No secar; determinar volumétrica-
como se encuentra. Mantener el envase herméticamente cerrado. mente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el
Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER g-Glutamil-(S)-Alil-L-Cisteı́na USP—Secar la porción al vacı́o ER Hidroclorotiazida USP—Secar la porción a 1058 durante
a 808 sobre pentóxido de fósforo durante 2 horas antes de usar. 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. ER Hidrocortisona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
Almacenar en un congelador. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Glutamina USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Hidroflumetiazida USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice
mente cerrado. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Gonadotropina Coriónica USP—Almacenar en un refrigerador cerrado.
y no secar antes de usar. Emplear una ampolla nueva para cada grupo ER Hidroquinona USP—No secar; determinar volumétricamente el
de valoraciones y desechar las porciones no usadas. contenido de agua antes de usar para análisis cuantitativos. Mantener
ER Gramicidina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar. ER Hidroxipropil Celulosa USP—Secar la porción a 1058 durante
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Hidroxipropil Metilcelulosa USP—(CAMBIO DE NOMBRE) Ver
ER Griseofulvina USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Hipromelosa USP.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un ER Hidroxiurea USP—[Precaución—Higroscópica; se descom-
lugar frı́o. pone en presencia de humedad.] Secar la porción al vacı́o a 608
ER Guaifenesina USP—Secar la porción a una presión no inferior durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
a 10 mm de mercurio a 608 hasta peso constante antes de usar. cerrado. Almacenar en un desecador a 08 o menos.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Hipericina USP.
ER Guayacol USP—No secar. Después de abrir la ampolla, ER Hiperósido USP.
almacenar en un recipiente herméticamente cerrado. Proteger de la
luz. ER Hipromelosa USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Este
ER Guayacolsulfonato de Potasio USP—No secar. Determinar material es higroscópico.
volumétricamente el contenido de agua antes de usar para análisis
cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger ER Hipurato de Metenamina USP—Secar la porción al vacı́o
de la luz. a 608 durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado.
ER Halcinónida USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 durante
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER L-Histidina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. herméticamente cerrado.
ER Haloperidol USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Homopolı́mero de Polipropileno USP—Tomar precauciones al
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. manejar y almacenar la sustancia para no rayar la superficie de las
Proteger de la luz. tiras. Preparar las muestras según se indica en el respectivo Capı́tulo
General de Prueba USP.
ER Halotano USP—No secar. El material es altamente volátil.
Después de abrir la ampolla, almacenar en un recipiente herméti- ER Homosalato USP—No secar. Mantener el envase hermética-
camente cerrado, resistente a la luz. Almacenar en un refrigerador. mente cerrado.
ER Hemisuccinato de Hidrocortisona USP—Secar la porción ER Ibuprofeno USP—No secar. Mantener el envase hermética-
a 1058 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase mente cerrado.
herméticamente cerrado. ER Identidad de Claritromicina USP.
ER Hemisuccinato de Metilprednisolona USP—No secar. Man- ER Idoxuridina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
tener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un lugar fresco.
64 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Ifosfamida USP—No secar; determinar volumétricamente el ER Iopodato de Sodio USP—Secar la porción al vacı́o a 608
contenido de agua cuando se utilice para análisis cuantitativos. durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar a tempera- cerrado.
tura que no exceda de 258. ER Iopromida USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas,
ER Imidazol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase usar un valor de 0,979 mg de iopromida por mg calculado con
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. respecto a la sustancia ‘‘tal como se encuentra’’. Mantener el envase
ER Imidurea USP—Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido de herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
fósforo durante 48 horas antes de usar. Mantener el envase ER Ioversol USP.
herméticamente cerrado. Almacenar en un desecador. ER Ioxilán USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas,
ER Iminodibencilo USP (C14H13N 195,28)—Secar la porción determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento
sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
herméticamente cerrado y protegido de la luz. luz.
ER Imipenem Monohidrato USP—No secar antes de usar. ER Irbesartán USP—No secar.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un ER Isobutilamida del Ácido 2E,4E-Hexadienoico USP—No
congelador. secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en
ER Impurezas Relacionadas de Succinato de Sumatriptán USP un refrigerador. Proteger de la luz.
[Mezcla de succinato de sumatriptán, sal de maleato de [3-[2- ER Isoflurano USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
(metilamino)etil)]-1H-indol-5-il]-N-metilmetansulfonamida, herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
compuesto relacionado C de succinato de sumatriptán, [3-[2- ER L-Isoleucina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
( d i m e t i l a m i n o - N - ó x i d o ) e t i l ] - 1 H - i n d o l - 5 - i l ] - N - antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
metilmetansulfonamida y [3-[2-(aminoetil)-1H-indol-5-il]-N-
metilmetansulfonamida]—No secar. Mantener el envase hermética- ER Isomalatión USP (C10H19O6PS2 330,37)—No secar.
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar
fresco.
ER Inamrinona USP—No secar antes de usar; determinar
volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar. ER Isomalt USP.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Isómero Delta-3 de Cefaclor USP—No secar antes de usar.
ER Indapamida USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger congelador.
de la luz. Almacenar en un desecador. ER Isómero Delta-3 de Ceftazidima USP—No secar antes de usar.
ER Indigotindisulfonato Sódico USP—Secar la porción a 1058 Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente Almacenar en un congelador.
cerrado. Proteger de la luz. Este material es higroscópico. ER Isómeros Delta-3 de Cefuroxima Axetilo USP—No secar.
ER Indinavir USP—No secar. Corresponde a la forma monohidrato Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y
del indinavir. Mantener el envase herméticamente cerrado. almacenar en un congelador.
ER Indinavir Aptitud del Sistema USP—No secar. Mantener el ER Isómero E de Aztreonam USP—No secar antes de usar.
envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz, el
aire y la humedad y almacenar en un refrigerador.
ER Indometacina USP—Secar la porción a una presión inferior
a los 5 mm de mercurio a 1008 durante 2 horas antes de usar. ER Isómero (E) de Cefprozilo USP—No secar antes de usar.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Insulina USP—Conservar a una temperatura que no exceda de ER Isómero E de Ceftriaxona Sódica USP—No secar antes de
–158. Después de abrir el vial, transferir sin demora todo el usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz
contenido del vial, en porciones medidas con exactitud, a matraces y almacenar en un lugar frı́o.
volumétricos limpios y secos. Mantener los matraces hermética- ER Isómero L de Loracarbef USP—No secar antes de usar.
mente cerrados y almacenar en un congelador. No secar antes de usar Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y
para pruebas y valoraciones. almacenar en un lugar frı́o.
ER Insulina (Bovina) USP—No secar. Almacenar en un con- ER Isómero (Z) de Cefprozilo USP—No secar. Mantener el envase
gelador entre –208 y –188; después de abrir, almacenar en un herméticamente cerrado. Almacenar en un congelador.
recipiente impermeable, protegido del aire y la humedad. ER Isómero Z de Clorhidrato de Triprolidina USP—No secar.
ER Insulina Humana USP—Conservar en un congelador entre – Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
208 y –188 y, después de abrir el vial, almacenar en un recipiente ER Isoniazida USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
impermeable. Después de abrir el vial, transferir sin demora de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
porciones pesadas con exactitud a matraces volumétricos limpios y luz.
secos. Mantener los matraces herméticamente cerrados y almacenar ER Isosorbida USP—Para aplicaciones cuantitativas, determinar
en un congelador. No secar antes de usar para pruebas y volumétricamente el contenido de agua. Después de abrir la ampolla,
valoraciones. almacenar en un recipiente herméticamente cerrado.
ER Insulina Lispro USP. ER Isotretinoı́na USP—No secar. Almacenar los viales a una
ER Insulina (Porcina) USP—No secar. Almacenar en un temperatura inferior a 08; dejar que lleguen a temperatura ambiente
congelador entre –208 y –188; después de abrir, almacenar en un antes de abrir y usar el contenido rápidamente después de abrir los
recipiente impermeable, protegido del aire y la humedad. viales. Proteger del aire y la luz después de abrir el vial.
ER Iodipamida USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas ER Isradipino USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de
ER Iodixanol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes la luz.
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la ER Ivermectina USP—No secar. Proteger de la luz. Mantener el
luz y almacenar en un lugar seco, preferentemente en un desecador. envase herméticamente cerrado.
ER Iodoquinol USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Jengibre en Polvo USP—No secar antes de usar. Mantener el
mente cerrado. envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y la humedad.
ER Iohexol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Ketoconazol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. herméticamente cerrado.
ER Iopamidol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes ER Ketoprofeno USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
luz.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 65
ER Ketorolaco Trometamina USP—Secar la porción al vacı́o ER Lindano USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
a 608 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase cerrado.
herméticamente cerrado y protegido de la luz. ER Linoleato de Metilo USP—Almacenar en un congelador. No
ER Lactasa USP—No secar antes de usar. Mantener el envase secar antes de usar. Después de abrir la ampolla, desechar la porción
herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. Antes de no utilizada.
abrir, permitir que alcance la temperatura ambiente. Proteger del aire ER Linolenato de Metilo USP—Almacenar en un congelador. No
y la humedad después de abrir. secar antes de usar. Después de abrir la ampolla, desechar la porción
no utilizada.
ER Liotironina USP—No secar antes de usar. Corregir por la
Agregar lo siguiente: humedad, determinada secando por separado al vacı́o una porción
a 608 durante 3 horas. Mantener el envase herméticamente cerrado.
~
ER Lactato de Calcio USP.~USP30 Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
ER Lactato de Sodio USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Lipasa de Pancreatina USP—Mantener el envase hermética-
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. mente cerrado y almacenar en un refrigerador. No abrir mientras esta
ER Lactitol USP. frı́o y no secar antes de usar.
ER Lactobionato de Calcio USP—Secar la porción a 1058 durante ER Lisinopril USP—Este material corresponde a la forma
8 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. dihidratada del Lisinopril. No secar; determinar volumétricamente
el contenido de agua en el momento de usar para análisis
ER Lactobionato de Eritromicina USP—Secar la porción al vacı́o cuantitativos. Mantener el envase herméticamente cerrado.
a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Loracarbef USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
Almacenar en un lugar frı́o. herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un lugar
frı́o.
ER Lactonas Terpénicas de Ginkgo USP.
ER Loratadina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Lactosa Anhidra USP—Secar la porción a 808 durante 2 horas mente cerrado. Proteger de la luz.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Lorazepam USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Lactosa Monohidrato USP—Para la prueba de identificación, mente cerrado. Proteger de la luz.
secar una porción a 808 durante 2 horas. Para uso cuantitativo,
determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de ER Lovastatina USP—No secar; usar tal como se encuentra.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un
congelador bajo nitrógeno.
ER Lactulosa USP—Secar la porción a 708 durante 4 horas antes de
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar entre ER Luteı́na USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
28 y 308. cerrado y almacenar bajo nitrógeno en un lugar fresco. Proteger de la
luz.
ER Lamivudina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un congelador. ER Magaldrato USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado y almacenar en un lugar fresco.
ER Lanolina USP—Mantener el envase herméticamente cerrado y
almacenar a temperatura ambiente controlada. ER Malatión USP—No secar. Después de abrir la ampolla,
transferir el contenido a un recipiente adecuado. Mantener el
ER Lansoprazol USP (C16H14F3N3O2S 369,36)—No secar. recipiente herméticamente cerrado y protegido de la luz. Almacenar
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. en un refrigerador.
Almacenar en un lugar frı́o.
ER Maleato de Acepromazina USP—Secar la porción a 1058
ER Laurato de Metilo USP—No secar antes de usar. Después de durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
abrir la ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente cerrado, cerrado y protegido de la luz.
protegido de la luz.
ER Maleato de Azatadina USP—No secar. Mantener el envase
ER Letrozol USP—No secar. herméticamente cerrado.
ER L-Leucina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Maleato de Bis(2-etilhexilo) USP (C20H36O4 340,51)—No
herméticamente cerrado. secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Leucovorina Cálcica USP—[NOTA—Este material es extrema- ER Maleato de Bromfeniramina USP—Secar la porción a 1058
damente higroscópico.] No secar; determinar volumétricamente el durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
contenido de agua en el momento de usar para análisis cuantitativos. cerrado. Proteger de la luz.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Maleato de Carbinoxamina USP—Secar la porción a 1058
ER Levmetanfetamina USP—No secar antes de usar. Mantener el durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. cerrado. Proteger de la luz.
ER Levocarnitina USP—Para uso cuantitativo, determinar volu- ER Maleato de Clorfeniramina USP—No secar. Mantener el
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Para uso envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
en la identificación en el IR, secar la porción a 508 al vacı́o durante
5 horas. Mantener el envase herméticamente cerrado. Este material ER Maleato de Dexbromfeniramina USP—Secar la porción a 658
es extremadamente higroscópico. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz.
ER Levodopa USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la ER Maleato de Dexclorfeniramina USP—No secar. Mantener el
luz. Almacenar en un lugar seco y evitar la exposición al calor envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
excesivo. refrigerador.
ER Levonordefrina USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Maleato de Enalapril USP—No secar. Mantener el envase
15 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. herméticamente cerrado.
ER Levotiroxina USP—Usar sin secar; corregir la humedad, ER Maleato de Ergonovina USP—Secar la porción al vacı́o a 808
determinada secando por separado al vacı́o una porción a 608 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
durante 4 horas. Mantener el envase herméticamente cerrado y cerrado. Proteger de la luz.
protegido de la luz. ER Maleato de Feniramina USP—Secar la porción al vacı́o a 658
ER Licopeno USP. durante 6 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado.
ER Lidocaı́na USP—Secar la porción al vacı́o sobre gel de sı́lice
durante 24 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Maleato de Fluvoxamina USP.—Secar la porción a 808 durante
cerrado. 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Proteger de la luz.
66 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Maleato de Metilergonovina USP—Secar la porción al vacı́o ER Meropenem USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas,
a 808 hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un
refrigerador. refrigerador.
ER Maleato de Metisergida USP—Secar la porción al vacı́o a 1208 ER Mesalamina USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
cerrado. Proteger de la luz. protegido de la luz.
ER Maleato de Monoestearilo USP—No secar. Mantener el envase ER Mesilato de Benzatropina USP—Secar la porción a 1058
herméticamente cerrado. durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Maleato de Pirilamina USP—No secar. Mantener el envase cerrado.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Mesilato de Bromocriptina USP—Este material es higros-
ER Maleato de Proclorperazina USP—Secar la porción al vacı́o cópico. Determinar el contenido de sustancias volátiles por análisis
a 608 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase termogravimétrico calentando por separado una porción de 5 a 10
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. mg de 258 a 1608 a una velocidad de 108 por minuto bajo nitrógeno
ER Maleato de Tietilperazina USP—Secar la porción a 1058 que fluye aproximadamente a 45 mL por minuto. Mantener el envase
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un lugar
cerrado y protegido de la luz. frı́o.
ER Maleato de Timolol USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 ER Mesilato de Deferoxamina USP—No secar; determinar
hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase hermética- volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
mente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Maltitol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Mesilato de Dihidroergotamina USP—Secar la porción al
herméticamente cerrado. vacı́o a 1008 hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Maltol USP.
ER Mesilato de Dolasetrón USP—Corresponde a la forma
ER Maltosa USP—No secar; determinar volumétricamente el monohidratada del mesilato de dolasetrón. No secar. Mantener el
contenido de agua en el momento de usar para análisis cuantitativos. envase herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Mesilato de Fenoldopam USP—No secar.
ER Maltosa Monohidrato USP—No secar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. ER Mesilato de Fentolamina USP—Secar la porción al vacı́o a 608
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Mandelato de Metenamina USP—Secar la porción sobre gel cerrado. Proteger de la luz.
de sı́lice durante 18 horas antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. ER Mesilato de Pergolida USP—No secar.
ER Mangafodipir Trisódico USP [dipiridoxal difosfato de ER Mesilato de Saquinavir USP.
manganeso(II)]—No secar. Higroscópico. Para aplicaciones cuanti- ER Mesilatos de Ergoloides USP—No secar; determinar volu-
tativas, determinar volumétricamente el contenido de agua en el métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener
momento de usar. Después de abrir el vial, almacenar en un el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
desecador herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. ER Mestranol USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Manitol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase cerrado. Proteger de la luz.
herméticamente cerrado. ER Metazolamida USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
ER Marcador Vo de Dextrano USP. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Mazindol USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante 2 horas de la luz.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Metenamina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
Almacenar a temperatura ambiente que no exceda de 258. mente cerrado.
ER Mebendazol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas ER Meticilina Sódica USP—No secar. Determinar volumétrica-
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. mente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el
ER Mebrofenina USP—No secar. Mantener el envase hermética- envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
mente cerrado. lugar frı́o.
ER Meclofenamato Sódico USP—No secar; determinar volu- ER Meticlotiazida USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER 5-Metil-3-Isoxazolcarboxilato de Metilo USP—Secar la
ER Mefobarbital USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas porción sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER Menadiona USP—[Precaución—Evitar el contacto; evitar la ER Metilbromuro de Homatropina USP—Secar la porción a 1058
exposición a la luz.] Secar la porción sobre gel de sı́lice durante durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. cerrado. Proteger de la luz.
Proteger de la luz. ER Metildopa USP—No secar; determinar volumétricamente el
ER Menotropinas USP. contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Mentol USP—No secar. Corresponde a la forma L de mentol.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER 3-O-Metilmetildopa USP (C11H15NO4 225,25)—No secar.
Corresponde a la forma monohidratada de 3-O-metilmetildopa.
ER Meprednisona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
de la luz. ER Metilparabeno USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice
durante 5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Meprobamato USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante cerrado.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Metilprednisolona USP—Secar la porción a 1058 durante
ER Meradimato USP. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Mercaptopurina USP—No secar; determinar volumétricamente Proteger de la luz.
el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase ER Metilsulfato de Neostigmina USP—Secar la porción a 1058
herméticamente cerrado. durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 67
ER Metiltestosterona USP—Secar la porción a 1058 durante Compuesto relacionado C de propionato de fluticasona [S-
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. fluorometil-17a-acetiloxi-6a,9a-difluoro-11b-hidroxi-16a-metil-3-
Proteger de la luz. oxo-androsta-1,4-dieno-17b-carbotioato de].
ER Metimazol USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes Compuesto relacionado D de propionato de fluticasona [S-metil
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la 6a,9a-difluoro-11b-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-propioniloxi-
luz y almacenar en un congelador. androsta-1,4-dieno-17b-carbotioato de].
ER L-Metionina USP—No secar. Mantener el envase hermética- Compuesto relacionado E de propionato de fluticasona [éster
mente cerrado. 6a,9a-difluoro-17b-(fluorometiltio) carbonil-11b-hidroxi-16a-metil-
3-oxo-androsta-1,4-dien-17a-ı́lico del ácido 6a,9a-difluoro-11b,17a-
ER Metirapona USP—Secar la porción al vacı́o a temperatura dihidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1,4-dien-17b-carboxı́lico].
ambiente durante 6 horas antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
fresco y seco.
Agregar lo siguiente:
ER Metirosina USP—Secar la porción a una presión que no exceda
de 5 mm de mercurio a 1008 durante 2 horas antes de usar. Mantener ~
el envase herméticamente cerrado. ER Mezcla de Componentes de Jengibre USP.~USP30
ER Metocarbamol USP—Secar la porción a 608 durante 2 horas ER Mezcla de Compuesto Relacionado E de Paroxetina USP
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. (clorhidrato de paroxetina al que se le ha agregado una cantidad
conocida de 1-metil-4-(p-fluorofenil)-1,2,3,6-tetrahidropiridina)—
ER Metohexital USP—No secar. Mantener el envase hermética- No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de
mente cerrado. la luz.
ER Metolazona USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas ER Mezcla de Compuestos Relacionados de Ritonavir USP.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
de la luz. ER Mezcla de Norgestimato Oxima USP [una mezcla de
norgestimato de sin-17-deacetil y norgestimate de anti-17-deacetil ].
ER Metotrexato USP—Este material es higroscópico. No secar;
determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de ER Mezcla de Resolución A de Lamivudina USP—No secar.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un refrigerador. Almacenar en un congelador.
ER Metotrimeprazina USP—Secar la porción a 1008 durante ER Mezcla de Resolución B de Lamivudina USP—No secar.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz y
Proteger de la luz. almacenar a temperatura ambiente controlada.
ER Metoxaleno USP—No secar; determinar volumétricamente el ER Mezcla de Resolución de Ciclosporina USP—Este material es
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase una mezcla 100 : 1 de ciclosporina y ciclosporina U. No secar antes
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la
luz y almacenar en un lugar frı́o.
ER Metoxiflurano USP—Mantener el envase herméticamente
cerrado y protegido de la luz. ER Mezcla de Resolución de Etopósido USP—No secar antes de
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la
ER 3-Metoxitirosina USP—(CAMBIO DE NOMBRE) Ver ER Com- luz.
puesto Relacionado B de Levodopa USP.
ER Mezcla de Resolución de Naratriptán USP—Una mezcla de
ER Metrifonato USP [triclorfón]—No secar. Mantener el envase clorhidrato de naratriptán con aproximadamente 1% de compuesto
herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un relacionado A de naratriptán [clorhidrato de 3-(1-metilpiperidin-4-
refrigerador. il)-1H-indol] y compuesto relacionado B de naratriptán [metilamida
ER Metronidazol USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas oxalato del ácido 2-[3-(1-metil-1,2,3,6-tetrahidropiridin-4-il)-1H-
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger indol-5-il]etanosulfónico].
de la luz. ER Mezcla de Resolución de Ondansetrón USP—Clorhidrato de
ER Metsuximida USP—Secar la porción sobre pentóxido de ondansetrón con aproximadamente 0,4% p/p tanto del compuesto
fósforo durante 16 horas antes de usar. Mantener el envase relacionado A de ondansetrón, como de 6,6’-metilen bis-[(1,2,3,9-
herméticamente cerrado. tetrahidro-9-metil-3-[(2-metil-1H-imidazol-1-il)-metil]-4H-carbazol-
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Paroxetina USP—Una 4-ona)]—No secar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
mezcla de aproximadamente 1% de compuesto relacionado A de Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
paroxetina [clorhidrato (3S-trans) 3-[(1,3-benzodioxol-5-iloxi)me- ER Mezcla de Resolución de Propionato de Fluticasona USP—
til]-4-(4-metoxifenil)-piperidina] y 1% de compuesto relacionado B Es una mezcla de propionato de fluticasona y del compuesto
de paroxetina [clorhidrato (3S-trans) 3-[(1,3-benzodioxol-5-iloxi)- relacionado D de propionato de fluticasona.
metil]-4-fenil)-piperidina] en una matriz de clorhidrato de paroxe- ER Mezcla de Resolución de Propofol USP [propofol y 2-
tina. isopropil-6-n-propilfenol].
ER Mezcla A de Compuestos Relacionados de Triclosán USP. ER Mezcla de Resolución de Ranitidina USP—Es una mecla de
ER Mezcla de Aptitud del Sistema de Estavudina USP—Es una clorhidrato de ranitidina y cuatro impurezas relacionadas: ranitidina-
mezcla de estavudina y los siguientes compuestos relacionados: N-óxido, nitroacetamida complejo de ranitidina, hemifumarato
timidina, timina, alfa-estavudina y xilo-timidina. No secar. Mantener diamina de ranitidina y hemifumarato alcohol amino de ranitidina.
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en Ranitidine-N-óxido: N,N-dimetil[5-[[[2-[[1-(metilamino)-2-nitroe-
un refrigerador. tenil]amino]etil]sulfanil]metil]furan-2-il]methanamina N-óxido.
ER Mezcla de Aptitud del Sistema de Mitoxantrona USP Nitroacetamida complejo de ranitidina: N-[2-[[[5-[(dimetilami-
[clorhidrato de 8-amino-1,4-dihidroxi-5[[2-[(2- no)metil]furan-2-il]metil]sulfanil]etil]-2-nitroacetamida.
hidroxietil)amino]etil]amino]-9,10-antracendiona] Hemifumarato diamina de ranitidina (compuesto relacionado A):
(C18H19N3O5 HCl 393,83)—No secar. Mantener el envase sal hemifumarato de [5-[[(2-aminoetil)tio]metil]-N,N-dimetil-2-fur-
herméticamente cerrado. anmethanamina].
ER Mezcla de Aptitud del Sistema de Propionato de Fluticasona Hemifumarato alcohol amino de ranitidina: [5-[(dimetilamino)-
USP—Es una mezcla de ER Propionato de Fluticasona USP y de los metil]furan-2-il]metanol.
compuestos relacionados B, C y D de propionato de fluticasona. ER Mezcla Racémica de Clorhidrato de Tiagabina USP
Compuesto relacionado A de propionato de fluticasona [ácido [clorhidrato del ácido (S)-(+), (R)-(–)-1-[4,4-bis(3-metil-2-tienil)-3-
6a,9a-difluoro-11b-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17a-propioniloxian- butenil]nipecótico] (C20H25NO2S2 HCl 412,0)—No secar.
drosta-1,4-dieno-17b-carbonilsulfénico].
Compuesto relacionado B de propionato de fluticasona [6a,9a-
difluoro-11b-hidroxi-16a-metil-2’,3,4’-trioxo-17a-espiro(androsta-
1,4-dieno-17,5’-(1,3)oxatiolano)].
68 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Mezlocilina Sódica USP—No secar. Para aplicaciones ER Naloxona USP—Secar la porción a 1058 hasta peso constante
cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido de agua antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado de la luz.
y almacenar en un lugar fresco y seco. Este material es higroscópico. ER Naltrexona USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Mibolerona USP. mente cerrado. Proteger de la luz.
ER Miconazol USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Nandrolona USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un
Proteger de la luz. refrigerador.
ERV Microfotografı́as de Referencia de Cultivo de ER Naproxeno USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes
Feocromocitoma de Ratas USP. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ERV Microfotografı́as de Referencia de Piel para Injertos USP. ER Naproxeno Sódico USP—Secar la porción al vacı́o a 1058
ERV Microfotografı́as de Referencia de Sustituto Dérmico durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
Crioconservado Derivado de Fibroblastos Humanos USP. cerrado.
ERV Microfotografı́as de Referencia de Sustituto Dérmico ER Napsilato de Propoxifeno USP—Corresponde a la forma
Temporal Derivado de Fibroblastos Humanos USP. monohidratada. No secar; determinar volumétricamente el contenido
ER Milrinona USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas, de agua en el momento de usar para análisis cuantitativos. Mantener
determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de el envase herméticamente cerrado.
usar. Este material es higroscópico. Mantener el envase hermética- ER Narasina USP.
mente cerrado. ER Natamicina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Minoxidil USP—No secar antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
herméticamente cerrado. frı́o.
ER Miristato de Isopropilo USP—No secar antes de usar. Después ER Neotamo USP.
de abrir la ampolla, transferir el contenido a un envase hermética- ER Nevirapina Anhidra USP—No secar. Mantener el envase
mente cerrado y proteger de la luz. herméticamente cerrado.
ER Miristato de Metilo USP—No secar antes de usar. Después de ER Nevirapina Hemihidrato USP—No secar. Mantener el envase
abrir la ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente sellado, herméticamente cerrado.
protegido de la luz. ER Niacina USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Mirtazapina USP—No secar; determinar volumétricamente el cerrado.
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase ER Niacinamida USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Mitomicina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Nifedipino USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar cerrado. Evitar la exposición a la luz. Manipular con cuidado.
frı́o y seco. ER Nimodipino USP.
ER Mitotano USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante 2 horas ER Nistatina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que no
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger exceda de 5 mm de mercurio a 408 durante 2 horas antes de usar.
de la luz. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Monensina Sódica USP. Almacenar en un congelador.
ER Monobenzona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas ER Nitrato de Butoconazol USP—Secar la porción al vacı́o a 608
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
de la luz. Evitar la exposición a temperaturas superiores a los 308. cerrado. Proteger de la luz.
ER Monoetanolamina USP—No secar. ER Nitrato de Econazol USP—No secar. Mantener el envase
ER Éter Monoetı́lico de Dietilenglicol USP. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Monoglicéridos USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Nitrato de Miconazol USP—Secar la porción a 1058 durante
envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Monoglicéridos Diacetilados USP—Mantener el envase Proteger de la luz.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Nitrato de Pilocarpina USP—Secar la porción a 1058 durante
ER Monolaurato de Propilenglicol USP. 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Monolinoleato de Glicerilo USP. Proteger de la luz.
ER Mononitrato de Isosorbida USP. ER Nitrato de Sulconazol USP—Secar la porción al vacı́o a 808
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Monooleato de Glicerilo USP. cerrado.
ER Monosulfato de Guanetidina USP—Secar la porción a 1058 ER 5-Nitro-2-furfuraldazina USP—(CAMBIO DE NOMBRE) Ver ER
hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase hermética- Compuesto Relacionado A de Nitrofurazona USP.
mente cerrado.
ER Nitrofurantoı́na USP—Secar la porción a 1408 durante 30
ER Mucato de Isometepteno USP. minutos antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Mupirocina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase Proteger de la luz.
herméticamente cerrado y almacenar en un congelador. ER Nitrofurazona USP—Secar la porción a 1058 durante 1 hora
ER Mupirocina de Litio USP—No secar antes de usar. Mantener el antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
envase herméticamente cerrado y almacenar en un congelador. de la luz. Evitar la exposición a la luz solar directa, a la iluminación
ER Nabumetona USP—No secar. Mantener el envase hermética- fluorescente intensa, al calor excesivo y a los materiales alcalinos.
mente cerrado. Almacenar en un lugar frı́o. ER Nitrógeno USP.
ER Nadolol USP—No secar. Mantener el envase herméticamente ER Nitroglicerina Diluida USP—[Precaución—Manejar con
cerrado. cuidado; puede explotar por percusión o debido al calor excesivo.]
ER Nafato de Cefamandol USP—No secar antes de usar. Mantener No secar; cada ampolla contiene aproximadamente 200 mg de una
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en solución al 1,00% (p/p) de nitroglicerina en propilenglicol.
un lugar frı́o. Almacenar las ampollas sin abrir a 48; dejar que se equilibre
ER Nafcilina Sódica USP—No secar antes de usar. Mantener el a temperatura ambiente antes de abrir la ampolla. Una vez abierta,
envase herméticamente cerrado. Almacenar en un lugar frı́o. proteger de la humedad y la luz y usar sin demora. Desechar todas
las porciones no utilizadas.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 69
ER Nitroprusiato de Sodio USP—Corresponde a la forma ER Oxazepam USP—Secar la porción a una presión inferior a los
dihidratada. No secar antes de usar. Mantener el envase hermética- 5 mm de mercurio a 1058 durante 3 horas antes de usar. Mantener el
mente cerrado. Proteger de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER Nizatidina USP—Secar la porción a 1008 durante 1 hora antes ER Oxfendazol USP—No secar. Mantener el envase hermética-
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de mente cerrado. Proteger de la luz.
la luz. ER Oxibenzona USP—Secar la porción al vacı́o a 408 durante
ER Nonoxinol 9 USP—No secar. Después de abierto, tomar las 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
precauciones necesarias para que no entre en contacto con el aire. Proteger de la luz.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Oxicodona USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
ER Nordazepam USP [7-cloro-1,3-dihidro-5-fenil-2H-1,4- de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
benzodiazepin-2-ona] (C15H11ClN2O 270,72)—No secar antes ER N-Óxido de Codeı́na USP (C18H21NO4 315,37)—
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la Almacenar en un envase herméticamente cerrado, protegido de la
luz. luz. No secar antes de usar.
ER Noretindrona USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Óxido de Polietileno USP—Secar la porción al vacı́o
mente cerrado. a temperatura ambiente hasta peso constante antes de usar. Mantener
ER Noretinodrel USP—No secar antes de usar. Mantener el envase el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
herméticamente cerrado. ER Óxido Nitroso USP.
ER Norfloxacino USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que ER Oxı́geno–Helio USP.
no exceda de 5 mm de mercurio a 1008 durante 2 horas antes de usar. ER Oximetolona USP—Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. de fósforo durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Norgestimato USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas. herméticamente cerrado.
Mantener los envases herméticamente cerrados. ER Oximorfona USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Norgestrel USP—No secar. Mantener el envase herméticamente herméticamente cerrado y protegido de la luz.
cerrado. ER Oxitetraciclina USP—No secar. Mantener el envase herméti-
ER Noscapina USP—No secar; determinar volumétricamente el camente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o.
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase ER Oxitocina USP—Almacenar a 08 o menos. Reconstituir todo el
herméticamente cerrado. contenido de un vial en agua, transferir cuantitativamente con agua
ER Novobiocina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que a un matraz volumétrico de 5 mL, diluir con agua a volumen y
no exceda de 5 mm de mercurio a 1008 durante 4 horas antes de usar. mezclar. Para la Prueba de aptitud del sistema, agregar una cantidad
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. conocida de clorobutanol a la solución final.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Oxtrifilina USP—Secar la porción a 808 durante 4 horas antes
ER Octasulfato Potásico de Sacarosa USP [NOTA—El nombre de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
Sucrosofato Potásico es USAN] [sal octapotásica de a-D- luz.
glucopiranósido, 1,3,4,6-tetra-O-sulfo-b-D-fructofuranosil, tetra ER Paclitaxel USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
(hidrógeno sulfato), heptahidrato] (C 12 H 14 K 8 O 35 S 8 7H 2 O cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
1413,64 CAS-76578-81-9). (C12H14K8O35S8 anhidro 1287,53
CAS-73264-44-5)—No secar; determinar volumétricamente el ER Padimato O USP—No secar; determinar volumétricamente el
contenido de agua cuando se utilice para análisis cuantitativos. contenido de agua para aplicación cuantitativa en el momento de
Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
congelador. Dejar que se equilibre a temperatura ambiente antes de ER Palmitato de Cetilo USP—No secar antes de usar. Almacenar
abrir. a temperatura ambiente que no exceda de 308. Proteger de la luz.
ER Octildodecanol USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Palmitato de Cloranfenicol USP—No secar antes de usar.
envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Octinoxato USP [metoxicinamato de octilo]—No secar. Almacenar en un lugar frı́o.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Almacenar en un ER Palmitato de Cloranfenicol No Polimorfo A USP—No secar
lugar fresco. Proteger de la luz. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Octisalato USP [salicilato de octilo].—No secar. Mantener el de la luz. Almacenar en un lugar frı́o.
envase herméticamente cerrado. ER Palmitato de Cloranfenicol Polimorfo A USP—No secar antes
ER Octocrileno USP—No secar. Después de abrir la ampolla, de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en
almacenar en un envase herméticamente cerrado. un lugar frı́o y seco.
ER Octoxinol 9 USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Palmitato de Isopropilo USP—No secar antes de usar. Después
herméticamente cerrado. de abrir la ampolla, transferir el contenido a un envase hermética-
mente cerrado. Proteger de la luz.
ER Ofloxacino USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado y protegido de la luz. ER Palmitato de Metilo USP—No secar antes de usar. Mantener el
envase herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador.
ER Oleato de Metilo USP—Almacenar en un congelador. No secar
antes de usar. Después de abrir la ampolla, almacenar en un ER Palmitoleato de Metilo USP—Almacenar en un congelador. No
recipiente herméticamente cerrado bajo un gas inerte, protegido de la secar antes de usar. Después de abrir la ampolla, almacenar en un
luz. recipiente herméticamente cerrado bajo un gas inerte, protegido de la
luz.
ER Oleato de Polioxilo USP.
ER Pamidronato Disódico USP.
ER Omeprazol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado y almacenar en un lugar frı́o, protegido de la ER Pamoato de Hidroxizina USP—No secar antes de usar. Para
humedad. aplicaciones cuantitativas, determinar volumétricamente el contenido
de agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Oxacilina Sódica USP—No secar antes de usar. Mantener el cerrado.
envase herméticamente cerrado. Almacenar a temperatura ambiente
controlada. ER Pamoato de Pirantel USP—Secar la porción al vacı́o a 608
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Oxandrolona USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas cerrado. Proteger de la luz.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
de la luz. ER Pamoato de Pirvinio USP—No secar; determinar volumétri-
camente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el
ER Oxaprozina USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
a temperatura ambiente durante 24 horas antes de usar. Mantener
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
70 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Pantenol Racémico USP—No secar. Mantener el envase ER Pituitaria Posterior USP—No secar antes de usar. Almacenar
herméticamente cerrado. a una temperatura de 08 o inferior. Cada mg representa 2,4 Unidades
ER Pantolactona USP—No secar. Mantener el envase hermética- USP de Pituitaria Posterior de actividad oxitócica y 2,1 Unidades
mente cerrado. Proteger de la luz. USP de Pituitaria Posterior de actividad vasopresora. No congelar.
ER Pantotenato de Calcio USP—Secar la porción a 1058 durante ER Pivalato de Clocortolona USP—Secar la porción a 1058
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Papaı́na USP—No secar antes de usar. Mantener el envase cerrado. Proteger de la luz.
herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un ER Pivalato de Desoxicorticosterona USP—Secar la porción
refrigerador. No abrir mientras está frı́o. a 1058 durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Paraclorofenol USP. herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER Parbendazol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Pivalato de Flumetasona USP—Secar la porción a 1058
herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz.
ER Paricalcitol USP.
ER Plicamicina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que
ER Partenolida USP—No secar antes de usar. Mantener el envase no exceda de 5 mm de mercurio a 258 durante 4 horas antes de usar.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
congelador. Almacenar en un lugar frı́o.
ER Penicilamina USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Polacrilina Potásica USP—Secar la porción a 1058 durante
mente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un lugar frı́o. 6 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Penicilina G Benzatı́nica USP—No secar antes de usar. ER Polidimetilsiloxano USP—No secar antes de usar. Después de
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. abrir la ampolla, almacenar en un recipiente herméticamente cerrado.
Almacenar en un lugar frı́o.
ER Polietileno de Alta Densidad USP—[NOTA—Manejar y
ER Penicilina G Potásica USP—No secar antes de usar. Mantener almacenar el material con cuidado para no rayar las superficies
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en lisas de las tiras.] Preparar las muestras según se indica en los
un lugar frı́o. respectivos Capı́tulos Generales de Pruebas de la USP. No secar.
ER Penicilina G Procaı́nica USP—No secar. Corresponde a la ER Polietileno de Baja Densidad USP—[NOTA—Manejar y
forma monohidratada de Penicilina G Procaı́nica. Mantener el almacenar el material con cuidado para no rayar las superficies
envase herméticamente cerrado. Almacenar en un refrigerador. lisas de las tiras.] Cortar los segmentos con las dimensiones
ER Penicilina G Sódica USP—Secar la porción al vacı́o a 608 necesarias para el montaje en los portamuestras utilizados para
durante 3 horas. Mantener el envase herméticamente cerrado. determinar espectros de reflectancia. Preparar las muestras para
Almacenar en un refrigerador. análisis térmicos con las porciones restantes de las tiras. No secar.
ER Penicilina V USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Poliisobutileno USP.
herméticamente cerrado. ER Polioxilglicéridos de Caprilocaproilo USP—No secar.
ER Penicilina V Potásica USP—No secar antes de usar. Mantener Después de abrir la ampolla, almacenar el material en un recipiente
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en herméticamente cerrado.
un lugar frı́o. ER Polioxilglicéridos de Estearoilo USP—No secar. Mantener el
ER Pentazocina USP—Secar la porción a 608 y a una presión que envase herméticamente cerrado.
no exceda de 5 mm de mercurio hasta peso constante antes de usar. ER Polioxilglicéridos de Lauroilo USP—Almacenar en el envase
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. original y evitar la exposición al aire, al calor y a la humedad.
ER Pentobarbital USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Polioxilglicéridos de Linoleoilo USP—Almacenar en el envase
mente cerrado. original y evitar la exposición al aire, al calor y la humedad.
ER Pentoxifilina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que ER Polioxilglicéridos de Oleoilo USP—No secar. Después de abrir
no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar. la ampolla, almacenar el material en un recipiente herméticamente
ER Perclorato de Potasio USP. cerrado.
ER Perfenazina USP—Secar la porción al vacı́o a 658 durante ER Poloxaleno USP—No secar. Mantener el envase hermética-
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar fresco.
Proteger de la luz. ER Prazicuantel USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que
ER Perflubrón USP—No secar. Después de abrir la ampolla, no exceda de 5 mm de mercurio a 508 sobre pentóxido de fósforo
almacenar en un recipiente herméticamente cerrado. Proteger de la durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
luz. cerrado. Proteger de la luz.
ER Picolinato de Cromo USP—Secar la porción a 1058 durante ER Prednicarbato USP—Mantener el envase herméticamente
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. cerrado, protegido de la luz y almacenar a temperatura ambiente
ER Pilocarpina USP—No secar. Dejar que la ampolla se equilibre controlada.
a temperatura ambiente antes de abrir. ER Prednisolona USP—Corresponde a la forma anhidra. Secar la
ER Pimozida USP—Secar la porción al vacı́o a 808 durante 4 horas porción al vacı́o a 1058 durante 3 horas antes de usar. Mantener el
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
de la luz. ER Prednisona USP—No secar. Mantener el envase hermética-
ER Pindolol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes de mente cerrado.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Prilocaı́na USP.
ER Piperacilina USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas, ER Primidona USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes
determinar el contenido de agua en el momento de usar. Mantener el de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
envase herméticamente cerrado y almacenar en un lugar frı́o y seco, ER Probenecid USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes
protegido de la luz. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Pirazinamida USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice ER Probucol USP—Secar la porción al vacı́o a 808 durante 1 hora
durante 18 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
cerrado. de la luz.
ER Pirimetamina USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas ER Producto de Reacción de Metildopa-Glucosa USP.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
de la luz. ER Progesterona USP—No secar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado. Proteger de la luz.
ER Piroxicam USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 71
ER L-Prolina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes ER Quimotripsina USP—Mantener el envase herméticamente
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. cerrado y almacenar en un refrigerador. Dejar que el contenido
ER Propilenglicol USP—No secar antes de usar. Después de abrir llegue a temperatura ambiente antes de abrir y no secar antes de usar.
la ampolla, transferir el contenido a un recipiente herméticamente Proteger de la luz. Determinar la pérdida por secado en una porción
cerrado. separada en un horno de vacı́o a 608 durante 4 horas.
ER Propilparabeno USP—No secar. Mantener el envase her- ER Quininona USP (C20H22N2O2 322,40)—No secar. Mantener
méticamente cerrado. el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER Propiltiouracilo USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas ER Ramipril USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
de la luz. ER Ramipril Dicetopiperazina USP (C23H30N2O4 398,50)—No
ER Propionato de Clobetasol USP—No secar antes de usar. secar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz. luz. Almacenar en un refrigerador.
ER Propionato de Fluticasona USP [17-propionato de S- ER Rauwolfia Serpentina USP—No secar antes de usar. Mantener
(fluorometil)6a,9a-difluoro-11b,17-dihidroxi-16a-metil-3-oxoan- el envase herméticamente cerrado y almacenar a temperatura
drosta-1,4-dieno-17b-carbotioato] (C25H31F3O5S 500,6). ambiente controlada en un lugar seco.
ER Propionato de Sodio USP—No secar antes de usar. Mantener el ER Recuento de Partı́culas USP (2 blancos y 2 suspensiones)—El
envase herméticamente cerrado. juego consta de 2 viales que contienen una suspensión de esferas de
ER Propionato de Testosterona USP—Secar la porción al vacı́o poliestireno de 15 mm y 2 viales que contienen la fase acuosa sin
sobre gel de sı́lice durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase partı́culas (el blanco). Las partı́culas deben ser resuspendidas antes
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. de usar. No abrir hasta que esté listo para comenzar la prueba, según
se indica en el capı́tulo Partı́culas en Inyecciones h788i. Almacenar
ER Propofol USP—No secar. Una vez abierto, mantener en envases en un lugar fresco. EVITAR LA CONGELACIÓN.
impermeables y resistentes a la luz bajo gas inerte.
ER Repaglinida USP—No secar.
ER Prostaglandina A1 USP—No secar antes de usar. Mantener el
envase herméticamente cerrado. Almacenar en un congelador. ER Reserpina USP—Secar la porción a 608 durante 3 horas antes
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
ER Prostaglandina B1 USP (C20H32O4 336,47)—No secar antes luz.
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en
un congelador. ER Resina de Colestiramina USP—Secar la porción en un tubo
adecuado para secado al vacı́o sobre pentóxido de fósforo a una
ER Punto de Fusión de Acetanilida USP—Secar la porción sobre presión que no exceda de 50 mm de mercurio a 708 durante 16 horas
ácido sulfúrico durante 16 horas antes de usar. Cuando funde por el antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
método de tubo capilar, Clase Ia en el capı́tulo general h741i
Intervalo y Temperatura de Fusión, el intervalo observado cae ER Resina Polacrilex USP—No secar antes de usar. Mantener el
dentro del intervalo de aceptación indicado. Mantener el envase envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado. ER Resorcinol USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER Punto de Fusión de Cafeı́na USP—Secar la porción sobre gel cerrado. Proteger de la luz. Evitar el contacto con metales.
de sı́lice durante 16 horas antes de usar. Cuando funde por el método ER Ribavirina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
de tubo capilar de la USP, Clase Ia del capı́tulo general h741i mente cerrado.
Intervalo y Temperatura de Fusión, el intervalo observado cae ER Riboflavina USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
dentro del intervalo de aceptación indicado. Mantener el envase antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
herméticamente cerrado y protegido de la luz. de la luz.
ER Punto de Fusión de Fenacetina USP—Secar la porción sobre ER Riboflavina Fosfatada USP—Secar la porción a 1058 durante
gel de sı́lice durante 16 horas antes de usar. Cuando funde por el 2 horas. Mantener el envase herméticamente cerrado.
método de tubo capilar de la USP, Clase Ia del capı́tulo general h741i ER Rifabutina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
Intervalo y Temperatura de Fusión, el intervalo observado cae herméticamente cerrado. Almacenar en un congelador.
dentro del intervalo de aceptación indicado. Mantener el envase ER Rifampı́n USP—No secar; determinar la pérdida por secado de
herméticamente cerrado. una porción separada en el momento de usar. Evitar la exposición al
ER Punto de Fusión de Sulfanilamida USP—Secar la porción oxı́geno. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
sobre gel de sı́lice durante 16 horas antes de usar. El intervalo de luz. Almacenar en un lugar frı́o.
fusión es el intervalo de temperatura en el cual la sustancia se fusiona ER Rifampı́n Quinona USP—No secar antes de usar. Mantener el
y funde completamente cuando se prueba por el método de tubo envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
capilar de la USP. Mantener el envase herméticamente cerrado y lugar frı́o y seco.
protegido de la luz.
ER Rimexolona USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante
ER Punto de Fusión de Sulfapiridina USP—Secar la porción 3 horas antes de usar. Proteger de la luz. Mantener el envase
sobre gel de sı́lice durante 16 horas antes de usar. Cuando funde por herméticamente cerrado.
el método de tubo capilar de la USP, Clase Ia del capı́tulo general
Intervalo o Temperatura de Fusión h741i, el intervalo observado cae ER Ritonavir USP.
dentro del intervalo de aceptación indicado. Mantener el envase ER Roxarsona USP—Secar la porción a 1008 durante 6 horas antes
herméticamente cerrado. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Punto de Fusión de Vainillina USP—No secar. Cuando funde ER Rutina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
por el método de tubo capilar de la USP, Clase Ia del capı́tulo general herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
Intervalo o Temperatura de Fusiónh741i, el intervalo observado cae frı́o.
dentro del intervalo de aceptación indicado. Mantener el envase ER Sacarato de Calcio USP—No secar antes de usar. Mantener el
herméticamente cerrado y protegido de la luz. envase herméticamente cerrado.
ER Quazepam USP—[¡ADVERTENCIA! Tóxico para la Repro- ER Sacarina USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ducción.] Secar la porción a 1058 durante 4 horas. Mantener el cerrado.
envase herméticamente cerrado. ER Sacarina Cálcica USP—Secar a 1058 durante 2 horas antes de
ER Quercetina USP—No secar. Corresponde a la forma dihidrato. usar.
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Sacarina Sódica USP—Secar a 1058 durante 2 horas antes de
Almacenar en un congelador. usar.
ER Sacarosa USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado.
72 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Sal 1,2-Difeniletilamı́nica del Ácido 3-Mercapto-2- ER Succinato de Doxilamina USP—No secar. Mantener el envase
metilpropanoico USP (C4H7O2S C14H16N 317,45)—No secar herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Succinato de Loxapina USP—Secar la porción a 1058 durante
ER Sal de Amonio de Cilastatina USP—No secar antes de usar. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Mantener el envase herméticamente cerrado y almacenar en un ER Succinato de Metoprolol USP—No secar. Mantener el envase
congelador bajo nitrógeno. herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Sales Biliares USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas ER Succinato de Sumatriptán USP [butandioato de 3-[2-
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. (dimetilamino)etil]-N-metil- 1H-indol-5-metansulfonamida (1 : 1)]
[Precaución—No inhalar las partı́culas suspendidas en el aire.] (C14H21N3O2S C4H6O4 413,49)—No secar. Mantener el envase
ER Salicilamida USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
18 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. refrigerador.
ER Salicilato de Fisostigmina USP—No secar. Mantener el envase ER Sucralosa USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. cerrado.
ER Salicilato de Magnesio USP—Secar la porción a 1058 durante ER Sulbactam USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. herméticamente cerrado y almacenar en un congelador.
ER Salicilato de Sodio USP. ER Sulfabenzamida USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
ER Salsalato USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. de la luz.
ER Secobarbital USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante ER Sulfacetamida USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
18 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Selenometionina USP. de la luz.
ER Senósidos USP—No secar antes de usar. Secar una porción ER Sulfacetamida Sódica USP—Determinar volumétricamente el
separada al vacı́o a 1008 hasta peso constante para obtener la pérdida contenido de agua en el momento de usar. Este material es muy
por secado para análisis cuantitativos. Mantener el envase higroscópico. Almacenar sobre gel de sı́lice. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Este material es extremadamente higros- herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
cópico. fresco.
ER L-Serina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de ER Sulfaclorpiridazina USP—Secar la porción a 1058 durante
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
protegido de la luz.
ER Sevoflurano USP—No secar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado. Almacenar en un refrigerador. ER Sulfadiazina USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Silibina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase de la luz.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
congelador. ER Sulfadiazina de Plata USP—Secar la porción a 1058 durante
1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Silidianina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase Proteger de la luz.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un
congelador. ER Sulfadimetoxina USP—No secar. Mantener el envase her-
méticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Simeticona USP—Mezclar bien antes de usar. Mantener el
envase herméticamente cerrado. Después de abrir, almacenar en una ER Sulfadoxina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
atmósfera de gas inerte. mente cerrado. Proteger de la luz.
ER Simvastatina USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ER Sulfamerazina USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en un antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
congelador. de la luz.
ER Sincalida USP. ER Sulfametazina USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER b-Sitosterol USP—No secar. Para aplicaciones cuantitativas, de la luz.
determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento de
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Este material es ER Sulfametizol USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
higroscópico. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
de la luz.
ER Sulfametoxazol USP—Secar la porción a 1058 durante 4 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
Agregar lo siguiente: de la luz.
~ ER Sulfanilamida USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
ER Solución de Calcitrol USP—Almacenar en un refrigerador. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
Proteger de la luz.~USP30 protegido de la luz.
ER Solución de Isómero Eritro de Clorhidrato de Metilfenidato ER Sulfapiridina USP—No secar. Mantener el envase hermética-
USP—Esta solución contiene 0,5 mL de isómero eritro de mente cerrado. Proteger de la luz.
clorhidrato de metilfenidato por mL en metanol. Almacenar en un
refrigerador. ER Sulfaquinoxalina USP.
ER Solución de Paricalcitol USP. ER Sulfasalazina USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Somatropina USP—Almacenar en un envase impermeable en de la luz.
un congelador. Cuando se reconstituye, almacenar en un lugar frı́o y
usar dentro de las 24 horas siguientes. ER Sulfatiazol USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
ER 1,4-Sorbitán USP (C6H12O5 164,16)—No secar antes de luz.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Sulfato de Albuterol USP—No secar antes de usar. Mantener el
ER Sorbitol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
herméticamente cerrado.
ER Sulfato de Aminopentamida USP—Secar a 1058 durante
ER Subsalicilato de Bismuto USP—No secar. Mantener el envase 4 horas antes de usar.
herméticamente cerrado.
ER Sulfato de Atropina USP—No secar antes de usar. Determinar
ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP—No secar. Mantener volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 73
ER Sulfato de Bleomicina USP—Secar la porción al vacı́o a una ER Sulfato de Paromomicina USP—Secar la porción al vacı́o
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a temperatura ambiente a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante
durante 3 horas en un desecador que contenga pentóxido de fósforo 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
antes de usar. Almacenar en un congelador, protegido de la luz y Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o.
dejar que llegue a temperatura ambiente antes de abrir. Este material ER Sulfato de Penbutolol USP—Secar la porción a 1058 durante
es muy higroscópico. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
ER Sulfato de Capreomicina USP—Secar la porción al vacı́o a una protegido de la luz.
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 1008 durante 4 horas ER Sulfato de Polimixina B USP—Secar la porción al vacı́o a una
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas
de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Sulfato de Codeı́na USP—Secar la porción a 1058 durante de la luz. Almacenar en un lugar frı́o.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Sulfato de Pseudoefedrina USP—Secar la porción a 1058
Proteger de la luz. durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Sulfato de Colistina USP—Secar la porción al vacı́o a una cerrado. Proteger de la luz.
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas ER Sulfato de Quinidina USP—No secar. Corresponde a la forma
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger dihidratada del sulfato de quinidina. Determinar volumétricamente el
de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase
ER Sulfato de Dextroanfetamina USP—Secar la porción a 1058 herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Sulfato de Quinina USP—No secar. Corresponde a la forma
cerrado. dihidratada del sulfato de quinina. Mantener el envase hermética-
ER Sulfato de Dihidroestreptomicina USP—Secar la porción al mente cerrado. Proteger de la luz.
vacı́o a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 1008 E R S u l f a t o d e S i s o m i c in a U S P — N o s e c a r.
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente [Precaución: Higroscópico.] Corregir el contenido de volátiles
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. según se determine al calentar una porción separada de 100 mg
ER Sulfato de Efedrina USP—Secar la porción a 1058 durante a 1108 a una presión de 5 mm de mercurio o menos durante 3 horas.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y
Proteger de la luz. almacenar en un lugar frı́o.
ER Sulfato de Estreptomicina USP—Secar la porción al vacı́o ER Sulfato de Terbutalina USP—Secar la porción a 1058 durante
a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz y almacenar a temperatura ambiente controlada.
Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. ER Sulfato de Vinblastina USP—Equilibrar a temperatura
ER Sulfato de Fenelzina USP—Secar la porción a una presión que ambiente antes de abrir. Después de abrir la ampolla, dejar que el
no exceda de 5 mm de mercurio sobre gel de sı́lice a 808 durante contenido se equilibre durante 30 minutos a humedad ambiente antes
2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. del pesado para análisis. Usando el método de análisis termogravi-
Proteger de la luz y el calor. métrico, calentar una porción separada de 10 mg equilibrada a 58 por
ER Sulfato de Gentamicina USP—Secar la porción al vacı́o a una minuto entre temperatura ambiente y 2008 bajo un flujo de nitrógeno
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 1108 durante 3 horas de 40 mL por minuto (ver Análisis Térmico h891i). A partir del
antes de usar. Manipular el material seco rápidamente y en una termograma, determinar la pérdida de peso acumulada entre la
atmósfera seca. Mantener el envase herméticamente cerrado. temperatura ambiente y un punto de la meseta antes de que se
Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. indique la descomposición (aproximadamente a 1608). Mantener el
ER Sulfato de Guanadrel USP—Secar la porción a temperatura envase herméticamente cerrado, protegido de la luz y almacenar en
ambiente a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio durante un lugar frı́o.
16 horas en el momento de usar para análisis cuantitativos. Mantener ER Sulfato de Vincristina USP—Almacenar la ampolla sin abrir en
el envase herméticamente cerrado. un lugar frı́o. Después de abrir la ampolla, dejar que el contenido se
ER Sulfato de Hidroxicloroquina USP—Secar la porción a 1058 equilibre durante 30 minutos a humedad ambiente antes del pesado
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente para análisis. Usando el método de análisis termogravimétrico,
cerrado. Proteger de la luz. calentar una porción separada de 10 mg equilibrada a 58 por minuto
entre temperatura ambiente y 2008 bajo un flujo de nitrógeno de 40
ER Sulfato de Hiosciamina USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 mL por minuto. A partir del termograma, determinar la pérdida de
durante 16 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente peso acumulada entre la temperatura ambiente y un punto de la
cerrado. Proteger de la luz. meseta antes de que se indique la descomposición (aproximadamente
ER Sulfato de Kanamicina USP—No secar antes de usar. a 1608). Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la
Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. luz y almacenar en un lugar frı́o.
Almacenar en un lugar frı́o. ER Sulfinpirazona USP—No secar. Mantener el envase herméti-
ER Sulfato de Metaproterenol USP—Secar la porción a 1058 camente cerrado.
durante 1 hora antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Sulfisoxazol USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas
cerrado. Proteger de la luz. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
ER Sulfato de Morfina USP—Corresponde a la forma pentahi- de la luz.
dratada. No secar antes de usar, excepto cuando se indica para ER Sulfosalicilato de Meclociclina USP—No secar; determinar
cumplir con las normas oficiales. Determinar volumétricamente el volumétricamente el contenido de agua en el momento de usar.
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Sulfóxido de Perfenazina USP—No secar. Mantener el envase
ER Sulfato de Neomicina USP—Secar la porción al vacı́o a una herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger ER Sulfóxido de Pergolida USP [(8b)-8-[(metilsulfinil)metil]-6-
de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. propil-D-ergolina]—No secar.
ER Sulfato de Netilmicina USP—No secar antes de usar; ER Sulindaco USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 durante
determinar el contenido de sustancias volátiles calentando una 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
porción separada de 100 mg a 1108 a una presión de 5 mm de ER Sulisobenzona USP.
mercurio o inferior durante 3 horas. Mantener el envase hermética- ER Sumatriptán USP—No secar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un congelador. mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
ER Sulfato de Oxiquinolina USP—No secar. Mantener el envase ER Suprofeno USP—Secar la porción al vacı́o a 708 durante
herméticamente cerrado. 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
74 h11i Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 30
ER Tabletas de Ácido Salicı́lico USP (Calibrador de Disolución, para el montaje en los portamuestras utilizados para determinar
No desintegrables)—La etiqueta indica el peso nominal de cada espectros de reflectancia. Preparar las muestras para análisis térmicos
tableta. Utilizar únicamente tabletas enteras—se suministran tabletas con las porciones restantes de las tiras. No secar.
adicionales. Retirar el polvo de la superficie con un pincel suave ER Testolactona USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 durante
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
Almacenar en un desecador o en un lugar seco a temperatura Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
ambiente. ER Testosterona USP—Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido
ER Tabletas de Liberación Prolongada de Clorfeniramina USP de fósforo durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
(Calibrador para la Liberación de Fármacos, Unidad Simple)—Usar herméticamente cerrado.
junto con la prueba de Liberación de Fármacos h724i. La etiqueta ER 8-Tetrahidrocannabinol USP—Almacenar en un refrigerador,
indica el peso nominal de maleato de clorfeniramina en cada tableta. protegido de la luz.
Usar sólo tabletas enteras. Eliminar el polvo de la superficie con un
pincel suave antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER 9-Tetrahidrocannabinol USP—Almacenar en un refrigerador,
cerrado y evitar la exposición a humedad excesiva. protegido de la luz.
ER Tabletas de Prednisona USP (Calibrador de Disolución, ER 3,3’-5,5’-Tetraisopropildifenol USP.
Desintegrable)—La etiqueta indica el peso nominal de prednisona ER Tiabendazol USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 durante
en cada tableta. Usar sólo tabletas enteras. Retirar el polvo de la 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
superficie con un pincel blando antes de usar. Mantener el envase ER Tiacetarsamida USP.
herméticamente cerrado. Almacenar en un desecador o en un lugar ER Tiamulina USP.
seco a temperatura ambiente.
ER Ticarcilina Monosódica Monohidrato USP (C15H15N2Na
ER Tagatosa USP—Secar una porción a 1028durante 2 horas antes O6S2 H2O 424,43)—No secar antes de usar. Mantener el envase
de usar. herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar
ER Talidomida USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante frı́o.
2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Tilmicosina USP—Dejar que el vial alcance la temperatura
Proteger de la luz. ambiente antes de abrirlo. Abrir y dejar que se equilibre durante 30
ER Tartrato de Butorfanol USP—No secar; determinar volu- minutos con la humedad ambiente antes del pesado para análisis.
métricamente el contenido de agua en el momento de usar. Mantener Determinar volumétricamente el contenido de agua en el momento
el envase herméticamente cerrado. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la
ER Tartrato de Ergotamina USP—Secar la porción al vacı́o a 608 luz. Almacenar en un refrigerador.
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente ER Tilosina USP.
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o. ER Tiloxapol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
ER Tartrato de Fendimetrazina USP—Secar la porción a 1058 herméticamente cerrado.
hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase hermética- ER Timerosal USP—Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido de
mente cerrado. fósforo hasta peso constante antes de usar. Mantener el envase
ER Tartrato de Levorfanol USP—Corresponde a la forma herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
dihidratada. No secar; determinar volumétricamente el contenido ER Timol USP.
de agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. ER Tinidazol USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar fresco.
ER Tartrato de Metoprolol USP—Mantener el envase hermética-
mente cerrado. Proteger de la luz. ER Tioconazol USP—No secar antes de usar. Mantener el envase
herméticamente cerrado.
ER Tartrato de Morantel USP—No secar. Mantener el envase
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Después de abrir el ER Tioguanina USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante
envase, almacenar en un desecador. 5 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Tartrato de Tilosina USP—Secar la porción al vacı́o a 608 ER Tiopental USP—Secar la porción a 1058 durante 2 horas antes
durante 3 horas antes de usar. de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Tartrato de Trimeprazina USP—Secar la porción al vacı́o ER Tioridazina USP—Secar la porción al vacı́o a 508 durante
a 608 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Proteger de la luz.
ER Tartrato de Vinorelbina USP—No secar. Mantener bajo gas ER Tiostreptón USP—Secar la porción al vacı́o a una presión que
inerte con el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar.
Almacenar en un congelador. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
Almacenar en un lugar frı́o.
ER Taurina USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz. ER Tiotepa USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante 24
horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Tebutato de Prednisolona USP—Secar la porción al vacı́o Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador.
a una presión que no exceda de 5 mm de mercurio a 1058 durante
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Tiotixeno USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
cerrado. Proteger de la luz.
ER Temazepam USP—No secar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado. ER (E)-Tiotixeno USP—Secar la porción al vacı́o a 1008 durante
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y
ER Teofilina USP—Este material corresponde a la forma anhidra de protegido de la luz.
la teofilina. Secar la porción a 1058 durante 4 horas antes de usar.
Mantener el envase herméticamente cerrado. ER L-Tirosina USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
cerrado.
ER Terconazol USP—No secar. Mantener el envase hermética-
mente cerrado. ER Tizanidina USP.
ER Tereftalato de Polietileno USP—[NOTA—Manejar y almacenar ER Tobramicina USP—No secar. Almacenar en un refrigerador. El
el material con cuidado para rayar las superficies lisas de las tiras.] material es higroscópico.
Cortar los segmentos con las dimensiones necesarias para el montaje ER Tolazamida USP—Secar la porción a una presión que no
en los portamuestras utilizados para determinar espectros de exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de usar.
reflectancia. Preparar las muestras para análisis térmicos con las Mantener el envase herméticamente cerrado.
porciones restantes de las tiras. No secar. ER Tolbutamida USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
ER Tereftalato G de Polietileno USP—[NOTA—Manejar y antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
almacenar el material con cuidado para rayar las superficies lisas ER Tolcapona USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
de las tiras.] Cortar los segmentos con las dimensiones necesarias cerrado. Proteger de la luz.
USP 30 Requisitos Generales / h11i Estándares de Referencia USP 75
ER Tolmetina Sódica USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Tropicamida USP—Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. de fósforo a 808 durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase
ER Tolnaftato USP—Secar la porción al vacı́o a 658 durante herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Ubidecarenona USP—No secar. Mantener el envase herméti-
Almacenar en un refrigerador. camente cerrado. Proteger de la luz.
ER o-Toluenosulfonamida USP (C7H9NO2S 171,22)—No secar ER Ubidecarenona para Aptitud del Sistema USP—No secar.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Mantener el envase herméticamente cerrado y protegido de la luz.
ER p-Toluenosulfonamida USP (C7H9NO2S 171,22)—No secar ER Uracilo Arabinósido USP—No secar antes de usar. Mantener el
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz.
ER Torsemida USP (Forma 1)—No secar antes de usar. Mantener el ER Urea USP—No secar.
envase herméticamente cerrado. Proteger de la luz. ER Urea C 13 USP—Secar la porción al vacı́o a 408 durante 3 horas
ER Tosil Pleuromutilina USP—(CAMBIO DE NOMBRE) Ver ER antes de usar. Conservar en recipientes impermeables, resistentes a la
Compuesto Relacionado A de Tiamulina USP. luz.
ER Tosilato de Bretilio USP—Secar la porción al vacı́o a 758 ER Ursodiol USP—Secar a 1058 durante 3 horas antes de usar.
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente Mantener el envase herméticamente cerrado.
cerrado. ER Vainillina USP—Secar la porción sobre gel de sı́lice durante
ER Transplatino USP—No secar antes de usar. Mantener el envase 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
herméticamente cerrado. Proteger de la luz. Proteger de la luz.
ER Trenbolona USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Valerato de Betametasona USP—No secar. Mantener el envase
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. herméticamente cerrado.
ER L-Treonina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes ER Valerato de Estradiol USP—No secar; usar tal como se
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. encuentra. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de
ER Tretinoı́na USP—No secar antes de usar. Almacenar en un la luz. Almacenar en un refrigerador.
congelador, protegido de la luz, dejar que llegue a temperatura ER Valerato de Hidrocortisona USP—Secar la porción a 1058
ambiente antes de abrir y usar el contenido sin demora después de durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
abrir. cerrado.
ER Triacetina USP—No secar antes de usar. Después de abrir la ER Valeriana en Polvo USP.
ampolla, almacenar en un envase herméticamente cerrado. Evitar el ER L-Valina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas antes de
contacto con metal. usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
ER Triamcinolona USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante ER Valrubicina USP—Secar al vacı́o sobre pentóxido de fósforo
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. a 808 durante 4 horas antes de usar.
Este material es higroscópico. Proteger de la humedad.
ER Triamtereno USP—Secar al vacı́o a 1058 durante 2 horas antes
de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger de la Agregar lo siguiente:
luz.
ER Triazolam USP—No secar antes de usar. Mantener el envase ~
ER Valsartán USP—No secar.~USP30
herméticamente cerrado.
ER Vasopresina USP.
ER Triclormetiazida USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Verde de Indocianina USP—Secar la porción al vacı́o a 508
durante 3 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Tricloroaminoplatinato de Potasio USP (Cl3H3KNPt cerrado.
357,58)—Secar la porción al vacı́o a temperatura ambiente sobre
pentóxido de fósforo en un desecador durante 20 horas antes de usar. ER Verteporfina USP (C41H42N4O8 718,79)—Es una mezcla del
Mantener el envase herméticamente cerrado. éster trans-(+) 18-etenil-4,4a-dihidro-3,4-bis(metoxicarbonil)-
4a,8,14,19-tetrametil 9-metı́lico del ácido 23H,25H-benzo[b]porfin-
ER Triclosán USP—No secar. Mantener el envase herméticamente 9,13-dipropanoico y del éster trans-(+) 18-etenil-4,4a-dihidro-3,4-
cerrado. Proteger de la luz. bis(metoxicarbonil)-4a,8,14,19-tetrametil 13-metı́lico del ácido
ER Trietioduro de Galamina USP—Secar la porción a 1008 23H,25H-benzo[b]porfino-9,13-dipropanoico. Determinar volu-
durante 4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente métricamente el contenido de agua en el momento de usar.
cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar fresco. Conservar en envases impermeables y almacenar en un congelador.
ER Trifluridina USP—Secar la porción al vacı́o a 1058 durante ER Vidarabina USP—Corresponde a la forma monohidratada de la
4 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado y Vidarabina. No secar antes de usar. Mantener el envase hermética-
protegido de la luz. mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o.
ER Trimetoprima USP—No secar. Mantener el envase hermética- ER Violeta de Genciana USP—No secar; determinar el contenido
mente cerrado. Proteger de la luz. de agua en el momento de usar. Mantener el envase herméticamente
ER Trioxaleno USP—No secar. Mantener el envase hermética- cerrado. Almacenar en un lugar fresco.
mente cerrado. Proteger de la luz. ER Vitamina A USP—Para usar, cortar el extremo de la cápsula,
ER Tripsina Cristalizada USP—Dejar que el envase llegue expulsar el contenido y pesar la solución. Desechar la porción no
a temperatura ambiente antes de abrir y no secar antes de usar. utilizada después de abrir cada cápsula. Mantener el envase
Determinar la pérdida por secado en una porción separada al vacı́o herméticamente cerrado y almacenar en un lugar fresco y seco
a 608 durante 4 horas. Mantener el envase herméticamente cerrado, o en un refrigerador, protegido de la luz.
protegido de la luz y el calor y almacenar en un refrigerador. ER Vitexina USP—No secar. Mantener el envase herméticamente
ER L-Triptófano USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un lugar frı́o y seco.
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. ER Warfarina USP—Corresponde a la forma ácida de la Warfarina.
ER Trolamina USP—No secar. Secar la porción al vacı́o sobre pentóxido de fósforo durante 4 horas
ER Troleandomicina USP—Secar la porción al vacı́o a una presión antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. Proteger
que no exceda de 5 mm de mercurio a 608 durante 3 horas antes de de la luz.
usar. Mantener el envase herméticamente cerrado, protegido de la luz ER Xantona USP (C13H8O2 196,21)—No secar. Mantener el
y almacenar en un lugar fresco. envase herméticamente cerrado.
ER Trometamina USP—Secar la porción a 1058 durante 3 horas ER Xilazina USP—Secar la porción al vacı́o a 608 durante 4 horas
antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado.
76 h16i Métodos Automatizados de Análisis / Aparatos USP 30
ER Xilitol USP—No secar. Determinar volumétricamente el idénticas durante intervalos de tiempo idénticos. La excesiva
contenido de agua en el momento de usar. Mantener el envase variabilidad en la respuesta de las preparaciones estándar indica
herméticamente cerrado. que el sistema analı́tico tiene fallas en su funcionamiento y que los
ER Xilosa USP—Secar la porción al vacı́o a 608 hasta peso resultados de las pruebas son, por lo tanto, inválidos. Sin embargo,
constante antes de usar. Mantener el envase herméticamente cerrado. cuando los sistemas automatizados demuestran operar con fiabilidad,
ER Yoduro de Isopropamida USP—Secar la porción al vacı́o a 608 la precisión del método automatizado puede superar la del
durante 2 horas antes de usar. Mantener el envase herméticamente procedimiento manual empleando los mismos fundamentos quı́mi-
cerrado. Proteger de la luz. cos.
Muchos de los métodos manuales ofrecidos en esta Farmacopea
ER Zalcitabina USP—No secar. Mantener el envase hermética- pueden adaptarse para su uso en equipos automatizados que
mente cerrado, protegido de la luz. incorporen analizadores discretos o sistemas de flujo continuo y
ER Zidovudina USP—No secar. Mantener el envase hermética- que operan en gran variedad de condiciones. Por otra parte, un
mente cerrado. Proteger de la luz. Almacenar en un refrigerador. esquema analı́tico diseñado para un sistema automatizado especı́fico
ER Zileutón USP—No secar. Mantener el envase herméticamente puede no resultar fácilmente transferible para su uso en un
cerrado. Almacenar a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Proteger procedimiento manual o en otros tipos de equipo automatizado.
de la luz. El aparato necesario para los métodos manuales es, en general,
menos complicado que el aparato de sistemas automatizados, incluso
aquellos sistemas utilizados para la medida automatizada directa de
un analito único (es decir, la sustancia que se determina o analiza) en
una mezcla binaria. Sin embargo, debido a su versatilidad, los
sistemas automatizados diseñados para la rápida determinación de
Equipos para Pruebas y una sustancia especifica, a menudo pueden modificarse fácilmente
mediante la adición de módulos y accesorios adecuados que
Valoraciones permiten la determinación de una o más sustancias adicionales en
una forma farmacéutica. Dichos sistemas extendidos se han
utilizado, por ejemplo, en el análisis automatizado de artı́culos que
contienen tanto estrógenos como progestágenos.
Los diagramas pertinentes exhibidos en este capı́tulo representan
ejemplos de métodos automatizados. Los diagramas de los métodos
oficiales se reproducen en este capı́tulo y no en las monografı́as
individuales. Las descripciones de los detalles de procedimiento en
estos métodos ejemplifican el enfoque general en el análisis
automatizado aplicable a las formas farmacéuticas. Debe señalarse
que los diagramas con detalle minucioso son una parte indispensable
de las instrucciones para realizar el análisis.
h16i MÉTODOS
AUTOMATIZADOS DE ANÁLISIS DIAGRAMAS
Los diagramas que se muestran a continuación vienen ordenados
en orden alfabético según el nombre del fármaco mencionado en
Cuando un número lo suficientemente grande de unidades primer lugar, en el caso de que el diagrama sea para un
similares van a someterse habitualmente al mismo tipo de examen, procedimiento de un artı́culo especı́fico. En el caso de que no
los métodos automatizados de análisis pueden resultar mucho más haya procedimiento alguno en este capı́tulo para un diagrama
eficaces y precisos que los métodos manuales. Dichos métodos particular, se hace referencia a la monografı́a nombrada.
automatizados han demostrado ser especialmente útiles en la prueba
de la uniformidad de contenido de tabletas y cápsulas, y en la
ejecución de métodos que exigen condiciones experimentales ANTIBIÓTICOS—VALORACIÓN CON
controladas con exactitud. Muchas instalaciones de fabricantes, HIDROXILAMINA
ası́ como los laboratorios de las agencias reguladoras, han
encontrado cómodo utilizar métodos automatizados como alter- El procedimiento que se indica a continuación puede aplicarse
nativas a los métodos Farmacopeicos (ver Procedimientos en para el análisis de aquellos antibióticos Farmacopeicos, como
Pruebas y Valoraciones en Advertencias y Requisitos Generales). cefalosporinas y penicilinas, que poseen estructura beta-lactámica.
Además de la ejecución experimental, el sistema de detección y Aparato—Analizador automático que consiste en (1) un
cálculo de resultados para métodos automatizados a menudo se ha muestreador de lı́quidos, (2) una bomba dosificadora, (3) espec-
computarizado. trofotómetros adecuados equipados con celdas de flujo afines y
Antes de adoptar como alternativa el uso de un método capacidad de análisis a 480 nm, (4) un medio de registro de las
automatizado para la prueba de un artı́culo, se advierte que se medidas espectrofotométricas o computadora para recuperación y
debe establecer que los resultados obtenidos por el método cálculo de datos y (5) un sistema de conexiones compuesto por los
automatizado son equivalentes en exactitud y precisión a los componentes ilustrados en el diagrama adjunto pertinente.
obtenidos mediante el método Farmacopeico prescrito, teniendo en Reactivos—
cuenta el principio adicional establecido en las Advertencias y
Requisitos Generales que dice ‘‘si surgieran diferencias o en el caso Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina—Disolver 20 g de
de controversia, solamente el resultado obtenido por el procedi- clorhidrato de hidroxilamina en 5 mL de solución de polioxietilén
miento dado en esta Farmacopea será el que prevalezca.’’ (23) lauril éter (1 en 1000) y agregar agua hasta obtener 1000 mL.
Es necesario realizar un seguimiento continuo del desempeño del Solución Amortiguadora de Acetato—Disolver 173 g de hidróxido
sistema analı́tico automatizado mediante el análisis de preparaciones de sodio y 20,6 g de acetato de sodio en agua hasta obtener 1000 mL.
estándar de composición conocida intercaladas frecuentemente entre Diluir 75 mL de esta solución con agua hasta 500 mL y mezclar.
las preparaciones de prueba. Cuando se utilizan disolventes Solución de Nitrato Férrico—Suspender 233 g de nitrato férrico
inmiscibles en los aparatos automatizados para extracciones rápidas, en aproximadamente 600 mL de agua, agregar 2,8 mL de ácido
a menudo se separan para su análisis antes de obtener la extracción sulfúrico, mezclar hasta que se disuelva el nitrato férrico, agregar
completa y las reacciones quı́micas utilizadas en los métodos 1 mL de polioxietilén (23) lauril éter, diluir con agua hasta 1000 mL
automatizados rara vez son estequiométricas. Tanto la exactitud y mezclar.
como la precisión de las determinaciones dependen del ajuste preciso Estándares de Referencia USP h11i—Utilizar el Estándar de
del equipo, mantenido de modo tal que todas las preparaciones Referencia USP según se indica en la monografı́a individual.
estándar y de prueba se exponen a manipulaciones fı́sicas y quı́micas
USP 30 Aparatos / h16i Métodos Automatizados de Análisis 77
Diagrama para el Paso de la Determinación Automatizada de Aspirina en la Prueba de Disolución de Tabletas de Aspirina, Alúmina y Óxido de
Magnesio
C, en mg por mL, de la Preparación de Valoración. Calcular la Solución de Ácido Acético 3%—Transferir 30 mL de ácido acético
cantidad, en mg, de C6H8O6 en la porción de lı́quidos, de tabletas glacial a un matraz volumétrico de 1000 mL que contenga
o de cápsulas tomada, mediante la fórmula adecuada: aproximadamente 300 mL de agua. Diluir a volumen con agua y
Para Lı́quidos: 5C/V en donde V es el volumen, en mL, de mezclar.
preparación lı́quida tomada para preparar la Preparación de Preparaciones Estándar—
Valoración. Solución Madre del Estándar—Transferir una cantidad pesada con
Para Tabletas o Cápsulas: 12,5C. exactitud de 1,3080 g de yoduro de potasio anteriormente secada
durante 24 horas a 1058, a un matraz volumétrico de 1000 mL. Diluir
a volumen con agua y mezclar para obtener una solución con
VALORACIÓN DE YODURO concentración de yoduro de 1000 mg por mL.
Solución Estándar Intermedia—Diluir cuantitativamente un volu-
Aparato—Analizador automático que consiste en (1) un men adecuado de Solución Madre del Estándar con agua para
muestreador de lı́quidos, (2) una bomba dosificadora, (3) un baño obtener una solución con una concentración de yoduro de 1 mg por
de calentamiento, (4) un colorı́metro adecuado equipado con una mL.
celda de flujo de 2,0 6 50 mm y capacidad de análisis a 420 nm, (5) Preparaciones Estándar de Trabajo—Transferir 2,0; 4,0; 6,0; 8,0
un medio de registro de medidas colorimétricas y (6) un colector que y 10,0 mL de Solución estándar intermedia a matraces volumétricos
consta de los componentes que se ilustran en el diagrama adjunto de 100 mL separados. Agregar 5 mL de Solución de Ácido Acético
pertinente. 3%. Diluir el contenido de cada matraz a volumen con agua y
Reactivos— mezclar para obtener las Preparaciones Estándar A, B, C, D y E con
Solución Portadora de Ácido Acético—Transferir 3,0 mL de ácido concentraciones conocidas de yoduro de aproximadamente 0,02 mg
acético glacial a un matraz volumétrico de 2000 mL que contenga por mL, 0,04 mg por mL, 0,06 mg por mL, 0,08 mg por mL y 0,1 mg
aproximadamente 800 mL de agua. Agregar 2 mL de polioxietilén por mL, respectivamente.
(23) lauril éter y diluir a volumen con agua. Preparación de Valoración—
Solución de Agente Tensoactivo—Preparar una solución de Para Preparaciones Lı́quidas—Transferir un volumen medido
polioxietilén (23) lauril éter al 30% fundiendo 150 g en un recipiente con exactitud de la preparación lı́quida, equivalente a 16 mg de
en un baño de vapor y agregando lentamente aproximadamente 250 yoduro, a un matraz volumétrico de 200 mL. Agregar 10 mL de
mL de agua mezclando continuamente. Enfriar y diluir con agua para Solución de Ácido Acético 3% para disolver, diluir a volumen con
obtener 500 mL. agua desionizada, mezclar y filtrar. Transferir 10,0 mL de esta
Solución de Ácido Arsenioso—Transferir 19,6 g de trióxido de solución a un matraz volumétrico de 100 mL, agregar 5,0 mL de
arsénico y 14,0 g de hidróxido de sodio a un matraz volumétrico de Solución de Ácido Acético 3%, diluir a volumen con agua
2000 mL. Agregar aproximadamente 150 mL de agua y mezclar para desionizada, mezclar y filtrar para obtener una solución con una
disolver. Diluir con agua hasta un volumen aproximado de 800 mL y concentración de yoduro de aproximadamente 0,08 mg por mL.
agregar 66 mL de ácido sulfúrico. Enfriar a temperatura ambiente. Para Preparaciones en Tabletas—Pesar y pulverizar finamente no
Transferir 50,0 g de cloruro de sodio a la solución y mezclar hasta menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo pesada con
disolver. Agregar 2 mL de Solución de Agente Tensoactivo, diluir exactitud, que equivalga aproximadamente a 250 mg de yoduro, a un
a volumen con agua, mezclar y filtrar. matraz volumétrico de 250 mL. Agregar 100 mL de ácido
Solución de Sulfato Cérico Amónico—Transferir 12,65 g de clorhı́drico 1 N y mezclar con ayuda de ultrasonido durante 30
sulfato cérico amónico a un matraz volumétrico de 1000 mL. minutos. Diluir con agua a volumen, mezclar y filtrar. Transferir 8,0
Agregar aproximadamente 700 mL de agua seguidos de 100 mL de mL de la solución filtrada a un matraz volumétrico de 100 mL,
ácido sulfúrico, agitando por rotación moderada para mezclar. agregar 5 mL de Solución de Ácido Acético 3%, diluir a volumen con
Calentar para disolver y enfriar a temperatura ambiente. Agregar agua y mezclar para obtener una solución con una concentración de
1 mL de Solución de Agente Tensoactivo, diluir a volumen con agua, yoduro de aproximadamente 0,08 mg por mL.
mezclar y filtrar.
80 h16i Métodos Automatizados de Análisis / Aparatos USP 30
Diagrama para la Determinación Automatizada de Etilsuccinato de Eritromicina en Disolución de Tabletas de Etilsuccinato de Eritromicina
Etiquetadas como Masticables
Diagrama para Prueba Automatizada de Liberación de Fármacos y Uniformidad de Contenido para Cápsulas de Clorhidrato de Propranolol
e Hidroclorotiazida de Liberación Prolongada
USP 30 Aparatos / h16i Métodos Automatizados de Análisis 83
Diagrama para Prueba Automatizada de Uniformidad de Contenido de Tabletas de Reserpina, Clorhidrato de Hidralazina e Hidroclorotiazida
84 h21i Termómetros / Aparatos USP 30
*
Ver ‘‘Comprobación de Aparatos Volumétricos de Vidrio,’’ N.B.S. Circ.
602, 18 de abril, 1959 y NTIS COM-73-10504, National Technical
Information Service (Servicio Nacional de Información Técnica).
{ Ver ASTM E 288, Fed. Spec. NNN-F-289 e Estándar ISO 384.
USP 30 Aparatos / h51i Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 85
Matraces Volumétricos
Pipetas de Transferencia
Buretas
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado técnica de siembra a partir de cultivo madre. Los cultivos recibidos
puede mantenerse al mı́nimo si los ingredientes activos de la de ATCC se deben revivir de acuerdo con las instrucciones. Si han
formulación poseen eficacia antimicrobiana intrı́nseca. La eficacia sido desarrollados en caldo, las células son precipitadas mediante
antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida por la centrifugación. Resuspender en 1/20 el volumen del caldo de
adición de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para mantenimiento nuevo y agregar un volumen igual de 20% (v/v en
todas las inyecciones dispensadas en envases multidosis o para otros agua) de glicerol estéril. Las células desarrolladas en agar pueden
productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia rasparse de la superficie y transferirse al caldo con glicerol al 10%.
antimicrobiana debe ser demostrada para formas farmacéuticas Dispensar alı́cuotas pequeñas de la suspensión en viales estériles.
multidosis orales y tópicas y para otras formas farmacéuticas, como Almacenar los viales en nitrógeno lı́quido o en un congelador
por ejemplo oftálmicas, óticas, nasales, de irrigación y lı́quidos de mecánico a no más de –508. En los casos en que se requiera un vial
diálisis (ver Formas Farmacéuticas h1151i). para siembra madre, se puede retirar y emplear para inocular una
Este capı́tulo estipula pruebas para demostrar la actividad de serie de cultivos de trabajo. Los cultivos de trabajo entonces pueden
protección antimicrobiana. Los conservantes antimicrobianos deben ser empleados de forma periódica (todos los dı́as en el caso de
estar indicados en la etiqueta. Las pruebas y criterios de eficacia se bacterias y levaduras) para iniciar el cultivo de inóculos.
aplican al producto en su envase original cerrado, en el que fue
distribuido por el fabricante.
MEDIOS
CATEGORÍAS DE PRODUCTOS La promoción del crecimiento de todos los medios empleados en
la prueba debe ser evaluada. Emplear los microorganismos indicados
Para los fines de las pruebas, los artı́culos farmacopeicos han sido más arriba en Organismos de Prueba.
divididos en cuatro categorı́as (ver Tabla 1). Los criterios de eficacia
antimicrobiana para estos productos se establecen en función de la
ruta de administración. PREPARACIÓN DE INÓCULOS
Tabla 1. Categorı́as de Productos Farmacopeicos Antes de la prueba, inocular la superficie de un volumen
apropiado de un medio de agar sólido proveniente de un cultivo
Categorı́a Descripción del Producto madre de cada microorganismo especificado revivido recientemente.
Las condiciones de cultivo para el inóculo se describen en la Tabla
1 Inyectables, otros parenterales incluyendo 2 en la que los medios apropiados son el Medio de Agar Sabouraud-
emulsiones, productos óticos, productos Dextrosa o de Digerido de Caseı́na-Soja (ver Lı́mites Microbianos
nasales estériles y productos oftálmicos h61i).
preparados con bases o vehı́culos acuosos. Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear
2 Productos empleados de manera tópica solución salina SR estéril, lavando el desarrollo de la superficie,
preparados con bases o vehı́culos colocándolo en un recipiente apropiado y agregando suficiente
acuosos, productos nasales no estériles solución salina SR estéril para obtener un recuento microbiano de
y emulsiones, incluyendo aquellos que aproximadamente 1 6 108 unidades formadoras de colonias (ufc) por
se aplican a membranas mucosas. mL. Para cosechar las células de A. niger, emplear solución salina
3 Productos orales a excepción de antiácidos, SR estéril con 0,05% de polisorbato 80 y agregar suficiente solución
preparados con bases o vehı́culos acuosos. salina SR estéril para obtener un recuento de aproximadamente
4 Antiácidos preparados con una base acuosa. 1 6 108 ufc por mL.
Alternativamente, los organismos de cultivo madre pueden
desarrollarse en un medio lı́quido apropiado (es decir, Caldo de
Digerido de Caseı́na-Soja o Caldo de Sabouraud-Dextrosa) y las
ORGANISMOS DE PRUEBA células se pueden cosechar mediante centrifugación, luego lavar y
resuspender en solución salina SR estéril para obtener un recuento
Emplear cultivos de los siguientes microorganismos1: Candida microbiano de aproximadamente 1 6 108 ufc por mL. [NOTA—El
albicans (ATCC N8 10231), Aspergillus niger (ATCC N8 16404), cálculo de la concentración de inóculo se puede realizar mediante
Escherichia coli (ATCC N8 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC mediciones turbidimétricas para los microorganismos de desafı́o.
N8 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC N8 6538). Los Refrigerar la suspensión si no se va a emplear dentro de las 2 horas.]
microorganismos viables empleados en la prueba no deben haber Determinar el número de ufc por mL en cada suspensión,
sufrido más de cinco pasajes desde su extracción del cultivo original utilizando las condiciones de los medios y los tiempos de incubación
de ATCC. Para los fines de la prueba, un pasaje se define como la para recuperación microbiana indicados en la Tabla 2 para confirmar
transferencia de organismos desde un cultivo establecido a un medio el cálculo inicial de ufc por mL. Este valor sirve para calibrar el
nuevo. Todas las transferencias se cuentan. En el caso de organismos tamaño del inóculo empleado en la prueba. Las suspensiones
mantenidos mediante técnicas de siembra en lote, cada ciclo bacterianas y de levaduras se deben utilizar dentro de las 24 horas de
consistente en congelar, descongelar y revivir a los microorgaismos cosechadas, pero la preparación de hongos puede ser almacenada en
en un medio nuevo se considera como una sola transferencia. Para el refrigeración hasta 7 dı́as.
almacenamiento de cultivos a largo plazo, se debe emplear una
1
Disponible en American Type Culture Collection, 10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h51i Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 87
Inóculo
Temperatura Tiempo Recuperación Microbiana
Organismo Medio Apropiado de Incubación de Incubación Tiempo de Incubación
Escherichia coli Caldo Digerido de Caseı́na y Soja; 32,5 + 2,58 18 a 24 horas 3 a 5 dı́as
(ATCC N8 8739) Agar Digerido de Caseı́na y Soja
Pseudomonas aeruginosa Caldo Digerido de Caseı́na y Soja; 32,5 + 2,58 18 a 24 horas 3 a 5 dı́as
(ATCC N8 9027) Agar Digerido de Caseı́na y Soja
Staphylococcus aureus Caldo Digerido de Caseı́na y Soja; 32,5 + 2,58 18 a 24 horas 3 a 5 dı́as
(ATCC N8 6538) Agar Digerido de Caseı́na y Soja
Candida albicans Agar Sabouraud Dextrosa; 22,5 + 2,58 44 a 52 horas 3 a 5 dı́as
(ATCC N8 10231) Caldo Sabouraud Dextrosa
Aspergillus niger Agar Sabouraud Dextrosa; 22,5 + 2,58 6 a 10 dı́as 3 a 7 dı́as
(ATCC N8 16404) Caldo Sabouraud Dextrosa
88 h55i Indicadores Biológicos—Pruebas de Resistencia / Pruebas Microbiológicas USP 30
Aparato
h55i INDICADORES Para un Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco,
BIOLÓGICOS—PRUEBAS DE Portador de Papel, usar un aparato de caracterı́sticas termodinámi-
cas conocidas que haya sido validado para cumplir con los requisitos
RESISTENCIA de seguridad1 y desempeño,2 que conste de una cámara de
esterilización equipada con un medio para calentar el aire contenido
en su interior, preferentemente por medio de un sistema eléctrico en
lugar de a gas, y que tenga un movimiento adecuado de aire a través
de ventilación forzada (mediante dispositivos mecánicos como
ventiladores), con dispositivos para medir y controlar la temperatura
RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES y el tiempo, capaces de indicar con una exactitud de no más de 0,58
e intervalos de 1 segundo, respectivamente. El modelo geométrico
Extraer tres muestras del indicador biológico pertinente de sus de la fuente o fuentes de calor es tal que permite calentar
envases originales individuales. Desmenuzar el papel hasta reducirlo uniformemente los indicadores biológicos en análisis bajo las
a las fibras que lo componen y colocar las muestras de prueba en el condiciones especificadas. El perfil de temperatura de la cámara se
vaso estéril de 250 mL de un mezclador adecuado que contenga 100 conoce y los puntos frı́os, los puntos calientes y las zonas de
mL de Agua Purificada frı́a y estéril, y mezclar durante 3 a 5 minutos calentamiento lento están identificadas. La cámara tiene la capacidad
para obtener una suspensión homogénea. Transferir a un tubo estéril de funcionar dentro de un intervalo de temperatura entre 408 y 3008,
de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca una alı́cuota de 10 mL de la con una exactitud de no menos de +28 a cualquier temperatura
suspensión. Si se trata de un Indicador Biológico para Esterilización fijada. El aparato está equipado con una puerta o un puerto de acceso
por Vapor, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la adicional adecuado que permite introducir e insertar (o retirar) las
suspensión en un baño de agua de 958 a 1008 durante 15 minutos muestras en un tiempo de 6 segundos y que permite que la
(choque térmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura regrese a los valores a los que se ajustó, en un lapso de
temperatura alcanza los 958. Si se trata de un Indicador Biológico 0,5 minutos, cuando la temperatura especificada se encuentra entre
para Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel, o de un 1208 y 1908, y dentro de un lapso de 1,0 minuto cuando dicha
Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, temperatura es de 2208 o más.
Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización con
baño de agua de 808 a 858 durante 10 minutos, comenzando a medir Óxido de Etileno, Portador de Papel, usar un aparato que conste de
el tiempo cuando la temperatura alcanza los 808. Enfriar rápidamente una cámara de prueba con un medio para asegurar la mezcla
en un baño de agua con hielo de 08 a 48. Transferir a tubos adecuada del gas esterilizante y un medio para calentar el gas
adecuados dos alı́cuotas de 1 mL y hacer diluciones seriadas esterilizante a una temperatura que no sea inferior a la temperatura de
apropiadas en Agua Purificada estéril; las diluciones se seleccionan funcionamiento preseleccionada, de modo que no ingrese lı́quido
por medio de cálculos de manera que se obtengan preferentemente alguno en la cámara de prueba, y que esté equipado con dispositivos
entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada una de las de control y seguimiento de temperatura, control de presión,
placas del par cuando se tratan según se describe a continuación. Si humidificación y de seguimiento de concentración de gas. Las
el indicador biológico tiene una concentración baja de esporas, especificaciones detalladas y los parámetros de funcionamiento para
puede ser necesario modificar las series de dilución y usar más placas los aparatos adecuados están publicados en Standard for a Biological
en cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para Indicator—Evaluator Resistometer for Ethylene Oxide Gas Vessels
cada alı́cuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en cada (BIER/EO) Gas Vessels.3
una de las dos placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización por
20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de Medio Agar con Vapor, Portador de Papel o un Indicador Biológico para
Digerido de Caseı́na–Soja (ver Pruebas de Lı́mites Microbianos Esterilización por Vapor, Autocontenido, usar un aparato que
h61i) que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 458 y conste de una cámara equipada con dispositivos de calentamiento
508. Mezclar por rotación suave para obtener una suspensión y de control y seguimiento de temperatura y vapor. Las
homogénea y dejar solidificar. Incubar las placas en posición especificaciones detalladas y los parámetros de funcionamiento
invertida a una temperatura de entre 558 y 608 si se trata de un para los aparatos adecuados están publicados en Standard for
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de a Biological Indicator—Evaluator Resistometer for Saturated Steam
Papel, y a una temperatura entre 308 y 358 si se trata de un Indicador (BIER/Steam Vessels).4
Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de
Papel o de un Indicador Biológico para Esterilización por Calor
Seco, Portador de Papel, o a la temperatura de recuperación óptima Procedimiento
especificada por el fabricante, y examinar las placas después de
transcurridas 24 y 48 horas, registrando el número de colonias para Realizar las pruebas de valor D en cada conjunto de condiciones
cada placa y usando el número de colonias encontrado después de 48 de esterilización aplicable según indique la etiqueta del indicador
horas para calcular los resultados. Calcular el número promedio de biológico envasado que está en análisis. Tomar un número suficiente
esporas por muestra a partir de los resultados, usando el factor de de grupos de muestra de indicadores biológicos en sus recipientes
dilución apropiado. La prueba es válida si el logaritmo del número originales individuales; cada grupo consta de 5 a 10 muestras. El
de esporas por Portador a las 48 horas es igual o mayor que el número de grupos proporciona un intervalo de observaciones de no
logaritmo del número después de 24 horas en cada caso. Para el menos de un valor D declarado en la etiqueta por debajo del tiempo
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido, de supervivencia declarado, hasta no menos de un valor D declarado
extraer asépticamente la tira de esporas del recipiente y proceder en la etiqueta por encima del tiempo de muerte declarado. Colocar
según se indica para un Indicador Biológico para Esterilización por 1
La seguridad incluye el diseño para evitar choques eléctricos o explosiones
Vapor, Portador de Papel. de gas y quemaduras, donde los operarios pueden usar ropa y guantes
protectores para evitar quemaduras al tocar superficies calientes.
2
La Health Industry Manufacturers Association en el Informe No. 78-1.7,
DETERMINACIÓN DEL VALOR D Operator Training for Dry Heat Sterilizing Equipment, y la Parenteral Drug
Association, Inc., en el Informe Técnico N8 3, Validation of Dry Heat
Para todas las pruebas descritas en esta sección, manipular cada Processes Used for Sterilization and Depyrogenation han publicado
muestra de prueba con precauciones asépticas, usando equipos descripciones de los distintos tipos de equipos de esterilización por calor
esterilizados según corresponda. seco y guı́as detalladas para determinar, realizar el seguimiento y controlar los
parámetros de funcionamiento.
3
Norma denominada Standard for BIER/EO Gas Vessels, 1 de julio de 1992,
Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI), 3330
Washington Boulevard, Suite 440, Arlington, VA 22201-4598.
4
Norma denominada Standard for BIER/Steam Vessels, 1 de julio de 1992,
AAMI, 3330 Washington Boulevard, Suite 400, Arlington, VA 22201-4598.
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h55i Indicadores Biológicos—Pruebas de Resistencia 89
los grupos en sendos soportes para muestras adecuados que permitan Recuperación
exponer cada muestra a la condición de esterilización indicada en
una ubicación especı́fica en la cámara de esterilización. Controlar los Después de completar el procedimiento de esterilización para el
parámetros de funcionamiento del aparato usando soportes sin Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco, Portador
muestras. Seleccionar una serie de tiempos de esterilización en de Papel, el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de
incrementos a partir del menor tiempo para las muestras a analizar. Etileno, Portador de Papel o el Indicador Biológico para
Las diferencias en los tiempos de esterilización a lo largo de las Esterilización por Vapor, Portador de Papel, según corresponda y
series son tan constantes como sea posible, y la diferencia entre los dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas, retirar
tiempos adyacentes no es mayor de 75% del valor D declarado en la asépticamente cada tira y agregarla a un volumen entre 10 mL y 30
etiqueta. mL de Medio de Digerido de Caseı́na–Soja (ver Medios en Pruebas
En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización por de esterilidad h71i) para sumergir el indicador biológico por
Calor Seco, Portador de Papel, precalentar la cámara de completo en un tubo adecuado. Para cada muestra del Indicador
esterilización durante 30 minutos. Abrir la puerta o puerto de Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido, se sumerge
acceso, colocar uno de los soportes con un grupo de muestras en la la tira de papel en el medio autocontenido según las instrucciones del
cámara de esterilización, cerrar la puerta o puerto de acceso y fabricante, dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas.
continuar haciendo funcionar el aparato. Comenzar a medir el Incubar cada tubo a una temperatura de 558 a 608 para el Indicador
tiempo de exposición al calor cuando la temperatura de la cámara Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel y el
vuelva a ser 28 menor que la temperatura especificada. Después de Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido,
someter el contenido a las condiciones de esterilización durante un o de 308 a 358 para el Indicador Biológico para Esterilización por
tiempo predeterminado seleccionado de una serie de incrementos de Calor Seco, Portador de Papel y el Indicador Biológico para
tiempo, retirar el soporte con las muestras calentadas y reemplazarlo Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel o en todo
por otro soporte con muestras. Repetir el procedimiento de caso, a la temperatura de recuperación óptima especificada por el
esterilización de manera similar, pero para otro tiempo predetermi- fabricante. Observar cada tubo con medio inoculado a las 24 y 48
nado y continuar con grupos sucesivos hasta haberlos calentado horas y cada 1 ó 2 dı́as desde ese momento en adelante durante un
todos apropiadamente. total de 7 dı́as después de la inoculación. (Cuando se observa
En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización con crecimiento en algún momento de observación en particular, se
Óxido de Etileno, Portador de Papel proceder del siguiente modo: puede suspender la incubación de dicha muestra.) Tomar nota del
1. Aplicar vacı́o a la cámara de prueba hasta una presión de no número de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en
más de 100 mm + 3 mm de mercurio. ningún momento.
2. Inyectar suficiente vapor de agua (por ejemplo, vapor saturado)
para que el contenido de la cámara llegue a una humedad
relativa que no se aleje en más de: 10% de la condición de Cálculos
humidificación necesaria y dejar que la cámara se equilibre con
la humedad y a temperatura durante aproximadamente 30 Este capı́tulo describe el uso del Método Spearman-Karber
minutos. Limitado para determinar el valor D de indicadores biológicos en
3. Inyectar una cantidad suficiente de óxido de etileno gaseoso portadores de papel con esporas. Usar este método en los casos de
equilibrado térmicamente para obtener la concentración apro- problemas farmacopeicos o como prueba normativa de arbitraje de
piada + 30 mg de óxido de etileno por litro. un sistema de indicadores biológicos. Se reconoce que otros
4. Someter un grupo de muestras a las condiciones de temperatura, métodos, como el Método de la Curva de Supervivencia y el
humidificación y concentración de gas apropiadas durante el procedimiento de Stumbo-Murphy-Cochran, pueden ser usados
tiempo necesario. rutinariamente por fabricantes y usuarios de indicadores biológicos
5. Aplicar vacı́o a la cámara de prueba hasta una presión de 100 para determinar los valores D. El cálculo del valor D usando el
mm + 3 mm de mercurio y liberar el vacı́o con aire estéril Método de Spearman-Karber Limitado se basa en el uso de 10
filtrado. Repetir esto hasta que se haya extraı́do no menos de indicadores biológicos por grupo. [NOTA—Si se usan menos de 10
99% del gas restante y retirar el o los soportes con las muestras indicadores biológicos (es decir, 5), se debe modificar la fórmula y
expuestas. los pasos del cálculo, incluyendo el Reemplazo de Valores Faltantes;
Para exponer los demás grupos de muestras a las condiciones de sin embargo, los requisitos de la prueba son los mismos.]
esterilización, proceder con los pasos 6 y 7. Designar el número de muestras tomado para cada grupo (es decir,
6. Purgar la cámara de prueba cinco veces con aire filtrado 10) con n y la diferencia entre los tiempos adyacentes (en minutos)
después de la evacuación, cada vez a una presión de no más de con d. Designar para cada grupo de la serie el número de muestras
100 mm + 3 mm de mercurio. que no presentan crecimiento con:
7. Repetir todo el procedimiento de esterilización, del paso 1 al 6,
para los otros grupos de muestras sin exponer, pero mantener f1, f2, ... fk,
las condiciones especificadas en el paso 4 para cada uno de los en donde f1 es la respuesta cuando las 10 muestras presentan
demás tiempos necesarios. crecimiento (0/10 inactivado) en el grupo mantenido durante el
En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización por menor perı́odo tiempo, siendo dicho resultado adyacente a una
Vapor, Portador de Papel, vaciar la cámara de esterilización y dentro mortalidad intermedia; y fk es la respuesta cuando las 10 muestras del
de los 15 segundos de haber abierto la puerta, colocar uno de los grupo no muestran crecimiento (10/10 inactivados) en el grupo
soportes con un grupo de muestras en la cámara de esterilización y mantenido durante el mayor perı́odo de tiempo, siendo tal resultado
hacer funcionar el aparato para calentar el contenido de la cámara lo adyacente a una mortalidad intermedia. No usar para los cálculos
más rápido que sea posible. Después de someter el contenido a la observaciones de grupos más allá de los extremos de la serie, f1 y fk,
condición de esterilización durante un tiempo predeterminado que den resultados no adyacentes a una mortalidad intermedia. La
seleccionado de una serie de incrementos de tiempo, vaciar la prueba es válida si existe un resultado (0/10) de un grupo mantenido
cámara lo más rápido que sea posible. Retirar el soporte con las durante un tiempo menor que el del resultado del menor tiempo
muestras calentadas y reemplazarlo con otro grupo de muestras. seleccionado (f1) y si existe un resultado (10/10) de un grupo
Repetir el procedimiento de esterilización de manera similar, pero mantenido durante un tiempo mayor que el del resultado del tiempo
para otro tiempo predeterminado y continuar con grupos sucesivos
hasta haberlos calentado todos apropiadamente.
En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización por
Vapor, Autocontenido, seguir el procedimiento indicado para el
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de
Papel, pero manipular cada unidad autocontenida como un sistema
de indicador biológico, con el valor D determinado para el sistema
autocontenido.
90 h55i Indicadores Biológicos—Pruebas de Resistencia / Pruebas Microbiológicas USP 30
más largo seleccionado (f k). Calcular el tiempo medio de puerta o puerto de acceso y hacer funcionar el aparato. Comenzar
calentamiento, T, para lograr la muerte completa, por la ecuación: a medir el tiempo de exposición al calor cuando la temperatura de la
cámara vuelva al lı́mite inferior de la temperatura seleccionada.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido,
ingresar a la cámara y retirar los soportes con las 10 muestras.
Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si
transcurrió un tiempo sustancial, para someter el segundo soporte
con 10 muestras a condiciones similares a la primeras pero durante el
tiempo de muerte necesario.
En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización con
en donde Tk es el tiempo para lograr el resultado fk. Calcular el valor Óxido de Etileno, Portador de Papel, precalentar la cámara hasta
D, por la ecuación: equilibrarla a la temperatura seleccionada +28, e iniciar y controlar
los pasos operativos 1 a 6 descritos para Determinación del Valor D,
apropiados para la combinación de concentración de gas, tempera-
tura y humedad relativa, usando, en el paso 4, un tiempo de
tratamiento con el gas apropiado para el tiempo de supervivencia.
Repetir el procedimiento anterior con dos o más grupos con 10
muestras cada uno, pero usando, en el paso 4, un tiempo de
tratamiento con el gas apropiado para el tiempo de muerte.
en donde N0 es el recuento promedio de esporas por portador En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización por
determinado por el Recuento Total de Esporas Viables (ver Vapor, Portador de Papel y el Indicador Biológico para Esterili-
anteriormente) al momento de realizar esta prueba. Calcular la zación por Vapor, Autocontenido, vaciar la cámara de vapor y abrir
varianza de T, VT , por la ecuación: la puerta. Dentro del plazo de 15 segundos de abrir la puerta, colocar
los soportes cargados en la cámara y hacer funcionar el aparato para
calentar el contenido de la cámara lo más rápidamente posible.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido,
contando el tiempo de exposición desde el momento en que el
registro de temperatura muestra que la cámara alcanzó la temperatura
requerida. Vaciar la cámara con la mayor rapidez posible al final del
en donde d representa un intervalo constante entre las exposiciones perı́odo de exposición. Cuando se pueda ingresar a la cámara con
sucesivas, según se definió anteriormente. seguridad, retirar los soportes con las muestras. Repetir el
La desviación estándar, sT , es la raı́z cuadrada de la varianza: procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcu-
rrió un intervalo sustancial, para someter los soportes con 10
muestras a condiciones similares a la primera exposición. Repetir el
procedimiento anterior con dos grupos más, cada uno con 10
muestras, pero exponiendo las muestras durante el tiempo de muerte
requerido. En cada caso para el Indicador Biológico para
Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel; el Indicador
Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de
Calcular los lı́mites de confianza (LC aproximado), inferior y Papel o el Indicador Biológico para Esterilización por Vapor,
superior al 95% para el valor D por la ecuación: Portador de Papel, según corresponda, después de completar el
procedimiento de esterilización, y dentro de un tiempo determinado
LC aproximado para D = (T + 2sT/log N0 þ 0,2507). de no más de 4 horas, retirar asépticamente y agregar cada portador
a un volumen de 10 mL a 30 mL de Medio de Digerido de Caseı́na y
Soja (ver Medios en Pruebas de Esterilidad h71i) para sumergir el
indicador biológico por completo en un tubo adecuado. Incubar cada
Reemplazo de Valores Faltantes tubo a una temperatura de 558 a 608 en el caso del Indicador
Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel; o de
Si no falta más de una muestra de un grupo y no faltan más de dos 308 a 358 en los casos del Indicador Biológico para Esterilización
muestras en el total de grupos que dan los resultados f1 a fk, por Calor Seco, Portador de Papel y el Indicador Biológico para
reemplazar cada valor faltante, sumando 0 a la cantidad que no Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel; o a la
muestra crecimiento si el número que no muestra crecimiento en las temperatura óptima especificada por el fabricante. En el caso de un
nueve muestras restantes de dicho grupo es 4 o menos, y sumando Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido,
1 si el número que no muestra crecimiento en las nueve muestras se sumerge la tira de papel en el medio autocontenido según las
restantes de dicho grupo es 5 o más. instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo indicado de no más
de 4 horas, y se incuba de 558 a 608. Observar cada tubo con medio
inoculado a las 24 y 48 horas y cada 1 ó 2 dı́as desde ese momento
en adelante durante un total de 7 dı́as después de la inoculación.
Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte (Cuando se observe un crecimiento en algún momento de
Tomar dos grupos, cada uno integrado por 10 muestras del observación en particular, se puede suspender la incubación de
indicador biológico pertinente, en sus envases individuales origi- dicha muestra.) Tomar nota de las muestras que no presentan
nales. Colocar las muestras de un grupo en un soporte para muestras evidencia de crecimiento en ningún momento.
adecuado que permita exponer cada muestra a las condiciones de
esterilización en una ubicación especı́fica en la cámara de
esterilización. Comprobar los parámetros de funcionamiento de la
cámara precalentándola a la temperatura seleccionada +28 en los
casos del Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco,
Portador de Papel y del Indicador Biológico para Esterilización con
Óxido de Etileno, Portador de Papel o +0,58 en los casos del
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de
Papel y el Indicador Biológico para Esterilización por Vapor,
Autocontenido.
En el caso de un Indicador Biológico para Esterilización por
Calor Seco, Portador de Papel, precalentar la unidad a la
temperatura y equilibrar la cámara de calor. Abrir la puerta
o puerto de acceso, y colocar los soportes en la cámara, cerrar la
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h61i Pruebas de Lı́mites Microbianos 91
IV. Medio Agar Manitol Salado VIII. Medio Agar Pseudomonas para la Detección de Fluorescina
Digerido Pancreático de Caseı́na . . . . . . . . . . 5,0 g Digerido Pancreático de Caseı́na . . . . . . . . . . 10,0 g
Digerido Péptico de Tejido Animal . . . . . . . . 5,0 g Digerido Péptico de Tejido Animal . . . . . . . . 10,0 g
Extracto de Carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g Fosfato Dibásico de Potasio Anhidro . . . . . . . 1,5 g
D-Manitol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 g Sulfato de Magnesio (MgSO4 7H2O). . . . . . . 1,5 g
Cloruro de Sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75,0 g Glicerina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 mL
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0 g Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0 g
Rojo de Fenol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,025 g Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
Disolver los componentes sólidos en el agua antes de agregar la
Mezclar, luego calentar agitando frecuentemente y hervir durante glicerina. Calentar, agitando frecuentemente, y mantener en ebulli-
1 minuto para disolver. ción durante 1 minuto para disolver.
pH después de la esterilización: 7,4 + 0,2. pH después de la esterilización: 7,2 + 0,2.
V. Medio Agar Baird–Parker
IX. Medio Agar Pseudomonas para la Detección de Piocianina
Digerido Pancreático de Caseı́na . . . . . . . . . . 10,0 g
Extracto de Carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g Digerido Pancreático de Gelatina. . . . . . . . . . 20,0 g
Extracto de Levadura. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g Cloruro de Magnesio Anhidro . . . . . . . . . . . 1,4 g
Cloruro de Litio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g Sulfato de Potasio Anhidro. . . . . . . . . . . . . . 10,0 g
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 g Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15,0 g
Glicina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12,0 g Glicerina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 mL
Piruvato de Sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 g Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 950 mL
Disolver todos los componentes sólidos en el agua antes de
Calentar con agitación frecuente y mantener en ebullición durante agregar la glicerina. Calentar, agitando frecuentemente, y mantener
1 minuto. Esterilizar, enfriar a una temperatura de 458 a 508 y en ebullición durante 1 minuto para disolver.
agregar 10 mL de solución de telurito de potasio estéril (1 en 100) y pH después de la esterilización: 7,2 + 0,2.
50 mL de emulsión de yema de huevo. Mezclar bien pero con
suavidad y verter en placas. (Preparar la emulsión de yema de huevo
desinfectando la superficie de la cáscara de los huevos, cascándolos X. Medio Lı́quido de Lactosa
asépticamente y transfiriendo las yemas intactas a una probeta
graduada estéril. Agregar solución salina estéril SR para obtener una Extracto de Carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g
proporción entre la yema y la solución salina de 3 a 7. Agregar a un Digerido Pancreático de Gelatina. . . . . . . . . . 5,0 g
vaso de mezclador estéril y mezclar a alta velocidad durante Lactosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
5 segundos.) Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
pH después de la esterilización: 6,8 + 0,2.
Enfriar tan rápido como sea posible después de la esterilización
VI. Medio Agar Vogel–Johnson pH después de la esterilización: 6,9 + 0,2.
Digerido Pancreático de Caseı́na . . . . . . . . . . 10,0 g
Extracto de Levadura. . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g XI. Medio Lı́quido de Selenito–Cistina
Manitol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio . . . . . . . . . . . . . 5,0 g Digerido Pancreático de Caseı́na . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
Cloruro de Litio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g Lactosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0 g
Glicina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 g Fosfato de Sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 g
Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16,0 g Selenito Ácido de Sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0 g
Rojo de Fenol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25,0 mg L-Cistina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 mg
Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
Llevar a ebullición la solución de sólidos y mantener durante Llevar a ebullición la mezcla de sólidos y agua, y mantener
1 minuto. Esterilizar justo antes de utilizar, fundir el medio, verter en durante 1 minuto para disolver.
placas Petri y dejar enfriar. pH después de la esterilización: 7,1 + 0,2.
pH después de la esterilización: 6,9 + 0,2.
XIV. Medio Agar Xilosa Lisina Desoxicolato XVIII. Medio Agar Levine con Eosina–Azul de Metileno
PROCEDIMIENTO mente a 458. Cubrir las placas de Petri, mezclar la muestra con agar
inclinando ligeramente o rotando suavemente las placas y dejar que
Preparar la muestra que se desea analizar con un tratamiento el contenido se solidifique a temperatura ambiente. Invertir las placas
apropiado a sus caracterı́sticas fı́sicas y que no altere el número y de Petri e incubar durante 48 a 72 horas. Una vez finalizada la
tipo de microorganismos presentes originalmente, a fin de obtener incubación, examinar las placas para verificar el crecimiento de
una solución o suspensión de la totalidad o parte de la muestra que microorganismos, contar el número de colonias y expresar el
sea adecuada para el o los procedimientos de prueba que se deben promedio de las dos placas en términos del número de micro-
llevar a cabo. organismos por g o por mL de muestra. En caso de no recuperarse
En el caso de sólidos que se disuelven en gran medida pero no colonias microbianas de las placas que representen la dilución inicial
totalmente, reducir la sustancia a un polvo moderadamente fino, 1 : 10 de la muestra, expresar los resultados como ‘‘menos de 10
suspenderlo en el vehı́culo especificado y proceder según se indica microorganismos por g o por mL de muestra’’.
en Recuento Total de Microorganismos Aerobios y en Prueba para
determinar la ausencia de Staphylococcus aureus y Pseudomonas
aeruginosa y Prueba para determinar la ausencia de Salmonella MÉTODO EN TUBOS MÚLTIPLES
spp y Escherichia coli.
En el caso de muestras lı́quidas que consisten en una solución En cada uno de 14 tubos de ensayo de tamaño similar, colocar 9,0
verdadera o una suspensión en agua o un vehı́culo hidroalcohólico mL de Medio Lı́quido de Digerido de Caseı́na y Soja estéril.
que contenga menos de 30 por ciento de alcohol, y para aquellos Distribuir doce de los tubos en cuatro grupos de tres tubos cada uno.
sólidos de disolución fácil y casi total en 90 mL de Solución Separar un grupo de tres tubos para utilizarlo como control. Pipetear
Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en los medios especificados, 1 mL de la solución o suspensión de la muestra y transferir a cada
proceder según se indica en Recuento Total de Microorganismos uno de los tres tubos de un grupo (‘‘100’’) y a un cuarto tubo (A), y
Aerobios y en Prueba para determinar la ausencia de Staphylo- mezclar. Pipetear 1 mL del tubo A y transferir al tubo restante (B), no
coccus aureus y Pseudomonas aeruginosa y Prueba para determi- incluido en un grupo, y mezclar. Estos dos tubos contienen 100 mg
nar la ausencia de Salmonella spp y Escherichia coli. (o 100 mL) y 10 mg (o 10 mL) de la muestra, respectivamente.
En el caso de ceras, cremas, ungüentos y lı́quidos inmiscibles con Pipetear 1 mL del tubo A y transferir a cada uno de los tres tubos del
agua, preparar una suspensión con ayuda de una cantidad mı́nima de segundo grupo (‘‘10’’) y pipetear 1 mL del tubo B y transferir a cada
un agente emulsionante estéril adecuado (por ejemplo, uno de los tubo del tercer grupo (‘‘1’’). Desechar el contenido no utilizado de
polisorbatos), utilizando un mezclador mecánico y calentando a una los tubos A y B. Cerrar bien e incubar todos los tubos. Una vez
temperatura que no exceda de 458, si fuera necesario, y proceder con transcurrido el periodo de incubación, examinar los tubos para
la suspensión según se indica en Recuento Total de Microorganismos verificar el crecimiento de los microorganismos: los tres tubos de
Aerobios y en Prueba para determinar la ausencia de Staphylo- control se mantienen transparentes y los resultados observados en los
coccus aureus y Pseudomonas aeruginosa y Prueba para determi- tubos que contienen la muestra, interpretados según la Tabla 1,
nar la ausencia de Salmonella spp y Escherichia coli. indican el número más probable de microorganismos por g o por mL
Para una muestra lı́quida en forma de aerosol, enfriar el envase en de muestra.
una mezcla de alcohol y hielo seco durante aproximadamente 1 hora,
abrir el envase, dejar que alcance temperatura ambiente, dejar que el
propelente escape, o entibiar para expulsar el propelente si fuera Tabla 1. Recuento Total Más Probable por el Método en Tubos
factible, y transferir la cantidad de material de prueba requerida para Múltiples
los procedimientos especificados en uno de los dos párrafos
precedentes, según corresponda. Cuando no se pueden obtener Combinaciones Observadas de Número de
10,0 g o 10,0 mL de la muestra, según corresponda, de 10 envases en Tubos que Evidencian Crecimiento en cada
forma de aerosol, transferir la totalidad del contenido de 10 envases Grupo Número más
enfriados al medio de cultivo, dejar que el propelente se escape y Probable de
proceder a realizar la prueba a los residuos. Si los resultados de la N8 de mg (o mL) de Muestra por Tubo
Microorganis-
prueba no fueran concluyentes o fueran dudosos, repetir la prueba 100 10 1 mos por g
con una muestra de 20 envases más. (100 mL) (10 mL) (1 mL) o por mL
3 3 3 41100
3 3 2 1100
Recuento Total de Microorganismos Aerobios 3 3 1 500
En el caso de muestras que son lo suficientemente solubles 3 3 0 200
o translúcidas para permitir el uso del Método en Placa, usar dicho 3 2 3 290
método; de lo contrario, usar el Método en Tubos Múltiples. Con 3 2 2 210
cualquiera de los métodos, primero disolver o suspender 10,0 g de la 3 2 1 150
muestra si es sólida, o 10 mL, medidos con exactitud, si la muestra 3 2 0 90
es lı́quida, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2, Medio 3 1 3 160
Lı́quido de Digerido de Caseı́na y Soja o Medio Lı́quido de Digerido 3 1 2 120
de Caseı́na–Lecitina de Soja-Polisorbato 20 para obtener 100 mL. 3 1 1 70
En el caso de muestras viscosas que no se puedan pipetear y
transferir a esta dilución inicial de 1 : 10, diluir la muestra hasta 3 1 0 40
obtener una suspensión, es decir, 1 : 50 ó 1 : 100, etc., que pueda 3 0 3 95
pipetearse. Realizar la prueba para determinar la ausencia de 3 0 2 60
propiedades inhibidoras (antimicrobianas) según se describe en 3 0 1 40
Pruebas Preparatorias antes de determinar el Recuento Total de 3 0 0 23
Microorganismos Aerobios. Agregar la muestra al medio a más
tardar 1 hora después de preparar las diluciones apropiadas para
inoculación.
Prueba para Determinar la ausencia de
MÉTODO EN PLACA Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa
Diluir el lı́quido aun más, si fuera necesario, para que 1 mL
permita obtener entre 30 y 300 colonias. Pipetear 1 mL de la dilución Agregar Medio Lı́quido de Digerido de Caseı́na y Soja a la
final y transferir a dos placas de Petri estériles. Agregar de muestra para obtener 100 mL, mezclar e incubar. Examinar el medio
inmediato, a cada placa, de 15 a 20 mL de Medio Agar Digerido para verificar el crecimiento y, si hubiera crecimiento, utilizar un
de Caseı́na y Soja, previamente fundido y enfriado aproximada- bucle de inoculación para realizar estrı́as con una porción del medio
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h61i Pruebas de Lı́mites Microbianos 95
sobre la superficie del Medio Agar Vogel–Johnson (o Medio Agar Tabla 4. Caracterı́sticas Morfológicas de Salmonella spp en
Baird–Parker o Medio Agar Manitol Salado) y del Medio Agar Medio Agar Selectivo
Cetrimida, cada uno de ellos colocado en placas de Petri. Cubrir las
placas, invertirlas e incubar. Si al examinarlas, ninguna de las placas Morfologı́a Caracterı́stica de las Colo-
contiene colonias con las caracterı́sticas enumeradas en las Tablas Medio Selectivo nias
2 y 3 para los medios utilizados, la muestra de prueba cumple con los
requisitos de ausencia de Staphylococcus aureus y Pseudomonas Medio Agar Pequeñas, transparentes, incoloras o de
aeruginosa. Verde Brillante color rosado a blanco opaco (frecuen-
temente rodeadas por una zona de
Prueba de Coagulasa (para Staphylococcus aureus)—Con la color rosado a rojo)
ayuda de un bucle de inoculación, transferir colonias sospechosas
representativas desde las superficies de agar del Medio Agar Vogel– Medio Agar De color rojo, con o sin centros negros
Johnson (o Medio Agar Baird–Parker o Medio Agar Manitol Salado) Xilosa Lisina
a tubos individuales, que contengan cada uno 0,5 mL de plasma de Desoxicolato
mamı́fero, preferentemente de conejo o caballo, con o sin aditivos Medio Agar De color negro o verde
adecuados. Incubar en un baño de agua a 378, examinando los tubos con Sulfito de Bismuto
a las 3 horas y posteriormente a intervalos adecuados hasta 24 horas.
Analizar los controles positivos y negativos simultáneamente con las
muestras desconocidas. Si no se observa ningún grado de Si se encuentran colonias de bastones Gram-negativos que se
coagulación, la muestra cumple con los requisitos para confirmar ajustan a la descripción de la Tabla 4, proceder con una
la ausencia de Staphylococcus aureus. identificación adicional transfiriendo colonias sospechosas represen-
Pruebas de Oxidasa y de Pigmentos (para determinar la tativas individualmente, por medio de un alambre de inoculación,
ausencia de Pseudomonas aeruginosa)—Con la ayuda de un bucle a un tubo inclinado de Medio Agar–Triple Azúcar–Hierro estriando
de inoculación, realizar estrı́as de las colonias sospechosas primero la superficie inclinada y luego clavando el alambre bien por
representativas, tomadas de las superficies de agar del Medio Agar debajo de la superficie. Incubar. Si en el examen no se hallan indicios
Cetrimida, sobre las superficies de agar del Medio Pseudomonas de que los tubos presentan superficies alcalinas (rojas) y fondos
Agar para la Detección de Fluorescina y del Medio Pseudomonas ácidos (amarillos), (con o sin ennegrecimiento concomitante de los
Agar para la Detección de Piocianina contenidas en las placas de fondos debido a la producción de sulfuro de hidrógeno), la muestra
Petri. Si debe transferirse un número grande de colonias sospecho- cumple con los requisitos de la prueba para determinar la ausencia
sas, dividir la superficie de cada placa en cuadrantes e inocular cada del género Salmonella.*
uno con una colonia diferente. Cubrir las placas, invertir el medio Prueba para determinar la ausencia de Escherichia coli—Con
inoculado e incubar a 358 + 28 durante no menos de tres dı́as. ayuda de un bucle de inoculación, hacer estrı́as con una porción del
Examinar las superficies estriadas bajo luz UV. Examinar las placas Medio Lı́quido de Lactosa restante sobre la superficie del Medio
para determinar si hay colonias presentes con las caracterı́sticas Agar MacConkey. Cubrir las placas, invertirlas e incubar. Al
enumeradas en la Tabla 3. examinar las placas, si ninguna de las colonias se ajusta a la
Por medio de la prueba de oxidasa, confirmar si un crecimiento de descripción que aparece en la Tabla 5 para este medio, la muestra
colonias sospechoso en uno o más medios corresponde a Pseudo- cumple con los requisitos de la prueba para determinar la ausencia de
monas aeruginosa. Una vez que haya tenido lugar el crecimiento de Escherichia coli.
colonias, colocar o transferir las colonias a tiras o discos de papel de
filtro que se han impregnado previamente con diclorhidrato de N,N-
dimetil-p-fenilendiamina: si no aparece un color rosado, que se torna Tabla 5. Caracterı́sticas Morfológicas de Escherichia coli en
púrpura, la muestra cumple con los requisitos de la prueba para Medio Agar MacConkey
determinar la ausencia de Pseudomonas aeruginosa. La presencia de
Pseudomonas aeruginosa se puede confirmar mediante otras pruebas Morfologı́a Caracterı́stica de las Colo-
bioquı́micas y de cultivos adecuadas, si fuera necesario. nias
Tinción Gram
Bacilos negativos De color rojo ladrillo, pueden tener una
Prueba para determinar la ausencia de Salmonella (coco-bacilos) zona de bilis precipitada alrededor
spp y Escherichia coli
Si se encuentran colonias que se ajustan a la descripción que
Agregar a la muestra, que está contenida en un vaso adecuado, un aparece en la Tabla 5, proceder con una identificación adicional
volumen de Medio Lı́quido de Lactosa para obtener 100 mL transfiriendo las colonias sospechosas individualmente, por medio de
e incubar. Examinar el medio para verificar el crecimiento y, si un bucle de inoculación, a la superficie de Medio Agar Levine con
hubiera crecimiento, mezclar agitando suavemente. Pipetear por- Eosina–Azul de Metileno colocado en placas de Petri. Si debe
ciones de 1 mL y transferir a vasos que contengan, respectivamente, transferirse un número grande de colonias, dividir la superficie de
10 mL de Medio Lı́quido de Selenito–Cistina y de Medio Lı́quido de cada placa en cuadrantes y sembrar cada uno de ellos con una
Tetrationato, mezclar e incubar durante 12 a 24 horas. (Conservar el colonia diferente. Cubrir las placas, invertirlas e incubar. Al
remanente del Medio Lı́quido de Lactosa.) examinarlas, si ninguna de las colonias exhibe un brillo metálico
Prueba para determinar la ausencia de Salmonella Spp—Por caracterı́stico bajo luz reflejada y si ninguna de ellas presenta una
medio de un bucle de inoculación, realizar estrı́as de los medios de apariencia negro azulada bajo luz transmitida, la muestra cumple con
selenito-cistina y de tetrationato sobre la superficie del Medio Agar los requisitos de la prueba para determinar la ausencia de
Verde Brillante, del Medio Agar Xilosa Lisina Desoxicolato y del Escherichia coli. La presencia de Escherichia coli se puede
Medio Agar con Sulfito de Bismuto contenidos en placas de Petri. confirmar mediante otras pruebas adicionales bioquı́micas y de
Cubrir las placas, invertirlas e incubar. Al examinar las placas, si cultivos adecuadas, si fuera necesario.
ninguna de las colonias se ajusta a la descripción que aparece en la
Tabla 4, la muestra cumple con los requisitos de la prueba para
determinar la ausencia del género Salmonella. Recuento Total Combinado de Hongos Filamentosos
y Levaduras
Proceder como se indica en el Método en Placa en Recuento Total
de Microorganismos Aerobios, excepto que se debe utilizar la misma
cantidad de Medio Agar Sabouraud Dextrosa o Medio Agar Papa
*
Se pueden obtener pruebas confirmatorias adicionales utilizando los
procedimientos que se establecen en Official Methods of Analysis of the
AOAC, 128 Ed. (1975), apartados 46.013-46.026.
96 h61i Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas USP 30
Dextrosa, en lugar de Medio de Digerido de Caseı́na y Soja y se Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta
deben incubar las placas de Petri invertidas durante 5 a 7 dı́as a una debe removerse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si se usan
temperatura de 208 a 258. inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y ausencia
de toxicidad para los microorganismos.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la
Repetición de la Prueba muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad en micro-
organismos y compatibilidad con cualquier inactivador usado.
A fin de confirmar un resultado dudoso mediante cualquiera de los
procedimientos descritos en las pruebas anteriores después de su
aplicación a una muestra de 10,0 g, puede realizarse una nueva MÉTODOS DE RECUENTO
prueba en una muestra de 25 g del producto. Proceder como se indica
en Procedimiento teniendo en cuenta que la muestra es más grande. Usar, según se indica, el método de Filtración por Membrana
o uno de los Métodos de Recuento en Placa. El Método del Número
Más Probable (NMP) es generalmente el método de recuento
microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos de
productos con biocarga muy baja, puede resultar el método más
h61i EXAMEN MICROBIOLÓGICO apropiado.
La elección del método se basa en factores tales como la
DE PRODUCTOS NO naturaleza del producto y el lı́mite de microorganismos requerido. El
método seleccionado debe permitir que se someta a prueba un
ESTÉRILES: PRUEBAS DE tamaño de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la
RECUENTO MICROBIANO especificación. Se debe establecer la aptitud del método seleccio-
nado.
INTRODUCCIÓN
PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO
Las pruebas que se describen en este capı́tulo permitirán el Y APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO
recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pueden
desarrollarse en condiciones aeróbicas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si
una sustancia o preparación cumple con alguna especificación Consideraciones Generales
establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales
propósitos, seguir las instrucciones que se indican a continuación, Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar
incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los microorganismos en presencia del producto a examinar.
resultados según se indica más abajo. Se debe confirmar la aptitud si se introdujera un cambio en la
Los métodos no aplican a productos que contengan microorga- ejecución de la prueba o en el producto que pudiera afectar los
nismos viables como ingredientes activos. resultados de la prueba.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos,
incluyendo métodos automatizados, siempre que se haya demostrado
que equivalen al método farmacopeico. Preparación de Cepas de Prueba
Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba
PROCEDIMIENTOS GENERALES o preparar según se indica más abajo. Las técnicas de mantenimiento
de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan
Realizar la determinación en las condiciones requeridas para evitar para que los microorganismos viables empleados para inoculación
la contaminación microbiana extrı́nseca del producto a examinar. Las correspondan a no más de 5 repiques desde el lote de siembra
precauciones a tomar para evitar la contaminación deben ser tales maestro original. Cultivar, por separado, cada cepa de prueba de
que no afecten a ningún microorganismo que deba detectarse en esta bacterias y hongos filamentosos según se indica en la Tabla 1.
prueba.
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h61i Examen Microbiológico 97
Aptitud del Método de Prueba diluyente de elección, mezclar e incubar a una temperatura de 208
a 258 durante un perı́odo suficiente para resucitar las bacterias pero
Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la que no estimule la multiplicación de los organismos (por lo general
muestra según se indica en el párrafo pertinente en Pruebas de 2 horas pero no más de 5 horas).
Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba Prueba de Ausencia—A menos que se indique algo diferente,
en el medio de crecimiento indicado. Inocular individualmente las usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, según se indica
cepas de prueba. Usar un número de microorganismos equivalente en Preparación de la Muestra e Incubación Previa, para inocular
a no más de 100 ufc en la preparación de prueba inoculada. Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias. Incubar
Realizar la prueba según se indica en el párrafo pertinente en a una temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 24 a 48 horas.
Pruebas de Productos empleando el perı́odo más corto de Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar
incubación indicado. a una temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 a 24 horas.
Se deben detectar los microorganismos especı́ficos con las El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
reacciones indicadoras según se describe en Pruebas de Productos. Prueba Cuantitativa—
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una
modificación del procedimiento de la prueba (ver Neutralización/ Selección y Subcultivo—Inocular cantidades adecuadas de Caldo
Eliminación de la Actividad Antimicrobiana en Examen Micro- Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la preparación
biológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento según se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa
Microbiano h61i). y/o diluciones de la misma que contengan respectivamente 0,1 g;
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con 0,01 g y 0,001 g (ó 0,1 mL; 0,01 mL y 0,001 mL) del producto
respecto al microorganismo para el cual se indica la prueba no puede a examinar. Incubar a una temperatura de 308 a 358 durante un
neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no perı́odo de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una
estará presente en el producto. placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a una temperatura
de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 a 24 horas.
Interpretación—El crecimiento de colonias constituye un resul-
PRUEBAS DE PRODUCTOS tado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que produce un
resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado
Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis negativo. Determinar la cantidad probable de bacterias a partir de la
Tabla 2.
Preparación de la Muestra e Incubación Previa—Preparar una Escherichia coli
muestra empleando una dilución 1 en 10 de no menos de 1 g del
producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Preparación de la Muestra e Incubación Previa—Preparar una
Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i, muestra empleando una dilución 1 en 10 de no menos de 1 g del
excepto que se debe usar Caldo Digerido de Caseı́na y Soja como producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h62i Examen Microbiológico 103
Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i y Interpretación—El crecimiento de colonias indica la posible
usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 mL, para inocular presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas de
una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del identificación.
Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseı́na y Soja, mezclar El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si
e incubar a una temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 los resultados de las pruebas de identificación confirmatorias son
a 24 horas. negativos.
Selección y Subcultivo—Agitar el envase, transferir 1 mL de
Caldo Digerido de Caseı́na y Soja a 100 mL de Caldo MacConkey
e incubar a una temperatura de 428 a 448 durante un perı́odo de 24 Staphylococcus aureus
a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar MacConkey a una
temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 a 72 horas. Preparación de la Muestra e Incubación Previa—Preparar una
Interpretación—El crecimiento de colonias indica la posible muestra empleando una dilución 1 en 10 de no menos de 1 g del
presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de
identificación. Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i y
El producto cumple con la prueba si no se presentan colonias o si usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 mL, para inocular
los resultados de las pruebas de identificación son negativos. una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del
Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseı́na y Soja y
homogenizar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el volumen
Salmonella de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver
Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en Examen
Preparación de la Muestra e Incubación Previa—Preparar el Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento
producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Microbiano h61i) a través de un filtro de membrana estéril y colocar
Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i y en 100 mL de Caldo Digerido de Caseı́na y Soja. Incubar a una
usar una cantidad correspondiente a no menos de 10 g ó 10 mL, para temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 a 24 horas.
inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Selección y Subcultivo—Subcultivar en una placa de Agar
Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseı́na y Manitol Salado e incubar a una temperatura de 308 a 358 durante un
Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 a 72 horas.
perı́odo de 18 a 24 horas. Interpretación—El crecimiento de colonias amarillas o blancas
Selección y Subcultivo—Transferir 0,1 mL de Caldo Digerido de rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de S.
Caseı́na y Soja a 10 mL de Caldo Rappaport–Vassiliadis para aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 308 El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de
a 358 durante 18 a 24 horas. Subcultivar en placas de Agar Xilosa los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de identificación
Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 308 a 358 durante confirmatorias son negativos.
un perı́odo de 18 a 48 horas.
Interpretación—El crecimiento de colonias bien desarrolladas de
color rojo, con o sin centros negros indica la posible presencia de Clostridios
Salmonella. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se presentan colonias de Preparación de la Muestra y Tratamiento Térmico—Preparar
los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de identificación el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de
confirmatorias son negativos. Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i.
Tomar dos porciones iguales correspondientes a no menos de 1 g o
1 mL del producto a examinar. Calentar una porción a 808 durante 10
Pseudomonas aeruginosa minutos y enfriar rápidamente. No calentar la otra porción.
Selección y Subcultivo—Transferir 10 mL de cada una de las
Preparación de la Muestra e Incubación Previa—Preparar una porciones mezcladas a dos envases (38 mm 6 200 mm) u otros que
muestra empleando una dilución 1 en 10 de no menos de 1 g del contengan 100 mL de Medio Reforzado para Clostridios. Incubar
producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 308 a 358 durante
Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i y 48 horas. Luego de la incubación, realizar subcultivos a partir de
usar 10 mL o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 mL, para inocular cada tubo en Agar Columbia e incubar en condiciones anaeróbicas
una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del a una temperatura de 308 a 358 durante 48 horas.
Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseı́na y Soja y mezclar. Interpretación—El crecimiento anaeróbico de bacilos (con o sin
Al analizar parches transdérmicos, filtrar el volumen de muestra endoesporas) que dan una reacción de catalasa negativa indica la
correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches presencia de Clostridios.
Transdérmicos en Preparación de la Muestra en Examen Micro- Si no se detecta crecimiento anaeróbico de microorganismos en
biológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Agar Columbia o la prueba de catalasa resulta positiva, el producto
Microbiano h61i) a través de un filtro de membrana estéril y colocar cumple con la prueba.
en 100 mL de Caldo Digerido de Caseı́na y Soja. Incubar a una
temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo—Subcultivar en una placa de Agar
Cetrimida e incubar a una temperatura de 308 a 358 durante un
perı́odo de 18 a 72 horas.
104 h62i Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas USP 30
Candida albicans
Agar Sabouraud Dextrosa
Preparación de la Muestra e Incubación Previa—Preparar el Mezcla de Digerido Péptico de Tejido 10,0 g
producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Animal y Digerido Pancreático de
Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano h61i y Caseı́na (1 : 1)
usar 10 mL o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g ó 1 mL, Agar 15,0 g
para inocular 100 mL de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Agua Purificada 1000 mL
Incubar a una temperatura de 308 a 358 durante un perı́odo de
3 a 5 dı́as. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 + 0,2
Selección y Subcultivo—Subcultivar en una placa de Agar a 258. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 308 a 358
durante un perı́odo de 24 a 48 horas. Agar Papa Dextrosa
Interpretación—El crecimiento de colonias blancas puede Infusión de papas 200 g
indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante Dextrosa 20,0 g
pruebas de identificación. Agar 15,0 g
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales Agua Purificada 1000 mL
colonias o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan
negativas. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 + 0,2
a 258. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Caldo Sabouraud Dextrosa
SOLUCIONES RECOMENDADAS Y
Dextrosa 20,0 g
MEDIOS DE CULTIVO Mezcla de Digerido Péptico de Tejido 10,0 g
[NOTA—Esta sección se proporciona como información.] Animal y Digerido Pancreático de
Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado Caseı́na (1 : 1)
satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales se Agua Purificada 1000 mL
indican en la prueba de contaminación microbiana en la Farmacopea. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 + 0,2
Se pueden usar otros medios si éstos tiene propiedades promotoras a 258. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
del crecimiento e inhibidoras similares.
Solución Amortiguadora Madre—Transferir 34 g de fosfato Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias
monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1000 mL, Digerido Pancreático de Gelatina 10,0 g
disolver en 500 mL de Agua Purificada, ajustar con hidróxido de Glucosa Monohidrato 5,0 g
sodio a un pH de 7,2 + 0,2, agregar Agua Purificada a volumen y Bilis de Buey Deshidratada 20,0 g
mezclar. Dispensar en envases y esterilizar. Almacenar a una Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 g
temperatura de 28 a 88. Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 8,0 g
Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2—Preparar una Verde Brillante 15 mg
mezcla de Agua Purificada y Solución Amortiguadora Madre Agua Purificada 1000 mL
(800 : 1 v/v) y esterilizar.
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,2 + 0,2
Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio–Peptona de pH 7,0 a 258. Calentar a 1008 durante 30 minutos y enfriar inmediatamente.
Fosfato Monobásico de Potasio 3,6 g Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa
7,2 g (equivalente
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato a fosfato 0,067 M) Extracto de Levadura 3,0 g
Cloruro de Sodio 4,3 g Digerido Pancreático de Gelatina 7,0 g
Peptona (de carne o caseı́na) 1,0 g Sales Biliares 1,5 g
Agua Purificada 1000 mL Cloruro de Sodio 5,0 g
Glucosa Monohidrato 10,0 g
Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Agar 15,0 g
Rojo Neutro 30 mg
Caldo Digerido de Caseı́na y Soja Cristal Violeta 2 mg
Digerido Pancreático de Caseı́na 17,0 g Agua Purificada 1000 mL
Digerido Papaı́nico de Soja 3,0 g Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 + 0,2
Cloruro de Sodio 5,0 g a 258. Calentar hasta el punto de ebullición, pero no calentar en
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g autoclave.
Glucosa Monohidrato 2,5 g
Agua Purificada 1000 mL Caldo MacConkey
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 + 0,2 Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g
a 258. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Lactosa Monohidrato 10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 5,0 g
Agar Digerido de Caseı́na y Soja Púrpura de Bromocresol 10 mg
Digerido Pancreático de Caseı́na 15,0 g Agua Purificada 1000 mL
Digerido Papaı́nico de Soja 5,0 g Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 + 0,2
Cloruro de Sodio 5,0 g a 258. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 mL Agar MacConkey
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 + 0,2 Digerido Pancreático de Gelatina 17,0 g
a 258. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Peptonas (de carne y caseı́na) 3,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Agar Sabouraud Dextrosa Cloruro de Sodio 5,0 g
Dextrosa 40,0 g Sales Biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo Neutro 30,0 mg
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h71i Pruebas de Esterilidad 105
^
ALMACENAMIENTO
Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Si los medios preparados se almacenan en envases no sellados,
Usar en la Prueba de Promoción del Crecimiento y en la pueden usarse durante 1 mes, siempre que se hayan evaluado en
Prueba de Validación cuanto a promoción del crecimiento durante el periodo de 2 semanas
anteriores al uso y que se cumplan los requisitos del indicador de
Bacterias Aerobias color. Si se almacenan en envases impermeables, los medios pueden
Staphylococcus aureus^1^ ATCC 6538, CIP 4.83, usarse durante 1 año, siempre que se hayan realizado pruebas de
NCTC 10788, NCIMB promoción del crecimiento durante el periodo de 3 meses anteriores
9518 al uso y que se cumplan los requisitos del indicador de color.^
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62,
NCIMB 8054
Pseudomonas aeruginosa^2^ ATCC 9027, NCIMB ^LÍQUIDOS DE DILUCIÓN Y LAVADO PARA
8626, CIP 82.118
Bacteria anaerobia FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Clostridium sporogenes^3^ ATCC 19404, CIP 79.3,
NCTC 532 o ATCC Lı́quido A
11437
Hongos PREPARACIÓN
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72,
NCPF 3179 Disolver 1 g de digerido péptico de tejido animal en agua para
Aspergillus niger AT C C 1 6 4 0 4 , I P obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera necesario,
1431.83, IMI 149007 y ajustar a un pH de 7,1 + 0,2. Transferir a envases y esterilizar
empleando un proceso validado.
^1
Una alternativa a Staphylococcus aureus es Bacillus subtilis (ATCC
6633).^
^2
Un microorganismo alternativo es Micrococcus luteus (Kocuria rhizo- PREPARACIÓN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS
phila), ATCC 9341.^
^3
Una alternativa a Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un Agregar asépticamente a la Preparación anterior, si fuera
microorganismo no formador de esporas, es Bacetroides vulgatus (ATCC necesario, una cantidad de b-lactamasa estéril suficiente para
8482).^ inactivar cualquier actividad residual de antibióticos en las
[NOTA—Las técnicas de mantenimiento de cultivo aplicadas a los lotes de membranas después de haber filtrado la solución de la muestra de
siembra (sistemas para lotes de siembra) han de usarse de modo que los
microorganismos viables empleados para inoculación no hayan tenido más de prueba (ver Medios para Penicilinas o Cefalosporinas).
cinco transferencias desde el lote maestro original.]
Lı́quido D
Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Lı́quido A, y
Pruebas de Aptitud ajustar a un pH de 7,1 + 0,2. Transferir a envases y esterilizar
empleando un proceso validado. Usar este lı́quido para artı́culos que
Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiquetados ‘‘para
realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el producto administración estéril.’’
a examinar.
Lı́quido K
ESTERILIDAD
Disolver 5,0 g de digerido péptico de tejido animal, 3,0 g de
Confirmar la esterilidad del medio para cada partida de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua para
esterilización incubando una porción del medio a la temperatura obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, después de la
de incubación especificada durante 14 dı́as. No se produce esterilización, un pH de 6,9 + 0,2. Transferir a envases y esterilizar
crecimiento de ningún organismo. empleando un proceso validado.^
En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos
mencionados anteriormente en Prueba de Promoción del Creci- o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean un efecto
miento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una antimicrobiano en las condiciones de la prueba.
prueba de promoción del crecimiento como control positivo. Incubar
todos los envases que contienen medio durante no más de 5 dı́as.
Si después de la incubación se obtiene un crecimiento claramente Filtración por Membrana
visible de microorganismos, comparable visualmente con el del
recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no
antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal actividad se ha mayor de 0,45 mm, cuya eficacia para retener microorganismos haya
eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa
entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones. para soluciones acuosas, oleosas y con bajo contenido alcohólico, y
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones
del producto a evaluar, comparable visualmente con el de los con alto contenido alcohólico. Es posible que para ciertos productos
recipientes de control sin producto, el producto posee actividad (por ejemplo, antibióticos) se necesiten filtros especialmente
antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente en las adaptados.
condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de La técnica descrita más adelante supone que se usarán membranas
eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la prueba de de aproximadamente 50 mm de diámetro. Si se usan filtros de un
validación. diámetro diferente, los volúmenes de las diluciones y los lavados
Esta validación se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad deben ajustarse según corresponda. El aparato de filtración y la
tiene que realizarse en un producto nuevo y (b) siempre que haya un membrana se esterilizan usando técnicas adecuadas. El aparato se
cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La diseña de tal modo que la solución a examinar se pueda introducir y
validación podrá llevarse a cabo simultáneamente con la Prueba filtrar en condiciones asépticas: permite retirar asépticamente la
de Esterilidad para el Producto a Examinar. membrana para transferirla al medio de cultivo, o es adecuado para
llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de
agregarle el medio.
PRUEBA DE ESTERILIDAD PARA EL
PRODUCTO A EXAMINAR
SOLUCIONES ACUOSAS
^Número de Artı́culos a Evaluar
Si corresponde, transferir una pequeña cantidad de un diluyente
A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este estéril adecuado, como por ejemplo el ^Lı́quido A (ver Lı́quidos de
capı́tulo o en la monografı́a individual, evaluar el número de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),^ a la membrana
artı́culos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artı́culo en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener sustancias
está en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede dividir para neutralizantes adecuadas y sustancias inactivantes apropiadas, por
agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones ejemplo, en el caso de los antibióticos.
iguales y apropiadas. [NOTA—Realizar las pruebas de esterilidad Transferir el contenido a evaluar desde el envase o envases a la
utilizando dos o más de los medios especificados.] Si cada artı́culo membrana o membranas, si fuera necesario, después de diluirlo al
no contiene las cantidades suficientes para cada medio, usar el doble volumen usado en la Prueba de Validación con el diluyente estéril
del número de artı́culos indicado en la Tabla 3.^ elegido, pero usando no menos de las cantidades del producto
La prueba puede llevarse a cabo mediante la técnica de Filtración a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si
por Membrana o por Inoculación Directa del Medio de Cultivo con el producto posee propiedades antimicrobianas, lavar la membrana
el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del
La técnica de filtración por membrana se usa cuando la naturaleza diluyente estéril elegido usado en la Prueba de Validación. No
del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas excederse de un ciclo de lavado de 5 veces con 200 mL, incluso si
filtrables, para preparaciones alcohólicas o aceitosas y para durante la validación se ha demostrado que tal ciclo no elimina por
Tabla 2. Cantidad Mı́nima a Usar para cada Medio
Sólidos
Menos de 50 mg El contenido total de cada envase
50 mg o más, pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg–5 g 150 mg
Más de 5 g 500 mg
Dispositivos
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 3 secciones de una hebra (cada uno de 30 cm de longitud)
^
Apósito quirúrgico/algodón/gasa (en envases) 100 mg por envase
Material de sutura y otro material desechable envasado individual- El dispositivo completo
mente
Otros dispositivos médicos El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado^
USP 30 Pruebas Microbiológicas / h71i Pruebas de Esterilidad 109
Tabla 3. Número Mı́nimo de Artı́culos a Evaluar en Relación con el Número de Artı́culos en la Partida
completo la actividad antimicrobiana. Transferir la membrana al medio o medios de cultivo, o viceversa, según lo descrito
completa al medio de cultivo o cortarla asépticamente en dos anteriormente para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas
partes iguales y transferir una mitad a cada uno de dos medios temperaturas y durante los mismos tiempos.
adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado
en la Prueba de Validación. Alternativamente, transferir el medio
a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos UNGÜENTOS Y CREMAS
de 14 dı́as.
Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto
indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungüentos en base grasa y las
SÓLIDOS SOLUBLES (DISTINTOS DE ANTIBIÓTICOS) emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1% en miristato
de isopropilo según lo descrito anteriormente, calentando si fuera
Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto necesario a no más de 408. Es probable que en casos excepcionales
indicada en las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecuado, se requiera calentar hasta no más de 448. Filtrar tan rápidamente
como por ejemplo el ^Lı́quido A (Lı́quidos de Dilución y Lavado como sea posible y proceder según lo descrito anteriormente para
para Filtración por Membrana),^ y proceder con la prueba según lo Aceites y Soluciones Oleosas.
indicado anteriormente para Soluciones Acuosas usando una
membrana adecuada para el disolvente elegido.
^
JERINGAS PRELLENADAS
ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS Para jeringas prellenadas sin agujas estériles acopladas, expulsar
el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para filtración
Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la
indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas de transferencia. Si se acopla una aguja estéril, expulsar directamente el
viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilución contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y
a través de una membrana seca. Los aceites viscosos se pueden diluir proceder según lo descrito para Soluciones Acuosas. Evaluar la
según sea necesario con un diluyente estéril adecuado, como por esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculación
ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demostrado no tener Directa que se indica en Prueba de Validación.
actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que
el aceite penetre la membrana por su propio peso y, a continuación,
filtrar, aplicando presión o succión gradualmente. Lavar la INYECTABLES DISTINTOS DE ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS
membrana al menos tres veces filtrando cada vez aproximadamente
con 100 mL de una solución estéril adecuada, como por ejemplo el Reconstituir los artı́culos de prueba según las instrucciones de la
^
Lı́quido A (ver Lı́quidos de Dilución y Lavado para Filtración por etiqueta y proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas
Membrana),^ que contenga un agente emulsionante adecuado a una o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTA—
concentración que haya demostrado ser apropiada en la validación Si fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso para ayudar
de la prueba, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentración en la reconstitución y filtración del artı́culo de prueba reconstituido.]
de 10 g por L ^(Lı́quido K)^. Transferir la membrana o membranas
110 h71i Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 30
ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS INYECTABLES medio de cultivo concentrado preparado de tal modo que se tenga en
cuenta la dilución subsiguiente. Cuando corresponda, el medio
Envases a Granel para Farmacias, 5 5 g—Tomar una cantidad concentrado podrá agregarse directamente al producto en su envase.
aproximada a 300 mg de sólido de cada uno de 20 envases, transferir
asépticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en
aproximadamente 200 mL de Lı́quido A (ver Lı́quidos de Dilución y LÍQUIDOS OLEOSOS
Lavado para Filtración por Membrana) y mezclar; o bien,
reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 20 envases Usar medios a los que se les haya agregado un agente
y transferir una cantidad de lı́quido o suspensión que equivalga emulsionante apropiado a una concentración que haya demostrado
aproximadamente a 300 mg de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril ser adecuada en la validación de la prueba, por ejemplo polisorbato
de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Lı́quido A y 80 a una concentración de 10 g por litro.
mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para
Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar.
Envases a Granel para Farmacias, 5 g— Tomar aproximada- UNGÜENTOS Y CREMAS
mente 1 g de sólido de cada uno de 6 envases, transferir
asépticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver Realizar una dilución de aproximadamente 1 en 10, emulsionando
en aproximadamente 200 mL de Lı́quido A y mezclar; o bien, con el agente elegido en un diluyente estéril adecuado, como por
reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y ejemplo el ^Lı́quido A (ver Lı́quidos de Dilución y Lavado para
transferir una cantidad de lı́quido que equivalga aproximadamente Filtración por Membrana).^ Transferir el producto diluido a un
a 1 g de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en medio que no contenga agente emulsionante.
aproximadamente 200 mL de Lı́quido A y mezclar. Proceder según lo Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 dı́as.
indicado para Soluciones Acuosas. Observar los cultivos varias veces durante el perı́odo de incubación.
Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos
todos los dı́as. Sin embargo, cuando se use un medio de tioglicolato
ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS EN GRANELES Y MEZCLAS u otro medio similar para detectar microorganismos anaerobios,
agitar o mezclar mı́nimamente con el fin de mantener las condiciones
Retirar asépticamente una cantidad suficiente de sólido de la anaerobias.
cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta obtener
una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de sólido y
transferir a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL. Disolver en CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRÚRGICA PARA
aproximadamente 200 mL de Lı́quido A y mezclar. Proceder según lo USO VETERINARIO
indicado para Soluciones Acuosas.
Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto
indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado teniendo en
PRODUCTOS ESTÉRILES EN AEROSOL cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra
para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prueba sobre las tres
Para productos lı́quidos en forma de aerosol presurizado, congelar secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al
los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo menos a comienzo, medio y final de la hebra. Usar hebras completas de
–208 durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el envases recién abiertos. Transferir cada una de las secciones de la
propelente escape antes de abrir asépticamente el envase y transferir hebra a los medios elegidos. Usar suficiente medio para cubrir
el contenido a un recipiente de combinación estéril. Agregar 100 mL adecuadamente el material a evaluar (de 20 mL a 150 mL).
de Lı́quido D al recipiente de combinación y mezclar suavemente.
Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y
Soluciones Oleosas, según corresponda. ^
SÓLIDOS
OBSERVACIÓN E INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS
A intervalos durante el perı́odo de incubación, y al momento de su
finalización, examinar los medios en busca de evidencias ma-
croscópicas de crecimiento microbiano. Si el material que se
está evaluando enturbia el medio de modo que no puede
h81i ANTIBIÓTICOS—
determinarse fácilmente la presencia o ausencia de crecimiento VALORACIONES
microbiano mediante examen visual, transferir porciones de medio
(no menores de 1 mL cada una) 14 dı́as después de comenzada la MICROBIOLÓGICAS
incubación, a recipientes nuevos con el mismo medio y, a continua-
ción, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no
menos de 4 dı́as.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto Bajo las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los
examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la microorganismos. La reducción en la actividad antimicrobiana
prueba de esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente también revela cambios sutiles no comprobables mediante métodos
que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el quı́micos. En consecuencia, las valoraciones microbiológicas
producto examinado. La prueba puede considerarse inválida sólo si o biológicas siguen siendo, por lo general, el estándar para disipar
se cumplen una o más de las siguientes condiciones: dudas en cuanto a la posible pérdida de actividad. Este capı́tulo
a. Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones describe este tipo de procedimientos para los antibióticos recono-
para pruebas de esterilidad demuestran una falla. cidos en esta farmacopea para los que la valoración microbiológica
b. Una revisión del procedimiento analı́tico usado durante la sigue siendo el método definitivo.
prueba en cuestión revela una falla. Se utilizan dos métodos generales: la valoración en cilindro-placa
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos. o ‘‘en placa’’ y la valoración turbidimétrica o ‘‘en tubo’’. El primer
d. Después de determinar la identidad de los microorganismos método se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro
aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o especies) vertical a través de una capa de agar solidificada en un plato o placa
puede atribuirse de manera inequı́voca a fallas con respecto al de Petri hasta inhibir totalmente el crecimiento del microorganismo
material o a la técnica usados al realizar el procedimiento de la añadido, en un área circular o ‘‘zona de inhibición’’ en torno al
prueba de esterilidad. cilindro que contiene una solución del antibiótico. El método
Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número turbidimétrico se basa en la inhibición del crecimiento de un cultivo
de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas de microbiano en una solución uniforme del antibiótico en un medio
crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto lı́quido que promueva su rápido crecimiento en ausencia del
examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas antibiótico.
de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto
examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
APARATO
APLICACIÓN DE LA PRUEBA A Todos los equipos deben limpiarse bien antes y después de cada
uso. Los elementos de vidrio utilizados para conservar y transferir
PREPARACIONES PARENTERALES, los organismos de prueba se esterilizan con calor seco o con vapor.
OFTÁLMICAS Y OTRAS PREPARACIONES NO
INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA
PRUEBA DE ESTERILIDAD Control de Temperatura
Al usar la técnica de filtración por membrana, utilizar, siempre que Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración
sea posible, el contenido total del envase, pero no menos de las microbiológica: durante el cultivo de un microorganismo y la
cantidades indicadas en las Tablas 2 y 3, diluyendo cuando sea preparación del inóculo, ası́ como durante la incubación en placa y
necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solución estéril las valoraciones en tubo. Mantener la temperatura de las placas de
adecuada, como por ejemplo el ^Lı́quido A (ver Lı́quidos de valoración a +0,58 de la temperatura seleccionada. Es imperativo un
Dilución y Lavado para Filtración por Membrana).^ control más estricto de la temperatura (+0,18 de la temperatura
Al usar la técnica de inoculación directa de medios, usar las seleccionada) durante la incubación en una valoración en tubo y
cantidades que se muestran en las Tablas 2 y 3, a menos que se puede lograrse con circulación de aire o agua. La mayor capacidad
justifique y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad térmica del agua representa una ventaja respecto del aire en
bacteriana y fúngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del circulación.
producto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un único
envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usará el
contenido de dos o más envases para inocular los distintos medios. Espectrofotometrı́a
La medición de la transmitancia dentro de una banda de
frecuencia relativamente estrecha requiere un espectrofotómetro
adecuado en el que pueda variarse o restringirse la longitud de onda
de la fuente luminosa mediante el uso de un filtro de 580 nm o 530
nm para leer la absorbancia en una valoración en tubo. Para este
último propósito, el instrumento puede disponerse de manera tal que
acepte el tubo en el que tiene lugar la incubación (ver Receptáculos
de Valoración Turbidimétrica), que acepte una celda modificada
112 h81i Antibióticos—Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 30
equipada con un drenaje que facilita el cambio rápido del contenido MEDIO 3
o, preferentemente, que tenga una celda de flujo directo para un
análisis de flujo continuo; regular el instrumento a una absorbancia Peptona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g
igual a cero con caldo no inoculado transparente preparado según las Extracto de Levadura. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g
especificaciones de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad Extracto de Carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 g
de solución de prueba y formaldehı́do que se encuentra en cada Cloruro de Sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,5 g
muestra. Dextrosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g
NOTA—Puede utilizarse la medición de la absorbancia o transmi- Fosfato Dibásico de Potasio . . . . . . . . . . . . . 3,68 g
tancia para preparar los inóculos. Fosfato Monobásico de Potasio. . . . . . . . . . . 1,32 g
Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 mL
MEDIO 2 MEDIO 13
MEDIO 41
NOTAS—‘‘B’’ denota ‘‘solución amortiguadora’’ y el número que sigue se refiere a las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en este
capı́tulo.
Para anfotericina B, colistimetato sódico y nistatina, preparar las soluciones Estándar de Referencia USP y la solución de prueba de la muestra
simultáneamente.
Para anfotericina B, diluir nuevamente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 mg por mL antes de
realizar las diluciones de prueba. La Dilución de Prueba de la muestra deberı́a contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del
Estándar de Referencia USP.
Para la bacitracina-cinc, cada una de las diluciones de prueba del Estándar deberı́a contener la misma cantidad de ácido clorhı́drico que la Dilución de Prueba
de la muestra.
Para la valoración turbidimétrica de la neomicina, diluir la solución madre de 100mg por mL en forma cuantitativa con Solución Amortiguadora N8 3 para
obtener una solución con una concentración equivalente a 25,0 mg de neomicina por mL. A matraces volumétricos de 50 mL separados, agregar 1,39; 1,67; 2,00;
2,40 y 2,88 mL de esta solución, agregar 5,0 mL de ácido clorhı́drico 0,01 N a cada matraz, diluir a volumen con Solución Amortiguadora N8 3 y mezclar para
obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 mg de neomicina por mL. Utilizar esta soluciones para preparar la lı́nea de respuesta del
estándar.
Para la nistatina, diluir nuevamente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 Unidades por mL antes
de realizar las diluciones de prueba. Preparar las soluciones de lı́nea de respuesta del estándar simultáneamente con las diluciones de la muestra que se desea
analizar. La Dilución de Prueba de la muestra deberı́a contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del Estándar. Utilizar
recipientes de vidrio con protección actı́nica.
Para la Polimixina B, preparar la solución madre añadiendo 2 mL de agua por cada 5 mg del material del Estándar de Referencia USP pesado.
Turbidimétrico de Procedimiento, los tubos que contienen la dosis Dentro de estas restricciones, el diseño de valoración recomen-
media del Estándar deberı́an tener absorbancias de al menos 0,3 dado es una valoración de 1 nivel con una curva estándar. Para esta
unidades de absorbancia, excepto la Amicacina, Clortetraciclina, valoración con una curva estándar, preparar soluciones de 5, 6 o más
Gramicidina y Tetraciclina (0,35 unidades de absorbancia) y la diluciones de prueba del Estándar, siempre que incluyan una que
Capreomicina, Metaciclina y Tobramicina (0,4 unidades de absor- corresponda a la concentración de referencia (S 3) y una sola solución
bancia). de un nivel de prueba medio de la Muestra Desconocida, según se
Para la valoración en cilindro-placa, determinar mediante ensayo describe en Preparación del Estándar y Preparación de la Muestra.
las proporciones de suspensión madre que se deben incorporar en el Considerar una valoración como preliminar si su potencia compu-
Inóculo, comenzando con los volúmenes indicados en la Tabla 3, tada con cualquiera de los diseños es inferior al 80% o superior al
que den como resultado una demarcación satisfactoria de zonas de 125% de la potencia supuesta al preparar la solución madre de la
inhibición de aproximadamente 14 a 16 mm de diámetro y Muestra Desconocida. En dicho caso, ajustar la potencia supuesta
produzcan una relación de dosis reproducible. Preparar el inóculo según corresponda y repetir la valoración.
añadiendo una porción de suspensión madre a una cantidad Las determinaciones microbiológicas de potencia están sujetas
suficiente de medio agar derretido y enfriado a 458 a 508 y agitando a variables intervaloración e intravaloración, de modo tal que se
por rotación moderada para lograr una suspensión homogénea. requieren dos o más valoraciones independientes para obtener una
estimación confiable de la potencia de una determinada preparación
de valoración o Muestra Desconocida. Comenzando con soluciones
PROCEDIMIENTO madre preparadas por separado y diluciones de prueba del Estándar y
de la Muestra Desconocida, repetir otro dı́a la valoración de una
Diseños de Valoración Muestra Desconocida dada. Si la potencia estimada de la segunda
valoración difiere mucho, según lo indique el error estándar
Las valoraciones microbiológicas aumentan su precisión con la calculado, respecto de la primera, realizar una o más valoraciones
segregación de fuentes relativamente grandes de posibles errores y adicionales. El resultado combinado de una serie de valoraciones
desviaciones mediante diseños experimentales adecuados. En una independientes más pequeñas a lo largo de varios dı́as es una
valoración en cilindro-placa, las comparaciones esenciales están estimación más confiable de la potencia que el obtenido de una
restringidas a las relaciones entre las mediciones del diámetro de la valoración grande con el mismo número total de placas o tubos.
zona dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre
placas en su preparación y posterior manipulación. Para realizar una
valoración turbidimétrica de modo tal que las diferencias en la Método de cilindro-placa
turbidez observada reflejen las diferencias en la concentración
antibiótica se requiere una mayor uniformidad en el entorno creado Para preparar placas de valoración utilizando placas de Petri,
para los tubos a través de un control termostático más estricto de la colocar 21 mL de Medio 2 en cada una de las cantidades de placas
incubadora y se debe evitar la desviación sistemática colocando requeridas y dejar que se endurezca hasta formar una capa base lisa
tubos replicados aleatoriamente en gradillas separadas, cada una con de profundidad uniforme, excepto en el caso de Anfotericina B y
un conjunto de tratamientos. De esta manera, las comparaciones Nistatina, donde no se utiliza una capa de base separada. En el caso
esenciales se restringen a las relaciones entre los valores de turbidez de la Eritromicina, Gentamicina, Neomicina B, Paromomicina y
observados dentro de cada gradilla. Sisomicina, utilizar Medio 11. En el caso de la Bleomicina, utilizar
NOTA—Para algunos propósitos, se diseña la valoración de manera 10 mL de Medio 35. Para la Dihidroestreptomicina, utilizar Medio 5.
tal que un conjunto de tratamientos incluya no menos de tres tubos Para la Vancomicina, utilizar 10 mL de Medio 8. Para la
por cada muestra y concentración de estándar y cada conjunto se Carbenicilina, Colistimetato Sódico, Colistina y Polimixina B,
coloca en una sola gradilla. utilizar Medio 9. Para la Netilmicina, utilizar 20 mL de Medio 11.
Agregar 4 mL de inóculo de capa de siembra (ver Preparación del
USP 30 Pruebas Biológicas / h81i Antibióticos—Valoraciones Microbiológicas 117
Composición Sugerida
Condiciones de Incubación del Inóculo
Cantidad
Organismo de Prueba & (mL por 100
(N8 ATCC) Medio Temp. (8) Tiempo Medio mL) Antibióticos Valorados
Bacillus subtilis 32 32 a 35 5 dı́as 5 Según lo Dihidrostreptomicina
(6633) requerido
8 Según lo Vancomicina
requerido
Bordetella bronchiseptica 1 32 a 35 24 horas. 10 0,1 Colistimetato Sódico, Colistina, Po-
(4617) limixina B
Escherichia coli 1 32 a 35 24 horas. 3 0,7 Cloranfenicol
(10536)
Klebsiella pneumoniae 1 36 a 37,5 16 a 24 3 0,05 Capreomicina
(10031) horas.
0,1 Estreptomicina, Troleandomicina,
Dihidrostreptomicina
39 2 Neomicina
Micrococcus luteus 1 32 a 35 24 hs. 11 1,5 Eritromicina
(9341)
Micrococcus luteus 1 32 a 35 24 horas. 1 0,3 Bacitracina
(10240)
Mycobacterium 36 36 a 37,5 48 horas. 35 1,0 Bleomicina
smegmatis (607)
Pseudomonas aeruginosa 1 36 a 37,5 24 horas. 10 0,5 Carbenicilina
(25619)
Saccharomyces cerevisiae 19 29 a 31 48 horas. 13 0,2 Candicidina
(9763)
19 1,0 Anfotericina B
Saccharomyces cerevisiae 19 29 a 31 48 horas. 19 1,0 Nistatina
(2601)
Staphylococcus aureus 3 35 a 39 16 a 18 39 2-3 Tilosina
(9144) horas.
Staphylococcus aureus 1 32 a 35 24 horas. 1 0,1 Cefalotina, Cefapirina, Cloxacilina
(29737)
1 0,3 Nafcilina
1 1,0 Penicilina G
3 0,1 Amicacina, Clortetraciclina,
Demeclociclina, Doxiciclina,
Metaciclina, Oxitetraciclina, Rolite-
traciclina,
Tetraciclina
3 0,2 Kanamicina
3 0,4 Cicloserina
3 0,15 Tobramicina
Staphylococcus 1 32 a 35 24 horas. 11 0,25 Netilmicina
epidermidis
(12228) 1 4,0 Novobiocina
11 0,03 Gentamicina, Sisomicina
11 0,4 Neomicina
11 2,0 Paromomicina
Enterococcus hirae 3 36 a 37,5 16 a 18 3 1,0 Gramicidina
(10541) horas.
40 36 a 37,5 18 a 24 41 0,2 Tiostreptón
horas.
NOTA—Para Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619) en la valoración de Carbenicilina, utilizar 0,5 mL de una dilución de 1 : 25 de la suspensión madre por
100 mL de Medio 10.
Inóculo y la Tabla 3), preparado según las indicaciones para el diámetro de cada zona de inhibición de crecimiento con una
antibiótico determinado, excepto en el caso de la Bleomicina (utilizar aproximación de 0,1 mm. Incubar las placas a una temperatura de
6 mL), Netilmicina (utilizar 5 mL) y la Nistatina y Anfotericina B 298 a 318 en el caso de la Anfotericina B y Nistatina. Incubar a una
(utilizar 8 mL), inclinando la placa hacia atrás y hacia adelante para temperatura de 348 a 368 en el caso de la Novobiocina. Incubar a una
esparcir el inóculo uniformemente sobre la superficie y dejar que se temperatura de 368 a 37,58 en el caso de la Carbenicilina,
endurezca. Dejar caer seis cilindros de valoración sobre la superficie Colistimetato Sódico, Colistina, Dihidroestreptomicina, Gentami-
inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una guı́a mecánica cina, Neomicina, Netilmicina, Paromomicina, Polimixina B, Siso-
u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de micina y Vancomicina.
2,8 cm y cubrir las placas para evitar la contaminación. Después de Para la valoración de un nivel con una curva estándar, preparar
llenar los seis cilindros sobre cada placa con diluciones de diluciones que representen cinco niveles de prueba del Estándar (S1
antibiótico que contengan los niveles de prueba que se especifican a S5) y un nivel de prueba único de la Muestra Desconocida U3
a continuación, incubar las placas a una temperatura de 328 a 358, correspondiente a S3 de la curva estándar, según se define en
o a la temperatura especificada a continuación para cada caso, Preparación del Estándar y Preparación de la Muestra. Para derivar
durante 16 a 18 horas, retirar los cilindros, y medir y registrar el la curva estándar, llenar cilindros alternos en cada una de las tres
118 h85i Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 30
placas con la dilución de prueba media (S3) del Estándar y cada uno
de los nueve cilindros restantes con una de las otras cuatro diluciones
del Estándar. Repetir el proceso para las tres diluciones del Estándar.
h85i PRUEBA DE ENDOTOXINAS
Para cada Muestra Desconocida, llenar cilindros alternos en cada una BACTERIANAS
de las tres placas con la dilución de prueba media del Estándar (S3) y
cada uno de los nueve cilindros restantes con la dilución de prueba
correspondiente (U3) de la Muestra Desconocida.
^
Partes de este capı́tulo general han sido armonizadas con los
textos correspondientes de la Farmacopea Europea o de la
Método Turbidimétrico Farmacopea Japonesa. Aquellas partes que no están unificadas
están marcadas con los sı́mbolos (^^) para especificar dicha
El dı́a de la valoración, preparar las dosis necesarias diluyendo las situación.^
soluciones madre del Estándar y de cada Muestra Desconocida Este capı́tulo describe una prueba para detectar o cuantificar las
según se define en Preparación del Estándar y Preparación de la endotoxinas bacterianas que pueden estar presentes en la muestra de
Muestra. Agregar 1,0 mL de cada dosis, excepto en el caso de un artı́culo o artı́culos a los que se aplica la prueba. Se usa Lisado de
Gramicidina, Tiostreptón y Tilosina (utilizar 0,10 mL) a cada uno de Amebocitos de Limulus (LAL) obtenido a partir de extractos
tres tubos de ensayo preparados y colocar los tres tubos replicados en acuosos de amebocitos circulantes del cangrejo herradura (Limulus
una posición, elegida al azar, en una gradilla u otro soporte. Incluir polyphemus o Tachypleus tridentatus), preparado y caracterizado
de manera similar en cada gradilla uno o dos tubos de control que para ser utilizado como Reactivo LAL.^1^
contengan 1 mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 1) pero no Hay dos tipos de técnicas para esta prueba: las técnicas de
antibiótico. Una vez completada la gradilla de soluciones de prueba coagulación (gel-clot) que se basan en la formación de un gel y las
(con Candicidina dentro de los 30 minutos del momento en que se técnicas fotométricas. Estas últimas comprenden un método
añade el agua a la solución madre de dimetil sulfóxido), agregar 9,0 turbidimétrico, que se basa en la producción de turbidez después
mL de inóculo a cada tubo de la gradilla y colocar de inmediato la de la ruptura de uniones de un sustrato endógeno y un método
gradilla completada en una incubadora o en un baño de agua cromogénico que se basa en el desarrollo de color después de la
mantenidos a una temperatura de 368 a 37,58, excepto en el caso de ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Proceder
la Candicidina (incubar a una temperatura de 278 a 298). Incubar los empleando cualquiera de estas técnicas, a menos que en la
tubos durante 4 a 5 horas, excepto en el caso de Capreomicina, monografı́a se indique algo diferente. Si hubiera discrepancias en
Cloranfenicol, Cicloserina, Dihidroestreptomicina, Espectinomicina, los resultados, la decisión final se basa en las técnicas de
Estreptomicina y Troleandomicina (incubar durante 3 a 4 horas), coagulación, salvo que en la monografı́a se indique algo diferente.
Tilosina (incubar durante 3 a 5 horas) y Candicidina (incubar durante En las técnicas de coagulación, el punto final de la reacción se
16 a 18 horas). Después de la incubación, agregar a cada tubo 0,5 determina a partir de diluciones del material en análisis comparán-
mL de formaldehı́do diluido, excepto en el caso de la Tilosina dolas directamente con diluciones en paralelo de una endotoxina de
(calentar la gradilla en un baño de agua a una temperatura de 808 referencia, y las cantidades de endotoxina se expresan como
a 908 durante 2 a 6 minutos o en un baño de vapor durante 5 a 10 Unidades USP de Endotoxinas (UE-USP). [NOTA—Una UE-USP es
minutos y llevar a temperatura ambiente), tomando una gradilla a la igual a una UI (Unidad Internacional) de endotoxinas.]
vez, leer su transmitancia o absorbancia en un espectrofotómetro Debido a que los Reactivos LAL han sido formulados para ser
adecuado equipado con un filtro de 530 nm o 580 nm (ver utilizados también en pruebas turbidimétricas o colorimétricas,
Espectrofotómetro en Aparato). dichas pruebas se pueden emplear para cumplir con los requisitos.
Para la valoración de un nivel con una curva estándar, preparar Estas pruebas requieren que se establezca una curva de regresión
diluciones que representen cinco niveles de prueba del Estándar (S1 estándar; el contenido de endotoxina del material de prueba se
a S5) y un nivel de prueba único (U3) de cada una de hasta determina por interpolación de la curva. Los procedimientos
20 Muestras Desconocidas correspondiente a S3 del Estándar. incluyen la incubación durante un perı́odo predeterminado de la
Preparar también un S3 adicional como prueba de crecimiento. endotoxina de reacción y de soluciones de control con Reactivo LAL
Agregar 1 mL de cada dilución de prueba, excepto en el caso de la y la lectura de la absorbancia de la luz espectrofotométrica
Gramicidina, Tiostreptón y Tilosina (utilizar 0,10 mL), a tres tubos y a longitudes de onda adecuadas. En el procedimiento turbidimétrico
1 mL de diluyente sin antibiótico a seis tubos como controles. de punto final la lectura se hace inmediatamente al final del perı́odo
Distribuir un conjunto completo, incluyendo dos tubos de controles, de incubación. En el procedimiento colorimétrico de punto final la
a una gradilla, intercalándolos al azar. Agregar 9,0 mL de inóculo, reacción se detiene al final del perı́odo preseleccionado mediante el
excepto en el caso de Tiostreptón (utilizar 10,0 mL de inóculo), agregado de un agente que detiene la reacción enzimática antes de
incubar, agregar 0,5 mL de formaldehı́do diluido y completar la realizar las lecturas. En los ensayos cinéticos colorimétricos y
valoración como se indicó anteriormente. Determinar la duración turbidimétricos la absorbancia se mide durante el perı́odo de
exacta de la incubación observando el crecimiento en la concentra- reacción y los valores de velocidad se determinan a partir de esas
ción de referencia (dosis media) de las diluciones del estándar (S3). lecturas.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE DEL por l, que representa la sensibilidad declarada en la etiqueta (en UE
ESTÁNDAR DE ENDOTOXINA Y LAS por mL) del Reactivo LAL, para obtener el factor MDV. Si en la
monografı́a individual se especifica la concentración lı́mite de
SOLUCIONES ESTÁNDAR endotoxina en términos de peso o Unidades de fármaco activo (en
El ER Endotoxina USP tiene una potencia definida de 10 000 UE por mg o en UE por Unidad), multiplicar el lı́mite por la
Unidades USP de Endotoxina (UE) por vial. Reconstituir todo el concentración (en mg por mL o en Unidades por mL) del fármaco en
contenido de 1 vial de ERE (Estándar de referencia de endotoxina) la solución sometida a prueba o del fármaco reconstituido según las
con 5 mL de Agua Reactivo para LAL^3^, mezclar intermitente- instrucciones de la etiqueta, según corresponda, y dividir el producto
mente durante 30 minutos con un mezclador por vórtice y usar este de la multiplicación por l, para obtener el factor MDV. El factor
concentrado para hacer diluciones en serie adecuadas. Conservar el MDV ası́ obtenido es el factor de dilución lı́mite de la preparación
concentrado en un refrigerador durante no más de 14 dı́as para para que la prueba sea válida.
preparar diluciones posteriores. Mezclar vigorosamente con un
mezclador por vórtice durante no menos de 3 minutos antes de usar.
Mezclar cada dilución durante no menos de 30 segundos antes de DETERMINACIÓN DE LOS LÍMITES DE
preparar la siguiente dilución. Debido a la pérdida de actividad por ENDOTOXINA
adsorción, no almacenar las diluciones en ausencia de datos que
respalden lo contrario. El lı́mite de endotoxina para fármacos de administración
parenteral, definido en base a la dosis, es igual a K/M,^4^ en
donde K es el umbral de la dosis pirogénica de endotoxina por kg de
Pruebas Preparatorias peso corporal en seres humanos, y M es igual a la dosis máxima
recomendada para seres humanos de un producto por kg de peso
Usar un Reactivo LAL cuya sensibilidad declarada en la etiqueta corporal durante un perı́odo de una hora.
haya sido confirmada. El lı́mite de endotoxina para fármacos de administración
La validez de los resultados de la prueba de endotoxinas parenteral se especifica en las monografı́as individuales en unidades
bacterianas requiere una adecuada demostración de que las muestras como por ejemplo UE/mL, UE/mg, o UE/Unidad de actividad
del artı́culo o de las soluciones, los lavados o los extractos de los biológica.
mismos, a los que se les realizará la prueba, no inhiben ni potencian
por sı́ mismos la reacción, ni interfieren con la prueba de ninguna
otra manera. La validación se lleva a cabo realizando la prueba de TÉCNICAS DE COAGULACIÓN
inhibición o potenciación descrita en cada una de las tres técnicas
indicadas. Se incluyen controles negativos adecuados. La validación Las técnicas de coagulación detectan o cuantifican las endotoxinas
debe repetirse si se cambia la fuente de Reactivo LAL o el método de basándose en la coagulación del Reactivo LAL en presencia de la
fabricación o formulación del artı́culo. endotoxina. La concentración de endotoxina necesaria para que el
lisado se aglutine en condiciones estándar, es la sensibilidad
declarada en la etiqueta del Reactivo LAL. Para asegurar tanto la
Preparación de las Soluciones de Prueba precisión como la validez de la prueba, en Pruebas Preparatorias
para las Técnicas de Coagulación se describen las pruebas para
Preparar soluciones de prueba disolviendo o diluyendo fármacos confirmar la sensibilidad declarada en la etiqueta del Reactivo LAL y
o extrayendo dispositivos médicos utilizando Agua Reactivo para para los factores de interferencia.
LAL. Algunas sustancias o preparaciones se pueden disolver, diluir
o extraer de un modo más adecuado en otras soluciones acuosas. Si
fuera necesario, ajustar el pH de la solución (o de la dilución) que se Pruebas Preparatorias para las Técnicas de
va a examinar de modo que el pH de la mezcla del Reactivo LAL y Coagulación
la muestra se encuentre dentro del intervalo de pH especificado por
el fabricante del Reactivo LAL. Esto se aplica habitualmente a un Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada en la
producto con un pH comprendido entre 6,0 y 8,0. El pH se puede Etiqueta del Reactivo LAL—Confirmar la sensibilidad declarada
ajustar con un ácido, una base o una solución amortiguadora en la etiqueta utilizando por lo menos 1 vial del lote de Reactivo
adecuada según lo recomiende el fabricante del Reactivo LAL. Los LAL. Preparar una serie de diluciones dobles de ER Endotoxina
ácidos y las bases se pueden preparar a partir de concentrados USP en Agua Reactivo para LAL para obtener concentraciones de
o sólidos con Agua Reactivo para LAL en recipientes exentos de 2l, l, 0,5l y 0,25l, en donde l corresponde a lo definido
endotoxinas detectables. Las soluciones amortiguadoras se deben anteriormente. Efectuar la prueba por cuadruplicado sobre cada una
validar para garantizar que están libres de endotoxinas detectables y de las cuatro concentraciones estándar e incluir controles negativos.
otros factores de interferencia. La prueba de confirmación de sensibilidad del lisado se debe llevar
a cabo cuando se usa una partida nueva de Reactivo LAL o cuando
hay algún cambio en las condiciones experimentales que puedan
DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN afectar el resultado de la prueba.
VÁLIDA (MDV) Mezclar un volumen del Reactivo LAL con un volumen igual
(como por ejemplo alı́cuotas de 0,1 mL) de una de las soluciones
La Máxima Dilución Válida es la dilución máxima permitida de estándar en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas
una muestra a la que se le puede determinar el lı́mite de endotoxina. de prueba individuales que contengan Reactivo LAL liofilizado,
Se aplica a soluciones inyectables o soluciones de administración agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la
parenteral en la forma reconstituida o diluida para administración, o, mezcla de reacción durante un perı́odo constante según las
cuando corresponda, a la cantidad de fármaco en peso si el volumen instrucciones del fabricante del Reactivo LAL (habitualmente
de la forma farmacéutica para administración pudiera variar. La a 37 + 18 durante 60 + 2 minutos), evitando vibraciones. Para
ecuación general para determinar la MDV es: analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente
de la incubadora y con un único movimiento suave, invertirlos
MDV = (Lı́mite de endotoxina 6 Concentración de la solución de aproximadamente 1808. Si se ha formado un gel firme que
muestra) / (l) ^4
K es 5 UE-USP/kg para cualquier vı́a de administración que no sea la
donde la concentración de la solución de muestra y l se intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de
corresponden con las definiciones dadas a continuación. Cuando productos radiofarmacéuticos que no se administren por vı́a intratecal, el
lı́mite de endotoxina se calcula como 175/V, donde V es la dosis máxima
en una monografı́a individual se especifique la concentración lı́mite recomendada en mL. En el caso de radiofármacos administrados por vı́a
de endotoxina por volumen (en UE por mL), se debe dividir el lı́mite intratecal, el lı́mite de endotoxina se obtiene mediante la fórmula 14/V. Para
^3
Agua Estéril para Inyección u otro tipo de agua que no presente ninguna formulaciones (habitualmente productos oncológicos) que se administran por
reacción con el Reactivo LAL especı́fico con el que se va a usar, al lı́mite de metro cuadrado de superficie corporal, la fórmula es K/M, en donde K =
sensibilidad de dicho reactivo.^ 5 UE/kg y M es la (dosis máxima/m2/hora 6 1,80 m2)/70 Kg. ^
120 h85i Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 30
permanece en su lugar después de invertir los tubos, registrar el Prueba de Lı́mite de Coagulación
resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un
gel con esas caracterı́sticas. La prueba no es válida a menos que la Esta prueba se utiliza cuando una monografı́a contiene un
concentración más baja de las soluciones estándar muestre un requisito respecto al lı́mite de endotoxina.
resultado negativo en todas las pruebas repetidas. Procedimiento—Preparar las Soluciones A, B, C y D como se
El punto final es la última prueba positiva en la serie de indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas soluciones
concentraciones decrecientes de endotoxina. Calcular el valor medio siguiendo el procedimiento de la Prueba de Confirmación de la
de los logaritmos de la concentración en el punto final y luego el Sensibilidad Declarada en la Etiqueta del Reactivo LAL en Pruebas
antilogaritmo del valor medio usando la ecuación siguiente: Preparatorias para las Técnicas de Coagulación.
Media Geométrica de la Concentración del Punto Final =
antilogaritmo (e / f),
Tabla 2. Preparación de Soluciones para la Prueba de Lı́mite de
donde e es la suma de los logaritmos de las concentraciones de Coagulación
punto final de la serie de dilución utilizada, y f es el número de tubos
de ensayo repetidos. La media geométrica de la concentración del Concentración de Endotoxina/Solu-
punto final es la sensibilidad medida del Reactivo LAL (en UE/mL). Número de
ción a la que se Agrega Endotoxina Repeti-
Si no es menor de 0,5l y no es mayor de 2l, se confirma la
sensibilidad declarada en la etiqueta y se usa en pruebas realizadas Solución* ciones
con este lisado. A ninguna/solución de muestra diluida 2
Prueba de Factores de Interferencia para las Técnicas de B 2l/solución de muestra diluida 2
Coagulación—Preparar soluciones A, B, C y D como se muestra en C 2l/Agua Reactivo para LAL 2
la Tabla 1 y realizar la prueba de inhibición o potenciación en las D ninguna/Agua Reactivo para LAL 2
soluciones de muestra a una dilución menor que la MDV, que no *
contenga endotoxinas detectables, siguiendo el procedimiento Preparar la Solución A y la Solución B de control positivo del producto
indicado antes en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad utilizando una dilución no mayor que la MDV y tratamientos como se indica
Declarada en la Etiqueta del Reactivo LAL. La media geométrica de en la Prueba de Factores de Interferencia para las Técnicas de Coagulación
en Pruebas Preparatorias para las Técnicas de Coagulación. Las Soluciones
las concentraciones del punto final de las soluciones B y C se B y C de control positivo contienen la preparación de endotoxina estándar
determina empleando la ecuación de esa prueba. a una concentración que corresponde al doble de la sensibilidad declarada en
Esta prueba se debe repetir cuando cambia cualquier condición la etiqueta del Reactivo LAL. La Solución D de control negativo es Agua
que pueda influir sobre los resultados de la misma. Esta prueba no es Reactivo para LAL.
válida a menos que las Soluciones A y D no muestren ninguna
reacción y el resultado de la Solución C confirme la sensibilidad
declarada en la etiqueta. Interpretación—La prueba no es válida a menos que ambas
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la determinaciones repetidas de las Soluciones B y C de control
solución de muestra en análisis de la Solución B no es menor de 0,5l positivo sean positivas y la Solución D de control negativo sea
y no es mayor de 2l, la solución de muestra no contiene factores que negativa. La preparación en análisis cumple con la prueba si se
interfieran en las condiciones experimentales utilizadas. En caso obtiene un resultado negativo en ambos tubos que contienen la
contrario, la solución de muestra que se va a examinar interfiere con Solución A. La preparación en análisis no cumple con la prueba si se
la prueba. obtiene un resultado positivo en ambos tubos que contienen la
Si la muestra en análisis no cumple con la prueba a una dilución Solución A.
menor que la MDV, repetir la prueba empleando una dilución mayor Repetir la prueba cuando se obtenga un resultado positivo en
que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad 1 tubo que contenga la Solución A y un resultado negativo en el otro.
permite una dilución mayor de la muestra que se va a examinar y La preparación en análisis cumple con la prueba cuando se obtiene
esto puede contribuir a la eliminación de la interferencia. un resultado negativo en ambos tubos que contienen la Solución A
La interferencia se puede solucionar mediante un tratamiento en el resultado de la repetición. Si la prueba es positiva para la
adecuado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. preparación en análisis a una dilución menor que la MDV, se puede
Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la repetir la prueba a una dilución que no sea mayor que la MDV.
interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración que se
describe a continuación utilizando la preparación a examinar, a la
que se ha agregado ER Endotoxina USP y ha sido sometida al
tratamiento seleccionado.
Ensayo de Coagulación método para medir el tiempo de iniciación que se necesita para
alcanzar una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción
Este ensayo cuantifica endotoxinas bacterianas en soluciones de o la velocidad de producción de turbidez.
muestras por titulación hasta punto final. El método cromogénico mide el cromóforo liberado a partir de un
Procedimiento—Preparar Soluciones A, B, C y D como se indica péptido cromogénico adecuado por medio de la reacción de las
en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba de endotoxinas con el Reactivo LAL. Según el principio de prueba
Confirmación de la Sensibilidad Declarada en la Etiqueta del empleado, esta técnica se clasifica como cromogénica de punto final
Reactivo LAL en Pruebas Preparatorias para las Técnicas de o cromogénica cinética. La técnica cromogénica de punto final se
Coagulación. basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endotoxinas
Cálculo e Interpretación—La prueba no es válida a menos que y la liberación del cromóforo al término de un perı́odo de
se cumplan las siguientes condiciones: (1) ambas determinaciones incubación. La técnica cromogénica cinética es un método para
repetidas de la Solución D de control negativo son negativas; (2) medir el tiempo de iniciación que se necesita para alcanzar una
ambas determinaciones repetidas de la Solución B de control absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad
positivo del producto son positivas; y (3) la media geométrica de la de aparición de color.
concentración de punto final de la Solución C está comprendida en el Todas las pruebas fotométricas se llevan a cabo a la temperatura
intervalo de 0,5l a 2l. de incubación recomendada por el fabricante del Reactivo LAL, que
Para determinar la concentración de endotoxinas de la Solución A, generalmente es 37 + 18.
calcular la concentración del punto final para cada serie de
determinaciones repetidas de las diluciones multiplicando cada
factor de dilución del punto final por l. La concentración de Pruebas Preparatorias para las Técnicas
endotoxina en la muestra es la media geométrica de la concentración Fotométricas
de punto final de las determinaciones repetidas (ver la fórmula
proporcionada en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Para asegurar la precisión o validez de las técnicas turbidimétricas
Declarada en la Etiqueta del Reactivo LAL en Pruebas Prepara- y cromogénicas, se realizan las pruebas preparatorias para verificar
torias para las Técnicas de Coagulación). Si la prueba se realiza con que los criterios para la curva estándar son válidos y que la solución
una solución de muestra diluida, calcular la concentración de de muestra no inhibe ni potencia la reacción. Cuando cambian las
endotoxinas en la solución de muestra original multiplicando por el condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es
factor de dilución. Si ninguna de las diluciones de la solución de necesaria la revalidación del método.
muestra es positiva en un ensayo válido, informar la concentración Verificación de los Criterios para la Curva Estándar—
de endotoxina como menor que l (si se analizó la muestra diluida, Utilizando la Solución de Endotoxina Estándar, preparar por lo
menor que l por el factor de dilución más bajo de la muestra). Si menos tres concentraciones de endotoxinas para generar la curva
todas las diluciones son positivas, la concentración de endotoxina se estándar. Realizar la prueba usando por lo menos tres determina-
informa como igual o mayor que el factor de dilución mayor ciones repetidas de cada concentración de endotoxina estándar
multiplicado por l (por ejemplo, el factor de dilución inicial siguiendo las instrucciones del fabricante del Reactivo LAL (con
multiplicado por 8 veces l en la Tabla 3). respecto a relaciones de volumen, tiempo de incubación, tempera-
El artı́culo cumple con los requisitos de la prueba si la tura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los métodos cinéticos es
concentración de endotoxinas es menor que la que se especifica en mayor de dos logaritmos, se deben incluir estándares adicionales
la monografı́a individual. para enmarcar cada aumento logarı́tmico dentro del intervalo de la
curva estándar. El valor absoluto del coeficiente de correlación, |r|,
debe ser mayor o igual a 0,980 para el intervalo de concentraciones
TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS de endotoxina indicado por el fabricante del Reactivo LAL.
Prueba de Factores de Interferencia para las Técnicas
El método turbidimétrico mide el aumento en la turbidez. Fotométricas—Seleccionar una concentración de endotoxina en
Dependiendo del principio de prueba empleado, esta técnica se o cerca de la mitad de la curva estándar de endotoxina. Preparar las
clasifica como turbidimétrica de punto final o turbidimétrica cinética. Soluciones A, B, C y D como se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo
La técnica turbidimétrica de punto final se basa en la relación la prueba en las Soluciones A, B, C y D por lo menos en duplicado
cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la turbidez según las instrucciones del Reactivo LAL utilizado (con respecto al
(absorbancia o transmisión) de la mezcla de reacción al término de volumen de la muestra y del Reactivo LAL, la relación entre el
un perı́odo de incubación. La técnica turbidimétrica cinética es un volumen de la muestra y el del Reactivo LAL, el tiempo de
incubación, etc.).
Prueba de Elución
Esta prueba está diseñada para la evaluación de extractos de
h88i PRUEBAS DE REACTIVIDAD
materiales poliméricos. El procedimiento permite la extracción de BIOLÓGICA, IN VIVO
muestras a temperaturas fisiológicas y no fisiológicas para distintos
intervalos de tiempo. Es adecuada para materiales de alta densidad y
para evaluaciones de respuesta a la dosis.
Preparación de Muestra—Preparar según se indica en la Las siguientes pruebas están diseñadas para determinar la
Preparación de Extractos, usando una Inyección de Cloruro de respuesta biológica de animales a materiales elastoméricos, plásticos
Sodio (NaCl al 0,9%) o un medio de cultivo de células de mamı́fero y otros materiales poliméricos en contacto directo o indirecto con el
sin suero como Solventes de Extracción. Si el tamaño de la Muestra paciente, o mediante la inyección de extractos especı́ficos preparados
no se puede determinar inmediatamente, usar no menos de 0,1 g de a partir del material bajo prueba. Es esencial conocer el área
material elastomérico o 0,2 g de material plástico o polimérico por especı́fica para la extracción. Cuando ésta no se puede determinar,
mL de medio de extracción. De modo alternativo, usar un medio de utilizar 0,1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otro material por
cultivo de células de mamı́fero suplementado con suero como medio cada mL de lı́quido extraı́do. También es fundamental tomar las
de extracción para simular mejor las condiciones fisiológicas. precauciones necesarias en la preparación de los materiales que se
Preparar los extractos calentando la muestra durante 24 horas en van a inyectar o instilar para evitar la contaminación con
una incubadora que contenga 5 + 1% de dióxido de carbono. microorganismos y otra materia extraña. Se describen tres pruebas.
Mantener la temperatura de extracción a 378 + 18, ya que La Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba Intracutánea se
a temperaturas superiores pueden desnaturalizarse de las proteı́nas utilizan para materiales elastoméricos, especialmente para cierres
séricas. elastoméricos para los que las Pruebas de Reactividad Biológica, In
Preparación de Control Positivo—Proceder según se indica para Vitro h87i correspondientes han indicado una reactividad biológica
la Preparación de Muestra. significativa. Estas dos pruebas se utilizan para plásticos y otros
polı́meros además de una tercera prueba, la Prueba de Implantación,
Preparación de Control Negativo—Proceder según se indica para para probar la idoneidad de estos materiales utilizados en la
la Preparación de Muestra. fabricación de envases y accesorios, en preparaciones parenterales y
Procedimiento—Usando 2 mL de suspensión de células preparada en dispositivos médicos, implantes y otros sistemas.
según se indica en la Preparación del Cultivo Celular, preparar las Estas tres pruebas se aplican a materiales o dispositivos médicos,
monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la cuando existe la necesidad de clasificar los plásticos y otros
incubación, aspirar el medio de cultivo de las monocapas y polı́meros sobre la base de las pruebas de reactividad biológica in
reemplazarlo con extractos de la Preparación de Muestra, Prepara- vivo.
ción de Control Negativo o Preparación de Control Positivo. Los A los efectos de este capı́tulo, se aplicarán las siguientes
extractos de los medios de cultivo de células suplementados con definiciones: la Muestra es la muestra en análisis o un extracto
suero y sin suero se analizan por duplicado sin dilución (100%). El preparado a partir de dicha muestra. Un Blanco consiste en la misma
extracto con Inyección de Cloruro de Sodio se diluye con el medio cantidad del mismo medio de extracción utilizado para extraer la
de cultivo de células suplementado con suero y se analiza por muestra bajo prueba, tratado de la misma manera que el medio de
duplicado a una concentración del extracto del 25%. Incubar todos extracción que contiene dicha muestra. Un Control Negativo* es una
los cultivos durante 48 horas a 378 + 18, preferentemente en una muestra que no produce ninguna reacción bajo las condiciones de
incubadora humidificada que contenga 5 + 1% de dióxido de prueba.
carbono. Examinar cada cultivo a las 48 horas, al microscopio, Clasificación de Plásticos—Se definen seis clases de plásticos
usando una tinción adecuada, si se desea. (ver Tabla 1). Esta clasificación se basa en respuestas a una serie de
Interpretación de los Resultados—Proceder según se indica para pruebas in vivo para las que se especifican extractos, materiales y
la Interpretación de los Resultados en Prueba de Difusión en Agar, vı́as de administración. Estas pruebas están directamente relaciona-
pero usando la Tabla 2. La Muestra cumple con los requisitos de la das con el uso final al que están destinados los artı́culos de plástico.
prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra no es mayor que La elección de extractantes es representativa de los vehı́culos en
grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud preparaciones con las que es probable que los plásticos entren en
del sistema no se confirma. Para realizar evaluaciones de la respuesta contacto. La clasificación de la Tabla 1 facilita la comunicación entre
a la dosis, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas proveedores, usuarios y fabricantes de plásticos ya que resume las
del extracto de la muestra. pruebas a las que deben someterse los envases de inyecciones y
dispositivos médicos en caso de ser necesaria su clasificación.
Con excepción de la Prueba de Implantación, los procedimientos
se basan en el uso de extractos que, según la resistencia térmica del
material, se preparan a una de tres temperaturas estándar: 508, 708 y
Tabla 2. Grados de Reactividad en la Prueba de Elución 1218. Por lo tanto, la designación del tipo de plástico debe estar
Grad- Reactividad Condiciones de todos los Cultivos acompañada por una indicación de la temperatura de extracción (p.
o ej., IV-1218, que representa un plástico clase IV extraı́do a 1218 o I-
508, que representa un plástico clase I extraı́do a 508).
0 Ninguna Gránulos intracitoplasmáticos dife- Los plásticos pueden clasificarse como Clases de Plástico USP I–
renciados sin lisis celular VI únicamente sobre la base de los criterios de respuesta prescritos
1 Escasa No más del 20% de las células son en la Tabla 1.
redondas, levemente adheridas, sin Esta clasificación no es válida para plásticos destinados al uso
gránulos intracitoplasmáticos; hay como envases de productos orales o tópicos o que pudieran utilizarse
algunas células lisadas como una parte integral de la formulación de un medicamento. La
2 Leve No más del 50% de las células son Tabla 1 no es válida para elastómeros naturales, los cuales deben
redondas y desprovistas de gránulos probarse con Inyección de Cloruro de Sodio y aceites vegetales
intracitoplasmáticos; no hay lisis únicamente.
celular extensiva y áreas vacı́as La Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba Intracutánea están
entre células diseñadas para determinar las respuestas biológicas sistémica y local,
3 Moderada No más del 70% de las capas respectivamente, de animales a plásticos y otros polı́meros mediante
celulares contienen células redondas la inyección monodosis de extractos especı́ficos preparados a partir
o lisadas de una Muestra. La Prueba de Implantación está diseñada para
4 Grave Destrucción casi total de las capas evaluar la reacción de tejido vivo al plástico y a otros polı́meros
celulares mediante la implantación de la Muestra propiamente dicha en tejido
*
ER Polietileno de Alta Densidad USP.
USP 30 Pruebas Biológicas / h88i Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 125
metileno) antes de utilizarlos para subdividir una muestra. Limpiar temperatura durante la extracción, el enfriamiento adecuado, el
todos los demás equipos cepillándolos bien con un detergente agitado y el proceso de decantación, ası́ como la manipulación y
adecuado y enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. conservación aséptica de los extractos después de la extracción.
Esterilizar los envases y equipos utilizados para la extracción,
transferencia y administración de material de prueba; secar con un
proceso adecuado. [NOTA—Si se usa óxido de etileno como agente Prueba de Inyección Sistémica
esterilizante, dejar transcurrir el tiempo suficiente para la desgasi-
ficación total.] Esta prueba está diseñada para evaluar respuestas sistémicas a los
Procedimiento— extractos de materiales bajo prueba después de su inyección en
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA—Tanto la Prueba de Inyección ratones.
Sistémica como la Prueba Intracutánea pueden realizarse utilizando Animal de Prueba—Utilizar ratones albinos sanos que pesen de
el mismo extracto, si se desea, o bien pueden utilizarse extractos 17 a 23 g y que no hayan sido utilizados previamente. Para cada
separados para cada prueba. Seleccionar y subdividir en porciones grupo de prueba, utilizar únicamente ratones del mismo origen.
una Muestra del tamaño indicado en la Tabla 3. Eliminar las Suministrar agua y comida ad lı́bitum, del tipo normalmente
partı́culas, como pelusas y partı́culas sueltas, tratando cada Muestra utilizado para animales de laboratorio y de composición conocida.
subdividida o Control negativo del siguiente modo: colocar la Procedimiento—[NOTA—Agitar cada extracto enérgicamente
Muestra en una probeta graduada limpia de 100 mL con tapón de antes de retirar las dosis de inyección para asegurar la distribución
vidrio de Tipo I y agregar aproximadamente 70 mL de agua para uniforme de la materia extraı́da. No obstante, no deben inyectarse
inyección. Agitar aproximadamente 30 segundos y escurrir el agua, partı́culas visibles por vı́a intravenosa.] Inyectar a cada uno de los
repetir este paso y secar las piezas preparadas para la extracción con cinco ratones del grupo de prueba la Muestra o el Blanco según se
Aceite Vegetal en un horno a una temperatura máxima de 508. indica en la Tabla 4. Diluir cada g del extracto de la Muestra
[NOTA—No limpiar la Muestra con un paño seco o húmedo ni preparada con Polietilenglicol 400 y el blanco correspondiente con
enjuagando o lavando con un disolvente orgánico, agente tensoac- 4,1 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una
tivo, etc.] solución con una concentración de aproximadamente 200 mg de
PREPARACIÓN DE EXTRACTOS—Colocar una Muestra debidamente polietilenglicol por mL.
preparada para probar en un envase de extracción y agregar 20 mL
del medio de extracción adecuado. Repetir estas indicaciones para
cada medio de extracción requerido para la prueba. Preparar también
un blanco de 20 mL de cada medio para inyecciones paralelas y Tabla 4. Procedimiento de Inyección—Prueba de Inyección
comparaciones. Extraer calentando en un autoclave a 1218 durante Sistémica
60 minutos, en un horno a 708 durante 24 horas o a 508 durante 72
horas. Dejar transcurrir suficiente tiempo para que el lı́quido que se Tasa de
encuentra dentro del envase alcance la temperatura de extracción. Inyec-
[NOTA—Las condiciones de extracción no deberı́an en ningún caso ción, mL
causar cambios fı́sicos, como fusión o derretimiento de los trozos de Dosis por por se-
Muestra, lo cual provocarı́a una reducción de la superficie Extracto o Blanco kg Vı́a* gundo
disponible. Puede tolerarse una ligera adherencia de los trozos. Inyección de Cloruro de Sodio 50 mL IV 100
Agregar siempre las piezas limpias al medio de extracción en forma Solución 1 en 20 de Alcohol en
individual. Si se utilizan tubos para cultivo para extracciones con Inyección de Cloruro de
autoclave con Aceite Vegetal, sellar las tapas de rosca en forma Sodio 50 mL IV 100
adecuada con cinta sensible a la presión.] Polietilenglicol 400 10 g IP —
Enfriar a temperatura cercana a la ambiente pero no por debajo de Excipiente del producto 50 mL IV 100
los 208, agitar enérgicamente durante varios minutos y decantar cada farmacéutico
extracto de inmediato en un recipiente seco estéril tomando las (cuando corresponda) 50 mL IP —
precauciones asépticas pertinentes. Guardar los extractos a una Aceite Vegetal 50 mL IP —
temperatura de 208 a 308 y no utilizar para las pruebas después de
*
transcurridas 24 horas. Es importante el contacto del medio de IV = intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra
extracción con la superficie disponible del plástico y el tiempo y la oleaginosa y blanco).
Observar a los animales de inmediato después de la inyección, determinar la puntuación media de cada Muestra versus la de cada
nuevamente 4 horas después de la inyección y luego a las 24, 48 y Blanco correspondiente. Los requisitos de la prueba se habrán
72 horas como mı́nimo. Si durante el perı́odo de observación cumplido si la diferencia entre la puntuación media de la Muestra y
ninguno de los animales tratados con el extracto de la Muestra el Blanco es de 1,0 o menos. Si en cualquier perı́odo de observación,
evidencia una reactividad biológica significativamente mayor que los la reacción promedio a la Muestra es cuestionablemente mayor que
animales tratados con el Blanco, la Muestra cumple con los la reacción promedio al Blanco, repetir la prueba utilizando tres
requisitos de esta prueba. Si dos o más ratones mueren, o si se conejos adicionales. Los requisitos de la prueba se habrán cumplido
produce una conducta anormal, como por ejemplo convulsiones si la diferencia entre la puntuación media de la Muestra y el Blanco
o postración, en dos o más ratones, o si se registra una pérdida de es de 1,0 o menos.
peso de más de 2 g en tres o más ratones, la Muestra no cumple con
los requisitos de la prueba. Si cualquiera de los animales tratados con
la Muestra sólo presenta signos leves de reactividad biológica y no Prueba de Implantación
más de un animal presenta sı́ntomas fuertes de reactividad biológica
o muere, repetir la prueba utilizando grupos de 10 ratones. Al repetir La prueba de implantación está diseñada para la evaluación de
la prueba, los 10 animales tratados con la Muestra no muestran materiales plásticos y otros materiales poliméricos que están en
reactividad biológica significativa superior a la de los animales contacto directo con tejido vivo. Es importante la preparación
tratados con el Blanco durante el perı́odo de observación. adecuada de la tiras de implante y su adecuada implantación bajo
condiciones asépticas. Preparar para su implantación 8 tiras de la
Muestra y 4 tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP. Cada tira
Prueba Intracutánea deberı́a medir no menos de 10 6 1 mm. Los bordes de las tiras
deberı́an ser lo más liso posible para evitar traumatismos mecánicos
Esta prueba está diseñada para evaluar respuestas locales a los adicionales durante la implantación. Las tiras del tamaño mı́nimo
extractos de materiales bajo prueba después de su inyección especificado se implantan con una aguja hipodérmica (calibre 15
intracutánea en conejos. a 19) con punta intravenosa y un trocar estéril. Utilizar agujas
Animal de Prueba—Seleccionar conejos albinos sanos de piel previamente esterilizadas dentro de las cuales se hayan insertado
delgada que puedan esquilarse bien y cuya piel esté libre de asépticamente las tiras de plástico estériles o insertar cada tira limpia
irritación mecánica o traumatismos. Al manipular los animales, en una aguja, la cánula y el conector protegiéndola con una cubierta
evitar tocar los sitios de la inyección durante los perı́odos de apropiada y luego someter al procedimiento de esterilización
observación, salvo para discriminar entre edema y residuos de aceite. adecuado. [NOTA—Permitir la desgasificación adecuada si se utilizan
[NOTA—Los conejos previamente utilizados en otras pruebas no agentes como por ejemplo óxido de etileno.]
relacionadas, como por ejemplo la Prueba de Pirógeno h151i y que Animal de Prueba—Seleccionar conejos adultos sanos con un
hayan tenido el perı́odo de descanso prescrito podrán utilizarse para peso de al menos 2,5 kg y cuyos músculos paravertebrales sean lo
esta prueba, siempre y cuando tengan la piel limpia y sin defectos.] suficientemente grandes para permitir la implantación de las tiras de
Procedimiento—[NOTA—Antes de retirar las dosis de inyección, prueba. No utilizar ningún tejido muscular que no sea el sitio
agitar cada extracto enérgicamente para asegurar la distribución paravertebral. Los animales deben anestesiarse con un agente
uniforme de la materia extraı́da.] El dı́a de la prueba, esquilar bien el anestésico de uso común hasta un grado suficiente como para
lomo del animal a ambos lados de la columna vertebral sobre un área evitar los movimientos musculares, como por ejemplo los espasmos.
de prueba lo suficientemente grande. Evitar la irritación y los Procedimiento—Realizar la prueba en un área limpia. El dı́a de la
traumatismos mecánicos. Eliminar los pelos sueltos mediante prueba, o hasta 20 horas antes, esquilar a los animales a ambos lados
aspiración. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con de la columna vertebral. Eliminar los pelos sueltos mediante
un hisopo humedecido en alcohol diluido y secar antes de aplicar la aspiración. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con
inyección. Puede utilizarse más de un extracto de un determinado un hisopo con alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyección.
material por conejo, siempre y cuando se haya determinado que los Implantar cuatro tiras de la Muestra en el músculo paravertebral
resultados de la prueba no se verán afectados. Para cada Muestra a un lado de la columna de dos conejos, 2,5 a 5 cm respecto de la
utilizar dos animales e inyectar a cada uno por vı́a intracutánea, lı́nea media y en forma paralela a la columna vertebral, con una
utilizando un lado del animal para la Muestra y el otro lado para el separación de aprox. 2,5 cm entre sı́. De manera similar, implantar
Blanco, según se indica en la Tabla 5. [NOTA—Diluir cada g del dos tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP en el músculo
extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el opuesto de cada animal. Insertar un estilete estéril en la aguja para
Blanco correspondiente, con 7,4 volúmenes de Inyección de Cloruro sostener la tira de implante en el tejido mientras se extrae la aguja.
de Sodio para obtener una solución con una concentración de En caso de observar sangrado excesivo después de implantar una
aproximadamente 120 mg de polietilenglicol por mL.] tira, colocar una tira duplicada en otro lugar.
Mantener los animales durante 120 horas como mı́nimo y luego
sacrificarlos al final del perı́odo de observación administrándoles una
Tabla 5. Prueba Intracutánea sobredosis de un agente anestésico u otros agentes adecuados. Dejar
transcurrir suficiente tiempo para cortar el tejido sin sangrado.
Número de Sitios Examinar macroscópicamente el área del tejido que rodea la porción
Extracto o Blanco (por animal) Dosis, mL por sitio central de cada tira de implante. Utilizar una lente de aumento y una
Muestra 5 200 fuente de luz auxiliar. Observar los sitios de implante de la Muestra y
Blanco 5 200 de Control para detectar la presencia de hemorragia, necrosis,
coloración e infecciones y registrar las observaciones. Medir la
encapsulación, si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula
Examinar los sitios de inyección en busca de evidencia de (desde la periferia del espacio ocupado por el Control o la Muestra
cualquier reacción del tejido, como por ejemplo eritema, edema y del implante hasta la periferia de la cápsula) redondeado al 0,1 mm
necrosis. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con un más cercano. Calificar la encapsulación según se indica en la Tabla
hisopo con alcohol diluido para facilitar la lectura de los sitios de 6.
inyección. Observar a todos los animales 24, 48 y 72 horas después
de la inyección. Califique las observaciones en una escala numérica Tabla 6. Evaluación de la Encapsulación en la Prueba de
para el extracto de la Muestra y para el Blanco, utilizando la Tabla 2. Implantación
Vuelva a esquilar el pelaje según sea necesario durante el perı́odo de
observación. Las puntuaciones promedio de eritema y edema para Ancho de la cápsula Puntuación
los sitios de la Muestra y el Blanco se determinan en cada intervalo
de puntuación (24, 48 y 72 horas) para cada conejo. Después de la Ninguna 0
puntuación de las 72 horas, todas las puntuaciones de eritema más hasta 0,5 mm 1
las puntuaciones de edema se suman por separado para cada Muestra 0,6–1,0 mm 2
y Blanco. Dividir cada uno de los totales por 12 (2 animales 1,1–2,0 mm 3
6 3 perı́odos de puntuación X 2 categorı́as de puntuación) para Mayor que 2,0 mm 4
128 h91i Valoración de Pantotenato de Calcio / Pruebas Biológicas USP 30
Calcular las diferencias entre puntuaciones promedio para los prueba una segunda vez. Utilizar el doble de animales de la especie
sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se pertinente que se utilizaron en la prueba inicial. Si los animales
habrán cumplido si la diferencia no es mayor que 1,0, o si la cumplen con los criterios especificados para la prueba inicial, se
diferencia entre las puntuaciones medias de la Muestra y el Control habrá cumplido con los requisitos de la prueba.
para más de uno de los cuatro sitios de implantación no es mayor que
1 en cualquiera de los animales implantados.
PRUEBAS DE SEGURIDAD—PRODUCTOS
BIOLÓGICOS h91iVALORACIÓN DE
La prueba de seguridad aquı́ descrita está diseñada para detectar PANTOTENATO DE CALCIO
cualquier reactividad biológica imprevista e inaceptable en un
artı́culo. Esta prueba in vivo es para la evaluación de seguridad de
los productos biológicos (ver Productos Biológicos h1041i) y los
productos derivados de la biotecnologı́a. Estándares de Referencia USP h11i—ER Pantotenato de Calcio
USP.
Solución Madre del Estándar de Pantotenato de Calcio—En
Prueba de Seguridad un matraz volumétrico de 1000 mL, disolver, en aproximadamente
500 mL de agua, 50 mg de ER Pantotenato de Calcio USP,
Seleccionar cinco ratones sanos que no hayan sido utilizados previamente secado y almacenado en un lugar oscuro sobre
previamente para pruebas y que pesen de 17 a 23 g, a menos que se pentóxido de fósforo, y pesado con exactitud evitando la absorción
indique algo diferente en la monografı́a individual correspondiente de humedad durante la pesada. Agregar 10 mL de ácido acético
o en otra parte de este capı́tulo, mantenidos con una dieta equilibrada 0,2 N y 100 mL de solución de acetato de sodio (1 en 60) y diluir
adecuada. Preparar una solución de prueba según las indicaciones de a volumen con agua. Cada mL contiene 50 mg de ER Pantotenato de
la monografı́a individual correspondiente. A menos que se indique lo Calcio USP. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
contrario en la monografı́a individual o en otra parte de este capı́tulo,
inyectar por vı́a intravenosa una dosis de 0,5 mL de la solución de Preparación Estándar—Diluir, el mismo dı́a de la valoración, un
prueba a cada uno de los ratones, utilizando una aguja calibre 26 de volumen medido de Solución Madre del Estándar de Pantotenato de
la longitud adecuada o especificada a continuación, según Calcio con una cantidad de agua suficiente para obtener entre 0,01
corresponda. Observar a los animales durante las 48 horas mg y 0,04 mg de pantotenato de calcio por mL, cuya concentración
posteriores a la inyección. Si, al cabo de las 48 horas, todos los exacta sea tal que las respuestas obtenidas según se indica en el
animales sobreviven y no más de uno de los animales presenta Procedimiento, utilizando 2,0 y 4,0 mL de la Preparación Estándar,
sı́ntomas externos de una reacción inesperada debido al nivel de se encuentren en la parte lineal de la curva de respuesta en función
toxicidad relacionado con el artı́culo, se habrán cumplido los del logaritmo de la concentración.
requisitos de esta prueba. Si uno o más animales mueren o si más de Preparación de Valoración—Proceder según se indica en la
uno de los animales presenta signos de toxicidad anormal o indebida monografı́a individual y preparar una solución que se espera que
del artı́culo bajo prueba, repetir la prueba utilizando al menos otros contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de
10 ratones similares a los utilizados para la prueba inicial pero con pantotenato de calcio en la Preparación Estándar.
un peso de 20 + 1 g. En cualquiera de los casos, si todos los Solución Madre de Medio Basal—
animales sobreviven durante 48 horas y no muestran sı́ntomas de una
reacción indicativa de un nivel de toxicidad anormal o indebido del Solución de Hidrolizado Ácido de Caseı́na . . . . . . . . 25 mL
artı́culo, se habrán cumplido los requisitos de la prueba. Solución de Cistina–Triptófano . . . . . . . . . . . . . . . . 25 mL
Para los productos biológicos, realizar la prueba según los Solución de Polisorbato 80 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 mL
procedimientos que se describen en Reglamentaciones Federales Dextrosa, Anhidra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g
(ver Productos Biológicos h1041i), Sección 610.11, utilizando no Acetato de Sodio, Anhidro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5g
menos de dos ratones similares a los descritos más arriba pero con un Solución de Adenina–Guanina–Uracilo . . . . . . . . . . 5 mL
peso de menos de 22 g y no menos de dos cobayas sanas que pesen Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Bio- 5 mL
menos de 400 g. A menos que se indique lo contrario en la tina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
monografı́a individual, para un producto lı́quido o un producto Solución de Ácido Paraaminobenzoico–Niacina–Clor-
criodesecado que se ha constituido según se indica en la etiqueta, hidrato de Piridoxina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
inyectar un volumen de 0,5 mL por vı́a intraperitoneal en cada ratón Solución Salina A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
y un volumen de 5,0 mL por vı́a intraperitoneal en cada cobaya. En Solución Salina B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
el caso de productos deshidratados por congelación para los que el
volumen de constitución no está indicado en la etiqueta, o en el caso
de productos no lı́quidos que no sean productos criodesecados, Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones
realizar la prueba utilizando la vı́a de administración, la dosis de previamente mezcladas y ajustar con hidróxido de sodio 1 N a un pH
prueba y el diluyente aprobados por el Centro de Evaluación de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 mL y mezclar.
e Investigación Biológica (FDA), sobre la base de evidencia Solución de Hidrolizado Ácido de Caseı́na—Mezclar 100 g de
sustancial que demuestre que la variación de la prueba asegurara caseı́na sin vitaminas con 500 mL de ácido clorhı́drico 6 N y someter
una sensibilidad igual o superior a la de la prueba arriba descrita. la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhı́drico
Observar a los animales durante 7 dı́as como mı́nimo. Si todos los de la mezcla mediante destilación bajo presión reducida hasta que
animales sobreviven el perı́odo de prueba, no presentan ninguna quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en agua,
respuesta que no sea especı́fica del producto o esperable y que pueda ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 + 0,1
indicar una diferencia en la calidad de dicho producto, y si los y agregar agua para obtener 1000 mL. Agregar 20 g de carbón
animales no pesan menos al finalizar el perı́odo de prueba que en el activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con
momento en que se aplicó la inyección, entonces se habrán cumplido carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una
los requisitos de la prueba. Si el artı́culo no cumple con los temperatura no inferior a 108. Filtrar la solución si se formara un
requisitos, podrá repetirse la prueba como en la prueba inicial, en precipitado durante el almacenamiento.
una o ambas especies en las que no se cumplieron. Si los animales Solución de Cistina–Triptófano—Suspender 4,0 g de L-cistina y
cumplen con los criterios especificados para la prueba inicial, el 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un volumen de
artı́culo cumple con los requisitos de la prueba. Si el artı́culo no agua entre 700 y 800 mL, calentar hasta entre 708 y 808 y agregar,
cumple con los requisitos después de la primera repetición de la gota a gota y agitando, ácido clorhı́drico diluido (1 en 2), hasta que
prueba, y ha sobrevivido más del 50% de la cantidad total de los sólidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000
animales de las especies en las que no se cumplieron los requisitos mL. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no
en la prueba inicial y la repetición combinadas, podrá repetirse la inferior a 108.
USP 30 Pruebas Biológicas / h111i Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 129
denominará a cada una de estas preparaciones ‘‘Estándar’’ y a cada estos casos, ni las diferencias promedio entre individuos ni el orden
preparación que se está valorando, o Muestra, la ‘‘Incógnita,’’ y se de los tratamientos pueden influir de manera parcial en la potencia
designarán respectivamente con las letras S y U. (A veces se o en la precisión. En las valoraciones microbiológicas de actividad
denomina ‘‘preparación de prueba’’ a la Muestra.) de vitamina B12 y de pantotenato de calcio, las réplicas, en sus
Después de eliminar las variables extrañas de la comparación respectivos tubos, se asignan a dos o más conjuntos separados y
entre el Estándar y la Incógnita, se calculará la varianza del error completos, preferentemente distribuyendo los tubos al azar dentro de
a partir de la variación restante que, a pesar de que no se puede cada conjunto. Esto restringe la variación causada por la posición
controlar, se puede medir. Se necesita la varianza del error para u orden dentro de un conjunto a las diferencias dentro de cada réplica
calcular el intervalo de confianza de la potencia valorada. El completa.
intervalo de confianza se calcula de modo tal que se espera que los Rechazo de Observaciones Aberrantes o Erráticas—Una
lı́mites inferior y superior de este intervalo cubran la potencia respuesta que es dudosa debido a que no cumple con el
verdadera de la Incógnita en 19 de cada 20 valoraciones. Muchas procedimiento durante el curso de una valoración es rechazada.
valoraciones fijan la amplitud aceptable del intervalo de confianza y Otros valores aberrantes pueden descubrirse sólo después de tabular
puede que se necesiten dos o más valoraciones independientes para las respuestas, pero entonces pueden relacionarse con irregularidades
cumplir el lı́mite especificado. Los lı́mites de confianza de las en la valoración que justifiquen su omisión. El rechazo arbitrario o la
valoraciones de los componentes individuales generalmente se conservación arbitraria de un resultado aparentemente aberrante
superponen. pueden ser una importante fuente de parcialidad. Por lo general, el
El objetivo de este capı́tulo es presentar un resumen conciso de los rechazo de observaciones que se basa únicamente en su magnitud
procedimientos biométricos para las valoraciones biológicas de la relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
USP. Las diferentes secciones están interrelacionadas. Aunque los Cuando esto sea inevitable, cada respuesta que se sospecha es
procedimientos se diseñan fundamentalmente para la valoración de aberrante o anómala deberá analizarse conforme a uno de los
una única Incógnita, las ecuaciones para la valoración conjunta de criterios siguientes:
varias Incógnitas se ofrecen en contexto a lo largo del capı́tulo y 1. El primer criterio se basa en la variación dentro de un grupo
aparecen en forma de resumen en el último apartado. La prueba de único de respuestas supuestamente equivalentes. En promedio se
que una potencia valorada cumple con los requisitos necesarios rechazará una observación válida una vez cada 25 o una vez cada 50
respecto a los lı́mites de confianza también puede basarse en otros pruebas siempre que pocas o ninguna de las respuestas en el grupo
métodos biométricos reconocidos que tengan una precisión equiva- sean idénticas. Empezando con el valor supuestamente aberrante
lente a los métodos que se describen en este documento. o errático, se deben designar las respuestas en orden de magnitud de
Al final de este capı́tulo se incluye un glosario de los términos y1 a yN, en donde N representa el número de observaciones en el
utilizados en las ecuaciones. grupo. Calcular el intervalo relativo G1 = (y2 – y1)/(yN – y1) cuando N
= 3 a 7, G2 = (y3 – y1)/(yN–1 – y1) cuando N = 8 a 13, o G3 = (y3 – y1)/
(yN–2 – y1) cuando N = 14 a 24. Si G1, G2 o G3 exceden el valor crı́tico
Pasos Previos al Cálculo de la Potencia que aparece en la Tabla 1 para el valor de N observado, existe una
base estadı́stica para omitir el valor aberrante.
Diseños para Minimizar la Varianza del Error—La variación Este criterio también se aplica a las valoraciones microbiológicas,
en la respuesta se reduce tanto como es posible mediante los lı́mites en las que cada tratamiento se representa mediante una transmitancia
impuestos con respecto al peso corporal, la edad, la manipulación en cada uno de dos conjuntos completos separados. El valor de cada
previa, el entorno y otros factores similares. En algunas valoracio- transmitancia en el primer conjunto se resta de su valor pareado en el
nes, las diferentes dosis del Estándar y de la Incógnita se asignan de segundo conjunto y se registra cada diferencia con su signo, ya sea
manera aleatoria a los animales de prueba o sus equivalentes, pero positivo o negativo. Comenzando con la diferencia más divergente,
dividiéndolos en grupos con igual número de individuos. Esto se designan las N diferencias en orden de magnitud de y1 a yN y se
implica un proceso objetivo de selección al azar, como por ejemplo calcula el intervalo relativo G1, G2 o G3. Si esta diferencia excede su
tirar los dados, barajar las cartas o utilizar una tabla con números valor crı́tico que aparece en la Tabla 1, una de las dos transmitancias
aleatorios. Al asignar el mismo número de individuos a cada que producen la diferencia aberrante es sospechosa y puede
tratamiento, los cálculos se simplifican sustancialmente y, por lo identificarse por inspección o por comparación con su valor
general, también da lugar al menor intervalo de confianza para un esperado (ver la siguiente columna). Se repite el proceso con las
número dado de observaciones. diferencias restantes si se sospechara un valor aberrante en un
En algunas valoraciones, las respuestas potenciales pueden segundo par.
reunirse en conjuntos homogéneos antes del tratamiento. Las 2. El segundo criterio compara los intervalos de una serie de k =
diferencias entre los conjuntos se pueden separar posteriormente, 2 o más grupos. Grupos diferentes pueden recibir tratamientos
de manera que no afecten adversamente ni a la potencia calculada ni diferentes pero todas las respuestas f dentro del mismo grupo
a su intervalo de confianza. Cada tratamiento se adjudica a una representan el mismo tratamiento. Calcular el intervalo de cada
unidad seleccionada aleatoriamente dentro de cada conjunto. grupo restando la respuesta menor de la respuesta mayor dentro de
Ejemplos de conjuntos aleatorios son las zonas trasparentes en una cada uno de los k grupos. Dividir el mayor de los k intervalos entre la
placa individual en la valoración de un antibiótico o cuatro lecturas suma de todos los intervalos en la serie. Consultar este cociente R*
pareadas sucesivas en la misma rata en la valoración de la Inyección en la Tabla 2. Si k no es mayor de 10, usar los valores tabulados que
de Vasopresina. Se presentan conjuntos de dos cuando cada animal figuran en la parte superior de la Tabla 2; si k es mayor de 10,
de prueba se emplea dos veces, como en las valoraciones de multiplicar R* por (k + 2) e interpolar, si fuera necesario, entre los
Inyección de Cloruro de Tubocurarina y de Inyección de Insulina. En valores tabulados en la parte inferior de la Tabla 2. Si R* excede el
Tabla 1
Prueba para detectar valores aberrantes. En muestras tomadas de una población normal, los intervalos iguales o mayores que los siguientes
valores de G1, G2 y G3 suceden con una probabilidad de P = 0,02 en donde los valores aberrantes pueden suceder sólo en uno de los extremos
o con una probabilidad de P = 0,04 en donde pueden ocurrir en cualquiera de los dos extremos.
N 3 4 5 6 7
G1 0,976 0,846 0,729 0,644 0,586
N 8 9 10 11 12 13
G2 0,780 0,725 0,678 0,638 0,605 0,578
N 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
G3 0,602 0,579 0,559 0,542 0,527 0,514 0,502 0,491 0,481 0,472 0,464
USP 30 Pruebas Biológicas / h111i Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 131
valor interpolado o tabulado, el grupo con el intervalo mayor es (b) Si la valoración consiste en grupos tomados al azar, reemplazar
sospechoso y la inspección de sus componentes generalmente el valor faltante mediante:
permitirá identificar la observación que luego se asumirá que es
aberrante o anómala. Se puede repetir el proceso con los intervalos
restantes si se sospechara un valor aberrante en un segundo grupo.
Reemplazo de Valores Faltantes—Tal como se indica en las
monografı́as y en este apartado, el cálculo de la potencia y su
intervalo de confianza a partir de la respuesta total para cada dosis de
cada preparación requiere el mismo número de observaciones en
cada total. Cuando se pierden observaciones o se han obtenido donde f es el número de conjuntos, k es el número de tratamientos
respuestas adicionales con el Estándar, el equilibrio se puede o dosis y Tr’, Tt’ y T ’ son los totales incompletos para el conjunto
restablecer mediante uno de los siguientes procedimientos a fin de aleatorio, el tratamiento y la valoración a los que les falta una
que se puedan emplear las ecuaciones usuales. observación.
1. Reducir el número de observaciones en los grupos más grandes Si la valoración consiste en n’ cuadrados latinos con k filas en
hasta que el número de respuestas sea el mismo para cada común, reemplazar un valor faltante mediante
tratamiento. Si se han asignado aleatoriamente a cada grupo de
tratamiento se puede omitir una o más respuestas, seleccionadas
aleatoriamente, de cada grupo más grande o se puede restar la media
de cada grupo más grande de su total inicial, cuantas veces sea
necesario. Se prefiere esta última técnica cuando se han asignado
deliberadamente animales adicionales para el Estándar. Cuando la
valoración consiste en conjuntos aleatorios, deben retenerse sólo los en donde n’ es el número de cuadrados latinos con k filas en común,
conjuntos completos. k es el número de tratamientos o dosis y Tc’, Tr’, Tt’ y T ’ son
2. Alternativamente, un grupo más pequeño ocasional puede respectivamente los totales incompletos para la columna, fila,
llevarse al tamaño adecuado cuando el número de respuestas tratamiento y valoración a los que les falta una observación.
faltantes no sea más de una en cualquier tratamiento, o no represente Si falta más de un valor, sustituir temporalmente los lugares
más del 10% de la totalidad de la valoración. Estimar el valor de vacı́os, excepto uno, con la media del tratamiento y calcular y’ para
reemplazo para cada valor faltante ya sea por el método a o el el otro mediante la Ecuación 1. Reemplazar a su vez cada una de las
método b. Se pierde un grado de libertad (n) de la varianza del error sustituciones iniciales mediante la Ecuación 1 y repetir el proceso en
s2 por cada reemplazo realizado mediante cualquiera de los dos aproximaciones sucesivas hasta obtener una y’ estable para cada
métodos, excepto en las valoraciones microbiológicas en donde cada observación faltante.
respuesta está basada en la suma de dos o más transmitancias y sólo
se reemplaza una transmitancia.
(a) Si los animales han sido asignados aleatoriamente a los Cálculo de la Potencia a partir de una Valoración
tratamientos, sumar la media de las respuestas restantes del grupo Única
incompleto a su total. En una valoración microbiana, cuando para un
tratamiento dado falte una de dos transmitancias, para obtener el En las monografı́as individuales se dan instrucciones para calcular
reemplazo sumar a la transmitancia restante la diferencia media entre la potencia a partir de los datos de una valoración única. En aquellas
conjuntos, calculada a partir de todos los pares completos. valoraciones que especifican una interpolación gráfica de curvas de
dosis-respuesta pero que cumplen las condiciones para la validez de
la valoración que se establecen en este documento, la potencia se
puede calcular alternativamente por el método apropiado de este
apartado.
Tabla 2
Prueba para grupos que contienen valores aberrantes. Calcular el intervalo de las f observaciones en cada uno de los k grupos, cuando todos
los grupos de la serie son de igual tamaño. El cociente R* observado entre el intervalo mayor y la suma de los k intervalos deberá exceder
o ser igual a los siguientes valores crı́ticos con una probabilidad de
P = 0,05.
N8 de R* Crı́tico para Intervalos de f Observaciones Cada Uno
Intervalos 2 3 4 5 6 7 8 9 10
k
La planificación de la valoración implica asignar una potencia la posición de la relación de la respuesta en función del logaritmo de
supuesta a la Incógnita, para poder administrarla en dosificaciones la dosis usando dos o más niveles del Estándar o, preferentemente,
equivalentes a las del Estándar. Mientras más aproximada sea la del Estándar y de la Incógnita.
concordancia entre esta suposición inicial y el resultado de la En la valoración de la Heparina Sódica, el intervalo entre la dosis
valoración, más precisa será la potencia calculada. El cociente entre con la que ocurre la coagulación y la dosis que no produce
una dosis dada del Estándar, en mg o Unidades USP y la dosis coagulación es tan pequeño que la curva dosis-respuesta no se
correspondiente de la Incógnita, medido como se especifica en la determina explı́citamente. En su lugar, se usan promedios móviles
monografı́a, se designa de manera uniforme como R. El logaritmo de para interpolar el logaritmo de la dosis correspondiente al 50% de
la potencia relativa en cantidades que inicialmente se supone que son coagulación, tanto para el Estándar como para la Incógnita, que
iguales a las del Estándar, se designa como M’. llevan al logaritmo de la potencia (ver Cálculos en Heparina
Idealmente, M’ no debiera diferir significativamente de cero. El Sódica). La precisión de la potencia se estima a partir de la
logaritmo de la potencia es: concordancia entre valoraciones independientes de la misma
Incógnita.
En el caso de un fármaco al que se le realiza una valoración
biológica, la respuesta debe graficarse como una lı́nea recta frente al
logaritmo de la dosis a lo largo de un intervalo adecuado de dosis.
Cuando se requiere una prueba preliminar o la valoración depende
o de la interpolación a partir de una curva de dosis múltiples del
Estándar, se graficará en papel milimetrado la respuesta media del
Estándar a cada nivel de dosis en el eje de las ordenadas frente al
logaritmo de la dosis x en el eje de las abscisas. Si la representación
muestra una tendencia básicamente lineal a lo largo del intervalo de
dosis requerido, la unidad de respuesta inicial se puede usar
directamente como y; si por el contrario la tendencia es visiblemente
curvilı́nea, una transformación adecuada de cada lectura inicial podra
conferir linealidad.
Valoraciones a partir de Determinaciones Directas de la Dosis Una posibilidad para ello es la trasformación en logaritmos; otra
Umbral— La Inyección de Cloruro de Tubocurarina y el Yoduro de transformación, en el caso de las valoraciones microbiológicas en
Metocurarina se valoran a partir de la dosis umbral mı́nima que tubos de ensayo, en donde y = (100 – % de transmitancia) no se
produce una respuesta biológica caracterı́stica. El cociente entre la representa gráficamente en forma lineal en función del logaritmo de
dosis umbral media para el Estándar y la dosis umbral media para la la dosis x, es la trasformación en probitas. En este caso, si la
Incógnita proporciona directamente la potencia. La dosis umbral se absorbancia no se puede leer directamente, en primer lugar el
determina dos veces en cada animal, una vez con el Estándar y una porcentaje de transmitancia para cada tubo o solución de prueba se
vez con la Incógnita. Cada dosis se convierte en su logaritmo, se debe convertir en la absorbancia A = 2 – log(% de transmitancia).
determina la diferencia (x) entre los dos logaritmos de las dosis para Cada valor de absorbancia, a su vez se convierte en un % de
cada animal y se calcula la potencia a partir del promedio de estas reducción del crecimiento bacteriano como lo expresa la fórmula:
diferencias.
En la Prueba de Endotoxinas Bacterianas h85i, el punto final de
la dilución de la media geométrica para la Incógnita que corresponde
al punto final de la dilución de la media geométrica del Estándar
(multiplicado por un factor de dilución, si fuera aplicable)
proporciona la concentración de endotoxinas en el material en
análisis. en donde Ac es la densidad media para los tubos control (sin
En estas valoraciones, el intervalo de confianza depende de la antibióticos o con exceso de vitamina) en el mismo conjunto
variabilidad en la dosis umbral. o gradilla de tubos. La reducción porcentual se transforma luego en
Valoraciones Indirectas a partir de la Relación entre el probitas (ver Tabla 3) a fin de obtener una nueva y para cálculos
Logaritmo de la Dosis y la Respuesta —Por lo general, la dosis posteriores. La transformación en probitas ofrece la ventaja de
umbral no puede medirse directamente; por lo tanto, la potencia se ampliar el intervalo de trabajo de linealidad aún cuando una porción
determinará indirectamente por comparación de las respuestas de la relación dosis-respuesta no sea lineal en las unidades originales
a dosis conocidas del Estándar con las respuestas después de una de porcentaje de transmitancia, siempre que el perı́odo de incubación
o varias dosis similares de la Incógnita. Dentro de un intervalo de no se extienda mas allá de la fase logarı́tmica de crecimiento de los
dosificación restringido, generalmente se puede graficar una medida tubos de control.
adecuada de la respuesta como una lı́nea recta frente al logaritmo de La DL50 en la prueba de Seguridad para Hierro Dextrán,
la dosis, lo que simplifica el cálculo de la potencia y su intervalo de Inyección se calcula con logaritmos de dosis y probitas. Las cuatro
confianza. En cada valoración se determinan tanto la pendiente como dosis de la Inyección, en mg de hierro por kg de peso corporal se
Tabla 3
Probitas (desviación normal + 5) correspondientes a los porcentajes que figuran en los márgenes.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
transforman en x1 = 2,574, x2 = 2,699, x3 = 2,875 y x4 = 3,000. Las pueden calcularse directamente usando los coeficientes x* que
probitas correspondientes al número de muertes observadas en cada figuran en la Tabla 4, que corresponden a los sucesivos k logaritmos
grupo de 10 ratones se designan respectivamente como y1, y2, y3 e y4 de dosis, como
y figuran en la Tabla 3 para mortalidades de 10 a 90 por ciento. Para
las muertes observadas de 0 y 10 adyacentes a las dosis que
proporcionan una mortalidad intermedia, emplear las probitas
aproximadas de 3,02 y 6,98 respectivamente; omitir el valor final
(a x1 o x4) si no es adyacente a una mortalidad intermedia. Puesto que
la información en una probita varı́a con su valor esperado, se debe
asignar a cada probita una ponderación relativa aproximada w para
calcular la DL50 de la Inyección, como se muestra en la siguiente
tabla.
en donde representa de manera uniforme ‘‘la suma de’’ los valores
N8 de 0 ó 10 1 ó 9 2u8 3 ó 7 4a6 que le siguen. Cuando YL e YH se representan gráficamente en
Muertes función del logaritmo de las dosis bajas y altas, XL y XH,
respectivamente, pueden conectarse mediante una lı́nea recta con
Ponderación, 0,3 0,7 1,0 1,2 1,3 la pendiente
w
Tabla 4
Coeficientes x* para calcular las respuestas YL e YH pronosticadas mediante los cuadrados mı́nimos para el valor inferior y superior de k
logaritmos de dosis cuando estos se encuentran espaciados a intervalos iguales.
Extremo Pro- Coeficiente x* para Respuesta Media yt al Logaritmo de Dosis
N8 de Dosis nosticado Y 1 2 3 4 5 6 Divisor
3 YL 5 2 –1 6
YH –1 2 5 6
4 YL 7 4 1 –2 10
YH –2 1 4 7 10
5 YL 3 2 1 0 –1 5
YH –1 0 1 2 3 5
6 YL 11 8 5 2 –1 –4 21
YH –4 –1 2 5 8 11 21
134 h111i Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 30
Tabla 5
Coeficientes x1 para calcular la pendiente b de una curva de logaritmo de dosis-respuesta cuando las dosis están espaciadas como se muestra
en la escala aritmética.
Coeficientes x1 para Calcular b a partir de las Respuestas y a Dosis, en mL, de
Media del
Logaritmo de
N8 de Dosis 1 1,5 2 3 4 5 Divisor eb’i Dosis x
produzca cada respuesta y observada de una Incógnita se calcula por En una valoración completamente balanceada, tal como la
interpolación a partir de la curva y luego se ajusta teniendo en cuenta valoración de corticotropina, calcular M’ con los coeficientes que
la concentración conocida de su solución de prueba. figuran en la Tabla 6. Si una preparación tiene una diferencia de
Cuando la respuesta frente al Estándar puede graficarse line- menos de una dosis respecto de la otra pero los sucesivos intervalos
almente en función del logaritmo de la dosis, se ajusta numérica- de los logaritmos de dosis del Estándar y de la Incógnita difieren en
mente mediante una lı́nea recta, como se describió en la sección un intervalo constante i, usar los coeficientes factoriales que
precedente. Para determinaciones en conjuntos aleatorios, la curva aparecen en la Tabla 7, corrigiendo en función de la diferencia
del estándar se calcula con b para la valoración e y para cada existente entre la media de los logaritmos de dosis observada, xS y xU,
conjunto y la respuesta yU en cada tubo de una Incógnita dada en ese calculando:
conjunto se convierte a un logaritmo de la potencia relativa estimada,
Tabla 6
Coeficientes factoriales x1 para analizar una valoración biológica balanceada, en la que los sucesivos logaritmos de dosis del Estándar (Si) y
de la Incógnita Ui) están espaciados de igual manera y cada uno tiene el mismo número (f) de respuestas que suman un total de Tt.
Coeficientes Factoriales x1 para Cada Dosis
Diseño Fila S1 S2 S3 S4 U1 U2 U3 U4 ei Ti
2,2 a –1 –1 1 1 4 Ta
b –1 1 –1 1 4 Tb
ab 1 –1 –1 1 4 Tab
3,3 a –1 –1 –1 1 1 1 6 Ta
b –1 0 1 –1 0 1 4 Tb
ab 1 0 –1 –1 0 1 4 Tab
q 1 –2 1 1 –2 1 12 Tq
aq –1 2 –1 1 –2 1 12 Taq
4,4 a –1 –1 –1 –1 1 1 1 1 8 Ta
b –3 –1 1 3 –3 –1 1 3 40 Tb
ab 3 1 –1 –3 –3 –1 1 3 40 Tab
q 1 –1 –1 1 1 –1 –1 1 8 Tq
aq –1 1 1 –1 1 –1 –1 1 8 Taq
Tabla 7
Coeficientes factoriales x1 para analizar una valoración parcialmente balanceada, en la que los sucesivos logaritmos de dosis del Estándar (Si)
y de la Incógnita Ui) están espaciados de igual manera y cada uno tiene el mismo número ( f ) de respuestas que suman un total de Tt. Si el
número de las dosis sucesivas de la Incógnita excede en uno el número del Estándar, intercambiar Si y Ui en el encabezado e invertir el signo
en todas las filas a, ab y aq.
Coeficientes Factoriales x1 para Cada Dosis
Diseño Fila S1 S2 S3 S4 U1 U2 U3 ei Ti
2,1 a –1 –1 2 6 Ta
b –1 1 0 2 Tb
3,2 a –2 –2 –2 3 3 30 Ta
b –2 0 2 –1 1 10 Tb
ab 1 0 –1 –2 2 10 Tab
q 1 –2 1 0 0 6 Tq
4,3 a –3 –3 –3 –3 4 4 4 84 Ta
b –3 –1 1 3 –2 0 2 28 Tb
ab 3 1 –1 –3 –5 0 5 70 Tab
q 3 –3 –3 3 2 –4 2 60 Tq
aq –1 1 1 –1 1 –2 1 10 Taq
Error Experimental y Pruebas de Validez de la uniformemente como s2, a pesar de las diferencias en la definición
Valoración de la unidad. Se requiere en las pruebas de validez de la valoración y
para el cálculo del intervalo de confianza.
En este documento, el término ‘‘error experimental’’se refiere a la Varianza del Error de una Dosis Umbral—En algunas
variación residual en la respuesta de los indicadores biológicos y no valoraciones la dosis umbral individual se mide directamente. En
a un error en el procedimiento o a valores aberrantes que necesiten la valoración de Digital, se designa cada dosis umbral individual con
ser reemplazados. Se mide en términos de la varianza del error de el sı́mbolo z, el número o frecuencia de z con f y el total de los
una respuesta individual u otra unidad, la cual se designa
136 h111i Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 30
Tabla 8
Coeficientes factoriales x1 para analizar valoraciones con una secuencia de 3 ó 4 dosis de 1,5; 2,0; 3,0 y 4,0 donde cada dosis tiene el mismo
número ( f ) de respuestas.
Dosis del Estándar Dosis de la Incógnita
Diseño Fila 1,5 2,0 3,0 4,0 1,5 2,0 3,0 4,0 ei Ti
4,4 a –1 –1 –1 –1 1 1 1 1 8 Ta
b –29 –12 12 29 –29 –12 12 29 3940 Tb
ab 29 12 –12 –29 –29 –12 12 29 3940 Tab
q 1 –1 –1 1 1 –1 –1 1 8 Tq
aq –1 1 1 –1 1 –1 –1 1 8 Taq
3,3 a –1 –1 –1 1 1 1 6 Ta
b –25 –3 28 –25 –3 28 2836 Tb
ab 25 3 –28 –25 –3 28 2836 Tab
q 31 –53 22 31 –53 22 8508 Tq
aq –31 53 –22 31 –53 22 8508 Taq
3,3 a –1 –1 –1 1 1 1 6 Ta
b –28 3 25 –28 3 25 2836 Tb
ab 28 –3 –25 –28 3 25 2836 Tab
q 22 –53 31 22 –53 31 8508 Tq
aq –22 53 –31 22 –53 31 8508 Taq
M’ 8, 10 ci 7,2332 5,3695
L 26, 29 c’i2 0,10623 0,06100
valores de z para cada preparación con T, con los subı́ndices S y U En el diseño más sencillo, las unidades de respuesta se asignan
para indicar el Estándar y la Incógnita, respectivamente. Calcular la aleatoriamente a cada nivel de dosificación, como ocurre en la
varianza del error de z como: valoración de corticotropina. Si se reemplaza un valor faltante
sumando la media de los valores de y restantes a cualquier nivel de
dosificación dado a su total, los grados de libertad (n) en la varianza
del error se reducen en uno por cada reemplazo pero no es necesario
hacer ningún otro cambio en el cálculo. Suponiendo que f es
entonces igual para todos los grupos o dosis, calcular la varianza del
con n = fS + fU – 2 grados de libertad. En la valoración de la error a partir de la variación dentro de las dosis de todos los valores
Inyección de Cloruro de Tubocurarina, cada logaritmo de la dosis de y como:
umbral de la Incógnita se resta del logaritmo de la dosis
correspondiente del Estándar en el mismo conejo, para obtener una
diferencia individual x. Dado que cada x puede tener valor positivo
o negativo (+ o –), es esencial transportar el signo correcto en todas
las sumas. Designar el total de valores x para los animales inyectados
con el Estándar el primer dı́a como T1 y para aquellos inyectados con en donde Tt es el total en cada dosis de los f valores de y; hay k
el Estándar el segundo dı́a como T2. Calcular la varianza del error de totales Tt y los grados de libertad n = f – k, donde f disminuye en
x con n = N – 2 grados de libertad como: 1 con cada reemplazo.
Si las variaciones en f se ajustan restando una media de grupo del
total del grupo, calcular la varianza del error a partir de los valores de
y observados y de los totales Tt no ajustados como
pendiente Tb’ = (x1y) en donde los valores de x1 son los coeficientes función de los conejos que se pierden durante la valoración, calcular
factoriales para el Estándar en la fila b apropiada de la Tabla 6 u 8. la varianza del error de y a partir de las respuestas en los cuatro
La varianza del error para la valoración es grupos y a partir de los totales de los grupos Ti = T1 a T4 como
combinada en la misma dirección y en la fila aq es una prueba de la dosis mayor (o menor) de ambas preparaciones puede ser
curvaturas separadas en direcciones opuestas. Si algún cociente en excesivamente grande (o excesivamente pequeña). Su omisión puede
una valoración de 3 ó 4 dosis excede s2 en más del triple, calcular conducir a una valoración válida con los coeficientes factoriales para
el diseño menor que le sigue en la Tabla 6 u 8. Se puede descartar un
Tq o Tq’ estadı́sticamente significativo y se pueden retener todos los
niveles de dosificación sin ocasionar desvı́os de más de 5% en el
logaritmo de la potencia M’ calculado y su intervalo de confianza
cuando la siguiente desigualdad es verdadera:
Cálculos Generales—Las valoraciones biológicas, a pesar de la En una valoración de dos o más Incógnitas frente a un Estándar en
diversidad de sus formas, están comprendidas en dos categorı́as común, todas con curvas de dosis-respuesta paralelas dentro del error
generales: (1) las que el logaritmo de la potencia se calcula experimental, se puede calcular C con la varianza del error s2 para la
directamente a partir de una media o de una diferencia media y (2) valoración y con la pendiente de la valoración como
las que se calculan a partir del cociente de dos estadı́sticas.
(1) Cuando el logaritmo de la potencia de una valoración se
calcula como la media de varias estimaciones del logaritmo de
potencias que son aproximadamente iguales en precisión, el
logaritmo del intervalo de confianza es
Calcular la media del logaritmo de la potencia M de dos o más aproximada omitiendo el término que sigue al signo menos en las
valoraciones mutuamente coherentes como Ecuaciones 45 y 46. Una semiponderación se define como
Este es el valor individual más probable en un intervalo de confianza Usar w’ y w’ en lugar de w y w en la Ecuación 41 para obtener la
combinado de amplitud Lc, definido como la raı́z cuadrada de media semiponderada M. Este valor se aproxima al valor medio de
un intervalo de confianza de una amplitud aproximada Lc’, en donde
Tabla 2
donde f (grados de libertad en los errores estándar) = 4(k–1), donde k Cloruro de Sodio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139,3 g
es la cantidad de conejos en un grupo, t es el percentilo superior de Bifosfato de Potasio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389,0 g
97,5 de la distribución t con grados f de libertad, y Sulfato de Magnesio, Anhidro . . . . . . . . . . . . . . . . 57,3 g
Carbonato de Calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381,4 g
Sulfato Ferroso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27,0 g
Sulfato de Manganeso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,01 g
Yoduro de Potasio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,79 g
Sulfato de Cinc. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,548 g
Sulfato Cúprico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,477 g
Cloruro Cobaltoso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,023 g
Si g 1, el denominador no es significativamente diferente a 0 y la Colocar una porción de la cantidad de cloruro de sodio pesada en
fórmula no funciona. un mortero apropiado, agregar el yoduro de potasio y triturar. Dejar
la mezcla en reposo y preparar de la misma forma las demás sales
con el remanente de cloruro de sodio, agregando al final la mezcla de
cloruro de sodio y yoduro de potasio. Reducir la mezcla final a un
polvo fino (ver Finura de Polvos h811i).
Mezcla Control de Nitrógeno Suplementario—Colocar 50 g de
caseinato de calcio y 46 g de dextrosa anhidra en un vaso de
precipitados, agregar suficiente agua para formar una pasta y agregar
1000 mL de agua. Calentar la solución revolviendo a una
temperatura entre 708 y 828 durante 5 minutos, y enfriar. Determinar
el nitrógeno en una alı́cuota usando el procedimiento de Determina-
ción de Nitrógeno—Método I o Método II h461i. Almacenar en un
refrigerador. Mezclar antes de extraer porciones para su análisis
o antes de usar.
Perı́odos de Agotamiento y Control—Seleccionar un grupo de
no menos de 6 ratas macho, de 2 a 4 meses de edad y con un peso
entre 190 g a 225 g. Colocarlas en jaulas individuales con acceso
libre a agua y la Dieta de Depleción durante 12 dı́as. Pesar las ratas
en estado de depleción proteica y descartar los animales que pesen
más del 90% del peso inicial.
Durante los 3 dı́as siguientes, sustituir el agua para beber por la
Mezcla Control de Nitrógeno Suplementario en una cantidad
equivalente a 0,12 g de nitrógeno por rata y por dı́a, diluida con
agua a 20 mL y ofrecerla a la misma hora cada mañana en un
recipiente adecuado para evitar que se derrame o en un recipiente
equipado con un tubo para beber. Retirar toda el agua para beber de
las jaulas de las ratas en estado de depleción proteica durante cada
perı́odo de alimentación y reponerla luego de que el suplemento
USP 30 Pruebas Biológicas / h151i Prueba de Pirógenos 147
haya sido consumido o retirado. Al tercer dı́a, pesar cada rata. ANIMALES DE PRUEBA
Descartar las ratas que no hayan consumido toda la Mezcla Control
de Nitrógeno Suplementario. Emplear conejos adultos y sanos. Mantenerlos individualmente en
Durante los 3 dı́as siguientes, reemplazar la Mezcla Control de un lugar sin perturbaciones que los puedan excitar y a una
Nitrógeno Suplementario por agua ad libitum y continuar mante- temperatura uniforme entre 208 y 238, con una variación máxima
niendo a los animales con la Dieta de Depleción. Pesar las ratas y de +38 respecto de la temperatura seleccionada. Antes de emplear
descartar las que no hayan perdido peso desde la última pesada. por primera vez un conejo en una prueba de pirógenos, se lo debe
Procedimiento—Agrupar no menos de 6 ratas que hayan acondicionar durante un perı́odo de no más de siete dı́as, realizando
completado el perı́odo de agotamiento y el perı́odo de control. un ensayo simulado que incluya todos los pasos indicados en el
Durante 5 dı́as mantener el grupo de ratas sometido a la Dieta de Procedimiento, pero omitiendo la inyección. No utilizar el mismo
Depleción con un suplemento diario de 20 mL, medido con conejo para pruebas de pirógenos más de una vez cada 48 horas, ni
exactitud, de una solución que contenga Inyección de Hidrolizado de antes de que hayan transcurrido dos semanas después de una
Proteı́nas en una cantidad equivalente a 0,12 g de nitrógeno. Este elevación de la temperatura corporal de 0,68 o más, mientras es
alimento se debe ofrecer cada mañana de la misma manera que se sometido a la prueba de pirógenos o después de administrarle una
ofreció previamente la Mezcla Control de Nitrógeno Suplementario. sustancia considerada pirogénica.
Retirar el agua por lo menos 2 horas antes de ofrecer el suplemento y
durante 4 horas después de haberlo suministrado. Luego, si el
suplemento fue consumido, suministrar agua ad libitum. PROCEDIMIENTO
En la tarde del quinto dı́a, pesar cada rata y comparar el peso
inicial y el peso final respectivos. No menos del 80% del grupo de El ensayo se debe llevar a cabo en un área destinada
ratas utilizadas aumentan de peso o lo mantienen durante la prueba. exclusivamente a la prueba de pirógenos, con condiciones
ambientales similares a las del espacio donde están alojados los
conejos y libres de perturbaciones que puedan excitarlos. Durante el
perı́odo de prueba se les suspenderá todo alimento. El acceso al agua
está permitido en todo momento pero podrá restringirse durante la
prueba. Si el dispositivo empleado para medir la temperatura rectal
debe dejarse insertado durante el perı́odo de prueba, sujetar los
h151i PRUEBA DE PIRÓGENOS conejos mediante sujetadores en el cuello, no muy ajustados, que les
permita adoptar una postura natural de descanso. Determinar la
‘‘temperatura control’’ de cada conejo no más de 30 minutos antes de
la inyección de la dosis de prueba: ésta es la temperatura base para
La prueba de pirógenos está diseñada para limitar a un nivel determinar si existe aumento provocado por la inyección de una
aceptable el riesgo de reacción febril en pacientes a los que se solución de prueba. En cada uno de los grupos de conejos de prueba,
inyecta un determinado producto. La prueba mide el aumento de la emplear solamente aquellos cuya temperatura control no varı́e más
temperatura corporal en conejos a los que se inyecta una solución de de 18 respecto de los demás. Descartar los conejos cuya temperatura
prueba por vı́a intravenosa. Este ensayo está diseñado para productos corporal exceda de 39,88.
que pueden ser tolerados por conejos en una dosis que no exceda de A menos que se especifique algo diferente en la monografı́a
10 mL por kg del peso del conejo, inyectados por vı́a intravenosa correspondiente, inyectar a cada uno de tres conejos, en una vena de
durante un perı́odo de no más de 10 minutos. En el caso de la oreja, 10 mL de la solución de prueba por kg de peso,
productos que requieren una preparación preliminar o que están completándose cada inyección dentro de los 10 minutos desde el
sujetos a condiciones especiales de administración, se deben seguir inicio de su administración. La solución de prueba es o bien el
las indicaciones adicionales establecidas en la monografı́a individual producto, reconstituido de acuerdo con las especificaciones de la
o, en el caso de antibióticos o de productos biológicos, seguir las etiqueta, o bien el material en análisis, tratado según se indica en la
indicaciones adicionales establecidas en las reglamentaciones monografı́a individual e inyectado en la dosis especificada en la
federales (ver Productos Biológicos h1041i). misma. Para la prueba de pirógenos de dispositivos médicos
o sistemas de inyección, lavar o enjuagar las superficies del
dispositivo o sistema que entran en contacto con el material
APARATOS Y DILUYENTES administrado en forma parenteral, o con el sitio de inyección, o con
los tejidos internos del paciente. Asegurarse de que todas las
Despirogenar jeringas, agujas y material de vidrio por calenta- soluciones de prueba estén protegidas de la contaminación.
miento a 2508 durante no menos de 30 minutos o utilizando otro Administrar la inyección después de entibiar la solución de prueba
método adecuado. Todos los diluyentes y soluciones para lavado y a una temperatura de 37 + 28. Registrar la temperatura a intervalos
enjuague de los dispositivos o sistemas de inyección parenteral, se de 30 minutos durante el perı́odo de 1 a 3 horas posteriores a la
deben tratar de manera que garanticen la esterilidad y la ausencia de inyección.
pirógenos. Se deben realizar periódicamente pruebas de control de
pirógenos en porciones representativas de los diluyentes y
soluciones que se emplean para lavado y enjuague de los aparatos. INTERPRETACIÓN Y CONTINUACIÓN DE LA
Cuando se especifique el uso de Inyección de Cloruro de Sodio PRUEBA
como diluyente, emplear una Inyección que contenga 0,9 por ciento
de NaCl. Considerar cualquier disminución de la temperatura como
elevación cero. El producto cumple con los requisitos de la prueba
para determinar la ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra
REGISTRO DE LA TEMPERATURA un aumento de 0,58 o más por encima de su temperatura control
respectiva. Si algún conejo muestra un aumento de 0,58 o más,
Emplear dispositivos sensores de temperatura exactos, tales como continuar la prueba empleando otros cinco conejos. El material en
termómetros clı́nicos, sondas termométricas u otra clase de sonda análisis cumple con los requisitos para determinar la ausencia de
calibrada, que aseguren una exactitud de +0,18 y que faciliten la pirógenos cuando no más de tres de los ocho conejos tienen un
lectura máxima en menos de 5 minutos. Insertar la sonda sensora de aumento de temperatura de 0,58 o más y si la suma del aumento
temperatura en el recto del conejo, a una profundidad de no menos máximo de las temperaturas individuales de los ocho conejos no
de 7,5 cm y, durante un perı́odo no menor que el previamente excede de 3,38.
estimado como suficiente, registrar la temperatura corporal del
animal de prueba.
148 h161i Equipos para Transfusión e Infusión / Pruebas Biológicas USP 30
PRODUCTOS FARMACÉUTICOS Estos incluyen los siguientes, sin limitarse a estos: equipos de
RADIOACTIVOS administración de soluciones, de extensión, de transferencia, de
administración de sangre; catéteres intravenosos, implantes, tuberı́as
Dosis de Prueba para Productos Preformulados, y accesorios de oxigenadores extracorpóreos, dializadores y tubos y
accesorios para diálisis, válvulas cardı́acas, injertos vasculares,
Listos para Usar Marcados con Radioactividad catéteres de administración intramuscular de fármacos; y equipos de
transfusión e infusión. Estos requisitos no se aplican a productos
ALBÚMINA AGREGADA Y OTROS PRODUCTOS QUE CONTIENEN ortopédicos, guantes de látex o apósitos para heridas.
PARTÍCULAS Esterilidad—Proceder como se indica para Dispositivos Este-
rilizados en Pruebas de Esterilidad h71i.
Para la prueba de pirógenos en conejos, diluir el producto con
Inyección de Cloruro de Sodio a no menos de 100 mCi por mL Endotoxinas Bacterianas—Proceder como se indica en Prueba
e inyectar a cada conejo una dosis de 3 mL por kg de peso corporal. de Endotoxinas Bacterianas h85i.
El lı́mite de endotoxinas para los dispositivos médicos no es más
de 20,0 Unidades USP de Endotoxinas por dispositivo, salvo para
los dispositivos médicos que entran en contacto con el lı́quido
OTROS PRODUCTOS cefalorraquı́deo, cuyo lı́mite es no más de 2,15 Unidades USP de
Endotoxinas por dispositivo.
Cuando la Vida Media Fı́sica de los Radionucleidos Es de Más Efectuar una segunda prueba de Endotoxinas Bacterianas
de Un Dı́a—Calcular el volumen máximo del producto que puede solamente con todo dispositivo que no cumpla con la primera
inyectarse a una persona. Este cálculo debe tener en cuenta la dosis prueba efectuada. Efectuar la Prueba de Pirógenos h151i con todos
radioactiva máxima recomendada del producto, en mCi, y la los dispositivos a los que no se les puede efectuar la Prueba de
valoración de la radioactividad, en mCi por mL, del producto a la Endotoxinas Bacterianas h85i por aumento o inhibición no
hora o fecha de su caducidad. Utilizando esta información, se calcula eliminable.
el volumen de la dosis máxima por kg en una persona de 70 kg. Preparación de los Equipos—Escoger no menos de 3 y no más de
Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar a cada conejo un 10 equipos. Enjuagarlos o remojarlos en Agua Reactiva LAL.
mı́nimo de 10 veces esta dosis por kg de peso corporal. Si fuera Ajustar el volumen de la solución de extracción o de enjuague según
necesario, diluir la dosis con Inyección de Cloruro de Sodio. El el tamaño y la configuración del equipo.
volumen total inyectado por conejo no debe ser menor de 1 mL ni Purgar las lı́neas de recorrido del lı́quido de los equipos
mayor de 10 mL de solución. etiquetados como ‘‘recorrido de lı́quido apirógeno’’ con lı́quido de
Cuando la Vida Media Fı́sica de los Radionucleidos Es de extracción calentado a 37 + 1,08 y mantener el lı́quido de extracción
Menos de Un Dı́a—Para productos cuya etiqueta indica que en contacto con el recorrido que corresponda durante no menos de
contienen radionucleidos con una vida media inferior a 1 dı́a, los 1 hora a temperatura ambiente controlada. Combinar los extractos si
cálculos de dosificación son idénticos a los descritos en el primer corresponde. Calcular el lı́mite de endotoxinas de la solución de
párrafo en Otros Productos. Se puede autorizar la distribución de extracción o de enjuague por la fórmula:
estos productos antes de terminar la prueba de pirógenos en conejos,
pero las pruebas se deben comenzar antes de las 36 horas de la (K 6 N) / (V) ,
autorización a más tardar.
en donde K es la cantidad de endotoxinas permitida por equipo, N es
el número de equipos que se analizan y V es el volumen total del
extracto o del lı́quido de enjuague. Si la solución de enjuague o de
Dosis de Prueba para Componentes de Productos extracción sin diluir no es adecuada para efectuar la Prueba de
Farmacéuticos o Reactivos a Ser Marcados Endotoxinas Bacterianas h85i, repetir la prueba de aumento
o inhibición después de neutralizar y eliminar las sustancias
Se establecen los siguientes requisitos para la dosis de prueba de interferentes o después de diluir la solución en un factor que no
reactivos a ser marcados o reconstituidos antes del uso por agregado exceda el de la Dilución Máxima Válida. La Dilución Máxima Válida
directo de soluciones radioactivas tales como Inyección de para dispositivos se calcula dividiendo el lı́mite de endotoxinas por
Pertecnetato de Sodio Tc 99 m, por ejemplo: ‘‘equipos frı́os’’. la sensibilidad l declarada en la etiqueta del reactivo LAL utilizado.
Se debe suponer que el contenido total del vial de reactivo no
radioactivo se inyectará a una persona de 70 kg o que se inyectará el Pirógenos—Efectuar la Prueba de Pirógenos h151i con las
1
/70 del contenido total por kg. Si el contenido es seco, reconstituirlo muestras a las que no se puede efectuar la Prueba de Endotoxinas
con un volumen medido de Inyección de Cloruro de Sodio. Bacterianas por aumento o inhibición no eliminable de la prueba.
Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar (1/7) del Escoger 10 dispositivos y obtener un efluente combinado,
contenido de un vial por kg de peso corporal de cada conejo. La empleando métodos de preparación adecuados al equipo, según se
dosis máxima por conejo será igual al contenido completo de un solo indica en Endotoxinas Bacterianas, pero utilizando volúmenes de
vial. El volumen total inyectado por conejo no debe ser de menos de lı́quido de extracción o de enjuague que no excedan de 40 mL de
1 mL ni de más de 10 mL de solución. solución salina estéril SR por equipo. Se cumple con los requisitos
de la Prueba de Pirógenos h151i.
Otros Requisitos—Las partes de los dispositivos médicos que
están fabricadas de plásticos u otros polı́meros cumplen con los
requisitos especificados para Pruebas Biológicas—Plásticos y Otros
h161i EQUIPOS PARA Polı́meros en Envases h661i; las fabricadas de elastómeros cumplen
con los requisitos establecidos en Cierres Elastoméricos para
TRANSFUSIÓN E INFUSIÓN Y Inyectables h381i. Si fuera necesario establecer una designación de
clases para elastómeros, plásticos u otros polı́meros, realizar las
DISPOSITIVOS MÉDICOS pruebas in vivo correspondientes, según se indica en el capı́tulo de
pruebas generales Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo h88i.
SIMILARES
Cultivo Madre de Lactobacillus leichmannii—Agregar 1,0 g precauciones para mantener la uniformidad de las condiciones de
a 1,5 g de agar a 100 mL de Medio de Cultivo y calentar la mezcla en esterilización y enfriamiento durante toda la valoración ya que si los
un baño de vapor, con agitación, hasta que el agar se disuelva. tubos se colocan demasiado juntos o si se sobrecarga el autoclave
Colocar porciones de aproximadamente 10 mL de la solución podrı́a variar la velocidad de calentamiento.
caliente en los tubos de ensayo, tapar bien los tubos, esterilizarlos Agregar asépticamente 0,5 mL de Inóculo a cada tubo
a 1218 durante 15 minutos en autoclave (temperatura de la salida) y ası́ preparado, excepto a dos de los cuatro que no contengan
dejar que los tubos se enfrı́en en posición vertical. Inocular tres Solución de Cianocobalamina Estándar (los blancos no inoculados).
o más de los tubos, por transferencias en cuña de un cultivo puro de Incubar los tubos a una temperatura entre 308 y 408, mantenida
Lactobacillus leichmannii.* (Antes de usar un cultivo nuevo por termostáticamente dentro de +0,58, durante 16 a 24 horas.
primera vez en esta valoración, hacer no menos de 10 transferencias Terminar el crecimiento calentando a una temperatura no inferior
sucesivas del cultivo en un perı́odo de 2 semanas.) Incubar durante a 808 durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Después de
16 a 24 horas, a cualquier temperatura seleccionada entre 308 y 408, agitar su contenido, colocar el tubo en un espectrofotómetro que se
pero mantenida termostáticamente dentro de +0,58 y finalmente ha fijado a una longitud de onda de 530 nm y leer la transmitancia
almacenar en un refrigerador. cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se
Preparar cultivos nuevos en cuña al menos tres veces por semana observa unos pocos segundos después de agitar, cuando la lectura se
y no usarlos para preparar el inóculo si tienen más de 4 dı́as. La mantiene constante durante 30 segundos o más. Emplear aproxima-
actividad del microorganismo se puede aumentar mediante transfe- damente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
rencias del cultivo en cuña realizadas a diario o dos veces al dı́a, Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado,
hasta el punto en que se pueda observar una evidente turbidez en el leer la transmitancia del blanco inoculado. Si la diferencia es mayor
inóculo lı́quido 2 a 4 horas después de la inoculación. Un cultivo de de 5% o si hay evidencia de contaminación con un microorganismo
crecimiento lento raramente proporciona una curva de respuesta extraño, descartar los resultados de la valoración.
adecuada y puede conducir a resultados irregulares. Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado,
Inóculo—[NOTA—Una suspensión congelada de Lactobacillus leer la transmitancia de cada uno de los tubos restantes. Descartar los
leichmannii puede usarse como cultivo madre, siempre que resultados de la valoración si la pendiente de la curva estándar indica
proporcione un inóculo comparable a un cultivo nuevo.] Transferir un problema de sensibilidad.
las células del Cultivo Madre de Lactobacillus leichmannii a 2 tubos Cálculos—Preparar una curva estándar de concentración-
estériles que contengan 10 mL de Medio de Cultivo cada uno. respuesta según el siguiente procedimiento. Examinar los resultados
Incubar estos cultivos durante 16 a 24 horas a cualquier temperatura para detectar y reemplazar cualquier valor de transmitancia
seleccionada entre 308 y 408, pero mantenida termostáticamente aberrante. Para cada nivel del estándar, calcular la respuesta
dentro de +0,58. En condiciones asépticas, centrifugar los cultivos y a partir de la suma de los valores duplicados de las transmitancias
decantar el sobrenadante. Suspender las células de cultivo en 5 mL () como la diferencia, y = 2,00 – . Graficar esta respuesta en la
de Medio de Suspensión estéril y mezclar. Usando Medio de ordenada del papel cuadriculado, contra el logaritmo de los mL de
Suspensión estéril, ajustar el volumen para que una dilución 1 en 20 Solución de Cianocobalamina Estándar por tubo en la abscisa,
en solución salina SR produzca transmitancia de 70% cuando se lee usando para la ordenada una escala aritmética o logarı́tmica, la que
en un espectrofotómetro apropiado a una longitud de onda ajustada produzca una mejor aproximación a una lı́nea recta. Trazar la lı́nea
a 530 nm, equipado con una celda de 10 mm y se lee contra solución recta o la curva continua que mejor se ajuste a los puntos graficados.
salina SR ajustada a una transmitancia de 100%. Preparar una Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada
dilución 1 en 400 de la suspensión ajustada usando Solución Madre nivel de la Preparación de Valoración. Leer de la curva estándar el
de Medio Basal y usarla para el inóculo de prueba. (Esta dilución logaritmo del volumen de la Preparación Estándar correspondiente
puede alterarse, cuando sea necesario, para obtener la respuesta a cada uno de esos valores de y que estén comprendidos en el
deseada.) intervalo entre el punto más bajo y más alto graficados para el
Calibración del Espectrofotómetro—Comprobar la longitud de estándar. Restar de cada logaritmo ası́ obtenido el logaritmo del
onda del espectrofotómetro periódicamente, usando una celda de volumen, en mL, de la Preparación de Valoración para obtener la
longitud de onda estándar u otro dispositivo apropiado. Previamente diferencia, x, de cada nivel de dosificación. Promediar los valores de
a la lectura de las soluciones, calibrar el espectrofotómetro con agua x para cada uno de tres o más niveles de dosis para obtener x = M’, el
para fijar el 0% y el 100% de transmitancia, a la longitud de onda de logaritmo de la potencia relativa de la Preparación de Valoración.
530 nm. Determinar la cantidad, en mg, de ER Cianocobalamina USP
correspondiente a la cianocobalamina en la porción de material
Procedimiento—Limpiar meticulosamente, por medios apropia- tomada para la valoración con la ecuación antilog M = antilog (M’ +
dos, los tubos de ensayo de vidrio duro, de 20 mm 6 150 mm de log R), en donde R es el número de mg de cianocobalamina que se
tamaño aproximado y otro material de vidrio necesario, preferente- supone presente en cada mg (o cápsula o tableta) del material
mente seguido de un calentamiento a 2508 durante 2 horas, debido tomado para la valoración.
a la alta sensibilidad del organismo de prueba a la actividad de
cantidades diminutas de vitamina B12 y a trazas de muchos agentes Repetición—Repetir toda la determinación al menos una vez,
de limpieza. usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado. Si la
Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado: 1,0 mL; 1,5 mL; 2,0 diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor
mL; 3,0 mL; 4,0 mL y 5,0 mL, respectivamente, de la Solución de de 0,08; su promedio, M, es el logaritmo de la potencia resultado de
Cianocobalamina Estándar. A cada uno de estos tubos y a cuatro la valoración del material de prueba (ver Valoración de la Actividad
tubos vacı́os similares, agregar 5,0 mL de Solución Madre de Medio de la Vitamina B12 en Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas
Basal y agua para completar 10 mL. h111i). Si las dos determinaciones difieren en más de 0,08 hay que
En tubos de ensayo similares, agregar, por duplicado, respectiva- realizar una o más determinaciones adicionales. Del promedio de dos
mente, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 3,0 mL y 4,0 mL de la Preparación o más valores de M que no difieren en más de 0,15 calcular la
de Valoración. Agregar a cada tubo 5,0 mL de Solución Madre de potencia media de la preparación valorada.
Medio Basal y agua para completar 10 mL. Colocar juntos un juego
completo de tubos del estándar y de la valoración en una gradilla y el
conjunto duplicado en una segunda gradilla o en otra sección de la
misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos apropiadamente para prevenir la contaminación
bacteriana y esterilizar los tubos y su contenido en un autoclave
a 1218 durante 5 minutos, procurando alcanzar esta temperatura en
no más de 10 minutos, precalentando el autoclave si fuera necesario.
Enfriar tan rápidamente como sea posible para evitar formación de
color como resultado del sobrecalentamiento del medio. Tomar
*
Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacillus leichmannii, Número
7830, de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h191i Identificación—Pruebas Generales 151
seco, éste crepita y desprende un gas amarillo verdoso. exceso de hipofosfito. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas
[Precaución—Emplear sólo una pequeña cantidad de clorato para con ácido sulfúrico y calentadas con sulfato cúprico SR, producen un
esta prueba y extremar las precauciones para realizarla.] precipitado rojo.
Cloruros—Con nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros Lactatos—Cuando las soluciones de lactatos se acidifican con
producen un precipitado blanco, caseoso, que es insoluble en ácido ácido sulfúrico, se les agrega permanganato de potasio SR y se
nı́trico pero soluble en un ligero exceso de hidróxido de amonio 6 N. calientan, desprenden acetaldehı́do. Éste se puede detectar al permitir
Cuando se analizan clorhidratos de aminas (incluidos los alcaloides) que los vapores entren en contacto con un papel de filtro humedecido
que no responden a la prueba anterior, agregar una gota de ácido con una mezcla recién preparada de volúmenes iguales de solución
nı́trico diluido y 0,5 mL de nitrato de plata SR a una solución de la acuosa de morfolina al 20% y de nitroferricianuro de sodio SR: se
sustancia que está siendo examinada que contenga, a menos que se produce un color azul.
indique algo diferente en la monografı́a, aproximadamente 2 mg de Litio—Con carbonato de sodio SR, las sales de litio en soluciones
ión cloruro en 2 mL: se forma un precipitado blanco, caseoso. moderadamente concentradas, alcalinizadas con hidróxido de sodio,
Centrifugar la mezcla sin demora y decantar la capa sobrenadante. producen un precipitado blanco al llevarlas a ebullición. El
Lavar el precipitado con tres porciones de 1 mL de solución de ácido precipitado es soluble en cloruro de amonio SR. Las sales de litio
nı́trico (1 en 100) y desechar los lavados. Agregar amonı́aco SR gota humedecidas con ácido clorhı́drico proporcionan un color carme-
a gota a este precipitado. Se disuelve rápidamente. Cuando una sı́ intenso a una llama no luminosa. Las soluciones de sales de litio
monografı́a especifica que un artı́culo responde a la prueba para no precipitan en ácido sulfúrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia
cloruros secos, mezclar el sólido que se va a analizar con un peso del estroncio).
igual de dióxido de manganeso, humedecer con ácido sulfúrico y Magnesio—Las soluciones de sales de magnesio en presencia de
calentar moderadamente la mezcla: se produce cloro, que es cloruro de amonio producen solamente un precipitado ligeramente
reconocible por la producción de un color azul con papel de turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con
yoduro y almidón humedecido. la adición posterior de fosfato dibásico de sodio SR producen un
Cobalto—Las soluciones de sales de cobalto (1 en 20) en ácido precipitado blanco cristalino, insoluble en hidróxido de amonio 6 N.
clorhı́drico 3 N producen un precipitado rojo cuando la mezcla se Manganeso—Con sulfuro de amonio SR, las soluciones de sales
calienta en un baño de vapor, con un volumen igual de una solución manganosas producen un precipitado color salmón que se disuelve
caliente, recién preparada, de 1-nitroso-2-naftol (1 en 10) en ácido en ácido acético.
acético 9 N. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan
con cloruro de potasio y se tratan con nitrito de potasio y ácido Mercurio—Cuando se aplican sobre una lámina de cobre
acético, producen un precipitado amarillo. brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un
exceso de ácido nı́trico, producen un precipitado que, al frotarlo,
Cobre—Las soluciones de compuestos cúpricos acidificadas con adquiere una apariencia plateada y brillante. Con sulfuro de
ácido clorhı́drico, depositan una pelı́cula roja de cobre metálico hidrógeno, las soluciones de compuestos de mercurio producen un
sobre una superficie de hierro brillante y no oxidado. Un exceso de precipitado negro que es insoluble en sulfuro de amonio SR y en
hidróxido de amonio 6 N, agregado a una solución de una sal ácido nı́trico 2 N en ebullición.
cúprica, produce al principio un precipitado azulado y posterior-
mente una solución de color azul intenso. Las soluciones de sales Sales Mercúricas—Las soluciones de sales mercúricas producen
cúpricas con ferrocianuro de potasio SR producen un precipitado de un precipitado amarillo con hidróxido de sodio 1 N. En soluciones
color marrón rojizo insoluble en ácidos diluidos. neutras con yoduro de potasio SR, también producen un precipitado
escarlata que es muy soluble en un exceso de reactivo.
Fosfatos—[NOTA—Cuando la monografı́a especifica la prueba de
identificación de Fosfatos, utilizar las pruebas para ortofosfatos, Sales Mercuriosas—Los compuestos mercuriosos se descompo-
a menos que las instrucciones especifiquen que se deben emplear las nen con hidróxido de sodio 1 N y producen un color negro. Con
pruebas para pirofosfatos o que se debe incinerar el producto antes ácido clorhı́drico, las soluciones de sales mercuriosas producen un
de realizar la prueba.] Con nitrato de plata SR, las soluciones neutras precipitado blanco que se ennegrece con hidróxido de amonio 6 N.
de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en Con yoduro de potasio SR producen un precipitado amarillo que, al
ácido nı́trico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N. Con molibdato de quedar en reposo, puede tornarse verde.
amonio SR, las soluciones acidificadas de ortofosfatos producen un Nitratos—Cuando una solución de nitrato se mezcla con un
precipitado amarillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. Este volumen igual de ácido sulfúrico, se enfrı́a la mezcla y se superpone
precipitado puede tardar en formarse. Con nitrato de plata SR, los una solución de sulfato ferroso, se desarrolla un color marrón en la
pirofosfatos obtenidos por incineración producen un precipitado unión de los dos lı́quidos. Cuando se calienta un nitrato con ácido
blanco que es soluble en ácido nı́trico 2 N y en hidróxido de amonio sulfúrico y cobre metálico, se desprenden humos de color rojo
6 N. Con molibdato de amonio SR se forma un precipitado amarillo amarronado. Los nitratos no decoloran el permanganato de potasio
que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. SR acidificado (a diferencia de los nitritos).
Hierro—Los compuestos férricos y ferrosos en solución producen Nitritos—Cuando se los trata con ácidos minerales diluidos o con
un precipitado negro con sulfuro de amonio SR. Este precipitado se ácido acético 6 N, los nitritos desprenden humos de color rojo–
disuelve en presencia de ácido clorhı́drico 3 N frı́o con desprendi- amarronado. Las soluciones colorean de azul el papel de almidón-
miento de sulfuro de hidrógeno. yoduro.
Sales Férricas—Las soluciones ácidas de sales férricas producen Oxalatos—Las soluciones neutras y alcalinas de oxalatos forman
un precipitado azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR. Con un un precipitado blanco con cloruro de calcio SR. Este precipitado es
exceso de hidróxido de sodio 1 N, se forma un precipitado marrón insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve con ácido clorhı́drico.
rojizo. Con tiocianato de amonio SR, las soluciones de sales férricas Las soluciones de oxalatos acidificadas y calientes decoloran el
producen un color rojo intenso que no se elimina con el agregado de permanganato de potasio SR.
ácidos minerales diluidos. Permanganatos—Las soluciones de permanganatos acidificadas
Sales Ferrosas—Las soluciones de sales ferrosas producen un con ácido sulfúrico se decoloran con peróxido de hidrógeno SR y
precipitado azul oscuro con ferricianuro de potasio SR. Este con bisulfito de sodio SR en frı́o y con ácido oxálico SR en solución
precipitado es insoluble en ácido clorhı́drico 3 N pero se descom- caliente.
pone con hidróxido de sodio 1 N. Las soluciones de sales ferrosas Peróxidos—Las soluciones de peróxidos acidificadas ligeramente
con hidróxido de sodio 1 N producen un precipitado blanco–verdoso con ácido sulfúrico proporcionan un color azul intenso con la adición
que cambia de color rápidamente a verde y luego, cuando se agita, se de dicromato de potasio SR. Si la mezcla se agita con un volumen
torna marrón. igual de éter etı́lico y se deja que se separen los lı́quidos, el color
Hipofosfitos—Cuando se los calienta enérgicamente, los hipo- azul se encuentra en la capa de éter etı́lico.
fosfitos desprenden fosfina que es espontáneamente inflamable. Los Plata—Con ácido clorhı́drico, las soluciones de sales de plata
hipofosfitos en solución producen un precipitado blanco con cloruro producen un precipitado caseoso, blanco, que es insoluble en ácido
mercúrico SR. Este precipitado se torna gris ante la presencia de un nı́trico pero fácilmente soluble en hidróxido de amonio 6 N. Una
solución de una sal de plata a la que se le agrega hidróxido de
USP 30 Pruebas Quı́micas / h193i Identificación—Tetraciclinas 153
mezcla de gel de sı́lice octilsilanizada para cromatografı́a. Activar la prueba, previamente secada bajo las condiciones especificadas para
placa calentándola a 1308 durante 20 minutos, dejar que se enfrı́e y el Estándar de Referencia correspondiente, a menos que se
utilizarla mientras aún esté tibia. especifique algo diferente, o que el Estándar de Referencia se
Procedimiento—Aplicar por separado 1 mL de la Solución emplee sin secar, presenta máximos sólo a las mismas longitudes de
Estándar, 1 mL de la Solución de Prueba y 1 mL de la Solución de onda que el de una preparación similar del Estándar de Referencia
Resolución a la Placa para Cromatografı́a. Dejar que las USP correspondiente.
aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en la Fase Las diferencias que pueden observarse en los espectros
Móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido ası́ obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo
aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la cual no es siempre aceptable (ver Procedimiento en Espectrofoto-
placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y metrı́a y Dispersión de Luz h851i). Por lo tanto, a menos que se
dejar que la placa se seque al aire. Exponer la placa a vapores de especifique algo diferente en la monografı́a individual, continuar del
amonı́aco durante 5 minutos y localizar rápidamente las manchas en siguiente modo. Si aparece una diferencia en los espectros IR del
la placa observándola bajo luz UV de longitud de onda larga: el analito y del estándar, disolver porciones iguales de la muestra de
cromatograma de la Solución de Resolución presenta manchas bien prueba y del Estándar de Referencia en volúmenes iguales de un
separadas y el valor RF, la intensidad y el aspecto de la mancha disolvente apropiado, evaporar la solución hasta sequedad en
principal obtenida de la Solución de Prueba se corresponden con los envases similares, bajo condiciones idénticas, y repetir la prueba
de la mancha obtenida de la Solución Estándar. con los residuos.
ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA
La referencia h197Ui en una monografı́a significa que una
h197i PRUEBAS DE solución de prueba y una Solución Estándar se examinan
IDENTIFICACIÓN espectrofotométricamente, en celdas de 1 cm, sobre el intervalo
espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo
ESPECTROFOTOMÉTRICA diferente en la monografı́a individual.
Disolver una porción de la sustancia que se está examinando en el
Medio especificado para obtener una solución de prueba que tenga la
concentración especificada en la monografı́a para Solución. En
Las pruebas espectrofotométricas son las de mayor importancia en forma similar, preparar una Solución Estándar que contenga el
la identificación de muchas de las sustancias quı́micas del Estándar de Referencia USP correspondiente.
compendio. Los procedimientos de prueba que se indican a con- Registrar y comparar los espectros obtenidos concomitantemente
tinuación se aplican a sustancias que absorben radiación infrarroja para la solución de prueba y la Solución Estándar. Calcular los
(IR) y/o UV (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz h851i). cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios están
El espectro de absorción IR de una sustancia, en comparación con incluidos en una monografı́a individual. A menos que se especifique
el que se obtuvo concomitantemente para el Estándar de Referencia algo diferente, las absorbancias indicadas para estos cálculos son
USP correspondiente, proporciona quizá la evidencia más con- aquellas medidas a la absorbancia máxima, aproximadamente a la
cluyente de la identidad de la sustancia, que puede obtenerse en una longitud de onda especificada en la monografı́a individual. Cuando
sola prueba. El espectro de absorción UV, por otro lado, no presenta la absorbancia se deba medir aproximadamente a la longitud de onda
un alto grado de especificidad. La conformidad con las especifica- especificada en lugar de la máxima absorbancia, las abreviaturas
ciones de prueba referentes tanto para la absorción IR como con la (min) y (sh) se utilizan para indicar un mı́nimo y un hombro
absorción UV, según se indica en una gran proporción de (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorción. Los
monografı́as oficiales, deja pocas dudas, si las hubiera, con respecto requisitos se cumplen si los espectros de absorción UV de la
a la identidad de la muestra que se está examinando. solución de prueba y de la Solución Estándar presentan máximos y
mı́nimos a las mismas longitudes de onda y los cocientes de
absortividad y/o absorbancia están dentro de los lı́mites especifica-
ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO dos.
sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma con una fase donde J es el cociente entre las cantidades de Unidades USP de
móvil constituida por una mezcla de cloroformo, metanol y agua Polimixina B y de Unidades USP de Bacitracina declaradas en la
(180 : 15 : 1), a menos que se especifique algo diferente en la etiqueta por g de Crema, Loción o Ungüento.
monografı́a individual, hasta que el frente de la fase móvil haya Fase móvil—Preparar una mezcla de metanol, alcohol isopro-
recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. pı́lico, cloruro de metileno, hidróxido de amonio y agua
Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase (4 : 2 : 2 : 2 : 1,5).
móvil y dejar que el disolvente se evapore. A menos que se Procedimiento—Aplicar 10 mL de Solución de prueba y 10 mL de
especifique algo diferente en la monografı́a individual, localizar las cada una de las Soluciones Estándar que corresponda a una placa
manchas de la placa examinándolas bajo luz UV de longitud de onda para cromatografı́a en capa delgada adecuada (ver Cromatografı́a
corta. El valor RF de la mancha principal obtenida a partir de la h621i), recubierta con una capa de gel de sı́lice para cromatografı́a
solución de prueba se corresponde con el obtenido a partir de la de 0,25 mm de espesor. Colocar la placa en una cámara
Solución estándar. cromatográfica presaturada y desarrollar los cromatogramas con la
Fase móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido
aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la
PROCEDIMIENTO PARA BACITRACINA, placa de la cámara y secar a 1058 durante 10 minutos. Rociar la placa
NEOMICINA Y POLIMIXINA B con una solución al 0,2% de ninhidrina en alcohol butı́lico y
calentarla a 1058 durante 5 minutos. El valor RF de cada mancha
El procedimiento de cromatografı́a en capa delgada descrito principal en el cromatograma de la Solución de Prueba se
a continuación tiene como fin verificar la identificación de los corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma
ingredientes activos bacitracina, neomicina y polimixina B y en sus obtenido a partir de cada Solución Estándar que corresponda según
formas farmacéuticas cuando se encuentran presentes de forma el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta. Si el
aislada o en mezclas de dos o tres componentes. La referencia cromatograma de la Solución de Prueba presenta demasiadas
h201BNPi en una monografı́a indica que éste es el procedimiento bandas, proceder según se indica en el Procedimiento Modificado.
a seguir. Procedimiento Modificado—Transferir la Solución de Prueba
Preparar una Solución de Prueba como se indica a continuación, a un tubo de centrı́fuga de 15 mL, agregar 10 mL de solución acuosa
a menos que se especifique algo diferente en la monografı́a de ácido pı́crico saturada (1,2%, p/v), mezclar en un mezclador por
individual. vórtice durante 1 minuto, centrifugar durante 10 minutos y desechar
Solución de Prueba— el sobrenadante. Lavar el residuo con porciones de agua de 1 mL
PARA FÁRMACOS—Disolver una porción de Bacitracina, Bacitra- hasta que no se observe color amarillo en el lavado. Desechar los
cina Cinc, Sulfato de Neomicina o Sulfato de Polimixina B en ácido lavados y secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 508.
clorhı́drico 0,1 N para obtener una solución que contenga 500 Disolver el residuo en 1 mL de acetona, agregar 1 mL de una
Unidades USP de Bacitracina por mL, 3,5 mg de neomicina (base) solución de ácido sulfúrico en acetona (1 en 100) recién preparada,
por mL, o 10 000 Unidades USP de Polimixina B por mL. agitar, centrifugar durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.
PARA SOLUCIONES—Si la Solución contiene neomicina y polimi- Enjuagar el residuo con 1 mL de acetona, centrifugar brevemente y
xina B, diluir una porción de solución con ácido clorhı́drico 0,1 N desechar el lavado. Repetir el lavado hasta que no se observe color
para obtener una solución que contenga, aproximadamente, la amarillo. Secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 508.
cantidad equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL. Si la Disolver el residuo en 0,5 mL de ácido clorhı́drico 0,1 N (Solución
Solución contiene polimixina B pero no neomicina, diluir una de Prueba Modificada). Repetir el Procedimiento utilizando esta
porción de solución con ácido clorhı́drico 0,1 N para obtener una Solución de Prueba Modificada en lugar de la Solución de Prueba.
solución que contenga aproximadamente 10 000 Unidades USP de El valor RF de cada mancha principal en el cromatograma de la
Polimixina B por mL. Solución de Prueba Modificada se corresponde con el de la mancha
principal en el cromatograma obtenido a partir de cada Solución
PARA CREMAS, LOCIONES Y UNGÜENTOS—Si la Crema, la Loción
Estándar que corresponda según el o los ingredientes activos
o el Ungüento contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, transferir una declarados en la etiqueta.
porción que equivalga aproximadamente a 500 Unidades USP de
Bacitracina a un tubo de centrı́fuga de 15 mL. Si la Crema, la Loción
o el Ungüento contiene neomicina pero no contiene Bacitracina ni
Bacitracina Cinc, transferir una porción que equivalga aproximada-
mente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL a un tubo de centrı́fuga PRUEBAS DE LÍMITE
de 15 mL. Agregar 4 mL de cloroformo al tubo de centrı́fuga y agitar
bien para dispersar la Crema, la Loción o el Ungüento. Agregar
1 mL de ácido clorhı́drico 0,1 N, mezclar en un mezclador por
vórtice durante 4 minutos, centrifugar y usar el sobrenadante
transparente.
NOTA—En el Procedimiento Modificado se puede usar la Solución
de Prueba Modificada preparada como se indica a continuación en
lugar de la Solución de Prueba.
Solución de Bacitracina Estándar—Disolver una porción de ER
Bacitracina Cinc USP en ácido clorhı́drico 0,1 N para obtener una
solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL. h206i ALUMINIO
Solución de Neomicina Estándar—Disolver una porción de ER
Sulfato de Neomicina USP en ácido clorhı́drico 0,1 N para obtener
una solución que contenga el equivalente a 3,5 mg de neomicina El objetivo de este procedimiento es demostrar que el contenido
(base) por mL. de aluminio (Al) no excede el lı́mite establecido en la monografı́a
Solución de Polimixina B Estándar—Disolver una porción de individual de una sustancia cuya etiqueta indica que está destinada
ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhı́drico 0,1 N para a ser usada en hemodiálisis. [NOTA—Las Preparaciones Estándar y
obtener una solución que contenga 10 000 Unidades USP de la Preparación de Prueba pueden modificarse, si fuera necesario,
Polimixina B por mL. Si el artı́culo en análisis también contiene para obtener soluciones de concentraciones adecuadas adaptables al
Bacitracina o Bacitracina Cinc, disolver una porción de ER Sulfato intervalo lineal o de trabajo del instrumento.]
de Polimixina B USP en ácido clorhı́drico 0,1N para obtener una Diluyente de Ácido Nı́trico—Transferir 40 mL de ácido nı́trico
solución que contenga 500J Unidades USP de Polimixina B por mL, a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua.
156 h211i Arsénico / Pruebas Quı́micas USP 30
grasa adecuada para llaves de paso, apropiada para usarse con momento durante la digestión agregando pequeñas cantidades de la
disolventes orgánicos y conectar la unidad depuradora al tubo de solución de peróxido de hidrógeno cada vez que la mezcla se torne
absorción (e). Transferir 3,0 mL de dietilditiocarbamato de plata SR de color marrón o se oscurezca. Continuar la digestión hasta que la
al tubo de absorción. Agregar 3,0 g de cinc granulado (malla N8 20) materia orgánica se destruya, aumentando gradualmente la tempe-
a la mezcla del matraz y conectar inmediatamente la unidad ratura de la placa de calentamiento hasta que se desprenda abundante
depuradora ensamblada y permitir el desprendimiento de hidrógeno humo de trióxido de azufre y la solución se vuelva incolora
y el desarrollo de color a temperatura ambiente durante 45 minutos, o presente solamente un color ligeramente pajizo. Enfriar, agregar
agitando el matraz por rotación moderada cada 10 minutos. cuidadosamente 10 mL de agua, mezclar y volver a evaporar hasta
Desconectar el tubo de absorción de la unidad depuradora y del que aparezca humo irritante; repetir este procedimiento para eliminar
matraz generador y transferir la solución absorbente a celdas de cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar, agregar
absorción de 1 cm. La coloración roja producida por la Preparación cuidadosamente 10 mL de agua, lavar las paredes del matraz con
de Prueba no excederá la producida por la Preparación Estándar. Si algunos mL de agua y diluir con agua a 35 mL.
fuera necesario o conveniente, determinar la absorbancia a la Procedimiento—Proceder según se indica en el Procedimiento en
longitud de onda de máxima absorción entre 535 nm y 540 nm con el Método I.
un espectrofotómetro o colorı́metro adecuado, usando dietilditiocar- Sustancias Quı́micas Interferentes—Ver Sustancias Quı́micas
bamato de plata SR como blanco. Interferentes en Método I.
Sustancias Quı́micas Interferentes—Los metales o las sales de
metales, como el cromo, cobalto, cobre, mercurio, molibdeno,
nı́quel, paladio y plata, pueden interferir con la formación de arsina.
El antimonio, que forma estibina, produce una interferencia positiva
en el desarrollo del color con dietilditiocarbamato de plata SR.
Cuando se sospecha la presencia de antimonio, el color rojo que se
produce en las dos soluciones de dietilditiocarbamato de plata, puede
compararse a la longitud de onda de máxima absorción entre 535 nm
h221i CLORUROS Y SULFATOS
y 540 nm con un colorı́metro apropiado, ya que a esta longitud de
onda la interferencia debida a la estibina es inapreciable.
Las siguientes pruebas de lı́mites se utilizan como procedimientos
generales en aquellos casos en que se especifican los lı́mites de
MÉTODO II cloruros y sulfatos en las monografı́as individuales.
Realizar las pruebas y los controles utilizando tubos de vidrio que
NOTAS— tengan el mismo diámetro y sean tan semejantes en las restantes
(1) Precaución—Algunas sustancias pueden reaccionar en forma caracterı́sticas como sea posible (ver Comparación Visual en
de explosiones violentas cuando se digieren con peróxido de Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz h851i). Emplear las
hidrógeno. Extremar las medidas de seguridad en todo momento. mismas cantidades de los mismos reactivos tanto para la solución
(2) Si se trabaja con compuestos que contienen halógenos, en análisis como para la solución control que contiene el volumen
calentar las muestras con ácido sulfúrico a una temperatura más baja especificado de cloruro o sulfato. Si, después de la acidificación, la
evitando que la mezcla entre en ebullición y agregar cuidadosamente solución no queda totalmente transparente, filtrarla a través de un
el peróxido de hidrógeno antes de que tenga lugar la carbonización papel de filtro exento de cloruro y sulfato. Agregar el precipitante,
para prevenir la pérdida de arsénico trivalente. nitrato de plata SR o cloruro de bario SR, según sea necesario, a la
(3) Si la sustancia de prueba reacciona con demasiada rapidez y solución de prueba y a la solución de control en secuencia inmediata.
comienza a carbonizarse con 5 mL de ácido sulfúrico antes de En aquellos casos en que la monografı́a individual indique la
calentarse, se deberá usar en su lugar 10 mL de ácido sulfúrico realización de la prueba sobre un volumen especı́fico de una solución
diluido frı́o (1 en 2) y agregar algunas gotas de peróxido de de la sustancia y el lı́mite para cloruro o sulfato corresponda a 0,20
hidrógeno antes de calentar. mL o menos de ácido clorhı́drico 0,020 N o de ácido sulfúrico
Preparación Estándar—Pipetear 3,0 mL de Solución Estándar 0,020 N, respectivamente, realizar la prueba a la solución sin
de Arsénico y transferir al matraz generador, agregar 2 mL de ácido dilución adicional. En tales casos, mantener las mismas relaciones de
sulfúrico, mezclar y agregar la cantidad total de peróxido de volumen para la solución de control y para la solución en análisis.
hidrógeno al 30 por ciento empleado en la Preparación de Prueba. Cuando se realiza la prueba a sales de metales pesados, que muestran
Calentar la mezcla hasta que se desprenda humo denso. Dejar que se normalmente una reacción ácida, omitir la acidificación y no
enfrı́e, agregar cuidadosamente 10 mL de agua y volver a calentar neutralizar la solución. Disolver las sales de bismuto en unos
hasta que se produzca humo irritante. Se debe repetir este pocos mL de agua y 2 mL de ácido nı́trico antes del tratamiento con
procedimiento con otros 10 mL de agua para eliminar cualquier el agente precipitante.
traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar y diluir con agua hasta Cloruros—Disolver la cantidad especificada de la sustancia en
obtener 35 mL. análisis en 30 mL a 40 mL de agua o, si la sustancia ya está en
Preparación de Prueba—Excepto que se indique algo diferente solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40
en la monografı́a individual, transferir un matraz generador la mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al tornasol con ácido
cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la fórmula: nı́trico. Agregar 1 mL de ácido nı́trico y 1 mL de nitrato de plata SR
y agua suficiente para obtener 50 mL. Mezclar y dejar en reposo
3,0 / L, durante 5 minutos protegido de la luz solar directa. A menos que se
en donde L es el lı́mite de arsénico en ppm. Agregar 5 mL de ácido especifique algo diferente en la monografı́a correspondiente,
sulfúrico y algunas perlas de vidrio y digerir en una campana de comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solución
extracción, preferentemente en una placa de calentamiento, y a una que contenga el volumen de ácido clorhı́drico 0,020 N especificado
temperatura de no más de 1208, hasta que se inicie la carbonización. en la monografı́a.
(Agregar más ácido sulfúrico si fuera necesario para humedecer Sulfatos—Disolver la cantidad especificada de la sustancia en
completamente algunas muestras pero teniendo en cuenta que el análisis en 30 mL a 40 mL de agua, o, si la sustancia ya está en
volumen total agregado no puede exceder de 10 mL.) Agregar solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40
cuidadosamente, gota a gota, peróxido de hidrógeno al 30%, y dejar mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al tornasol con ácido
que la reacción disminuya y calentar nuevamente entre una y otra clorhı́drico. Agregar 1 mL de ácido clorhı́drico 3 N, 3 mL de cloruro
gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente mezclando lo de bario SR y agua suficiente para obtener 50 mL. Mezclar y dejar en
suficiente para evitar una reacción rápida. Interrumpir el calenta- reposo durante 10 minutos. A menos que se especifique algo
miento si se produce excesiva espuma. Cuando la reacción ha diferente en la monografı́a correspondiente, comparar la turbidez, si
terminado, calentar cuidadosamente, rotando el matraz ocasional- la hubiera, con la producida en una solución que contenga el
mente para evitar que algunas porciones de la muestra queden volumen de ácido sulfúrico 0,020 N especificado en la monografı́a.
adheridas a las paredes del matraz expuestas a la unidad de
calentamiento. Mantener las condiciones de oxidación en todo
158 h223i Dimetilanilina / Pruebas Quı́micas USP 30
cuidadosamente 1 mL de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento y agua hasta 45 mL; o disolver en agua y diluir con agua hasta 45 mL
evaporar nuevamente hasta que se produzcan humos blancos densos la cantidad, en g, de la sustancia a analizar, según se calcula por la
y hasta un volumen de 2 a 3 mL. Si la solución aún está amarilla, fórmula:
repetir la adición de 5 mL de agua y el tratamiento con peróxido.
Enfriar, diluir cuidadosamente con unos pocos mL de agua, enjuagar 1,0 / (1000L),
y recoger en un tubo de comparación de color de 50 mL, teniendo en donde L es el lı́mite de Hierro expresado como porcentaje.
cuidado de que el volumen combinado no exceda de 25 mL. Agregar 2 mL de ácido clorhı́drico y mezclar.
Si la sustancia es un lı́quido—Transferir la cantidad pesada de la Procedimiento—A cada uno de los tubos que contienen la
sustancia en análisis a un matraz Kjeldahl de 100 mL limpio y seco. Preparación Estándar y la Preparación de Prueba agregar 50 mg de
[NOTA—Se puede usar un matraz de 300 mL si la reacción produce cristales de peroxidisulfato de amonio y 3 mL de Solución de
mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en un ángulo de 458 y Tiocianato de Amonio y mezclar: el color de la solución obtenida con
agregar cuidadosamente unos pocos mL de una mezcla de 8 mL de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de
ácido sulfúrico y 10 mL de ácido nı́trico. Entibiar suavemente hasta la Preparación Estándar.
que se inicie la reacción, dejar que la reacción disminuya y proceder
según se indica en Si la sustancia es un sólido, comenzando donde
dice ‘‘agregar porciones de la misma mezcla de ácidos’’.
Preparación Control—Proceder con la digestión, usando la
misma cantidad de muestra y el mismo procedimiento, según se
indica en el párrafo Si la sustancia es un sólido en la sección
h251i PLOMO
Preparación de Prueba, hasta el paso ‘‘Enfriar, diluir cuidadosa-
mente con unos pocos mL de agua’’. Agregar 2,0 mL de la Solución
Estándar de Plomo (20 mg de plomo) y mezclar. Transferir a un tubo La imposición de lı́mites estrictos para las cantidades de plomo
de comparación de color de 50 mL, enjuagar el matraz con agua, que pueden estar presentes en los productos farmacéuticos ha dado
agregando los enjuagues al tubo hasta obtener un volumen de 25 mL como resultado la utilización de dos métodos; el que se presenta
y mezclar. a continuación se basa en la extracción de plomo mediante
Procedimiento—Tratar la Preparación de Prueba, la Prepara- soluciones de ditizona. Para la determinación del contenido de
ción Estándar y la Preparación Control del siguiente modo. Usando metales pesados en general, expresados como equivalentes de
un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto plomo, ver Metales Pesados h231i.
como indicador externo, ajustar la solución a un pH entre 3,0 y 4,0 Seleccionar todos los reactivos para esta prueba de forma que
con hidróxido de amonio (se puede usar una solución de amonı́aco tengan un contenido de plomo lo más bajo posible y almacenar todas
diluida, si se desea, a medida que se acerca al pH especificado), las soluciones reactivo en recipientes de vidrio de borosilicato.
diluir con agua hasta 40 mL y mezclar. Enjuagar bien todos los materiales de vidrio con ácido nı́trico diluido
Agregar a cada tubo 2 mL de la Solución Amortiguadora de (1 en 2) tibio y luego con agua.
Acetato de pH 3,5, luego agregar 1,2 mL de tioacetamida–glicerina Reactivos Especiales—
básica SR, diluir con agua hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo
durante 2 minutos y observar hacia abajo sobre una superficie SOLUCIÓN DE CIANURO Y AMONÍACO—Disolver 2 g de cianuro de
blanca*: el color de la Preparación de Prueba no es más oscuro que potasio en 15 mL de hidróxido de amonio y diluir con agua hasta
el de la Preparación Estándar, y el color de la Preparación Control 100 mL.
es igual o más oscuro que el de la Preparación Estándar. SOLUCIÓN DE CITRATO DE AMONIO—Disolver 40 g de ácido
cı́trico en 90 mL de agua. Agregar 2 ó 3 gotas de rojo fenol SR y
luego agregar cuidadosamente hidróxido de amonio hasta que la
solución adquiera un color rojizo. Eliminar todo el plomo que pueda
estar presente mediante extracción de la solución con porciones de
20 mL de Solución de Extracción de Ditizona (ver a continuación),
hasta que la solución de ditizona retenga su color verde anaranjado.
h241i HIERRO SOLUCIÓN DE PLOMO ESTÁNDAR DILUIDA—Diluir un volumen
medido con exactitud de Solución de Plomo Estándar (ver Metales
Pesados h231i) [que contiene 10 mg de plomo por mL], con 9
volúmenes de ácido nı́trico diluido (1 en 100) para obtener una
Esta prueba de lı́mite se suministra para demostrar que el solución que contenga 1 mg de plomo por mL.
contenido de hierro, en forma férrica o ferrosa, no excede el lı́mite de SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN DE DITIZONA—Disolver 30 mg de
hierro especificado en la monografı́a individual. La determinación se ditizona en 1000 mL de cloroformo y agregar 5 mL de alcohol.
realiza mediante la comparación visual concomitante con un control Almacenar la solución en un refrigerador.
preparado a partir de una solución de hierro estándar. Antes de usar, agitar un volumen apropiado de la solución de
Reactivos Especiales— extracción de ditizona junto con aproximadamente la mitad de su
SOLUCIÓN DE HIERRO ESTÁNDAR—Disolver 863,4 mg de sulfato volumen de ácido nı́trico diluido (1 en 100), desechando el ácido
férrico amónico [FeNH4(SO4)2 12H2O] en agua, agregar 10 mL de nı́trico.
ácido sulfúrico 2 N y diluir con agua hasta 100,0 mL. Pipetear 10 mL SOLUCIÓN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA—Disolver 20 g
de esta solución y transferirlos a un matraz volumétrico de 1000 mL, de clorhidrato de hidroxilamina en suficiente agua para obtener
agregar 10 mL de ácido sulfúrico 2 N, diluir con agua a volumen y aproximadamente 65 mL. Transferir a un separador, agregar 5 gotas
mezclar. Esta solución contiene el equivalente a 0,01 mg (10 mg) de de azul de timol SR, luego agregar hidróxido de amonio hasta que la
hierro por mL. solución adquiera un color amarillo. Agregar 10 mL de solución de
SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE AMONIO—Disolver 30 g de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 25), mezclar y dejar en reposo
tiocianato de amonio en agua para obtener 100 mL. durante 5 minutos. Extraer esta solución con porciones sucesivas de
Preparación Estándar—Pipetear 1 mL de Solución Estándar de 10 a 15 mL de cloroformo hasta que una porción de 5 mL del
Hierro (10 mg de Fe) y transferirlos a un tubo para comparación de extracto clorofórmico no presente color amarillo al agitarla con
color de 50 mL, diluir con agua hasta 45 mL, agregar 2 mL de ácido sulfato cúprico SR. Agregar ácido clorhı́drico 3 N hasta que la
clorhı́drico y mezclar. solución adquiera un color rosado (si fuera necesario, agregar
1 ó 2 gotas más de azul de timol SR) y luego diluir con agua hasta
Preparación de Prueba—Colocar en un tubo para comparación 100 mL.
de color de 50 mL la solución preparada para la prueba según se
SOLUCIÓN DE CIANURO DE POTASIO—Disolver 50 g de cianuro de
indica en la monografı́a individual y, si fuera necesario, diluir con
potasio en suficiente agua para obtener aproximadamente 100 mL.
Eliminar el plomo de esta solución mediante extracción con
porciones sucesivas de Solución de Extracción de Ditizona, según
se ha descrito en Solución de Citrato de Amonio, luego extraer
USP 30 Pruebas Quı́micas / h261i Mercurio 161
condensador y enjuagar las paredes del matraz para obtener un Se destaca la importancia de la concentración del ácido sulfúrico
volumen de 35 mL. Agregar 1 mL de la Solución de Permanganato utilizado en la prueba. El reactivo con la concentración requerida, es
de Potasio, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar. decir, 95,0 por ciento + 0,5 por ciento de H2SO4, se denomina
Preparación de Prueba—Transferir la cantidad calculada de la ‘‘Solución Reactivo.’’
sustancia de prueba a un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Agregar
5 mL de ácido nı́trico, 5 mL de ácido sulfúrico y algunas perlas de
vidrio. Acoplar un condensador refrigerado por agua adecuado con
una junta ahusada estándar que se ajuste al matraz y digerir en una
campana de extracción, preferentemente sobre una placa de
calentamiento, y a una temperatura que no exceda los 1208 hasta h281i RESIDUO DE
que comience la carbonización. (Si se necesita ácido sulfúrico
adicional para humedecer la muestra por completo, agregarlo INCINERACIÓN
cuidadosamente a través del condensador, pero sin permitir que el
volumen total agregado exceda de 10 mL.) Después de que el ácido
haya descompuesto la sustancia de prueba, agregar cuidadosamente,
gota a gota a través del condensador, peróxido de hidrógeno al 30 Partes de este capı́tulo general han sido armonizadas con los
por ciento, permitir que la reacción disminuya su intensidad, calentar textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la
nuevamente entre las gotas (agregar las primeras gotas muy Farmacopea Japonesa. Las partes que no están armonizadas se
lentamente y mezclando bien para evitar una reacción rápida; indican con los sı́mbolos (^^). Los textos armonizados de estas
detener el calentamiento si la espuma se torna excesiva). Cuando la farmacopeas son por lo tanto intercambiables y, en lugar de este
reacción haya disminuido, calentar cuidadosamente y girar el matraz capı́tulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pueden
ocasionalmente para evitar que la muestra se aglutine sobre el vidrio usar los métodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea
expuesto a la unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de Japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos. Estas
oxidación en todo momento durante la digestión agregando farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio
pequeñas cantidades de solución de peróxido de hidrógeno cuando unilateral a este capı́tulo armonizado.
la mezcla se vuelva de color marrón o se oscurezca. Continuar la La prueba de Residuo de Incineración / Cenizas Sulfatadas emplea
digestión hasta que la materia orgánica se destruya y luego calentar un procedimiento para medir la cantidad de sustancia residual no
a reflujo la mezcla durante 1 hora. Cortar el agua que circula a través volatilizada de una muestra cuando ésta se incinera en presencia de
del condensador y calentar hasta que se desprendan abundantes ácido sulfúrico conforme al procedimiento que se describe
humos de trióxido de azufre y la solución se vuelva incolora a continuación. Generalmente esta prueba se emplea para determinar
o presente solamente un color pajizo claro. Enfriar y agregar el contenido de impurezas inorgánicas en una sustancia orgánica.
cuidadosamente 10 mL de agua a través del condensador, mezclando Procedimiento—Incinerar un crisol adecuado (por ejemplo de
por rotación suave. Calentar nuevamente hasta que aparezcan humos sı́lice, platino, cuarzo o porcelana) a 600 + 508 durante 30 minutos,
blancos. Enfriar y agregar cuidadosamente 15 mL de agua. Retirar el enfriar el crisol en un desecador (gel de sı́lice u otro desecante
condensador y enjuagar las paredes del matraz con algunos mL de adecuado) y pesarlo con exactitud. Pesar con exactitud ^1 a 2 g de la
agua para obtener un volumen de 35 mL. Agregar 1 mL de la sustancia o^ la cantidad que se especifica en la monografı́a
Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición durante individual, en el crisol.
unos segundos y enfriar. Humedecer la muestra con una pequeña cantidad (generalmente
Procedimiento—Proceder según se indica en el Procedimiento en 1 mL) de ácido sulfúrico y luego calentar suavemente a una
Método IIa. temperatura tan baja como sea posible hasta que la sustancia se
carbonice totalmente. Enfriar; y luego ^, a menos que se indique
algo diferente en la monografı́a individual,^ humedecer el residuo
con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de ácido sulfúrico;
calentar suavemente hasta que no se generen humos blancos
h271i PRUEBA PARA e incinerar a 600 + 508 ^, a menos que se especifique otra
temperatura en la monografı́a individual,^ hasta que el residuo este
SUSTANCIAS FÁCILMENTE completamente incinerado. Asegurarse, durante todo el procedi-
miento, de que no se produzcan llamas en ningún momento. Enfriar
CARBONIZABLES el crisol en un desecador (gel de sı́lice u otro desecante adecuado),
pesar con exactitud y calcular el porcentaje del residuo.
A menos que se especifique algo diferente, si la cantidad del
residuo ası́ obtenido excede el lı́mite especificado en la monografı́a
En las pruebas para sustancias fácilmente carbonizables, a menos individual, humedecer nuevamente con ácido sulfúrico, calentar
que se indique algo diferente, agregar la cantidad especificada de la e incinerar como se indicó anteriormente, usando un perı́odo de
sustancia, finamente pulverizada si se encuentra en forma sólida, en incineración de 30 minutos, hasta que dos pesadas consecutivas del
pequeñas porciones al recipiente para comparación que es de vidrio residuo no difieran en más de 0,5 mg o hasta que el porcentaje del
incoloro resistente a la acción del ácido sulfúrico y contiene el residuo cumpla con el lı́mite establecido en la monografı́a individual.
^
volumen especificado de ácido sulfúrico SR (ver en Soluciones Realizar la incineración en una campana bien ventilada, pero
Reactivo). protegida de las corrientes de aire y a la menor temperatura posible
Revolver la mezcla con una varilla de vidrio hasta completar su para lograr la combustión completa del carbón. Puede usarse una
disolución, dejar la solución en reposo durante 15 minutos, a menos mufla, si se desea, cuyo uso para la incineración final se recomienda
que se indique algo diferente, y comparar el color de la solución con a 600 + 508.
el del lı́quido de comparación especificado utilizando un recipiente La mufla se puede calibrar empleando un termómetro digital
para comparación, que también es de vidrio incoloro y tiene las adecuado y una sonda termopar de trabajo calibrada contra un
mismas dimensiones internas y cruzadas, observando los lı́quidos termopar estándar rastreable al Instituto Nacional de Estándares y
transversalmente contra un fondo de porcelana blanca o de vidrio Tecnologı́a (National Institute of Standards and Technology).
blanco. Verificar la exactitud de los circuitos de medición y control de la
Cuando se aplica calor para disolver la sustancia en el ácido mufla mediante la comprobación de la temperatura fijada para el uso
sulfúrico SR, mezclar la muestra y el ácido en un tubo de ensayo, previsto en distintas posiciones dentro de la mufla. Seleccionar las
calentar como se indica y transferir la solución al recipiente para posiciones que reflejen el método de uso eventual con respecto a la
comparación para observarla con el Lı́quido de Comparación ubicación de la muestra en análisis. La tolerancia es de +258 en
designado (ver Color y Acromatismo h631i). cada posición medida.^
164 h291i Selenio / Pruebas Quı́micas USP 30
Cápsulas—Pesar con exactitud no menos de 20 cápsulas. Extraer mL, J. El tubo de entrada (burbujeo) se extiende casi hasta el fondo
completamente el contenido de las cápsulas con la ayuda de un del frasco de lavado de gas y termina en un disco sinterizado con una
hisopo de algodón si fuera necesario. Pesar con exactitud las porosidad gruesa. El tamaño de todas las juntas de vidrio es de 24/40,
cápsulas vacı́as y determinar el peso promedio del contenido de cada excepto la junta de 45/50 del frasco de lavado de gas.
cápsula. Mezclar el contenido combinado de las cápsulas para
obtener una mezcla uniforme y proceder según se indica en Tabletas
No Masticables, comenzando donde dice ‘‘transferir una cantidad
pesada con exactitud’’.
Procedimiento para Polvos, Sólidos Efervescentes,
Suspensiones y Otros Lı́quidos, Tabletas de Disolución Bucal,
Tabletas No Masticables, Tabletas Masticables y Cápsulas—
Pipetear 30,0 mL de ácido clorhı́drico 1,0 N SV y transferir a la
Preparación de Prueba mientras se continúa mezclando con el
Mezclador Magnético. [NOTA—Cuando la capacidad neutralizante de
ácido de la muestra en análisis es mayor de 25 mEq, usar 60,0 mL de
ácido clorhı́drico 1,0 N SV, y hacer las modificaciones correspon-
dientes en los cálculos.] Mezclar durante 15 minutos, cronometrados
exactamente, después de agregar el ácido, comenzar a valorar de
inmediato y en un perı́odo que no exceda los 5 minutos adicionales,
valorar el ácido clorhı́drico en exceso con hidróxido de sodio 0,5 N
SV para obtener un pH de 3,5 estable (durante 10 a 15 segundos).
Calcular el número de mEq de ácido consumido por la fórmula:
mEq totales = (30 6 NHCl) – (VNaOH 6 NNaOH),
en donde NHCl y NNaOH son las normalidades del ácido clorhı́drico SV
y del hidróxido de sodio SV, respectivamente; y VNaOH es el volumen
de hidróxido de sodio SV usado para la valoración. Expresar el
resultado como mEq del ácido consumido por g de la sustancia
analizada.
Procedimiento para Tabletas que Deben Masticarse—Pipetear
30,0 mL de ácido clorhı́drico 1,0 N SV y transferir a la Preparación
de Prueba mientras se continúa mezclando con el Mezclador
Magnético durante 10 minutos, cronometrados con exactitud, Figura 1. Aparato para Valoración de Alginatos.
después de agregar el ácido. Interrumpir el mezclado brevemente y
retirar sin demora cualquier base gomosa del vaso de precipitados
usando una aguja larga. Enjuagar sin demora la aguja con 20 mL de
agua, recogiendo los lavados en el vaso de precipitados y continuar
mezclando durante 5 minutos exactamente cronometrados, después APTITUD DEL SISTEMA
comenzar a valorar de inmediato y en un perı́odo que no exceda los
5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhı́drico en exceso con Empleando D-glucuronolactona como el estándar, proceder como
hidróxido de sodio 0,5 N SV para obtener un pH de 3,5 estable se indica en el Procedimiento, pero no realizar los pasos previos a la
(durante 10 a 15 segundos). Calcular el número de mEq de ácido ebullición. El sistema es adecuado si se cumplen los siguientes
consumido por la Tableta analizada por la fórmula: criterios: (1) la determinación con el blanco da como resultado un
valor neto de volumetrı́a C, de entre 0,02 y 0,06 mEq de ácido
mEq totales = (30 6 NHCl) – (VNaOH 6 NNaOH), clorhı́drico 0,1 N, calculado de la siguiente manera:
en donde los términos son los definidos anteriormente. Ab – Bb,
en donde Ab es el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en
los 25 mL utilizados y Bb es el número de mEq de ácido clorhı́drico
0,1 N utilizados en la volumetrı́a con el blanco; y (2) el porcentaje de
h311i VALORACIÓN DE dióxido de carbono, CO2, obtenido a partir del estándar está entre
24,7% y 25,3%.
ALGINATOS
PROCEDIMIENTO
A menos que se indique algo diferente en la monografı́a
APARATO individual, transferir una muestra de aproximadamente 250 mg,
pesados con exactitud, al matraz de reacción, D, agregar 50 mL de
El aparato necesario (ver Figura 1) contiene una válvula ácido clorhı́drico 0,1 N, agregar varias perlas de ebullición y
dosificadora capilar, A, seguida de un caudalı́metro, B, para controlar conectar el matraz al condensador de reflujo, F, empleando ácido
y vigilar el flujo de nitrógeno a través del sistema. Se emplean tubos fosfórico como lubricante. [NOTA—Se puede emplear grasa para
de plástico vinı́lico halogenado* y una conexión de caucho, C, para llaves de paso para las otras conexiones.] Conectar la lı́nea de
conectar el caudalı́metro a un brazo lateral de un matraz de reacción, nitrógeno al brazo lateral del matraz y ajustar el flujo de agua
D. El matraz D es un matraz de fondo esférico, de 250 mL, para refrigerante aproximadamente a 2 L por minuto.
ebullición, apoyado en un manto de calefacción adecuado, E. El [NOTA—Los pasos previos a la ebullición que se describen en este
matraz D está equipado con un condensador de reflujo de bobina párrafo son opcionales y únicamente es necesario realizarlos cuando
Hopkins de 225 mm, F. El condensador termina en una trampa en U, se sospecha la presencia de carbonatos inorgánicos.] Mantener el
G, que contiene dos bandas de 25 g de cinc de malla 20; estas bandas flujo de nitrógeno a través del aparato a una velocidad de 90 mL
están limitadas y separadas por tres tapones de lana de vidrio de a 100 mL por minuto. Acercar el manto de calefacción, E, hasta el
3 pulgadas. La trampa termina en un adaptador, H, que por medio de matraz, calentar la muestra y llevarla a ebullición, y mantener una
un tubo de plástico vinı́lico halogenado y un conector con llave de ebullición moderada durante 2 minutos. Apagar la fuente de calor,
paso por torsión, I, se conecta con un frasco lavador de gas de 250 bajar el manto, E, y dejar que la muestra se enfrı́e durante
*
Este tipo de tubos se denominan comúnmente tubos Tygon. Esta nota se aproximadamente 10 minutos.
agrega a los efectos de una mayor claridad y no implica que la USP avale este
producto.
166 h331i Valoración de Anfetaminas / Pruebas Quı́micas USP 30
Conectar el frasco lavador de gas vacı́o, J, y purgar el sistema con separen, deshechar la capa clorofórmica y usar los 10,0 mL de
nitrógeno a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto durante solución ácida del sulfato de la anfetamina como la Solución de
5 minutos. Reducir el flujo de nitrógeno hasta 60 mL a 65 mL por Valoración. Determinar concomitantemente la absorbancia de la
minuto, agregar al frasco 10 gotas de alcohol butı́lico, 25,0 mL de solución de la Preparación Estándar y la de la Solución de
hidróxido de sodio 0,25 N SV y 50 mL de agua destilada, Valoración en celdas de 1 cm a 280 nm y a la longitud de onda de
enjuagando hacia el interior del frasco lavador de gas y volver máxima absorción, aproximadamente a 257 nm, con un espectro-
a colocar la tapa. Desconectar la conexión de caucho, C, del brazo fotómetro apropiado, utilizando ácido sulfúrico 2 N previamente
lateral y agregar 46 mL de ácido clorhı́drico a través del brazo lateral saturado con cloroformo como blanco. Registrar la absorbancia de la
del matraz de ebullición. Volver a unir la lı́nea de nitrógeno, acercar solución de la Preparación Estándar como AS y la de la Solución de
el manto de calefacción y calentar la mezcla de reacción hasta Valoración como AU y calcular según se indica en la monografı́a
ebullición. Después de 2 horas de ebullición, aumentar el flujo de individual.
nitrógeno hasta 90 mL a 100 mL por minuto, suspender el
calentamiento y bajar el manto. Dejar que se enfrı́e durante 10
minutos. Desconectar y desmontar el frasco lavador de gas.
Empleando un chorro dirigido de agua destilada, enjuagar bien
todas las partes del tubo de burbujeo y tapar, recolectando los
lavados en el frasco de lavado de gas. Emplear nitrógeno para forzar
suavemente la salida de toda el agua del tubo de burbujeo. Agregar h341i AGENTES
al frasco inmediatamente 10 mL de solución de cloruro de bario al
10% y una barra de agitación. Tapar herméticamente y mezclar ANTIMICROBIANOS—
lentamente durante 1 minuto. Dejar en reposo durante un mı́nimo de
5 minutos. Agregar tres gotas de fenolftaleı́na SR y valorar con ácido CONTENIDO
clorhı́drico 0,1 N SV. Realizar una determinación con un blanco (ver
Valoraciones Volumétricas Residuales en Volumetrı́a h541i). Cal-
cular el porcentaje de dióxido de carbono, CO2, por la fórmula:
Un componente esencial de las inyecciones conservadas en
2200[(A – B) – C]/(1000W)(1 – D), envases multidosis es el agente o los agentes que se incorporan para
reducir el riesgo de que, en el momento de retirar parte del
en donde A es el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en los contenido, se produzca una contaminación microbiana accidental del
25 mL empleados; B es el número de mEq de ácido clorhı́drico 0,1 N contenido restante. Es un requisito farmacopeico que la presencia y
empleado para la volumetrı́a de la muestra o del estándar; C es el la cantidad agregada de tal(es) agente(s) consten en la etiqueta del
valor neto de volumetrı́a calculado en la determinación con un envase. Los métodos proporcionados aquı́ para los agentes más
blanco; W es el peso, en g, de la muestra o del estándar tomado; y D usados deben emplearse para demostrar que el agente declarado esta
es el porcentaje expresado hasta la décima de unidad (1 lugar presente pero no excede la cantidad declarada en la etiqueta en más
decimal), obtenido en la prueba de Pérdida por Secado para la de 20%.
muestra o para el estándar. La concentración de un conservante antimicrobiano agregado
a una preparación para uso oftálmico, nasal, ótico y parenteral,
multidosis o monodosis, puede disminuir durante la vida útil del
producto. Por ello, el fabricante debe determinar el nivel mı́nimo en
el que el conservante resulta eficaz y debe formular el producto de
h331i VALORACIÓN DE modo que se garantice que este nivel de efectividad exceda durante
toda la vida útil del producto. En el momento de su fabricación, el
ANFETAMINAS producto debe contener la cantidad declarada del conservante
antimicrobiano (dentro de un +20% considerando las variaciones
originadas en la fabricación y el análisis). La declaración de la
cantidad de conservante que se indica en la etiqueta, no pretende
Estándares de referencia USP h11i—ER Sulfato de Dextroanfe- definir la cantidad de conservante a mantener durante la vida útil del
tamina USP. producto; sino la cantidad que fue agregada, dentro de las
Preparación Estándar—Disolver una cantidad adecuada de ER limitaciones del proceso, y que no se excedió en más de 20%. Un
Sulfato de Dextroanfetamina USP, pesada con exactitud, en ácido ejemplo de tal declaración en la etiqueta es ‘‘___(unidad) agregado
sulfúrico 2 N (saturado con cloroformo) y diluir cuantitativamente como conservante.’’ [NOTA—‘‘ ____(unidad)’’ es un número seguido
con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una de la unidad de medida, por ej. 0,015 mg por mL o 0,1%.]
concentración conocida de aproximadamente 0,5 mg de sulfato de Los agentes más usados incluyen los dos derivados mercuriales,
dextroanfetamina por mL. nitrato fenilmercúrico y timerosal, los cuatro ésteres homólogos del
Preparación de Valoración—Preparar según se indica en la ácido p-hidroxibenzoico, fenol, alcohol bencı́lico y clorobutanol.
monografı́a individual. Para los dos primeros mencionados se emplea el método
polarográfico, mientras que para la determinación de los otros
Preparación de la Columna Cromatográfica (ver agentes se emplea la cromatografı́a de gases cuantitativa.
Cromatografı́a h621i)—Rellenar la base de un tubo cromatográfico
de 25 mm 6 300 mm con un trozo de lana de vidrio fina. Colocar
2 g de tierra silı́cea purificada en un vaso de precipitados de 100 mL,
agregar 1 mL de ácido clorhı́drico 0,1 N y mezclar hasta obtener una MÉTODO GENERAL POR CROMATOGRAFÍA
mezcla esponjosa. Transferir la mezcla a la columna y apisonar DE GASES
moderadamente para comprimir el material en una masa uniforme.
Transferir la Preparación de Valoración a la columna, enjuagar y Los procedimientos generales que se establecen a continuación
secar el vaso de precipitados con 1 g de tierra silı́cea purificada y son aplicables a la determinación cuantitativa de alcohol bencı́lico,
transferir a la columna. Apisonar un trozo de lana de vidrio en la clorobutanol, fenol y los ésteres metı́lico, etı́lico, propı́lico y butı́lico
parte superior de la columna. del ácido p-hidroxibenzoico; estos últimos se tratan como un grupo
Procedimiento—Lavar la columna con 100 mL de cloroformo pero, si están presentes en forma individual, se los puede determinar
previamente saturado con agua y descartar los lavados. Colocar por separado. Preparar la Solución de Estándar Interno y la
como receptor debajo de la columna un separador de 125 mL que Preparación Estándar para cada agente según se indica a continua-
contenga 10,0 mL de ácido sulfúrico 2 N previamente saturado con ción. A menos que se indique lo contrario, preparar la Preparación
cloroformo. Hacer pasar a través de la columna 35 mL de cloroformo de Prueba a partir de porciones medidas con exactitud de la Solución
amoniacal, preparado equilibrando 2 mL de hidróxido de amonio y de Estándar Interno y la muestra de la prueba, de tamaño tal que la
100 mL de cloroformo y completar la elución con 70 mL de concentración del agente y la composición del disolvente se
cloroformo previamente saturado con agua. Retirar el separador, correspondan estrechamente con la concentración y la composición
agitar vigorosamente durante 1 minuto, dejar que las capas se de la Preparación Estándar. En la siguiente tabla se proporcionan los
USP 30 Pruebas Quı́micas / h341i Agentes Antimicrobianos—Contenido 167
parámetros operativos recomendados para el cromatógrafo de gases; Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—[NOTA—
el gas transportador es helio o nitrógeno y el detector es del tipo de Ver la tabla adjunta para determinar las dimensiones de la columna,
ionización a la llama. el relleno de la columna con su fase y soporte, la velocidad de flujo y
la temperatura de la columna.] Mantener la temperatura del inyector
a 1808 y la del detector, a 2208. Cromatografiar la Preparación
Estándar y registrar el cromatograma según se indica en el
Parámetros Operativos Recomendados para Procedimiento: los tiempos de retención relativos son aproximada-
el Cromatógrafo de Gases mente 0,8 para el benzaldehı́do y 1,0 para el clorobutanol; la
Dimensiones Relleno de Velocidad Tempera- resolución, R, entre el benzaldehı́do y el clorobutanol no es menor de
de la Columna la Columna de Flujo, tura de 2,0; y la desviación estándar relativa para inyecciones repetidas no es
Fases y mL por la más de 2,0%.
Agente Long. DI Soporte min. Columna Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo volú-
menes iguales (aproximadamente 1 mL) de la Preparación Estándar
Alcohol 1,8 m 3 mm 5% G16/ 50 1408 y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas y medir
Bencı́- S1A las áreas correspondientes a los picos principales. Calcular la
lico cantidad, en mg, de clorobutanol (C4H7Cl3O) en cada mL de la
Cloro- 1,8 m 2 mm 5% G16/ 20 1108 muestra sometida a la prueba, por la fórmula:
buta- S1A
nol C(L/D)(RU / RS)
Fenol 1,2 m 3 mm 5% G16/ 50 1458
S1A en donde C es la concentración, en mg por mL, de clorobutanol,
Parabenos 1,8 m 2 mm 5% G2/ 20 1508 calculada con respecto a la sustancia anhidra, en la Preparación
S1A Estándar; L es la cantidad declarada, en mg, de clorobutanol en cada
mL de la muestra de prueba; D es la concentración, en mg por mL,
de clorobutanol en la Preparación de Prueba, respecto al volumen
de la muestra sometida a la prueba y el grado de dilución; y RU y RS
son los cocientes entre el pico de clorobutanol y el pico de
Alcohol Bencı́lico benzaldehı́do obtenidos a partir de la Preparación de Prueba y de la
Preparación Estándar, respectivamente.
Solución de Estándar Interno—Disolver aproximadamente 380
mg de fenol en 10 mL de metanol contenido en un matraz
volumétrico de 200 mL. Agregar agua a volumen y mezclar. Fenol
Preparación Estándar—Disolver aproximadamente 180 mg de
ER Alcohol Bencı́lico USP, pesados con exactitud, en 20,0 mL de Solución de Estándar Interno—Pipetear 1 mL de ER Alcohol
metanol contenidos en un matraz volumétrico de 100 mL. Agregar la Bencı́lico USP y transferir a un matraz volumétrico de 500 mL,
Solución de Estándar Interno a volumen y mezclar. agregar metanol a volumen y mezclar.
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo volú- Preparación Estándar—Disolver aproximadamente 75 mg de
menes iguales (aproximadamente 5 mL) de la Preparación Estándar ER Fenol USP, pesados con exactitud, en 7,5 mL de metanol
y de la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el contenidos en un matraz volumétrico de 100 mL. Agregar 20,0 mL
aparato ajustado a los parámetros establecidos en la tabla adjunta y de Solución de Estándar Interno, luego agregar agua a volumen y
medir las áreas correspondientes a los picos de alcohol bencı́lico y mezclar.
fenol. Calcular el contenido, en mg por mL, de alcohol bencı́lico Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo volú-
(C7H8O) en la muestra tomada, por la fórmula: menes iguales (aproximadamente 3 mL) de la Preparación Estándar
y la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas con el
100(C/V)(p1 / p2)(P2 / P1) aparato ajustado a los parámetros establecidos en la tabla adjunta y
en donde C es la concentración, en mg por mL, de alcohol bencı́lico medir las áreas correspondientes a los picos de fenol y alcohol
en la Preparación Estándar; V es el volumen, en mL, de la muestra bencı́lico. Calcular el contenido, en mg por mL, de fenol (C6H6O) en
de la prueba usada para preparar cada 100 mL de la Preparación de cada mL de la muestra tomada, por la fórmula:
Prueba; p1 y p2 son las áreas de los picos del alcohol bencı́lico y el 100(C/V)(p1 / p2)(P2 / P1)
fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de
Prueba; y P1 y P2 son las áreas de los picos del alcohol bencı́lico y el en donde C es la concentración, en mg por mL, de fenol en la
fenol, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Preparación Estándar; V es el volumen, en mL, de la muestra de la
Estándar. prueba usada para preparar 100 mL de la Preparación de Prueba; p1
y p2 son las áreas de los picos de fenol y alcohol bencı́lico,
respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación de Prueba; y
Clorobutanol P1 y P2 son las áreas de los picos de fenol y alcohol bencı́lico,
respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación Estándar.
Solución de Estándar Interno—Transferir aproximadamente
140 mg de benzaldehı́do a un matraz volumétrico de 100 mL,
agregar 10 mL de metanol y agitar por rotación moderada para Metilparabeno y Propilparabeno
disolver. Diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación Estándar—Transferir aproximadamente 125 mg de Solución de Estándar Interno—Colocar aproximadamente 200
ER Clorobutanol USP, pesados con exactitud, a un matraz mg de benzofenona en un matraz volumétrico de 250 mL, diluir
volumétrico de 25 mL. Agregar 2 mL de metanol, agitar por a volumen con éter y mezclar.
rotación moderada para disolver, diluir a volumen con agua y Preparación Estándar—Colocar 100 mg de ER Metilparabeno
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución y 5,0 mL de la Solución USP y 10 mg de ER Propilparabeno USP, pesados con exactitud, en
de Estándar Interno a un matraz de 25 mL y mezclar para obtener un matraz volumétrico de 200 mL, diluir a volumen con Solución de
una solución con una concentración conocida de aproximadamente Estándar Interno y mezclar. Colocar 10 mL de esta solución en un
2,5 mg de clorobutanol por mL. matraz Erlenmeyer de 25 mL y proceder según se indica en la
Preparación de Prueba—Diluir cuantitativamente, si fuera Preparación de Prueba, comenzando desde donde dice ‘‘Agregar
necesario, un volumen medido con exactitud de la muestra de la 3 mL de piridina.’’
prueba con metanol para obtener una solución que no contenga más Preparación de Prueba—Pipetear 10 mL de la muestra sometida
de aproximadamente 5,0 mg de clorobutanol por mL. Combinar 3,0 a la prueba y 10 mL de la Solución de Estándar Interno en un
mL de esta solución con 3,0 mL de la Solución de Estándar Interno separador pequeño. Agitar vigorosamente, permitir que las capas se
y mezclar. separen, retirar la capa acuosa y ponerla en un segundo separador y
168 h345i Valoración de Ácido Cı́trico/Citrato y Fosfato / Pruebas Quı́micas USP 30
transferir la capa de éter a un matraz pequeño a través de un embudo (id)U, como la diferencia entre la corriente residual y la corriente
que contenga sulfato de sodio anhidro. Extraer la capa acuosa con limitante. De forma similar y concomitante, determinar la corriente
dos porciones de éter de 10 mL y filtrar también los extractos a través de difusión, (id) S, de la Preparación Estándar. Calcular la cantidad,
del sulfato de sodio anhidro. Evaporar los extractos combinados en en mg, de nitrato fenilmercúrico (C6H5HgNO3) en cada mL de la
una corriente de aire seco hasta que el volumen se reduzca muestra tomada, por la fórmula:
aproximadamente a 10 mL y luego transferir el residuo a un
matraz Erlenmeyer de 25 mL. Agregar 3 mL de piridina, completar 2,5C[(id)U / (id)S],
la evaporación del éter y hervir en una placa de calentamiento hasta en donde C es la concentración, en mg por mL, de nitrato
que el volumen se reduzca aproximadamente a 1 mL. Enfriar y fenilmercúrico en la Preparación Estándar.
agregar 1 mL de un agente silanizante adecuado, como por ejemplo
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida, bis(trimetilsilil)acetamida o una
mezcla de hexametildisilazano y trimetilclorosilano [2 : 1 ó 3 : 1 (v/
v)]. Mezclar y dejar en reposo durante no menos de 15 minutos. Timerosal
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo volú- Preparación Estándar—En el dı́a de uso, colocar aproximada-
menes iguales (2 mL) de la solución silanizada de la Preparación mente 25 mg de ER Timerosal USP, pesados con exactitud, en un
Estándar y la Preparación de Prueba, registrar los cromatogramas matraz volumétrico de 250 mL, agregar agua a volumen y mezclar.
con el aparato ajustado a los parámetros establecidos en la tabla Proteger de la luz. Pipetear 15 mL de esta solución en un matraz
adjunta y medir las áreas correspondientes a los picos de volumétrico de 25 mL, agregar 1,5 mL de solución de gelatina (1 en
metilparabeno, propilparabeno y benzofenona. Calcular el con- 1000), luego agregar solución de nitrato de potasio 1 en 100
tenido, en mg por mL, de metilparabeno (C8H8O3) en la muestra a volumen y mezclar.
sometida a la prueba, por la fórmula:
Preparación de Prueba—Pipetear 15 mL de la muestra en
10(CM / V)(p1 / p3)(P3 / P1) análisis, transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, agregar 1,5
mL de solución de gelatina (1 en 1000), agregar solución de nitrato
en donde CM es la concentración, en mg por mL, de metilparabeno en de potasio 1 en 100 a volumen y mezclar.
la Preparación Estándar; V es el volumen, en mL, de la muestra Procedimiento—Transferir una porción de la Preparación de
tomada; p1 y p3 son las áreas de los picos del metilparabeno y la Prueba a la celda polarográfica y desairear burbujeando nitrógeno
benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación a través de la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo de
de Prueba; y P1 y P3 son las áreas de los picos del metilparabeno y la goteo de mercurio de un polarógrafo adecuado (ver Polarografı́a
benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación h801i) y registrar el polarograma de –0,2 a –1,4 voltios en
Estándar. De modo similar, calcular el contenido, en mg por mL, de comparación con el electrodo de calomel saturado. Determinar la
propilparabeno (C10H12O3) en la muestra sometida a la prueba, por la corriente de difusión, (id)U, como la diferencia entre la corriente
fórmula: residual y la corriente limitante. De forma similar y concomitante,
10(CP / V)(p2 / p3)(P3 / P2) determinar la corriente de difusión, (id) S, de la Preparación
Estándar. Calcular la cantidad, en mg, de timerosal (C6H9HgNaO2S)
en donde CP es la concentración, en mg por mL, de propilparabeno en en cada mL de la muestra sometida a la prueba, por la fórmula:
la Preparación Estándar; V es el volumen, en mL, de la muestra
tomada; p2 y p3 son las áreas de los picos del propilparabeno y la 1,667C[(id)U / (id)S],
benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Preparación en donde C es la concentración, en mg por mL, de timerosal en la
de Prueba; y P2 y P3 son las áreas de los picos del propilparabeno y Preparación Estándar y los otros términos son los definidos
la benzofenona, respectivamente, obtenidos a partir de la Prepara- anteriormente.
ción Estándar.
El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse de modo
similar.
Preparación Estándar 1—Disolver ER Ácido Cı́trico USP en y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con alcohol para
hidróxido de sodio 1 mM recién preparado para obtener una solución obtener una solución con una concentración de aproximadamente 10
con una concentración conocida de aproximadamente 20 mg de mg por mL. Pipetear 20 mL de esta solución y transferir a un matraz
citrato (C6H5O7) por mL. Erlenmeyer de 50 mL con tapón de vidrio.
Preparación Estándar 2—Disolver ER Ácido Cı́trico USP y Preparación de Valoración—Preparar según se indica en la
fosfato monobásico de sodio en hidróxido de sodio 1 mM recién monografı́a individual.
preparado para obtener una solución con concentraciones conocidas Procedimiento—A sendos matraces que contienen la Prepara-
de aproximadamente 20 mg por mL y 12 mg por mL de citrato y ción de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente, y
fosfato (PO4), respectivamente. a un matraz similar que contenga 20,0 mL de alcohol como blanco,
Preparación de Valoración para la Valoración de Ácido agregar 2,0 mL de una solución preparada por disolución de 50 mg
Cı́trico/Citrato—A menos que se especifique algo diferente en la de azul de tetrazolio en 10 mL de metanol y mezclar. Agregar
monografı́a, disolver una cantidad adecuada de la forma farmacéu- después a cada matraz 2,0 mL de una mezcla de alcohol e hidróxido
tica sólida en hidróxido de sodio 1 mM recién preparado para de tetrametilamonio SR (9 : 1), mezclar y dejar en reposo en la
obtener una solución que contenga aproximadamente 20 mg de oscuridad durante 90 minutos. Sin demora, determinar al mismo
citrato por mL. Si la forma farmacéutica es una formulación lı́quida, tiempo las absorbancias de las soluciones de la Preparación de
diluir con agua y agregar una solución de hidróxido de sodio recién Valoración y la Preparación Estándar aproximadamente a 525 nm,
preparada para obtener una solución que contenga aproximadamente utilizando un espectrofotómetro adecuado, contra el blanco. Calcular
20 mg de citrato por mL en hidróxido de sodio 1 mM. el resultado por la fórmula dada en la monografı́a individual, en
Preparación de Valoración para la Valoración de Fosfato—A donde C es la concentración, en mg por mL, del Estándar de
menos que se especifique algo diferente en la monografı́a, disolver Referencia en la Preparación Estándar; y AU y AS son las
una cantidad adecuada de la forma farmacéutica sólida en hidróxido absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y
de sodio 1 mM recién preparado para obtener una solución que la Preparación Estándar, respectivamente.
contenga aproximadamente 12 mg de fosfato por mL. Si la forma
farmacéutica es una formulación lı́quida, diluir con agua y agregar
una solución de hidróxido de sodio recién preparada para obtener
una solución que contenga aproximadamente 12 mg de fosfato por
mL en hidróxido de sodio 1 mM.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar h361i VALORACIÓN
un cromatógrafo de lı́quidos con una columna separadora de aniones
adecuada; una guarda columna de 4 mm 6 50 mm y una columna DE BARBITÚRICOS
analı́tica de 4 mm 6 250 mm, ambas rellenas con material L61; y un
detector electroquı́mico con detección de conductividad suprimida
mediante un autosupresor de aniones con micromembrana o un
sistema de supresión quı́mica adecuado. Mantener todas las Estándar Interno, Solución del Estándar Interno, Preparación
columnas a una temperatura de 308 y eluir a una velocidad de Estándar y Preparación de Valoración—Preparar según se indica
flujo de 2 mL por minuto. [NOTA—Se debe colocar una columna para en la monografı́a individual.
atrapar aniones antes del inyector para extraer las trazas de Sistema cromatográfico—En condiciones tı́picas, equipar un
contaminantes aniónicos en la Fase Móvil.] Cromatografiar la cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y con
Preparación Estándar 1 o la Preparación Estándar 2, según una columna de vidrio de 4 mm 6 0,9 m rellena con fase lı́quida
corresponda, y registrar el cromatograma según se indica en el G10 al 3% sobre soporte S1A de malla 80 a 100. Mantener la
Procedimiento: el factor de asimetrı́a no es mayor de 2,0 y la temperatura de la columna a 2008 + 108 y mantener el inyector y el
desviación estándar relativa de las áreas de los picos de citrato (y detector aproximadamente a 2258, la temperatura de la columna
fosfato, según corresponda), para seis inyecciones repetidas de la puede variar dentro de la tolerancia especificada, según sea
Preparación Estándar 1 o de la Preparación Estándar 2, no es más necesario, para cumplir las especificaciones de Aptitud del Sistema
de 1,5%. y proporcionar tiempos de retención apropiados. Emplear un gas
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo 10 mL trasportador adecuado, tal como nitrógeno seco, a una velocidad de
de la Preparación Estándar y de la Preparación de Valoración flujo apropiada, como por ejemplo de 60 mL a 80 mL por minuto.
correspondientes, registrar los cromatogramas y medir las áreas de Emplear inyección directa en la columna. [NOTA—Si el instrumento
los picos de citrato y de fosfato según corresponda. Determinar la no está equipado para inyección directa en la columna, emplear un
concentración de citrato o de fosfato en la porción de Preparación de inyector recubierto de vidrio que se haya lavado sucesivamente con
Valoración tomada, por la fórmula: una solución de limpieza de ácido crómico, agua, metanol,
cloroformo, una solución 1 en 10 de trimetilclorosilano en
CS (rU / rS) cloroformo y cloroformo.]
en donde CS es la concentración de citrato o fosfato, en mg por mL, Aptitud del Sistema (ver Cromatografı́a h621i)—Cromatogra-
en la Preparación Estándar correspondiente; y rU y rS son las áreas fiar cinco inyecciones repetidas de la Preparación Estándar y
de los picos de citrato o fosfato obtenidos a partir de la Preparación registrar el cromatograma según se indica en el Procedimiento: la
de Valoración y de la Preparación Estándar, respectivamente. desviación estándar relativa para el cociente RS no es más de 1,5%.
En un cromatograma apropiado, la resolución, R, entre el ácido
barbitúrico y el Estándar Interno no es menor que el valor dado en la
monografı́a individual y el factor de asimetrı́a, T, para cada uno de
los dos picos no es mayor de 2,0.
Procedimiento—Inyectar en un cromatógrafo de gases apropiado
h351i VALORACIÓN DE una porción adecuada (aproximadamente 5 mL) de la Preparación
estándar y registrar el cromatograma. De modo similar, inyectar una
ESTEROIDES porción adecuada de la Preparación de Valoración y registrar el
cromatograma. Calcular el contenido de barbiturato o ácido
barbitúrico en la muestra de valoración por la fórmula que se
proporciona en la monografı́a individual, en donde RU es el cociente
El siguiente procedimiento se aplica para determinar los esteroides de respuesta entre los picos del ácido barbitúrico y del Estándar
Farmacopeicos que poseen grupos funcionales reductores tales como Interno en la Preparación de Valoración; QS es el cociente entre el
a-cetoles. peso del barbitúrico en la forma de ácido y el del Estándar Interno
Preparación Estándar—Disolver en alcohol una cantidad en la Preparación Estándar; Ci es la concentración, en mg por mL,
adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la de Estándar Interno en la Solución de Estándar Interno; y RS es el
monografı́a individual, previamente secado en las condiciones cociente de respuesta entre los picos del ácido barbitúrico y del
especificadas en la monografı́a individual y pesado con exactitud, Estándar Interno en la Preparación Estándar.
170 h371i Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo / Pruebas Quı́micas USP 30
Los factores tales como los procedimientos de limpieza, los temperatura de extracción. Dejar que el autoclave se enfrı́e
medios con los que entra en contacto y las condiciones de rápidamente y enfriar a temperatura ambiente. Tratar el envase
almacenamiento también pueden afectar la aptitud de un tapón blanco de manera similar.
elastomérico para un uso especı́fico. Para determinar la aptitud de un Extractos (usando el Disolvente de Extracción B o C)—Colocar en
tapón elastomérico para su uso indicado, deben evaluarse estos un Aparato de Reflujo adecuado que contenga 200 mL del
factores mediante las pruebas especı́ficas adicionales correspondien- Disolvente de Extracción una muestra preparada adecuadamente
tes. Los criterios para la selección de un tapón elastomérico también que tenga un área expuesta de 100 cm2 y someter a reflujo durante 30
deben incluir una revisión cuidadosa de todos los ingredientes para minutos. Tratar el blanco de manera similar.
asegurar que no se agregue ninguna sustancia cancerı́gena conocida Turbidez—[NOTA—Usar los Extractos preparados con el Disol-
o presunta, ni ninguna otra sustancia tóxica. vente de Extracción A, B o C.] Agitar el recipiente y transferir a una
Definición—Un tapón elastomérico es un componente del celda una cantidad suficiente del Extracto, diluido con el Disolvente
envasado que está, o puede estar, en contacto directo con el fármaco. de Extracción, si fuera necesario. Medir la turbidez en un
turbidı́metro de relación adecuado (ver Espectrofotometrı́a y
Dispersión de Luz h851i) frente a estándares reproducibles fijos.*
Procedimientos para Pruebas Biológicas La turbidez es la diferencia entre los valores obtenidos para el blanco
y la muestra expresada en Unidades de Turbidez Nefelométrica
Se establecen dos etapas de prueba. La primera etapa es la (Nephelometric Turbidity Units o NTU), una escala numérica lineal
realización de pruebas in vitro según los procedimientos definidos en arbitraria que expresa un intervalo de opacidad desde la transparen-
el capı́tulo h87i, Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro. Los cia absoluta hasta la zona de turbidez.
materiales que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no Agentes Reductores—[NOTA—Usar los Extractos preparados con
necesitan someterse a más pruebas. Los materiales que no cumplen el Disolvente de Extracción A.] Agitar el recipiente, transferir 50 mL
con los requisitos de las pruebas in vitro están sujetos a la segunda del extracto de la muestra a un recipiente adecuado y valorar con
etapa de prueba que es la realización de pruebas in vivo, es decir, la yodo 0,01 N SV, usando 3 mL de almidón SR como indicador. Tratar
Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba Intracutánea, según los el extracto del blanco de manera similar. La diferencia entre la
procedimientos presentados en el capı́tulo Pruebas de Reactividad valoración volumétrica del blanco y la muestra se expresa en mL de
Biológica, In Vivo h88i. yodo 0,01 N.
Metales Pesados h231i—[NOTA—Usar los Extractos preparados
con el Disolvente de Extracción A o B.] Transferir 20 mL de los
Procedimientos para Pruebas Fisicoquı́micas extractos del blanco y la muestra a tubos de comparación de color
separados. Transferir 2 mL, 6 mL y 10 mL de la Solución Estándar
Las siguientes pruebas están diseñadas para determinar las de Plomo a tubos de comparación de color separados, agregar 2 mL
caracterı́sticas de extracción fisicoquı́micas pertinentes de los de ácido acético 1 N a cada tubo y ajustar el volumen a 25 mL con
tapones elastoméricos. Debido a que las pruebas se basan en la agua purificada. Agregar a cada tubo 10 mL de sulfuro de hidrógeno
extracción del elastómero, es esencial que esté disponible la cantidad SR recién preparado, mezclar, dejar en reposo durante 5 minutos y
designada del área de muestra. En cada caso, el área especificada esta observar hacia abajo sobre una superficie blanca. Determinar la
disponible para la extracción a la temperatura designada. Los cantidad de metales pesados en el blanco y en la muestra. El
métodos de prueba están diseñados para detectar la mayorı́a de las contenido de metales pesados es la diferencia entre el blanco y la
variaciones esperadas. muestra.
Disolventes de Extracción— Cambio de pH—[NOTA—Usar los Extractos preparados con el
A: Agua Purificada. Disolvente de Extracción A o B, agregando suficiente cloruro de
B: Vehı́culo del producto farmacéutico (donde corresponda). potasio a los extractos obtenidos con el Disolvente A para
C: Alcohol isopropı́lico. proporcionar una concentración de 0,1%.] Determinar potencio-
Aparato— métricamente el pH de los extractos de la muestra A y B, realizando
determinaciones con un blanco con los extractos del blanco A y B y
Autoclave—Usar un autoclave capaz de mantener una temperatura realizando las correcciones necesarias. El cambio de pH es la
de 121 + 28, equipada con un termómetro, un manómetro y una diferencia entre el blanco y la muestra.
gradilla adecuada para acomodar los envases de prueba por encima
del nivel del agua. Sustancias Extraı́bles Totales—[NOTA—Usar los Extractos
preparados con el Diolvente de Extracción A, B o C.] Agitar los
Horno—Usar un horno, preferentemente un modelo de circulación recipientes y transferir alı́cuotas de 100 mL del blanco y la muestra
forzada, que mantenga una temperatura de funcionamiento de 1058 a cápsulas de evaporación taradas independientes. Evaporar en un
+ 28. baño de vapor hasta sequedad (los Extractos preparados con el
Aparato de Reflujo—Usar un aparato de reflujo adecuado que Disolvente de Extracción C) o en un horno a 1008, secar a 1058
tenga una capacidad de aproximadamente 500 mL. durante 1 hora, enfriar en un desecador y pesar. Calcular las
Procedimiento— sustancias extraı́bles totales, en mg, por la fórmula:
Preparación de la Muestra—Colocar una cantidad suficiente de 2(WU – WB),
tapones elastoméricos en un recipiente de extracción adecuado para
proporcionar 100 cm2 de área expuesta. Agregar 300 mL de agua en donde WU es el peso, en mg, del residuo encontrado en la alı́cuota
purificada a cada envase, cubrir con un vaso de precipitados del extracto de la muestra; y WB es el peso, en mg, del residuo
invertido adecuado y someter a autoclave a 121 + 28 durante 30 encontrado en la alı́cuota de la solución blanco.
minutos. [NOTA—Ajustar de modo que la temperatura se eleve
rápidamente, preferentemente dentro de los 2 a 5 minutos.] Decantar,
usando un tamiz de acero inoxidable para mantener los tapones en
los envases. Enjuagar con 100 mL de agua purificada, agitar por
rotación moderada y desechar los enjuagues. Repetir con una
segunda porción de 100 mL de agua purificada. Tratar todos los
envases blanco de manera similar.
Extractos (usando el Disolvente de Extracción A)—Colocar en un
recipiente adecuado una muestra preparada adecuadamente, que
tenga un área expuesta de 100 cm2 y agregar 200 mL de agua
purificada. Cubrir con un vaso de precipitados invertido adecuado y
extraer calentando en un autoclave a 1218 durante 2 horas, dejando
tiempo suficiente para que el lı́quido dentro del recipiente alcance la
*
Se puede obtener un estándar adecuado del fabricante del instrumental.
172 h391i Valoración de Epinefrina / Pruebas Quı́micas USP 30
ÍNDICE DE ESTERIFICACIÓN
h401i GRASAS Y ACEITES FIJOS
El Índice de Esterificación es el número de mg de hidróxido de
potasio necesario para saponificar los ésteres en 1,0 g de la sustancia.
Las siguientes definiciones y procedimientos generales se aplican Si se han determinado el Índice de Saponificación y el Índice de
a grasas, aceites fijos, ceras, resinas, bálsamos y sustancias similares. Acidez, la diferencia entre estos dos representa el Índice de
Esterificación.
Procedimiento—Colocar de 1,5 g a 2 g de la sustancia, pesados
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA con exactitud, en un matraz tarado de 250 mL agregar entre 20 mL y
30 mL de alcohol neutralizado y agitar. Agregar 1 mL de
Si la muestra de aceite se presenta turbia debido a la presencia de fenolftaleı́na SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico
estearina, calentar el recipiente en un baño de agua a 508 hasta que el 0,5 N SV hasta que se neutralice el ácido libre. Agregar 25,0 mL de
aceite quede lı́mpido; si el aceite no se clarifica, filtrarlo a través de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV y proceder según se indica
un papel de filtro seco en un embudo dentro de una camisa de agua en Índice de Saponificación, comenzando donde dice ‘‘Calentar el
USP 30 Pruebas Quı́micas / h401i Grasas y Aceites Fijos 173
matraz’’, pero omitiendo el agregado adicional de fenolftaleı́na SR. agitando ocasionalmente. Luego agregar, en este orden, 30 mL de
La diferencia entre los volúmenes, en mL, de ácido clorhı́drico 0,5 N yoduro de potasio SR y 100 mL de agua, valorar el yodo liberado
consumido por la prueba y el blanco, multiplicada por 28,05 y con tiosulfato de sodio 0,1 N SV, agitando bien después de cada
dividida por el peso en g de la muestra tomada equivale al Índice de agregado de tiosulfato. Cuando el color del yodo se torna muy
Esterificación. pálido, agregar 3 mL de almidón SR y continuar la volumetrı́a con
tiosulfato de sodio 0,1 N SV hasta que el color azul desaparezca.
Realizar una prueba en blanco al mismo tiempo con las mismas
ÍNDICE DE HIDROXILO cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver
Valoraciones Volumétricas Residuales h541i). Calcular el Índice de
El Índice de Hidroxilo es el número de mg de hidróxido de potasio Yodo por la fórmula:
equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de la sustancia.
[126,9(VB – VS)N] / 10W,
Reactivo de Piridina–Anhı́drido Acético—Antes de comenzar
el ensayo, mezclar 3 volúmenes de piridina recientemente abierta en donde 126,9 es el peso atómico del yodo; VB y VS son los
o recién destilada con 1 volumen de anhı́drido acético recién abierto volúmenes, en mL, de tiosulfato de sodio 0,1 N SV consumido por la
o recién destilado. prueba en blanco y la prueba presente, respectivamente; N representa
Procedimiento—Transferir una cantidad de la sustancia, pesada la normalidad exacta del tiosulfato de sodio SV; y W es el peso, en g,
con exactitud y determinada según la tabla adjunta, a un matraz de la sustancia tomada para la prueba. [NOTA—Si la porción de
Erlenmeyer de 250 mL con tapón de vidrio y agregar 5,0 mL de sustancia tomada absorbe más de la mitad del bromuro de yodo SR,
Reactivo Piridina–Anhı́drido Acético. Transferir 5,0 mL de Reactivo repetir la determinación empleando una porción más pequeña de la
Piridina–Anhı́drido Acético a un segundo matraz Erlenmeyer de 250 sustancia a examinar.]
mL con tapón de vidrio para proporcionar el blanco del reactivo.
Equipar ambos matraces con refrigerantes apropiados con juntas Peso de las muestras
esmeriladas, calentar en baño de vapor durante una hora, agregar 10
mL de agua a través de cada refrigerante y calentar el baño de vapor Índice de yodo esperado Peso en g, +0,001
durante 10 minutos más. Enfriar y agregar a cada matraz 25 mL de 55 3,000
alcohol butı́lico previamente neutralizado a la fenolftaleı́na SR con 5–20 1,000
hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N, vertiendo 15 mL a través de 21–50 0,400
cada refrigerante y, después de retirados, lavar las paredes de cada 51–100 0,200
matraz con las porciones de 10 mL restantes. Agregar 1 mL de 101–150 0,130
fenolftaleı́na SR a cada matraz y valorar con hidróxido de potasio 151–200 0,100
alcohólico 0,5 N SV, registrando el volumen, en mL, consumido por
el ácido residual en la solución de prueba como T y el consumido por
el blanco como B. En un matraz Erlenmeyer de 125 mL, mezclar
aproximadamente 10 g de la sustancia, pesada con exactitud, con 10
mL de piridina recién destilada y previamente neutralizada a la Método II
fenolftaleı́na SR, agregar 1 mL de fenolftaleı́na SR y valorar con
hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV, registrar el volumen, en Solución de Yoduro de Potasio—Disolver 10,0 g de yoduro de
mL, consumido por el ácido libre en la muestra de prueba como A potasio en agua para obtener 100 mL. Almacenar en recipientes
o emplear el Índice de Acidez para obtener A. Calcular el Índice de resistentes a la luz.
Hidroxilo tomado por la fórmula:
Solución Indicadora de Almidón—Mezclar 1 g de almidón
(56,11N / W)[B + (WA / C) – T], soluble con suficiente agua frı́a para obtener una pasta fina. Agregar
mezclando sobre 100 mL de agua en ebullición. Mezclar y enfriar.
en donde W y C son los pesos, en g, de las sustancias tomadas para la Emplear sólo la solución transparente.
acetilación y para la determinación del ácido libre, respectivamente; Procedimiento—Fundir la muestra si ya no estuviera lı́quida.
N es la normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico y [NOTA—La temperatura durante la fusión no debe exceder el punto de
56,11 es el peso molecular del hidróxido de potasio. fusión de la muestra en más de 108.] Pasar por papel de filtro doble
para eliminar cualquier impureza sólida y los últimos restos de
Intervalo del Índice de Hidroxilo Peso de la Muestra de Prueba, g humedad. El filtrado puede realizarse en un horno de aire a 1008 pero
0 a 20 10 debe completarse dentro de un lapso de 5 minutos + 30 segundos.
20 a 50 5 La muestra debe estar absolutamente seca. El material de vidrio debe
50 a 100 3 estar absolutamente limpio y completamente seco. Después del
100 a 150 2 filtrado, dejar que la muestra filtrada alcance una temperatura de 688
150 a 200 1,5 a 71 + 18 antes de pesar la muestra. Una vez que la muestra alcan-
200 a 250 1,25 zó la temperatura de 688 a 71 + 18, pesar inmediatamente la muestra
250 a 300 1,0 en un matraz para yodo de 500 mL, de acuerdo con los pesos y la
300 a 350 0,75 precisión de pesado de la tabla adjunta. [NOTA—El peso de la
sustancia debe ser tal que se produzca un exceso de cloruro de yodo
SR de 50% a 60% de la cantidad agregada, es decir, de 100%
a 150% de la cantidad absorbida.] Agregar 15 mL de una mezcla
recién preparada de ciclohexano y ácido acético glacial (1 : 1) y
ÍNDICE DE YODO agitar por rotación moderada para disolver la muestra. Agregar 25,0
mL de cloruro de yodo SR, insertar el tapón con firmeza en el matraz
El Índice de Yodo representa el número de g de yodo absorbido, y mezclar por rotación moderada. Dejar en reposo a 25 + 58,
en las condiciones prescritas, por 100 g de la sustancia. A menos que protegido de la luz, agitando de vez en cuando durante 1,0 ó 2,0
se especifique de otro modo en la monografı́a individual, determinar horas, dependiendo del Índice de Yodo (IV) de la muestra: IV menos
el Índice de Yodo mediante el Método I. de 150; 1,0 hora; IV igual o más de 150; 2,0 horas. Luego, en un
lapso de 3 minutos después del tiempo de reacción indicado, agregar
en este orden, 20 mL de Solución de Yoduro de Potasio y 150 mL de
Método I (Método de Hanus) agua recién hervida y enfriada, y mezclar. En 30 minutos, valorar el
yodo liberado con tiosulfato de sodio 0,1 N SV mientras se mezcla
Procedimiento—Transferir una cantidad de la muestra pesada por medios mecánicos después de cada adición de tiosulfato. Cuando
con exactitud, como se determina en la tabla adjunta, a un matraz el color amarillo del yodo haya desparecido casi por completo,
para yodo de 250 mL, disolver en 10 mL de cloroformo, agregar agregar de 1 a 2 mL de Solución Indicadora de Almidón y continuar
25,0 mL de bromuro de yodo SR, insertar con firmeza el tapón en el la volumetrı́a con tiosulfato de sodio 0,1 N SV hasta que desaparezca
vaso y dejar en reposo durante 30 minutos protegido de la luz, el color azul. Realizar una prueba con un blanco al mismo tiempo
174 h401i Grasas y Aceites Fijos / Pruebas Quı́micas USP 30
con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma inferior a 258, y transferir el contenido del matraz a un separador
forma (ver Valoraciones Volumétricas Residuales h541i). La que tenga una llave de paso de teflón, enjuagar el matraz con dos
diferencia entre los volúmenes, en mL, de tiosulfato de sodio porciones de 50 mL de agua que se agregan al separador (no usar
0,1 N consumido por la prueba en blanco y la prueba actual, grasa en la llave de paso). Extraer con tres porciones de 100 mL de
multiplicada por 1,269 y dividida por el peso, en g, de la muestra éter, combinando los extractos de éter en otro separador que
tomada es el Índice de Yodo. contenga 40 mL de agua. Rotar o agitar suavemente el separador
durante unos minutos. [NOTA—Si se agita con violencia, puede
formarse una emulsión difı́cil de separar.] Dejar que la mezcla se
ÍNDICE DE PERÓXIDO separe y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto etéreo con
dos porciones adicionales de agua de 40 mL y desechar la fase
El Índice de Peróxido es el número que expresa, en miliequiva- acuosa inferior. Lavar el extracto etéreo sucesivamente con una
lentes de oxı́geno activo, la cantidad de peróxido contenido en porción de 40 mL de solución de hidróxido de potasio (3 en 100) y
1000 g de la sustancia. [NOTA—Esta prueba debe realizarse una porción de agua de 40 mL. Repetir tres veces esta secuencia de
inmediatamente después de tomar la muestra para evitar oxidación lavado con solución de hidróxido de potasio y agua. Lavar el
de la muestra de prueba.] extracto etéreo con porciones de agua de 40 mL hasta que el último
Procedimiento—A menos que se indique algo diferente, colocar lavado no se torne rojo con el agregado de 2 gotas de fenolftaleı́na
aproximadamente 5 g de la sustancia, pesada con exactitud, en un SR. Transferir el extracto etéreo a un matraz tarado y enjuagar el
matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapón de vidrio esmerilado. separador con 10 mL de éter, agregando los enjuagues al matraz.
Agregar 30 mL de una mezcla de ácido acético glacial y cloroformo Evaporar el éter en un baño de vapor y agregar 6 mL de acetona al
(3 : 2), agitar hasta disolver y agregar 0,5 mL de solución de yoduro residuo. Extraer la acetona en una corriente de aire y secar el residuo
de potasio saturada. Agitar durante un minuto exactamente y agregar a 1058 hasta que las pesadas sucesivas no difieran en más de 1 mg.
30 mL de agua. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV, agregando Calcular el porcentaje de materia insaponificable en la porción de
lentamente la solución volumétrica con agitación continua, hasta que aceite o grasa tomada, por la fórmula:
el color amarillo desaparezca casi por completo. Agregar 5 mL de 100(WR / WS),
almidón SR y continuar la volumetrı́a, agitando enérgicamente, hasta
que desaparezca el color azul. Realizar una determinación con un en donde WR es el peso, en g, del residuo; y WS es el peso, en g, del
blanco bajo las mismas condiciones. [NOTA—El volumen de la aceite o grasa tomada para la prueba.
solución volumétrica empleada en la determinación con el blanco no Disolver el residuo en 20 mL de alcohol, neutralizado previamente
debe exceder 0,1 mL.] La diferencia entre los volúmenes, en mL, de en el punto final de fenolftaleı́na, agregar fenolftaleı́na SR y valorar
tiosulfato de sodio 0,01 N consumido por la prueba y por el blanco, con hidróxido de sodio alcohólico 0,1 N SV hasta la primera
multiplicada por 10 y dividida por el peso, en g, de la muestra aparición de un color rosado pálido que permanezca no menos de 30
tomada equivale al Índice de Peróxido. segundos. Si el volumen requerido de hidróxido de sodio alcohólico
0,1 N es superior a 0,2 mL, la separación de las capas no fue
completa; el residuo pesado no puede considerarse como ‘‘materia
ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN insaponificable’’ y debe repetirse la prueba.
El Índice de Saponificación es el número de mg de hidróxido de
potasio necesario para neutralizar los ácidos libres y saponificar los TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN DE
ésteres existentes en 1,0 g de la sustancia. ÁCIDOS GRASOS
Procedimiento—Colocar de 1,5 g a 2 g de la sustancia, pesados
con exactitud, en un matraz tarado de 250 mL, y agregar 25,0 mL de Preparación de los Ácidos Grasos—Calentar 75 mL de solución
hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N. Calentar el matraz en un baño de glicerina–hidróxido de potasio (preparada al disolver 25 g de
de vapor, bajo un condensador apropiado para mantener el reflujo hidróxido de potasio en 100 mL de glicerina) en un vaso de
durante 30 minutos, rotando el contenido con frecuencia. Agregar precipitados de 800 mL a 1508 y agregar 50 mL de la grasa
a continuación 1 mL de fenolftaleı́na SR y valorar volumétricamente clarificada, fundida si fuera necesario. Calentar la mezcla durante 15
el exceso de hidróxido de potasio con ácido clorhı́drico 0,5 N SV. minutos mezclando con frecuencia, pero sin permitir que la
Realizar una determinación con un blanco bajo las mismas temperatura sobrepase los 1508. La saponificación se considera
condiciones (ver Valoraciones Volumétricas Residuales en Volume- completa cuando la mezcla es homogénea, sin partı́culas que se
trı́a h541i). La volumetrı́a también puede realizarse potenciométri- adhieran al vaso de precipitados en el menisco. Verter el contenido
camente. La diferencia entre los volúmenes, en mL, de ácido del vaso de precipitados en 500 mL de agua próxima a su punto de
clorhı́drico 0,5 N consumido en la prueba actual y en la prueba en ebullición, en una cápsula con mango o un vaso de precipitados de
blanco, multiplicada por 56,1 y la normalidad exacta del ácido 800 mL, agregar lentamente 50 mL de ácido sulfúrico diluido
clorhı́drico 0,5 N SV, y dividida por el peso en g de la muestra (preparada agregando agua y ácido sulfúrico (3 : 1)) y calentar la
tomada equivale al Índice de Saponificación. solución, mezclando con frecuencia, hasta que los ácidos grasos se
Si se ha saturado el aceite con dióxido de carbono con el propósito separen formando una capa transparente. Lavar los ácidos con agua
de conservarlo, dejarlo en una cápsula poco profunda en un en ebullición hasta que queden libres de ácido sulfúrico, recogerlos
desecador de vacı́o durante 24 horas antes de pesar las muestras de en un vaso de precipitados pequeño, colocar en un baño de vapor
prueba. hasta que el agua se haya sedimentado y los ácidos grasos estén
transparentes, filtrar en un vaso de precipitados seco mientras
esté caliente y secar a 1058 durante 20 minutos. Colocar los ácidos
MATERIA INSAPONIFICABLE grasos aún calientes en un recipiente adecuado y enfriar en un baño
de hielo hasta que se solidifiquen.
El término‘‘Materia Insaponificable’’ en aceites o grasas, se refiere Prueba de Saponificación Completa—Colocar 3 mL de los
a aquellas sustancias que no son saponificables por medio de ácidos secos en un tubo de ensayo y agregar 15 mL de alcohol.
hidróxidos alcalinos pero que son solubles en disolventes de grasas Calentar la solución hasta su ebullición y agregar un volumen igual
ordinarios y a los productos de saponificación que son solubles en de hidróxido de amonio 6 N. Se obtiene una solución transparente.
dichos disolventes.
Procedimiento—Empleando un aparato similar al ‘‘Aparato de
Procedimiento—Transferir aproximadamente 5,0 g del aceite Temperatura de Solidificación’’ especificado en el Capı́tulo, proceder
o grasa, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 según se indica en Procedimiento en Temperatura de solidificación
mL, agregar 50 mL de una solución de hidróxido de potasio h651i, leyendo ‘‘temperatura de solidificación’’ por ‘‘punto de
alcohólico (preparada por disolución de 12 g de hidróxido de potasio solidificación’’ (los términos son sinónimos). El promedio de no
en 10 mL de agua y dilución de esta solución con alcohol a 100 mL), menos de cuatro lecturas consecutivas del punto más alto al que llega
calentar el matraz en un baño de vapor bajo un condensador la temperatura es la temperatura de solidificación de los ácidos
apropiado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando grasos.
frecuentemente por rotación suave. Enfriar a una temperatura
USP 30 Pruebas Quı́micas / h401i Grasas y Aceites Fijos 175
2PV + AV,
en donde PV es el Índice de Peróxido, y AV es el Índice de Anisidina.
h425i ANTIBIÓTICOS—
VALORACIÓN YODOMÉTRICA
PRINCIPIO
Una muestra representativa, dispersada a una concentración
adecuada en un lı́quido o gas adecuado, se pasa a través del haz
de una fuente de luz monocromática, generalmente de un láser. La
luz dispersada por las partı́culas a diversos ángulos se mide con un
detector multi-elemento y luego se registran los valores numéricos
178 h429i Medición del Tamaño de Partı́cula por Difracción de Luz / Pruebas Quı́micas USP 30
relacionados con el patrón de dispersión para su posterior análisis. multielemento. Los lentes proporcionan un patrón de dispersión que,
Estos valores numéricos de dispersión se transforman luego, usando dentro de sus lı́mites, no depende de la ubicación de las partı́culas en
un modelo óptico y un procedimiento matemático adecuados, para el haz de luz. De este modo, la distribución de intensidad angular
obtener la proporción entre el volumen total y un número continua se convierte en una distribución de intensidad espacial
diferenciado de clases de tamaño que forman una distribución diferenciada sobre un conjunto de elementos detectores.
volumétrica de tamaño de partı́cula (por ejemplo, x50 describe un Se supone que el patrón de dispersión registrado del conjunto de
diámetro de partı́cula correspondiente al 50% de la distribución partı́culas es idéntico a la suma de los patrones de todas las partı́culas
acumulada de tamaño menor al normal). dispersantes individuales presentadas en posiciones relativas aleato-
rias. Se debe tener en cuenta que sólo un intervalo angular limitado
de luz dispersa es captado por los lentes y por lo tanto, por el
APARATO detector.
Puede utilizarse un agente tensoactivo de baja capacidad Medición de la Dispersión de la Luz en las Muestras
espumante y un dispersante para facilitar la humectación de las Dispersas
partı́culas y para estabilizar la dispersión. Se puede hacer una
revisión preliminar de la calidad de la dispersión por medio de una Por lo general, se emplea un gran número de barridos del detector
inspección visual o microscópica de la suspensión. a intervalos breves (tı́picamente cada 2 segundos, o 1000 barridos).
Si se necesitan muestras muy pequeñas, también es posible tomar Para cada elemento detector, se calcula una señal promedio, a veces
muestras fraccionadas de una pasta de muestra bien mezclada, si el junto con su desviación estándar. Los datos se almacenan en la
material no es ni frágil ni soluble. Ası́, la consistencia de la pasta, memoria de la computadora. La magnitud de la señal de cada
evita errores de segregación. Las pastas se forman agregando elemento detector depende del área de detección, de la intensidad de
dispersante a la muestra, gota a gota, mientras se mezcla con una la luz y de la eficiencia cuántica. Las coordenadas (tamaño y
espátula. Mientras la mezcla forme grumos, se debe seguir posición) de los elementos detectores, junto con la distancia focal del
agregando gotas, una por una, mientras se continúa mezclando lente, determinan la región de ángulos de dispersión para cada
después de cada gota. Una buena consistencia para la pasta es una elemento. Estos factores vienen determinados de fábrica y se
similar a la de la miel o la pasta de dientes. Si la pasta queda almacenan en la computadora.
demasiado lı́quida por error, no se puede usar y debe iniciarse una La mayorı́a de los instrumentos también miden la intensidad del
nueva preparación. haz láser central. La diferencia entre una muestra dispersada y un
Alternativamente, se puede preparar una suspensión concentrada. experimento con un blanco se da como un valor de oscurecimiento,
Mientras se mezcla esta suspensión concentrada, retirar una pequeña el cual es indicativo de la cantidad total de luz dispersada y de la
alı́cuota y transferir a la celda de medición óptica que contiene el concentración de partı́culas.
medio dispersante blanco. Se debe tener cuidado para asegurar la
transferencia completa de la muestra y evitar la sedimentación de las
partı́culas más grandes. Selección de un Modelo Óptico Adecuado
Cuando no se pueda encontrar un dispersante que no disuelva las
partı́culas, podrı́a utilizarse como dispersante una solución saturada Habitualmente se usa la aproximación de Fraunhofer o la teorı́a
de la muestra, prefiltrada, en el disolvente dispersante. Una solución Mie, aunque a veces se aplican otras aproximaciones para el cálculo
saturada de ese tipo se puede producir agitando un exceso de muestra de la matriz de dispersión. Por debajo de aproximadamente 25 mm,
en el disolvente dispersante durante varias horas. Para el caso de las diferencias entre los modelos ópticos se vuelven más significa-
ácidos y bases débiles, la amortiguación del disolvente dispersante tivas. En este intervalo, la aplicación adecuada de la teorı́a Mie
a un pH bajo o alto, respectivamente, puede ayudar a identificar un (suponiendo valores de ı́ndice de refracción reales e imaginarios
dispersante adecuado. El medio saturado se filtra usando un filtro de exactos) proporciona la mayor exactitud. Cuando se usa la teorı́a
membrana, para eliminar cualquier muestra no disuelta antes de su Mie, los ı́ndices de refracción de las partı́culas y del medio, o su
uso. Este enfoque no es adecuado si la muestra forma una solución relación, se ingresan en el instrumento para permitir el cálculo de la
concentrada más viscosa. matriz modelo. A menudo, se aplican valores pequeños de la parte
imaginaria del ı́ndice de refracción (aproximadamente 0,01–0,1)
para sobrellevar la aspereza de la superficie de las partı́culas.1 A fin
Gases para Dispersión de obtener resultados rastreables, es fundamental informar los
valores de ı́ndice de refracción usados.
Para dispersión seca y aplicaciones de rocı́o, a veces se usa un gas
comprimido. En ese caso, es fundamental que el gas no contenga
aceite, agua ni partı́culas. Para lograr esto, se requiere de un secador Conversión del Patrón de Dispersión de la Luz en
con filtro. Ubicar lejos de la zona de medición toda unidad de vacı́o,
de modo que la salida del aire caliente no alcance la zona de Distribución del Tamaño de Partı́cula
medición. Evitar las corrientes de aire, a fin de evitar corrientes de
partı́culas inestables. Este paso de deconvolución es la inversa del cálculo de un patrón
de dispersión de la luz para una distribución dada de tamaño de
partı́cula. El hecho que los datos medidos rápidamente siempre
contienen algunos errores aleatorios y sistemáticos puede causar
Concentración resultados erróneos de distribución de tamaño. Se han desarrollado
varios procedimientos matemáticos para los diferentes instrumentos
La concentración de partı́culas en la dispersión debe estar por disponibles. Éstos permiten cierta ponderación de las desviaciones
encima de un nivel mı́nimo, que para muchos instrumentos entre los patrones de dispersión de la luz medidos y calculados (tales
corresponde aproximadamente al 5% de oscurecimiento, para como cuadrados mı́nimos), algunas restricciones (tales como la no
producir una relación señal-ruido aceptable en el detector. Del negatividad para cantidades de partı́culas), o (o en combinación con)
mismo modo, debe estar por debajo de un nivel máximo para evitar cierta suavización de la curva de distribución de tamaño. Un nuevo
la dispersión múltiple (por ejemplo, 35% por encima de 20 mm y procedimiento utiliza las fluctuaciones observadas de las señales del
15% por debajo de 20 mm). detector para introducir una ponderación adecuada de estos datos y
La concentración óptima está influenciada por el ancho del haz para calcular los intervalos de confianza para la distribución del
láser, la longitud de paso de la zona de medición, las propiedades tamaño de partı́cula.
ópticas de las partı́culas y la sensibilidad de los elementos detectores. Los algoritmos utilizados son especı́ficos para cada marca y
En vista de lo antedicho, se deben realizar mediciones a distintas modelo de equipo y están amparados por una licencia. Las
concentraciones de partı́culas para decidir acerca del intervalo de diferencias en los algoritmos entre distintos instrumentos pueden
concentración óptimo que logra el oscurecimiento requerido para dar lugar a diferencias en la estadı́stica de tamaño de partı́cula. Por
cualquier muestra tı́pica del material. esta razón, cuando se informe la distribución del tamaño de partı́cula
y la estadı́stica para un material dado, también deben informarse el
tipo de celda, el estado de la muestra y su preparación, junto con la
MEDICIÓN marca y el modelo del equipo.
Ajuste del Instrumento y Medición en Blanco
Después de seleccionar el intervalo de tamaño de partı́cula
Determinaciones Repetidas
adecuado y la alineación adecuada de la parte óptica del instrumento, La precisión requerida del método depende de las caracterı́sticas
se realiza una medición en blanco, usando un medio de dispersión del material (molido o no molido, robusto o frágil) y también de los
exento de partı́culas. requisitos de la aplicación (tipo de formulación y técnica). Las
1
Pequeñas diferencias en el ı́ndice de refracción supuesto del complejo
pueden causar diferencias significativas en las distribuciones de tamaño de
partı́cula resultantes.
180 h431i Determinación de Grupos Metoxilo / Pruebas Quı́micas USP 30
condiciones adecuadas de medición se establecen experimental- La respuesta de un instrumento de difracción láser se considera
mente, en relación con la precisión deseada. En general, se miden al adecuada si el valor medio de x50 obtenido a partir de al menos tres
menos tres muestras representativas diferentes del mismo lote. La mediciones independientes no excede el intervalo certificado de
repetibilidad del parámetro de distribución del tamaño de partı́cula es valores del material certificado o de referencia en más de 3%. Los
la siguiente: para cualquier valor central de la distribución, por valores medios para x10 y x90 no deben exceder el intervalo certificado
ejemplo la mediana (x50), el coeficiente de variación es de menos de de valores en más del 5%. Para la repetibilidad, el coeficiente de
10%. Para valores alejados del centro de la distribución, por ejemplo variación debe ser menos de 3% para x50 y menos de 5% para x10 y
x10 y x90, el coeficiente de variación no puede exceder de 15%. Por x90. Por debajo de los 10 mm, estos valores máximos se duplican.
debajo de los 10 mm, estos valores máximos se duplican. Pese a que se prefiere el uso de materiales esféricos, también
pueden usarse materiales no esféricos. Preferentemente, éstos tienen
valores certificados o tı́picos provenientes de análisis de difracción
Aptitud del Sistema láser según un procedimiento operativo acordado y detallado. Si los
valores de referencia provienen de métodos que no son la difracción
La prueba de aptitud del sistema se usa para verificar que la láser, esto puede producir un sesgo importante. El motivo de esta
precisión y la exactitud sean adecuadas para el análisis que se desviación es que los distintos principios aplicados en los diversos
realizará. La prueba se basa en el concepto de que el equipo, la métodos pueden conducir a respuestas diferentes a las partı́culas y,
electrónica y las operaciones analı́ticas constituyen un sistema por lo tanto, a distintos diámetros de esfera equivalentes para la
integral que puede ser evaluado como tal. Esto puede hacerse misma partı́cula no esférica.
midiendo a intervalos de tiempo regulares un material de control con
una distribución de tamaño conocida. En general, a menos que se
especifique algo diferente en la monografı́a individual, los valores
medios de tres mediciones deben desviarse del valor establecido en
menos de 10% para x50 y en menos de 15% para x10 y x90. Por debajo
de los 10 mm, estos valores máximos se duplican.
h431i DETERMINACIÓN DE
GRUPOS METOXILO
Informe de Resultados
Por lo general, el sistema de datos del instrumento informa la Aparato—El aparato para la determinación de grupos metoxilos
estadı́stica de distribución. Los parámetros más comunes se calculan se muestra esquemáticamente en la figura adjunta. El matraz de
a partir de la distribución acumulativa por interpolación. Los ebullición, A, cuenta con un brazo lateral capilar para la introducción
tamaños de percentil, xm, representan el tamaño de partı́cula con de dióxido de carbono o nitrógeno y está conectado a una columna,
respecto al cual m por ciento de la distribución es menor. (La B, que sirve para separar el ácido yodhı́drico acuoso del yoduro de
notación dm también se usa y es equivalente a xm.) Qy representa el metilo que es más volátil. El yoduro de metilo pasa a través de agua
porcentaje que tiene un tamaño menor que y micrones. Los tamaños en una trampa depuradora, C, y finalmente es absorbido en la
medios, tales como D4,3, el diámetro medio de volumen aritmético, solución de bromo–ácido acético en el tubo de absorción D. El
también se pueden calcular representando la distribución como una dióxido de carbono o nitrógeno se introduce a través de un
colección de partı́culas esféricas con diámetros del tamaño de los dispositivo que regula la presión y se conecta al aparato por medio
puntos medios de la banda. A menos que se especifique otra cosa, los de un capilar pequeño que contiene un pequeño trozo de algodón.
parámetros se calculan sobre la base del volumen o la masa. [NOTA—Evitar el uso de disolventes orgánicos al limpiar este aparato,
ya que las trazas remanentes pueden afectar la determinación. Esta
prueba se emplea también para la determinación de grupos etoxilo
CALIFICACIÓN con un tiempo de reacción de 80 minutos y un equivalente de
solución volumétrica de 0,751 mg de (OC2H5).]
Calibración Para mayor comodidad en el uso y la limpieza, una junta esférica
de vidrio esmerilado conecta las dos columnas verticales del aparato.
Los sistemas de difracción láser se basan en la medición directa La parte superior del depurador C consta de una junta esférica 35/20,
del patrón de difracción de las partı́culas, pero con propiedades cuya mitad superior está conectada por medio del brazo lateral al
idealizadas de las partı́culas. Por eso, no se requiere una calibración tubo D. Esto permite separar el aparato en partes y facilita el
en el sentido estricto. Sin embargo, aún es necesario y deseable agregado de agua a la trampa. Además, permite el acceso al tubo de
confirmar el correcto funcionamiento del instrumento con un ensayo (de 10 mm) suelto e invertido que sirve como trampa sobre el
procedimiento de calificación. tubo interno del depurador C.
Reactivos—
SOLUCIÓN DE BROMO-ÁCIDO ACÉTICO—Disolver 100 g de acetato
Exactitud y Repetibilidad de potasio en 1000 mL de una solución constituida por 900 mL de
ácido acético glacial y 100 mL de anhı́drido acético. En el dı́a de su
Principalmente, la validación de la calificación puede realizarse utilización, agregar 5 mL de bromo a 145 mL de esta solución.
con cualquier material de referencia certificado o estándar, aceptable
para ser usado en esa industria en particular. Aquı́, se examina el ÁCIDO YODHÍDRICO—Está disponible comercialmente una solución
procedimiento de medición total, incluyendo el muestreo, la reactivo incolora o casi incolora de punto de ebullición constante
dispersión de las muestras, el transporte de muestras a través de la preparada para este fin. Si no se obtiene comercialmente, puede
zona de medición, la medición y el procedimiento de deconvolución. prepararse destilando ácido yodhı́drico sobre fósforo rojo, pasando
Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa dióxido de carbono o nitrógeno a través del aparato durante la
adecuadamente, proporcionando detalles completos. destilación. Usar la mezcla de punto de ebullición constante (entre
Se prefieren los materiales de referencia certificados o estándar 55% y 58% de HI) que destila entre 1268 y 1278, que es incolora
con una distribución conocida que presenten una gama de tamaños o casi incolora. [Precaución—Se deben tomar medidas de seguridad
de partı́culas esféricas que exceda diez. Deberı́an estar certificados al destilar Ácido Yodhı́drico.] Colocar el ácido en frascos pequeños
para un porcentaje de masa por medio de una técnica absoluta, si de color ámbar con tapón de vidrio purgados con dióxido de carbono
estuvieran disponibles, y se usan junto con un procedimiento o nitrógeno, sellarlos con parafina y almacenar en un sitio fresco y
operativo acordado y detallado. Es fundamental que la parte real y la oscuro.
imaginaria del ı́ndice de refracción complejo se especifiquen con Procedimiento—Preparar el aparato desconectando la junta
precisión para el material si se aplica la teorı́a Mie en el análisis de esférica y vertiendo agua en la trampa C hasta la mitad. Conectar
datos. las dos partes, empleando una cantidad mı́nima de una grasa de
silicona apropiada para sellar la junta esférica. Agregar 7 mL de
Solución de Bromo-Ácido Acético en el tubo de absorción D. Pesar la
muestra en una cápsula de gelatina tarada y colocarla en el matraz de
USP 30 Pruebas Quı́micas / h441i Valoración de Niacina o Niacinamida 181
Solución Madre de Niacina Estándar—Transferir 25,0 mg de Calentar la mezcla en un autoclave a una temperatura entre 1218 y
ER Niacina USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver en 1238 durante 30 minutos y enfriar. Si se forman grumos, agitar la
solución de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solución de mezcla hasta que las partı́culas se dispersen uniformemente. Ajustar
alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un refrigerador. Cada mL la mezcla a un pH de 6,8 con solución de hidróxido de sodio, diluir
de esta solución contiene 50 mg de ER Niacina USP. con agua para obtener un volumen final medido que tenga una
Preparación Estándar de Niacina—Transferir 10,0 mL de concentración de niacina que equivalga a la de la Solución Estándar
Solución Madre de Niacina Estándar a un matraz volumétrico de de Niacina y filtrar.
100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Cada mL de esta (b) Para Materiales Secos o Semisecos que Contienen Cantidades
solución contiene 5 mg de ER Niacina USP. Apreciables de Sustancias Básicas—Agregar suficiente solución de
Solución Madre de Niacinamida Estándar—Transferir 50,0 mg ácido sulfúrico para llevar el pH de la mezcla a entre 5,0 y 6,0.
de ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 500 mL, Agregar una cantidad de agua suficiente para que el volumen total
disolver en solución de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con del lı́quido sea equivalente, en mL, a no menos de diez veces el peso
solución de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un seco de la muestra de valoración, en g, pero que la solución
refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 100 mg de ER resultante no contenga más de 5,0 mg de niacina en cada mL. Luego
Niacinamida USP. agregar el equivalente a 10 mL de ácido sulfúrico diluido (2 en 7)
por cada 100 mL de lı́quido y proceder como se indica en (a),
Preparación Estándar de Niacinamida—Transferir 10,0 mL de comenzando a partir del segundo párrafo.
Solución Madre de Niacinamida Estándar a un matraz volumétrico (c) Para Materiales Lı́quidos—Ajustar el material a un pH de 5,0
de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Cada mL de esta a 6,0 con solución de ácido sulfúrico o bien con solución de
solución contiene 10 mg de ER Niacinamida USP. hidróxido de sodio. Agregar una cantidad de agua suficiente para que
Preparación de Valoración—Preparar según se indica en la el volumen total del lı́quido sea igual, en mL a no menos de 10 veces
monografı́a individual. el volumen de la muestra, en mL, pero que la solución resultante no
Procedimiento—Pipetear y transferir a cuatro tubos marcados las contenga más de 5,0 mg de niacina en cada mL. Luego agregar el
cantidades de la Preparación Estándar correspondiente, de la equivalente a 10 mL de ácido sulfúrico diluido (2 en 7) por cada mL
Preparación de Valoración, de la dilución de amonı́aco y del agua de lı́quido y proceder como se indica en (a), comenzando a partir del
que se indican en la tabla adjunta. Luego agregar los demás segundo párrafo.
componentes, respectivamente, según se indican en la tabla, Solución Madre de Niacina Estándar I—Transferir 50,0 mg de
conforme a las instrucciones que se proporcionan aquı́. ER Niacina USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disolver en
Agregar al Tubo 1 la Solución de Ácido Sulfanı́lico, agitar bien, alcohol, diluir a volumen con alcohol y mezclar. Almacenar en un
agregar el ácido clorhı́drico, mezclar, colocar en un espectrofotóme- refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 100 mg de ER
tro adecuado y ajustar a absorbancia cero a 450 nm. Agregar al Tubo Niacina USP.
2 la Solución de Bromuro de Cianógeno, mezclar y a los 30 Solución Madre de Niacina Estándar II—Agregar agua a 100,0
segundos, cronometrados con exactitud, después de completar la mL de Solución Madre de Niacina Estándar I para obtener 1000,0
adición del bromuro de cianógeno, agregar la Solución de Ácido mL. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. Cada mL de esta
Sulfanı́lico, agitando por rotación suave. Cerrar el tubo, colocarlo en solución contiene 10 mg de ER Niacina USP.
el espectrofotómetro y después de 2 minutos medir su absorbancia
a 450 nm contra el Tubo 1 utilizado como blanco, designando la Solución de Niacina Estándar—Diluir con agua un volumen
absorbancia como AS. Repetir el procedimiento con el Tubo 3 (como adecuado de Solución Madre de Niacina Estándar II hasta un
blanco) y el Tubo 4, designando la absorbancia del Tubo 4 como AU. volumen medido tal que después de su incubación, como se describe
Calcular la cantidad de niacina o niacinamida en la muestra según se en el Procedimiento de Valoración, la transmitancia del nivel de 5,0
indica en la monografı́a individual. mL de Solución de Niacina Estándar sea equivalente a un peso de
células secas de no menos de 1,25 mg, cuando el blanco inoculado se
fija a una transmitancia de 100 por ciento. Esta concentración
generalmente está entre 10 ng y 40 ng de niacina por mL. Preparar
Método Microbiológico una Solución de Niacina Estándar nueva para cada valoración.
Solución Madre de Medio Basal—
Solución de Prueba del Material a Valorar—Colocar la
cantidad indicada del material a valorar en un matraz de tamaño
adecuado y proseguir según uno de los métodos que se ofrecen Solución de Hidrolizado Ácido de Caseı́na . . . . . . . . 25 mL
a continuación. Las concentraciones de las soluciones de ácido Solución de Cistina–Triptófano . . . . . . . . . . . . . . . . 25 mL
sulfúrico y de hidróxido de sodio empleadas no se indican en cada Dextrosa Anhidra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 g
caso porque estas concentraciones pueden variar dependiendo de la Acetato de Sodio Anhidro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5g
cantidad de material tomado para valorar, el volumen de la solución Solución de Adenina–Guanina–Uracilo . . . . . . . . . . 5 mL
de prueba y el efecto amortiguador del material. Solución de Riboflavina–Clorhidrato de Tiamina–
(a) Para Materiales Secos o Semisecos que No Contienen Biotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
Cantidades Apreciables de Sustancias Básicas—Agregar un volu- Solución de Ácido Aminobenzoico–Pantotenato de
men de ácido sulfúrico diluido (1 en 35) que equivalga, en mL, a no Calcio–Clorhidrato de Piridoxina . . . . . . . . . . . . . 5 mL
menos de 10 veces el peso seco del material, en g, pero la solución Solución Salina A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
resultante debe contener no más de 5,0 mg de niacina en cada mL. Si Solución Salina B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mL
el material no es fácilmente soluble, triturarlo para que pueda
dispersarse uniformemente en el lı́quido, luego agitar vigorosamente
y lavar las paredes del matraz con ácido sulfúrico diluido (1 en 35).
Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones temperatura seleccionada entre 308 y 378 pero mantenerla constante
previamente mezcladas y ajustar a un pH de 6,8 con hidróxido de con una aproximación de + 0,58. La suspensión de células
sodio 1 N. Finalmente, agregar agua para obtener 250 mL. ası́ obtenida es el inóculo.
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseı́na—Mezclar 100 g de Calibración del Espectrofotómetro—Agregar en forma aséptica
caseı́na exenta de vitaminas con 500 mL de ácido clorhı́drico 1 mL de Inóculo a aproximadamente 300 mL de Medio de Cultivo
aproximadamente al 20 por ciento (p/p) en ebullición constante, y que contenga 1 mL de Solución de Niacina Estándar. Incubar el
someter la mezcla a reflujo durante 24 horas. Eliminar el ácido medio inoculado durante el mismo perı́odo de tiempo y a la misma
clorhı́drico de la mezcla mediante destilación a presión reducida temperatura que se va a emplear en el Procedimiento de Valoración.
hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en Después del perı́odo de incubación, centrifugar y lavar las células
agua, ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH de tres veces con porciones de aproximadamente 50 mL de solución
3,5 (+ 0,1) y agregar agua para obtener 1000 mL. Agregar 20 g de salina SR y luego resuspender las células en aproximadamente 25
carbón activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el mL de la solución salina.
tratamiento con carbón activado si el filtrado no presenta un color Secar hasta peso constante una porción de 10 mL, medida con
amarillo claro a incoloro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador. exactitud, empleando un baño de vapor y completando el secado al
Filtrar la solución si se formara un precipitado al almacenar. vacı́o a 1008 y calcular el peso seco de las células, en mg por mL,
Solución de Cistina–Triptófano—Suspender 4,0 g de l-cistina y corregido por la cantidad de cloruro de sodio presente.
1,0 g de l-triptófano (o 2,0 g de dl-triptófano) en 700 a 800 mL de Diluir una segunda porción, medida con exactitud, de la
agua, calentar entre 708 y 808, y agregar el ácido clorhı́drico al 20 suspensión celular salina con solución salina de manera que cada
por ciento (p/p), gota a gota, revolviendo, hasta que los sólidos se mL contenga una cantidad de células conocida que equivalga a 500
disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 mL. Almacenar mg con respecto a la sustancia seca. Agregar a los tubos de ensayo,
bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura no inferior a 108. por triplicado, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 2,5 mL, 3,0 mL, 4,0
Solución de Adenina–Guanina–Uracilo—Disolver 100 mg de mL y 5,0 mL, respectivamente, de esta suspensión de células diluida
sulfato de adenina, 100 mg de clorhidrato de guanina y 100 mg de y 5,0 mL de Solución Madre de Medio Basal y llevar el volumen de
uracilo, con ayuda de calor, en 5,0 mL del ácido clorhı́drico al 20 por cada tubo hasta 10,0 mL con solución salina. Empleando como
ciento (p/p), enfriar y agregar agua para obtener 100 mL. Almacenar blanco tres tubos similares que no contengan suspensión de células,
bajo tolueno en un refrigerador. medir la transmitancia de luz de cada tubo en las mismas
condiciones que se van a utilizar en la valoración. Graficar en
Solución de Riboflavina–Clorhidrato de Tiamina–Biotina— papel cuadriculado las observaciones como la ordenada en función
Preparar una solución que contenga, en cada mL, 20 mg de del contenido celular, expresado en mg de peso seco, como la
riboflavina, 10 mg de clorhidrato de tiamina y 0,04 mg de biotina abscisa.
obtenida disolviendo riboflavina cristalina, clorhidrato de tiamina Repetir este procedimiento como mı́nimo dos veces para el
cristalino y biotina cristalina (ácido libre) en ácido acético glacial espectrofotómetro que se va a emplear en la valoración. Trazar la
diluido (1 en 850). Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en curva compuesta que mejor represente las tres o más curvas
un refrigerador. individuales que relacionan la transmitancia en función de la
Solución de Ácido Aminobenzoico–Pantotenato de Calcio– densidad celular para el espectrofotómetro bajo las condiciones de la
Clorhidrato de Piridoxina—Preparar una solución de alcohol valoración.
neutro al 25 por ciento con una concentración de 10 mg de ácido Procedimiento de Valoración—Preparar los tubos del estándar
aminobenzoico, 20 mg de pantotenato de calcio y 40 mg de de niacina del siguiente modo. Agregar a los tubos de ensayo, por
clorhidrato de piridoxina por mL. Almacenar en un refrigerador. duplicado, 0,0 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, 2,5 mL, 3,0
Solución Salina A—Disolver 25 g de fosfato monobásico de mL, 3,5 mL, 4,0 mL, 4,5 mL y 5,0 mL, respectivamente, de Solución
potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para obtener de Niacina Estándar. Agregar a cada tubo 5,0 mL de Solución
500 mL. Agregar 5 gotas de ácido clorhı́drico y almacenar bajo Madre de Medio Basal y agua para completar 10,0 mL.
tolueno. Preparar los tubos que contienen el material a valorar de la
Solución Salina B—Disolver en agua 10 g de sulfato de siguiente manera. Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado, 1,0
magnesio, 500 mg de cloruro de sodio, 500 mg de sulfato ferroso mL, 2,0 mL, 3,0 mL y 4,0 mL, respectivamente, de la solución de
y 500 mg de sulfato de manganeso para obtener 500 mL. Agregar prueba del material a valorar. Agregar a cada tubo 5,0 mL de
5 gotas de ácido clorhı́drico y almacenar bajo tolueno. Solución Madre de Medio Basal y agua para completar 10,0 mL.
Cultivo Madre de Lactobacillus plantarum—Disolver 2,0 g de Después de mezclar, tapar los tubos con algodón o cubrir con tapas y
extracto de levadura hidrosoluble en 100 mL de agua, agregar 500 esterilizar en autoclave a una temperatura entre 1218 y 1238. (El
mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g recalentamiento de los tubos de ensayo puede ocasionar resultados
de agar y calentar la mezcla en un baño de vapor, con agitación, no satisfactorios.) Enfriar, inocular en forma aséptica cada tubo con
hasta que el agar se disuelva. Agregar porciones de aproximada- 1 gota de Inóculo e incubar durante 16 a 24 horas a una temperatura
mente 10 mL de la solución caliente a los tubos de ensayo, tapar los seleccionada entre 308 y 378 pero mantenida constante con una
tubos con algodón, esterilizar en un autoclave durante 15 minutos aproximación de + 0,58. La contaminación de los tubos de ensayo
a una temperatura entre 1218 y 1238 y dejar que los tubos se enfrı́en con organismos extraños invalida la valoración.
en posición vertical. Preparar cultivos en cuña en tres o más de los Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera.
tubos, empleando un cultivo puro de Lactobacillus plantarum,* Mezclar el contenido de cada tubo, al que se puede agregar 1 gota de
incubándolos durante 16 a 24 horas a cualquier temperatura una solución de un agente antiespumante adecuado, y transferir a un
seleccionada entre 308 y 378 pero manteniéndola constante con recipiente apto para la lectura óptica. Después de agitar su contenido,
una aproximación de + 0,58 y finalmente almacenar en un colocar el recipiente en un espectrofotómetro que se haya fijado
refrigerador. Preparar un cultivo madre en cuña nuevo una vez por a una longitud de onda especı́fica entre 540 y 660 nm y leer la
semana y no usar para inoculación si el cultivo tiene más de transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado
1 semana. estacionario se observa unos pocos segundos después de agitar,
cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o más.
Medio de Cultivo—Agregar 5,0 mL de agua que contenga 1,0 mg Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la
de niacina a cada uno de los tubos de una serie de tubos de ensayo lectura de cada tubo.
que contengan 5,0 mL de Solución Madre de Medio Basal. Tapar los Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer
tubos con algodón, esterilizar durante 15 minutos en un autoclave la transmitancia del blanco inoculado. Si esta lectura de transmi-
a una temperatura entre 1218 y 1238 y enfriar. tancia corresponde a un peso celular seco mayor de 600 mg por tubo
Inóculo—Hacer una transferencia de células del cultivo madre de o si hay evidencia de contaminación con un microorganismo
Lactobacillus plantarum a un tubo estéril que contenga 10 mL de extraño, descartar los resultados de la valoración.
medio de cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una Luego, con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco inoculado,
leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes. Descartar
*
Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacillus plantarum, con el los resultados de la valoración si la diferencia entre la transmitancia
número 8014, de American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852, EE. UU.
184 h451i Volumetrı́a con Nitrito / Pruebas Quı́micas USP 30
Procedimiento—Colocar en el matraz de digestión del aparato obtenidas en los cromatogramas de las Soluciones Estándar
una cantidad del material pesada o medida con exactitud, equivalente correspondientes. El total de las impurezas comunes observadas no
a 2 a 3 mg de nitrógeno. Agregar 1 g de una mezcla pulverizada de excede de 2,0%, a menos que se especifique algo diferente en la
sulfato de potasio y sulfato cúprico (10 : 1) y lavar el cuello del monografı́a individual.
matraz con un chorro fino de agua para desprender cualquier material
adherido a él. Agregar 7 mL de ácido sulfúrico, dejando que se
escurra por las paredes del matraz; luego, girando el matraz con CLAVE DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN
rotación suave, agregar cuidadosamente 1 mL de peróxido de
hidrógeno al 30 por ciento de manera tal que resbale por la pared del (1) Utilizar luz UV a 254 nm y aproximadamente a 366 nm.
matraz. (No agregar peróxido de hidrógeno durante la digestión.) (2) Utilizar Yodoplatinato SR.
Calentar el matraz sobre una llama libre o sobre un calentador (3) Solución A—Mezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40
eléctrico hasta que la solución tome un color azul transparente y las mL de agua y 10 mL de ácido acético glacial.
paredes del matraz estén exentas de material carbonoso. Agregar Solución B—Disolver 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua.
cuidadosamente 70 mL de agua a la mezcla de digestión, enfriar la Preparar una Solución Madre mezclando A y B, la cual se puede
solución y preparar para destilación con vapor. Agregar 30 mL de almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Para preparar el
solución de hidróxido de sodio (2 en 5) a través de un embudo, de reactivo para rociado, mezclar 10 mL de la Solución Madre con 20
manera tal que la solución fluya hacia abajo por la pared interna del mL de ácido acético glacial y diluir con agua hasta obtener 100 mL.
matraz para formar una capa bajo la solución ácida; enjuagar el (4) Solución de Ninhidrina para Rociado—Disolver 200 mg de
embudo con 10 mL de agua, cerrar herméticamente el aparato y ninhidrina en 100 mL de alcohol. Calentar la placa después de
comenzar la destilación con vapor inmediatamente. Recibir el rociarla.
destilado en 15 mL de solución de ácido bórico (1 en 25), a la cual se (5) Solución de Ácido para Rociado—Colocar 90 mL de alcohol
le han agregado 3 gotas de rojo de metilo-azul de metileno SR y agua en un baño de hielo y agregar lentamente, mezclando y con cuidado,
suficiente para cubrir el extremo del tubo condensador. Continuar la 10 mL de ácido sulfúrico. Rociar la placa y calentarla hasta que se
destilación hasta que el destilado mida de 80 a 100 mL. Retirar el carbonice.
matraz de absorción, enjuagar el extremo del tubo condensador con (6) Solución de Ácido y Dicromato para Rociado—Preparar una
una cantidad pequeña de agua y valorar volumétricamente el solución con 100 mL de ácido sulfúrico y la adición de una cantidad
destilado con ácido sulfúrico 0,01 N SV. Realizar una determinación suficiente de dicromato de potasio para saturarla. Rociar la placa y
con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de ácido calentarla hasta que se carbonice.
sulfúrico 0,01 N SV equivale a 140,1 mg de nitrógeno. (7) Vainillina—Disolver 1 g de vainillina en 100 mL de ácido
Cuando se toma una cantidad de material que contiene más de sulfúrico.
2 mg a 3 mg de nitrógeno, puede emplearse ácido sulfúrico 0,02 N (8) Cloramina T-Ácido Tricloroacético—Mezclar 10 mL de una
o 0,1 N, siempre y cuando se requieran al menos 15 mL para la solución acuosa de cloramina T al 3% con 40 mL de una solución
volumetrı́a. Si el peso seco total de material tomado es mayor de 100 alcohólica de ácido tricloroacético al 25%. Preparar inmediatamente
mg, aumentar proporcionalmente las cantidades de ácido sulfúrico y antes de su utilización.
de hidróxido de sodio. (9) Folin-C—Agregar 10 g de tungstato de sodio y 2,5 g de
molibdato de sodio a 70 mL de agua, agregar 5 mL de ácido
fosfórico al 85% y 10 mL de ácido clorhı́drico al 36% y someter la
solución resultante a reflujo durante 10 horas.
(10) KMnO4—Disolver 100 mg de Permanganato de Potasio en
h466i IMPUREZAS COMUNES 100 mL de agua.
(11) DAB—Mezclar 1 g de p-dimetilaminobenzaldehı́do en 100
mL de ácido clorhı́drico 0,6 N.
(12) DAC—Mezclar 100 mg de p-dimetilaminocinamaldehı́do en
100 mL de ácido clorhı́drico 1 N.
Esta prueba tiene como fin evaluar el perfil de impurezas de un (13) Ferricianuro—Mezclar volúmenes iguales de una solución
artı́culo y se utiliza cuando una monografı́a individual ası́ lo indica. de cloruro férrico al 1% y de una solución de ferricianuro de potasio
La introducción general a la técnica de cromatografı́a en capa al 1%. Usar inmediatamente.
delgada se encuentra en el capı́tulo Cromatografı́a h621i. A menos (14) Fast Blue B—Reactivo A—Disolver 500 mg de Sal de Fast
que se especifique algo diferente en la monografı́a individual, usar el Blue B en 100 mL de agua.
método siguiente. Reactivo B—Hidróxido de sodio 0,1 N.
Solución de Prueba—Preparar una solución de la sustancia en Rociar primero con el Reactivo A y luego con el Reactivo B.
análisis en el disolvente especificado en la monografı́a para obtener (15) Cianuro Férrico Alcalino—Diluir 1,5 mL de una solución de
una concentración final conocida con exactitud de aproximadamente ferricianuro de potasio al 1% con agua hasta 20 mL y agregar 10 mL
10 mg por mL. [NOTA—Para disolver el fármaco se puede utilizar de una solución de hidróxido de sodio al 15%.
calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no (16) Solución de Yodo para Rociado—Preparar una solución de
afecten negativamente el compuesto.] yodo al 0,5% en cloroformo.
Soluciones Estándar—Preparar soluciones del Estándar de (17) Exponer la placa durante 10 minutos a los vapores de yodo en
Referencia USP o de la sustancia indicada en el disolvente una cámara cerrada preequilibrada que tenga cristales de yodo en el
especificado en la monografı́a, para obtener concentraciones fondo.
conocidas con exactitud de 0,01 mg por mL, 0,05 mg por mL, de (18) Solución A—Disolver 0,5 g de yoduro de potasio en 50 mL
0,1 mg por mL y 0,2 mg por mL. [NOTA—Para disolver el fármaco se de agua.
puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos Solución B—Preparar una solución de 0,5 g de almidón soluble en
procedimientos no afecten negativamente el compuesto.] 50 mL de agua caliente.
Procedimiento—Utilizar una placa para cromatografı́a en capa Mezclar volúmenes iguales de la Solución A y de la Solución B
delgada recubierta de una capa de mezcla de gel de sı́lice para inmediatamente antes de usar.
cromatografı́a de 0,25 mm de espesor y la Fase móvil especificada en (19) PTSS—Disolver 20 g de ácido p-toluensulfónico en 100 mL
la monografı́a. Aplicar volúmenes iguales (de 20 mL) de la Solución de alcohol, rociar la placa, secarla durante 15 minutos a 1108 y
de Prueba y de las Soluciones Estándar a la placa y secar las examinarla bajo luz UV a 366 nm.
manchas con una corriente de nitrógeno. (20) Solución de o-Tolidina para Rociado—Disolver 160 mg de
Desarrollar el cromatograma en una cámara preequilibrada hasta o-tolidina en 30 mL de ácido acético glacial, diluir con agua hasta
que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres obtener 500 mL, agregar 1 g de yoduro de potasio y mezclar hasta
cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara y que el yoduro de potasio se haya disuelto.
secar al aire. Examinar la placa utilizando las técnicas de (21) Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 3 mL de
visualización indicadas. Localizar en el cromatograma de la Solución solución de ácido cloroplatı́nico (1 en 10) con 97 mL de agua y
de Prueba toda mancha diferente de la mancha principal y luego agregar 100 mL de una solución de yoduro de potasio (6 en
determinar las intensidades relativas comparándolas con las manchas 100).
186 h467i Impurezas Orgánicas Volátiles / Pruebas Quı́micas USP 30
Opción 1
Cantidad en Contenido de Exposición
Se emplean los lı́mites de concentración en ppm indicados en la la Formulación Acetonitrilo Diaria
Tabla 2. Éstos se calcularon empleando la ecuación (1) que figura Componente (g) (ppm) (mg)
más adelante, suponiendo un peso de producto de 10 g administrado
diariamente. Fármaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 2000 1,80
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto far- 5,0 1016 5,08
m a c é u -
tico
En este ejemplo, el producto farmacéutico no cumple con el lı́mite de
la Opción 1 ni con el de la Opción 2. El fabricante podrı́a analizar el
En este caso, la EDP se expresa en mg por dı́a y la dosis se producto farmacéutico para determinar si el proceso de formulación
expresa en g por dı́a. redujo el nivel de acetonitrilo. Si durante la formulación el nivel de
Estos lı́mites se consideran aceptables para todos los fármacos, acetonitrilo no se redujo a los lı́mites permitidos, el producto no
excipientes y productos farmacéuticos. Por lo tanto, esta opción se cumple con los requisitos de la prueba.
puede aplicar si la dosis diaria no se conoce o no se ha fijado. Si
todos los fármacos y excipientes de una formulación cumplen con
los lı́mites que se proporcionan en la Opción 1, estos componentes se LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES
pueden usar en cualquier proporción. No es necesario realizar
cálculos adicionales siempre que la dosis diaria no exceda los 10 g.
Los productos que se administren en dosis superiores a 10 g por dı́a
se incluyen en la Opción 2. Óxido de Etileno
[NOTA—La prueba para óxido de etileno sólo se realiza cuando se
Opción 2 especifica en la monografı́a individual.] Los parámetros de la
solución estándar y el procedimiento para la determinación se
No es necesario que cada componente del producto farmacéutico describen en la monografı́a individual. A menos que se especifique
cumpla con los lı́mites que se proporcionan en la Opción 1. Se puede algo diferente en la monografı́a individual, el lı́mite es de 10 mg por
emplear la EDP expresada en mg por dı́a según se indica en la Tabla g.
2 con la dosis diaria máxima conocida y la ecuación (1) mencionada
anteriormente para determinar la concentración de disolvente
residual permitida en un producto farmacéutico. Tales lı́mites se Clase 1
consideran aceptables siempre y cuando se haya demostrado que el
disolvente residual se ha reducido al mı́nimo factible. Estos lı́mites Los disolventes residuales de Clase 1 (Tabla 1) no deben
deben ser realistas en cuanto a la precisión analı́tica, la capacidad de emplearse en la fabricación de fármacos, excipientes y productos
fabricación y la variación razonable en el proceso de fabricación. farmacéuticos debido a su toxicidad inaceptable y efectos ambien-
Estos lı́mites también deben reflejar las normas de fabricación tales perjudiciales. No obstante, si su uso en la fabricación de un
actuales. medicamento es inevitable, sus niveles deben estar restringidos tal
La Opción 2 se puede aplicar sumando las cantidades de como se muestra en la Tabla 1, a menos que se indique algo diferente
disolvente residual presentes en cada uno de los componentes del en la monografı́a individual. El disolvente 1,1,1-tricloroetano se ha
producto farmacéutico. La suma de las cantidades diarias de incluido en la Tabla 1 debido al riesgo que representa para el medio
disolvente debe ser menor que la indicada por la EDP. ambiente. El lı́mite indicado de 1500 ppm está basado en datos de
A continuación se ofrece un ejemplo de la aplicación de la seguridad.
Opción 1 y la Opción 2 para la concentración de acetonitrilo en un Cuando se emplean o producen disolventes residuales de Clase
producto farmacéutico. La exposición diaria permitida al acetonitrilo 1 en la fabricación o purificación de fármacos, excipientes
es 4,1 mg por dı́a; ası́, el lı́mite de la Opción 1 es 410 ppm. El peso o productos farmacéuticos, éstos se deben identificar y cuantificar.
diario máximo administrado de un producto farmacéutico es 5,0 g y Los procedimientos que se describen en la sección Identificación,
el producto farmacéutico contiene dos excipientes. La composición Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este Capı́tulo
del producto farmacéutico y el contenido máximo calculado de General se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el
acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla. caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. Tal
procedimiento se enviará a la USP para su evaluación.
Cantidad Contenido de Exposición
en la Formu- Acetonitrilo Diaria
Componente lación (g) (ppm) (mg) Tabla 1. Disolventes Residuales de Clase 1
Fármaco 0,3 800 0,24 Lı́mite de
Excipiente 1 0,9 400 0,36 Concentración
Excipiente 2 3,8 800 3,04 Disolvente (ppm) Problema
Producto far- 5,0 728 3,64
m a c é u - Benceno 2 Carcinógeno
tico 1,2-Dicloroetano 5 Tóxico
1,1-Dicloroeteno 8 Tóxico
El Excipiente 1 cumple con el lı́mite de la Opción 1, pero el fármaco, Tetracloruro de 4 Tóxico y riesgo
el excipiente 2 y el producto farmacéutico no cumplen con el lı́mite Carbono ambiental
de la Opción 1. No obstante, el producto farmacéutico cumple con el 1,1,1-Tricloroetano 1500 Riesgo
lı́mite de la Opción 2 de 4,1 mg por dı́a y ası́ se ajusta al criterio de ambiental
aceptación de este Capı́tulo General.
Se ofrece a continuación otro ejemplo que emplea acetonitrilo
como disolvente residual. El peso diario máximo administrado de un
producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene
dos excipientes. La composición del producto farmacéutico y el Clase 2
contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se ofrecen en la
siguiente tabla. El uso de los disolventes residuales de Clase 2 (Tabla 2) debe ser
limitado en los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos
debido a sus toxicidades inherentes. Las EDP se proporcionan con
188 h467i Impurezas Orgánicas Volátiles / Pruebas Quı́micas USP 30
una aproximación de 0,1 mg por dı́a y las concentraciones con una A menos que se indique algo diferente en la monografı́a
aproximación de 10 ppm. Los valores indicados no reflejan la individual, los disolventes residuales de Clase 3 están limitados
precisión analı́tica necesaria del proceso de determinación. La a no más de 50 mg por dı́a (lo que corresponde a 5000 ppm ó 0,5%
precisión se debe determinar como parte de la validación del en la Opción 1). Si el lı́mite de disolvente de Clase 3 en una
procedimiento. monografı́a individual es superior a 50 mg por dı́a, ese disolvente
Si los disolventes residuales de Clase 2 están presentes en residual se debe identificar y cuantificar. Los procedimientos que se
cantidades superiores a los lı́mites de la Opción 1, es necesario describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de
identificarlos y cuantificarlos. Los procedimientos que se describen Disolventes Residuales de este Capı́tulo General con las debidas
en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes modificaciones a las soluciones estándar, se aplican siempre que sea
Residuales de este Capı́tulo General se aplican siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento
posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado. Tal procedimiento se enviará a la USP para su
validado apropiado. Tal procedimiento se enviará a la USP para su evaluación. En estos procedimientos se deben usar Estándares de
evaluación. Referencia USP, siempre que estén disponibles.
NOTA—Los siguientes disolventes residuales de Clase 2 no se
detectan con facilidad mediante las condiciones de inyección de fase
gaseosa que se describen en la sección Identificación, Control y Tabla 3. Disolventes Residuales de Clase 3
Cuantificación de Disolventes Residuales de este Capı́tulo General: (limitados por las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos
formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol, etilenglicol, N-metilpirro- basados en la calidad en fármacos, excipientes y productos
lidona y sulfolano. Es necesario emplear otros procedimientos farmacéuticos)
validados apropiados para la cuantificación de estos disolventes
residuales. Tales procedimientos se enviarán a la USP para su Acetato de butilo Etanol
revisión y posible inclusión en la monografı́a individual correspon- Acetato de etilo Éter terc-butilmetı́lico
diente. Acetato de isobutilo Éter etı́lico
Acetato de isopropilo Formiato de etilo
Acetato de metilo Heptano
Acetato de propilo 3-Metil-1-butanol
Tabla 2. Disolventes Residuales de Clase 2 Acetona Metiletilcetona
Ácido acético Metilisobutilcetona
Lı́mite de Ácido fórmico 2-Metil-1-propanol
EDP Concentración Anisol Pentano
Disolvente (mg/dı́a) (ppm) 1-Butanol 1-Pentanol
Acetonitrilo 4,1 410 2-Butanol 1-Propanol
Ciclohexano 38,8 3880 Cumeno 2-Propanol
Clorobenceno 3,6 360 Dimetil sulfóxido
Cloroformo 0,6 60
Cloruro de metileno 6,0 600
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870
N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090
N,N-Dimetilformamida 8,8 880 Otros Disolventes Residuales
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
1,4-Dioxano 3,8 380 Los disolventes residuales que figuran en la Tabla 4 también
Etilenglicol 6,2 620 podrı́an interesar a los fabricantes de fármacos, excipientes
2-Etoxietanol 1,6 160 o productos farmacéuticos. No obstante, no se han encontrado
Formamida 2,2 220 datos toxicológicos para fundamentar una EDP.
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000
Metilbutilcetona 0,5 50 Tabla 4. Otros Disolventes Residuales
Metilciclohexano 11,8 1180 (para los cuales no se han encontrado datos toxicológicos adecuados)
N-Metilpirrolidona 5,3 530
2-Metoxietanol 0,5 50 Ácido tricloroacético Éter isopropı́lico
Nitrometano 0,5 50 Ácido trifluoroacético Éter de petróleo
Piridina 2,0 200 1,1-Dietoxipropano Isooctano
Sulfolano 1,6 160 1,1-Dimetoximetano Metil isopropil cetona
Tetrahidrofurano 7,2 720 2,2-Dimetoxipropano Metiltetrahidrofurano
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890
Tricloroetileno 0,8 80
Xileno* 21,7 2170
IDENTIFICACIÓN, CONTROL Y
*
Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% CUANTIFICACIÓN DE DISOLVENTES
de etilbenceno RESIDUALES
[NOTA—El agua exenta de sustancias orgánicas que se especifica
en los siguientes procedimientos no produce picos que interfieran
significativamente cuando se lleva a cabo una cromatografı́a.]
Clase 3
Se considera que los disolventes residuales de Clase 3 (Tabla 3)
son menos tóxicos y representan un riesgo menor para la salud Disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2
humana que los disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2. La Clase
3 no incluye disolventes que representen un riesgo para la salud ARTÍCULOS SOLUBLES EN AGUA
humana a los niveles normalmente aceptados en productos
farmacéuticos. Sin embargo, no hay estudios de carcinogenicidad Procedimiento A—
o toxicidad a largo plazo para muchos de los disolventes residuales Solución Madre del Estándar de Clase 1—Transferir 1,0 mL de
de la Clase 3. Los datos disponibles indican que son menos tóxicos ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz
en estudios de toxicidad a corto plazo o agudos y que son negativos volumétrico de 100 mL, agregar 9 mL de dimetil sulfóxido, diluir
en estudios de genotoxicidad. a volumen con agua y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución
USP 30 Pruebas Quı́micas / h467i Impurezas Orgánicas Volátiles 189
a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y Tabla 5. Parámetros Operativos para
mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico el Inyector de Cámara Gaseosa
de 10 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Solución Estándar de Clase 1—Transferir 1,0 mL de Solución Parámetros Operativos
Madre del Estándar de Clase 1 a un vial para muestreo de cámara
gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, introducir el tapón, tapar 1 2 3
y mezclar. Temperatura de equilibrio (8) 80 105 80
Soluciones Madre del Estándar de Clase 2—Transferir 1,0 mL de Tiempo de equilibrio (min.) 60 45 45
ER Mezcla A—Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz Temperatura de lı́nea de 85 110 105
volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Ésta transferencia (8)
es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Transferir 1,0 mL Gas transportador: nitrógeno o helio a una presión adecuada
de ER Mezcla B—Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un Tiempo de presurización (s) 30 30 30
matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Volumen de inyección (mL) 1 1 1
Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2.
Solución Estándar Mezcla A de Clase 2—Transferir 1,0 mL de Procedimiento B—
Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de
de cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, introducir el Clase 1, Soluciones Madre del Estándar de Clase 2, Solución
tapón, tapar y mezclar. Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2—Transferir 5,0 mL de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución
Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo de Aptitud del Sistema de Clase 1—Preparar según se indica en el
de cámara gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, introducir el Procedimiento A.
tapón, tapar y mezclar. Solución de Aptitud del Sistema de Clase 2—Transferir 1,0 mL de
Solución Madre de Prueba—Transferir aproximadamente 250 mg ER Acetonitrilo—Disolventes Residuales de Clase 2 USP y 1,0 mL
del artı́culo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz de ER Tricloroetileno—Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
volumétrico de 25 mL, disolver y diluir a volumen con agua, y matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de cámara
Solución de Prueba—Transferir 5,0 mL de Solución Madre de gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, introducir el tapón, tapar
Prueba a un vial para muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar y mezclar.
1,0 mL de agua, introducir el tapón, tapar y mezclar. Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar un
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1—Transferir 1,0 mL de cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una
Solución Madre del Estándar de Clase 1 a un vial para muestreo de columna de sı́lice fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una
cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de Solución Madre de capa de 0,25 mm de fase G16 o una columna macrocapilar de 0,53
Prueba, introducir el tapón, tapar y mezclar. mm 6 30 m recubierta con una capa de 0,25 mm de fase G16. El gas
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar un transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de
cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una aproximadamente 35 cm por segundo y una relación de partición de
columna de sı́lice fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una 1 : 5. Mantener la temperatura de la columna a 508 durante 20
capa de 1,8 mm de fase G43 o una columna macrocapilar de 0,53 mm minutos, luego elevarla a una velocidad de 68 por minuto hasta 1658
6 30 m recubierta con una capa de 3,0 mm de fase G43. El gas y mantener a 1658 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas
transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de del inyector y del detector a 1408 y 2508, respectivamente.
aproximadamente 35 cm por segundo y una relación de partición de Cromatografiar la Solución Estándar de Clase 1, la Solución de
1 : 5. Mantener la temperatura de la columna a 408 durante 20 Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución de Aptitud del Sistema
minutos, luego elevarla a una velocidad de 108 por minuto hasta de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en el
2408 y mantener a 2408 durante 20 minutos. Mantener las Procedimiento: la relación señal-ruido del benceno en la Solución
temperaturas del inyector y del detector a 1408 y 2508, respectiva- Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal-ruido de
mente. Cromatografiar la Solución Estándar de Clase 1, la Solución cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es
de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A menor de 3; y la resolución, R, entre el acetonitrilo y el
de Clase 2, y registrar los cromatogramas según se indica en el tricloroetileno en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 2 no
Procedimiento: la relación señal-ruido del 1,1,1-tricloroetano en la es menor de 1,0.
Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal- Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo
ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase (siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la
1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre el acetonitrilo y el Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0
cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar
es menor de 1,0. Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo de la Solución de prueba, registrar los cromatogramas y medir las
(siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la respuestas correspondientes a los picos principales. Si las respuestas
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 de los picos en la Solución de Prueba correspondientes a los picos
mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los
Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y picos correspondientes en la Solución Estándar de Clase 1 o en
de la Solución de prueba, registrar los cromatogramas y medir las cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar
respuestas correspondientes a los picos principales. Si la respuesta a cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no
correspondiente a cualquiera de los picos en la Solución de Prueba sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de esta prueba.
es mayor o igual al pico correspondiente en la Solución Estándar de Procedimiento C—
Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de
Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad Clase 1, Solución Madre A del Estándar de Clase 2, Solución
del pico; si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución
esta prueba. de Prueba y Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1—Preparar
según se indica en el Procedimiento A.
Solución Estándar—[NOTA—Preparar por separado una Solución
Estándar para cada pico identificado y verificado mediante los
Procedimientos A y B.] Transferir un volumen, medido con
exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual que
corresponda a cada pico de disolvente residual identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente
adecuado y diluir con agua cuantitativamente, y si fuera necesario en
190 h467i Impurezas Orgánicas Volátiles / Pruebas Quı́micas USP 30
diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentra- Solución Madre de Prueba—Transferir aproximadamente 250 mg
ción final de 1/20 del valor indicado en la Tabla 1 ó 2 (en Lı́mite de del artı́culo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz
Concentración). Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para volumétrico de 25 mL, disolver y diluir a volumen con
muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, dimetilformamida, y mezclar.
introducir el tapón, tapar y mezclar. Solución de Prueba 1—Transferir 5,0 mL de Solución Madre de
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada— Prueba a un vial para muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar
[NOTA—Preparar por separado una Solución de Prueba con una 1,0 mL de dimetilformamida, introducir el tapón, tapar y mezclar.
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y Solución de Prueba 2—[NOTA—Esta solución se emplea para la
verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL identificación de dimetilformamida y/o N,N-dimetilacetamida en el
de la Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de cámara artı́culo en análisis.] Transferir aproximadamente 250 mg del artı́culo
gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de la Solución Estándar, en análisis, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 25
introducir el tapón, tapar y mezclar. mL, disolver y diluir a volumen con 1,3-dimetil-2-imidazolidinona y
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—[NOTA—Si mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución a un vial para muestreo
se verifica que los resultados de la cromatografı́a del Procedimiento de cámara gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de 1,3-dimetil-2-
A son inferiores a los del Procedimiento B, se puede sustituir el imidazolidinona, introducir el tapón, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico del Procedimiento B.] Equipar un croma- Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo
tógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una (siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la
columna de sı́lice fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0
capa de 1,8 mm de fase G43 o una columna macrocapilar de 0,53 mm mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar
6 30 m recubierta con una capa de 3,0 mm de fase G43. El gas Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2,
transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de de la Solución Estándar Mezcla C de Clase 2, de la Solución de
aproximadamente 35 cm por segundo y una relación de partición de Prueba 1 y de la Solución de Prueba 2 (si corresponde), registrar los
1 : 5. Mantener la temperatura de la columna a 408 durante 20 cromatogramas y medir las respuestas correspondientes a los picos
minutos, luego elevarla a una velocidad de 108 por minuto hasta principales. Si la respuesta correspondiente a cualquier pico en la
2408 y mantener a 2408 durante 20 minutos. Mantener las Solución de Prueba 1 es mayor o igual a la del pico correspondiente
temperaturas del inyector y del detector a 1408 y 2508, respectiva- en la Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las tres
mente. Cromatografiar la Solución Estándar de Clase 1, la Solución Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el
de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no
de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en el sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de esta prueba. Si la
Procedimiento: la relación señal-ruido del 1,1,1-tricloroetano en la respuesta del pico de dimetilformamida o de N,N-dimetilacetamida
Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal- en la Solución de Prueba 2 es mayor o igual a la del pico
ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase correspondiente en la Solución Estándar Mezcla C de Clase 2,
1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre el acetonitrilo y el llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico;
cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de esta
es menor de 1,0. prueba.
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo Procedimiento B—
(siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solución Madre
mL) de la Solución Estándar, de la Solución de Prueba y de la A del Estándar de Clase 2, Solución Madre B del Estándar de Clase
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, registrar 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 y Solución Estándar
los cromatogramas y medir las respuestas correspondientes a los Mezcla B de Clase 2— Preparar según se indica en Procedimiento A
picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente en Artı́culos Solubles en Agua.
residual encontrado en el artı́culo en análisis, por la fórmula:
Solución Madre C del Estándar de Clase 2, Solución Estándar
5(C/W)[rU /(rST – rU)] Mezcla C de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de
Prueba 1 y Solución de Prueba 2—Proceder según se indica en el
en donde C es la concentración, en ppm, del Estándar de Referencia Procedimiento A.
USP apropiado en la Solución Estándar; W es el peso, en g, del Solución de Aptitud del Sistema de Clase 2 y Sistema
artı́culo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Cromatográfico—Proceder según se indica en Procedimiento B en
Prueba; y rU y rST son las respuestas correspondientes a los picos de Artı́culos Solubles en Agua.
cada disolvente residual obtenidos a partir de la Solución de Prueba
y la Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo
respectivamente. (siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0
mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar
Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2,
ARTÍCULOS INSOLUBLES EN AGUA
de la Solución Estándar Mezcla C de Clase 2, de la Solución de
Prueba 1 y/o la Solución de Prueba 2 (si corresponde), registrar los
Procedimiento A— cromatogramas y medir las respuestas correspondientes a los picos
Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de principales. Si las respuestas de los picos en la Solución de Prueba
Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solución Madre 1 correspondientes a los picos identificados en el Procedimiento A
A del Estándar de Clase 2, Solución Madre B del Estándar de Clase son iguales o mayores que las de los picos correspondientes en la
2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las tres Soluciones
Mezcla B de Clase 2 y Sistema Cromatográfico—Proceder según se Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento C para
indica en Procedimiento A en Artı́culos Solubles en Agua. cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los
Solución Madre C del Estándar de Clase 2—Transferir 1,0 mL de requisitos de esta prueba. Si la respuesta del pico de dimetilforma-
ER Mezcla C—Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz mida o de N,N-dimetilacetamida en la Solución de Prueba 2 es
volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con 1,3-dimetil-2- mayor o igual al pico correspondiente en la Solución Estándar
imidazolidinona y mezclar. Mezcla C de Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento C para
Solución Estándar Mezcla C de Clase 2—[NOTA—Esta solución se cuantificar el pico; si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los
emplea para la identificación y cuantificación de dimetilformamida requisitos de esta prueba.
y/o N,N-dimetilacetamida en el artı́culo en análisis.] Transferir 1,0
mL de la Solución Madre C del Estándar de Clase 2 a un vial para
muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de 1,3-
dimetil-2-imidazolidinona, introducir el tapón, tapar y mezclar.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h467i Impurezas Orgánicas Volátiles 191
Método V
Solución Estándar y Solución de Prueba—Preparar según se
Método IV indica en el Método I.
Sistema cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar un
Solución Estándar—Preparar según se indica para la Solución cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama, una
Estándar en el Método I. Pipetear 5 mL de la solución ası́ obtenida y columna analı́tica de sı́lice fundida de 0,53 mm 6 30 m recubierta
transferir a un vial con un septo y una tapa precintada, que contenga con fase estacionaria G43 de 3,0 mm y un guarda columna de sı́lice
1 g de sulfato de sodio anhidro y sellar. Calentar el vial sellado a 808 de 0,53 mm 6 5 m desactivado con fenilmetil siloxano. El gas
durante 60 minutos. transportador es helio con una velocidad lineal de aproximadamente
USP 30 Pruebas Quı́micas / h467i Impurezas Orgánicas Volátiles 193
35 cm por segundo. Mantener las temperaturas del inyector y del Factor de modificación: Un factor determinado según el criterio
detector a 1408 y 2608, respectivamente. Programar la temperatura profesional de un toxicólogo y que se aplica a datos de valoraciones
de la columna según los pasos siguientes. Mantener a 408 durante 20 biológicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres
minutos, luego aumentar rápidamente a 2408 y mantener a 2408 humanos de manera segura.
durante 20 minutos. Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar
Inyectar la Solución Estándar y registrar el cromatograma según efectos adversos en el sistema nervioso.
se indica en el Procedimiento: un sistema apropiado proporciona Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en inglés): La
cromatogramas donde están resueltos todos los componentes de la dosis máxima de una sustancia con la que no se producen
Solución Estándar: la resolución, R, entre cualquier par de incrementos biológicamente significativos en la frecuencia o grave-
componentes no es menor de 3 y la desviación estándar relativa de dad de los efectos causados a los seres humanos o los animales
las respuestas de los picos individuales de inyecciones repetidas no expuestos a esta sustancia.
es más de 15%. Exposición diaria permitida (EDP): El consumo máximo
Procedimiento—Proceder según se indica en el Método I, con un admisible diario de un disolvente residual en productos farmacéu-
volumen de inyección de aproximadamente 1 mL. ticos.
Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados
por una sustancia que desaparecen cuando termina la exposición.
Método VI Sustancias donde existe fuerte sospecha de carcinogenidad para
los seres humanos: Una sustancia para la cual no hay evidencia
epidemiológica de carcinogénesis pero donde existen datos de
Solución Estándar y Solución de Prueba—Preparar según se genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinogénesis en
indica en el Método I. roedores.
Sistema cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar un Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en
cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama. Las un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra una sustancia
condiciones de columna y de temperatura de la columna, elegidas de durante el embarazo.
la lista que figura a continuación (ver Tabla 6), se especifican en la
monografı́a individual. El gas transportador, la velocidad lineal
o velocidad de flujo y las temperaturas del detector y del inyector son
apropiadas para las dimensiones de la columna y las temperaturas de
la columna elegidas de la lista que figura a continuación.
Inyectar la Solución Estándar y registrar el cromatograma según
se indica en el Procedimiento: un sistema apropiado proporciona
cromatogramas donde estén resueltos todos los componentes de la APÉNDICE 2. REFERENCIA ADICIONAL
Solución Estándar; la resolución, R, entre cualquier par de
componentes no es menor de 1,0 y la desviación estándar relativa A2.1. Reglamentación Ambiental sobre Disolventes
de las respuestas de los picos individuales de inyecciones repetidas Orgánicos Volátiles
no es más de 15%.
Procedimiento—Proceder según se indica en el Método I, con un Varios de los disolventes residuales empleados con frecuencia en
volumen de inyección de aproximadamente 1 mL. la elaboración de productos farmacéuticos figuran como productos
quı́micos tóxicos en las monografı́as de los Criterios Sanitarios
Ambientales (EHC, por sus siglas en inglés) y en el Sistema
GLOSARIO Integrado de Información de Riesgo (IRIS, por sus siglas en inglés).
Los objetivos de grupos tales como el Programa Internacional para la
Carcinógenos genotóxicos: Son carcinógenos que producen Seguridad de las Sustancias Quı́micas (IPCS, por sus siglas en
cáncer al afectar los genes o cromosomas. inglés), la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos
Nivel de efecto mı́nimo observable (LOEL, por sus siglas en (EPA, por sus siglas en inglés) y la Administración de Alimentos y
inglés): La dosis mı́nima de una sustancia en un estudio o grupo de Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés)
estudios que produce incrementos biológicamente significativos en incluyen la determinación de niveles de exposición admisibles. Su
la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos propósito es mantener la integridad medioambiental y proteger la
o los animales expuestos a esta sustancia. salud de los seres humanos contra los posibles efectos nocivos de las
sustancias quı́micas ocasionados por una exposición medioambiental
a largo plazo. Los procedimientos relativos al cálculo estimado de
los lı́mites para una exposición máxima segura están basados
Tabla 6. Condiciones Cromatográficas para el Método VI
Clorobenceno Clase 2
*
Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etil benceno.
generalmente en estudios a largo plazo. Cuando no hay disponibles Los niveles de exposición admisibles que figuran en este Capı́tulo
datos de estudios a largo plazo, se pueden emplear datos de estudios General para los disolventes residuales de Clase 2 se establecieron
a plazos más cortos modificando el método, por ejemplo empleando mediante el cálculo de los valores de EDP conforme a los
factores de seguridad mayores. El enfoque descrito en esos procedimientos para fijar lı́mites de exposición en preparados
documentos se refiere en primer lugar a la exposición a largo farmacéuticos (página 5748 de PF 15(6) [Nov.–Dic. 1989]) y el
plazo o durante toda la vida de la población general en el medio método adoptado por la IPCS para la Evaluación del Riesgo para la
ambiente (es decir, el aire ambiental, la comida, el agua potable y Salud Humana de los Productos Quı́micos (Assessing Human Health
otros medios). Risk of Chemicals (Environmental Health Criteria 170, OMS,
1994). Estos procedimientos son similares a los que emplean la EPA
de los Estados Unidos (IRIS), la FDA de los Estados Unidos (Libro
A2.2. Disolventes Residuales en Productos Rojo) y otros organismos. El método que se describe en este
Farmacéuticos documento tiene como fin facilitar la comprensión de los valores de
EDP. No es necesario realizar estos cálculos para emplear los valores
Los lı́mites de exposición que figuran en este Capı́tulo General de EDP que figuran en la Tabla 2 de este documento.
están establecidos con respecto a metodologı́as y datos de seguridad La EDP proviene del nivel sin efecto observable (NOEL), o del
descritos en monografı́as del EHC e IRIS. Sin embargo, las nivel de efecto mı́nimo observable (LOEL), en la mayorı́a de los
siguientes suposiciones especı́ficas sobre los disolventes residuales estudios más importantes en animales, de la siguiente manera:
que se van a emplear en la sı́ntesis y formulación de productos
farmacéuticos deben tenerse en cuenta al establecer los lı́mites de
exposición.
1. Los pacientes (no la población en general) emplean los
productos farmacéuticos para tratar sus enfermedades o como
profilaxis para prevenir infecciones o enfermedades.
2. La suposición de una exposición del paciente durante toda su La EDP se calcula preferentemente a partir de un NOEL. Si no se
vida no es necesaria para la mayorı́a de los productos obtiene un NOEL, se puede emplear el LOEL. Los factores de
farmacéuticos, pero puede ser adecuada como hipótesis de modificación que se proponen en este documento para relacionar
trabajo para reducir el riesgo para la salud de los seres humanos. datos con seres humanos son del mismo tipo que los ‘‘factores de
3. Los disolventes residuales son componentes inevitables en la incertidumbre’’ empleados en los Criterios Sanitarios Ambientales
producción farmacéutica y a menudo son parte de los productos (Environmental Health Criteria 170, OMS, Ginebra, 1994) y los
medicinales. ‘‘factores de modificación’’ o los ‘‘factores de seguridad’’ en el
4. No se debe exceder el nivel recomendado de disolventes Pharmacopeial Forum. La suposición de una exposición sistémica
residuales salvo en circunstancias excepcionales. de 100 por ciento se emplea en todos los cálculos sin tener en cuenta
5. Los datos de los estudios toxicológicos que se emplean para la vı́a de administración.
determinar los niveles admisibles para los residuos toxicológi- Los factores de modificación son los siguientes:
cos deben provenir de protocolos apropiados, como por
ejemplo los que describe la Organización para la Cooperación F1 = Un factor que representa la extrapolación entre especies
y el Desarrollo Económico (OECD, por sus siglas en inglés), la F1 = 2 para extrapolación de perros a seres humanos
EPA y el Libro Rojo de la FDA. F1 = 2,5 para extrapolación de conejos a seres humanos
F1 = 3 para extrapolación de monos a seres humanos
F1 = 5 para extrapolación de ratas a seres humanos
F1 = 10 para extrapolación de otros animales a seres
APÉNDICE 3. PROCEDIMIENTOS PARA humanos
ESTABLECER LÍMITES DE EXPOSICIÓN F1 = 12 para extrapolación de ratones a seres humanos
El método Gaylor-Kodell para la evaluación del riesgo (Gaylor, D. El factor F1 tiene en cuenta la relación comparativa entre el área de
W. y Kodell, R. L., Linear Interpolation Algorithm for Low Dose superficie y el peso corporal de las especies involucradas y a los
Assessment of Toxic Substance. Journal of Environmental Pathol- seres humanos. El área de superficie (S) se calcula como:
ogy and Toxicology, 4 : 305, 1980) es apropiado para los disolventes S = kM 0,67 (2)
carcinogénicos de Clase 1. Solamente cuando se dispone de datos
fiables sobre carcinogenicidad puede hacerse una extrapolación en donde M = peso corporal; y la constante k se ha tomado con valor
mediante modelos matemáticos para fijar lı́mites de exposición. Los 10. Los pesos corporales empleados en la ecuación figuran
lı́mites de exposición para los disolventes residuales de Clase a continuación en la Tabla A3.-1.
1 podrı́an determinarse empleando factores de seguridad mayores (es
decir, de 10 000 a 100 000) con respecto al nivel sin efecto F2 = Un factor de 10 representa la variabilidad entre individuos.
observable (NOEL). La detección y la cuantificación de estos Por lo general, se proporciona un factor de 10 para todos
disolventes residuales se efectúan mediante técnicas analı́ticas de los disolventes orgánicos y 10 se usa en todo este Capı́tulo
última generación. General.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h467i Disolventes Residuales 197
F3 = Un factor de variabilidad que representa los estudios de A3.-1. - Valores Empleados en los Cálculos en Este Documento
toxicidad de exposición a corto plazo.
F3 = 1 para estudios que duran como mı́nimo la mitad Peso corporal de ratas 425 g
de su vida (1 año para roedores o conejos; 7 años Peso corporal de ratas preñadas 330 g
para gatos, perros y monos). Peso corporal de ratones 28 g
F3 = 1 para estudios reproductivos que se cubren el Peso corporal de ratones hembra preñadas 30g
periodo completo de organogénesis. Peso corporal de cobayos 500 g
F3 = 2 para un estudio de 6 meses en roedores o un Peso corporal de monos Rhesus 2,5 kg
estudio de 3,5 años en no roedores. Peso corporal de conejos (preñadas o no) 4 kg
F3 = 5 para un estudio de 3 meses en roedores o un Peso corporal de perros Beagle 11,5 kg
estudio de 2 años en no roedores. Volumen respiratorio de ratas 290 L/dı́a
F3 = 10 para estudios más breves. Volumen respiratorio de ratones 43 L/dı́a
En todos los casos se ha empleado el valor más alto para los estudios Volumen respiratorio de conejos 1440 L/dı́a
con duración intermedia entre estos tiempos (por ejemplo, un factor Volumen respiratorio de cobayos 430 L dı́a
de 2 para un estudio de 9 meses en roedores). Volumen respiratorio humano 28 800 L/dı́a
Volumen respiratorio de perros 9000 L/dı́a
F4 = Un factor que se puede aplicar en casos de toxicidad grave, Volumen respiratorio de monos 1150 L/dı́a
p. ej. carcinogenicidad no genotóxica, neurotoxicidad Consumo de agua de ratones 5 mL/dı́a
o teratogenicidad. En estudios de toxicidad reproductiva, Consumo de agua de ratas 30 mL/dı́a
se emplean los siguientes factores: Consumo de alimentos de ratas 30 g/dı́a
F4 = 1 para toxicidad fetal asociada a toxicidad materna
F4 = 5 para toxicidad fetal sin toxicidad materna Se emplea la ecuación de gases ideales, PV = nRT, para convertir
F4 = 5 para un efecto teratogénico con toxicidad las concentraciones de gases empleados en estudios de inhalación de
materna unidades en ppm a unidades en mg/L o mg/m3. Se propone como
F4 = 10 para un efecto teratogénico sin toxicidad ejemplo un estudio de toxicidad reproductiva en ratas por inhalación
materna de tetracloruro de carbono (peso molecular 153,84) resumido en
Pharmeuropa, Vol. 9, No. 1, Suplemento, abril 1997, página S9.
F5 = Un factor variable que se puede aplicar si no
se ha establecido un nivel sin efecto.
Opción 2
No se requiere que cada componente del producto farmacéutico
cumpla con los lı́mites proporcionados en la Opción 1. Se puede
emplear la EDP expresada en mg por dı́a según se indica en la Tabla
2 con la dosis diaria máxima conocida y la ecuación (1) mencionada
anteriormente, para determinar la concentración de disolvente
USP 30 Pruebas Quı́micas / h467i Disolventes Residuales 199
Solución Madre de Prueba—Transferir aproximadamente 250 mg Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)— Equipar un
del artı́culo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una
volumétrico de 25 mL, disolver y diluir a volumen con agua, y columna de sı́lice fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una
mezclar. capa de 0,25 mm de fase G16 o una columna macrocapilar de 0,53
Solución de Prueba—Transferir 5,0 mL de Solución Madre de mm 6 30 m recubierta con una capa de 0,25 mm de fase G16. El gas
Prueba a un vial para muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de
1,0 mL de agua, introducir el tapón, tapar y mezclar. aproximadamente 35 cm por segundo y una relación de partición de
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1—Transferir 1,0 mL de 1 : 5. Mantener la temperatura de la columna a 508 durante 20
Solución Madre del Estándar de Clase 1 a un vial para muestreo de minutos, luego elevarla a una velocidad de 68 por minuto hasta 1658
cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de Solución Madre de y mantener a 1658 durante 20 minutos. Mantener las temperaturas
Prueba, introducir el tapón, tapar y mezclar. del inyector y del detector a 1408 y 2508, respectivamente.
Cromatografiar la Solución Estándar de Clase 1, la Solución de
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar un Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución de Aptitud del Sistema
cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en el
columna de sı́lice fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una Procedimiento: la relación señal-ruido del benceno en la Solución
capa de 1,8 mm de fase G43 o una columna macrocapilar de 0,53 mm Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal-ruido de
6 30 m recubierta con una capa de 3,0 mm de fase G43. El gas cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es
transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de menor de 3; y la resolución, R, entre el acetonitrilo y el
aproximadamente 35 cm por segundo y una relación de partición de tricloroetileno en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 2 no
1 : 5. Mantener la temperatura de la columna a 408 durante 20 es menor de 1,0.
minutos, luego elevarla a una velocidad de 108 por minuto hasta
2408 y mantener a 2408 durante 20 minutos. Mantener las Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo
temperaturas del inyector y del detector a 1408 y 2508, respectiva- (siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la
mente. Cromatografiar la Solución Estándar de Clase 1, la Solución Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0
de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar
de Clase 2, y registrar los cromatogramas según se indica en el Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y
Procedimiento: la relación señal-ruido del 1,1,1-tricloroetano en la de la Solución de prueba, registrar los cromatogramas y medir las
Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal- respuestas correspondientes a los picos principales. Si las respuestas
ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase de los picos en la Solución de Prueba correspondientes a los picos
1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre el acetonitrilo y el identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los
cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no picos correspondientes en la Solución Estándar de Clase 1 o en
es menor de 1,0. cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar
a cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de esta prueba.
(siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 Procedimiento C—
mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de
Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Clase 1, Solución Madre A del Estándar de Clase 2, Solución
de la Solución de prueba, registrar los cromatogramas y medir las Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución
respuestas correspondientes a los picos principales. Si la respuesta de Prueba y Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1—Preparar
correspondiente a cualquiera de los picos en la Solución de Prueba según se indica en el Procedimiento A.
es mayor o igual al pico correspondiente en la Solución Estándar de Solución Estándar—[NOTA—Preparar por separado una Solución
Clase 1 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Estándar para cada pico identificado y verificado mediante los
Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad Procedimientos A y B.] Transferir un volumen, medido con
del pico; si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual que
esta prueba. corresponda a cada pico de disolvente residual identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente
adecuado y diluir con agua cuantitativamente, y si fuera necesario en
diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentra-
Tabla 5. Parámetros Operativos para ción final de 1/20 del valor indicado en la Tabla 1 ó 2 (en Lı́mite de
el Inyector de Cámara Gaseosa Concentración). Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para
Parámetros Operativos muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua,
introducir el tapón, tapar y mezclar.
1 2 3 Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada—
Temperatura de equilibrio (8) 80 105 80 [NOTA—Preparar por separado una Solución de Prueba con una
Tiempo de equilibrio (min.) 60 45 45 Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y
Temperatura de lı́nea de 85 110 105 verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL
transferencia (8) de la Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de cámara
Gas transportador: nitrógeno o helio a una presión adecuada gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de la Solución Estándar,
Tiempo de presurización (s) 30 30 30 introducir el tapón, tapar y mezclar.
Volumen de inyección (mL) 1 1 1 Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—[NOTA—Si
se verifica que los resultados de la cromatografı́a del Procedimiento
A son inferiores a los del Procedimiento B, se puede sustituir el
Procedimiento B— Sistema Cromatográfico del Procedimiento B.] Equipar un croma-
Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de tógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una
Clase 1, Soluciones Madre del Estándar de Clase 2, Solución columna de sı́lice fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una
Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de capa de 1,8 mm de fase G43 o una columna macrocapilar de 0,53 mm
Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución 6 30 m recubierta con una capa de 3,0 mm de fase G43. El gas
de Aptitud del Sistema de Clase 1—Preparar según se indica en el transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de
Procedimiento A. aproximadamente 35 cm por segundo y una relación de partición de
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 2—Transferir 1,0 mL de 1 : 5. Mantener la temperatura de la columna a 408 durante 20
ER Acetonitrilo—Disolventes Residuales de Clase 2 USP y 1,0 mL minutos, luego elevarla a una velocidad de 108 por minuto hasta
de ER Tricloroetileno—Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un 2408 y mantener a 2408 durante 20 minutos. Mantener las
matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. temperaturas del inyector y del detector a 1408 y 2508, respectiva-
Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de cámara mente. Cromatografiar la Solución Estándar de Clase 1, la Solución
gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, introducir el tapón, tapar de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A
y mezclar. de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica en el
202 h467i Disolventes Residuales / Pruebas Quı́micas USP 30
Procedimiento: la relación señal-ruido del 1,1,1-tricloroetano en la en la Solución de Prueba 2 es mayor o igual a la del pico
Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación señal- correspondiente en la Solución Estándar Mezcla C de Clase 2, llevar
ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto
1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre el acetonitrilo y el no sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de esta prueba.
cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no Procedimiento B—
es menor de 1,0. Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solución Madre
(siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la A del Estándar de Clase 2, Solución Madre B del Estándar de Clase
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 y Solución Estándar
mL) de la Solución Estándar, de la Solución de prueba y de la Mezcla B de Clase 2—Preparar según se indica en Procedimiento A
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, registrar en Artı́culos Solubles en Agua.
los cromatogramas y medir las respuestas correspondientes a los Solución Madre C del Estándar de Clase 2, Solución Estándar
picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente Mezcla C de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de
residual encontrado en el artı́culo en análisis, por la fórmula: Prueba 1 y Solución de Prueba 2—Proceder según se indica en el
5(C/W)[rU /(rST – rU)] Procedimiento A.
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 2 y Sistema
en donde C es la concentración, en ppm, del Estándar de Referencia Cromatográfico—Proceder según se indica en Procedimiento B en
USP apropiado en la Solución Estándar; W es el peso, en g, del Artı́culos Solubles en Agua.
artı́culo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de
Prueba; y rU y rST son las respuestas correspondientes a los picos de Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo
cada disolvente residual obtenidos a partir de la Solución de Prueba (siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la
y la Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0
respectivamente. mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar
Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2,
de la Solución Estándar Mezcla C de Clase 2, de la Solución de
Prueba 1 y/o la Solución de Prueba 2 (si corresponde), registrar los
ARTÍCULOS INSOLUBLES EN AGUA cromatogramas y medir las respuestas correspondientes a los picos
principales. Si las respuestas de los picos en la Solución de Prueba
Procedimiento A— 1 correspondientes a los picos identificados en Procedimiento A son
Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de iguales o mayores que las de los picos correspondientes en la
Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solución Madre Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las tres Soluciones
A del Estándar de Clase 2, Solución Madre B del Estándar de Clase Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento C para
2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los
Mezcla B de Clase 2 y Sistema Cromatográfico—Proceder según se requisitos de esta prueba. Si la respuesta del pico de dimetilforma-
indica en Procedimiento A en Artı́culos Solubles en Agua. mida o de N,N-dimetilacetamida en la Solución de Prueba 2 es
Solución Madre C del Estándar de Clase 2—Transferir 1,0 mL de mayor o igual al pico correspondiente en la Solución Estándar
ER Mezcla C—Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz Mezcla C de Clase 2, llevar a cabo el Procedimiento C para
volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con 1,3-dimetil-2- cuantificar el pico; si esto no sucediera, el artı́culo cumple con los
imidazolidinona y mezclar. requisitos de esta prueba.
Solución Estándar Mezcla C de Clase 2—[NOTA—Esta solución se Procedimiento C—
emplea para la identificación y cuantificación de dimetilformamida Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de
y/o N,N-dimetilacetamida en el artı́culo en análisis.] Transferir 1,0 Clase 1, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1, Solución Madre
mL de la Solución Madre C del Estándar de Clase 2 a un vial para A del Estándar de Clase 2 y Solución Estándar Mezcla A de Clase
muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de 1,3- 2—Proceder según se indica en Procedimiento A en Artı́culos
dimetil-2-imidazolidinona, introducir el tapón, tapar y mezclar. Solubles en Agua.
Solución Madre de Prueba—Transferir aproximadamente 250 mg Solución Estándar 1—[NOTA—Preparar por separado una Solución
del artı́culo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz Estándar para cada pico identificado y verificado mediante los
volumétrico de 25 mL, disolver y diluir a volumen con Procedimientos A y B.] Transferir un volumen, medido con
dimetilformamida y mezclar. exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual corres-
Solución de Prueba 1—Transferir 5,0 mL de Solución Madre de pondiente a cada pico de disolvente residual identificado y verificado
Prueba a un vial para muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar mediante los Procedimientos A y B a un envase adecuado, y diluir
1,0 mL de dimetilformamida, introducir el tapón, tapar y mezclar. con dimetilformamida cuantativamente, y si fuera necesario en
Solución de Prueba 2—[NOTA—Esta solución se emplea para la diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentra-
identificación de dimetilformamida y/o N,N-dimetilacetamida en el ción final de 1/20 del valor indicado en la Tabla 1 o la Tabla 2 (en
artı́culo en análisis.] Transferir aproximadamente 250 mg del artı́culo Lı́mite de Concentración). Transferir 1,0 mL de esta solución a un
en análisis, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 25 vial para muestreo de cámara gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de
mL, disolver y diluir a volumen con 1,3-dimetil-2-imidazolidinona y dimetilformamida, introducir el tapón, tapar y mezclar.
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución a un vial para muestreo Solución Estándar 2—[NOTA—Esta solución se emplea para la
de cámara gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de 1,3-dimetil-2- cuantificación de dimetilformamida y/o N,N-dimetilacetamida en el
imidazolidinona, introducir el tapón, tapar y mezclar. artı́culo en análisis.] Transferir un volumen, medido con exactitud,
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo de ER N,N-Dimetilformamida—Disolvente Residual de Clase 2 USP
(siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la y/o un volumen, medido con exactitud, de ER N,N-Dimetilaceta-
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mida—Disolvente Residual de Clase 2 USP a un recipiente
mL) de la Solución Estándar de Clase 1, de la Solución Estándar adecuado, y diluir con 1,3-dimetil-2-imidazolidinona cuantitativa-
Mezcla A de Clase 2, de la Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, mente, y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una
de la Solución Estándar Mezcla C de Clase 2, de la Solución de solución con una concentración final de 1/20 del valor indicado en la
Prueba 1 y de la Solución de Prueba 2 (si corresponde), registrar los Tabla 2 (en Lı́mite de Concentración). Transferir 1,0 mL de esta
cromatogramas y medir las respuestas correspondientes a los picos solución a un vial para muestreo de cámara gaseosa adecuado,
principales. Si la respuesta correspondiente a cualquier pico en la agregar 5,0 mL de 1,3-dimetil-2-imidazolidinona, introducir el
Solución de Prueba 1 es mayor o igual a la del pico correspondiente tapón, tapar y mezclar.
en la Solución Estándar de Clase 1 o en cualquiera de las tres Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba 1 y Solución de
Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el Prueba 2—Proceder según se indica en el Procedimiento A.
Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada 1—
sucediera, el artı́culo cumple con los requisitos de esta prueba. Si la [NOTA—Preparar por separado una Solución de Prueba con una
respuesta del pico de dimetilformamida o de N,N-dimetilacetamida Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y
USP 30 Pruebas Quı́micas / h467i Disolventes Residuales 203
verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL de residual se debe identificar y cuantificar, aplicando los procedimien-
Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de cámara tos descritos anteriormente, con las debidas modificaciones a las
gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de la Solución Estándar 1, soluciones estándar, siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso,
introducir el tapón, tapar y mezclar. se emplea un procedimiento validado apropiado. Tal procedimiento
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada 2— se enviará a la USP para su evaluación. En estos procedimientos se
[NOTA—Preparar por separado una Solución de Prueba con una deben usar Estándares de Referencia USP, siempre que estén
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y disponibles. En la Figura 1 se muestra un diagrama de flujo para la
verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL aplicación de las pruebas de lı́mite de disolventes residuales.
de Solución de Prueba 2 a un vial para muestreo de cámara gaseosa
adecuado, agregar 1,0 mL de Solución Estándar 2, introducir el
tapón, tapar y mezclar. GLOSARIO
Sistema Cromatográfico—Proceder según se indica en Procedi-
miento C en Artı́culos Solubles en Agua. Carcinógenos genotóxicos: Son carcinógenos que producen
cáncer al afectar los genes o cromosomas.
Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo Exposición diaria permitida (EDP): El consumo máximo
(siguiendo alguno de los parámetros operativos descritos en la admisible diario de un disolvente residual en productos farmacéu-
Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 ticos.
mL) de la Solución Estándar, de la Solución de Prueba 1 y/o la Factor de modificación: Un factor determinado según el criterio
Solución de Prueba 2 y de la Solución de Prueba con una Cantidad profesional de un toxicólogo y que se aplica a datos de valoraciones
Conocida Agregada 1 y/o la Solución de Prueba con una Cantidad biológicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres
Conocida Agregada 2, registrar los cromatogramas y medir las humanos de manera segura.
respuestas correspondientes a los picos principales. Calcular la Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar
cantidad, en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el efectos adversos en el sistema nervioso.
artı́culo en análisis, por la fórmula: Nivel mı́nimo de efecto observable (LOEL, por sus siglas en
5(C/W)[rU /(rST – rU)] inglés): La dosis mı́nima de una sustancia en un estudio o grupo de
estudios que produce un incremento biológicamente significativo en
en donde C es la concentración, en ppm, del Estándar de Referencia la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos
USP apropiado en la Solución Estándar; W es el peso, en g, del o animales expuestos a esta sustancia.
artı́culo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en inglés): La
Prueba; y rU y rST son las respuestas correspondientes a los picos de dosis máxima de una sustancia con la que no se produce un
cada disolvente residual obtenidos a partir de la Solución de Prueba incremento biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad
1 o la Solución de Prueba 2 y de la Solución de Prueba con una de los efectos causados a los seres humanos o animales expuestos
Cantidad Conocida Agregada 1 o la Solución de Prueba con una a esta sustancia.
Cantidad Conocida Agregada 2, respectivamente. Sustancias seriamente sospechadas de carcinogenidad para los
seres humanos: Una sustancia para la cual no hay evidencia
epidemiológica de carcinogénesis pero donde existen datos de
Disolventes Residuales de Clase 3 genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinogénesis en
roedores.
Si solamente están presentes disolventes de Clase 3, el nivel de Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en
disolventes residuales se determina según se indica en Pérdida por un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra una sustancia
Secado h731i. Si el valor de pérdida por secado es más de 0,5%, se durante el embarazo.
debe determinar el agua en la muestra de prueba según se indica en Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados
Determinación de Agua h921i. Determinar el agua mediante el por una sustancia que desaparecen cuando termina la exposición.
Método Ia, a menos que se especifique algo diferente en la
monografı́a individual. Si el lı́mite de disolvente de Clase 3 en una
monografı́a individual es superior a 50 mg por dı́a (lo que
corresponde a 5000 ppm ó 0,5% en la Opción 1), ese disolvente
204 h467i Disolventes Residuales / Pruebas Quı́micas USP 30
Clorobenceno Clase 2
*
Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etil benceno.
Aparato—El aparato1 consta de un matraz Erlenmeyer de paredes Estándares de referencia USP h11i—ER Riboflavina USP.
gruesas, con boca de bordes elevados o en forma de copa, de 500 mL Solución Madre del Estándar de Riboflavina—A 50,0 mg de
de capacidad (salvo que se indique un matraz de mayor capacidad), ER Riboflavina USP, previamente secados y protegidos de la luz en
equipado con un tapón de vidrio esmerilado al que se ha soldado un un desecador sobre pentóxido de fósforo, agregar aproximadamente
dispositivo para colocar la muestra de prueba, formado por un 300 mL de ácido acético 0,02 N y calentar la mezcla en un baño de
alambre de platino grueso y un pieza de malla de platino soldada de vapor agitando frecuentemente hasta que la riboflavina se haya
aproximadamente 1,5 6 2 cm. disuelto. Luego enfriar, agregar ácido acético 0,02 N para obtener
500 mL y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Diluir una porción medida con exactitud de esta solución, usando
ácido acético 0,02 N, hasta una concentración de 10,0 mg de ER
Riboflavina USP seca por mL para obtener la Solución Madre del
Estándar de Riboflavina. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Preparaciones estándar—Diluir a volumen con agua 10,0 mL de
la Solución Madre del Estándar de Riboflavina en un matraz
volumétrico de 100 mL y mezclar. Cada mL representa 1,0 mg de ER
Riboflavina USP. Preparar una Preparación Estándar nueva para
cada valoración.
Preparación de Valoración—Colocar una cantidad del material
Aparato para la Combustión en Matraz con Oxı́geno a valorar en un matraz de tamaño adecuado y agregar un volumen de
ácido clorhı́drico 0,1 N igual en mL a no menos de 10 veces el peso
seco del material en g, aunque la solución resultante no debe
Procedimiento—[Precaución—Usar lentes de seguridad y colo- contener más de 100 mg de riboflavina por mL. Si el material no es
car una protección de seguridad adecuada entre el aparato y usted. fácilmente soluble, pulverizarlo para que pueda dispersarse uni-
Tomar las precauciones necesarias para asegurar que el matraz este formemente en el lı́quido. Luego agitar vigorosamente y lavar las
perfectamente limpio y no contenga ni siquiera trazas de disolventes paredes del matraz con ácido clorhı́drico 0,1 N.
orgánicos.] Si se trata de un sólido, pesar la sustancia colocándola Calentar la mezcla en un autoclave entre 1218 y 1238 durante 30
sobre un trozo de papel de filtro exento de haluros de aproxima- minutos y enfriar. Si el material se aglutina, agitar la mezcla hasta
damente 4 cm cuadrados y plegar el papel de forma tal que el sólido que las partı́culas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla,
quede envuelto por aquel. Si se trata de sustancias lı́quidas, pesarlas agitando vigorosamente, a un pH de 6,0 a 6,5 con solución de
en cápsulas taradas; las cápsulas de policarbonato1 se utilizan para hidróxido de sodio* y, de inmediato, agregar solución de ácido
lı́quidos cuyos volúmenes no excedan de 200 mL, mientras que las clorhı́drico* hasta que no haya más precipitación (por lo general a un
cápsulas de gelatina resultan adecuadas para volúmenes mayores. pH de aproximadamente 4,5, el punto isoeléctrico de muchas de las
[NOTA—Es posible que las cápsulas de gelatina contengan cantidades proteı́nas presentes). Diluir la mezcla con agua para obtener un
significativas de azufre o haluros combinados. Si se utiliza este tipo volumen medido que contenga aproximadamente 0,11 mg de
de cápsulas, efectuar una determinación con un blanco y realizar las riboflavina en cada mL y filtrar a través de papel que se sepa que
correcciones necesarias.] Colocar la muestra y una tira de papel de no adsorbe riboflavina. A una alı́cuota del filtrado, agregar, agitando
filtro, a modo de mecha, en el soporte de malla de platino. Colocar vigorosamente, una solución de hidróxido de sodio* para producir un
en el matraz el lı́quido absorbente especificado en la monografı́a pH de 6,6 a 6,8, diluir la solución con agua para obtener un volumen
individual o en el capı́tulo general, humedecer la junta del tapón con final medido que contenga aproximadamente 0,1 mg de riboflavina
agua y desplazar el aire del matraz con una corriente rápida de en cada mL y, si la solución se enturbia, filtrar nuevamente.
oxı́geno, agitando el lı́quido por rotación moderada para favorecer la Procedimiento—Agregar a cada uno de cuatro o más tubos (o
absorción de oxı́geno. [NOTA—La saturación del lı́quido con oxı́geno recipientes de reacción) 10,0 mL de la Preparación de Valoración.
es clave para el éxito del procedimiento de combustión.] Encender la Agregar a cada uno de dos o más de estos tubos 1,0 mL de la
tira de papel de filtro por medios adecuados. Si se enciende la tira Preparación Estándar y mezclar y luego agregar a cada uno de los
fuera del matraz, introducir inmediatamente el soporte de la muestra dos o más tubos restantes 1,0 mL de agua y mezclar. Agregar a cada
en el matraz, invertir el matraz para que la solución de absorción tubo 1,0 mL de ácido acético glacial y mezclar; luego agregar,
selle el tapón y sostener el tapón en su lugar con firmeza. Se puede mezclando, 0,50 mL de solución de permanganato de potasio (1 en
omitir la inversión del matraz si se enciende en un sistema cerrado. 25) y dejar en reposo durante 2 minutos. Agregar a cada tubo,
Una vez finalizada la combustión, agitar el matraz vigorosamente y mezclando, 0,50 mL de solución de peróxido de hidrógeno, con lo
dejarlo en reposo durante no menos de 10 minutos agitando cual el color del permanganato desaparecerá en 10 segundos. Agitar
intermitentemente. Luego proceder según se indica en la monografı́a vigorosamente los tubos hasta expulsar todo el exceso de oxı́geno.
individual o en el capı́tulo general. Cuando haya cesado la producción de espuma, eliminar las burbujas
de gas que queden en las paredes de los tubos por inclinación de los
tubos para que la solución fluya lentamente de un extremo a otro.
En un fluorofotómetro adecuado que tenga un filtro de entrada con
un estrecho intervalo de transmitancia y un máximo aproximada-
mente a 440 nm y un filtro de salida con un estrecho intervalo de
h481i VALORACIÓN DE transmitancia y un máximo aproximadamente a 530 nm, medir la
fluorescencia de todos los tubos y designar la lectura promedio de los
RIBOFLAVINA tubos que contienen solamente la Preparación de Valoración como
IU y el promedio de los tubos que contienen la Preparación de
Valoración y la Preparación Estándar como IS. Luego, a uno o más
tubos de cada tipo, agregar, mezclando, 20 mg de hidrosulfito de
El siguiente procedimiento es apropiado para las preparaciones sodio y medir nuevamente la fluorescencia a los 5 segundos;
donde la riboflavina es un elemento constitutivo de una mezcla de designar la lectura promedio como IB.
varios ingredientes. Al emplearlo, se debe mantener el pH de las Cálculo—Calcular la cantidad, en mg, de C17H20N4O6 en cada mL
soluciones por debajo de 7,0 y proteger las soluciones de la luz solar de la Preparación de Valoración tomado, por la fórmula:
directa en todo momento.
0,0001(IU – IB) / (IS – IU).
Calcular la cantidad, en mg, de C17H20N4O6 en cada cápsula o tableta.
1 *
Thomas Scientific, localizado en 99 High Hill Road, Swedesboro, NJ Las concentraciones de las soluciones de ácido clorhı́drico e hidróxido de
08085 provee un aparato [Números de Catálogo 6513-C20 (de 500 mL de sodio empleadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones
capacidad) y 6513-C30 (de 1000 mL de capacidad)] y cápsulas [Número de pueden variar según la cantidad de material tomado para la valoración, el
Catálogo 6513-84 (1000 cápsulas)] adecuados. volumen de la solución de prueba y el efecto amortiguador del material.
210 h501i Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas / Pruebas Quı́micas USP 30
los reactivos redox pueden servir como sus propios indicadores. Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar como ácidos
Igual que en cualquier tipo de volumetrı́a, el indicador ideal cambia están los ácidos de haluros, anhı́dridos de ácidos, ácidos carbo-
de color en un punto final que está lo más próximo posible al punto xı́licos, aminoácidos, enoles como barbituratos y xantinas, imidas,
de equivalencia. En consecuencia, cuando la solución volumétrica fenoles, pirroles y sulfonamidas. Entre los tipos de compuestos que
sirve como su propio indicador, la diferencia entre el punto final y el se pueden valorar como bases están las aminas, compuestos
punto de equivalencia sólo está determinada por la habilidad del heterocı́clicos que contienen nitrógeno, oxazolinas, compuestos de
analista para detectar el cambio de color. Un ejemplo común es el amonio cuaternario, sales alcalinas de ácidos orgánicos, sales
uso del ión permanganato como componente de una solución alcalinas de ácidos inorgánicos débiles y algunas sales de aminas.
volumétrica de oxidación ya que un leve exceso se puede detectar Muchas sales de ácidos halogenados se pueden valorar en ácido
por su color rosado. Otras soluciones volumétricas que pueden servir acético o anhı́drido acético después de agregar acetato de mercurio,
como sus propios indicadores son el yodo, las sales de cerio (IV) y el que elimina iones haluros formando un complejo de halógeno-
dicromato de potasio. En la mayorı́a de los casos, sin embargo, el mercurio sin ionizar e introduce el acetato ionizado.
uso de un indicador redox producirá un punto final mucho más Para la volumetrı́a de un compuesto básico se prefiere una
marcado. solución volumétrica de ácido perclórico en ácido acético glacial,
Puede ser necesario ajustar el estado de oxidación del analito antes aunque en casos especiales se usa ácido perclórico en dioxano. El
de la volumetrı́a mediante el uso de un agente oxidante o reductor sistema de electrodos de vidrio-calomel resulta útil en este caso. En
adecuado; después, el exceso de reactivo se debe eliminar, por ácido acético como disolvente, este sistema de electrodos funciona
ejemplo, mediante precipitación. Esta es casi siempre la práctica de acuerdo a la teorı́a.
habitual en la determinación de agentes oxidantes, ya que la mayorı́a Para la volumetrı́a de un compuesto ácido, se dispone de dos
de soluciones volumétricas de agentes reductores son oxidadas clases de soluciones volumétricas: los alcóxidos de metales alcalinos
lentamente por el oxı́geno atmosférico. y los hidróxidos de tetraalquilamonio. Con frecuencia se usa una
Valoraciones Volumétricas en Disolventes No Acuosos—Los solución volumétrica de metóxido de sodio en una mezcla de
ácidos y las bases han sido definidas durante mucho tiempo como metanol y tolueno, aunque en algunos casos, cuando se produce un
sustancias que cuando se disuelven en agua, proporcionan iones de precipitado gelatinoso con el metóxido de sodio, se emplea metóxido
hidrógeno e hidroxilo, respectivamente. Esta definición, introducida de litio en un disolvente de metanol-benceno.
por Arrhenius, no reconoce el hecho de que propiedades Cuando se emplean soluciones volumétricas de alcóxidos de
caracterı́sticas de los ácidos o las bases también se pueden metales alcalinos se produce un error alcalino que limita el empleo
desarrollar en otros disolventes. Una definición más generalizada de un electrodo de vidrio, en particular en disolventes básicos. El
es la de Brönsted, quien definió un ácido como una sustancia que electrodo indicador de antimonio, aunque algo errático, resulta útil
proporciona protones y una base como una sustancia que se combina en estos casos. El uso de hidróxidos de amonio cuaternario, por ej.,
con protones. Una definición aún más amplia es la de Lewis, quien el hidróxido de tetra-n-butilamonio y el hidróxido de trimetilhexa-
definió un ácido como cualquier sustancia que acepta un par de decilamonio (en benceno-metanol o alcohol isopropı́lico), presenta
electrones, una base como cualquier sustancia que dona un par de dos ventajas sobre las otras dos soluciones volumétricas: (a) la sal de
electrones y la neutralización como la formación de una unión de tetraalquilamonio del ácido valorado es soluble en el medio de
coordinación entre un ácido y una base. valoración y (b) se puede emplear un par de electrodos de vidrio
La fuerza aparente de un ácido o una base se determina por su calomel, de uso corriente en la mayorı́a de los laboratorios analı́ticos,
grado de reacción con un disolvente. En solución acuosa todos los para llevar a cabo valoraciones volumétricas potenciométricas.
ácidos fuertes parecen ser igualmente fuertes porque reaccionan con Debido a la interferencia producida por el dióxido de carbono, los
el disolvente para sufrir una conversión casi completa en el ión disolventes empleados en la valoración de sustancias ácidas se deben
oxonio y el anión del ácido (efecto nivelador). En un disolvente proteger de la exposición excesiva al aire atmosférico durante la
débilmente protófilo como el ácido acético, el grado de formación valoración mediante una protección adecuada o una atmósfera inerte.
del ión acidonio del acetato, indica que el orden decreciente de la La absorción de dióxido de carbono se puede determinar mediante la
fuerza para ácidos es perclórico, bromhı́drico, sulfúrico, clorhı́drico volumetrı́a con un blanco. El blanco no debe exceder más de 0,01
y nı́trico (efecto diferenciador). mL de metóxido de sodio SV 0,1 N por mL de disolvente.
El ácido acético reacciona de forma incompleta con el agua para El punto final se puede determinar visualmente por el cambio de
formar ión oxonio y por lo tanto es un ácido débil. En contraste, se color de un indicador, o potenciométricamente, según se especifique
disuelve en una base como etilendiamina y reacciona en forma tan en la monografı́a correspondiente. Si se usa un electrodo de calomel
completa con el disolvente que se comporta como un ácido fuerte. como referencia, es recomendable sustituir la solución acuosa de
Lo mismo es válido para el ácido perclórico. cloruro de potasio del puente salino con perclorato de litio 0,1 N en
Este efecto nivelador también se observa en el caso de las bases. ácido acético glacial para valoraciones en disolventes ácidos
En ácido sulfúrico, casi todas las bases parecen tener la misma o cloruro de potasio en metanol para valoraciones en disolventes
fuerza. A medida que las propiedades del disolvente disminuyen en básicos.
la serie constituida por ácido sulfúrico, ácido acético, fenol, agua, Cuando en la monografı́a correspondiente se indica el uso de estas
piridina y butilamina, las bases se vuelven progresivamente más u otras mezclas, el electrodo de calomel de referencia se modifica
débiles hasta que todas, excepto las más fuertes, pierden sus retirando en primer lugar la solución acuosa de cloruro de potasio y
propiedades básicas. En orden de fuerza decreciente, las bases más el cloruro de potasio residual, si lo hubiera, enjuagando con agua y
fuertes son 2-aminoetóxido de sodio, metóxido de potasio, metóxido luego eliminando el agua residual enjuagando con el disolvente no
de sodio y metóxido de litio. acuoso indicado y finalmente, llenando el electrodo con la mezcla no
Muchos compuestos insolubles en agua adquieren mejores acuosa indicada.
propiedades ácidas o básicas cuando se disuelven en disolventes En casi todos los casos, excepto en aquellos en los que el ión de
orgánicos. De esta manera, la elección del disolvente adecuado plata podrı́a interferir, el electrodo de calomel se puede sustituir por
permite la determinación de una variedad de tales sustancias un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. El electrodo de
mediante valoración en medios no acuosos. Además, dependiendo plata-cloruro de plata es más resistente y su uso ayuda a eliminar
de cual sea la parte fisiológicamente activa del compuesto, con sales de mercurio tóxicas del laboratorio. En general se puede utilizar
frecuencia es posible valorarla selectivamente, eligiendo el disol- un puente salino para evitar la interferencia del ión plata.
vente y el valorante adecuados. Los compuestos puros se pueden Los sistemas más útiles para volumetrı́a en disolventes no acuosos
valorar directamente, pero en preparaciones farmacéuticas a menudo se indican en la Tabla 1.
es necesario aislar el ingrediente activo de los excipientes y
vehı́culos que interfieran.
214 h541i Volumetrı́a / Pruebas Quı́micas USP 30
Indicadores y Detección Potenciométrica del Punto Final—El reaccionan no es igual al número de cationes que reaccionan, el
método más simple y conveniente para determinar el punto de punto final definido por la inflexión de la curva de volumetrı́a no
equivalencia, es decir, el punto en el que la reacción analı́tica ocurre exactamente en el punto de equivalencia estequiométrico. En
estequiométrica está terminada, es mediante el uso de indicadores. consecuencia, la detección potenciométrica del punto final mediante
Estas sustancias quı́micas, generalmente coloreadas, responden este método no es adecuada para reacciones asimétricas, como por
a cambios en la solución antes y después del punto de equivalencia ejemplo la reacción de precipitación,
presentando cambios de color que se pueden detectar visualmente
como el punto final de la reacción, lo que constituye una estimación 2Ag+ + CrO4–2
confiable del punto de equivalencia. y la reacción de óxido-reducción,
Un método útil de determinación del punto final es mediante
mediciones electroquı́micas. Si un electrodo indicador, sensible a la 5Fe+2 + MnO4–.
concentración de la especie sometida a la reacción volumétrica y un
electrodo de referencia cuyo potencial no es sensible a ninguna Todas las reacciones ácido-base, sin embargo, son simétricas. De
especie disuelta, se sumergen en la solución a valorar para formar este modo, la detección potenciométrica del punto final se puede
una celda galvánica, la diferencia de potencial entre los electrodos se emplear en valoraciones volumétricas ácido-base y en otras
puede medir con un medidor de pH que permite seguir el curso de la valoraciones volumétricas que comprendan reacciones simétricas
reacción. Cuando es posible graficar correctamente dichas series de reversibles donde se especifique un indicador, a menos que se
cambios (por ejemplo, para el caso de una valoración ácido-base, el indique lo contrario en la monografı́a correspondiente.
pH en función de los mL de solución volumétrica agregada; para Existen dos tipos de tituladores electrométricos. El primero agrega
valoraciones de precipitación, complejométricas o de óxido-reduc- la solución volumétrica automáticamente y registra las diferencias de
ción, los mV en función de los mL de solución volumétrica potencial del electrodo durante el curso de la titulación dando la
agregada), se obtiene una curva sigmoidea con una porción que curva sigmoidea esperada. En el segundo tipo, el agregado de
cambia rápidamente (punto de ‘‘ruptura’’) cerca del punto de solución volumétrica se lleva a cabo automáticamente hasta que se
equivalencia. El punto medio de esta porción vertical o punto de alcanza un potencial o pH preseleccionado, que representa el punto
inflexión se puede considerar como punto final. El punto de final y en ese momento cesa el agregado de solución volumétrica.
equivalencia también se puede determinar matemáticamente sin Varios sistemas de electrodos, apropiados para valoraciones
trazar una curva de valoración. Sin embargo, se debe tener en cuenta volumétricas potenciométricas, se resumen en la Tabla 2.
que en reacciones asimétricas en las que el número de aniones que
USP 30 Pruebas Quı́micas / h541i Volumetrı́a 215
Correcciones con un Blanco—Como se hizo notar anterior- la muestra en análisis se omite. En tales casos, el volumen real de
mente, el punto final determinado en una volumetrı́a es una solución volumétrica, equivalente a la sustancia analizada, es la
estimación del punto de equivalencia de la reacción. La validez de diferencia entre el volumen consumido en la valoración residual del
esta estimación depende, entre otros factores, de la naturaleza de las blanco y el consumido en la valoración de la muestra. El volumen
sustancias a valorar y de la concentración de la solución volumétrica. corregido que se obtiene de esta manera se utiliza para calcular la
Para aumentar la confiabilidad de la determinación del punto final en cantidad de sustancia valorada, de la misma manera que se indica en
valoraciones volumétricas, se realiza una corrección con un blanco Valoraciones volumétricas residuales. Cuando el punto final se
adecuado. Dicha corrección con un blanco se obtiene habitualmente determina potenciométricamente, la corrección del blanco en general
mediante una valoración residual del blanco, en la que el es inapreciable.
procedimiento indicado se repite en todos los detalles excepto que
216 h551i Valoración de Alfa Tocoferol / Pruebas Quı́micas USP 30
Tabla 2. Cálculo de dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente Cu2O) (Expresado en mg)
Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa Óxido Dextrosa
cuproso (D-Glu- cuproso (D-Glu- cuproso (D-Glu- cuproso (D-Glu- cuproso (D-Glu- cuproso (D-Glu-
(Cu2O) cosa) (Cu2O) cosa) (Cu2O) cosa) (Cu2O) cosa) (Cu2O) cosa) (Cu2O) cosa)
10 4,0 90 38,9 170 75,1 250 112,8 330 152,2 410 193,7
12 4,9 92 39,8 172 76,0 252 113,7 332 153,2 412 194,7
14 5,7 94 40,6 174 76,9 254 114,7 334 154,2 414 195,8
16 6,6 96 41,5 176 77,8 256 115,7 336 155,2 416 196,8
18 7,5 98 42,4 178 78,8 258 116,6 338 156,3 418 197,9
20 8,3 100 43,3 180 79,7 260 117,6 340 157,3 420 199,0
22 9,2 102 44,2 182 80,6 262 118,6 342 158,3 422 200,1
24 10,0 104 45,1 184 81,5 264 119,5 344 159,3 424 201,1
26 10,9 106 46,0 186 82,5 266 120,5 346 160,3 426 202,2
28 11,8 108 46,9 188 83,4 268 121,5 348 161,4 428 203,3
30 12,6 110 47,8 190 84,3 270 122,5 350 162,4 430 204,4
32 13,5 112 48,7 192 85,3 272 123,4 352 163,4 432 205,5
34 14,3 114 49,6 194 86,2 274 124,4 354 164,4 434 206,5
36 15,2 116 50,5 196 87,1 276 125,4 356 165,4 436 207,6
38 16,1 118 51,4 198 88,1 278 126,4 358 166,5 438 208,7
40 16,9 120 52,3 200 89,0 280 127,3 360 167,5 440 209,8
42 17,8 122 53,2 202 89,9 282 128,3 362 168,5 442 210,9
44 18,7 124 54,1 204 90,9 284 129,3 364 169,6 444 212,0
46 19,6 126 55,0 206 91,8 286 130,3 366 170,6 446 213,1
48 20,4 128 55,9 208 92,8 288 131,3 368 171,6 448 214,1
50 21,3 130 56,8 210 93,7 290 132,3 370 172,7 450 215,2
52 22,2 132 57,7 212 94,6 292 133,2 372 173,7 452 216,3
54 23,0 134 58,6 214 95,6 294 134,2 374 174,7 454 217,4
56 23,9 136 59,5 216 96,5 296 135,2 376 175,8 456 218,5
58 24,8 138 60,4 218 97,5 298 136,2 378 176,8 458 219,6
60 25,6 140 61,3 220 98,4 300 137,2 380 177,9 460 220,7
62 26,5 142 62,2 222 99,4 302 138,2 382 178,9 462 221,8
64 27,4 144 63,1 224 100,3 304 139,2 384 180,0 464 222,9
66 28,3 146 64,0 226 101,3 306 140,2 386 181,0 466 224,0
68 29,2 148 65,0 228 102,2 308 141,2 388 182,0 468 225,1
70 30,0 150 65,9 230 103,2 310 142,2 390 183,1 470 226,2
72 30,9 152 66,8 232 104,1 312 143,2 392 184,1 472 227,4
74 31,8 154 67,7 234 105,1 314 144,2 394 185,2 474 228,3
76 32,7 156 68,6 236 106,0 316 145,2 396 186,2 476 229,6
78 33,6 158 69,5 238 107,0 318 146,2 398 187,3 478 230,7
80 34,4 160 70,4 240 108,0 320 147,2 400 188,4 480 231,8
82 35,3 162 71,4 242 108,9 322 148,2 402 189,4 482 232,9
84 36,2 164 72,3 244 109,9 324 149,2 404 190,5 484 234,1
86 37,1 166 73,2 246 110,8 326 150,2 406 191,5 486 235,2
88 38,0 168 74,1 248 111,8 328 151,2 408 192,6 488 236,3
de que la porción tomada sea representativa de la Muestra de Solución de Aflatoxinas—[Precaución—Las aflatoxinas son muy
Laboratorio. Determinar el contenido de agua según se indica en tóxicas. Manipular con cuidado.] Disolver cantidades pesadas con
Procedimiento para Artı́culos de Origen Botánico Método III exactitud de aflatoxina B1, aflatoxina B2, aflatoxina G1 y aflatoxina
(Gravimétrico) en Determinación de Agua h921i. G2 en una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8 : 0,2) para obtener
una solución con concentraciones de 0,5 mg por mL de aflatoxina B1
y aflatoxina G1, y 0,1 mg por mL de aflatoxina B2 y aflatoxina G2.
PRUEBA DE AFLATOXINAS Procedimiento—Aplicar por separado 2,5 mL, 5 mL, 7,5 mL y 10
mL de la Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 10 mL de la
Precaución—Las aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se Solución de Prueba 1 o de la Solución de Prueba 2 a una placa
debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales de adecuada para cromatografı́a en capa delgada (ver Cromatografı́a
aflatoxinas. h621i) recubierta con una capa de 0,25 mm de mezcla de gel de
Esta prueba se suministra para detectar la posible presencia de sı́lice para cromatografı́a. Superponer 5 mL de la Solución de
aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 en cualquier material de origen vegetal. A Aflatoxinas a una de las tres aplicaciones de 10 mL de la Solución de
menos que se especifique algo diferente en la monografı́a individual, Prueba. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el
usar el método siguiente. cromatograma en una cámara no saturada que contenga una fase
Reactivo de Acetato de Cinc–Cloruro de Aluminio—Disolver móvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y alcohol
20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua isopropı́lico (85 : 10 : 5) hasta que el frente de la fase móvil haya
suficiente para obtener 100 mL. recorrido no menos de 15 cm desde el origen. Retirar la placa de la
Solución de Cloruro de Sodio—Disolver 5 g de cloruro de sodio cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la
en 50 mL de agua. placa se seque al aire. Localizar las manchas en la placa bajo luz UV
a 365 nm: las cuatro aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas
Solución de Prueba 1—Moler aproximadamente 200 g de aparecen como cuatro manchas fluorescentes azules claramente
material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproximada- separadas. Las manchas obtenidas de la Solución de Prueba que se
mente 50 g pesados con exactitud de material en polvo a un matraz superpuso a la Solución de Aflatoxinas no son más intensas que la
con tapón de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de metanol y que corresponden a la Solución de Aflatoxinas, y ninguna mancha de
agua (17 : 3). Agitar vigorosamente por medios mecánicos durante las demás Soluciones de Prueba se corresponden con las manchas
no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTA—Si la solución contiene obtenidas a partir de las aplicaciones de la Solución de Aflatoxina. Si
pigmentos vegetales interferentes, proceder según se indica para la se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solución de Prueba,
Solución de Prueba 2.] Desechar los primeros 50 mL del filtrado y comparar la posición de cada mancha fluorescente de la Solución de
recoger la porción siguiente de 40 mL. Transferir el filtrado a un Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo
embudo de separación. Agregar 40 mL de Solución de Cloruro de de aflatoxina presente. Obtener una concentración aproximada de la
Sodio y 25 mL de éter de petróleo, y agitar durante 1 minuto. aflatoxina en la Solución de Prueba, si estuviera presente, por
Permitir que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior comparación de la intensidad de su mancha, con las de la aflatoxina
a un segundo embudo de separación. Extraer dos veces la capa correspondiente en las aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas.
acuosa en el embudo de separación, cada vez con 25 mL de cloruro
de metileno, agitando durante 1 minuto. Permitir que las capas se
separen cada vez, separar la capa orgánica inferior y recoger las
capas orgánicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. MÉTODO GENERAL PARA ANÁLISIS DE
Evaporar el disolvente orgánico hasta sequedad en un baño de agua. RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder
según se indica para Procedimiento de Limpieza; de lo contrario, Definición—Siempre que se emplee en esta Farmacopea, la
disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla denominación de plaguicida se aplica a cualquier sustancia o mezcla
de cloroformo y acetonitrilo (9,8 : 0,2) y agitar mecánicamente si de sustancias destinadas a evitar, destruir o controlar especies de
fuera necesario. plantas o animales no deseados que provocan daños durante la
Solución de Prueba 2—Obtener 100 mL de filtrado del inicio del producción, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la
flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 mL. Agregar 20 comercialización de artı́culos puros, o que interfieren de algún otro
mL de Reactivo de Acetato de Cinc–Cloruro de Aluminio y 80 mL modo con estos procesos. La denominación incluye sustancias
de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Agregar 5 g elaboradas para ser usadas como reguladores de crecimiento,
de un coadyuvante de filtración adecuado, como por ejemplo tierra defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los
de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar los primeros 50 mL del cultivos antes o después de la cosecha para proteger el producto del
filtrado y recoger la porción siguiente de 80 mL. Proceder según se deterioro durante el almacenamiento y el transporte.
indica para la Solución de Prueba 1, empezando por donde dice Lı́mites—Dentro de los Estados Unidos, muchos productos
‘‘Transferir el filtrado a un embudo de separación.’’ botánicos se tratan como suplementos dietéticos, y por lo tanto,
Procedimiento de Purificación—Colocar un disco de vidrio dentro de la Ley Federal sobre Alimentos, Medicamentos y
sinterizado de porosidad media o un tapón de lana de vidrio en el Productos Cosméticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act),
fondo de un tubo cromatográfico de 10 mm 6 300 mm. Preparar están sujetos a las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los
una suspensión espesa de 2 g de gel de sı́lice con una mezcla de éter alimentos, y no a las que rigen sobre los medicamentos. La Agencia
etı́lico y éter de petróleo (3 : 1), verter la suspensión espesa en la de Protección del Medio Ambiente (EPA - Environmental Protection
columna y lavar con 5 mL de la misma mezcla de disolventes. Dejar Agency) determina los lı́mites para los plaguicidas en alimentos, y
que el adsorbente sedimente y agregar a la parte superior de la cuando no se establece ningún lı́mite, el lı́mite es cero. Por lo tanto,
columna una capa de 1,5 g de sulfato de sodio anhidro. Disolver el los lı́mites aquı́ detallados no son válidos en los Estados Unidos
residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y cuando los artı́culos de orı́gen botánico están etiquetados para fines
transferir a la columna. Enjuagar el matraz dos veces con porciones alimentarios. Sin embargo, los lı́mites se pueden aplicar en otros
de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna paı́ses donde se permite la presencia de residuos de plaguicidas. A
y eluir a una velocidad de no más de 1 mL por minuto. Agregar menos que se especifique algo diferente en la monografı́a individual,
sucesivamente a la columna 3 mL de éter de petróleo, 3 mL de éter el artı́culo en análisis contiene una cantidad no mayor que la de
etı́lico y 3 mL de cloruro de metileno, eluir a una velocidad de no cualquier plaguicida indicado en la Tabla 3. Los lı́mites aplicables
más de 3 mL por minuto y desechar los eluatos. Agregar a la a los plaguicidas que no se detallan en la Tabla 3 y cuya presencia se
columna 6 mL de una mezcla de cloruro de metileno y acetona (9 : 1) sospecha por alguna razón, cumplen con los reglamentos de la EPA.
y eluir a una velocidad de no más de 1 mL por minuto, Si un plaguicida no está incluido en la Tabla 3 ni en los reglamentos
preferentemente sin la ayuda de vacı́o. Recoger este eluato en un de la EPA, calcular el lı́mite de acuerdo con la fórmula:
vial pequeño, agregar una perla de ebullición si fuera necesario y
evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Disolver el residuo en AM / 100B,
0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8 : 0,2) y agitar en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), en mg por kg, de
mecánicamente si fuera necesario. peso corporal; M es el peso corporal, en kg; y B es la dosis diaria del
artı́culo, en kg.
222 h561i Artı́culos de Origen Botánico / Pruebas Quı́micas USP 30
Purificación— Tabla 5
Insecticidas Organoclorados, Organofosforados y Piretroides— Tiempo de Retención
Equipar un cromatógrafo de lı́quidos con una columna de exclusión Sustancia Relativo
por tamaño de acero inoxidable de 7,8 mm 6 30 cm rellena con
material L21 de 5 mm. El tolueno se usa como fase móvil a una Diclorvos 0,20
velocidad de flujo de aproximadamente 1 mL por minuto. Fonofos 0,50
Funcionamiento de la Columna—Inyectar 100 mL de una solución Diazinón 0,52
de tolueno que contenga, en cada mL, 0,5 mg de rojo de metilo y 0,5 Paratión-metı́lico 0,59
mg de azul de oracet. La columna no es adecuada a menos que el Clorpirifos-metı́lico 0,60
color de los eluatos cambie de naranja a azul en un volumen de Pirimifos-metı́lico 0,66
elución de aproximadamente 10,3 mL. Calibrar la columna, si fuera Malatión 0,67
necesario, usando una solución en tolueno que contenga concen- Paratión 0,69
traciones adecuadas del plaguicida de interés que tenga el menor Clorpirifos 0,70
peso molecular (por ejemplo, diclorvos) y del que tenga el mayor Metidatión 0,78
peso molecular (por ejemplo, deltametrina). Determinar qué fracción Etión 0,96
del eluato contiene ambos plaguicidas. Carbofenotión 1,00
Azinfos-metı́lico 1,17
Purificación de la Solución de Prueba—Inyectar un volumen Fosalona 1,18
adecuado (100 mL a 500 mL) de Solución A en el cromatógrafo.
Recoger la fracción (Solución B) según se indica más arriba en
Funcionamiento de la Columna. Los plaguicidas organofosforados Análisis Cuantitativo de Insecticidas Organoclorados y
eluyen entre 8,8 mL y 10,9 mL. Los plaguicidas organoclorados y Piretroides—
piretroides eluyen entre 8,5 mL y 10,3 mL. Solución de Prueba—Concentrar la Solución C casi hasta
Insecticidas Organoclorados y Piretroides—En una columna sequedad, con la ayuda de un flujo de helio o nitrógeno sin oxı́geno,
cromatográfica de 5 mm 6 10 cm, introducir una pieza de algodón diluir con tolueno a 500 mL y mezclar.
desengrasada y 0,5 g de gel de sı́lice tratado del siguiente modo. Solución Estándar—Preparar al menos tres soluciones en tolueno
Calentar el gel de sı́lice para cromatografı́a en un horno a 1508 que contengan cada uno de los plaguicidas de interés y carbofenotión
durante no menos de 4 horas. Dejar enfriar y agregar gota a gota una en concentraciones adecuadas para graficar una curva de calibración.
cantidad de agua correspondiente a 1,5% del peso del gel de sı́lice
usado. Agitar vigorosamente hasta que desaparezcan los aglomera- Sistema cromatográfico—El cromatógrafo de gases está equipado
dos y continuar agitando mecánicamente durante 2 horas. Acondi- con un detector de captura de electrones, un dispositivo que permite
cionar la columna con 1,5 mL de hexano. [NOTA—También se la inyección directa en frı́o en la columna, y una columna de sı́lice
pueden usar columnas previamente rellenas que contengan aproxi- fundida de 0,32 mm 6 30 m recubierta con una capa de 0,25 mm de
madamente 0,50 g de un gel de sı́lice adecuado, siempre que hayan fase estacionaria G1. Usar hidrógeno como gas transportador.
sido validadas con antelación.] Concentrar la Solución B casi hasta También se pueden usar otros gases, como helio o nitrógeno.
sequedad, con la ayuda de un flujo de helio o nitrógeno sin oxı́geno, Mantener la temperatura del inyector a 2758 y la del detector, a 3008.
y diluir con tolueno a un volumen adecuado (200mL a 1 mL, de Mantener la temperatura de la columna a 808 durante 1 minuto,
acuerdo con el volumen inyectado en la preparación de la Solución luego aumentarla a 1508 a una velocidad de 308 por minuto,
B). Transferir cuantitativamente esta solución a la columna y mantener a 1508 durante 3 minutos y, a continuación, aumentar
proceder con la cromatografı́a usando 1,8 mL de tolueno como fase a 2808 a una velocidad de 48 por minuto y mantener a esta
móvil. Recoger el eluato (Solución C). temperatura durante 1 minuto. Usar carbofenotión como estándar
interno. [NOTA—Si fuera necesario, usar un segundo estándar interno
Análisis Cuantitativo de Insecticidas Organofosforados— para identificar cualquier posible interferencia con el pico corres-
Solución de Prueba—Concentrar la Solución B casi hasta pondiente a carbofenotión.] Inyectar el volumen elegido de cada
sequedad, con la ayuda de un flujo de helio, diluir con tolueno solución y registrar las respuestas correspondientes a los picos: los
a 100 mL y mezclar. tiempos de retención relativos son aproximadamente los que se
Solución Estándar—Preparar al menos tres soluciones en tolueno detallan en la Tabla 6. Calcular el contenido de cada plaguicida
que contengan cada uno de los plaguicidas de interés y carbofenotión a partir de las áreas correspondientes a los picos y las concen-
en concentraciones adecuadas para graficar una curva de calibración. traciones de las soluciones.
Sistema Cromatográfico—Equipar un cromatógrafo de gases con
un detector de ionización a la llama alcalina o un detector de Tabla 6
fotometrı́a a la llama y una columna de sı́lice fundida de 0,32 mm
6 30 m recubierta con una capa de 0,25 mm de fase estacionaria G1. Tiempo de Retención
Usar hidrógeno como gas transportador. También se pueden usar Sustancia Relativo
otros gases, como helio o nitrógeno. La temperatura del inyector se a-Hexaclorociclohexano 0,44
mantiene a 2508 y la del detector, a 2758. Mantener la temperatura de Hexaclorobenceno 0,45
la columna a 808 durante 1 minuto, luego aumentarla a 1508 a una b-Hexaclorociclohexano 0,49
velocidad de 308 por minuto, mantener a 1508 durante 3 minutos y, Lindano 0,49
a continuación, aumentar a 2808 a una velocidad de 48 por minuto y d-Hexaclorociclohexano 0,54
mantener a esta temperatura durante 1 minuto. Usar carbofenotión E-Hexaclorociclohexano 0,56
como estándar interno. [NOTA—Si fuera necesario, usar un segundo Heptaclor 0,61
estándar interno para identificar cualquier posible interferencia con el Aldrina 0,68
pico correspondiente a carbofenotión.] Inyectar el volumen elegido cis-Heptaclor epóxido 0,76
de cada solución y registrar las respuestas correspondientes a los o, p’-DDE 0,81
picos: los tiempos de retención relativos son aproximadamente los a-Endosulfán 0,82
que se detallan en la Tabla 5. Calcular el contenido de cada Dieldrina 0,87
plaguicida a partir de las áreas correspondientes a los picos y las p, p’-DDE 0,87
concentraciones de la solución. o, p’-DDD 0,89
Endrina 0,91
b-Endosulfán 0,92
o, p’-DDT 0,95
Carbofenotión 1,00
p, p’-DDT 1,02
cis-Permetrina 1,29
trans-Permetrina 1,31
Cipermetrina* 1,40
224 h563i Identificación de Artı́culos de Origen Botánico / Pruebas Quı́micas USP 30
IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
Tabla 6 (Continuación)
La identificación botánica de las materias primas vegetales que se
Tiempo de Retención emplean en la fabricación de productos farmacéuticos, excipientes,
Relativo o suplementos dietéticos consiste en determinar las caracterı́sticas
Sustancia macroscópicas e histológicas (microscópicas) de la parte de la planta,
Fenvalerato* 1,47 como por ejemplo, raı́z, tallo, hoja, flor, fruto o semilla, que se
1,49 utilizan en la fabricación del artı́culo. La identificación puede incluir
Deltametrina 1,54 también la inspección de las caracterı́sticas organolépticas del tejido
vegetal, como la presencia o ausencia de un olor caracterı́stico. Las
*
La sustancia muestra varios picos. monografı́as oficiales individuales pueden incluir información
botánica de posibles especies adulterantes para asegurar su ausencia
en la materia prima. Para identificar adecuadamente la planta, el
órgano o el tejido vegetal, es necesario tener un conocimiento básico
de anatomı́a vegetal.
Las flores son las mejores caracterı́sticas morfológicas diagnós- Procedimiento General—Las muestras vegetales se observan
ticas de cualquier planta de flores y la estructura floral es el criterio bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes medios de
principal que se usa en taxonomı́a vegetal. Las caracterı́sticas montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta
diagnósticas de las flores comprenden el tipo de inflorescencia; la identificación del artı́culo de prueba. Si se dispone de un Material de
presencia, el número y el aspecto de las partes florales principales Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos
(sépalos, pétalos, estambres y carpelos); el tipo de simetrı́a que medios de montaje o soluciones reactivo utilizados para el artı́culo
presentan las partes florales; la posición relativa de los ovarios con de prueba. Colocar una o dos gotas de agua, Solución de Alcohol–
respecto a las demás partes de la flor; el número de óvulos por Glicerina, Solución de Hidrato de Cloral, u otra solución reactivo en
ovario; el tipo de placentación del ovario; el aspecto fı́sico de los el centro de un portaobjetos limpio (ver Preparación y Uso de
granos de polen; la presencia de nectarios, la presencia de Soluciones Reactivo, Dispositivos Ópticos y Medios de Montaje).
recubrimientos o tricomas glandulares; y caracterı́sticas fı́sicas de Transferir una pequeña sección de tejido vegetal o una porción de
226 h563i Identificación de Artı́culos de Origen Botánico / Pruebas Quı́micas USP 30
y las sustancias intercelulares y permite observar fácilmente las Solución de Tetróxido de Osmio—Disolver 0,1 g de tetróxido de
paredes y las formas celulares. Se puede utilizar para ayudar a la osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar de 1 a 2 gotas de la
identificación de súber, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio solución ası́ obtenida al material vegetal: los aceites esenciales, los
(con ayuda de polarizadores cruzados), tricomas, estomas y polen. aceites grasos y otros lı́pidos, los taninos y los cuerpos proteicos
Polarizadores Cruzados—Este dispositivo óptico se emplea para adquieren un color marrón a negro.
detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidón Solución de Floroglucinol–Ácido Clorhı́drico—Esta solución se
(amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de utiliza para la identificación de la lignina y otros derivados de
calcio y los granos de almidón aparecen como objetos brillantes, hidroxifenilpropano, tejidos lignificados como esclereidas, vasos,
birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidón fibras y células pétreas y parénquima lignificado. Humedecer el
observados bajo la luz polarizada también presentan el efecto de la polvo o la muestra cortada con floroglucinol SR y dejar que se seque
cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los durante 2 a 3 minutos antes de colocar el cubreobjetos. Agregar
cristales de oxalato de calcio se ven mejor después de clarificar la algunas gotas de solución de ácido clorhı́drico al 25% y cubrir con el
muestra con Solución de Hidrato de Cloral u otro agente clarificante. cubreobjetos. Las paredes de las células lignificadas se tornan de
Ácido Acético Diluido—Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal color rojo carmı́n. [NOTA—Este colorante no es estable.] Las células
y observar inmediatamente bajo un microscopio: los depósitos de que presentan derivados de hidroxifenilpropano, como vainillina y
carbonato de calcio se disuelven con efervescencia. ácido ferúlico, también se tornan de color rojo. Alternativamente, los
Solución de Cloruro Férrico—Diluir 1 mL de cloruro férrico SR derivados del hidroxifenilpropano se pueden extraer del material
con 9 mL de agua. Para la detección de grupos hidroxilo fenólicos, vegetal y luego éste puede ser examinado. Para extraer los derivados
como taninos y flavonoides, agregar la solución a la muestra acuosa del hidroxifenilpropano, sumergir repetidamente en alcohol el
desde la parte lateral del cubreobjetos: los taninos y otros polifenoles material sin tratar, mezclar en un mezclador por vórtice, centrifugar
adquieren un color de negro azulado a verde. y desechar el alcohol entre los lavados. A continuación tratar el
material vegetal según la especificación provista anteriormente,
Glicerina—Usar como medio de montaje para evitar que las comenzando con el agregado de floroglucinol SR.
soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen.
Solución de Hidróxido de Potasio 1 M—Agregar 1 gota al material
Solución de Glicerina–Alcohol—Mezclar volúmenes iguales de vegetal: las células que contienen 1,8-dihidroxiantraquinonas se
glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje. tiñen de rojo.
Mezcla de Glicerina–Gelatina—Agregar 10,0 g de gelatina en Solución de Rojo de Rutenio—Agregar algunas gotas de hidróxido
polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y agregar 70 de amonio a rojo de rutenio SR. [NOTA—Almacenar esta solución
mL de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un protegiéndola de la luz.] Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal:
baño de agua y filtrar a través de un embudo precalentado que las membranas celulares que contienen pectina, mucı́lago ácido y
contenga lana de vidrio. La mezcla filtrada se licúa antes de usar y fitoglicógeno se tornan de color rojo.
sirve como medio de montaje. Agregar algunas gotas al material
vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos Solución de Hipoclorito de Sodio—Esta solución se usa para
calentado. Esta preparación se utiliza para el almacenamiento blanquear profundamente los cortes coloreados. Sumergir el material
a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del vegetal en la solución durante algunos minutos hasta que
cubreobjetos se pueden sellar con bálsamo de Canadá después de esté suficientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua, y
algunos meses de secado. montar con un agente de montaje adecuado. [NOTA—El hipoclorito
de sodio extraerá la lignina; el tejido vegetal tratado de esta manera
Ácido Yodhı́drico—Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal: las dará un resultado negativo para lignina.]
paredes celulares de celulosa adquieren un color azul a violeta
azulado. Solución de Sudán III—Disolver 0,5 g de Sudán III en 50 mL de
alcohol o alcohol isopropı́lico con ebullición a reflujo. Enfriar, filtrar
Solución de Yodo—Agregar de 1 a 2 gotas de yodo 0,1 N SR al y agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 1 a 2 gotas de esta solución
material vegetal: las partı́culas de almidón adquieren de un color azul al polvo vegetal: los aceites esenciales, las ceras, la cutina, la
oscuro a violeta azulado; esta reacción es reversible si se calienta. suberina, los aceites grasos y otros lı́pidos se combinan con este
[NOTA—Las proteı́nas, los lı́pidos y la celulosa se tornan amarillos de colorante lipofı́lico y adquieren de un color rojo anaranjado a un
color marrón; y las partı́culas de polvo de guayaco se tornan de verde color rojo después de un perı́odo corto.
a azul, pero este reactivo no se usa para la identificación diagnóstica
de estas caracterı́sticas.] Solución de Tionina—Preparar una solución de acetato de tionina
al 0,2% en 25 por ciento de alcohol. Sumergir la muestra seca en esta
Solución de Yodo–Glicerina—Disolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de solución. Después de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso
yoduro de potasio en una pequeña cantidad de agua y agregar 10 mL de colorante con alcohol al 25 por ciento: el mucı́lago se
de una mezcla de glicerina y agua (1 : 1). Agregar de 1 a 2 gotas al habrá hinchado formando glóbulos esféricos y se habrá tornado de
material vegetal en polvo: las muestras que contienen saponinas color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la pectina y los
forman grumos o agregados de color amarillo. Si la prueba de una tabiques lignificados se tornarán de color azul o violeta azulado.
muestra diera un resultado positivo para saponina, el resultado se
debe confirmar realizando una prueba a la muestra con la Mezcla de Solución de Azul de Toluidina—Utilizando azul de toluidina,
Sangre–Gelatina también. proceder según se indica en Solución de Tionina.
Solución de Lactocloral—Disolver 50,0 g de hidrato de cloral en Reactivo Universal—
SOLUCIÓN A—Diluir 20 mL de una solución de Sudán III saturada
50 mL de ácido láctico, calentando suavemente. Agregar algunas
gotas al material vegetal. Colocar el portaobjetos del microscopio en con ácido láctico con 30 mL de ácido láctico.
SOLUCIÓN B—Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de
un pequeño desecador al vacı́o, si fuera necesario, para eliminar las
burbujas de aire. La Solución de Hidrato de Cloral y la Solución de agua.
SOLUCIÓN C—Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de
Lactocloral se utilizan para el mismo tipo de identificación, excepto
que la Solución de Lactocloral es un agente clarificante más fuerte y yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol.
PROCEDIMIENTO—Combinar la Solución A, la Solución B y la
se la usa para el material vegetal que es más difı́cil de clarificar.
Solución C y agregar mezclando 2,5 mL de ácido clorhı́drico.
Solución de Lactofenol—Mezclar 20 g de ácido láctico, 40 g de [NOTA—La solución se usa sin filtrar.] Para la identificación, agregar
glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar. Éste es de 2 a 3 gotas a la muestra y calentar a ebullición moderada sobre
un agente clarificante fuerte adecuado para el examen de granos de una llama pequeña. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades
polen. pequeñas de Reactivo Universal durante la ebullición. Cubrir con el
Solución de Naftol–Ácido Sulfúrico—Preparar una solución al cubreobjetos: los elementos lignificados se tornan de color amarillo,
20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota de la suberina de color marrón rojizo, los lı́pidos de color rojo y el
solución de 1-naftol y 1 gota de ácido sulfúrico: los cristales de almidón de color violeta azulado.
inulina adquieren un color rojo amarronado y luego se disuelven. Agua—Usar como medio de montaje. [NOTA—Todos los grados de
agua son aceptables para este propósito.]
228 h563i Identificación de Artı́culos de Origen Botánico / Pruebas Quı́micas USP 30
Solución de Cloruro de Cinc–Yodo—Disolver 20,0 g de cloruro de Usar el corte transversal del tejido foliar ası́ obtenido para
cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua. Agregar 0,5 g determinar la relación de mesófilo en empalizada. Alternativamente,
de Yodo 0,1 N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera calentar a ebullición fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm2
necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con protección en Solución de Hidrato de Cloral, montar, cubrir con un
actı́nica. Agregar de 1 a 2 gotas al material vegetal y dejar en cubreobjetos y observar bajo un microscopio. Identificar grupos de
reposo durante algunos minutos: las paredes celulares de celulosa se cuatro células epidérmicas adaxiales, y contar las células de mesófilo
tiñen de color azul a violeta azulado. en empalizada que se extiendan por debajo y estén cubiertas al
Preparación de Montajes Temporales y Cortes Manuales— menos en el 50% por las células epidérmicas. Este valor dividido
Cuando se use el tejido vegetal seco, empapar o calentar a ebullición entre 4 es la relación de mesófilo en empalizada. Determinar la
moderada en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande relación de mesófilo en empalizada de al menos 10 grupos de células
demasiado. El material se puede tratar entonces como material epidérmicas y calcular un valor medio. La relación de mesófilo en
vegetal fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje empalizada también se puede determinar en material foliar en polvo.
o soluciones reactivo indicadas para usar con plantas en polvo para Para hacer un corte transversal de tallos o raı́ces gruesas, u otras
ayudar a visualizar las caracterı́sticas del tejido (ver Preparación y partes gruesas de la planta, incluidos los tejidos leñosos, sostener el
Uso de Soluciones Reactivo, Dispositivos Ópticos y Medios de tejido con una mano y utilizando una cuchilla afilada revestida de
Montaje). teflón, previamente humedecida con agua, rebanar un corte
Para sacar una pelı́cula epidérmica de la hoja, pétalo, sépalo, transversal del apéndice. Montar en agua, otro medio o solución
bráctea u otro apéndice similar a la hoja, enrollar el tejido en un reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y examinar al
cilindro y hacer una muesca con una cuchilla afilada, revestida de microscopio. En general, con un poco de práctica se pueden hacer
teflón, que haya sido humedecida con agua. Con una pinza tomar el cortes que sean lo suficientemente delgados como para determinar la
trozo de tejido cortado y tirando hacia atrás, remover un corte organización vascular, el tipo de rayos, la distribución del
transparente de la epidermis. Montar en agua sobre un portaobjetos, parénquima, la presencia de cristales y similares.
colocar un cubreobjetos sobre el tejido y examinarlo en el Maceración—Para la adecuada identificación del material
microscopio. Si resulta difı́cil obtener una pelı́cula epidérmica vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus células
mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. individuales antes del examen microscópico. Esta técnica puede ser
Empapar el tejido en una solución de ácido nı́trico entre 40% y 60%, particularmente útil para tejidos leñosos u otros tejidos duros. El
a 608 durante 3 a 4 minutos o hasta que la epidermis se pueda pelar material se corta en pequeños trozos de aproximadamente 2 mm de
con facilidad. La pelı́cula epidérmica después se lava en agua de tres grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos de aproximadamente
a cinco veces para eliminar el exceso de ácido nı́trico. Neutralizar el 1 mm de grosor. Según la naturaleza de la pared celular, se emplea
tejido en una solución de hidróxido de potasio al 1% o una solución uno de los métodos siguientes. Para tejidos duros o muy lignificados,
de hidróxido de sodio al 1%. Lavar nuevamente el tejido con agua, usar el Método I. Para tejidos que no están muy lignificados, usar el
montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre Método II.
el tejido y examinarlo en el microscopio. Método I—
Un método alternativo para preparar tejido vegetal para el examen SOLUCIÓN A—Usar solución de ácido nı́trico 4 N.
de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja (aproximada- SOLUCIÓN B—Preparar una mezcla de solución de trióxido de
mente 5 mm 6 5 mm) durante 15 minutos en Solución de Hidrato cromo 1,2 M y ácido sulfúrico (7 : 4).
de Cloral en un baño de agua. Transferir el tejido a un portaobjetos, PROCEDIMIENTO—Colocar el material vegetal en un tubo de
agregar una gota de agua y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de la
emplear estos procedimientos para determinar el tipo, la distribución Solución A y de la Solución B (1 : 1). Calentar en un baño de agua
y el número de estomas, al igual que el ı́ndice estomático. durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir
El número de estomas se determina contando el número de a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de disección,
estomas por unidad de superficie de un campo microscópico. agregar de 1 a 2 gotas de medio de montaje, cubrir con un
Determinar el número de estomas en al menos 10 sitios diferentes de cubreobjetos y examinar bajo un microscopio. Si fuera necesario, las
la muestra y calcular un valor medio. Registrar la superficie foliar células se pueden separar más entre sı́ al presionar el cubreobjeto con
que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dará un
el número de estomas de las distintas superficies es muy diferente. resultado negativo en la prueba para lignina.
Para calcular el ı́ndice estomático, la muestra se observa bajo un Método II—
microscopio con poco aumento. El tamaño de la superficie se define PROCEDIMIENTO—Colocar el material vegetal en un tubo de
con un micrómetro ocular calibrado y se determina el número de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solución de
estomas y el número de células epidérmicas para esa superficie. El hidróxido de potasio 2 M. Calentar en un baño de agua durante 30
ı́ndice estomático se calcula mediante la fórmula: minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transferir a un
100S/(E + S), portaobjetos. Agregar de 1 a 2 gotas de medio de montaje. Colocar
un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo, aplastando el
en donde S es el número de estomas para una superficie determinada; tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dará un
y E es el número de células epidérmicas de la misma superficie. resultado negativo en la prueba para lignina.
Determinar el ı́ndice estomático en al menos 10 sitios diferentes de la Preparación de Materiales en Polvo—Colocar una o dos gotas
muestra y calcular el valor medio. Nuevamente registrar la superficie de agua, otro medio de montaje o una solución reactivo en el centro
foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con de un portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de
frecuencia los ı́ndices estomáticos de las distintas superficies son disección con agua y sumergir en el polvo sometido a prueba.
muy diferentes. Transferir una pequeña cantidad de material que se adhiera a la aguja
Para hacer un corte transversal de una hoja o raı́ces delgadas, al lı́quido en el portaobjetos y mezclar bien con mucho cuidado.
tallos u otros apéndices delgados, poner el apéndice que se va Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la
a cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el organización de las estructuras del tejido dentro del tejido vegetal,
apéndice con una porción del tejido expuesto. Con una cuchilla las caracterı́sticas importantes a observar del material vegetal en
afilada, revestida de teflón, humedecida con agua, cortar derecho polvo son las caracterı́sticas fı́sicas y quı́micas de los tejidos y los
hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin mover tipos celulares, al igual que la presencia y las caracterı́sticas quı́micas
el portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la y fı́sicas de sustancias ergásticas. Los tejidos, células y sustancias
cuchilla en ángulo. Se puede necesitar cierta práctica para poder ergásticas especı́ficas que se van a examinar se especifican en la
obtener cortes lo suficientemente finos, de modo que cuando se monografı́a individual.
monten y se cubran con un cubreobjetos, estos cortes se puedan
utilizar para determinar la organización del tejido (por ejemplo, el
número de capas en empalizada en la hoja, el grosor de la cutı́cula,
los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares).
Debido a que las cuchillas se desafilan rápidamente, se las debe
reemplazar con frecuencia.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h563i Identificación de Artı́culos de Origen Botánico 229
disolver la gelatina. Hacer un frotis de una pelı́cula del adhesivo PROCEDIMIENTO—Una vez que el tejido haya sido rehidratado
ası́ obtenido sobre el portaobjetos, dejar secar, enjuagar con una hasta alcohol al 70 por ciento según se describe en Preparación para
solución de formaldehı́do SR al 4% y agregar una pequeña cantidad Tinción, transferir en forma secuencial el frotis por la siguiente serie
de agua. Colocar del revés las secciones cortadas sobre el de soluciones.
portaobjetos, de modo que floten en agua e inundar con una
solución de formaldehı́do SR al 4%. Los cortes se extienden Solución Tiempo
inmediatamente y desaparecen las arrugas. Alcohol al 35 por ciento 5 minutos
Colocar el portaobjeto sobre una plataforma de calentamiento, Una solución filtrada de cloruro de cinc al 2% 1 minuto
mantenida a 428, para que los cortes se expandan. Pipetear y secar el Agua 5 segundos
exceso de agua y solución de formaldehı́do. Secar durante toda la Solución de Tinción de Safranina O 5 minutos
noche en un horno a 428 para asegurar la adherencia del corte de Agua 5 segundos
tejido al portaobjeto. Solución de Tinción de Anaranjado G 1 minuto
Tinción— Agua 5 segundos
Preparación para Tinción—Sumergir dos veces en xileno el Una solución filtrada de ácido tánico al 5% 5 minutos
portaobjetos con el tejido fijado, durante 10 a 15 minutos cada vez Agua 3 segundos
para eliminar la parafina. Luego sumergir el portaobjetos en varias Una solución de sulfato férrico amónico al 1% 2 minutos
soluciones, dejándolo durante 5 minutos en cada solución y teniendo Agua 15 segundos
cuidado de no sacar el tejido y usar la siguiente secuencia de Alcohol al 45 por ciento 10 segundos
soluciones: una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 : 1), Alcohol al 90 por ciento 10 segundos
alcohol deshidratado, alcohol y una solución de alcohol al 70 por Alcohol deshidratado 10 segundos
ciento. El tejido se blanquea antes de la tinción si está opaco debido Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno 1 a 2 minutos
a la presencia de taninos u otros materiales ergásticos. Para (1 : 1)
blanquear, sumergir el portaobjetos en una solución de permanga-
nato de potasio al 1% durante 1 minuto, enjuagar con agua, sumergir
en una solución de ácido oxálico al 5% durante 1 minuto y enjuagar Finalmente, almacenar en xileno hasta que esté listo para colocar
muy bien con agua. El material está ya listo para la tinción. Para la el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se teñirán de negro
mayorı́a de los trabajos de identificación botánica se recomienda usar azulado, los núcleos de color amarillo, los granos de almidón de
uno de los dos procedimientos de tinción siguientes. El primer color negro y las paredes celulares lignificadas de color rojo.
procedimiento de tinción emplea safranina O contrastada con verde Montaje del Cubreobjetos—El montaje del cubreobjetos sobre
rápido. Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada el tejido completa la preparación del portaobjetos. Como adhesivo se
con anaranjado G. puede usar bálsamo de Canadá, diluido con una pequeña parte de
Tinción de Safranina O–Verde Rápido— xileno. En el comercio existen otros medios de montaje disponibles.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O —Preparar una mezcla de Cuando se seca el medio de montaje, el frotis puede examinarse en el
metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solución de formaldehı́do microscopio. Todo el proceso de preparación de extensiones
(50 : 25 : 25 : 2). Agregar una cantidad suficiente de acetato de sodio permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 dı́as o más.
para obtener una solución que contenga 1% de acetato de sodio y
mezclar. Agregar una cantidad suficiente de safranina O para obtener
una solución que contenga 1% de safranina O y mezclar. IDENTIFICACIÓN QUÍMICA
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE VERDE RÁPIDO —Preparar una mezcla de
metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo (1 : 1 : 1) Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artı́culo, se
con 0,05% de verde rápido FCF. realiza la identificación quı́mica junto con la identificación botánica
PROCEDIMIENTO—Una vez que el tejido haya sido rehidratado descrita anteriormente. La identificación quı́mica generalmente
hasta alcohol al 70 por ciento según se describe en Preparación para emplea procedimientos cromatográficos para detectar la presencia
Tinción, sumergir durante 2 a 24 horas, dependiendo del tejido, en de compuestos indicadores o marcadores especificados en la
Solución de Tinción de Safranina O. Eliminar el exceso de colorante monografı́a individual. Se pueden emplear perfiles espectroscópicos
sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el o cromatográficos para obtener la identificación quı́mica mediante la
portaobjetos a una solución de alcohol con 0,5% de ácido pı́crico comparación de impresiones o caracterizaciones con un estándar
durante 2 a 10 segundos para eliminar más el exceso de colorante del o muestra de referencia. Algunos ejemplos de métodos espectros-
corte y ayudar a la diferenciación de las estructuras del tejido. Para cópicos son UV, IR e IR por transformada de Fourier (ver Pruebas
detener la acción del ácido pı́crico, transferir el portaobjetos durante de Identificación Espectrofotométrica h197i). Algunos ejemplos de
10 segundos a 1 minuto a una solución de alcohol que contenga métodos cromatográficos son cromatografı́a lı́quida de alta presión
4 gotas de hidróxido de amonio cada 100 mL de alcohol. Transferir (HPLC, por sus siglas en inglés), cromatografı́a en capa delgada
el portaobjetos al alcohol deshidratado durante 10 segundos. (TLC, por sus siglas en inglés), TLC bidimensional y cromatografı́a
Inspeccionar visualmente el tejido teñido bajo un microscopio para de gases (ver Cromatografı́a h621i). Los métodos analı́ticos
comprobar si es necesaria una mayor decoloración con ácido pı́crico. utilizados para la impresión deben ser capaces de detectar tantos
Contrastar durante 10 a 15 segundos en Solución de Tinción de Verde componentes quı́micos como sea posible. Pueden resultar útiles las
Rápido. Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de impresiones múltiples, empleando una combinación de métodos
salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2 : 1 : 1); cada analı́ticos con principios de separación y condiciones de prueba
cambio dura entre 5 y 10 segundos. Luego transferir el portaobjetos diferentes. Además de los métodos cromatográficos espectroscópi-
a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95 : 5) durante cos, en la monografı́a individual también se pueden especificar
1 minuto. Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno métodos cualitativos de quı́mica húmeda.
hasta que esté listo para montar el cubreobjetos. Los cromosomas,
los núcleos y las paredes celulares lignificadas, cutinizadas
o suberizadas, se teñirán de color rojo. El citoplasma y la paredes Quimiotaxonomı́a
celulares de celulosa se teñirán de color verde a azul, dependiendo
del pH del tejido. La quimiotaxonomı́a es la clasificación de las plantas, basada en
Tinción de Anaranjado G–Safranina O— sus componentes quı́micos, y la misma puede resultar útil para la
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O—Preparar una solución de identificación de artı́culos botánicos. Los compuestos metabólicos
safranina O al 0,004%. que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden dividir en dos
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE ANARANJADO G —Disolver 2 g de amplias categorı́as, en base a sus funciones. La primera categorı́a
anaranjado G, 5 g de ácido tánico y 4 gotas de ácido clorhı́drico en comprende los metabolitos primarios—metabolitos que participan en
agua, y diluir con agua hasta 100 mL. los procesos fisiológicos vegetales, que son absolutamente necesa-
rios para la vida y están presentes en todo el reino vegetal. Estos
procesos comprenden la fotosı́ntesis, la respiración y el metabolismo
de los ácidos nucleicos, las proteı́nas, los carbohidratos y los lı́pidos.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h565i Extractos Botánicos 231
A menos que se especifique algo diferente, las tinturas general- Realizar la valoración sin demora y tomar precauciones a lo largo
mente se preparan a partir de polvo grueso o cortes finos de materia de todo el procedimiento para reducir al mı́nimo la exposición a la
vegetal, ya sea mediante un proceso de percolado o un proceso de luz actı́nica y al oxı́geno atmosférico y otros agentes oxidantes
maceración. empleando preferentemente material de vidrio con protección
actı́nica y una atmósfera de gas inerte.
Reactivos Especiales—
PROCESO DE PERCOLACIÓN ÉTER—Emplear éter etı́lico y utilizarlo dentro de un lapso de 24
horas después de abrir el envase.
Mezclar cuidadosamente la mezcla de ingredientes molidos con
ALCOHOL ISOPROPÍLICO—Usar alcohol isopropı́lico de grado
una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado para
humedecerlo de forma completa y uniforme, dejar en reposo durante espectrofotométrico (ver Alcohol Isopropı́lico en Especificaciones
15 minutos, trasladar la mezcla a un percolador adecuado y de Reactivos en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones).
compactar la masa con firmeza. Verter una cantidad suficiente del Procedimiento—Pesar, contar o medir con exactitud una porción
disolvente de extracción indicado para saturar el material a extraer y de la muestra de prueba, que se espera que contenga el equivalente
cubrir la parte superior del percolador. Cuando el lı́quido esté a punto a no menos de 0,15 mg de retinol pero que no contenga más de 1 g
de gotear, cerrar el orificio inferior y dejar macerar durante 24 horas de grasa. Si se presenta en forma de cápsulas, tabletas u otro sólido,
o durante el tiempo especificado en la monografı́a. Si la monografı́a de modo que no se puede saponificar eficazmente según las
individual no requiere prueba de contenido de principios activos instrucciones descritas a continuación, someter a reflujo la porción
o compuestos marcadores, dejar que la percolación proceda tomada en 10 mL de agua en un baño de vapor durante unos 10
lentamente o a la velocidad indicada (ver definiciones de velocidad minutos, aplastar el sólido restante con una varilla de vidrio de punta
de flujo en Extractos Lı́quidos), agregar gradualmente una cantidad roma y entibiar durante aproximadamente 5 minutos más.
suficiente de disolvente para producir 1000 mL de tintura y mezclar. Transferir a un matraz de vidrio de borosilicato adecuado y
Si se requiere una prueba de principios activos o compuestos agregar 30 mL de alcohol, seguidos de 3 mL de solución de
marcadores, recolectar sólo 950 mL del percolado, mezclar y hidróxido de potasio (9 en 10). Someter a reflujo en un aparato que
analizar una porción según se indica en la monografı́a individual. sea completamente de vidrio de borosilicato, durante 30 minutos.
Diluir el resto del percolado con la cantidad de disolvente de Enfriar la solución, agregar 30 mL de agua y transferir a un
extracción que indique la prueba de contenido que es necesaria para separador cónico. Agregar 4 g de sulfato de sodio decahidrato
producir una tintura que cumple con los requisitos y mezclar. finamente pulverizado. Para extraer, agitar, con una porción de 150
mL de éter durante 2 minutos y, posteriormente, si se forma una
emulsión, con tres porciones de 25 mL de éter. Combinar los
PROCESO DE MACERACIÓN extractos etéreos, si fuera necesario, y lavar agitando por rotación
moderada con 50 mL de agua. Repetir el lavado más vigorosamente
Macerar el material a extraer con 750 mL del disolvente de con tres porciones más de 50 mL de agua. Transferir el extracto
extracción indicado en un recipiente cerrado y colocar en un lugar etéreo lavado a un matraz volumétrico de 250 mL, agregar éter
tibio. Agitarlo con frecuencia durante 3 dı́as o hasta que el material a volumen y mezclar.
soluble se disuelva. Transferir la mezcla a un filtro. Cuando se haya Evaporar una porción de 25,0 mL del extracto etéreo hasta
filtrado la mayor parte del lı́quido, lavar el residuo sobre el filtro con aproximadamente 5 mL. Sin aplicar calor y con ayuda de una
una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado, corriente de gas inerte o vacı́o, continuar la evaporación hasta
combinar los filtrados para producir 1000 mL de tintura y mezclar. aproximadamente 3 mL. Disolver el residuo en suficiente alcohol
isopropı́lico para proporcionar una concentración esperada equiva-
lente a entre 3 mg y 5 mg de vitamina A por mL o para obtener una
absorbancia entre 0,5 y 0,8 a 325 nm. Determinar las absorbancias
REQUISITOS FARMACOPEICOS GENERALES de la solución resultante a las longitudes de onda de 310 nm, 325 nm
A menos que se especifique algo diferente en las monografı́as y 334 nm con un espectrofotómetro adecuado equipado con celdas
individuales, los requisitos Farmacopeicos para las tinturas son los de cuarzo idénticas, empleando alcohol isopropı́lico como blanco.
siguientes. EN PRESENCIA DE TOCOFEROL—Transferir a un matraz de vidrio
Envasado y Almacenamiento—Almacenar en envases imper- borosilicatado adecuado una muestra de prueba medida con
meables y resistentes a la luz y protegerlos de la exposición a la luz exactitud de no menos de 5 cápsulas o tabletas previamente
solar directa y al calor excesivo. [NOTA—Ver Conservación, trituradas. Someter a reflujo en un aparato que sea completamente de
Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y vidrio de borosilicato con 30 mL de alcohol y 3 mL de solución de
Requisitos Generales.] hidróxido de potasio (9 en 10) durante 30 minutos. Agregar a través
del condensador 2,0 g de ácido cı́trico monohidrato, lavando las
Etiquetado—Declarar en la etiqueta el nombre de la parte de la paredes del condensador con 10 mL de agua. Enfriar y transferir la
planta usada para la preparación, el nombre del disolvente o de la solución a un separador cónico con ayuda de 20 mL de agua.
mezcla disolvente usada para la extracción, el contenido de los Agregar 4 g de sulfato de sodio decahidrato finamente pulverizado.
componentes de interés y la relación entre el material inicial y el Para extraer, agitar con una porción de 150 mL de éter y, luego si se
producto final. forma una emulsión, con tres porciones de 25 mL de éter. Combinar
los extractos etéreos, si fuera necesario, y lavar por rotación
moderada con 50 mL de agua. Repetir el lavado más vigorosamente
con tres porciones más de 50 mL de agua. Transferir el extracto
etéreo lavado a un matraz volumétrico de 250 mL, agregar éter
a volumen. Transferir una alı́cuota de 100,0 mL de la solución etérea
resultante a un separador cónico y lavar una vez con 50 mL de
h571i VALORACIÓN DE solución de hidróxido de potasio (1 en 33), utilizando alcohol, si
fuera necesario, para romper cualquier emulsión que se forme. Lavar
VITAMINA A agitando por rotación moderada con 50 mL de agua. Repetir el
lavado más vigorosamente con tres porciones más de 50 mL de agua.
Transferir el extracto etéreo lavado a un matraz volumétrico de 100
mL, agregar éter a volumen y mezclar.
MÉTODO QUÍMICO Evaporar una alı́cuota de 50,0 mL de la solución etérea del
extracto insaponificable hasta aproximadamente 5 mL. Sin aplicar
El siguiente procedimiento se utiliza para la determinación de la calor y con ayuda de una corriente de gas inerte o vacı́o, eliminar el
vitamina A como ingrediente de las preparaciones farmacopeicas. Se éter residual. Disolver el residuo en 50,0 mL de alcohol isopropı́lico.
ajusta a las disposiciones adoptadas en 1956 para uso internacional
por la Unión Internacional de Quı́mica Pura y Aplicada (Interna- Porción Hidrogenada—Pipetear 15,0 mL de la solución en
tional Union of Pure and Applied Chemistry). alcohol isopropı́lico y transferir a un tubo de centrı́fuga de 50 mL,
agregar aproximadamente 200 mg de catalizador de paladio, mezclar
234 h581i Valoración de Vitamina D / Pruebas Quı́micas USP 30
con una varilla de vidrio e hidrogenar durante 10 minutos en un n-hexano, diluir a volumen con n-hexano y mezclar. Pipetear 5,0 mL
Hidrogenador, tal como el que se describe en Valoración de Alfa de esta solución, transferir a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir
Tocoferol h551i, utilizando alcohol isopropı́lico en el tubo del a volumen con n-hexano y mezclar.
blanco. Agregar aproximadamente 300 mg de tierra silı́cea para Sistema Cromatográfico (ver Cromatografı́a h621i)—Equipar
cromatografı́a, mezclar con una varilla de vidrio y centrifugar un cromatógrafo de lı́quidos con un detector a 325 nm y una
inmediatamente hasta que la solución sea transparente. columna de 4,6 mm 6 15 cm rellena con material L8. La velocidad
Para analizar una alı́cuota de 1 mL de la solución, eliminar el de flujo es aproximadamente 1 mL por minuto. Cromatografiar la
disolvente por evaporación, disolver el residuo en 1 mL de Solución de Aptitud del Sistema y registrar el cromatograma según se
cloroformo y agregar 10 mL de ácido fosfomolı́bdico SR: no se indica en el Procedimiento: la resolución, R, entre el acetato de
detecta un color verde azulado. [NOTA—Si aparece un color verde retinilo y el palmitato de retinilo no es menor de 10; y la desviación
azulado, repetir la hidrogenación durante un periodo más largo o con estándar relativa para inyecciones repetidas no es más de 3,0%.
un nuevo lote de catalizador.] Procedimiento—Inyectar por separado en el cromatógrafo volú-
Pipetear volúmenes iguales de la Porción Hidrogenada y de la menes iguales (aproximadamente 40 mL) de la Preparación
solución de alcohol isopropı́lico sin tratar, respectivamente, transferir Estándar y de la Preparación de Valoración, registrar los
a sendos matraces y agregar suficiente alcohol isopropı́lico para cromatogramas y medir la respuesta correspondiente al acetato de
proporcionar una concentración esperada de vitamina A equivalente retinilo obtenido a partir de la Preparación Estándar y el área del
a entre 3 mg y 5 mg por mL. Determinar las absorbancias de la pico de acetato de retinilo o palmitato de retinilo en el cromatograma
solución sin tratar frente a la solución de la Porción Hidrogenada de la Preparación de Valoración. Calcular la cantidad, en mg, de
como blanco, a las longitudes de onda de 310 nm, 325 nm y 334 nm, vitamina A, como equivalente de retinol (C20H30O), en la porción de
con un espectrofotómetro adecuado equipado con celdas de cuarzo vitamina A tomada, por la fórmula:
idénticas.
Cálculos—Calcular el contenido de vitamina A de la siguiente 0,872CD(rU / rS),
manera:
en donde 0,872 es el factor utilizado para convertir el acetato de
Contenido (en mg) = 0,549A325 / LC, retinilo, obtenido de ER Vitamina USP, en su equivalente de retinol;
C es la concentración, en mg por mL, de ER Vitamina A USP en la
en donde A325 es la absorbancia observada a 325 nm; L es la longitud, Preparación Estándar; D es el factor de dilución, en mL, para la
en cm, de la celda de absorción; y C es la cantidad de muestra de Preparación de Valoración; y rU y rS son las respuestas de los picos
prueba expresada como g, cápsulas o tabletas en cada 100 mL de la de éster de retinilo obtenidos a partir de la Preparación de
solución de alcohol isopropı́lico final, siempre que A325 tenga un Valoración y de la Preparación Estándar, respectivamente.
valor que no sea menor de [A325]/1,030 y que no sea mayor de [A325]/ [NOTA—Las respuestas molares de acetato de retinilo y de palmitato
0,970, en donde [A325] es la absorbancia corregida a 325 nm dada por de retinilo son equivalentes.]
la ecuación:
[A325] = 6,815A325 – 2,555A310 – 4,260A334,
en donde A designa la absorbancia a la longitud de onda indicada por
el subı́ndice.
Cuando [A325] tiene un valor menor de A325/1,030, aplicar la
h581i VALORACIÓN DE
siguiente ecuación: VITAMINA D
Contenido (en mg) = 0,549[A325] / LC,
en donde los valores son los definidos anteriormente. Cada mg de
vitamina A (alcohol) representa 3333 Unidades USP de vitamina A. Método Cromatográfico
Intervalo de Confianza—El intervalo de los lı́mites de error, que El siguiente procedimiento de cromatografı́a lı́quida de alta
indica la medida de la discrepancia que se puede esperar en los presión se utiliza para la determinación de la vitamina D, como
resultados de laboratorios distintos a P = 0,05, es aproximadamente colecalciferol o ergocalciferol, como ingrediente de Preparaciones
+8%. polivitamı́nicas farmacopeicas.
Durante toda esta valoración, proteger de la atmósfera y la luz
todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
MÉTODO CROMATOGRÁFICO Estándar de Referencia y las que deriven de éstos, preferentemente
usando una atmósfera de gas inerte y material de vidrio con
El siguiente procedimiento de cromatografı́a de lı́quidos a presión protección actı́nica.
se proporciona para la determinación de Vitamina A. Cuando en el Estándares de Referencia USP h11i—[NOTA—Usar ER Ergo-
siguiente procedimiento se especifica el uso de un éster de vitamina calciferol USP o ER Colecalciferol USP para valorar formas
A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo), emplear la forma farmacéuticas cuyas etiquetas declaran contenido de vitamina D
quı́mica presente en la materia prima. Usar material de vidrio con como ergocalciferol o como colecalciferol, respectivamente.] ER
protección actı́nica en todo este procedimiento. Colecalciferol USP. ER 4,6-Colestadienol USP. ER Ergocalciferol
Estándares de Referencia USP h11i—[NOTA—Utilizar ER Vita- USP. ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP.
mina A USP, forma todo trans del acetato de retinilo, para valorar Reactivos y Soluciones Especiales—
formas farmacéuticas cuya etiqueta indique que contienen retinol
o éster de vitamina A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo).] Éter—Usar éter etı́lico. Usar dentro de las 24 horas siguientes a la
apertura del envase.
Fase móvil—Usar n-hexano.
Hexanos Deshidratados—Preparar una columna cromatográfica
Preparación de Aptitud del Sistema—Disolver en n-hexano una rellenando un tubo cromatográfico de 60 cm 6 8 cm de diámetro
cantidad pesada con exactitud de palmitato de retinilo y ER Vitamina con 500 g de tierra silı́cea para cromatografı́a de 50 a 250 mm,
A USP para obtener una solución que contenga aproximadamente activada mediante secado a 1508 durante 4 horas (ver Cromatografı́a
7,5 mg por mL de cada compuesto. de Adsorción en Columna en Cromatografı́a h621i). Pasar 500 mL
Preparación Estándar—Disolver una cantidad pesada con de hexanos a través de la columna y recolectar el eluato en un matraz
exactitud de ER Vitamina A USP en n-hexano y diluir cuantitati- con tapón de vidrio.
vamente, en diluciones sucesivas si fuera necesario, para obtener una Solución de Hidroxitolueno Butilado—Disolver una cantidad de
solución con una concentración conocida de aproximadamente 15 mg hidroxitolueno butilado en hexano para cromatografı́a para obtener
de acetato de retinilo por mL. una solución que contenga 10 mg por mL.
Preparación de Valoración—Transferir a un matraz volumétrico Solución Acuosa de Hidróxido de Potasio—Disolver 500 g de
de 100 mL aproximadamente 15 mg de éster de vitamina A (acetato hidróxido de potasio en 500 mL de agua recién hervida, mezclar y
de retinilo o palmitato de retinilo), pesados con exactitud, disolver en enfriar. Preparar esta solución a diario.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h581i Valoración de Vitamina D 235
Solución Alcohólica de Hidróxido de Potasio—Disolver 3 g de extractos de éter-éter de petróleo, agregar 5,0 mL de la Solución de
hidróxido de potasio en 50 mL de agua recién hervida, agregar 10 Estándar Interno y 100 mL de la Solución de Hidroxitolueno
mL de alcohol, diluir con agua recién hervida hasta 100 mL y Butilado y mezclar. Evaporar hasta sequedad al vacı́o agitando por
mezclar. Preparar esta solución a diario. rotación moderada en un baño de agua a una temperatura no superior
Solución de Ascorbato de Sodio—Disolver 3,5 g de ácido a 408. Enfriar bajo agua corriente e introducir suficiente nitrógeno
ascórbico en 20 mL de hidróxido de sodio 1 N. Preparar esta para restaurar la presión atmosférica. Sin demora, disolver el residuo
solución a diario. en 5,0 mL de una mezcla de volúmenes iguales de acetonitrilo y
Solución de Sulfuro de Sodio—Disolver 12 g de sulfuro de sodio metanol, o en una porción medida de la mezcla de acetonitrilo-
en 20 mL de agua, diluir con glicerina hasta 100 mL y mezclar. metanol hasta que la concentración de vitamina D sea aproximada-
mente 25 mg por mL, para obtener la Preparación de Valoración.
Fase Móvil A—Preparar una mezcla de acetonitrilo, metanol y
agua (25 : 25 : 1). La cantidad de agua y la velocidad de flujo pueden Sistema Cromatográfico—Emplear un cromatógrafo que fun-
variar para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema. cione a temperatura ambiente y equipado con un detector de UV que
controle la absorción a 254 nm, una columna de acero inoxidable
Fase Móvil B—Preparar una mezcla 3 en 1000 de alcohol n- purificadora de 30 cm 6 4,6 mm rellena con material L7 y que
amı́lico en Hexanos Deshidratados. La relación entre los compo- utilice Fase Móvil A y una columna analı́tica de acero inoxidable de
nentes y la velocidad de flujo pueden variar para cumplir con los 25 cm 6 4,6 mm rellena con material L3 y que utilice Fase Móvil B.
requisitos de aptitud del sistema.
Prueba de Aptitud del Sistema de la Columna Purificadora—
Solución de Estándar Interno—Transferir 15 mg de ER 4,6- Pipetear 5 mL de la Preparación Estándar y transferir a un matraz de
Colestadienol USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico fondo redondo equipado con un condensador de reflujo y agregar 2 o
de 200 mL, agregar a volumen una mezcla 1 en 10 de tolueno y la 3 cristales de hidroxitolueno butilado. Desplazar el aire con
Fase Móvil B y mezclar. nitrógeno y calentar en un baño de agua mantenido a una
Preparación Estándar—Transferir aproximadamente 25 mg de temperatura de 908 con luz tenue bajo una atmósfera de nitrógeno
ER Ergocalciferol USP o ER Colecalciferol USP, pesados con durante 45 minutos para obtener una solución que contenga vitamina
exactitud, a un matraz volumétrico de 50 mL, disolver sin calentar en D y pre-vitamina D. Enfriar, agregar 10,0 mL de la Solución de
tolueno, agregar tolueno a volumen y mezclar. Pipetear 10 mL de Estándar Interno, mezclar y evaporar al vacı́o hasta sequedad
esta solución madre y transferir a un matraz volumétrico de 100 mL, agitando por rotación moderada en un baño de agua mantenido a una
diluir a volumen con tolueno y mezclar. Preparar la solución madre temperatura no superior a 408. Enfriar bajo agua corriente e introducir
a diario. suficiente nitrógeno para restaurar la presión atmosférica. Sin
Preparación de Valoración— demora, disolver el residuo en 10,0 mL de una mezcla de volúmenes
Para soluciones aceitosas—Pesar con exactitud una porción de la iguales de acetonitrilo y metanol y mezclar. Inyectar 500 mL de esta
muestra a valorar, preferentemente más de 0,5 g y que equivalga solución en la columna purificadora y registrar el cromatograma
aproximadamente a 125 mg de colecalciferol o ergocalciferol (5000 según se indica en el Procedimiento. El cromatograma presenta un
Unidades USP). Agregar 1 mL de la Solución de Ascorbato de pico con un tiempo de retención entre 5 y 9 minutos, correspondiente
Sodio, 25 mL de alcohol y 2 mL de la Solución Acuosa de Hidróxido a la separación bajo un solo pico de la mezcla de vitamina D, pre-
de Potasio y mezclar. vitamina D y 4,6-colestadienol de otras sustancias. Ajustar el
contenido de agua u otros parámetros de funcionamiento, si fuera
Para cápsulas o tabletas—Calentar a reflujo no menos de 10 necesario (ver Fase Móvil A).
cápsulas o tabletas con una mezcla de 10 mL de la Solución de
Ascorbato de Sodio y 2 gotas de la Solución de Sulfuro de Sodio en Prueba de Aptitud del Sistema de la Columna Analı́tica—
un baño de vapor durante 10 minutos, triturar los sólidos restantes Transferir aproximadamente 100 mg de ER Aptitud del Sistema de
con una varilla de vidrio de punta roma y continuar el calentamiento Valoración de Vitamina D USP a un matraz volumétrico de 100 mL,
durante 5 minutos. Enfriar, agregar 25 mL de alcohol y 3 mL de la agregar a volumen una mezcla de 1 en 20 de tolueno y Fase Móvil B
Solución Acuosa de Hidróxido de Potasio y mezclar. y mezclar. Calentar una porción de esta solución a reflujo a 908
durante 45 minutos y enfriar. Cromatografiar cinco inyecciones de la
Para preparaciones secas y dispersiones acuosas—Pesar con solución resultante y medir las respuestas de los picos según se
exactitud una porción de la muestra a valorar, preferentemente más indica en el Procedimiento: la resolución, R, entre trans-colecalci-
de 0,5 g y que equivalga aproximadamente a 125 mg de ferol y pre-colecalciferol no es menor de 1,0 y la desviación estándar
colecalciferol o ergocalciferol (5000 Unidades USP). Agregar, en relativa para la respuesta del pico de colecalciferol no excede de
pequeñas cantidades y mezclando por rotación suave, 25 mL de 2,0%. [NOTA—Los cromatogramas obtenidos según se indica para
alcohol, 5 mL de la Solución de Ascorbato de Sodio y 3 mL de la esta prueba muestran tiempos de retención relativos de aproxima-
Solución Acuosa de Hidróxido de Potasio. damente 0,4 para pre-colecalciferol, 0,5 para trans-colecalciferol y
SAPONIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN—Calentar a reflujo la mezcla
1,0 para colecalciferol.]
preparada a partir de la muestra a valorar en un baño de vapor
durante 30 minutos. Enfriar rápidamente bajo agua corriente, Calibración—
transferir la mezcla saponificada a un separador cónico, y enjuagar Factor de Respuesta de la Vitamina D—Transferir 4,0 mL de la
el matraz de saponificación con dos porciones de 15 mL de agua, 10 Preparación Estándar y 10,0 mL de la Solución de Estándar Interno
mL de alcohol y dos porciones de 50 mL de éter. Agitar a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con la Fase
vigorosamente la combinación de la mezcla saponificada y los Móvil B y mezclar para obtener la Preparación Estándar de Trabajo.
enjuagues durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas Almacenar esta Preparación Estándar de Trabajo a una temperatura
capas estén transparentes. Transferir la fase acuosa a un segundo no superior a 08 y conservar la porción sin usar para el
separador cónico, agregar una mezcla de 10 mL de alcohol y 50 mL Procedimiento. Inyectar 200 mL de la Preparación Estándar de
de éter de petróleo y agitar vigorosamente. Dejar que se separen, Trabajo en la columna analı́tica y medir las respuestas correspon-
transferir la fase acuosa a un tercer separador cónico y transferir la dientes a los picos de vitamina D y de 4,6-colestadienol. El tiempo
fase de éter de petróleo al primer separador; enjuagar el segundo de retención relativo del 4,6-colestadienol es aproximadamente 1,3.
separador con dos porciones de 10 mL de éter de petróleo y agregar Calcular el factor de respuesta, FD, por la fórmula:
los enjuagues al primer separador. Agitar la fase acuosa en el tercer
separador con 50 mL de éter de petróleo y agregar la fase de éter de CS / (RSCR),
petróleo al primer separador. Lavar los extractos combinados de éter- en donde CS y CR son las concentraciones, en mg por mL, de vitamina
éter de petróleo agitando vigorosamente con tres porciones de 50 mL D y de 4,6-colestadienol, respectivamente, en la Preparación
de la Solución Alcohólica de Hidróxido de Potasio y lavar Estándar de Trabajo; y RS es el cociente entre las respuestas de los
vigorosamente con porciones de 50 mL de agua hasta que el picos de vitamina D y de 4,6-colestadienol.
último lavado sea neutro a la fenolftaleı́na. Drenar las gotas restantes
de agua de los extractos combinados de éter-éter de petróleo, agregar Factor de Respuesta de la Pre-Vitamina D—Pipetear 4 mL de la
tiras de 2 láminas de papel de filtro de 9 cm al separador y agitar. Preparación Estándar y transferir a un matraz de fondo redondo
Transferir los extractos lavados de éter-éter de petróleo a un matraz equipado con un condensador de reflujo y agregar 2 ó 3 cristales de
de fondo redondo y enjuagar el separador y el papel con éter de hidroxitolueno butilado. Desplazar el aire con nitrógeno y calentar
petróleo. Combinar los enjuagues de éter de petróleo con los en un baño de agua mantenido a una temperatura de 908 con luz
236 h581i Valoración de Vitamina D / Pruebas Quı́micas USP 30
tenue bajo una atmósfera de nitrógeno durante 45 minutos para Estándares de Referencia USP h11i—[NOTA—Usar ER Ergo-
obtener una solución que contenga vitamina D y pre-vitamina D. calciferol USP, o ER Colecalciferol USP, para evaluar formas
Enfriar, transferir con ayuda de varias porciones de la Fase Móvil B farmacéuticas cuyas etiquetas declaran contenido de vitamina D
a un matraz volumétrico de 100 mL que contenga 10,0 mL de la como ergocalciferol o como colecalciferol, respectivamente.] ER
Solución de Estándar Interno, diluir a volumen con Fase Móvil B y Colecalciferol USP. ER Ergocalciferol USP.
mezclar para obtener la Mezcla de Trabajo. Inyectar 200 mL de esta Reactivos y Soluciones Especiales—
Mezcla de Trabajo en la columna analı́tica y medir las respuestas de Tierra de Fuller para Cromatografı́a—Usar tierra de Fuller para
los picos de vitamina D, de pre-vitamina D y de 4,6-colestadienol. cromatografı́a con un contenido de agua que corresponda a entre
Calcular la concentración, C ’s, en mg por mL, de vitamina D en la 8,5% y 9,0% de la pérdida por secado.
Mezcla de Trabajo (calentada), por la fórmula:
Éter de Petróleo—Usar éter de petróleo (ver en Reactivos,
FDCR R’S, Indicadores y Soluciones) y volver a destilarlo si fuera necesario
de modo que cumpla con las siguientes especificaciones adicionales:
en donde CR es la concentración, en mg por mL, de 4,6-colestadienol PUREZA ESPECTRAL—Medir en una celda de 1 cm a 300 nm, con
y R’S es el cociente entre las respuestas de los picos de vitamina D y un espectrofotómetro adecuado, usando aire como blanco: la
de 4,6-colestadienol. Calcular la concentración, C’PRE, en mg por mL, absorbancia no es mayor de 0,070.
de pre-vitamina D en la Mezcla de Trabajo, por la fórmula:
Dicloruro de Etileno—Purificar pasando a través de una columna
C ’PRE = CS – C ’S. de gel de sı́lice granular (de malla 20 a 200).
Solución de Hidróxido de Potasio—Disolver 500 g de hidróxido
Calcular el factor de respuesta, FPRE, para la pre-vitamina D, por la de potasio en agua para obtener 1000 mL.
fórmula:
Solución de Hidroxitolueno Butilado—Disolver 10 mg de
(FDR’SC ’PRE) / (R’PREC ’S), hidroxitolueno butilado en 100 mL de alcohol. Preparar esta
solución a diario.
en donde R’PRE es el cociente entre las respuestas de los picos de pre-
vitamina D y de 4,6-colestadienol. [NOTA—El valor de FPRE Éter—Usar éter recién destilado, desechando el primer y el último
determinado por duplicado, en distintos dı́as, se puede usar durante 10% del destilado.
todo el procedimiento.] Reactivo Colorante—Preparar dos soluciones madre del siguiente
Procedimiento—Inyectar 500 mL de la Preparación de Valora- modo.
SOLUCIÓN A —Vaciar, sin pesar, todo el contenido de un frasco de
ción en la columna para limpieza y obtener la fracción que representa
entre 0,7 y 1,3 con respecto al tiempo de retención del pico de la 113 g sin abrir de tricloruro de antimonio seco cristalino en un
mezcla de vitamina D (ver Prueba de Aptitud del Sistema de la matraz que contenga 400 mL de Dicloruro de Etileno. Agregar
Columna para Limpieza) en un matraz de fondo esférico. Agregar 50 aproximadamente 2 g de alúmina anhidra, mezclar y pasar a través
mL de la Solución de Hidroxitolueno Butilado, mezclar y evaporar al de un papel de filtro a un recipiente de vidrio transparente con tapón
vacı́o hasta sequedad agitando por rotación moderada en un baño de de vidrio calibrado a 500 mL. Diluir con Dicloruro de Etileno a 500
agua mantenido a una temperatura no superior a 408. Enfriar bajo mL y mezclar: la absorbancia de la solución, medida en una celda de
agua corriente e introducir suficiente nitrógeno para restaurar la 20 mm a 500 nm con un espectrofotómetro adecuado, en
presión atmosférica. Sin demora, disolver el residuo en 5,0 mL de comparación con el Dicloruro de Etileno, no excede de 0,070.
SOLUCIÓN B—Mezclar, en una campana, 100 mL de cloruro de
una mezcla 1 en 20 de tolueno y Fase Móvil B y mezclar. Inyectar
200 mL de esta solución en la columna analı́tica y medir las acetilo y 400 mL de Dicloruro de Etileno.
respuestas de los picos de vitamina D, pre-vitamina D y 4,6- Mezclar 45 mL de la Solución A y 5 mL de la Solución B para
colestadienol. Calcular la concentración, en mg por mL, de obtener el Reactivo Colorante. Almacenar en un envase imperme-
colecalciferol (C27H44O) o ergocalciferol (C28H44O) en la Preparación able y usar dentro de los 7 dı́as, pero desechar cualquier reactivo que
de Valoración, por la fórmula: presente coloración.
Tubos Cromatográficos—
(R’’DFD + R’’PREFPRE)C’’R, Primera Columna—Preparar una columna cromatográfica des-
en donde R’’D es el cociente entre las respuestas de los picos de cendente en un tubo de 2,5 cm de diámetro (interno), de
vitamina D y de 4,6-colestadienol; R’’PRE es el cociente entre las aproximadamente 25 cm de largo y estrechado hasta un diámetro
respuestas de los picos de pre-vitamina D y de 4,6-colestadienol; y de 8 mm a una distancia de 5 cm del extremo inferior, introduciendo
C’’R es la concentración, en mg por mL, de 4,6-colestadienol en la en el punto de estrechamiento un disco de vidrio sinterizado de
Preparación de Valoración. porosidad gruesa o un pequeño trozo de lana de vidrio. La porción
estrechada puede equiparse con una llave de paso de plástico inerte.
Segunda Columna—Seleccionar un tubo de tres secciones: (1) una
Método Quı́mico sección superior cónica de 18 mm de diámetro (interno) y
aproximadamente 14 cm de largo, (2) una sección media de 6 mm
Se realiza el siguiente procedimiento para la determinación de la de diámetro (interno) y aproximadamente 25 cm de largo y (3) un
vitamina D como ingrediente de preparaciones Farmacopeicas. tubo de salida inferior cónico y estrecho de aproximadamente 5 cm
Completar la valoración rápidamente y tener cuidado durante todo de largo. Introducir un pequeño trozo de lana de vidrio de 1 cm en la
el procedimiento para mantener al mı́nimo la exposición al aire y a la porción superior de la sección estrechada.
luz actı́nica, preferentemente usando una atmósfera de gas inerte y
material de vidrio con protección actı́nica.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h581i Valoración de Vitamina D 237
Cálculos—Calcular la cantidad, en mg, de vitamina D en la su potencia de vitamina D. Para cada muestra de valoración,
porción de la muestra tomada, por la fórmula: suministrar uno o más grupos de valoración y no menos de dos
grupos estándar. Los dos grupos estándar se pueden usar para la
(CS / C)(AU / AS), valoración conjunta de más de una muestra de valoración. Dentro de
un intervalo que no exceda los 30 dı́as, completar la distribución de
en donde CS es la concentración de vitamina D, en mg por mL, de la ratas a grupos según un diseño que reparta las camadas entre los
Preparación Estándar; C es la concentración de la muestra (como g, grupos para lograr un equilibrio completo.
cápsulas, tabletas, etc.) en cada mL de la solución final; AU tiene el Para lograr un equilibrio completo, donde cada camada
valor de (A2500 – A3500) – 0,67(A2550 – A3550) determinado a partir de las esté representada igualmente en cada grupo, usar 7 o más camadas
absorbancias observadas en las soluciones de la Preparación de que tengan al menos tantas ratas reducidas como grupos. De una
Valoración; y AS tiene el valor de A1500 – A2500 determinado a partir de camada dada, asignar una rata, seleccionada al azar, a cada grupo el
las soluciones de la Preparación Estándar. mismo dı́a. Si una camada tiene el doble de ratas que número de
grupos, asignar una segunda serie de ratas de manera similar. La
última camada a asignar, o las últimas dos, se puede dividir entre los
Método Biológico grupos de modo que al comienzo del perı́odo de valoración, el peso
corporal promedio de cada grupo completo no difiera en más de
La valoración biológica de la vitamina D comprende el registro 8 gramos del resto de los grupos.
e interpretación de las observaciones en grupos de ratas mantenidas
en regı́menes alimenticios especı́ficos durante perı́odos especı́ficos Dosis de Valoración—Seleccionar dos niveles de dosificación de
de sus vidas donde la respuesta biológica a la preparación a valorar ER Colecalciferol USP, espaciados de modo que la relación entre la
se compara con la respuesta a ER Cápsulas de Vitamina D USP. dosis mayor y la dosis menor no sea menor de 1,5 ni mayor de 2,5.
Seleccionar uno o dos niveles de dosificación basándose en una
Estándares de Referencia USP h11i—ER Colecalciferol USP. potencia única supuesta para cada muestra. Los niveles de
Perı́odo Preliminar—Durante todo el perı́odo preliminar en la dosificación de la muestra son equivalentes a los del estándar
vida de una rata, que no es superior a 30 dı́as y abarca del nacimiento o a un nivel medio igual a la raı́z cuadrada del producto de los dos
al primer dı́a del perı́odo de reducción, mantener las camadas bajo la niveles de dosificación del estándar.
supervisión inmediata de la persona responsable de la valoración Seleccionar los niveles de dosificación de modo que, cuando se
o alguien que se encuentre bajo sus órdenes. Durante el perı́odo alimenten ratas raquı́ticas, se espera que produzcan grados de
preliminar, utilizar un régimen alimenticio que suministre lo calcificación dentro del intervalo especificado en la prueba de
necesario para un desarrollo normal pero cuyo contenido de aceptabilidad de datos. Antes de la alimentación, el Estándar de
vitamina D se encuentre limitado, de modo que cuando se coloca Referencia y/o la muestra se pueden diluir con aceite de semilla de
en la Dieta Raquitogénica en el perı́odo de reducción, las ratas algodón, siempre que no se administren más de 0,2 mL en un solo
desarrollen raquitismo. Al final del perı́odo preliminar, rechazar dı́a. Almacenar las soluciones en aceite dentro de frascos bien
cualquier rata que pese menos de 44 g o más de 60 g o que presente cerrados, protegidos de la luz, a una temperatura que no exceda de
lesiones, enfermedades o anomalı́as anatómicas. 108 y usar dentro de 5 semanas.
Perı́odo de Reducción—Durante el perı́odo de reducción, que Asignar un grupo de ratas a cada nivel de dosificación del estándar
abarca desde el final del perı́odo preliminar hasta el primer dı́a del y de una o más muestras.
perı́odo de valoración, suministrar a cada rata la Dieta Raquito- Perı́odo de Valoración—Durante el perı́odo de valoración, que
génica y agua ad lı́bitum y no permitir acceso a ningún otro alimento va del final del perı́odo de reducción y se extiende durante un
ni suplemento dietético. intervalo fijado entre 7 y 10 dı́as, colocar cada rata en una jaula
Dieta Raquitogénica—La Dieta Raquitogénica consiste en una individual y suministrarle la Dieta Raquitogénica y agua ad lı́bitum.
mezcla uniforme de los siguientes ingredientes en las proporciones Suministrar una Dieta Raquitogénica preparada a partir de los
que aparecen en la tabla adjunta. mismos lotes de ingredientes a todas las ratas. En el primer y en el
tercer (o cuarto) dı́a del perı́odo de valoración, alimentar cada rata
Dieta Raquitogénica con la mitad de la dosis total asignada.
Durante todo el perı́odo de valoración, mantener las condiciones
Ingrediente Partes en peso ambientales lo más uniformemente posible para todas las ratas y no
exponer a radiaciones antirraquı́ticas. Al final del perı́odo fijado de
Maı́z amarillo integral, molido 76 7 a 10 dı́as, pesar y sacrificar cada rata. Diseccionar uno o más
Gluten de trigo, molido 20 huesos de las extremidades posteriores de las ratas que no pesen
Carbonato de calcio 3 menos al final que al principio del perı́odo de valoración y que hayan
Cloruro de sodio 1 consumido cada dosis asignada dentro de las 24 horas tras haberlas
alimentado para examinarlo mediante la Prueba de la Lı́nea.
Cuando un análisis quı́mico de la ración total muestre una relación Prueba de la Lı́nea—En una misma valoración, eliminar el
Ca:P de menos de 4 : 1 o de más de 5 : 1, la proporción del carbonato extremo proximal de una tibia o el extremo distal de un radio y
de calcio se podrá variar para ajustar la relación a un nivel uniforme limpiar el tejido adherido, usando el mismo hueso de todos los
dentro de este intervalo. animales. Con una cuchilla limpia y filosa, realizar un corte
Asignación de Ratas a Grupos para el Perı́odo de longitudinal por la mediana a través de la unión de la epı́fisis y la
Valoración—Considerar una camada adecuada para el perı́odo de diáfisis en el mismo lugar en cada hueso. Enjuagar ambas secciones
valoración cuando las ratas individuales de la camada muestren en agua purificada, sumergir inmediatamente en una solución de
raquitismo, como por ejemplo articulaciones agrandadas y una nitrato de plata (1 en 50) durante 1 minuto y enjuagar nuevamente en
marcha tambaleante caracterı́stica del raquitismo, siempre que el agua purificada. Exponer la superficie del corte del hueso, en agua,
perı́odo de reducción no sea menor de 19 ni mayor de 25 dı́as. La a la luz diurna y otra fuente de luz actı́nica hasta que las áreas
presencia de raquitismo se puede establecer también a partir del calcificadas desarrollen una mancha claramente definida sin cambio
ancho de las metáfisis raquı́ticas mediante radiografı́as o aplicando la marcado de color en las zonas no calcificadas. El procedimiento de
Prueba de la Lı́nea (descrita más adelante) a un hueso de la tinción se puede modificar para diferenciar más claramente entre las
extremidad posterior de uno de los miembros de cada camada. zonas calcificadas y sin calcificar.
Registrar el peso de cada rata y asignarla a un grupo, donde cada Calificar el grado de calcificación de la metáfisis raquı́tica en cada
rata se alimentará con una dosis especificada del Estándar de rata, según una escala que permita graficar la respuesta promedio
Referencia o de la muestra de valoración en estudio para determinar como una lı́nea recta en función del logaritmo de la dosis.
USP 30 Pruebas Quı́micas / h591i Determinación de Cinc 239
producto cumplen con los requisitos de Tapones Elastoméricos para + 2,08 durante no menos de 3 dı́as, pesar nuevamente cada envase,
Inyecciones h381i. (Tener en cuenta que en Procedimientos de registrar el peso de cada uno, en mg, como W2 y registrar la fecha y
Pruebas Fisicoquı́micas en h381i, las instrucciones para preparar la la hora con una aproximación de media hora. Determinar el tiempo,
muestra requieren una extracción previa, lo que puede ocasionar una T (en horas), durante el que se analizaron los envases. Calcular la
subestimación de la cantidad de sustancia extraı́ble de un velocidad de fuga, en mg por año, de cada envase tomado, por la
componente dado.) Ver también Aerosoles en Formas Farmacéuti- fórmula:
cas h1151i.
(365)(24/T)(W1 – W2).
conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la Uniformidad de Dosis Liberada en Todo el
bomba de vacı́o en funcionamiento y la válvula solenoide cerrada, Contenido
insertar la boquilla horizontalmente en el adaptador de boquilla.
Descargar el polvo en el aparato de muestreo activando el La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Todo el
temporizador que controla la válvula solenoide y extrayendo 4,0 L Contenido se requiere para inhaladores (por ejemplo inhaladores
de aire desde el inhalador a la velocidad de flujo previamente de dosis fija o inhaladores de polvo seco) que contienen múltiples
definida. Si las instrucciones de la etiqueta ası́ lo indican, repetir la dosis de la formulación (por ejemplo, solución, suspensión o polvo
operación para simular el uso del inhalador por el paciente (por seco) en reservorios o en unidades de dosificación previamente
ejemplo, inhalar dos o tres veces, si fuera necesario, para vaciar la medidas (por ejemplo, blı́steres), y para formulaciones envasadas en
cápsula). Repetir la operación completa n –1 veces, comenzando reservorios o en presentaciones multidosis de unidades de dosifica-
donde dice ‘‘Cebar o cargar el inhalador con polvo’’, en donde n es ción previamente medidas que tienen una secuencia de dosis
el número de veces definido en la etiqueta como la dosis mı́nima predeterminada, cuando la etiqueta de estas presentaciones multi-
recomendada. Desmontar el inhalador de polvo seco del aparato de dosis indica que están destinadas a ser utilizadas con un dispositivo
muestreo y desconectar la tuberı́a de vacı́o D. Valorar el contenido de de inhalación determinado. La prueba de Uniformidad de Dosis
fármaco en el aparato después de enjuagar el filtro y el interior del Liberada en Todo el Contenido también asegura que los productos
aparato con un disolvente adecuado. Si ası́ se indica en la multidosis proporcionen el número de descargas declarado en la
monografı́a individual, realizar esta prueba en condiciones de etiqueta. A menos que se especifique algo diferente en la monografı́a
temperatura y humedad controladas. individual, el contenido de fármaco de al menos 9 de las 10 dosis
recolectadas a partir de un inhalador, de acuerdo con el
procedimiento que se describe más adelante, está comprendido en
un intervalo entre 75% y 125% de la dosis liberada esperada y
ninguno está fuera del intervalo entre 65% y 135% de la dosis
liberada esperada. Si el contenido de no más de 3 dosis está fuera del
intervalo entre 75% y 125%, pero está comprendido en el intervalo
246 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
entre 65% y 135% de la dosis liberada esperada, seleccionar 2 abandonan el inhalador. La distribución de tamaños aerodinámicos
inhaladores adicionales y seguir el procedimiento establecido para define la forma en que un aerosol se deposita durante la inhalación.
analizar 10 dosis de cada uno. Los requisitos se cumplen si no más Cuando hay una distribución logarı́tmica normal, la distribución de
de 3 resultados, entre los 30 valores, quedan fuera del intervalo entre tamaños aerodinámicos puede caracterizarse por la mediana del
75% y 125% de la dosis liberada esperada y ninguno queda fuera del diámetro aerodinámico de la masa (MMAD, por sus siglas en inglés)
intervalo entre 65% y 135% de la dosis liberada esperada. y la desviación estándar geométrica (GSD, por sus siglas en inglés).
La distribución de tamaños aerodinámicos del fármaco que abandona
los inhaladores de polvo seco y de dosis fija se determina empleando
INHALADORES DE DOSIS FIJA los Aparatos 1; 2; 3; 4; 5 ó 6 según se especifica en este capı́tulo.
Una dosis de partı́culas finas o una fracción de partı́culas finas
Aparato—Emplear el Aparato A según se indica en Muestreo de también puede definirse como la porción de la emisión del inhalador
Dosis Liberada de Inhaladores de Dosis Fija en Uniformidad de que tiene un diámetro aerodinámico menor que el establecido en la
Dosis Liberada a una velocidad de flujo de 28,3 L de aire por minuto monografı́a individual. Es de esperar que estos términos establezcan
(+5%). una correlación con la dosis de fármaco o la fracción de la dosis de
fármaco que penetra en los pulmones durante la inhalación. Las
Procedimiento—Una dosis única se define como el número de monografı́as individuales también pueden definir las fracciones
atomizaciones especificado en la etiqueta del producto para la dosis emitidas de la dosis liberada en más de un rango de tamaño
mı́nima recomendada. Seleccionar un inhalador de dosis fija y seguir aerodinámico.
todas las instrucciones que figuran en la etiqueta para cebar, agitar,
limpiar y accionar el inhalador para liberar la dosis. A menos que se
indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente,
agitar el inhalador durante 5 segundos y accionar el disparador para DISTRIBUCIÓN DE TAMAÑOS AERODINÁMICOS
desechar una dosis mı́nima recomendada. Esperar 5 segundos y
recolectar la siguiente dosis. Desmontar el inhalador del Aparato A y Los dispositivos de impacto en cascada clasifican las partı́culas y
desconectar el vacı́o. Valorar el contenido de fármaco en el aparato las gotas de los aerosoles de acuerdo con sus diámetros
después de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un aerodinámicos. El principio de operación de estos dispositivos,
disolvente adecuado. Recolectar dos dosis más, dejando que mediante el cual las partı́culas y gotas de aerosol se separan de la
transcurran como mı́nimo 5 segundos entre dosis. Descargar el corriente de aire en movimiento por su inercia, se muestra en la
dispositivo, desechar el contenido, esperar no menos de 5 segundos Figura 3.
entre disparos (a menos que se indique algo diferente en la
monografı́a individual), hasta que queden por descargar (n/2) + 1 del
número mı́nimo de dosis recomendadas, en donde n es el número
mı́nimo de dosis recomendadas declarado en la etiqueta. Recolectar
cuatro dosis más y dejar que transcurran como mı́nimo 5 segundos
entre dosis, a menos que se indique algo diferente en la monografı́a
individual. Descargar el dispositivo y desechar la descarga, como se
hizo anteriormente, hasta que queden tres dosis por descargar.
Recolectar las tres dosis finales dejando que transcurran como
mı́nimo 5 segundos entre dosis. Tener en cuenta que la velocidad de
las descargas para desechar el contenido no debe ocasionar un
enfriamiento excesivo del envase.
Tamaño de Partı́cula
La distribución del tamaño de partı́culas o gotas en el rocı́o
descargado por los inhaladores de dosis fija y la distribución del
tamaño de partı́culas en la nube descargada de los inhaladores de Figura 3. Representación esquemática del principio de operación de
polvo seco son parámetros importantes para evaluar el funciona- los impactadores en cascada. (Se muestra un solo chorro por estación
miento del inhalador. Aunque se puede emplear la medición del del impactador. Los impactadores con chorros múltiples en cada
tamaño de partı́culas por microscopı́a para evaluar el número de estación funcionan de la misma manera.)
partı́culas extrañas, aglomerados y partı́culas grandes en las
emisiones de los inhaladores de dosis fija (por ejemplo, Bitartrato Debido a que las dimensiones del tubo de admisión utilizado para
de Epinefrina, Aerosol para Inhalación), cuando sea posible, esta conectar los inhaladores a impactadores en cascada y a impactadores
prueba debe reemplazarse por un método para determinar la en fase lı́quida (que se muestra en los Aparatos 1; 2; 3; 4; 5 y 6)
distribución de tamaños aerodinámicos de las partı́culas que también definen la masa del fármaco que ingresa en el dispositivo
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 247
para clasificar el tamaño aerodinámico, estas dimensiones se definen Reingreso por arrastre—Cuando sea posible variar la metodolo-
cuidadosamente y, cuando es posible, se mantienen constantes entre gı́a, la técnica seleccionada debe apuntar a minimizar el reingreso de
aparatos (ver Figuras 4, 6, 7, 8 y 9). partı́culas por arrastre (desde una estación de impacto superior a una
inferior) en las estaciones que contribuyan a fracciones del tamaño
definido en la monografı́a individual, especialmente cuando esto
pueda alterar las cantidades recolectadas de fármaco. Minimizar el
número de dosis tomadas como muestra, usar superficies de
recolección de partı́culas recubiertas y probar que las técnicas para
dosis múltiples producen resultados estadı́sticamente similares a los
obtenidos a partir de un número de dosis menor son métodos que se
pueden emplear para este propósito. En el caso de que no se pueda
evitar el reingreso por arrastre, se debe normalizar el número de
dosis recolectadas, el intervalo de tiempo entre dosis y la duración
total del flujo de aire a través del dispositivo de impacto en cascada.
Bajo estas circunstancias, la presentación de los datos de impacto no
debe asumir la validez de la calibración del impactador (es decir, los
rangos de diámetros aerodinámicos no deben ser asignados a masas
de fármacos recolectadas en estaciones especı́ficas).
Usando métodos de valoración apropiados y un dispositivo de
impacto medido adecuadamente, se puede determinar la distribución
de tamaños aerodinámicos de partı́culas de los fármacos que salen de
las boquillas de los inhaladores de dosis fija o polvo seco. Si los
lı́mites de temperatura o humedad para el uso del inhalador están
Figura 4. Aparato 1: Montaje del tubo de admisión y del cono de indicados en la etiqueta, puede ser necesario controlar la temperatura
ingreso sobre el impactador en cascada. y la humedad del aire del entorno del dispositivo y del aire que lo
atraviesa para que se ajusten a esos lı́mites. Se suponen las
Dado que la distribución de tamaños ocasionada por distintos condiciones ambientales, salvo que se especifique algo diferente en
impactadores es a menudo una función del diseño del impactador y las monografı́as individuales.
de la velocidad del flujo de aire que pasa a través de ellos, existe la Balance de Masa—Además de la distribución de tamaño, las
necesidad de normalizar los instrumentos que se emplean para buenas prácticas analı́ticas dictan que se debe lograr un balance de
analizar los inhaladores (es decir, Aparatos 1 ó 6 para inhaladores de masa completo para confirmar que toda la cantidad de fármaco
dosis fija) o de proporcionar guı́as sobre la aptitud del sistema en descargada desde el inhalador, que se captura y se mide en el aparato
donde se puedan utilizar distintos aparatos (es decir, Aparatos 2; 3; 4 tubo de admisión-impactador en cascada, está comprendida en el
ó 5 para inhaladores de polvo seco). intervalo aceptable con respecto al valor esperado. La masa total de
Debido a la naturaleza variada de las formulaciones y dispositivos fármaco recolectada en todos los componentes (balance material)
en análisis, los sistemas de impacto en cascada y las técnicas dividida por el número total de dosis mı́nimas recomendadas
seleccionadas para analizar un inhalador deben cumplir con ciertos descargadas no es menos de 75% y no es más de 125% de la dosis
criterios. mı́nima recomendada promedio determinada durante la prueba de
Medición de Estación—Los fabricantes de dispositivos de impacto Uniformidad de Dosis Liberada. Ésta no es una prueba del inhalador
en cascada proporcionan una calibración definitiva para las pero sirve para asegurar que los resultados de la prueba son válidos.
caracterı́sticas de separación de cada estación de impacto en Usar uno de los dispositivos de impacto de múltiples estaciones
términos de la relación entre la eficiencia de recolección a dicha que se muestran más adelante, o uno equivalente, para determinar la
estación y el diámetro aerodinámico de las partı́culas y gotas que la distribución de tamaños aerodinámicos de partı́culas de los fármacos
atraviesan en forma de aerosol. La calibración es una propiedad que que salen de las boquillas de inhaladores de dosis fija o polvo seco.
depende de la dimensión, la disposición espacial del chorro y de la Los Aparatos 1 y 6 [Figuras 4 y 9 (sin preseparador),
superficie sobre la que se recoge, y de la velocidad del flujo de aire respectivamente] están destinados para uso con inhaladores de
que pasa a través de éste. Debido a que los chorros pueden causar dosis fija a una única velocidad de flujo. Los Aparatos 2; 3; 4 y 5
corrosión y desgaste a lo largo del tiempo, las dimensiones crı́ticas (Figuras 6, 7, 8 y 9, respectivamente) están destinados para uso con
de cada estación, que definen la calibración de la estación de inhaladores de polvo seco a la velocidad de flujo apropiada, Qout,
impacto, deben medirse periódicamente. Este proceso conocido determinada anteriormente, siempre que el valor Qout esté compren-
como medición de estación evita la necesidad de la calibración dido en el intervalo de 30 L a 100 L por minuto.
repetida (usando aerosoles estándar) y asegura que, en el análisis de
las emisiones de los inhaladores, sólo se utilicen aquellos NOTA—Si Qout es mayor que 100 L por minuto, la prueba debe ser
dispositivos que cumplen con las especificaciones. El proceso realizada ajustando Qout a 100 L por minuto; si Qout es menor que 30
incluye la medición y el ajuste de las dimensiones crı́ticas del L por minuto, la prueba se realiza con Qout a 30 L por minuto.
instrumento.
Aparato 1 para Inhaladores de Dosis fija—Usar este aparato o
Pérdida de Fármaco entre Estaciones (pérdidas de pared)— uno equivalente a una velocidad de flujo de 28,3 L por minuto (+
Cuando sean posibles variaciones en la metodologı́a y no se 5%) conforme a lo especificado por el fabricante del impactador en
especifique un aparato en la monografı́a, la técnica seleccionada cascada.
debe asegurar que no se pierda más del 5% de la masa de fármaco
total descargada (dentro del impactador) entre las superficies de Diseño—El diseño y montaje de este aparato y el tubo de
recolección de muestra del dispositivo de impacto. En el caso de que admisión para conectar el dispositivo al inhalador se muestran en las
se sepa que las pérdidas de fármaco entre estaciones son mayores de Figuras 4, 4a y 4b1.
5%, se debe usar otro aparato alternativo o bien el procedimiento
debe realizarse de tal forma que las pérdidas de pared se incluyan
junto con la recolección de la placa correspondiente asociada. A
modo de ejemplo, los siguientes procedimientos descritos para los 1
Se puede obtener un impactador en cascada adecuado como Modelo Mk II
Aparatos 1 y 3 han sido redactados incluyendo pérdidas de pared de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador
junto con la recolección de la placa asociada. Siempre que se sepa se usa sin el preseparador. El inhalador se conecta al impactador a través del
que tales pérdidas son menores o iguales al 5% de la masa total de tubo de admisión, por encima del cono de ingreso que se muestra en la Figura
fármaco descargada dentro del impactador y que no haya 4. Si se emplea un impactador equivalente, se debe utilizar el tubo de
instrucciones contrarias en una monografı́a individual, la técnica admisión de la Figura 4a, aunque el cono de ingreso (Figura 4b) debe ser
puede simplificarse valorando sólo el fármaco que está sobre las reemplazado por otro que se ajuste al impactador en cuestión. Se debe tener
placas de recolección. en cuenta que las superficies internas del tubo de admisión (Figura 4a) están
diseñadas para ajustarse a nivel con sus contrapartes en el cono de ingreso
(Figura 4b). Este diseño evita la captura del aerosol en la junta entre los dos
tubos.
248 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
Fig. 4a. Aparato 1: Vista expandida del tubo de admisión para uso con inhaladores de dosis fija y de polvo seco.
Figura 4b. Aparato 1: Vista expandida del cono de ingreso para montar el tubo de admisión en el impactador en cascada Andersen sin
preseparador. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. La rugosidad de la superficie (Ra) debe ser
aproximadamente de 0,4 mm.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 249
Figura 5. Aparatos 2; 3, 4 ó 5: Equipos de control general. (Ver Tabla 3 para obtener información sobre las especificaciones de los
componentes.)
Figura 7. Aparato 3: Vista expandida de la parte superior del preseparador Andersen adaptado al tubo de admisión USP. El material puede ser
aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado; el interior debe estar pulido hasta una rugosidad de superficie (Ra) de aproximadamente
0,4 mm.
Las dimensiones crı́ticas de ingenierı́a aplicadas por los recolección de partı́culas de cada estación con glicerol, aceite
fabricantes a las estaciones del Aparato 1 figuran en la Tabla 2. siliconado u otro lı́quido adecuado, normalmente depositado a partir
Durante el uso, puede producirse la oclusión y bloqueo de las toberas de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es
de chorros y por lo tanto, es necesario justificar las tolerancias de innecesario. Unir el tubo de admisión y el adaptador de boquilla de
medición ‘‘durante el uso’’. manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del
inhalador y el tubo de admisión según se muestra en la Figura 4.
Tabla 2. Dimensiones Crı́ticas para las Toberas de Chorro del Usar un adaptador de boquilla que asegure que el extremo de la
Aparato 1 boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo abierto del tubo de
admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador
N8 Diámetro de Tobera (mm) en cascada estén conectados herméticamente para evitar fugas.
Esta- Encender la bomba de vacı́o para extraer el aire a través del
ción Número de Chorros impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a través del sistema
0 96 2,55 + 0,025 con un caudalı́metro apropiado unido al extremo abierto del tubo de
1 96 1,89 + 0,025 admisión. Ajustar la válvula de control de flujo en la bomba de vacı́o
2 400 0,914 + 0,0127 para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad
3 400 0,711 + 0,0127 requerida y asegurarse de que el flujo de aire a través del sistema
4 400 0,533 + 0,0127 tenga una aproximación de +5% respecto de la velocidad de flujo
5 400 0,343 + 0,0127 especificada por el fabricante. A menos que se indique algo diferente
6 400 0,254 + 0,0127 en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el inhalador
7 201 0,254 + 0,0127 durante 5 segundos y accionar el disparador para desechar una
descarga. Con la bomba de vacı́o en funcionamiento, insertar la
boquilla en su adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la
Procedimiento—Ajustar el impactador en cascada de múltiples dosis mı́nima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la
estaciones como se describe en las instrucciones del fabricante, con válvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la
un filtro terminal debajo de la última estación para capturar todas las dosis se ha descargado por completo. Si se requieren atomizaciones
partı́culas finas que de otra manera escaparı́an del dispositivo. Para adicionales para recolectar la muestra, esperar 5 segundos antes de
asegurar una captura eficiente de partı́culas, recubrir la superficie de desmontar el inhalador del adaptador de boquilla, agitar el inhalador,
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 251
Figura 8. Aparato 4: Esquema del impactador en fase lı́quida multiestación. (Ver Tabla 4 para obtener información sobre las especificaciones de
los componentes.)
colocar nuevamente en el adaptador e inmediatamente pulsar para Aparato 2 para Inhaladores de Polvo Seco—
descargar la siguiente dosis mı́nima recomendada. Repetir hasta que Diseño—El diseño y el montaje del Aparato 2 y del tubo de
se descargue el número de dosis requerido. El número de dosis admisión para conectar el dispositivo a un inhalador se muestran en
mı́nimas recomendadas debe ser tal que permita una determinación la Figura 62 . [NOTA—El tubo de admisión se muestra en detalle en la
exacta y precisa de la Distribución de Tamaños Aerodinámicos. Figura 4a.] El impactador tiene 5 estaciones de impactación y un
[NOTA—Usualmente, el número de dosis mı́nimas recomendadas no filtro terminal. A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L
es mayor de 10.] Después de descargar la última dosis, retirar el por minuto (la velocidad del flujo nominal, Qn), los diámetros
inhalador del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de aerodinámicos lı́mite D50,Qn de las Estaciones 1 a 5 son 10 mm; 5 mm;
boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir el 2,5 mm; 1,25 mm y 0,625 mm, respectivamente. El filtro terminal
enjuague cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar retiene eficazmente el fármaco suspendido en aerosol en un rango de
el impactador en cascada, colocar cada estación y su respectiva placa tamaño de partı́cula de hasta 0,625 mm. Colocar el impactador en
de recolección o filtro asociado en sendos recipientes y enjuagar para cascada multiestación con el sistema de control según se especifica
extraer el fármaco de cada uno de éstos. [NOTA—Si se ha en la Figura 5. Para asegurar que la captura de partı́culas sea
determinado que las pérdidas de pared en el impactador son menores eficiente, recubrir la superficie de recolección de partı́culas de cada
o iguales a 5%, entonces se puede usar solamente el material estación con glicerol, aceite siliconado u otro lı́quido adecuado
recolectado en las placas.] normalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos
Diluir cada uno cuantitativamente hasta un volumen apropiado. que se haya demostrado que es innecesario. Ensamblar el impactador
Empleando el método de análisis especificado en la monografı́a según se describe en las instrucciones del fabricante con un filtro
individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno terminal por debajo de la estación final para capturar todas las
de los componentes. Para analizar los datos, proceder según se indica 2
Se puede obtener el impactador en cascada como Modelo 160 Marple-Miller
en Análisis de Datos. Impactor de MSP Corporation, Minneapolis, MN. El inhalador debe
conectarse al impactador mediante el tubo de admisión que se muestra en
la Figura 4a.
252 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
partı́culas finas que de otra manera escaparı́an del dispositivo. Unir se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el inhalador
el tubo de admisión y el adaptador de boquilla, de manera que se según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la
produzca un sellado hermético entre la boquilla del inhalador y el boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que
tubo de admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la
que el extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el descarga de la última dosis, apagar la bomba de vacı́o.
extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un
diferentes estaciones del impactador en cascada estén conectadas y disolvente adecuado y diluir el enjuague cuantitativamente hasta un
selladas herméticamente para evitar fugas. volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada y colocar
Poner en marcha la bomba de vacı́o, abrir la válvula solenoide y el filtro terminal en un recipiente aparte. Enjuagar para extraer el
calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a fármaco de cada una de las estaciones y del filtro y diluir
continuación. Conectar un caudalı́metro al tubo de admisión. cuantitativamente cada uno a un volumen apropiado. Empleando
Emplear un caudalı́metro calibrado para medir el flujo volumétrico el método de análisis especificado en la monografı́a individual,
que abandona el medidor para determinar directamente Qout o, si tal determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los
medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumétrico que sale componentes. Determinar los diámetros lı́mite de cada una de las
del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales. Por estaciones individuales del impactador, al valor de Q = Qout
ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volumétrico de empleado en la prueba, por la fórmula:
entrada (Qin), emplear la fórmula:
D50,Q = D50,Qn(Qn / Q)1 / 2, (Ecuación 1)
Qout = QinP0 / (P0 – P),
en donde D50,Q es el diámetro lı́mite a la velocidad de flujo, Q,
en donde P0 es la presión atmosférica y P es la caı́da de presión a empleada en la prueba y el subı́ndice n se refiere a los valores
lo largo del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo para nominales determinados cuando Qn es igual a 60 L por minuto. Ası́,
lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad cuando Q es igual a 40 L por minuto, el diámetro lı́mite de la
requerida, Qout, de manera que el valor de Qout esté dentro del +5% Estación 2 viene dado por la fórmula:
del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis
Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crı́tico en la válvula de D50,40LPM = 5 mm 6 [60/40]1 / 2 = 6,1 mm.
control de flujo a la velocidad de flujo que se va a emplear durante la
prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el inhalador
montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulación, medir Procedimiento General—Realizar la prueba utilizando el Aparato
la presión absoluta a ambos lados de la válvula de control de flujo 2 a la velocidad de flujo de aire, Qout determinada anteriormente,
(P2 y P3 en la Figura 5). Una relación de P3/P2 5 0,5 indica flujo durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada, siempre que
crı́tico. Cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente Qout sea menor o igual a 100 L por minuto. [NOTA—Si Qout es mayor
la velocidad de flujo si P3/P2 4 0,5. Ajustar el temporizador que que 100 L por minuto, utilizar una velocidad de flujo de aire de 100
controla la operación de la válvula solenoide de dos vı́as, de manera L por minuto.] Conectar el aparato al sistema de control de flujo
que abra esta válvula durante un lapso de T segundos, según se basado en el flujo crı́tico (sónico) según se especifica en la Figura 5
determinó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. (ver también la Tabla 3).
Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para inhalación
de acuerdo con las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la
bomba de vacı́o en funcionamiento y la válvula solenoide de dos
vı́as cerrada, insertar la boquilla del inhalador en forma horizontal en
el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo
dentro del aparato, abriendo la válvula solenoide de dos vı́as durante
un lapso de T segundos. Después de que la válvula solenoide de dos
vı́as se haya cerrado, retirar el inhalador del adaptador de boquilla. Si
Tabla 3. Especificaciones de los Componentes para la Figura 5
Código Artı́culo Descripción Dimensiones
A Conector (por ej., acoplamiento corto de diámetro interno de 8 mm
metal con ramificación a P3 de
diámetro menor)
B Tuberı́a de vacı́o (por ej., tuberı́a de silicona con un Un tubo de longitud adecuada de diámetro interno 8 mm
diámetro externo de 14 mm y un con un volumen interno de 25 mL + 5 mL.
diámetro interno de 8 mm)
C Válvula solenoide de dos Ver Figura 5 Válvula solenoide de 2 vı́as, 2 puertos, con un diámetro
vı́asa interno 8 mm y un tiempo de respuesta de 5100
milisegundos.
D Bomba de vacı́ob Ver Figura 5 La bomba debe ser capaz de extraer el flujo requerido a
través del aparato ensamblado con el inhalador de polvo
seco en el adaptador de boquilla. Conectar la bomba a la
válvula solenoide empleando una tuberı́a de vacı́o corta y
ancha (10 mm de diámetro interno) y conectores para
minimizar los requisitos de capacidad de la bomba.
E Temporizadorc Ver Figura 5 El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a
la válvula solenoide durante el lapso de tiempo requerido.
P2, P3 Mediciones de Presión Determinar en condiciones de flujo estacionario con un
transductor de presión absoluta.
F Válvula de control de flujod Ver Figura 5 Válvula reguladora ajustable con Cv 1 máximo.
a
A modo de ejemplo, el producto ASCO número 8030G13 (Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932) o equivalente. Ver también
la Nota al pie h en la Tabla 1.
b
Producto Gast tipo 1023, 1423 ó 2565 (Gast Manufacturing Inc., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente.
c
A modo de ejemplo, el producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901 South 12th Street, Watertown, WI 53094) o
equivalente.
d
Producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS o equivalente (Parker Hannifin plc, Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaña). Ver también la
Nota al pie h en la Tabla 1.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 253
Tabla 4. Unidades Componentes del Impactador en Fase Lı́quida (Impinger) Multiestación (ver Figura 8)
Código1 Artı́culo Descripción Dimensiones2
A,H Tubo de chorro Tubo de metal atornillado a una pared Ver Figura 8a
divisora sellada por una junta (C),
superficie interna pulida
B,G Pared divisoria Placa circular de metal, diámetro 120
Grosor Ver Figura 8a
C Junta por ej., de PTFE para adaptarse al tubo de chorro
D Placa de impacto Disco de vidrio sinterizado de porosidad
O,
Diámetro Ver Figura 8a
E Cilindro de vidrio Tubo de vidrio cortado pulido plano
Altura, incluyendo juntas 46
Diámetro externo 100
Espesor de pared 3,5
Diámetro (F) del muestreador 18
Tapón en muestreador ISO 24/25
J Marco de metal Marco circular con perfil en L con ranura
Diámetro interno Para adaptarse a la placa de impacto
Altura 4
Grosor de sección horizontal 0,5
Grosor de sección vertical 2
K Alambre Alambre de acero que interconecta el
marco de metal y el eje (dos por cada
marco)
Diámetro 1
L Camisa Camisa de metal fijado al tubo de chorro
mediante tornillos
Diámetro interno Para adaptarse al tubo del chorro
Altura 6
Grosor 5
M Junta Por ej., de silicona Para adaptarse al cilindro de vidrio
N Perno Perno con tuerca de metal (seis pares), 205
longitud
Diámetro 4
P Junta tórica Junta tórica de goma, diámetro 6 grosor 66,34 6 2,62
Q Junta tórica Junta tórica de goma, diámetro 6 grosor 29,1 6 1,6
R Portafiltro Bastidor de metal con pie y salida Ver Figura 8b
S Soporte de filtro Lámina de metal perforada, diámetro 65
Diámetro de orificio 3
Distancia entre orificios 4
(puntos centrales)
T Cierres de funcionamiento ultrarrápido
U Tubo de chorros múltiples Tubo de chorro (H) que termina en Ver insertos en Figura 8a
disposición de chorros múltiples
V Salida Salida y tobera para conexión Diámetro interno 10 (Figura 8b)
a vacı́o
1
Ver Figura 8.
2
Las medidas son en mm a menos que se indique algo diferente.
254 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
3
El impactador en cascada está disponible como el producto Andersen
1ACFM Non-Viable Cascade Impactor (Mark II) de Thermo-Electron, 27
Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa con el
preseparador.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 255
Tabla 5. Aparato 4: Dimensiones1 del Tubo de Chorro con Placa de Impacto (ver Figura 8a).
Filtro (Esta-
Tipo Código2 Estación 1 Estación 2 Estación 3 Estación 4 ción 5)
Distancia 1 9,5 (–0,0, +0,5) 5,5 (–0,0, +0,5) 4,0 (–0,0, +0,5) 6,0 (–0,0, +0,5) n.a.
Distancia 2 26 31 33 30,5 0
Distancia 3 8 5 5 5 5
Distancia 4 3 3 3 3 n.a.
Distancia 5 0 3 3 3 3
Distancia 63 20 25 25 25 25
Distancia 7 n.a. n.a. n.a. 8,5 n.a.
Diámetro c 25 14 8,0(+0,1) 21 14
Diámetro d 50 30 20 30 n.a.
Diámetro e 27,9 16,5 10,5 23,9 n.a.
Diámetro f 31,75 (–0,05, +0,00) 22 14 31 22
Diámetro g 25,4 21 13 30 21
Diámetro h n.a. n.a. n.a. 2,70 (+0,05) n.a.
Diámetro j n.a. n.a. n.a. 6,3 n.a.
Diámetro k n.a. n.a. n.a. 12,6 n.a.
Radio4 r 16 22 27 28,5 0
Radio4 s 46 46 46 46 n.a.
Radio4 t n.a. 50 50 50 50
Ángulo w 108 538 538 538 538
Ángulo u n.a. n.a. n.a. 458 n.a.
Ángulo v n.a. n.a. n.a. 608 n.a.
1
Medidas en mm con tolerancias conformes a ISO 2768-m, a menos que se indique algo diferente.
2
Ver Figura 8a.
3
Incluyendo junta.
4
Lı́nea central relativa del compartimento de la estación.
n.a.: no aplicable.
Aparato 4 para Inhaladores de Polvo Seco — contra el borde de un filtro colocado en el portafiltro. El portafiltro
NOTA—El Aparato 4, un impactador en fase lı́quida multiestación, (R), es una cubeta con un hueco concéntrico en el que se calza un
tiene un número reducido de estaciones y su uso está ampliamente soporte de filtro perforado (S). El portafiltro está diseñado para filtros
difundido fuera de los Estados Unidos. Se proporciona en este de 76 mm de diámetro. El montaje completo de la estación de
documento para beneficio de los usuarios de los restantes paı́ses impacto se ajusta al portafiltro mediante dos cierres de funciona-
fuera de los Estados Unidos. miento ultrarrápido (T). El impactador en fase lı́quida está equipado
Diseño—El diseño y el montaje del Aparato 4 se muestran en las con un tubo de admisión (Figura 4a) que se ajusta al tubo de entrada
Figuras 8, 8a y 8b.4 El tubo de admisión utilizado para conectar el de chorro de la Estación 1. Una junta tórica de goma en el tubo de
dispositivo al inhalador se muestra en la Figura 4a. El dispositivo es chorro proporciona un sellado hermético al tubo de admisión. Un
un impactador en fase lı́quida multiestación que consiste en las adaptador de boquilla elastomérico para insertar el inhalador en
Estaciones de impacto 1; 2; 3 y 4 y un filtro terminal integrado análisis proporciona un sellado hermético entre el inhalador y el tubo
(Estación 5). Las estaciones de recolección del impactador en fase de admisión.
lı́quida (ver Figura 8 y Tabla 4) se mantienen húmedas, a diferencia A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L por minuto
de los impactadores tradicionales, como por ejemplo los Aparatos 1; (la velocidad del flujo nominal, Qn), los diámetros aerodinámicos
2; 3; 5 y 6; este humedecimiento puede producir un efecto similar al lı́mite D50,Qn de las Estaciones 1 a 4 son 13,0 mm, 6,8 mm, 3,1 mm y
recubrimiento de las estaciones de los Aparatos 2; 3; 5 y 6 a 1,7 mm, respectivamente. El filtro terminal retiene eficazmente el
determinadas velocidades de flujo, aunque esto debe confirmarse fármaco suspendido en aerosol cuyo tamaño de partı́cula se
demostrando el control del reingreso por arrastre según se ha descrito encuentra en el rango hasta 1,7 mm. Asegurarse de que el Aparato
previamente. Una estación de impacto comprende una pared 4 esté limpio y exento de solución del fármaco proveniente de
divisoria metálica horizontal y superior (B) a través de la cual pruebas anteriores. Colocar un filtro de 76 mm de diámetro en la
sobresale un tubo metálico de entrada de chorro (A) con su placa de estación de filtro y montar el aparato. Usar un filtro de baja presión
impacto (D); un cilindro de vidrio (E) con una abertura de muestreo capaz de recolectar cuantitativamente el aerosol del fármaco que lo
(F), que forma la pared vertical de la estación; y una pared divisoria atraviesa, que también permita una recuperación cuantitativa del
metálica horizontal inferior (G) a través de la cual un tubo (H) se fármaco recolectado. Armar el Aparato 4 empleando el sistema de
conecta a la estación inferior. El tubo que entra en la Estación 4 (U) control especificado en la Figura 5. Unir el tubo de admisión
termina en una disposición de chorros múltiples. La placa de impacto (Figura 4a) y el adaptador de boquilla para que se produzca un
(D) se asegura en un marco metálico (J), el cual se ajusta mediante sellado hermético entre la boquilla del inhalador y el tubo de
dos alambres (K) a una manga (L) asegurada sobre el tubo de chorro admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el
(C). Para más detalles sobre el tubo de chorro y la placa de impacto, extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo
ver Figura 8a. El plano horizontal de la placa de recolección es abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes
perpendicular al eje del tubo de chorro y se alinea centralmente. La estaciones del aparato estén conectadas herméticamente para evitar
superficie superior de la placa de impacto se eleva levemente por fugas. Poner en marcha la bomba de vacı́o, abrir la válvula solenoide
encima del borde del marco metálico. Un surco alrededor del de dos vı́as y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se
perı́metro de la pared divisoria horizontal guı́a la posición del indica a continuación. Conectar al tubo de admisión un caudalı́metro
cilindro de vidrio. Los cilindros de vidrio se sellan con juntas (M) calibrado para medir la velocidad del flujo volumétrico que sale del
contra las paredes divisorias horizontales y se sujetan mediante seis medidor. Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo
pernos (N). Las aberturas de muestreo se sellan con tapones. El constante a través del sistema a la velocidad requerida, Qout, de
fondo de la pared divisoria inferior de la Estación 4, tiene una manera que el valor de Qout esté dentro del +5 % del valor
protuberancia concéntrica fijada con una junta tórica (P) que la sella determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada.
4
Asegurar que se produzca el flujo crı́tico en la válvula de control de
El impactador en fase lı́quida de cinco estaciones está disponible de Copley flujo al valor Qout que se va a emplear durante la prueba, empleando
Instruments, plc, Nottingham, Gran Bretaña. El inhalador debe conectarse al el siguiente procedimiento. Con el inhalador montado en su lugar y
impactador por medio del tubo de admisión, que se muestra en la Figura 4 y el flujo de aire deseado en circulación, medir la presión absoluta a
la Figura 4a.
256 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
a ambos lados de la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura Aparato 5 para Inhaladores de Polvo Seco—
5). Una relación de P3/P2 5 0,5 indica flujo crı́tico. Cambiar la Diseño—El diseño y montaje del Aparato 55 se muestran en las
bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad de Figuras 9, 9a, 9b, 9c y 9d. El tubo de admisión, empleado para
flujo si P3/P2 4 0,5. Ajustar el temporizador que controla la conectar el dispositivo a un inhalador, se muestra en la Figura 4a. El
operación de la válvula solenoide de dos vı́as, de manera que abra dispositivo es un impactador en cascada con siete estaciones y un
esta válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). A lo
empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. largo del intervalo de velocidad de flujo de diseño de 30 L a 100 L
Dispensar 20 mL de un disolvente capaz de disolver el fármaco por minuto, los diámetros lı́mite de las estaciones al 50% de
dentro de cada una de las cuatro estaciones superiores del Aparato eficiencia (valores D50) varı́an entre 0,24 mm y 11,7 mm espaciados
4 y colocar nuevamente los tapones. [Precaución—Algunos de manera uniforme en una escala logarı́tmica. En el intervalo de
disolventes pueden producir mezclas de aire y vapor inflamables velocidad de flujo de diseño, siempre hay como mı́nimo cinco
que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de estaciones con valores D50 entre 0,5 mm y 6,5 mm. Las curvas de
vacı́o. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alter- eficiencia de recolección para cada estación son marcadas y
nativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operación de la bomba minimizan la superposición entre estaciones. El material puede ser
mı́nimos, etc.) para garantizar la protección del operador durante la aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado.
prueba.] Inclinar el aparato para humedecer los tapones y de esa La distribución del impactador tiene cubetas de impacto extraı́bles
forma neutralizar sus cargas electroestáticas. Ajustar el temporizador con todas las cubetas en un plano (Figuras 9 a 9c). El impactador
que controla la operación de la válvula solenoide de dos vı́as, de tiene tres secciones principales: el marco inferior que aloja las
manera que abra la válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que cubetas de impacto, el cuerpo sellador que mantiene en su lugar los
el que se empleó durante la prueba de Uniformidad de Dosis chorros y la tapa que contiene los pasajes entre estaciones (que se
Liberada. Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para muestran en las Figuras 9 a 9b). Se emplean múltiples toberas en
inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. todas las estaciones salvo en la primera (Figura 9c). El flujo pasa
Con la bomba de vacı́o en funcionamiento y la válvula solenoide de a través del impactador siguiendo un patrón en forma de dientes de
dos vı́as cerrada, insertar la boquilla del inhalador en forma sierra.
horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. La medición de la estación se realiza periódicamente junto con la
Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y confirmación de otras dimensiones crı́ticas para el eficaz funciona-
abriendo la válvula solenoide de dos vı́as durante el lapso requerido, miento del impactador. Las dimensiones crı́ticas se proporcionan
T + 5%. Después de que la válvula solenoide de dos vı́as se haya a continuación en la Tabla 6.
cerrado, retirar el inhalador del adaptador de boquilla. Si se requieren En las operaciones de rutina, el cuerpo sellador y la tapa se
dosis adicionales para la muestra, recargar el inhalador según las mantienen juntos entre sı́ como un solo dispositivo. Se tiene acceso
instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el a las cubetas de impacto cuando se abre este equipo al final de una
adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de prueba de un inhalador. Las cubetas se mantienen en una bandeja
dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la que hace de soporte, de manera que todas las cubetas se pueden sacar
ultima dosis, apagar la bomba de vacı́o. simultáneamente del impactador levantando la bandeja.
Desarmar la estación de filtro del Aparato 4. Cuidadosamente Un tubo de admisión con dimensiones internas idénticas a las que
retirar el filtro y extraer el fármaco con disolvente. Enjuagar el se definen en la Figura 4a se conecta a la entrada del impactador.
adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente Cuando sea necesario, con los inhaladores de polvo seco, se puede
adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen agregar un preseparador para evitar sobrecargar la primera estación.
apropiado. Enjuagar el interior del tubo de chorro de entrada que va El preseparador se conecta entre el tubo de admisión y el impactador.
a la Estación 1 (Figura 8), permitiendo que el disolvente fluya dentro Se emplea un adaptador de boquilla adecuado para proporcionar un
de la estación. Enjuagar para extraer el fármaco de las paredes sellado hermético entre el inhalador y el tubo de admisión.
internas y de la placa de recolección de cada una de las 4 estaciones A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L por minuto
superiores del aparato y transferir a la solución de la estación (velocidad de flujo de referencia asignada para cálculos de diámetro
respectiva, inclinando y rotando el aparato, asegurándose de que no lı́mite, Qn), los diámetros aerodinámicos lı́mite D50,Qn de las
haya transferencia de lı́quido entre estaciones. Empleando el método Estaciones 1 a 7 son 8,06 mm, 4,46 mm, 2,82 mm, 1,66 mm, 0,94
de análisis especificado en la monografı́a individual, determinar la mm, 0,55 mm y 0,34 mm respectivamente. El aparato contiene un
masa de fármaco recolectada en cada uno de los seis volúmenes de colector de microorificios (MOC) terminal que, para la mayorı́a de
disolvente. Asegurarse de que el método corrija la posible las formulaciones, puede eliminar la necesidad de un filtro final,
evaporación de disolvente durante la prueba. Esto puede involucrar según se determine mediante la validación del método. El MOC es la
el uso de un estándar interno (de concentración original conocida en placa de toberas y cubeta de recolección de un impactador. La placa
el disolvente y valorado al mismo tiempo que el fármaco) o la de toberas contiene, nominalmente, 4032 orificios, cada uno con un
transferencia cuantitativa del contenido lı́quido de cada una de las diámetro de aproximadamente 70 mm. La mayorı́a de las partı́culas
estaciones, seguida por una dilución hasta un volumen conocido. que no fueron capturadas en la Estación 7 del impactador serán
Determinar los diámetros lı́mite de cada una de las estaciones capturadas en la superficie de la cubeta que está debajo del MOC.
individuales del impactador, al valor de Q = Qout empleado en la (Para impactadores que operan a 60 L por minuto, el MOC es capaz
prueba, por la fórmula: de recolectar un 80% de partı́culas de 0,14 mm). Para formulaciones
D50,Q = D50,Qn (Qn / Q)1 / 2, con una fracción significativa de partı́culas no capturadas por el
MOC, hay un portafiltro opcional que puede reemplazar al MOC
en donde D50,Q es el diámetro lı́mite a la velocidad de flujo, Q, o colocarse a continuación del MOC que contiene un filtro terminal
empleada en la prueba y el subı́ndice n se refiere a los valores adecuado (a menudo, la fibra de vidrio es adecuada).
nominales determinados cuando Qn es igual a 60 L de aire por Procedimiento—Ensamblar el aparato con el preseparador (Figura
minuto. Ası́, cuando Q es igual a 40 L de aire por minuto, el 9d), a menos que se haya demostrado experimentalmente que su
diámetro lı́mite de la Estación 2 viene dado por la fórmula: omisión no da como resultado un incremento en la pérdida de
fármaco entre estaciones (45%) o en el reingreso de partı́culas por
D50,40LPM = 6,8 mm 6 (60/40)1 / 2 = 8,3 mm. arrastre, en cuyo caso se puede omitir el preseparador.
Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para
Procedimiento—Proceder según se indica en el Procedimiento asegurar una captura eficiente de partı́culas, recubrir la superficie de
General en Aparato 2, excepto que se debe usar el Aparato 4. recolección de partı́culas de cada estación con glicerol, aceite
siliconado u otro lı́quido adecuado generalmente depositado a partir
de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es
innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y
5
El impactador en cascada puede obtenerse como Next Generation
Pharmaceutical Impactor de MSP Corporation, Minneapolis, MN.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 257
bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con Cebar o cargar el inhalador de polvo seco con polvo para
el cuerpo sellador unido a esta y operar la manija para cerrar ambas inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta.
partes del impactador de forma que el sistema sea hermético. Con la bomba de vacı́o en funcionamiento y la válvula solenoide de
El preseparador puede prepararse del siguiente modo: montar el dos vı́as cerrada, insertar la boquilla del inhalador en forma
inserto del preseparador en la base del preseparador; conectar la base horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión.
del preseparador a la entrada del impactador; agregar 15 mL del Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y
disolvente empleado para la recuperación de la muestra a la cubeta abriendo la válvula solenoide de dos vı́as durante el lapso requerido,
central del inserto del preseparador; colocar el cuerpo del T (+ 5%). Después de que la válvula solenoide de dos vı́as se haya
preseparador; y cerrar las dos grampas sujetadoras. [Precaución— cerrado, retirar el inhalador del adaptador de boquilla. Si se requieren
Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire y vapor dosis adicionales para la muestra, recargar el inhalador según las
inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el
bomba de vacı́o. Tomar las precauciones correspondientes (por adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de
ejemplo, disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la
mı́nimos de operación de la bomba, etc.) para garantizar la ultima dosis, apagar la bomba de vacı́o.
protección del operador durante la prueba.] Desarmar el aparato y recuperar el fármaco a analizar de la
Conectar un tubo de admisión con dimensiones internas según se siguiente manera: retirar el tubo de admisión y el adaptador de
definen en la Figura 4a a la entrada del impactador o a la entrada del boquilla del preseparador y extraer el fármaco en una alı́cuota de
preseparador ubicado encima del impactador en cascada (Figura 9d). disolvente; si se hubiera empleado el preseparador, retirarlo del
Colocar en posición un adaptador de boquilla adecuado al final del impactador sin derramar el disolvente dentro de este último; y
tubo de admisión de manera que el extremo final de la boquilla del recuperar el ingrediente activo de todas las superficies internas.
inhalador, cuando se inserta, esté alineado a lo largo del eje Abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y
horizontal del tubo de admisión. La cara frontal de la boquilla del levantando la tapa. Retirar la bandeja de cubetas con las cubetas y
inhalador está a nivel con la cara frontal del tubo de admisión, recuperar el ingrediente activo de cada cubeta con una alı́cuota de
produciendo un sellado hermético. Cuando se une al adaptador de disolvente. Empleando el método de análisis especificado en la
boquilla, el inhalador debe colocarse en la misma orientación en la monografı́a individual, determinar la masa de fármaco contenida en
que está previsto que se use. Conectar el aparato al sistema de flujo cada alı́cuota de disolvente.
conforme al esquema especificado en la Figura 5. Determinar los diámetros lı́mite de cada una de las estaciones
A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba a la individuales del impactador, al valor de Q = Qout empleado en la
velocidad de flujo empleada en la prueba para Uniformidad de Dosis prueba, por la fórmula:
Liberada, extrayendo 4 L de aire desde la boquilla del inhalador a
través del aparato. Conectar un caudalı́metro al tubo de admisión. D50,Q = D50,Qn (Qn / Q)X, (Ecuación 2)
Emplear un caudalı́metro calibrado para medir el flujo volumétrico en donde D50,Q es el diámetro lı́mite a la velocidad de flujo, Q,
que abandona el medidor o calcular el flujo volumétrico que sale del empleada en la prueba y el subı́ndice n se refiere a los valores
medidor (Qout) utilizando la ley de los gases ideales. Para un medidor nominales o de referencia para Qn = 60 L de aire por minuto (ver
calibrado con el fin medir el flujo volumétrico de entrada (Qin), Tabla 7). Los valores para el exponente x, se enumeran en la Tabla 7.
emplear la fórmula: Ası́, cuando Q = 40 L de aire por minuto, el diámetro lı́mite de la
Qout = Qin P0 / (P0 – P), Estación 2 viene dado por la fórmula:
en donde P0 es la presión atmosférica y P es la caı́da de presión a D50,40LPM = 4,46 mm 6 (60/40)0,52 = 5,51 mm.
lo largo del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo para Analizar los datos según se indica en Análisis de Datos.
lograr un flujo estable a través del sistema a la velocidad requerida,
Qout (+5%). Asegurar que se produzca flujo crı́tico en la válvula de
control de flujo mediante el procedimiento descrito para el Aparato
2. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula
solenoide de dos vı́as, de manera que abra la válvula durante el
mismo lapso de tiempo, T, que el que se empleó durante la prueba de
Uniformidad de Dosis Liberada.
258 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
Tabla 7. Diámetro Aerodinámico Lı́mite para las Estaciones de Tamaños Aerodinámicos. [NOTA—Usualmente, el número de dosis
los Aparatos 5 y 6 mı́nimas recomendadas no es mayor de 10.] Después de que la
última dosis haya sido descargada, retirar el inhalador del adaptador
Utilizar la Ecuación 2 para calcular D50,Q para velocidades de flujo, de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión
Q, comprendidas en el intervalo entre 30 L y 100 L por minuto con con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente
Qn = 60 L por minuto. hasta un volumen apropiado.
Estación D50,Qn x Desarmar el aparato y recuperar el fármaco para su análisis de la
1 8,06 0,54 siguiente manera: retirar el tubo de admisión y el adaptador de
2 4,46 0,52 boquilla del aparato y recuperar el fármaco depositado en una
3 2,82 0,50 alı́cuota de disolvente; abrir el impactador liberando el mecanismo
4 1,66 0,47 de enganche y levantando la tapa; retirar la bandeja de cubetas con
5 0,94 0,53 las cubetas; y extraer el ingrediente activo de cada cubeta con una
6 0,55 0,60 alı́cuota de disolvente. Empleando el método de análisis especificado
7 0,34 0,67 en la monografı́a individual, determinar la cantidad de ingrediente
activo contenida en cada alı́cuota de disolvente.
Determinar los diámetros lı́mite de cada una de las estaciones
Aparato 6 para Inhaladores de Dosis Fija— individuales del impactador, al valor de Q empleado en la prueba,
Diseño—El Aparato 6 es idéntico al Aparato 5 (Figuras 9 a 9d), utilizando la Ecuación 2 con los valores obtenidos de la Tabla 7. Ası́,
excepto que no se utiliza el preseparador. Emplear este aparato a una cuando Q = 30 L de aire por minuto, el diámetro lı́mite de la
velocidad de flujo de 30 L por minuto (+5%), a menos que se Estación 2 viene dado por la fórmula:
indique algo diferente en la monografı́a individual. D50,30LPM = 4,46 mm 6 (60/30)0,52 = 6,40 mm.
Procedimiento—Montar el aparato sin el preseparador. Colocar las
cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una Para analizar los datos, proceder según se indica en Análisis de
captura eficiente de partı́culas, recubrir la superficie de recolección Datos.
de partı́culas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro
lı́quido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente
volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Análisis de Datos
Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para
colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impactador con el cuerpo Esta sección describe el análisis de datos requerido para definir la
sellador unido y accionar el mecanismo de enganche para trabar Distribución de Tamaños Aerodinámicos del fármaco descargado de
ambas partes del impactador de forma que el sistema cierre un inhalador de prueba, después del uso de los Aparatos 1; 2; 3, 4; 5
herméticamente. Conectar a la entrada del impactador un tubo de ó 6. Ingresar los datos recolectados de los Aparatos 1; 2; 3, 4; 5 ó 6
admisión con dimensiones internas idénticas a las que se definen en en la tabla de resumen de masas según se muestra en la Tabla 8.
la Figura 4a. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el Realizar exclusivamente los cálculos especificados en la monografı́a
extremo de la boquilla del inhalador esté a nivel con el extremo individual.
abierto del tubo de admisión. Encender la bomba de vacı́o para
extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el flujo
de aire a través del sistema con un caudalı́metro apropiado unido al CÁLCULOS
extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la válvula de control
de flujo de la bomba de vacı́o para lograr un flujo constante a través Dosis de Partı́culas Finas y Fracción de Partı́culas Finas —
del sistema a la velocidad requerida, y asegurarse de que el flujo de Calcular la masa total, A, de fármaco descargado en el aparato
aire que recorre el sistema esté comprendido entre +5% de la desde la boquilla del inhalador. Luego calcular la masa total, R, de
velocidad de flujo seleccionada. A menos que se indique algo fármaco encontrada en las estaciones del aparato y en el filtro que
diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el capturó el fármaco en el intervalo de partı́culas finas apropiado para
inhalador durante 5 segundos y disparar para desechar una descarga. el fármaco particular en análisis. La Dosis de Partı́culas Finas se
Con la bomba de vacı́o en funcionamiento, insertar la boquilla en su calcula con la fórmula:
adaptador e inmediatamente disparar para descargar la dosis mı́nima
recomendada en el impactador en cascada. Mantener la válvula R/n,
presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis
se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones en donde R es el término definido anteriormente y n es el número de
adicionales para recolectar la muestra, agitar el inhalador, reinsertar dosis descargadas durante la prueba. La Fracción de Partı́culas
en el adaptador de boquilla e inmediatamente pulsar para descargar Finas que serı́a emitida desde el inhalador se calcula luego por la
la siguiente dosis mı́nima recomendada. fórmula:
Repetir hasta que se haya descargado el número de dosis R/A.
requerido. El número de dosis mı́nimas recomendadas debe ser tal
que permita una determinación exacta y precisa de la Distribución de
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h601i Aerosoles 259
Tabla 8. Tabla de Resumen de Masas para Análisis de Inhaladores de Dosis Fija e Inhaladores de Polvo Seco
Masa Aparato 1 Aparato 2 Aparato 3a Aparato 4b Aparato 5d Aparato 6d
Adaptador de Ai — AiAi — Ai — Ai — Ai — Ai —
boquilla
Preseparador — — — — AP — — — AP — — —
Estación 0 del A0 B0 — — A0 B0 — — — — — —
impactador
Estación 1 del A1 B1 A1 — A1 B1 A1 — A1 B1 A1 B1
impacta-
dor/borbo-
teador
Estación 2 del A2 B2 A2 B2 A2 B2 A2 B2 A2 B2 A2 B2
impacta-
dor/borbo-
teador
Estación 3 del A3 B3 A3 B3 A3 B3 A3 B3 A3 B3 A3 B3
impacta-
dor/borbo-
teador
Estación 4 del A4 B4 A4 B4 A4 B4 A4 B4 A4 B4 A4 B4
impacta-
dor/borbo-
teador
Estación 5 del A5 B5 A5 B5 A5 B5 — — A5 B5 A5 B5
impacta-
dor/borbo-
teador
Estación 6 del A6 B6 — — A6 B6 — — A6 B6 A6 B6
impacta-
dor/borbo-
teador
Estación 7 del A7 B7 — — A7 B7 — — A7 B7 A7 B7
impacta-
dor/borbo-
teador
Filtro AF BF AF BF AF BF AF BF AF BF AF BF
Suma de Ac Bc Ac Bc Ac Bc Ac Bc Ac Bc Ac Bc
Masas
a
Las Estaciones 6 y 7 se han omitido del Aparato 3 a velocidades de flujo de aire de 460 L por minuto.
b
La Estación 5 del Aparato 4 es la estación de filtro (ver Figura 8).
c
A es la masa total de fármaco recuperada del aparato; B es la masa de fármaco recuperado del impactador (Aparatos 1, 3, 5 y 6) o de las estaciones del
impactador ubicadas debajo de la estación más alta (Aparatos 2 y 4).
d
Para los Aparatos 5 y 6, los valores para las masas de fármaco AF y BF se refieren a recolecciones del MOC o el filtro terminal, si se utiliza, o de ambos.
262 h601i Aerosoles / Pruebas Fı́sicas USP 30
Porcentaje Acumulativo (% Acum.) de Masa de Fármaco Si fuera necesario y cuando fuera apropiado, graficar el porcentaje
Menor que el Diámetro Aerodinámico Declarado—Confeccionar de masa menor que el diámetro aerodinámico establecido, en función
la Tabla 9 dividiendo la masa de fármaco recolectada en la estación del diámetro aerodinámico, D50,Q, en papel para probabilidades
de filtro entre B (ver Tabla 8). Multiplicar el cociente por 100 e logarı́tmicas. Calcular la desviación estándar geométrica (GSD) por
introducir este número como el porcentaje opuesto al diámetro lı́mite la ecuación:
efectivo de la estación inmediata superior en la pila de estaciones del
impactador o borboteador. Para el Aparato 2 ó 4, emplear la
Ecuación 1 para calcular los diámetros lı́mite de estación, D50,Q, a la
velocidad de flujo de aire, Q, utilizada durante la prueba. Para los
Aparatos 5 y 6, emplear la Ecuación 2 con la Tabla 7. Para el
Aparato 1, usar los diámetros lı́mite informados por el fabricante.
Para el Aparato 3, presentar los datos como porcentajes acumula-
tivos de masa para la estación establecida e inferiores y evitar la Utilizar estos datos o el gráfico para determinar los valores de
asignación de valores a los diámetros lı́mite de la estación. MMAD y GSD, (ver Figura 10).
Repetir los cálculos para cada una de las estaciones en la pila de
estaciones del impactador o borboteador, en orden numérico inverso
(de mayor a menor número de estación). Para cada estación, calcular
el porcentaje acumulativo de masa que sea menor que el diámetro
aerodinámico establecido, sumando el porcentaje de masa en esa
estación y el porcentaje de masa total de las estaciones por debajo e
ingresando el valor opuesto al diámetro lı́mite efectivo de la estación
por encima en la pila de estaciones. De esta manera, el porcentaje de
fármaco sobre el filtro puede verse como el que tiene diámetros
aerodinámicos menores que el diámetro lı́mite de la estación por
encima del filtro; y el porcentaje sobre el filtro más el porcentaje de
la estación superior tiene diámetros aerodinámicos menores que el
d i á m e t r o l ı́ m i t e d e l a e s t a c i ó n p o r e n c i m a y
ası́ sucesivamente. Repetir los cálculos para cada una de las
restantes estaciones en orden numérico inverso (ver Tabla 9).
Tabla 9. Porcentaje Acumulativo (% Acum.) de Masa Menor que el Diámetro Aerodinámico Declarado
Procedimiento—Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de 100 mL, emplear una probeta de 100 mL. Nivelar el polvo, si fuera
gases aproximadamente 5 mL de Preparación de Prueba y 5 mL de necesario, cuidadosamente y sin compactar, y tomar la lectura del
Preparación estándar, registrar los cromatogramas y determinar los volumen aparente sin asentar, Vo, con una aproximación a la unidad
cocientes entre las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de más cercana de la escala. Calcular la densidad aparente, en g por
alcohol (v/v) de la muestra en análisis de acuerdo con la fórmula: mL1, por la fórmula:
CD(RU / RS), (M) / (Vo).
en donde C es la concentración de ER Determinación de Alcohol— En general, se recomienda efectuar mediciones repetidas para
Alcohol USP declarada en la etiqueta; D es el factor de dilución (el determinar esta propiedad.
cociente entre el volumen de la Preparación Madre de Prueba y el
volumen de muestra tomado); y RU y RS son los cocientes entre las
respuestas de los picos obtenidos a partir de la Preparación de Método II—Determinación en un Volúmetro
Prueba y de la Preparación Estándar, respectivamente.
Prueba de Aptitud del Sistema—En un cromatograma ade- El aparato (ver Figura 1) que cumple con los requisitos de la
cuado, el factor de resolución, R, no es menor de 2; el factor de Norma ASTM B 329-90 (Volúmetro de Scott)2 se compone de un
asimetrı́a del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones embudo superior con un tamiz de 1,00 mm (N8 18) o con la abertura
repetidas de la Preparación Estándar presentan una desviación de tamiz indicada en la monografı́a individual. El embudo
estándar relativa de no más de 2,0% en el cociente entre el pico de está montado sobre una caja deflectora que contiene cuatro placas
alcohol y el pico del estándar interno. deflectoras de vidrio sobre las que se desliza el polvo y rebota a
medida que pasa. El embudo que se encuentra en el fondo de la caja
deflectora, recoge el polvo y lo vierte en un vaso de capacidad
especificada colocado directamente debajo del embudo. El vaso
puede ser de dos tipos: cilı́ndrico (con una capacidad de
h616i DENSIDAD APARENTE Y 25,00 + 0,05 mL y con un diámetro interno de 30,00 + 2,00 mm)
o cuadrangular (con una capacidad de 16,39 + 0,05 mL y cuyas
DENSIDAD POR ASENTAMIENTO dimensiones internas son de 25,4 + 0,076 mm).
Procedimiento—Dejar que fluya en el aparato un exceso de polvo
y recogerlo en el vaso recolector de la muestra hasta que éste
desborde, usando al menos 25 cm3 de polvo si se trata del vaso
La determinación de la densidad aparente de un sólido es un cuadrangular o 35 cm3 de polvo si se trata del vaso cilı́ndrico. Quitar
procedimiento que a menudo presenta dificultades ya que la más el exceso de polvo del extremo superior del vaso pasando
mı́nima distorsión del lecho da como resultado una nueva densidad suavemente la hoja de una espátula ubicada en dirección
aparente. Además, es evidente que las propiedades que determinan la perpendicular a la superficie y apoyada en el borde superior del
densidad aparente de un polvo dependen del ‘‘historial’’ de ese polvo vaso, tomando las precauciones necesarias para que la espátula
(por ejemplo, cómo se manipuló) y de que éste se pueda asentar de esté siempre perpendicular y ası́ evitar la compactación o la
forma tal que tenga un intervalo de valores de densidad aparente. Por remoción del polvo del vaso. Limpiar el material que hubiera podido
lo tanto, cuando se informa la densidad aparente, es de suma quedar adherido a las paredes laterales del vaso y determinar el peso,
importancia especificar cómo se realizó su determinación. M, de la muestra de polvo con una aproximación de 0,1%. Calcular
Dado que las interacciones entre las partı́culas que afectan las la densidad aparente, expresada en g por mL, por la fórmula:
propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo,
también afectan el flujo del polvo, una comparación entre la (M ) / (Vo),
densidad aparente y la densidad por asentamiento puede proporcio- en donde Vo es el volumen, en mL, del vaso. En general, se
nar una medida de la importancia relativa de estas interacciones en recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones
un polvo determinado. A menudo, este tipo de comparación se repetidas.
emplea como ı́ndice de la capacidad de flujo de un polvo. La
densidad aparente es con frecuencia la densidad aparente del polvo
‘‘según se vertió’’ o tal como fue llenando de manera pasiva un DENSIDAD POR ASENTAMIENTO
recipiente de medición. La densidad por asentamiento es una
densidad limitante obtenida después de ‘‘golpetear’’ el polvo, La densidad por asentamiento se determina golpeteando mecáni-
generalmente con un dispositivo que levanta y deja caer, una camente una probeta de medición que contenga una muestra del
distancia fija, la probeta de medición volumétrica que lo contiene. polvo. Después de observar el volumen inicial, golpetear la probeta
empleando un dispositivo mecánico y tomar las lecturas hasta que
casi no se observen variaciones en el volumen. El asentamiento
DENSIDAD APARENTE mecánico se obtiene levantando la probeta y dejándola caer por su
propio peso una distancia determinada, por alguno de los dos
La densidad aparente se determina midiendo el volumen de una métodos que se describen a continuación. En algunos casos, se
muestra de polvo de masa conocida, que se ha vertido en una probeta prefiere emplear dispositivos que rotan la probeta durante el proceso
graduada pasando a través de un tamiz (Método I); o que se ha de asentamiento a fin de reducir al mı́nimo la posibilidad de que la
vertido en un vaso pasando a través de un aparato para medir el masa se separe durante el asentamiento.
volumen (Método II).
Método I
Método I—Medición en una Probeta Graduada
Procedimiento—A menos que se especifique algo diferente,
Procedimiento—A menos que se especifique algo diferente, pasar una cantidad de material, suficiente para efectuar la prueba, a
pasar una cantidad del material, suficiente para efectuar la prueba, a través de un tamiz de 1,00 mm (N8 18) para deshacer los
través de un tamiz de 1,00 mm (N8 18) para deshacer los aglomerados que se hubieran formado durante el almacenamiento.
aglomerados que se hubieran formado durante el almacenamiento. 1
Introducir sin compactar aproximadamente 100 g de la muestra, M, Normalmente, la densidad de los sólidos se expresa en g por cm3 y la de los
lı́quidos en g por mL; sin embargo, como los volúmenes de polvo se miden
pesada con una exactitud de 0,1%, en una probeta seca de 250 mL. en probetas graduadas en mL, la densidad aparente y la densidad por
Si no se pudieran emplear 100 g, la cantidad de la muestra de prueba asentamiento se expresan en g por mL. Por definición, el volumen expresado
y el volumen de la probeta se pueden modificar, especificando en los en mL es equivalente al volumen expresado en cm3.
resultados las condiciones en las que se realizó la prueba. 2
El aparato, que se puede obtener de empresas proveedoras de equipos
Seleccionar una masa de la muestra con un volumen aparente sin cientı́ficos, se conoce generalmente como ‘‘Scott, Schaeffer and White Paint
asentar de 150 mL a 250 mL. Para volúmenes aparentes de 50 mL a Pigment Volumeter’’.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h616i Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento 265
Método II
Proceder según se indica para el Método I, excepto que se debe
emplear un medidor de densidad por asentamiento mecánico, con
una caı́da fija de 3 mm (+10%) a una velocidad nominal de
250 golpeteos por minuto.
266 h621i Cromatografı́a / Pruebas Fı́sicas USP 30
Se han registrado diferencias en el valor RF cuando los evitar que el disolvente corra hacia abajo sobre el papel cuando se
cromatogramas se desarrollan en la dirección de las fibras del abre la cámara y se retira el cromatograma. La ubicación del frente
papel (dirección de máquina) en comparación con los desarrollados de la fase móvil se marca rápidamente y luego se secan las hojas.
en ángulos rectos con respecto a las fibras; por lo tanto la orientación El cromatograma se observa y se mide directamente o después de
de las fibras del papel con respecto al flujo de disolvente se debe un revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco o de
mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, los fármacos aislados. La sección o secciones del papel que
el fabricante indica la dirección de máquina en los paquetes de papel previamente se ha determinado que contienen el fármaco o fármacos
para cromatografı́a.) aislados pueden cortarse y eluirse con un disolvente apropiado y las
soluciones se pueden llevar a un volumen conocido y se pueden
analizar cuantitativamente mediante técnicas quı́micas o instrumen-
Cromatografı́a Descendente tales apropiadas. Deben realizarse procedimientos similares con
distintas cantidades del estándar de referencia aplicadas de modo
En la cromatografı́a descendente, la fase móvil fluye hacia abajo similar sobre el mismo papel, en el rango de concentraciones que
en la hoja cromatográfica. corresponda, para preparar una curva de calibración válida.
Aparato—El equipo esencial para cromatografı́a descendente
comprende lo siguiente:
Una cámara hermética al vapor provista de entradas para agregar Cromatografı́a Ascendente
el disolvente o para liberar la presión interna. Preferentemente, la
cámara se construye de vidrio, acero inoxidable o porcelana y En la cromatografı́a ascendente, el borde inferior de la hoja (o tira)
está diseñada de manera que se pueda observar el progreso de la se sumerge en la fase móvil para permitir que la fase móvil ascienda
corrida cromatográfica sin abrir la cámara. Los cilindros de vidrio en la hoja cromatográfica por capilaridad.
altos son convenientes, usando tapas y sellos adecuados, si son Aparato—El equipo esencial para la cromatografı́a ascendente es
herméticos al vapor. básicamente el mismo que se describió en la Cromatografı́a
Una gradilla de material resistente a la corrosión aproximada- Descendente.
mente 5 cm más corta que la altura interior de la cámara. La gradilla Procedimiento—Los materiales de prueba se aplican a las hojas
sirve como soporte para las cubetas de solventes y para las varillas cromatográficas según se indica en la Cromatografı́a Descendente
antisifón que, a su vez, sostienen la hoja cromatográfica. por encima del nivel hasta el que se sumerge el papel en la fase
Una o varias cubetas de vidrio capaces de contener un volumen de móvil. El fondo de la cámara de desarrollo está cubierto con la fase
disolvente mayor que el necesario para una corrida cromatográfica. móvil indicada. Si se emplea un sistema de dos fases, se agregan
La longitud de las cubetas debe ser mayor que el ancho de las hojas ambas fases. También es deseable revestir las paredes de la cámara
cromatográficas. con papel y saturar este revestimiento con la fase móvil. Las cubetas
Varillas antisifón de vidrio pesadas, sostenidas por la gradilla y de disolvente vacı́as se colocan en el fondo de la cámara y las hojas
colocadas por fuera del borde de la cubeta de vidrio, en paralelo al cromatográficas se suspenden de manera tal que el borde inferior en
borde y ligeramente por encima. el que se han aplicado las soluciones cuelgue libremente dentro de la
Hojas cromatográficas de papel de filtro especial de un ancho no cubeta vacı́a.
menor de 2,5 cm y no mayor que la longitud de las cubetas, cortadas La cámara se sella y se deja que se equilibre como se describe en
a una longitud aproximadamente igual a la altura de la cámara. Se la Cromatografı́a Descendente. Luego se agrega a la cubeta la fase
traza una lı́nea fina con lápiz horizontalmente a través del papel de móvil a través de la entrada en una cantidad que exceda la requerida
filtro a una distancia del borde tal que, cuando la hoja se suspenda de para humedecer por completo la hoja cromatográfica. Se sella
las varillas antisifón con el extremo superior del papel apoyado en la nuevamente la cámara. Cuando el frente de la fase móvil haya
cubeta y la porción inferior del papel colgando libre y suspendido en alcanzado la altura deseada, se abre la cámara, la hoja se retira y se
la cámara, la lı́nea quede ubicada a unos pocos centı́metros por seca.
debajo de las varillas. Se debe tener cuidado para evitar que se El análisis cuantitativo de las manchas se puede realizar como se
contamine el papel de filtro por manipulación excesiva o por describe en la Cromatografı́a Descendente.
contacto con superficies sucias.
Procedimiento—Se disuelve la sustancia o sustancias que se van
a analizar en un disolvente adecuado. Se aplican volúmenes CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
convenientes, medidos con micropipetas adecuadas, de la solución
resultante que contengan normalmente de 1 mg a 20 mg del En la cromatografı́a en capa delgada, el adsorbente es una capa
compuesto, en manchas de 6 mm a 10 mm y con una separación relativamente delgada y uniforme de material seco, reducido a polvo
de no menos de 3 cm, a lo largo de la lı́nea trazada con lápiz. Si el fino, que se aplica sobre una lámina o placa de vidrio, plástico o
volumen total que se debe aplicar produce manchas de un diámetro metal; las que se utilizan más comúnmente son las placas de vidrio.
mayor de 6 mm a 10 mm, se aplica en varias porciones separadas La placa recubierta puede considerarse una ‘‘columna cromato-
sobre la misma mancha, dejando secar cada porción antes de aplicar gráfica abierta’’ y las separaciones logradas pueden basarse en la
la siguiente. adsorción, la partición o una combinación de ambos efectos, según el
La hoja cromatográfica con las manchas se suspende en la cámara tipo especı́fico de fase estacionaria, su preparación y los disolventes
utilizando la varilla antisifón, que sostiene el extremo superior de la empleados. La cromatografı́a en capa delgada de capas de
hoja en la cubeta del disolvente. El fondo de la cámara está cubierto intercambio iónico puede emplearse para separar compuestos
con la fase móvil indicada. La saturación de la cámara con el vapor polares. La identificación presuntiva se puede efectuar mediante la
del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un observación de las manchas o zonas con valores RF idénticos y de
papel humedecido con la fase móvil indicada. Es importante magnitud aproximadamente igual, obtenidos respectivamente cro-
asegurar que la porción de la hoja que cuelga por debajo de las matografiando una muestra desconocida y una muestra de referencia
varillas esté suspendida libremente en la cámara sin tocar la gradilla en la misma placa. Una comparación visual del tamaño o intensidad
o las paredes de la cámara o el lı́quido que está en el interior de la de las manchas o zonas puede servir para una estimación
cámara. La cámara está sellada para permitir su equilibrio semicuantitativa. Las mediciones cuantitativas se pueden efectuar
(saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Si fuera mediante densitometrı́a (mediciones de absorbancia o de fluores-
necesario, se liberará cualquier exceso de presión que se produzca. cencia) o bien pueden retirarse cuidadosamente las manchas de la
En el caso de cámaras grandes, puede ser necesario equilibrarlas placa, luego eluirse con un disolvente adecuado y medirse
durante toda la noche. espectrofotométricamente. Para la cromatografı́a en capa delgada
Un volumen de fase móvil que exceda el volumen requerido para bidimensional, la placa, una vez cromatografiada, se gira en ángulo
el desarrollo completo del cromatograma se satura por agitación con recto y se cromatografı́a de nuevo, generalmente en otra cámara
la fase estacionaria. Después de equilibrar la cámara, la fase móvil equilibrada con una fase móvil diferente.
preparada se introduce en la cubeta a través de la entrada. Luego se Aparato—El equipo y los materiales aceptables para la
cierra la entrada y se deja que la fase móvil se desplace hacia abajo la cromatografı́a en capa delgada comprenden lo siguiente:
distancia deseada sobre el papel. Se deben tomar precauciones para
268 h621i Cromatografı́a / Pruebas Fı́sicas USP 30
Una placa para cromatografı́a en capa delgada (TLC, por sus Desarrollo Horizontal—Introducir una cantidad suficiente de la
siglas en inglés) o para cromatografı́a en capa delgada de alta fase móvil en el reservorio de la cámara utilizando una jeringa o
resolución (HPTLC, por sus siglas en inglés). Por lo general, la pipeta. Colocar la placa horizontalmente en la cámara, conectar el
cromatografı́a se lleva a cabo utilizando hojas o placas previamente dispositivo para dirigir la fase móvil de acuerdo con las instrucciones
recubiertas (en soporte de vidrio, aluminio o poliéster) de tamaño del fabricante y cerrar la cámara. Si se indica, desarrollar la placa
adecuado. Puede ser necesario limpiar las placas antes de la comenzando simultáneamente en ambos extremos. Retirar la placa
separación. Esto se puede lograr mediante migración de un cuando la fase móvil se haya desplazado la distancia indicada en la
disolvente adecuado o inmersión en él. Las placas también pueden monografı́a. Secar la placa y visualizar los cromatogramas según se
estar impregnadas mediante procedimientos como por ejemplo el indica.
desarrollo, la inmersión o el rociado. En el momento de uso, la Para la cromatografı́a bidimensional, secar las placas después del
placas se pueden activar, si fuera necesario, calentándolas en una primer desarrollo y realizar un segundo desarrollo en una dirección
estufa a 1208 durante 20 minutos. La fase estacionaria de las placas perpendicular a la del primer desarrollo.
de TLC tiene un tamaño de partı́cula promedio de 10–15 mm y el de Detección—Observar la placa seca en primer lugar bajo luz UV de
las placas de HPTLC un tamaño de partı́cula promedio de 5 mm. Se longitud de onda corta (254 nm) y luego bajo luz UV de longitud de
pueden utilizar placas comerciales con una zona preadsorbente si su onda larga (365 nm) o según se indica en la monografı́a. Si además
uso se especifica en una monografı́a. La muestra aplicada a la región se indicara, rociar, sumergir o exponer la placa a los vapores del
preabsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas reactivo especificado, calentar la placa cuando se requiera, observar
en la interfase entre el preabsorbente y el sorbente. Alternativamente, y comparar el cromatograma de prueba con el cromatograma
se pueden recubrir placas de vidrio planas de tamaño conveniente, estándar. Documentar los resultados de la placa después de cada
normalmente de 20 cm 6 20 cm, según se describe en la observación. Medir y registrar la distancia hasta cada mancha o zona,
Preparación de Placas Cromatográficas. desde el punto de origen e indicar, para cada mancha o zona, la
Un dispositivo de aplicación manual, semiautomático o auto- longitud de onda bajo la que se observó. Determinar los valores RF
mático adecuado se puede utilizar para asegurar una colocación para las manchas o zonas principales (ver Glosario de Sı́mbolos).
correcta de la placa y una apropiada transferencia de la muestra, con Medición Cuantitativa—Utilizando la instrumentación apro-
respecto al volumen y a la posición, a la placa. Alternativamente se piada, se pueden determinar directamente en la placa las sustancias
puede utilizar una plantilla como guı́a para aplicar manualmente las separadas por TLC que responden a la radiación ultravioleta o
manchas de prueba a intervalos definidos, para marcar distancias visible (UV-Vis) antes o después de ser derivatizadas. Mientras se
según sea necesario y para ayudar a etiquetar las placas. Para la mueve la placa o el dispositivo de medición, la placa se examina
correcta aplicación de las soluciones, se recomiendan micropipetas, midiendo la reflectancia de la luz incidente. De manera similar, la
microjeringas o capilares calibrados desechables. fluorescencia se mide utilizando un sistema óptico adecuado. Las
Para el desarrollo ascendente, se utiliza una cámara cromato- sustancias que contienen radionucleidos se pueden cuantificar de tres
gráfica de un material inerte transparente y con las siguientes formas: (1) directamente moviendo la placa a lo largo de un contador
especificaciones: una cubeta de fondo plano o cubetas gemelas, con adecuado o viceversa; (2) cortando las placas en tiras y midiendo la
una tapa que cierre herméticamente y de un tamaño adecuado para radioactividad en cada tira individual, utilizando un contador
las placas. Para el desarrollo horizontal, la cámara está provista de un adecuado; o (3) raspando la fase estacionaria, disolviéndola en un
recipiente para la fase móvil y también contiene un dispositivo para cóctel de centelleo adecuado y midiendo la radioactividad
dirigir la fase móvil hacia la fase estacionaria. empleando un contador de centelleo lı́quido (ver Radioactividad
Dispositivos para transferencia de reactivos a la placa mediante h821i).
rociado, inmersión o exposición a vapor y dispositivos para facilitar El aparato para la medición cuantitativa directa en la placa es un
el calentamiento necesario para la visualización de las zonas o densitómetro que consta de un dispositivo mecánico para mover la
manchas separadas. placa o el dispositivo de medición a lo largo del eje x y el eje y, un
Una fuente de luz UV adecuada para realizar observaciones bajo registrador, una computadora o un integrador adecuados y, para las
luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm). sustancias que responden a la radiación UV-Vis, un fotómetro con
Un dispositivo para documentar adecuadamente el resultado una fuente de luz, un dispositivo óptico capaz de generar luz
cromatográfico visualizado. monocromática y una fotocélula de sensibilidad suficiente; todos
Procedimiento—Aplicar el volumen indicado de la solución de estos instrumentos se utilizan para la medición de la reflectancia.
prueba y de la solución estándar en porciones lo suficientemente Cuando se mide la fluorescencia, también se requiere un filtro
pequeñas para obtener manchas circulares de 2 mm a 5 mm de adecuado que impida que la luz utilizada para la excitación alcance
diámetro (de 1 mm a 2 mm en placas para HPTLC) o en bandas de la fotocélula y que a la vez permita que la luz emitida o porciones
10 mm a 20 mm por 1 mm a 2 mm (de 5 mm a 10 mm por 0,5 mm a especı́ficas de ella la atraviesen. El intervalo de linealidad del
1 mm en placas para HPTLC) a una distancia apropiada del borde dispositivo contador se debe verificar.
inferior—durante la cromatografı́a, la posición de aplicación debe Para pruebas cuantitativas, es necesario aplicar a la placa no
estar de 3 mm (para HPTLC) a 5 mm (para TLC) por encima del menos de tres soluciones estándar de la sustancia a examinar, cuyas
nivel de la fase móvil— y de los bordes laterales de la placa. Aplicar concentraciones cubran el intervalo de valores esperado en la
las soluciones en una lı́nea paralela al borde inferior de la placa con solución de prueba (por ejemplo, 80%, 100% y 120%). Realizar la
una separación mı́nima de 10 mm (5 mm para placas de HPTLC) derivatización con el reactivo indicado, si fuera necesario, y registrar
entre los centros de las manchas o 4 mm (2 mm en placas de la reflectancia o fluorescencia en los cromatogramas obtenidos.
HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen. Utilizar los resultados determinados para el cálculo de la cantidad de
Desarrollo Ascendente—Revestir como mı́nimo una pared de la sustancia presente en la solución de prueba.
cámara cromatográfica con papel de filtro. Verter en la cámara Preparación de Placas Cromatográficas—
cromatográfica una cantidad de fase móvil que sea suficiente para el Aparato—
tamaño de la cámara de modo que proporcione, después de Placas de vidrio planas de un tamaño adecuado, normalmente de
impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado a 20 cm 6 20 cm.
la dimensión de la placa utilizada. Para lograr la saturación de la Una bandeja de alineación o una superficie plana sobre la cual se
cámara cromatográfica, cerrar la tapa y dejar que el sistema se alinean y apoyan las placas durante la aplicación del adsorbente.
equilibre. A menos que se indique algo diferente, la separación se Una gradilla de almacenamiento para sostener las placas
realiza en la cámara saturada. preparadas durante el secado y el transporte. La gradilla que sostiene
Colocar la placa en la cámara, asegurándose de que la placa las placas debe mantenerse en un desecador o debe poder sellarse
esté tan vertical como sea posible y que las manchas o bandas estén para proteger las placas del medio ambiente después de retirarlas de
por encima de la superficie de la fase móvil y cerrar la cámara. La la estufa de secado.
fase estacionaria está ubicada mirando hacia el interior de la cámara. El adsorbente consta de materiales adsorbentes finamente
Retirar la placa cuando la fase móvil se haya desplazado la distancia divididos, normalmente de 5 mm a 40 mm de diámetro, adecuados
indicada. Secar la placa y visualizar los cromatogramas según se para cromatografı́a. Pueden aplicarse directamente sobre la placa de
indica. Para la cromatografı́a bidimensional, secar las placas después vidrio o unirse a la placa mediante yeso Parı́s [sulfato de calcio
del primer desarrollo y realizar un segundo desarrollo en una hemihidrato (en una proporción de 5% a 15%)] o con pasta de
dirección perpendicular a la del primer desarrollo.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h621i Cromatografı́a 269
almidón u otros aglutinantes. El yeso Parı́s no produce una superficie Cromatografı́a de Adsorción en Columna
tan dura como el almidón, pero no se ve afectado por reactivos de
rociado fuertemente oxidantes. El adsorbente puede contener El adsorbente (como por ejemplo alúmina o gel de sı́lice
materiales fluorescentes que ayuden a la visualización de las activados, sı́lice de diatomeas calcinado o tierra silı́cea purificada
manchas que absorben luz UV. para cromatografı́a) se introduce como relleno, en forma de sólido
Un esparcidor que, cuando se mueve sobre la placa de vidrio, seco o de suspensión espesa, dentro de una columna cromatográfica
aplica una capa uniforme del adsorbente del espesor deseado sobre de vidrio o cuarzo. En la parte superior de la columna, se agrega una
toda la superficie de la placa. solución del fármaco en una cantidad pequeña de disolvente y se
Procedimiento—[NOTA—En este procedimiento, usar Agua Puri- deja que fluya en el adsorbente. Los principios activos se separan
ficada obtenida por destilación.] Limpiar las placas de vidrio cuantitativamente de la solución y quedan absorbidos en una banda
escrupulosamente, empleando una solución de limpieza apropiada transversal estrecha en la parte superior de la columna. A medida que
(ver Limpieza de Materiales de Vidrio h1051i), enjuagándolas con se deja fluir una cantidad adicional de disolvente a través de la
cantidades abundantes de agua hasta que el agua corra por las placas columna, ya sea sólo por gravedad o mediante la aplicación de aire
sin dejar marcas visibles de agua o aceite; luego secar. Es importante a presión, cada sustancia se desplaza hacia abajo en la columna a una
que las placas estén completamente exentas de pelusa y polvo velocidad caracterı́stica y se produce una separación espacial que da
cuando se aplica el adsorbente. lo que se conoce como cromatograma. La velocidad de movimiento
Colocar la placa o placas en la bandeja de alineación; colocar una para una sustancia se ve afectada por diversas variables, que
placa de 5 cm 6 20 cm adyacente al borde frontal de la primera incluyen el poder de adsorción del adsorbente, su tamaño de
placa cuadrada y otra de 5 cm 6 20 cm, adyacente al borde posterior partı́cula y el área; la naturaleza y polaridad del disolvente; la presión
de la última placa cuadrada y asegurar todas las placas para que no se aplicada o la carga hidrostática; y la temperatura del sistema
deslicen durante la aplicación del adsorbente. Colocar el esparcidor cromatográfico.
en la última placa opuesta al extremo elevado de la bandeja de Si los compuestos separados tienen color o si son fluorescentes
alineación. Mezclar 1 parte de adsorbente con 2 partes de agua (o la bajo la luz UV, la columna adsorbente puede extrudirse y luego,
proporción sugerida por el proveedor), agitar vigorosamente durante mediante cortes transversales, se pueden aislar los segmentos
30 segundos en un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio y correspondientes. Luego, los compuestos deseados se extraen de
transferir la suspensión espesa al esparcidor. Generalmente, 30 g de cada segmento con un disolvente adecuado. Si los compuestos son
adsorbente y 60 mL de agua son suficientes para cinco placas de 20 incoloros, se pueden ubicar pintando o rociando la columna extruida
cm 6 20 cm. Cuando se emplea yeso Parı́s como aglutinante, se con reactivos cromogénicos. Si las sustancias cromatografiadas son
debe completar la aplicación de los adsorbentes dentro del plazo de radioactivas, pueden ser ubicadas por medio de detectores Geiger-
2 minutos desde la adición del agua, ya que posteriormente la mezcla Müller o instrumentos registradores y sensores similares. Los tubos
empieza a endurecer. Deslizar el esparcidor suavemente sobre las de plástico transparente hechos con un material como por ejemplo
placas hacia el extremo elevado de la bandeja de alineación y retirar nailon, que es inerte a la mayorı́a de los disolventes y transparente
el esparcidor cuando esté sobre la última placa próxima al extremo a la luz UV de longitud de onda corta, se pueden rellenar con
elevado de la bandeja de alineación. (Lavar los restos de adsorbente adsorbente y usarse como una columna cromatográfica. Tal columna
que queden en el esparcidor inmediatamente después de usar). No puede cortarse con una cuchilla filosa sin retirar el relleno del tubo.
mover las placas durante 5 minutos, luego transferir las placas Si se emplea un adsorbente fluorescente, la columna puede marcarse
cuadradas a la gradilla de almacenamiento con la capa hacia arriba y bajo luz UV para prepararla antes del corte.
secar a 1058 durante 30 minutos. Preferentemente colocar la gradilla Los cromatogramas de ‘‘flujo’’, que se emplean ampliamente, se
con cierto ángulo en la estufa de secado para impedir la obtienen mediante un procedimiento en el que se deja que los
condensación de la humedad en las caras posteriores de las placas disolventes fluyan a través de la columna hasta que el fármaco
en la gradilla. Cuando las placas estén secas, dejar que se enfrı́en separado aparezca en la solución efluente, conocida como ‘‘eluato’’.
a temperatura ambiente e inspeccionar la uniformidad de la El fármaco puede determinarse en el eluato mediante una valoración
distribución y la textura de la capa adsorbente; la luz transmitida volumétrica o por un método espectrofotométrico o colorimétrico,
muestra uniformidad en la distribución y la luz reflejada muestra o se puede evaporar el disolvente, dejando el fármaco en forma más
uniformidad en la textura. Almacenar las placas satisfactorias sobre o menos pura. Si en el procedimiento está involucrado un segundo
gel de sı́lice en una cámara adecuada. principio activo, se eluye a continuación con el mismo disolvente
o pasando un disolvente de mayor poder eluyente a través de la
columna. La eficiencia de la separación puede controlarse realizando
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA una cromatografı́a en capa delgada de las fracciones individuales.
A veces se emplea un procedimiento modificado para agregar la
mezcla a la columna. El fármaco en forma sólida y, como en el caso
Aparato—El aparato requerido para los procedimientos cromato- de una tableta pulverizada, sin separación de los excipientes, se
gráficos en columna es sencillo y consta solamente del tubo mezcla con algún adsorbente y se agrega a la parte superior de la
cromatográfico y una varilla compactadora, que puede necesitarse columna. El flujo subsiguiente del disolvente desplaza el fármaco
para colocar un trozo de lana de vidrio o algodón, si fuera necesario, hacia abajo a través de la columna de la manera descrita.
en la base del tubo y comprimir el adsorbente o la suspensión espesa
uniformemente dentro del tubo. En algunos casos, un disco de vidrio
poroso está soldado a la base del tubo para sostener el contenido. El
tubo es cilı́ndrico y de vidrio, a menos que se especifique otro Cromatografı́a de Partición en Columna
material en la monografı́a individual correspondiente. Un tubo de
salida de diámetro más pequeño se suelda o se une de otra forma En la cromatografı́a de partición, las sustancias que se desea
mediante una junta a prueba de filtraciones al extremo inferior del separar se dividen entre dos lı́quidos inmiscibles, uno de los cuales,
tubo principal. Las dimensiones de la columna son variables; las más la fase inmóvil o estacionaria, se adsorbe en un Soporte Sólido,
comúnmente empleadas en el análisis farmacéutico varı́an de 10 mm presentando de ese modo un área de contacto muy grande con el
a 30 mm de diámetro interior uniforme y de 150 mm a 400 mm de disolvente que fluye o fase móvil. El gran número de contactos
largo, excluyendo el tubo de salida. El tubo de salida, generalmente sucesivos lı́quido-lı́quido permite una eficiencia en la separación que
de 3 mm a 6 mm de diámetro interno, puede incluir una llave de paso no se logra en la extracción común lı́quido-lı́quido.
para el control exacto de la velocidad de flujo de los disolventes El Soporte Sólido es generalmente polar y la fase estacionaria
a través de la columna. La varilla compactadora, un pistón cilı́ndrico adsorbida es más polar que la fase móvil. El Soporte Sólido que se
unido firmemente a un eje, puede estar hecho de plástico, vidrio, emplea con mayor frecuencia es la tierra silı́cea para cromatografı́a,
acero inoxidable o aluminio, a menos que se especifique un material que tiene un tamaño de partı́cula adecuado para permitir un flujo
diferente en la monografı́a individual. El diámetro del eje de la apropiado del eluyente.1 En la cromatografı́a de partición en fase
varilla es sustancialmente más pequeño que el diámetro de la reversa, la fase inmóvil absorbida es menos polar que la fase móvil y
columna y no es menos de 5 cm más largo que la longitud efectiva
de la columna. El pistón tiene un diámetro que es aproximadamente
1 mm más pequeño que el diámetro interior de la columna. 1
Se puede obtener un grado adecuado en Johns-Manville Corp., 22 East 40th
St., New York, NY 10016, disponible como Celite 545 lavado con ácido.
270 h621i Cromatografı́a / Pruebas Fı́sicas USP 30
el adsorbente sólido se torna no polar mediante el tratamiento con un en varias porciones pequeñas, permitiendo que cada una drene
agente silanizante, como por ejemplo el diclorodimetilsilano, para completamente, antes de agregar el grueso de la Fase Móvil. Cuando
obtener la tierra silı́cea cromatográfica silanizada. la valoración o la prueba requieren el uso de columnas cromato-
La muestra que se va a cromatografiar se introduce generalmente gráficas múltiples montadas en serie y se especı́fica el agregado de la
en el sistema cromatográfico por alguno de los dos métodos Fase Móvil en porciones divididas, dejar que cada porción drene
siguientes: (a) una solución de la muestra en un volumen pequeño de completamente a través de cada columna y enjuagar la punta de cada
la fase móvil se agrega a la parte superior de la columna; o (b) una una con la Fase Móvil antes de agregar cada porción sucesiva.
solución de la muestra en un volumen pequeño de la fase
estacionaria se mezcla con el Soporte Sólido y se transfiere a la
columna como una capa colocada por encima de un lecho CROMATOGRAFÍA DE GASES
constituido por una mezcla de la fase estacionaria y adsorbente.
El desarrollo y la elución se logran con el flujo del disolvente Las caracterı́sticas distintivas de la cromatografı́a de gases son una
como se describió anteriormente. Generalmente, se satura la fase fase móvil gaseosa y una fase estacionaria lı́quida inmovilizada o
móvil con el disolvente estacionario antes del uso. sólida. Las fases estacionarias lı́quidas están disponibles en
En la cromatografı́a de partición convencional lı́quido-lı́quido, el columnas capilares o rellenas. En las columnas rellenas, la fase
grado de partición de un compuesto dado entre las dos fases lı́quidas lı́quida se deposita en un soporte sólido finamente dividido, inerte,
se expresa por su coeficiente de partición o de distribución. En el como por ejemplo la tierra de diatomeas, polı́meros porosos o
caso de los compuestos que se disocian, la distribución se puede carbono grafito, con el que se rellena una columna que tı́picamente
controlar modificando el pH, la constante dieléctrica, la fuerza iónica tiene de 2 mm a 4 mm de diámetro interno y de 1 m a 3 m de
y otras propiedades de las dos fases. La elución selectiva de los longitud. En las columnas capilares, que no contienen relleno, la fase
componentes de una mezcla se puede lograr cambiando sucesiva- lı́quida se deposita en la superficie interna de la columna y puede
mente la fase móvil por una que proporcione un coeficiente de unirse quı́micamente a ella. En la cromatografı́a gas-sólido, la fase
partición más favorable, o cambiando el pH de la fase estacionaria in sólida es un adsorbente activo, como por ejemplo alúmina, sı́lice o
situ con una fase móvil que conste de una solución de un ácido o una carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas porosas
base apropiados en un disolvente orgánico. poliaromáticas, que a veces se emplean en las columnas rellenas, no
A menos que se especifique algo diferente en la monografı́a se recubren con una fase lı́quida.
individual, las valoraciones y las pruebas que emplean cromatografı́a Cuando se introduce un compuesto vaporizado en el gas
de partición en columna se llevan a cabo según los siguientes transportador y se lleva a la columna, se divide entre el gas y la
métodos generales. fase estacionaria mediante un proceso de distribución dinámico en
Soporte Sólido—Usar tierra silı́cea purificada. Usar tierra silı́cea contracorriente. El compuesto se transporta a través de la columna
silanizada para cromatografı́a de partición en fase reversa. mediante el gas transportador, y es retardado en mayor o menor
Fase Estacionaria—Emplear el disolvente o la solución especi- grado por la sorción y desorción en la fase estacionaria. La elución
ficada en la monografı́a individual. Si se emplea una mezcla de del compuesto se caracteriza por la constante de partición, k’, un
lı́quidos como Fase Estacionaria, mezclarlos antes de la introduc- valor adimensional también llamado factor de capacidad (ver
ción del Soporte Sólido. Glosario de Sı́mbolos para obtener la definición de los sı́mbolos).
Es equivalente al cociente entre el tiempo requerido para que el
Fase Móvil—Emplear el disolvente o la solución especificada en compuesto fluya a través de la columna (el tiempo de retención) y el
la monografı́a individual. Equilibrar con agua si la Fase Estacio- tiempo de elución de un compuesto que no se retiene. El valor del
naria es una solución acuosa; si la Fase Estacionaria es un lı́quido factor de capacidad depende de la naturaleza quı́mica del compuesto;
orgánico polar, equilibrar con ese lı́quido. de la naturaleza, la cantidad y la superficie de la fase lı́quida; de la
Preparación de la Columna Cromatográfica—A menos que se temperatura de la columna y de la velocidad de flujo del gas. En
especifique algo diferente en la monografı́a individual, el tubo presencia de un conjunto especı́fico de condiciones experimentales,
cromatográfico es de aproximadamente 22 mm de diámetro interno y cada compuesto tiene un factor de capacidad caracterı́stico. La
de 200 mm a 300 mm de largo, sin disco de vidrio poroso, al que se separación por cromatografı́a de gases ocurre sólo si los compuestos
une un tubo de salida, sin llave de paso, de alrededor de 4 mm de involucrados tienen diferentes factores de capacidad.
diámetro interno y aproximadamente 50 mm de largo. Rellenar con Aparato—Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas
un trozo de lana de vidrio fina la base del tubo. Colocar el volumen transportador, un inyector, una columna, un detector y un dispositivo
especificado de Fase Estacionaria en un vaso de precipitados de 100 registrador. El inyector, la columna y el detector tienen una
mL a 250 mL, agregar la cantidad especificada de Soporte Sólido y temperatura controlada. Los gases transportadores tı́picos son
mezclar para producir una mezcla homogénea y esponjosa. helio, nitrógeno o hidrógeno, dependiendo de la columna y el
Transferir esta mezcla al tubo cromatográfico y apisonar empleando detector en uso. El gas se administra desde un cilindro a alta presión
presión suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad o desde un generador de gases de alta pureza y pasa, a través de
especificada de Soporte Sólido es más de 3 g, transferir la mezcla a la válvulas reductoras de presión y un medidor de flujo adecuados, al
columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar cada inyector y a la columna. Los compuestos que se van a
porción. Si la valoración o la prueba requieren una columna cromatografiar, en solución o como gases, se inyectan en la corriente
multisegmento, con una Fase Estacionaria diferente especificada gaseosa a través del inyector. Según la configuración del aparato, la
para cada segmento, apisonar después de la adición de cada mezcla de prueba puede inyectarse directamente en la columna o se
segmento y agregar cada segmento directamente sobre el anterior. vaporiza en el inyector y se mezcla con el gas transportador antes de
Si la solución del analito se incorpora en la Fase Estacionaria, ingresar a la columna.
completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico Una vez en la columna, los compuestos de la mezcla de prueba se
lavando el vaso de precipitados empleado para la preparación de separan en virtud de las diferencias en sus factores de capacidad que,
la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g de a su vez, dependen de la presión de vapor y el grado de interacción
Soporte Sólido y varias gotas del disolvente usado para preparar la con la fase estacionaria. El factor de capacidad, que rige la
solución de prueba. resolución, los tiempos de retención y la eficiencia de la columna de
Rellenar con un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno los componentes de la mezcla, también depende de la temperatura.
completo de la columna. La Fase Móvil fluye a través de la columna Esta dependencia se aprovecha para lograr una separación eficaz de
bien rellena como una corriente moderada o, si se aplica los compuestos que difieren ampliamente en presión de vapor,
cromatografı́a en fase reversa, como un goteo lento. mediante el uso de hornos de temperatura programable para la
Procedimiento—Transferir la Fase Móvil al espacio de la columna.
columna por encima del relleno de la columna y permitir que Los compuestos resueltos, a medida que eluyen por separado de la
fluya a través de la columna por acción de la gravedad. Enjuagar la columna, pasan a través de un detector diferencial, que responde a la
punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 mL de cantidad de cada compuesto presente. El tipo de detector que se
Fase Móvil antes de cada cambio en la composición de la Fase Móvil emplea depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y
y después de completar la elución. Si el analito se introduce en la se especifica en la monografı́a individual. Los detectores se calientan
columna como una solución en la Fase Móvil, permitir que pase para impedir la condensación de los compuestos eluidos.
completamente al relleno de la columna y luego agregar Fase Móvil
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h621i Cromatografı́a 271
La señal de salida de los detectores se registra como una función menos que se especifique algo diferente en la monografı́a individual,
del tiempo, produciendo un cromatograma que consta de una serie las velocidades de flujo para las columnas rellenas son aproxima-
de picos en un eje de tiempo. Cada pico representa un compuesto en damente de 30 mL a 60 mL por minuto. Para las columnas capilares,
la mezcla vaporizada, aunque algunos picos pueden superponerse. El se emplea a menudo la velocidad de flujo lineal en lugar de la
tiempo de elución es una caracterı́stica de un compuesto individual y velocidad de flujo. Ésta se determina cómodamente a partir de la
la respuesta del instrumento, medida como área o altura del pico, es longitud de la columna y el tiempo de retención de una muestra de
una función de la cantidad presente. metano diluida, siempre que se utilice un detector de ionización a la
Inyectores—Los dispositivos de inyección de muestras varı́an llama. A temperaturas operativas altas se produce una presión de
desde simples jeringas hasta inyectores totalmente automáticos y vapor suficiente para dar lugar a una pérdida gradual de la fase
programables. La cantidad de muestra que puede inyectarse en una lı́quida, un proceso que se denomina purga.
columna capilar sin sobrecargarla es pequeña comparada con la Detectores—Para la mayorı́a de los análisis farmacéuticos se
cantidad que puede inyectarse en las columnas rellenas y puede ser emplean detectores de ionización a la llama; menos usados son los
menor que la cantidad más pequeña que puede manipularse detectores de conductividad térmica, de captura electrónica, de
satisfactoriamente con la jeringa. En consecuencia, las columnas nitrógeno-fósforo y los de espectrometrı́a de masa. Para los análisis
capilares se emplean a menudo con inyectores capaces de dividir las cuantitativos, los detectores deben tener un intervalo dinámico lineal
muestras en dos fracciones; una pequeña que se introduce en la amplio: la respuesta debe ser directamente proporcional a la cantidad
columna y una grande que se desecha. Tales inyectores pueden de compuesto presente en el detector para un intervalo amplio de
emplearse en una modalidad sin división para el análisis de trazas o concentraciones. Los detectores de ionización a la llama tienen un
componentes minoritarios. intervalo lineal amplio y son sensibles a la mayorı́a de los
Los inyectores de purga y trampa están equipados con un compuestos orgánicos. La respuesta de los detectores depende de
dispositivo de burbujeo mediante el cual los compuestos volátiles de la estructura y la concentración del compuesto y de las velocidades
la solución se transportan a una trampa de baja temperatura. Una vez de flujo de los gases de combustión, del aire, del gas de
que se completa el burbujeo, los compuestos atrapados se desorben compensación y del gas transportador. A menos que se especifique
en el gas transportador mediante el calentamiento rápido de la algo diferente en las monografı́as individuales, los detectores de
trampa, que posee un dispositivo programable de temperatura. ionización a la llama se emplean con helio o nitrógeno como gas
Los inyectores de cámara gaseosa están equipados con una cámara transportador con columnas rellenas y con helio o hidrógeno con
de calentamiento de muestra con control termostático. Las muestras columnas capilares.
lı́quidas o sólidas se colocan en envases herméticamente cerrados y El detector de conductividad térmica emplea un alambre
se calientan en la cámara durante un perı́odo de tiempo fijo, lo que calentado, colocado en la corriente del gas transportador. Cuando
permite que los componentes volátiles de la muestra alcancen un un analito entra en el detector junto con el gas transportador, se mide
equilibrio entre la fase no gaseosa y la gaseosa. la diferencia de conductividad térmica de la corriente de gas (gas
Una vez establecido el equilibrio, el inyector introduce auto- transportador y componentes de la muestra) en relación con la de un
máticamente una cantidad determinada de la fase gaseosa presente flujo de referencia del gas transportador solo. Por lo general, el
en el envase de la muestra en el cromatógrafo de gases. detector de conductividad térmica responde en forma uniforme a los
Columnas—Las columnas capilares que por lo general están compuestos volátiles, cualquiera que sea su estructura; sin embargo,
hechas de sı́lice fundida, tı́picamente tienen un diámetro interno de es considerablemente menos sensible que el detector de ionización a
0,2 mm a 0,53 mm y una longitud de 5 m a 60 m. La fase lı́quida o la llama.
estacionaria, que a veces se une quı́micamente a la superficie interna, El detector de ionización a la llama alcalino, a veces llamado
tiene de 0,1 mm a 1,0 mm de espesor, aunque las fases estacionarias detector de nitrógeno-fósforo o NP (por sus siglas en inglés),
no polares pueden medir hasta 5 mm de espesor. En el apartado contiene una fuente termoiónica, como por ejemplo una sal de un
Reactivos para Cromatografı́a se incluye una lista con las fases metal alcalino o un elemento de vidrio que contenga rubidio u otro
lı́quidas que se utilizan en la actualidad. metal, que produce una ionización eficaz de compuestos con
Las columnas rellenas, de vidrio o metal, son de 1 m a 3 m de nitrógeno y fósforo orgánicos. Es un detector selectivo que muestra
largo con diámetros internos de 2 mm a 4 mm. Los rellenos poca respuesta a los hidrocarburos.
utilizados para el análisis son generalmente polı́meros porosos o El detector de captura electrónica contiene una fuente radioactiva
soportes sólidos con cargas de fase lı́quida de aproximadamente 5% de radiación ionizante. Presenta una respuesta sumamente alta a
(p/p). Las columnas de alta capacidad, con cargas de fase lı́quida de compuestos que contienen halógenos y grupos nitro pero una
aproximadamente 20% (p/p), se emplean para muestras de prueba respuesta pequeña a los hidrocarburos. La sensibilidad aumenta con
grandes y para la determinación de compuestos de bajo peso el número y peso atómico de los átomos halógenos.
molecular como el agua. La capacidad requerida influye en la Dispositivos de Recolección de Datos—Las estaciones de datos
elección del soporte sólido. modernas reciben la señal de los detectores y calculan las áreas de
Los soportes para analizar compuestos polares en columnas con los picos y las alturas máximas e imprimen el cromatograma
fases lı́quidas de baja polaridad, con baja capacidad, deben ser completo con los parámetros de la corrida y de los picos. Los datos
inertes para evitar la aparición de asimetrı́a en los picos. La cromatográficos pueden almacenarse y reprocesarse, con la posibi-
reactividad de los materiales de soporte puede reducirse mediante lidad de realizar cambios en la integración y otras variables de
silanización antes del revestimiento con la fase lı́quida. La tierra de cálculo según sea necesario. Las estaciones de datos se emplean
diatomeas fundido-calcinada lavada con ácido a menudo se emplea también para programar la cromatografı́a, controlando la mayorı́a de
para el análisis de fármacos. Hay materiales de soporte disponibles las variables operativas y proporcionando perı́odos largos de
en diversos tamaños de malla, y las más comúnmente utilizadas en operación sin necesidad de supervisión.
columnas de 2 mm a 4 mm son las mallas 80 a 100 y 100 a 120. Los Los datos también pueden recolectarse para ser medidos
soportes y las fases lı́quidas se enumeran en el apartado Reactivos manualmente en registradores sencillos o en integradores con
para Cromatografı́a. distintas capacidades que varı́an desde aquellos que proporcionan
El tiempo de retención y la eficiencia máxima dependen de la una copia impresa de las áreas de los picos a los que son capaces de
velocidad de flujo del gas transportador; el tiempo de retención es proporcionar cromatogramas con áreas y alturas de los picos
también directamente proporcional a la longitud de la columna, calculados y de almacenar datos para un posible reprocesamiento.
mientras que la resolución es proporcional a la raı́z cuadrada de la Procedimiento—Las columnas capilares y rellenas deben acon-
longitud de la columna. Para las columnas rellenas, la velocidad de dicionarse antes del uso, hasta que la lı́nea de base y otras
flujo del gas transportador se expresa generalmente en mL por caracterı́sticas sean estables. Esto puede hacerse mediante la
minuto a presión atmosférica y temperatura ambiente. Se mide a la operación a una temperatura mayor a la requerida para el método
salida del detector con un caudalı́metro mientras la columna está a la o mediante inyecciones repetidas del compuesto o la mezcla que se
temperatura operativa. La velocidad de flujo lineal a través de una va a cromatografiar. Los distribuidores de columnas y materiales de
columna rellena es inversamente proporcional al cuadrado del relleno proporcionan instrucciones relativas al acondicionamiento
diámetro de la columna para un volumen de flujo dado. Velocidades recomendado. En el caso de polisiloxanos sustituidos por metilos y
de flujo de 60 mL por minuto en una columna de 4 mm y de 15 mL fenilos, térmicamente estables, una secuencia especial aumenta la
por minuto en una columna de 2 mm producen velocidades de flujo inercia y la eficiencia; mantener la columna a una temperatura de
lineal idénticas y por lo tanto tiempos de retención similares. A 2508 durante una hora con un flujo de helio para eliminar el oxı́geno
272 h621i Cromatografı́a / Pruebas Fı́sicas USP 30
y los disolventes. Detener el flujo de helio, calentar aproximada- programarse para variar la relación entre los componentes de la
mente a 3408 durante 4 horas; luego reducir el calentamiento a una fase móvil, según se requiera para la cromatografı́a en gradiente, o
temperatura de 2508 y acondicionar con flujo de helio hasta lograr la para mezclar la fase móvil en corridas isocráticas (es decir, fases
estabilidad. móviles que tienen una composición fija de disolventes). Sin
La mayorı́a de los fármacos son moléculas polares reactivas. Una embargo, la proporción de los ingredientes en las fases móviles
cromatografı́a exitosa puede requerir la conversión del fármaco en isocráticas mezcladas previamente puede ser controlada con mayor
un derivado menos polar y más volátil mediante el tratamiento de exactitud que en las suministradas por la mayorı́a de los sistemas de
grupos reactivos con reactivos apropiados. Los agentes sililantes son bombeo. Las presiones operativas son tı́picamente de hasta 5000 psi
utilizados ampliamente para este fin y se consiguen con facilidad. o más, con velocidades de flujo de hasta aproximadamente 10 mL
Las valoraciones requieren la comparación cuantitativa de un por minuto. Las bombas empleadas para el análisis cuantitativo
cromatograma con otro. Una fuente importante de error es la deben construirse con materiales inertes a los componentes
imposibilidad de reproducir la cantidad de muestra inyectada, en corrosivos de la fase móvil y ser capaces de bombear la fase
particular cuando se hacen inyecciones manuales con una jeringa. A móvil a una velocidad constante, con fluctuaciones mı́nimas, durante
fin de que la variabilidad pueda reducirse al mı́nimo, se agrega un perı́odos de tiempo prolongados.
estándar interno, un compuesto no interferente presente en la misma Inyectores—Después de ser disueltos en la fase móvil u otra
concentración en las soluciones de prueba y estándar. El cociente solución apropiada, los compuestos que se van a cromatografiar se
entre la respuesta del analito y la del estándar interno se compara inyectan en la fase móvil, ya sea manualmente usando jeringas o
entre los cromatogramas. Cuando el estándar interno es quı́mica- inyectores de espiral o automáticamente mediante el uso de
mente similar a la sustancia que se desea determinar, existe también inyectores automáticos. Estos últimos constan de un carrusel o una
una compensación por variaciones menores en las caracterı́sticas de gradilla para sostener los viales de muestra cuya parte superior se
la columna y del detector. En algunos casos, el estándar interno encuentra tapada con un septo o un tapón perforable y un dispositivo
puede agregarse en el proceso de preparación de la muestra, antes de de inyección para transferir la muestra desde los viales a un espiral
la cromatografı́a de gases, para controlar otros aspectos cuantitativos conectado al cromatógrafo. Algunos inyectores automáticos pueden
de la valoración. Los inyectores automáticos mejoran enormemente programarse para controlar el volumen de muestreo, el número de
la reproducibilidad de las inyecciones de muestra y reducen la inyecciones y los ciclos de enjuague del espiral, el intervalo entre las
necesidad de estándares internos. inyecciones y otras variables operativas.
Muchas monografı́as requieren que ciertos requisitos de aptitud Se puede emplear una jeringa para la inyección manual de las
del sistema se cumplan antes de analizar las muestras (ver Aptitud muestras a través de un septo cuando las presiones en la parte
del Sistema e Interpretación de Cromatogramas). superior de la columna sean menores de 70 atmósferas (aproxima-
damente 1000 psi). Con presiones mayores, es indispensable utilizar
una válvula de inyección. Algunos sistemas de válvula poseen un
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA espiral calibrado que se llena con solución de muestra para
PRESIÓN transferirla a la columna en la fase móvil. En otros sistemas, la
solución de muestra se transfiere a una cavidad por medio de una
La cromatografı́a de lı́quidos de alta presión (HPLC, por sus siglas jeringa y luego se transfiere a la fase móvil.
en inglés), a veces llamada cromatografı́a de lı́quidos de alta Columnas—Para la mayorı́a de los análisis farmacéuticos, la
resolución, es una técnica de separación basada en una fase separación se logra por la partición de los compuestos presentes en la
estacionaria sólida y una fase móvil lı́quida. Las separaciones se solución de prueba entre la fase móvil y la estacionaria. Los sistemas
logran por procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, que constan de fases estacionarias polares y fases móviles no polares
según el tipo de fase estacionaria empleada. La HPLC tiene ventajas se describen como de fase normal, mientras que, por el contrario,
distintivas sobre la cromatografı́a de gases para el análisis de cuando se emplean fases móviles polares y fases estacionarias no
compuestos orgánicos. Los compuestos que se van a analizar se polares se denomina cromatografı́a en fase reversa. La cromatografı́a
disuelven en un disolvente adecuado y la mayorı́a de las de partición casi siempre se emplea para compuestos solubles en
separaciones tienen lugar a temperatura ambiente. Por lo tanto, la hidrocarburos de peso molecular menor de 1000. La afinidad de un
mayorı́a de los fármacos, aun siendo compuestos no volátiles o compuesto por la fase estacionaria, y por consiguiente su tiempo de
térmicamente inestables, pueden cromatografiarse sin descomposi- retención en la columna, se controla mediante una fase móvil más o
ción o sin necesidad de hacer derivados volátiles. La mayorı́a de los menos polar. La polaridad de la fase móvil se puede variar mediante
análisis farmacéuticos se basan en la cromatografı́a de partición y se el agregado de un segundo y, a veces, un tercer o hasta un cuarto
completan dentro de los 30 minutos. componente.
Como en la cromatografı́a de gases, el tiempo de elución de un Las fases estacionarias para la cromatografı́a de lı́quidos en fase
compuesto puede ser descrito por su factor de capacidad, k’ (ver reversa moderna constan normalmente de una fase orgánica
Glosario de Sı́mbolos), que depende de la naturaleza quı́mica del quı́micamente unida a sı́lice u otros materiales. Las partı́culas son
analito, la composición y la velocidad de flujo de la fase móvil y la generalmente de 3 mm a 10 mm de diámetro, pero los tamaños pueden
composición y el área de la fase estacionaria. La longitud de la llegar hasta 50 mm o más para las columnas preparativas. Las
columna es un parámetro determinante de la resolución. Sólo los partı́culas pequeñas recubiertas con una capa delgada de fase
compuestos que tienen diferentes factores de capacidad pueden ser orgánica proporcionan una baja resistencia a la transferencia de masa
separados por HPLC. y, por lo tanto, se obtiene una transferencia rápida de los compuestos
entre la fase estacionaria y la móvil. La polaridad de la columna
Aparato—Un cromatógrafo de lı́quidos consta de un recipiente depende de la polaridad de los grupos funcionales unidos, que varı́a
que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso de la fase desde el octadecilsilano relativamente no polar a grupos nitrilo muy
móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir polares. Las fases estacionarias lı́quidas no unidas deben ser en gran
la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica, un detector medida inmiscibles con la fase móvil. Aun ası́, generalmente es
y un dispositivo de recolección de datos como, por ejemplo, una necesario saturar previamente la fase móvil con fase estacionaria
computadora, un integrador o un registrador. Las columnas cortas de para impedir la redisolución de la fase estacionaria de la columna.
diámetro interior pequeño que contienen un relleno denso de Las fases estacionarias poliméricas recubiertas sobre el soporte son
partı́culas de fase estacionaria permiten un intercambio rápido de los más duraderas.
compuestos entre la fase móvil y la fase estacionaria. Además de Por lo general, las columnas empleadas para las separaciones
recibir y reproducir las señales enviadas por el detector, las analı́ticas tienen diámetros internos de 2 mm a 5 mm; para la
computadoras se emplean para controlar las operaciones y los cromatografı́a preparativa se emplean columnas de diámetros más
parámetros cromatográficos y permiten perı́odos largos de operación grandes. Las columnas pueden calentarse para proporcionar
sin necesidad de supervisión. separaciones más eficaces, pero rara vez se las utiliza a temperaturas
Sistemas de Bombeo—Los sistemas de bombeo de HPLC por encima de los 608, debido a la potencial degradación de la fase
administran cantidades exactas de fase móvil desde los recipientes estacionaria o a la volatilidad de la fase móvil. A menos que se
hasta la columna mediante una tuberı́a y uniones adecuadas para especifique algo diferente en la monografı́a individual, las columnas
altas presiones. Los sistemas modernos constan de una o varias se emplean a temperatura ambiente.
bombas reguladoras controladas por computadora que pueden
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h621i Cromatografı́a 273
La cromatografı́a de intercambio iónico se emplea para separar Los detectores electroquı́micos potenciométricos, voltamétricos o
compuestos ionizables y solubles en agua con un peso molecular polarográficos son útiles para la cuantificación de las especies que
menor de 1500. Las fases estacionarias son generalmente resinas pueden oxidarse o reducirse en un electrodo de trabajo. Estos
orgánicas sintéticas; las resinas de intercambio catiónico contienen detectores son selectivos, sensibles y confiables, pero requieren que
sitios activos con carga negativa y se emplean para separar las fases móviles estén libres de oxı́geno disuelto y de iones
sustancias básicas, como por ejemplo las aminas, mientras que las metálicos reducibles. Debe emplearse una bomba sin pulso y debe
resinas de intercambio aniónico tienen sitios activos con carga asegurarse de que el pH, la fuerza iónica y la temperatura de la fase
positiva para la separación de compuestos con grupos con carga móvil permanezcan constantes. Los electrodos de trabajo son
negativa, como los grupos fosfato, sulfonato o carboxilato. Los propensos a la contaminación por productos de reacción con las
compuestos iónicos o ionizables hidrosolubles son atraı́dos hacia las consiguientes variaciones en las respuestas.
resinas y las diferencias en la afinidad producen la separación Los detectores electroquı́micos con electrodos de pasta de carbono
cromatográfica. El pH de la fase móvil, la temperatura, el tipo de ión, pueden emplearse ventajosamente para medir cantidades en el orden
la concentración iónica y los modificadores orgánicos influyen en el de los nanogramos de compuestos fácilmente oxidables, en
equilibrio; estas variables pueden ajustarse para obtener el grado particular, fenoles y catecoles.
deseado de separación. Se continúan desarrollando nuevos detectores en un intento de
En la cromatografı́a de exclusión por tamaño, las columnas están superar las deficiencias de los que se utilizan actualmente.
rellenas con una fase estacionaria porosa. Las moléculas de los Dispositivos de Recolección de Datos—Las estaciones de datos
compuestos cromatografiados se filtran de acuerdo con el tamaño. modernas reciben y almacenan la señal de los detectores e imprimen
Las que son demasiado grandes para pasar por los poros pasan a el cromatograma completo con las alturas y las áreas de los picos, la
través de la columna sin ser retenidas. Las moléculas más pequeñas identificación de la muestra y las variables del método. Se emplean
se introducen en los poros y se retienen más a medida que el tamaño también para programar la cromatografı́a de lı́quidos, controlando la
molecular disminuye. Estas columnas se emplean comúnmente para mayorı́a de las variables y proporcionando perı́odos largos de
medir la agregación y la degradación de macromoléculas (ver el operación sin necesidad de supervisión.
apartado Cromatografı́a de Exclusión por Tamaño). Los datos también pueden recolectarse para ser medidos
Detectores—Muchos métodos farmacopeicos de HPLC requieren manualmente en registradores sencillos o en integradores indepen-
el uso de detectores espectrofotométricos. Este tipo de detector dientes, que varı́an en complejidad desde los que proporcionan una
consta de una celda de flujo colocada en el extremo de la columna. copia impresa de las áreas de los picos a los que proporcionan
Un haz de radiación UV pasa a través de la celda de flujo y se cromatogramas con las áreas y las alturas de los picos calculadas y
introduce en el detector. A medida que los compuestos eluyen de la almacenan datos para un posible reprocesamiento posterior.
columna, pasan a través de la celda y absorben la radiación, lo que Procedimiento—La composición de la fase móvil influye
da lugar a cambios cuantificables en el nivel de energı́a. significativamente en el desempeño cromatográfico y en la
Pueden obtenerse con facilidad detectores de longitud de onda resolución de los compuestos de la mezcla que se está cromato-
fija, variable y múltiple. Los detectores de longitud de onda fija grafiando. Para el trabajo cuantitativo exacto deben emplearse
operan a una sola longitud de onda, habitualmente a 254 nm, emitida reactivos de alta pureza y disolventes orgánicos de ‘‘grado HPLC’’.
por una lámpara de mercurio de baja presión. Los detectores de El agua de calidad adecuada debe tener una conductividad baja y una
longitud de onda variable contienen una fuente de luz continua, absorción UV baja, adecuadas para el uso previsto.
como una lámpara de deuterio o de xenón de alta presión y un Los reactivos utilizados con tipos especiales de detectores (por
monocromador o un filtro de interferencia para generar radiación ejemplo, espectrómetro de masas, electroquı́mico) pueden requerir
monocromática a una longitud de onda seleccionada por el operador. que se establezcan tolerancias adicionales para especies que puedan
Se debe controlar la exactitud de la longitud de onda de un detector interferir. La composición de la fase móvil ejerce un efecto mucho
de longitud de onda variable equipado con un monocromador mayor que la temperatura en el factor de capacidad, k’.
mediante el procedimiento recomendado por el fabricante; si las En la cromatografı́a de partición, el coeficiente de partición y en
longitudes de onda difieren en más de 3 nm de los valores correctos, consecuencia la separación, se pueden cambiar mediante el agregado
se indica una recalibración del instrumento. Los detectores modernos de otro componente a la fase móvil. En la cromatografı́a de
de longitud de onda variable pueden programarse para cambiar la intercambio iónico, el pH y la fuerza iónica, ası́ como los cambios en
longitud de onda mientras un análisis está en curso. Los detectores la composición de la fase móvil, afectan a los factores de capacidad.
de longitud de onda múltiple miden la absorbancia a dos o más La técnica de cambiar continuamente la composición del disolvente
longitudes de onda simultáneamente. En los detectores múltiples de durante la corrida cromatográfica se llama elución en gradiente o
red de diodos, la radiación continua se hace pasar a través de la celda programación del disolvente. Se utiliza algunas veces para
de la muestra, luego la radiación se resuelve en las longitudes de cromatografiar mezclas complejas de componentes que difieren
onda que la constituyen, que son detectadas una por una mediante la enormemente en sus factores de capacidad. Los detectores que son
red de fotodiodos. Estos detectores adquieren los datos de sensibles al cambio en la composición del disolvente, como el
absorbancia a lo largo del intervalo total UV-visible y, por lo detector de refractometrı́a diferencial, son más difı́ciles de emplear
tanto, proporcionan al analista cromatogramas a múltiples longitudes con la técnica de elución en gradiente.
de onda seleccionadas y espectros de los picos eluidos. Los El detector debe tener un rango dinámico lineal amplio y los
detectores de red de diodos tienen, por lo general, menor relación compuestos que se miden deben resolverse de cualquier sustancia
señal-ruido que los detectores de longitud de onda fija o variable y, que interfiera. El intervalo dinámico lineal de un compuesto es el
por lo tanto, son menos aptos para el análisis de compuestos intervalo en el que la respuesta de la señal del detector es
presentes a concentraciones bajas. directamente proporcional a la cantidad del compuesto. Para una
Los detectores de refractometrı́a diferencial miden la diferencia máxima flexibilidad en el trabajo cuantitativo, este intervalo debe ser
entre el ı́ndice de refracción de la fase móvil sola y el de la fase aproximadamente de tres órdenes de magnitud. Los sistemas de
móvil que contiene los compuestos cromatografiados a medida que HPLC se calibran graficando las respuestas de los picos en función
salen de la columna. Los detectores de ı́ndice de refracción se de concentraciones conocidas de un estándar de referencia,
emplean para detectar compuestos que no absorben radiación UV, empleando un procedimiento de estandarización externa o interna.
pero son menos sensibles que los detectores UV. Son sensibles a Se obtienen resultados cuantitativos confiables mediante la
pequeños cambios en la composición del disolvente, la velocidad de calibración externa si se emplean inyectores automáticos o
flujo y la temperatura, de modo que puede ser necesaria una columna muestreadores automáticos. Este método incluye la comparación
de referencia para obtener una lı́nea base satisfactoria. directa de las respuestas de los picos obtenidos al cromatografiar, por
Los detectores fluorométricos son sensibles a los compuestos que separado, la solución estándar y la solución de prueba. Si se debe
son inherentemente fluorescentes o que pueden convertirse en emplear la inyección con jeringa, la cual es irreproducible a las altas
derivados fluorescentes mediante la transformación quı́mica del presiones involucradas, se obtienen mejores resultados cuantitativos
compuesto o mediante el acoplamiento de reactivos fluorescentes mediante el procedimiento de calibración interna donde una cantidad
con grupos funcionales especı́ficos. Si se requiere derivatización, conocida de un compuesto no interferente, el estándar interno, se
ésta puede hacerse antes de la separación cromatográfica o, agrega a la solución de muestra y a la solución del estándar de
alternativamente, el reactivo puede introducirse en la fase móvil referencia, y se comparan los cocientes entre las respuestas de los
justo antes de su entrada al detector. picos del fármaco y del estándar interno.
274 h621i Cromatografı́a / Pruebas Fı́sicas USP 30
Debido a las variaciones normales en el equipo, los suministros y Cromatogramas). Las caracterı́sticas de elución de un compuesto en
las técnicas, se requiere una prueba de aptitud del sistema para una columna determinada se pueden describir mediante el
asegurarse de que un sistema operativo dado pueda ser aplicable de coeficiente de distribución, KD, que se calcula por la fórmula:
manera general. Las caracterı́sticas principales de las pruebas de
aptitud del sistema se describen más adelante. (VI – VO) / (VT – VO)
Para obtener información sobre la interpretación de los resultados, en donde VO, V T y VI son los volúmenes de retención del componente
ver el apartado Interpretación de Cromatogramas. no retenido, del componente que tiene acceso total a todos los poros
del soporte y del compuesto en análisis, respectivamente. Cada
volumen de retención se mide desde el momento de la aplicación
Cromatografı́a de Exclusión por Tamaño hasta el momento de pico máximo.
Determinación de la Composición Relativa de los Componentes
La cromatografı́a de exclusión por tamaño es una técnica de en la Mezcla—Llevar a cabo la separación, según se indica en la
cromatografı́a lı́quida de alta presión que separa las moléculas en monografı́a individual. Controlar continuamente la elución de los
solución de acuerdo a su tamaño. Los métodos de cromatografı́a de componentes y medir las áreas de los picos correspondientes. Si
exclusión por tamaño se dividen en métodos cromatográficos de todos los componentes en análisis muestran respuestas equivalentes
permeación de geles, que utilizan fases móviles orgánicas no polares a las propiedades fisicoquı́micas que se controlan (por ejemplo, si
y rellenos hidrófilos, y métodos cromatográficos por filtración de muestran una absortividad correspondiente), calcular la cantidad
geles que utilizan fases móviles acuosas y rellenos hidrófobos. La relativa de cada componente dividiendo el área del pico respectivo
muestra se introduce en una columna rellena con un gel o con por la suma de las áreas de los picos de todos los componentes en
material de relleno de partı́culas porosas y es transportada por la fase análisis. Si las respuestas a la propiedad usada para la detección de
móvil a través de la columna. La separación por tamaños se realiza los componentes en análisis no fueran equivalentes, calcular el
por el intercambio repetido de las moléculas de soluto entre el contenido empleando curvas de calibración obtenidas a partir del
disolvente de la fase móvil y el mismo disolvente en la fase lı́quida procedimiento de calibración especificado en la monografı́a
estacionaria que se encuentra dentro de los poros del material de individual.
relleno. El intervalo de tamaño de los poros del material de relleno Determinación de Pesos Moleculares—La cromatografı́a de
determina el intervalo de tamaño molecular en el que tiene lugar la exclusión por tamaño se emplea para determinar los pesos
separación. moleculares de los componentes en análisis por comparación con
Las moléculas que son lo suficientemente pequeñas para penetrar estándares de calibración que se especifican en la monografı́a
en todos los espacios de los poros eluyen al volumen de permeación individual. Graficar los volúmenes de retención de los estándares de
total, VT. Por otra parte, las moléculas que son aparentemente más calibración en función del logaritmo de sus pesos moleculares.
grandes que el tamaño máximo de poro del material de relleno, Trazar la lı́nea recta que mejor se ajuste a los puntos graficados
migran a lo largo de la columna a través de los espacios entre las dentro de los lı́mites de exclusión y de permeación total para el
partı́culas del material de relleno sin quedar retenidas y eluyen al medio de separación en particular. Los pesos moleculares de los
volumen de exclusión, VO (volumen muerto). La separación componentes en análisis se estiman a partir de la curva de
conforme al tamaño molecular ocurre entre el volumen de exclusión calibración. Esta calibración es válida solamente para el sistema
y el volumen total de permeación y la separación útil normalmente disolvente-soluto macromolecular especı́fico utilizado y bajo las
tiene lugar en los primeros dos tercios de este intervalo. condiciones experimentales especificadas.
Aparato—Los componentes del cromatógrafo se describen en Determinación de la Distribución de Pesos Moleculares en
Cromatografı́a de Lı́quidos de Alta Presión. Polı́meros—Los materiales empleados para la calibración y los
Columna—Si fuera necesario, se controla la temperatura de la métodos para la determinación de la distribución de los pesos
columna. Está rellena con un material de separación que tiene una moleculares de los polı́meros se especifican en cada monografı́a
capacidad de fraccionamiento dentro del intervalo correspondiente individual. Sin embargo, la comparación entre muestras es válida
de tamaños moleculares y a través del cual pasa el eluyente a una solamente para resultados obtenidos bajo condiciones experimen-
velocidad constante. Por lo general, uno de los extremos de la tales idénticas.
columna está equipado con un dispositivo adecuado para aplicar la
muestra, como por ejemplo un adaptador de flujo, una jeringa a
través de un septo o una válvula de inyección y también puede estar INTERPRETACIÓN DE CROMATOGRAMAS
conectada a una bomba adecuada para controlar el flujo del eluyente.
Alternativamente, se puede aplicar la muestra directamente sobre la La Figura 1 representa una separación cromatográfica tı́pica de
superficie del lecho o, si la muestra fuera más densa que el eluyente, dos sustancias, 1 y 2, donde t1 y t2 son los tiempos de retención
se puede depositar formando una capa debajo del eluyente. El respectivos; y h, h/2, y Wh/2 son la altura, la mitad de la altura y el
material de relleno puede ser un soporte blando tal como por ejemplo ancho a la mitad de la altura, respectivamente, para el pico 1. W1 y
un gel hinchado o un soporte rı́gido constituido por materiales como W2 son los anchos respectivos de los picos 1 y 2 en la lı́nea base. Los
por ejemplo vidrio, sı́lice o un polı́mero orgánico entrecruzado picos de aire son una caracterı́stica de los cromatogramas de gases y
compatible con el disolvente. En general, los soportes rı́gidos corresponden al frente de la fase móvil en la cromatografı́a de
requieren un sistema de presurización, que produce separaciones lı́quidos.
más rápidas. La fase móvil se elige de acuerdo con el tipo de Los tiempos de retención cromatográficos son caracterı́sticos de
muestra, el medio de separación y el método de detección. los compuestos que representan, pero no son únicos. La coincidencia
Detector—Por lo general, la salida de la columna se conecta a un de los tiempos de retención de una sustancia de prueba y una
detector adecuado equipado con un registrador automático que sustancia de referencia puede emplearse como una caracterı́stica en
permita controlar las concentraciones relativas de los componentes la construcción de un perfil de identidad, pero es insuficiente por
de la muestra ya separados. Por lo general, los detectores se basan en sı́ misma para establecer la identidad. Los tiempos de retención
propiedades luminescentes, refractométricas o fotométricas (ver absolutos de un compuesto dado varı́an de un cromatograma al
Detectores en Cromatografı́a de Lı́quidos de Alta Presión). Si fuera siguiente. Dado que en la mayorı́a de los procedimientos no es
necesario, se puede conectar un recolector automático de fracciones. necesario identificar un pico no retenido, las comparaciones se hacen
Procedimiento—Antes de llevar a cabo la separación, tratar el generalmente en términos de tiempos de retención relativos, Rr:
material de relleno y rellenar la columna según se describe en la
monografı́a individual o conforme a las instrucciones del fabricante.
En aquellos casos en que sea necesario, los procedimientos para
verificar la aptitud del sistema se describen en la monografı́a
individual. La eficiencia de la columna puede evaluarse a partir del
número de platos teóricos, N (ver el apartado Interpretación de
R resolución entre dos picos cromatográficos, t tiempo de retención medido desde el tiempo de
inyección hasta el tiempo de elución del
máximo del pico.
tM tiempo de retención del componente no
retardado, aire con detección por
conductividad térmica.
W ancho del pico medido por extrapolación de los
lados relativamente rectos en
la lı́nea base.
Wh/2 ancho del pico a la mitad de la altura.
W0,05 ancho del pico al 5% de altura.
L17—Resina de intercambio catiónico fuerte que consta de un L42—Grupos octilsilano y octadecilsilano unidos quı́micamente a
copolı́mero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno, en partı́culas de sı́lice porosas, de 5 mm de diámetro.
forma de hidrógeno, de 7 mm a 11 mm de diámetro. L43—Grupos pentafluorofenilo unidos quı́micamente a partı́culas
L18—Grupos amino y ciano unidos quı́micamente a partı́culas de de sı́lice mediante un espaciador propilo, de 5 mm a 10 mm de
sı́lice porosas, de 3 mm a 10 mm de diámetro. diámetro.
L19—Resina de intercambio catiónico fuerte que consta de un L44—Un soporte multifuncional, que consiste en un sustrato de
copolı́mero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno, en la sı́lice esférico de alta pureza, 60 Å, unido a un intercambiador
forma cálcica, de aproximadamente 9 mm de diámetro. catiónico, con funcionalidad sulfónica ácida, además de una
L20—Grupos dihidroxipropano quı́micamente unidos a partı́culas funcionalidad en fase reversa convencional de C8.
de sı́lice porosas, de 5 mm a 10 mm de diámetro. L45—Beta ciclodextrina unida a partı́culas de sı́lice porosas, de
L21—Un copolı́mero rı́gido, esférico de estireno-divinilbenceno, 5 mm a 10 mm de diámetro.
de 5 mm a 10 mm de diámetro. L46—Sustrato de poliestireno y divinilbenceno aglomerado con
L22—Resina de intercambio catiónico constituida por gel de perlas de látex con funcionalidad de aminas cuaternarias, de
poliestireno poroso con grupos ácidos sulfónicos, de un tamaño aproximadamente 10 mm de diámetro.
aproximado de 10 mm. L47—Sustrato microporoso de intercambio aniónico de alta
L23—Resina de intercambio aniónico constituida por gel de capacidad, totalmente funcionalizado con grupos trimetilamino, de
poliacrilato o polimetacrilato poroso con grupos de amonio 8 mm de diámetro. [NOTA—Está disponible como CarboPac MA1 y lo
cuaternario, de un tamaño aproximado de 10 mm. distribuye Dionex Corp. (www.dionex.com).]
L24—Gel hidrófilo semirrı́gido que consta de polı́meros de vinilo L48—Poliestireno entrecruzado sulfonado, con una capa exterior
con numerosos grupos hidroxilo sobre la superficie de la matriz, de de microperlas de intercambio aniónico porosas submicrométricas,
32 mm a 63 mm de diámetro. [NOTA—Está disponible como YMC- de 15 mm de diámetro.
Pack PVA-SIL, fabricado por YMC Co., Ltd. y distribuido por L49—Un relleno en fase reversa obtenido por recubrimiento con
Waters Corp. (www.waters.com).] una capa fina de polibutadieno sobre partı́culas porosas esféricas de
L25—Relleno con capacidad para separar compuestos en un zirconio, de 3 mm a 10 mm de diámetro. [NOTA—Está disponible
intervalo de peso molecular de 100 a 5000 (determinado con óxido como Zirchrom PBD, fabricado por ZirChrom Separations, Inc. y
de polietileno), aplicable a polı́meros hidrosolubles neutros, distribuido por Alltech, www.Alltechweb.com.]
aniónicos y catiónicos. Se determinó que una base de resina de L50—Resina multifuncional, con retención en fase reversa y
polimetacrilato, entrecruzada con éter polihidroxilado (la superficie funcionalidades de intercambio de aniones fuerte. La resina consta
contiene algunos grupos funcionales carboxilo residuales) es de etilvinilbenceno, entrecruzado al 55% con copolı́mero de
adecuada. divinilbenceno, de 3 mm a 15 mm de diámetro, y una superficie de
L26—Butilsilano unido quı́micamente a partı́culas de sı́lice no menos de 350 m2 por g. El sustrato está recubierto de partı́culas
totalmente porosas, de 3 mm a 10 mm de diámetro. de látex con funcionalidad de amonio cuaternario que constan de
L27—Partı́culas de sı́lice porosas, de 30 mm a 50 mm de diámetro. estireno entrecruzado con divinilbenceno. [NOTA—Está disponible
L28—Un soporte multifuncional, que consiste en un sustrato de como OmniPac PAX-500 y lo distribuye Dionex Corp. (www.
sı́lice esférico de alta pureza, de 100 Å, unido a un intercambiador dionex.com).]
aniónico, con funcionalidad amina, además de una funcionalidad en L51—Partı́culas de sı́lice esféricas, porosas, recubiertas con
fase reversa convencional de C8. amilosa tris-3,5-dimetilfenilcarbamato, de 5 mm a 10 mm de
L29—Gamma alúmina de fase reversa con bajo porcentaje, en diámetro. [NOTA—Está disponible como Chiralpak AD que se
peso, de carbono y partı́culas esféricas de polibutadieno con base de puede obtener de Chiral Technologies, Inc., (www.chiraltech.com).]
alúmina, de 5 mm de diámetro con un volumen de poro de 80 Å. L52—Resina de intercambio catiónico fuerte de sı́lice porosa con
L30—Etilsilano unido quı́micamente a partı́culas de sı́lice grupos sulfopropilo, de 5 mm a 10 mm de diámetro. [NOTA—
totalmente porosas, de 3 mm a 10 mm de diámetro. Está disponible como TSK IC SW Cation que se puede obtener de
L31—Resina de intercambio aniónico fuerte, hidróxido-selectivo, Tosoh Biosep (www.tosohbiosep.com).]
unida por amina cuaternaria a partı́culas de látex ligadas a un núcleo L53—Resina de intercambio catiónico débil que consta de
de partı́culas macroporosas de 8,5 mm con un tamaño de poro de etilvinilbenceno, entrecruzado al 55% con copolı́mero de divinil-
2000 Å y constituidas de etilvinilbenceno entrecruzado con 55% de benceno, de 3 mm a 15 mm de diámetro. El sustrato está injertado en
divinilbenceno. la superficie con ácido carboxı́lico y/o monómeros funcionalizados
L32—Relleno de intercambio con ligando quiral–complejo de L- de ácido fosfórico. La capacidad es de no menos de 500 mEq/
prolina y cobre unido covalentemente a partı́culas de sı́lice columna. [NOTA—Está disponible como IonPac CS14 distribuido por
irregulares de 5 mm a 10 mm de diámetro. Dionex Corp. (www.dionex.com).]
L33—Relleno con capacidad para separar dextranos de un tamaño L54—Medio de exclusión por tamaño constituido por dextrano
molecular en un intervalo de entre 4000 y 500 000 Da. Es esférico unido covalentemente a perlas de agarosa porosa altamente
con base de sı́lice y tiene un procesamiento que le proporciona entrecruzada, de aproximadamente 13 mm de diámetro. [NOTA—
estabilidad frente al pH. [NOTA—Está disponible como TSKgel Está disponible como Superdex Peptide HR 10/30 que se puede
G4000 SWXL que se puede obtener de Tosoh Biosep (www. obtener de Amersham Pharmacia Biotech (www.amershambio
tosohbiosep.com).] sciences.com).]
L34—Resina de intercambio catiónico fuerte que consiste de un L55—Resina de intercambio catiónico fuerte hecha de sı́lice
copolı́mero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno en la porosa recubierta con copolı́mero de polibutadieno–ácido maleico,
forma de plomo, de aproximadamente 9 mm de diámetro. de aproximadamente 5 mm de diámetro. [NOTA—Está disponible
L35—Relleno de sı́lice esférica estabilizada con zirconio con una como IC-Pak C M/D que se puede obtener de Waters Corp.
fase unida que consta de una monocapa molecular hidrófila (tipo (www.waters.com).]
diol), con un tamaño de poro de 150 Å. L56—Propilsilano unido quı́micamente a partı́culas de sı́lice
L36—Derivado 3,5-dinitrobenzoilo de L-fenilglicina unido cova- totalmente porosas, de 3 mm a 10 mm de diámetro. [NOTA—
lentemente a sı́lice aminopropı́lica de 5 mm. Está disponible como Zorbax SB-C3 que se puede obtener de
L37—Relleno con capacidad para separar proteı́nas por tamaño Agilent Technologies. (www.agilent.com/chem).]
molecular en un intervalo de entre 2000 y 40 000 Da. Es un gel de L57—Proteı́na de reconocimiento quiral, ovomucoide, unida
polimetacrilato. quı́micamente a partı́culas de sı́lice, de aproximadamente 5 mm de
L38—Relleno basado en metacrilato para cromatografı́a de diámetro, con un tamaño de poro de 120 Å. [NOTA—Está disponible
exclusión por tamaño de muestras hidrosolubles. como Ultron ES-OVM que se puede obtener de Agilent Technol-
L39—Gel de polihidroximetacrilato hidrófilo de resina esférica ogies (www.agilent.com/chem).]
totalmente porosa. L58—Resina de intercambio catiónico fuerte, que consiste de
L40—Partı́culas de sı́lice porosas cubiertas con tris-3,5-dimetilfe- copolı́mero sulfonado entrecruzado de estireno-divinilbenceno en la
nilcarbamato de celulosa, de 5 mm a 20 mm de diámetro. forma sódica, de aproximadamente 7 mm a 11 mm de diámetro.
L41—Glicoproteı́na a1-ácida inmovilizada sobre partı́culas es- [NOTA—Está disponible como Aminex HPX-87N que se puede
féricas de sı́lice, de 5 mm de diámetro. obtener de Bio-Rad Laboratories, (N8 de catálogo 2000/01, 125-
0143) www.bio-rad.com.]
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h621i Cromatografı́a 279
L59—Relleno con capacidad para separar proteı́nas por peso G32—20% de fenilmetilpolisiloxano y 80% de dimetilpolisiloxa-
molecular en un intervalo de entre 10 y 500 kDa. Es esférico (10 no.
mm), con base de sı́lice y tiene un procesamiento que le proporciona G33—20% de carboranosilicona y 80% de metilsilicona.
caracterı́sticas hidrófilas y estabilidad de pH. [NOTA—Está disponible G34—Poliéster de succinato de dietilenglicol estabilizado con
como TSKgel G3000SW Column (columna analı́tica) y como ácido fosfórico.
TSKgel Guard (guarda columna) que se pueden obtener de Tosoh G35—Un compuesto de alto peso molecular de polietilenglicol y
Biosep (número de pieza 05789 y 05371, respectivamente) un diepóxido que se esterifica con ácido nitrotereftálico.
(www.tosohbiosep.com).] G36—1% de vinilpolisiloxano y 5% de fenilmetilpolisiloxano.
L60—Gel de sı́lice poroso, esférico, de 3 mm o 5 mm de diámetro, G37—Poliimida.
cuya superficie se ha modificado covalentemente con grupos G38—Fase G1 que contiene un pequeño porcentaje de inhibidor
palmitamidopropilo y se ha recubierto exhaustivamente. [NOTA— de asimetrı́a. [NOTA—Un grado adecuado está disponible comercial-
Está disponible como Supelcosil ABZ que se puede obtener de mente como ‘‘SP2100/0,1% Carbowax 1500’’ que se puede obtener
Supelco (www.sigmaaldrich.com/supelco).] de Supelco, Inc., (www.sigmaaldrich.com/supelco).]
L61—Resina de intercambio aniónico fuerte hidróxido-selectiva G39—Polietilenglicol (peso molecular promedio aproximadamen-
compuesta de un núcleo altamente entrecruzado de partı́culas te 1500).
microporosas de 13 mm con un tamaño de poro de menos de G40—Adipato de etilenglicol.
10 Å y que consiste en etilvinilbenceno entrecruzado con G41—Fenilmetildimetilsilicona (sustituida al 10% por fenilo).
divinilbenceno al 55%, con un recubrimiento de látex compuesto G42—35% de fenilpolisiloxano y 65% de dimetilpolisiloxano (los
de microperlas de 85 nm de diámetro unidas con iones alcanol porcentajes hacen referencia a la sustitución molar).
amonio cuaternario (6%). G43—6% de cianopropilfenilpolisiloxano y 94% de dimetilpoli-
[NOTA—Está disponible como Ion Pac AS 11 y como AG 11 que siloxano (los porcentajes hacen referencia a la sustitución molar).
se pueden obtener de Dionex (www.dionex.com).] G44—2% de grasa de hidrocarburos de vaselina de bajo peso
L62—Fase de silano C30 unida a sı́lice esférica, totalmente molecular y 1% de solución de hidróxido de potasio.
porosa, de 3 mm a 15 mm de diámetro. G45—Divinilbenceno-etilenglicol-dimetilacrilato.
G46—14% de cianopropilfenilpolisiloxano y 86% de metilpoli-
siloxano.
Fases G47—Polietilenglicol (peso molecular promedio aproximadamen-
te 8000).
G1—Aceite de dimetilpolisiloxano. G48—Cianopolisiloxano altamente polar y parcialmente entre-
G2—Goma de dimetilpolisiloxano. cruzado.
G3—50% de fenilpolisiloxano y 50% de metilpolisiloxano.
G4—Poliéster de succinato de dietilenglicol.
G5—3-Cianopropilpolisiloxano. Soportes
G6—Trifluoropropilmetilpolisiloxano.
G7—50% de 3-cianopropilsilicona y 50% de fenilmetilsilicona. NOTA—A menos que se especifique algo diferente, se indican
G8—80% de bis (3-cianopropil)polisiloxano y 20% de 3- tamaños de malla de 80 a 100 o alternativamente de 100 a 120.
cianopropilfenilpolisiloxano (los porcentajes hacen referencia a la S1A—Tierra silı́cea para cromatografı́a de gases que ha sido
sustitución molar). fundida-calcinada mezclando diatomita con flujo de Na2CO3 y
G9—Metilvinilpolisiloxano. calcinada a una temperatura superior a 9008. La tierra silı́cea se lava
G10—Poliamida formada por reacción de un ácido dicarboxı́lico con ácido, luego se lava con agua hasta lograr la neutralidad, pero no
de C36 con 1,3-di-4-piperidilpropano y piperidina en una relación se lava con bases. La tierra silı́cea puede ser silanizada al tratarla con
molar de 1,00 : 0,90 : 0,20. un agente como dimetildiclorosilano [NOTA—A menos que se
G11—Poliéster de sebacato de bis(2-etilhexilo). especifique algo diferente en la monografı́a individual, se indica
G12—Poliéster de succinato de fenildietanolamina. un soporte silanizado.] para enmascarar los grupos silanoles
G13—Sorbitol. superficiales.
G14—Polietilenglicol (peso molecular promedio de 950 a 1050). S1AB—Tierra silı́cea conforme a la descripción anterior pero
G15—Polietilenglicol (peso molecular promedio de 3000 a 3700). lavada con ácido y base. [NOTA—A menos que se especifique algo
G16—Compuesto de polietilenglicol (peso molecular promedio diferente en la monografı́a individual, se indica un soporte
de aproximadamente 15 000). Un compuesto de polietilenglicol de silanizado.]
alto peso molecular con un enlazador diepóxido. [NOTA—Es- S1C—Un soporte preparado con ladrillo refractario molido y
tá disponible comercialmente como Polyethylene Glycol Compound calcinado o quemado con arcilla como aglutinante, a una
20M o como Carbowax 20M, que se pueden obtener de proveedores temperatura por encima de los 9008 y lavado posteriormente con
de reactivos para cromatografı́a.] ácido. Puede estar silanizado.
G17—75% de fenilpolisiloxano y 25% de metilpolisiloxano. S1NS—Tierra silı́cea no tratada.
G18—Polialquilenglicol. S2—Copolı́mero de estireno-divinilbenceno con un área nominal
G19—25% de fenilsilicona, 25% de cianopropilsilicona y 50% de de menos de 50 m2 por g y un diámetro de poro promedio de 0,3 mm
metilsilicona. a 0,4 mm.
G20—Polietilenglicol (peso molecular promedio de 380 a 420). S3—Copolı́mero de etilvinilbenceno y divinilbenceno con un área
G21—Succinato de neopentilglicol. nominal de 500 m2 a 600 m2 por g y un diámetro de poro promedio
G22—Ftalato de bis(2-etilhexilo) de 0,0075 mm.
G23—Adipato de polietilenglicol. S4—Copolı́mero de estireno-divinilbenceno con grupos aromáti-
G24—Ftalato de diisodecilo. cos –O y –N con un área nominal de 400 m2 a 600 m2 por g y un
G25—Compuesto de polietilenglicol y ácido tereftálico (TPA, por diámetro de poro promedio de 0,0076 mm.
sus siglas en inglés). Un compuesto de alto peso molecular de un S5—Polı́mero de tetrafluoroetileno de alto peso molecular de
polietilenglicol y un diepóxido que se esterifica con ácido tereftálico. malla 40 a 60.
[NOTA—Está disponible comercialmente como Carbowax 20M-TPA S6—Copolı́mero de estireno-divinilbenceno con un área nominal
que se puede obtener de proveedores de reactivos para cromato- de 250 m2 a 350 m2 por g y un diámetro de poro promedio de
grafı́a.] 0,0091 mm.
G26—25% de 2-cianoetilpolisiloxano y 75% de metilpolisiloxa- S7—Carbono grafitizado que tiene un área nominal de 12 m2 por
no. g.
G27—5% de fenilpolisiloxano y 95% de metilpolisiloxano. S8—Copolı́mero de 4-vinil-piridina y estireno-divinilbenceno.
G28—25% de fenilpolisiloxano y 75% de metilpolisiloxano. S9—Polı́mero poroso a base de óxido de 2,6-difenil-p-fenileno.
G29—3,3’-Tiodipropionitrilo. S10—Copolı́mero altamente polar entrecruzado con acrilonitrito y
G30—Tetraetilenglicol dimetil éter. divinilbenceno.
G31—Nonilfenoxipoli(etilenoxi)etanol (la longitud promedio de
la cadena etilenoxi es 30); Nonoxinol 30.
280 h631i Color y Acromatismo / Pruebas Fı́sicas USP 30
S11—Carbono grafitizado que tiene un área nominal de 100 m2 tricromáticos, X, Y, Z (ver Color—Medición Instrumental h1061i).
por g modificado con cantidades pequeñas de vaselina y compuestos Las funciones de distribución se determinaron en experimentos de
de polietilenglicol. [NOTA—Está disponible comercialmente como comparación de color con sujetos humanos.
SP1500 en Carbopack B que se puede obtener de Supelco Los valores tricromáticos no son coordenadas en un espacio de
(www.sigmaaldrich.com/supelco).] color visualmente uniforme; sin embargo, se han propuesto varias
S12—Carbono grafitizado que tiene un área nominal de 100 m2 transformaciones que son cercanas a la uniformidad, una de las
por g. cuales se describe en el capı́tulo citado h1061i Color—Medición
Instrumental. El valor es a menudo una función solamente del valor
de Y. La obtención de uniformidad en el subespacio de matiz y
cromatismo ha sido menos satisfactoria. En un sentido práctico, esto
significa que en una comparación visual de colores, cuando dos
objetos difieren significativamente en matiz, resulta difı́cil decidir
h631i COLOR Y ACROMATISMO cuál tiene mayor cromaticidad. Esto señala la importancia de elegir
un estándar de comparación lo más parecido posible al color de la
muestra, especialmente para los atributos de matiz y cromaticidad.
Determinación de Color y Estándares—La percepción del color
Definición—A los fines de este capı́tulo, el color se puede definir y de la igualdad de colores depende de las condiciones de
como la percepción o la respuesta subjetiva de un observador al observación e iluminación. Las determinaciones deben hacerse
estı́mulo objetivo de energı́a radiante en el espectro visible que se usando iluminación difusa y uniforme bajo condiciones que
extiende en el intervalo de longitudes de onda de 400 nm a 700 nm. reduzcan al mı́nimo las sombras y la reflectancia no espectral. La
El color percibido es una función de tres variables: las propiedades superficie de los polvos debe alisarse con presión suave para que
espectrales del objeto, tanto absorbentes como reflectantes; las puedan presentar una superficie plana sin irregularidades. Los
propiedades espectrales de la fuente de iluminación; y las lı́quidos deben compararse en tubos para comparación de color
caracterı́sticas visuales del observador. iguales, contra un fondo blanco. Si se descubre que los resultados
Se dice que dos objetos poseen colores iguales para una fuente varı́an con la iluminación, se considerarán correctos los valores
especı́fica de iluminación cuando un observador no puede detectar obtenidos con luz de dı́a natural o artificial. En lugar de la
una diferencia de color. Cuando un par de objetos presenta colores determinación visual debe emplearse un método instrumental
iguales, con una fuente de iluminación y no con otra, constituyen un apropiado.
par metamérico. El color de dos objetos es igual para todas las Los colores de los estándares deben ser lo más parecidos posibles
fuentes de iluminación si los espectros de absorción y de reflectancia a los de las muestras de prueba para cuantificar las diferencias de
de los dos objetos son idénticos. color. Los estándares para materiales opacos están disponibles como
El acromatismo o falta de color es un extremo de cualquier escala conjuntos de muestras indicadoras de color que se disponen en un
de color para la transmisión de luz. Esto implica la ausencia espacio visualmente uniforme.* Estándares para comparaciones de
completa de color y, en consecuencia, el espectro visible del objeto color de lı́quidos, identificados mediante una letra, se pueden
carece de absorbancias. A efectos prácticos, el observador en este preparar según la tabla adjunta. Para preparar el lı́quido de
caso percibe poca o ninguna absorción en el espectro visible. comparación requerido, pipetear y transferir los volúmenes pre-
Atributos del Color—Como la sensación de color tiene un scritos de las soluciones de prueba colorimétricas [ver en Soluciones
componente subjetivo y otro objetivo, el color no puede describirse Colorimétricas (SC) en la sección Reactivos, Indicadores, y
exclusivamente en términos espectrofotométricos. Por lo tanto, los Soluciones] y agua en uno de los recipientes para comparación y
atributos comunes del color no pueden corresponder uno a uno con mezclar la solución en el recipiente. Hacer la comparación según se
la terminologı́a espectral. indica en la monografı́a individual, bajo las condiciones de
Por lo general se utilizan tres atributos para identificar un color. observación previamente descritas. Los lı́quidos de comparación u
(1) el matiz, o la cualidad según la cual una familia de colores se otras combinaciones de las soluciones colorimétricas pueden
distingue de otra, como por ejemplo rojo, amarillo, azul, verde y emplearse en concentraciones muy bajas para medir desviaciones
términos intermedios; (2) el valor, o la cualidad que distingue un del acromatismo.
color claro de uno oscuro; y (3) la cromaticidad, o la cualidad que
distingue un color fuerte de uno débil, o el grado en el cual un color Lı́quidos de Comparación
difiere de un gris del mismo valor.
Los tres atributos del color se pueden utilizar para definir un Partes de
espacio de color tridimensional, en el cual se ubica cualquier color Lı́quido de Cloruro Partes de Partes de
por sus coordenadas. El espacio de color elegido es visualmente Compara- Cobaltoso Cloruro Sulfato Partes de
uniforme si la distancia geométrica entre dos colores en el espacio de ción SC Férrico SC Cúprico SC Agua
color es directamente una medida de la distancia del color entre A 0,1 0,4 0,1 4,4
ellos. A menudo se eligen coordenadas cilı́ndricas por conveniencia: B 0,3 0,9 0,3 3,5
Los puntos a lo largo del eje longitudinal representan valores del C 0,1 0,6 0,1 4,2
oscuro al claro o del negro al blanco y poseen un matiz D 0,3 0,6 0,4 3,7
indeterminado y ninguna cromaticidad. Centrándose en una sección E 0,4 1,2 0,3 3,1
transversal perpendicular al eje del valor, el matiz se determina por el F 0,3 1,2 0,0 3,5
ángulo con respecto al eje longitudinal y la cromaticidad se G 0,5 1,2 0,2 3,1
determina por la distancia desde el eje longitudinal. Los matices H 0,2 1,5 0,0 3,3
rojos, amarillos, verdes, azules, morados e intermedios están dados I 0,4 2,2 0,1 2,3
por diferentes ángulos. Los colores a lo largo de un radio de una J 0,4 3,5 0,1 1,0
sección transversal tienen el mismo matiz, que se convierte en un K 0,5 4,5 0,0 0,0
matiz más intenso a medida que se aleja. Por ejemplo, el agua L 0,8 3,8 0,1 0,3
incolora o acromática tiene un matiz intermedio, valor alto y ninguna M 0,1 2,0 0,1 2,8
cromaticidad. Si se agrega un soluto de color, el agua adopta un N 0,0 4,9 0,1 0,0
matiz especı́fico. A medida que se agrega más soluto, el color se O 0,1 4,8 0,1 0,0
torna más oscuro, más intenso, o más profundo; es decir, general- P 0,2 0,4 0,1 4,3
mente la cromaticidad aumenta y el valor disminuye. Sin embargo si Q 0,2 0,3 0,1 4,4
el soluto es de color neutro, es decir, gris, el valor disminuye, no se R 0,3 0,4 0,2 4,1
observa un aumento en la cromaticidad y el matiz permanece
indeterminado. *
Las colecciones de muestras de color, ordenadas según matiz, valor y
Las mediciones espectroscópicas de laboratorio pueden conver- cromatismo en un espacio visualmente uniforme y apropiado para su uso en
tirse en mediciones de los tres atributos de color. Los resultados la designación de colores de muestras por comparación visual están
espectroscópicos para tres luces o estı́mulos elegidos se ponderan disponibles en GretagMacbeth LLC, 617 Little Britain Road, New Windsor,
mediante tres funciones de distribución para producir los valores NY 12553-6148.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h643i Carbono Orgánico Total 281
de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del del medidor, debe conocerse con una precisión de +2%. La
Sistema, rss – rw. Calcular la eficiencia de la respuesta de la Solución constante de la celda puede ser verificada directamente empleando
de Aptitud del Sistema, por la fórmula: una solución de conductividad conocida o indirectamente compa-
rando la lectura del instrumento con la celda en cuestión con lecturas
100[(rss – rw) / (rS – rw)]. realizadas usando una celda de constante conocida o certificada.
El sistema es apto si la eficiencia de la respuesta no es menos de 85% La calibración del medidor se realiza reemplazando la celda de
ni es más de 115% de la respuesta teórica. conductividad por resistores de precisión rastreables a las normas
NIST (con una exactitud que no se aleje en más de +0,1% del valor
Procedimiento—Realizar la prueba utilizando la Solución de indicado) o por un dispositivo de resistencia ajustable y exactitud
Prueba y registrar la respuesta, rU. La Solución de Prueba cumple equivalente, como por ejemplo un Puente de Wheatstone, para
con los requisitos si rU no es mayor que la respuesta lı́mite, rS – rw. obtener una respuesta predecible del instrumento. Cada escala del
Alternativamente, este método también puede realizarse empleando medidor puede requerir calibraciones separadas antes del uso. La
instrumental en lı́nea que haya sido calibrado y estandarizado frecuencia de la recalibración se determina en función del diseño del
apropiadamente y que haya demostrado una aptitud del sistema instrumento, de la frecuencia de uso, etc. Sin embargo, como
aceptable. La aceptabilidad de dicho instrumental en lı́nea para las algunos instrumentos con múltiples escalas tienen un único ajuste de
pruebas de atributos de calidad depende de su localización o calibración, en algunos casos es necesario recalibrar cada vez que se
localizaciones en el sistema de agua. Estas localizaciones del utilice una escala diferente. El instrumento debe tener una resolución
instrumento y las respuestas deben reflejar la calidad del agua mı́nima de 0,1 mS/cm* en la parte inferior de la escala. Excluyendo la
empleada. exactitud de la celda, la exactitud del instrumento debe ser de +0,1
mS/cm.
Debido a que la temperatura tiene un impacto sustancial sobre las
lecturas de conductividad de las muestras a temperaturas altas y
h645i CONDUCTIVIDAD DEL bajas, muchos instrumentos corrigen automáticamente la lectura real
para mostrar el valor que teóricamente se observarı́a a la temperatura
AGUA nominal de 258. La corrección se efectúa mediante un sensor de
temperatura en la sonda de la celda de conductividad y un algoritmo
en el sistema de circuitos del instrumento. Este algoritmo de
compensación de temperatura puede no ser exacto. Los valores de
La conductividad eléctrica del agua es una medida del flujo de conductividad que se usan en este método son mediciones que no
electrones facilitado con iones. Las moléculas de agua se disocian en han sido compensadas por temperatura. La exactitud de las
iones en función del pH y la temperatura, produciéndose una mediciones de temperatura debe ser de +28.
conductividad fácil de predecir. Algunos gases, especialmente el El procedimiento que se describe a continuación está diseñado
dióxido de carbono, se disuelven rápidamente en el agua e para medir la conductividad del Agua Purificada y del Agua para
interactúan para formar iones, lo que afecta la conductividad y el Inyección. La Etapa 1 del procedimiento que se describe a
pH en forma predecible. Para los fines de este capı́tulo, estos iones y continuación se puede efectuar (modificando el Paso 1 según
la conductividad resultante se pueden considerar como intrı́nsecos al corresponda) usando instrumentos en lı́nea que hayan sido
agua. calibrados apropiadamente, cuyas constantes de celda hayan sido
La presencia de iones extraños también afecta la conductividad del determinadas con exactitud y cuyas funciones de compensación de
agua. Los iones extraños empleados para determinar las especifica- temperatura hayan sido desactivadas. La aptitud de dicho instru-
ciones de conductividad, que se describen a continuación, son los mental en lı́nea para la prueba de control de calidad también depende
iones cloruro y sodio. En cuanto al nivel de impurezas permitidas en de sus localizaciones en el sistema de agua. Las localizaciones del
el agua, la mayor proporción corresponde a la conductividad del ión instrumento seleccionadas deben reflejar la calidad del agua
cloruro ubicuo (en una concentración teórica de punto de valoración empleada.
igual a 0,47 ppm en los casos en que constituı́a una prueba de
calidad en la USP XXII y en versiones anteriores) y al ión amonio
con un lı́mite de 0,3 ppm. Con este nivel de impurezas permitido, la PROCEDIMIENTO
neutralidad eléctrica se mantiene con una cantidad de cationes cuya
función es equilibrar, como por ejemplo el ión sodio. Los iones Etapa 1
extraños como los mencionados, pueden tener un impacto
significativo en la pureza quı́mica del agua y en su aptitud para 1. Determinar la temperatura y la conductividad del agua usando
usarla en aplicaciones farmacéuticas. Las conductividades combina- una lectura de conductividad que no haya sido compensada por
das de los iones intrı́nsecos y extraños varı́an en función del pH y temperatura. La medición se puede realizar en un recipiente
constituyen la base de las especificaciones de conductividad que se adecuado o como una medición en lı́nea.
incluyen en la tabla adjunta y que se utilizan en la Etapa 3 del 2. Usar la tabla Etapa 1—Requisitos de Temperatura y
método de prueba. En el método de prueba se incluyen dos etapas Conductividad, para determinar el valor de temperatura que no sea
preliminares. Si se cumplen las condiciones de prueba y los lı́mites mayor que la temperatura medida, es decir, el valor inmediatamente
de conductividad en cualquiera de estas etapas preliminares, el agua inferior. El valor de conductividad correspondiente en esta tabla es el
cumple con los requisitos de esta prueba. En estas circunstancias, no lı́mite. [NOTA—No interpolar.]
es necesario realizar la tercera etapa de la prueba. Solamente si falla 3. Si la conductividad medida no es mayor que el valor
la etapa final de la prueba se considera que la muestra no cumple con especificado en la tabla, el agua cumple con los requisitos de la
los requisitos de la prueba. prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor que el valor
especificado en la tabla, pasar a la Etapa 2.
*
mS/cm (microsiemens por centı́metro) = mmho/cm = recı́proco de megohm-
cm.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h651i Temperatura de Solidificación 283
Etapa 2
4. Transferir una cantidad de agua suficiente (100 mL o más) a un
recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la
h651i TEMPERATURA DE
temperatura, si fuera necesario, y manteniéndola a 25 + 18, SOLIDIFICACIÓN
comenzar a agitar vigorosamente la muestra de prueba a medida
que observa la conductividad periódicamente. Cuando el cambio en
la conductividad (producido por la absorción de dióxido de carbono
atmosférico) sea menor de 0,1 mS/cm neto cada 5 minutos, registrar La temperatura a la cual una sustancia pasa del estado lı́quido al
la conductividad. sólido cuando se enfrı́a es un ı́ndice útil de su pureza si se libera
5. Si la conductividad no es mayor de 2,1 mS/cm, el agua cumple calor al producirse la solidificación, siempre que toda impureza
con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad presente se disuelva sólo en el lı́quido y no en el sólido. Las
es mayor de 2,1 mS/cm, pasar a la Etapa 3. sustancias puras tienen un punto de congelación bien definido, pero
generalmente las mezclas se congelan a diferentes temperaturas. Para
muchas mezclas, la temperatura de solidificación, determinada
Etapa 3 siguiendo estrictamente los siguientes métodos empı́ricos, es un
ı́ndice útil de su pureza. El método para determinar las temperaturas
6. Efectuar esta prueba dentro de los 5 minutos (aproximadamen- de solidificación que se describe en este documento se aplica
te) de haber efectuado la determinación de conductividad en el Paso a sustancias que funden entre –208 y 1508, que es el intervalo del
5, manteniendo siempre la temperatura de la muestra a 25 + 18. termómetro usado en el baño. La temperatura de solidificación es el
Agregar una solución saturada de cloruro de potasio a la misma punto máximo (o en caso de no existir un máximo, el punto de
muestra de agua (0,3 mL por cada 100 mL de la muestra de prueba) inflexión) en la curva de temperatura-tiempo.
y determinar el pH con una aproximación de 0,1 según se indica en Aparato—Ensamblar un aparato similar al ilustrado, donde el
pH h791i. recipiente para la sustancia es un tubo de ensayo de 25 6 100 mm en
7. Empleando la tabla de la Etapa 3—Requisitos de pH y el que se coloca un termómetro adecuado de intervalo corto,
Conductividad, determinar el lı́mite de conductividad en el valor de suspendido en el centro y un mezclador de alambre, aproximada-
pH medido. Si la conductividad medida en el Paso 4 no es mayor mente de 30 cm de largo, que se dobla en su extremo inferior en un
que los requisitos de conductividad para el pH determinados en el anillo horizontal que rodea el termómetro. Emplear un termómetro
Paso 6, el agua cumple con los requisitos de la prueba de con un intervalo que no exceda de 308, graduado en divisiones de
conductividad. Si la conductividad medida es mayor que este valor 0,18 y calibrado para una inmersión a 76 mm pero no usado a esa
o si el pH está fuera del intervalo comprendido entre 5,0 y 7,0 el profundidad. La serie ASTM E1 89C a 96C es una serie disponible
agua no cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. y adecuada de termómetros, que abarcan un intervalo desde –208
hasta +1508. Se pueden usar otros aparatos para medir temperaturas
284 h661i Envases / Pruebas Fı́sicas USP 30
siempre y cuando estén validados para este procedimiento (ver esperado. Revolver continuamente la muestra hasta terminar la
Termómetros h21i). Las dimensiones deben estar comprendidas entre prueba moviendo el agitador de alambre hacia arriba y hacia abajo
+ 20% con respecto a las que se muestran en la figura. entre la parte superior e inferior de la muestra, a una velocidad
constante de 20 ciclos completos por minuto.
Frecuentemente, la congelación puede inducirse frotando las
paredes internas del tubo de ensayo con el termómetro, o introdu-
ciendo un fragmento pequeño de la sustancia previamente
solidificada. Un sobreenfriamiento pronunciado puede causar una
desviación respecto del patrón normal de cambios de temperatura. Si
esto último ocurre, repetir la prueba, introduciendo partı́culas
pequeñas del material en análisis en forma sólida a intervalos de
18 a medida que la temperatura se acerca al punto de solidificación
esperado.
Registrar la lectura del termómetro del tubo de ensayo cada 30
segundos. Continuar revolviendo sólo mientras baje gradualmente la
temperatura; dejar de revolver cuando la temperatura se vuelva
constante o comience a subir levemente. Continuar registrando la
temperatura en el tubo de ensayo cada 30 segundos, al menos
durante 3 minutos, después de que la temperatura comience a caer
nuevamente después de haber permanecido constante.
El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas
comprendidas dentro de un intervalo de 0,28 constituye la
temperatura de solidificación. Estas lecturas se encuentran cerca de
un punto de inflexión o un máximo, en la curva de temperatura-
tiempo, que se produce después de que la temperatura se vuelva
constante o comience a subir y antes de que empiece a bajar
nuevamente. El promedio de las lecturas con una aproximación de
0,18 constituye la temperatura de solidificación.
h661i ENVASES
1
Para más información, consultar las siguientes publicaciones de la American
Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense de Pruebas y
Materiales, ASTM por sus siglas en inglés) sita en 100 Barr Harbor Drive,
West Conshohocken, PA 19428-2959, ‘‘Standard Method of Test for Haze
and Luminous Transmittance of Transparent Plastics’’, Referencia ASTM D-
1003-61; ‘‘Tentative Method of Test for Luminous Reflectance, Transmit-
tance, and Color of Materials’’, ASTM E 308-66.
286 h661i Envases / Pruebas Fı́sicas USP 30
Tabla 2. Tipos de Vidrio y Lı́mites de Prueba Distribución del Tamaño de Partı́cula por Tamizado Analı́tico
h786i), matraces Erlenmeyer de 250 mL de vidrio resistente tratados
Lı́mites según se indica, un martillo de 900 g (2 libras), un imán permanente,
Tamaño2 mL de un desecador y un aparato volumétrico adecuado.
Descripción mL Ácido Reactivos—
Tipo General1 Tipo de Prueba 0,020 N Agua de Alta Pureza—La conductividad del agua que se utiliza en
estas pruebas a 258, determinada en una celda colocada inmedia-
I Vidrio tamente antes de la salida del sistema, no excede de 0,15 mS por cm
borosilicato, (6,67 Megaohmios por cm). También es necesario garantizar de la
altamente Vidrio Pulveri- ausencia de contaminación con cobre o sus derivados (debido, por
resistente zado Todos 1,0 ejemplo, a tuberı́as de cobre, alambiques o recipientes). Un método
II Vidrio de cal 100 o 0,7 para preparar el agua consiste en pasar agua destilada a través de un
sodada tratado Acción del menos cartucho desionizador relleno con un lecho mixto de resina de grado
Agua Más de 100 0,2 nuclear, y luego pasarla a través de una membrana de éster de
celulosa con un tamaño de poro que no exceda de 0,45 mm3. No
III Vidrio de cal Vidrio Pulveri- Todos 8,5 utilizar tuberı́as de cobre. Enjuagar las lı́neas de descarga antes de
sodada zado dispensar el agua en los recipientes de prueba. Cuando ya no se
NP Vidrio de cal obtenga la conductividad especificada, reemplazar el cartucho
sodada para desionizador.
Fines Gene- Vidrio Pulveri- Solución de Rojo de Metilo—Disolver 24 mg de rojo de metilo
rales zado Todos 15,0 sódico en Agua Purificada para completar 100 mL. Si fuera
necesario, neutralizar la solución con hidróxido de sodio 0,02 N o
1
La descripción se aplica a los envases de este tipo de vidrio generalmente acidificarla con ácido sulfúrico 0,02 N para que la valoración de 100
disponibles. mL de Agua de Alta Pureza con 5 gotas de indicador, no requiera
2
El tamaño indica la capacidad de desbordamiento del envase. más de 0,020 mL de hidróxido de sodio 0,020 N para obtener el
cambio de color del indicador que ocurre a un pH de 5,6.
Aparato—
Autoclave—Para estas pruebas, utilizar un autoclave capaz de Prueba de Vidrio Pulverizado
mantener una temperatura de 121 + 2,08, equipado con un
termómetro, un manómetro, una válvula de ventilación y una Enjuagar bien con Agua Purificada 6 o más envases seleccionados
gradilla en la que se puedan colocar al menos 12 envases de prueba aleatoriamente y secarlos con una corriente de aire limpio y seco.
por encima del nivel del agua. Triturar los envases en fragmentos con un tamaño de aproximada-
Mortero y Mano—Emplear un mortero y una mano de acero mente 25 mm, dividir aproximadamente 100 g del vidrio triturado en
endurecido, construidos según las especificaciones de la ilustración tres porciones aproximadamente iguales y colocar una de las
adjunta. porciones en el mortero especial. Con la mano del mortero colocada
en su lugar, volver a triturar el vidrio golpeando con el martillo 3 ó 4
veces. Apilar los tamices y vaciar el mortero en el tamiz N8 20.
Repetir la operación con cada una de las dos porciones restantes de
vidrio, vaciando el mortero todas las veces en el tamiz N8 20. Agitar
los tamices durante un tiempo corto, luego retirar el vidrio de los
tamices números 20 y 40 y nuevamente triturar y tamizar como se
describió anteriormente. Repetir la operación de triturado y tamizado
una vez más. Vaciar el recipiente recolector, volver a encajar los
tamices y agitar mecánicamente durante 5 minutos o a mano durante
un perı́odo equivalente. Transferir a un recipiente con tapa la porción
retenida en el tamiz N8 50, que deberá pesar más de 10 g, y
almacenar en un desecador hasta el momento de la prueba.
Extender la muestra sobre una pieza de papel satinado y pasar un
imán a través del material para eliminar las partı́culas de hierro que
pudieran haberse introducido durante el triturado. Transferir la
muestra a un matraz Erlenmeyer de 250 mL de vidrio resistente y
lavarlo con seis porciones de 30 mL de acetona, agitando por
rotación suave cada vez durante aproximadamente 30 segundos y
decantando cuidadosamente la acetona. Luego del lavado, la muestra
debe quedar exenta de aglomeraciones de polvo de vidrio mientras
que la superficie de los granos debe estar prácticamente exenta de
partı́culas finas adheridas. Secar el matraz y el contenido durante 20
minutos a 1408, transferir los granos a un frasco de pesar y enfriar en
un desecador. Emplear la muestra de prueba dentro de las 48 horas
después de haberla secado.
Procedimiento—Transferir 10,00 g de la muestra preparada,
pesada con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 mL
previamente digerido (tratado) con Agua de Alta Pureza en un
baño a 908 durante al menos 24 horas o a 1218 durante 1 hora.
Agregar 50,0 mL de Agua de Alta Pureza a este matraz y a otro
Mortero y Mano Especiales para Pulverizar Vidrio2 3
Una mezcla adecuada de resina de grado nuclear de intercambio catiónico
fuertemente ácida en forma de hidrógeno y de intercambio aniónico
Otros Equipos—También se requieren tamices de 20,3 cm (8 fuertemente básica en forma de hidróxido, con una relación de equivalencia
de anión a catión de 1 a 1 se puede obtener de Millipore Corp., Bedford, MA
pulgadas) de acero inoxidable, incluidos los tamices números 20, 40 01730; Barnstead Co., 225 Rivermoor St., Boston, MA 02132; Illinois Water
y 50 junto con la bandeja y la cubierta (ver Tamaños de Series de Treatment Co., 840 Cedar St., Rockford, IL 61105; y de Vaponics, Inc., 200
Tamices Estándar en el Intervalo de Interés en Estimación de la Cordage Park, Plymouth, MA 02360.
2
Se puede obtener un mortero y una mano de mortero adecuados de Un filtro acoplado adecuado se puede obtener de Millipore Corp.; Gelman
Humboldt Manufacturing Co., 7300 West Agatite, Norridge, Chicago, IL Instrument Co., 600 S. Wagner Rd., Ann Arbor, MI 48106; y de Schleicher
60656, número de catálogo H-17280. and Schuell, Inc., 540 Washington St., Keene, NH 10003.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h661i Envases 287
preparado de manera similar para usar como blanco. Tapar todos los Si se necesita una designación de clase para plástico y otros
matraces con vasos de precipitados de vidrio borosilicato, pre- polı́meros que cumplan con los requisitos de las Pruebas de
viamente tratados igual que como se indicó para los matraces y que Reactividad Biológica, In Vitro h87i, realizar las pruebas in vivo
tengan un tamaño tal que el fondo de los vasos de precipitado quede apropiadas que se especifican en Clasificación de Plásticos en
bien ajustado en el borde superior de los matraces. Colocar los Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo h88i.
matraces con los vasos de precipitado en el autoclave y cerrarlo
firmemente, dejando abierta la válvula de ventilación. Calentar hasta
que la válvula de ventilación emita abundante vapor y continuar PRUEBAS FISICOQUÍMICAS—PLÁSTICOS
calentando durante 10 minutos. Cerrar la válvula de ventilación y
ajustar la temperatura a 1218, empleando de 19 a 23 minutos hasta Las siguientes pruebas, diseñadas para determinar las propiedades
alcanzar la temperatura deseada. Mantener la temperatura a fı́sicas y quı́micas de los plásticos y sus extractos, están basadas en la
121 + 2,08 durante 30 minutos, cronometrando el tiempo desde el extracción del material plástico y es esencial que se emplee la
momento en que se alcanza esta temperatura. Reducir el calor hasta cantidad de plástico indicada. Asimismo, es necesario que la
que se enfrı́e el autoclave y se equilibre hasta presión atmosférica en superficie especificada esté disponible para la extracción a la
38 a 46 minutos, abriendo la válvula de ventilación, según sea temperatura indicada.
necesario, para impedir la formación de vacı́o. Enfriar el matraz de Medio de Extracción—A menos que se indique algo diferente en
inmediato bajo agua corriente, decantar el agua del matraz en un alguna de las pruebas especı́ficas descritas a continuación, emplear
recipiente limpio y lavar el vidrio pulverizado residual con cuatro Agua Purificada (ver monografı́a) como medio de extracción y
porciones de 15 mL de Agua de Alta Pureza, agregando los lavados mantenerla a una temperatura de 708 durante la extracción de la
del decantado a la porción principal. Agregar 5 gotas de Solución de Muestra preparada.
Rojo de Metilo y, de inmediato, valorar con ácido sulfúrico 0,020 N.
Si se espera que el volumen de la solución de valoración sea menor Aparatos—Emplear un baño de agua y los Envases de Extracción
de 10 mL, emplear una microbureta. Registrar el volumen de ácido según se describen en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
sulfúrico 0,020 N usado para neutralizar el extracto de 10 g de la h88i.
muestra preparada, corregido por el blanco. El volumen no excede Preparación del Equipo—Proceder según se indica en el primer
del indicado en la Tabla 2 para el tipo de vidrio en cuestión. párrafo en Preparación del Equipo en Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vivo h88i. [NOTA—Los envases y equipos no necesitan
estar esterilizados.]
Acción del Agua a 1218 Procedimiento—
Preparación de la muestra—Utilizar una porción de una muestra
Enjuagar bien dos veces con Agua de Alta Pureza 3 o más de plástico homogénea, que equivalga a 120 cm2 de área superficial
envases, seleccionados aleatoriamente. total (ambos lados combinados), cada 20,0 mL de medio de
Procedimiento—Llenar cada envase al 90% de su capacidad de extracción y subdividir en tiras de aproximadamente 3 mm de ancho
desbordamiento con Agua de Alta Pureza y proceder como se indica y de preferencia con una longitud lo más próxima a 5 cm. Transferir
en el Procedimiento en Prueba de Vidrio Pulverizado, comenzando la Muestra subdividida a una probeta graduada de vidrio Tipo I de
donde dice ‘‘Tapar todos los matraces’’, excepto que el tiempo de 250 mL con tapón de vidrio y agregar aproximadamente 150 mL de
autoclavado debe ser de 60 minutos en lugar de 30 minutos, y Agua Purificada. Agitar durante aproximadamente 30 segundos,
terminando donde dice ‘‘para impedir la formación de vacı́o’’. Vaciar drenar y desechar el lı́quido, y repetir con un segundo lavado.
el contenido de 1 o más envases en una probeta graduada de 100 mL, Transferir la Muestra preparada a un matraz de extracción
combinando el contenido de varios envases, en el caso de envases adecuado y agregar la cantidad requerida de Medio de Extracción.
más pequeños, para obtener un volumen de 100 mL. Colocar la Extraer la muestra mediante calentamiento en un baño de agua a la
muestra combinada en un matraz Erlenmeyer de 250 mL de vidrio temperatura especificada para el Medio de Extracción durante 24
resistente, agregar 5 gotas de Solución de Rojo de Metilo y valorar, horas. Enfriar, pero a una temperatura no menor a 208. Pipetear 20
mientras esté tibia, con ácido sulfúrico 0,020 N. Completar la mL del extracto de la Muestra y transferir a un recipiente adecuado.
valoración dentro de los 60 minutos desde la apertura del autoclave. Emplear esta porción en la prueba de Capacidad Amortiguadora. De
Registrar el volumen de ácido sulfúrico 0,020 N utilizado, corregido inmediato decantar el extracto restante recogiendo el filtrado en un
por un blanco obtenido valorando 100 mL de Agua de Alta Pureza a recipiente limpio y sellarlo.
la misma temperatura y con la misma cantidad de indicador. El Blanco—Usar Agua Purificada cuando se especifique un blanco
volumen no excede del indicado en la Tabla 2 para el tipo de vidrio en las siguientes pruebas.
en cuestión. RESIDUO NO VOLÁTIL—Transferir, en porciones apropiadas, 50,0
mL del extracto de la Muestra preparada, a un crisol tarado adecuado
(preferentemente un crisol de sı́lice fundida que haya sido lavado
Arsénico con ácido) y evaporar la materia volátil en un baño de vapor.
Emplear el mismo procedimiento para evaporar 50,0 mL del Blanco
Arsénico h211i—Utilizar como Preparación de Prueba 35 mL de en un segundo crisol. [NOTA—Si se espera obtener un residuo oleoso,
agua de un envase de vidrio Tipo I o, en el caso de envases más inspeccionar el crisol repetidamente durante la evaporación y el
pequeños, 35 mL del contenido combinado de varios envases de perı́odo de secado y reducir el calor si el aceite tiende a ascender por
vidrio Tipo I, preparado según se indica en el Procedimiento en las paredes del crisol.] Secar a 1058 durante 1 hora: la diferencia
Acción del Agua a 1218: el lı́mite es 0,1 mg por g. entre las cantidades obtenidas a partir de la Muestra y el Blanco no
excede de 15 mg.
RESIDUO DE INCINERACIÓN h281i—[NOTA—No es necesario
PRUEBAS BIOLÓGICAS—PLÁSTICOS Y realizar esta prueba cuando el resultado de la prueba de Residuo
OTROS POLÍMEROS No Volátil no excede de 5 mg.] Proceder con el Residuo no Volátil
obtenido a partir de la Muestra y del Blanco, utilizando, si fuera
Realizar las pruebas biológicas in vitro según los procedimientos necesario, una cantidad adicional de ácido sulfúrico pero agregando
que se establecen en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro la misma cantidad de ácido sulfúrico a cada crisol: la diferencia entre
h87i. Los materiales que cumplen los requisitos de las pruebas in las cantidades de residuo de incineración obtenidas a partir de la
vitro no necesitan ser sometidos a pruebas adicionales. No se asigna Muestra y el Blanco no excede de 5 mg.
ningún tipo de designación de clase de plástico para estos materiales. METALES PESADOS—Pipetear 20 mL del extracto de la Muestra
Los materiales que no cumplen los requisitos de las pruebas in vitro preparada, filtrada si fuera necesario, y transferir a uno de dos tubos
no son adecuados como envases para productos farmacéuticos. de comparación pareados de 50 mL. Ajustar con ácido acético 1 N o
hidróxido de amonio 6 N a un pH entre 3,0 y 4,0 utilizando papel
indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, diluir
con agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar.
288 h661i Envases / Pruebas Fı́sicas USP 30
Pipetear 2 mL de Solución Estándar de Plomo (ver Metales fabricación de los envases cumplen con los requisitos establecidos
Pesados h231i), transferir al segundo tubo de comparación de color en las secciones pertinentes del Código de Reglamentaciones
y agregar 20 mL del Blanco. Ajustar con ácido acético 1 N o Federales, Tı́tulo 21.
hidróxido de amonio 6 N a un pH entre 3,0 y 4,0 utilizando papel El espectro de absorción IR de ambos polietilenos, de alta y baja
indicador de pH de intervalo corto como indicador externo, diluir densidad, es tı́pico de los polietilenos y cada uno de ellos tiene
con agua hasta aproximadamente 35 mL y mezclar. Agregar a cada propiedades térmicas caracterı́sticas. La densidad del polietileno de
tubo 1,2 mL de tioacetamida-glicerina básica SR y 2 mL de Solución alta densidad está entre 0,941 g y 0,965 g por cm3. La del polietileno
Amortiguadora de Acetato de pH 3,5 (ver Metales Pesados h231i), de baja densidad está entre 0,850 g y 0,940 g por cm3. Las
diluir con agua hasta 50 mL y mezclar: el color marrón que se propiedades de permeación de envases moldeados de polietileno
produzca dentro de 10 minutos en el tubo que contiene el extracto de pueden alterarse por la incorporación de polı́mero recién molido,
la Muestra preparada no excede del que se produce en el tubo que según la proporción de material recién molido en el producto final.
contiene la Solución Estándar de Plomo, observando ambos tubos Otras propiedades que pueden afectar la aptitud del polietileno
hacia abajo sobre una superficie blanca (1 ppm en el extracto). utilizado para envasar fármacos son: la permeabilidad al oxı́geno y a
CAPACIDAD AMORTIGUADORA—Valorar potenciométricamente la la humedad, el coeficiente de elasticidad, el ı́ndice de fusión, la
porción de 20 mL previamente recolectada del extracto de la resistencia a las fisuras por estrés ambiental y el grado de
Muestra preparada hasta un pH de 7,0, utilizando ácido clorhı́drico cristalinidad posterior al moldeado. Las formas farmacéuticas secas
0,010 N o hidróxido de sodio 0,010 N, según se requiera. Tratar una de administración oral que no están destinadas a ser reconstituidas
porción de 20,0 mL del Blanco en forma similar: si se requiere la como solución y que se envasan en el tipo de envase definido en esta
misma solución volumétrica tanto para la Muestra como para el sección deben cumplir con los requisitos de esta sección.
Blanco, la diferencia entre los dos volúmenes no es mayor de 10,0 Reflectancia Interna Múltiple—
mL; si se requiere ácido para la Muestra o el Blanco y álcali para el APARATO—Utilizar un espectrofotómetro IR capaz de corregir por
otro, el total de los dos volúmenes requeridos no es mayor de 10,0 el espectro del blanco, equipado con accesorios de reflectancia
mL. interna múltiple y con una placa de reflectancia interna KRS-54. Un
cristal de KRS-5 de 2 mm de espesor con un ángulo de incidencia de
458 proporciona un número suficiente de reflejos.
ENVASES PARA PRODUCTOS OFTÁLMICOS — PREPARACIÓN DE LA MUESTRA—Cortar 2 secciones planas de un
PLÁSTICOS espesor equivalente al espesor promedio de la pared del envase y
recortarlas, según sea necesario, a fin de obtener segmentos que
Los plásticos para envases de productos oftálmicos están tengan un tamaño conveniente para montarlos en el accesorio de
constituidos por una mezcla de compuestos homólogos de peso reflectancia interna múltiple. Con cuidado para evitar rayar las
molecular variable. Con frecuencia, tales plásticos contienen otras superficies, secar las muestras con papel seco o, si fuera necesario,
sustancias; como por ejemplo: residuos del proceso de polimeriza- limpiarlas con una tela suave humedecida con metanol y dejarlas
ción, plastificantes, estabilizadores, antioxidantes, pigmentos y secar. Montar firmemente las muestras en ambos lados de la placa
lubricantes. Ciertos factores también pueden afectar la idoneidad KRS-5 de reflectancia interna, asegurándose de lograr un contacto
de un plástico para un uso especı́fico. Entre estos factores cabe superficial adecuado. Antes del montaje en la placa, las muestras
mencionar la composición del plástico, los procedimientos de pueden comprimirse mediante exposición a temperaturas de
procesamiento y limpieza, el contacto con los medios, tintas, aproximadamente 1778, a alta presión (15 000 psi o más) para
adhesivos, la absorción, la adsorción y permeabilidad de los obtener pelı́culas uniformes y delgadas.
conservantes y las condiciones de almacenamiento. PROCEDIMIENTO—Colocar las secciones de la muestra en el
Definición—A los efectos de este capı́tulo, un envase es aquel que accesorio de reflectancia interna múltiple y colocar el conjunto en el
contiene un fármaco y está o puede estar en contacto directo con el haz de la muestra del espectrofotómetro IR. Ajustar la posición de la
fármaco. muestra y de los espejos dentro del accesorio para permitir la
Pruebas Biológicas—Los plásticos y otros polı́meros empleados máxima transmisión de luz del haz de referencia no atenuado. (Si se
como envases para productos oftalmológicos deben cumplir con los trata de un instrumento de haz doble, completar los ajustes en el
requisitos establecidos en la sección Pruebas Biológicas—Plásticos accesorio y luego atenuar el haz de referencia para permitir una
y Otros Polı́meros. deflexión de escala completa durante el barrido de la muestra.)
Determinar el espectro IR de 3500 cm–1 a 600 cm–1: el espectro
corregido de la muestra presenta bandas de absorción principales
ENVASES DE POLIETILENO sólo a las mismas longitudes de onda que las del espectro del ER
Polietileno de Alta Densidad USP o del ER Polietileno de Baja
Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección, Densidad USP, determinados de manera similar.
caracterizan los envases de polietileno de alta y de baja densidad, Análisis Térmico —Cortar una sección que pese aproximada-
ambos considerados adecuados para envasar formas farmacéuticas mente 12 mg y colocarla en el platillo para la muestra de prueba.
secas de administración oral que no están destinadas a reconstituirse Determinar el termograma bajo nitrógeno a una temperatura entre
en solución. 408 y 2008 con una velocidad de calentamiento entre 28 y 108 por
Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha minuto, seguido de enfriamiento a una velocidad entre 28 y 108 por
de caducidad de una forma farmacéutica seca de administración oral minuto hasta 408, utilizando un equipo capaz de realizar las
especı́fica que no está destinada a reconstituirse en solución, determinaciones descritas en Análisis Térmico h891i.
contenida en un envase que cumple con los requisitos para envases Polietileno de Alta Densidad—El termograma de la muestra es
de polietileno de alta o baja densidad que se establecen en este similar al termograma del ER Polietileno de Alta Densidad USP,
documento, se puede utilizar, en cambio, cualquier otro envase de determinado de la misma manera y las temperaturas de los procesos
polietileno que cumpla con los mismos requisitos de las secciones endotérmicos y exotérmicos en el termograma de la muestra no
que correspondan al envasado de tal forma farmacéutica. El uso de difieren de las del estándar en más de 6,08.
envases alternativos es válido siempre que los programas de Polietileno de Baja Densidad—El termograma de la muestra es
estabilidad apropiados se amplı́en para incluir dicho envase similar al termograma del ER Polietileno de Baja Densidad USP,
alternativo de forma de garantizar que la identidad, contenido, determinado de la misma manera y las temperaturas de los procesos
calidad y pureza de la forma farmacéutica se mantienen hasta la endotérmicos y exotérmicos en el termograma de la muestra no
fecha de caducidad. difieren de las del estándar en más de 8,08.
Ambos polietilenos, de baja y alta densidad, son polı́meros de
cadena larga sintetizados a partir de no menos de 85,0% de etileno y
no menos de 95,0% de olefinas totales en condiciones controladas de
calor y presión mediante reacciones en las que se emplean 4
catalizadores. Los otros ingredientes olefı́nicos que se utilizan con Los accesorios de reflectancia interna múltiple y la placa KRS-5 están
mayor frecuencia son el buteno, el hexeno y el propileno. Los disponibles de diversas fuentes, entre las que se incluyen Beckman
Instruments, Inc., 2500 Harbor Blvd., Fullerton, CA 92634 y Perkin Elmer
ingredientes usados para fabricar el polietileno y los utilizados en la Corp., Main Ave., Norwalk, CT 06856.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h661i Envases 289
Transmisión de Luz—Los envases de polietileno destinados a molar de no más de 3) o 1,4-ciclohexanodimetanol (un porcentaje
proporcionar protección contra la luz cumplen con los requisitos de molar de no más de 5). La polimerización se realiza en condiciones
Transmisión de Luz. controladas de calor y vacı́o, con catalizadores y estabilizadores.
Permeabilidad al Vapor de Agua—Cerrar los envases con sellos Las resinas de copolı́mero de PET tienen propiedades fı́sicas y
impermeables empleando calor y un laminado de aluminio- espectrales similares a las del PET y a efectos prácticos se las
polietileno u otro sello apropiado 5. Analizar los envases según se considera como PET. La pruebas y especificaciones que se
describe en Envases—Permeabilidad h671i: los envases de polieti- proporcionan en esta sección para caracterizar a las resinas y los
leno de alta densidad analizados cumplen con los requisitos si la frascos de PET también se aplican a las resinas de copolı́meros de
permeabilidad a la humedad excede de 10 mg por dı́a por L, en no PET y a los frascos fabricados con éstos.
más de 1 de los 10 envases de prueba y ninguno de ellos excede de Las resinas de copolı́mero de PET y el PET, generalmente
25 mg por dı́a por L. Los envases de polietileno de baja densidad presentan una estructura molecular muy ordenada. Como con-
analizados cumplen con los requisitos si la permeabilidad a la secuencia, muestran un comportamiento térmico caracterı́stico que
humedad excede de 20 mg por dı́a por L en no más de 1 de los 10 depende de la composición, incluyendo una temperatura de
envases de prueba y ninguno de ellos excede de 30 mg por dı́a por L. transición vı́trea de aproximadamente 768 y una temperatura de
Metales Pesados y Residuo no Volátil—Preparar extractos de fusión de aproximadamente 2508. Estas resinas tienen un espectro de
muestras para estas pruebas según se indica en Preparación de la absorción IR distintivo que permite diferenciarlas de otros materiales
Muestra en el Procedimiento en Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos, plásticos (por ejemplo: policarbonato, poliestireno, polietileno y
con la excepción de que por cada 20,0 mL de Medio de Extracción la resinas de PETG). El PET y las resinas de copolı́mero de PET tienen
porción será de 60 cm2, independientemente del espesor. una densidad entre 1,3 y 1,4 g por cm3 y una viscosidad intrı́nseca
mı́nima de 0,7 dL por g, que corresponde a un peso molecular
METALES PESADOS—Los envases cumplen con los requisitos de promedio de aproximadamente 23 000 daltons.
Metales Pesados en Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos. Las resinas de PETG son polı́meros de alto peso molecular
RESIDUO NO VÓLATIL—Proceder según se indica en Residuo no preparados mediante condensación de etilenglicol con tereftalato de
Volátil en Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos, con la excepción de dimetilo o ácido tereftálico y un porcentaje molar de 15 a 34 de 1,4-
que el blanco será el mismo disolvente usado en cada una de las ciclohexanodimetanol. Las resinas PETG son polı́meros transpar-
pruebas que se describen a continuación. La diferencia entre las entes, amorfos, que poseen una temperatura de transición vı́trea de
cantidades obtenidas a partir de la muestra y del blanco no excede de aproximadamente 818 y no tienen un punto de fusión cristalino,
12,0 mg cuando se emplea agua mantenida a una temperatura de 708 determinado por calorimetrı́a diferencial de barrido. Estas resinas
como medio de extracción; no excede de 75,0 mg cuando se emplea tienen un espectro de absorción IR caracterı́stico que permite
alcohol mantenido a una temperatura de 708 como medio de diferenciarlas de otros materiales plásticos, incluso el PET. Las
extracción y no excede de 100,0 mg para el polietileno de alta resinas de PETG tienen una densidad de aproximadamente 1,27 g
densidad y no excede de 350,0 mg para el polietileno de baja por cm3 y una viscosidad intrı́nseca mı́nima de 0,65 dL por g, que
densidad cuando se emplean hexanos mantenidos a una temperatura corresponde a un peso molecular promedio de aproximadamente
de 508 como medio de extracción. Los envases cumplen con estos 16 000 daltons.
requisitos de Residuo no Volátil para todos los medios de extracción Las resinas de PET y de PETG y otros ingredientes utilizados en la
anteriormente mencionados. [NOTA—Los hexanos y el alcohol son fabricación de estos frascos cumplen con los requisitos de las
inflamables. Para evaporar estos disolventes, utilizar una corriente de secciones pertinentes del Código Federal de Reglamentaciones,
aire con el baño de agua y utilizar una estufa a prueba de explosiones Tı́tulo 21, en lo referente al uso de estos materiales en contacto con
para secar el residuo.] alimentos y bebidas alcohólicas. Las resinas de PET y de PETG no
contienen plastificantes, adyuvantes o antioxidantes. Los colorantes
que se empleen en la fabricación de frascos de PET y de PETG, si los
FRASCOS DE TEREFTALATO DE hubiera, no migran al lı́quido contenido en el frasco.
POLIETILENO Y FRASCOS DE TEREFTALATO Reflectancia Interna Múltiple—
DE POLIETILENO G APARATO—Utilizar un espectrofotómetro IR capaz de corregir por
el espectro del blanco, equipado con accesorios de reflectancia
Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección interna múltiple y una placa de reflectancia interna KRS-56. Un
caracterizan los frascos de tereftalato de polietileno (PET, por sus cristal de KRS-5 de 2 mm de espesor con un ángulo de incidencia de
siglas en inglés) y de tereftalato de polietileno G (PETG, por sus 458 proporciona un número suficiente de reflejos.
siglas en inglés), ambos adecuados para envasar formas farmacéu- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA—Cortar 2 secciones planas de un
ticas lı́quidas de administración oral. espesor equivalente al espesor promedio de la pared del frasco y
Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha recortarlas, según sea necesario, a fin de obtener segmentos que
de caducidad de una forma farmacéutica lı́quida de administración tengan un tamaño conveniente para montarlos en el accesorio de
oral especı́fica envasada en un frasco que cumple con los requisitos reflectancia interna múltiple. Con cuidado para evitar rayar las
establecidos en este documento para frascos de PET o PETG, se superficies, secar las muestras con papel seco o, si fuera necesario,
puede utilizar, en cambio, cualquier otro tipo de frasco de PET o limpiarlas con una tela suave humedecida con metanol y dejarlas
PETG para envasar dicha forma farmacéutica siempre que los secar. Montar firmemente las muestras en ambos lados de la placa
programas de estabilidad se amplı́en para incluir el frasco alternativo KRS-5 de reflectancia interna, asegurándose de lograr un contacto
a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y pureza de la superficial adecuado.
forma farmacéutica se mantiene hasta la fecha de caducidad. PROCEDIMIENTO—Colocar las secciones de la muestra en el
Efectuar las pruebas que correspondan a fin de determinar la accesorio de reflectancia interna múltiple y colocar el conjunto en el
aptitud de un frasco especı́fico de PET o PETG para dispensar una haz de la muestra del espectrofotómetro IR. Ajustar la posición de la
forma farmacéutica lı́quida de administración oral en particular. muestra y de los espejos dentro del accesorio para permitir la
Las resinas de PET son polı́meros cristalinos de cadena larga máxima transmisión de luz de los haces no atenuados. (Si se trata de
preparados mediante condensación de etilenglicol con tereftalato de un instrumento de haz doble, completar los ajustes en el accesorio y
dimetilo o ácido tereftálico. Las resinas de copolı́mero de PET se luego atenuar el haz de referencia para permitir una deflexión de
preparan de manera similar, con la excepción de que también pueden escala completa durante el barrido de la muestra.) Determinar el
contener una pequeña cantidad de ácido isoftálico (un porcentaje espectro IR de 4000 cm–1 a 400 cm–1. El espectro de la muestra
corregido presenta bandas de absorción principales sólo a las mismas
longitudes de onda que las del espectro de ER Tereftalato de
5
Un laminado adecuado para sellado tiene una capa de polietileno como capa Polietileno USP o ER Tereftalato de Polietileno G USP, determina-
de contacto con el envase de no menos de 0,025 mm (0,001 pulgadas) y una dos de manera similar.
segunda capa constituida por una lámina de aluminio de no menos de 0,018
6
mm (0,0007 pulgadas), con capas adicionales de materiales de refuerzo Los accesorios de reflectancia interna múltiple y la placa KRS-5T están
apropiados. Se puede obtener también un sello apropiado mediante el empleo disponibles de diversas fuentes, entre las que se incluyen Beckman
de placas de vidrio y una cera para sellado constituida por un 60% de cera Instruments, Inc., 2500 Harbor Blvd., Fullerton, CA 92634 y Perkin Elmer
amorfa refinada y un 40% de cera de parafina cristalina refinada. Corp., 761 Main Ave., Norwalk, CT 06859-01560.
290 h661i Envases / Pruebas Fı́sicas USP 30
Análisis Térmico—Cortar una sección del frasco que pese 168 + 1 hora, retirar los frascos, registrar los pesos de los frascos
aproximadamente 12 mg y colocarla en el platillo para la muestra individuales y calcular la velocidad de permeabilidad al vapor de
de prueba. Determinar el termograma bajo nitrógeno, empleando las agua, en mg por dı́a por L, para cada frasco por la fórmula:
condiciones de calentamiento y enfriamiento especificadas para el
tipo de resina utilizado, con un equipo capaz de realizar las
determinaciones descritas en Análisis Térmico h891i.
Tereftalato de Polietileno—Calentar la muestra a partir de
temperatura ambiente hasta 2808 a una velocidad de calentamiento
de aproximadamente 208 por minuto. Calentar la muestra a 2808
durante 1 minuto. Rápidamente enfriar la muestra hasta temperatura
ambiente, volver a calentar hasta 2808 a una velocidad de en donde Wli es el peso, en mg, del frasco i a los 14 dı́as; Wfi es el
calentamiento de aproximadamente 58 por minuto. El termograma peso, en mg, del frasco i a los 7 dı́as; 7 es el periodo de tiempo de la
de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de prueba, en dı́as, después del periodo de equilibrio de 7 dı́as y Va es el
Polietileno USP, determinado de manera similar: el punto de fusión volumen promedio de frasco, en L.
(Tm) de la muestra no difiere del punto de fusión del Estándar en más Los frascos analizados cumplen con los requisitos y son envases
de 9,08 y la temperatura de transición vı́trea (Tg) de la muestra no impermeables si la velocidad de permeabilidad a la humedad excede
difiere de la del Estándar en más de 4,08. de 100 mg por dı́a por L en no más de 1 de los 10 frascos de prueba
Tereftalato de Polietileno G—Calentar la muestra desde tempe- y en ninguno de ellos excede de 200 mg por dı́a por L.
ratura ambiente hasta 1208 a una velocidad de calentamiento de Extracción de Colorantes—Seleccionar 3 frascos de prueba.
aproximadamente 208 por minuto. Calentar la muestra a 1208 Cortar una porción relativamente plana de la pared de un frasco y
durante 1 minuto. Rápidamente enfriar la muestra hasta temperatura recortarla lo necesario para que pueda colocarse en el portamuestras
ambiente, volver a calentar hasta 1208 a una velocidad de del espectrofotómetro. Obtener el espectro visible de la pared
calentamiento de aproximadamente 108 por minuto. El termograma barriendo la porción del espectro visible desde 350 nm hasta 700 nm.
de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Determinar la longitud de onda de máxima absorción con una
Polietileno G USP, determinado de manera similar: la temperatura de aproximación de 2 nm. Llenar los dos frascos de prueba restantes,
transición vı́trea (Tg) de la muestra no difiere de la del Estándar en empleando alcohol al 50% para frascos de PET y alcohol al 25%
más de 6,08. para frascos de PETG. Sellar los frascos con sellos impermeables,
Transmisión de Luz—Los frascos de PET y PETG destinados a como por ejemplo papel de aluminio y colocar los cierres. Llenar un
proporcionar protección contra la luz cumplen con los requisitos de frasco de vidrio que tenga la misma capacidad que los frascos de
Transmisión de Luz. prueba con el disolvente que corresponda, sellar el frasco con un
sello impermeable, como por ejemplo papel de aluminio y colocar el
Permeabilidad al Vapor de Agua—[NOTA—En el siguiente cierre. Incubar los frascos de prueba y el frasco de vidrio en una
procedimiento, determinar los pesos de los frascos y las tapas como habitación a temperatura ambiente constante o en una estufa a 498
pesos de tara y los pesos de los frascos llenos con una aproximación durante diez dı́as. Retirar los frascos y dejar que se equilibren a
de 0,1 mg si el volumen del frasco es menor de 200 mL; o con una temperatura ambiente. Concomitantemente determinar las absorban-
aproximación de un mg si el frasco tiene un volumen entre 200 mL y cias de las soluciones de prueba en celdas de 5 cm a la longitud de
1000 mL; y con una aproximación de un centigramo (10 mg) si el onda de máxima absorción (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión de
volumen del frasco es igual o mayor de 1000 mL.] Seleccionar 10 Luz h851i), empleando el disolvente del frasco de vidrio como
frascos de tipo y tamaño uniforme, limpiar las superficies de sellado blanco. Los valores de absorbancia ası́ obtenidos son menores a 0,01
con un paño sin pelusas y cerrar y abrir cada frasco 30 veces. Cada para ambas soluciones de prueba.
vez que se cierra el frasco, ajustar la tapa firmemente y de manera
uniforme. Para cerrar los frascos con tapa de rosca, emplear una Metales Pesados, Tereftaloı́lo Total y Etilenglicol —
fuerza de torsión que esté comprendida dentro del intervalo de ajuste MEDIO DE EXTRACCIÓN—
especificado en la tabla que figura en Envases—Permeabilidad Agua Purificada—(ver monografı́a).
h671i. Pesar cada frasco vacı́o y su cierre. Llenar diez frascos con Alcohol al 50 por Ciento—Diluir 125 mL de alcohol con agua
agua a 25 + 28 hasta que el menisco quede tangente a la parte hasta 238 mL y mezclar.
superior de la abertura del frasco. Registrar el peso de cada frasco y Alcohol al 25 por Ciento—Diluir 125 mL de Alcohol al 50 por
su tapa y determinar el volumen promedio del frasco, en litros, por la Ciento con agua hasta 250 mL y mezclar.
fórmula:
n-Heptano.
PROCEDIMIENTO—[NOTA—Utilizar el Medio de Extracción de
Alcohol al 50 por Ciento con los frascos de PET. Utilizar el
Medio de Extracción de Alcohol al 25 por Ciento con los frascos de
PETG.] Para cada Medio de Extracción, llenar un número suficiente
de frascos de prueba al 90% de su capacidad nominal para obtener
no menos de 30 mL de extracto. Llenar un número correspondiente
en donde Woi es el peso total, en g, del frasco i y su cierre; Wti es el de frascos de vidrio con Medio de Extracción de Agua Purificada, un
peso de tara, en g, del frasco i y su cierre; y 9970 es la densidad del número correspondiente de frascos de vidrio con Medio de
agua a 258 multiplicada por 10 000 (el número de frascos analizados Extracción de Alcohol al 50 por Ciento o Medio de Extracción de
por el factor de conversión para convertir mililitros en litros). Alcohol al 25 por Ciento y un número correspondiente de frascos de
Empleando una pipeta, ajustar el nivel de agua en los frascos hasta vidrio con Medio de Extracción de n-Heptano para emplearlos como
el punto de llenado. Cerrar con una fuerza de torsión que este blancos de los Medios de Extracción. Sellar los frascos con sellos
comprendida dentro del intervalo especificado en la tabla que se impermeables, como por ejemplo papel de aluminio y colocar los
proporciona en Envases—Permeabilidad h671i y almacenar los cierres. Incubar los frascos de prueba y los frascos de vidrio en una
frascos a una temperatura de 25 + 28 y una humedad relativa de habitación a temperatura ambiente constante o en una estufa a 498
50 + 2%. Después de 168 + 1 hora (7 dı́as), registrar el peso de los durante diez dı́as. Retirar los frascos de prueba con las muestras de
frascos individuales. Regresar los frascos al lugar de almacena- los Medios de Extracción, las frascos de vidrio con los blancos de los
miento durante otras 168 +1 hora. Después del segundo perı́odo de Medios de Extracción y almacenarlos a temperatura ambiente. No
transferir las muestras de los Medios de Extracción a otros
recipientes de almacenamiento.
METALES PESADOS—Pipetear 20 mL del extracto de Agua
Purificada de los frascos de prueba, filtrado si fuera necesario y
transferir a uno de dos tubos de comparación de color pareados de 50
mL y reservar el extracto restante de Agua Purificada en los frascos
de prueba para utilizarlo en la prueba de Etilenglicol. Ajustar el
extracto con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N a un pH
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h661i Envases 291
entre 3,0 y 4,0 utilizando papel indicador de pH de intervalo corto de la Solución de prueba no excede la absorbancia de la solución
como indicador externo. Diluir con agua hasta aproximadamente 35 obtenida a partir de la Solución estándar, que corresponde a no más
mL y mezclar. de 1 ppm de etilenglicol.
Pipetear 2 mL de Solución Estándar de Plomo recién preparada
(en el dı́a de uso) (ver Metales Pesados h231i), transferir al segundo
tubo de comparación de color y agregar 20 mL de Agua Purificada. ENVASES DE POLIPROPILENO
Ajustar con ácido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N a un pH
entre 3,0 y 4,0 utilizando papel indicador de pH de intervalo corto Las normas y pruebas que se proporcionan en esta sección
como indicador externo. Diluir con agua hasta aproximadamente 35 caracterizan los envases de polipropileno, producidos a partir de
mL y mezclar. homopolı́meros o copolı́meros, que se consideran apropiados para
Agregar a cada tubo 1,2 mL de tioacetamida-glicerina básica SR y envasar formas farmacéuticas lı́quidas y sólidas de administración
2 mL de Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,5 (ver Metales oral.
Pesados h231i), diluir con agua hasta 50 mL y mezclar: todo color Si se han realizado estudios de estabilidad para establecer la fecha
que se produzca durante el plazo de diez minutos en el tubo que de caducidad de una forma farmacéutica especı́fica contenida en un
contiene el extracto de Agua Purificada de los frascos de prueba no envase de polipropileno apropiado, se puede utilizar cualquier otro
excede el que se produce en el tubo que contiene la Solución envase de polipropileno que cumpla con estos requisitos para
Estándar de Plomo, observando ambos tubos hacia abajo sobre una envasar dicha forma farmacéutica, siempre que los programas de
superficie blanca (1 ppm en el extracto). estabilidad apropiados se amplı́en para incluir el frasco alternativo
Tereftaloı́lo Total —Determinar la absorbancia del extracto de a fin de garantizar que la identidad, contenido, calidad y pureza de la
Alcohol al 50 por Ciento o de Alcohol al 25 por Ciento en una celda forma farmacéutica se mantienen hasta la fecha de caducidad.
de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorción, aproximada- Los polı́meros de propileno son polı́meros de cadena larga
mente a 244 nm, (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz sintetizados a partir de propileno o de propileno y otras olefinas en
h851i), utilizando el blanco de Medio de Extracción correspondi- condiciones controladas de calor y presión y catalizadores. Entre las
ente: la absorbancia del extracto no excede 0,150, correspondiente otras olefinas que se utilizan con mayor frecuencia se incluyen,
a no más de 1 ppm de tereftaloı́lo total. a modo de ejemplo, el etileno y el buteno. Los polı́meros de
Determinar la absorbancia del extracto de n-Heptano en una celda propileno, los ingredientes usados para fabricar los polı́meros de
de 1 cm a la longitud de onda de máxima absorción, aproximada- propileno y los ingredientes utilizados en la fabricación de los
mente a 240 nm, (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz envases cumplen con los requisitos establecidos en las secciones
h851i), utilizando el blanco de Medio de Extracción de n-Heptano pertinentes del Código de Reglamentaciones Federales, Tı́tulo 21.
correspondiente: la absorbancia del extracto no excede de 0,150, Ciertos factores, como por ejemplo la composición del material,
correspondiente a no más de 1 ppm de tereftaloı́lo total. los procedimientos de procesamiento y limpieza, los medios de
ETILENGLICOL — contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción, la adsorción y
permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacena-
Solución de Ácido Peryódico—Disolver 125 mg de ácido miento también pueden afectar la idoneidad de un material para un
peryódico en 10 mL de agua. uso especı́fico. Efectuar las pruebas que correspondan para
Ácido Sulfúrico Diluido—Agregar despacio y mezclando cons- determinar la aptitud de un polipropileno especı́fico.
tantemente 50 mL de ácido sulfúrico a 50 mL de agua y dejar que se El polipropileno posee un espectro de absorción IR tı́pico y
enfrı́e a temperatura ambiente. propiedades térmicas caracterı́sticas. Su densidad está entre 0,880 g
Solución de Bisulfito de Sodio—Disolver 0,1 g de bisulfito de por cm3 y 0,913 g por cm3. Las propiedades de permeación de
sodio en 10 mL de agua. Usar esta solución dentro de los siete dı́as envases moldeados de polipropileno pueden alterarse incorporando
de preparada. polı́mero recién molido, según la proporción de material recién
Solución de Cromotropato Disódico—Disolver 100 mg de molido en el producto final. Otras propiedades que pueden afectar la
cromotropato disódico en 100 mL de ácido sulfúrico. Proteger esta aptitud del polipropileno utilizado para envasar fármacos son: la
solución de la luz y utilizar dentro de los siete dı́as de preparada. permeabilidad al oxı́geno y a la humedad, el coeficiente de
Solución Estándar —Disolver en agua una cantidad, pesada con elasticidad, el ı́ndice de flujo de fusión, la resistencia a las fisuras
exactitud, de etilenglicol y diluir cuantitativamente, y en diluciones por estrés ambiental y el grado de cristalinidad después del
sucesivas si fuera necesario, para obtener una solución con una moldeado. Las formas farmacéuticas secas y lı́quidas de adminis-
concentración conocida de aproximadamente 1 mg por mL. tración oral que están destinadas a ser envasadas en el tipo de envase
definido en esta sección cumplen con los requisitos de esta sección.
Solución de Prueba—Emplear el extracto de Agua Purificada.
Reflectancia Interna Múltiple—
Blanco—Emplear el blanco de Medio de Extracción de Agua
APARATO—Utilizar un espectrofotómetro IR capaz de corregir por
Purificada.
el espectro del blanco, equipado con accesorios de reflectancia
Procedimiento—Transferir 1,0 mL de Solución Estándar a un interna múltiple y una placa de reflectancia interna KRS-5. Un cristal
matraz volumétrico de 10 mL. Transferir 1,0 mL de Solución de de KRS-5 de 2 mm de espesor con un ángulo de incidencia de 458
Prueba a un segundo matraz volumétrico de 10 mL. Transferir 1,0 proporciona un número suficiente de reflejos.
mL del blanco de Medio de Extracción de Agua Purificada a un
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA—Cortar 2 secciones planas de un
tercer matraz volumétrico de 10 mL. Agregar a cada uno de los tres
matraces 100 mL de Solución de Ácido Peryódico, agitar por rotación espesor equivalente al espesor promedio de la pared del envase y
suave para mezclar y dejar en reposo durante 60 minutos. Agregar recortarlas, según sea necesario, a fin de obtener segmentos que
1,0 mL de Solución de Bisulfito de Sodio a cada matraz y mezclar. tengan un tamaño conveniente para montarlos en el accesorio de
Agregar 100 mL de Solución de Cromotropato Disódico a cada reflectancia interna múltiple. Con cuidado para evitar rayar las
matraz y mezclar. [NOTA—Analizar todas las soluciones dentro del superficies, secar las muestras con papel seco o, si fuera necesario,
plazo de una hora después de agregar la Solución de Cromotropato con una tela suave humedecida con metanol y dejarlas secar. Montar
Disódico.] Con cuidado, agregar 6 mL de ácido sulfúrico a cada firmemente las muestras en ambos lados de la placa KRS-5 de
matraz, mezclar y dejar que las soluciones se enfrı́en a temperatura reflectancia interna, asegurándose de lograr un contacto superficial
ambiente. [Precaución—La dilución de ácido sulfúrico produce adecuado. Antes del montaje en la placa, las muestras pueden
mucho calor y puede hacer que la solución entre en ebullición. comprimirse mediante exposición a temperaturas entre 2208 y 2408
Realizar esta adición cuidadosamente. Se desprenderán gases de para obtener pelı́culas uniformes delgadas. Durante esta operación
dióxido de azufre. Se recomienda usar una campana de extracción.] los tiempos y las temperaturas empleados deben limitarse a lo que
Diluir a volumen cada dilución con Ácido sulfúrico diluido y sea necesario para moldear las pelı́culas.
mezclar. Determinar concomitantemente las absorbancias de las PROCEDIMIENTO—Colocar las secciones de la muestra en el
soluciones obtenidas a partir de la Solución Estándar y de la accesorio de reflectancia interna múltiple y colocar el conjunto en
Solución de Prueba en celdas de 1 cm a la longitud de onda de el haz de la muestra del espectrofotómetro IR. Ajustar la posición de
máxima absorción, a 575 nm, (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión la muestra y de los espejos dentro del accesorio para permitir la
de Luz h851i), usando la solución del blanco de Medio de Extracción máxima transmisión de luz del haz de referencia no atenuado. (Si se
de Agua Purificada: la absorbancia de la solución obtenida a partir trata de un instrumento de haz doble, completar los ajustes en el
292 h661i Envases / Pruebas Fı́sicas USP 30
accesorio y luego atenuar el haz de referencia para permitir una este requisito de fecha de caducidad en la etiqueta. Es necesario, en
deflexión de escala completa durante el barrido de la muestra.) consecuencia, que el dispensador tome otras precauciones para
Determinar el espectro IR de 3500 cm-1 a 600 cm1. El espectro conservar el contenido, calidad y pureza de los fármacos que se
corregido de la muestra presenta bandas de absorción principales reenvasan para la distribución o venta a pacientes.
sólo a las mismas longitudes de onda que las del espectro del Las siguientes guı́as y requisitos se aplican cuando las formas
Estándar de Referencia USP para un homopolı́mero o copolı́mero de farmacéuticas oficiales se reenvasan en envases unitarios o de dosis
polipropileno, determinados de manera similar. únicas o en envases mnemotécnicos para dispensarse de conformi-
Análisis Térmico—Cortar una sección que pese aproximadamen- dad con una receta médica.
te 12 mg y colocarla en el platillo para la muestra de prueba. Es Etiquetado—Es responsabilidad de la persona que dispensa el
esencial un buen contacto entre el platillo y la termocupla para lograr fármaco, incluir una fecha lı́mite de uso en la etiqueta, teniendo en
resultados reproducibles. Determinar el termograma bajo nitrógeno a cuenta la naturaleza del fármaco reenvasado, ası́ como la informa-
una temperatura entre temperatura ambiente y 308 por encima del ción del embalaje o la información de la fecha lı́mite de uso que
punto de fusión. Mantener la temperatura durante 10 minutos, luego figura en el etiquetado del fabricante, las caracterı́sticas de los
enfriar hasta 508 por debajo de la temperatura pico de cristalización a envases y las condiciones de almacenamiento para el artı́culo en
una velocidad de 108 a 208 por minuto, utilizando un equipo capaz cuestión. Las etiquetas de las formas farmacéuticas reenvasadas
de realizar las determinaciones descritas en Análisis Térmico h891i. deben indicar la fecha lı́mite de uso del producto según se determine
El termograma de la muestra es similar al termograma correspon- a partir de la información del etiquetado del producto. Cada envase
diente del Estándar de Referencia USP para el polipropileno: Las unitario o de dosis única posee una etiqueta separada, a menos que el
temperaturas de los procesos endotérmicos y exotérmicos en el dispositivo que contiene la forma farmacéutica de dosis única no
termograma no difieren de las temperaturas del Estándar de permita su eliminación o separación del envase unitario o de dosis
Referencia USP para los homopolı́meros en más de 12,08 o de las única.
temperaturas del Estándar de Referencia USP para los copolı́meros Almacenamiento—Almacenar el artı́culo reenvasado en un
en más de 6,08. ambiente con humedad controlada y a la temperatura especificada
Transmisión de Luz—Los envases de polipropileno destinados a en la monografı́a individual o en el etiquetado del producto. Si la
proporcionar protección contra la luz cumplen con los requisitos de monografı́a no especifica ninguna temperatura o humedad, o si en el
Transmisión de Luz. etiquetado del producto no figura indicación alguna, las condiciones
Permeabilidad al Vapor de Agua—Sellar los envases con sellos de temperatura ambiente controlada de 75% de humedad relativa a
impermeables de laminado de papel de aluminio y polietileno u otro 238 no deben excederse durante el reenvasado y almacenamiento.
sello apropiado, con ayuda de calor. Analizar los envases según se Ni un refrigerador ni un congelador se consideran ambientes con
describe en Envases—Permeabilidad h671i. Los envases cumplen humedad controlada y si se trata de fármacos que se deban
con los requisitos si la permeabilidad a la humedad excede de 15 mg almacenar en frı́o, en un refrigerador o congelador, es necesario
por dı́a por L, en no más de uno de los 10 envases de prueba y en emplear un envase exterior que cumpla con los requisitos indicados
ninguno de ellos excede de 25 mg por dı́a por L. en la monografı́a que corresponda.
Metales Pesados y Residuo no Volátil—Preparar extractos de Reprocesamiento—No volver a procesar ningún envase
muestras para estas pruebas según se indica en el Procedimiento en empleado para reenvasar dosis únicas (es decir, retirar la unidad de
Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos, con la excepción de que cada dosificación del envase de dosis única y colocarla en otro envase de
20 mL de Medio de Extracción la porción será de 60 cm2, dosis única). No obstante, el reprocesamiento de un empaque
independientemente del espesor. secundario (por ejemplo, retirar el blı́ster de un paquete de cartón y
METALES PESADOS—Los envases cumplen con los requisitos de
colocarlo en otro paquete de cartón) está permitido siempre que se
Metales Pesados en Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos. mantenga la fecha lı́mite de uso original.
RESIDUO NO VOLÁTIL—Proceder según se indica en Residuo no
Volátil en Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos, con la excepción de
que el blanco será el mismo disolvente usado en cada una de las PAQUETES DE MEDICAMENTOS
pruebas que se describen a continuación. La diferencia entre las PERSONALIZADOS PARA EL PACIENTE
cantidades obtenidas a partir de la muestra y del blanco no excede de
10,0 mg cuando se emplea agua mantenida a una temperatura de 708 En lugar de dispensar dos o más productos farmacéuticos
como medio de extracción; no excede de 60,0 mg cuando se emplea recetados en envases separados, el farmacéutico puede suministrar
alcohol mantenido a una temperatura de 708 como medio de paquetes de medicación personalizados para el paciente (paquete de
extracción y no excede de 225,0 mg cuando se emplean hexanos medicación para el paciente), si cuenta con el consentimiento del
mantenidos a una temperatura de 508 como medio de extracción. Los paciente, el terapeuta, o el médico que receta.7
envases cumplen con estos requisitos de Residuo no Volátil para Un paquete de medicación para el paciente es un paquete
todos los medios de extracción anteriormente mencionados. [NOTA— preparado por un farmacéutico para un paciente en particular que
Los hexanos y el alcohol son inflamables. Para evaporar estos comprende varios envases y que contiene dos o más formas
disolventes, utilizar una corriente de aire con un baño de agua y farmacéuticas sólidas de administración oral según la receta médica
utilizar una estufa a prueba de explosiones para secar el residuo.] correspondiente. El paquete de medicación para el paciente esta
diseñado de tal modo que en la etiqueta de cada envase se indica el
Capacidad Amortiguadora—Preparar extractos de la muestra dı́a y tiempo o perı́odo de tiempo en el que debe administrarse el
según se describe en el Procedimiento en Pruebas Fisicoquı́micas— contenido de cada envase.
Plásticos. Los envases cumplen con los requisitos de Capacidad El farmacéutico instruye al paciente o al terapeuta sobre el uso del
Amortiguadora en Pruebas Fisicoquı́micas—Plásticos. paquete de medicación para el paciente.
Etiqueta—La etiqueta del paquete de medicación para el paciente
indica:
FORMAS FARMACÉUTICAS SÓLIDAS Y (1) el nombre del paciente;
LÍQUIDAS NO ESTÉRILES: REENVASADO EN (2) un número de paquete de medicación para el paciente, y los
ENVASES UNITARIOS Y ENVASES DE DOSIS números de serie de identificación individuales de cada uno de
ÚNICA los productos farmacéuticos solicitados en la receta contenidos
en el paquete;
La etiqueta de toda forma farmacéutica oficial indica una fecha de
7
caducidad asignada a la formulación y al envase utilizado para ese Debe tenerse en cuenta que no existe ninguna exención especial para los
artı́culo. Esta fecha limita el tiempo durante el cual el producto se paquetes de medicación para el paciente en lo que respecta a los requisitos
puede dispensar o utilizar. Dado que la fecha de caducidad indicada establecidos por la Ley de Envasado para Prevenir el Envenenamiento. Por lo
en el envase del fabricante o del distribuidor se ha determinado para tanto, si un paquete de medicación para el paciente no cumple las normas de
seguridad establecidas para la protección de los niños, colocar otro embalaje
el fármaco en ese envase especı́fico y no es aplicable al producto exterior que cumpla estos requisitos o, en su defecto, obtener el
reenvasado en un envase diferente, los fármacos reenvasados que se consentimiento del comprador o del médico para dispensar en un envase
dispensan conforme a una receta médica están exentos de exhibir que no es seguro para niños.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h671i Envases—Permeabilidad 293
Transferir el contenido de cada envase a una probeta graduada y equipo pueden afectar la permeabilidad a la humedad de un envase
determinar el volumen promedio de los envases, en mL. Calcular la formado o cerrado, se deben determinar las caracterı́sticas de
velocidad de permeabilidad a la humedad, en mg por dı́a por litro, permeabilidad de humedad del sistema de envase que se utiliza.
por la fórmula: Desecante—Secar un desecante granular adecuado2 a 1108
durante 1 hora antes de su uso. Utilizar gránulos que pesen
(1000 / 14V)[(TF – TI)–(CF – CI)], aproximadamente 400 mg cada uno y que tengan un diámetro de
en donde V es el volumen, en mL, del envase, (TF – TI) es la aproximadamente 8 mm. [NOTA—Si fuera necesario, debido al
diferencia, en mg, entre el peso final y el peso inicial de cada envase tamaño limitado de los envases de dosis única, se pueden usar
de prueba y (CF – CI) es la diferencia, en mg, entre el peso promedio gránulos que pesen menos de 400 mg cada uno y que tengan un
final y el peso promedio inicial de los 2 controles. Para los envases diámetro menor de 8 mm.]
utilizados para medicamentos que se dispensan con receta médica, Procedimiento—
los envases analizados son envases impermeables si no más de uno Método I—Sellar no menos de 10 envases de dosis única con
de los 10 envases de prueba tiene una permeabilidad a la humedad 1 gránulo en cada uno y sellar 10 envases de dosis única vacı́os
superior a 100 mg por dı́a por L y ninguno excede de 200 mg por dı́a adicionales que servirán de control, usando dedales o pinzas con
por L. extremos almohadillados para manipular los envases sellados.
Para los envases utilizados para medicamentos dispensados con Numerar los envases y registrar los pesos individuales3 con una
receta médica, los envases son envases bien cerrados si no más de aproximación de 1 mg. Pesar los controles como una sola unidad y
uno de los 10 envases de prueba excede de 2000 mg por dı́a por L de dividir el peso total por el número de controles para obtener el
permeabilidad a la humedad y ninguno excede de 3000 mg por dı́a promedio. Almacenar todos los envases a una humedad relativa de
por L. 75 + 3% y a una temperatura de 23 + 28. [NOTA—Un sistema
saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua
colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad
Fuerza de Torsión Aplicable a Envases con Tapa de Rosca especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas
condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo
Diámetro de Intervalo Sugerido para la Aplicación múltiplo de éste (ver Resultados), retirar los envases de la cámara y
Cierre1 (mm) Manual de Torsión;2 (pulgadas-libra) permitir que se equilibren durante 15 a 60 minutos en el área de
8 5 pesada. Registrar nuevamente el peso de los envases individuales y
10 6 de los controles combinados de la misma manera. [NOTA—Si algún
13 8 gránulo indicador se torna de color rosado durante este procedi-
15 5–9 miento, o si el aumento de peso del gránulo excede de 10%, terminar
18 7–10 la prueba y considerar válidas sólo las determinaciones anteriores.]
20 8–12 Devolver los envases a la cámara de humedad. Calcular la velocidad
22 9–14 de permeabilidad a la humedad, en mg por dı́a, de cada envase
24 10–18 tomado, por la fórmula:
28 12–21
30 13–23 (1 / N)[(WF – WI) – (CF – CI)],
33 15–25 en donde N es el número de dı́as transcurridos en el perı́odo de
38 17–26 prueba (comenzando después del perı́odo de equilibrio inicial de 24
43 17–27 horas), (WF – WI) es la diferencia, en mg, entre el peso final y el peso
48 19–30 inicial de cada envase de prueba y (CF – CI) es la diferencia, en mg,
53 21–36 entre el peso promedio final y el peso promedio inicial de los
58 23–40 controles, calculando los datos con dos cifras significativas. [NOTA—
63 25–43 Cuando los valores de permeabilidad medidos son menores de 5 mg
66 26–45 por dı́a y cuando se observa que los controles llegan a un estado de
70 28–50 equilibrio dentro de los 7 dı́as, la permeabilidad individual puede
83 32–65 determinarse con mayor exactitud empleando en el cálculo los
86 40–65 valores obtenidos a los 7 dı́as para los pesos del envase de prueba y
89 40–70 del envase de control como WI y CI, respectivamente. En tal caso, un
100 45–70 intervalo de prueba apropiado para la Clase A (ver Resultados) no
110 45–70 serı́a menor de 28 dı́as después del perı́odo de equilibrio inicial de 7
120 55–95 dı́as (un total de 35 dı́as).]
132 60–95 Método II—Emplear este procedimiento para envases (por
1
ejemplo, blı́steres) que incorporen varios envases de dosis única
Se debe aplicar la fuerza de torsión que se designa para el próximo diámetro sellados por separado. Sellar un número suficiente de envases, de
de cierre de tamaño mayor al probar envases que tengan un diámetro de cierre modo que no menos de 4 envases y un total de no menos de 10
intermedio a los diámetros listados.
2
Owens-Illinois, de Toledo, OH 43666, tiene disponible un aparato adecuado. envases de dosis única o blı́steres con 1 gránulo en cada unidad sean
(Se usa el medidor de torsión Modelo 25 para medir entre 0 y 25, el Modelo sometidos a la prueba. Sellar el mismo número de envases vacı́os,
50 para medir entre 0 y 50 y el Modelo 100 para medir entre 0 y 100 que contengan cada uno el mismo número de envases de dosis única
pulgadas-libra de torsión.) Los valores de torsión se refieren a cerrar y no a o blı́steres que los usados en los envases de prueba, para utilizarlos
aflojar la tapa de rosca. Para mayores detalles con respecto a las instrucciones, como control. Almacenar todos los envases a una humedad relativa
se puede consultar ‘‘Standard Test Method for Application and Removal de 75 + 3% y a una temperatura de 23 + 28. [NOTA—Un sistema
Torque of Threaded or Lug-Style Closures’’, Método ASTM D3198-97, saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua
publicado por American Society for Testing and Materials, 1916 Race St., colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad
Philadelphia, PA 19103.
especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas
2
Hay desecantes granulados con indicador de humedad apropiados están
disponibles comercialmente de fuentes, tales como Medical Packaging, Inc.,
470 Route 31, Ringoes, NJ -08551-1409 [Teléfono 800-257-5282 en EE.
ENVASES UNITARIOS Y DE DOSIS ÚNICA UU.; en NJ, 609-466-8991; FAX 609-466-3775], como Indicating Desiccant
Pellets, Item No. TK-1002.
PARA CÁPSULAS Y TABLETAS 3
Las comparaciones exactas de envases Clase A pueden exigir perı́odos de
prueba de más de 28 dı́as si las pesadas se realizan en una balanza para
El procedimiento y el esquema de clasificación que siguen a preparar medicamentos recetados Clase A (ver Balanzas y Aparatos
continuación para evaluar las caracterı́sticas de permeabilidad a la Volumétricos para Preparar Medicamentos Recetados h1176i). El uso de
humedad de envases unitarios y de dosis única se proporcionan para una balanza analı́tica que permita registrar los pesos con una sensibilidad de
permitir un juicio objetivo de la aptitud del envase para un tipo de décima o centésima de miligramo lleva a una caracterización más precisa
producto especı́fico. Debido a que el desempeño del operador y del entre envases y/o perı́odos de prueba más cortos.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h691i Algodón 295
condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo Determinar, preferentemente mediante el uso de un cronómetro, el
múltiplo de éste (ver Resultados), retirar los envases de la cámara y tiempo requerido en segundos hasta que la canastilla se sumerja
dejar que se equilibren durante 45 minutos. Registrar los pesos de los completamente.
envases individuales y devolverlos a la cámara. Pesar los envases de Retirar la canastilla del agua, dejar que se escurra durante 10
control como una sola unidad y dividir el peso total por el número de segundos en la misma posición horizontal; luego colocarla de
envases de control para obtener el peso promedio del paquete vacı́o. inmediato en un recipiente tarado cubierto y pesarla. Restar el peso
[NOTA—Si algún gránulo indicador se torna de color rosado durante de la canastilla de prueba y del algodón purificado para determinar el
el procedimiento, o si el aumento promedio del peso del pellet en peso del agua absorbida.
cualquier paquete excede de 10%, terminar la prueba y considerar
válidas sólo las determinaciones anteriores.] Calcular la velocidad
promedio de permeabilidad a la humedad, en mg por dı́a, para cada Longitud de Fibra
envase de dosis única o blı́ster en cada paquete tomado, por la
fórmula: Para determinar la longitud y la distribución de la longitud de las
fibras de algodón en el algodón purificado emplear el siguiente
(1 / NX)[(WF – WI) – (CF – CI)], método:
en donde N es el número de dı́as transcurridos en el perı́odo de Llevar a cabo todas las operaciones asociadas con la determina-
prueba (comenzando después del perı́odo de equilibrio inicial de 24 ción de la longitud de fibra del algodón purificado en una atmósfera
horas), X es el número de unidades selladas por separado por estable de humedad relativa de 65 + 2% a 21 + 1,18 (70 + 28F).
paquete, (WF – WI) es la diferencia, en mg, entre el peso final y el Estas instrucciones describen la modalidad de procedimiento que
peso inicial de cada envase de prueba y (CF – CI) es la diferencia, en se adecúa bien al clasificador* de mayor uso en la actualidad en los
mg, entre el peso promedio final y el peso promedio inicial de los Estados Unidos.
envases control, calculando las velocidades con dos cifras Aparato—El clasificador (ver ilustración) consta de dos bancos
significativas. de peines rı́gidamente montados uno al lado del otro sobre una base
Resultados—Los envases de dosis única individuales probados común. Cada banco de peines consta de por lo menos 12 peines
según el Método I se designan Clase A si no más de 1 de los 10 individuales, separados 3,2 mm uno de otro y montados en ranuras
envases probados excede de 0,5 mg por dı́a de velocidad de para que a medida que se acercan durante el proceso de
permeabilidad a la humedad y ninguno excede de 1 mg por dı́a; se fraccionamiento y cuando ya no sean necesarios, puedan descender
designan Clase B si no más de 1 de 10 envases probados excede de debajo del plano de trabajo. Cada peine individual tiene una sola fila
5 mg por dı́a y ninguno excede de 10 mg por dı́a; se designan Clase de dientes puntiagudos de 12 mm de largo exactamente alineados,
C si no más de 1 de 10 envases probados excede de 20 mg por dı́a y que son agujas de 0,38 mm de diámetro. Los dientes están
ninguno excede de 40 mg por dı́a; y se designan Clase D si los espaciados a una distancia de 62 a 25 mm entre sı́ a lo largo de
envases probados no cumplen con ninguno de los requisitos de una extensión de aproximadamente 50 mm.
velocidad de permeabilidad a la humedad.
Los envases probados según el Método II se designan Clase A si
ningún envase probado excede de 0,5 mg por dı́a de velocidad
promedio de permeabilidad a la humedad del blı́ster; se designan
Clase B si ningún envase probado excede de 5 mg por dı́a de
velocidad promedio de permeabilidad a la humedad del blı́ster; se
designan Clase C si ningún envase probado excede de 20 mg por dı́a
de velocidad promedio de permeabilidad a la humedad del blı́ster; y
se designan Clase D si los envases probados no cumplen con
ninguno de los requisitos anteriores de velocidad promedio de
permeabilidad a la humedad del blı́ster.
Utilizando el Desecante descrito en este documento, tal como se
indica en el Método I y el Método II, después de cada 24 horas, pesar
los envases de prueba y de control; los intervalos de prueba
apropiados para las pesadas finales, WF y CF, son los siguientes: 24
horas para la Clase D, 48 horas para la Clase C, 7 dı́as para la Clase
B y no menos de 28 dı́as para la Clase A.
Clasificador Doble de Fibra de Algodón
láminas de aluminio de aproximadamente 100 mm 6 225 mm 6 Colocar las tracciones sobre las placas recubiertas con terciopelo
2,4 mm de espesor, recubiertas sobre ambos lados con terciopelo de una al lado de la otra, tan derechas como sea posible, con los
alta calidad, preferentemente de color negro. extremos lo mejor definidos que sea posible y con los extremos
Selección del Algodón—Después de desenrollar el algodón, distales colocados en una lı́nea recta. Presionar luego hacia abajo
preparar una muestra de prueba representativa tomando, de un suavemente y en forma homogénea con la placa para comprimir
paquete que contenga de 8 a 16 onzas, 32 trozos pequeños (de fibras antes de liberar la tracción de las pinzas. Emplear no menos de
aproximadamente 75 mg cada uno) bien distribuidos en todo el 50 y no más de 100 tracciones para fraccionar la porción de prueba.
volumen del rollo, tomando 16 trozos representativos de cada mitad Agrupar todas las fibras que midan 12,5 mm (aproximadamente
longitudinal del rollo. Evitar los extremos cortados del rollo y tener media pulgada) o más de longitud y pesar el grupo con una
la precaución de tomar porciones de todo el espesor del rollo. Para aproximación de 0,3 mg. De la misma manera, agrupar todas las
evitar que se seleccionen sólo las fibras largas o las cortas, extraer fibras de 6,25 mm (aproximadamente 1/4 de pulgada) o menos de
todas las fibras tomadas del grupo cuidando que no se resbalen entre longitud y pesar de la misma manera. Finalmente, agrupar las fibras
los dedos. restantes de longitudes intermedias y pesarlas. La suma de los tres
De los paquetes de no más de 4 onzas de peso, tomar 8 trozos y de pesos no difiere del peso inicial de la porción de prueba en más de 3
los envases de más de 4 onzas pero no más de 8 onzas, tomar 16 mg. Dividir el peso de cada uno de los dos primeros grupos por el
trozos, en forma bien distribuida. peso de la porción de prueba para obtener el porcentaje, en peso, de
Mezclar muy bien los trozos en pares y combinar cada par tirando fibra en los dos intervalos de longitud.
y enrollando suavemente entre los dedos. Luego fraccionar cada par
combinado dividiéndolos longitudinalmente en dos partes aproxi-
madamente iguales y utilizar una parte en el mezclado adicional. (La
otra parte puede descartarse o reservarse para cualquier prueba o
control adicional.) h695i CRISTALINIDAD
Repetir el proceso descrito en el párrafo anterior con las sucesivas
mitades de la serie bifurcada hasta que sólo se obtenga un trozo: la
porción de prueba final integrada. Enderezar suavemente y colocar
en forma paralela las fibras de la porción de prueba final integrada Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento con los
extrayéndolas y enrollándolas entre los dedos. Tomar la precaución requisitos de cristalinidad establecidos en la monografı́a individual
de retener todas las fibras, en lo posible incluyendo aquellas que de un fármaco.
forman botones (partı́culas de fibras enmarañadas) y lanillas (masas Procedimiento—En Microscopı́a Óptica h776i se describe un
apelmazadas de fibras), desechando sólo las motas (fragmentos de detallado procedimiento de la prueba.
semillas inmaduras con fibras) y todo material extraño que no sea
fibra, como por ejemplo tallos, hojas y fragmentos de las cáscaras de
las semillas.
De la porción final integrada descrita en el párrafo anterior,
separar longitudinalmente una porción de prueba de 75 + 2 mg,
pesada con exactitud. Retener el residuo para cualquier prueba de
h696i DETERMINACIÓN DE
control que pudiera ser necesaria. CRISTALINIDAD POR
Procedimiento—Con la rejilla para comprimir las fibras, insertar
cuidadosamente la porción de prueba pesada en un banco de peines CALORIMETRÍA EN SOLUCIÓN
del clasificador de algodón de modo tal de que se extienda a través
de los peines en ángulos aproximadamente rectos.
Con las pinzas clasificadoras, tomar por los extremos libres una
porción pequeña de las fibras extendiéndolas a través de los dientes INTRODUCCIÓN—CONCEPTO DE
del peine más cercano al operador. En forma suave y pareja, halar las CRISTALINIDAD
fibras para que emerjan de los peines hacia adelante y transferirlas a
las puntas de los dientes en el segundo banco de peines; colocarlas Una retı́cula cristalina perfectamente ordenada, donde cada
en forma paralela entre sı́ y en un ángulo aproximadamente recto con molécula ocupa su lugar esperado en la retı́cula es un ideal que
respecto a las caras de los peines, liberando los extremos sujetos tan casi nunca se logra. El otro extremo es el estado amorfo, en el cual
cerca de la cara del peine frontal como sea posible. Con la rejilla para un cristal contiene la mayor densidad posible de imperfecciones
comprimir las fibras, apretar cuidadosamente las fibras transferidas a (defectos de diversas dimensionalidades), de forma que se pierde
los dientes de los peines. Continuar la operación hasta que se hayan todo el orden de largo alcance mientras tan sólo permance el orden
transferido todas las fibras al segundo banco de peines. Durante esta de corto alcance, impuesto por las moléculas adyacentes más
transferencia de las fibras, soltar en forma sucesiva los peines del cercanas. Los cristales reales están en algún punto entre estos dos
primer banco una vez que todas las fibras sobresalientes hayan sido extremos. La posición de un cristal en una escala delimitada por
retiradas. estos dos extremos es lo que se denomina su cristalinidad.
Girar la máquina a 1808 y transferir las fibras de algodón Todos los cristales reales, incluso los que están en estado puro,
nuevamente al primer banco de peines de la manera descrita en el poseen algunas imperfecciones o defectos en su retı́cula, que
párrafo anterior. incrementan tanto la energı́a (entalpı́a en condiciones de presión
Asegurarse bien de emparejar los extremos de las fibras durante atmosférica constante) como el desorden (expresado como la
las dos transferencias anteriores, acomodándolas lo más cerca entropı́a) de su retı́cula cristalina. Un cristal con una densidad de
posible a la superficie frontal del peine próximo. Este empareja- imperfecciones relativamente pequeña se dice que es altamente
miento de las puntas de las fibras sobresalientes también puede cristalino y que posee una alta cristalinidad. Por el contrario, una
incluir la extracción de fibras desparejas del frente o de la parte de partı́cula con una densidad de imperfecciones relativamente alta se
atrás de los bancos de peines, para volver a colocarlas dentro o sobre dice que es parcialmente amorfa y que posee una baja cristalinidad.
el manojo principal de algodón en los peines. A una partı́cula totalmente amorfa le corresponde una cristalinidad
Girar nuevamente la máquina a 1808. Soltar en forma sucesiva los de cero. Incluso las partı́culas amorfas pueden contener dominios de
peines, si fuera necesario, para exponer los extremos de las fibras moléculas ordenadas de alguna manera que pueden actuar como
más largas. Puede ser necesario volver a depositar algunas fibras núcleos para la cristalización; tales partı́culas denominadas amorfas
desparejas. Con las pinzas extraer las pocas fibras que más se dice que poseen una cristalinidad pequeña pero finita.
sobresalgan. Continuar extrayendo de esta manera las fibras Para el caso de un polvo o de un conjunto de partı́culas, se han
sobresalientes que queden en la parte opuesta a la cara frontal del propuesto dos modelos de cristalinidad: el modelo de un estado y el
peine más próximo. Soltar este peine y repetir la serie de operaciones modelo de dos estados. Conforme al modelo de un estado, todas las
de la misma manera hasta que se hayan extraı́do todas las fibras. Para partı́culas presentes en el polvo poseen esencialmente la misma
no alterar excesivamente la porción de prueba y de ese modo viciar cristalinidad. Por el contrario, el modelo de dos estados postula que
el fraccionamiento de longitudes en grupos, hacer varias tracciones cada partı́cula presente en el polvo puede ser cristalina o amorfa, de
(8 a 10) entre cada par de peines. modo que la cristalinidad real es el promedio ponderado de estas dos
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h696i Determinación de Cristalinidad por Calorimetrı́a en Solución 297
cristalinidades extremas. En realidad, un polvo probablemente En teorı́a, la determinación de la cristalinidad de los polı́meros
contiene partı́culas con diferentes grados de cristalinidad, ası́ como también puede realizarse utilizando la calorimetrı́a en solución, pero
puede contener partı́culas con diversas formas y tamaños. Cuanto para esto es necesario un estándar de referencia definido para el
más baja es la cristalinidad de una partı́cula, mayor es su entalpı́a y polı́mero y un disolvente en el que el polı́mero sea lo suficientemente
su entropı́a. El aumento de la entalpı́a nunca se compensa totalmente soluble, como se trata más adelante.
con el incremento en la entropı́a; sin embargo, la energı́a libre de Como la entalpı́a de la solución depende no sólo de la cristalinidad
Gibbs, que refleja el equilibrio entre ambas, tiene un aumento real. del sólido sino también de diversas interacciones intermoleculares
Ası́, cuanto más baja es la cristalinidad de una partı́cula, y soluto–soluto y de las interacciones intermoleculares soluto–
consecuentemente, cuanto mayor es su carácter amorfo, mayor es disolvente y disolvente–disolvente, un valor cero de entalpı́a de
su solubilidad intrı́nseca aparente, su velocidad de disolución y su solución no necesariamente indica una cristalinidad cero del soluto
reactividad, pero menor es su estabilidad. Debido a la gran sólido.
relevancia de estas propiedades, la cristalinidad es asimismo una A veces se prefiere expresar la cristalinidad, Pc , de una sustancia
propiedad importante y es necesario medirla mediante un método en una escala porcentual, tal como lo describen Pikal y col.* ,
adecuado. quienes también proporcionan referencias de trabajos anteriores
Hay diversos métodos disponibles para medir la cristalinidad. En relevantes. Este procedimiento requiere dos estándares de referencia,
el presente capı́tulo, la cristalinidad de un polvo se mide mediante la a saber, una muestra altamente cristalina que represente una
calorimetrı́a en solución, aunque se pueden emplear otros métodos cristalinidad de 100% y que posea una entalpı́a de solución
siempre que se hayan validado. medida, Hsc, y una muestra esencialmente amorfa que represente
una cristalinidad de 0% con una entalpı́a de solución medida, Hsa.
A partir de estos valores y de la entalpı́a medida, Hss, de la solución
DETERMINACIÓN DE LA CRISTALINIDAD del sólido en estudio, se puede calcular el porcentaje de cristalinidad
POR CALORIMETRÍA EN SOLUCIÓN del sólido, Pc , de la siguiente manera:
Pc (%) = 100(Hss – Hsa)/(Hsc – Hsa)
La calorimetrı́a en solución proporciona un medio para determinar
la entalpı́a de una solución (es decir, el calor de una solución a Claramente, la cristalinidad expresada en una escala porcentual
presión atmosférica constante) de una sustancia sólida. La entalpı́a depende de tres, y no de dos, valores medidos y las entalpı́as de
de una solución se puede definir como la entalpı́a de la sustancia solución pueden ser reemplazadas por otras cantidades fı́sicas
disuelta en la solución a una concentración definida, menos la correspondientes que dependan de la cristalinidad. El valor de la
entalpı́a de la sustancia sólida original. El disolvente para el proceso cristalinidad porcentual de una muestra sólida, sin embargo, depende
de disolución debe ser tal que el peso del sólido tomado (de 25 a 100 no sólo de la naturaleza y del método de preparación de dos
mg) se disuelva en un plazo equivalente al tiempo de respuesta del estándares de referencia, sino también de la elección de la cantidad
calorı́metro, tal como se trata más adelante. Por supuesto, la entalpı́a fı́sica que se mide.
de una solución es proporcional a la cantidad de sólido que se La entalpı́a de la solución se mide a 25,0 + 0,18 ya sea mediante
disuelve. Esta cantidad se puede definir como un mol para la entalpı́a un calorı́metro de solución isoperibólico (con perı́metro constante, es
molar o un gramo para la entalpı́a especı́fica. Si la sustancia es pura y decir, camisa) o mediante un calorı́metro de solución isotérmico (con
se conoce su peso molecular, se prefiere la entalpı́a molar; en caso temperatura constante) utilizando un peso fijo de 25 a 100 mg de
contrario, se emplea la entalpı́a especı́fica. La entalpı́a de una muestra sólida, pesada con una aproximación de +0,1 mg, con un
solución es débilmente dependiente tanto de la temperatura, que peso fijo de disolvente de 25 a 100 g, pesado con una aproximación
generalmente es de 25,08, como de la concentración final del soluto de 0,01 g (generalmente 50,00 + 0,01 g). El peso del soluto sólido y
disuelto, que generalmente está en el orden de 50 a 200 mg por 100 la naturaleza del disolvente deben ser elegidos de manera tal que la
mL de disolvente. entalpı́a de la solución no sea menos de 200 mJ. Realizar como
La cristalinidad de la muestra sólida en estudio está dada por la mı́nimo tres mediciones con cada muestra, si hay disponible una
entalpı́a de la solución de la muestra sólida Hsx, menos la entalpı́a cantidad suficiente, hasta que los valores medidos del calor de la
de la solución del estándar de referencia de la misma sustancia que solución no difieran en más de 5%. Luego calcular la media
se haya elegido, HsR, cuando se determina en las mismas aritmética de estos tres valores.
condiciones. Debido a que generalmente se elige el estándar de
referencia por su alta cristalinidad percibida, la entalpı́a en solución
de este estándar es mayor algebraicamente (más endotérmica o Calorimetrı́a de Solución Isoperibólica
menos exotérmica) que la de la muestra sólida en estudio en el
mismo disolvente. En consecuencia, la cristalinidad ası́ determinada En el calorı́metro de solución isoperibólico, el cambio de
es una cantidad negativa en unidades SI, kJ/mol o J/g (debido a su temperatura durante el proceso de disolución ocasiona un cambio
potencial para inducir a errores y a lo incómodo de su manejo, se correspondiente en la temperatura del sistema disolvente–soluto (es
evita utilizar valores en J/kg). La preferencia por un valor negativo decir, en la solución). Este cambio de temperatura se mide con un
en relación a un estándar de referencia altamente cristalino reconoce sensor de temperatura, que está conectado a un circuito eléctrico que
el hecho de que la mayorı́a de las muestras presentan una registra una señal eléctrica que corresponde al cambio de
cristalinidad menor que la de este estándar de referencia. temperatura. Tı́picamente, este cambio de temperatura en forma
Varias sustancias, incluyendo algunas purificadas por liofilización, electrónica se mide en intervalos de tiempo definidos con precisión
pueden estar disponibles en forma amorfa pero no en forma para proporcionar datos de temperatura–tiempo que una computa-
cristalina. Con tales sustancias, se puede emplear como estándar de dora recoge, analiza y posteriormente grafica. Una corrida con un
referencia una forma amorfa, preparada mediante un procedimiento blanco sin la adición del soluto sólido al disolvente no debe mostrar
estándar. La entalpı́a de la solución puede ser algebraicamente menor un cambio discernible en la pendiente de la gráfica de temperatura–
que la del estándar de referencia amorfo elegido, en cuyo caso la tiempo.
cristalinidad, tal como se definió anteriormente, tiene un valor Para los calorı́metros de solución isoperibólicos, la respuesta es
positivo. relativamente rápida, pero cualquier pérdida o ganancia de calor
El uso de un único estándar de referencia para cada sustancia originada a partir del baño reduce la exactitud y contribuye al ruido.
sólida proporciona una única escala de cristalinidad, expresada como Por lo tanto los calorı́metros de solución isoperibólicos tienen más
energı́a, para cada sustancia y reconoce que cada fármaco o ventajas que los calorı́metros de solución isotérmica cuando el
excipiente sólido tiene propiedades únicas. Asimismo, la cristalini- proceso de disolución es relativamente rápido. Para todas las
dad se puede volver a calcular—si el estándar de referencia original mediciones de la entalpı́a de la solución empleando calorı́metros de
es posteriormente reemplazado por otro estándar de referencia más solución isoperibólicos, la elección del disolvente y del sólido es
cristalino (o más amorfo)—dado que las entalpı́as de solución son fundamental. La naturaleza y el peso del disolvente y el peso de la
cantidades aditivas conforme a la ley de Hess de suma de calores muestra sólida permiten que el cambio de calor total, correspondi-
constantes (es decir, la primera ley de la termodinámica). ente a la disolución total del sólido, se complete en el plazo de 10
*
Ver Pikal, M.J.; Lukes, A.L.; Lang, J.E.; Gaines, K. Quantitative
crystallinity determinations for b-lactam antibiotics by solution calorimetry:
correlations with stability, J. Pharm. Sci. 1978, 67, 767–773.
298 h698i Volumen de Entrega / Pruebas Fı́sicas USP 30
minutos agitando vigorosamente a una velocidad de rotación preparaciones lı́quidas reconstituidas a partir de sólidos mediante el
constante de 400 a 600 revoluciones por minuto. La velocidad de agregado del volumen determinado del diluyente especificado. Estas
rotación se verifica con un estrosboscopio. pruebas no son obligatorias para los artı́culos envasados en envases
unitarios cuando la monografı́a incluye la prueba de Uniformidad de
Unidades de Dosificación h905i.
Calorimetrı́a de Solución Isotérmica
En el calorı́metro de solución isotérmico (con temperatura PREPARACIONES DE PRUEBA
constante), el cambio de calor durante el proceso de disolución se
compensa con un cambio de energı́a igual pero opuesto, de forma tal Para determinar el volumen de entrega, seleccionar no menos de
que la temperatura del sistema disolvente–soluto (es decir, la 30 envases y proceder del siguiente modo para la forma farmacéutica
solución) permanece constante. Este cambio igual pero opuesto de correspondiente.
energı́a se mide y, cuando se invierte su signo, proporciona la Soluciones Orales, Suspensiones Orales y Otras Formas
entalpı́a de la solución. Para calorı́metros isotérmicos, la respuesta es Farmacéuticas Lı́quidas Orales—Agitar individualmente el con-
relativamente lenta, pero el proceso de compensación elimina el tenido de 10 envases.
efecto de pérdidas o ganancias de calor causadas por el baño. Por lo Polvos en Cuya Etiqueta se Declara el Volumen de la
tanto los calorı́metros de solución isotérmicos son más ventajosos Preparación Lı́quida Oral que Resulta cuando el Polvo se
que los calorı́metros de solución isoperibólicos cuando el proceso de Reconstituye con el Volumen de Diluyente Declarado en el
disolución es relativamente lento. Etiquetado—Reconstituir 10 envases con el volumen de diluyente
declarado en el etiquetado, medido con exactitud, y agitar
individualmente.
CALIBRACIÓN DEL CALORÍMETRO
Para asegurar la exactitud del calorı́metro, hay que realizar a diario
calibraciones quı́micas. Para una disolución endotérmica, la calibra- PROCEDIMIENTO
ción del calorı́metro se verifica midiendo el calor absorbido durante Evitando la formación de burbujas, verter suavemente el
la disolución de cloruro de potasio en agua destilada a 298,15 K contenido de cada envase en probetas graduadas separadas, secas
(25,08). El cambio en entalpı́a establecido en este proceso y calibradas ‘‘para contener’’, cuya capacidad nominal no exceda
endotérmico es de 235,5 J/g o 4,196 kcal/mol. Para una disolución dos veces y medio el volumen que se desea medir. Permitir que cada
exotérmica, el calorı́metro se verifica midiendo el calor desarrollado envase drene durante un perı́odo que no exceda de 30 minutos en el
durante la disolución de 5 g por L de trometamina [tris(hidro- caso de envases de unidades múltiples, y 5 segundos en el caso de
ximetil)aminometano, THAM] en una solución acuosa de ácido envases unitarios, a menos que se especifique algo diferente en la
clorhı́drico de 0,1 mol/L a 298,15 K (25,08). El calor establecido monografı́a correspondiente. Cuando el lı́quido quede exento de
para el proceso mencionado anteriormente es de –29,80 kJ/mol o burbujas de aire, medir el volumen de cada mezcla. Como
–7,12 kcal/mol. alternativa, en el caso de productos de bajo volumen envasados en
Se determina la capacidad de calor efectiva de la celda del envases unitarios, el volumen puede calcularse de la siguiente
calorı́metro y su contenido para cada corrida del calorı́metro. Esta manera: (1) descargar el contenido del envase en un recipiente tarado
determinación se logra mediante el calentamiento eléctrico del apropiado (permitir el drenaje durante no más de 5 segundos); (2)
contenido de la celda del calorı́metro. La capacidad de calor efectiva determinar el peso del contenido y (3) calcular el volumen después
se determina conforme a uno de dos protocolos—ya sea mediante la de determinar la densidad.
realización de una determinación después de la ruptura de la ampolla
o realizando una determinación antes y una segunda determinación
después de la ruptura de la ampolla y luego promediando los dos
resultados. La exactitud y confiabilidad del calentamiento eléctrico CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
se establecen mediante la exactitud y confiabilidad de las
calibraciones quı́micas anteriormente mencionadas. Usar los siguientes criterios para determinar el cumplimiento con
esta prueba.
Para Envases de Unidades Múltiples (ver Figura 1)—El
MANEJO DE LA MUESTRA volumen promedio de lı́quido obtenido a partir de los 10 envases
no es menos de 100%, y el volumen de ningún envase es menos de
La estabilidad termodinámica de los sólidos se reduce al disminuir 95%, del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la prueba en
la cristalinidad. En particular, los sólidos de baja cristalinidad, 20 envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100%
especialmente los sólidos amorfos, tienden a absorber vapor de agua del declarado en el etiquetado pero el volumen de ningún envase es
de la atmósfera, lo que provoca cristalización y un aumento menos de 95% de la cantidad declarada, o si B, el volumen promedio
correspondiente en la cristalinidad. Por estos motivos, las muestras no es menos de 100% y el volumen de no más de 1 envase es menos
sólidas anhidras cuya cristalinidad se va a determinar deben de 95% pero no menos del 90% del volumen declarado en la
almacenarse en condiciones de cero humedad en cámaras selladas etiqueta. El volumen promedio de lı́quido obtenido de los 30 envases
que contengan un desecante que preferentemente contenga un no es menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado; y el
indicador de eficacia. Si se van a llevar a cabo estudios de volumen de lı́quido obtenido de no más de 1 de los 30 envases es
cristalinidad–humedad, la muestra sólida debe almacenarse en una menos de 95% pero no menos de 90% del volumen declarado en el
cámara sellada que contenga una solución de sal saturada para etiquetado.
proporcionar una humedad relativa definida a 25,0+0,18. Para Envases Unitarios (ver Figura 2)—El volumen promedio
de lı́quido obtenido a partir de los 10 envases no es menos de 100%
del volumen declarado en el etiquetado y el volumen de cada uno de
los 10 envases se encuentra dentro del intervalo de 95% a 110% del
volumen declarado en el etiquetado. Realizar la prueba en 20
h698i VOLUMEN DE ENTREGA envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100%
del declarado en el etiquetado pero el volumen de ningún envase se
encuentra fuera del intervalo de 95% a 110%, o si B, el volumen
promedio no es menos de 100% y el volumen de no más de 1 envase
Las siguientes pruebas están diseñadas para garantizar que las se encuentra fuera del intervalo de 95% a 110%, pero dentro del
preparaciones lı́quidas orales, cuando se transfieren desde su envase intervalo de 90% a 115%. El volumen promedio de lı́quido obtenido
original, entreguen el volumen de la forma farmacéutica que se de los 30 envases no es menos de 100% del volumen declarado en el
declara en la etiqueta del artı́culo. Estas pruebas se aplican etiquetado y el volumen obtenido de no más de 1 de los 30 envases
a productos cuyas etiquetas declaren contener no más de 250 mL, se encuentra fuera del intervalo de 95% a 110% pero dentro del
ya sea que se suministren como preparaciones lı́quidas o como intervalo de 90% a 115% del volumen declarado en el etiquetado.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h698i Volumen de Entrega 299
Figura 1. Esquema de decisión para envases de unidades múltiples. (V = Volumen promedio. V decl. = Volumen declarado)
300 h699i Densidad de Sólidos / Pruebas Fı́sicas USP 30
Figura 2. Esquema de decisión para envases unitarios. (V = Volumen promedio. V decl. = Volumen declarado)
independiente del método de determinación. La densidad verdadera
h699i DENSIDAD DE SÓLIDOS de un cristal perfecto puede determinarse a partir del tamaño y la
composición de la unidad.
La densidad picnométrica, medida por picnometrı́a de gases, es
una medición de la densidad conveniente para polvos farmacéuticos.
En un picnómetro de gases, el volumen ocupado por una masa
TÉRMINOS Y DEFINICIONES conocida de polvo se determina mediante la medición del volumen
El término densidad se refiere a la distribución espacial promedio de gas desplazado por el polvo. El cociente entre la masa y el
de la masa en un material. La densidad de los sólidos tı́picamente se volumen de gas desplazado es la densidad picnométrica. La densidad
expresa en g por cm3, mientras que en los lı́quidos la densidad se picnométrica equivale a la densidad verdadera a menos que el
expresa generalmente en g por mL a una temperatura de referencia material contenga espacios vacı́os impenetrables, o poros cerrados
establecida. que sean inaccesibles al gas empleado en el picnómetro.
La densidad de una partı́cula sólida puede tomar diferentes valores La densidad granular incluye las contribuciones al volumen de la
según el método empleado para medir el volumen de la partı́cula. Es partı́cula de poros abiertos que son más pequeños que un tamaño
importante distinguir entre tres posibilidades diferentes. lı́mite, que depende del método de medición. Una técnica común de
La densidad verdadera de una sustancia es la masa promedio por medición es la porosimetrı́a de mercurio, donde el tamaño lı́mite del
unidad de volumen, excluyendo todos los espacios vacı́os que no son poro depende de la presión máxima de penetración. Debido a la
parte fundamental de la disposición tridimensional molecular. Es una contribución adicional del volumen de poro, la densidad granular
propiedad de cada material particular y, por lo tanto, debe ser nunca será mayor que la densidad verdadera. Un concepto
relacionado es la densidad aerodinámica, que es la densidad de la
partı́cula con un volumen definido por la envoltura aerodinámica de
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h699i Densidad de Sólidos 301
la partı́cula en una corriente de flujo. Tanto los poros cerrados como desciende a la presión final, Pf. Si el gas de medición se comporta
los abiertos contribuyen a este volumen, pero los poros abiertos se idealmente en las condiciones de medición, el volumen de la
llenan con el lı́quido impregnante. Por lo tanto, si la partı́cula es muestra, Vs, se calcula mediante la siguiente expresión:
porosa, la densidad aerodinámica depende de la densidad del lı́quido
utilizado en la prueba.
En sı́ntesis, tanto la densidad picnométrica como la densidad
verdadera se denominan "densidad". Si es necesario, se pueden
distinguir estas cantidades según el método de medición.
La densidad de un material depende de la cohesión molecular. En
el caso de los gases y los lı́quidos, la densidad depende de la
temperatura y la presión. En el caso de los sólidos, la densidad
también variarı́a según la estructura del cristal y el grado de La densidad, r, se calcula por la ecuación:
cristalinidad. Si los sólidos son amorfos, la densidad también puede
depender de los antecedentes de preparación y tratamiento de esta
sustancia. En consecuencia, a diferencia de los lı́quidos, las
densidades de dos sólidos quı́micamente equivalentes pueden ser
diferentes debido a una diferencia en la estructura del estado sólido.
La densidad de las partı́culas constitutivas es una caracterı́stica fı́sica
importante de los polvos farmacéuticos. Los detalles del diseño instrumental pueden diferir, pero todos los
Más allá de estas definiciones sobre densidad de la partı́cula, la picnómetros de gases dependen de la medición de los cambios de
densidad aparente de un polvo incluye la contribución al volumen presión a medida que se agrega o se elimina un volumen de
del espacio vacı́o entre las partı́culas. En consecuencia, la densidad referencia de la celda de prueba.
aparente depende tanto de la densidad como de la compactación de La densidad medida es una media ponderada por volumen de las
las partı́culas de polvo. densidades de las partı́culas individuales que constituyen el polvo.
La densidad será errónea si el gas de la prueba se adsorbe o se
absorbe en el polvo o si se producen contaminantes volátiles a partir
PICNOMETRÍA DE GASES PARA LA del polvo durante la medición. La adsorción o absorción se evitan
mediante una elección apropiada del gas de prueba. Normalmente se
MEDICIÓN DE DENSIDAD elige helio. Los contaminantes volátiles del polvo se eliminan
mediante la desgasificación del polvo a través de una purga
La picnometrı́a de gases es un método conveniente y apropiado constante con helio antes de la medición. Ocasionalmente, los
para la medición de la densidad de partı́culas de polvo. En la Figura polvos pueden desgasificarse al vacı́o. Si los contaminantes volátiles
1 se muestra un diagrama sencillo de un tipo de picnómetro de gases. no interfieren con la medición, los volúmenes de muestra
proporcionados por dos lecturas consecutivas no difieren en más
del 0,2%. Debido a que se pueden producir contaminantes volátiles
durante la medición, el peso de la muestra debe tomarse después de
la medición picnométrica del volumen.
Método
Asegurarse de que el volumen de referencia y el volumen de
calibración se hayan determinado para el picnómetro de gases
mediante un procedimiento apropiado de calibración. El gas a
utilizar en la prueba debe ser helio, a menos que se especifique otro
gas en la monografı́a individual correspondiente. La temperatura del
pic-
nómetro de gases debe estar entre 158 y 308 y no debe variar en más
de 28 durante el curso de la medición. Cargar la celda de prueba con
la sustancia en análisis que se ha preparado según la monografı́a
individual correspondiente. Secar la sustancia en análisis, cuando se
indica h699Di, según se describe en Pérdida por secado en la
monografı́a correspondiente, a menos que se especifiquen otras
condiciones de secado en la prueba de Densidad de sólidos de la
monografı́a. Cuando se indica h699Ui, la sustancia en análisis se
emplea sin secar. Emplear una cantidad de polvo recomendada en el
manual operativo para el picnómetro. Sellar la celda de prueba del
picnómetro y purgar el sistema del picnómetro con el gas de prueba
según el procedimiento indicado en las instrucciones de funciona-
miento del fabricante. Si la muestra debe desgasificarse al vacı́o,
Fig. 1. Esquema de Picnómetro de Gases. seguir las recomendaciones de las monografı́as individuales
correspondientes y las instrucciones del manual operativo del
La muestra, con una masa w y un volumen Vs, se coloca dentro de picnómetro.
una celda de prueba sellada que tiene un volumen de celda sin La secuencia de medición anterior describe el procedimiento para
contenido de Vc. La presión de referencia del sistema, Pr se el picnómetro de gases que aparece en la Figura 1. Si el picnómetro
determina en el manómetro mientras la válvula que conecta el tiene una operación o construcción diferentes, del que se muestra en
volumen de referencia con la celda de prueba está abierta. Se cierra la Figura 1, seguir el procedimiento operativo indicado en el manual
la válvula para separar el volumen de referencia, Vr, de la celda de de uso del picnómetro.
prueba. La celda de la prueba se presuriza con el gas de medición a Repetir la secuencia de medición para la misma muestra de polvo
una presión inicial, Pi. Luego, se abre la válvula para conectar el hasta que las mediciones consecutivas del volumen de muestra, Vs,
volumen de referencia, V r, con la celda de la prueba y la presión no difieran en más del 0,2%. Descargar la celda de la prueba y medir
el peso final de polvo, w. Calcular la densidad picnométrica, r, de la
muestra según la Ecuación 2.
302 h701i Desintegración / Pruebas Fı́sicas USP 30
siguiente modo. Cuando se especifica utilizar agua o un medio con forman una unidad. En algunos casos, se puede usar un dispositivo
un pH inferior a 6,8 como el Medio de la monografı́a individual, desmontable de dos partes, siempre y cuando las partes permanezcan
emplear el mismo Medio especificado agregando pepsina purificada, firmemente ajustadas durante la prueba . El eje y el aspa de la paleta
de forma que la actividad resultante sea igual o menor a 750 000 pueden estar recubiertos con un material inerte adecuado. Dejar que
Unidades por cada 1000 mL. Para medios con un pH igual o mayor a la unidad de dosificación se hunda hasta el fondo del vaso antes de
6,8, se puede agregar pancreatina de forma que la actividad de la empezar a rotar el aspa. A las unidades de dosificación se les puede
proteasa sea igual o menor a 1750 Unidades USP por 1000 mL. agregar una pieza pequeña, suelta, de algún material no reactivo,
Estándares de Referencia USP h11i—ER Tabletas de Libera- como por ejemplo un par de vueltas de alambre, para evitar que
ción Prolongada de Maleato de Clorfeniramina USP (Calibrador de floten. La Figura 2a ilustra un dispositivo de sumersión alternativo.
Liberación de Fármacos, Dosis Única). ER Tabletas de Prednisona También se puede emplear otro dispositivo de sumersión validado.
USP (Calibrador de Disolución, Desintegrable). ER Tabletas de
Ácido Salicı́lico USP (Calibrador de Disolución, no Desintegra-
ble).^
APARATO
Aparato 1 (Aparato con Canastilla)
El aparato consiste de: un vaso, con o sin tapa, de vidrio u otro
material inerte y transparente1; un motor, un eje propulsor metálico y
una canastilla cilı́ndrica. El vaso está parcialmente sumergido en un
baño de agua adecuado de cualquier dimensión conveniente o recibe
calor de un dispositivo adecuado, como por ejemplo una camisa de
calentamiento. Durante el transcurso de la prueba, el baño de agua o
el dispositivo de calentamiento mantienen la temperatura en el
interior del vaso a 37 + 0,58 y garantizan que el fluido del baño se
mantenga en movimiento suave y constante. Ninguna parte del
equipo, ni el entorno en el cual está colocado, aumenta significa-
tivamente el movimiento, agitación o vibración, por encima de los
producidos por el elemento de agitación que gira con suavidad. Es
preferible emplear un aparato que permita observar la muestra y el
elemento de agitación durante la prueba. El vaso es cilı́ndrico y de
fondo semiesférico ^con las siguientes dimensiones y capacidades:^
para 1 L de capacidad nominal: altura entre 160 mm y 210 mm y
diámetro interno entre 98 mm y 106 mm; ^para 2 L de capacidad
nominal: altura entre 280 mm y 300 mm y diámetro interno entre 98
mm y 106 mm; y para 4 L de capacidad nominal: altura entre 280
mm y 300 mm y diámetro interno entre 145 mm y 155 mm.^ Las
paredes del vaso cilı́ndrico tienen un reborde en el extremo superior.
Se puede utilizar una tapa si fuera necesario para minimizar la
evaporación.2 Colocar el eje propulsor de forma tal que su eje central
guarde una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier
punto del eje vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones
que pudieran afectar los resultados. Emplear un dispositivo para
regular la velocidad con el objeto de seleccionar y mantener la
velocidad de rotación del eje propulsor a la velocidad especificada
^
en la monografı́a individual,^ con una aproximación de + 4%. Figura. 2. Elemento de Agitación de Paleta
Los componentes del eje y de la canastilla del elemento de
agitación son de acero inoxidable tipo 316 o de otro material inerte,
según las especificaciones de la Figura 1. Se puede emplear una
canastilla con un baño de oro de aproximadamente 0,0001 pulgadas
(2,5 mm) de espesor. La unidad de dosificación se coloca en una Aparato 3 (Cilindro oscilante)
canastilla seca al comienzo de cada prueba. La distancia entre el
fondo interno del vaso y el fondo de la canastilla se mantiene a NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
25 + 2 mm durante la prueba.
El equipo se compone de un grupo de vasos cilı́ndricos de fondo
plano, un grupo de cilindros oscilantes de vidrio, accesorios de un
Aparato 2 (Aparato con Paleta) material inerte (de acero inoxidable tipo 316 o de otro material
adecuado) y mallas de un material adecuado no absorbente ni
Emplear el Aparato 1 usando como elemento de agitación una reactivo, que se fijan a la parte superior e inferior de los cilindros
paleta compuesta por un aspa y un eje. Colocar el eje propulsor de oscilantes; un motor y una transmisión que hacen oscilar los
forma tal que su eje central guarde una distancia máxima de 2 mm cilindros en sentido vertical dentro de los vasos y, de ser necesario,
con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso y rote traslada los cilindros oscilantes en sentido horizontal hacia otra
suavemente sin fluctuaciones que pudieran afectar los resultados. La hilera de vasos. Los vasos están parcialmente sumergidos en un baño
lı́nea central vertical del aspa está alineada con el eje propulsor de de agua adecuado de un tamaño conveniente que permita mantener
forma tal que el extremo inferior del aspa está nivelado con el la temperatura a 37 + 0,58 durante la prueba. Ninguna parte del
extremo inferior del eje propulsor. La paleta cumple con las equipo, ni el entorno en el cual el equipo está colocado, produce una
especificaciones que se indican en la Figura 2. La distancia entre el cantidad importante de movimiento, agitación o vibración, que
fondo interno del vaso y el aspa se mantiene en 25 + 2 mm durante exceda la oscilación vertical suave del cilindro oscilante. Se usa un
la prueba. El aspa metálica o de otro material inerte adecuado y el eje dispositivo que permite elegir la velocidad de oscilación y
mantenerla a la velocidad de inmersión ^especificada en cada
1
Los materiales deben ser tales que no produzcan sorción, ni reacciones ni monografı́a individual,^ dentro de + 5%. Es preferible emplear un
interferencias con la muestra en análisis. aparato que permita observar las muestras y los cilindros oscilantes.
2
Si se usa una tapa, verificar que cuenta con orificios para insertar fácilmente Los vasos cuentan con una tapa de evaporación que permanece
un termómetro y para extraer las muestras. colocada durante la prueba. Los componentes se ajustan a las
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h711i Disolución 305
Figura. 2a. Dispositivo de sumersión alternativo. Las dimensiones están expresadas en mm.
306 h711i Disolución / Pruebas Fı́sicas USP 30
dimensiones que aparecen en la Figura 3, a menos que se diámetro estándar de la celda se ubica entre 12 mm y 22,6 mm; la
especifique algo diferente ^en la monografı́a individual.^ base cónica de la celda está generalmente llena de pequeñas perlas de
vidrio de aproximadamente 1 mm de diámetro y una de esas perlas,
de aproximadamente 5 mm, está ubicada en el ápice para proteger el
tubo de entrada del fluido; se dispone de un portatabletas (ver las
Figuras 4 y 5) para colocar formas farmacéuticas especiales, por
ejemplo, tabletas estratificadas. La celda se sumerge en un baño de
agua y se mantiene la temperatura a 37 + 0,58.
El aparato emplea un mecanismo de abrazadera y dos juntas de
goma para fijar la celda. La bomba está separada de la unidad de
disolución a fin de proteger a esta última de las vibraciones que
pueda originar la bomba. La bomba no debe estar colocada en un
nivel superior al de los recipientes de depósito. Las conexiones entre
tubos son lo más cortas posible. Emplear tuberı́as de material inerte,
como por ejemplo teflón de 1,6 mm de diámetro interno y
conexiones con rebordes quı́micamente inertes.
PROCEDIMIENTO
Aparato 1 y Aparato 2
FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA
Figura 4. Celda grande para tabletas y cápsulas (arriba). Portatabletas para la celda grande (abajo). (Todas las dimensiones están expresadas en
mm a menos que se indique algo diferente.)
308 h711i Disolución / Pruebas Fı́sicas USP 30
Figura 5. Celda pequeña para tabletas y cápsulas (arriba). Portatabletas para celda pequeña (abajo). (Todas las dimensiones están expresadas en
mm a menos que se indique algo diferente.)
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h711i Disolución 309
adecuada.] Realizar el análisis ^como se indica en la monografı́a Realizar un análisis de la alı́cuota empleando un método de
individual^ empleando un método de análisis adecuado.3 Repetir la análisis adecuado. ^El procedimiento se especifica en la monografı́a
prueba con otras unidades de la forma farmacéutica. individual.^
Si se emplean equipos automáticos para muestreo o si se ETAPA AMORTIGUADA—[NOTA—Completar los pasos de agregar la
introducen otras modificaciones en el aparato, es necesario verificar solución amortiguadora y ajustar el pH en no más de 5 minutos.]
que los resultados obtenidos con el aparato modificado son Con el aparato en funcionamiento a la velocidad indicada ^en la
equivalentes a los obtenidos con el aparato estándar descrito en monografı́a,^ agregar al lı́quido del vaso 250 mL de fosfato de sodio
este capı́tulo general. tribásico 0,20 M previamente equilibrado a 37 + 0,58. Ajustar, si
Medio de Disolución—Emplear un medio de disolución fuera necesario, con ácido clorhı́drico 2 N o hidróxido de sodio 2 N
adecuado. Emplear el disolvente especificado ^en la monografı́a a un pH de 6,8 + 0,05. Dejar el aparato funcionando durante 45
individual.^ El volumen especificado se refiere a mediciones minutos o durante el tiempo especificado ^en la monografı́a
a temperaturas entre 208 y 258. Si el Medio de Disolución es una individual.^ Al finalizar ese perı́odo, retirar una alı́cuota del lı́quido
solución amortiguada, ajustar el pH al valor indicado con una y efectuar el análisis empleando un método de valoración adecuado.
aproximación de 0,05 unidades respecto del pH indicado ^en la ^
El procedimiento se especifica en la monografı́a individual. La
monografı́a individual.^ [NOTA—Los gases disueltos pueden causar prueba puede concluir en un perı́odo más corto que el especificado
la formación de burbujas que pueden alterar los resultados de la para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mı́nima
prueba. Si los gases disueltos interfieren con los resultados de la disuelta se cumple antes de lo previsto.^
disolución, eliminarlos antes de iniciar las pruebas.4] Método B—
Tiempo—Cuando se especifica un solo tiempo, la prueba se Procedimiento ^(a menos que se especifique algo diferente en la
puede concluir en un periodo más corto, siempre y cuando se cumpla monografı́a individual)^—
el requisito de cantidad mı́nima disuelta. Tomar las muestras sólo en ETAPA ÁCIDA—Colocar 1000 mL de ácido clorhı́drico 0,1 N en el
los tiempos indicados con una tolerancia de + 2%. vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una
^
Procedimiento para una Muestra Combinada para Formas temperatura de 37+ 0,58. Colocar 1 unidad de dosificación en el
Farmacéuticas de Liberación Inmediata—Usar este procedi- aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la
miento cuando se especifica un Procedimiento para una Muestra velocidad especificada ^en la monografı́a.^ Después de funcionar
Combinada en la monografı́a individual. Proceder según se indica en 2 horas con ácido clorhı́drico 0,1 N, retirar una alı́cuota del lı́quido y
Procedimiento para Aparato 1 y Aparato 2 en Formas Farmacéu- proceder de inmediato como se indica para la Etapa Amortiguada.
ticas de Liberación Inmediata. Combinar volúmenes iguales de Realizar un análisis de la alı́cuota empleando un método de
soluciones filtradas de las seis o doce muestras individuales tomadas valoración adecuado. ^El procedimiento se especifica en la
y emplear la muestra combinada como la muestra de prueba. monografı́a individual.^
Determinar la cantidad promedio de ingrediente activo disuelto en la ETAPA AMORTIGUADA—[NOTA—Para esta etapa del procedimiento,
muestra combinada.^ emplear una solución amortiguadora previamente equilibrada a una
temperatura de 37 + 0,58.] Retirar el medio ácido del vaso y agregar
1000 mL de una solución amortiguadora de fosfato de pH 6,8,
FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA preparada mediante la mezcla de ácido clorhı́drico 0,1 N y fosfato de
sodio tribásico 0,20 M (3 : 1) y ajustar, si fuera necesario, con ácido
Proceder como se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación clorhı́drico 2 N o con hidróxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 + 0,05.
Inmediata. [NOTA—Este paso también puede llevarse a cabo extrayendo del
Medio de Disolución—Proceder como se indica en Formas aparato el vaso que contiene el ácido, reemplazándolo con otro vaso
Farmacéuticas de Liberación Inmediata. que contenga la solución amortiguadora y transfiriendo la unidad de
Tiempo—Los tiempos de prueba, que generalmente son tres, se dosificación al vaso que contiene la solución amortiguadora.]
expresan en horas. Dejar funcionar el aparato durante 45 minutos o durante el tiempo
especificado ^en la monografı́a individual.^ Al cabo de ese perı́odo,
extraer una alı́cuota del lı́quido y analizarla empleando un método de
FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA valoración adecuado. ^El procedimiento se especifica en la
monografı́a individual. La prueba puede concluir en un perı́odo
NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA más corto que el especificado para la Etapa Amortiguada si el
requisito de cantidad mı́nima disuelta se cumple antes de lo
Emplear el Método A o el Método B y el aparato especificado ^en previsto.^
la monografı́a individual.^ Todos los tiempos de prueba especifica-
dos deben cumplirse con una tolerancia de +2%, a menos que se
especifique algo diferente. Aparato 3 (Cilindro Oscilante)
Método A—
Procedimiento ^(a menos que se indique algo diferente en la NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA
monografı́a individual)^—
FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA
ETAPA ÁCIDA—Colocar 750 mL de ácido clorhı́drico 0,1 N en el
vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una Colocar el volumen indicado de Medio de Disolución en cada
temperatura de 37 + 0,58. Colocar 1 unidad de dosificación en el vaso del aparato, ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de
aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la Disolución a 37 + 0,58 y retirar el termómetro. Colocar 1 unidad de
velocidad especificada ^en la monografı́a.^ la forma farmacéutica en cada uno de los seis cilindros oscilantes,
Después de funcionar 2 horas con ácido clorhı́drico 0,1 N, retirar tomando la precaución de eliminar las burbujas de la superficie de
una alı́cuota del lı́quido y proceder de inmediato como se indica para cada unidad de dosificación y poner en funcionamiento el aparato
la Etapa Amortiguada. inmediatamente como se especifica ^en la monografı́a individual.^
Durante el recorrido ascendente y descendente, los cilindros
3
oscilantes recorren una distancia total de 9,9 cm a 10,1 cm. Dentro
Filtrar las muestras de prueba inmediatamente después de tomarlas, salvo del intervalo de tiempo especificado, o en cada tiempo especificado,
que se demuestre que la filtración no es necesaria. Usar un filtro inerte que no elevar los cilindros oscilantes y retirar una porción de la solución en
adsorba el ingrediente activo y que no contenga sustancias extraı́bles que análisis de una zona equidistante entre la superficie del Medio de
pudieran interferir en el análisis.
4
Disolución y el fondo de cada vaso. Efectuar el análisis como se
Un método para eliminar los gases es el siguiente: Calentar el medio, indica ^en la monografı́a individual.^ Si fuera necesario, repetir la
mezclando suavemente, hasta aproximadamente 418; inmediatamente filtrar al
vacı́o utilizando un filtro con un tamaño de poro de 0,45 mm o menor, prueba con otras unidades de forma farmacéutica.
mezclando vigorosamente y continuar mezclando al vacı́o durante aproxi- Medio de Disolución—Proceder como se indica en Formas
madamente 5 minutos. También se puede emplear otra técnica de Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 1 y Aparato 2.
desgasificación validada para eliminar los gases disueltos.
310 h711i Disolución / Pruebas Fı́sicas USP 30
h724i LIBERACIÓN DE
FÁRMACOS Figura 1. Paleta sobre Disco.
(Todas las dimensiones están expresadas en mm, a menos que se
indique algo diferente.)
presión sobre el sistema, con la superficie de liberación hacia arriba, coloca sobre el cilindro al comienzo de cada prueba. La distancia
para adherirlo a la pared cubierta de adhesivo del ensamble del disco. entre el fondo interno del vaso y el cilindro se mantiene a 25 +2 mm
Si se emplea una membrana4 para sostener el sistema, ésta se aplica durante la prueba.
de modo que no queden burbujas de aire entre la membrana y la Medio de Disolución—Emplear el medio especificado en la
superficie de liberación. Colocar el disco plano en el fondo del vaso monografı́a individual (ver Disolución h711i).
con la superficie de liberación hacia arriba y paralela al borde del Procedimiento—Colocar el volumen indicado de Medio de
aspa de la paleta y la superficie del Medio de Disolución. El borde Disolución en el vaso del aparato especificado en la monografı́a
inferior de la paleta está ubicado a 25 + 2 mm de la superficie del individual, ensamblar el aparato y equilibrar el Medio de Disolución
disco. Poner el aparato en funcionamiento de inmediato a la a 32 + 0,58. A menos que se indique algo diferente en la monografı́a
velocidad especificada en la monografı́a. En los intervalos en que se individual, preparar el sistema de prueba antes de iniciar la prueba
toman las muestras, extraer una muestra de la zona intermedia entre del siguiente modo. Quitar el recubrimiento protector del sistema y
la superficie del Medio de Disolución y la parte superior del aspa, a colocar el lado adhesivo sobre una porción de Cuprofano4 que no
no menos de 1 cm de la pared del vaso. Realizar el análisis de cada sobresalga más de 1 cm en todos los lados del sistema. Colocar el
alı́cuota tomada según se indica en la monografı́a individual sistema con el lado cubierto por el Cuprofano hacia abajo sobre una
corrigiendo, según fuera necesario, toda pérdida de volumen. Repetir superficie limpia y aplicar un adhesivo adecuado3 sobre los bordes
la prueba con otros sistemas transdérmicos. expuestos del Cuprofano. Si fuera necesario, aplicar más adhesivo en
Tiempo—Los tiempos, que generalmente son tres, se expresan en la parte posterior del sistema. Dejar secar 1 minuto. Colocar con
horas. Las muestras deben tomarse con una tolerancia de +15 cuidado la cara del sistema cubierta de adhesivo sobre el exterior del
minutos o +2% del tiempo especificado, pero debe aplicarse la cilindro, de modo que el eje largo del sistema quede ajustado
tolerancia que corresponda al intervalo de tiempo más corto. alrededor del cilindro. Presionar la cubierta de Cuprofano para
Interpretación—A menos que se especifique algo diferente en la eliminar las burbujas de aire que pudieran haber quedado atrapadas.
monografı́a individual, se cumplen los requisitos si la cantidad de Colocar el cilindro en el aparato e inmediatamente ponerlo a rotar a
ingrediente activo liberado por el sistema se ajusta a la Tabla de la velocidad especificada en la monografı́a individual. Dentro del
Aceptación 1 para sistemas de administración transdérmica de intervalo especificado, o a cada tiempo especificado, extraer para
fármacos. Continuar efectuando los tres niveles de prueba a menos analizar una cantidad de Medio de Disolución de una zona
que los resultados se ajusten en L1 o en L2. intermedia entre la superficie del Medio de Disolución y la parte
superior del cilindro rotatorio que no esté a menos de 1 cm de la
pared del vaso. Realizar el análisis como se indica en la monografı́a
individual corrigiendo, según fuera necesario, toda pérdida de
Tabla de Aceptación 1 volumen. Repetir la prueba con otros sistemas de administración
Número transdérmica adicionales.
Nivel Analizado Criterio Tiempo—Proceder según se indica en Aparato 5.
L1 6 Ningún valor individual se encuentra Interpretación—A menos que se especifique algo diferente en la
fuera del intervalo especificado. monografı́a individual, se cumplen los requisitos si la cantidad de
L2 6 El valor promedio de las 12 unidades ingrediente activo liberado por el sistema se ajusta a la Tabla de
(L1 + L2) se encuentra dentro del Aceptación 1 para sistemas de administración transdérmica de
intervalo especificado. Ningún valor fármacos. Continuar efectuando los tres niveles de prueba a menos
individual se encuentra fuera del que los resultados se ajusten a L1 o a L2.
intervalo especificado en más del
10% del promedio del intervalo
especificado. Aparato 7 (Soporte Oscilante)
L3 12 El valor promedio de las 24 unidades
(L1 + L2 + L3) se encuentra dentro del NOTA—Este aparato también puede estar indicado para una
intervalo especificado. No más de 2 variedad de formas de dosificación.
de las 24 unidades se encuentran Aparato—El equipo se compone de un grupo de recipientes para
fuera del intervalo especificado en soluciones volumétricamente calibrados o tarados, hechos de vidrio
más del 10% del promedio del o de otro material inerte adecuado6, un motor y una transmisión que
intervalo especificado; y ninguna de hacen oscilar el sistema en sentido vertical dentro de los vasos y que,
las unidades se encuentra fuera del de ser necesario, trasladan automáticamente el sistema en sentido
intervalo especificado en más del horizontal hacia otra hilera de vasos y un grupo de portamuestras
20% del promedio del intervalo adecuados (ver la Figura 37 y las Figuras 4a–4d). Durante la
especificado. prueba, los recipientes para soluciones están parcialmente sumergi-
dos en un baño de agua adecuado de tamaño conveniente que
permita mantener la temperatura, T, dentro de los recipientes a
Aparato 6 (Cilindro) 32 + 0,58 o dentro del intervalo permitido, como se especifica en la
monografı́a individual. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en el
Aparato—Emplear el vaso del Aparato 1 como se describe en cual el equipo está colocado, produce una cantidad importante de
Disolución h711i, pero reemplazar la canastilla y el eje con un movimiento, agitación o vibración, que exceda la suave oscilación
cilindro de acero inoxidable y, durante la prueba, mantener la vertical del portamuestras. Es preferible emplear un aparato que
temperatura a 32 + 0,58. Los componentes del eje y del cilindro del permita observar el sistema y el portamuestras durante la prueba.
elemento de agitación son de acero inoxidable según las especifi- Emplear el recipiente y el portamuestras de los tamaños que se
caciones que aparecen en la Figura 2. La unidad de dosificación se especifican en la monografı́a individual.
6
Los materiales no deben absorber la muestra de prueba ni reaccionar ni
interferir con ella.
4 7
Emplear Cuprofano, Tipo 150 pm, de grosor 11 + 0,5 mm, un material El disco oscilante portamuestras puede obtenerse de ALZA Corp., 1900
celulósico poroso e inerte, que produce Medicell International Ltd., 239 Charleston Road, P.O. Box 7210, Mt. View, CA 94039–7210 o VanKel
Liverpool Road, Londres NI ILX, Inglaterra. Technology Group.
314 h724i Liberación de Fármacos / Pruebas Fı́sicas USP 30
5
El cilindro puede obtenerse de Accurate Tool, Inc., 25 Diaz St., Stamford,
CT 06907 o de VanKel Technology Group, 13000 Weston Parkway, Cary,
NC 27513.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h724i Liberación de Fármacos 315
Figura 4c. Portatabletas para Tabletas Orales de Liberación Prolongada —Varilla, Puntiaguda para Encolado.
Figura 4d. Portatabletas para Tabletas Orales de Liberación Prolongada —Soporte de Resorte.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h726i Electroforesis 317
La temperatura afecta indirectamente la movilidad, ya que la El gel de poliacrilamida presenta varias ventajas que avalan su
viscosidad, Z, del electrólito de soporte depende de la temperatura. amplio uso. Presenta propiedades mı́nimas de adsorción ası́ como un
La viscosidad del agua disminuye a una velocidad de aproximada- efecto electroosmótico insignificante. Pueden prepararse de forma
mente 3% por 8C en el intervalo de 08 a 58 y a una velocidad reproducible geles con una amplia gama de tamaños de poro
ligeramente más lenta para valores cercanos a la temperatura variando la concentración total del gel (basada en monómero más
ambiente. Por tanto, la movilidad aumenta al aumentar la agente de entrecruzamiento) y el porcentaje de agente de
temperatura del electrólito. entrecruzamiento utilizado para formar dicho gel. Estas cantidades
Como resultado del paso de la corriente a través del electrólito de se expresan convenientemente como
soporte se desprende un calor considerable. Este calor aumenta con
el voltaje aplicado y al aumentar la concentración iónica.
Especialmente en aparatos de mayor tamaño, y a pesar de la
circulación de refrigerante, este calor produce un gradiente de
temperatura a través del lecho que puede dar lugar a una distorsión
de las zonas separadas. Por tanto, las consideraciones prácticas y el
diseño de cada aparato dictarán la elección de la concentración
iónica y del voltaje de operación.
Efecto de un medio estabilizante, Electroósmosis—Cuando se
pasa una corriente eléctrica a través de un electrólito contenido en un
tubo de vidrio o entre placas de vidrio o plástico, se observa un flujo donde T es la concentración total de gel en %; C es el porcentaje de
masivo del electrólito hacia uno de los electrodos. Este flujo se agente de entrecruzamiento utilizado para preparar el gel; V es el
denomina electroósmosis. Se produce como resultado de la carga volumen, en mL, de solución amortiguadora utilizada para la
superficial en las paredes del aparato, debida a grupos funcionales preparación del gel y a y b son los pesos, en g, de monómero
ionizables inherentes al material estructural o a iones adsorbidos en (acrilamida) y agente de entrecruzamiento (normalmente N,N’-
las paredes de la celda procedentes del electrólito con el que están en metilenbisacrilamida) utilizados para preparar el gel. Se han
contacto. El efecto normalmente es mayor cuando la celda está llena preparado geles satisfactorios con concentraciones (T) que varı́an
con un lecho de sustancia porosa, como un gel, que se utiliza para de aproximadamente 3% a 30%. Normalmente la cantidad de agente
estabilizar el electrólito de soporte y evitar que las zonas separadas de entrecruzamiento está entre aproximadamente una décima parte y
se vuelvan a mezclar por convección térmica o difusión. La solución una vigésima parte de la cantidad de monómero (C = 10% a 5%),
inmediatamente adyacente a la superficie crea una carga eléctrica utilizándose un porcentaje menor para valores más altos de T.
igual pero de signo contrario a la carga superficial, y el campo Para preparar el gel se rellena el lecho del aparato de electroforesis
eléctrico que atraviesa la celda produce un movimiento de la con una solución acuosa de monómero y agente de entrecruza-
solución hacia el electrodo de carga opuesta. miento, normalmente amortiguado al pH deseado en la última
Las sustancias utilizadas habitualmente como medios estabi- corrida y polimerizado in situ mediante un proceso de radicales
lizantes en la electroforesis de zona desarrollan una carga superficial libres. La polimerización puede iniciarse con un proceso quı́mico,
negativa y, por tanto, el flujo electroosmótico del electrólito se dirige normalmente utilizando persulfato de amonio más N,N,N’,N’-
hacia el cátodo. Como resultado, todas las zonas, incluidas las tetrametilendiamina o con medios fotoquı́micos utilizando una
sustancias neutras, se desplazan hacia el cátodo durante el ciclo mezcla de riboflavina y N,N,N’,N’-tetrametilendiamina. La polime-
electroforético. rización se inhibe con oxı́geno molecular y condiciones ácidas. Debe
El grado de electroósmosis observado varı́a en función de la respetarse rigurosamente la composición del gel y las condiciones de
sustancia estabilizante. Este hecho resulta apreciable con el gel de polimerización elegidas para conseguir una calidad reproducible del
agar y es insignificante con el gel de poliacrilamida. gel.
Tamizado molecular—En ausencia de un medio estabilizante o en Aparato para la electroforesis en gel—En general, el lecho
aquellos casos en los que el medio es muy poroso, la separación o medio en el que se realiza la electroforesis puede estar soportado
electroforética de las moléculas se produce debido a diferencias en el en sentido horizontal o vertical, dependiendo del diseño del aparato.
cociente entre su carga eléctrica y su tamaño. En presencia de un También pueden realizarse una serie de separaciones comparativas
medio estabilizante, las diferencias de adsorción o de otras en diferentes tubos individuales o colocando diferentes muestras en
afinidades de las moléculas por el medio producen un efecto pocillos adyacentes, conformados o cortados en una sola placa de
cromatográfico que permite mejorar la separación. gel. Un conjunto de placa vertical como el que se muestra
Si el medio estabilizante es un gel de alta reticulación de forma esquemáticamente en la Figura 2 resulta adecuado para comparar
que el tamaño de los poros resultantes es del orden de la dimensión directamente diferentes muestras. Una ventaja particular es la
de las moléculas que se desean separar, se obtiene un efecto de comparación de las muestras en un único lecho de gel con una
tamizado molecular. Este efecto es análogo al obtenido en composición probablemente más uniforme que la de los geles
separaciones basadas en cromatografı́a de exclusión molecular conformados en una serie de cámaras.
o permeación en gel, aunque en la electroforesis en gel el efecto
se superpone a la separación electroforética. El tamizado molecular
puede visualizarse como el resultado de oponer una barrera estérica
al paso de las moléculas de mayor tamaño. Las moléculas pequeñas
pasan a través de poros con un amplio intervalo de tamaño y, por
tanto, su paso electroforético a través del gel no se ve impedido. A
medida que aumenta el tamaño, cada vez menos poros permiten el
paso de las moléculas, causando un retardo en la migración de las
sustancias de peso molecular elevado.
Electroforesis en Gel
Los procesos que utilizan un gel como, por ejemplo, agar, almidón
o poliacrilamida, como medio estabilizante se denominan de forma
general electroforesis en gel. Este método resulta especialmente Fig. 2. Aparato de electroforesis en gel de placa vertical.
ventajoso para la separación de proteı́nas. La separación obtenida
depende del cociente entre carga eléctrica y tamaño junto con un En muchos tipos de aparatos un elemento, no ilustrado en la vista
efecto de tamizado molecular que depende básicamente del peso esquemática, sella la cámara amortiguadora inferior a la base del
molecular. lecho y permite igualar el nivel de la solución amortiguadora de la
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h726i Electroforesis 319
cámara inferior con el de la cámara superior, eliminando ası́ la solución de monómero de gel espaciador que se aplica sobre el gel
presión hidrostática en el gel. Además, algunas unidades disponen de espaciador y se deja polimerizar. El pH del gel separador es de forma
circulación de refrigerante en uno o en ambos lados del lecho de gel. tı́pica 8,9, mientras que el del gel espaciador y el del gel de muestra
En la preparación del gel, la base de la cámara de gel está cerrada es 6,7. Los tres geles se preparan utilizando cloruro como anión.
con un dispositivo adecuado y la unidad se llena con la solución de Los reservorios de solución amortiguadora superior e inferior se
monómero, agente de entrecruzamiento y catalizador. Se introduce llenan con una solución amortiguadora de pH 8,3 preparada con tris
un peine, con dientes de un tamaño adecuado, en la parte superior y y glicina. A este pH, aproximadamente el 3% de las moléculas de
se deja que finalice la polimerización. Al retirar el peine quedan glicina tienen una carga negativa neta.
conformados una serie de pocillos de muestra en el gel polimerizado. Cuando se aplica un voltaje al sistema, la interfaz glicinato-cloruro
En la electroforesis en gel sencilla se utiliza la misma solución se desplaza bajando hacia el ánodo. Inicialmente estaba colocada en
amortiguadora para rellenar las cámaras de amortiguación superior la unión entre la solución amortiguadora en el reservorio superior y
e inferior ası́ como en la solución utilizada para preparar el gel. la parte superior de la capa de gel de muestra. El anión cloruro, por
Después de llenar las cámaras, las muestras, disueltas en sacarosa su tamaño pequeño, migra más rápido que cualquiera de las
u otra solución densa y ligeramente viscosa para evitar la difusión, se proteı́nas presentes en la muestra. El pH de la muestra y de las capas
introducen con una jeringa o micropipeta en el fondo de los pocillos espaciadoras se eligió para que tuviera un valor de aproximadamente
de muestra y a continuación se inicia inmediatamente la electrofor- 3 unidades por debajo del valor pKa más alto de la glicina. Por tanto,
esis. al atraversar estas capas, solamente cerca de un 0,1% de las
moléculas de glicina tienen una carga negativa neta. Como
consecuencia, la glicina migra más lentamente que el cloruro. La
ELECTROFORESIS DE DISCO tendencia del cloruro, de movimiento más rápido, a alejarse del
glicinato reduce la concentración en la interfaz, produciendo una
Una variante importante de la electroforesis en gel de poliacri- mayor caı́da de voltaje en la interfaz, lo que a su vez hace que el
lamida, que utiliza una serie discontinua de soluciones amortigua- glicinato alcance al cloruro. En estas condiciones se mantiene una
doras y a menudo también una serie discontinua de capas de gel, interfaz muy clara que hace que a medida que se desplaza a través de
recibe el nombre de electroforesis de disco. Este nombre se debe a la las capas de muestra y espaciadoras, las proteı́nas en la muestra
forma discoide de las zonas muy estrechas que se obtienen con esta tiendan a concentrarse en la interfaz en capas muy finas ordenadas
técnica. Debido a las estrechas zonas obtenidas, esta técnica presenta según su movilidad. El proceso se denomina concentración y es la
una resolución extremadamente elevada y se recomienda para la causa de la separación de los discos.
identificación de mezclas de proteı́nas y para la detección de Cuando las proteı́nas concentradas alcanzan el gel separador de
contaminantes que pueden tener movilidades próximas a las del alta densidad, se ven lentificadas por un proceso de tamizado
componente principal. molecular. Al encontrar un valor más alto de pH en el gel separador
La base de la electroforesis de disco se describe en los siguientes el glicinato migra más rápidamente, de forma que la interfaz de la
párrafos tomando como ejemplo un sistema aniónico adecuado para solución amortiguadora discontinua adelanta a las proteı́nas y
separar proteı́nas con una carga negativa neta. Para poder entender la finalmente alcanza el fondo del gel separador. Durante este periodo,
electroforesis de disco resulta esencial conocer los aspectos los discos de proteı́na continúan separándose por electroforesis y
generales de la electroforesis y el aparato anteriormente descrito. tamizado molecular en el gel separador. Al final del ciclo, el pH del
Bases de la electroforesis de disco—La alta resolución obtenida gel separador habrá superado su valor original de 8,9 para alcanzar
en la electroforesis de disco depende del uso de un sistema un valor de pH de aproximadamente 9,5.
amortiguador que sea discontinuo con respecto tanto al pH como a la Movilidad relativa—El azul de bromofenol se utiliza con
composición. Esto normalmente se combina con el uso de series frecuencia como estándar para calcular la movilidad relativa de las
discontinuas de dos o tres geles de diferente densidad. zonas separadas y para juzgar visualmente el progreso del ciclo. Este
Un sistema tı́pico se ilustra esquemáticamente en la Figura 3. puede añadirse a uno de los pocillos de la muestra o mezclarse con la
Un gel separador de alta densidad (T = 10% a 30%) y de varios propia muestra, o simplemente agregarse a la solución amortigua-
centı́metros de altura se polimeriza en una solución amortiguadora dora en el reservorio superior de la muestra.
de tris-cloruro en el lecho del aparato. Durante la polimerización la La movilidad relativa, MB, se calcula como:
solución amortiguadora se cubre con una capa fina de agua para
evitar la formación de un menisco en la parte superior del gel. A
continuación se retira la capa superior de agua y se polimeriza una
capa fina, de 3 mm a 10 mm de espesor, de gel de baja densidad (T =
3%), denominado gel espaciador o concentrador, en una solución
amortiguadora de tris-cloruro encima del gel separador. Se vuelve
a utilizar una capa superior de agua para asegurar que la superficie
esté plana. La muestra se mezcla con una pequeña cantidad de
Fig. 3. Terminologı́a, pH y composición de la solución amortiguadora para la electroforesis de disco en gel de acrilamida.
320 h727i Electroforesis Capilar / Pruebas Fı́sicas USP 30
Visualización de zonas—Dado que la poliacrilamida es transpa- toda la solución. Este movimiento del volumen de la solución que se
rente, las bandas de proteı́na pueden localizarse mediante escaneado produce bajo la fuerza del campo eléctrico se llama flujo
en un densitómetro con luz UV. Las zonas pueden fijarse mediante electroosmótico (EOF por sus siglas en inglés). El grado de
inmersión en precipitantes de proteı́nas tales como el ácido ionización de los grupos silanol en la pared interna del capilar
fosfotúngstico o el ácido tricloroacético al 10%. Puede utilizarse depende principalmente del pH de la solución amortiguadora
una amplia gama de reactivos de tinción, incluido el negro de operativa y de los modificadores que se puedan haber agregado al
naftaleno (negro amido) y el azul brillante de Coomassie R250. Las electrolito. A un pH bajo, los grupos silanol suelen tener una
zonas fijadas o teñidas pueden observarse y fotografiarse conve- ionización baja y el EOF es bajo. A un pH mayor, los grupos silanol
nientemente con luz transmitida por un iluminador de pelı́cula de se ionizan más y aumenta el EOF. En algunos casos se agregan
rayos X. disolventes orgánicos, como por ejemplo metanol o acetonitrilo, a la
solución amortiguadora acuosa para aumentar la solubilidad del
soluto y de otros aditivos o para afectar el grado de ionización de la
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD muestra. El agregado de tales modificadores orgánicos suele causar
una disminución del EOF. El detector está ubicado en el extremo
Los voltajes utilizados en la electroforesis pueden producir catódico del capilar. Por lo general, el EOF es mayor que la
fácilmente una electrocución letal. El riesgo se ve aumentado por movilidad electroforética; por lo tanto, incluso los aniones son
el uso de soluciones amortiguadoras acuosas y la posibilidad de trasladados hacia el cátodo y el detector. Cuando se emplea un
trabajar en entornos húmedos. capilar no recubierto que contiene una solución amortiguadora de
El equipo, con la posible excepción de la fuente de energı́a, debe fosfato de pH 7,0, el orden usual de aparición de los solutos en un
estar contenido en una caja de metal con descarga a tierra o en una electroferograma es el siguiente: especies catiónicas, solutos neutros
caja de material aislante. La caja debe tener un sistema que corte la y especies aniónicas.
fuente de energı́a cuando la caja se abra y evitar la reactivación hasta En la actualidad existen cinco modalidades principales de
que se lleve a cabo un reinicio del interruptor. operación de CE: la electroforesis capilar de zona (CZE), también
Los cables de alto voltaje que van desde la fuente de energı́a al conocida como electroforesis capilar de solución libre o flujo libre, la
aparato deben ser preferiblemente de un tipo en el cual un blindaje cromatografı́a electrocinética micelar (MEKC), la electroforesis
de metal trenzado encierre completamente al conductor central capilar en gel (CGE), el isoelectroenfoque capilar (CIEF) y la
aislado y, además, el blindaje debe tener toma a tierra. La base del isotacoforesis capilar (CITP).
aparato debe ser de metal con toma a tierra o contener un borde de En la CZE, las separaciones se controlan a través de las
metal con toma a tierra construido de forma que cualquier fuga de diferencias en las movilidades electroforéticas relativas de los
electrólito produzca un cortocircuito que corte la fuente de energı́a componentes individuales de la muestra o la solución de prueba. Las
antes de que el electrólito pueda salir mas allá de la cubierta diferencias de movilidad dependen de la carga y del tamaño del
protectora. analito bajo las condiciones especı́ficas del método. Se optimizan
Si la fuente de alimentación contiene condensadores como parte mediante el control apropiado de la composición de la solución
de un circuito de filtro, también debe contener una resistencia de amortiguadora, su pH y su fuerza iónica.
derivación para garantizar la descarga de los condensadores antes de En la MEKC, se agregan agentes tensoactivos iónicos a la
que se abra la caja de protección. La existencia de una barra de solución amortiguadora operativa a una concentración superior a su
cortocircuito que se active al abrir la caja puede ser considerada concentración micelar crı́tica. Las micelas proporcionan una fase
como una precaución adicional. pseudoestacionaria en la cual los analitos se pueden particionar. Esta
Dado el riesgo potencial asociado a la electroforesis, el personal técnica es útil para la separación de especies neutras y de iones.
de laboratorio debe estar totalmente familiarizado con el equipo de En la CGE, que es análoga a la filtración en gel, se emplean
electroforesis antes de utilizarlo. capilares rellenos con gel para separar moléculas sobre la base de
diferencias relativas de tamaño y peso molecular. En un principio, se
empleaba para separar proteı́nas, péptidos y oligómeros. Los geles
pueden tener la ventaja de reducir el EOF y también reducir
significativamente la adsorción de las proteı́nas sobre la pared
h727i ELECTROFORESIS interna del capilar, lo que puede mejorar significativamente la
simetrı́a de los picos.
CAPILAR En la CIEF las sustancias se separan sobre la base de sus
diferencias relativas en puntos isoeléctricos. La separación se logra
produciendo zonas de muestra en estado estacionario dentro de un
gradiente de pH en una solución amortiguadora, donde el pH es bajo
La electroforesis se refiere a la migración de especies cargadas en el ánodo y alto en el cátodo. El gradiente se establece mediante la
eléctricamente cuando se las disuelve o suspende en un electrolito aplicación de un voltaje a través del capilar relleno con una mezcla
a través del cual pasa una corriente eléctrica. Los cationes migran de componentes transportadores que consisten en sustancias
hacia el electrodo cargado negativamente (cátodo) mientras que los anfotéricas con diferentes valores de pI.
aniones son atraı́dos hacia el electrodo cargado positivamente La CITP emplea dos amortiguadores del pH que encierran las
(ánodo). Las partı́culas neutras no son atraı́das hacia ninguno de los zonas de analito entre ellas. Se pueden analizar aniones o cationes en
electrodos. zonas claramente separadas. Además, las concentraciones del analito
El uso de capilares como un canal de migración en la son las mismas en cada zona. Por lo tanto, la longitud de cada zona
electroforesis ha permitido a los analistas realizar separaciones es proporcional a la cantidad del analito especı́fico.
electroforéticas a un nivel instrumental comparable al de la Las técnicas de electroforesis capilar más comúnmente utilizadas
cromatografı́a lı́quida de alta resolución (HPLC), aunque con son la CZE y la MEKC, que se describen brevemente en las
algunas diferencias operativas, ventajas y desventajas en relación siguientes secciones. También se tratan los principios generales y la
con la HPLC. Este método de análisis se conoce comúnmente como teorı́a pertinentes, algunas consideraciones sobre el instrumental, el
electroforesis capilar (CE). Durante una tı́pica operación de CE con análisis y las consideraciones y parámetros operativos.
un capilar sin recubrimiento, relleno con una solución amortiguadora
conocida como ‘‘solución amortiguadora operativa’’, los grupos
silanol presentes en la pared interna de los capilares de vidrio liberan PRINCIPIOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR
iones hidrógeno a la solución amortiguadora y la superficie de la DE ZONA
pared se carga negativamente, incluso a un pH bastante bajo. Los
cationes, o los solutos que en el medio posean cargas positivas La CZE usa los principios de la electroforesis y la electroósmosis
parciales, son atraı́dos electrostáticamente a la pared negativamente para lograr la separación de especies cargadas.
cargada formando una capa doble eléctrica. Al inicio de la
electroforesis, la aplicación de un voltaje a través de toda la longitud
del capilar causa que la porción de la solución de la doble capa
eléctrica migre hacia el extremo catódico del capilar, arrastrando
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h727i Electroforesis Capilar 321
(1) La movilidad electroforética de un ión, mEP, se describe se emplea detección al UV. El agente tensoactivo más común para la
mediante la ecuación: electroforesis MEKC es dodecil sulfato de sodio (agente tensoactivo
aniónico). Otros incluyen bromuro de cetiltrimetrilamonio (agente
mEP = q / (6pZr), tensoactivo catiónico) y sales biliares (agente tensoactivo quiral). La
en donde q es la carga del ión, Z es la viscosidad de la solución y r es selectividad de un sistema de electroforesis MEKC depende
el radio del ión hidratado. De esta relación se infiere que los analitos principalmente de la naturaleza del agente tensoactivo. Con
pequeños y altamente cargados tienen movilidades altas y que los frecuencia se agregan disolventes orgánicos a la solución amorti-
analitos grandes, moderadamente cargados, tienen movilidades guadora de MEKC para ajustar los factores de capacidad, como en
bajas. las separaciones HPLC en fase reversa. Se puede emplear la
(2) La velocidad de migración, EP, en cm por segundo, se electroforesis MEKC para la separación de enantiómeros. Para tales
representa por la ecuación: separaciones, se agrega un aditivo quiral a la solución amortiguadora
o se emplea un agente tensoactivo quiral, como por ejemplo una sal
EP = mEP(V / L), biliar.
Un conocimiento general de los principios de la cromatografı́a en
en donde mEP es la movilidad electroforética; V es el voltaje aplicado columna convencional ayuda a comprender los principios de la
y L, en cm, es la longitud total del capilar. MEKC. Sin embargo, en la MEKC las micelas no son realmente
(3) La velocidad del EOF, EO, en cm por segundo, se describe en estacionarias; por lo tanto, se necesita modificar la teorı́a de
la ecuación: cromatografı́a en columna. La principal modificación introducida
EO = mEO(V / L), a los principios de la MEKC es la naturaleza finita de la ventana de
separación para moléculas neutras.
en donde mEO es la movilidad del EOF (el coeficiente de flujo (7) El tiempo de migración, tR, para una especie neutra se expresa
electroosmótico) y los otros términos son los definidos anterior- con la ecuación siguiente:
mente.
(4) El tiempo, t, en segundos, necesario para que un soluto migre tR = (1 + k’)t0 / [1 + (t0 / tMC)],
toda la longitud efectiva del capilar (desde la entrada hasta el en donde t0 es el tiempo requerido para que una sustancia no retenida
detector), l, se representa por la ecuación: recorra la longitud disponible del capilar; tMC es el tiempo necesario
t = l / E(mEP + mEO) = lL / V(mEP + mEO), para que una micela recorra el capilar; k’ es el factor de capacidad y
tR está siempre entre t0 y tMC.
en donde E es la fuerza del campo eléctrico aplicado y los otros (8) El factor de capacidad, k’, para una especie neutra se calcula
términos son los definidos anteriormente. mediante la ecuación: *
(5) La eficiencia de un sistema electroforético puede estar
relacionada con la movilidad y el EOF y estar expresada en función k’ = (tR / t0 – 1) / (1 – tR / tMC),
del número de platos teóricos, N, por la ecuación:
en donde los términos son los definidos anteriormente.
N = (mEP + mEO)V / 2D, (9) Para fines prácticos, k’ se calcula por la ecuación:
en donde D es el coeficiente de difusión del soluto y los otros k’ = tR / t0 – 1,
términos son los definidos anteriormente.
(6) La resolución, R, de dos solutos que eluyen en forma en donde tR es el tiempo medido desde el punto de aplicación de
consecutiva pueden ser definida por la ecuación: voltaje (o inyección) hasta el máximo del pico y t0 se mide desde el
punto de aplicación del voltaje (o inyección) hasta el borde frontal de
la fase móvil o de una sustancia no retenida. En contraste con la
CZE, k’ es significativo en la MEKC y es una caracterı́stica de un
soluto dado en un sistema dado de MEKC. Otras discusiones sobre k’
aparecen más adelante en la sección Aptitud del Sistema en
Parámetros Operativos.
(10) La resolución, RS, para especies neutras se calcula por la
en donde mEP1 y mEP2 son las movilidades de los dos solutos, ecuación:
PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFÍA
ELECTROCINÉTICA MICELAR (MEKC)
en donde a es la selectividad, definida como el cociente entre k’2 y
En la MEKC, el medio de soporte del electrolito contiene un k’1, de las condiciones operativas para separar dos solutos. Si los dos
agente tensoactivo a una concentración superior a su concentración solutos eluyen muy cerca entre sı́ (a 5 1,1), se puede emplear
micelar crı́tica (CMC). En este medio acuoso, el agente tensoactivo cualquier k’. La ecuación indica que, del mismo modo que en la
se autoagrega y forma micelas, en las cuales los grupos de las cromatografı́a convencional, la resolución en MEKC puede
cabezas hidrófilas forman una cápsula externa y las cadenas mejorarse mediante el control de la eficiencia, la selectividad, la
hidrofóbas forman un núcleo no polar donde se pueden particionar retención y la naturaleza quı́mica del sistema de resolución
los solutos. En general, las micelas son aniónicas en su superficie y tensoactivo-medio. El último término de la ecuación se debe al
al aplicar el voltaje migran en dirección opuesta al EOF. Este tipo de intervalo de elución limitado. Aunque la MEKC es particularmente
partición es análoga a la que sucede en la extracción con disolventes útil para la separación de especies neutras, también puede emplearse
o en HPLC en fase reversa. La partición diferencial de las moléculas esta técnica para la separación de solutos cargados. Este último
neutras entre la fase móvil acuosa amortiguada y la fase procedimiento consiste en una combinación de mecanismos de
pseudoestacionaria micelar es el único factor en que se basa la separación cromatográficos y electroforéticos. Puede emplearse la
separación. La solución amortiguadora y las micelas forman un interacción adicional entre los solutos cargados y las micelas para
sistema de dos fases y el analito puede repartirse entre estas dos optimizar una separación. Se pueden formar pares iónicos si las
fases. cargas referentes al agente tensoactivo y al soluto son opuestas; de
Un sistema micelar apropiado para la MEKC reúne los siguientes otra manera, el agente tensoactivo y el soluto se repelen. Estas
criterios: el agente tensoactivo es altamente soluble en la solución diferencias pueden influir significativamente en la separación de
amortiguadora y la solución micelar es homogénea y transparente si moléculas cargadas.
322 h727i Electroforesis Capilar / Pruebas Fı́sicas USP 30
Otra caracterı́stica esencial de la fuente de alimentación es su Efectos del pH—La resolución, la selectividad y la forma del pico
utilidad para introducir una muestra en el extremo catódico o anódico pueden verse considerablemente alteradas por cambios en el pH, ya
del capilar. Ya que resulta poco práctico pasar el detector en lı́nea de que este parámetro afecta el grado de ionización del soluto y el nivel
un extremo del instrumento al otro, es útil poder especificar si el del EOF. El EOF es alto cuando el pH es alto y es bajo cuando el pH
extremo de inyección de la muestra está en el cátodo o el ánodo. es bajo en capilares de sı́lice fundida sin recubrimiento.
Aptitud del Sistema—Los parámetros a medir pueden incluir la muestra ajustando el pH de la solución amortiguadora según sea
reproducibilidad del inyector, la selectividad del sistema, la necesario para que cumpla con los requisitos de aptitud del sistema.
eficiencia del sistema y la asimetrı́a de los picos. La resolución El factor de resolución puede calcularse con la ecuación:
entre los analitos y otros compuestos puede determinarse utilizando
mezclas de prueba estándar. R = 2(t2 – t1) / (W1 + W2),
Los parámetros normalmente utilizados para determinar la aptitud en donde t2 y t1 son los tiempos de migración, medidos en el máximo
del sistema incluyen la desviación estándar relativa (RSD), el factor de los picos, para el pico con la migración más lenta y el pico con la
de capacidad (k’), el número de platos teóricos (N), la sensibilidad migración más rápida, respectivamente; W2 y W1 son los anchos
(lı́mite de detección o cuantificación), el número de platos teóricos correspondientes a estos dos picos medidos en sus bases.
por metro (TPM), el factor de asimetrı́a (T) y la resolución (R).
Se examina en detalle la forma del pico; idealmente, el pico Análisis de la Muestra—Una vez que se haya establecido la
deberı́a ser simétrico, sin hombros y sin excesiva asimetrı́a. Si no se aptitud del sistema de CE, se inyectan alı́cuotas de la Preparación
reúnen estas condiciones, se deben tomar medidas correctivas antes estándar y de la preparación de prueba. Los estándares se inyectan
de proceder con el análisis. También se debe examinar con cuidado antes o después de las muestras y en forma intermitente entre
la integración del pico para asegurarse de que su respuesta sea muestras corridas en serie.
cuantificada correctamente. Manejo de Datos—En los cálculos cuantitativos es frecuente
Pueden emplearse inyecciones repetidas de una Preparación emplear las áreas de los picos normalizadas por tiempo. Éstas se
estándar de concentración conocida para determinar la reproducibi- determinan dividiendo las áreas de los picos por el tiempo de
lidad del sistema de electroforesis capilar. Se emplean datos de cinco migración del analito. Esto se hace para compensar el hecho de que
o más inyecciones repetidas para calcular la desviación estándar cada analito se desplaza a través del detector a una velocidad
relativa RSD. A menos que se especifique algo diferente en la diferente en la CE, cosa que no ocurren en HPLC. A menos que se
monografı́a individual correspondiente, la desviación estándar realice esta normalización, los analitos de migración lenta (que
relativa para inyecciones repetidas no es más de 3,0%. Se pueden migran más tarde) tendrán áreas de pico desproporcionadamente
especificar valores mı́nimos de precisión de las inyecciones en grandes en comparación con las de los componentes que migran
métodos de CE especı́ficos, especialmente cuando se determinan primero.
componentes a nivel de trazas. El cálculo de los parámetros Apagado del Sistema—Después del análisis, debe lavarse el
electroforéticos en la MEKC, como en otras formas de CE, puede capilar según las instrucciones especificadas en cada monografı́a
incluir una combinación de relaciones cromatográficas y electro- o siguiendo las recomendaciones del fabricante. Por ejemplo, se
foréticas. Por lo tanto, el factor de capacidad, k’, para la migración de puede lavar el capilar con agua destilada hasta eliminar los
un analito neutro en MEKC se puede calcular por la ecuación: componentes de las soluciones amortiguadoras y luego se puede
llenar con aire o nitrógeno realizando un enjuague desde un vial
k’ = tR – t0(1 – tR / tMC), vacı́o. Naturalmente, se vacı́a la solución amortiguadora de los viales
en donde tR, t0 y tMC son los tiempos de migración del analito, del de recepción y de origen, denominados viales 4 y 2 en la Figura 1, y
volumen de la solución (EOF) y de la micela, respectivamente. éstos se enjuagan minuciosamente con agua desionizada.
El número de platos teóricos, N, es una medida de la eficiencia del
sistema y se la calcula por la ecuación:
N = 16(tR / W)2 o N = 5,54(tR / W1/ 2)2,
en donde W es el ancho del pico del analito en la lı́nea de base, W1/2 h730i ESPECTROQUÍMICA DE
es el ancho del pico del analito a la mitad de la altura y tR es el
tiempo de migración del analito. PLASMA
El número de platos teóricos por metro, TPM, es una medida de la
eficiencia del capilar en función del ancho del pico en la lı́nea base y
puede calcularse por la ecuación:
Las técnicas instrumentales con plasma que se utilizan en el
TPM = 1600(tR / W)2 / L, análisis farmacéutico se clasifican en dos grandes grupos: por un
lado las técnicas que se basan en plasma inductivamente acoplado y
en donde L, en cm, es la longitud total del capilar y los otros por otro las técnicas en que el plasma se genera en la superficie de la
términos son los definidos anteriormente. El factor de asimetrı́a, T, muestra. La técnica de plasma inductivamente acoplado (ICP, por
del pico del analito es una medida de la simetrı́a del pico y representa sus siglas en inglés) consiste en una fuente de excitación de alta
el grado de desviación de la simetrı́a del pico con respecto a un pico temperatura que desolvata, vaporiza, atomiza, excita e ioniza
gaussiano que es idealmente simétrico. Este factor puede calcularse átomos. Estos átomos e iones del analito excitados se detectan
por la ecuación: posteriormente con una serie de medios espectroquı́micos basados en
el plasma, tales como la espectroscopı́a de emisión atómica de
T = W0,05 / 2f, plasma inductivamente acoplado (ICP–AES, por sus siglas en
en donde W0,05 es la longitud de una lı́nea trazada paralelamente a la inglés), que también se conoce como espectroscopı́a de emisión
base del pico desde el borde frontal hasta el borde posterior del pico óptica de plasma inductivamente acoplado (ICP–OES, por sus siglas
a 5% de la altura del pico y f es la distancia a lo largo de la misma en inglés) y la espectrometrı́a de masas de plasma inductivamente
lı́nea desde el borde frontal del pico, que aparece a la izquierda del acoplado (ICP–MS, por sus siglas en inglés). La ICP–AES y la ICP–
máximo del pico en el electroferograma, hasta la intersección de una MS son técnicas que permiten analizar uno o varios elementos y
lı́nea perpendicular que desciende desde el máximo del pico hasta la constituyen procedimientos generales apropiados, tanto para análisis
lı́nea base. Una relación de 1,0 indica un pico perfectamente secuenciales como para análisis simultáneos, con un amplio
simétrico. Si ocurren efectos electrodispersivos, se pueden generar intervalo lineal y buena sensibilidad.
picos muy asimétricos. Esto puede ocurrir cuando se emplean Una nueva técnica de espectroscopı́a con plasma es la
concentraciones altas de muestra, como por ejemplo las que se espectroscopı́a de descomposición inducida por láser (LIBS, por
emplean para la prueba de impurezas. Es aceptable utilizar picos sus siglas en inglés). La técnica LIBS consiste en calentar
muy asimétricos siempre y cuando sean reproducibles y no directamente la muestra en estado lı́quido, sólido o gaseoso con un
comprometan la selectividad de la separación. láser pulsado, de forma tal que se genera un estado de plasma
El factor de resolución, R, es una medida de la capacidad del transitorio de alta energı́a en que los componentes de la muestra se
sistema capilar para separar dos analitos consecutivos. Se determina reducen a átomos, fragmentos moleculares y grupos más grandes.
la resolución para todos los analitos de interés presentes en la Las emisiones de los átomos y los iones de la muestra se recolectan,
generalmente con fibra óptica y se miden con un detector de matriz,
tal como un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD, por sus
siglas en inglés). La LIBS se puede utilizar para realizar análisis
cualitativos o cuantitativos con una curva estándar de trabajo. Si bien
la industria farmacéutica aún no ha incorporado la utilización
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h730i Espectroquı́mica de Plasma 325
generalizada de la LIBS, es adecuada para realizar mediciones tanto para cada análisis en función de la matriz de la muestra, del analito y
en el área de producción como en el laboratorio, en el lugar fı́sico de la sensibilidad deseada. Algunos nebulizadores son más
o en lı́nea. Su potencial la convierte en una técnica viable para la adecuados para soluciones que contengan concentraciones altas de
espectroquı́mica de plasma en el laboratorio farmacéutico, pero sólidos disueltos, otros, por el contrario, son más adecuados para
como la LIBS es una técnica relativamente nueva, este capı́tulo soluciones orgánicas.
general no la tratará de forma detallada. Una vez que la muestra sale del nebulizador, ingresa en la cámara
de nebulización que está diseñada para seleccionar sólo las gotitas
más pequeñas de la nebulización para que ingresen al plasma. Esta
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA cámara elimina las gotitas más grandes que se generaron durante la
nebulización, de forma que generalmente sólo llega al ICP entre el
La preparación de la muestra es de suma importancia en el análisis 1% y el 2% de la muestra en forma de aerosol. Al igual que con los
mediante técnicas basadas en el plasma y es el primer paso en todo nebulizadores, existen varios tipos de cámaras de nebulización
análisis por CP–AES o ICP–MS. Los resultados de las técnicas con disponibles para ICP–AES o ICP–MS, como por ejemplo la cámara
plasma dependen en gran medida del transporte de la muestra al de nebulización de doble pasaje de Scott y las cámaras de
plasma y como el sistema de introducción de muestra de la ICP–AES nebulización ciclónica con distintas configuraciones. Seleccionar
y la ICP–MS es el mismo, la preparación de las muestras puede ser una cámara de nebulización compatible con la muestra y con el
igual para ambas técnicas. El método más convencional para disolvente, considerando que es necesario que se equilibre y se vacı́e
introducir la muestra en el plasma es por nebulización de la solución. en el menor tiempo posible. Cuando se seleccione una cámara de
Si se emplea la nebulización de la solución, es necesario disolver las nebulización, se considera la naturaleza de la matriz de las muestras,
muestras sólidas para introducirlas en el plasma para su análisis. Las la sensibilidad deseada y el analito.
muestras se pueden disolver en cualquier disolvente apropiado. Hay Además de la nebulización, la otra técnica usada para analizar
una gran preferencia por utilizar soluciones acuosas o diluidas de muestras sólidas es la ablación láser (LA, por sus siglas en inglés).
ácido nı́trico, ya que han demostrado ser sumamente adecuadas por En esos casos, la muestra ingresa directamente a la antorcha. En vista
su interferencia mı́nima en comparación con otros disolventes. Para de las dificultades que presenta la obtención de estándares
disolver la muestra también se pueden emplear peróxido de apropiados, las técnicas de LA–ICP y LA–ICP–MS se consideran
hidrógeno, ácido clorhı́drico, ácido sulfúrico, ácido perclórico, más adecuadas para los análisis cualitativos de compuestos
distintas combinaciones de ácidos o mezclas de ácidos con distintas farmacéuticos. Sin embargo, los análisis cuantitativos se pueden
concentraciones. El ácido fluorhı́drico diluido también se puede realizar siempre y cuando se pueda demostrar que los estándares
utilizar, aunque cuando se emplea es necesario tomar las empleados son satisfactorios. Esto se demuestra mediante una
precauciones necesarias para garantizar la seguridad del analista y validación apropiada del método.
para proteger el equipo. Se pueden emplear otras alternativas para
disolver la muestra, tales como las bases diluidas, disolventes
orgánicos puros o diluidos, combinaciones de ácidos o bases, PREPARACIÓN ESTÁNDAR
o distintas combinaciones de disolventes orgánicos, entre otras.
Cuando se analizan muestras que se introducen en el plasma por Se pueden adquirir soluciones estándar de uno o múltiples
nebulización de la solución, es necesario tener en cuenta las posibles elementos, con concentraciones rastreables a estándares de referencia
interferencias ocasionadas por el disolvente empleado. En todos los primarios, como los del Instituto Nacional de Normas y Tecnologı́a
casos, cuando se analizan muestras por ICP–MS, se debe emplear un (NIST, por sus siglas en inglés), para emplearlas en la preparación de
estándar interno apropiado. Cuando la viscosidad de la muestra soluciones estándar de trabajo. Como alternativa, se pueden preparar
difiere de la del estándar, se debe emplear un estándar interno soluciones estándar a partir de materiales estándar y se determina su
apropiado o con una matriz similar a la de la muestra para su análisis concentración independientemente, según corresponda. Siempre que
por ICP–AES. En todo caso, la selección de un estándar interno sea posible, se deberán emplear soluciones de muestra, blancos y
apropiado debe tener en cuenta el analito en cuestión, la energı́a de estándares tan similares a la matriz como sea posible para reducir al
ionización, las longitudes de onda o las masas y la naturaleza de la mı́nimo las interferencias con la matriz. Cuando no sea posible
matriz de la muestra. homologar la matriz, se recomienda utilizar para la ICP–AES un
Cuando una muestra no es soluble en ninguno de los disolventes estándar interno apropiado o el método de estándar agregado. Las
aceptables, se pueden emplear diversas técnicas de digestión. Entre soluciones blanco y estándar que se van a utilizar en los análisis
ellas cabe mencionar la digestión asistida por calentamiento en placa ICP–MS siempre deben contener un estándar interno apropiado. En
o por microondas, incluidas las digestiones en recipientes cerrados cualquier caso, la selección de un estándar interno apropiado debe
o abiertos. La selección del tipo de técnica de digestión depende de tener en cuenta el analito en cuestión, sus energı́as de ionización, sus
la naturaleza de la muestra a digerir y de los analitos en estudio. longitudes de onda o masas y la naturaleza de la matriz de la
Como algunos metales son volátiles (por ejemplo el mercurio y muestra.
selenio), la digestión por calentamiento en placa o con recipiente
abierto no es apropiada para todos los analitos.
Utilizar ácidos, bases y peróxido de hidrógeno ultra puros. El agua ICP
desionizada debe tener 18 megaohmios como mı́nimo. Verificar las
posibles interferencias del diluyente antes de utilizarlo en un análisis. La fuente de excitación de ICP está compuesta por un suministro
Seleccionar los disolventes orgánicos de la calidad más alta de gas argón, una antorcha, una bobina de inducción de radio-
disponible con respecto al contenido de contaminantes metálicos, frecuencia (RF) y un generador de RF. El gas que se utiliza
ya que no siempre es posible obtener estos disolventes exentos de generalmente en la ICP es el argón, aunque existen otros gases que
metales. se pueden utilizar, según los instrumentos disponibles. No es
frecuente la utilización de gases distintos al argón. La antorcha de
plasma consiste en tres tubos de cuarzo concéntricos, denominados
INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA tubo interno, intermedio y exterior. El flujo del gas nebulizador
ayuda a crear un fino aerosol de la solución de muestra y luego la
Existen dos formas de introducir la muestra en el nebulizador: con muestra pasa a través del tubo interno de la antorcha e ingresa al
una bomba peristáltica o por autosucción. La bomba peristáltica plasma. El tubo intermedio transporta el gas auxiliar. El flujo del gas
garantiza la misma velocidad de flujo de la muestra y de la solución auxiliar ayuda a elevar el plasma y a hacerlo salir de los tubos
estándar hacia el nebulizador, independientemente de la viscosidad intermedio e interno para evitar que el carbono y las sales se fundan
de la muestra. En algunos casos, cuando no es necesario emplear la y se depositen en el tubo interno. El tubo exterior contiene el gas de
bomba peristáltica, puede utilizarse la autosucción. plasma o refrigerante que se utiliza para crear y mantener el plasma.
Existen varios tipos de nebulizadores disponibles: neumáticos El flujo tangencial del gas refrigerante a través de la antorcha
(concéntricos y de flujo cruzado), de rejilla y ultrasónicos. También mantiene el plasma donde debe estar, impidiendo que el ICP se
están disponibles los micronebulizadores, los nebulizadores de alta expanda hacia el tubo exterior y lo llene y que la antorcha se funda.
eficiencia, los nebulizadores de alta eficiencia por inyección directa y Alrededor de la antorcha se encuentra la bobina de inducción RF,
los nebulizadores de inyección de flujo. Seleccionar el nebulizador también denominada bobina de carga, que genera un campo
326 h730i Espectroquı́mica de Plasma / Pruebas Fı́sicas USP 30
magnético oscilatorio. Este campo genera a su vez una corriente fondo de la muestra o del plasma. Los ICP modernos generalmente
oscilatoria en los iones y electrones del argón. La transferencia de cuentan con un dispositivo que permite realizar las correcciones por
energı́a entre la bobina y el argón en la bobina de carga del el fondo y se pueden aplicar varias técnicas de corrección de
generador RF genera un plasma autónomo. Los choques entre los interferencias de fondo. La corrección de fondo simple tı́picamente
iones y electrones del argón ioniza y excitan los átomos del analito consiste en medir la intensidad de la emisión del fondo en algún
que están en el plasma a alta temperatura. La temperatura del plasma punto que no se encuentre cercano al pico principal y restar el valor
es de 6000 a 10 000 K, tal que básicamente todas las uniones obtenido de la señal total. Los modelos matemáticos para restar la
covalentes y las interacciones entre los analitos se han eliminado. señal de interferencia del fondo son otra forma de realizar las
correcciones por el fondo.
La selección de la lı́nea analı́tica es fundamental para lograr el
ICP–AES éxito de un análisis, independientemente de la configuración de la
antorcha o del tipo de detector que se utilice. Si bien algunas
El plasma inductivamente acoplado puede emplearse en sistemas longitudes de onda se consideran como las longitudes de onda
de detección ópticos o de espectrometrı́a de masas. En el primer analı́ticas principales, debido a la infinita variedad de matrices de
caso, ICP–AES, la detección del analito depende de su longitud de muestra, la selección de la longitud de onda analı́tica debe realizarse
onda de emisión. Existe una amplia variedad de sistemas ICP–AES teniendo en cuenta la matriz de la muestra, la composición de la
disponibles con distintas tecnologı́as, cada uno con distintas muestra en sı́, el tipo de instrumento y la sensibilidad necesaria. El
capacidades y con sus propias ventajas y desventajas. Los sistemas analista podrı́a comenzar con las longitudes de onda recomendadas
simultáneos permiten analizar varios elementos al mismo tiempo, por el fabricante del instrumento y luego seleccionar otras longitudes
reduciendo el tiempo de análisis. Los sistemas secuenciales, por el de onda según las recomendaciones del fabricante o en función de
contrario, funcionan con una longitud de onda a la vez y luego pasan las tablas de longitudes de onda publicadas.
a la siguiente y generalmente ofrecen una variedad más amplia de Se pueden optimizar la potencia, las velocidades de flujo del gas y
bandas analı́ticas para seleccionar la de trabajo. Los dispositivos de la posición de la antorcha para mejorar la señal. Cuando se utilizan
acoplamiento de carga y los de inyección de carga, con detectores en disolventes orgánicos, a menudo es necesario utilizar más potencia
un chip, permiten combinar las ventajas de los sistemas secuenciales que con soluciones acuosas y reducir el flujo del gas nebulizador.
y de los simultáneos, analizando rápidamente como en los sistemas Cuando se emplean disolventes orgánicos, puede ser necesario
simultáneos y utilizando el amplio espectro de bandas analı́ticas inyectar pequeñas cantidades de oxı́geno para que no se acumule
como en los sistemas secuenciales. carbón en la antorcha.
Además, el ICP puede orientarse en planos axiales o radiales
(también llamados laterales). En los plasmas axiales, la antorcha se
coloca en posición horizontal y la muestra se visualiza de forma Calibración
‘‘invertida’’. En los plasmas radiales, la antorcha se coloca en
posición vertical y la muestra se visualiza desde un lado. La En las detecciones ICP–AES, la exactitud de la longitud de onda
visualización axial del plasma permite obtener una respuesta más debe cumplir con los requisitos de los procedimientos operativos del
sensible, aunque cuando hay mucha interferencia de la muestra o del fabricante. El instrumento debe estandarizarse para la cuantificación
fondo a la longitud de onda de trabajo, los resultados obtenidos con en el momento de utilizarlo. Las diferencias entre los tipos de
la visualización radial son más confiables. Considerando el amplio instrumentos disponibles no permiten establecer un solo procedi-
rango de concentraciones de elementos en algunas muestras tomadas miento de ‘‘aptitud del sistema’’. Deben efectuarse las pruebas
en el mundo real y teniendo en cuenta los problemas de matrices recomendadas por el fabricante de cada ICP–AES. Estas pruebas
complejas, en muchos casos, la visualización radial puede dar pueden incluir la calibración de la longitud de onda para varios
mejores resultados que la axial o viceversa. Los métodos validados elementos utilizando una solución de referencia, la calibración
con un instrumento de configuración radial no siempre serán cien por interna con mercurio (Hg) y el barrido de picos, entre otras. Verificar
ciento aplicables a un instrumento de configuración axial y el sistema según las recomendaciones del fabricante.
viceversa. Como la ICP–AES es una técnica considerada en general lineal en
También existen sistemas con ambas configuraciones de visuali- el intervalo entre 106 y 108 órdenes de magnitud, no siempre es
zación, lo que permite al analista aprovechar la configuración de necesario demostrar continuamente la linealidad con una curva
antorcha más ventajosa. La selección de la configuración de la estándar. Una vez que el método se ha desarrollado y se emplea de
antorcha es función de la matriz de la muestra, el analito en cuestión, forma rutinaria, el instrumento se puede calibrar con un blanco y un
la longitud de onda analı́tica seleccionada, el costo de la único estándar. Cuando se trata de métodos nuevos, se recomienda
instrumentación, la sensibilidad necesaria y los instrumentos demostrar la linealidad adecuada de las mediciones de prueba en el
disponibles en cada laboratorio. intervalo en cuestión. Se recomienda valorar las concentraciones
Independientemente de la configuración de la antorcha o de la apropiadas de una solución blanco y de estándares que abarquen
tecnologı́a del detector, la ICP–AES es una técnica que proporciona intervalo esperado de concentraciones de la muestra que se analiza-
una medición cuantitativa de la emisión óptica de átomos e iones rá y graficar la respuesta del detector en función de la concentración
excitados a longitudes de onda especı́ficas. Estas mediciones luego del analito. Sin embargo, no siempre es posible analizar un estándar
se utilizan para determinar la concentración del analito en la muestra que abarque estas concentraciones cuando se realiza un análisis del
en estudio. Un átomo excitado emite un conjunto de frecuencias de lı́mite de detección. Esto es aceptable. Es necesario elegir la cantidad
luz caracterı́stico de la transición energética tı́pica de ese elemento. y las concentraciones de las soluciones estándar utilizadas según el
En general, la intensidad de la luz es proporcional a la concentración analito en estudio, la sensibilidad deseada y la matriz de la muestra.
del analito. Es necesario realizar las correcciones por la señal de Se debe evaluar la linealidad de la respuesta del detector por análisis
fondo del plasma. Las concentraciones de la muestra se determinan de regresión de la gráfica del estándar y a menudo las monografı́as
generalmente a partir de una curva de trabajo de estándares individuales exigen ciertos criterios para el error residual de la lı́nea
conocidos con un intervalo de concentraciones similar al intervalo de regresión. En un escenario óptimo, se debe demostrar un
de interés. Sin embargo, es posible realizar una calibración de un coeficiente de correlación para la curva estándar de trabajo no menor
único punto en determinadas circunstancias, como por ejemplo en el de 0,99, u otro valor distinto según se especifique en la monografı́a
caso de las pruebas de lı́mite. individual. Sin embargo, la naturaleza de la matriz de la muestra, el
Como las transiciones entre los niveles de energı́a atómica son o los analitos, la sensibilidad deseada y el tipo de instrumentación
claras las lı́neas de emisión tienen anchos de banda reducidos. Para pueden hacer aceptable un coeficiente de correlación inferior a 0,99.
efectuar la separación de los espectros de lı́neas de emisión En estos casos se recomienda que el analista proceda con sumo
múltiples, es necesario contar con un espectrómetro de alta cuidado y que utilice estándares de trabajo adicionales.
resolución. La decisión respecto a qué lı́nea espectral se va A fin de demostrar la estabilidad del sistema en el perı́odo de
a medir debe incluir una evaluación de las potenciales interferencias análisis transcurrido desde la estandarización inicial, se recomienda
espectrales. En la muestra, todos los átomos se excitan simultánea- volver a determinar las concentraciones de la solución usada para la
mente, de manera que las muestras que contienen múltiples curva estándar inicial, a modo de estándar de verificación,
elementos pueden producir una superposición de espectros. Las a intervalos apropiados según sea necesario durante el análisis de
interferencias espectrales también pueden deberse a emisiones de todo el conjunto de muestras. El analista puede determinar si los
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h730i Espectroquı́mica de Plasma 327
intervalos apropiados son satisfactorios según cada tipo de análisis. estos parámetros incluyen el flujo de gas (velocidades de flujo del
El estándar nuevamente analizado debe concordar con una nebulizador, del plasma y del gas auxiliar), flujo de la muestra,
aproximación de +10% con su valor teórico para el caso de potencia de RF, voltaje del lente de extracción, etc.; o mediante la
análisis de un único elemento, con longitudes de onda analı́ticas utilización de celdas de colisión o de reacción o de plasma frı́o, si
comprendidas entre 200 y 500 nm o con concentraciones de 41 mg estuvieran disponibles en el instrumento. Salvo que el laboratorio
por mL. El estándar nuevamente analizado debe coincidir con su genere o analice isótopos que no existen en la naturaleza, una lista de
valor teórico con una aproximación de +20% para análisis de varios isótopos naturales proporciona al analista isótopos aceptables para
elementos, con longitudes de onda analı́ticas de 5200 o 4500 nm fines analı́ticos. Además, existen tablas de interferencias comunes y
o con concentraciones de 51 mg por mL. Si la monografı́a de interferencias isobáricas poliatómicas con factores de corrección.
individual proporciona pautas diferentes para el nuevo análisis del La ICP–MS es generalmente más sensible que la ICP–AES. Una
estándar de verificación, rige lo que especifica la monografı́a. de las grandes ventajas de la ICP–MS en la determinación de
concentraciones muy bajas de un analito o cuando es necesario
eliminar las interferencias de la matriz, es la capacidad del
Procedimiento espectrómetro de masas de determinar los valores de un solo ión
con una relación masa/carga especı́fica. A menudo, empleando la
Utilizar los parámetros del instrumento especificados en la ICP–MS los analitos se pueden detectar a concentraciones de ng por
monografı́a individual. Sin embargo, debido a las diferencias en litro (ppt).
las configuraciones de los equipos, los parámetros por defecto El éxito de un análisis depende de la selección correcta de la masa
especificados por cada fabricante pueden emplearse y modificarse analı́tica, independientemente del diseño del instrumento. Si bien
según sea necesario. Aunque una monografı́a especifique los algunas masas se consideran las masas analı́ticas por excelencia, la
parámetros a utilizar, se pueden utilizar otros parámetros operativos gran variedad de matrices de la muestra imposibilita recomendar una
adecuados y ajustar las condiciones de trabajo cuando sea necesario. masa especı́fica para un elemento dado. La selección de la masa
Pero sı́ es necesario contar con información validada que respalde la analı́tica siempre se realiza en función de la matriz de la muestra, el
utilización de otras condiciones; para fines oficiales, las condiciones tipo de instrumento y la sensibilidad necesaria. El analista podrı́a
especificadas en la monografı́a tienen precedencia. La información comenzar con las masas recomendadas por el fabricante del
obtenida de cada introducción de una única muestra se considera un instrumento y luego seleccionar otras masas según las recomenda-
único resultado. Este puede ser el promedio de lecturas secuenciales ciones del fabricante o en función de las tablas de isótopos naturales
y repetidas de una única introducción de la solución del estándar publicadas.
apropiado o de las preparaciones de la muestra. Calcular las La optimización de un método de ICP–MS depende de los
concentraciones de la muestra en función de la curva estándar de parámetros del plasma y el medio de introducción de la muestra.
trabajo; se grafica la respuesta del detector contra la concentración Estos instrumentos permiten regular la potencia, las velocidades de
del analito en las preparaciones estándar. Normalmente el instru- flujo del gas y la posición de la antorcha a fin de obtener la señal más
mento hace este cálculo. adecuada. Cuando se utilizan disolventes orgánicos, a menudo es
Cuando la interferencia de la matriz lleva a una determinación necesario utilizar más potencia que con soluciones acuosas y reducir
inexacta del analito, se puede emplear el método de adición de el flujo del gas nebulizador. En algunos casos es necesario agregar
estándar o el método de estándar interno. El método de adición de pequeñas cantidades de oxı́geno en el gas auxiliar para que no se
estándar implica agregar una concentración conocida del elemento deposite carbón en la antorcha. Con algunos disolventes orgánicos
analito a distintas concentraciones. La respuesta del instrumento se puede ser necesario usar conos de muestreo o de selección con punta
grafica en función de la concentración del elemento analito agregado de platino para disminuir la degradación del cono.
y se traza la recta de regresión lineal a través de los datos. La
concentración del analito en la muestra se obtiene por multiplicación
del valor absoluto de la intersección en el eje x por el factor de Calibración
dilución que corresponda.
En las determinaciones por ICP–MS, la exactitud del espectro de
masas debe estar de acuerdo con lo indicado en los procedimientos
ICP–MS operativos aplicables. Se debe estandarizar el instrumento para la
cuantificación en el momento de utilizarlo. La variedad de
Cuando el plasma inductivamente acoplado emplea un sistema de instrumentos disponibles y las caracterı́sticas propias de cada uno
detección de espectrometrı́a de masas, la técnica se denomina de de ellos no permiten establecer un procedimiento de ‘‘aptitud del
plasma inductivamente acoplado y espectrometrı́a de masas (ICP– sistema’’ general. Se deben consultar las pruebas recomendadas por
MS, por sus siglas en inglés). La detección del analito en esta técnica el fabricante de cada instrumento de ICP–MS. Estas pruebas pueden
depende de la masa de los distintos componentes elementales de la incluir, de manera no taxativa, la puesta a punto con una o más
muestra. La ICP–MS es un técnica para la detección de elementos, masas de referencia, el barrido de picos y la calibración másica. Se
en la cual la muestra se descompone en iones por la intensidad debe verificar el sistema según las recomendaciones del fabricante
térmica de la fuente de plasma. Al igual que en la ICP–AES, las del instrumento.
diferencias en las tecnologı́as resultan en una amplia variedad de La técnica ICP–MS se considera en general lineal en el intervalo
sistemas ICP–AES. comprendido entre 106 y 108 órdenes de magnitud, por lo que no
Los sistemas más comunes son los de cuadrupolo. Los sistemas de siempre es necesario demostrar continuamente la linealidad con el
ICP–AES de "tiempo de vuelo" cobran cada vez mayor importancia. uso de una curva estándar. Una vez que el método está establecido y
Si bien aún no se utilizan ampliamente, es muy probable que se emplea de forma rutinaria, generalmente el instrumento se calibra
aumente su uso en el futuro. Adicionalmente, también existen, y con un blanco y un único estándar. Cuando se trata de métodos
están disponibles, instrumentos de alta resolución. nuevos, se recomienda demostrar una linealidad adecuada de las
La ICP–AES, cualquiera sea el diseño o la configuración del mediciones de prueba en el intervalo en cuestión. Se recomienda
instrumento, es una técnica que proporciona una medida cuantitativa valorar la solución blanco y los estándares apropiados cuyas
de los componentes de la muestra. Los átomos del analito generan concentraciones comprendan el intervalo de concentraciones de la
iones por efecto del plasma. Estos iones se extraen del plasma por el muestra y graficar la respuesta del detector en función de la
cono de muestreo. El cono de selección, ubicado detrás del cono de concentración del analito. La selección de la cantidad y las
muestreo ‘‘selecciona’’ los iones que emergen del cono de muestreo concentraciones de las soluciones estándar utilizadas se realizara
y luego pasan al espectrómetro de masas. Allı́ los iones se separan en según el analito en estudio, la sensibilidad deseada y la matriz de la
un campo magnético según su relación masa-carga: (m/z). El muestra y quedan a criterio del analista. En un escenario óptimo, se
intervalo de masas de ICP–MS comprende hasta 240 unidades de debe demostrar un coeficiente de correlación para la curva estándar
masa atómica (uma). Según la configuración del equipo, los aductos de trabajo no menor de 0,99 u otro valor distinto según se
que forman la muestra reaccionan con los diluyentes o sus productos especifique en la monografı́a individual. Al igual que anteriormente,
de descomposición, óxidos e iones elementales de carga múltiple la naturaleza de la matriz de la muestra, el o los analitos, la
aumentan la complejidad de los espectros de masa resultantes. La sensibilidad deseada y el tipo de instrumentación disponible pueden
optimización de los parámetros operativos reduce las interferencias;
328 h731i Pérdida por Secado / Pruebas Fı́sicas USP 30
resultar en un coeficiente de correlación inferior a 0,99. En estos CELDA DE COLISIÓN: Caracterı́stica de diseño de los instrumentos
casos se recomienda que el analista proceda con sumo cuidado y que de ICP–MS. Las celdas de colisión permiten eliminar o reducir a un
utilice estándares de trabajo adicionales. mı́nimo las interferencias causadas por el argón y facilitan el análisis
A fin de demostrar la estabilidad del sistema en el perı́odo de de los elementos que podrı́an estar afectados por esas interferencias.
análisis transcurrido desde la normalización inicial, se recomienda GAS REFRIGERANTE O DE PLASMA: El gas refrigerante constituye
volver a determinar las concentraciones de la solución a partir de la la fuente principal de suministro de gas para el plasma.
cual se trazó la curva estándar inicial, a modo de estándar de PLASMA FRÍO: Condiciones para el plasma empleado por ICP–MS
verificación, a intervalos apropiados según sea necesario durante el que producen un plasma más frı́o que lo habitual para estos análisis.
análisis de todo el conjunto de muestras. Se pueden establecer Este plasma más frı́o se obtiene utilizando menos potencia y reduce
intervalos apropiados, como por ejemplo cada 5 ó 10 muestras al mı́nimo las interferencias isotópicas causadas por el argón.
o según lo considere satisfactorio el analista, teniendo en cuenta el
POTENCIA: El número de vatios necesario para encender el gas y
tipo de análisis en cuestión. El estándar nuevamente analizado debe
concordar con una aproximación de +10% con su valor teórico para mantener el plasma durante un análisis. Los requisitos de potencia
el caso de análisis de un único elemento, con masas analı́ticas varı́an según la matriz de la muestra y cada analito.
exentas de interferencias o con concentraciones de 41 ng por mL. ESTÁNDAR INTERNO: El elemento que se agrega o está presente en
El estándar nuevamente analizado debe concordar con su valor la misma concentración en los blancos, estándares y muestras, y se
teórico con una aproximación de +20% para análisis de múltiples usa como referencia de intensidad en el análisis. Es un requisito
elementos o cuando las concentraciones son de 51 ng por mL. Si la indispensable en los análisis cuantitativos por ICP–MS y optativo
monografı́a individual proporciona pautas diferentes para el nuevo para trabajar con ICP–AES
análisis del estándar de verificación, rige lo que especifica la VISUALIZACIÓN LATERAL: Ver Visualización Radial.
monografı́a. m: La masa del ión en estudio.
IONES CON CARGA MÚLTIPLE: Átomos que se convierten en iones
con carga doble o triple (X++ o X+++, etc.) cuando se someten
Procedimiento a energı́as de ionización altas, de forma tal que cuando se detectan
por MS la masa aparente es la ½ o 13 de la masa atómica.
Utilizar los procedimientos que se indican en la monografı́a NEBULIZADOR: El dispositivo que se utiliza para transformar la
individual para el modo de detección y los parámetros del muestra en un aerosol homogéneo que se mezcla con el argón.
instrumento. Aunque una monografı́a especifique los parámetros
GAS NEBULIZADOR: Una de las tres zonas por donde fluye el argón
definitivos a utilizar, esto no impide utilizar otros parámetros
operativos adecuados ni tampoco ajustar las condiciones operativas en la antorcha. El gas nebulizador se emplea para nebulizar la
cuando sea necesario. Pero sı́ es necesario contar con información solución de la muestra, formando una neblina de finı́simas partı́culas,
validada adecuada que respalde la utilización de otras condiciones, y que luego pasa al tubo central de la antorcha para ingresar al plasma.
para fines oficiales, las condiciones especificadas en la monografı́a GAS DE PLASMA: Ver también Gas Refrigerante.
tienen precedencia. Sin embargo, considerando las diferencias que VISUALIZACIÓN RADIAL: Configuración del plasma en la técnica
existen en las configuraciones de los equipos de cada fabricante, el de AES en la que el plasma está orientado ortogonalmente al
analista puede preferir comenzar con los parámetros por defecto recorrido óptico del espectrómetro, también conocida con el nombre
especificados por el fabricante y modificarlos si fuera necesario. La de ‘‘visualización de lado’’. Ver también Visualización Lateral.
información obtenida de cada introducción de una única muestra se CELDA DE REACCIÓN: Es similar a la celda de colisión.
considera un único resultado. Promediar los datos obtenidos de Está diseñada para reducir o eliminar las interferencias.
lecturas secuenciales y repetidas de una única introducción de la CONO DE MUESTREO: Un cono de metal (generalmente con la
preparación muestra o del estándar apropiado y obtener un único punta de platino, aluminio o nı́quel) con una pequeña abertura
valor. Calcular las concentraciones de la muestra en función de la a través de la cual fluye la muestra ionizada una vez que emergió del
curva estándar de trabajo obtenida graficando la respuesta del plasma.
detector en función de la concentración del analito en las
preparaciones estándar. En general, los instrumentos más modernos SECUENCIAL: Una de las posibles configuraciones para la AES
cuentan con dispositivos que realizan este cálculo. Promediar los donde las lı́neas de emisión discretas se observan mediante un
datos obtenidos de dos o tres lecturas secuenciales de una única barrido del intervalo espectral con un monocromador.
introducción de la solución de las preparaciones de la muestra o del SIMULTÁNEA: Una de las configuraciones posibles para la AES
estándar apropiado y obtener un único valor. Calcular las donde las lı́neas de emisión escogidas se observan al mismo tiempo
concentraciones de la muestra en función de la curva estándar de con un policromador, con lo cual aumenta la velocidad del análisis
trabajo obtenida graficando la respuesta del detector en función de la para muestras con varios elementos.
concentración del analito en las preparaciones estándar. Los CONO DE SELECCIÓN: Un cono metálico con una abertura de
instrumentos más modernos cuentan con dispositivos que realizan menor tamaño que la del cono de muestreo, por donde fluye la
este cálculo. muestra luego de pasar por el cono de muestreo y antes de ingresar
Cuando las interferencias de la matriz pueden dar como resultado a la zona de vacı́o de ICP–MS.
una determinación poco precisa del analito, emplear el método de ESTÁNDAR AGREGADO: Método que se utiliza para determinar la
adiciones de estándar. Este método implica agregar una concentra- concentración real del analito en la muestra cuando la viscosidad
ción conocida del elemento analito a distintos niveles de concentra- puede causar determinaciones erróneas.
ción de la muestra. La respuesta del instrumento se grafica en
ANTORCHA: Serie de tres tubos de cuarzo concéntricos donde se
función de la concentración del elemento analito agregado y se traza
la recta de regresión lineal por los puntos de datos. La concentración genera el plasma inductivamente acoplado.
del analito en la muestra se obtiene multiplicando el valor absoluto
del punto donde la recta corta el eje x por el factor de dilución que
corresponda.
Mezclar y pesar con exactitud la sustancia a analizar y, a menos emplear un crisol adecuado, completo con su tapa, previamente
que se especifique algo diferente en la monografı́a individual, incinerado durante 1 hora a la temperatura especificada para la
realizar la determinación en 1 a 2 g. Si la muestra de prueba estuviera prueba, enfriado en un desecador y pesado con exactitud.
en forma de cristales grandes, reducir el tamaño de las partı́culas A menos que se especifique algo diferente en la monografı́a
aproximadamente a 2 mm triturando rápidamente. Tarar un frasco individual, transferir al crisol tarado una cantidad pesada con
para pesada con tapón de cristal, de poca profundidad, que se haya exactitud, en g, de la sustancia que se va a analizar, aproximada-
secado durante 30 minutos en las mismas condiciones que deben mente igual a la calculada por la fórmula:
emplearse en la determinación. Colocar la muestra a analizar en el
frasco, volver a colocar el tapón y pesar con exactitud el frasco y el 10 / L
contenido. Distribuir la muestra a analizar tan uniformemente como en donde L es el lı́mite (o el valor de la media de los lı́mites) para la
sea posible agitando suavemente hacia los lados, hasta lograr una Pérdida por incineración, en porcentaje. Incinerar el crisol
profundidad de aproximadamente 5 mm por lo general, y no más de destapado cargado y cubrir a la temperatura (+258) y durante el
10 mm en caso de materiales voluminosos. Colocar el frasco cargado periodo de tiempo indicado en la monografı́a individual. Incinerar
en la cámara de secado, retirando el tapón y dejándolo también en la durante periodos sucesivos de 1 hora cuando se indique incineración
cámara. Secar la muestra de prueba a la temperatura y durante el hasta peso constante. Una vez completada cada incineración, cubrir
tiempo especificado en la monografı́a. [NOTA—La temperatura el crisol y dejar enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente
especificada en la monografı́a debe considerarse comprendida en antes de pesar.
el intervalo de +28 la cifra especificada.] Al abrir la cámara, cerrar
rápidamente el frasco, permitiendo que llegue a temperatura
ambiente en un desecador antes de pesarlo.
Si la sustancia se funde a una temperatura inferior a la que se
especifica para la determinación de la Pérdida por secado, mantener
el frasco y sus contenidos durante 1 a 2 horas a una temperatura de h736i ESPECTROMETRÍA DE
58 a 108 inferior a la temperatura de fusión y luego secar a la
temperatura especificada. MASAS
Si se deben analizar Cápsulas, utilizar una porción del contenido
mezclado de no menos de 4 cápsulas.
Si se deben analizar Tabletas, utilizar no menos de 4 tabletas
trituradas hasta convertirlas en polvo fino. Un espectrómetro de masas genera iones a partir de la sustancia en
En caso de que la monografı́a individual indique que la pérdida análisis, los separa en función de su relación masa/carga (m/z) y
por secado debe determinarse mediante análisis termogravimétrico, registra la abundancia relativa de cada especie iónica presente. El
utilizar una electrobalanza sensible. instrumento consta de tres componentes principales (ver Figura 1):
En el caso de que la monografı́a individual indique secado al vacı́o una fuente de iones para producir iones gaseosos a partir de la
sobre un desecador, utilizar un desecador al vacı́o, una pistola de sustancia en estudio, un analizador para resolver los iones en función
secado al vacı́o u otro aparato de secado al vacı́o adecuado. de sus masas caracterı́sticas según la razón entre sus masas y sus
En el caso de que se especifique secado en un desecador, debe cargas, y un sistema de detección para detectar los iones y registrar la
tenerse especial cuidado para asegurarse de que el desecante se abundancia relativa de cada una de las especies iónicas resueltas.
mantiene siempre completamente eficaz mediante su recambio Además, se necesita un sistema de introducción de muestras que
frecuente. permita el ingreso de las mismas al generador de iones, mientras se
En caso de que la monografı́a individual indique secar en un mantienen las exigencias de alto vacı́o (10–6 a 10–8 mm de
frasco con tapón de perforación capilar,* utilizar un frasco o tubo con mercurio) que la técnica requiere, y se necesita una computadora
un tapón con un capilar de 225 + 25 mm de diámetro y mantener la para controlar el instrumento, obtener y manipular los datos y
cámara de calentamiento a una presión de 5 mm o menos de comparar los espectros con bibliotecas de referencia.
mercurio. Al final del periodo de calentamiento, dejar entrar aire
seco a la cámara de calentamiento, retirar el frasco con el tapón de
perforación capilar todavı́a en su sitio, permitir que se enfrı́e en un
desecador antes de pesar.
Las sustancias que están en estado gaseoso o lı́quido a temperatura partı́culas como por ejemplo el bombardeo con atómos acelerados de
ambiente y a presión atmosférica, pueden introducirse en la cámara flujo continuo (CF-FAB, por sus siglas del inglés continous-flow fast
de ionización como un haz neutro mediante un sistema de paso atomic bombardment).
controlable. Los compuestos volatilizables disueltos en lı́quidos
o adsorbidos en sólidos pueden extraerse y concentrarse con un
analizador de vapor confinado en el espacio superior (headspace). INTERFASE DE HAZ DE PARTÍCULAS
Los vapores se arrastran desde la matriz sólida o lı́quida con una
corriente de gas transportador y se retienen en una columna de El disolvente se elimina de un aerosol del efluente cromatográfico
adsorción. Los vapores atrapados se desorben luego mediante de lı́quidos y las moléculas del analito neutro se introducen en la
calentamiento programado de la trampa y se introducen en el fuente de iones del espectrómetro de masas, donde se ionizan
espectrómetro de masas mediante una conexión capilar. mediante ionización por electrones (EI, del inglés Electronic
Para sólidos volatilizables, el método de introducción de muestra Ionization) o ionización quı́mica (CI, del inglés Chemical Ioniza-
más frecuente es la sonda de inserción directa. En esta técnica, la tion). Los espectros resultantes son por lo tanto espectros clásicos de
muestra se coloca en un crisol pequeño que se encuentra en el EI o CI y el primero brinda una gran información estructural. Existen
extremo de una sonda, y se calienta a alto vacı́o muy cerca de la limitaciones con respecto a la polaridad, labilidad térmica y peso
fuente de iones. En una variante de esta técnica, las muestras se molecular, por lo que esta técnica es más apropiada para pequeñas
desorben desde un alambre dentro de la cámara de ionización moléculas orgánicas con pesos moleculares de menos de 1000
mediante un calentamiento rápido, o con la ayuda de un rayo láser. daltons.
Las técnicas de desorción, combinadas con la ionización por
electrones, quı́mica o de campo, son las preferidas para el análisis
de muestras sensibles al calor o poco volátiles. TERMOSPRAY
Las técnicas de introducción de muestras que implican la
expulsión de moléculas cargadas desde la superficie de muestras El compuesto de interés disuelto en una fase móvil con
sólidas incluyen el método de desorción por campo y diversas amortiguadores del pH volátiles, como por ejemplo, el acetato de
técnicas de desprendimiento por bombardeo (sputtering), en las que amonio, se hace pasar a través de una tuberı́a de calibre estrecho
las muestras se bombardean con fotones de alta energı́a, con un haz caliente directamente en la fuente de iones de un espectrómetro de
de iones primarios o con un haz de partı́culas neutras. De manera masas. La solución se vaporiza en la tuberı́a y los iones del analito se
similar, los iones pueden expulsarse desde soluciones mediante el desorben e incorporan a la fase gaseosa y luego se introducen en el
bombardeo con un haz de iones primarios o por una de las diversas analizador de masas. Las moléculas de analito neutro de la fase
técnicas de rociado descritas a continuación. gaseosa pueden sufrir una ionización quı́mica al reaccionar con los
Los cromatógrafos de gases y lı́quidos son ampliamente usados iones del amortiguador de pH en fase gaseosa, como por ejemplo
como dispositivos para la introducción de muestras en los NH4+. El termospray es compatible con velocidades de flujo
espectrómetros de masas. Dichos cromatógrafos proporcionan una relativamente elevadas de 1 a 2 mL por minuto, con disolventes
purificación inicial de la muestra, dado que sólo se necesita que contienen un alto porcentaje de agua y con muchos tipos de
introducir en el espectrómetro de masas la porción del efluente analitos polares. Es posible que ocurra degradación térmica, ya que
cromatográfico que contiene el compuesto de interés. Las combina- los analitos están expuestos a temperaturas relativamente altas
ciones cromatografı́a de gases/espectrometrı́a de masas (GC/MS) y durante el proceso de volatilización.
cromatografı́a de lı́quidos/espectrometrı́a de masas (LC/MS) son
valiosas herramientas para la identificación de impurezas descono-
cidas en fármacos. Estos métodos combinados tienen la capacidad de ELECTROSPRAY
separar mezclas complejas con la posibilidad de obtener información
estructural acerca de los componentes individuales. La fase móvil se rocı́a a través de una pequeña abertura (la punta
de una aguja) que se mantiene a un potencial de varios kilovoltios.
Las gotitas cargadas ası́ producidas se desolvatan mediante el pasaje
Cromatografı́a de Gases/Espectrometrı́a de Masas a través de un gas seco y los iones resultantes se inyectan
directamente a alto vacı́o en el analizador a través de un orificio
Los efluentes de los cromatógrafos de gases se encuentran en o capilar de vidrio. El electrospray clásico se limita a velocidades de
estado de vapor y pueden introducirse directamente en el flujo de 1 a 5 mL por minuto y por lo tanto es compatible con las
espectrómetro de masas. Inicialmente, se usaban dispositivos para técnicas de HPLC en columnas de calibre pequeño (microbore) y
separar los gases de transporte y de ese modo superar la diferencia de con las técnicas de derivatización en post-columna.
varios órdenes de magnitud entre las presiones operativas de ambos Los iones pueden adquirir múltiples cargas, de modo que el valor
sistemas. Sin embargo, con el advenimiento de las columnas m/z de las sustancias de alto peso molecular entrará en el intervalo
capilares para cromatografı́a de gases y las bombas de vacı́o de útil de la mayorı́a de los analizadores de masas cuadrupolares o de
alta capacidad para espectrómetros de masas, los efluentes sector magnético (m/z 5 4000). Analitos con peso molecular de
cromatográficos de gases ahora se introducen directamente en la hasta 150 000 daltons pueden analizarse con éxito de esta manera.
cámara de ionización.
ROCIADO IÓNICO
Cromatografı́a de Lı́quidos/Espectrometrı́a de
Masas Es una variante del electrospray donde se usa la nebulización con
un flujo de gas para ayudar a la formación de microgotas de fase
Esta técnica resulta particularmente útil para analizar materiales móvil. La técnica puede extender el lı́mite superior de las
que no pueden analizarse mediante GC/MS debido a inestabilidad velocidades de flujo utilizables a 0,1 mL por minuto. Con ambas
térmica, elevada polaridad o elevado peso molecular. Los compues- técnicas deben usarse amortiguadores del pH volátiles.
tos de interés biológico, como por ejemplo los fármacos y sus
metabolitos, las sustancias endógenas polares y las macromoléculas
—incluidos péptidos, proteı́nas, ácidos nucleicos y oligosacáridos— TÉCNICAS DE DESORCIÓN
con frecuencia se pueden clasificar en una de estas categorı́as.
Las interfases LC/MS disponibles actualmente abarcan una La cromatografı́a de lı́quidos por microflujo puede también
variedad de enfoques para separar el compuesto de interés de la acoplarse con técnicas de desorción inducida por partı́culas como
fase móvil de la cromatografı́a de lı́quidos y transformarlo en una por ejemplo el bombardeo con atómos acelerados (FAB, del inglés
especie ionizada apta para la espectrometrı́a de masas. Entre éstos se fast atomic bombardment) y la espectrometrı́a de masas de iones
incluyen dispositivos de transporte como por ejemplo el haz de secundarios de lı́quidos (LSIMS del inglés liquid secondary ion mass
partı́culas, diversas técnicas de rociado incluido el termospray, el spectrometry), descritas en la siguiente sección sobre técnicas de
electrospray y el rociado iónico, ası́ como la desorción inducida por ionización. Normalmente, el efluente de una columna, que fluye
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h736i Espectrometrı́a de Masas 331
a una velocidad de 1 a 10 mL por minuto, se mezcla con un pequeño Bombardeo con Atómos Acelerados (FAB)
porcentaje de lı́quido no volátil como por ejemplo glicerol. La
mezcla se introduce mediante una entrada capilar en un objetivo La muestra se ioniza por el bombardeo con un haz de átomos de
dentro de la fuente de iones, donde se bombardea con átomos o iones xenón de alta velocidad producido por el intercambio con iones de
de alta energı́a (5 a 20 keV). Los espectros resultantes son similares xenón altamente acelerados en una celda de colisión. El proceso se
a los espectros de FAB o LSIMS, pero con el fondo de la matriz de resume del siguiente modo:
muestra reducido en gran medida. Frit-FAB es una variante de FAB
en flujo continuo, donde la muestra se introduce a través de un foco
de material sinterizado.
TÉCNICAS DE IONIZACIÓN
Impacto de Electrones
donde las flechas en subı́ndice señalan las partı́culas en movimiento
Las moléculas de la muestra en análisis entran en la cámara de rápido.
ionización en estado de vapor. Se producen iones positivos mediante FAB es una técnica de análisis de superficie y se debe tener
el impacto con un haz de electrones procedente de filamentos de cuidado durante la preparación de la muestra para optimizar el estado
tungsteno o renio sobre el vapor, que se mantiene a una presión de de la superficie. Cuando la muestra se deposita sobre una sonda por
10–4 a 10–6 mm de mercurio. Siempre que la energı́a del haz de evaporación de una solución, el haz de iones que se obtiene de la
electrones sea mayor que el potencial de ionización de la sustancia, muestra es a menudo transitorio. Los aductos moleculares con
la muestra se ioniza y/o fragmenta, según se indica mediante la metales alcalinos, como por ejemplo (M + Na) y (M + K), favorecen
siguiente ecuación: la formación de iones. Este fenómeno se usa para favorecer la
ionización de moléculas biológicas. Ası́, el tratamiento de la
superficie de la muestra con cloruro de sodio puede mejorar el
rendimiento de aductos iónicos. El calentamiento de la muestra
durante el análisis puede también incrementar el rendimiento iónico.
El rendimiento decreciente de los iones de muestra obtenidos
durante el análisis se debe probablemente a la destrucción de la
superficie de la muestra. En efecto, la superficie puede remplazarse
continuamente disolviendo la muestra en un lı́quido no volátil
adecuado y recubriendo la parte superior de la sonda con la mezcla.
Mediante el uso de este método, la vida de las muestras en la fuente
Ionización Quı́mica (CI) se ha extendido a más de 1 hora y se ha expandido el rango de
compuestos que pueden someterse al análisis por FAB. La larga
En este proceso, un reactivo gaseoso a una presión entre 0,1 a 10 duración de las muestras y las mayores sensibilidades ası́ logradas
mm de mercurio ingresa en la cámara y se ioniza por un haz de hacen del FAB una técnica espectral de masas importante para el
electrones o una descarga de alta energı́a. A estas presiones, ocurren análisis bioquı́mico, ya que proporciona la fórmula elemental de la
reacciones entre iones y moléculas y los iones primarios del gas muestra mediante la determinación de la masa exacta. Otra ventaja
reactivo reaccionan aún más. Los reactivos gaseosos más común- de FAB, a diferencia de CI, es la presencia de iones fragmentados
mente usados son metano, isobutano y amonı́aco. Las reacciones dentro de los espectros, lo que ayuda en la elucidación estructural.
tı́picas para el metano se muestran en las siguientes ecuaciones: Recientemente, el bombardeo con átomos neutros ha sido
reemplazado por el bombardeo con iones de cesio. Aunque a esta
técnica se la conoce todavı́a como FAB, la describe más
correctamente la denominación de espectrometrı́a de masas de
iones secundarios de lı́quidos (LSIMS).
En los diversos procesos de ionización descritos anteriormente se
forman iones negativos y positivos, y ambos son fácilmente
analizables con los espectrómetros de masas modernos. Las muestras
con alta capacidad de captura electrónica, particularmente aquéllas
que contienen átomos de halógenos, producen abundantes iones
negativos. Por esta razón, a menudo se preparan derivados
La especie CH5+ es un ácido fuerte de Bronsted y transfiere halogenados de los compuestos objeto de estudio. La espectrometrı́a
fácilmente un protón a la mayorı́a de los compuestos orgánicos de masas de iones negativos se ha aplicado con éxito en el análisis de
residuos de plaguicidas, dado que las estructuras de dichos
compuestos se adecuan bien a esta técnica.
ANALIZADORES
En el caso del metano, el ion protonado (MH)+ formado inicialmente Los analizadores de masas separan las especies cargadas en la
puede ser lo suficientemente energético para disociarse posterior- muestra ionizada según sus razones m/z y de ese modo permiten
mente. determinar la masa y abundancia de cada especie. Los cuatro
analizadores más frecuentes son el analizador de sector magnético, el
cuadrupolo, el de tiempo de vuelo y el analizador por la
transformada de Fourier.
tanto en su dirección de desplazamiento como en la dirección del desplazándose más rápidamente los iones más livianos y alcanzando
campo magnético y ası́ desvı́an el haz. El movimiento de cada ion se el detector en un perı́odo de tiempo menor. El tiempo de vuelo esa
describe por dado por
El concepto básico de MS/MS implica la capacidad para Los fragmentos iónicos son los que se producen a partir del ion
determinar la relación de masa entre un ion precursor en MS1 y molecular mediante diversos procesos de ruptura de enlaces.
un ion producto en MS2. Se pueden investigar diferentes relaciones Numerosos artı́culos de la literatura relacionan los patrones de
de masas dependiendo de cómo se efectúe el barrido en MS1 y MS2. ruptura de enlaces (patrones de fragmentación) con la estructura
Entre dichas relaciones se encuentran la fragmentación de un molecular.
precursor y la medición de todos sus fragmentos (un barrido de Además de la medición de la masa de un ion molecular y sus
producto), la selección de múltiples precursores y la evaluación de fragmentos iónicos asociados, los espectrómetros de masas se usan
un fragmento común (un barrido de precursor), o un barrido para también para cuantificar compuestos con un alto grado de
determinar si, de una serie de precursores, todos pierden la misma selectividad, precisión y exactitud. Los compuestos se introducen
especie neutra (un barrido de pérdida neutra constante). en el espectrómetro de masas mediante la sonda de inserción directa,
La fragmentación del ion precursor puede inducirse por la entrada de gas o, lo que es más común, mediante interfases
transferencia de impulso mediante colisiones con moléculas de gas cromatográficas de gases o de lı́quidos que purifican la muestra. La
y superficies sólidas o por excitación electrónica por medio de un ionización puede ser por EI, CI, FAB, termospray o electrospray y
láser. Estas técnicas se conocen como disociación inducida por separación de masas por espectrómetros de masas de sector
colisiones, disociación inducida por superficies o disociación magnético, cuadrupolo o cuadrupolo de trampa de iones. La
inducida por láser, respectivamente. Se conoce como descomposi- espectrometrı́a de masas cuantitativa implica la medición de la
ción metaestable a la fragmentación del ion sin activación adicional. abundancia de un ion especı́fico o conjunto de iones y la relación de
Existen muchas aplicaciones de MS/MS para los problemas la respuesta con un estándar conocido. Pueden usarse estándares
farmacéuticos. Los barridos de los productos pueden usarse para externos o internos, pero se prefieren estos últimos para una mayor
obtener información cualitativa de los iones precursores de fármacos, exactitud.
impurezas y contaminantes. Esto puede ayudar en la identificación Para la espectrometrı́a de masas, los estándares internos pueden
de sustancias desconocidas. El método también puede usarse para ser análogos estructurales o isótopos estables. Los primeros tienen la
determinar la secuencia de aminoácidos de péptidos y fragmentos de ventaja de un menor costo y mayor disponibilidad, pero mayor
proteı́nas. precisión y exactitud se logran normalmente usando un análogo del
MS/MS ofrece ventajas en el análisis de mezclas. Incluso cuando analito marcado con un isótopo estable (2H, 13C, 15N). Los únicos
el espectrómetro de masas se acopla a un dispositivo separador como requisitos para marcar el analito son que el ion elegido para el
por ejemplo un cromatógrafo de lı́quidos o gases, es posible que las estándar interno debe conservar la marca isotópica después de la
señales obtenidas sean el resultado de componentes superpuestos ionización y la marca no debe ser intercambiable en las condiciones
o sin resolver. MS/MS puede emplearse para seleccionar el ion de muestreo, separación o ionización. Para una cuantificación
precursor de un componente y obtener información estructural sin aceptable, a menudo se necesitan estándares internos de isótopos
interferencia de los otros. estables, en particular con las técnicas de FAB y LC/MS como por
El seguimiento de la reacción seleccionada se usa para reducir la ejemplo el termospray y el electrospray.
interferencia encontrada durante el análisis cuantitativo de bajos Las abundancias relativas de los iones del analito y del estándar
niveles de fármacos en matrices biológicas, como los encontrados en interno se suelen determinar mediante el seguimiento del ion
estudios farmacocinéticos. Si el análisis es para el ion especı́fico de seleccionado, por el cual sólo se determinan los iones especı́ficos
un fármaco, las señales de interferencia de otros compuestos de la debidos al analito y al estándar interno. La ventaja de esta técnica,
matriz pueden ocultar la señal deseada. La interferencia se reduce si sobre el barrido completo de masas, es que se invierte más tiempo en
se selecciona un fragmento especı́fico del fármaco con MS1 y un integrar la corriente de iones al cociente masa/carga seleccionado, lo
fragmento especı́fico de la estructura con MS2. Las probabilidades cual incrementa la sensibilidad. El área del pico cromatográfico o la
de que otra molécula produzca la misma relación de masas son en cantidad de analito de una muestra se calcula a partir del cociente del
extremo remotas. analito con el área (o altura) del pico del estándar interno y los
MS/MS también puede usarse en estudios de metabolismo para parámetros de regresión, según determina la curva de calibración,
buscar moléculas con caracterı́sticas estructurales comunes como por usando técnicas estándar.
ejemplo los metabolitos relacionados con el medicamento. Todos los
metabolitos podrı́an contener el mismo grupo funcional que se
pierde como fragmento neutro. En este caso, un barrido de pérdida
neutra constante mostrará todas estas especies. Por ejemplo, todos
los ácidos carboxı́licos perderán dióxido de carbono neutro. Si la
funcionalidad común se pierde como fragmento iónico, entonces un
barrido del precursor mostrará todas las moléculas que producen ese h741i INTERVALO O
ion fragmentado.
TEMPERATURA DE FUSIÓN
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS
El experimento de espectros de masas proporciona información Para fines farmacopeicos, el intervalo o temperatura de fusión de
acerca del peso molecular de iones derivados de la muestra y la un sólido se define como los puntos de temperatura entre los cuales
abundancia relativa de cada uno de estos iones. Los espectros son o el punto en el que el sólido coalesce y se funde completamente,
a menudo complejos y no todos los iones pueden separarse mediante excepto para las Clases II y III, según se aclara más adelante. Puede
el espectrómetro de masas. La capacidad del instrumento para emplearse cualquier aparato o método que proporcione una exactitud
separar iones se llama poder de resolución, habitualmente descrita equivalente. La exactitud debe verificarse a intervalos adecuados
por la definición de ‘‘valles de 10%’’. Esto afirma que el poder de mediante el uso de uno o varios de los seis Estándares de Referencia
resolución es el mayor número de masa al que dos picos que difieren de Punto de Fusión USP, preferentemente aquellos que fundan
en una unidad de peso molecular y de igual altura tienen un valle a temperaturas lo más cercanas posibles a las temperaturas de fusión
entre ellos que es igual al 10% de la altura de los picos. Para de los compuestos que se desean analizar (ver Estándares de
espectrómetros de masa de baja, media y alta resolución, este valor Referencia USP h11i).
se encuentra entre 100 y 2000, entre 2000 y 10 000 y por encima de A continuación se describen cinco procedimientos para la
10 000, respectivamente. determinación del intervalo o temperatura de fusión, los cuales
Si se quita o agrega un electrón a una molécula neutra, se forma varı́an según la naturaleza de la sustancia. Cuando no se designa
un ion molecular con esencialmente el mismo peso molecular que la ninguna clase en la monografı́a, emplear el procedimiento para la
molécula que le dio origen. A menudo es posible determinar la masa Clase Ia.
de este ion con suficiente precisión para permitir el cálculo de la El procedimiento conocido como determinación del punto de
fórmula empı́rica del compuesto. Las masas moleculares pueden fusión de mezcla, en el cual el intervalo de fusión de un sólido
determinarse con exactitud usando instrumentos de alta resolución a analizar se compara con el de una mezcla ı́ntima de partes iguales
o mediciones de coincidencia de picos con compuestos de referencia. del sólido y de una muestra auténtica del mismo, por ejemplo el
334 h741i Intervalo o Temperatura de Fusión / Pruebas Fı́sicas USP 30
correspondiente Estándar de Referencia USP, si estuviera disponible, según se indica para la Clase I, Aparato I. Luego, colocar de
puede emplearse como una prueba de identificación confirmatoria. inmediato el tubo capilar cargado en un desecador al vacı́o y secar
La coincidencia de las observaciones del original y de la mezcla a una presión que no exceda los 20 mm de mercurio durante 3 horas.
constituye una evidencia confiable de identidad quı́mica. Inmediatamente después de retirar del desecador, sellar a la llama el
Aparato I—Un ejemplo de Aparato I adecuado para la extremo abierto del tubo y proceder lo antes posible con la
determinación del intervalo de fusión consiste en un recipiente de determinación del intervalo de fusión del siguiente modo: Calentar el
vidrio para un baño de lı́quido transparente, un dispositivo baño hasta alcanzar una temperatura de 10 + 18 por debajo del
mezclador apropiado, un termómetro exacto (ver Termómetros intervalo de fusión esperado. Luego, introducir el tubo cargado y
h21i),* y una fuente controlada de calor. El lı́quido del baño se calentar a una velocidad de ascenso de 3 + 0,58 por minuto hasta
selecciona de acuerdo con la temperatura requerida pero, por lo completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión como se indica
general, se utiliza parafina lı́quida y ciertas siliconas lı́quidas que se para la Clase I, Aparato I.
adaptan bien a intervalos más altos de temperatura. El lı́quido del Si el tamaño de partı́cula del material es demasiado grande para el
baño tiene la suficiente profundidad para permitir la inmersión del capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba como se indi-
termómetro a la profundidad especificada de manera que el bulbo có anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar
quede aproximadamente a 2 cm del fondo del baño. El calor puede las partı́culas a un tamaño adecuado para que entren en el capilar y
ser suministrado por una llama abierta o eléctricamente. El tubo cargar de inmediato el tubo.
capilar tiene aproximadamente 10 cm de largo y entre 0,8 y 1,2 mm Procedimiento para la Clase I, Aparato II—Preparar la
de diámetro interno, con paredes de 0,2 a 0,3 mm de espesor. sustancia de prueba y cargar el tubo capilar según se indica para la
Aparato II—Se puede emplear un instrumento en los procedi- Clase I, Aparato I. Operar el aparato según las indicaciones del
mientos para las Clases I, Ia y Ib. Un ejemplo de Aparato II fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura
adecuado para la determinación del intervalo de fusión consiste en esté aproximadamente a 308 por debajo del punto de fusión
un bloque de metal que puede calentarse a velocidad controlada, con esperado. Insertar el tubo capilar en el bloque de calentamiento y
su temperatura controlada mediante un sensor. El bloque permite continuar el calentamiento hasta que la temperatura aumente entre 18
alojar el tubo capilar que contiene la sustancia de prueba y controlar y 28 por minuto aproximadamente hasta completar la fusión.
del proceso de fusión, normalmente por medio de un haz de luz y un La temperatura a la cual la señal del detector se desvı́a por primera
detector. Se puede procesar la señal del detector a través de una vez de su valor inicial se define como el comienzo de la fusión y la
microcomputadora para determinar y mostrar el punto o intervalo de temperatura a la cual la señal del detector alcanza su valor definitivo
fusión, o bien la señal del detector se puede graficar para permitir el se define como el final de la fusión o punto de fusión. Las dos
cálculo visual del punto o intervalo de fusión. temperaturas caen dentro de los lı́mites del intervalo de fusión.
Procedimiento para la Clase I, Aparato I—Reducir la sustancia Si existieran discrepancias, solamente el intervalo o temperatura
de prueba a un polvo muy fino y, a menos que se indique algo de fusión obtenido según las indicaciones para Clase I, Aparato I es
diferente, deshidratar la sustancia secándola a la temperatura decisivo.
especificada en la monografı́a correspondiente cuando contiene Procedimiento para la Clase II—Fundir cuidadosamente el
agua de hidratación. Si la sustancia no contiene agua de hidratación, material que se desea probar a la menor temperatura posible y
secarla sobre un desecante apropiado durante no menos de 16 horas. colocarlo en un tubo capilar con ambos extremos abiertos, a una
Cargar un tubo capilar de vidrio con un extremo cerrado con profundidad de aproximadamente 10 mm. Enfriar el tubo cargado
suficiente polvo seco para que forme una columna en el fondo del a 108 o menos durante 24 horas, o mantenerlo en contacto con hielo
tubo que tenga entre 2,5 y 3,5 mm de altura al compactarla tanto durante no menos de 2 horas. Luego unir el tubo capilar al
como sea posible golpeteando suavemente sobre una superficie termómetro por medios adecuados, ajustarlo en un baño de agua de
sólida. manera que el borde superior del material quede 10 mm por debajo
Calentar el baño hasta que la temperatura sea aproximadamente del nivel del agua y calentar como se indica para la Clase I, Aparato
308 menor que el punto de fusión esperado. Retirar el termómetro y I excepto por regular la velocidad de aumento de temperatura a razón
acoplar rápidamente el tubo capilar al termómetro mojando ambos de 0,58 a 1,08 por minuto, dentro de los 58 de la temperatura de
con una gota del lı́quido del baño o de alguna otra manera y ajustar fusión esperada. La temperatura a la cual el material comienza
su altura para que el material en el capilar quede a nivel del bulbo del a subir en el tubo capilar es la temperatura de fusión.
termómetro. Colocar el termómetro nuevamente en el baño y Procedimiento para la Clase III—Fundir lentamente una
continuar el calentamiento, mezclando constantemente, de manera cantidad de la sustancia de prueba, mientras se agita, hasta que
que la temperatura ascienda a una velocidad de alrededor de 38 por alcance una temperatura de 908 a 928. Retirar la fuente de calor y
minuto. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 38 por dejar que la sustancia fundida se enfrı́e a una temperatura de 88 a 108
debajo del lı́mite inferior del intervalo de fusión esperado, reducir el por encima del punto de fusión esperado. Enfriar el bulbo de un
calentamiento para que la temperatura ascienda a una velocidad de termómetro apropiado (ver Termómetros h21i) a 58, secarlo y
aproximadamente 18 a 28 por minuto. Continuar el calentamiento mientras todavı́a está frı́o colocarlo en la sustancia fundida hasta que
hasta que se complete la fusión. quede sumergida aproximadamente la mitad inferior del bulbo.
La temperatura a la cual la columna de la sustancia de prueba se Retirarlo de inmediato y mantenerlo en posición vertical lejos del
colapsa claramente contra las paredes del tubo en cualquier punto se calor hasta que se opaque la superficie de la cera. Luego, sumergirlo
define como el comienzo de la fusión y la temperatura a la cual la durante 5 minutos en un baño de agua con una temperatura que no
sustancia de prueba se torna completamente lı́quida se define como exceda de 168.
el final de la fusión o ‘‘punto de fusión’’. Las dos temperaturas caen Fijar el termómetro firmemente a un tubo de ensayo de manera
dentro de los lı́mites del intervalo de fusión. que el punto inferior quede 15 mm por encima del fondo del tubo de
Procedimiento para la Clase Ia, Aparato I—Preparar la ensayo. Suspender el tubo de ensayo en un baño de agua ajustado
sustancia de prueba y cargar el capilar según se indica para la a aproximadamente 168y aumentar la temperatura del baño a una
Clase I, Aparato I. Calentar el baño hasta que la temperatura velocidad de 28 por minuto hasta 308. Luego, cambiar a una
esté alrededor de 108 por debajo del punto de fusión esperado y velocidad de 18 por minuto y observar la temperatura a la cual se
aumentarla a una velocidad de 1 + 0,58 por minuto. Insertar el desprende del termómetro la primera gota de sustancia fundida.
capilar según se indica para la Clase I, Aparato I cuando la Repetir la determinación dos veces con una porción recién fundida
temperatura esté aproximadamente a 58 por debajo del lı́mite inferior de la sustancia de prueba. Si la variación de las tres determinaciones
del intervalo de fusión esperado y continuar el calentamiento hasta es de menos de 18, tomar el promedio de las tres como punto de
completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión como se indica fusión. Si la variación de las tres determinaciones es 18 o mayor de
para la Clase I, Aparato I. 18, hacer dos determinaciones adicionales y tomar el promedio de las
Procedimiento para la Clase Ib, Aparato I—Colocar la cinco.
sustancia de prueba en un envase cerrado y enfriarla a una
temperatura de 108 o menor, durante 2 horas como mı́nimo. Sin
pulverización previa, cargar el material enfriado en el tubo capilar
*
El Método E77 de la ASTM trata sobre ‘‘Verificación y Calibración de
Termómetros de Lı́quido en Vidrio.’’
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h761i Resonancia Magnética Nuclear 335
campo de radiofrecuencia oscilatorio, la absorción de la radiación utiliza para excitar simultáneamente todos los núcleos. Los núcleos
tiene lugar de acuerdo a la relación: excitados regresan al nivel más bajo de energı́a generando una señal
de decaimiento libre inducida (FID, del inglés free induction decay)
que contiene en un dominio de tiempo, toda la información que se
obtendrı́a en un dominio de frecuencia con un espectrómetro CW.
Las respuestas en el dominio tiempo y el dominio de frecuencia
forman un par de FT; que se transforma luego a un gráfico de
amplitud en función de frecuencia (espectro). Esta operación
donde h es la constante de Planck, y matemática se realiza por computadora después de una conversión
análogica-digital. Después de un perı́odo de espera que permite la
relajación de los núcleos excitados, el experimento de pulsos
(transiente) puede repetirse y la respuesta se acumula en forma
apropiada en la memoria de la computadora, promediando el ruido
aleatorio para disminuirlo. (Un aumento similar de la señal-ruido
Por lo tanto, cuando la frecuencia ( 0) del campo de energı́a externo puede obtenerse combinando espectrómetros de CW con computa-
(E = h) es la misma que la velocidad angular de precesión, se doras que promedien transientes).
presenta resonancia. El diagrama de bloques de un espectrómetro tı́pico de pulsos de
La diferencia de energı́a entre los dos niveles corresponde a una alta resolución se muestra en la Figura 2. Ésta es una configuración
radiación electromagnética especı́fica dentro del intervalo de radio- tı́pica de un espectrómetro de alta resolución que utiliza un solenoide
frecuencias utilizado. Esta es una función de g, que es una propiedad superconductor (criogénico) como fuente del campo magnético. La
del núcleo, y H0, que representa la fuerza del campo externo. Como introducción del espectrómetro de RMN de pulsos ha hecho que la
se muestra en Tabla 1, la frecuencia de resonancia de un núcleo obtención de espectros de muchos núcleos, distintos de protones, se
aumenta cuando se incrementa la fuerza del campo magnético. convierta en rutina. También ha permitido obtener el espectro de
La RMN es una técnica de alta especificidad pero con sensibilidad protones en mucho menos tiempo, y con cantidades muy pequeñas
relativamente baja. La razón principal para la baja sensibilidad es de muestra, comparado con las técnicas de CW.
que la diferencia de energı́a entre el estado excitado y el estado Los espectrómetros de RMN tienen requerimientos estrictos de
fundamental es comparativamente pequeña (0,02 calorı́as en campos estabilidad y homogeneidad. La estabilidad se logra frecuentemente
de fuerza de 15 a 20 kilogauss), lo que resulta en una diferencia por un sistema de fijación de la frecuencia del campo que ‘‘fija‘‘ el
poblacional entre los dos niveles de sólo unas pocas partes por campo magnético a la frecuencia de resonancia de una señal de
millón. Otro aspecto importante del fenómeno RMN, con efectos referencia. La señal de fijación puede ser homonuclear o hetero-
negativos sobre la sensibilidad, es la larga vida de la mayorı́a de los nuclear. En el último caso, la resonancia de referencia es usualmente
núcleos en el estado excitado, lo que afecta el diseño de las pruebas la señal del deuterio de un disolvente deuterado. En espectrómetros
analı́ticas de RMN, especialmente en experimentos de secuencia de más antiguos, el empleo de deuterio como núcleo para fijar el campo
pulsos. La obtención simultánea de un espectro completo en lugar de permite desacoplar el ruido de los protones mientras se estudian
un espectro de barrido de frecuencias puede mejorar la sensibilidad. núcleos como 13C. Aunque la fijación homonuclear interna todavı́a
se utiliza en espectrómetros de protones de CW (donde el
tetrametilsilano al 0,5% brinda una fijación conveniente), éstos
Aparato casi nunca se usan en espectrómetros de pulsos FT.
Ninguna clase de imán es capaz de producir un campo homogéneo
Los componentes principales de un espectrómetro de RMN son un en el espacio ocupado por la muestra. Por lo general se utilizan dos
imán y una fuente de radiofrecuencia. Los instrumentos se describen técnicas para compensar esta falta de homogeneidad: giro de la
por la frecuencia de resonancia aproximada del núcleo analı́tico, por muestra y el empleo de bobinas adicionales (compensadores
ej., 1H RMN. Más recientemente, los instrumentos se denominan por o "shim"). Debido al diseño, particularmente el diseño de la sonda,
la fuerza de sus campos. Algunos espectrómetros analizan un único el giro en el caso de electroimanes o imanes permanentes es
tipo de núcleo; otros se diseñan para obtener espectros de diferentes perpendicular al campo magnético básico. En imanes superconduc-
núcleos. tores, el eje de rotación sólo puede ser paralelo al campo magnético
Hay dos tipos de espectrómetros comerciales de RMN: los básico. La velocidad de giro debe ser suficiente para promediar el
instrumentos clásicos de onda continua (CW) y los instrumentos más campo, pero no debe ser demasiado rápida como para producir un
modernos por pulsos y transformada de Fourier (FT). Los vórtice extendido en el tubo de la muestra. Un vórtice extendido
espectrómetros de CW utilizan una técnica similar a los espectróme- cerca de la región expuesta a las bobinas de radiofrecuencia
tros ópticos clásicos: un barrido lento de radiofrecuencias (en un disminuye la resolución. Las bobinas compensadoras son ajustadas
campo magnético fijo) o del campo magnético (a una radiofrecuencia por el usuario hasta que las contribuciones instrumentales al ancho
fija) sobre un dominio correspondiente a la resonancia de los núcleos de banda observado se reduzcan al mı́nimo.
en estudio. La señal generada por la absorción de energı́a se detecta, La mayorı́a de los espectrómetros de RMN poseen un integrador
amplifica y registra. electrónico. En un instrumento de CW (H y 19F) el integrador,
Son posibles varias configuraciones del instrumento. La disposi- conectado a la salida del espectrómetro, determina las áreas relativas
ción de un espectrómetro tı́pico de doble bobina, como se puede de los picos de resonancia y presenta estas áreas como una serie de
observar en instrumentos de CW de 60 MHz y 100 MHz en la lı́neas horizontales escalonadas cuando se realiza un barrido en la
resolución más baja, se ilustra en la Figura 1. modalidad de integración. En un espectrómetro FT-RMN, se incluye
Las limitaciones de los espectrómetros de CW son su baja un algoritmo de integración en el software del espectrómetro, y las
sensibilidad y el largo tiempo de análisis. En espectrómetros de áreas de los picos de resonancia pueden presentarse gráficamente
RMN de pulsos, un pulso simple de energı́a de radiofrecuencia se como lı́neas escalonadas o tabularse como valores numéricos. El
El acoplamiento puede ocurrir entre 1H y otro núcleo, como por Tabla 2. Solventes Normalmente Empleados para RMN de
ejemplo 19F, 13C y 31P. En algunos casos, por ej., en el modo CW, las Protones
constantes de acoplamiento pueden ser tan grandes que parte del Señal Residual de Protones, d a
multiplete queda fuera de la escala en el lı́mite superior e inferior del Disolvente
campo. Este tipo de acoplamiento puede presentarse sobre una CCl4b —
‘‘distancia normal de tres enlaces’’, como para el acoplamiento 1H- CS2b —
1
H. SO2 (lı́quido) —
Los núcleos magnéticamente activos I 1, como por ejemplo 14N, (CF3)2CO —
poseen un momento eléctrico cuadrupolar, el cual produce CDCl3 7,27
ensanchamiento de la lı́nea de la señal debido a núcleos vecinos. CD3OD 3,35; 4,8 c
La intensidad relativa es otra caracterı́stica de la señal que tiene (CD3)2CO 2,05
vastas aplicaciones analı́ticas. En experimentos cuidadosamente D 2O 4,7 c
diseñados (ver la sección Método General), el área o intensidad de DMSO-d6 d 2,50
una señal es directamente proporcional al número de protones que C 6D 6 7,20
producen la señal. Como resultado, es posible determinar la razón p-Dioxano-d8 3,55
relativa de diferentes clases de protones u otros núcleos en una CD3CO2D 2,05; 8,5 c
muestra o realizar valoraciones de RMN con la ayuda de un estándar DMF-d7e 2,77; 2,93; 8,05
interno.
El espectro de RMN puede contener señales extrañas debido a la a
d en ppm respecto al tetrametilsilano arbitrariamente tomado como 0d o 0
falta de homogeneidad del campo magnético en la muestra. Estos ppm.
b
artefactos, llamados bandas laterales de rotación, aparecen como Grado Espectrofotométrico.
c
lı́neas pequeñas simétricamente localizadas alrededor de cada señal. Altamente variable; depende del soluto y la temperatura.
d
La presencia de bandas laterales de rotación grandes indica que es Dimetil sulfóxido-d6.
e
N,N-Dimetilformamida-d7 extraı́do de los catálogos de Aldrich, Alfa, Fluka,
necesario ajustar las bobinas de compensación que no giran. La y Sigma.
separación es igual a la frecuencia de la velocidad de giro del tubo de
muestra o un múltiplo entero de esa frecuencia. Por lo tanto, las
bandas laterales de rotación son fácilmente identificables. Algunos disolventes (por ej., D2O o CD3OD) intervienen en
reacciones de intercambio rápido de protones y pueden eliminar las
señales de resonancia de grupos –COOH, –OH, y –NH2. Los
protones en alcoholes y aminas no se intercambian rápidamente,
Método General excepto en presencia de D2O y algunos otros disolventes (por ej.,
La preparación inadecuada de la muestra o los ajustes y CD3OD), o que se catalicen con pequeñas concentraciones de ácido
parámetros instrumentales incorrectos pueden conducir a una baja o base.
resolución, disminución de la sensibilidad, artefactos espectrales y Para RMN 19F, puede utilizarse la mayorı́a de los disolventes
datos erróneos. Es preferible que el usuario esté familiarizado con la empleados en RMN de protones; los más comunes son CHCl3, CCl4,
teorı́a básica de la RMN, las propiedades de la muestra y los H2O, CS2, ácidos y bases acuosos, y dimetilacetamida. En general,
principios de operación de los instrumentos. Deben seguirse puede utilizarse cualquier disolvente no-fluorado, siempre que sean
estrictamente los manuales de instrucciones suministrados por el de calidad espectroscópica. Obviamente, no hay interferencia de los
fabricante y realizarse frecuentes controles del funcionamiento del grupos funcionales protonados del disolvente. Sin embargo, los
instrumento. grupos funcionales protonados y con 19F de la muestra presentarán
El método y los procedimientos discutidos aquı́ se refieren acoplamiento-J a menos que estén desacoplados.
especı́ficamente a RMN de 1H (protón) y 19F y son aplicables, con Preparación de la Muestra—Las instrucciones se dan normal-
modificaciones, a otros núcleos. La discusión supone que el espectro mente en las monografı́as individuales. La concentración de soluto
de RMN se obtiene a partir de sustancias lı́quidas o soluciones en depende del objetivo del experimento y del tipo de instrumento. La
disolventes apropiados. detección de contaminantes menores puede requerir concentraciones
Selección del Disolvente—Los disolventes apropiados además de más altas. Las soluciones se preparan en viales separados y se
tener buenas propiedades disolventes, no deben presentar picos de transfieren al tubo de muestra para RMN. El volumen requerido
resonancia que enmascaren aquellos originados por la muestra en depende del tamaño del tubo de muestra y de la geometrı́a del
análisis. Los disolventes más empleados para RMN de protones y instrumento. El nivel de la solución en el tubo debe extenderse más
carbono se enumeran en la Tabla 2. Los disolventes deuterados allá de las bobinas cuando el tubo se inserta en la sonda del
también proporcionan señales para los sistemas heteronucleares de instrumento y gira.
fijación del campo. La pureza isotópica del solvente, debe ser lo más Los tubos de muestras para RMN deben cumplir estrictas
alta posible para evitar que los picos del mismo puedan dificultar la especificaciones de tolerancia en diámetro, espesor de pared,
visualización de cualquier señal de la muestra. El deuterio (I = 1) no concentración y curvatura. Los tubos más usados tienen un diámetro
presenta resonancia bajo condiciones de 1H pero puede causar externo de 5 a 10 mm y miden entre 15 y 20 cm. Hay microtubos
acoplamiento-J. Los protones residuales generan picos de disolvente para el análisis de cantidades pequeñas de muestra.
cuyos desplazamientos quı́micos se muestran en la Tabla 2. Procedimiento—El tubo de muestra se coloca en una sonda
ubicada en el campo magnético. La sonda contiene un circuito
electrónico que incluye el emisor o los emisores de radiofrecuencia,
y aditamentos para el suministro de aire que hacen girar los tubos de
las muestras.
340 h761i Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Fı́sicas USP 30
El instrumento se ajusta antes de cada experimento. La velocidad barrido prolongado. La extensión de la migración se obtiene por lo
de giro del tubo de muestra se ajusta de tal forma que las bandas general al comparar las posiciones relativas de otro pico en el barrido
laterales de rotación no interfieran con los picos de interés y el inicial con el mismo pico en el barrido desplazado.
vórtice no se extienda más allá de las bobinas en la sonda. Para La operación de un espectrómetro FT-RMN es un experimento
optimizar el rendimiento del instrumento, se ajustan los gradientes mucho más elaborado. La computadora sirve para controlar el
del compensador magnético en los espectrómetros FT-RMN. Para el espectrómetro, programar el experimento, y almacenar y procesar los
ajuste de resolución de espectrómetros de CW, un buen indicador es datos. La programación del experimento involucra la asignación de
la ‘‘oscilación de cola’’ (ringing) de la señal del TMS. El fenómeno valores a un gran número de variables, incluyendo el ancho del
de oscilación de cola es la oscilación del registrador por encima y espectro que será examinado, la duración (‘‘ancho’’) del pulso de
por debajo de la lı́nea base después de que el campo magnético ha excitación, el tiempo de adquisición de datos, el número de
pasado a través de una frecuencia de resonancia. La oscilación de transientes acumulados, y el perı́odo de espera entre una adquisición
cola, evidenciada en un número de picos en las Figuras 5 y 6, se de datos y la siguiente. El tiempo de análisis para un transiente es del
presenta durante barridos rápidos de onda continua y decae orden de segundos. El número de transientes a usar es función de la
exponencialmente hacia el valor de la lı́nea base. concentración de la muestra, el tipo de núcleo y el objetivo del
experimento. Al finalizar el experimento, la señal FID se almacena
en forma digital en la memoria de la computadora y se muestra en el
monitor de vı́deo. La señal puede ser procesada matemáticamente
para mejorar la resolución o la sensibilidad, y puede convertirse en
espectros de dominio de frecuencia usando la transformada de
Fourier. El instrumento proporciona una gráfica del espectro. La
rutina de integración, accesible mediante comandos del teclado,
resulta en una gráfica con lı́neas escalonadas. Se obtienen integrales
mucho más exactas si las señales o regiones de interés se integran
por separado.
Los espectrómetros FT-RMN pueden arrojar datos cualitativos y
cuantitativos del mismo experimento, pero esto se hace rara vez en la
práctica. En experimentos FT cuantitativos, deben tomarse pre-
cauciones especiales para que las áreas de las señales sean
proporcionales al número de protones. Los tiempos de espera entre
pulsos deben ser lo suficientemente largos para permitir la relajación
total de todos los núcleos excitados. Esto aumenta considerable-
mente el tiempo de análisis y se pierde algo de resolución. El análisis
cualitativo se realiza normalmente en condiciones no cuantitativas,
con el experimento diseñado para la obtención de un análisis rápido
con máxima resolución o sensibilidad.
Existen varias técnicas especiales (resonancia doble, intercambio Si las dos señales se originan a partir de diferentes especies
quı́mico, uso de reactivos de desplazamiento, análisis bidimensional, moleculares,
etc.) para simplificar algunos de los espectros más complejos,
identificar ciertos grupos funcionales y determinar correlaciones de
acoplamiento.
La resonancia doble, o desacoplamiento de espı́n, es una técnica
que anula el acoplamiento entre núcleos y por lo tanto, simplifica el
espectro e identifica los componentes en una relación de acopla-
miento. Por ejemplo, en un sistema simple de dos protones,
generalmente designado como sistema AX (ver Figura 4), cada
protón aparece como un doblete. Si se introduce un campo fuerte de donde m1 y m2 son el número de moles; W1 y W2 son las masas; y M1
radiofrecuencia a la frecuencia de X, mientras el campo de y M2 son los pesos moleculares de los compuestos 1 y 2,
radiofrecuencia normal se mantiene a la frecuencia que causa la respectivamente.
resonancia de A, el acoplamiento entre A y X queda anulado El examen de las Ecuaciones 2 y 3 muestra que el análisis
(desacoplamiento homonuclear). La señal de A ya no está dividida, y cuantitativo por RMN puede realizarse en forma absoluta o relativa.
aparece en cambio como un singulete. Los espectros de rutina de 13C En el método absoluto, un estándar interno se añade a la muestra y
se obtienen en condiciones de desacoplamiento protónico que anulan un área de pico de resonancia procedente de la sustancia de muestra
todos los acoplamientos heteronucleares 13C-1H. Como resultado de se compara con un área de pico de resonancia del estándar interno. Si
este desacoplamiento, las señales de carbono aparecen como la sustancia de prueba y el estándar interno se pesan con exactitud,
singuletes, a menos que estén presentes otros núcleos que no están puede calcularse la pureza absoluta de una sustancia. Un buen
desacoplados (por ej., 19F, 31P). estándar interno tiene las siguientes propiedades: presenta un pico de
Los grupos funcionales que contienen protones intercambiables resonancia de referencia, preferentemente singulete, en una posición
unidos a hetero-átomos como por ejemplo –OH, –NH2, o –COOH del campo distinta de la de todos los picos de muestra; es soluble en
pueden identificarse mediante intercambio rápido de estos protones el disolvente analı́tico; su peso equivalente protónico, esto es, el peso
con D2O. Para determinar la presencia y posición de estos grupos es molecular dividido entre el número de protones que generan el pico
necesario hacer un barrido de la sustancia de prueba en CDCl3 de referencia, es bajo y no interactúa con el compuesto de prueba.
o DMSO-d6, después agregar algunas gotas de D2O al tubo de 1,2,4,5-tetraclorobenceno, 1,4-dinitrobenceno, benzoato de bencilo,
muestra, agitar y barrer otra vez. Los picos de resonancia de estos y ácido maleico son ejemplos de tı́picos estándares útiles. La
grupos se colapsan en el segundo barrido y son reemplazados por el elección de un estándar será dictada por el espectro de la muestra.
singulete HDO entre 4,7 y 5,0 ppm. El método relativo puede usarse para determinar la fracción molar
Este intercambio quı́mico sirve para ejemplificar el efecto de la de una impureza en la sustancia de prueba (o de los componentes en
velocidad de los procesos intermoleculares e intramoleculares en los una mezcla) mediante la Ecuación 3.
espectros de RMN. Si un protón puede experimentar diferentes El análisis cuantitativo, tanto como la detección de trazas de
ambientes en virtud de tal proceso (tautomerismo, rotación en torno impurezas, ha mejorado mucho con los instrumentos modernos. Los
a un enlace, equilibrios de intercambio, inversión de anillo, etc.), la campos magnéticos más fuertes y la habilidad de acumular y
apariencia del espectro será una función de la velocidad del proceso. promediar señales en periodos largos de tiempo mejora mucho la
Los procesos lentos (en una escala de RMN) proporcionan más de sensibilidad del método.
una señal, los procesos rápidos promedian estas señales en una lı́nea, Método Absoluto de Cuantificación—Cuando la monografı́a
y los procesos intermedios producen señales anchas. individual indica que se utilice el Método Absoluto de Cuantifica-
Los programs de los espectrómetros FT-RMN modernos tienen en ción, proceder del siguiente modo.
cuenta secuencias de pulsos mucho más complejas que la Disolvente, Estándar Interno y Referencia de RMN—Usar según
acumulación repetitiva de transientes descrita anteriormente. Tales se indica en la monografı́a individual.
experimentos incluyen análisis bidimensionales homonucleares Preparación de prueba—Transferir una cantidad de la sustancia
o heteronucleares, que determinan la correlación de acoplamientos en análisis pesada con exctitud, que contenga aproximadamente 4,5
y pueden simplificar la interpretación de otros espectros complejos. mEq de protones en un tubo de centrı́fuga graduado, con tapón de
Aplicaciones Cuantitativas—Si el instrumento se ha calibrado vidrio. Agregar aproximadamente 4,5 mEq de protones de Estándar
correctamente para un análisis cuantitativo, las áreas (o intensidades) interno, pesados con exactitud, y 3,0 mL de Disolvente; insertar el
de dos señales son proporcionales al número total de protones que tapón y agitar. Cuando la disolución esté completa, agregar
las generan. aproximadamente de 30 mL (30 mg si es un sólido) de Referencia
de RMN, procurando que esto no interfiera con la medición posterior,
y agitar.
Procedimiento—Transferir una cantidad apropiada (0,4 a 0,8 ml)
de Preparación de prueba a un tubo giratorio estándar de 5 mm para
RMN y registrar el espectro, ajustando la velocidad de giro de
maneral tal que las bandas laterales de rotación no interfieran con los
picos de interés. Medir el área bajo cada uno de los picos como se
especifica en la monografı́a individual, integrando no menos de
Si las dos señales se originan a partir de dos grupos funcionales de cinco veces. Registrar el área promedio del pico del Estándar interno
la misma molécula, la ecuación puede simplificarse a como AS y el pico de la Preparación de prueba como AU.
Calcular la cantidad, en mg, del analito en la Preparación de
prueba por la fórmula:
en donde n1 y n2 son el número de protones en los grupos funcionales en donde WS es el peso, en mg, del Estándar interno tomado y EU y
respectivos. ES son los pesos equivalentes protónicos (esto es, los pesos
moleculares divididos entre el número de protones que generan el
pico de referencia) del analito y del Estándar interno, respectiva-
mente.
342 h771i Ungüentos Oftálmicos / Pruebas Fı́sicas USP 30
fotografı́as de la muestra y para la determinación del aumento. Tanto Diámetro de Martin—El diámetro de la partı́cula en el punto en el
la resolución del microscopio como la exposición y los procesos de que divide una partı́cula orientada de forma aleatoria en dos áreas
revelado e impresión influyen en el tamaño aparente de la imagen proyectadas iguales.
fotográfica. Diámetro del Área Proyectada—El diámetro de un cı́rculo cuya
Preparación del Medio de Montaje—El medio de montaje se área proyectada es la misma que la de la partı́cula.
selecciona según las propiedades fı́sicas de la muestra. Para ver los Longitud—La medida más larga tomada de extremo a extremo de
detalles de los bordes de la muestra, es necesario un contraste la partı́cula orientada en paralelo a la escala del ocular.
adecuado, aunque no excesivo, entre la muestra y el medio de Ancho—La medida más larga de la partı́cula tomada en ángulo
montaje. Para distinguir las partı́culas individuales en estudio, es recto a la longitud.
necesario que estén dispuestas en un mismo plano y con la
dispersión adecuada. Además, es necesario que las partı́culas sean Caracterización de la Forma de la Partı́cula—Si se trata de
representativas de la distribución del tamaño de las partı́culas y que partı́culas de forma irregular, la caracterización del tamaño debe
no sufran ninguna alteración durante la preparación del medio de incluir información sobre la forma de la partı́cula. Verificar la
montaje. Tomar las precauciones necesarias para que se cumpla este homogeneidad del polvo usando el aumento que corresponda. A
importante requisito. Para seleccionar el medio de montaje continuación se describen algunos de los descriptores usados
adecuado, considerar la solubilidad del analito. comúnmente para la forma de la partı́cula (ver la Figura 2):
Caracterización de la Cristalinidad—Si la monografı́a indivi- Acicular—Partı́cula fina, en forma de aguja, de ancho y espesor
dual de un fármaco indica caracterizar la cristalinidad, se puede similares.
determinar por microscopı́a óptica. Montar algunas partı́culas de la Columnar—Partı́cula larga y fina, de ancho y espesor superiores
muestra en aceite mineral y colocar el preparado sobre un a los de una partı́cula acicular.
portaobjetos de vidrio limpio, a menos que la monografı́a individual Escama—Partı́cula fina y plana, de longitud y ancho similares.
especifique algo diferente. Analizar el preparado con un microscopio Placa—Partı́culas planas de longitud y ancho similares pero de
de luz polarizada: al girar la platina del microscopio, las partı́culas mayor espesor que las escamas.
presentan birrefringencia (interferencia de colores) y posiciones de
extinción. Listón—Partı́cula larga y fina en forma de hoja.
Prueba de Lı́mite del Tamaño de Partı́culas por Cubos o esferas—Partı́culas cúbicas o esféricas, de largo, ancho y
Microscopı́a—Pesar una cantidad adecuada del polvo a analizar espesor de dimensiones similares.
(entre 10 mg y 100 mg, por ejemplo) y suspenderla en 10 mL de un Consideraciones Generales—La partı́cula se considera, en
medio adecuado, en el que el polvo no se disuelva y agregar, si fuera general, la unidad discreta más pequeña. Una partı́cula puede estar
necesario, un agente humectante. Suspender las partı́culas en un en estado de gotita lı́quida o semisólida, un cristal único
medio de densidad igual o similar y agitar para mantener la o policristalina, en estado amorfo o como aglomerado. En algunos
homogeneidad de la suspensión de partı́culas. Introducir una porción casos, las partı́culas están asociadas. El grado de asociación se puede
de la suspensión homogénea en una celda de conteo adecuada, describir en los siguientes términos:
observar en un área del microscopio que corresponda a no menos de Laminar—Placas superpuestas.
10 mg del polvo a analizar. Contar las partı́culas cuya dimensión Agregado—Masa de partı́culas adheridas.
máxima supera el lı́mite de tamaño indicado. El lı́mite de tamaño y el Aglomerado—Partı́culas amalgamadas o cementadas.
número máximo de partı́culas que exceden el lı́mite se definen para
cada sustancia. Conglomerado—Mezcla de dos o más tipos de partı́culas.
Caracterización del Tamaño de Partı́culas—La complejidad de Esferulita—Grupo con estructura radial.
la medición del tamaño de las partı́culas varı́a según la forma de la Drusa—Partı́cula recubierta de pequeñı́simas partı́culas.
partı́cula. Por otra parte, el número de partı́culas caracterizadas debe La partı́cula se puede describir en los siguientes términos:
ser suficiente para garantizar un grado de incertidumbre aceptable en Bordes—Angulares, redondeados, lisos, filosos o fragmentados.
los parámetros de medición. La norma ISO 9276, por ejemplo, Óptico—Color (usando filtros de compensación del color
proporciona información adicional sobre la medición del tamaño de apropiados), transparente, translúcida, opaca.
las partı́culas, tamaño de la muestra y análisis de los datos. Si se trata
de partı́culas esféricas, el tamaño está definido por el diámetro. Si se Defectos—Oclusiones, inclusiones.
trata de partı́culas irregulares, hay distintas definiciones del tamaño Las caracterı́sticas de la superficie se pueden describir en los
de partı́cula. En general, para partı́culas de forma irregular, la siguientes términos:
caracterización del tamaño debe incluir información sobre el tipo de Resquebrajada—División parcial, rotura o fisura.
diámetro medido y sobre la forma de la partı́cula. A continuación se Lisa—Sin irregularidades, proyecciones ni áreas rugosas.
describen varias medidas usadas comúnmente para el tamaño de Porosa—Con orificios o canales.
partı́culas (ver la Figura 1): Áspera—No lisa, con protuberancias o dispareja.
Diámetro de Feret—La distancia entre lı́neas paralelas imaginarias Punteada—Con pequeñas hendiduras.
tangentes a una partı́cula orientada de forma aleatoria y perpendi-
cular a la escala del ocular.
344 h781i Rotación Óptica / Pruebas Fı́sicas USP 30
h781i ROTACIÓN ÓPTICA Las sustancias que poseen la capacidad de mostrar poder rotatorio
óptico son sustancias quirales. Aquéllas que rotan la luz en el
sentido de las agujas del reloj, observando hacia la fuente de
iluminación, son dextrógiras, o isómeros ópticos (+). Las que rotan
Muchas sustancias farmacéuticas son ópticamente activas dado la luz en la dirección opuesta se llaman levógiras o isómeros ópticos
que rotan el plano incidente de la luz polarizada de manera que la luz (–). (Los sı́mbolos d- y l- que anteriormente se usaban para indicar
transmitida surge a un ángulo cuantificable con respecto al plano de isómeros dextro- y levógiros ya no se utilizan, debido a la confusión
la luz incidente. Esta propiedad es caracterı́stica de algunos cristales con los sı́mbolos D- y L-, que se refieren a las configuraciones
y de muchos lı́quidos o soluciones de sólidos de uso farmacéutico. relacionadas con el D-gliceraldehı́do. Los sı́mbolos R y S ası́ como
En aquellos casos en que un lı́quido o un soluto en solución posee a y b también se emplean para indicar la configuración, es decir, el
esta propiedad, por lo general se debe a la presencia de uno o varios ordenamiento de los átomos o grupos de átomos en el espacio.)
centros asimétricos, normalmente un átomo de carbono con cuatro Las propiedades fı́sicoquı́micas de las sustancias quirales no
sustituyentes diferentes. El número de isómeros ópticos es 2n, en superponibles que rotan el plano de la luz polarizada la misma
donde n es el número de centros asimétricos. La polarimetrı́a, la cantidad de grados pero en direcciones opuestas, llamadas
medición de la rotación óptica de un artı́culo farmacéutico, puede ser enantiómeros, son idénticas, salvo por esta propiedad y en sus
el único medio conveniente para distinguir entre sı́ isómeros reacciones con otras sustancias quirales. Los enantiómeros presentan
ópticamente activos y, por lo tanto, es un criterio importante de a menudo diferencias profundas en sus caracterı́sticas farmacológi-
identidad y pureza. cas y toxicológicas, debido al hecho de que los receptores biológicos
y las enzimas son quirales. Muchos artı́culos de origen natural, como
por ejemplo los aminoácidos, las proteı́nas, los alcaloides, los
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h785i Osmolalidad y Osmolaridad 345
antibióticos, los glicósidos y los azúcares, existen como compuestos se indique de otro modo, las mediciones de rotación óptica se
quirales. La sı́ntesis de estos compuestos a partir de materiales no realizan a 589 nm y a 258. Cuando se emplea un poları́metro
quirales da lugar a números iguales de enantiómeros, los racematos. fotoeléctrico, se hace una sola medición corregida por el blanco de
Los racematos tienen una rotación óptica neta nula y sus propiedades disolvente. Cuando se emplea un poları́metro visual, se utiliza el
fı́sicas pueden diferir de las de los enantiómeros que los componen. promedio de no menos de cinco determinaciones, corregidas por la
Para obtener los isómeros ópticos individuales pueden emplearse lectura del mismo tubo con un blanco de disolvente. La temperatura,
métodos de sı́ntesis estereoselectivos o estereoespecı́ficos o de que se aplica a la solución o al lı́quido de prueba, debe mantenerse
separación de mezclas racémicas. con una aproximación de 0,58 del valor establecido. Emplear la
La medición de la rotación óptica se realiza empleando un misma celda para la muestra y el blanco. Mantener la misma
poları́metro.* La ecuación general usada en polarimetrı́a es: orientación angular de la celda en cada lectura. Colocar la celda de
tal manera que la luz la atraviese en la misma dirección cada vez. La
rotación especı́fica, a menos que se especifique algo diferente, se
calcula con respecto a la sustancia seca cuando se especifica Pérdida
por secado en la monografı́a correspondiente o con respecto a la
sustancia anhidra cuando se especifica Agua.
La rotación óptica de las soluciones se debe determinar dentro de
los 30 minutos de hecha la preparación. En el caso de sustancias que
en donde [a] es la rotación especı́fica a la longitud de onda l, t es la puedan sufrir racemización o mutarotación, se deben tomar
temperatura, a es la rotación observada en grados (8), l es el paso de precauciones para estandarizar el tiempo entre el agregado del
la celda en decı́metros y c es la concentración del analito en g por soluto al Disolvente y la introducción de la solución al tubo del
100 mL. Por lo tanto, [a] es 100 veces el valor medido, en grados (8), poları́metro.
para una solución que contiene 1 g en 100 mL, medido en una celda Rotación Angular—A menos que se indique de otro modo, la
con un paso de 1,0 decı́metro bajo determinadas condiciones de referencia Rotación angular h781Ai en una monografı́a significa que
longitud de onda de luz incidente y temperatura. Para algunos la rotación óptica del lı́quido lı́mpido se mide en un tubo de 1,0 dm
artı́culos farmacopeicos, especialmente los lı́quidos, como por a 589 nm y a 258, corregida por la lectura del tubo vacı́o y seco.
ejemplo los aceites esenciales, el requisito de rotación óptica se
expresa en función de la rotación observada, a, medida bajo las
condiciones definidas en la monografı́a correspondiente.
Históricamente, la polarimetrı́a se realizaba empleando un
instrumento en el cual se estimaba el grado de rotación óptica al
igualar visualmente la intensidad de los campos divididos. Por este
h785i OSMOLALIDAD Y
motivo, se empleaba con mayor frecuencia la lı́nea D de la lámpara OSMOLARIDAD
de sodio a la longitud de onda de 589 nm en el espectro visible. La
rotación especı́fica determinada en la lı́nea D se expresa con el
sı́mbolo:
INTRODUCCIÓN
La presión osmótica tiene una importancia fundamental en todos
los procesos biológicos donde hay difusión de solutos o transferencia
de lı́quidos a través de membranas. La ósmosis sucede cuando un
disolvente, pero no las moléculas de soluto, pasa a través de una
y gran parte de los datos disponibles se expresan de esta forma. El membrana semipermeable desde regiones de menor a mayor
empleo de longitudes de onda menores, como por ejemplo las concentración para llegar al equilibrio. Es muy importante para los
obtenibles con las lı́neas de la lámpara de mercurio, aisladas a través profesionales conocer las presiones osmóticas para poder determinar
de filtros de máxima transmitancia, aproximadamente a 578, 546, si una solución parenteral es hipoosmótica, isoosmótica o hipe-
436, 405 y 365 nm en un poları́metro fotoeléctrico, ha demostrado rosmótica. Una medición cuantitativa de la presión osmótica facilita
proporcionar ventajas en sensibilidad con una reducción consi- la dilución requerida para producir una solución isoosmótica con
guiente de la concentración del compuesto de prueba. En general, la respecto a la sangre entera.
rotación óptica observada a 436 nm es aproximadamente el doble y
a 365 nm aproximadamente tres veces la observada a 589 nm. La
reducción de la concentración del soluto requerida para la medición PRESIÓN OSMÓTICA
a veces puede lograrse mediante la conversión de la sustancia
a analizar en una sustancia que tenga una rotación óptica La presión osmótica de una solución depende del número de
significativamente mayor. La rotación óptica también se afecta por partı́culas en la solución y, por lo tanto, se la considera como una
el disolvente empleado para la medición y éste debe especificarse en propiedad coligativa. Una partı́cula puede ser una molécula o un ión
todos los casos. o una especie agregada (por ejemplo, un dı́mero) que puede existir
En la actualidad, es práctica común emplear otras fuentes de luz, en forma diferenciada en solución. Una solución presenta un
tales como lámparas de xenón o halógenas de tungsteno, con filtros comportamiento ideal cuando no hay interacción entre los solutos y
apropiados, puesto que éstas pueden ser menos costosas, además de el disolvente, excepto cuando las moléculas del disolvente están
ser de larga duración y tener un amplio rango de longitudes de onda unidas a los solutos mediante enlaces de hidrógeno o enlaces
de emisión con respecto a las fuentes de luz tradicionales. covalentes coordinados. En el caso de tales soluciones que contienen
un soluto no disociado, la presión osmótica (p) es directamente
Rotación Especı́fica—La referencia Rotación especı́fica h781Si proporcional a su molalidad (el número de moles de soluto por
en una monografı́a significa que esa rotación especı́fica se calcula- kilogramo de disolvente):
rá a partir de las rotaciones ópticas observadas en la Solución de
prueba, obtenida según se indica en ese mismo texto. A menos que p = (rRT/1000)m,
*
Pueden encontrarse calibradores adecuados disponibles a través de la Office
of Standard Reference Materials, National Institute of Standards and en donde r es la densidad del disolvente a la temperatura T (en la
Technology, NIST (Oficina de Materiales de Referencia Estándar, Instituto escala absoluta); R es la constante universal del gases; y m es la
Nacional de Estándares y Tecnologı́a), Gaithersburg, MD 20899, al igual que molalidad de la solución. Para el caso de una solución real que
lotes vigentes de Materiales de Referencia Estándar, Dextrosa y Sacarosa. contiene más de un soluto, la presión osmótica se calcula por la
Como alternativa, la calibración puede controlarse empleando un Estándar de fórmula:
Referencia de Polarización, que consiste de una placa de cuarzo montada
sobre un soporte perpendicular al paso de la luz. Estos estándares, p = (rRT/1000) imim,i,
normalizados respecto a estándares del NIST, se encuentran disponibles
a través de Rudolph Research Analytical, 354 Route 206, Flanders, NJ en donde i es el número de partı́culas formadas por la disociación
07836, o Rudolph Instruments, Inc., 40 Pier Lane, Fairfield, NJ 07004-2113. de una molécula del iésimo soluto (el número ordinal de soluto); i =
346 h785i Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Fı́sicas USP 30
1 para solutos no iónicos (que no se disocian); mi es la molalidad del El resultado sugiere que la solución es ligeramente hiperosmótica
iésimo soluto (el número ordinal de soluto); y m,i es el coeficiente dado que la osmolalidad de la sangre es entre 285 y 310 mOsmol por
osmótico molal del iésimo soluto. El coeficiente osmótico molal kg. Sin embargo, se ha descubierto que la solución es hipoosmótica
tiene en cuenta la desviación de una solución con respecto al y se ha determinado experimentalmente una osmolalidad de 255
comportamiento ideal. Su valor depende de la concentración del mOsmol por kg.1 El ejemplo ilustra que los valores de osmolaridad
soluto o los solutos en la solución, de sus propiedades quı́micas y de calculados teóricamente a partir de la concentración de una solución
sus caracterı́sticas iónicas. El valor del coeficiente osmótico molal de se deben interpretar con cautela y es posible que este valor no
un soluto se puede determinar experimentalmente midiendo el represente las propiedades osmóticas de las soluciones en infusión.
descenso del punto de congelación a diferentes concentraciones La discrepancia entre los resultados teóricos (osmolaridad) y los
molales. A concentraciones de interés farmacéutico, el valor del experimentales (osmolalidad) se debe, en parte, al hecho de que la
coeficiente osmótico molal es menos de uno. El coeficiente osmótico presión osmótica está relacionada con la osmolalidad y no con la
molal disminuye al aumentar la concentración del soluto (Tabla 1). osmolaridad. Más significativamente, la discrepancia entre los
resultados experimentales y los cálculos teóricos se debe a que la
presión osmótica de una solución real es menor que la de una
OSMOLALIDAD solución ideal debido a las interacciones entre las moléculas del
soluto o entre las moléculas del soluto y del disolvente en una
La osmolalidad de una solución m se representa mediante la solución. Estas interacciones reducen la presión que ejercen las
fórmula moléculas del soluto sobre la membrana semipermeable, lo que
reduce los valores experimentales de la osmolalidad en comparación
m = imim,i. con los valores teóricos. Esta diferencia está relacionada con el
La osmolalidad de una solución real se corresponde con la molalidad coeficiente osmótico molal (m,i). El ejemplo también ilustra la
de la solución ideal que contiene solutos que no se disocian y se importancia de determinar experimentalmente la osmolalidad de una
expresa en osmoles o miliosmoles por kilogramo de disolvente solución, en vez de calcular el valor teóricamente.
(Osmol por kg o mOsmol por kg, respectivamente), una unidad que
es similar a la molalidad de una solución. Ası́, la osmolalidad es la
medida de la presión osmótica ejercida por una solución real a cada MEDICIÓN DE LA OSMOLALIDAD
lado de una membrana semipermeable. Al igual que la presión
osmótica, otras propiedades coligativas de la solución, tales como la Normalmente, el valor de osmolalidad de una solución se
disminución de la presión de vapor, la elevación del punto de determina midiendo el descenso del punto de congelación de una
ebullición y el descenso del punto de congelación, también están solución.
directamente relacionadas con la osmolalidad de la solución. Ası́, la Aparato—El aparato, un osmómetro para medir el descenso del
osmolalidad de una solución se determina tı́picamente con la mayor punto de congelación, consiste en lo siguiente: un medio para enfriar
exactitud y conveniencia midiendo el descenso del punto de el recipiente utilizado para la medición; una resistencia sensible a la
congelación (Tf): temperatura (termistor), con un dispositivo adecuado para medir la
diferencia de potencial o de corriente y que puede graduarse en
Tf = kf m, función de cambios de temperatura o en osmolalidad; y un
en donde kf es la constante crioscópica molal, que es una propiedad mecanismo para mezclar la muestra.
del disolvente. Para el agua, el valor de kf es 1,8608 por Osmol. Es Los osmómetros que miden la presión de vapor de las soluciones
decir, 1 Osmol de un soluto agregado a 1 kg de agua hace descender se emplean con menor frecuencia. Requieren un volumen de muestra
el punto de congelación en 1,8608. más pequeño (generalmente cerca de 5 mL), aunque la exactitud y
precisión de los resultados de las determinaciones de osmolaridad
son comparables a las obtenidas mediante el uso de osmómetros que
dependen de la observación del punto de congelación.
OSMOLARIDAD Soluciones Estándar—Preparar las Soluciones Estándar como se
La osmolaridad de una solución es una cantidad teórica expresada indica en la Tabla 1, según sea necesario.
en osmoles por L (Osmol por L) de una solución y se usa
ampliamente en la práctica clı́nica porque expresa los osmoles en
función del volumen. La osmolaridad no se puede medir pero se
calcula teóricamente a partir del valor de osmolalidad medido
experimentalmente.
A veces, la osmolaridad (c) se calcula teóricamente a partir de las
concentraciones molares:
c = ici,
en donde i es según se ha definido anteriormente y ci es la
concentración molar del iésimo soluto (el número ordinal de soluto)
en solución. Por ejemplo, la osmolaridad de una solución que se
prepara disolviendo 1 g de vancomicina en 100 mL de solución de
cloruro de sodio al 0,9% se puede calcular de la siguiente manera:
[3 6 10 g/L/1468 (peso molecular de la vancomicina) + 2 6 9 g/L/
58,5 (peso molecular del cloruro de sodio)] 6 1000 = 328 mOsmol/
L.
1
Kastango, E.S. y Hadaway, L. International Journal of Pharmaceutical
Compounding 5, (2001) 465-469.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h785i Osmolalidad y Osmolaridad 347
Solución de Prueba—En el caso de un sólido para inyección, Antes de cada medición, enjuagar la celda de medición por lo menos
reconstituir con el diluyente apropiado según se indica en las dos veces con la solución a analizar. Repetir el procedimiento con
instrucciones de la etiqueta. En el caso de soluciones, usar la muestra cada Solución de Prueba. Leer la osmolalidad de la Solución de
tal como se encuentra. [NOTA—Se puede diluir una solución para que Prueba directamente o calcularla a partir del valor obtenido para el
quede dentro del intervalo de medición del osmómetro, si fuera descenso del punto de congelación.
necesario, pero se deberá consignar el resultado correspondiente a la Suponiendo que el valor del coeficiente osmótico es esencial-
solución diluida y NO se debe multiplicarlo por un factor de dilución mente el mismo ya sea que la concentración se exprese en molalidad
para calcular la osmolalidad de la solución original. El coeficiente o molaridad, la osmolalidad de una solución determinada experi-
osmótico molal es una función de la concentración. Por lo tanto, mentalmente se puede convertir en osmolaridad de la misma manera
cambia con la dilución.] que la concentración de una solución se convierte de molalidad
Procedimiento—Fijar el valor cero del aparato con agua. Para a molaridad. A menos que una solución esté muy concentrada, la
calibrar el aparato, elegir al menos dos soluciones de la Tabla 1 de osmolaridad de una solución (c) se puede calcular a partir de su
manera que las osmolalidades de las Soluciones Estándar cubran el osmolalidad determinada experimentalmente (m):
intervalo de osmolalidad esperado de la Solución de Prueba. c = 1000m / (1000 / r + wi i),
Introducir un volumen adecuado de cada Solución Estándar en la
celda de medición conforme a las instrucciones del fabricante y en donde wi es el peso en gramos; y i es el volumen especı́fico
poner en marcha el sistema de enfriamiento. En general, el parcial, en mL por g, del iésimo soluto (el número ordinal de soluto).
dispositivo de mezclado se programa para que opere a una El volumen especı́fico parcial de un soluto es el cambio en volumen
temperatura inferior a la temperatura más baja esperada de descenso de una solución cuando se disuelve 1 g adicional de soluto en la
del punto de congelación. El aparato indica cuando se ha logrado el solución. Este volumen se puede determinar midiendo las densidades
equilibrio. Calibrar el osmómetro utilizando un dispositivo de ajuste de la solución antes y después de agregar el soluto. Los volúmenes
adecuado de modo que la lectura corresponda a la osmolalidad o al especı́ficos parciales de las sales son generalmente muy pequeños,
valor de descenso del punto de congelación de la Solución Estándar aproximadamente de 0,1 mL por g. Sin embargo, los otros solutos
que aparece en la Tabla 1. [NOTA—Algunos instrumentos indican la son generalmente mayores. Por ejemplo, los volúmenes especı́ficos
osmolalidad y otros muestran el descenso del punto de congelación.] parciales de los aminoácidos están entre 0,6 mL y 0,9 mL por g.
348 h786i Estimación de la Distribución del Tamaño de Partı́cula / Pruebas Fı́sicas USP 30
Seleccionar los tamices de forma que todos los tamaños de electrostática, tomar las precauciones necesarias para garantizar
partı́cula de la muestra de prueba estén comprendidos en el intervalo. que esa carga no altere los resultados del análisis. En algunos casos,
Se recomiendapemplear un grupo de tamices encajados con una se recomienda agregar un 0,5 por ciento (m/m) de un agente anti-
progresión de 2 del área de los orificios del tamiz. Encajar los estático, como un dióxido de silicio coloidal u óxido de aluminio,
tamices de forma que la malla con orificios más grandes quede en el para reducir el efecto a un mı́nimo. Si no se puede eliminar la carga
extremo superior y la que tenga los orificios más pequeños en el estática y la absorción o pérdida de agua, es necesario emplear otra
extremo inferior. Clasificar los orificios del tamiz asignándoles un técnica para determinar el tamaño de partı́cula.
valor en micrómetros o en milı́metros. [NOTA—Los números de malla Métodos de Agitación—Todos los distintos tipos de dispositivos
que figuran en la tabla se proporcionan exclusivamente para realizar de agitación para tamices y polvos están disponibles comercialmente
conversiones.] Los tamices analı́ticos son preferentemente de acero y son adecuados para el tamizado analı́tico. Sin embargo, las
inoxidable o, en su defecto, de bronce o de otro alambre no reactivo distintas fuerzas y las diferencias de magnitud de estas fuerzas sobre
adecuado. las partı́culas en estudio que emplean los distintos métodos de
Tanto la primera calibración del tamiz analı́tico como las agitación producirán resultados distintos y tendrán puntos finales
subsiguientes se realizan según lo dispuesto en la versión más distintos. Algunos métodos emplean la agitación mecánica o electro-
actualizada de la norma ISO 3310-1. Antes de emplear un tamiz, magnética que induce un cierto grado de oscilación vertical o de
examinarlo cuidadosamente en busca de fracturas y distorsiones movimiento circular en el plano horizontal o golpes suaves o una
considerables, sobre todo en las juntas de la malla y el cilindro. En combinación de golpes suaves y de movimiento circular en el plano
algunos casos, se pueden emplear métodos ópticos para calibrar el horizontal. Otro método consiste en arrastrar las partı́culas en un
tamiz, estimando el tamaño promedio del orificio y la variabilidad chorro de aire. Es necesario indicar en los resultados qué método de
que pudieran presentar los orificios de la malla. Alternativamente agitación se empleó y con qué parámetros (si están sujetos
también se pueden emplear Esferas de Vidrio Estándar para medir a variación), ya que los cambios en las condiciones de agitación
los orificios reales de los tamices analı́ticos en el intervalo de 212 mm generan cambios en los resultados del tamizado analı́tico y en la
a 850 mm. A menos que la monografı́a individual especifique algo determinación del punto final y en algunos casos la variación es lo
diferente, analizar el tamiz con temperatura ambiente controlada y en suficientemente amplia como para dar resultados que no cumplan
condiciones de humedad relativa ambiente. con los requisitos en ciertas circunstancias.
Limpieza de los Tamices Analı́ticos—En condiciones ideales se Determinación del Punto Final—El tamizado analı́tico se da por
recomienda limpiar los tamices solamente con un chorro de aire concluido cuando el peso de cualquiera de los tamices no presenta
o con un chorro de lı́quido. Si después del chorro de lı́quido o de variaciones de más de 5% o de 0,1 g (10% si se emplean tamices de
aire, todavı́a se observan orificios obstruidos por partı́culas del 76 mm) del peso previo obtenido en ese mismo tamiz. Si en uno
material en estudio, emplear un cepillo como último recurso cualquiera de los tamices hay menos del 5% del total de la muestra,
pasándolo suavemente y tomando las precauciones necesarias para aumentar el punto final para ese tamiz hasta un 20% del peso previo
no dañar el tamiz. obtenido en ese mismo tamiz.
Muestra de Prueba—Si la monografı́a del material en estudio no Si en uno de los tamices se encuentra más del 50% del peso total
indica el peso de la muestra de prueba, emplear una muestra de de la muestra, a menos que esta circunstancia esté indicada en la
prueba de 25 g a 100 g, en función de la densidad aparente y tamices monografı́a, repetir la prueba agregando a ese conjunto de tamices
analı́ticos de 200 mm de diámetro. Para tamices de 76 mm calcular la un tamiz con orificios más grandes, de tamaño intermedio entre el
cantidad de material adecuada considerando que es aproximada- tamaño del tamiz que contiene el exceso de peso y el siguiente tamiz
mente 1/7 de la cantidad que puede colocarse en un tamiz de 200 en el orden del grupo original, es decir, agregando el tamiz de la serie
mm. Determinar el peso más apropiado para un material dado, ISO omitido en el conjunto de tamices.
tamizando muestras de distintos tamaños pesadas con exactitud, por
ejemplo 25 g, 50 g y 100 g colocadas en un agitador mecánico
durante el mismo periodo de tiempo. [NOTA—Si los resultados MÉTODOS DE TAMIZADO
obtenidos con las muestras de 25 g y 50 g son similares, pero el
porcentaje obtenido en el tamiz de orificios más pequeños con la Agitación Mecánica
muestra de 100 g es menor, la muestra de 100 g es demasiado
grande.] Si sólo se dispone de una muestra de 10 g a 25 g, se pueden Método de Tamizado en Seco—Tarar cada tamiz con una
emplear tamices analı́ticos de menor diámetro que cumplan con las aproximación de 0,1 g. Colocar una cantidad de la muestra de
mismas especificaciones de la malla. En este caso, volver prueba pesada con exactitud en el tamiz superior (el de orificios más
a determinar el punto final. En algunos casos, puede ser necesario grandes) y tapar. Agitar el conjunto de tamices durante 5 minutos. A
emplear muestras con una masa menor (por ejemplo, hasta 5 g). En continuación desmontar cuidadosamente cada tamiz del conjunto de
algunos casos, si se trata de materiales con densidad de partı́culas tamices sin que haya pérdida de material. Volver a pesar cada tamiz y
aparente baja, o de materiales compuestos principalmente por determinar el peso del material en cada uno de ellos. Determinar el
partı́culas de forma muy isodiamétrica, es necesario emplear una peso del material utilizando una bandeja recolectora u otro
muestra de menos de 5 g en un tamiz de 200 mm, para ası́ evitar la adminı́culo similar para recolectar el material Volver a montar el
obstrucción excesiva de los orificios del tamiz. En la validación de conjunto de tamices y agitar durante 5 minutos. Desmontar y pesar
un método de tamizado analı́tico en particular, se asume que el cada uno de los tamices como se describió anteriormente. Repetir los
problema de la obstrucción de los orificios se tomó en consideración. pasos hasta obtener los resultados del punto final (ver Determinación
Si el material en estudio es propenso a absorber o a perder del Punto Final en Tamices Analı́ticos) Una vez completado el
cantidades de agua considerables con las variaciones de humedad, análisis, conciliar los pesos del material. Las pérdidas totales no
efectuar la prueba en un ambiente controlado apropiado. De forma exceden de 5% del peso de la muestra original.
análoga, si se sabe que el material en estudio genera carga
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h788i Partı́culas en Inyectables 351
PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR especı́ficas del fabricante. Los principios que deben seguirse para
OBSTRUCCIÓN DE LUZ asegurar que los instrumentos funcionen dentro de lı́mites aceptables
se enumeran más adelante.
Estándares de Referencia USP h11i—ER Partı́culas para La siguiente información para la normalización de los instrumen-
Conteo USP. tos ayuda a asegurar que la exactitud del volumen, la velocidad de
Esta prueba se aplica a inyecciones de gran volumen con un flujo de la muestra, la curva de respuesta al tamaño de las partı́culas,
contenido declarado en la etiqueta de más de 100 mL, a menos que la resolución de los sensores y la exactitud del conteo sean
se especifique algo diferente en la monografı́a correspondiente. La adecuadas para la realización de la prueba. Estos procedimientos se
prueba cuenta las partı́culas sólidas o lı́quidas en suspensión. deben llevar a cabo cada seis meses como mı́nimo.
También se aplica a inyecciones monodosis o multidosis de pequeño
volumen con un contenido declarado en la etiqueta de 100 mL
o menos, ya sean soluciones o soluciones que han sido reconstituidas EXACTITUD DEL VOLUMEN DE MUESTRA
a partir de sólidos estériles, cuando se especifica una prueba de
detección de partı́culas en la monografı́a correspondiente. Están Dado que el conteo de partı́culas en una alı́cuota de muestra varı́a
exentos de estos requisitos aquellos productos cuya monografı́a directamente con el volumen de lı́quido tomado, es importante que la
especifica que la etiqueta indica que el producto se debe usar con un exactitud del muestreo esté comprendida en un intervalo determi-
filtro final. nado. Para la determinación del volumen de muestra, determinar el
volumen muerto (tara) en el dosificador de la muestra con agua
destilada y filtrada o agua desionizada pasada por un filtro con un
tamaño de poro de 1,2 mm o menor. Transferir a un recipiente un
Aparato de Prueba volumen de agua destilada y filtrada o agua desionizada mayor que
El aparato es un sistema electrónico que cuenta partı́culas el volumen de muestra a ser tomado y pesar. Pasar a través del
suspendidas en un lı́quido mediante un sensor de obstrucción de tomador de muestra un volumen adecuado para el muestreador
luz con un dispositivo apropiado para la toma de muestras. Diversos especı́fico y volver a pesar el recipiente. Para determinar el volumen
dispositivos adecuados de este tipo están comercialmente dispon- de la muestra, restar el volumen de tara del volumen de tara más el
ibles. Los responsables de la prueba deben asegurar que los volumen de la muestra combinados. Verificar que el valor obtenido
parámetros operativos del instrumental sean los adecuados para no difiera en más de 5% con respecto al volumen de muestra
lograr la exactitud y la precisión requeridas para el resultado de la adecuado para la prueba. Como alternativa, el volumen de la muestra
prueba, y deben capacitar adecuadamente a los técnicos que realizan puede determinarse usando una probeta graduada Clase A adecuada
la prueba. (ver Aparatos Volumétricos h31i). [NOTA—Los instrumentos de este
Es importante señalar que para las aplicaciones farmacopeicas lo tipo requieren un volumen de tara variable. Ésta es la cantidad de
ideal es que el contador de partı́culas mida y cuente reproduci- muestra extraı́da antes del conteo. Para el caso de muestreadores que
blemente las partı́culas presentes en el material inyectable analizado. funcionan con jeringa, este volumen puede determinarse fijando el
Los instrumentos disponibles van desde sistemas que se calibran y volumen de muestra en cero e iniciando el muestreo para que el
normalizan a mano a sistemas complejos que incorporan computa- único volumen de solución extraı́da sea la tara. Restar el volumen de
doras y programas informáticos para la normalización. En tara del volumen total de solución extraı́da en el ciclo de muestreo
consecuencia, no es posible especificar métodos exactos para la para determinar el volumen de muestra tomado.]
normalización del instrumento y es necesario resaltar que se requiere
un resultado final en la normalización en lugar de un método
especı́fico para obtener este resultado. En esta sección se pone VELOCIDAD DE FLUJO DE LA MUESTRA
énfasis en los criterios que debe cumplir un sistema más que en los
métodos especı́ficos que deben utilizarse para su determinación. Es Verificar que la velocidad de flujo esté dentro de las especifica-
responsabilidad del usuario aplicar los diversos métodos de ciones del fabricante para el sensor usado. Esta verificación puede
normalización adecuados para un instrumento especı́fico. A hacerse usando un cronómetro calibrado que mida el tiempo
continuación, se presentan los criterios operativos fundamentales. requerido por el instrumento para retirar y contar un volumen de
muestra especı́fico (es decir, el tiempo entre el comienzo y el final
Lı́mites de Concentración del Sensor—Usar un instrumento que del ciclo de conteo determinado por medio de las luces indicadoras
tenga un lı́mite de concentración (número máximo de partı́culas por del instrumento u otro medio). Los sensores pueden funcionar con
mL) que sea mayor que la concentración de partı́culas en la muestra exactitud dentro de un intervalo de velocidades de flujo. Realizar el
que se desea contar, según lo indicado por el fabricante. El lı́mite de Procedimiento de Prueba a la misma velocidad de flujo que se
concentración para un sensor, certificado por el fabricante, se define seleccionó para la calibración del instrumento.
como el nivel de conteo donde las cuentas por coincidencia debidas
a la presencia simultánea de dos o más partı́culas en el volumen de
lectura del sensor, es menos de 10% de los conteos obtenidos para
las partı́culas de 10 mm. CALIBRACIÓN
Intervalo Dinámico del Sensor—El intervalo dinámico del Usar uno de los siguientes métodos.
instrumento usado (intervalo de tamaños de partı́culas que pueden
contarse y medirse con exactitud) deben incluir el tamaño de Método Manual—Calibrar el instrumento con un mı́nimo de tres
partı́cula más pequeño que se debe enumerar en los artı́culos de calibradores, cada uno de ellos con esferas de poliestireno de
prueba. diámetro uniforme de aproximadamente 10 mm, 15 mm y 25 mm, en
un vehı́culo acuoso.* Las esferas calibradoras deben tener un
diámetro promedio que no difiera en más de 5% con respecto a los
diámetros nominales (10; 15 y 25 mm) y estar normalizadas con
Normalización del Instrumento materiales de referencia rastreables a los patrones de referencia del
NIST. El número de esferas contadas debe estar dentro del lı́mite de
En el siguiente texto sobre la normalización de los instrumentos se concentración del sensor. Preparar suspensiones de las esferas
pone más énfasis en los criterios de desempeño que en los métodos calibradoras en agua a una concentración de 1000 a 5000 partı́culas
especı́ficos empleados para calibrar o normalizar un instrumento por mL y determinar el canal de lectura que corresponda al conteo
determinado. Este enfoque es particularmente evidente en la más alto de la distribución de esferas. Esto se consigue haciendo que
descripción de la calibración, en donde debe contemplarse el uso el valor umbral de conteo máximo divida a la distribución en dos
de métodos manuales, métodos basados en programas encapsulados partes iguales en número de conteos, con el instrumento ajustado en
en un microprocesador (firmware) o en programas externos el modo de conteo diferencial (método de semi-conteo por ventana
(software) y el uso de instrumentos de prueba electrónicos. Es móvil). Usar únicamente la porción central de la distribución en este
fundamental una calificación adecuada del instrumento para que la
prueba se realice de acuerdo con los requisitos. Como en una prueba *
La norma F658-87 de la ASTM proporciona descripciones útiles sobre los
pueden emplearse instrumentos de diferentes marcas, el usuario debe procedimientos de calibración que utilizan esferas de látex de tamaños
asegurarse de que el contador se utilice según las instrucciones prácticamente uniformes.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h788i Partı́culas en Inyectables 353
cálculo para evitar incluir porciones asimétricas del pico. La ventana los Canales 1 y 3. Verificar que los conteos en el Canal 1 y en el
de conteo es la porción de la distribución que ha de dividirse en Canal 3 sean 1,68 + 10% y 0,32 + 10%, respectivamente, del
partes iguales. La ventana está limitada por los voltajes umbrales, conteo en el Canal 2. Si éste no es el caso, ajustar el umbral del
que se fijan aproximadamente a +20% el diámetro medio de las Canal 1 y del Canal 3 para cumplir con estos criterios. Una vez
esferas de prueba. La ventana deberı́a incluir todas las esferas satisfechos estos criterios, pasar una muestra de suspensión a través
individuales, considerando la desviación estándar de las esferas y la del contador hasta que los conteos en el Canal 2 alcancen
resolución del sensor, excluyendo el ruido y las esferas aglomeradas. aproximadamente 10 000, o hasta contar un volumen adecuado
El valor de 20% se eligió considerando la suma de 10% como la peor (por ejemplo, 10 mL) de la suspensión de esferas. Verificar que los
resolución del sensor más 10% como la peor desviación estándar de conteos en el Canal 1 y Canal 3 sean de 1,68 + 3% y 0,32 + 3%,
las esferas. Como los umbrales son proporcionales a la superficie de respectivamente, del conteo en el Canal 2.
las esferas y no a su diámetro, los voltajes inferior y superior a los Registrar el tamaño de partı́cula para los umbrales recién
que se ajusta el instrumento se determinan según las siguientes determinados de los Canales 1; 2 y 3. Restar el tamaño de partı́cula
ecuaciones: para el Canal 2 del tamaño para el Canal 3. Restar el tamaño de
partı́cula para el Canal 1 del tamaño para el Canal 2. Los valores
VL = 0,64VS, determinados de esta manera son las desviaciones estándar
en donde VL es el voltaje de ajuste inferior y VS es el voltaje en el observadas en el lado positivo y negativo del conteo medio para el
centro del pico y estándar 10 mm. Calcular el porcentaje de resolución del sensor, por
la fórmula:
VU = 1,44VS,
en donde VU es el voltaje de ajuste superior.
Una vez determinados los umbrales para el centro del pico, usarlos
para los estándares y luego crear una regresión de logaritmo del
voltaje en función del logaritmo del tamaño de partı́cula, a partir de
la cual se pueden determinar los ajustes del instrumento para en donde SO es la desviación estándar máxima observada para la
tamaños de 10 mm y 25 mm. esfera; SS es la desviación estándar suministrada por el proveedor
Método Automático—La curva de calibración (respuesta al para las esferas y D es el diámetro de las esferas, en mm, especificado
tamaño) para el sistema instrumento-sensor se puede obtener por el proveedor. La resolución no es mayor de 10%.
mediante el uso de rutinas de software validadas ofrecidas por los Método Automático—Para algunos contadores existen progra-
proveedores del instrumento. Estas rutinas pueden estar incluidas mas que permiten la determinación automatizada de la resolución del
como parte del software del instrumento o se puede emplear una sensor. Este software puede estar incluido en el instrumento o se
microcomputadora conectada al contador. El uso de estos métodos puede emplear junto con una microcomputadora conectada al
automatizados es adecuado si el proveedor certifica por escrito que el contador. Es adecuado usar estos métodos automatizado si el
software proporciona una curva de respuesta equivalente a la lograda proveedor certifica por escrito que el software permite determinar
con el método manual y si el usuario valida la calibración una resolución equivalente al método manual y si el usuario valida la
automatizada según sea necesario. determinación automatizada de resolución según sea necesario.
Método Electrónico—Usando un analizador multicanal de altura Método Electrónico—Registrar la distribución del voltaje de
de picos, determinar el canal central de la respuesta del contador de salida del sensor de partı́culas, usando un analizador multicanal
partı́culas por pulsos para cada suspensión estándar. Este ajuste de mientras se toma la muestra de una suspensión estándar de tamaño
voltaje de pico se usa como umbral para calcular la curva de de partı́cula de 10 mm. Para determinar la resolución, mover el cursor
respuesta para el instrumento. Las suspensiones estándar a utilizar del analizador multicanal hacia arriba y hacia abajo en la escala de
para la calibración se procesan en orden y se determinan las potencial eléctrico con respecto al voltaje medio de pulso para
medianas de los voltajes de pulso para cada suspensión. Estos identificar un canal a cada lado del pico de 10 mm que contenga
umbrales se utilizan para generar la curva de respuesta de tamaño aproximadamente 61% del conteo observado en el canal central.
manualmente o por rutinas de software. Los umbrales determinados Para convertir los valores de mV de estos dos canales a tamaños de
con los datos del analizador multicanal se transfieren al contador partı́cula mediante el uso de la curva de respuesta en función del
para finalizar la calibración. Si se utiliza este procedimiento con un tamaño y obtener de este modo, el tamaño de partı́cula con 1
instrumento basado en un comparador, los comparadores del desviación estándar respecto del estándar de 10 mm. Usar estos
contador deben ajustarse exactamente en forma previa. valores para calcular la resolución según se describe en el Método
Manual.
RESOLUCIÓN DEL SENSOR
EXACTITUD DEL CONTEO DE PARTÍCULAS
La resolución del tamaño por el contador de partı́culas depende
del sensor usado y puede variar con distintos sensores del mismo Determinar la exactitud del instrumento para contar partı́culas
modelo. Se determina la resolución del contador de partı́culas de 10 usando el Método 1 (en el caso de inyecciones de pequeño volumen)
mm usando esferas calibradoras de 10 mm. La desviación estándar o el Método 2 (en el caso de inyecciones de gran volumen).
relativa para la distribución de tamaños del estándar empleado no es Método 1—
más de 5%. Los métodos aceptables para determinar la resolución
del tamaño de las partı́culas son (1) determinar manualmente el Procedimiento—Preparar la suspensión y el blanco empleando el
ensanchamiento del pico debido a la respuesta del instrumento; (2) ER Partı́culas para Conteo USP. Con el instrumento ajustado para
usar un método electrónico para medir y ordenar el voltaje de salida hacer el conteo en modo acumulativo (total), realizar los conteos
del sensor de partı́culas con un analizador multicanal; y (3) usar fijando los ajustes en un valor mayor o igual a 10 mm y mayor
métodos automatizados. o igual a 15 mm. Mezclar el blanco invirtiéndolo 25 veces durante 10
Método Manual—Ajustar el contador de partı́culas para que segundos y desgasificar la mezcla por ultrasonido (a una potencia de
80 a 120 vatios) durante aproximadamente 30 segundos o dejándola
funcione en modo acumulativo o en modo de conteo total. Referirse en reposo. Destapar el envase y mezclar suavemente el contenido por
a la curva de calibración obtenida previamente y determinar el rotación manual o por medios mecánicos, procurando no introducir
umbral de voltaje para las esferas de 10 mm. Ajustar 3 canales del burbujas de aire ni contaminación. Mezclar continuamente durante
contador que se va a utilizar en el procedimiento de calibración de la todo el análisis. Extraer directamente del envase tres alı́cuotas
siguiente manera: consecutivas de no menos de 5 mL cada una, obtener los conteos de
El Canal 1 se ajusta al 90% del voltaje umbral. partı́culas y descartar los datos de la primera. [NOTA—Completar el
El Canal 2 se ajusta al voltaje umbral. procedimiento en cinco minutos.] Repetir el procedimiento usando la
El Canal 3 se ajusta al 110% del voltaje umbral. suspensión en lugar del blanco. A partir de los promedios de los
Pasar una muestra a través del sensor, observando el conteo en el conteos obtenidos del análisis de las dos alı́cuotas de la suspensión
Canal 2. Cuando el conteo de partı́culas en ese canal alcance
aproximadamente 1000, detener el conteo y observar los conteos en
354 h788i Partı́culas en Inyectables / Pruebas Fı́sicas USP 30
a un valor mayor o igual a 10 mm y del análisis de las dos alı́cuotas por rotación moderada o por medios mecánicos para suspender las
del blanco a un valor mayor o igual a 10 mm, calcular el número de partı́culas. Retirar tres muestras consecutivas de no menos de 5 mL
partı́culas en cada mL, por la siguiente fórmula: cada una para el conteo de partı́culas, sin tener en cuenta el primer
conteo. Si se observan más de 10 partı́culas de un tamaño de 10 mm
(PS – PB) / V, o mayor, o más de 2 partı́culas de un tamaño de 25 mm o mayor en la
en donde PS es el conteo de partı́culas promedio obtenido a partir de muestra combinada de 10 mL, el ambiente no es adecuado para el
la suspensión; PB es el conteo de partı́culas obtenido a partir del análisis de partı́culas: el agua destilada y filtrada o agua desionizada
blanco; y V es el volumen promedio, en mL, de las 4 porciones y los materiales de vidrio no se han preparado de manera adecuada
analizadas. Repetir los cálculos, usando los resultados obtenidos con o el contador está generando conteos espurios. En este caso, repetir
un ajuste a no menos de 15 mm. los pasos preparatorios hasta que las condiciones de análisis sean
adecuadas para la prueba.
Interpretación—El instrumento cumple con los requisitos de
Exactitud del Conteo de Partı́culas si el conteo obtenido a no menos
de 10 mm y la relación entre el conteo obtenido a un valor mayor
o igual a 10 mm y el obtenido a un valor mayor o igual a 15 mm se Procedimiento de Prueba
ajusta a los valores que acompañan el ER Partı́culas para Conteo
USP. Si el instrumento no cumple con los requisitos de Exactitud del PREPARACIÓN DE PRUEBA
Conteo de Partı́culas, repetir el procedimiento con la suspensión y el
blanco restante. Si los resultados de la segunda prueba están dentro Preparar las muestras de prueba en la siguiente secuencia. Fuera
de los lı́mites anteriores, el instrumento cumple con los requisitos de de la campana de flujo laminar, quitar los cierres externos, bandas de
la prueba para Exactitud del Conteo de Partı́culas. Si en el segundo sellado y toda etiqueta de papel suelta o que libere partı́culas.
intento el sistema no cumple con los requisitos de la prueba, Enjuagar el exterior de los envases con agua destilada y filtrada
determinar la causa de los fracasos, corregirla y volver a someter o agua desionizada según se indica en el Ambiente de Prueba.
a prueba el instrumento. Proteger los envases de la contaminación ambiental hasta que se
haya realizado la prueba. Retirar el contenido de los envases,
Método 2— evitando la posibilidad de generar partı́culas que puedan contaminar
Procedimiento—Usando esferas calibradoras estándar con un la muestra. El contenido de envases con tapones desmontables puede
diámetro nominal de 15 a 30 mm, preparar una suspensión que muestrearse directamente quitándoles los cierres. También se pueden
contenga entre 50 y 200 partı́culas por mL. Desgasificar la emplear dispositivos de muestreo con agujas que penetran los cierres
suspensión por ultrasonido (a una potencia de 80 a 120 vatios) de las unidades. Los productos envasados en envases de plástico
durante aproximadamente 30 segundos o dejándola en reposo. flexible pueden muestrearse haciendo un corte en el tubo de
Suspender las partı́culas en forma adecuada, mezclando suavemente, administración o cortando una punta de la unidad con una navaja
y realizar cinco conteos en alı́cuotas de 5 mL de la suspensión, o tijeras debidamente limpiadas.
usando un contador con el umbral fijado para partı́culas de 10 mm de Los productos secos o liofilizados pueden reconstituirse quitando
tamaño. Obtener el conteo promedio acumulativo de partı́culas por el cierre para agregar el diluyente o inyectando el diluyente con una
mL. Pipetear un volumen de esta suspensión que contenga de 250 jeringa hipodérmica que posea un filtro de un tamaño de poro de 1,2
a 500 partı́culas y transferir a un embudo de filtración preparado mm o menor. Si las muestras de prueba deben combinarse, retirar el
según se describe en Aparatos de Filtración en Conteo Microscópico cierre y vaciar el contenido en un recipiente limpio.
de Partı́culas. Después de secar la membrana, contar el número total El número de muestras de prueba debe ser suficiente para
de esferas estándar recolectadas en la membrana de filtración. Este evaluación estadı́sticamente válida que permita afirmar que un lote
conteo no debe diferir en más del 20% con respecto al conteo entero de producción u otro grupo grande de unidades, representado
instrumental promedio por mL para la suspensión. por las muestras de prueba cumple o excede los lı́mites. Si el
volumen en el envase es menor de 25 mL, llevar a cabo la prueba
con una solución combinada de 10 o más unidades. Las unidades de
Entorno de Prueba inyecciones de pequeño volumen pueden analizarse individualmente
si el volumen de cada unidad es 25 mL o mayor. Para inyecciones de
Realizar la prueba en un ambiente que no aporte una cantidad gran volumen, se analizan unidades individuales. Para inyecciones
importante de partı́culas. Las muestras deben limpiarse para que la de gran volumen o inyecciones de pequeño volumen donde el
cantidad de partı́culas externas introducidas tenga un efecto volumen de cada unidad es 25 mL o mayor, pueden analizarse
insignificante sobre el resultado de la prueba. Preferentemente, la menos de 10 unidades individuales, conforme a la definición de un
muestra de prueba, los materiales de vidrio, cierres y otros equipos plan de muestreo adecuado.
requeridos deben prepararse en un ambiente protegido con filtros de
aire de alta eficiencia contra partı́culas (HEPA) y usando vestimenta
que no desprenda pelusa y guantes sin polvo durante la preparación DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO
de las muestras.
Limpiar los materiales de vidrio, cierres y otros equipos Dependiendo de la forma farmacéutica analizada, proceder según
requeridos, preferentemente sumergiéndolos y restregándolos en se indica a continuación para la categorı́a correspondiente.
una solución tibia de detergente no iónico. Enjuagar con un chorro Preparaciones Lı́quidas—
de agua corriente y luego volver a enjuagar con agua destilada y
filtrada o agua desionizada. También pueden usarse disolventes Envases con Contenido Menor de 25 mL—Preparar los envases
orgánicos para facilitar la limpieza. [NOTA—Estos pasos describen según se indica en Preparación de Prueba. Mezclar y suspender las
una manera de limpiar los equipos; como alternativa, se pueden partı́culas de cada unidad invirtiéndola 20 veces. [NOTA—Debido al
conseguir equipos sin partı́culas de un proveedor apropiado.] Por pequeño volumen de algunos productos, puede ser necesario agitar
último, enjuagar los equipos en agua destilada y filtrada o agua la solución más vigorosamente para suspender las partı́culas
desionizada usando una boquilla de mano a presión con un filtro en completamente.] En un recipiente limpio, abrir y combinar el
el extremo u otra fuente de agua filtrada adecuada, como por ejemplo contenido de 10 o más unidades para obtener un volumen no menor
agua destilada o desionizada pasada a través de una cápsula de de 20 mL. Desgasificar la solución combinada por ultrasonido
filtración con un tamaño de poro de 1,2 mm o menor. durante aproximadamente 30 segundos o dejando la solución en
Para obtener los conteos del blanco, usar un recipiente limpio del reposo hasta que no tenga burbujas de aire. Mezclar suavemente el
mismo tipo y volumen al empleado en la prueba. Colocar un contenido en forma manual o por medios mecánicos, teniendo
volumen de 50 mL de agua destilada y filtrada o agua desionizada en cuidado de no introducir burbujas de aire ni contaminación. Extraer
el recipiente y agitar la muestra de agua en el recipiente de vidrio no menos de tres alı́cuotas, cada una de un volumen no menor de
limpio por inversión o por rotación suave. [NOTA—Puede usarse un 5 mL y colocarlas en el sensor del sistema de conteo por obstrucción
volumen más pequeño, según el artı́culo analizado.] Desgasificar la de luz. Descartar los datos de la primera alı́cuota. [NOTA—Algunos
suspensión por ultrasonido (a una potencia de 80 a 120 vatios) productos pueden requerir la combinación de 15 o más unidades para
durante aproximadamente 30 segundos o dejándola en reposo. lograr un volumen que permita extraer tres alı́cuotas de 5 mL.
Agitar el recipiente que contiene la muestra de agua manualmente Pueden usarse alı́cuotas más pequeñas (por ejemplo, menos de
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h788i Partı́culas en Inyectables 355
5 mL) si se valida el resultado del ensayo obtenido con las alı́cuotas Muestras Individuales (Inyecciones de Pequeño Volumen)—
más pequeñas para obtener una evaluación de la aptitud de la partida Promediar los conteos obtenidos para las porciones de las alı́cuotas
equivalente a la obtenida con las alı́cuotas de 5 mL especificadas de 5 mL o mayores de cada unidad que se analiza y calcular el
más arriba.] número de partı́culas en cada envase, por la siguiente fórmula:
Envases con Contenido de 25 mL o Mayor—Preparar los envases
según se indica en Preparación de Prueba. Mezclar y suspender las PV / VA,
partı́culas de cada unidad invirtiéndola 20 veces. Desgasificar la en donde P es el conteo de partı́culas promedio obtenido a partir de
solución por ultrasonido durante aproximadamente 30 segundos las porciones analizadas; V es el volumen, en mL, de la unidad
o dejando la solución en reposo hasta que no tenga burbujas de aire. probada; y VA es el volumen, en mL, de cada porción analizada.
Quitar el cierre de la unidad o abrirla de otra manera para permitir la Muestras de Unidades Individuales (Inyecciones de Gran
inserción de la sonda del contador en el centro de la solución. Volumen)—Promediar los conteos obtenidos para las dos o más
Mezclar suavemente el contenido de la unidad agitando manual- alı́cuotas de 5 mL tomadas de la unidad de solución. Calcular el
mente por rotación moderada o por medios mecánicos. Extraer no número de partı́culas en cada mL de la Inyección tomada, por la
menos de tres alı́cuotas, cada una de un volumen de no menos de fórmula:
5 mL y colocarlas en el sensor del sistema de conteo por obstrucción
de luz. Descartar los datos de la primera porción. P / V,
Preparaciones Secas o Liofilizadas—Preparar los envases según
se indica en Preparación de Prueba. Abrir cada envase, procurando en donde P es el conteo de partı́culas promedio para un volumen de
no contaminar la abertura o la tapa. Reconstituir según se indica en muestra individual de 5 mL o mayor; y V es el volumen, en mL, de la
Preparación de Prueba, usando el volumen especificado de agua porción tomada.
filtrada o un diluyente filtrado adecuado si el agua no es apropiada. Para todos los tipos de productos, si el material analizado se ha
Volver a colocar el cierre y agitar manualmente el envase hasta diluido para reducir su viscosidad, el factor de dilución debe tomarse
disolver el medicamento. [NOTA—Para ciertos productos secos en cuenta al calcular el resultado final de la prueba.
o liofilizados, puede ser necesario dejar en reposo las unidades
durante un tiempo adecuado y luego agitar nuevamente hasta que el
medicamento se disuelva completamente.] Una vez completamente Interpretación
disuelto el medicamento de la muestra reconstituida, mezclar y
suspender las partı́culas presentes en cada unidad, invirtiendo 20 El inyectable cumple con los requisitos de la prueba si el número
veces antes de la prueba. Proceder según se indica para el volumen promedio de partı́culas presentes en cada unidad discreta analizada
adecuado en Preparaciones Lı́quidas y extraer por lo menos tres o en cada muestra combinada analizada no excede el valor
alı́cuotas, cada una de un volumen de no menos de 5 mL, y correspondiente indicado en la Tabla 1. Si el número promedio de
colocarlas en el sensor del sistema de conteo por obstrucción de luz. partı́culas excede del lı́mite, analizar el artı́culo mediante la Prueba
Descartar los datos de la primera porción. de Conteo Microscópico de Partı́culas.
Productos en Envases con Compartimientos Dobles Diseñados
para Contener el Fármaco y un Disolvente en Compartimientos
Separados—Preparar las unidades que deben analizarse según se Tabla 1. Conteo de Partı́culas por Obstrucción de Luz
indica en Preparación de Prueba. Mezclar cada unidad según se
indica en la etiqueta, activando y agitando cada unidad para asegurar 10 mm 25 mm
que los componentes se mezclen bien y se disuelva el medicamento.
Desgasificar las unidades por ultrasonido o dejando la solución en Inyecciones de Pequeño 6000
reposo hasta que no tenga burbujas de aire. Proceder según se indica Volumen 600 por envase
conforme al volumen de la unidad en Preparaciones Lı́quidas y Inyecciones de Gran Volumen 25 3 por mL
extraer por lo menos tres alı́cuotas, cada una de un volumen de no
menos de 5 mL, y colocarlas en el sensor del sistema de conteo por
obstrucción de luz. Descartar los datos de la primera porción.
Productos Etiquetados ‘‘Envase a Granel para Farmacias - No PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE
para Infusión Directa’’—Proceder según se indica en Preparacio- PARTÍCULAS
nes Lı́quidas para volúmenes de 25 mL o mayores. Calcular el
resultado de la prueba sobre la base del volumen de una porción La prueba de conteo microscópico de partı́culas puede aplicarse
equivalente a la dosis máxima indicada en la etiqueta. Por ejemplo, tanto a inyecciones de gran volumen como a inyecciones de pequeño
si el volumen total del envase a granel es de 100 mL y el volumen de volumen. Esta prueba cuenta las partı́culas subvisibles de estos
la dosis máxima es de 10 mL, el promedio del conteo de partı́culas productos, esencialmente sólidas, por unidad de volumen o por
por obstrucción de luz por mL se multiplicarı́a por 10 para obtener el envase, después de su recolección sobre un filtro de membrana
resultado de la prueba sobre la base de la dosis máxima de 10 mL. microporosa. Algunos artı́culos no pueden analizarse en forma
[NOTA—Para los cálculos de los resultados de las pruebas, considerar satisfactoria con el método de obstrucción de la luz. En estos casos,
que el volumen de dosis máxima es equivalente al contenido de un las monografı́as correspondientes a cada artı́culo especifican
envase lleno.] únicamente el ensayo microscópico. Las soluciones que se eximen
de este análisis microscópico se identifican en las monografı́as
correspondientes. Se pueden citar, como ejemplo, las soluciones que
Cálculos no se filtran con facilidad porque son demasiado viscosas (tales
como: dextrosa concentrada, soluciones de almidón o dextranos).
Muestras Combinadas (Inyecciones de Volumen Pequeño)— Cuando se realiza la prueba microscópica, no se debe intentar la
Promediar los conteos de las dos o más alı́cuotas analizadas. medición o el conteo de materiales amorfos, semilı́quidos,
Calcular el número de partı́culas en cada envase, por la fórmula: o morfológicamente indiferenciados de algún otro modo y que
tengan la apariencia de una mancha o coloración sobre la superficie
PVT / VAn, de la membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve y
en donde P es el conteo de partı́culas promedio obtenido a partir de presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una pelı́cula. Debido
las porciones analizadas; VT es el volumen de la muestra combinada, a que este material en solución consiste en unidades del orden de 1
en mL; VA es el volumen, en mL, de cada porción analizada; y n es el mm o menores, que se pueden contar en una membrana analı́tica sólo
número de envases combinados. después de su aglomeración o deformación, puede facilitarse la
interpretación del conteo analizando una muestra de la solución por
el método de conteo de partı́culas por obstrucción de luz.
356 h788i Partı́culas en Inyectables / Pruebas Fı́sicas USP 30
Fig. 1. Retı́cula para la medición del diámetro de partı́culas. El cı́rculo grande tiene filamentos que lo dividen en cuadrantes y determina el
campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés). Los cı́rculos transparentes y de color negro, con diámetros de 10 mm y 25 mm en 1006, se
proporcionan como elementos de comparación para clasificar las partı́culas por tamaño.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h788i Partı́culas en Inyectables 357
episcópica al grado más bajo. Luego, aumentar la intensidad de volumen de cada unidad es 25 mL o más, pueden analizarse menos
iluminación episcópica hasta que las sombras producidas por las de 10 unidades individuales, conforme a la definición de un plan de
partı́culas muestren la disminución menos perceptible de contraste. muestreo adecuado.
Enumeración de Partı́culas Para realizar un conteo parcial de partı́culas sobre una membrana,
comenzar por el borde derecho del centro del área de filtración y
La prueba microscópica descrita en esta sección es flexible, ya que empezar a contar los GFOV adyacentes. Cuando se llega al borde
se pueden contar, en partı́culas por mL, muestras que contengan 1 izquierdo del área de filtración, mover un GFOV hacia la parte
partı́cula por mL, ası́ como muestras con muchas más partı́culas por superior del filtro y continuar contando los GFOV avanzando en el
mL. Este método puede usarse cuando se cuentan todas las partı́culas sentido contrario. Se puede pasar de un GFOV al próximo mediante
sobre la superficie de la membrana de análisis o cuando sólo se uno de dos métodos. Un método es definir una referencia (partı́cula
cuentan las partı́culas de una fracción de la superficie de la o irregularidad de la superficie del filtro) y pasar al GFOV más alla
membrana. de ese punto. Un segundo método es emplear el vernier de la platina
del microscopio para trasladarse un 1 mm entre los GFOV. Para
facilitar esto último, ajustar la posición de los controles x e y en la
PROCEDIMIENTO DE CONTEO TOTAL platina del microscopio a un número entero en la posición inicial del
borde derecho del centro del área de filtración. Luego, cada GFOV
Al realizar un conteo total, no se tiene en cuenta el campo reticular será una división entera de movimiento del control x de posición de
(GFOV) definido por el cı́rculo grande de la retı́cula y se utiliza el la platina. Si se llega a la parte superior del área de filtración antes de
filamento vertical. Recorrer toda la membrana de derecha a izquierda, alcanzar el número deseado de GFOV, se empieza nuevamente en el
con un recorrido colindante con el primer recorrido, sin super- borde derecho del centro del área de filtración, un GFOV por debajo
posición de recorridos. Repetir este procedimiento, de izquierda del usado la primera vez. Esta vez, mover hacia abajo en la
a derecha y nuevamente a la izquierda, hasta contar todas las membrana cuando se llega al final de una fila de los GFOV.
partı́culas en la membrana. Registrar el número total de partı́culas de Continuar como antes hasta completar el número de GFOV.
tamaño de 10 mm ó mayor y de 25 mm o mayor. Para inyecciones de Para inyecciones de gran volumen, si se utiliza un procedimiento
gran volumen, calcular el conteo, en partı́culas por mL, para la de conteo parcial para los tamaños 10 mm y 25 mm, calcular las
unidad analizada, por la fórmula: partı́culas por mL por la fórmula:
P / V, PAT / APV,
en donde P es el número total de partı́culas contadas; y V es el en donde P es el número de partı́culas contadas, AT es el área de
volumen, en mL, de la solución. Para inyecciones de pequeño filtración, en mm2, de la membrana; AP es el área parcial contada, en
volumen, calcular el conteo, en partı́culas por envase, por la fórmula: mm2, basada en el número de campos de retı́cula contados y V es el
volumen, en mL, de solución filtrada. Para una solución combinada
P / n, (para unidades de inyecciones de pequeño volumen que contengan
en donde P es el número total de partı́culas contadas y n es el menos de 25 mL) o para una sola unidad de inyección de pequeño
número de unidades combinadas (1 en el caso de una sola unidad). volumen, calcular el número de partı́culas por unidad, por la
fórmula:
PAT / APn,
PROCEDIMIENTO DE CONTEO PARCIAL
en donde n es el número de unidades contadas (1 en el caso de una
Si se realizara un conteo parcial de partı́culas sobre una sola unidad) y los otros términos corresponden a los definidos
membrana, el analista debe asegurarse primero que las partı́culas anteriormente.
estén uniformemente distribuidas sobre la membrana. Esto puede Para todos los tipos de productos, si el material analizado se ha
comprobarse haciendo un barrido rápido en búsqueda de aglome- diluido para reducir su viscosidad, el factor de dilución debe tomarse
rados de partı́culas. No debe haber ningún aglomerado. Contar las en cuenta al calcular el resultado final de la prueba.
partı́culas de tamaño de 10 mm o mayor en un GFOV en el borde del
área de filtración, ası́ como en el centro de la membrana. El número
de partı́culas de tamaño de 10 mm o mayor en el GFOV con el Interpretación
conteo total más alto de partı́culas no es más del doble del GFOV
con el conteo más bajo de partı́culas. Rechazar los filtros que no El inyectable cumple con los requisitos de la prueba si el número
cumplan con estos criterios y preparar otro si se utiliza un de partı́culas presentes (real o calculado) en cada unidad individual
procedimiento de conteo parcial o, como alternativa, analizar esta o en cada muestra combinada analizada no excede los valores
membrana por el método de conteo total. enumerados en la Tabla 2.
El número normal de GFOV contados para un conteo parcial es de
20. Si se desea un intervalo de confianza más pequeño con respecto
al resultado, se pueden contar más campos y partı́culas. Contar todas Tabla 2. Conteo de Partı́culas por el Método Microscópico
las partı́culas que tengan un diámetro de 10 mm o más y de 25 mm
o más dentro del GFOV y aquellas que están en contacto con el lado 10 mm 25 mm
derecho del cı́rculo del GFOV. No contar las partı́culas fuera del Inyecciones de Pequeño
GFOV. Pasar por alto las que tocan el lado izquierdo del cı́rculo de Volumen 3000 300 por envase
GFOV. La lı́nea divisoria entre el lado derecho y el lado izquierdo Inyecciones de Gran
del cı́rculo de GFOV es el filamento vertical. [NOTA—Emplear el Volumen 12 2 por mL
mejor criterio posible para determinar el tamaño de las partı́culas sin
cambiar el aumento o iluminación del microscopio.]
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h789i Partı́culas en Soluciones Oftálmicas 359
Aparato de Prueba, Entorno de Prueba, Procedimiento de por cambio de unidad en el pH y teóricamente es [0,05916 +
Prueba y Enumeración de Partı́culas—Proceder según se indica 0,000198(t – 258)] voltios a cualquier temperatura t.
para la Prueba de Conteo de Partı́culas Microscópicas en Partı́culas Se debe enfatizar que las definiciones de pH, la escala de pH y los
en Inyectables h788i. valores asignados a las Soluciones Amortiguadoras de Normaliza-
Interpretación—La solución oftálmica cumple con los requisitos ción tienen el propósito de establecer un sistema práctico y operativo
de la prueba si el número promedio de partı́culas presente en las para que los resultados se puedan comparar entre laboratorios. Los
unidades analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la valores de pH ası́ medidos no se corresponden exactamente con los
Tabla 2. obtenidos por la definición, pH = – log aH+. Siempre que la solución
que se está midiendo sea lo suficientemente similar en composición
a la solución amortiguadora usada para la normalización, el pH
Tabla 2. Conteo de Partı́culas por Método Microscópico operacional será bastante cercano al pH teórico. Aunque no se hace
ninguna afirmación en lo que se refiere a la aptitud del sistema para
Diámetro medir la actividad o la concentración del ión hidrógeno, los valores
10 mm 25 mm 50 mm obtenidos están estrechamente relacionados con la actividad del ión
hidrógeno en soluciones acuosas.
Número de 50 por mL 5 por mL 2 por mL Cuando un medidor de pH se normaliza mediante el uso de una
partı́culas solución amortiguadora acuosa y luego se la emplea para medir el
‘‘pH’’ de una solución o suspensión no acuosa, la constante de
ionización del ácido o de la base, la constante dieléctrica del medio,
el potencial de unión lı́quida (que puede originar errores de
aproximadamente 1 unidad de pH) y la respuesta del electrodo de
vidrio al ión hidrógeno cambian totalmente. Por estas razones, los
valores ası́ obtenidos con soluciones que son sólo de carácter
h791i pH parcialmente acuoso pueden considerarse únicamente como valores
aparentes de pH.
*
Se pueden emplear soluciones amortiguadoras disponibles comercialmente
para la normalización de medidores de pH, normalizadas mediante métodos
reconocidos por el National Institute of Standards and Technology (NIST)
cuya etiqueta indica un valor de pH con una aproximación de 0,01 unidades
de pH. Para las soluciones de normalización que tengan un pH menor que 4,
se acepta una exactitud etiquetada de 0,02. Se pueden usar soluciones
preparadas con materiales de grado reactivo de la ACS u otros materiales
adecuados, en las cantidades declaradas, siempre y cuando el pH de la
solución resultante sea el mismo que el de la solución preparada con el
material certificado por el NIST.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h791i pH 361
Temperatu- Tetraoxalato de Potasio, Biftalato de Potasio, Fosfato Equimolal, Tetraborato de Sodio, Hidróxido de Calcio,
ra, 8C 0,05 m 0,05 m 0,05 m 0,01 m Saturado a 258
10 1,67 4,00 6,92 9,33 13,00
15 1,67 4,00 6,90 9,28 12,81
20 1,68 4,00 6,88 9,23 12,63
25 1,68 4,01 6,86 9,18 12,45
30 1,68 4,02 6,85 9,14 12,29
35 1,69 4,02 6,84 9,10 12,13
40 1,69 4,04 6,84 9,07 11,98
45 1,70 4,05 6,83 9,04 11,84
50 1,71 4,06 6,83 9,01 11,71
55 1,72 4,08 6,83 8,99 11,57
60 1,72 4,09 6,84 8,96 11,45
Tetraoxalato de Potasio, 0,05 m—Disolver 12,61 g de de calibración para que el valor de pH observado sea idéntico al
KH3(C2O4)2 2H2O en agua para obtener 1000 mL. valor tabulado. Enjuagar los electrodos y la celda con varias
Biftalato de Potasio, 0,05 m—Disolver 10,12 g de KHC8H4O4, porciones de la segunda Solución Amortiguadora de Normalización,
previamente secado a 1108 durante 1 hora, en agua para obtener luego llenar la celda con esa solución a la misma temperatura que el
1000 mL. material a medir. El pH de la segunda solución amortiguadora
Fosfato Equimolal, 0,05 m—Disolver 3,53 g de Na2HPO4 y está dentro de +0,07 unidades de pH del valor tabulado. Si se
3,39 g de KH2PO4, cada uno previamente secado a 1208 durante 2 observa una desviación mayor, examinar los electrodos y, si
horas, en agua para obtener 1000 mL. estuvieran defectuosos, reemplazarlos. Ajustar la ‘‘pendiente’’
o control de ‘‘temperatura’’ para hacer que el valor de pH observado
Tetraborato de Sodio, 0,01 m—Disolver 3,80 g de Na2B4O7 sea idéntico al tabulado. Repetir la normalización hasta que ambas
10H2O en agua para obtener 1000 mL. Proteger de la absorción de Soluciones Amortiguadoras de Normalización den valores de pH
dióxido de carbono. observados con una aproximación de 0,02 unidades de pH del valor
Hidróxido de Calcio, saturado a 258—Agitar un exceso de tabulado sin ajuste adicional de los controles. Cuando el sistema esta
hidróxido de calcio con agua y decantar a 258 antes de usar. Proteger funcionando satisfactoriamente, enjuagar los electrodos y la celda
de la absorción de dióxido de carbono. varias veces con unas pocas porciones del material de prueba, llenar
Debido a las variaciones en la naturaleza y funcionamiento de los la celda con el material de prueba y leer el valor de pH. Usar agua
medidores de pH disponibles, no es práctico dar instrucciones de libre de dióxido de carbono (ver Agua en la sección Reactivos,
aplicación universal para las determinaciones potenciométricas del Indicadores y Soluciones) para disolver o diluir el material de prueba
pH. Los principios generales a seguir para llevar a cabo las para las determinaciones de pH. En todas las mediciones de pH,
instrucciones estipuladas para cada instrumento por su fabricante se dejar que transcurra un tiempo suficiente para la estabilización.
establecen en los párrafos siguientes. Examinar los electrodos y, si Cuando los valores de pH aproximados sean suficientes, los
está presente, el puente salino antes de usar. Si fuera necesario, indicadores y papeles de prueba (ver Indicadores y Papeles de
volver a llenar la solución del puente salino y cumplir con otras Prueba, en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones) pueden
precauciones indicadas por el fabricante del instrumento o del ser adecuados.
electrodo. Para ver una discusión sobre las soluciones amortiguadores del pH
Para normalizar el medidor de pH, seleccionar dos Soluciones y la composición de las soluciones amortiguadoras estándar
Amortiguadoras de Normalización cuya diferencia de pH no exceda necesarias para las pruebas y valoraciones farmacopeicas, ver
de 4 unidades y de tal manera que el pH esperado del material en Soluciones Amortiguadoras en la sección Reactivos, Indicadores y
análisis se encuentre entre éstos. Llenar la celda con una de las Soluciones.
Soluciones Amortiguadoras de Normalización a la temperatura a la
que se medirá el material de prueba. Ajustar el control de
‘‘temperatura’’ a la temperatura de la solución y ajustar el control
362 h795i Preparación Magistral—Preparaciones No Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
el mantenimiento del equipo y de los accesorios que se utilizan en las magistral, el preparador utiliza toda la información disponible con
preparaciones magistrales a intervalos adecuados para asegurar el respecto a la estabilidad ası́ como también su experiencia y sus
funcionamiento exacto y confiable. conocimientos farmacéuticos.
Cuando se utiliza un producto fabricado como ingrediente activo
de una preparación magistral no estéril, la fecha de caducidad del
ESTABILIDAD DE LAS PREPARACIONES producto no se utilizará para extrapolar directamente una fecha lı́mite
MAGISTRALES de uso para la preparación magistral. Sin embargo, el preparador
puede consultar la literatura o la información de estabilidad
La ‘‘estabilidad’’ se define como la conservación, dentro de ciertos suministrada por el fabricante. El preparador también puede
lı́mites especı́ficos y durante todo el perı́odo de almacenamiento y de consultar las publicaciones que correspondan para conseguir los
utilización, de las mismas propiedades y caracterı́sticas que poseı́a la datos necesarios sobre la estabilidad, compatibilidad y degradación
preparación cuando se elaboró. Ver la tabla Criterios de Niveles de los ingredientes. Todos los datos de estabilidad obtenidos deben
Aceptables de Estabilidad en Consideraciones de Estabilidad en la ser cuidadosamente interpretados en función de la formulación
Práctica de Dispensación h1191i. realmente preparada.
El preparador no debe utilizar ingredientes ni condiciones de Es necesario que el preparador observe el medicamento preparado
procesamiento capaces de resultar en una preparación potencial- para detectar signos de inestabilidad durante todas las etapas de
mente tóxica o ineficaz. El conocimiento que el preparador tiene preparación, dispensación y almacenamiento. En Observación de
sobre las reacciones quı́micas de degradación de los medicamentos Productos en busca de Evidencia de Inestabilidad en Considera-
constituye una forma de determinar las condiciones necesarias para ciones de Estabilidad en la Práctica de Dispensación h1191i se
reducir al mı́nimo la velocidad de descomposición. Los factores que encuentran detalles especı́ficos sobre signos fı́sicos de deterioro
afectan la estabilidad de las preparaciones magistrales son general- comunes. Sin embargo, la degradación quı́mica excesiva y otras
mente los mismos que para los medicamentos fabricados (ver pérdidas de concentración del fármaco ocasionadas por reacciones
Factores que Afectan la Estabilidad del Producto y Responsabilidad suelen ser invisibles.
del Farmacéutico en Consideraciones de Estabilidad en la Práctica Si no se dispone de datos de estabilidad del fármaco o de la
de Dispensación h1191i). preparación especı́fica, se recomienda utilizar las siguientes fechas
lı́mite de uso máximas para preparaciones magistrales no estériles1
que se envasan en envases impermeables y resistentes a la luz y se
almacenan a temperatura ambiente controlada, salvo si se indica algo
Envase primario diferente (ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etique-
Envasar las preparaciones magistrales en envases que cumplan tado en las Advertencias y Requisitos Generales).
con las normas USP (ver Envases en Conservación, Envasado, Para Lı́quidos no Acuosos y Formulaciones Sólidas—
Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Cuando el Ingrediente Activo se obtiene de un Producto
Generales, Envases h661i, y Envases—Permeabilidad h671i). Farmacéutico Fabricado —La fecha lı́mite de uso es anterior al
Utilizar un envase seleccionado según las propiedades fı́sicas y 25% del tiempo que resta hasta la fecha de caducidad del producto
quı́micas de la preparación magistral. Tener en cuenta la interacción o 6 meses, lo que ocurra primero.
envase–fármaco siempre que se trate de sustancias tales como Cuando el Ingrediente Activo se obtiene de una Sustancia NF
compuestos fenólicos y materiales con propiedades de absorción y o USP —La fecha lı́mite de uso no supera los 6 meses.
adsorción (por ejemplo polipéptidos y proteı́nas). Para Formulaciones que Contienen Agua (preparadas a partir
de ingredientes sólidos)—La fecha lı́mite de uso es anterior a 14 dı́as
para preparaciones lı́quidas almacenadas a temperaturas entre 28 y 88
Esterilidad (368 y 468 F).
Es obligatorio garantizar la esterilidad de una preparación Para Todas las Demás Formulaciones—La fecha lı́mite de uso
magistral estéril. La preparación y el envasado de medicamentos es anterior a la duración de la terapia o 30 dı́as, lo que ocurra
estériles, como por ejemplo las soluciones oftálmicas, requiere un primero. Estas fechas lı́mite de uso son indicativas y factibles de
cumplimiento estricto de las pautas contenidas en el capı́tulo de extensión cuando existen datos de estabilidad aplicables y
pruebas generales titulado Preparación Magistral—Preparaciones cientı́ficamente válidos, que corresponden exactamente a la prepara-
Estériles h797i y de las instrucciones de etiquetado del fabricante. ción en cuestión (por ejemplo, el mismo intervalo de concentración
del fármaco, pH, excipientes, vehı́culo, contenido de agua, etc.). Ver
también la información sobre fechado de lı́mite de uso en la sección
Etiquetado en Formas Farmacéuticas Lı́quidas y Sólidas No
Criterios de Estabilidad y Determinación de la Fecha Estériles: Reenvasado en Envases Unitarios y en Envases de
Lı́mite de Uso Dosis Única en Envases h661i.
La fecha lı́mite de uso es la fecha a partir de la cual la preparación
magistral no debe usarse y se determina a partir de la fecha de Etiquetado de Lı́mite de Uso
elaboración de la preparación. Como las preparaciones magistrales
están destinadas a administrarse inmediatamente o luego de un La legislación federal dispone que la fecha de caducidad debe
perı́odo de almacenamiento corto, las fechas lı́mite de uso pueden figurar en la etiqueta de los productos farmacéuticos fabricados. En
determinarse en función de criterios distintos a los utilizados para algunos casos, la legislación estatal dispone que además debe figurar
determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados. la fecha de lı́mite de uso. La etiqueta de un envase o del empaque de
Para determinar la fecha lı́mite de uso es necesario que los una preparación magistral oficial debe indicar la fecha lı́mite de uso.
preparadores consulten y apliquen la información disponible en la Según las buenas prácticas de preparación magistral, la etiqueta de
documentación y literatura sobre la estabilidad en general y la del toda preparación magistral debe indicar el lı́mite de uso.
fármaco en particular y que consideren la naturaleza del fármaco y su
mecanismo de degradación, el envase utilizado, las condiciones de
almacenamiento esperadas y la duración prevista de la terapia (ver
Fecha de Caducidad y Fecha Lı́mite de Uso en Etiquetado en las DEFINICIONES
Advertencias y Requisitos Generales). Las fechas lı́mite de uso A los efectos de este capı́tulo, los siguientes términos tienen los
deben fijarse de manera conservadora. Antes de determinar la fecha siguientes significados:
lı́mite de uso de una preparación final en forma de solución
o suspensión acuosa en cuya preparación se utilizaron formas
farmacéuticas sólidas fabricadas, el preparador debe tener en cuenta
1
factores como la hidrólisis y los ciclos de congelamiento y Ver Almacenamiento y Fechado de Lı́mite de Uso en Preparación
descongelación de la preparación final. Para determinar la fecha Magistral—Preparaciones Estériles h797i donde se exponen las pautas
lı́mite de uso de un medicamento elaborado por preparación aplicables a la determinación de la fecha lı́mite de uso de preparaciones
magistrales estériles.
364 h795i Preparación Magistral—Preparaciones No Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
PREPARACIÓN es una forma farmacéutica, suplemento dietético o 1. ¿Se han analizado las propiedades fı́sicas y quı́micas y los usos
dispositivo terminado. Es la preparación terminada o parcialmente farmacéuticos, dietéticos y medicinales de los fármacos?
terminada de una o más sustancias formuladas que se utiliza para un 2. ¿Son identificables la cantidad y calidad de cada ingrediente
paciente o consumidor (ver Advertencias y Requisitos Generales). activo?
SUSTANCIA OFICIAL incluye una entidad activa farmacéutica, un 3. ¿La preparación y la vı́a de administración escogidas permiten
suplemento dietético o un ingrediente farmacéutico (ver también NF la absorción eficaz, local o sistémica, de los ingredientes activos
23) o un componente de un dispositivo terminado. para el fin deseado?
INGREDIENTE ACTIVO se refiere, en general, a compuestos 4. ¿Entre las sustancias agregadas (ver Definiciones) a los
quı́micos, sustancias u otros componentes de artı́culos destinados a productos fabricados hay sustancias que podrı́an causar
diagnosticar, curar, mitigar, tratar o prevenir enfermedades en seres reacciones alérgicas, irritación, toxicidad o tener propiedades
humanos o en otros animales, o para usar como suplementos organolépticas no deseadas? ¿Hay sustancias agregadas (ver
dietéticos. Definiciones) adversas (por ejemplo, con un pH distinto al
SUSTANCIAS AGREGADAS son ingredientes necesarios para elaborar adecuado o con solubilidad inadecuada) ?
la preparación pero sin la intención ni la expectativa de causar una 5. ¿Los cálculos y mediciones para asegurar una exacta elabora-
respuesta farmacológica en seres humanos si se administra ción de la preparación magistral se obtendrá con exactitud (ver
aisladamente en las cantidades o a la concentración de una dosis Cálculos Farmacéuticos en la Preparación Magistral de
única de la preparación magistral. El término sustancias agregadas Prescripciones h1160i) se han confirmado?
se usa generalmente como sinónimo de los términos ingredientes
inactivos, excipientes e ingredientes farmacéuticos.
PREPARACIONES MAGISTRALES
SELECCIÓN DE INGREDIENTES El término preparaciones magistrales significa toda forma
terminada elaborada por un preparador habilitado o bajo su
Fuentes supervisión directa y comprende la preparación de formas
farmacéuticas, los medicamentos preparados y las formulaciones
Las preparaciones magistrales oficiales se obtienen a partir de preparadas.
ingredientes que cumplen con los requisitos de la monografı́a oficial Si se utilizan sustancias controladas, hay que consultar con las
para los ingredientes que lo componen y para los cuales existe una autoridades estatales o federales para verificar cuáles con sus
monografı́a. polı́ticas. Las preparaciones magistrales se deben elaborar de manera
Es preferible utilizar una sustancia de calidad NF o USP como que pueda asegurarse que cada preparación contiene no menos de
fuente de ingredientes para elaborar otras preparaciones. Si no se 90,0% y no más de 110,0% de la cantidad de ingrediente activo
dispone de dicha sustancia o si se utiliza o fuera necesario utilizar calculada teóricamente e indicada en la etiqueta por unidad de peso o
alimentos, cosméticos u otras sustancias, se recomienda usar otra de volumen, y no menos de 90,0% y no más de 110,0% del peso o
fuente de buena calidad, como por ejemplo con calidad de reactivo volumen calculado teóricamente por unidad de preparación, salvo si
analı́tico (RA), certificado por la Sociedad Quı́mica de los Estados se indica algo diferente, o si fuera adecuado utilizar otros
Unidos (American Chemical Society, ACS por sus siglas en inglés) o porcentajes. Las preparaciones magistrales incluyen, las siguientes
por el Código de Sustancias Quı́micas para Alimentos (Food formas farmacéuticas, sin limitarse a ellas y cuya descripción figura
Chemical Codex, FCC por sus siglas en inglés). Es necesario que el en Formas Farmacéuticas h1151i.
preparador determine la pureza y la seguridad de toda sustancia
utilizada en la preparación magistral que no hubiera sido comprada a
un fabricante de fármacos registrado, mediante métodos razonables Cápsulas, Polvos, Tabletas de Disolución Bucal y
que podrı́an incluir el análisis de lotes, evaluación de la reputación Tabletas
del fabricante o la confiabilidad de la fuente.
Se puede utilizar un producto farmacéutico fabricado para obtener El preparador debe elaborar una cantidad tal de la formulación
un ingrediente activo pero sólo son aceptables aquellos cuyo envase total de estas formas farmacéuticas que permita dispensar exacta-
cuenta con una etiqueta que indica el número de control de la partida mente la cantidad recetada. Las prácticas y precauciones necesarias
y una fecha de caducidad a futuro. Al trabajar con productos para elaborar estas formas farmacéuticas incluyen las siguientes:
farmacéuticos fabricados, el preparador debe tomar en cuenta todos reducir los ingredientes sólidos a partı́culas del mı́nimo tamaño
sus ingredientes en relación con el uso propuesto para la preparación razonable;
magistral. realizar los controles necesarios para asegurar que todos los
El preparador no está autorizado para elaborar preparaciones ingredientes están mezclados hasta lograr una mezcla homo-
magistrales de fármacos que estén incluidos en la lista de productos génea;
farmacéuticos de la FDA retirados del mercado por razones de controlar la humedad si es posible que cause hidrólisis, la
seguridad. adhesión de la forma farmacéutica a las paredes de los envases
o el ablandamiento o disolución parcial de la cubierta de las
cápsulas;
Requisitos para la Preparación Magistral de pesar con exactitud para asegurar que cada unidad contenga no
Productos Distintos de los Medicamentos menos de 90% y no más de 110% del peso calculado
teóricamente por unidad [NOTA—Según lo dispuesto por la
Si la preparación está destinada a utilizarse en suplementos legislación de Alimentos y Fármacos de EE. UU., las
nutricionales o dietéticos (para suplementar la dieta) o con fines preparaciones clasificadas como suplementos dietéticos no
cosméticos (por ejemplo para embellecer), el preparador debe pueden contener menos del 100% de la potencia declarada.] y
adoptar las Buenas Prácticas de Preparación Magistral h1075i y lo envasar las unidades de dosificación según las especificaciones
dispuesto en este capı́tulo y cumplirá con las disposiciones estatales de envases para cápsulas y tabletas del ingrediente activo
y federales pertinentes. especı́fico, salvo si se indica algo diferente en las monografı́as
individuales (ver Envases h661i).
Para envases unitarios, el peso de cada envase lleno, corregido 6. Preparar una sola receta por vez en una zona de preparación
por la tara, debe ser equivalente a no menos de 100% y no más dada.
de 110% del volumen declarado en la etiqueta. 7. Reunir todos los materiales necesarios para elaborar la
Preparar las suspensiones acuosas levigando la mezcla de polvo preparación.
con el agente humectante hasta obtener una pasta homogénea y 8. Elaborar la preparación según el registro de formulación o
luego transformarla en un lı́quido por el agregado de un según la receta médica (ver Documentos y Registros de
vehı́culo adecuado. Utilizar porciones sucesivas del vehı́culo Preparación más adelante) y siguiendo las reglas de la técnica
para lavar el mortero u otro recipiente, o para transferir y la ciencia farmacéutica.
cuantitativamente la suspensión a un recipiente graduado o 9. Evaluar las variaciones de peso, la adecuación del mezclado,
frasco para dispensar calibrado. Se puede homogeneizar la transparencia, olor, color, consistencia y pH, según correspon-
preparación para asegurar una dispersión final homogénea. da.
Reducir el tamaño de partı́cula de los ingredientes sólidos al 10. Registrar los pasos en el libro de registro de preparaciones y
tamaño mı́nimo posible describir la apariencia de la formulación.
Las soluciones, dispensadas no deben tener material sin 11. Etiquetar los envases de la prescripción incluyendo lo siguiente:
disolver. [NOTA—Las soluciones sobresaturadas, como la a) el nombre de la preparación; b) el número de identificación
Solución Oral de Yoduro de Potasio pueden constituir una interna; c) la fecha lı́mite de uso (ver Etiquetado de Lı́mite de
excepción.] Uso); d) las iniciales del preparador que elaboró la etiqueta; e)
La etiqueta de las emulsiones y suspensiones incluye la leyenda las condiciones de almacenamiento; y f) toda otra leyenda
‘‘Agitar bien antes de usar’’. exigida por las leyes.
12. Firmar y fechar la receta indicando que se realizaron todos los
procedimientos necesarios para asegurar la uniformidad,
Supositorios identidad, contenido, cantidad y pureza del producto.
13. Limpiar todo el equipo inmediatamente y almacenarlo adecua-
El preparador debe elaborar una cantidad excesiva de la damente.
formulación total de supositorios para dispensar exactamente la
cantidad recetada. Las prácticas y precauciones seleccionadas para
elaborar estas formas farmacéuticas incluyen las siguientes: DOCUMENTOS Y REGISTROS DE
no utilizar ingredientes cáusticos o irritantes y pulverizar PREPARACIÓN
completamente los sólidos abrasivos para las mucosas;
escoger una base que permita a los ingredientes activos Es necesario que todos los preparadores que dispensan recetas
proporcionen el efecto terapéutico local o sistémico deseado; médicas lleven un registro según lo dispuesto por la legislación del
reducir el tamaño de partı́cula de los ingredientes sólidos al estado correspondiente. No es necesario que el preparador lleve
tamaño mı́nimo razonable y registros adicionales si la preparación se elabora según las
pesar una cantidad representativa de supositorios para asegurar instrucciones en la etiqueta del fabricante, pero sı́ debe llevarlos
que cada uno de ellos tenga no menos de 90% y no más de para toda otra preparación magistral. Los registros incluyen la lista
110% del peso promedio de todos los supositorios en la partida. de los ingredientes, la cantidad utilizada de cada uno y la secuencia
de la elaboración de la preparación magistral.
El objetivo de los registros es servir de fuente de información que
Cremas, Geles Tópicos, Ungüentos y Pastas permita a otro preparador elaborar una preparación idéntica en una
fecha futura. El registro de formulación es ası́ un documento de
El preparador debe elaborar una cantidad en exceso de la referencia para elaborar la preparación (una receta) y el registro de
formulación total de estas formas farmacéuticas semi-sólidas para preparación documenta los ingredientes utilizados en la preparación
dispensar exactamente la cantidad recetada. Las prácticas y y los datos de la persona responsable de elaborarla. El perı́odo de
precauciones seleccionadas para elaborar estas formas farmacéuticas conservación de los registros es idéntico al perı́odo dispuesto por la
incluyen las siguientes: legislación estatal para cualquier receta médica. El registro puede ser
no utilizar ingredientes cáusticos, irritantes o alergénicos para la una copia de la prescripción, escrita o en forma de registro
piel u otros sitios de aplicación, salvo si fueran necesarios para electrónico, que incluya el registro de formulación, el registro de
un tratamiento; preparación y las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales.
escoger una base o vehı́culo que permita a los ingredientes
activos proporcionar el efecto terapéutico local o sistémico
deseado; Registro de Formulación
reducir el tamaño de partı́cula de los ingredientes sólidos al
tamaño mı́nimo razonable; El registro de formulación es un documento creado para cada
incorporar geométricamente los ingredientes activos con las preparación magistral. Este registro debe indicar el nombre, el
sustancias agregadas para lograr la uniformidad de la forma contenido y la forma de administración de la preparación magistral,
farmacéutica lı́quida o de la dispersión del sólido; y todos los ingredientes y las cantidades empleadas, el equipo
evaluar la uniformidad de la dispersión extendiendo una necesario para elaborar la preparación, cuando corresponda, y las
pelı́cula delgada de la formulación terminada sobre una instrucciones de mezclado. Las instrucciones de mezclado incluyen
superficie transparente y plana (por ejemplo, una placa de la secuencia en que se mezclan los ingredientes, las temperaturas de
vidrio transparente para ungüentos). mezclado y otras variables ambientales, como por ejemplo los
tiempos de mezclado y otros factores pertinentes para reproducir la
preparación original. El registro de formulación debe incluir una
EL PROCESO DE PREPARACIÓN fecha lı́mite de uso asignada, el envase utilizado para dispensar, las
condiciones de almacenamiento y todo procedimiento de control de
A continuación se presenta una lista de pasos para ayudar a calidad empleado.
reducir al mı́nimo los errores y obtener los resultados esperados por
quien extendió la receta.
1. Evaluar si la receta médica a preparar es inocua y adecuada para Registro de Preparación
los fines previstos. Determinar cuáles son las limitaciones
legales aplicables, que corresponden. El registro de preparación contiene el nombre y el contenido de la
2. Hacer los cálculos para determinar las cantidades de los preparación magistral, la referencia del registro de formulación
ingredientes necesarios (ver Cálculos Farmacéuticos en Pre- utilizado y las fuentes y números de lote de los ingredientes.
paración Magistral de Prescripciones h1160i). También incluye información sobre el número total de unidades de
3. Identificar el equipo necesario. dosificación preparadas, el nombre de la persona que elaboró la
4. Vestir ropas adecuadas y lavarse las manos. preparación y el nombre del preparador que aprobó la preparación, la
5. Limpiar la zona de preparación y el equipo necesario.
366 h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
fecha de preparación, el número de identificación interna asignado o ciones de preparación más limpias, una capacitación y evaluación
el número de receta y la fecha de lı́mite de uso asignada y el número especı́fica del personal en los principios y las prácticas de
de receta. Registrar los resultados de los procedimientos de control manipulación aséptica, la evaluación y el mantenimiento de la
de calidad (por ejemplo, intervalo de peso de las cápsulas llenadas) calidad del aire y un conocimiento sólido de los principios y las
efectuados para toda preparación magistral. Si ocurre algún prácticas de esterilización y estabilidad de las soluciones. Se requiere
problema con las preparaciones elaboradas según las monografı́as un mayor cuidado en la preparación de inyecciones acuosas, el tipo
de preparación magistral de USP, el preparador debe completar el de preparación magistral estéril (PME) más usada con fines
Formulario para Informar Experiencias con Monografı́as USP y terapéuticos. Las inyecciones acuosas que se administran en el
enviarlo a la USP para su evaluación. sistema vascular y en el sistema nervioso central presentan el mayor
riesgo de ocasionar daños a los pacientes cuando existen problemas
de ausencia de esterilidad y errores importantes en los ingredientes.
Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales El propósito de este capı́tulo es evitar daños a los pacientes, o su
muerte, como resultado de la contaminación microbiana (falta de
Todo el personal que trabaja con fármacos o sustancias quı́micas a esterilidad), la cantidad excesiva de endotoxinas bacterianas, los
granel en las instalaciones de preparación debe tener fácil acceso a errores importantes en las concentraciones de los ingredientes y el
las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales. Debe enseñarse a uso de ingredientes inadecuados en las PME. En este capı́tulo se
los empleados cómo conseguir e interpretar la información necesaria. describen controles y pruebas de calidad apropiados y necesarios
para las PME. El contenido de este capı́tulo es válido para
instituciones dedicadas al cuidado de la salud, farmacias, centros
CONTROL DE CALIDAD de práctica médica y otras instituciones en las que se preparan,
almacenan y dispensan PME. A los efectos de este capı́tulo, las PME
La seguridad, la calidad y la eficiencia de las preparaciones incluyen cualquiera de las siguientes preparaciones:
magistrales dependen de una correcta utilización de los ingredientes, a. Preparaciones que se constituyen según las instrucciones que
cálculos bien hechos mediciones precisas y exactas, condiciones y figuran en la etiqueta del fabricante y otras manipulaciones para
procedimientos de formulación adecuados y el ejercicio prudente del la preparación de productos estériles que exponen el contenido
criterio farmacéutico. El preparador debe hacer una última verifica- original a una potencial contaminación.
ción de cada procedimiento utilizado en el proceso de preparación b. Preparaciones que contienen ingredientes no estériles o que
magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la emplean componentes y dispositivos no estériles que deben
integridad, debe observar la preparación final para determinar que su esterilizarse antes de su administración.
apariencia es la esperada y debe investigar cualquier discrepancia, c. Productos biológicos, de diagnóstico, medicamentos, nutrientes
adoptando las medidas necesarias para corregirlas antes de dispensar y preparados radiofarmacéuticos que poseen cualquiera de las
la receta médica al paciente (ver Lista de Verificación para dos caracterı́sticas anteriores, incluyendo, entre otros, baños y
Determinar la Aceptabilidad de Contenido, Calidad y Pureza, las soluciones para órganos y tejidos vivos, implantes, inhala-
disposiciones para la forma farmacéutica que corresponda en ciones, inyecciones, polvos para inyección, irrigaciones,
Preparaciones Magistrales y los pasos indicados en El Proceso de aerosoles de dosis fijas y preparaciones oftálmicas y óticas.
Preparación). Las secciones de este capı́tulo están organizadas para facilitar a los
profesionales la comprensión de las prácticas fundamentales
relativas a la exactitud y la calidad requeridas para las PME.
VERIFICACIÓN Proporcionan la base para el desarrollo e implementación de
procedimientos esenciales para la elaboración segura de PME en
Completar y verificar los procedimientos de preparación magistral los tres niveles de riesgo, los que se clasifican según el potencial de
rutinarios, como por ejemplo la preparación de partidas, según los contaminación microbiana, quı́mica y fı́sica. El capı́tulo se divide en
procedimientos escritos. La verificación de un procedimiento de las siguientes secciones principales:
preparación magistral incluye revisar los cálculos, los pesos y las Responsabilidades de todo el personal de preparación magistral
mediciones, el orden de mezclado y las técnicas de preparación para Fundamentos para clasificar una PME en niveles de riesgo bajo,
asegurar que eran las adecuadas y se hicieron correctamente. mediano o alto, con ejemplos de PME, y las prácticas de
garantı́a de calidad correspondientes a cada uno de estos niveles
de riesgo
Verificación de la exactitud de la preparación y su esterilización
CONSEJOS AL PACIENTE Capacitación y evaluación del personal en técnicas de
Al dispensar una preparación magistral, se debe instruir al manipulación aséptica, incluyendo pruebas de desafı́o de
paciente o a un representante del paciente sobre el uso correcto y transferencia y llenado con medios de cultivo microbiológicos
el almacenamiento de la preparación, y la detección de signos de estériles.
inestabilidad (ver Responsabilidad del Farmacéutico en Considera- Calidad y control ambiental durante el procesamiento de PME
ciones de Estabilidad en la Práctica de Dispensación h1191i). Equipos utilizados en la elaboración de PME
Verificación de dispositivos automatizados para la elaboración
magistral de preparaciones destinadas a nutrición parenteral
Controles y pruebas de liberación de preparaciones terminadas
Almacenamiento y fechado de lı́mite de uso
Mantenimiento de la calidad y control de las PME una vez que
h797i PREPARACIÓN egresan de las instalaciones de preparación, incluyendo
educación y capacitación del personal
MAGISTRAL—PREPARACIONES Envasado, manipulación, almacenamiento y transporte de PME
ESTÉRILES
Capacitación del paciente o prestador de cuidados médicos
Seguimiento del paciente y reporte de episodios adversos
Programa de garantı́a de calidad para PME. Todo el personal
que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad
de comprender estas prácticas y precauciones fundamentales,
INTRODUCCIÓN desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y
Este capı́tulo describe los procedimientos y requisitos para la evaluar en forma constante dichos procedimientos y la calidad
elaboración magistral de preparaciones estériles. de las PME finales para evitar daños y muerte de pacientes
La principal diferencia entre una preparación magistral estéril y tratados con dichas PME.
una preparación magistral no estéril (ver Preparación Magistral—
Preparaciones No Estériles h795i y Buenas Prácticas de Prepara-
ción Magistral h1075i) es que la primera requiere una prueba de
esterilidad. La preparación magistral estéril también exige instala-
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 367
Estos niveles de riesgo se aplican a la calidad de las PME Ejemplo de un Procedimiento de Prueba de Llenado con
inmediatamente después del mezclado o llenado asépticos finales o Medios—Esta prueba, u otra equivalente, debe ser realizada al
inmediatamente después de la esterilización final, a menos que lo menos una vez al año por cada persona autorizada para realizar una
impidan las caracterı́sticas especı́ficas de la preparación, como en el preparación de riesgo bajo, en condiciones que simulen las
caso de las emulsiones a base de lı́pidos, en las que la administración situaciones más difı́ciles o extremas que se encuentran durante la
debe llevarse a cabo dentro de las 12 horas de su preparación. elaboración de PME de riesgo bajo. Una vez iniciada, esta prueba
Después del almacenamiento y expedición de las PME recién debe completarse sin interrupciones. Dentro de un entorno de calidad
terminadas, debe esperarse un aumento en los riesgos de degradación de aire ISO Clase 5, (ver Tabla 1) transferir tres series de cuatro
quı́mica de los ingredientes, contaminación por daños fı́sicos en los alı́cuotas de 5 mL de Medio de Digerido de Caseı́na–Soja estéril, con
envases y permeabilidad de los envases de plástico y elastoméricos. la misma combinación de jeringa de 10 mL y aguja con venteo
En estos casos, el personal de preparación magistral debe considerar estériles, a sendos viales vacı́os de 30 mL que sean transparentes,
los riesgos adicionales potenciales para la integridad de las PME al sellados y estériles (es decir, cuatro alı́cuotas de 5 mL en cada uno de
momento de asignar las fechas lı́mite de uso. La duración de la los tres viales de 30 mL). Fijar asépticamente sellos adhesivos a los
exposición previa a la administración y los lı́mites de temperatura tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales
especificados en las siguientes secciones sobre PME de riesgo bajo, según se describe en la sección Capacitación y Evaluación del
mediano y alto deberán aplicarse en aquellos casos en que no se Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica.
cuente con resultados de pruebas directas o fuentes de información
apropiadas que justifiquen otros lı́mites para PME especı́ficas. Para
un resumen de los criterios para cada nivel de riesgo, ver el PME de Riesgo Mediano
Apéndice.
Cuando se cumplen las Condiciones de Riesgo Bajo, pero existen
una o más de las siguientes condiciones, las PME tienen un riesgo
PME de Riesgo Bajo mediano de contaminación.
Condiciones de Riesgo Mediano—
Las PME preparadas en las condiciones indicadas a continuación 1. Se combinan o agrupan varias dosis individuales o pequeñas de
tienen un riesgo bajo de contaminación. productos estériles para preparar una PME que se administrará a
Condiciones de Riesgo Bajo— varios pacientes o a un solo paciente en varias ocasiones.
1. Las PME se preparan mediante manipulación aséptica y en un 2. El proceso de preparación incluye manipulaciones asépticas
ambiente con una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1) o complejas distintas de una simple transferencia de volumen.
una calidad de aire superior usando únicamente ingredientes, 3. El proceso de preparación requiere una duración inusualmente
productos, componentes y dispositivos estériles. prolongada, como la necesaria para completar la disolución o
2. La preparación magistral sólo incluye manipulaciones de lograr un mezclado homogéneo.
transferencia, medición y mezclado con sistemas de envasado 4. Las PME no contienen sustancias bacteriostáticas de amplio
cerrado o sellado que se realizan de manera rápida y con espectro y se administran en el curso de varios dı́as (por
atención. ejemplo, a través de un dispositivo de infusión implantado o en
3. Las manipulaciones se limitan a la apertura aséptica de forma externa).
ampollas, la perforación de tapones estériles de viales con 5. En el caso de preparaciones de riesgo mediano, cuando no se
agujas y jeringas estériles y la transferencia de lı́quidos estériles someten a una prueba de esterilidad, los perı́odos de
contenidos en jeringas estériles a dispositivos de administración almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos:
estéril y envases estériles de otros productos. antes de su administración, las PME deben almacenarse de
4. En el caso de preparaciones de riesgo bajo, cuando no se forma apropiada y exponerse durante no más de 30 horas a
someten a una prueba de esterilidad, los perı́odos de temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos
almacenamiento no pueden superar los siguientes plazos: Generales), durante no más de 7 dı́as a temperatura frı́a (ver
antes de su administración, las PME deben almacenarse de Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 dı́as en
forma apropiada y exponerse durante no más de 48 horas a estado sólido de congelación a –208 o menor temperatura.
temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Ejemplos de Preparaciones Magistrales de Riesgo Mediano—
Generales), durante no más de 14 dı́as a temperatura frı́a (ver 1. Preparación magistral de lı́quidos para nutrición parenteral total
Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 dı́as en usando dispositivos manuales o automatizados durante la que se
estado sólido de congelación a –208 o menor temperatura. realizan varias inyecciones, desconexiones y conexiones de
Ejemplos de Preparaciones Magistrales de Riesgo Bajo— productos de la fuente de nutrientes al dispositivo o máquina
1. Transferencias simples de formas farmacéuticas estériles desde para suministrar todos los componentes nutricionales a un
ampollas, frascos, bolsas y viales usando jeringas estériles con envase estéril final.
agujas estériles, otros dispositivos de administración y otros 2. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyección e
envases estériles. El contenido de las ampollas requiere infusión con varios productos farmacéuticos estériles y
filtración estéril para eliminar toda partı́cula de vidrio que evacuación del aire presente en dichos reservorios antes de
pudiera estar presente. dispensar el dispositivo lleno.
2. La medición y el mezclado manual de no más de tres productos 3. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyección e
fabricados para preparar mezclas de medicamentos y soluciones infusión con volúmenes de soluciones farmacéuticas estériles
nutricionales. que se administrarán en el curso de varios dı́as a temperatura
Garantı́a de Calidad—Las prácticas de garantı́a de calidad ambiente entre 258 y 408.
incluyen, entre otras, las siguientes: 4. Transferencia de volúmenes de varias ampollas o viales a un
1. Desinfección y control de calidad rutinario del aire del entorno solo envase o producto estéril final.
de preparación directo para reducir al mı́nimo la contaminación Garantı́a de Calidad—Los procedimientos para garantizar la
microbiana de las superficies y mantener una calidad de aire calidad de las PME de riesgo mediano incluyen los mismos
ISO Clase 5 (ver Tabla 1). procedimientos utilizados para las PME de riesgo bajo y, además,
2. Verificación visual de que el personal de preparación magistral una prueba de llenado con medios más exigente que debe realizarse
está usando correctamente los elementos, la ropa y las gafas en forma anual o con mayor frecuencia.
protectoras apropiadas. Ejemplo de un Procedimiento de Prueba de Llenado con
3. Revisión de todos los pedidos y envases de ingredientes para Medios—Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse en
asegurar la correcta identidad y cantidad de los ingredientes condiciones que simulen las situaciones más difı́ciles o extremas
incorporados en la preparación magistral. que se encuentran durante la elaboración de preparaciones
4. Inspección visual de las PME para asegurar la ausencia de magistrales. Esta prueba debe completarse sin interrupciones
partı́culas en las soluciones, la ausencia de fugas en los viales y dentro de un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
bolsas y la información exacta y completa del etiquetado. Transferir asépticamente por gravedad seis alı́cuotas de 100 mL de
Medio Digerido de Caseı́na–Soja estéril a través de tubuladuras
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 369
separadas a sendos recipientes estériles evacuados. A continuación, 3. Medición y mezclado de ingredientes estériles en dispositivos
distribuir los seis recipientes en tres pares y usar una combinación de no estériles antes de su esterilización.
jeringa de 10 mL y aguja de calibre 18 estériles para intercambiar 4. Se presume, sin evidencia apropiada ni determinación directa,
dos alı́cuotas de 5 mL de medio de un recipiente al otro del par. Por que los envases de ingredientes a granel contienen al menos un
ejemplo, después de agregar una alı́cuota de 5 mL del primer 95% en peso del principio quı́mico activo y que no se han
recipiente al segundo recipiente del par, agitar este último durante 10 contaminado ni adulterado entre usos.
segundos, tomar una alı́cuota de 5 mL y volver a colocarla en el Garantı́a de Calidad—Los procedimientos para garantizar la
primer recipiente del par. Luego, agitar el primer recipiente durante calidad de las PME de riesgo alto incluyen los mismos procedi-
10 segundos y transferir la siguiente alı́cuota de 5 mL de vuelta al mientos empleados para las PME de riesgo bajo. Además, debe ser
segundo recipiente del par. Después de los dos intercambios de realizada en forma semestral, por cada persona autorizada a elaborar
alı́cuotas de 5 mL en cada par de recipientes, inyectar asépticamente PME de riesgo alto, una prueba de llenado con medios que
una alı́cuota de 5 mL de medio de cada recipiente en un vial vacı́o de represente una preparación magistral de riesgo alto.
10 mL que sea transparente, sellado y estéril usando una jeringa de Ejemplo de un Procedimiento de Prueba de Llenado con
10 mL y una aguja con venteo estériles. Fijar asépticamente sellos Medios—Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse en
adhesivos a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego condiciones que simulen las situaciones más difı́ciles o extremas
incubar los viales según se describe en la sección Capacitación y que se encuentran durante la elaboración de preparaciones
Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica. magistrales de riesgo alto. Esta prueba debe realizarse sin
interrupciones en la siguiente secuencia:
1. Disolver en 100 mL de agua no bacteriostática 3 g de Medio de
PME de Riesgo Alto Digerido de Caseı́na–Soja no estéril disponible comercialmente
para preparar una solución al 3%.
Son las PME elaboradas bajo cualquiera de las condiciones 2. Extraer 25 mL del medio y colocarlo en tres jeringas de 30 mL
indicadas a continuación, las que están contaminadas o las que estériles. Transferir 5 mL de cada jeringa a sendos viales de 10
tienen un riesgo alto de contaminarse con microorganismos mL estériles. Estos viales son los controles y generan un
infecciosos. crecimiento microbiano exponencial, indicado por una turbidez
Condiciones de Riesgo Alto— visible después de su incubación.
1. Se incorporan ingredientes no estériles, incluyendo productos 3. Bajo condiciones asépticas y utilizando técnicas asépticas, fijar
fabricados para vı́as de administración—que no sean las a cada jeringa una unidad de filtración estéril con un tamaño de
enumeradas en el punto c. de la Introducción—o se utiliza un poro de 0,2 mm y una aguja calibre 20. Inyectar los siguientes
dispositivo no estéril antes de la esterilización terminal. 10 mL de cada jeringa en tres viales separados de 10 mL
2. Los ingredientes, componentes, dispositivos y mezclas estériles estériles. Repetir el proceso en tres viales más. Etiquetar todos
están expuestos a una calidad de aire inferior a la ISO Clase 5 los viales, colocar sellos adhesivos estériles a los tapones de los
(ver Tabla 1). Esto incluye el almacenamiento de envases nueve viales e incubarlos a una temperatura entre 258 y 358.
abiertos o parcialmente usados de productos estériles fabricados Inspeccionar los viales para detectar crecimiento microbiano
que carecen de conservantes antimicrobianos en ambientes con durante 14 dı́as según se describe en la sección Capacitación y
una calidad inferior a la ISO Clase 5. Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación
3. Preparaciones no estériles expuestas durante 6 horas o más Aséptica.
antes de su esterilización.
4. Se presume, sin verificar las etiquetas y la documentación de los
proveedores o sin determinación directa, que la pureza quı́mica VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD DE LA
y la concentración del contenido de los ingredientes cumplen
con sus especificaciones originales o farmacopeicas en envases PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN
no abiertos o abiertos de ingredientes a granel (ver Selección de Los procedimientos de preparación magistral y los métodos de
Ingredientes en Preparación Magistral—Preparaciones No esterilización de PME deben corresponderse con los especificados en
Estériles h795i). la documentación escrita, debidamente confeccionada y verificada
5. En el caso de preparaciones de riesgo alto, cuando no se por la institución responsable de la preparación magistral. La
someten a una prueba de esterilidad, los perı́odos de verificación requiere pruebas planificadas que permitan demostrar la
almacenamiento no pueden superar los siguientes plazos: eficacia de todos los procedimientos crı́ticos para asegurar la
antes de su administración, las PME deben almacenarse de exactitud y pureza de las PME terminadas. Por ejemplo, pueden
forma apropiada y exponerse durante no más de 24 horas a realizarse pruebas de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad del
temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Producto a Examinar en Pruebas de Esterilidad h71i) con muestras
Generales), durante no más de 3 dı́as a temperatura frı́a (ver de PME de riesgo bajo y mediano y pueden agregarse cultivos
Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 dı́as en bacterianos no patógenos estándar a muestras de PME de riesgo alto
estado sólido de congelación a –208 o menor temperatura. que no serán dispensadas, antes de su esterilización terminal para su
Todos los dispositivos de medición, mezclado y purificación no evaluación posterior mediante pruebas de esterilidad. Las PME
estériles, empleados en la preparación de PME de riesgo alto, deben envasadas y etiquetadas deben inspeccionarse visualmente para
enjuagarse bien con agua estéril apirógena y luego escurrirse o verificar su integridad fı́sica y aspecto, incluyendo el volumen de
secarse en su totalidad inmediatamente antes de ser utilizados. Todas llenado final. Para asegurarse que las identidades y concentraciones
las PME de riesgo alto que son soluciones y que serán sometidas a de los ingredientes sean exactas, y en caso de no contar con
esterilización terminal por vapor deben pasarse por un filtro con un observaciones y datos confiables para confirmar y extrapolar dichos
tamaño de poro nominal de no más de 1,2 mm antes o durante el parámetros, debe realizarse una valoración de muestras de las PME.
llenado de los envases finales. La esterilización de las PME de nivel
de riesgo alto por filtración debe realizarse en su totalidad en un
entorno con calidad de aire ISO Clase 5 o superior (ver Tabla 1).
Ejemplos de Preparaciones Magistrales de Riesgo Alto—
Métodos de Esterilización
1. Disolución de polvos farmacéuticos y nutrientes a granel no Los profesionales de la salud autorizados a cargo de supervisar las
estériles para preparar soluciones que se esterilizarán en forma preparaciones magistrales son responsables de asegurar que el
terminal. método de esterilización seleccionado (ver Métodos de Esteriliza-
2. Ingredientes, componentes, dispositivos y mezclas estériles ción en Esterilización y Garantı́a de Esterilidad de Artı́culos
expuestos a una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Farmacopeicos h1211i) esterilice y mantenga la concentración,
Tabla 1). Esto incluye el almacenamiento en ambientes con una pureza, calidad e integridad del envase de las PME. Conforme a la
calidad inferior a la ISO Clase 5 de envases abiertos o experiencia y a fuentes de referencia apropiadas y, preferentemente,
parcialmente usados de productos estériles terminados que verificándolo siempre que sea posible, el proceso de esterilización
carecen de conservantes antimicrobianos.
370 h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
seleccionado deberı́a lograr la esterilidad de las PME correspon- Los dispositivos de filtración estériles disponibles comercialmente
dientes. Éstas son algunas pautas generales para asignar un método para usar en jeringas manuales pueden verificarse comprobando que
de esterilización apropiado a una PME y sus componentes: ofrecen una mayor resistencia en el émbolo cuando se filtra aire
1. Debe comprobarse que las PME se mantienen fı́sica y después de haber filtrado un lı́quido acuoso.
quı́micamente estables cuando se las somete al método de
esterilización seleccionado.
2. Los dispositivos de vidrio y metal pueden envolverse con papel ESTERILIZACIÓN POR VAPOR
de aluminio y luego exponerse a calor seco en una estufa a una
temperatura media de 2508 durante 2 horas para lograr la El proceso de esterilización térmica utilizando vapor saturado bajo
esterilidad y despirogenación (ver Esterilización por Calor presión, o esterilización en autoclave, es el método preferido para la
Seco en Esterilización y Garantı́a de Esterilidad de Artı́culos esterilización terminal de preparaciones acuosas que, según se ha
Farmacopeicos h1211i). Dichos artı́culos deben usarse de verificado, mantienen su estabilidad quı́mica y fı́sica bajo las
inmediato o almacenarse hasta su uso en un ambiente adecuado condiciones empleadas (ver Esterilización por Vapor en Esteriliza-
para la elaboración de las PME de bajo y mediano riesgo. ción y Garantı́a de Esterilidad de Artı́culos Farmacopeicos h1211i).
3. El personal debe determinar, a partir de fuentes de referencia Para lograr la esterilidad, es necesario exponer todos los materiales al
apropiadas, si el filtro de membrana microporosa estéril usado vapor a una temperatura de 1218, bajo una presión de aproximada-
para esterilizar las soluciones PME, ya sea durante su mente una atmósfera o 15 psi, durante un tiempo que, según se haya
preparación o su administración, es quı́mica y fı́sicamente verificado mediante pruebas, logre la esterilidad de los artı́culos. Por
compatible con la PME. lo general, este tiempo es de 20 a 60 minutos en el caso de las PME.
Debe contemplarse el tiempo requerido para que el material alcance
los 1218 antes de comenzar a medir el tiempo de esterilización.
ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN Algunos microorganismos y esporas pueden sobrevivir cuando los
artı́culos no se exponen directamente al vapor presurizado. Antes de
Los filtros estériles disponibles comercialmente deben estar su esterilización, los dispositivos de plástico, vidrio y metal deben
aprobados para uso en seres humanos cuando se utilizan para la envolverse en un papel o tela que no libere demasiadas partı́culas o
esterilización de lı́quidos farmacéuticos. Tanto los filtros que deben sellarse en sobres que impidan la penetración microbiana después de
esterilizarse antes de procesar las PME como los filtros desechables, su esterilización. Inmediatamente antes de llenar las ampollas y
estériles y apirógenos disponibles comercialmente tienen un tamaño viales que se esterilizarán con vapor, las soluciones deben pasarse
de poro nominal de 0,2 mm, que incluye un tamaño de poro de 0,22 por un filtro con un tamaño de poro de no más de 1,2 mm para
mm. El fabricante debe certificar que retienen al menos 107 eliminar las partı́culas. Los envases sellados deben poder generar
microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) vapor internamente; en consecuencia, los viales vacı́os con tapón y
diminuta en cada cm2 de la superficie del filtro en contacto con la precintados deben contener una pequeña cantidad de humedad para
solución a filtrar, en condiciones similares a las que se utilizarán para generar vapor.
esterilizar las PME. En casos de emergencia, cuando no se cuente La descripción de las condiciones y duración de la esterilización
con membranas de tamaño de poro de 0,2 mm, pueden usarse filtros por vapor para cada PME debe estar documentada por escrito en la
de la misma composición y un tamaño de poro nominal de 0,45 mm. institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la
Los filtros de esterilización con tamaños de poro nominales de 0,2 esterilización con vapor debe verificarse utilizando indicadores
mm y 0,45 mm no eliminarán las endotoxinas bacterianas y virus por biológicos apropiados (ver Indicadores Biológicos h1035i) u otros
retención fı́sica. métodos de verificación (ver Esterilización y Garantı́a de Esterilidad
El profesional de la salud a cargo de supervisar la esterilización de Artı́culos Farmacopeicos h1211i o Pruebas de Esterilidad h71i).
debe asegurar, en forma directa o a partir de documentación
apropiada, que los filtros sean quı́mica y fı́sicamente estables en las
condiciones de presión y temperatura que se utilizarán y que logren CAPACITACIÓN Y EVALUACIÓN DEL
la esterilidad de la PME y mantengan la calidad farmacéutica que PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN
tenı́a antes de la filtración. Las dimensiones del filtro y el material
con el que está fabricado deben permitir que el proceso de ASÉPTICA
esterilización se complete rápidamente sin tener que cambiar el
filtro durante el proceso. Cuando se sabe que la PME contiene una Antes de comenzar a elaborar PME, el personal de preparación
cantidad excesiva de partı́culas, debe colocarse un prefiltro o una magistral debe recibir la capacitación apropiada en los principios
membrana con un tamaño de poro mayor antes del filtro de teóricos y técnicas prácticas de manipulación aséptica a través de
esterilización para eliminar las partı́culas contaminantes grandes y personal experto, instrucción audiovisual y publicaciones profesio-
aumentar al máximo la eficiencia del filtro de esterilización. nales. Inicialmente, el personal de preparación magistral debera
Cuando el personal de preparación magistral deba montar los realizar una revisión didáctica y pasar pruebas escritas de llenado
dispositivos de filtración usando componentes no estériles, debera con medios y de técnicas de manipulación aséptica; luego, al menos
verificarse que dichos dispositivos sean estériles y eficaces bajo las una vez al año, en el caso de preparaciones magistrales de riesgo
condiciones pertinentes antes de utilizarlos para esterilizar PME. La bajo y mediano, y en forma semestral, en el caso de preparaciones de
esterilidad puede identificarse, por ejemplo, usando indicadores riesgo alto. El personal de preparación magistral que no pase las
biológicos (ver Indicadores Biológicos h1035i). Las unidades de pruebas escritas, o cuyos viales de prueba de llenado con medios
filtración usadas para esterilizar las PME también pueden someterse produzcan una colonización microbiana profusa, deberá recibir de
a la prueba de integridad recomendada por el fabricante, como la inmediato la recapacitación necesaria y someterse a una nueva
prueba de punto de burbuja. evaluación a cargo de personal de preparación magistral experto para
Cuando se utilizan dispositivos de filtración estériles desechables asegurarse de que hayan corregido sus deficiencias en materia de
disponibles comercialmente, el personal de preparación magistral práctica aséptica.
puede aceptar la certificación escrita de los proveedores de que los Prueba de Desafı́o de Llenado con Medios—La habilidad del
filtros retienen al menos 107 ufc de Brevundimonas (Pseudomonas) personal para elaborar PME asépticamente puede evaluarse usando
diminuta en cada cm2 de superficie del filtro. El personal de el método de validación de llenado con medios lı́quidos de cultivo
preparación magistral debe verificar que los filtros seleccionados bacteriano estériles,1 (es decir, transferencia de un medio de cultivo
logren la esterilización de las PME que se están esterilizando. bacteriano estéril a través de una jeringa y aguja estériles). La prueba
Cualquier desviación significativa respecto de las propiedades de llenado con medios se utiliza para evaluar la habilidad del
quı́micas y fı́sicas normales o esperadas de la PME podrı́a causar personal en la preparación aséptica . Las pruebas de llenado con
daños no detectables en la integridad del filtro y la reducción de los medios deben representar las condiciones más exigentes o difı́ciles
microorganismos a un tamaño más pequeño que el de los poros del
filtro. 1
Pauta de la FDA sobre productos farmacéuticos estériles producidos por
procesamiento aséptico, junio de 1987, páginas 20-27; Monografı́a técnica de
la PDA N8 2, Validación de llenado aséptico para soluciones farmacéuticas,
1980.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 371
con las que el personal puede encontrarse durante la elaboración de Cuartos Limpios y Barreras Aisladoras
PME de un determinado nivel de riesgo y durante la esterilización de
PME de riesgo alto. Por lo general, las instituciones responsables de preparar
Los medios lı́quidos de cultivo estériles disponibles comercial- productos estériles utilizan bancos de flujo laminar (BFL) para
mente, como el Medio de Digerido de Caseı́na–Soja (ver Pruebas de crear un entorno satisfactorio para los sitios crı́ticos. A continuación,
Esterilidad h71i), deben ser capaces de promover el crecimiento se describen las instalaciones necesarias y los procedimientos
exponencial de las bacterias que el personal de preparación magistral correctos para la preparación de productos estériles usando BFL
y el entorno suelen transmitir a las PME. Los viales llenados con en cuartos limpios. También es posible el uso de sistemas
medios deben incubarse a una temperatura de 258 a 358 durante 14 alternativos en cuartos limpios siempre que se haya verificado que
dı́as. Si el medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 dı́as, logran el mismo nivel de calidad ambiental o un nivel superior que el
significa que no ha pasado la prueba. que permiten obtener BFL correctamente operados. Una tecnologı́a
Ejemplo de un Procedimiento de Prueba de Llenado con alternativa emergente utiliza sistemas de barrera aisladora para
Medios—Realizar la prueba según se indica en la sección Garantı́a reducir al mı́nimo el grado de contacto e interacción con el personal,
de Calidad de PME de Riesgo Bajo. para separar el entorno externo del sitio crı́tico y proporcionar un
entorno ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para la elaboración de PME. Una
barrera aisladora de presión positiva bien diseñada, complementada
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL con procedimientos apropiados para su mantenimiento, seguimiento
y control, puede ser una alternativa aceptable al uso de BFL
Lograr y mantener la esterilidad y la ausencia total de convencionales en cuartos limpios para el procesamiento aséptico.
contaminación de un producto farmacéutico depende de la calidad En el primer plano de la Figura 1 puede verse un ejemplo de
de los componentes incorporados, del proceso utilizado, del distribución de un cuarto limpio para PME de riesgo bajo y mediano.
desempeño del personal y de las condiciones ambientales en las El segundo plano de la Figura 1 muestra un cuarto limpio
que se realiza el proceso. Los niveles de exigencia requeridos en multicompartimental apropiado para PME de riesgo alto.
relación con las condiciones ambientales dependen del grado de
exposición de la PME al entorno inmediato durante su procesa-
miento. En esta sección se describe la calidad y el control de las Controles Ambientales
condiciones ambientales para cada nivel de riesgo. Además, las
operaciones que utilizan componentes no estériles requieren el uso Los controles de ingenierı́a reducen el potencial de contaminación
de un método de preparación que permita obtener un producto por partı́culas en el aire en los espacios de trabajo limitando la
estéril. cantidad y tamaño de contaminantes en el entorno de procesamiento
de las PME. Se utilizan controles de ingenierı́a primarios que suelen
incluir flujos laminares horizontales, flujos laminares verticales,
Exposición de un Sitio Crı́tico gabinetes de bioseguridad y barreras aisladoras. El control ambiental
primario debe proporcionar una calidad de aire ISO Clase 5 como
El grado de exposición del producto durante su procesamiento mı́nimo (ver Tabla 1) para la exposición directa de los ingredientes y
dependerá de la duración de la exposición, del tamaño del sitio componentes de las PME. Los controles de ingenierı́a secundarios
crı́tico expuesto y de las caracterı́sticas del sitio crı́tico. por lo general proporcionan una zona amortiguadora o cuarto
Un sitio crı́tico es cualquier abertura que proporcione una vı́a de amortiguador como lugar central para la ubicación de los bancos o
comunicación directa entre un producto estéril y el entorno o aisladores.
cualquier superficie que entre en contacto directo con el producto y
el entorno. El riesgo de que un sitio de estas caracterı́sticas se
contamine a través del entorno aumenta en forma proporcional al Tabla 1. Clasificación ISO (Organización Internacional de
tiempo de exposición. Por lo tanto, el plan de procesamiento y el Normalización) de partı́culas en el aire ambiental [Los lı́mites se
operador deben tener en cuenta factores tales como la organización, expresan en partı́culas de 0,5 mm y más grandes por metro cúbico
eficiencia y velocidad a fin de reducir al mı́nimo el tiempo de (ISO actual) y pies cúbicos (ex Federal Standard N8 209E,
exposición. Por ejemplo, una ampolla no debe abrirse antes de usarse FS209E).]*
si no es necesario. Nombre de la clase Tamaño de la partı́cula
El tamaño del sitio crı́tico influye en el grado de riesgo de que
ingrese contaminación en el producto: cuanto más grande sea el área Clase ISO FS 209E ISO, m3 FS 209E, pies3
expuesta, mayor será el riesgo. La superficie crı́tica expuesta a EE.UU.
contaminación de un vial o frasco abierto es mucho más grande que 3 Clase 1 35,2 1
la punta de una aguja calibre 26. En consecuencia, el riesgo de 4 Clase 10 352 10
contaminación de un vial o frasco abierto es mucho mayor que el 5 Clase 100 3520 100
que existe durante la exposición momentánea a la punta de una 6 Clase 1000 35 200 1000
aguja. 7 Clase 10 000 352 000 10 000
Las caracterı́sticas del sitio crı́tico también influyen en el grado de 8 Clase 100 000 3 520 000 100 000
riesgo de contaminación. Después de frotarla con una gasa embebida
en alcohol, la superficie relativamente áspera y permeable de un *
Adaptado de la norma federal N8 209E, Administración de Servicios
tapón elastomérico retiene microorganismos y otros contaminantes Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO
con más facilidad que la superficie de vidrio lisa del cuello de una [4644-1 : 1999 Clean rooms and associated controlled environments—Part 1:
ampolla. En consecuencia, puede esperarse que la desinfección de la Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partı́culas de 0,5 mm por
superficie sea más eficaz en el caso de una ampolla. m3 o más grandes (ISO Clase 5) equivalen a 100 partı́culas por pie3 (Clase
Una vez abierta la ampolla, el sitio crı́tico de exposición aumenta 100) (1 m3 = 34,314 pies3).
considerablemente, creando una vı́a que puede permitir el ingreso
potencial de vidrio, fibra y polvo en el lı́quido contenido en la El flujo de aire a través de filtros de alta eficiencia para partı́culas
ampolla. aéreas (HEPA por sus siglas en inglés) es unidireccional o columnar
Debe darse prioridad a la prevención o eliminación de partı́culas y, debido al tamaño de los poros del filtro, el ‘‘primer aire’’ en la cara
en el aire. Los contaminantes aéreos tienen muchas más probabi- del filtro, está libre de contaminación con partı́culas a los efectos de
lidades de llegar a sitios crı́ticos que los contaminantes que se la preparación magistral aséptica. Las barreras aisladoras proporcio-
adhieren al piso o a otras superficies por debajo del nivel de trabajo. nan un entorno adecuado al restringir el ingreso de aire ambiental al
Además, las partı́culas que son relativamente grandes o de alta recinto de trabajo. Estos sistemas no son tan sensibles a entornos
densidad se depositan con más rapidez y, en consecuencia, pueden externos como las unidades de flujo de aire unidireccional filtrado
ser eliminadas de la proximidad de los sitios crı́ticos. con filtros HEPA.
Deben entenderse y ponerse en práctica varios aspectos del
aislamiento con barreras y el flujo de aire unidireccional filtrado en el
ambiente de trabajo durante el proceso de preparación magistral.
372 h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
Fig. 1
Deben elaborarse, actualizarse, mantenerse e implementarse polı́ticas también deben realizarse con una calidad de aire ISO Clase 8 como
y procedimientos para mantener las condiciones prescritas durante el mı́nimo (ver Tabla 1). Deben implementarse controles apropiados
procesamiento aséptico. Estas polı́ticas y procedimientos deben para el aire acondicionado y la humedad en la zona amortiguadora.
determinarse según el alcance y los niveles de riesgo de las Las tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben
actividades realizadas como parte de la elaboración de PME. limitarse a aquellas para las que se requiere un ambiente controlado.
En general, el ambiente de trabajo para PME debe tener las Sólo pueden llevarse a este cuarto los muebles, equipos, materiales y
superficies de trabajo más limpias (flujos laminares horizontales o otros artı́culos requeridos para realizar las tareas y éstos deben ser
verticales, gabinetes de bioseguridad o aisladores) ubicadas en una impermeables y resistentes a los desinfectantes y no liberar
zona amortiguadora, precedida por una antesala que proporcione un partı́culas. Cada vez que se lleva alguno de estos elementos al
área limpia para que el personal se coloque las protecciones cuarto, primero deben limpiarse y sanitizarse. Siempre que sea
personales, como cofias, guantes, trajes o el uniforme completo para posible, los equipos y otros elementos usados en la zona
el cuarto limpio. Debe comprobarse que la clase de aire del cuarto amortiguadora no deben retirarse del cuarto, salvo para su
amortiguador o central sea mejor que la del aire ambiente para calibración, reparación u otra actividad asociada con el manteni-
reducir el riesgo de arrastrar o introducir contaminantes en el miento correcto del equipo.
ambiente de flujo de aire unidireccional filtrado. Por ejemplo, las Las superficies de los techos, paredes, pisos, artefactos, estantes,
corrientes de aire fuertes provenientes de puertas abiertas, el tráfico mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e
del personal o los flujos de aire provenientes de los sistemas de impermeables, no deben tener grietas y no deben liberar partı́culas
calefacción, ventilación y aire acondicionado pueden alterar para facilitar su limpieza y reducir al mı́nimo los espacios en los que
fácilmente el flujo de aire columnar unidireccional en los bancos podrı́an acumularse microorganismos y otros contaminantes. Las
de trabajo abiertos. Los operadores también pueden producir superficies deben ser resistentes a los daños causados por agentes
alteraciones en el flujo de aire con sus propios movimientos y al sanitizantes. Las uniones de los techos con las paredes deben ser
colocar objetos sobre la superficie de trabajo. abovedadas o rellenarse para evitar la formación de grietas donde
Las zonas amortiguadoras o cuartos limpios en los que se pueda acumularse polvo. Si los techos constan de paneles, estos
encuentran los BFL deben proporcionar una calidad de aire ISO paneles deben impregnarse con un polı́mero para hacerlos
Clase 8 como mı́nimo (ver Tabla 1). La medición, pesado, mezclado impermeables e hidrófobos y, además, deben sellarse la unión con
y otras formas de manipulación de PME no estériles en proceso el armazón que hace de soporte en todo su perı́metro. Las paredes
pueden constar de paneles unidos entre sı́ y sellados o de placas de
yeso recubiertas con epoxi. Preferentemente, los pisos deben
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 373
cubrirse con planchas anchas de revestimiento vinı́lico, térmica- Los pisos de la zona amortiguadora o cuarto limpio deben
mente soldadas y arqueadas hacia los zócalos. Debe evitarse la limpiarse una vez al dı́a pasando un trapeador cuando no se esta
presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberı́as realizando ninguna operación aséptica. La limpieza del suelo puede
de servicios que pasan por el techo o los marcos de las ventanas. La ser realizada por personal de apoyo capacitado y supervisado usando
superficie externa de los artefactos de iluminación empotrados en el los agentes aprobados que se describen en los procedimientos
cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del techo. Cualquier escritos. Sólo deben utilizarse agentes de limpieza y sanitización
otro elemento que penetre en el techo o las paredes debe estar aprobados teniendo en cuenta su compatibilidad, eficacia y la
sellado. generación de residuos inapropiados o tóxicos. La frecuencia de uso
La zona amortiguadora no debe contener lavabos ni drenajes en el y los métodos de aplicación deben ajustarse a los procedimientos
piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con escritos. Ninguno de los implementos de limpieza, como paños
materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico absorbentes, esponjas y trapeadores, debe liberar partı́culas y su uso
moldeado, para que puedan limpiarse y sanitizarse fácilmente. Los debe estar reservado exclusivamente a la zona amortiguadora o
carros deben ser de alambre de acero inoxidable o planchas metálicas cuarto limpio. Pueden usarse trapeadores tanto en la zona
con ruedas de buena calidad para facilitar su movilidad y fáciles de amortiguadora o cuarto limpio como en la antesala pero únicamente
limpiar. Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes en ese orden. La mayorı́a de los trapos debe desecharse después de
deben ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y un solo uso. En caso de reutilizar los implementos de limpieza, estos
sanitizar y, además deben estar libres de grietas y no desprender deben mantenerse limpios enjuagándolos y sanitizándolos después
partı́culas. La cantidad, el diseño y la forma de instalación deben ser de cada uso y guardándolos en un ambiente limpio entre cada uso.
tales que faciliten una limpieza y sanitización eficaces. La basura debe recogerse en bolsas de plástico adecuadas y retirarse
del lugar con la menor agitación posible.
En la antesala, los materiales y equipos retirados de su embalaje
Entorno de Elaboración de las PME original deben limpiarse con un trapo y un agente sanitizante, como
solución estéril de alcohol isopropı́lico al 70%3 y debe inspeccio-
Las condiciones y los procedimientos de reducción de la narse periódicamente para asegurarse de que no está contaminado.
contaminación que se describen en esta sección incluyen la Como alternativa, en el caso de recibir los materiales en bolsas
colocación de BFL capaces de mantener una calidad de aire ISO selladas, éstas pueden abrirse al introducir los materiales en la zona
Clase 8 como mı́nimo dentro de las zonas amortiguadoras o cuartos amortiguadora o cuarto limpio sin necesidad de sanitizar cada uno de
limpios (ver Tabla 1). Se prefiere, aunque no es necesario, colocar los elementos en forma individual. No se pueden llevar cajas de
barreras aisladoras dentro de las zonas amortiguadoras con esta embalaje ni otros envases externos a la zona amortiguadora o cuarto
calidad de aire. La frecuencia de acceso y la cantidad de personal que limpio. La antesala debe ser limpiada y sanitizada al menos una vez
ingresa en las zonas amortiguadoras de calidad de aire deben estar por semana por personal de apoyo capacitado y supervisado,
restringidas para reducir al mı́nimo los contaminantes y, al mismo conforme a los procedimientos escritos. No obstante, los pisos deben
tiempo, permitir la entrega de los materiales esenciales para la limpiarse y sanitizarse a diario, comenzando siempre con la zona
elaboración de las PME. Los alimentos, las bebidas y los materiales amortiguadora o cuarto limpio y siguiendo con la antesala. Deben
expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes nunca retirarse todos los materiales de los estantes de almacenamiento y
deben introducirse en áreas en las que hay presentes componentes e luego se los debe limpiar y sanitizar con la frecuencia programada,
ingredientes para la elaboración de PME. preferentemente una vez por mes.
Los materiales, como agujas, jeringas, ampollas, bolsas, viales de Estos procedimientos de limpieza y sanitización son válidos para
lı́quidos parenterales y envases de tuberı́as de transferencia para todas las operaciones de riesgo bajo y alto.
grandes volúmenes de lı́quido, deben retirarse de sus cajas y
desinfectarse en un área cercana, pero fı́sicamente aislada de la zona
amortiguadora—la antesala—. Higiene y Vestimenta del Personal
En esta antesala contigua a la zona amortiguadora el personal
también se sanitiza las manos y se coloca el traje. Los grifos deben El personal cumple un papel clave en el mantenimiento de las
poder usarse sin necesidad de utilizar las manos. Antes de procesar condiciones asépticas durante el desarrollo de las responsabilidades
las PME, el personal debe volver a sanitizarse las manos después de asignadas. Deben estar perfectamente capacitados en el uso de
haberse colocado toda la ropa que corresponda, salvo los guantes. La técnicas asépticas y altamente motivados para mantener estos
separación de la zona amortiguadora y la antesala debe estar estándares cada vez que preparan un producto estéril.
identificada con una lı́nea o barrera. El personal de preparación Antes de ingresar en la zona amortiguadora o cuarto limpio, los
magistral debe poder acceder a la zona amortiguadora sin usar sus operadores deben quitarse los guardapolvos o prendas similares, el
manos. El propósito de las antesalas de las zonas amortiguadoras es maquillaje y las joyas, y cepillarse bien las manos y los brazos hasta
reducir al mı́nimo la introducción de contaminantes en la zona el codo. Después de secarse las manos y los brazos deben colocarse
amortiguadora. en forma correcta un uniforme limpio que no desprenda material,
incluyendo una cofia y cubrecalzado, guardapolvos hasta la rodilla u
overoles y guantes apropiados, en ese orden. Los guardapolvos
Limpieza y Sanitización de los Espacios de Trabajo deben quedar bien ajustados en las muñecas y deben cerrarse con
broches o cierres cremallera en la parte delantera. Los cubrecalzados
La limpieza, sanitización y organización de las áreas de deben colocarse de manera tal que los pies toquen el piso sólo sobre
preparación magistral directas y contiguas (APDC) debe estar a el lado limpio del banco u otra demarcación. Las máscaras deben
cargo de personal capacitado (farmacéuticos y técnicos) y debe- colocarse justo antes de comenzar con las actividades en las APDC
rá realizarse al comienzo de cada turno siguiendo los procedimientos para reducir al mı́nimo los contaminantes provenientes de la tos,
escritos existentes. Antes de realizar las preparaciones magistrales, estornudos y la conversación.
deben retirarse todos los elementos presentes en las APDC y Cuando se elaboran PME en un flujo laminar vertical con un
limpiarse todas las superficies para eliminar los materiales sueltos y escudo transparente entre la cara del operador y los componentes
residuos de derrames. A continuación, debe aplicarse un agente estériles, o cuando se utiliza un aislador, el uso de una máscara es
sanitizante que no deje residuos2 y dejarse el tiempo suficiente para opcional, pero la cabeza y el vello facial deben estar cubiertos.
que ejerza su efecto antimicrobiano. Los guantes protectores apropiados libres de polvo deben ser
Las superficies de trabajo cercanas a las APDC en la zona estériles o, en caso de que no lo sean, deben sanitizarse antes de su
amortiguadora o cuarto limpio deben limpiarse de manera similar, uso con un limpiador antimicrobiano apropiado, como alcohol al
incluyendo las superficies de los mostradores y los carros. Deben 70%. Los guantes protectores deben colocarse después de colocarse
quitarse todos los materiales de los estantes de almacenamiento y el resto del uniforme. Cuando se utilizan guantes no estériles,
limpiarse y sanitizarse al menos una vez por semana con agentes elegidos por su composición quı́micamente protectora, deben
aprobados. 3
NOTA—la solución de alcohol isopropı́lico al 70% puede albergar esporas
microbianas resistentes. En consecuencia, el alcohol isopropı́lico siempre
debe filtrarse con un filtro hidrófobo de 0,2-mm para esterilizarlo antes de
2
Aprobado por el farmacéutico a cargo. usarlo en zonas asépticas.
374 h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
desinfectarse con alcohol isopropı́lico al 70% estéril o con un agente (6) Los objetos que liberan partı́culas incluyendo lápices, cajas de
microbiano que deberá dejarse evaporar antes de iniciar los cartón, toallas de papel y artı́culos de algodón no pueden
procedimientos de preparación magistral. Los guantes estériles y llevarse a la zona amortiguadora o cuarto limpio. Sólo pueden
sanitizados no se mantienen estériles y limpios durante las llevarse productos a base de papel que no desprendan partı́culas
actividades de preparación magistral ya que entran en contacto con (cajas, fichas de trabajo, etc.).
superficies no estériles y con el aire. En consecuencia, debe (7) Debe reducirse al mı́nimo el flujo de tráfico hacia y desde la
enseñarse al personal de preparación magistral cómo evitar tocar zona amortiguadora o cuarto limpio.
las superficies estériles de los envases, dispositivos de transferencia y (8) El personal que se prepara para ingresar en la zona
componentes dentro de entornos de calidad de aire ISO Clase 5 o amortiguadora o cuarto limpio debe quitarse todas las joyas
superiores (ver Tabla 1). Durante las actividades de preparación de las manos y brazos.
magistral prolongadas, el personal debe volver a sanitizar sus (9) El personal que ingresa en la zona amortiguadora o cuarto
guantes periódicamente con alcohol isopropı́lico al 70% estéril. limpio debe lavarse las manos y los brazos con jabón, usando
Todo el personal, sin excepción, debe lavarse y vestirse de forma un cepillo para los dedos y las uñas. Debe utilizarse un secador
correcta inmediatamente antes de ingresar en la zona amortiguadora de aire o toallas desechables que no liberen partı́culas para
o cuarto limpio. En caso de que el operador deba salir del cuarto, secarse las manos y los brazos después de lavarse.
puede quitarse el guardapolvo cuidadosamente en la entrada y (10) El personal que ingresa en la zona amortiguadora o cuarto
colgarlo del revés, y luego ponérselo nuevamente al volver a limpio, después de cepillarse, deberı́a vestirse según se describe
ingresar, pero sólo durante el mismo turno. No obstante, debera en Higiene y Vestimenta del Personal.
desechar las cofias, máscaras, cubrecalzado y guantes y colocarse (11) No puede llevarse goma de mascar, dulces ni ningún tipo de
otros nuevos antes de volver a ingresar. alimentos a la zona amortiguadora o cuarto limpio ni a la
En las operaciones de riesgo alto, es fundamental reducir al antesala.
mı́nimo el riesgo de contaminación de los guardapolvos, overoles y (12) Al comienzo de cada sesión de preparación magistral, y cuando
otras prendas que deben usarse en la zona amortiguadora o cuarto se derrama un lı́quido, las superficies del ambiente de
limpio. Preferentemente, el personal deberá colocarse ropa limpia de preparación magistral directa deben limpiarse con Agua
nuevo cada vez que ingresa en la zona amortiguadora o cuarto limpio Purificada para eliminar los residuos hidrosolubles. Inmedia-
para evitar liberar contaminantes provenientes de la ropa usada tamente después, deben sanitizarse con alcohol isopropı́lico al
anteriormente. Como alternativa, puede quitarse la ropa que estaba 70% estéril, o con otros agentes antimicrobianos eficaces,
usando y volver a colocársela al reingresar en la zona amortiguadora usando un trapo que no libere pelusa.
o cuarto limpio. Mientras tanto, la ropa debe guardarse bajo un (13) Cuando se utilizan BFL o barreras aisladoras como entorno de
control y protección apropiados en la antesala. La ropa usada o calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), los ventiladores
llevada fuera de los lı́mites de la antesala no puede volver a usarse en deben estar en funcionamiento continuo durante la preparación,
la zona amortiguadora o cuarto limpio. incluyendo durante interrupciones de menos de 8 horas.
La dispersión de partı́culas de las superficies del cuerpo, Cuando se apaga el ventilador, y antes de que ingrese el
provenientes, por ejemplo, de erupciones cutáneas, quemaduras de siguiente turno de personal para realizar actividades de
sol o cosméticos, aumenta el riesgo de contaminación en los sitios preparación magistral, sólo puede ingresar una persona en la
crı́ticos y debe controlarse de forma apropiada o reducirse al zona amortiguadora contigua a los efectos de encender el
mı́nimo. En casos graves, debe impedirse el ingreso del operador en ventilador (durante al menos 30 minutos) y sanitizar las
la zona amortiguadora o cuarto limpio hasta que se reponga, superficies de trabajo.
especialmente en el caso de operaciones de riesgo alto. (14) El tráfico en las APDC debe reducirse al mı́nimo y controlarse.
Las APDC deben protegerse de las corrientes de aire menos
limpio que sean de mayor velocidad que el flujo de aire laminar
Procedimientos Operativos Estándar Sugeridos limpio.
(15) Deben juntarse los materiales que se utilizarán en las APDC
La farmacia deberı́a contar con procedimientos operativos para los procedimientos planificados y luego descontaminarse
estándar escritos debidamente aprobados para asegurar la calidad limpiando o rociando la superficie externa con solución de
del entorno en el que se elaboran las PME. Se recomienda adoptar alcohol isopropı́lico o retirando el envoltorio externo en el
los siguientes procedimientos: borde de las APDC antes de introducir el artı́culo en el área de
(1) Restringir el acceso a la zona amortiguadora o cuarto limpio a trabajo aséptica.
personal calificado con responsabilidades especı́ficas o tareas (16) Después de introducir en forma correcta en las APDC
asignadas en el área. únicamente los materiales requeridos para las operaciones
(2) Descontaminar todos los materiales envasados en la antesala asignadas, deben organizarse de manera tal que un flujo
retirándolos de sus cajas y limpiándolos o rociándolos con un ininterrumpido de aire filtrado con un filtro HEPA bañe todos
agente desinfectante, como solución de alcohol isopropı́lico los sitios crı́ticos en todo momento durante los procedimientos
estéril, mientras se los transfiere a un carro limpio y sanitizado o planificados. Es decir, no pueden colocarse objetos detrás de un
a otro medio de transporte para su introducción en la zona sitio crı́tico expuesto en una posición horizontal o sobre un flujo
amortiguadora o cuarto limpio. No es necesario limpiar los laminar vertical.
materiales que vienen en bolsas individuales ya que las bolsas (17) Los materiales deben disponerse en las APDC para evitar su
pueden retirarse a medida que se introducen los materiales en la acumulación y hacer que el flujo de trabajo sea más eficiente y
zona amortiguadora o cuarto limpio. ordenado.
(3) Los materiales requeridos con frecuencia o que deben tenerse a (18) Todos los procedimientos deben realizarse de manera tal de
mano pero que no son necesarios para las operaciones reducir al mı́nimo el riesgo de contaminación por contacto. Los
programadas en un determinado turno deben descontaminarse guantes deben sanitizarse con la frecuencia necesaria con un
y almacenarse en los estantes de la antesala. desinfectante aprobado.
(4) Los carros usados para llevar materiales desde la sala de (19) Todos los tapones de goma de los viales y frascos y el cuello de
almacenamiento no pueden desplazarse más allá de la lı́nea de las ampollas deben sanitizarse con solución de alcohol
demarcación de la antesala y aquellos usados en la zona isopropı́lico antes de introducir una aguja para extraer el
amortiguadora o cuarto limpio no pueden llevarse más allá de la producto.
lı́nea de demarcación a menos que se limpien y saniticen antes (20) Después de la preparación de cada mezcla, el contenido del
de volverlos a introducir. envase debe mezclarse bien y luego inspeccionarse para
(5) Por lo general, los materiales requeridos para las operaciones asegurarse de que no tenga partı́culas, signos de incompatibi-
programadas en cada turno deben prepararse y llevarse a la lidad u otros defectos.
zona amortiguadora o cuarto limpio en uno o más carros (21) Una vez finalizados los procedimientos, deben retirarse las
móviles. Los materiales de reserva o de respaldo general para jeringas, frascos, viales y otros materiales utilizados, procuran-
las operaciones pueden almacenarse en el estante designado en do volver a llevarlos a las APDC la menor cantidad de veces
la zona amortiguadora o cuarto limpio pero debe evitarse la posible para reducir al mı́nimo las probabilidades de introducir
acumulación excesiva de materiales. contaminación en el espacio de trabajo aséptico.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 375
cumplan con las normas oficiales de la USP o NF. Cuando se utilizan Validación de Procedimientos Oficiales h1225i para verificar los
ingredientes no oficiales, deben ir acompañados por certificados de parámetros que deben tenerse en cuenta para la evaluación de un
análisis de sus proveedores para que el personal de preparación DPA.
magistral pueda evaluar su identidad, calidad y pureza en relación
con el uso que se les dará en cada PME. Es necesario realizar una
inspección fı́sica del envase que contiene los ingredientes para Exactitud
asegurarse de que no tenga roturas, tapas o cierres flojos y que el
contenido cumpla con el aspecto, aroma y textura esperados. La exactitud de un DPA puede determinarse de varias maneras
Las sustancias farmacéuticas a granel, o no formuladas, y las para asegurar que se suministren las cantidades correctas de
sustancias agregadas, o excipientes, deben almacenarse en envases nutrientes, electrólitos u otros componentes nutricionales al envase
herméticamente cerrados bajo las condiciones de temperatura, de infusión final. Inicialmente, debe evaluarse el DPA para verificar
humedad e iluminación indicadas en las monografı́as oficiales o la exactitud de su volumen y peso. Para verificar la exactitud del
aprobadas por los proveedores; además, la fecha de recepción en la volumen, debe programarse en el DPA un volumen adecuado de
institución responsable de la preparación magistral debe indicarse en Agua Estéril para Inyección, que represente un volumen aditivo
forma clara e indeleble en cada envase. Una vez recibidos por la tı́pico (p. ej., 40 mL para un volumen pequeño de 1 a 100 mL; o 300
institución responsable de la preparación magistral, los envases de mL para un volumen grande de 100 a 1000 mL) y administrarse a un
ingredientes que no tienen una fecha de caducidad del proveedor no recipiente volumétrico apropiado. Luego, el farmacéutico debe
podrán utilizarse después de transcurrido un año, a menos que una consultar en el capı́tulo Aparatos Volumétricos h31i los parámetros
inspección o análisis apropiados indiquen que el ingrediente ha apropiados para evaluar el desempeño volumétrico del DPA. Para
conservado su pureza y calidad para su uso en la elaboración de verificar la exactitud gravimétrica, debe evaluarse la balanza
PME. utilizada junto con el DPA, usando diferentes tamaños de pesas
Deberán considerarse y evaluarse cuidadosamente las fuentes de que representen las cantidades normalmente usadas para administrar
ingredientes no estériles, especialmente cuando la PME ha de los diferentes aditivos. El farmacéutico debe consultar en la sección
administrarse en el sistema vascular, en el sistema nervioso central o Pesas y Balanzas h41i las tolerancias aceptables de las pesas usadas.
en los ojos. Además, luego debe pesarse el mismo volumen de Agua Estéril para
La persona a cargo de la preparación magistral debe realizar una Inyección usado para evaluar la exactitud volumétrica en la balanza
inspección visual de cada lote de fármaco o excipiente a granel usada con el DPA. Por ejemplo, si se utilizaron 40 mL de agua en la
recibido que se utilizará en la elaboración de las PME para detectar evaluación volumétrica, su peso correspondiente deberı́a ser de
cualquier deterioro, otras caracterı́sticas de calidad inaceptable o aproximadamente 40 g (suponiendo que la densidad relativa del agua
identificación errónea. La inspección visual de la sustancia es de 1,0). Además, durante el uso del DPA, también pueden
farmacéutica o excipiente a granel debe realizarse periódicamente analizarse ciertos aditivos, como cloruro de potasio (corregido según
según se describe en el protocolo escrito correspondiente. las diferencias de densidad) como si fuera una prueba realizada
durante el proceso.
Por último, pueden realizarse pruebas adicionales de exactitud
Equipos para determinar el contenido de ciertos ingredientes en el volumen
final de la mezcla agregada para nutrición parenteral. Por lo general,
Es necesario que los equipos, aparatos y dispositivos utilizados en los departamentos de farmacia no tienen la capacidad para realizar en
la preparación magistral de una PME se encuentren en buen forma rutinaria análisis quı́micos, como análisis de concentraciones
funcionamiento en todo momento y dentro de los lı́mites de de dextrosa o electrólitos. En consecuencia, es posible que los
tolerancia aceptables. Deben establecerse por escrito y seguirse los laboratorios de los hospitales o instituciones deban encargarse de
procedimientos de calibrado del equipo, mantenimiento anual, realizar estas pruebas de control de calidad. No obstante, los
control de funcionamiento correcto, uso y la frecuencia especı́fica métodos utilizados por dichos laboratorios suelen estar diseñados
para cada una de estas actividades. Estos procedimientos escritos para sistemas biológicos, no farmacéuticos. En consecuencia, debe
también deben describir el mantenimiento de rutina y su frecuencia. verificarse que sus procedimientos de prueba cumplan con los
Los resultados de la calibración de los equipos, informes de requisitos USP especificados en la monografı́a individual corres-
mantenimiento anual y mantenimiento de rutina deben conservarse pondiente al componente que se desea analizar. Por ejemplo, en la
en los archivos durante toda la vida útil del equipo. El personal debe monografı́a Inyección de Dextrosa, se especifica lo siguiente:
prepararse mediante una combinación apropiada de capacitación Contiene no menos de 95,0 por ciento y no más de 105,0 por
especı́fica y experiencia para usar o manipular cualquier equipo, ciento de la cantidad de C6H12O6 H2O declarada en la etiqueta. Los
aparato o dispositivo que pudiera tener que usar para la elaboración laboratorios hospitalarios o institucionales deben validar sus
de PME. La capacitación debe incluir los conocimientos necesarios métodos para que puedan usarse dentro de este intervalo y corregir
para determinar si un equipo determinado está funcionando la determinación de dextrosa anhidra en relación con la dextrosa
correctamente o si tiene algún desperfecto. monohidratada. Similares consideraciones existen por ejemplo, para
las inyecciones de gluconato de calcio, sulfato de magnesio, cloruro
de potasio, etc. El punto crı́tico es el uso de referencias USP y
VERIFICACIÓN DE DISPOSITIVOS DE posibles diferencias de procedimiento entre laboratorios.
PREPARACIÓN AUTOMÁTICOS DE
PRODUCTOS PARA NUTRICIÓN PARENTERAL Precisión
Los dispositivos de preparación automáticos (DPA) para la
preparación de mezclas para nutrición parenteral son ampliamente La precisión intermedia del DPA puede determinarse teniendo en
utilizados por los farmacéuticos en hospitales y otros centros de cuenta las variaciones diarias en rendimiento de las mediciones de
salud. Están diseñados para agilizar los procesos más engorrosos exactitud. En consecuencia, el farmacéutico debe llevar un registro
requeridos para la preparación magistral de estas formulaciones de diario de las evaluaciones de exactitud antes descritas y revisar los
varios componentes, administrando automáticamente los compo- resultados a lo largo del tiempo. Esta revisión debe realizarse al
nentes nutricionales individuales en una secuencia predeterminada menos cada semana para evitar errores acumulativos clı́nicamente
bajo control computarizado. Por lo general, las mezclas agregadas significativos con el tiempo, especialmente en el caso de aditivos con
para nutrición parenteral contienen 20 o más aditivos individuales un ı́ndice terapéutico estrecho, como el cloruro de potasio.
que representan hasta 50 o más componentes individuales (p. ej., 15
a 20 aminoácidos cristalinos, dextrosa monohidratada y lı́pidos; 10 a
12 sales electrolı́ticas; 5 a 7 oligominerales y 12 vitaminas). En
consecuencia, los DPA pueden mejorar la exactitud y precisión del
proceso de preparación magistral en comparación con los métodos
de preparación magistral manuales tradicionales. Se recomienda a
los farmacéuticos consultar el capı́tulo de información general
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 377
1. Que las etiquetas de las PME tengan los nombres y cantidades o pruebas directas. Las fechas lı́mite de uso de las PME que no puedan
concentraciones de ingredientes correctos; el volumen total; la justificarse con la literatura apropiada o mediante pruebas directas
fecha lı́mite de uso; las vı́as de administración apropiadas; las deben ser asignadas según se describe en la sección Criterios de
condiciones de almacenamiento y otra información para su uso Estabilidad y Fechado de Lı́mite de Uso en el capı́tulo de pruebas
seguro. generales Preparación Magistral—Preparaciones No Estériles
2. Que las identidades, purezas y cantidades de ingredientes sean h795i.
correctas, comparando la receta original con el registro de El farmacéutico también podrá consultar las publicaciones
preparación escrito de la PME. correspondientes para obtener información pertinente acerca de la
3. Que se han obtenido los volúmenes de llenado correctos en las estabilidad, compatibilidad y degradación del fármaco o de fármacos
PME y las cantidades correctas de unidades. Cuando no se similares. Al asignar una fecha lı́mite de uso, los farmacéuticos
puede verificar que la concentración de las PME terminadas es deben consultar la documentación y literatura especı́ficas sobre la
exacta, según las tres inspecciones que se describen más arriba, estabilidad en general y la del fármaco en particular en aquellos
las PME deben analizarse utilizando los métodos especı́ficos casos en que se cuente con ellas, y deberı́an considerar la naturaleza
para los ingredientes activos. del fármaco y su mecanismo de degradación, el envase en el que esta
Para inhibir el crecimiento microbiano debido a una contamina- contenido, las condiciones de almacenamiento esperadas y la
ción no detectada, las PME terminadas que no se dispensarán ni duración prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha
administrarán de inmediato deben refrigerarse a una temperatura de Lı́mite de Uso en Etiquetado en las Advertencias y Requisitos
28 a 88, a menos que se sepa que su estabilidad quı́mica y fı́sica Generales). La información de estabilidad debe interpretarse
pueden verse adversamente afectadas por las temperaturas frı́as. cuidadosamente en relación con la formulación preparada y sus
Cuando las PME se colocan en dispositivos de infusión usados por el condiciones de almacenamiento y uso. Las predicciones basadas en
paciente cuyas temperaturas pueden exceder los 308 durante más de otra evidencia, como publicaciones, cuadros, tablas, etc. sólo
24 horas, debe verificarse la estabilidad quı́mica y fı́sica a dichas permiten obtener fechas lı́mite de uso teóricas. El fechado de
temperaturas y tiempos correspondientes consultando la literatura lı́mite de uso estimado en forma teórica está sujeto a diferentes
pertinente o mediante pruebas directas. grados de hipótesis y, en consecuencia, a una probabilidad de error o
al menos inexactitud. El grado de error o inexactitud dependerı́a del
grado de las diferencias entre las caracterı́sticas de la PME (como
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LÍMITE composición, concentración de ingredientes, volumen de llenado o
DE USO tipo y material del envase) y las caracterı́sticas de los productos de
los que deben extrapolarse los datos o información de estabilidad.
Por lo general, las fechas lı́mite de uso para las preparaciones Cuanto mayor sea la duda respecto de la exactitud de las fechas
magistrales se asignan basándose en la experiencia profesional, la lı́mite de uso estimadas en forma teórica, mayor será la necesidad de
cual deberı́a incluir una interpretación cuidadosa de las fuentes de determinar las fechas en forma experimental. Las fechas lı́mite de
información correspondientes para las mismas formulaciones u otras uso estimadas en forma teórica deberı́an considerarse con cuidado
similares (ver Criterios de Estabilidad y Fechado de Lı́mite de Uso para las PME preparadas a partir de ingredientes activos a granel no
en el capı́tulo general Preparación Magistral—Preparaciones No estériles que tienen actividad terapéutica, especialmente en aquellos
Estériles h795i). Las fechas lı́mite de uso de las PME rara vez se casos en que se prevé que su preparación será rutinaria. Cuando las
basan en los resultados de valoraciones quı́micas especı́ficas a cada PME son para distribución y administración en domicilios
preparación, las cuales, junto con la ecuación de Arrhenius son particulares y no en centros de salud, debe tenerse en cuenta el
utilizadas para determinar las fechas de caducidad (ver Advertencias efecto de las condiciones de temperatura potencialmente no
y Requisitos Generales) de productos fabricados. La mayorı́a de las controladas y no vigiladas al asignar las fechas lı́mite de uso.
PME son soluciones acuosas en las que la hidrólisis de los Debe verificarse que las PME no estén expuestas a temperaturas
ingredientes disueltos es la reacción de degradación quı́mica más cálidas (ver Advertencias y Requisitos Generales) a menos que la
común. El grado de hidrólisis y otras reacciones de degradación institución responsable de la preparación magistral tenga evidencia
térmicamente catalizadas en cualquier momento durante la vida útil que justifique la estabilidad de las PME a esas temperaturas.
de una PME representa la suma termodinámica de las temperaturas Debe reconocerse que la única evidencia válida de estabilidad para
de exposición y sus duraciones. Dicha exposición de la estabilidad predecir el fecha lı́mite de uso puede obtenerse solamente a través de
de la vida útil del producto está representada en el cálculo de la estudios experimentales especı́ficos con cada producto. Los
temperatura cinética media (ver Cálculos Farmacéuticos en la procedimientos semicuantitativos, como una cromatografı́a en capa
Preparación Magistral de Recetas h1160i). La velocidad de delgada (TLC), pueden ser aceptables para muchas PME. No
hidrólisis de los fármacos aumenta en forma exponencial con el obstante, los ensayos cuantitativos indicadores de estabilidad, como
aumento aritmético de la temperatura; en consecuencia, la exposi- la cromatografı́a lı́quida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en
ción de una solución de un antibiótico beta-lactámico durante un dı́a inglés), serı́an más apropiados para ciertas PME, como por ejemplo
a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos aquellas con un ı́ndice terapéutico reducido, en las que se requiere un
Generales) tendrá un efecto equivalente sobre el grado de hidrólisis seguimiento o valoración estrictos de las dosis para asegurar su
de aproximadamente 3 a 5 dı́as a temperatura frı́a (ver Advertencias y eficacia terapéutica y evitar la toxicidad, aquellos en que la fecha
Requisitos Generales). lı́mite de uso estimada en forma teórica sólo es avalada por evidencia
El personal a cargo de preparar, dispensar y administrar PME debe marginal, o en aquellos casos en que no se puede verificar un margen
almacenarlas estrictamente conforme a las condiciones especificadas significativo de seguridad para la fecha lı́mite de uso propuesta. En
en la etiqueta de los ingredientes y de la PME terminada. Cuando se sı́ntesis, debido a que los perı́odos de fechado de lı́mite de uso
sabe que las PME han estado expuestas a temperaturas superiores al establecidos a partir de datos especı́ficos de un producto obtenidos
lı́mite indicado en la etiqueta pero no han excedido los 408 (ver mediante análisis con instrumental apropiado son sin duda más
Advertencias y Requisitos Generales) durante más de 4 horas, dichas confiables que los determinados en forma teórica, se recomienda
PME deberı́an desecharse a menos que se verifique su estabilidad a enfáticamente utilizar el enfoque anterior para avalar los perı́odos
través de documentación apropiada o una valoración directa. que superen los 30 dı́as.
Para asegurar prácticas consistentes en la determinación y
asignación de fechas lı́mite de uso, la farmacia debe contar con
normas y procedimientos escritos para la determinación de las fechas
Determinación de las Fechas Lı́mite de Uso lı́mite de uso para todos los productos preparados magistralmente.
Cuando las PME se desvı́an de las condiciones indicadas en las Cuando se intente predecir una fecha lı́mite de uso teórica, debe
etiquetas aprobadas de los productos contenidos en las PME, el considerarse el producto preparado magistralmente como un sistema
personal de preparación puede solicitar al fabricante del producto en único que tiene propiedades fı́sicas y quı́micas y caracterı́sticas de
cuestión asesoramiento sobre la asignación de fechas lı́mite de uso estabilidad que difieren de las de sus componentes. Por ejemplo, las
basadas en parámetros de estabilidad quı́mica y fı́sica. Las fechas propiedades antioxidantes, de amortiguación o antimicrobianas de
lı́mite de uso de las PME que se preparan estrictamente conforme un vial estéril para inyección pueden perderse al diluirlo y podrı́an
con la etiqueta del producto del fabricante deben ser las especificadas afectar seriamente la estabilidad quı́mica del ingrediente activo del
en dicha etiqueta, o deben basarse en la literatura apropiada o en vial estéril para inyección o la estabilidad fı́sica o microbiológica de
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles 379
la formulación de dicho vial. En consecuencia, por lo general no por ella, durante todo su ciclo de vida, independientemente del lugar
puede esperarse que las propiedades de estabilidad en la formulación donde se encuentre fı́sicamente la PME dentro del sistema de salud
del vial estéril para inyección se trasladen al producto magistral- organizado. Como parte de esta responsabilidad general, la farmacia
mente preparado o mezclado. Se prefieren los protocolos de es responsable del envasado, manipulación, transporte y almacena-
evaluación de datos de estabilidad determinados en forma experi- miento correctos de las PME que prepara o dispensa, incluyendo la
mental para cada producto en lugar de la información sobre enseñanza, capacitación y supervisión apropiadas del personal de la
estabilidad publicada. Se recomienda a los farmacéuticos consultar farmacia asignado a dichas funciones. La farmacia deberı́a colaborar
en el capı́tulo de información general Estabilidad Farmacéutica en la enseñanza y capacitación del personal ajeno a la farmacia
h1150i los parámetros de estabilidad apropiados que deben tenerse responsable de llevar a cabo cualquier aspecto de estas funciones.
en cuenta al iniciar o evaluar un estudio de estabilidad de un La farmacia también tiene la responsabilidad de establecer,
producto especı́fico. mantener y asegurar el cumplimiento de las normas y procedimien-
El personal de preparación magistral que asigna fechas lı́mite de tos escritos relacionados con dichas responsabilidades. En aquellos
uso a PME cuando se carece de resultados de ensayos quı́micos casos en que se asignan tareas que implican cualquiera de estas
directos deben interpretar y evaluar en forma crı́tica las fuentes de responsabilidades a personal ajeno a la farmacia, las normas y
información disponibles más apropiadas para decidir una fecha procedimientos que cubren dichas tareas deben ser desarrolladas por
lı́mite de uso conservadora y segura. El manual de procedimientos la farmacia en colaboración con los demás departamentos institu-
operativos estándar de la institución responsable de la preparación cionales que correspondan. Las actividades o asuntos que debe
magistral y los registros de formulación de cada PME deben atender la farmacia como parte de dichas responsabilidades son las
describir los fundamentos generales sobre los que debe basarse la siguientes:
asignación de la fecha lı́mite de uso y las condiciones de
almacenamiento.
Si se utilizan viales de medicación parenteral de dosis múltiples ENVASADO, MANIPULACIÓN Y TRANSPORTE
(VDM), refrigerar los VDM una vez abiertos a menos que el
fabricante indique lo contrario. Desechar los VMD una vez vacı́os o Los procesos o técnicas inapropiados relacionados con el envase,
cuando se sospecha u observa contaminación, o cuando ha pasado la manipulación y transporte pueden afectar adversamente la calidad
fecha de caducidad especificada por el fabricante, siempre y cuando del producto y la integridad del envase. Si bien el personal de la
se haya cumplido con las condiciones de almacenamiento del farmacia realiza en forma rutinaria muchas de las tareas asociadas
fabricante. Las fechas de caducidad a las que no se hace referencia con estas funciones, algunas tareas, como el transporte, manipula-
especı́fica en el prospecto no deben exceder los 30 dı́as una vez ción y el almacenamiento, pueden ser realizadas por personal ajeno a
abierto el vial. la farmacia que no se encuentra bajo su control administrativo
directo. En estos casos, la farmacia deberá establecer por escrito
normas y procedimientos, en colaboración con los departamentos o
Monitoreo de Áreas de Almacenamiento servicios cuyo personal sea responsable de llevar a cabo las tareas
Controladas relacionadas con las PME en las que la farmacia tiene un interés
directo. Debe controlarse el desempeño del personal ajeno a la
Para asegurarse de que el producto conserva su potencia hasta la farmacia para asegurarse de que cumpla con las normas y
fecha de caducidad indicada por el fabricante en la etiqueta, los procedimientos establecidos.
farmacéuticos deben monitorear las áreas de almacenamiento de los Los requisitos fundamentales que son exclusivos de las PME y
fármacos dentro de la farmacia. Las áreas de almacenamiento a necesarios para asegurar la calidad del producto y la integridad del
temperatura controlada de la farmacia (refrigeradores, 28 a 88; envasado deben tratarse por escrito en procedimientos. Por ejemplo,
congeladores, –208 a –108; e incubadoras, 308 a 358; etc.) deben deberı́an especificarse técnicas para evitar la depresión de los
monitorearse al menos una vez por dı́a y deben documentarse los émbolos de las jeringas o que las puntas de las jeringas queden
resultados en un registro de temperatura. Asimismo, el personal de la expuestas durante su manipulación y transporte. Asimismo, debe
farmacia debe observar la temperatura de almacenamiento al colocar evitarse la desconexión de los componentes del sistema (por
el producto en la unidad de almacenamiento o al retirarlo de ella a fin ejemplo, cuando las PME se dispensan con equipos de administra-
de controlar cualquier desvı́o en la temperatura. Los dispositivos de ción conectados a estas) durante todo el ciclo de vida del producto.
registro de temperatura adecuados pueden incluir un dispositivo de Los rellenos o insertos de espuma resultan particularmente útiles
registro continuo calibrado o un termómetro calibrado NBS que cuando las PME deben transportarse mediante sistemas de tubos
tenga una exactitud y sensibilidad satisfactorias para el propósito al neumáticos. Independientemente de los métodos usados, la farmacia
que está destinado y deberán calibrarse correctamente a intervalos debe evaluar la eficacia y la confiabilidad de la protección utilizada.
adecuados. Si la farmacia utiliza un dispositivo de registro continuo La evaluación deberı́a ser continua, por ejemplo, a través de un
de la temperatura, el personal debe verificar al menos una vez al dı́a sistema de vigilancia, que incluya un sistema de información de
que dicho dispositivo esté funcionando correctamente. problemas a la farmacia.
Los mecanismos detectores de temperatura deben colocarse en El transporte y la manipulación inapropiados pueden afectar
forma adecuada en el área de almacenamiento de temperatura adversamente la calidad de ciertas PME que tienen requisitos de
controlada para que reflejen de forma exacta la temperatura real. estabilidad únicos. Por ejemplo, la agitación fı́sica que puede tener
Asimismo, la farmacia debe seguir procedimientos apropiados para lugar durante el transporte mediante tubo neumático, o la exposición
todas las áreas de almacenamiento controlado para asegurar que indebida al calor o a la luz, deben tratarse en cada producto en forma
dichos espacios no estén sometidos a fluctuaciones de temperatura especı́fica. Podrı́an ser necesarios modos de transporte alternativos o
significativamente prolongadas, como las que podrı́an ocurrir, por medidas de embalaje adicionales para asegurar debidamente la
ejemplo, al dejar la puerta de un refrigerador abierta demasiado calidad de estas PME. El uso de cierres y sellos inviolables puede ser
tiempo. una medida adicional de seguridad para asegurar la integridad del
producto independientemente del método de transporte usado.
Los productos quı́micos tóxicos y otras PME peligrosas requieren
MANTENIMIENTO DE LA CALIDAD DEL salvaguardas para mantener su integridad y reducir al mı́nimo el
potencial de exposición de estos productos al entorno y al personal
PRODUCTO Y CONTROL UNA VEZ QUE LA que podrı́a entrar en contacto con ellas. Los requisitos especiales
PME EGRESA DE LA FARMACIA asociados con el envasado, transporte y manipulación de estos
agentes incluyen la prevención de exposición o derrame accidental y
Preparaciones Estériles para Uso Institucional la capacitación del personal en caso de una exposición o derrame.
Otros ejemplos de requisitos especiales para estos agentes son
Esta sección se refiere a las responsabilidades de la farmacia de estrategias de reducción de la exposición, como el uso de jeringas
mantener la calidad y control del producto una vez que la PME con cierre Luer y conexiones, tapas para jeringas, tapas en los
egresa de la farmacia para su distribución y uso dentro del sistema de puertos de los envases, bolsas plásticas selladas, envases resistentes a
salud organizado al que pertenece la farmacia. La farmacia es los impactos y etiquetas con las precauciones pertinentes. Debe
responsable de la calidad de todas las PME preparadas o dispensadas elegirse y evaluarse un método de amortiguación apropiado para el
380 h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
transporte por tubos neumáticos para asegurarse de que los entre el momento en que la PME egresó de la farmacia y el momento
productos transportados por este medio puedan soportar las en que volvió a ella. Asimismo, las PME no deben volver a utilizarse
tensiones producidas por el sistema. Debe evitarse el transporte si se ha alcanzado la fecha lı́mite de uso originalmente asignada.
neumático de envases alternativos no evaluados y consultarse
referencias adicionales según sea necesario para obtener mayor
información sobre la manipulación de producto quı́micos tóxicos y ENSEÑANZA Y CAPACITACIÓN
otros fármacos peligrosos.
La garantı́a de calidad de la PME y la integridad del envasado
depende en gran medida de que todo el personal cumpla con los
USO Y ALMACENAMIENTO procedimientos escritos pertinentes. La farmacia debe diseñar,
implementar y mantener un programa formal de enseñanza,
La farmacia es responsable de asegurar que las PME que se capacitación y evaluación de competencia que cubra todas las
encuentran en el entorno en que se prestan cuidados al paciente funciones y tareas descritas en las secciones anteriores y que incluya
mantengan su calidad hasta el momento de su administración. El a todo el personal al que se asignen dichas funciones y tareas. Este
etiquetado inmediato del envase de la PME debe mostrar en forma programa incluye la evaluación y documentación de incumplimien-
prominente y clara los requisitos para su almacenamiento correcto y tos del procedimiento, errores de administración, efectos colaterales,
su fecha de caducidad. El personal de suministro y del entorno de reacciones alérgicas y complicaciones asociadas con la dosificación
cuidado del paciente debe estar debidamente capacitado para colocar o administración, como la extravasación. Este programa debe
la PME en el lugar de almacenamiento apropiado. Las PME vencidas coordinarse con los programas de informe de episodios adversos e
y no utilizadas deben devolverse a la farmacia para su eliminación o incidentes de la institución responsable.
posible reutilización.
Debe contarse con procedimientos escritos para asegurar que las
condiciones de almacenamiento en el entorno de cuidado del Envasado y transporte de PME
paciente sean adecuadas para los requisitos especı́ficos de cada PME.
Estos procedimientos incluyen la supervisión y documentación Las siguientes secciones sobre Embalaje de PME para su
diarias de los refrigeradores de almacenamiento de fármacos para Transporte y Transporte de PME describen cómo mantener la
asegurarse de que mantienen su temperatura entre 28 y 88 y la esterilidad y estabilidad de las PME hasta el momento en que son
inspección mensual de todos los lugares de almacenamiento de entregadas a los centros de salud para su administración.
fármacos por el personal de la farmacia. Las inspecciones deben
verificar el cumplimiento de las condiciones de almacenamiento
apropiadas, la separación de fármacos y alimentos, el uso correcto de EMBALAJE DE PME PARA SU TRANSPORTE
envases de dosis múltiples y que no se usen productos monodosis
como envases de dosis múltiples. Las PME, ası́ como todos los Cuando las PME se distribuyen a lugares fuera de las instalaciones
demás productos farmacéuticos, deben almacenarse en el área en que en las que se preparan, el personal de preparación magistral debe
se presta cuidados al paciente de manera que el personal no seleccionar envases y materiales de embalaje que mantengan la
autorizado, los visitantes y los pacientes no tengan acceso a ellos. integridad fı́sica, esterilidad y estabilidad de las PME durante su
transporte. Debe seleccionarse un embalaje que proteja las PME
contra daños, pérdidas, contaminación y degradación y, al mismo
ADMINISTRACIÓN tiempo, al personal a cargo de transportarlas de posibles lesiones. El
manual de procedimientos operativos estándar de la institución
Los procedimientos esenciales para asegurar la calidad general del responsable de la preparación magistral debe describir especı́fica-
producto, especialmente su esterilidad, al preparar una PME para su mente los materiales de embalaje apropiados y los materiales de
posterior administración incluyen, entre otros, lavarse bien las aislamiento y relleno apropiados, según las especificaciones del
manos, el uso de técnicas asépticas, el cuidado del sitio y el cambio producto, la información de los proveedores y la experiencia del
de los equipos de administración. También pueden ser fundamen- personal de preparación magistral. Deben proporcionarse a los
tales otros procedimientos adicionales para ciertos productos, pacientes y otros destinatarios instrucciones escritas que expliquen
dispositivos o técnicas, por ejemplo la filtración en lı́nea, la claramente cómo abrir en forma segura los paquetes de las PME.
operación de dispositivos de control de infusión automáticos y la
reposición de productos farmacéuticos en los reservorios de bombas
de infusión implantables o portátiles. TRANSPORTE DE PME
ALMACENAMIENTO FUERA DE LAS INSTITUCIONES (8) Cuidar los catéteres, cambiar vendajes y mantener el orden del
RESPONSABLES DE LA PREPARACIÓN DE LAS PME sitio según lo indicado.
(9) Controlar y detectar la ocurrencia de complicaciones terapéu-
Las instituciones responsables de la preparación que envı́an PME ticas, tales como infecciones, flebitis, desequilibrio electrolı́tico
a pacientes y otros destinatarios que se encuentran en otros lugares e inadecuada colocación del catéter.
deben verificar o garantizar, según el caso, lo siguiente: (10) Responder de inmediato a situaciones de emergencia o crı́ticas,
1. Las etiquetas y etiquetado accesorio de las PME incluyen en como rotura o salida de su lugar del catéter, desconexión del
forma claramente legible las fechas lı́mite de uso, instrucciones tubo, formación de coágulos, bloqueo del flujo y mal
de almacenamiento e instrucciones de eliminación para las funcionamiento del equipo.
unidades vencidas. (11) Saber cuándo y cómo recurrir a servicios de emergencia o
2. Los pacientes u otros destinatarios pueden almacenar las PME asesoramiento profesional.
en forma correcta, incluyendo el uso de un refrigerador y (12) Manipular, contener y eliminar los desechos, como agujas,
congelador que funcionen correctamente si la etiqueta indica jeringas, dispositivos, derrames o residuos que constituyan un
que las PME necesitan dicho tipo de almacenamiento. riesgo biológico y sustancias infecciosas.
Los programas de capacitación deben incluir demostraciones
prácticas y la práctica con elementos reales que el paciente o
CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O terapeuta deberán utilizar, como envases de PME, dispositivos y
TERAPEUTA equipos. El paciente o terapeuta debe practicar las técnicas asépticas
y de inyección bajo la observación directa del profesional de la
Debe proporcionarse un programa de capacitación formal a fin de salud.
que los pacientes y terapeutas puedan entender y cumplir con las La farmacia, junto con el personal de enfermerı́a o médico, es
numerosas responsabilidades especiales y complejas que tiene el responsable de asegurar inicialmente y en forma permanente que el
paciente o el proveedor de cuidados en cuanto al almacenamiento, paciente o terapeuta comprendan, dominen y estén en condiciones y
manipulación y administración de PME. Los objetivos del programa dispuestos a cumplir con todas estas responsabilidades relacionadas
de capacitación incluyen todas las responsabilidades de cuidado con el cuidado domiciliario. Esto se logra a través de un programa de
domiciliario que se espera que asuman el paciente o proveedor de evaluación formal escrito. Todas las competencias especificadas en
cuidados y deben especificarse en términos de competencias del el programa de capacitación del paciente o terapeuta deben evaluarse
paciente o del proveedor de cuidados. de manera formal. El paciente o terapeuta debe demostrar al personal
Al terminar el programa de capacitación, el paciente o el correspondiente de cuidado de la salud su dominio de las actividades
proveedor de cuidados deberı́a estar en condiciones de hacer lo asignadas antes de que se le permita administrar PME sin la
siguiente, en forma correcta y consistente: supervisión de un profesional de la salud.
(1) Describir la terapia en cuestión, incluyendo la enfermedad o El material impreso, como listas de control o instrucciones
trastorno para la que se receta la PME, los objetivos de la proporcionadas durante la capacitación, pueden servir como refuerzo
terapia, el resultado terapéutico esperado y los efectos del aprendizaje después de la capacitación o para verificar las
colaterales potenciales de la PME. responsabilidades especı́ficas del paciente o terapeuta. También
(2) Inspeccionar todos los productos farmacéuticos, dispositivos, puede utilizarse periódicamente el asesoramiento oral después de la
equipos y materiales en el momento de recibirlos para capacitación, según sea apropiado, para reforzar la capacitación y
asegurarse de que se han mantenido las temperaturas correctas asegurar el cumplimiento correcto y completo de las responsabili-
durante el transporte y que los artı́culos recibidos no presentan dades.
evidencia de deterioro o defectos.
(3) Manipular, almacenar y controlar todos los productos farma-
céuticos y materiales y equipos relacionados en la casa, MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE
incluyendo todos los requisitos especiales relacionados con EPISODIOS ADVERSOS
ellos.
(4) Inspeccionar visualmente todos los productos farmacéuticos, Las instituciones responsables de la preparación magistral deben
dispositivos y otros elementos que el paciente o el terapeuta controlar clı́nicamente a los pacientes tratados con PME según las
deben utilizar inmediatamente antes de la administración de reglamentaciones y pautas establecidas por la junta reguladora del
manera de asegurar que todos los elementos estén en ejercicio de la medicina de su respectivo estado o las normas de
condiciones de ser utilizados. Por ejemplo, las PME deben práctica aceptadas. Las instituciones responsables de la preparación
estar libres de pérdidas, rajaduras en los envases, partı́culas, magistral deben proporcionar a los pacientes y otros destinatarios de
precipitado, turbidez, decoloración u otras desviaciones PME alguna manera de obtener respuestas a sus preguntas e
respecto de su aspecto esperado normal y los envases informar cualquier inquietud que pudieran tener en relación con las
inmediatos de los dispositivos estériles deben estar completa- PME y sus dispositivos de administración.
mente sellados sin que haya evidencia de deterioro de la Los manuales de procedimientos operativos estándar de la
integridad del envase. institución responsable de la preparación magistral deben describir
(5) Verificar las etiquetas inmediatamente antes de su administra- las instrucciones especı́ficas para recibir, acusar recibo y fechar los
ción para asegurar que se trate del fármaco, la dosis, el paciente productos recibidos y para registrar, o archivar, y evaluar los
y el momento de administración correctos. informes de episodios adversos y de la calidad de la preparación
(6) Limpiar el área de preparación en el domicilio, lavar y asociada con las PME. Los informes de episodios adversos con PME
cepillarse las manos, usar la técnica aséptica apropiada y deben ser analizados a fondo y de inmediato por los supervisores de
manipular todos los envases, equipos, aparatos, dispositivos y preparación magistral para solucionarlos y evitar que se vuelvan a
materiales usados para la administración. repetir en el futuro. Se recomienda al personal de preparación
(7) Emplear todas las técnicas y precauciones asociadas con la magistral que participe en programas de métodos de informe de
administración de PME, por ejemplo, preparación de materiales episodios adversos y defectos de productos de la Dirección de
y equipos, manipulación de dispositivos, cebado de los tubos e Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Farmacopea de los Estados
interrupción de una infusión. Unidos (USP).
382 h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas USP 30
4
Otros términos aceptados para describir actividades destinadas a evaluar y
mejorar la calidad de los cuidados prestados incluyen Mejora de Calidad
Continua, Evaluación de la Calidad y Mejora y Gestión de Calidad Total.
5
El uso de recursos adicionales, como el Accreditation Manual for Home
Care (Manual de Acreditación para Cuidados Domiciliarios) de la Joint
Commission on Accreditation of Healthcare Organizations (Comisión
Conjunta de Acreditación de Organizaciones de Cuidado de la Salud),
puede resultar útil para el desarrollo de un plan de garantı́a de calidad.
APÉNDICE
CRITERIOS NIVEL DE RIESGO BAJO NIVEL DE RIESGO MEDIANO NIVEL DE RIESGO ALTO
USP 30
Condiciones de
Preparación
Preparadas magistralmente totalmente Todas las condiciones enumeradas en nivel de Se incorporan ingredientes no estériles o se
conforme a condiciones ISO Clase 5 riesgo bajo emplea un dispositivo no estéril antes de la
(Clase 100) Dosis individuales múltiples o pequeñas de esterilización terminal
La preparación magistral implica productos estériles se combinan o agrupan para Los ingredientes, componentes o dispositivos
únicamente la transferencia, medición preparar una PME que se administrará a varios estériles están expuestos a una calidad de aire
y mezclado con sistemas de envasado pacientes o a un solo paciente en varias inferior a la ISO Clase 5 (Clase 100)
cerrados o sellados que se realizan de condiciones Las preparaciones no estériles están expuestas
manera inmediata y prestando mucha El proceso de preparación magistral incluye durante no más de 6 horas antes de ser
atención manipulaciones asépticas complejas distintas esterilizadas
Las manipulaciones se limitan a la de la transferencia de un volumen único Las preparaciones no estériles son sometidas a
apertura aséptica de ampollas, la El proceso de preparación magistral requiere esterilización terminal pero no se prueban para
inserción de tapones estériles en los una duración inusualmente larga detectar la presencia de endotoxinas bacteria-
viales con agujas y jeringas estériles y Las PME no contienen agentes bacteriostáticos nas
la transferencia de lı́quidos estériles de espectro amplio y se administran a lo largo Se supone que la pureza quı́mica y concentra-
en jeringas estériles a dispositivos de de varios dı́as ción del contenido de los ingredientes cumplen
administración estériles y envases de con sus especificaciones originales o farmaco-
otros productos estériles peicas en envases no abiertos o en envases
abiertos de ingredientes a granel
Programa de Garantı́a de Cali- Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
dad
Formalizado por escrito
Debe describir las actividades de
monitoreo y evaluación
Informe y evaluación de los resulta-
dos
Identificación de actividades de
seguimiento cuando se exceden los
umbrales
Designación de responsabilidades
individuales para cada aspecto del
programa
Prácticas de Garantı́a de Cali- Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
dad
Desinfección y pruebas de calidad
rutinarias del entorno de preparación
magistral directa
Verificación visual de procesos del
personal relativos a la vestimenta, etc.
Revisión de pedidos y envases de
ingredientes para asegurar su identi-
dad y cantidad correctas
Inspección visual de la PME
Procedimiento de prueba de llenado
con medios realizado al menos anual-
mente para cada persona
Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles
APÉNDICE (Continuación)
CRITERIOS NIVEL DE RIESGO BAJO NIVEL DE RIESGO MEDIANO NIVEL DE RIESGO ALTO
Enseñanza/Capacitación
— Normas y procedimientos escri-
tos relativos a la enseñanza
correcta que deben recibir los
pacientes y terapeutas que ase-
gure todo lo anterior
Almacenamiento y Fechado de Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
Lı́mite de Uso
Requisitos especı́ficos de etiquetado
Normas, procedimientos y requisitos
de fechado de lı́mite de uso especı́fi-
cos
Normas relativas al almacenamiento
USP 30
APÉNDICE (Continuación)
USP 30
CRITERIOS NIVEL DE RIESGO BAJO NIVEL DE RIESGO MEDIANO NIVEL DE RIESGO ALTO
Condiciones de almacena- Si no se cuenta con pruebas de esterilidad, los perı́odos de almacenamiento (antes de su administración) no deben exceder los siguientes:
miento y fechado de lı́mite
de uso para PME terminadas
Temperatura 548 horas Temperatura ambiente 530 horas Temperatura ambiente 524 horas
ambiente 514 dı́as 28–88 57 dı́as 28–88 53 dı́as
28–88 545 dı́as 5208 545 dı́as 5208 545 dı́as
5208
Controles de liberación y prue- Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
bas de productos
Normas y procedimientos que traten
— Inspecciones fı́sicas
— Controles de exactitud de la
preparación magistral
Controles de liberación y prue- Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
bas de productos
Normas y procedimientos escritos
que describan
— Pruebas de esterilidad
— Pruebas de pirogenicidad
— Pruebas de potencia
Ambiente de trabajo Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
para PME
Superficies sólidas apropiadas
Muebles, artefactos, etc. limitados
(pero necesarios).
Antesala
Zona amortiguadora
Equipos Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
Normas y procedimientos escritos
que traten el calibrado, manteni-
miento de rutina, capacitación del
personal
Componentes Ver nivel de riesgo bajo.
Los componentes farmacéuticos estériles y no
Normas y procedimientos escritos estériles deben cumplir con las normas farmacopei-
que describan los componentes este- cas si estuvieran disponibles
riles Normas y procedimientos que describan
— Componentes estériles
— Componentes no estériles
Procesamiento: Técnica asép- Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
tica
Normas y procedimientos formales
que describan una capacitación espe-
Pruebas Fı́sicas / h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles
APÉNDICE (Continuación)
CRITERIOS NIVEL DE RIESGO BAJO NIVEL DE RIESGO MEDIANO NIVEL DE RIESGO ALTO
Pruebas de Esterilidad
Procedimientos Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
de verificación
Certificación de BFL y barrera aisla-
Monitoreo dora cada seis (6) meses
ambiental Certificación de la zona amortigua-
dora/cuarto limpio y de la antesala
cada seis (6) meses
Monitoreo bacteriano usando un
método apropiado al menos en
forma mensual
Procedimientos Inicialmente y luego anualmente Ver nivel de riesgo bajo. Ver nivel de riesgo bajo.
de verificación
Revisión didáctica
Capacitación y educación Pruebas escritas
del personal Prueba de llenado con medios
h797i Preparación Magistral—Preparaciones Estériles / Pruebas Fı́sicas
USP 30
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h801i Polarografı́a 387
h801i POLAROGRAFÍA Dado que, en el caso del EGM, la superficie del electrodo se
renueva constantemente en forma cı́clica, la corriente aumenta desde
un valor pequeño, cuando la gota comienza a formarse, hasta
alcanzar un valor máximo cuando la gota cae. Mediante el empleo de
La polarografı́a es un método de análisis electroquı́mico basado en un registrador apropiado para medir la corriente, se obtiene el
la medición del flujo de corriente resultante de la electrólisis de una registro caracterı́stico con perfil dentado. La corriente limitante es la
solución en un microelectrodo polarizable, en función de un voltaje suma de las corrientes residual y de difusión. La corriente residual se
aplicado. El polarograma (ver Figura 1) obtenido por esta medición resta de la corriente limitante para obtener la altura de la onda.
proporciona información cualitativa y cuantitativa de sustancias Ecuación de Ilkovic—La relación lineal entre la corriente de
electro-reducibles y electro-oxidables. El intervalo normal de difusión (id) y la concentración de especies electro-activas se muestra
concentraciones para las sustancias que se analizan es de 10–2 por la ecuación de Ilkovic:
molar a 10 –5 molar.
En la polarografı́a de corriente directa (cd), el microelectrodo es id = 708nD1 / 2Cm2 / 3t1 / 6,
un electrodo de goteo de mercurio (EGM) que consiste en pequeñas en la cual id es la corriente máxima en microamperios; n es el número
gotas de mercurio reproducibles que fluyen del orificio de un tubo de electrones requeridos por molécula de sustancia electro-activa; D
capilar conectado a un reservorio de mercurio. El electrodo de es el coeficiente de difusión, en centı́metros cuadrados por segundo;
referencia más comúnmente empleado es un electrodo de calomel C es la concentración, en milimoles por L; m es la velocidad de flujo
saturado (ECS) que posea una superficie extensa. El voltaje aplicado de mercurio del EGM, en mg por segundo; y t es el tiempo de caı́da
a la celda se aumenta gradualmente y sólo fluye una corriente de la gota, en segundos.
residual muy pequeña hasta que la sustancia que se valora Los polarógrafos modernos están equipados con registradores
experimenta reducción u oxidación. Al principio la corriente capaces de determinar la corriente hasta la última porción de la vida
aumenta gradualmente, luego lo hace de manera casi lineal con el de la gota; en consecuencia, registran la máxima fluctuación de
voltaje y gradualmente alcanza un valor lı́mite, como se muestra en corriente. Cuando la corriente se mide sólo al final de la vida de la
la Figura 1.En la porción ascendente inicial de la onda polarográfica, gota, la técnica se denomina polarografı́a cd por muestreo. En este
el aumento del flujo de corriente provoca una disminución en la caso, sólo se registran los máximos de corriente y no se observan las
concentración de las especies electroactivas en la superficie del oscilaciones debidas al crecimiento de la gota.
electrodo. A medida que aumentan el voltaje y la corriente, la Para instrumentos equipados con galvanómetros para medir la
concentración de las especies reactivas disminuye aún más hasta corriente, o en el caso de los registradores operados en modalidad de
alcanzar un valor mı́nimo en la superficie del electrodo. La corriente curva suavizada, las ondas dentadas son oscilaciones alrededor de la
queda limitada entonces por la velocidad de difusión de las especies corriente promedio. En el último caso, la medida de la corriente es el
reaccionantes desde el seno de la solución hasta la superficie del promedio de las oscilaciones. Para los polarogramas obtenidos de
microelectrodo. El incremento final de la corriente es provocado por esta manera, la id dada por la ecuación de Ilkovic es la corriente
la reacción del electrólito soporte. Esta gran concentración de promedio en microamperios observada durante la vida de la gota en
electrólito es inerte dentro del intervalo de potencial utilizado para el lugar de la corriente máxima, y entonces el coeficiente 708 se
análisis e impide que las especies reactivas alcancen el electrodo por reemplaza por 607.
migración eléctrica. De este modo, se asegura que la corriente
limitante esté controlada por la difusión. Control de la Corriente de Difusión—La ecuación de Ilkovic
identifica las variables que deben ser controladas para asegurar que
la corriente de difusión sea directamente proporcional a la
concentración de material electro-activo. A 258 los coeficientes de
difusión para soluciones acuosas de muchos iones y moléculas
orgánicas aumentan 1% a 2% por grado de aumento en la
temperatura. Por lo tanto, la temperatura de la celda polarográfica
debe controlarse en un margen de +0,58. Las cantidades m y t
dependen de las dimensiones del capilar y de la altura de la columna
de mercurio por encima del electrodo. Si bien es posible comparar
resultados obtenidos con capilares diferentes si se conoce el producto
m2/3t1/6, es recomendable utilizar el mismo capilar con una altura de
mercurio constante durante una serie de análisis. La corriente de
difusión es proporcional a la raı́z cuadrada de la altura de la columna
de mercurio. Un reservorio de mercurio con un diámetro de más de 4
cm previene una disminución significativa del nivel de mercurio
durante una serie de determinaciones.
El capilar para el EGM tiene un orificio de aproximadamente 0,04
mm y una longitud de 6 cm a 15 cm. La altura de la columna de
mercurio, medida desde el extremo del capilar hasta la parte superior
del depósito de mercurio, oscila entre 40 cm y 80 cm. La longitud
exacta del capilar y la altura de la columna de mercurio se ajustan de
modo que el tiempo de caı́da esté entre 3 y 5 segundos con el circuito
abierto y con el capilar inmerso en la solución de prueba.
Se encuentran disponibles equipos que permiten controlar los
tiempos de goteo desde fracciones de segundo hasta varios
segundos. Como el detalle dentro de un polarograma se relaciona
con el número de gotas proporcionadas durante un cambio de
potencial dado, los tiempos cortos de goteo permiten un registro más
rápido del polarograma.
La corriente que fluye a través de la solución de prueba durante el
registro de un polarograma está en el orden de los microamperios.
Por lo tanto, el flujo de corriente produce cambios inapreciables en la
solución de prueba y es posible realizar varios polarogramas con la
misma solución de prueba sin obtener diferencias significativas.
Potencial de Media Onda—El potencial de media onda (E1/2)
Fig. 1. Polarograma tı́pico que muestra el cambio en el flujo de tiene lugar, en el polarograma, al punto medio de la distancia entre la
corriente en función del aumento del potencial aplicado al electrodo corriente residual y la meseta de la corriente limitante. Este potencial
de goteo de mercurio. es caracterı́stico de las especies electro-activas y, por lo general, es
388 h801i Polarografı́a / Pruebas Fı́sicas USP 30
independiente de su concentración o del capilar empleado para Polarografı́a de pulsos—En la polarografı́a de cd convencional,
obtener la onda. Depende de la composición de la solución y puede la corriente se mide continuamente mientras se aplica un potencial
cambiar con variaciones en el pH o en el sistema de disolventes, o como una rampa lineal (ver Figura 2). Esta corriente se compone de
con la adición de agentes formadores de complejos. El potencial de dos elementos. El primero, la corriente de difusión (faradaica), que
media-onda, por lo tanto, sirve como criterio para la identificación se produce por la sustancia que experimenta la reducción u
cualitativa de una sustancia. oxidación en el electrodo de trabajo y es directamente proporcional
El potencial del EGM es igual al voltaje aplicado frente al a la concentración de esta sustancia. El segundo elemento es la
electrodo de referencia después de la corrección para la caı́da iR (el corriente capacitativa (relacionada con la carga de la doble capa
potencial necesario para pasar la corriente, i, a través de la solución electroquı́mica). Ambas corrientes cambian a medida que varı́a el
con una resistencia R). Resulta especialmente importante hacer esta tamaño de la gota de mercurio. Estos cambios producen las
corrección para soluciones no acuosas, las cuales suelen poseer alta oscilaciones presentes en los tı́picos polarogramas de cd.
resistencia, si se necesita un potencial exacto para el EGM. No se
necesita la corrección del potencial de media-onda para el análisis
cuantitativo. A menos que se indique de otro modo, se entiende que
los potenciales representan mediciones realizadas frente al ECS.
Eliminación del oxı́geno disuelto—Puesto que el oxı́geno se
reduce en el EGM en dos pasos, primero a peróxido de hidrógeno y
después a agua, interfiere cuando los polarogramas deben realizarse
a potenciales más negativos que aproximadamente 0 voltio frente al
ECS, y por lo tanto debe ser eliminado. Esto puede realizarse
introduciendo burbujas de nitrógeno libre de oxı́geno a través de la
solución durante 10 a 15 minutos inmediatamente antes de registrar
la onda; el nitrógeno primero debe pasarse a través de una porción
separada de la solución para ‘‘acondicionarlo’’ y de este modo
reducir al mı́nimo los cambios debidos a la evaporación.
Es necesario que la solución esté en reposo y libre de vibraciones
durante el tiempo en que se registra la onda, a fin de asegurar que la Fig. 2. Polarografı́a de Corriente Directa (cd).
corriente dependa solamente de la difusión. Por lo tanto, el burbujeo
con nitrógeno debe detenerse y el gas se debe dirigir para que fluya
sobre la superficie de la solución antes de registrar un polarograma. En la polarografı́a de pulso normal, se aplica un pulso de potencial
En medios alcalinos, se puede agregar bisulfito de sodio para al electrodo de mercurio cerca del final de la vida de la gota,
eliminar el oxı́geno, siempre que el reactivo no reaccione con otros manteniendo el potencial inicial durante el perı́odo de crecimiento de
componentes del sistema. la gota (ver Figura 3). A cada gota siguiente se le aplica un pulso
ligeramente mayor, con una constante de incremento determinada
Medición de la altura de la onda—Para usar un polarograma por la velocidad de barrido seleccionada. La corriente se mide al
cuantitativamente, es necesario medir la altura de la onda. Como ésta final del pulso cuando la corriente capacitativa es cercana a cero y,
es una medida de la magnitud de la corriente de difusión, se mide por lo tanto, se mide principalmente la corriente faradaica (ver
verticalmente. Para compensar la corriente residual, el segmento de Figura 4). Además, como el pulso que se aplica es de corta duración,
la curva que precede al aumento de la onda se extrapola más allá del la capa de difusión no se agota tanto como en la polarografı́a de cd, y
ascenso en la onda. Para una onda bien formada donde esta se obtienen niveles de corriente más elevados para concentraciones
extrapolación es paralela a la meseta de la corriente limitante, la equivalentes. Se pueden medir concentraciones de tan sólo 10–6 M, lo
medición no es ambigua. Para ondas no muy bien definidas, puede que permite una sensibilidad aproximadamente 10 veces mayor que
utilizarse el siguiente procedimiento a menos que se especifique algo la polarografı́a de cd. Los valores de la corriente limitante se miden
difrente en la monografı́a individual. Se extrapolan con lı́neas rectas más fácilmente, dado que las ondas están libres de oscilaciones.
tanto la corriente residual como la corriente limitante, tal como se
muestra en el gráfico (Figura 1). La altura de la onda se toma como
la distancia vertical entre las lı́neas extrapoladas medida a nivel del
potencial de media onda.
Procedimiento—[Precaución—El vapor de mercurio es tóxico y
el mercurio metálico tiene una presión de vapor significativa a
temperatura ambiente. El lugar de trabajo donde se utiliza mercurio
debe construirse de modo que cualquier salpicadura o gota de
mercurio derramada puedan recuperarse completamente con
relativa facilidad. Limpiar meticulosamente los derrames de
mercurio después de cada uso del instrumento. Trabajar en un
laboratorio bien ventilado, teniendo cuidado de limpiar cualquier
derrame de mercurio.] Transferir una porción de la dilución final de
la sustancia valorada a una celda polarográfica apropiada inmersa en
un baño de agua regulado a 25 + 0,58. Pasar una corriente de
nitrógeno a través de la solución durante 10 a 15 minutos para
eliminar el oxı́geno disuelto. Comenzar el goteo de mercurio desde Fig. 3. Polarografı́a de pulso.
el capilar, insertar el capilar en la solución de prueba y ajustar la
altura del reservorio de mercurio. Modificar el flujo de nitrógeno de
modo que pase sobre la superficie de la solución y registrar el
polarograma en el intervalo de potencial indicado en la monografı́a
individual, empleando un registrador o galvanómetro de sensibilidad
adecuada para obtener una onda apropiada. Medir la altura de la
onda y, a menos que se indique de otro modo en la monografı́a,
compararla con la altura de la onda obtenida con el Estándar de
Referencia USP apropiado, medida bajo las mismas condiciones.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h811i Finura de Polvos 389
Fármacos de Origen Animal o Vegetal en Polvo—En la En este capı́tulo se establecen definiciones, consideraciones
determinación de la finura de polvo de un fármaco de origen animal especiales y procedimientos relativos a las monografı́as de la
o vegetal, no puede dejarse de lado ninguna porción del fármaco Farmacopea sobre medicamentos radioactivos.
durante la molienda o el tamizado, a menos que la monografı́a
individual lo permita expresamente.
Método de Permeación de Aire para la Determinación de la CONSIDERACIONES GENERALES
Finura de Partı́culas Subtamizables—El promedio del tamaño de
partı́cula determinado está comprendido en el intervalo de 0,2 a 50
mm. La muestra se carga en un tubo de calibre preciso y se compacta
entre dos discos de papel y tapones porosos mediante un pistón Ley Fundamental de Desintegración
compactador de tipo piñón-cremallera. La determinación del tamaño
de partı́cula de la muestra en la columna compactada uniformemente La velocidad de desintegración de una fuente radioactiva se
se basa en la resistencia al flujo de una corriente de aire seco describe por la ecuación:
regulada con precisión. El nivel del lı́quido en el caudalı́metro-
manómetro se corresponde directamente con el tamaño de partı́cula.
Las monografı́as individuales incluyen las instrucciones de manejo y
los procedimientos especı́ficos.
Clasificación de Finura de Polvos—La clasificación de la finura
de los polvos se efectúa determinando la abertura más pequeña de
tamiz a través de la cual pasa una cantidad determinada del material en donde Nt es el número de átomos de la sustancia radioactiva en el
en estudio. Los resultados se informan habitualmente de la siguiente tiempo transcurrido t, No es el número de átomos cuando t = 0 y l es
manera: la constante de transformación o desintegración, la cual tiene un
d90 = la abertura más pequeña de tamiz a través de la cual pasa valor caracterı́stico para cada radionucleido. La vida media, T1/2, es el
una cantidad igual o superior al 90% del material tiempo requerido para que una actividad dada de un radionucleido
d50 = la abertura más pequeña de tamiz a través de la cual pasa alcance la mitad de su valor inicial y está relacionada con la
una cantidad igual o superior al 50% del material constante de desintegración por la ecuación:
d10 = la abertura más pequeña de tamiz a través de la cual pasa
una cantidad igual o superior al 10% del material. Se pueden
informar los lı́mites superior e inferior de los valores de
abertura de tamiz cuando se combinan los resultados de dos o
más lotes de prueba, por ejemplo, ‘‘El lote A tiene un valor d50
de 1000 mm con un intervalo de 850–1180 mm’’.
La tabla que figura a continuación presenta un método alternativo,
aunque menos informativo, para clasificar la finura de los polvos.
h821i RADIOACTIVIDAD
vida media (ver Gráfica Normalizada de Desintegración, Figura 1). estadı́sticas, depende del número de cuentas acumuladas en una
medición dada y puede expresarse en función de la desviación
estándar s. Una estimación de s es
Radiación de Fondo
Los rayos cósmicos, la radioactividad presente en el detector y en en donde t es el tiempo muerto. La fórmula de corrección anterior
los materiales de protección y la radiación proveniente de fuentes supone un tiempo muerto no prolongable. Por lo tanto, para la
radioactivas que no cuentan con un blindaje adecuado y que están en validez general, el valor de rt no debe exceder de 0,1. La velocidad
las inmediaciones del equipo de medición son factores que de conteo observada, r, se refiere a la velocidad de conteo bruto de la
contribuyen al conteo de la radiación de fondo. Todas las mediciones muestra y no se debe corregir por la radiación de fondo antes de su
de radioactividad deben corregirse restando el conteo de radiación de uso en la ecuación anterior.
fondo del conteo bruto de la muestra de prueba.
Estándares de Calibración
Estadı́sticas de Conteo
Realizar todas las valoraciones de radioactividad empleando
Dado que el proceso de desintegración radioactiva es un sistemas de medición calibrados con estándares de radioactividad
fenómeno aleatorio, los eventos a contar también forman una debidamente certificados. Estos estándares de calibración pueden
secuencia aleatoria en función del tiempo. Por esta razón, el conteo adquirirse directamente del Instituto Nacional de Estándares y
durante un tiempo definido sólo permite obtener una estimación del Tecnologı́a (National Institute of Standards and Technology) o de
conteo real. La precisión de esta estimación, sujeta a fluctuaciones otras fuentes con valores rastreables al Instituto Nacional de
Estándares y Tecnologı́a mediante su participación en un programa
de mediciones intercomparadas. En aquellos casos en que estos
estándares de calibración no se encuentren disponibles, la Farma-
392 h821i Radioactividad / Pruebas Fı́sicas USP 30
copea proporciona los datos de desintegración nuclear requeridos cruzadas de producción competentes y funciones de excitación a la
para la calibración. Estos datos, ası́ como los valores de vida media, energı́a o energı́as de las partı́culas bombardeantes durante la
se obtienen del Archivo de Datos sobre Estructura Nuclear Evaluada producción.
del Proyecto de Datos Nucleares de Oak Ridge (Evaluated Nuclear
Structure Data File of the Oak Ridge Nuclear Data Project) y reflejan
los últimos valores disponibles a la fecha de publicación. Términos y Definiciones
La fecha de fabricación es la fecha en la cual se completa el ciclo
Transportador de fabricación del producto terminado.
La fecha de valoración es la fecha (y hora, si fuera aplicable) en la
La masa total de átomos o moléculas radioactivas en una fuente cual se realiza la valoración concreta de la radioactividad.
radioactiva dada es directamente proporcional a la actividad del La fecha de calibración es una fecha y hora arbitrariamente
radionucleido para una vida media dada y, por lo general, la cantidad asignados, momento en el que se calcula la radioactividad del
presente en los preparados radiofarmacéuticos es demasiado pequeña producto para la comodidad del usuario.
para ser medida por métodos quı́micos o fı́sicos comunes. Por La fecha de caducidad es la fecha lı́mite para el uso del producto.
ejemplo, la masa de 131I con una actividad de 100 mCi es 8 6 10–7 g. El perı́odo de caducidad (es decir, el tiempo transcurrido entre la
Como cantidades tan pequeñas de material se comportan quı́mica- fecha de fabricación y la fecha de caducidad) se basa en el
mente de manera anómala, se pueden agregar isótopos no radio- conocimiento de las propiedades radioactivas del producto y los
activos del mismo radionucleido para actuar como transportadores resultados de los estudios de estabilidad de la forma farmacéutica
durante el procesamiento para facilitar su manipulación. En muchos terminada.
casos, la adsorción puede impedirse simplemente aumentando la
concentración de iones hidrógeno en la solución. Sin embargo, las
cantidades de este material deben ser lo suficientemente pequeñas Etiquetado
como para que no se produzcan efectos fisiológicos indeseables. La
expresión ‘‘sin transportador’’ se refiere únicamente a preparaciones Las monografı́as correspondientes a cada producto radiofarma-
radioactivas donde no hay isótopos no radioactivos del radio- céutico indican la fecha de caducidad, la fecha de calibración y la
nucleido. Esto implica que los preparados radiofarmacéuticos advertencia ‘‘Precaución—Material Radioactivo’’. El etiquetado
producidos a través de (n, g) reacciones no pueden considerarse indica que, al realizar los cálculos de dosificación, deben hacerse
exentas de transportador. las correcciones necesarias por desintegración radioactiva y
La actividad por unidad de volumen o peso de un medio o asimismo indica cuál es la vida media radioactiva del radionucleido.
vehı́culo que contiene un radionucleido, ya sea con o sin Los artı́culos que son Inyecciones deben cumplir con los requisitos
transportador, se denomina concentración radioactiva, en tanto que de Etiquetado en Inyectables h1i, mientras que los que son
el término actividad especı́fica se refiere a la actividad de un Productos Biológicos deben cumplir con los requisitos de Etiquetado
radionucleido por gramo de su elemento. en Productos Biológicos h1041i.
Se puede alcanzar fácilmente una reproducibilidad con un margen para la misma energı́a de rayos gamma. La resolución de energı́a es
de aproximadamente un 5% en alrededor de 10 segundos, con una una medida de la capacidad para distinguir la presencia de dos rayos
cámara de pozo profundo re-entrante. La forma más comúnmente gamma estrechamente espaciados en energı́a y se define por
empleada de cámara de ionización para medir las actividades de convención como el ancho total del fotopico a la mitad de su
preparados radiofarmacéuticos se conoce como calibrador de dosis. altura máxima (FWHM por sus siglas en inglés), expresado como
Aunque el factor de calibración para un radionucleido puede porcentaje de la energı́a del fotopico.
interpolarse a partir de la curva de respuesta a la energı́a de la cámara Los espectros de rayos gamma presentan uno o más fotopicos
de ionización, en este procedimiento hay varias fuentes posibles de nı́tidos tı́picos o picos de energı́a total, como resultado de la
error. Por lo tanto, se recomienda que todas las calibraciones de la absorción total en el detector de la energı́a completa de radiaciones
cámara de ionización se lleven a cabo con el uso de fuentes gamma provenientes de la fuente; estos fotopicos son útiles para
auténticas de referencia de los radionucleidos individuales, según se fines de identificación. Otros picos secundarios se observan como
describe más adelante. consecuencia de retrodispersión, radiación de aniquilación, suma de
La calibración de un calibrador de dosis debe mantenerse coincidencia, rayos X fluorescentes, etc., acompañados por una
relacionando la respuesta medida de un estándar con la de un banda amplia conocida como el efecto continuo Compton que surge
estándar de larga vida, como es el caso del radio 226 en equilibrio de la dispersión de los fotones en el detector y de los materiales
con sus productos de desintegración. El instrumento debe verificarse circundantes. Dado que la respuesta del fotopico varı́a con la energı́a
diariamente con 226Ra u otra fuente para evaluar su estabilidad del rayo gamma, la calibración de un espectrómetro de rayos gamma
durante un perı́odo prolongado. Esta verificación debe incluir debe realizarse con estándares de radionucleidos que tengan energı́as
lecturas del estándar de funcionamiento en todas las posiciones de de rayos gamma y velocidades de emisión conocidas. La forma del
radionucleido empleadas. Para obtener la actividad (Ax) del radio- espectro de rayos gamma depende de la forma y tamaño del detector
nucleido medido, emplear la relación: y los tipos de materiales de blindaje empleados.
Para verificar la identidad de un radionucleido por espectrometrı́a
de rayos gamma, es necesario hacer una comparación del espectro de
la muestra con el de una muestra de pureza conocida del mismo
radionucleido obtenida con parámetros instrumentales idénticos e
idéntica geometrı́a de muestra. Cuando los radionucleidos emiten
radiaciones coincidentes X o gamma, el carácter de la distribución de
en donde Rn es la nueva lectura para el radio u otra fuente, Rx es la la altura de pulso suele cambiar drásticamente debido al efecto de
lectura para la misma fuente obtenida durante el procedimiento de suma de estas radiaciones coincidentes en el detector a medida que
calibración inicial y R es la lectura observada para la muestra del aumenta la eficiencia de la detección (por ejemplo, al acercar la
radionucleido. Obviamente, primero hay que aplicar las correcciones fuente al detector). Este efecto es particularmente evidente en el caso
necesarias por desintegración radioactiva de la fuente de referencia. del yodo 125. Entre las aplicaciones más útiles de la espectrometrı́a
El uso de este procedimiento debe reducir al mı́nimo cualquier efecto de rayos gamma están aquellas que sirven para la identificación de
debido a la desviación en la respuesta del instrumento. La actividad radionucleidos y la determinación de impurezas radionucléidicas.
recomendada del 226Ra u otro indicador usado en el procedimiento Cuando no es posible confirmar la identidad de un radionucleido
descrito anteriormente es entre 75 mCi y 150 mCi. Se recomienda dado a través de una comparación directa con el espectro de una
también verificar la reproducibilidad o estabilidad de instrumentos muestra del mismo radionucleido de pureza conocida, la identidad
de intervalos múltiples para todos los intervalos con el uso de del radionucleido en cuestión debe establecerse con el siguiente
estándares apropiados. método. Deben medirse dos o más de los siguientes parámetros del
El tamaño y la forma de una fuente radioactiva pueden afectar la esquema de desintegración nuclear de la muestra del radionucleido
respuesta de un calibrador de dosis y suele ser necesario realizar una que se desea identificar, los cuales deben concordar dentro de
pequeña corrección cuando se mide una muestra voluminosa. +10%: (1) vida media, (2) energı́a de rayos gamma o rayos X
emitidos, (3) la abundancia de cada emisión y (4) el Emax para
aquellos radionucleidos que se desintegren con emisión de partı́culas
DETECTORES DE CENTELLEO Y DETECTORES beta. Estas mediciones deben realizarse según se indica en las
SEMICONDUCTORES secciones Identificación y Valoración de este capı́tulo. La coin-
cidencia de dos o más de los parámetros medidos con los datos
Cuando se disipa la totalidad o parte de la energı́a de la radiación correspondientes publicados del esquema de desintegración nuclear
beta o gamma dentro de los centelladores, se producen fotones de constituye la confirmación de la identidad del radionucleido.
intensidad proporcional a la cantidad de energı́a disipada. Un
fototubo multiplicador de electrones detecta estos pulsos y los
convierte en pulsos eléctricos, que posteriormente se analizan con un CONTADORES DE CENTELLEO LÍQUIDO
analizador de altura de pulso para obtener un espectro de altura de
pulso relacionado con el espectro de energı́a de la radiación emitida Los radionucleidos emisores de radiación alfa y beta pueden
por la fuente. En general, un espectro de altura de pulso por centelleo analizarse con un sistema de detectores de centelleo lı́quido. En el
de partı́culas beta se aproxima al espectro verdadero de energı́a beta, lı́quido de centelleo, la energı́a de radiación se transforma finalmente
siempre que la fuente de partı́culas beta esté preparada de tal manera en cuantos de luz que son detectados generalmente por dos fototubos
que la autoabsorción se reduzca al mı́nimo. Se pueden obtener multiplicadores preparados para contar sólo radiación de coinciden-
espectros de rayos beta utilizando fluoruro de calcio o antraceno cia. El lı́quido de centelleo es una solución constituida por un
como centellador, mientras que los espectros de rayos gamma suelen disolvente, solutos primarios y secundarios, y aditivos. La partı́cula
obtenerse con un cristal de yoduro de sodio activado con talio o con cargada disipa su energı́a en el disolvente y una fracción de esta
un detector semiconductor de gran volumen de germanio desplazado energı́a se transforma en fluorescencia en el soluto primario. La
por litio. Los espectros de partı́culas cargadas también pueden función del soluto secundario es desplazar la radiación de
obtenerse empleando detectores semiconductores de silicio y/o fluorescencia a longitudes de onda más largas que son detectadas
contadores proporcionales de gas. Los detectores semiconductores más eficientemente por los fototubos multiplicadores. Los disolven-
son, en esencia, cámaras de ionización de estado sólido, pero la tes empleados con más frecuencia son tolueno y p-xileno; los solutos
energı́a requerida para crear un par electrón-hueco o para elevar un primarios son 2,5-difeniloxazol (PPO) y 2-(4’-terc-butilfenil)-5-(4-
electrón desde la capa de valencia a la capa de conducción en el bifenilil)-1,3,4-oxadiazol (butil-PBD) y los solutos secundarios son
semiconductor es aproximadamente de un décimo de la energı́a 2,2’-p-fenilenbis[4-metil-5-feniloxazol] (dimetil-POPOP) y p-bis(o-
requerida para crear un par iónico en una cámara de ionización llena metilestrilil)benceno (bis-MSB). Para lograr compatibilidad y
de gas o un contador proporcional y es mucho menor que la miscibilidad con muestras acuosas a analizar, se incorporan también
requerida para producir un fotón en un cristal NaI(Tl) de centelleo. en el centellador muchos aditivos, tales como agentes tensoactivos y
En la espectrometrı́a de rayos gamma, un detector de Ge(Li) puede agentes de solubilización. Para una determinación exacta de la
producir una resolución de energı́a de 0,33% para rayos gamma de radioactividad de la muestra se debe prestar atención al preparar una
1,33 MeV provenientes de 60Co, mientras que un cristal de NaI(Tl) muestra verdaderamente homogénea. La presencia de impurezas o
de 3 6 3 pulgadas (7,6 6 7,6 cm) permite obtener un valor de 5,9% color en la solución disminuye la producción de fotones del
394 h821i Radioactividad / Pruebas Fı́sicas USP 30
centellador, lo cual se denomina extinción. Una medición exacta de potenciales redox, para que no ocurra ninguna hidrólisis o cambio en
la radioactividad requiere una corrección por pérdida de velocidad de el estado de oxidación con la dilución, lo que podrı́a conducir a
conteo debida a extinción. adsorción y separación del radionucleido de la solución.
La velocidad de desintegración de una fuente de partı́culas beta
puede determinarse mediante un procedimiento que consiste en
medir el conteo total de la muestra en función del umbral RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA
discriminador de la altura de pulso y la velocidad de emisión se
obtiene luego extrapolando a un umbral de cero. Los emisores de Procedimiento del Coeficiente de Absorción de Masa—
partı́culas alfa energéticas pueden medirse de forma similar Depositar y secar una alı́cuota de la solución de fósforo 32
utilizando este método. radioactivo sobre una pelı́cula plástica delgada para reducir al
mı́nimo la retrodispersión y colocar la alı́cuota bajo un contador
apropiado. Determinar sucesivamente las velocidades de conteo,
Identificación empleando no menos de seis ‘‘espesores’’ diferentes de aluminio
cada uno entre 20 mg/cm y 50 mg/cm2 y un solo absorbente de
Un radionucleido puede identificarse por su modo de desintegra- espesor no mayor de 800 mg/cm2, que se emplea para medir la
ción, su vida media y las energı́as de sus emisiones nucleares. radiación de fondo. (Los absorbentes se insertan entre la muestra de
La vida media radioactiva se determina fácilmente mediante el prueba y el contador pero se colocan más cerca de la ventana del
conteo sucesivo de una fuente dada del radionucleido durante un contador para reducir al mı́nimo la dispersión.) El conteo neto de
perı́odo más prolongado que su vida media. La respuesta del partı́culas beta se obtiene después de restar la velocidad de conteo
dispositivo para conteo cuando se emplea para la medición de la hallada con el absorbente de espesor de 800 mg/cm2 o mayor.
desintegración de radionucleidos de larga vida debe supervisarse con Graficar el logaritmo de la velocidad neta de conteo de partı́culas
una fuente de referencia de vida aún más larga para evaluar y beta en función del ‘‘espesor’’ total del absorbente. El ‘‘espesor’’
compensar errores que surjan de la derivación electrónica del total del absorbente es el ‘‘espesor’’ de los absorbentes de aluminio
aparato. Para radionucleidos de vida corta, cuando el perı́odo de más el ‘‘espesor’’ de aire equivalente (la distancia en centı́metros
conteo es una fracción significativa de la vida media del radio- entre la muestra y la ventana del contador multiplicada por 1,205
nucleido, la velocidad de conteo registrada debe corregirse al tiempo mg/cm3 a 208 y 76 cm de mercurio), expresado en mg/cm2. El
en que se inicia el conteo, del siguiente modo: resultado es una lı́nea aproximadamente recta.
Elegir dos ‘‘espesores’’ totales del absorbente que difieran en 20
mg/cm2 o más y que caigan sobre la gráfica lineal y calcular el
coeficiente de absorción de masa, m, por medio de la ecuación:
eficiencias geométricas bajas, las áreas bajo los fotopicos, después de Otro método útil que se emplea con frecuencia para la
corregir por la eficiencia de medida del detector, son proporcionales determinación de la velocidad de desintegración de radionucleidos
a la abundancia o velocidad de emisión de los respectivos rayos emisores de rayos beta es el conteo por centelleo lı́quido, que
gamma en el radionucleido. también utiliza una extrapolación del conteo de la muestra a un
umbral cero para el discriminador de altura de pulso.
IMPUREZAS RADIONUCLÉIDICAS
RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS GAMMA
Debido a que los nucleidos emisores de rayos alfa son sumamente
tóxicos, debe limitarse su uso en preparaciones radiofarmacéuticas. Se proporcionan tres métodos para la valoración de radionucleidos
Los procedimientos para la identificación de radionucleidos activos emisores de rayos gamma. La selección del método preferido
gamma y beta, según se ha indicado previamente, se aplican a la depende de la disponibilidad de un estándar de calibración del
detección de contaminantes gamma y, comúnmente, contaminantes radionucleido a analizar y la pureza radionucléidica del producto en
beta. sı́.
La actividad bruta de partı́culas alfa en preparaciones radio- Se requiere la comparación directa con un estándar de calibración
farmacéuticas puede medirse mediante el uso de un contador si el estándar de calibración del radionucleido a analizar esta
proporcional sin ventanas o un detector de centelleo que emplee un disponible y si se ha determinado que el lı́mite superior de error
detector fosforescente de sulfuro de cinc activado por plata o por las aceptable en la determinación de las actividades debido a la
técnicas de conteo de centelleo lı́quido. presencia de impurezas radionucléidicas es menos de 3%. Cuando el
La gran ionización causada por partı́culas alfa facilita la medición estándar de calibración requerido no es fácil de obtener, como
de radionucleidos emisores de rayos alfa en presencia de grandes probablemente sea el caso para un radionucleido de vida corta, pero
cantidades de nucleidos beta y gamma activos mediante el uso de ha estado disponible en algún momento previo a la ejecución de la
técnicas apropiadas para diferenciar la amplitud de los pulsos de valoración para determinar la eficiencia del sistema de conteo del
señal. En el conteo proporcional, la región de voltaje operativo para radionucleido a analizar, emplear un sistema de conteo calibrado
conteo de partı́culas alfa denominada ‘‘meseta alfa’’ es considera- siempre que el contenido de impurezas radionucléidica de la muestra
blemente menor que la ‘‘meseta beta’’ para conteo de radiaciones cumpla los requisitos establecidos para el método de comparación
beta y gamma. La calibración de voltaje tı́pica para la ‘‘meseta alfa’’ directa. Si los requisitos de cualquiera de los dos primeros métodos
y la ‘‘meseta beta’’ con gas de conteo P-10 es de 900 voltios a 1300 no se pueden cumplir, emplear el método para determinación de la
voltios y de 1600 voltios a 2000 voltios, respectivamente. actividad a partir de una curva de calibración.
Cuando se emplean detectores fosforescentes de sulfuro de cinc Con excepción del primer método, se realiza un seguimiento de
activado por plata para la detección de partı́culas alfa, éstas pueden los sistemas de conteo empleados para verificar la estabilidad. Este
distinguirse de otras radiaciones de interferencia por la diferencia- requisito se cumple mediante verificaciones diarias con una fuente de
ción de la altura de pulso. Se debe tomar la precaución de reducir al larga vida para verificar el funcionamiento y verificaciones
mı́nimo la autoabsorción en la fuente cuando se preparan las semanales con al menos tres fuentes que cubran una gama amplia
muestras para el conteo de partı́culas alfa. de energı́as de emisión de rayos gamma (por ejemplo, 57Co, 137Cs y
60
Co). Si se encuentra una discrepancia en cualquiera de las medidas
antedichas, recalibrar completamente el sistema o reparar y recalibrar
Valoración el sistema antes de volver a usarlo.
Valoración por Comparación Directa con un Estándar de
RADIONUCLEIDOS EMISORES DE RAYOS BETA Calibración—Para este procedimiento no se requiere un sistema de
medición selectiva de energı́a (por ejemplo, un analizador de altura
Procedimiento—La velocidad de desintegración (A) de una de pulso). Se emplea una cámara de ionización o un sistema integral
muestra emisora de partı́culas beta se obtiene mediante el conteo de de conteo con un detector de NaI(Tl). Para obtener resultados
una alı́cuota cuantitativamente depositada en una geometrı́a fija exactos es esencial un factor de geometrı́a reproducible de manera
según la fórmula: constante de muestra a muestra. Tomando precauciones adecuadas,
la exactitud de este método se aproxima a la exactitud con la cual se
determina la velocidad de desintegración del estándar de calibración.
Determinar la velocidad de conteo del sistema de detectores para
un estándar de calibración del radionucleido a valorar (por ejemplo,
suficientemente activo para dar estadı́sticas confiables de medición
dentro de un lapso razonable, pero no tan activo como para causar
problemas graves de tiempo muerto), seleccionando un estándar que
permita una exactitud óptima con el equipo especı́fico utilizado.
Colocar una alı́cuota exactamente medida de la muestra desconocida
en donde E es la eficiencia del contador, fr es el factor de corrección a valorar (diluida, si fuera necesario) en un recipiente aproximada-
por tiempo muerto del contador, fb es el factor de corrección por mente al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones geométricas
retrodispersión y fs es el factor de corrección por autoabsorción. La que el estándar. Si el tiempo transcurrido entre las mediciones del
velocidad de conteo para un absorbente cero se obtiene por estándar de calibración y la muestra excede las 12 horas, verificar la
extrapolación de la porción lineal inicial de la curva de absorción estabilidad del sistema de medición dentro de las 8 horas a partir del
a un‘‘espesor’’ cero del absorbente, considerando los mg/cm2 de momento en que se midió la muestra, con una fuente de larga vida
‘‘espesor’’ de cubierta de la muestra, la ventana del contador y el para verificación del funcionamiento. Registrar la respuesta del
espacio de aire presente entre la muestra y la ventana del contador. sistema con respecto a la misma fuente de verificación en el
La eficiencia del contador, E, se determina mediante el uso de un momento de la calibración y, si las verificaciones posteriores
estándar secundario de larga vida con caracterı́sticas espectrales exceden la respuesta original registrada en más de +3%, recalibrar
similares. RaD + E se ha utilizado con frecuencia para la calibración
de eficiencia de los contadores para fósforo 32. Mediante el uso de
condiciones de medición idénticas para la muestra y el estándar (y
extrapolación a absorbente cero), el cociente entre los valores de fr, fb
y fs para el estándar y la muestra se acerca a la unidad.
La relación anterior es válida también cuando se ha calibrado el
contador con un estándar del radionucleido que se va a analizar. En
este caso, sin embargo, no se requieren las extrapolaciones a
‘‘espesor’’ cero del absorbente para la muestra y el estándar, ya que
las dos correcciones para absorción se cancelan para una geometrı́a
dada.
396 h821i Radioactividad / Pruebas Fı́sicas USP 30
el sistema. Corregir ambas determinaciones de actividad por es muy cercana a la gausiana y multiplicándolo por el canal de
radiación de fondo y calcular la actividad, en mCi por mL, por la conteo máximo, P, después de corregir por contribuciones por el
fórmula: efecto Compton y la radiación de fondo. Por lo general, esta
radiación de fondo puede determinarse correctamente mediante una
interpolación lineal. Este procedimiento se ilustra en la Figura 2.
La curva del fotopico adopta una forma cercana a una lı́nea recta a
0,606P y la contribución al valor de a de los canales fraccionarios
en donde D es el factor de dilución, gx es la velocidad de conteo de la puede calcularse exactamente por interpolación. Calcular a por la
muestra (corregida por la radiación de fondo y el tiempo muerto) y Ex ecuación:
es la eficiencia correspondiente para el radionucleido.
Determinación de la Actividad a Partir de una Curva de
Calibración—La versatilidad en las mediciones de intensidad
absoluta de rayos gamma puede lograrse mediante un análisis de
altura de pulso en canales múltiples. La eficiencia de un sistema de
detección para fotopicos puede determinarse como una función de la
energı́a de los rayos gamma a través de una serie de muestras de
estándares de emisores de rayos gamma; la velocidad de emisión de
rayos gamma de un radionucleido para el cual no se disponga de
ningún estándar puede determinarse por la interpolación en la curva en donde c y d y también c’ y d’ son los canales de conteo
de eficiencia. Sin embargo, es necesario definir la curva de eficiencia individuales a cada lado de 0,606P y D y D’ son los números de los
para el sistema de detección adecuadamente sobre la región total de canales (ubicación) de d y d’, respectivamente. La posición de las
interés, usando un número suficiente de puntos de calibración a lo variables requeridas sobre el fotopico se ilustra en la Figura 3.
largo del eje de energı́a del fotopico.
Selección de un Equipo de Conteo—Para la identificación de
radionucleidos que emiten rayos X o gamma en su desintegración se
emplea un espectrómetro de rayos gamma. Los requisitos para un
equipo apropiado para la identificación y valoración de los
radionucleidos empleados en productos radiofarmacéuticos son: (a)
que la resolución del detector basada en el fotopico de 137Cs-137mBa
de 662-keV sea 8,0% o mejor, (b) que el detector cuente con un
soporte de muestra diseñado para facilitar la repetición exacta de la
geometrı́a de conteo y (c) que el analizador de altura de pulso tenga
canales suficientes para delinear claramente el fotopico bajo
observación.
Procedimiento—Los requisitos mı́nimos para el mantenimiento de
las calibraciones del instrumento son verificaciones semanales de
funcionamiento con una fuente apropiada de referencia y una
recalibración semestral completa. Si la verificación de funciona-
miento semanal se desvı́a del valor determinado en el momento de la
calibración en más de 4,0%, debe recalibrarse totalmente el
instrumento.
Este método se divide en tres pasos básicos: la integración del
fotopico, la determinación de la curva de eficiencia para fotopicos y
el cálculo de la actividad de la muestra.
INTEGRACIÓN DEL FOTOPICO—El método para determinar el área de
un fotopico utiliza una aproximación gausiana para el ajuste del Fig. 3 Ubicación de las Variables Requeridas para la Determinación
fotopico. Puede obtenerse una fracción fija del número total de del Ancho del Pico, a, a 0,606P.
conteos del fotopico tomando el ancho del pico, a, a una fracción del
máximo donde se ha determinado experimentalmente que la forma
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h821i Radioactividad 397
Verificación de los Procedimientos de Preparación producto cumple con los criterios de aceptación. Si se trata de
Magistral procedimientos de rutina verificados que se utilizan regularmente
con éxito, realizar al menos un procedimiento de verificación anual
Se deben establecer y llevar a cabo las tareas detalladas a para demostrar que el producto cumple con los criterios de
continuación. Una persona designada, calificada y con la capacita- aceptación establecidos.
ción adecuada, ha de ser la responsable de garantizar que estas
actividades se ejecuten y completen correctamente.
(1) Establecer criterios de aceptación escritos para la identidad, Pruebas de Estabilidad y Fechado de Caducidad
pureza y calidad de cada radiofármaco TEP que se prepare. Si hay
una monografı́a de la USP para un TEP especı́fico, los criterios de Han de establecerse especificaciones escritas para determinar la
aceptación mı́nimos son los allı́ dispuestos (ver Oficial y Artı́culos fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento de cada
Oficiales en Advertencias y Requisitos Generales). radiofármaco TEP, considerando los resultados de las pruebas de
(2) Establecer procedimientos escritos y verificados para la estabilidad y actividad especı́fica.La muestra utilizada en las pruebas
preparación de todo radiofármaco TEP que de estabilidad de un producto se debe tomar de un producto
impliquen filtrado por membrana estéril (0,22 mm) de radio- almacenado en las condiciones especificadas para almacenar el
fármacos TEP destinados a administración por vı́a parenteral; producto, en su envase y con su sistema de cierre. El radiofármaco
impliquen filtrado de partı́culas (0,45 mm) de radiofármacos TEP debe cumplir con todos los criterios de aceptación hasta su
TEP destinados a inhalación; y caducidad. Realizar las pruebas de estabilidad cada vez que se
se actualicen y verifiquen regularmente, ni bien se pongan en realice un cambio en las especificaciones de los componentes, en los
práctica los cambios en los procedimientos de preparación programas o en los procedimientos de preparación que pudieren
magistral, o revisarlos y verificarlos al menos una vez al año afectar la estabilidad del producto farmacéutico.
para asegurarse de que son los vigentes. Mantener, dentro de las
instalaciones de TEP, un archivo maestro con todos los
procedimientos escritos y vigentes para la preparación de Preparación de Radiofármacos TEP para Uso
cada radiofármaco TEP. Copias de los procedimientos que ya Humano
no se utilizan han de mantenerse separadamente del archivo
maestro, para fines de revisión. Se deben llevar a cabo y documentar las siguientes tareas según lo
(3) Controlar de forma adecuada los sistemas informáticos y todo dispuesto en los procedimientos escritos. Una persona designada,
otro equipo automatizado relacionado para asegurar que los cambios calificada y con la capacitación adecuada ha de ser la responsable de
en los programas de software de preparación son llevados a cabo garantizar que estas actividades se ejecuten y completen correcta-
solo por personal autorizado, que los cambios están documentados y mente.
verificados y que solamente las versiones vigentes de software están (1) Inmediatamente antes de usar, inspeccionar los equipos, las
disponibles y son utilizadas en los procedimientos de preparación áreas de preparación y de dispensación, verificando su aptitud y
magistral de radiofármacos para TEP. En las instalaciones de TEP se limpieza. Antes de comenzar las actividades de preparación o
ha de guardar en un archivo maestro una copia impresa y en diskette dispensación, verificar que todo material o etiqueta no perteneciente
de los programas utilizados en la preparación magistral de a la operación haya sido retirado del área y de los equipos
radiofármacos TEP. Copias de los programas que ya no se utilizan correspondientes. Cuando se trate de radiofármacos TEP para
han de guardarse separadamente del achivo maestro, para fines de administración por vı́a parenteral, manipular los componentes,
revisión. recipientes, envases y cierres y materiales que se encuentren en los
(4) Realizar estudios de verificación para asegurar que los alrededores del lugar donde se realiza el filtrado por membrana
procedimientos de preparación magistral escritos, los programas estéril utilizando técnicas asépticas apropiadas y en un ambiente
informáticos, los equipos y las instalaciones proporcionen un controlado.
radiofármaco de TEP que cumpla con los criterios de aceptación (2) Asegurar que la identidad, cantidad y aptitud de los
establecidos. Los estudios de verificación deben componentes, envases y cierres y otros materiales utilizados en la
incluir evaluaciones documentadas de la identidad y pureza preparación de radiofármacos sean las correctas.
radioquı́mica, identidad y pureza radionucléidica, actividad (3) Etiquetar los componentes subdivididos utilizados durante la
especı́fica, esterilidad (para parenterales), endotoxinas bacteria- preparación a los fines de identidad y rastreabilidad.
nas (para parenterales), pH, osmolalidad (para parenterales) si (4) Etiquetar el envase o el dispositivo de administración-
corresponde, apariencia, pureza estereoquı́mica (cuando corres- dispensación del radiofármaco TEP final antes de comenzar la
ponda), impurezas orgánicas volátiles potenciales, otras sus- preparación. La etiqueta del envase o del dispositivo de adminis-
tancias quı́micas tóxicas que pudieran haber sido utilizadas en tración-dispensación final deberá incluir la siguiente información: la
los procedimientos de purificación o sı́ntesis, concentración real identidad del radiofármaco TEP, las sustancias agregadas (por
de los estabilizantes (si los hubiera), pureza quı́mica del ejemplo, estabilizantes y conservantes), el número de partida o de
radiofármaco TEP. [NOTA—Las evaluaciones de la pureza lote correspondiente y la advertencia que corresponda (por ejemplo,
quı́mica deben incluir análisis de la presencia de materias radioactivo), en forma de leyenda o con el sı́mbolo apropiado.
primas, productos intermedios conocidos, subproductos y También se indicará la radioactividad total y la concentración
productos de degradación conocidos] y la equivalencia entre radioactiva a la hora de calibración indicada, la hora y fecha de
las subpartidas iniciales y finales (para radiofármacos TEP con caducidad y toda advertencia que corresponda o sea necesario incluir
radionucleidos con un T½ 520,0 minutos). A los efectos de este (por ejemplo, ‘‘Precaución Material Radioactivo’’, ‘‘No usar si
capı́tulo, el término ‘‘Subpartida‘‘ es una cantidad de un presenta turbidez o si contiene partı́culas’’) y/o el sı́mbolo que se
producto farmacéutico TEP de calidad y caracterı́sticas identifica con la radioactividad.
uniformes, dentro de los lı́mites especificados, producido (5) Preparar el radiofármaco TEP de acuerdo con los procedi-
mediante una sucesión de múltiples irradiaciones, con una mientos verificados y vigentes. Llevar un registro escrito para cada
purificación y/o sı́ntesis determinada y partida (es decir, del material producido durante una única sı́ntesis y
ser firmados, fechados y guardados como prueba de que el purificación) de radiofármaco TEP. El registro escrito incluye
procedimiento de preparación magistral, las instalaciones, los números de lote, identidad de los fabricantes, fechas de
equipos utilizados han producido un radiofármaco TEP que caducidad y cantidades de todos los componentes, recipiente,
cumple con los criterios de aceptación establecidos. envase y cierre y materiales utilizados en la preparación;
Siempre que un cambio en los procedimientos de preparación una descripción del proceso de preparación especı́fico a utilizar;
magistral, en los programas informáticos o en las especificaciones de la firma abreviada de la persona responsable indicando que el
los componentes tenga la capacidad de alterar la identidad, la calidad proceso de preparación de la partida en cuestión es una réplica
o la pureza del producto radiofarmacéutico, se han de realizar del procedimiento vigente verificado;
estudios de verificación. Antes de aprobar un producto para uso la firma abreviada de la persona responsable indicando que se
humano, realizar las verificaciones de todo procedimiento de han completado los pasos y procesos crı́ticos del procedimiento
preparación de un cierto radiofármaco TEP nuevo o revisado, en de preparación [NOTA—Supervisar los pasos crı́ticos en los
al menos tres partidas consecutivas a fin de demostrar que el procedimientos de preparación automatizados mediante obser-
400 h823i Radiofármacos / Pruebas Fı́sicas USP 30
vación directa (si fuera posible teniendo en cuenta las en el intervalo entre 5 unidades de endotoxina por mL y 175
limitaciones visuales o las debidas a la exposición a la unidades de entoxina/V, donde V es el volumen de inyección
radiación) o mediante una computadora u otros mecanismos máximo) en cada partida (con T½ 20,0 minutos) o en cada
de control]; subpartida de control de calidad (con T½ 5 20,0 minutos) antes
documentación de la investigación de toda desviación no de liberar la partida o las subpartidas subsiguientes para uso en
planificada o de resultados no esperados de los procedimientos seres humanos.
o procesos de preparación, y de los resultados obtenidos a partir Si se trata de radiofármacos TEP para administración por vı́a
de dicha investigación; parenteral, efectuar una prueba de endotoxinas bacterianas
el rendimiento calculado en porcentaje con respecto a la estándar de 60 minutos en cada partida (con T½ 20,0 minutos)
cantidad corregida por desintegración, conocida o esperada, del o en cada subpartida de control de calidad (con T½ 5 20,0
radionucleido de partida incorporado sintéticamente al radio- minutos) del radiofármaco. Las pruebas de endotoxinas se
fármaco final; pueden efectuar utilizando otros procedimientos aprobados (ver
datos analı́ticos originales (antes de su procesamiento) de cada Prueba de Endotoxinas Bacterianas h85i). Independientemente
partida de radiofármaco TEP; y de la prueba utilizada, se debe efectuar una evaluación de los
fecha y firma de la persona responsable indicando su resultados de endotoxinas bacterianas antes de la liberación de
responsabilidad general por el procedimiento de preparación cada partida (con T½ 20,0 minutos), o de cada subpartida de
magistral verificado y suscribiéndolo. control de calidad (con T½ 5 20,0 minutos) antes de liberar la
partida o las subpartidas subsiguientes para uso en seres
humanos.
Control de Calidad Las pruebas de esterilidad para cada radiofármaco TEP
destinado a la administración por vı́a parenteral se realizan en
Se deben llevar a cabo y documentar las siguientes tareas según lo cada partida (con T½ 20,0 minutos) o en cada subpartida de
dispuesto en los procedimientos establecidos escritos. Una persona control de calidad (con T½ 5 20,0 minutos). Dichas pruebas se
designada, calificada y con la capacitación adecuada ha de ser la realizan también después del reemplazo de algún componente
responsable de garantizar que estas actividades se ejecuten y del sistema. Comenzar las pruebas de esterilidad dentro de las
completen correctamente por personal calificado y capacitado. 24 horas de efectuada la filtración estéril. Realizar las pruebas
(1) Establecer por escrito las pruebas de control de calidad a sobre muestras individuales no combinadas del producto.
realizar para cada partida individual de radiofármacos TEP, los (2) Establecer por escrito los procedimientos para la realización de
procedimientos analı́ticos y los criterios de aceptación correspon- las pruebas de control de calidad de las partidas de un radiofármaco
dientes. de TEP destinado para uso humano.
Efectuar los siguientes procedimientos de control de calidad (3) Efectuar pruebas de verificación del equipo y de los
para cada partida (es decir, para el material producido durante procedimientos de prueba de control de calidad de radiofármacos
una única sı́ntesis y purificación) de radiofármacos TEP cuya TEP. Utilizando estándares internos o externos, confirmar el correcto
etiqueta declara que tiene un nucleido de T½ 20,0 minutos, funcionamiento del equipo, por ejemplo el cromatógrafo de gases o
antes de su liberación: medición del pH de las formas el cromatógrafo de lı́quidos de alta resolución (ver Aptitud del
farmacéuticas orales y parenterales; inspección visual de las Sistema en Cromatografı́a h621i), al cabo de la instalación inicial, o
formas farmacéuticas orales y parenterales; determinación de la si se hubieran realizado reparaciones considerables. Verificar
pureza radioquı́mica y la identidad de todas las formas periódicamente el correcto funcionamiento del equipo de análisis
farmacéuticas; determinación de la identidad radionucléidica (es decir, realizar una prueba de aptitud del sistema) y el
en todas las formas farmacéuticas; y evaluación de la actividad mantenimiento del equipo, según lo dispuesto en los procedimientos
especı́fica de los radiofármacos TEP que pudieran presentar escritos pertinentes. Verificar los calibradores de dosis, usados para
problemas de toxicidad o de localización dependiente de la medir la radioactividad de graneles y de dosis dispensadas de
masa; y evidencias de su conformidad con los criterios de radiofármacos TEP, según lo dispuesto en la reglamentación estatal
aceptación establecidos para disolventes residuales y para otros aplicable a la utilización de material radioactivo con fines médicos.
productos quı́micos tóxicos utilizados durante la sı́ntesis o (4) Realizar los controles de calidad en partidas de radiofármacos
purificación. TEP según los procedimientos escritos e inicialar los resultados.
Si se trata de radiofármacos TEP cuya etiqueta declara que tiene (5) Aprobar o rechazar cada partida de radiofármacos TEP
un núclido de T½ 5 20,0 minutos, una partida se define como individualmente según la conformidad de los resultados de los
todas las subpartidas conexas de un radiofármaco TEP controles de calidad con lo establecido en los criterios de aceptación.
preparadas en un dı́a determinado. Efectuar los siguientes Firmar y fechar toda partida individual de radiofármacos TEP
procedimientos en la subpartida de control de calidad inicial de aceptable.
cada partida de radiofármaco de TEP, antes de liberar las (6) Investigar los resultados inaceptables de los controles de
subpartidas siguientes para su uso en seres humanos: medición calidad y registrar los resultados de tales investigaciones.
del pH de las formas farmacéuticas orales y parenterales;
inspección visual de las formas farmacéuticas orales y
parenterales; determinación de la pureza radioquı́mica y de la Esterilización y Garantı́a de Esterilidad
identidad de todas las formas farmacéuticas; determinación de
la identidad radionucléidica en todas las formas farmacéuticas; La garantı́a de esterilidad de los radiofármacos de TEP requiere de
y evaluación de la actividad especı́fica de los radiofármacos un sistema de controles completo del proceso. Se deben establecer,
TEP que pudieran presentar problemas de toxicidad o de documentar y llevar a cabo tareas de esterilización para los
localización dependiente de la masa; y evidencias de con- siguientes elementos del proceso.
formidad con los criterios de aceptación establecidos para Componentes y Equipos de Preparación—Limpiar adecuada-
disolventes residuales y para otros productos quı́micos tóxicos mente y mantener la higiene del equipo utilizado para preparar los
utilizados o producidos durante la sı́ntesis o purificación. radiofármacos TEP. El equipo que entra en contacto con la solución
Realizar una prueba de integridad de membrana de filtro de un fármaco TEP se puede tratar para eliminar las endotoxinas y se
inmediatamente después de finalizar el filtrado del producto de puede esterilizar para eliminar la biocarga. Almacenar y proteger el
cada partida de radiofármacos TEP destinados a la administra- equipo preparado de forma de mantener su limpieza y, si fuera
ción por vı́a parenteral. Finalizar la prueba de integridad de necesario, esterilidad. Se recomienda utilizar los componentes para
membrana antes de liberar la partida para uso en seres humanos, productos TEP obtenidos de proveedores calificados, después de
excepto por el agua 15O, caso en el que puede ser necesario verificar que dichos componentes cumplen con los requisitos de
liberar la partida antes de dar por terminada la prueba de productos farmacéuticos estériles. Se recomienda además que filtros,
integridad de filtro. En este caso, la prueba se completa lo antes dispositivos de transferencia, jeringas y viales se obtengan ya
posible luego de la liberación de la partida. estériles de fuentes comerciales. Si la esterilización de los
Si se trata de radiofármacos TEP para administración por vı́a componentes se realiza en las instalaciones de TEP, verificar los
parenteral, efectuar una ‘‘prueba de lı́mite’’ de endotoxina de 20 procesos de esterilización y la asepsia del ensamble de los
minutos durante el proceso (incorporando controles positivos componentes del dispositivo. Verificar periódicamente el funciona-
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h831i Índice de Refracción 401
miento correcto del esterilizador. Las soluciones para administración con los filtros de membrana en condiciones especı́ficas. Los filtros
por vı́a parenteral se deben filtrar de forma estéril y transferir no deben liberarar partı́culas ni compuestos solubles, retener
asépticamente a viales multidosis, estériles y apirógenos. Algunas ingredientes del producto, ni alterar su integridad durante la
formas farmacéuticas de productos TEP no pueden transferirse a un utilización. Si los filtros están preparados y esterilizados por un
vial y requieren consideraciones especiales. fabricante de filtros comerciales, habitualmente este fabricante
Controles Ambientales—Mantener limpia el área de trabajo suministra las condiciones de filtración (es decir presión y velocidad
donde se prepara la forma farmacéutica final. Proteger la campana de flujo), condiciones que es necesario respetar durante la
aséptica de posibles fuentes de contaminación microbiana y preparación de un medicamento TEP. Para la mayorı́a de las
colocarla en un área donde la circulación de personal está restringida soluciones acuosas de pH casi neutro, los fabricantes de filtros
y controlada. El personal que trabaja en la campana aséptica debe proveen certificación de la retención microbiana de los filtros
usar indumentaria de laboratorio limpia y apropiada. Transferir los seleccionados. Examinar y conservar la certificación de conformidad
componentes, materiales y equipos al área aséptica en envoltorios o con las especificaciones de cada lote de filtros.
recipientes protectores. Utilizar técnicas asépticas para manipular Antes de usar los filtros de un lote en particular, verificar la
toda forma farmacéutica de solución estéril. Los envases, el integridad de una muestra para demostrar que la membrana y el
dispositivo de filtración, los filtros de escape y las agujas que se soporte no han perdido su capacidad para retener microorganismos,
utilizan con la forma farmacéutica final deben ser estériles y utilizando el método recomendado por el fabricante u otro método
desechables, y se usan una sola vez. Luego de montar el filtro en el considerado aceptable.
envase del producto, mantener la esterilidad del conjunto. Si hubiera Verificar la integridad de las membranas filtrantes de esterilización
dudas respecto a la esterilidad de cualquiera de los componentes, luego de haber filtrado el preparado radiofarmacéutico TEP pero
descartar el componente o el conjunto. Hisopar el septo del vial del antes de liberar el producto. Una prueba sencilla es la de ‘‘Punto de
producto con una solución desinfectante (por ejemplo, alcohol al Burbuja’’ que se efectúa con un manómetro y una fuente de aire
70% recién filtrado o certificado como estéril) y secar el septo al aire presurizada conectada al filtro a través del dispositivo de
en la campana aséptica antes de penetrar el envase del producto final. transferencia. Colocar el conjunto de filtración en un vaso de
Campana Aséptica—Montar el filtro del producto y el sistema de precipitados con agua de forma tal que la salida del conjunto se
envase y cierre para el producto final en una campana aséptica. encuentre sumergida en el agua. Aplicar aire a una presión moderada
Realizar todos los procedimientos estériles (asépticos) en un puesto del lado no estéril del dispositivo de filtración. Aumentar la presión
de trabajo aséptico con aire con clasificación de limpieza clase 100 del aire hasta alcanzar el punto de burbuja validado y mantenerla
(por ejemplo un aislador o una campana de flujo laminar). Las brevemente para permitir que se equilibre. La integridad del filtro se
superficies del equipo y de la campana aséptica han de ser fáciles de considera aceptable si no se observa una corriente continua de
limpiar y de desinfectar. Los desinfectantes han de estar filtrados o burbujas.
certificados como estériles con un certificado de análisis del Pruebas Microbiológicas del Producto Final—Los radiofárma-
fabricante y las superficies internas de la campana se limpian y se cos TEP para administración por vı́a parenteral han de ser estériles y
desinfectan a diario antes de usar y luego de ingresar equipos estar exentos de entoxinas, todo ello demostrado mediante las
nuevos. Realizar periódicamente pruebas microbiológicas de la pruebas de esterilidad y de endotoxinas. Las pruebas de esterilidad
campana aséptica (semanalmente por ejemplo), con un hisopo o con comienzan antes de transcurridas las 24 horas de la preparación y las
placas de contacto para las superficies, placas de muestreo por de endotoxinas inmediatamente luego de la preparación magistral.
sedimentación, o muestreadores dinámicos de aire. No es necesario Efectuar las pruebas para cada lote de forma individual y no
realizar con tanta frecuencia los recuentos de partı́culas atmosféricas combinarlo con otros lotes. Si la prueba microbiológica falla, realizar
no viables. una investigación para determinar la causa y realizar las correcciones
Técnica Aséptica—Todas las operaciones asépticas, incluido el necesarias. Cuando se haya establecido un registro de pruebas de
montaje de los componentes estériles, la preparación, el filtrado y la esterilidad satisfactorias para un fármaco TEP en particular,
manipulación de soluciones estériles han de ser realizadas por solamente el primer lote preparado cada dı́a se somete a pruebas
operadores calificados para trabajar con técnicas asépticas. Realizar de esterilidad utilizando métodos de cultivo. Sin embargo, cuando en
las manipulaciones asépticas empleando implementos estériles con las instalaciones se prepare otro fármaco TEP o se admita un nuevo
cubiertas protectoras selladas y abrirlos dentro de la campana lote de componentes estériles nuevo (por ejemplo, filtros o envases
aséptica. Reemplazar los equipos o componentes en duda que hayan para el producto final), realizar las pruebas de esterilidad en el primer
estado en contacto con una superficie no estéril. Transferir los lote de dicho fármaco TEP preparado en ese dı́a.
componentes estériles con sus correspondientes cierres a la campana.
Los operadores que realizan las operaciones asépticas deben usar
indumentaria de laboratorio adecuada para realizar preparaciones
magistrales. Desinfectar las manos enguantadas inmediatamente
antes de colocarlas dentro de la campana aséptica.
Capacitar a los operadores que trabajan dentro del área aséptica y
evaluar periódicamente su trabajo mediante observación directa y h831i ÍNDICE DE REFRACCIÓN
con pruebas microbiológicas. Evaluar las técnicas asépticas
utilizadas para fabricar productos estériles con simulaciones
usando un medio de crecimiento microbiológico en lugar de la
solución de radiofármaco TEP. Las simulaciones de procesos El ı́ndice de refracción (n) de una sustancia es la relación entre la
incluyen manipulaciones, como por ejemplo conexión de escapes velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz en la sustancia.
de aire y filtración. En las simulaciones de procesos es clave verificar Es valioso en la identificación de sustancias y en la detección de
la capacidad de promoción de crecimiento del medio en el envase del impurezas.
medicamento TEP. Una vez finalizado el proceso de simulación, La temperatura estándar en las determinaciones farmacopeicas es
agitar suavemente el envase del producto final para permitir que el 258 pero a menudo las especificaciones en las monografı́as
medio entre en contacto con todas las superficies e incubar el envase individuales indican que es necesario calcular el valor del ı́ndice
y el medio durante 14 dı́as (a entre 308 y 358, 208 y 258, o a otra de refracción a 208. Es necesario ajustar y mantener la temperatura
temperatura adecuada), observando periódicamente para detectar el cuidadosamente ya que el ı́ndice de refracción varı́a considerable-
crecimiento: el resultado de la prueba es aceptable si no se observa mente con la temperatura.
crecimiento en los envases. Durante la capacitación de un nuevo Los valores del ı́ndice de refracción indicados en esta Farmacopea
operador realizar las simulaciones por triplicado. Aproximadamente son para la lı́nea D de sodio (doblete a 589,0 nm y 589,6 nm). La
una vez al año o cada vez que se realicen cambios en los mayorı́a de los instrumentos disponibles están diseñados para usarse
procedimientos cada operador efectuará una simulación. con luz blanca pero están calibrados para expresar el ı́ndice de
refracción con respecto a la lı́nea D de la luz de sodio.
Calificación del Proceso de Filtración—La filtración esterili- El refractómetro Abbé mide la gama de ı́ndices de refracción de
zante es el último paso de seguridad para eliminar los micro- los materiales farmacopeicos para los cuales se indican dichos
organismos de las soluciones de radiofármacos TEP. Este valores. Se pueden utilizar otros refractómetros de igual o mayor
procedimiento requiere la demostración de la retención microbiana precisión.
402 h841i Peso Especı́fico / Pruebas Fı́sicas USP 30
Para lograr la exactitud teórica de +0,0001, es necesario calibrar La introducción de dos constantes A = c / (4p2 6 V) y B = M / V,
el instrumento contra un estándar suministrado por el fabricante y lleva a la ecuación clásica del transductor oscilante:
comprobar con frecuencia el control de temperatura y la limpieza del
instrumento mediante la determinación de ı́ndice de refracción de r = A 6 T2 – B
agua destilada, cuyos valores son 1,3330 a 208 y 1,3325 a 258.
El peso especı́fico del lı́quido está dado por la fórmula:
r(L) / r(W)
en donde r(L) y r(W) son las densidades del lı́quido y del agua,
respectivamente, ambas determinadas a 258, a menos que se
h841i PESO ESPECÍFICO especifique algo diferente en la monografı́a individual.
INTRODUCCIÓN
MÉTODO II
El área especı́fica superficial de un polvo se determina mediante la
El procedimiento incluye el uso del Densı́metro transductor adsorción fı́sica de un gas sobre la superficie del sólido calculando la
oscilante. El aparato consiste en lo siguiente: cantidad de gas adsorbida que corresponde a una capa monomole-
— un tubo en forma de U, por lo general de vidrio de borosilicato, cular en la superficie. La adsorción fı́sica es el resultado de fuerzas
que contiene el lı́quido que se va a examinar; relativamente débiles (fuerzas de van der Waals) entre las moléculas
— un sistema de excitación magnetoeléctrico o piezoeléctrico que del gas adsorbato y la superficie adsorbente del polvo de prueba.
hace oscilar al tubo como un oscilador en voladizo a una Generalmente, la determinación se lleva a cabo a la temperatura del
frecuencia caracterı́stica que depende de la densidad del lı́quido nitrógeno lı́quido. La cantidad de gas adsorbido puede medirse por
que se va a examinar; un procedimiento volumétrico o de flujo continuo.
— un medio para determinar el perı́odo de oscilación (T), que el
aparato puede convertir para arrojar una lectura directa de
densidad o que puede ser utilizado para calcular densidades a
través de las constantes A y B descritas más adelante; y
— un medio para determinar o controlar la temperatura del
transductor oscilante que contenga el lı́quido que se va a probar.
El perı́odo de oscilación es una función de la constante del resorte
(c) y de la masa del sistema:
TEORÍA DE BRUNAUER, EMMETT Y TELLER Es necesario un mı́nimo de tres datos. Se pueden llevar a cabo
(BET) Y DETERMINACIÓN DE ÁREA mediciones adicionales, especialmente cuando falta linealidad a un
valor P/Po cercano a 0,3. Como la no linealidad se obtiene a menudo
ESPECÍFICA con valores P/Po por debajo de 0,05, no se recomiendan los valores
en esta región. La prueba de linealidad, el tratamiento de los datos y
Medición de Múltiples Puntos el cálculo del área especı́fica superficial de la muestra se han descrito
anteriormente.
Los datos se tratan según la ecuación de la isoterma de adsorción
de Brunauer, Emmett y Teller (BET):
Medición con un Único Punto
Normalmente se necesitan como mı́nimo tres mediciones de Va,
cada una a distintos valores de P/Po, para determinar el área
especı́fica superficial mediante la técnica de la adsorción de gas por
flujo dinámico (Método I) o mediante la técnica volumétrica de
adsorción de gas (Método II). Sin embargo, bajo ciertas circuns-
tancias que se describen a continuación, puede ser aceptable
determinar el área especı́fica superficial de un polvo con un único
P = presión parcial de vapor de gas adsorbato en valor de Va medido a un único valor de P/Po como por ejemplo 0,300
equilibrio con la superficie a 77,4 K (punto de (correspondiente a 0,300 moles de nitrógeno o a una fracción molar
ebullición del nitrógeno lı́quido), en Pa, de criptón de 0,001038), empleando la siguiente ecuación para
Po = presión de saturación del gas adsorbato, en Pa; calcular Vm :
Va = volumen de gas adsorbido a temperatura y presión
estándar (STP, por sus siglas en inglés) [273,15 K y
presión atmosférica de (1,013 6 105 Pa)], en mL;
Vm = volumen de gas adsorbido a STP que produce una
monocapa aparente en la superficie de la muestra, en
mL;
C = una constante adimensionada relacionada con la
entalpı́a de adsorción del gas adsorbato sobre la
muestra de polvo. Luego se calcula el área especı́fica superficial a partir del valor de
Vm con la ecuación (2) antedicha.
El método de un único punto puede emplearse directamente para
Se mide un valor de Va en cada uno de no menos de tres valores de una serie de muestras de polvo de un material dado cuando la
P/Po. constante del material C es mucho mayor que la unidad. Estas
Luego, el valor BET circunstancias pueden verificarse por comparación de los valores de
área especı́fica determinados por el método de un único punto con
los valores determinados por el método de puntos múltiples para una
serie de muestras de polvo. La semejanza estrecha entre los valores
obtenidos con un único punto y con múltiples puntos sugiere que 1/
C se aproxima a cero.
El método de un solo punto puede emplearse indirectamente para
una serie de muestras de polvo similares de un material dado cuando
la constante del material C no es infinita, pero se puede suponer que
se grafica en función de P/Po, conforme a la ecuación (1). Este no varı́a. En estas circunstancias, el error asociado al método de un
gráfico debe producir una lı́nea recta en el intervalo de presión único punto puede reducirse o eliminarse empleando el método de
relativo aproximado de 0,05 a 0,3. Los datos se consideran puntos múltiples para evaluar C para una de las muestras de las serie
aceptables si el coeficiente de correlación, r, de la regresión lineal a partir del gráfico de BET, en el cual C se calcula como (1 +
no es menor de 0,9975; es decir, r2 no es menor de 0,995. A partir de pendiente /intersección). Lugo se calcula Vm a partir del valor único
la gráfica lineal resultante, la pendiente, que es igual a (C – 1)/VmC y de Va medido a un único valor de P/Po, por la ecuación:
la intersección, que es igual a 1/VmC, se evalúan por análisis de
regresión lineal. A partir de estos valores, Vm se calcula como 1/
(pendiente + intersección), mientras que C se calcula como
(pendiente/intersección) + 1. A partir del valor de Vm ası́ determinado
se calcula el área especı́fica, S, en m2 g–1, por la ecuación:
TÉCNICAS EXPERIMENTALES
N = constante de Avogadro (6,023 6 1023 mol–1),
a = área efectiva de sección transversal de una Esta sección describe los métodos que se utilizan para la
molécula de adsorbato, en nanometros cuadrados preparación de la muestra, la técnica de adsorción de gas por flujo
(0,162 nm2 para el nitrógeno y 0,195 nm2 para el dinámico (Método I) y la técnica volumétrica de adsorción de gas
criptón), (Método II).
m = masa de polvo de prueba, en g
22 400 = volumen, en mL, ocupado por 1 mol de gas
adsorbato a STP, admitiendo pequeñas desvia-
ciones del estado ideal.
404 h846i Área Especı́fica Superficial / Pruebas Fı́sicas USP 30
DESGASIFICACIÓN PRINCIPIO
Antes de determinar el área especı́fica superficial de la muestra, es En el método de flujo dinámico (ver Figura 1), el gas adsorbato
necesario eliminar los gases y vapores adsorbidos fı́sicamente en la recomendado es criptón o nitrógeno secos, mientras que se emplea
superficie después de la fabricación y durante el tratamiento, helio como gas diluyente, el cual no se adsorbe bajo las condiciones
manipulación y almacenamiento. Si no se logra la desgasificación, recomendadas.
el área especı́fica superficial podrı́a reducirse o variar, puesto que Se requiere un mı́nimo de tres mezclas del gas adsorbato
parte de la superficie estarı́a cubierta con moléculas de los gases o apropiado con helio dentro de un intervalo de P/Po entre 0,05 y 0,30.
vapores previamente adsorbidos. Las condiciones de desgasificación El detector de gas-integrador debe proporcionar una señal que sea
son de vital importancia para obtener la precisión y la exactitud aproximadamente proporcional al volumen de gas que lo atraviesa
requeridas de las mediciones de área especı́fica de sustancias en condiciones definidas de presión y temperatura. Con este fin,
farmacéuticas debido a la sensibilidad de la superficie de los entre los distintos tipos de dispositivos adecuados se cuenta un
materiales. detector de conductividad térmica con un integrador electrónico. Se
Se debe demostrar que las condiciones de desgasificación determina un mı́nimo de tres puntos dentro del intervalo recomen-
proporcionan gráficos BET reproducibles, un peso constante de dado de 0,05 a 0,30 de P/Po.
polvo de prueba y ningún cambio fı́sico o quı́mico detectable en el
polvo de prueba.
Las condiciones de desgasificación definidas por la temperatura, la PROCEDIMIENTO
presión y el tiempo deben elegirse de tal modo que la superficie
original del sólido se reproduzca lo más posible. Con frecuencia, la Se hace pasar una mezcla conocida de gases, por lo general
desgasificación de muchas sustancias se logra mediante la aplicación nitrógeno y helio, a través de una celda de conductividad térmica,
de vacı́o o purgando la muestra en una corriente de un gas no nuevamente a través de la muestra, a través de la celda de
reactivo, seco o aplicando un método de ciclos de desorción y conductividad térmica y posteriormente hasta un potenciómetro
adsorción. En cualquiera de los casos, algunas veces se aplican registrador.
temperaturas elevadas para aumentar la velocidad de eliminación de La celda de muestra se sumerge en nitrógeno lı́quido y la muestra
los contaminantes desde la superficie. Se debe tener cuidado cuando adsorbe nitrógeno de la fase móvil. Esto desequilibra la celda de
se desgasifiquen muestras de polvo con temperaturas elevadas, con conductividad térmica y se genera un pulso en la gráfica del
el fin de evitar la degradación de la muestra. registrador.
Si se emplea calor, la temperatura y el tiempo de desgasificación Se retira la muestra del refrigerante; esto proporciona un pico de
recomendados son tan bajos como sea posible para lograr desorción igual en área y en dirección opuesta al pico de adsorción.
mediciones de área especı́fica superficial reproducibles dentro de Debido a que éste está mejor definido que el pico de adsorción, es el
un plazo aceptable. Para desgasificar muestras sensibles, se pueden que se emplea para la determinación.
emplear otros métodos de desgasificación, tal como el método de los Para efectuar la calibración, se inyecta en el sistema una cantidad
ciclos de desorción y adsorción. conocida de adsorbato, suficiente para proporcionar un pico de
magnitud similar al pico de desorción y se obtiene la proporción de
volumen de gas por unidad de área de pico.
ADSORBATO Para una determinación en un único punto se emplea una mezcla
de nitrógeno y helio; y para la determinación de puntos múltiples se
La técnica estándar es la adsorción de nitrógeno de calidad usan varias mezclas similares o mezclas previas de dos corrientes de
analı́tica a la temperatura del nitrógeno lı́quido. gas.
Para polvos de área especı́fica superficial pequeña (5 0,2 m2g–1), Los cálculos son los mismos que en el método volumétrico.
la proporción adsorbida es pequeña. En tales casos, se prefiere usar
criptón a la temperatura del nitrógeno lı́quido porque su baja presión
de vapor reduce el error en gran medida. El uso de cantidades Método II: Método Volumétrico
mayores de muestra, cuando fuera posible (equivalentes a áreas
totales de 1 m2 o mayores empleando nitrógeno), pueden compensar
los errores para determinar áreas pequeñas.
Todos los gases empleados deben estar exentos de humedad. PRINCIPIO
Mediciones
PROCEDIMIENTO
Como la cantidad de gas adsorbido a una presión dada tiende a
aumentar cuando disminuye la temperatura, las mediciones de Colocar una cantidad pequeña de nitrógeno seco en el tubo de la
adsorción por lo general se realizan a temperaturas bajas. Las muestra para evitar la contaminación de la superficie limpia, retirar el
mediciones se realizan a 77,4 K, el punto de ebullición del nitrógeno tubo de la muestra, taparlo y pesarlo, y calcular el peso de la muestra.
lı́quido. Conectar el tubo de la muestra al aparato volumétrico. Cuidadosa-
mente aplicar vacı́o sobre la muestra a la presión especificada (por
ejemplo, entre 2 Pa y 10 Pa). Alternativamente, algunos instrumen-
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h846i Área Especı́fica Superficial 405
Figura 1. Diagrama esquemático del aparato para el método por flujo dinámico.
determinación del peso molecular requiere una medida precisa de la lo general se deben realizar correcciones por causa de las diferencias
diferencia de ı́ndice de refracción entre la solución y el solvente [(n – de los valores de las celdas. En tales casos, se llenan pares de celdas
n0)/c], se necesita un segundo instrumento, un refractómetro con el disolvente seleccionado y se determina la diferencia en sus
diferencial, para medir esta pequeña diferencia. absorbancias a la longitud de onda seleccionada. La celda que
Los espectrómetros Raman incluyen los siguientes componentes presenta una mayor absorbancia se emplea para la solución de la
principales: una fuente de radiación monocromática intensa muestra de prueba y la absorbancia medida se corrige restando la
(invariablemente un rayo láser); un sistema óptico para recoger la diferencia entre las celdas.
luz dispersada por la muestra de prueba; un monocromador (doble) Esta corrección no es necesaria cuando se usa un sistema IR por
para disipar la luz dispersada y rechazar la frecuencia incidente transformada de Fourier computarizado, ya que la misma celda
intensa; y un sistema apropiado para la detección y amplificación de puede emplearse tanto para el blanco de disolvente como para la
luz. La medición Raman es sencilla ya que la mayor parte de las solución de prueba. Sin embargo, es necesario asegurarse de que las
muestras se examinan directamente en capilares para punto de propiedades de transmisión de la celda sean constantes.
fusión. Debido a que la fuente láser puede concentrarse en un punto, Una muestra de prueba se podrá comparar mejor con un Estándar
se necesitan solamente unos pocos microlitros de muestra. de Referencia en un pico de absorción espectral para el compuesto
relevante. Las valoraciones que prescriben el uso de espectrofoto-
metrı́a proporcionan la longitud de onda comúnmente aceptada para
PROCEDIMIENTO los picos de absorción espectral de la sustancia en cuestión. Se sabe
que diferentes espectrofotómetros pueden mostrar una variación
Espectrofotometrı́a de Absorción pequeña en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas
prácticas requieren que las comparaciones se lleven a cabo a la
Los fabricantes proporcionan instrucciones detalladas para operar longitud de onda en la que ocurra un pico de absorción. Si esto
los espectrofotómetros. Para lograr resultados significativos y difiriere en más de +1 nm de la longitud de onda especificada en la
válidos, el operador de un espectrofotómetro debe conocer los monografı́a individual, se puede requerir la recalibración del
lı́mites de éste y las fuentes potenciales de error y variación. El instrumento.
manual de instrucciones debe seguirse con suma atención en lo que
se refiere al cuidado, limpieza y calibración del instrumento y las
técnicas de manipulación de las celdas de absorción, ası́ como PREPARACIÓN DE PRUEBA
también las instrucciones para la operación. Se debe poner un énfasis
especial en los siguientes puntos. En las determinaciones que utilizan espectrofotometrı́a UV o
Controlar la exactitud de la calibración del instrumento. Cuando visible, la muestra usualmente se disuelve en un disolvente. A menos
se emplee una fuente de energı́a radiante continua, se debe prestar que se indique otra cosa en la monografı́a, las determinaciones se
atención tanto a la longitud de onda como a la escala fotométrica; en hacen a temperatura ambiente empleando una longitud de paso de 1
el caso de que se emplee una fuente con una lı́nea espectral, sólo se cm. Hay muchos disolventes apropiados para estos intervalos,
necesitará controlar la escala fotométrica. Hay varias fuentes de incluyendo agua, alcoholes, cloroformo, hidrocarburos de cadena
energı́a radiante que tienen lı́neas espectrales de intensidad corta, éteres y soluciones diluidas de ácidos y álcalis fuertes. Se
adecuada, espaciadas apropiadamente en todo el intervalo espectral deben tomar precauciones para utilizar disolventes libres de
seleccionado. La mejor fuente de espectros de calibración de UV y contaminantes que absorban en la región espectral que se utiliza.
visible es el arco de cuarzo-mercurio, del cual pueden emplearse las Por lo general, es aconsejable emplear como disolvente metanol o
lı́neas a 253,7; 302,25; 313,16; 334,15; 365,48; 404,66 y 435,83 nm. alcohol libre de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adición
El arco de vidrio-mercurio es igualmente útil por encima de 300 nm. de metanol pero que no contenga benceno u otras impurezas que
También se pueden emplear las lı́neas a 486,13 nm y 656,28 nm de interfieran con la prueba. Existen en el comercio disolventes de
una lámpara de descarga de hidrógeno. La escala de longitud de calidad espectrofotométrica especial que garantizan la ausencia de
onda puede calibrarse también a través de filtros de vidrio contaminantes. Otros disolventes orgánicos de grado reactivo
apropiados, que tengan bandas de absorción útiles a través de las analı́tico pueden contener trazas de impurezas que tienen alto
regiones visible y UV. Se han empleado ampliamente vidrios grado de absorción en la región UV. Deberá verificarse la
estándar que contienen didimio (una mezcla de praseodimio y transparencia de lotes nuevos de estos disolventes y se debe tener
neodimio), a pesar de que los vidrios que contienen holmio se cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparación de la
consideran superiores. Recientemente, la solución de óxido de solución de prueba, la solución estándar y el blanco.
holmio estándar ha reemplazado el empleo del vidrio con holmio.1 Ningún disolvente con un espesor apreciable es completamente
Las escalas de longitud de onda de los espectrofotómetros IR e IR transparente en todo el espectro IR cercano e IR. El tetracloruro de
cercano se controlan fácilmente mediante el uso de bandas de carbono (hasta 5 mm de espesor) es prácticamente transparente a 6
absorción proporcionadas por pelı́culas de poliestireno, dióxido de mm (1666 cm–1). El disulfuro de carbono (1 mm de espesor) es
carbono, vapor de agua o amonı́aco gaseoso. adecuado como disolvente a 40 mm (250 cm–1) con la excepción de la
Para verificar la escala fotométrica se encuentran disponibles región de 4,2 mm a 5,0-mm (2381 cm–1 a 2000 cm–1) y de la región de
diferentes filtros de vidrio inorgánico estándar, ası́ como soluciones 5,5 mm a 7,5 mm (1819 cm–1 a 1333 cm–1), donde presenta una fuerte
estándar de transmitancias conocidas, como por ejemplo el absorción. Otros disolventes tienen regiones relativamente estrechas
dicromato de potasio.2 de transparencia. Otra condición adicional para que un disolvente se
Por lo general, las mediciones cuantitativas de absorbancias se considere apropiado para espectrofotometrı́a IR es que no debe
realizan en soluciones de la sustancia colocadas en celdas para afectar el material del que está hecha la celda (generalmente cloruro
contener lı́quidos. Como el disolvente y la ventana de la celda de sodio). La muestra de prueba también se puede preparar
absorben luz, debe hacerse un ajuste para compensar esta dispersando en aceite mineral la muestra sólida reducida a polvo
contribución a la absorbancia medida. Comercialmente se pueden fino o mezclándola muy bien con una sal de haluro alcalino
obtener celdas iguales para comparación para espectrofotometrı́a UV previamente secada (por lo general bromuro de potasio). Las
y visible, para las cuales no se necesita ninguna corrección de celda. mezclas con sales de haluros alcalinos pueden examinarse
Sin embargo, en los procedimientos con espectrofotometrı́a IR, por directamente o como discos transparentes o perlas obtenidos
1
National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg, MD mediante la compresión de dichas mezclas en una matriz. Las
20899: ‘‘Spectral Transmittance Characteristics of Holmium Oxide in condiciones de secado tı́picas para el bromuro de potasio son 1058 al
Perchloric Acid,’’ J. Res. Natl. Bur. Stds. 90, No. 2; 115 (1985). Se debe vacı́o durante 12 horas, aunque existen grados comercialmente
verificar el rendimiento de un filtro no certificado por comparación con un disponibles que no requieren secado. Es preferible la microscopı́a de
estándar certificado. infrarrojo o una dispersión en aceite mineral cuando haya una
2
Para más detalles referentes a la verificación de la escala fotométrica de un desproporción entre el haluro alcalino y la muestra de prueba. En el
espectrofotómetro, consultar las siguientes publicaciones del NIST: J. Res. caso de materiales adecuados, la muestra de prueba se puede
Nalt. Bur. Stds. 76A, 469 (1972) [re: SRM 93l, ‘‘Liquid Absorbance preparar pura como una muestra delgada para microscopı́a IR o
Standards for UV and Visible Spectrophotometry’’ y también la información puede suspenderse pura como una pelı́cula delgada para dispersión
referente a los patrones de cromato de potasio y dicromato de potasio]; NIST en aceite mineral. La mayorı́a de los disolventes más comunes son
Spec. Publ. 260–116 (1994) [re: SRM 930 and SRM 1930, ‘‘Glass Filters for
Spectrophotometry’’. apropiados para la espectrometrı́a Raman, en la cual pueden
410 h851i Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz / Pruebas Fı́sicas USP 30
emplearse celdas normales de vidrio (no fluorescente). La región IR dad, a, y el espesor de la celda, b, son iguales; entonces, las dos
del espectro electromagnético se extiende desde 0,8 hasta 400 mm. ecuaciones pueden combinarse y volver a enunciarse para hallar el
La región de 800 a 2500 nm (0,8 a 2,5mm) se considera valor de CU:
generalmente como la región IR cercano (NIR, por sus siglas en
inglés); la región de 2,5 a 25 mm, (4000 a 400 cm–1) se considera (3) CU = CS(AU / AS)
generalmente como la región intermedia (mid-IR, por sus siglas en
inglés); y la región de 25 a 400 mm es considerada la región de IR La cantidad de la muestra de prueba sólida que se debe tomar para
lejano (FIR, por sus siglas en inglés). A menos que se indique otra el análisis se especifica generalmente en mg. En la valoración se
cosa en la monografı́a individual, se debe utilizar la región de 3800 a proporcionan instrucciones para la dilución y, como se utilizan
650 cm–1 (2,6 a 15 mm) para asegurar el cumplimiento con las soluciones diluidas para las mediciones de absorbancia, por lo
especificaciones de la monografı́a para absorción IR. general las concentraciones se expresan por conveniencia en
Cuando se proporcionan los valores de los picos del espectro IR unidades de mg por mL. Si se toma una cantidad, en mg, de una
en una monografı́a individual, las letras s, m y w significan absorción muestra de prueba de un fármaco o una forma farmacéutica sólida
fuerte, mediana y débil, respectivamente; sh significa un hombro, bd para su análisis, se entiende que un volumen (VU), en L, de una
significa una banda y v significa "muy". Los valores pueden variar solución de concentración CU se puede preparar a partir de la
tanto como 0,1 mm o 10 cm–1, según el instrumento especı́fico cantidad de muestra de prueba que contiene una cantidad WU, en mg,
empleado. El polimorfismo aumenta las variaciones en los espectros del fármaco [NOTA—CU es numéricamente igual, ya sea que se
IR de muchos compuestos en estado sólido. En consecuencia, exprese como mg por mL o mg por L], de manera que:
cuando se realicen pruebas de absorción IR, si aparece una diferencia
en los espectros IR del analito y del estándar, disolver en volúmenes (4) WU = VUCU
iguales de un disolvente apropiado porciones iguales de la sustancia
en análisis y del estándar, evaporar las soluciones hasta sequedad en La forma en la cual la fórmula aparece en la valoración en una
envases similares bajo condiciones idénticas y repetir la prueba con monografı́a para un artı́culo sólido se puede derivar mediante la
los residuos. sustitución de CU de la ecuación (3) en la ecuación (4). En resumen,
En la espectroscopı́a NIR la mayor parte del interés actual esta el uso de la ecuación (4), considerando debidamente cualquier
centrado en la facilidad del análisis. Se pueden analizar muestras en conversión de unidades necesaria para lograr la igualdad en la
polvo o, mediante técnicas de reflectancia, con poca o ninguna ecuación (5), permite calcular el factor constante (VU) que figura en
preparación. El cumplimiento de las especificaciones internas del la fórmula final:
laboratorio puede determinarse mediante una comparación compu-
tarizada de los espectros previamente obtenidos a partir de materiales (5) WU = VUCS(AU / AS)
de referencia. Muchos de los materiales farmacéuticos muestran
poca absortividad en esta región del espectro, lo que permite que la La misma derivación se aplica a las fórmulas que aparecen en las
radiación del IR cercano incidente penetre las muestras más monografı́as para artı́culos lı́quidos que son valorados por
profundamente que la radiación UV, visible o IR. La espectrofoto- espectrofotometrı́a de absorción. Para formas farmacéuticas lı́quidas,
metrı́a NIR se puede emplear para observar modificaciones en las los resultados de los cálculos se expresan, en general, en función de
matrices y con una calibración apropiada se puede usar en análisis la cantidad, en mg, de fármaco en cada mL del artı́culo. Por lo tanto
cuantitativos. es necesario incluir en el denominador un término adicional, el
En la espectrofotometrı́a de absorción atómica se debe prestar volumen (V), en mL, de la preparación de prueba tomada.
especial atención a la naturaleza del disolvente y la concentración de Las valoraciones en la región visible requieren generalmente la
sólidos. Un disolvente ideal es aquel que interfiere en grado mı́nimo comparación concomitante entre la absorbancia producida por la
en la absorción o en los procesos de emisión y que produce átomos Preparación de valoración y la producida por una Preparación
neutros en la llama. Si hay una diferencia significativa entre la
tensión en la superficie o la viscosidad de la solución de prueba y la estándar que contiene aproximadamente una cantidad igual de un
solución estándar, las soluciones se aspiran o atomizan a velocidades Estándar de Referencia USP. En algunas situaciones, se admite la
diferentes, lo que causa diferencias significativas en las señales omisión del uso de un Estándar de Referencia. Esto es ası́ en el caso
generadas. La concentración de ácidos de las soluciones también de valoraciones espectrofotométricas con frecuencia rutinaria y
afecta a los procesos de absorción. Ası́, los disolventes empleados en cuando se dispone de una curva estándar apropiada, preparada con el
la preparación de la muestra de prueba y el estándar deben ser los Estándar de Referencia USP respectivo y cuando la sustancia
analizada se ajusta a la ley de Beer dentro de un intervalo de
mismos, o tan parecidos como sea posible, y deben producir aproximadamente entre 75% y 125% de la concentración final usada
soluciones que se aspiren fácilmente a través del tubo de muestra del en la valoración. En estas circunstancias, la absorbancia determinada
mechero-aspirador. Dado que los sólidos no disueltos presentes en en la valoración se puede interpolar en la curva estándar y el
las soluciones pueden producir interferencias de matriz o de resultado de la valoración se calcula a partir de esa interpolación.
volumen, el contenido total de los sólidos no disueltos en todas las Tales curvas estándar deben confirmarse con frecuencia y cada vez
soluciones debe mantenerse, en lo posible, debajo de 2%. que se emplee un espectrofotómetro nuevo o lotes nuevos de
reactivos.
En las valoraciones espectrofotométricas que indican la prepara-
CÁLCULOS ción y uso de una curva estándar, es permisible y preferible, cuando
la valoración se realiza con poca frecuencia, no emplear la curva
Por lo general, la aplicación de la espectrofotometrı́a de absorción estándar y hacer la comparación directamente en función de una
en una valoración o una prueba requiere el uso de un Estándar de cantidad de Estándar de Referencia aproximadamente igual a la
Referencia. Cuando tal medición se especifica en una valoración, se cantidad de muestra tomada y que ha sido tratada de manera similar.
proporciona una fórmula para permitir el cálculo del resultado
deseado. Con frecuencia, se incluye en la fórmula una constante
numérica. La siguiente derivación se proporciona para introducir un
enfoque lógico a la deducción de las constantes que aparecen en las Espectrofotometrı́a de Fluorescencia
fórmulas en las valoraciones de muchas monografı́as. La medición de la fluorescencia es una técnica analı́tica útil. La
La ley de Beer es válida para las soluciones tanto del Estándar de fluorescencia es la luz emitida por una sustancia en estado excitado
Referencia (S) como de la muestra de prueba (U): que se ha alcanzado mediante la absorción de energı́a radiante. Se
(1) AS = abCS dice que una sustancia es fluorescente si puede emitir fluorescencia.
(2) AU = abCU Muchos compuestos se pueden valorar mediante procedimientos que
se basan en su fluorescencia inherente o la fluorescencia de
en donde AS es la absorbancia de la Solución estándar de derivados adecuados.
concentración CS; y AU es la absorbancia de la solución de la Las muestras de prueba preparadas para espectrofotometrı́a de
muestra de prueba de concentración CU. Si CS y CU se expresan en las fluorescencia por lo general están de un décimo a un centésimo más
mismas unidades y las absorbancias de ambas soluciones se miden concentradas que las que se emplean en espectrofotometrı́a de
en celdas iguales que tienen las mismas dimensiones, la absortivi-
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h861i Suturas—Diámetro 411
absorción, por los motivos que se indican a continuación. En las dispersada directa y la medida de la luz transmitida. La ventaja de
aplicaciones analı́ticas, es preferible que la señal de fluorescencia emplear un sistema de turbidimetrı́a de relación es que la medida de
esté relacionada linealmente con la concentración; pero si una la luz perdida es inapreciable.
muestra de prueba estuviera demasiado concentrada, una parte En la práctica, es aconsejable asegurarse de que la sedimentación
significativa de la luz entrante será absorbida por la muestra más de las partı́culas que serán medidas sea inapreciable. Generalmente
próxima a la superficie de la celda y la luz que llega al centro se esto se logra incluyendo un coloide protector en el medio de
reduce. Es decir, la misma muestra actúa como un ‘‘filtro interno’’. suspensión lı́quido. Es importante que los resultados sean inter-
Sin embargo, la espectrofotometrı́a de fluorescencia es intrı́nsica- pretados mediante comparación de lecturas con las de un material en
mente una técnica de alta sensibilidad y, con frecuencia, se emplean suspensión de concentración conocida, producidas exactamente bajo
concentraciones de 10–5 M a 10–7 M. Para cualquier procedimiento las mismas condiciones.
analı́tico, es necesario realizar una curva de trabajo de intensidad de La turbidimetrı́a o nefelometrı́a puede ser útil para la medición de
fluorescencia en función de la concentración para establecer una precipitados formados por la interacción de soluciones altamente
relación lineal. Todas las lecturas deben corregirse para un blanco de diluidas de reactivos u otras partı́culas, como por ejemplo
disolvente. suspensiones de células bacterianas. Para que puedan lograrse
Las mediciones de fluorescencia son sensibles a la presencia de resultados consistentes, todas las variables deben controlarse
polvo y otras partı́culas sólidas en la muestra de prueba. Tales cuidadosamente. En los casos en los que dicho control sea posible,
impurezas pueden reducir la intensidad del haz de excitación o se pueden medir suspensiones sumamente diluidas.
proporcionar lecturas erróneamente altas debido a los reflejos La muestra se disuelve en el disolvente a varias concentraciones
múltiples en la celda de la muestra. Por lo tanto, es conveniente diferentes conocidas con exactitud, la elección de las concentra-
eliminar las partı́culas sólidas mediante centrifugación; también se ciones depende del peso molecular del soluto y varı́a desde 1% para
puede emplear la filtración, aunque algunos papeles de filtro Mw = 10 000 a 0,01% para Mw = 1 000 000. Cada solución debe
contienen impurezas fluorescentes. limpiarse muy cuidadosamente antes de la medición mediante
A menudo, la regulación de la temperatura es importante en la filtración repetida a través de filtros finos. Una partı́cula de polvo en
espectrofotometrı́a de fluorescencia. Para algunas sustancias, la la solución vicia la intensidad de la luz dispersada medida Un criterio
eficiencia de la fluorescencia puede reducirse hasta entre 1% y 2% para una solución transparente es que la disimetrı́a, la relación de
por grado de ascenso de temperatura. En tales casos, si se desea intensidad dispersada a 458/1358, haya alcanzado un mı́nimo.
mayor precisión, es conveniente el uso de celdas para muestra con Se miden la turbidez y el ı́ndice de refracción de las soluciones. A
temperatura controlada. Para los análisis de rutina, pueden ser partir de la ecuación general de dispersión de luz a 908, se traza un
suficiente realizar las mediciones con la rapidez necesaria como para gráfico de HC/t en función de C y se extrapola a dilución infinita y
que la muestra no se caliente demasiado debido a la exposición a la se calcula el peso molecular promedio, M, a partir de la intersección,
fuente de iluminación intensa. Muchos compuestos fluorescentes son 1/ M.
fotosensibles. Expuestos en un fluorómetro, pueden ser fotodegra-
dados en productos más o menos fluorescentes. Dichos efectos
pueden detectarse a través de la observación de la respuesta del Comparación Visual
detector en relación al tiempo y pueden reducirse atenuando la fuente
de iluminación con filtros o pantallas. Cuando se indica una comparación de color o una comparación de
Los cambios de disolvente pueden afectar notablemente la turbidez, deben utilizarse tubos de comparación de color que sean
intensidad y distribución espectral de la fluorescencia. Por lo tanto, tan idénticos como sea posible en diámetro interno y en cualquier
no es aconsejable alterar el disolvente especificado en los métodos otra caracterı́stica. Para la comparación de color, los tubos deben
establecidos sin una cuidadosa investigación preliminar. Muchos observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con la ayuda de una
compuestos son fluorescentes en disolventes orgánicos pero fuente de iluminación dirigida desde debajo de la parte inferior de los
prácticamente no son fluorescentes en agua; por lo tanto, se deben tubos, mientras que para la comparación de turbidez los tubos deben
probar varios disolventes antes de que se decida si un compuesto es observarse horizontalmente, contra a un fondo oscuro, con la ayuda
o no fluorescente. En muchos disolventes orgánicos, la intensidad de de una fuente de iluminación lateral.
la fluorescencia aumenta mediante la eliminación del oxı́geno Al realizar pruebas de lı́mites que incluyan una comparación de
disuelto, que ejerce un fuerte efecto de extinción. El oxı́geno puede color en dos recipientes iguales (por ejemplo, tubos de comparación
eliminarse mediante burbujeo de un gas inerte, como por ejemplo de color iguales), podrá utilizarse un instrumento apropiado, en lugar
nitrógeno o helio, a través de la muestra de prueba. de realizar una observación visual directa.
Una medida semicuantitativa de la fuerza de la fluorescencia esta
dada por el cociente entre la intensidad de fluorescencia de una
muestra de prueba y la de un estándar obtenido con los mismos
parámetros de ajuste de los instrumentos. Frecuentemente, se emplea
como estándar de referencia una solución de concentración conocida
de quinina en ácido sulfúrico 0,1 N o de fluoresceı́na en hidróxido de
sodio 0,1 N. h861i SUTURAS—DIÁMETRO
Dispersión de Luz
El calibrador para determinar el diámetro de las suturas es del tipo
La turbidez puede medirse con un espectrofotómetro o un de peso muerto, mecánico o eléctrico, y está equipado con un dial de
fotómetro de filtro fotoeléctrico estándar, preferentemente con lectura directa, un visor digital o una impresora. Emplear un
iluminación en la porción azul del espectro. Las mediciones calibrador graduado a 0,002 mm o un calibrador más pequeño. El
nefelométricas requieren un instrumento con una fotocélula situada yunque del calibrador tiene aproximadamente 50 mm de diámetro y
para recibir la luz dispersada en lugar de la luz transmitida; esta el pie compresor es de 12,70 + 0,02 mm de diámetro. El pie
geometrı́a se aplica también a los fluorómetros, de manera que, en compresor y las partes móviles conectadas a éste se gradúan de
general, los fluorómetros pueden emplearse como nefelómetros, manera que se aplique una carga total de 210 + 3 g a la muestra. Las
mediante la selección de filtros adecuados. Un turbidı́metro de superficies del pie compresor y del yunque son planas, con
relación combina la tecnologı́a de la nefelometrı́a a 908 y la de la desviaciones no mayores de 0,005 mm, y paralelas entre sı́ con
turbidimetrı́a: contiene fotocélulas que reciben y miden la luz una aproximación de 0,005 mm. Para medir el diámetro de las
dispersada a un ángulo de 908 de la muestra ası́ como también suturas de 0,4 y menor tamaño métrico, retirar el peso adicional del
reciben y miden la dispersión directa frente a la muestra; también pie compresor para que la carga total sobre la sutura no exceda de
mide la luz transmitida directamente a través de la muestra. La 60 g.
linealidad se obtiene al calcular la relación entre la medición de la Sutura Quirúrgica Absorbible de Colágeno—Determinar el
luz dispersada a un ángulo de 908 y la suma de la medida de la luz diámetro inmediatamente después de haberla retirado del envase
primario y sin estirarla. Colocar el hilo a través del centro del yunque
y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso
412 h871i Suturas—Sujeción de Agujas / Pruebas Fı́sicas USP 30
Los parámetros de fusión (intervalo de fusión, Hf y la pureza impureza eutéctica total, la cual, cuando se multiplica por 100 da el
eutéctica calculada) se obtienen fácilmente a partir del termograma porcentaje molar de impurezas eutécticas totales.
de un solo evento de fusión empleando una muestra de prueba Las desviaciones del gráfico lineal teórico también pueden ser
pequeña y el método no requiere mediciones múltiples de producto de la formación de soluciones sólidas (K 6¼ 0), por lo tanto
temperatura reales y precisas. Las unidades del termograma se se debe prestar atención al interpretar estos datos.
convierten directamente a transferencia de calor, en milicalorı́as por Para observar el efecto lineal de la concentración de impurezas
segundo. sobre la disminución del punto de fusión, la impureza debe ser
El descenso del punto de congelación en soluciones diluidas por soluble en la fase lı́quida o la fase fundida del compuesto, pero
moléculas de tamaño casi igual se expresa mediante la ecuación de insoluble en la fase sólida, es decir, no se forma ninguna solución
van’t Hoff modificada: sólida. Para que se produzca la solubilidad en el material fundido son
necesarias algunas semejanzas quı́micas. Por ejemplo, la presencia
de compuestos iónicos en compuestos orgánicos neutros y la
descomposición térmica quizá no se reflejen en las estimaciones de
pureza. El alcance de estas limitaciones teóricas se ha estudiado sólo
en forma parcial.
Las impurezas presentes provenientes de la ruta sintética a
menudo son similares al producto final, en consecuencia no hay
generalmente ningún problema de solubilidad en el material fundido.
en donde T = temperatura absoluta en grados Kelvin (8K), X2 = Las impurezas compuestas por moléculas de igual forma, tamaño y
fracción molar del componente menor (soluto; impureza), Hf = carácter que las del componente principal pueden acomodarse en la
calor molar de fusión del componente principal, R = constante de matriz del componente principal sin modificar la retı́cula, formando
gases y K = cociente de distribución del soluto entre la fase sólida y soluciones sólidas o inclusiones; tales impurezas no son detectables
la fase lı́quida. por DSC. En tales casos, las estimaciones de pureza son demasiado
Asumiendo que el intervalo de temperatura es pequeño y que no altas. Esto es más común con cristales menos ordenados, según lo
se forman sólidos en solución (K = 0), la integración de la ecuación indican los valores bajos de calor de fusión.
de van’t Hoff proporciona la siguiente relación entre la fracción Los niveles de impurezas calculados a partir de los termogramas
molar de la impureza y la disminución del punto de fusión: son reproducibles y probablemente confiables con una aproximación
de 0,1% para compuestos ideales. Las determinaciones del punto de
fusión mediante calorimetrı́a de barrido tienen una reproducibilidad
con una desviación estándar de aproximadamente 0,28. La calibra-
ción contra estándares puede permitir alrededor de 18 de exactitud
para el punto de fusión, por lo tanto esta técnica es comparable a
otros procedimientos.
Los compuestos que existen en forma polimorfa no pueden usarse
en donde To = punto de fusión del compuesto puro, en 8K y Tm = en la determinación de pureza a menos que el compuesto se
punto de fusión de la muestra de prueba, en 8K. convierta completamente a una forma. Por otro lado, la DSC y el
Sin formación de sólidos en la solución, la concentración de la DTA son intrı́nsicamente útiles para detectar y en consecuencia
impureza en la fase lı́quida, a cualquier temperatura durante la realizar el seguimiento del polimorfismo.
fusión, es inversamente proporcional a la fracción fundida a esa Procedimiento—El procedimiento vigente y los cálculos a
temperatura y la disminución del punto de fusión es directamente emplear dependen del instrumento especı́fico usado. Consultar la
proporcional a la fracción molar de la impureza. Un gráfico de la técnica más apropiada para un instrumento dado en la bibliografı́a
temperatura observada de la muestra de prueba, Ts, frente al del fabricante y/o en la bibliografı́a de análisis térmico. De todas
recı́proco de la fracción fundida, 1/ F, a una temperatura Ts, debe formas, es imperativo recordar las limitaciones de formación de
producir una lı́nea recta con una pendiente igual a la disminución del soluciones sólidas, la insolubilidad en el material fundido, el
punto de fusión (To – Tm). El punto de fusión teórico del compuesto polimorfismo y la descomposición durante el análisis.
puro se obtiene mediante extrapolación a 1/ F = 0:
Tabla 1. Aplicación de las Pruebas de Uniformidad de Contenido (UC) y Variación de Peso (VP) para Formas Farmacéuticas
Dosis y Proporción de
Fármaco
25 mg y 525 mg o
25% 525%
Forma Farmacéutica Tipo Subtipo
Tabletas Sin cubierta VP UC
Recubiertas Pelı́cula VP UC
Otras UC UC
Cápsulas Rı́gidas VP UC
Blandas Suspensión, emulsión UC UC
o gel
Soluciones VP VP
Sólidos en envases unitarios Componente VP VP
único
Varios Solución liofilizada en VP VP
componentes envase final
Otros UC UC
Suspensión, emulsión o gel para uso sistémico UC UC
exclusivamente, envasado en envases
unitarios
Soluciones para inhalación envasadas en ampollas VP VP
de vidrio o plástico y destinadas para ser
utilizadas en nebulizadores,
y soluciones orales envasadas en envases
de dosis única y cápsulas blandas
Inhalaciones (que no sean soluciones para UC UC
inhalación envasadas en ampollas de
vidrio o de plástico y destinadas
para ser utilizadas en nebulizadores)
envasadas en unidades de dosificación
prefijadas
Sistemas Transdérmicos UC UC
Supositorios UC UC
Otros UC UC
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h905i Uniformidad de Unidades de Dosificación 417
(3) Si el valor promedio de las unidades de dosificación analizadas cambia con la misma; por lo general, la viscosidad disminuye a
está entre 100 por ciento y el promedio de los lı́mites medida que se eleva la temperatura. Mientras que en la escala
especificados en la definición de potencia de la monografı́a absoluta la viscosidad se mide en poises o centipoises, por
individual, los requisitos son los especificados en el Lı́mite A, conveniencia, se utiliza comúnmente la escala cinemática, en la
excepto que la frase ‘‘cantidad declarada’’ se reemplaza por la cual las unidades son los stokes y los centistokes (1 stoke = 100
frase ‘‘cantidad declarada multiplicada por el valor promedio de centistokes). Para obtener la viscosidad cinemática a partir de la
las unidades de dosificación analizadas (expresado como un viscosidad absoluta, ésta última se divide por la densidad del lı́quido
porcentaje de la cantidad declarada) dividido por 100’’. a la misma temperatura, es decir, viscosidad cinemática =
Sistemas Transdérmicos e Inhalaciones Envasadas en (viscosidad absoluta)/(densidad). Debido al tamaño de las unidades,
Unidades de Dosificación Prefijadas— las viscosidades comprendidas en intervalos normales se expresan
Lı́mite A (si el promedio de los lı́mites especificados en la convenientemente en centistokes. La viscosidad aproximada del éter,
definición de potencia en la monografı́a individual es 100,0 por en centistokes, a temperatura ambiente es 0,2; la del agua es 1; la del
ciento o menor)—A menos que se especifique algo diferente en la queroseno es 2,5; la del aceite mineral está entre 20 y 70; y la de la
monografı́a individual, se cumplen los requisitos de uniformidad de miel es 10 000.
dosificación si la cantidad de fármaco en no menos de 9 de las 10 La viscosidad absoluta se puede medir directamente si se conocen
unidades de dosificación analizadas a partir del método Uniformidad las dimensiones exactas de los instrumentos de medición, pero es
de Contenido (o en el caso de soluciones para inhalación envasadas una práctica más común calibrar el instrumento con un lı́quido de
en ampollas de vidrio o de plástico y destinadas para usarse en viscosidad conocida y determinar la viscosidad del lı́quido
nebulizadores, a partir ya sea del método de Uniformidad de desconocido por comparación con la del lı́quido de viscosidad
Contenido o del método Variación de Peso) está comprendida en el conocida.
intervalo de 85,0% a 115,0% de la cantidad declarada, y ninguna Muchas sustancias, como por ejemplo las gomas que se emplean
unidad está fuera del intervalo de 75,0% a 125,0% de la cantidad en farmacia, tienen viscosidades variables y la mayorı́a de ellas
declarada y la RSD de las 10 unidades de dosificación es menor o ofrecen menor resistencia para fluir a velocidades de flujo altas. En
igual a 6,0%. tales casos, se selecciona un conjunto de condiciones para realizar la
Si 2 ó 3 unidades de dosificación están fuera del intervalo entre medición, y a la medición obtenida se la considera una viscosidad
85,0% y 115,0% de la cantidad declarada pero no fuera del intervalo aparente. Dado que un cambio en las condiciones de medición
de 75,0% a 125,0% de la cantidad declarada, o si la RSD es más de proporcionarı́a un valor diferente de viscosidad aparente para tales
6,0%, o si ambas condiciones prevalecen, analizar 20 unidades sustancias, el operador debe respetar fielmente las dimensiones del
adicionales. Los requisitos se cumplen si no más de 3 unidades de las instrumento y las condiciones de la medición.
30 está fuera del intervalo de 85,0% a 115,0% de la cantidad Medición de la Viscosidad—El método usual para medir la
declarada y ninguna unidad está fuera del intervalo de 75,0% a viscosidad implica la determinación del tiempo necesario para que
125,0% de la cantidad declarada y la RSD de las 30 unidades de un volumen de lı́quido escurra a través de un capilar. Existen muchos
dosificación no excede de 7,8%. viscosı́metros de tubo capilar, pero los viscosı́metros de Ostwald y
Lı́mite B (si el promedio de los lı́mites especificados en la de Ubbelohde se encuentran entre los usados más frecuentemente.
definición de potencia en la monografı́a individual es mayor de La American Society for Testing and Materials (Sociedad Nortea-
100,0 por ciento)— mericana de Pruebas y Materiales, ASTM) ha descrito varios tipos
(1) Si el valor promedio de las unidades de dosificación analizadas de viscosı́metros con sus instrucciones de uso (ASTM, D-445). La
es 100,0 por ciento o menos, los requisitos son los especificados viscosidad de los aceites se expresa en escalas arbitrarias que varı́an
en Lı́mite A. de un paı́s a otro, por lo que existen varios instrumentos que
(2) Si el valor promedio de las unidades de dosificación analizadas corresponden a estas escalas. Los que se utilizan más ampliamente
es mayor o igual al promedio de los lı́mites especificados en la son los siguientes: el de Redwood N8 I y N8 II, el de Engler, el de
definición de potencia en la monografı́a individual, los Saybolt Universal y el de Saybolt Furol. Cada uno de estos
requisitos son los especificados en Lı́mite A, excepto que la instrumentos emplea unidades arbitrarias que llevan el nombre del
frase ‘‘cantidad declarada’’ se reemplaza por la frase ‘‘cantidad instrumento. Para estos instrumentos, se adoptan temperaturas
declarada multiplicada por el promedio de los lı́mites estándar por conveniencia. En el caso de los instrumentos de
especificados en la definición de potencia en la monografı́a Saybolt, las determinaciones se hacen generalmente a 1008F y
individual dividido por 100’’. 2108F; los instrumentos de Redwood se pueden usar a varias
(3) Si el valor promedio de las unidades de dosificación probadas temperaturas hasta un máximo de 2508F; y por lo general, los
está entre 100 por ciento y el promedio de los lı́mites valores que se determinan con el instrumento de Engler se reportan a
especificados en la definición de potencia de la monografı́a 208C y 508C. Un tipo de instrumento particularmente conveniente y
individual, los requisitos son los especificados en el Lı́mite A, rápido es el viscosı́metro rotatorio, que utiliza un cilindro o huso
excepto que la frase ‘‘cantidad declarada’’ se reemplaza por la sumergido en la muestra de prueba y mide la resistencia al
frase ‘‘cantidad declarada multiplicada por el valor promedio de movimiento de la parte rotatoria. Existen distintos husos para
las unidades de dosificación analizadas (expresado como un intervalos determinados de viscosidad, y generalmente se dispone de
porcentaje de la cantidad declarada) dividido por 100’’. varias velocidades de rotación. Otros instrumentos rotatorios pueden
(Oficial a partir del 18 de enero de 2007) tener un huso estacionario y un vaso rotatorio. Los viscosı́metros de
Brookfield, Rotouisco y Stormer son ejemplos de instrumentos de
huso rotatorio y el de MacMichael es un ejemplo de un instrumento
de vaso rotatorio. Se han ideado otros instrumentos rotatorios de
diseño de avanzada con dispositivos especiales para la lectura o el
registro de datos y con amplios intervalos de velocidades de
h911i VISCOSIDAD rotación.
Cuando sólo un tipo especı́fico de instrumento es adecuado para la
medición de la viscosidad, la monografı́a individual ası́ lo indica.
Para la medición de la viscosidad o la viscosidad aparente, se debe
La viscosidad es una propiedad de los lı́quidos que controlar con exactitud la temperatura de la sustancia que se esta
está estrechamente relacionada con la resistencia al flujo. Se define analizando, ya que pequeños cambios en la temperatura pueden
en términos de la fuerza necesaria para mover de manera continua ocasionar cambios notables en la viscosidad. Para los fines
una superficie plana sobre otra, en condiciones constantes especi- farmacéuticos usuales, la temperatura se debe mantener con una
ficadas, cuando el espacio entre ellas está ocupado por el lı́quido en aproximación de +0,18.
cuestión. Se define como la tensión de cizallamiento dividida por la Procedimientos para Derivados de la Celulosa—La medición
velocidad de cizallamiento. La unidad básica es el poise; sin de la viscosidad de soluciones de metilcelulosa de alta viscosidad
embargo, las viscosidades que se encuentran comúnmente repre- constituye un caso especial, dado que son demasiado viscosas para
sentan fracciones de un poise, de manera que el centipoise (1 poise = los viscosı́metros comúnmente disponibles. El viscosı́metro de
100 centipoises) es la unidad que resulta más conveniente. La
especificación de la temperatura es importante, ya que la viscosidad
422 h921i Determinación de Agua / Pruebas Fı́sicas USP 30
Ubbelohde se puede adaptar (cf. ASTM, D-1347) para la medición Método Ia (Valoración Volumétrica Directa)
de los intervalos de viscosidad encontrados en las soluciones de
metilcelulosa. Principio—La determinación volumétrica del agua está basada en
Calibración de Viscosı́metros de Tipo Capilar—Determinar la la reacción cuantitativa del agua con una solución anhidra de dióxido
constante del viscosı́metro, k, para cada viscosı́metro mediante el uso de azufre y yodo en presencia de una solución amortiguadora que
de un aceite de viscosidad conocida.* reacciona con los iones hidrógeno.
Viscosı́metros Tipo Ostwald—Llenar el tubo con la cantidad En la solución de volumétrica original, conocida como Reactivo
exacta de aceite (ajustada a 20,0 + 0,18) especificada por del de Karl Fischer, el dióxido de azufre y el yodo se disuelven en
fabricante. Ajustar el menisco de la columna de lı́quido en el tubo piridina y metanol. La muestra de prueba puede valorarse
capilar al nivel de la lı́nea de graduación superior con ayuda de volumétricamente con el Reactivo directamente o el análisis puede
presión o succión. Abrir el tubo de llenado y el tubo capilar para realizarse mediante un procedimiento de volumetrı́a residual. La
permitir que el lı́quido fluya dentro del reservorio contra la presión estequiometrı́a de la reacción no es exacta y la reproducibilidad de la
atmosférica. [NOTA—Una falla en la apertura de cualquiera de estos determinación depende de factores tales como las concentraciones
tubos producirá valores falsos.] Registrar el tiempo necesario, en relativas de los ingredientes del Reactivo, la naturaleza del disolvente
segundos, para que el lı́quido fluya desde la marca superior hasta la inerte utilizado para disolver la muestra y la técnica utilizada en la
marca inferior en el tubo capilar. determinación en cuestión. Por lo tanto, para conseguir la exactitud
Viscosı́metros Tipo Ubbelohde—Colocar una cantidad del aceite deseada se utiliza una técnica empı́ricamente estandarizada. La
(ajustada a 20,0 + 0,18) en el tubo de llenado y transferirla al tubo precisión del método depende en gran parte de la medida en que la
capilar mediante succión suave, teniendo cuidado de evitar la humedad atmosférica es eliminada del sistema. Normalmente la
formación de burbujas en el lı́quido manteniendo el tubo de aire volumetrı́a del agua se realiza utilizando metanol anhidro como
cerrado. Ajustar el menisco de la columna de lı́quido en el tubo disolvente para la muestra de prueba, aunque también pueden
capilar al nivel de la lı́nea de graduación superior. Abrir el tubo de utilizarse otros disolventes adecuados para muestras de prueba
aire y el tubo capilar para permitir que el lı́quido fluya dentro del especiales o no habituales.
reservorio contra la presión atmosférica. [NOTA—Una falla en la Aparato—Puede utilizarse cualquier aparato que garantice una
apertura del tubo de aire antes de liberar el tubo capilar produci- exclusión de la humedad atmosférica y una determinación del punto
rá valores falsos.] Registrar el tiempo, en segundos, necesario para final adecuadas. En el caso de valoraciones volumétricas directas de
que el lı́quido fluya desde la marca superior hasta la marca inferior una solución incolora, el punto final se puede observar visualmente
en el capilar. como un cambio de color de amarillo canario a ámbar. El caso
Cálculos— inverso se observa cuando se realiza una volumetrı́a residual de una
Calcular la constante del viscosı́metro, k, a partir de la ecuación: muestra de prueba. Sin embargo, de forma más habitual el punto
final se determina de forma electrométrica utilizando un aparato con
k = v / d t, un circuito eléctrico simple que genera una potencia de aproxima-
damente 200 mV entre un par de electrodos de platino sumergidos en
en donde v es la viscosidad conocida del lı́quido en centipoises, d es la solución que se desea valorar volumétricamente. En el punto final
el peso especı́fico del lı́quido en análisis a 208/208, y t es el tiempo de la volumetrı́a un ligero exceso de reactivo aumenta el flujo de
transcurrido en segundos para que el lı́quido pase desde la marca corriente entre 50 y 150 microamperios durante un perı́odo de 30
superior a la marca inferior. segundos a 30 minutos, dependiendo de la solución que se
Si se repara un viscosı́metro, se debe recalibrar, dado que aún las esté valorando volumétricamente. Este perı́odo es menor en el
reparaciones menores ocasionan frecuentemente cambios significa- caso de sustancias que se disuelven en el reactivo. En algunos
tivos en el valor de su constante, k. tituladores automáticos el cambio abrupto de corriente o de potencia
en el punto final hace cerrar una válvula operada por solenoide que
controla la bureta que suministra la solución volumétrica. Los
aparatos comerciales generalmente comprenden un sistema cerrado
que consta de una o dos buretas automáticas y un vaso para la
volumetrı́a cubierto herméticamente equipado con los electrodos
necesarios y un mezclador magnético. El aire en el sistema se
h921i DETERMINACIÓN DE mantiene seco con un desecante adecuado y el vaso para la
volumetrı́a puede purgarse mediante una corriente de nitrógeno seco
AGUA o de aire seco.
Reactivo—Preparar el Reactivo de Karl Fischer como se indica a
continuación: Agregar 125 g de yodo a una solución que contenga
670 mL de metanol y 170 mL de piridina y enfriar. Colocar 100 mL
Numerosos artı́culos farmacopeicos son hidratos o contienen agua de piridina en una probeta graduada de 250 mL y, manteniendo la
en forma adsorbida. Como consecuencia, la determinación del piridina frı́a en un baño de hielo, introducir dióxido de azufre seco
contenido de agua es importante para demostrar el cumplimiento con hasta alcanzar un volumen de 200 mL. Agregar lentamente esta
las Normas farmacopeicas. Por lo general, en cada monografı́a se solución, agitando, a la mezcla de yodo enfriada. Agitar para
exige uno de los métodos que se describen a continuación, en disolver el yodo, transferir la solución al aparato y dejar en reposo la
función de la naturaleza del artı́culo. En algunos casos poco solución durante la noche antes de estandarizar. Un mL de esta
comunes se permite elegir entre dos métodos. Si el artı́culo contiene solución recién preparada equivale aproximadamente a 5 mg de
agua de hidratación, se utiliza el Método I (Volumétrico), el Método agua. La solución se deteriora gradualmente, por lo que se
II (Azeotrópico) o el Método III (Gravimétrico), como se indica en la recomienda estandarizarla como máximo 1 hora antes de su uso o
monografı́a individual, y el requisito se especifica bajo el diariamente si su uso es continuo. Proteger la solución de la luz
encabezado Agua. mientras se esté utilizando. Conservar el reactivo a granel en un
El encabezado Pérdida por secado (ver Pérdida por Secado recipiente adecuado sellado y con tapón de vidrio, totalmente
h731i) se utiliza en aquellos casos en los que la pérdida por protegido de la luz y refrigerado.
calentamiento puede no ser totalmente de agua. Puede utilizarse una solución estabilizada de reactivo de tipo Karl
Fischer disponible comercialmente. También pueden utilizarse
reactivos disponibles comercialmente que contengan disolventes o
MÉTODO I (VOLUMÉTRICO) bases diferentes a la piridina o alcoholes diferentes al metanol. Estos
pueden ser soluciones individuales o reactivos creados in situ
Determinar el agua mediante el Método Ia, a menos que se combinando los componentes de los reactivos presentes en dos
especifique algo diferente en la monografı́a individual. soluciones distintas. El Reactivo diluido requerido en algunas
*
Se pueden obtener aceites con viscosidades conocidas de Cannon monografı́as debe diluirse de acuerdo con las instrucciones del
Instrument Co., Box 16, State College, PA 16801. Para la metilcelulosa, se fabricante. Como diluyente puede utilizarse metanol u otro
debe elegir un aceite con una viscosidad tan cercana como sea posible a la del disolvente adecuado, como el éter monometı́lico de etilenglicol.
tipo de metilcelulosa que se va a determinar.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h921i Determinación de Agua 423
Preparación de Prueba—A menos que se especifique algo Prueba, mezclar y volver a valorar volumétricamente con el
diferente en la monografı́a individual, utilizar una cantidad pesada o Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual. Calcular el
medida con exactitud de la muestra que se está analizando con un contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la fórmula:
contenido de agua estimado de 10 a 250 mg.
Si la muestra que se está analizando es un aerosol con propelente, SF,
conservarla en el congelador durante no menos de 2 horas, abrir el en donde S es el volumen, en mL, del Reactivo consumido en la
envase y analizar 10,0 mL de la muestra bien mezclada. Para valorar segunda volumetrı́a; y F es el factor de equivalencia de agua del
volumétricamente la muestra, determinar el punto final a una Reactivo.
temperatura de 108 o mayor.
Si la muestra que se está analizando son cápsulas, utilizar una
porción de la mezcla del contenido de no menos de 4 cápsulas.
Si la muestra que se está analizando son tabletas, utilizar el polvo Método Ib (Valoración Volumétrica Residual)
de no menos de 4 tabletas molidas en polvo fino en una atmósfera
con valores de temperatura y humedad relativa que se sepa que no Principio—Ver la información que figura en la sección Principio
afectarán los resultados. en Método Ia. En la volumetrı́a residual se agrega un exceso de
En los casos en los que la monografı́a especifique que la muestra Reactivo a la muestra de prueba, se espera un tiempo suficiente para
analizada es higroscópica, utilizar una jeringa seca para inyectar un que se complete la reacción y se valora volumétricamente el
volumen adecuado de metanol, u otro disolvente adecuado, medido Reactivo no consumido con una solución estándar de agua en un
con exactitud, a un recipiente tarado y agitar para disolver la disolvente como el metanol. El procedimiento de volumetrı́a residual
muestra. Con la misma jeringa retirar la solución del recipiente y se aplica de forma general y evita los problemas que pueden surgir
transferirla a un vaso de volumetrı́a preparado según se indica en en la volumetrı́a directa de aquellas sustancias en las que el agua
Procedimiento. Repetir el procedimiento con una segunda porción unida se libera lentamente.
de metanol, o con otro disolvente adecuado, medido con exactitud, Aparato, Reactivo y Preparación de Prueba—Utilizar el
agregar el volumen de lavado al vaso de volumetrı́a y valorar Método Ia.
inmediatamente. Determinar el contenido de agua, en mg, de una Estandarización de la Solución de Agua para Valoraciones
porción de disolvente con el mismo volumen total que el utilizado Volumétricas Residuales—Preparar una Solución de Agua
para disolver la muestra y para lavar el recipiente y la jeringa, según diluyendo 2 mL de agua con metanol u otro disolvente adecuado
se indica en Estandarización de la Solución de Agua para hasta 1000 mL. Estandarizar esta solución valorando volumétrica-
Valoraciones Volumétricas Residuales, y restar este valor del mente 25,0 mL con el Reactivo, previamente estandarizado como se
contenido de agua, en mg, obtenido en la volumetrı́a de la muestra indica en Estandarización del Reactivo. Calcular el contenido de
que se está analizando. Secar el recipiente y su cierre a 1008 durante agua, en mg por mL, de la Solución de agua utilizada por la fórmula:
3 horas, dejar enfriar en un desecador y pesar. Determinar el peso de
la muestra analizada a partir de la diferencia de peso con respecto al V’F/25,
peso inicial del recipiente.
en donde V’ es el volumen del Reactivo consumido yF es el factor de
Estandarización del Reactivo—Colocar una cantidad suficiente equivalencia de agua del Reactivo. Determinar el contenido de agua
de metanol o de otro disolvente adecuado en el vaso de volumetrı́a de la Solución de Agua semanalmente y estandarizar periódicamente
para cubrir los electrodos y agregar suficiente Reactivo para obtener el Reactivo contra éste según sea necesario.
el color del punto final caracterı́stico, o 100 + 50 microamperios de
corriente continua con un potencial aplicado de aproximadamente Procedimiento—Si la monografı́a individual especifica que el
200 mV. contenido de agua debe ser determinado por el Método Ib, transferir
Para determinar cantidades de trazas de agua (menos de 1%) de 35 a 40 mL de metanol o de otro disolvente adecuado al vaso de
puede utilizarse tartrato de sodio como sustancia adecuada de volumetrı́a y valorar con el Reactivo al punto final electrométrico o
referencia de agua. Agregar rápidamente de 150 a 350 mg de tartrato visual. Agregar rápidamente la Preparación de prueba, mezclar y
de sodio (C4H4Na2O6 2H2O), pesados con exactitud por diferencia, y agregar un exceso medido con exactitud de Reactivo. Esperar un
valorar volumétricamente hasta el punto final. El factor de tiempo suficiente para que la reacción se complete y valorar
equivalencia del agua F, en mg de agua por mL de reactivo, se volumétricamente el Reactivo no consumido con la Solución de
calcula por la fórmula: Agua estandarizada al punto final electrométrico o visual. Calcular el
contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la fórmula:
2(18,02/230,08)(W/V), F(X’ – XR),
en donde 18,02 y 230,08 son los pesos moleculares del agua y del en donde F es el factor de equivalencia de agua del Reactivo; X’ es el
tartrato de sodio dihidrato, respectivamente; W es el peso, en mg, del volumen, en mL, del Reactivo agregado después de introducir la
tartrato de sodio dihidrato; y V es el volumen, en mL, del Reactivo muestra; X es el volumen, en mL, de la Solución de Agua
consumido en la segunda volumetrı́a. estandarizada necesaria para neutralizar el Reactivo no consumido;
Para una determinación precisa de cantidades significativas de y R es el cociente, V’/25 (mL de Reactivo/mL de Solución de Agua),
agua (1% o más), utilizar Agua purificada como sustancia de determinado a partir de la Estandarización de la Solución de Agua
referencia. Agregar rápidamente entre 25 y 250 mg de agua, pesados para Valoraciones Volumétricas Residuales.
con exactitud por diferencia, con una pipeta de pesada o con una
jeringa o micropipeta precalibrada. La cantidad tomada depende de
la concentración del reactivo y del tamaño de la bureta, como se
indica en Aparatos Volumétricos h31i. Valorar volumétricamente el Método Ic (Valoración Culombimétrica)
punto final. Calcular el factor de equivalencia del agua F, en mg de
agua por mL de reactivo, por la fórmula: Principio—Para la determinación culombimétrica del agua se
utiliza la reacción de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no se
W/V, agrega en forma de solución volumétrica sino que se obtiene por
oxidación anódica en una solución que contiene yoduro. La celda de
en donde W es el peso, en mg, del agua; y V es el volumen, en mL, reacción consta normalmente de un amplio compartimiento anódico
del reactivo necesario. y de un pequeño compartimiento catódico, separados entre sı́ por un
Procedimiento—A menos que se especifique algo diferente, diafragma. También pueden utilizarse otros tipos adecuados de
transferir de 35 a 40 mL de metanol o de otro disolvente adecuado al celdas de reacción (p. ej., sin diafragma). Cada compartimiento tiene
vaso de volumetrı́a y valorar con el Reactivo hasta el punto final un electrodo de platino que conduce la corriente a través de la celda.
electrométrico o visual para consumir la humedad que pudiera estar El yodo, que se produce en el electrodo anódico, reacciona
presente. (No tener en cuenta este volumen consumido, ya que no se inmediatamente con el agua que está presente en el compartimiento.
utiliza en los cálculos). Agregar rápidamente la Preparación de Cuando se ha consumido toda el agua, se produce un exceso de yodo
que normalmente se detecta electrométricamente, lo que indica el
punto final. La humedad se elimina del sistema mediante pre-
electrólisis. No es necesario cambiar la solución de Karl Fischer
424 h921i Determinación de Agua / Pruebas Fı́sicas USP 30
después de cada determinación ya que las diferentes determinaciones MÉTODO II (AZEOTRÓPICO— DESTILACIÓN
pueden realizarse de forma sucesiva en la misma solución reactivo. CON TOLUENO)
Un requisito de este método es que cada componente de la muestra
de prueba tiene que ser compatible con los demás componentes y Aparato—Utilizar un matraz de vidrio de 500 mL A conectado
que no se produzcan reacciones secundarias. Normalmente las mediante una trampa B a un condensador de reflujo C usando juntas
muestras son transferidas al vaso en forma de solución mediante la de vidrio esmerilado (ver la Figura).
inyección a través de un septo. Los gases se pueden introducir en la
celda utilizando un tubo de entrada de gas adecuado. La precisión
del método depende fundamentalmente del grado de eliminación de
la humedad atmosférica en el sistema; por tanto no se recomienda la
introducción de sólidos en la celda salvo que se tomen serias
precauciones tales como trabajar en una cámara cerrada en una
atmósfera de gas inerte seco. El control del sistema se puede
monitorizar midiendo el desplazamiento de la lı́nea base. Este
método es especialmente adecuado para sustancias quı́micas inertes
como hidrocarburos, alcoholes y éteres. En comparación con la
volumetrı́a de Karl Fischer, la culombimetrı́a es un micrométodo.
Aparato—Resulta adecuado cualquier aparato comercialmente
disponible que conste de un sistema absolutamente hermético
equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magnético.
El microprocesador del instrumento controla el procedimiento
analı́tico y visualiza los resultados. No es necesario calibrar el
instrumento ya que la corriente consumida puede medirse de forma
absoluta.
Reactivo—Ver Reactivo en Método Ia.
Preparación de prueba—Si la muestra es un sólido soluble,
disolver una cantidad adecuada, pesada con exactitud, en metanol
anhidro o en otros disolventes adecuados. Los lı́quidos pueden
utilizarse tal cual o como soluciones preparadas con exactitud en
disolventes anhidros adecuados.
Si la muestra es un sólido insoluble, puede extraerse el agua
utilizando un disolvente anhidro adecuado del cual puede inyectarse
una cantidad adecuada, pesada con exactitud, en la solución del
anolito. De forma alternativa, puede utilizarse una técnica de Aparato para Determinación Azeotrópica con Tolueno
evaporación en la que el agua se libera y se evapora calentando la
muestra en un tubo en una corriente de gas inerte seco, pasando a
continuación este gas a la celda. Las dimensiones crı́ticas de las piezas del aparato son las
siguientes: El tubo de conexión D tiene un diámetro interno de 9 a
Procedimiento—Con una jeringa seca, inyectar rápidamente en el 11 mm. La trampa tiene una longitud de 235 a 240 mm. El
anolito la Preparación de prueba, medida con exactitud y con un condensador, si es del tipo de tubo recto, tiene una longitud
contenido estimado de 0,5 a 5 mg de agua, o de acuerdo con las aproximada de 400 mm y un diámetro interior de no menos de 8
instrucciones del fabricante del instrumento, mezclar y realizar la mm. El tubo receptor E tiene una capacidad de 5 mL y su parte
valoración culombimétrica para determinar el punto final electro- cilı́ndrica, con una longitud de 146 a 156 mm, está graduada en
métrico. Leer el contenido de agua de la Preparación de Prueba subdivisiones de 0,1 mL, de forma que el error de lectura no es
directamente en la pantalla del instrumento y calcular el porcentaje mayor de 0,05 mL para cualquier volumen indicado. La fuente de
presente en la sustancia. Realizar una determinación con un blanco y calor es preferiblemente un calentador eléctrico con control de
hacer las correcciones necesarias. reóstato o un baño de aceite. La parte superior del matraz y el tubo
de conexión pueden estar aislados.
Limpiar el tubo receptor y el condensador con una mezcla
limpiadora a base de ácido crómico, enjuagar cuidadosamente con
agua y secar en un horno. Preparar el tolueno que se va a utilizar
agitando con una pequeña cantidad de agua, separando el exceso de
agua y destilando el tolueno.
Procedimiento—Colocar en un matraz seco una cantidad de la
sustancia, pesada con exactitud al centı́gramo más próximo, para
obtener de 2 a 4 mL de agua. Si la sustancia es de tipo pastoso, pesar
sobre una lámina metálica ovalada con un tamaño que pase justo a
través del cuello del matraz. Si existe la posibilidad de que al
ingresar la sustancia produzca turbulencias, agregar una cantidad
suficiente de arena lavada y seca para cubrir el fondo del matraz o
una serie de tubos capilares de punto de fusión, con una longitud
aproximada de 100 mm, cerrados por el extremo superior. Colocar
aproximadamente 200 mL de tolueno en el matraz, conectar el
aparato y llenar el tubo receptor E con tolueno vertido a través de la
parte superior del condensador. Calentar el matraz suavemente
durante 15 minutos y, una vez que el tolueno empiece a hervir,
destilar a una velocidad de aproximadamente 2 gotas por segundo
hasta que la mayor parte del agua se haya recogido y después
aumentar la velocidad de destilación aproximadamente a 4 gotas por
segundo. Una vez que aparentemente se haya destilado toda el agua,
enjuagar el interior del tubo del condensador con tolueno cepillando
al mismo tiempo el tubo con un cepillo para tubos fijado a un hilo de
cobre y saturado con tolueno. Continuar la destilación durante 5
minutos y después retirar la fuente de calor y dejar que el tubo
receptor se enfrı́e a temperatura ambiente. Si quedan gotitas de agua
adheridas a las paredes del tubo receptor, arrastrarlas hacia abajo con
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h941i Difracción de Rayos X 425
un cepillo formado por una cinta de goma envuelta alrededor de un termodinámico. Como la velocidad de transformación de la fase de
hilo de cobre y humedecida con tolueno. Una vez que el agua y el un polimorfo metaestable a uno estable puede ser bastante lenta, es
tolueno se hayan separado totalmente, leer el volumen de agua y común encontrar varios polimorfos de compuestos farmacéuticos
calcular el porcentaje que estaba presente en la sustancia. cristalinos coexistiendo en condiciones normales de manipulación.
Además de presentar polimorfismo, muchos compuestos forman
solvatos cristalinos en los que la molécula del disolvente es parte
MÉTODO III (GRAVIMÉTRICO) integral de la estructura cristalina. Ası́ como todo polimorfo tiene sus
propios patrones de rayos X caracterı́sticos, todos los solvatos
Procedimiento para Sustancias Quı́micas—Proceder como se también los tienen. En ocasiones, las diferencias en los patrones de
indica en la monografı́a individual preparando la sustancia quı́mica difracción de polimorfos diferentes son relativamente menores, y
según se indica en Pérdida por Secado h731i. deben ser evaluadas con sumo cuidado antes de alcanzar una
conclusión definitiva. En algunos casos, estos polimorfos y/o
Procedimiento parar Sustancias Biológicas—Proceder como se solvatos muestran velocidades de disolución variables. En con-
indica en la monografı́a individual. secuencia, en la escala temporal de la biodisponibilidad farmacéu-
Procedimiento para Artı́culos de Origen Botánico—Colocar en tica, se disuelven diferentes cantidades totales del fármaco, lo que da
un plato para evaporación tarado aproximadamente 10 g del fármaco, como resultado una bioinequivalencia potencial entre las varias
pesados con exactitud, preparados como se indica (ver Métodos de formas del fármaco.
Análisis en Artı́culos de Origen Botánico h561i). Secar a 1058 Principios Fundamentales—Un haz colimado de rayos X
durante 5 horas y pesar. Continuar el secado y la pesada a intervalos monocromático se difracta en varias direcciones cuando incide
de 1 hora hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no sea sobre un cristal en rotación o un polvo cristalino orientado de forma
más de 0,25%. aleatoria. El cristal actúa como una red de difracción tridimensional
ante esta radiación. La ley de Braggs describe este fenómeno al
establecer que la difracción (interferencia constructiva) puede ocurrir
únicamente cuando las ondas dispersadas desde regiones diferentes
del cristal en una dirección especı́fica recorren distancias que difieren
h941i DIFRACCIÓN DE RAYOS X en números enteros (n) de longitud de onda (l). Bajo estas
circunstancias, las ondas están en fase. Esta condición se describe
mediante la ecuación de Braggs:
difracciones de Braggs se registran ya sea por medio de una pelı́cula muestra en un mortero para obtener un polvo fino. Se sabe que la
o por detectores de radiación. El ángulo de Braggs se puede medir presión de molienda induce transformaciones de fase; por tanto, se
fácilmente en una pelı́cula, pero la aparición de los detectores de recomienda verificar el patrón de difracción de la muestra sin moler.
radiación ha hecho posible la construcción de difractómetros que En general, las formas de muchas partı́culas cristalinas tienden a
leen este ángulo directamente. Las intensidades y los espacios d se dar una muestra que presenta cierto grado de orientación preferida en
determinan mejor con difractómetros de polvo, que emplean el soporte de la muestra. Esto es especialmente evidente para los
detectores de radiación, que con el uso de los métodos de pelı́cula. cristales en forma de aguja o de placa en los que la reducción de
Con frecuencia se emplean microfotómetros para la medición precisa tamaño proporciona agujas o plaquitas más finas. La orientación
de la intensidad de las pelı́culas. preferida en la muestra influye en las intensidades relativas de
Un ejemplo de los tipos de patrones de polvo obtenidos para diversas difracciones.
cuatro fases sólidas diferentes de ampicilina se muestra en la figura Se pueden emplear varias técnicas de manipulación especializadas
adjunta. Estos patrones de difracción se derivaron de un para minimizar la preferencia en la orientación, pero reducir aún más
difractómetro de polvo equipado con un detector Geiger-Müller; se el tamaño de las partı́culas suele ser la mejor solución.
utilizó radiación Ka de Cu y filtro de nı́quel. En los casos en los que es necesario medir con mucha precisión
Radiación—Las principales fuentes de radiación utilizadas para los ángulos de Braggs, se puede mezclar una pequeña cantidad de un
la difracción de rayos X son tubos de vacı́o que utilizan cobre, estándar interno con la muestra. Esto permite calibrar el trazado de la
molibdeno, hierro y cromo como ánodos; los rayos X de cobre se pelı́cula o del registrador. Calibrar el difractómetro si se están
emplean más comúnmente para sustancias orgánicas. Para cada una llevando a cabo comparaciones con valores de d registrados en la
de estas radiaciones existe un elemento que filtrará la radiación Kb y literatura (incluidos los lı́mites farmacopeicos). Están disponibles las
permitirá el paso de la radiación Ka (en el caso de la radiación de estándares NIST, que cubren hasta un valor de d de 0,998 nm. Se
cobre se utiliza nı́quel). De esta forma la radiación es prácticamente puede usar: Tetradecanol1 (d es 3,963 nm) para espacios más
monocromática. La elección de la radiación que se va a usar depende grandes.
de las caracterı́sticas de absorción del material y la posible La absorción de la radiación por parte de cualquier muestra esta
fluorescencia de los átomos presentes en la muestra. determinada por el número y tipo de átomos a través de los cuales
Precaución—Se debe tener cuidado al usar este tipo de radiación. pasa el haz de rayos X. Una matriz orgánica absorbe generalmente
Aquellas personas que no estén familiarizadas con el uso del equipo menos radiación difractada que una matriz inorgánica. En con-
de rayos X deben solicitar el asesoramiento de un experto. El uso secuencia, en los estudios cuantitativos es importante que las curvas
indebido puede provocar efectos nocivos en el operador. estándar que relacionan la cantidad de material con la intensidad de
Preparación de prueba—En un intento por mejorar la ciertos espacios d para esa sustancia se determinen en una matriz
aleatoriedad en la orientación de los cristales (y a fin de evitar un similar a la matriz en la que será analizada la sustancia.
patrón granulado en las técnicas de pelı́cula), se puede moler la
1
Brindley, GW y Brown, G, eds., Crystal Structures of Clay Minerals and
Their X-ray Identification, Mineralogical Society Monograph N8 5, Londres,
1980, pp. 318 y sig.
USP 30 Pruebas Fı́sicas / h941i Difracción de Rayos X 427
En análisis cuantitativos de minerales, normalmente se agrega una dispone de material de referencia (por ejemplo un Estándar de
cantidad conocida del estándar a una cantidad pesada de la muestra Referencia USP), es preferible generar un patrón de referencia
que se va a analizar. Esto permite determinar la cantidad de la primario en el mismo equipo usado para tratar la muestra
sustancia en relación con la cantidad del estándar agregado. El desconocida y bajo las mismas condiciones. Para la mayorı́a de
estándar usado debe tener aproximadamente la misma densidad que los cristales orgánicos, es conveniente registrar el patrón de
la muestra y caracterı́sticas de absorción similares. Y lo que es más difracción para incluir valores para 2 que oscilen entre los valores
importante, su patrón de difracción no debe superponerse bajo más próximos posibles a cero grados y 40 grados. La concordancia
ningún concepto con el del material que se va a analizar. Bajo estas entre la muestra y la referencia debe estar dentro de la precisión
condiciones existe una relación lineal entre la intensidad de la lı́nea y calibrada del difractómetro para el ángulo de difracción (los valores
la concentración. En casos favorables, en matrices sólidas se pueden 2 deberı́an ser normalmente reproducibles a +0,10 grados),
determinar cantidades de materiales cristalinos de apenas el 10%. mientras que las intensidades relativas entre la muestra y la
La identificación de materiales cristalinos se puede lograr referencia pueden variar de forma considerable. Para otros tipos de
comparando los patrones de difracción de rayos X para polvos, muestras (por ejemplo, sales inorgánicas), puede ser necesario
obtenidos para materiales conocidos2, con los de materiales ampliar la región 2 barrida hasta bastante más allá de los 40 grados.
desconocidos. En la comparación se utiliza el cociente de intensidad Generalmente es suficiente barrer más allá de los diez reflejos más
(cociente entre la intensidad máxima de un espacio d particular y la fuertes identificados en el Archivo de Difracción de Polvo.2
máxima mayor en el patrón de difracción) y el espacio d. Si se
2
El International Centre for Diffraction Data, Newtown Square Corporate
Campus, 12 Campus Boulevard, Newtown Square, PA 19073, mantiene un
archivo sobre más de 60 000 materiales cristalinos, tanto orgánicos como
inorgánicos, adecuado para este tipo de comparaciones.
428 h1010i Datos Analı́ticos—Interpretación y Tratamiento / Información General USP 30
Capı́tulos Generales
Información General
Los capı́tulos de esta sección son de carácter informativo y no variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por
contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especificaciones de procedimientos analı́ticos. Si no se caracteriza ni especifica la
cumplimiento obligatorio para ningún artı́culo farmacopeico, a variabilidad de una medición junto con el resultado obtenido, los
excepción de las citas de Leyes y reglamentos federales que puedan datos sólo pueden interpretarse en el sentido más limitado. Por
ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los
en esta sección debido a que no son de la autorı́a de la Farmacopea. resultados obtenidos por dos laboratorios al analizar el mismo
Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten al conjunto de muestras es del 10%, la interpretación es limitada en
contenido de estas citas se publicarán en los Suplementos de los cuanto a la importancia de dicha diferencia a menos que se
compendios USP-NF a la brevedad posible. Los requisitos oficiales especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio.
de los artı́culos farmacopeicos se establecen en las Advertencias Este capı́tulo proporciona indicaciones para el tratamiento e
Generales, las monografı́as individuales y en los capı́tulos referentes interpretación cientı́ficamente aceptables de los datos. Se describen
a Pruebas y Valoraciones Generales de esta Farmacopea. además las herramientas estadı́sticas que pueden resultar útiles para
la interpretación de los datos analı́ticos. Muchas estadı́sticas
descriptivas, como la desviación estándar y la media, son de uso
difundido. Otras herramientas estadı́sticas, como las pruebas de
resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes méto-
dos cientı́ficamente válidos, de los cuales también se incluyen
h1010i DATOS ANALÍTICOS— ejemplos. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de
una prueba farmacopeica se describe en detalle en Resultados de las
INTERPRETACIÓN Y Pruebas, Estadı́sticas y Normas en Advertencias y Requisitos
Generales. En el Apéndice F al final de este capı́tulo, se incluye
TRATAMIENTO una selección de referencias útiles para obtener información
adicional sobre las herramientas estadı́sticas aquı́ descritas. USP
no avala especı́ficamente las referencias citadas, que no constituyen
una lista exhaustiva. Puede encontrarse información adicional sobre
cualquiera de los métodos citados en este capı́tulo en la mayorı́a de
los textos de estadı́stica.
INTRODUCCIÓN
Este capı́tulo proporciona información acerca de las prácticas
aceptables para el análisis e interpretación uniforme de los datos PREREQUISITOS PARA LAS PRÁCTICAS Y
obtenidos de los análisis quı́micos y otros análisis. Se describen PRINCIPIOS DE LABORATORIO
además algunos métodos estadı́sticos básicos para la evaluación de
datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados La correcta aplicación de los principios estadı́sticos a los datos de
aberrantes y la comparación de métodos analı́ticos. laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de forma
NOTA—No debe inferirse que las herramientas de análisis rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de
mencionadas en este capı́tulo conforman una lista exhaustiva. ello, son útiles las prácticas siguientes.
Pueden utilizarse otros métodos estadı́sticos igualmente válidos a
criterio del fabricante y demás usuarios de este capı́tulo.
La garantı́a de calidad de los productos farmacéuticos se logra Mantenimiento Adecuado de Registros
combinando una serie de prácticas, que incluyen un diseño robusto
de la formulación, validación, análisis de materias primas, análisis Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente
durante el proceso y pruebas del producto final. Cada una de estas detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan
prácticas depende de métodos de prueba confiables. Durante el reconstruir las condiciones experimentales y revisar los resultados
proceso de desarrollo, se desarrollan y validan procedimientos de obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse más
prueba para asegurar que los productos fabricados estén perfecta- decimales que los requeridos en la especificación y las cifras sólo
mente caracterizados. Las pruebas del producto final permiten deben redondearse una vez realizados los cálculos finales, conforme
comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces a lo establecido en las Advertencias y Requisitos Generales.
y que cumplen con sus especificaciones.
Las mediciones son intrı́nsecamente variables y la USP reconoce
tal variabilidad para las pruebas biológicas desde hace mucho Consideraciones Relativas al Muestreo
tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se
analizan datos de pruebas biológicas, por ejemplo, se trata en el Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluación de un
capı́tulo Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas h111i. Las atributo de calidad de una población. El objetivo del muestreo es
mediciones de análisis quı́micos comúnmente utilizadas para proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las
productos farmacéuticos también son intrı́nsecamente variables, propiedades de la población. La manera en que se obtiene dicha
aunque en menor grado que las pruebas biológicas. No obstante, en muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder
muchos casos los criterios de aceptación son proporcionalmente más con los datos de la muestra. Por lo general, un proceso aleatorio se
estrictos y, en consecuencia, debe tenerse en cuenta esta menor considera la manera más adecuada de seleccionar una muestra. De
USP 30 Información General / h1010i Datos Analı́ticos—Interpretación y Tratamiento 429
hecho, es necesario utilizar una muestra aleatoria e independiente formulación (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificación
para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones o producto intermedio de un proceso) únicamente después de
válidas acerca de las propiedades de la población. La generación de verificar que la nueva formulación no interfiere con la exactitud,
una muestra no aleatoria o ‘‘de conveniencia’’ conlleva el riesgo de linealidad ni precisión del método. No puede suponerse que un
que las estimaciones estén sesgadas. El tipo de muestreo aleatorio método validado puede medir correctamente el ingrediente activo de
más directo se conoce como muestreo aleatorio simple y es un una formulación que es diferente a la utilizada para establecer la
proceso en el que cada unidad de la población tiene la misma validez original del método.
probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos
casos este método de selección de muestra aleatoria no es óptimo ya
que no garantiza la misma representatividad en relación con todos PRINCIPIOS DE MEDICIÓN Y VARIACIÓN
los factores (por ejemplo, tiempo, lugar, máquina) que podrı́an influir
en las propiedades crı́ticas de la población. Por ejemplo, si se Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones
requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es del valor real (‘‘verdadero’’ o ‘‘aceptado’’), ya que contienen una
fundamental que la muestra sea representativa de todo el proceso de variabilidad aleatoria (también denominada error aleatorio) y, en
producción, no serı́a adecuado tomar una muestra aleatoria simple al algunos casos, un error sistemático (sesgo). En consecuencia, el
finalizar la producción ya que no se puede garantizar que contenga valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrı́nseca
una cantidad similar de unidades fabricadas en cada perı́odo del de la medición. Si un conjunto de mediciones consta de resultados
proceso de 12 horas. En estos casos es mejor tomar una muestra individuales representativos del todo, pueden usarse métodos
aleatoria sistemática, seleccionando al azar una unidad del proceso estadı́sticos para estimar propiedades informativas de la totalidad y
de producción a intervalos o en lugares sistemáticamente seleccio- otras pruebas estadı́sticas para determinar si es probable que dichas
nados (por ejemplo, cada 30 minutos, entre las unidades producidas propiedades cumplen con los requisitos establecidos. Los análisis
durante ese perı́odo) para asegurarse de incluir en la muestra estadı́sticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con
unidades tomadas durante todo el proceso de fabricación. Se el proceso de medición, ası́ como la variabilidad de la entidad que se
requerirá otro tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por está midiendo. Las mediciones estadı́sticas usadas para evaluar la
ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro dirección y magnitud de estos errores incluyen la desviación
máquinas de llenado diferentes. En este caso, serı́a importante tomar estándar, la media y expresiones derivadas de éstas, como el
una muestra aleatoria de los viales de cada una de las máquinas de coeficiente de variación (CV, también denominado desviación
llenado. Una muestra aleatoria estratificada, método que consiste en estándar relativa, o RSD por sus siglas en inglés). La variabilidad
tomar una muestra al azar del mismo número de viales en cada una estimada puede usarse para calcular intervalos de confianza para la
de las cuatro máquinas de llenado, cumple con este requisito. media, o medidas de variabilidad, e intervalos de tolerancia que
Independientemente del motivo del muestreo (por ejemplo, prueba capturan una proporción especificada de las mediciones individuales.
de liberación de partida), debe establecerse un plan de muestreo que El uso de mediciones estadı́sticas debe complementarse con el
indique detalladamente cómo se debe obtener la muestra para buen juicio, especialmente con respecto al muestreo representativo.
asegurar que sea representativa de toda la población y que los datos La mayorı́a de las mediciones estadı́sticas y pruebas citadas en este
resultantes tengan la sensibilidad requerida. La estrategia de capı́tulo suponen que la distribución de la población total es una
muestreo óptima depende del conocimiento de los procesos de distribución normal y que la muestra analizada es un subconjunto
fabricación y medición analı́tica. Una vez definido el plan de representativo de dicha población. La distribución normal (o
muestreo, es probable que incluya cierto elemento de selección gaussiana) tiene forma de campana, es simétrica respecto de su
aleatoria. Por último, debe obtenerse una cantidad de muestra centro y tiene ciertas caracterı́sticas requeridas para que estas
suficiente para el análisis original, los análisis de verificación pruebas sean válidas. Si no se puede garantizar una distribución
subsiguientes y otros análisis. normal para la población, con frecuencia puede lograrse la
Las pruebas que se describen en el resto de este capı́tulo suponen normalidad (al menos en forma aproximada) a través de la adecuada
que se ha realizado un muestreo aleatorio simple. transformación de los valores de medición. Por ejemplo, existen
variables que tienen distribuciones cuyo gráfico muestra una cola
más larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general,
Uso de Estándares de Referencia estas distribuciones pueden volverse aproximadamente normales
mediante una transformación logarı́tmica. Un método alternativo
Cuando se especifica el uso de un Estándar de Referencia USP, serı́a el uso de procedimientos estadı́sticos ‘‘independientes de la
debe utilizarse el Estándar de Referencia USP o un estándar distribución’’ o ‘‘no paramétricos’’ que no requieren que la
secundario rastreable al Estándar de Referencia USP. Debido a que la población tenga una distribución normal. Cuando el objetivo es
asignación de un valor a un estándar es uno de los factores más determinar un intervalo de confianza para la media o para la
importantes de la exactitud de un análisis, es fundamental hacerlo diferencia entre dos medias, por ejemplo, la suposición de
correctamente. normalidad no es tan importante debido al teorema de lı́mite central.
No obstante, debe verificarse la normalidad de los datos para calcular
intervalos de confianza válidos para desviaciones estándar y
Verificación del Desempeño del Sistema relaciones de desviaciones estándar, para realizar algunas pruebas
de resultados aberrantes y para determinar lı́mites de tolerancia
La verificación del desempeño aceptable de un sistema analı́tico estadı́stica válidos. En este último caso, la normalidad es una
que se utiliza en forma rutinaria o continua puede ser una práctica suposición fundamental. Los métodos gráficos simples, como
valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a gráficos de puntos, histogramas y gráficos de probabilidad normales,
intervalos adecuados o examinando otros factores, como la variación son útiles para verificar esta suposición.
entre estándares, las relaciones señal-ruido de fondo, etc. Si se Una medición analı́tica simple puede ser útil para evaluar la
realiza un seguimiento del parámetro medido, por ejemplo calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado
graficando los resultados del análisis de una muestra de control, se utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los
pueden detectar cambios en el desempeño que requieren el ajuste del errores analı́ticos son bien conocidos. El resultado analı́tico obtenido
sistema analı́tico. puede condicionarse incluyendo una estimación de los errores
asociados. En algunos casos puede considerarse el uso de promedios
ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es
Validación de Métodos menor que la variabilidad de las mediciones individuales. La opción
de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la
Todos los métodos deben validarse según se especifica en aplicación de la medición y su variabilidad. Por ejemplo, cuando se
Validación de Métodos Farmacopeicos h1225i. Los métodos obtienen mediciones múltiples con la misma alı́cuota de muestra,
publicados en la USP–NF se han validado y cumplen con los como en el caso de varias inyecciones de muestra en cromatografı́a
requisitos reglamentarios de Buenas Prácticas de Fabricación lı́quida de alta resolución, por lo general es aconsejable promediar
vigentes establecidos en el Código de Reglamentos Federales. Los los datos obtenidos, por la razón que se mencionó anteriormente.
métodos validados pueden utilizarse para analizar una nueva
430 h1010i Datos Analı́ticos—Interpretación y Tratamiento / Información General USP 30
La variabilidad se asocia con la dispersión de observaciones en siempre que sea posible. Se puede elaborar y utilizar una gráfica de
torno al centro de una distribución. El estadı́stico más comúnmente control para controlar el desempeño del método en forma continua
utilizado para medir el centro es la media de la muestra ( x ): según se muestra en el Apéndice A.
Debe realizarse un estudio de precisión para obtener una mejor
estimación de la variabilidad del método. El estudio de precisión
puede diseñarse para determinar la precisión intermedia (que incluye
los componentes de variabilidad ‘‘entre análisis’’ e ‘‘intra-análisis’’)
y la repetibilidad (variabilidad ‘‘intra-análisis’’). Los estudios de
precisión intermedia deben permitir cambios en las condiciones
experimentales que podrı́an esperarse, como por ejemplo diferentes
analistas, diferentes preparaciones de reactivos, diferentes dı́as y
diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisión, la
La variabilidad del método puede estimarse de varias maneras prueba debe repetirse varias veces. Cada análisis debe ser
diferentes. La evaluación más común y útil de la variabilidad de un completamente independientemente de los demás para obtener
método es la determinación de la desviación estándar basada en estimaciones exactas de los diferentes componentes de variabilidad.
mediciones independientes repetidas1 de una muestra. La desviación Además, dentro de cada análisis, deben realizarse determinaciones
estándar de la muestra, s, se calcula por la fórmula: repetidas para estimar la repetibilidad. Ver un ejemplo de un estudio
de precisión en el Apéndice B.
Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretación
de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios datos
usando la media (x) y la desviación estándar de la muestra (s) según
la fórmula:
Si no se encuentra una causa atribuible que se puede documentar igualmente en los registros. La inclusión o exclusión de resultados
para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado puede aberrantes en los cálculos para evaluar la conformidad del producto
analizarse, como parte de la investigación general, para determinar con los criterios de aceptación debe basarse en el juicio cientı́fico y
si se trata de un resultado aberrante. en las normas internas del fabricante. Suele ser útil realizar los
No obstante, se requiere una cuidadosa consideración cuando se cálculos con y sin los resultados aberrantes para evaluar su impacto.
utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de errores en las Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso
pruebas de resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como de medición deben informarse (por ejemplo, mediante una nota al
resultados aberrantes cuando en realidad no lo son; y (b) no pie), pero no incluirse en los cálculos estadı́sticos posteriores. Al
identificar resultados aberrantes que sı́ existen. Cualquier juicio evaluar si el producto cumple con un criterio de aceptación en
acerca de la aceptabilidad de los datos en que se observan resultados particular, es importante definir si el resultado a informar (el
aberrantes requiere una interpretación cuidadosa. resultado que se compara con los lı́mites) es un valor promedio, una
La ‘‘designación de resultado aberrante’’ es el reconocimiento medición individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de
informal de valores de laboratorio sospechosos que deben aceptación se establece para un promedio, entonces no es
investigarse con métodos más formales. La elección de la técnica estadı́sticamente apropiado requerir que las mediciones individuales
para la identificación de resultados aberrantes suele depender del también cumplan con el criterio, ya que la variabilidad asociada con
reconocimiento inicial del número y ubicación de los valores. el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier
Frecuentemente, la designación de resultado aberrante se hace medición individual.
visualmente con técnicas gráficas. La ‘‘identificación de resultados
aberrantes’’ implica el uso de pruebas de significancia estadı́stica
para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadı́stico COMPARACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
conocido o supuesto.
Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados Con frecuencia es necesario comparar dos métodos para
aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios farmacéu- determinar si hay una diferencia importante en sus resultados
ticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se promedios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de
incluyen en el Apéndice C ejemplos ilustrativos de tres de estos comparación de métodos es generar datos que permitan evaluar la
procedimientos: la Prueba de Desviación Estudentizada Extrema equivalencia de los dos métodos en toda una gama de concen-
(ESD, por sus siglas en inglés), la Prueba de Dixon y la Regla de traciones. En esta sección se describen algunos de los factores que se
Hampel. deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.
La elección de la prueba adecuada depende del tamaño de la
muestra y de las suposiciones de distribución. Muchas de estas
pruebas (por ejemplo, la Prueba ESD) requieren la suposición de que Precisión
los datos generados por el laboratorio puedan considerarse como una
muestra aleatoria de una población normalmente distribuida, La precisión es el grado de coincidencia entre los resultados de
posiblemente después de su transformación. Si se realiza una pruebas individuales cuando el método analı́tico se aplica repetida-
transformación de los datos, la prueba de resultado aberrante se mente a una muestra homogénea. Para considerar que un método
aplica a los datos transformados. Las transformaciones más comunes alternativo tiene una precisión ‘‘comparable’’ a la del método
incluyen tomar el logaritmo o la raı́z cuadrada de los datos. Existen vigente, su precisión (ver Caracterı́sticas de Desempeño Analı́tico
otros métodos para la manipulación de un resultado aberrante simple en Validación de Métodos Farmacopeicos h1225i) no debe ser peor
y un resultado múltiple que también pueden utilizarse, e incluyen que la del método vigente en un valor considerado importante. Una
pruebas que utilizan medidas robustas de dispersión y tendencia disminución en la precisión (o aumento en la variabilidad) puede
central, como por ejemplo la mediana y la desviación absoluta de la aumentar el número de resultados que no cumplen con las
mediana y métodos de análisis exploratorio de datos (EDA, por sus especificaciones requeridas. Por el contrario, un método alternativo
siglas en inglés). ‘‘Acomodamiento de resultados aberrantes’’ es el que proporciona una precisión superior es aceptable.
uso de técnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o Una manera de comparar la precisión de dos métodos es
rango de cada valor en el conjunto de datos en lugar del valor real, estimando la varianza de cada método (la varianza de la muestra,
para producir resultados que no estén adversamente influidos por la s2, es el cuadrado de la desviación estándar de la muestra) y
presencia de resultados aberrantes. El uso de dichos métodos reduce calculando un intervalo de confianza superior unilateral para la
los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificación de relación de varianzas (verdaderas), en donde relación se define como
resultados aberrantes. la varianza del método alternativo dividida por la varianza del
El ‘‘rechazo de resultados aberrantes’’ es la eliminación efectiva método vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposición en
del resultado aberrante identificado del conjunto de datos. No el Apéndice D. El lı́mite de confianza superior unilateral debe
obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el único compararse con un lı́mite superior considerado aceptable, a priori,
medio para eliminar un resultado aberrante de los datos de por el laboratorio analı́tico. Si el lı́mite de confianza superior
laboratorio. Puede resultar útil como parte de la evaluación de la unilateral es inferior a este lı́mite aceptable superior, la precisión del
significancia de ese resultado, junto con otros datos. Las pruebas de método alternativo se considera aceptable, ya que el uso del método
resultado aberrante no son válidas en aquellos casos en que se alternativo no llevará a una pérdida importante de precisión. Debe
está evaluando la variabilidad del producto, como por ejemplo la tenerse en cuenta que si el lı́mite de confianza superior unilateral es
uniformidad del contenido, la disolución o la determinación de la inferior a uno, se ha comprobado que el método alternativo tiene una
velocidad de liberación. En estos casos, un valor considerado como precisión superior a la del método vigente.
resultado aberrante puede ser en realidad resultado exacto de un El método de intervalo de confianza que se acaba de describir es
producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la significancia
aberrantes, deben conservarse para su análisis futuro. Los datos estadı́stica de la relación de varianzas. Para realizar la prueba F de
inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos dos muestras, la relación de varianzas calculada con las muestras se
históricos, por lo general no son tales sino que reflejan las compara con un valor crı́tico basado en los valores tabulados de la
influencias de fuentes adicionales de variación. distribución F para el nivel de confianza deseado y el número de
En resumen, el rechazo o la conservación de un resultado grados de libertad de cada varianza. La mayorı́a de los textos de
aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo. Deben estadı́stica incluyen tablas con los valores F. Si la relación calculada
tenerse en cuenta las caracterı́sticas de las pruebas, ası́ como el excede este valor crı́tico, se dice que existe una diferencia
conocimiento cientı́fico del proceso de fabricación y el método estadı́sticamente significativa en la precisión de los dos métodos.
analı́tico, para determinar el origen del resultado aparentemente No obstante, si la relación calculada es inferior al valor crı́tico, esto
aberrante. Una prueba de resultado aberrante nunca puede no prueba que los métodos tengan la misma precisión o una
reemplazar una investigación de laboratorio exhaustiva sino que precisión equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para
debe realizarse únicamente cuando la investigación no es con- probar que existe una diferencia estadı́sticamente significativa.
cluyente y no se observaron desviaciones en la fabricación o pruebas
del producto. Incluso si dichas pruebas estadı́sticas indicaran que
uno o más valores son resultados aberrantes, deben conservarse
432 h1010i Datos Analı́ticos—Interpretación y Tratamiento / Información General USP 30
Exactitud podrı́a darse en sentido opuesto, es decir, los métodos podrı́an ser
similares pero los datos no permiten esa conclusión. Esto se llama
La comparación de la exactitud de los métodos (ver Caracterı́s- falso negativo o error de Tipo II. Con los métodos estadı́sticos, no es
ticas de Desempeño Analı́tico en Validación de Métodos Farmaco- posible eliminar completamente la posibilidad de cualquiera de estos
peicos h1225i) proporciona información útil para determinar si el errores. No obstante, al elegir bien el tamaño de la muestra, la
nuevo método es equivalente, en general, al método vigente. Un probabilidad de cada uno de estos errores puede reducirse
método sencillo para realizar esta comparación es calcular un aceptablemente. La probabilidad máxima aceptable de un error de
intervalo de confianza para la diferencia entre las medias verdaderas, Tipo I comúnmente se denomina a y suele considerarse del orden del
donde la diferencia se calcula restando la media del método vigente 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad máxima deseada
de la media de la muestra obtenida con el método alternativo. de un error de Tipo II comúnmente se denomina b. Con frecuencia, b
El intervalo de confianza debe compararse con un lı́mite inferior y se especifica indirectamente eligiendo un nivel deseado de 1 – b, que
un lı́mite superior considerados aceptables, a priori, por el se denomina la ‘‘potencia’’ de la prueba. En el contexto de pruebas
laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del de equivalencia, la potencia es la probabilidad de concluir
rango aceptable, los dos métodos pueden considerarse equivalentes, correctamente que dos métodos son equivalentes. Normalmente, se
ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la toma una potencia del orden del 80% o 90% (correspondiente a un b
práctica. El lı́mite inferior y el superior del intervalo de confianza de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo
sólo muestran el tamaño de la posible diferencia real entre los dos para el experimento debe especificar el d, el a y la potencia. El
métodos y no si la diferencia se considera tolerable. Dicha tamaño de la muestra depende de todos estos componentes. Se
evaluación sólo puede realizarse dentro del contexto cientı́fico incluye un ejemplo en el Apéndice E. Aunque el Apéndice E sólo
adecuado. determina un valor único, suele ser útil determinar una tabla de
El método del intervalo de confianza que se acaba de describir es tamaños de muestras para diferentes opciones de d, a y potencia.
preferible a la práctica de aplicar una prueba t para evaluar la Dicha tabla permite una elección mejor fundamentada del tamaño de
significancia estadı́stica de la diferencia en promedios. Una manera la muestra para equilibrar mejor los recursos y los riesgos
de realizar la prueba t es calculando el intervalo de confianza y (conclusiones falsamente negativas y falsamente positivas).
examinando si contiene o no el valor cero. Los dos métodos
muestran una diferencia estadı́sticamente significativa en promedios
si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia APÉNDICE A: GRÁFICAS DE CONTROL
estadı́sticamente significativa puede no tener una magnitud suficiente
para tener importancia práctica en el laboratorio ya que puede surgir La Figura 1 muestra una gráfica de control para valores
de datos muy precisos o de una muestra de un tamaño mayor. Por individuales. Existen varios métodos diferentes para calcular el
otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia lı́mite de control superior (UCL, por sus siglas en inglés) y el lı́mite
estadı́sticamente significativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de de control inferior (LCL, por sus siglas en inglés). Un método utiliza
confianza incluye el cero y, de todas maneras, no puede descartarse el intervalo móvil, que se define como la diferencia absoluta entre
una diferencia práctica importante. Esto podrı́a ocurrir, por ejemplo, dos mediciones consecutivas (|xi – xi–1|). Estos intervalos móviles se
si los datos son muy variables o si el tamaño de la muestra es promedian ( MR ) y se usan en las siguientes fórmulas:
demasiado pequeño. En consecuencia, si bien el resultado de la
prueba t indica si se ha observado o no una diferencia
estadı́sticamente significativa, no determina la presencia o ausencia
de una diferencia de importancia práctica.
Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESD) procedimientos exactos que Dixon proporciona para un análisis de
Generalizada dos resultados aberrantes simultáneamente; no obstante, estos
procedimientos exceden en el alcance de este Apéndice.
Esta prueba es una versión modificada de la Prueba ESD que
permite analizar hasta un número previamente especificado, r, de
resultados aberrantes de una población normalmente distribuida. Regla de Hampel
Supongamos que r es igual a 2 y que n es igual 10.
Etapa 1 (n = 10)—Normalizar cada resultado restando la media a Paso 1—El primer paso para aplicar la Regla de Hampel es
cada valor y dividiendo esta diferencia por la desviación estándar normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de cada
(ver Tabla 3).5 dato y dividir la diferencia por la desviación estándar, se resta la
Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor media de cada dato y las diferencias resultantes se dividen por la
máximo (|R1| = 2,805), y compararlo con un valor crı́tico tabulado, MAD (ver a continuación). El cálculo de MAD se realiza en tres
previamente especificado, l1 (2,290) basado en el nivel de etapas. En primer lugar, se resta la mediana de cada dato. A
significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor máximo es continuación, se obtienen los valores absolutos de las diferencias,
más grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda que se denominan desviaciones absolutas Por último, se calcula la
con los datos restantes. Las fuentes de los valores l se incluyen en mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la
muchos textos de estadı́stica. Las tablas estadı́sticas deben usarse constante 1,483 para obtener la MAD6.
con cautela para asegurarse de utilizar las notaciones correctas (es Paso 2—El segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos
decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se declara como un
tabla. resultado aberrante. La Tabla 4 resume los cálculos.
Etapa 2 (n = 9)—Eliminar la observación correspondiente al El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado
resultado normalizado absoluto máximo del conjunto de datos aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos
originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La
determinar la media y desviación estándar (Tabla 3, las dos tabla resultante aparece como la Tabla 5. Al igual que en los
columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante.
absoluto de estos resultados. Determinar el máximo de los valores
absolutos de los 9 resultados normalizados (|R2| = 1,905), y
compararlo con l2 (2,215). El valor máximo no es mayor que el APÉNDICE D: COMPARACIÓN DE
valor tabulado. MÉTODOS—PRECISIÓN
Conclusión—El resultado de la primera etapa, 95,7, se declara
resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa, 99,5, no es El siguiente ejemplo muestra el cálculo de un intervalo de
un resultado aberrante. confianza del 90% para la relación de varianzas (verdaderas) a fin de
comparar la precisión de dos métodos. Se supone que la distribución
subyacente de las mediciones de la muestra está bien caracterizada
Pruebas tipo Dixon por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el
laboratorio aceptará el método alternativo si su precisión (medida
Al igual que la Prueba ESD, los dos valores más pequeños se por la varianza) no es más de cuatro veces mayor que la del método
analizan como resultados aberrantes; nuevamente, se supone que los vigente.
datos provienen de un sola población normal. Para determinar el tamaño de muestra adecuado para la precisión,
Etapa 1 (n = 10)—Los resultados se ordenan según su magnitud existe un método de tanteos sucesivos utilizando la siguiente
(por ejemplo, Xn es la observación más grande, Xn–1 es la segunda fórmula:
observación más grande, etc. y X1 es la observación más pequeña).
Las relaciones de la prueba de Dixon se basan en el tamaño de la
muestra (en este ejemplo, n = 10); para declarar X1 es un valor
aberrante, se calcula la relación, r11, según la fórmula siguiente:
99% de la población con una confianza del 99% para 50 muestras es aceptable más grande, d, entre los dos métodos, ahora se formula con
de 3,390. Los lı́mites de tolerancia se calculan de la siguiente respecto a la RSD de la población y la diferencia proporcional
manera: aceptable más grande entre los dos métodos.
99,5 + 3,390 6 2,0;
el intervalo de tolerancia más amplio resultante es de (92,7; 106,3).
De la misma manera, el nuevo LTI de 92,7 y UTL de 106,3
producirı́an un d más pequeño:
A = LTL – LSL para LTL LSL
(A = 92,7 – 90,0 = 2,7); en donde
B = USL – UTL para USL UTL
(B = 110,0 – 106,3 = 3,7); y
d = mı́nimo (A, B) = 2,7.
La elección de un d más grande lleva a un n más pequeño pero al
costo de aumentar el riesgo de una conclusión errónea.
Tamaño de la Muestra
Existen fórmulas que pueden utilizarse para un d especı́fico,
suponiendo que se conocen las varianzas de la población y que son
iguales, para calcular el número de muestras que se debe analizar por
método, n. El nivel de confianza y la potencia también deben
especificarse. [NOTA—Potencia se refiere a la probabilidad de llegar a y r representa la diferencia proporcional aceptable más grande entre
la conclusión correcta de que dos métodos idénticos son equivalen- los dos métodos ((alternativo-vigente)/vigente) y se supone que las
tes.] Por ejemplo, si d = 4,7 y se supone que las varianzas de las dos RSD de la población son conocidas e iguales.
poblaciones son iguales a 4,0; entonces, para una prueba de un nivel
del 5%9 y una potencia del 80% (con los correspondientes valores z
de 1,645 y 1,282, respectivamente), el tamaño de la muestra APÉNDICE F: FUENTES DE INFORMACIÓN
aproximado se calcula según la siguiente fórmula: ADICIONALES
Es posible utilizar una gran variedad de pruebas estadı́sticas para
evaluar un conjunto de datos. Este capı́tulo presenta varias pruebas
que permiten interpretar y manejar datos analı́ticos, pero pueden
emplearse otras pruebas semejantes. En este capı́tulo simplemente se
ilustra el análisis de datos usando métodos estadı́sticamente
aceptables. Como se menciona en la Introducción, las pruebas
especı́ficas se incluyen con fines ilustrativos únicamente y USP no
avala ninguna de estas pruebas como único método para el
tratamiento de los datos analı́ticos. Puede encontrarse información
adicional y pruebas alternativas en las referencias enumeradas a
continuación o en muchos textos de estadı́stica.
Gráficas de Control:
1. Manual on Presentation of Data and Control Chart Analysis, 6a
ed., American Society for Testing and Materials (ASTM),
En consecuencia, suponiendo que cada método tiene una varianza Philadelphia, 1996.
poblacional, s2, de 4,0, el número de muestras, n, requerido para 2. Grant, E.L., Leavenworth, R.S., Statistical Quality Control, 7a
concluir con una probabilidad de 80% que los dos métodos son ed., McGraw-Hill, New York, 1996.
equivalentes (el intervalo de confianza del 90% para la diferencia en 3. Montgomery, D.C., Introduction to Statistical Quality Control,
las medias verdaderas se encuentra entre –4,7 y +4,7) cuando, en 3a ed., John Wiley and Sons, New York, 1997.
realidad, son idénticos (la diferencia de medias verdadera es cero) es 4. Ott, E., Schilling, E., Neubauer, D., Process Quality Control:
4. Como se utilizó la distribución normal en la fórmula anterior, 4 es Troubleshooting and Interpretation of Data, 3a ed., McGraw-
en realidad un lı́mite inferior en el tamaño de muestra requerido. Si Hill, New York, 2000.
es factible, podrı́a convenir un tamaño de muestra más grande. Los Diferencias Detectables y Determinación del Tamaño de
valores de z para niveles de confianza comunes se presentan en la Muestra:
Tabla 8. La fórmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la 1. CRC Handbook of Tables for Probability and Statistics, 2a ed.,
varianza usada en el cálculo del tamaño de la muestra se basa en una Beyer W.H., ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1985.
cantidad de datos previos suficientemente grande que pueden tratarse 2. Cohen, J., Statistical Power Analysis for the Behavioral
como conocidos; 2) se utiliza la primera varianza conocida previa en Sciences, 2a ed., Lawrence Erlbaum Associates, Hillsdale, NJ,
el nuevo experimento, o el tamaño de la muestra para el nuevo 1988.
experimento es lo suficientemente grande como para que la 3. Fleiss, J.L., The Design and Analysis of Clinical Experiments,
distribución normal sea una buena aproximación a la distribución John Wiley and Sons, New York, 1986, págs. 369–375.
t; y 3) el laboratorio está seguro de que no existe ninguna diferencia 4. Juran, J.A., Godfrey, B., Juran’s Quality Handbook, 5a ed.,
real en las medias, que es el caso más optimista. No es común que se McGraw Hill, 1999, Section 44, Basic Statistical Methods.
den estas tres suposiciones. La fórmula anterior debe tratarse con 5. Lipsey, M.W., Design Sensitivity Statistical Power for Expe-
más frecuencia como una aproximación inicial. Las desviaciones de rimental Research, Sage Publications, Newbury Park, CA,
estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamaño de 1990.
muestra más grande. En general, se recomienda recurrir a alguna 6. Montgomery, D.C., Design and Analysis of Experiments, John
persona familiarizada con los métodos necesarios. Wiley and Sons, New York, 1984.
Cuando se requiere una transformación logarı́tmica para lograr la 7. Natrella, M.G., Experimental Statistics Handbook 91; National
normalidad, la fórmula de tamaño de la muestra debe ajustarse Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, 1991
ligeramente como se indica a continuación. En lugar de formular los (reimpresión del texto original de agosto de 1963).
problemas con respecto a la varianza de la población y la diferencia 8. Kraemer, H.C., Thiemann, S., How Many Subjects?: Statistical
Power Analysis in Research, Sage Publications, Newbury Park,
9
Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel 5% corresponde a un CA, 1987.
intervalo de confianza del 90%.
USP 30 Información General / h1010i Datos Analı́ticos—Interpretación y Tratamiento 437
9. van Belle G., Martin, D.C., ‘‘Sample size as a function of 3. Dixon, W.J., ‘‘Processing data for outliers,’’ Biometrics 1953;
coefficient of variation and ratio of means’’, American 9(1):74–89.
Statistician 1993; 47(3): 165–167. 4. Grubbs, F.E., ‘‘Procedures for detecting outlying observations
10. Westlake, W.J., response to Kirkwood, T.B.L.: ‘‘Bioequivalence in samples,’’ Technometrics 1969; 11 : 1–21.
testing—a need to rethink,’’ Biometrics 1981; 37 : 589–594. 5. Hampel, F.R., ‘‘The breakdown points of the mean combined
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TABLAS
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisión
Número de la Número del Análisis
Repetición 1 2 3 4 5
1 100,70 99,46 99,96 101,80 101,91
2 101,05 99,37 100,17 102,16 102,00
3 101,15 99,59 101,01 102,44 101,67
Media 100,97 99,47 100,38 102,13 101,86
Desviación Estándar 0,236 0,111 0,556 0,321 0,171
RSD1 0,234% 0,111% 0,554% 0,314% 0,167%
1
RSD (desviación estándar relativa) = 100% 6 (desviación estándar/media)
438 h1010i Datos Analı́ticos—Interpretación y Tratamiento / Información General USP 30
Tabla 1A. Tabla de Análisis de Varianza para los Datos Presentados en la Tabla 1
Fuente de Grados de Libertad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios1
Variación (df) (SS) (MS) F =MSB /MSW
Entre Análisis 4 14,200 3,550 34,80
Intra-análisis 10 1,018 0,102
Total 14 15,217
1
Los Cuadrados Medios Entre (MSB) = SSentre/dfentre y los Cuadrados Medios Intra (MSW) = SSIntra/dfIntra
Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaños de Muestras (Especı́ficas para el Ejemplo del Apéndice D)
Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Análisis Independientes (Especı́ficos para el Ejemplo del Apéndice D)
Varianza Tamaño de la Grados de
Método (desviación estándar) Muestra Libertad
Alternativo 45,0 (6,71) 20 19
Vigente 25,0 (5,00) 20 19
generalmente reciben sólo una dosis única de fármaco radioactivo tiempo, la temperatura, la presión, el volumen y la secuencia. Estos
reducen al mı́nimo la posibilidad de administrar cantidades nocivas parámetros se pueden controlar y restringir para que estén dentro de
de impurezas quı́micas. Estas afirmaciones no intentan rebatir la ciertos lı́mites.
necesidad del control de calidad en el manejo de equipos Garantı́a de Calidad del Equipo—El objetivo de la garantı́a de
automatizados de sı́ntesis, sino colocar la fabricación de radio- calidad es ayudar a asegurar que el radiofármaco posterior cumpla
fármacos que emiten positrones en una perspectiva adecuada y las normas farmacopeicas. Aunque los reglamentos sobre las buenas
enfatizar una vez más la enorme importancia de la validación prácticas de fabricación (21 CFR 820) no sean aplicables, pueden
anticipada de procesos y el control de calidad del producto resultar útiles para crear un programa de garantı́a de calidad. En la
terminado. práctica, esto comprende la medición y el control documentados de
La sı́ntesis de rutina de radiofármacos puede exponer al personal a todos los parámetros fı́sicos pertinentes controlados por los aparatos
dosis innecesariamente altas de radiación. Los dispositivos auto- de sı́ntesis.
matizados de sı́ntesis radioquı́mica se han ideado, en parte, para Prueba de Control de Calidad de Rutina—La prueba de control
cumplir con el concepto de reducir las exposiciones del personal a la de calidad de un equipo automatizado implica el examen periódico
radiación ‘‘hasta el menor grado razonablemente posible’’ (ALARA, de todos los parámetros certificados inicialmente durante la
del inglés "as low as reasonably achievable"). Estos dispositivos calificación de garantı́a de calidad. La frecuencia de la prueba
automatizados de sı́ntesis pueden ser más precisos y eficaces que los puede ser diaria, dependiendo de la importancia y la estabilidad de
métodos manuales existentes. Dichos métodos automatizados son los parámetros. Esta evaluación del funcionamiento del proceso se
particularmente útiles cuando una sı́ntesis radioquı́mica requiere debe aumentar por medio de pruebas periódicas del producto final.
manipulaciones repetitivas y uniformes a diario. Por ejemplo, se pueden aceptar las variaciones en la temperatura de
Los productos de estos dispositivos automatizados de radiosı́ntesis un baño de aceite si el radioquı́mico (producto final) demuestra que
deben cumplir los mismos criterios de garantı́a de calidad que los cumple todos los criterios pertinentes de la prueba.
productos obtenidos mediante sı́ntesis manual convencional. En el
caso de radiofármacos que emiten positrones, estos criterios incluyen Auditorı́a de Verificación de Calidad de los Reactivos—Los
muchas de las mismas determinaciones que se usan para los materiales y reactivos utilizados para la sı́ntesis de radiofármacos
radiofármacos utilizados en medicina nuclear convencional, por deben ajustarse a las especificaciones y las pruebas establecidas de
ejemplo, pruebas de esterilidad y de endotoxinas bacterianas. Se control de calidad. Se deben establecer los procedimientos para las
aplican muchas de las mismas limitaciones. En general no se pueden pruebas, el almacenamiento y el uso de estos materiales. En este
aplicar los procedimientos tı́picos, como por ejemplo la espectros- contexto, un reactivo se define como cualquier producto quı́mico
copia, debido a que la cantidad de producto es tan pequeña que cae utilizado en el procedimiento que conduce al producto radioquı́mico
debajo del nivel de detección mı́nima del método. En todos los final, mientras que los materiales se definen sólo como suministros
casos, el método farmacopeico aplicable es el árbitro decisivo (ver complementarios (tubos, materiales de vidrio, viales, etc.). Por
Procedimiento en Pruebas y Valoraciones en las Advertencias ejemplo, en algunos procesos se emplea nitrógeno comprimido para
Generales). mover reactivos lı́quidos. En este caso, tanto el nitrógeno como los
La preparación de la Inyección de Fludesoxiglucosa F 18 y otros tubos deben cumplir las especificaciones establecidas.
radiofármacos que emiten positrones se puede adaptar fácilmente a Documentación de Parámetros del Aparato—Se deben identi-
la sı́ntesis automatizada. En general, el equipo necesario para los ficar, controlar y documentar las variables fundamentales de la
métodos manuales es más sencillo y menos costoso que el que se sı́ntesis. Estas caracterı́sticas comprenden importantes atributos
emplea en los métodos automatizados, pero requiere mayor trabajo. fı́sicos, quı́micos, eléctricos y de funcionamiento. Para microproce-
Son de particular interés los métodos relacionados con la validación sadores y dispositivos controlados por computadora es particular-
del rendimiento correcto de un aparato automatizado. En un mente importante un método para especificar, probar y documentar
procedimiento manual, la intervención humana y la corrección los programas y las piezas de la computadora. Este procedimiento
mediante inspección pueden evitar muchos errores de procedi- debe incluir un análisis general y periódico de los componentes de la
miento. En un sistema automatizado, la retroalimentación eficaz computadora. Además, se debe examinar periódicamente el código
también puede comenzar durante la sı́ntesis. Por ejemplo, los del programa informático para determinar que no se haya modificado
detectores de radiación pueden controlar la actividad en varias etapas y que continúa dando como resultado el producto final que cumple
de la radiosı́ntesis. Cuando no se logra la actividad adecuada se todas las especificaciones. La retroalimentación durante el proceso es
puede activar un sistema de alarma que conduce a la intervención un medio para confirmar que la sı́ntesis está bajo control. Los
humana. cambios de código en los programas deben incluir un procedimiento
Radioquı́micos frente a Radiofármacos—Se debe establecer de autorización formal y se deben documentar.
una distinción entre un radioquı́mico y el radiofármaco correspon- Cada tipo de dispositivo de sı́ntesis radioquı́mica requiere un
diente. En los centros de investigación de TEP, los equipos conjunto de procedimientos especı́ficos para probar y controlar la
automatizados se emplean para preparar compuestos marcados confiabilidad y reproducibilidad de los diversos subsistemas que
para experimentos con animales. Estos radioquı́micos no se conforman el sistema total de sı́ntesis.
consideran radiofármacos si (1) no están preparados de acuerdo a Es esencial que la calibración de cada uno de los componentes se
un proceso validado que proporcione un alto grado de seguridad y confirme de acuerdo con un cronograma de mantenimiento
garantice que la preparación cumpla todos los requisitos establecidos establecido y que las mediciones o el control se realicen bajo las
de calidad y pureza; y (2) no han sido certificados por personal condiciones reales de sı́ntesis.
calificado (farmacéuticos y médicos autorizados) de conformidad Se deben medir los tiempos de entrega, los volúmenes de reactivo,
con los métodos farmacopeicos publicados para los radiofármacos las temperaturas, las presiones de los gases y las velocidades de flujo
individuales. y deben demostrar ser estables y reproducibles dentro de los lı́mites
establecidos. El agregado de los reactivos y disolventes se debe
Equipo automatizado—Las consideraciones que se hacen en este calibrar periódicamente. Otros componentes que se deben calibrar de
capı́tulo corresponden a la sı́ntesis que se lleva a cabo mediante forma rutinaria incluyen el sistema de detección de radiaciones y los
robots de uso general y aparatos especiales. Ambos son dispositivos sensores y el sistema de control de procesos.
automatizados que se emplean en la sı́ntesis de radioquı́micos. El Como ejemplo, se indican a continuación los elementos de
método exacto de control de los dispositivos de sı́ntesis es variable. validación de los sistemas de varios componentes representativos de
Tanto los dispositivos de sı́ntesis controlados electrónicamente como un dispositivo automático de sı́ntesis:
los controlados por programas informáticos caen dentro de la Los recipientes de reacción se pueden limpiar e inspeccionar
designación general y tienen un espectro que varı́a desde el equipo mediante un método establecido y documentado. Los recipientes se
manual tradicional, pasando por dispositivos semiautomatizados, pueden enumerar y se puede hacer un seguimiento de su desempeño.
hasta dispositivos completamente automáticos. Los sistemas de calentamiento y enfriamiento (como por ejemplo
Elementos Comunes de Equipos Automatizados de Sı́ntesis—Para los baños de aceite) se pueden controlar por medio de termómetros o
manipular un aparato quı́mico que efectúe la sı́ntesis de un termocuplas. Las temperaturas se pueden registrar en una hoja de
radioquı́mico, es necesario controlar parámetros tales como el partida o se pueden imprimir automáticamente como parte de un
registro computarizado. El mantenimiento implica la calibración
periódica.
USP 30 Información General / h1031i Biocompatibilidad de los Materiales Usados 441
Los gases y el funcionamiento del sistema de entrega de gas se Similares h161i, Cierres Elastoméricos para Inyectables h381i y
pueden controlar por medio de manómetros y flujómetros. La pureza Envases h661i. Los procedimientos de prueba in vitro e in vivo
del gas se puede establecer por medio de certificados de análisis especı́ficos para evaluar la biocompatibilidad de productos médicos
emitidos por el proveedor o se puede verificar mediante una prueba en pacientes se describen en Pruebas de Reactividad Biológica, In
independiente. El mantenimiento de los manómetros y flujómetros Vitro h87i y en Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo h88i.
implica la calibración periódica con estándares. Los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad de un
El desempeño motriz dependiente de la posición se puede verificar producto médico o de los materiales empleados en su elaboración se
por medio de interruptores de lı́mite. El mantenimiento podrı́a han categorizado como un panel de efectos biológicos (procedi-
implicar la medición real de la distancia recorrida y el tiempo mientos de toxicidad): citotoxicidad, sensibilización, irritación o
transcurrido. reactividad intracutánea, toxicidad sistémica aguda, toxicidad
Las válvulas solenoides se pueden controlar eléctricamente, por subcrónica (toxicidad subaguda), genotoxicidad, implantación,
medio de pruebas de flujo y presión. hemocompatibilidad, toxicidad crónica (duración de más de 10%
El rendimiento del calentador se evidencia por medio de lecturas de la expectativa de vida del animal de prueba o mayor de 90 dı́as),
adecuadas de la termocupla. Otras pruebas podrı́an incluir carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo y biode-
determinaciones de resistencia. gradación.1 En la Tabla 1 se indican los capı́tulos generales de USP
Los reactivos se pueden aceptar sobre la base de los certificados referentes a los procedimientos de toxicidad para estas categorı́as.
de análisis del proveedor. Como alternativa, el producto quı́mico se Además, la pirogenicidad, un tema de toxicidad especial, se evalúa
podrı́a analizar internamente o enviar a un laboratorio independiente. en Prueba de Pirógenos h151i y en Prueba de Endotoxinas
Según el grado de estabilidad, puede ser necesaria la repetición Bacterianas h85i. Actualmente no existen capı́tulos generales que
periódica de pruebas. detallen los requisitos de las pruebas de sensibilización, toxicidad
Los programas informáticos se pueden probar mediante la subcrónica, genotoxicidad, toxicidad crónica, carcinogenicidad,
documentación del tiempo de sı́ntesis transcurrido, con impresos hemotoxicidad, toxicidad reproductiva o biodegradación.
que verifiquen que se efectuaron todas las manipulaciones
adecuadas, inclusive impresiones de los parámetros pertinentes
como tiempos, temperatura, presiones y actividades. ENVASES DE MEDICAMENTOS
Los patrones de distribución de actividades, como por ejemplo la
cantidad absoluta de producto, el porcentaje de rendimiento y los Biocompatibilidad de los Envases de Plástico y de
niveles individuales de actividad de las impurezas, brindan al usuario
experimentado una oportunidad para localizar fallas del sistema. Otros Polı́meros para Medicamentos
Cambios en el Método de Sı́ntesis—Algunos cambios en los Los envases farmacéuticos consisten en un recipiente y un cierre.
aparatos de sı́ntesis se pueden considerar no significativos. A Los envases de plástico pueden estar formados por polı́meros que
menudo, esta categorı́a incluye cambios que no afectan a ninguno de tras su extracción no alteran la estabilidad del producto contenido ni
los parámetros controlados. Sin embargo, es importante tener muestran toxicidad. Los requisitos de la prueba de biocompatibilidad
cuidado para garantizar que los cambios que parecen inofensivos para los envases de medicamentos se especifican en Inyectables h1i
no tengan un efecto inesperado. Por ejemplo, cambios en una lı́nea y Envases h661i. Como se indica en estos capı́tulos, el plástico u
de comentario de un programa informático pueden provocar un otras porciones poliméricas de estos productos se prueban según los
cambio inadvertido o la eliminación de una instrucción importante. procedimientos definidos en Pruebas de Reactividad Biológica, In
Cualquier cambio en los parámetros controlados puede cambiar el Vitro h87i. Los plásticos u otros polı́meros que no cumplan con los
resultado del proceso. Si el radioquı́mico resultante no cumple con requisitos de las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro h87i no
las especificaciones o si el radiofármaco posterior no satisface los son materiales adecuados para envases de medicamentos. Los
criterios farmacopeicos, el cambio del proceso es inaceptable; se materiales que cumplen con los requisitos in vitro están calificados
debe corregir la falla y volver a validar el proceso. como materiales biocompatibles sin la necesidad de pruebas
adicionales y se pueden usar para fabricar envases de medicamentos.
Si se desea una designación de clase (clases I–VI) para los plásticos
u otros polı́meros, hay que realizar los procedimientos de prueba
adecuados que se presentan en la sección Pruebas In Vivo y
h1031i BIOCOMPATIBILIDAD DE Designación de Clase.
LOS MATERIALES USADOS EN
ENVASES DE MEDICAMENTOS, Cierres Elastoméricos
DISPOSITIVOS MÉDICOS E Los cierres elastoméricos son cierres que se pueden perforar con
una jeringa y mantener su integridad debido a sus propiedades
IMPLANTES elásticas. Los materiales elastoméricos pueden estar compuestos de
varias entidades quı́micas, incluyendo material de relleno, pigmen-
tos, plastificantes, estabilizadores, aceleradores, agentes vulcani-
zantes y un polı́mero natural o sintético. Estos materiales se usan
Este capı́tulo proporciona pautas para la identificación y para la fabricación de un producto que tenga las propiedades fı́sicas
realización de los procedimientos para evaluar la biocompatibilidad elastoméricas deseadas y a menudo demuestran reactividad biológica
de los envases de medicamentos, cierres elastoméricos, dispositivos —degeneración y malformación celular— cuando se les realizan
médicos e implantes. La biocompatibilidad se refiere a la tendencia pruebas con cultivos celulares in vitro.
de estos productos a mantenerse biológicamente inertes durante todo La biocompatibilidad de un material elastomérico se evalúa según
su perı́odo de contacto con el organismo. Los procedimientos de el protocolo de prueba de dos etapas especificado en Procedimientos
prueba de biocompatibilidad nombrados en este capı́tulo están para Prueba Biológica en Cierres Elastoméricos para Inyectables
diseñados para detectar las caracterı́sticas no especı́ficas de h381i. A diferencia de los plásticos u otros polı́meros, un material
reactividad biológica, fı́sicas o quı́micas de los productos médicos elastomérico que no cumple con los requisitos de las pruebas de
o de los materiales usados en su construcción. Junto con las pruebas primera etapa (in vitro) puede aceptarse como material biocompa-
quı́micas, estos procedimientos biológicos se pueden usar para tible si pasa las pruebas de segunda etapa (in vivo) que son la Prueba
detectar e identificar la toxicidad inherente o adquirida de los de Inyección Sistémica y la Prueba Intracutánea descritas en
productos médicos antes o durante su fabricación y procesamiento. Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo h88i. No se hace
En los siguientes capı́tulos generales se hace referencia a los distinción de clase ni de tipo entre los materiales elastoméricos que
procedimientos de prueba preclı́nicos para evaluar la seguridad de cumplen con los requisitos de la las pruebas de primera etapa y los
los elastómeros, plásticos u otros polı́meros usados en la elaboración
de productos médicos: Inyectables h1i, Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vitro h87i, Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 1
Documento ISO 10993-1 : 1997 titulado ‘‘Biological Evaluation of Medical
h88i, Equipos para Transfusión e Infusión y Dispositivos Médicos Devices—Part 1: Evaluation and Testing’’.
442 h1031i Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General USP 30
aceptables como materiales biocompatibles al cumplir con los elaboración de dispositivos médicos si cumplen con los requisitos de
requisitos de segunda etapa. Los materiales elastoméricos no reciben la Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba Intracutánea en
una designación clase I–VI. Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo h88i. Al igual que para
los envases de medicamentos, los plásticos y otros polı́meros que no
cumplen con los requisitos de la prueba in vitro no son materiales
DISPOSITIVOS MÉDICOS E IMPLANTES aptos para ser utilizados en dispositivos médicos.
Superficies Lesionadas Dispositivos en contacto con superficies Dispositivos para curación o apósitos
o Afectadas corporales lesionadas o afectadas de para úlceras, quemaduras y tejido de
algún modo granulación, y parches oclusivos
Vı́a Sanguı́nea, Indirecta Dispositivos en contacto con la vı́a Equipos para administración de solu-
sanguı́nea en un punto y que sirven de ciones, equipos de extensión, equipos
conducto para ingresar al sistema vas- de transferencia y equipos para admi-
cular nistración de sangre
Dispositivos En Comunicación con Dispositivos y materiales en comu- Laparoscopios, artroscopios, sistemas
Externos de Tejido, nicación con tejidos, hueso, o el de drenaje, cementos dentales, materia-
Comunicación Hueso o Dentina sistema de pulpa y dentina les de oclusión dental y grapas para piel
Dispositivos de Implante Tejido o Hueso Dispositivos principalmente en Ejemplos de los primeros son varillas
contacto con huesos o con tejidos ortopédicas, placas, articulaciones de
y fluidos de tejidos reemplazo, prótesis óseas, cementos y
dispositivos intraóseos; ejemplos de los
segundos son marcapasos, dispositivos
de administración de fármacos, sensores
y simuladores neuromusculares, ten-
dones de reemplazo, implantes mama-
rios, laringes artificiales, implantes
subperiosteales y pinzas de ligadura
Sangre Dispositivos principalmente en contacto Electrodos de marcapasos, fı́stulas
con sangre arteriovenosas artificiales, válvulas car-
dı́acas, injertos vasculares, catéteres
internos de administración de fármacos
y dispositivos de asistencia ventricular
cuerpo. La duración del contacto se define como (A) limitada (menos por ejemplo el uso de dispositivos de implante permanente o
de 24 horas); (B) prolongada (de 24 horas a 30 dı́as); o (C) dispositivos externos de comunicación para mujeres embarazadas.
permanente (más de 30 dı́as). Los efectos biológicos que se incluyen En la matriz se proporcionan las pautas para la identificación de
en la matriz son citotoxicidad, sensibilización, irritación o posibles procedimientos de prueba adicionales para cada subcate-
reactividad intracutánea, toxicidad sistémica, toxicidad subcrónica, gorı́a de dispositivos médicos.
genotoxicidad, implantación, hemocompatibilidad, toxicidad
crónica, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva o del desarrollo
y biodegradación. Los capı́tulos generales que contienen el PAUTAS PARA LA SELECCIÓN DE LA
procedimiento de prueba de toxicidad para estos efectos biológicos DESIGNACIÓN DE CLASE DEL PLÁSTICO U
se indican en la Tabla 1.
Cada subcategorı́a de la matriz tiene un panel asociado de OTRO POLÍMERO PARA UN DISPOSITIVO
requisitos de prueba. Generalmente, la cantidad de pruebas en el MÉDICO
panel aumenta cuando aumenta la duración del contacto entre el
dispositivo y el cuerpo y a medida que el dispositivo o implante Para proporcionar pautas para la selección de la designación de
está en contacto más cercano con el sistema circulatorio. Dentro de clase adecuada de un plástico u otro polı́mero para un dispositivo
varias subcategorı́as, la opción de realizar pruebas adicionales a las médico, se asigna a cada subcategorı́a de los Dispositivos de
requeridas se deberá considerar caso por caso. Para tomar decisiones Superficie (ver Figura 2) y los Dispositivos Externos de
con respecto a la inclusión de pruebas reproductivas o de desarrollo, Comunicación (ver Figura 3) una designación según la Clase de
el fabricante deberá tomar en cuenta situaciones especı́ficas, como Plástico de USP (ver Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo
h88i). Si las pruebas para cada designación de clase de USP no son
446 h1031i Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General USP 30
Fig. 2. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polı́meros para dispositivos de superficie.
*
Categorización basada en la duración del contacto: limitada—menos de 24 horas; prolongada—de 24 horas a 30 dı́as; permanente—más de
30 dı́as.
{ Designación según USP de la Clase de Plástico.
Fig. 3. Requisitos de USP para la clase de plástico y otros polı́meros para dispositivos externos de comunicación.
*
Categorización basada en la duración del contacto: limitada—menos de 24 horas; prolongada—de 24 horas a 30 dı́as; permanente—más de
30 dı́as.
{ Designación de la Clase de Plástico según USP.
suficientes para un dispositivo especı́fico, el fabricante o profesional La asignación de una designación de clase de plástico u otro
debe desarrollar un conjunto de pruebas adecuado. El número de polı́mero a una subcategorı́a no está pensada para restringir el uso de
clase numérica indicado aumenta en relación a la duración (riesgo) clases superiores de plásticos u otros polı́meros. Si bien la clase
del contacto entre el dispositivo y el cuerpo. En la categorı́a de asignada define la clase numérica más baja de plástico u otro
Dispositivos de Implante es obligatorio usar exclusivamente la clase polı́mero que se puede usar en el dispositivo correspondiente, el uso
VI. La asignación de la designación de la Clase de Plástico de USP de una clase numérica superior de plástico es opcional. Cuando un
se basa en las matrices de selección de prueba ilustradas en las dispositivo se puede definir como perteneciente a más de una
Tablas 3, 4 y 5. categorı́a de dispositivo, el plástico u otro polı́mero debe cumplir con
los requisitos de la clase numérica más alta.
Tabla 3. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos de Superficie.*
USP 30
Toxicidad Toxicidad
Subcró- Repro-
Duración Irritación o Toxicidad nica Hemo- ductiva o Biode-
del Con- Citoto- Sensibili- Reactividad Sistémica (Sub- Genoto- Implanta- compati- Toxicidad Carcino- del Desa- grada-
Contacto Corporal tactoa xicidad zación Intracutánea (Aguda) aguda) xicidad ción bilidad Crónica genicidad rrollo ción
A X X X — — — — — — — — —
Piel B X X X — — — — — — — — —
C X X X — — — — — — — — —
Dispositivos A X X X — — — — — — — — —
de Superficie Membrana B X X X O O — O — — — — —
Mucosa C X X X O X X O — O — — —
Superficies A X X X O — — — — — — — —
Lesionadas o B X X X O O — O — — — — —
Afectadas C X X X O X X O — O — — —
a
Leyenda A—limitada (menos de 24 horas); B—prolongada (de 24 horas a 30 dı́as); C—permanente (más de 30 dı́as).
b
Leyenda X—pruebas de evaluación ISO a considerar; O—pruebas adicionales que pueden ser aplicables.
*
Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar).
Información General / h1031i Biocompatibilidad de los Materiales Usados
447
Tabla 4. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos Externos de Comunicación.*
448
Dispositivos Comunicación A X X X O — — — — — — — —
Externos de con Tejido, B X X O O O X X — — — — —
Comunicación Hueso o Den-
tina C X X O O O X X — X X — —
Sangre en A X X X X — O — X — — — —
Circulación B X X X X O X O X — — — —
C X X X X X X O X X X — —
a
Leyenda A—limitada (menos de 24 horas); B—prolongada (de 24 horas a 30 dı́as); C—permanente (más de 30 dı́as).
b
Leyenda X—pruebas de evaluación ISO a considerar; O—pruebas adicionales que pueden ser aplicables.
*
Adaptado de Blue Book Memorandum #G95-1 de la FDA (Tabla 1. Pruebas de Evaluación Iniciales a Considerar y Tabla 2. Pruebas de Evaluación Suplementarias a Considerar).
h1031i Biocompatibilidad de los Materiales Usados / Información General
USP 30
Tabla 5. Matriz de Selección de Prueba para Dispositivos de Implante.*
USP 30
Selección de Indicadores para Procesos de reducción del tı́tulo de endotoxinas en tres o más unidades
Esterilización Especı́ficos logarı́tmicas dará como resultado un proceso que logra una
probabilidad de no esterilidad mucho menor de 10–6.
La selección de un indicador biológico requiere el conocimiento Radiación Ionizante—Las esporas de Bacillus pumilus se han
de la resistencia del sistema indicador biológico con respecto al usado para controlar los procesos de esterilización que emplean
proceso de esterilización especı́fico. Se debe establecer que el radiación ionizante; sin embargo, esta práctica se está abandonando.
sistema indicador biológico ofrece una mayor resistencia al proceso Para establecer procesos de radiación se han utilizado ampliamente
de esterilización que la correspondiente a la carga microbiana natural métodos de ajuste de dosis de radiación que no usan indicadores
presente en el producto. biológicos. Además, ciertos microorganismos de la biocarga pueden
El uso eficaz de indicadores biológicos en el ciclo de desarrollo, presentar mayor resistencia a la radiación que Bacillus pumilus.
proceso y validación del producto y en el control de la producción de Óxido de Etileno—En la esterilización por óxido de etileno,
rutina de un proceso de esterilización requiere un profundo habitualmente se emplean esporas de una subespecie de Bacillus
conocimiento del producto que se va a esterilizar y de sus subtilis (Bacillus subtilis var. niger). Generalmente se emplean los
componentes (materiales y envase). En el desarrollo o la validación mismos sistemas indicadores biológicos para la esterilización por
de un proceso de esterilización sólo se deben usar los indicadores óxido de etileno al 100% y para sistemas de óxido de etileno con un
biológicos ampliamente reconocidos en la monografı́a del indicador gas transportador.
biológico especı́fico. Esto garantizará que el indicador biológico Peróxido de Hidrógeno en Fase de Vapor (VPHP por sus siglas
seleccionado represente un desafı́o mayor para el proceso de en inglés)—Este proceso ha demostrado ser eficaz para esterilizar o
esterilización que la biocarga presente en el producto. Es posible descontaminar superficies. El VPHP puede lograr la esterilización
que algunos usuarios necesiten indicadores biológicos con caracte- (probabilidad de no esterilidad menor de uno en un millón) cuando
rı́sticas que difieran de las que poseen los que están disponibles las condiciones del proceso ası́ lo requieran y si el objeto de la
comercialmente. En dichos casos, los usuarios pueden desarrollar sus esterilización está adecuadamente configurado. Sin embargo, el
propios cultivos de esporas con el propósito expreso de preparar VPHP también se emplea habitualmente como agente descontami-
indicadores biológicos para su uso interno especı́fico. En dicho caso, nante de superficies en el tratamiento de pruebas de esterilidad,
se aconsejará al usuario que utilice microorganismos ya descritos en contención quı́mica y biológica, fabricación de aisladores y cuartos
publicaciones cientı́ficas como microorganismos indicadores y el limpios.
usuario debe tener la capacidad de determinar los valores D y z de La descontaminación de superficies es un proceso distinto de la
los indicadores biológicos de uso interno. Cuando los indicadores esterilización de materiales que entran en contacto con el producto,
biológicos se preparan internamente, los usuarios deben confirmar la sistemas de envase-cierre o producto. Es un proceso ideado para
población, la pureza y la vida útil del indicador biológico para dejar un entorno libre de microorganismos detectables o recupera-
asegurar la validez de cualquier prueba que se lleve a cabo con el bles. Los indicadores biológicos se utilizan frecuentemente para
indicador interno. Cuando se emplea un diseño de un proceso de verificar la eficacia del proceso de descontaminación. Sin embargo,
esterilización basado en la biocarga, son esenciales los datos que en el caso de la descontaminación, un valor de tres a cuatro unidades
comparan la resistencia del indicador biológico con la resistencia de de reducción logarı́tmica de esporas es adecuado, porque el objetivo
la biocarga. Además, se requiere el recuento del contenido de la es la descontaminación más que la esterilización.
biocarga de los artı́culos que se esterilizan. El proceso puede dar Bacillus stearothermophilus es el indicador biológico más
como resultado una letalidad verificada desde el punto de vista utilizado para validar el proceso VPHP. Otros microorganismos
biológico suficiente para lograr que la probabilidad de obtener una que pueden resultar útiles como indicadores biológicos en procesos
unidad no estéril sea menos de una en un millón. VPHP son las esporas de Bacillus subtilis y Clostridium sporogenes.
Como alternativa, se puede usar el método de sobremuerte en el Se pueden considerar otros microorganismos si sus reacciones al
diseño de un proceso de esterilización. En este caso, se hacen VPHP son similares a las de los microorganismos citados
presunciones especı́ficas con respecto a la resistencia presupuesta al anteriormente.
establecer los requisitos de letalidad del proceso de esterilización. En Estas esporas se pueden inocular en la superficie de varios
general, todos los procesos de sobremuerte se elaboran basándose en sistemas transportadores impermeables a los gases cuyas superficies
la suposición de que la biocarga es igual a un millón de sean de vidrio, metal o plástico. Las superficies muy absorbentes,
microorganismos y que los microorganismos son muy resistentes. como por ejemplo los sustratos fibrosos o cualquier otro sustrato que
En consecuencia, para lograr la probabilidad requerida de una unidad absorba fácilmente VPHP o humedad, pueden influir de manera
no estéril menor de uno en un millón, se necesita como mı́nimo un adversa sobre la concentración de VPHP disponible para inactivar
proceso 12 D. Un proceso 12 D se define como un proceso lo los microorganismos inoculados. No se usan sustratos de papel
suficientemente letal como para provocar una reducción de 12 porque el VPHP degrada los materiales que contienen celulosa.
unidades logarı́tmicas, lo que equivale a 12 veces un valor D para Para conocer las caracterı́sticas representativas de indicadores
microorganismos con una resistencia suficientemente más alta que la biológicos disponibles comercialmente, ver la Tabla 1.
resistencia media de la biocarga. Puesto que se da por sentado que la El indicador biológico también puede estar envasado individual-
biocarga es un millón, en la práctica real, un proceso de sobremuerte mente en un envase primario envuelto adecuadamente para que no
dará como resultado una probabilidad de no esterilidad mucho afecte de manera adversa el resultado del indicador y sea penetrable
menor de 10–6. El diseño y la evaluación del proceso de sobremuerte por VPHP. Se ha demostrado que los materiales de poliolefina
pueden diferir según el proceso de esterilización en análisis. El uso hilados son adecuados para envolver indicadores biológicos
de un diseño de sobremuerte y un enfoque de validación pueden destinados a la evaluación de procesos VPHP. El material de
minimizar o evitar la necesidad del recuento e identificación de la envoltura puede facilitar la manipulación de los indicadores
biocarga. biológicos en el laboratorio después de la exposición a VPHP.
Calor Húmedo—En procesos de esterilización por calor húmedo, Además, se debe evaluar cuidadosamente el material de envoltura,
con frecuencia se utilizan esporas de cepas adecuadas de Bacillus para asegurar que no queden residuos de peróxido de hidrógeno en el
stearothermophilus que están disponibles comercialmente como material del envase después de la exposición a VPHP, lo que
indicadores biológicos. También se han utilizado otros microorga- posiblemente inducirı́a una bacteriostasis durante los pasos de
nismos formadores de esporas, resistentes al calor, como Clostridium recuperación. Los valores D microbiológicos se verán influidos en
sporogenes, Bacillus subtilis y Bacillus coagulans en el desarrollo y cuanto a la velocidad de inactivación por la presencia del material de
validación de procesos de esterilización por calor húmedo. envoltura del indicador biológico y la posible presencia de residuos
Calor Seco—En la esterilización por calor seco, algunas veces se de VPHP. En los casos en que se empleen indicadores biológicos
emplean esporas de Bacillus subtilis spp. para validar el proceso. (transportadores inoculados) sin el envase primario, se requiere el
Durante la validación de los procesos de esterilización por calor estricto cumplimiento de las técnicas asépticas.
seco, frecuentemente se llevan a cabo estudios de despirogenación
de endotoxinas en lugar de estudios de inactivación microbiana
durante el establecimiento de ciclos de esterilización, debido a que la
inactivación de las endotoxinas en más difı́cil que la velocidad de
inactivación de las esporas de Bacillus subtilis. En la práctica, una
452 h1035i Indicadores Biológicos para Esterilización / Información General USP 30
1
Ver Aparatos en Indicadores Biológicos—Pruebas de Resistencia h55i.
Estos aparatos han sido diseñados para proporcionar condiciones fı́sicas
uniformes aplicables a la caracterización de indicadores biológicos. También
se indican las caracterı́sticas de desempeño requeridas.
USP 30 Información General / h1035i Indicadores Biológicos para Esterilización 453
2
Vigentes para Recipientes de Vapor/BIER, Estándares Nacionales de los
Estados Unidos (American National Standards), ANSI/AAMI ST45 : 1992.
454 h1041i Productos Biológicos / Información General USP 30
enzimas y soluciones amortiguadoras de procesamiento. Muchos de pruebas en proceso o de liberación finales. En otros casos, la escasez
estos artı́culos se usan para asegurar la supervivencia y favorecer la de tejido donante adecuado o la compleja logı́stica en el transporte
proliferación de determinadas poblaciones celulares, aunque su de materiales biológicos puede limitar la cantidad de material
mecanismo de acción puede no estar completamente elucidado. disponible para efectuar pruebas. Para minimizar estos riesgos,
Algunos ejemplos son el suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en cuando sea posible hay que implementar rigurosos procedimientos
inglés) y diversos suplementos de medios. Otros artı́culos, como la de calificación de los materiales y aplicar con prudencia controles del
toxina del cólera altamente purificada, se introducen en el flujo de proceso de fabricación.
procesamiento durante la fabricación para ejercer un efecto Con frecuencia, estos nuevos productos terapéuticos se crean
bioquı́mico especı́fico y se eliminan por lavado inmediatamente en utilizando procesos biológicos complicados. Los AM empleados en
pasos subsiguientes del procesamiento para evitar la toxicidad estos procedimientos se pueden seleccionar principalmente por sus
posterior no deseada. Los productos biológicos terminados elabora- contribuciones funcionales o efectos biológicos especiales. Cuando
dos en estos procesos a menudo son mezclas complejas que, en sea posible, es preferible que los AM sean productos terapéuticos
algunos casos, no se pueden caracterizar totalmente. Es necesario aprobados o autorizados porque están bien caracterizados, poseen un
examinar cuidadosamente los materiales utilizados en la elaboración, perfil toxicológico establecido y están fabricados según procedi-
para evitar la introducción de agentes adventicios o impurezas mientos controlados y documentados. Por otra parte, el AM puede
tóxicas, y para garantizar la máxima seguridad, eficacia y estar destinado al ‘‘uso en investigación’’ y por lo tanto puede
uniformidad del producto final. carecer del nivel de calificación necesario para su uso en la
En la fabricación de productos celulares, génicos y de ingenierı́a producción de un producto terapéutico. En cada caso, el fabricante
tisular, a estos reactivos y materiales se los conoce colectivamente del producto celular, génico o de ingenierı́a tisular debe elaborar
como materiales auxiliares (AM, por sus siglas en inglés). Los AM protocolos de calificación amplios y cientı́ficamente válidos para
también se conocen como productos auxiliares, reactivos auxiliares, garantizar la rastreabilidad, consistencia, aptitud, pureza y seguridad
coadyuvante del proceso ("processing aids") y reactivos de procesos. del AM. En los casos en que los AM sean productos aprobados para
Los AM se trataron por primera vez bajo el sinónimo de productos su uso con fines terapéuticos, el nivel de calificación probablemente
colaterales en la Notificación de la Administración de Alimentos y sea menos amplio que el de un material destinado a fines de
Medicamentos de los Estados Unidos, ‘‘Application of Current investigación. No obstante, aún es necesario determinar su aptitud en
Statutory Authorities to Human Somatic Cell Therapy Products and el proceso de fabricación cuando el AM se utiliza de forma distinta
Gene Therapy Products’’ (Reglamentación Vigente para Productos al uso previsto o a lo indicado en el etiquetado. El propósito de este
de Terapia Celular Somática Humana y Productos de Terapia capı́tulo es ofrecer una guı́a para elaborar programas de calificación
Génica) (Diario Oficial 58(197), 14 de octubre de 1993 ((Federal apropiados para AM que se empleen en la fabricación de productos
Register 58(197), Oct. 14, 1993) páginas 53248–53251). Este celulares, génicos y de ingenierı́a tisular.
documento estableció la autoridad de la FDA para reglamentar
productos de terapia celular somática humana y productos de terapia
génica. AM también es sinónimo de ‘‘materiales de proceso’’ que CALIFICACIÓN DE MATERIALES
fueron definidos en 21 CFR Parte 1271, ‘‘Current Good Tissue AUXILIARES
Practice for Manufacturers of Human Cellular and Tissue-based
Products; Inspection and Enforcement; Proposed Rule (Buenas La calificación es el proceso de obtener y evaluar datos para
Prácticas Vigentes para Fabricantes de Productos Tisulares y de establecer el origen, la identidad, la pureza, la seguridad biológica y
Células Humanas; Inspección y Ejecución; Norma Propuesta’’ la aptitud general de un AM especifico. La responsabilidad de la
(Diario Oficial 66(5), 8 de enero de 2001 ((Federal Register 66(5), calificación del AM recae en quien desarrolla o fabrica el producto
January 8, 2001) páginas 1508–1559). Los AM pueden ser análogos celular, génico o de ingenierı́a tisular. Esta sección resume a grandes
a ‘‘componentes’’, y en algunos casos, ‘‘envases’’ según se describe rasgos las bases para que un fabricante pueda establecer programas
en las reglamentaciones sobre las buenas prácticas de fabricación razonables y cientı́ficamente válidos para calificar los AM, aunque la
vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés) para productos amplia naturaleza de los productos celulares, génicos y de ingenierı́a
farmacéuticos terminados según se define en 21 CFR 211.80 a tisular, al igual que la de los AM empleados para producir estos
211.94 y 211.101(b) y (c). productos hacen difı́cil recomendar pruebas o protocolos especı́ficos
La propiedad que define a los AM es que no están destinados a para un programa de calificación. La documentación completa y
estar presentes en el producto final. Son materiales que se usan como rigurosa es la piedra angular de cualquier programa de calificación.
ayuda en el procesamiento y la purificación o agentes que ejercen su Un programa de calificación bien diseñado se torna más amplio a
efecto sobre la sustancia terapéutica. Los materiales o componentes medida que progresa el desarrollo del producto. En las primeras
destinados a estar en la forma farmacéutica del producto final (por etapas de desarrollo del producto, el enfoque principal es respecto a
ejemplo, materiales genéticos, soportes biopoliméricos, soluciones la seguridad. En las etapas posteriores, se deben desarrollar
amortiguadoras fisiológicas) no son AM. Los bancos de células y los actividades de producción y calificación del AM en forma amplia
bancos de virus tampoco se consideran AM; hay una serie de guı́as para respaldar la consiguiente concesión de la licencia del producto
que describen los requisitos para su certificación. Sin embargo, los celular, génico o de ingenierı́a tisular. En algunas ocasiones, es
virus ‘‘auxiliares’’ y plásmidos ‘‘auxiliares’’ se pueden considerar posible que no hayan proveedores de sustancias complejas o únicas
AM cuando no están destinados a formar parte del producto final. que han demostrado ser esenciales para el control del proceso o la
La calidad de un AM puede afectar la estabilidad, seguridad, producción y que las producen de conformidad con las cGMP. En
potencia y pureza de un producto celular, génico o de ingenierı́a estas situaciones, el fabricante debe elaborar una estrategia
tisular. Por ejemplo, se puede desconocer el mecanismo mediante el cientı́ficamente válida para la calificación. Un programa de
cual un AM ejerce su efecto y puede no comprenderse el impacto calificación para los AM que se utilicen en la fabricación de
que tiene la variación normal de un AM sobre la calidad y seguridad productos celulares, génicos y de ingenierı́a tisular debe cubrir los
del producto terapéutico. Otra posibilidad es que los AM de origen siguientes aspectos: (1) identificación, (2) selección y aptitud para
humano o animal podrı́an presentar un riesgo de transmisión de una usarlos en la fabricación, (3) caracterización, (4) calificación del
enfermedad infecciosa. Otros AM, si se administran a seres proveedor y (5) control y garantı́a de calidad.
humanos, pueden provocar una reacción inmunitaria. Finalmente,
un AM con propiedades tóxicas que se introduzca en un proceso de
fabricación y no se elimine de manera satisfactoria en pasos
subsiguientes del proceso, expondrá al paciente a una sustancia Identificación
tóxica y puede alterar la eficacia de la entidad terapéutica. Estos El primer paso de cualquier programa de calificación es listar
riesgos que afectan la calidad y seguridad del producto terapéutico todos los AM que se emplean en la fabricación de un producto
frecuentemente aumentan en el caso de productos celulares, génicos determinado e indicar en qué parte del proceso de fabricación se van
y de ingenierı́a tisular, como consecuencia de la capacidad limitada a utilizar. Se debe establecer el origen y el uso previsto de cada
de llevar a cabo pruebas exhaustivas en proceso y de liberación. Por material y se debe determinar la cantidad o concentración necesaria
ejemplo, la falta de pasos de retención en proceso o vida útil limitada de cada material. Además se deben identificar fuentes alternativas de
pueden crear la necesidad de administrar los productos celulares, cada material.
génicos o de ingenierı́a tisular antes de obtener los resultados de las
456 h1043i Materiales Auxiliares / Información General USP 30
Selección y Aptitud para el Uso evaluación de riesgos y del conocimiento obtenido durante el
desarrollo. Se deben establecer especificaciones de prueba para cada
Quienes desarrollan productos celulares, génicos y de ingenierı́a AM, para asegurar la uniformidad y el funcionamiento del proceso
tisular deben establecer y documentar los criterios de selección de de fabricación. Los criterios de aceptación se deben establecer y
AM y los criterios de calificación para cada proveedor al principio de justificar sobre la base de datos obtenidos a partir de lotes utilizados
la fase de diseño del desarrollo del producto. Los criterios de en estudios preclı́nicos y estudios clı́nicos iniciales, de lotes
selección deben incluir evaluaciones de pureza microbiológica y empleados para demostrar la uniformidad de la fabricación y de
quı́mica, identidad y actividad biológica pertinentes al proceso de datos pertinentes del desarrollo, como los que surgen del desarrollo
fabricación especı́fico. Es importante abordar estos temas al de procedimientos analı́ticos y estudios de estabilidad.
principio del desarrollo del producto porque la calificación de Algunos AM de naturaleza biológica pueden ser difı́ciles de
ciertos AM, que inicialmente pueden ser considerados necesarios, caracterizar totalmente. Como estos materiales ejercen su influencia
puede ser imposible o demasiado costosa, justificando de este modo a través de acciones biológicas complejas y las pruebas bioquı́micas
la investigación de productos alternativos o sustitutos. Entre los pueden no predecir el desempeño de los AM en el proceso, puede ser
ejemplos se encuentran algunos materiales de origen animal o necesario realizar pruebas funcionales o de desempeño. La
humano que en algunos casos tienen fuentes alternativas (como por variabilidad en el desempeño de dichos materiales puede tener un
ejemplo, de origen vegetal o por sı́ntesis quı́mica). efecto perjudicial sobre la potencia y la uniformidad del producto
Los AM de origen animal o humano se deben seleccionar terapéutico final. Algunos ejemplos de pruebas complejas de
cuidadosamente debido a los posibles riesgos de enfermedades funcionalidad de los AM son las pruebas de promoción del
infecciosas o zoonóticas asociadas a estos materiales. Hay que crecimiento de lotes individuales de FBS en la lı́nea celular utilizada
seleccionar proveedores que puedan proporcionar documentación en la fabricación, pruebas de desempeño de preparaciones de
sobre el paı́s de donde provienen los AM de origen animal para enzimas digestivas y valoraciones in vitro de citotoxicidad en cultivo
responder a las inquietudes respecto a la encefalopatı́a espongiforme de tejidos (ver aspectos de Pruebas de Desempeño).
bovina y otras enfermedades de interés agrı́cola, como tuberculosis y
brucelosis. En muchos casos, se debe documentar la cadena de
custodia de los AM de origen animal (es decir, matadero ? centro Calificación del Proveedor
de procesamiento intermedio ? centro de procesamiento final). Los
proveedores de AM de origen humano deben poder proporcionar Se debe calificar a los proveedores de AM lo antes posible. Una
documentación respecto a la rastreabilidad del material. Por ejemplo, auditorı́a temprana de las instalaciones de fabricación del proveedor,
los AM obtenidos de plasma humano deben provenir de estableci- incluyendo sus GMP y su programa de prueba de AM, son
mientos autorizados que controlen el conjunto de donantes y elementos básicos de un programa de calificación de un proveedor.
examinen a los donantes individuales para verificar que no padezcan Para poder considerar confiable a un proveedor es esencial revisar
enfermedades infecciosas humanas importantes. En algunos casos, los procedimientos de procesamiento y del programa de documen-
los proveedores de AM de origen animal y humano suministran tación del proveedor. Además, los proveedores certificados por
diferentes categorı́as de materiales, siendo algunas más adecuadas medio de un programa de inspección ISO o auditados por otros
para usar en la fabricación de productos celulares, génicos y de organismos gubernamentales suelen contar con sistemas de calidad
ingenierı́a tisular que otras categorı́as. Por ejemplo, se puede obtener robustos. Los informes de auditorı́as anteriores de proveedores de
FBS que haya sido procesado para reducir el riesgo de contamina- EE.UU. obtenidos a través de la Ley de Libertad de Información
ción viral bovina sometiéndolo a procesos validados de irradiación y (FOI, por sus siglas en inglés) pueden mejorar el proceso de
nanofiltración. Además, muchos componentes obtenidos de animales calificación.
y de plasma humano se someten a tratamientos quı́micos Es importante establecer una buena relación de trabajo con un
(tratamiento con detergentes o disolventes) o fı́sicos (exposición al proveedor. En algunos casos, el proveedor puede ofrecer normas de
calor durante perı́odos prolongados) que, mediante exhaustivos fabricación más exigentes, servicios de formulación de acuerdo a las
estudios de validación, han demostrado reducir significativamente el especificaciones del cliente o sustitución de componentes de calidad
riesgo de contaminación microbiana o viral adventicia asociada a los inferior previa solicitud, con o sin costos adicionales. Una buena
AM iniciales. Se prefiere utilizar dichos AM en procesos de relación es esencial si se justifica una investigación más extensa de
fabricación de productos celulares, génicos y de ingenierı́a tisular proveedores de AM. Además es crı́tico asegurar que el proveedor
porque reducen significativamente los riesgos asociados al material tome las medidas correspondientes para evitar la contaminación
original. cruzada entre sus productos durante la fabricación. Los proveedores
Se puede reducir la complejidad de la evaluación del riesgo deben estar familiarizados con los principios de validación,
mediante el empleo de uno de varios métodos cuantitativos o especialmente la validación de limpieza, al igual que la validación
semicuantitativos, como el análisis de los efectos en modo de falla de inactivación viral y la validación de esterilización. Finalmente, se
(FMEA, por sus siglas en inglés), el despliegue de la función de deben establecer sistemas para que los proveedores suministren a los
calidad (QFD, por sus siglas en inglés), o el análisis de riesgos y clientes certificación por escrito de cambios de procesamiento o de
punto crı́tico de control (HACCP, por sus siglas en inglés). Estos origen, mucho antes de la puesta en práctica de los cambios, de
programas generalmente asignan un valor puntual a cada parámetro modo que los clientes puedan evaluar sus consecuencias posibles.
de riesgo de un AM, que da como resultado puntajes acumulativos
que facilitan darle prioridad al esfuerzo y los recursos para disminuir
los riesgos asociados a los AM. Por ejemplo, un AM que tenga un Control de Calidad y Garantı́a de Calidad
fuerte perfil de seguridad y se utilice en cantidades mı́nimas en los
pasos iniciales del proceso de fabricación y se lave minuciosamente Como los componentes del programa de calificación tienen varios
para eliminarlo del sistema acumula un puntaje bajo. Por el aspectos y deben cumplir con las cGMP, deben ser controlados por
contrario, un AM que se sepa que es tóxico y se emplee en las una unidad de garantı́a de calidad y control de calidad (QAU, por sus
etapas finales del proceso presenta más posibilidades de aparecer siglas en inglés). Las acciones tı́picas de QAU comprenden los
como residuo en el producto final y se le debe asignar un puntaje siguientes sistemas o programas: (1) recepción de entrada,
más alto. También se pueden asignar puntos según la clasificación separación, inspección y liberación de materiales antes de su uso
del riesgo (ver Clasificación del Riesgo). en la fabricación, (2) auditorı́a y certificación del proveedor, (3)
pruebas de verificación del certificado de análisis, (4) polı́ticas y
procedimientos formales para materiales que no cumplen con las
Caracterización especificaciones, (5) prueba de estabilidad y (6) almacenamiento de
muestras de archivo.
Es necesario desarrollar o adoptar e implementar pruebas
especı́ficas de caracterización de control de calidad para cada AM.
El conjunto de pruebas para cada AM debe evaluar diversos
atributos de calidad, entre los que se incluyen la identidad, pureza,
funcionalidad y ausencia de contaminación microbiana o viral. El
nivel de prueba apropiado para cada AM proviene de su perfil de
USP 30 Información General / h1043i Materiales Auxiliares 457
CLASIFICACIÓN DEL RIESGO Nivel 1—Estos AM presentan riego bajo; son materiales
altamente calificados muy adecuados para usar en la fabricación.
Se debe crear un programa de calificación racional y cientı́fica- El AM es un producto biológico, un fármaco aprobado, un
mente válido para cada AM, que tome en cuenta su origen y los dispositivo médico aprobado o autorizado o está destinado al uso
procesos empleados en su fabricación. Cuando estén disponibles, se como material biológico implantable. En general, estos componentes
prefieren los AM que sean productos terapéuticos aprobados o o materiales se obtienen como un sistema de envasado estéril o
autorizados porque están bien caracterizados con un perfil forma farmacéutica para el uso que se indica en su etiqueta, pero en
toxicológico probado y están fabricados según procedimientos vez de esto se emplean para un uso ‘‘no indicado en la etiqueta’’ en
controlados y documentados. Los productos biológicos autorizados, el proceso de fabricación del producto celular, génico o de ingenierı́a
fármacos aprobados y dispositivos médicos o materiales implan- tisular.
tables aprobados o autorizados que han sido incorporados en Nivel 2—Estos AM presentan un riesgo bajo; son materiales bien
procesos de fabricación de productos celulares, génicos o de caracterizados y muy adecuados para usar en la fabricación. Están
ingenierı́a tisular presentan un perfil de seguridad conocido o más destinados para usarse en la fabricación de fármacos, productos
favorable para el paciente que las versiones no aprobadas o no biológicos o dispositivos médicos, incluyendo los productos
autorizadas. Los programas de calificación para estos AM deben celulares, génicos y de ingenierı́a tisular como AM, y se producen
reflejar la inspección amplia y minuciosa de estos artı́culos durante con las cGMP pertinentes. La mayorı́a de materiales de origen
su desarrollo y fabricación. En consecuencia, se debe poner mayor animal están excluidos de esta categorı́a.
énfasis en la investigación del impacto de la variabilidad inherente Nivel 3—Estos AM son materiales que presentan un riesgo
de estos AM sobre la función del producto final. Por ejemplo, un moderado y que requieren un nivel más alto de calificación que los
fabricante puede utilizar seroalbúmina humana, destinada a ser anteriores. Frecuentemente, se producen para uso diagnóstico in
administrada a seres humanos, como suplemento para un medio de vitro y no están destinados a la producción de productos celulares,
cultivo celular para un producto celular. Debido a que el producto génicos o de ingenierı́a tisular. En algunos casos, puede ser necesario
celular se comercializa como un producto biológico autorizado, no mejorar los procesos de fabricación del AM para emplearlo en la
es necesario repetir todas las pruebas realizadas por el proveedor fabricación de estos productos (por ejemplo, modificación del
como parte de la calificación del material. Por otra parte, el efecto de proceso de producción de un anticuerpo monoclonal de grado
la variabilidad de un lote a otro sobre la velocidad de crecimiento diagnóstico para incluir pasos robustos de eliminación de virus en la
celular o el mantenimiento de una propiedad celular diferenciada purificación).
puede ser una área de investigación aconsejable. Como alternativa, la
estabilidad de este material a la concentración empleada en el Nivel 4—Este es el mayor nivel de riesgo de AM. Es necesario
procesamiento o su potencial de interacción con otros componentes efectuar una exhaustiva calificación antes de emplearlos en la
del proceso, también pueden ser áreas que vale la pena investigar. En fabricación. El material no se produce de conformidad con las
consecuencia, estos criterios respecto a la calificación de AM se cGMP. Los AM no están destinados para la producción de productos
concentran en los AM como una fuente potencial de variabilidad que celulares, génicos o de ingenierı́a tisular. Este nivel de riesgo
puede influir en la potencia y seguridad del producto final. Los comprende sustancias tóxicas con mecanismos biológicos de acción
programas de calificación para estos AM deben ser amplios para conocida y también incluye materiales lı́quidos más complejos, de
minimizar el riesgo al consumidor y garantizar la detección de lotes origen animal, que no se someten a procedimientos de eliminación o
inaceptables o adulterados. inactivación de virus adventicios. Estos materiales pueden requerir
El programa de calificación también debe tener en cuenta la (a) un mejoramiento de los procesos de fabricación del AM; (b)
cantidad de AM empleado en la fabricación, al igual que su punto de tratamiento del AM para inactivar o eliminar agentes adventicios,
introducción en el proceso de fabricación. Un ejemplo pertinente es sustancias causantes de enfermedades o contaminantes especı́ficos
el uso de FBS como suplemento de un medio de cultivo de tejidos (por ejemplo, priones, virus animales); (c) análisis de cada lote de
empleado para aumentar una población de células madre de un tejido material para asegurar la ausencia de agentes adventicios, sustancias
especı́fico para su eventual administración a un paciente (ver causantes de enfermedades o contaminantes especı́ficos; (d) valida-
Perspectiva General de la Fabricación en Productos de Terapia ción del proceso de fabricación del producto celular, génico o de
Génica y Celular h1046i). Un programa de calificación para tal AM ingenierı́a tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación de
debe incluir (a) la garantı́a de que el suero proviene de un paı́s o una sustancia tóxica conocida o pruebas de liberación de lote
región que esté libre de encefalopatı́a espongiforme bovina (BSE, capaces de demostrar niveles de reducción seguros; o (e) validación
por sus siglas en inglés); (b) la garantı́a de que el ganado de origen se del proceso de fabricación del producto celular, génico o de
controla y que los resultados de las pruebas de detección de ingenierı́a tisular para evaluar la uniformidad en la eliminación o
enfermedades importantes en el correspondiente entorno agrı́cola inactivación de agentes adventicios, sustancias causantes de
son negativos (por ejemplo, tuberculosis, brucelosis, fiebre aftosa); enfermedades o contaminantes especı́ficos asociados al material.
(c) el análisis del suero para verificar su esterilidad, detectar Los encargados de desarrollar el producto deben evaluar en las
micoplasma, contenido de endotoxinas y virus adventicios bovinos etapas iniciales de desarrollo la necesidad de estos materiales e
vinculados a este material; 1 (d) la revisión y archivo del certificado investigar sustancias o fuentes alternativas.
de análisis del fabricante (e) la evaluación entre lotes de la aptitud
del suero para aumentar de manera uniforme una población celular
representativa utilizando una valoración de control de calidad PRUEBA DE DESEMPEÑO
estandarizada para el cultivo de células; y (f) la auditorı́a del
proveedor en su establecimiento para asegurar que la proveniencia y En los casos en que los AM se eligen por su capacidad para
el procesamiento del material sean aceptables según una unidad QA proporcionar una cierta función biológica en la elaboración del
responsable. producto terapéutico, la prueba de desempeño se torna un
Para ayudar a los fabricantes y a aquellos que desarrollan el componente fundamental de su calificación general. Esto es
producto en el diseño de sus programas de calificación para una particularmente cierto cuando el AM desempeña un papel crı́tico
variedad de AM, en las Tablas 1–4 se presentan niveles de categorı́as en la modulación de un efecto bioquı́mico complejo y ejerce un gran
de riesgo de muestra, que se proporcionan como una guı́a. El riesgo impacto sobre el rendimiento de la fabricación del producto, su
también depende de la cantidad y la etapa en la que se usa el AM en pureza o la potencia del producto final. Estos AM tienden a ser
el proceso de fabricación. Las Tablas 1–4 no consideran el efecto de sustancias o mezclas complejas, frecuentemente de origen biológico
la cantidad ni la etapa de uso. y pueden presentar gran variabilidad entre lotes. Como resultado,
estos AM en general no tienen una prueba de identidad simple, ni
pueden ser fácilmente caracterizados por pruebas fı́sicas o quı́micas.
1
La mayorı́a de los proveedores realizan pruebas para detectar agentes El desarrollo de valoraciones de desempeño bien definidas para AM
adventicios de conformidad con 9 CFR 113, establecido por el Centro de complejos no sólo asegura la reproducibilidad del proceso y la
Productos Biológicos Veterinarios, Servicio de Inspección Sanitaria Animal y calidad del producto final, sino que en muchos casos también cumple
Vegetal (Center for Veterinary Biologics, Animal and Plant Health Inspection con los criterios de pruebas de identidad conforme a 21 CFR
Service) del Departamento de Agricultura de Estados Unidos. Estas pruebas 211.84(d).
pueden diferir de las utilizadas para analizar productos desarrollados para uso
humano (por ejemplo, micoplasma).
458 h1043i Materiales Auxiliares / Información General USP 30
En algunos casos, la calificación inicial de un AM para usarse en Si se usa un tipo especial de gradiente de densidad para
la fabricación debe ser la investigación del efecto que tiene la purificar un vector o célula, se podrı́a demostrar que los nuevos
cantidad del AM sobre la respuesta deseada (aumento del lotes del material utilizado para obtener el gradiente pueden
rendimiento, pureza o potencia del producto terapéutico). La purificar el vector o célula hasta un grado satisfactorio.
cantidad de AM empleada en la fabricación debe ser seleccionada Si se usa un plásmido o vector viral en la producción de un
para que produzca el efecto deseado de manera uniforme, a la vez vector de terapia génica (por ejemplo, función auxiliar), se
que minimice los problemas mediante la eliminación del AM en los podrı́a demostrar que los nuevos lotes del vector auxiliar
pasos subsiguientes del procesamiento. Dicha prueba a menudo producen las cantidades esperadas del vector de terapia génica.
evalúa el atributo funcional importante que se espera del AM en un Si se produce terapia celular en un biorreactor de fibra hueca, se
proceso de fabricación a escala reducida o simulado. A continuación podrı́a demostrar que los nuevos lotes del biorreactor producen
se indican algunos ejemplos: la cantidad prevista de producto celular.
Si un AM se agrega a los medios de cultivo porque favorece la La valoración usada podrı́a evolucionar a medida que el proceso
proliferación celular o la secreción de un agente terapéutico de fabricación se desarrolla y las relaciones crı́ticas entre el AM y el
esencial, la valoración podrı́a demostrar que cada lote de AM producto final se comprendan mejor.
produce la velocidad o cantidad esperada de proliferación Debido a que la mayorı́a de las pruebas de desempeño producen
celular o el nivel esperado de agente terapéutico segregado. resultados relativos, a menudo resulta útil valorar un lote nuevo de
Si se usa un anticuerpo monoclonal para purificar un cierto tipo AM conjuntamente con un lote aprobado de AM o un estándar de
de célula, se podrı́a demostrar que el nuevo lote de anticuerpo referencia oficial, si se dispone de alguno. La comparación
monoclonal purifica la población celular con la recuperación y simultánea ayuda a reducir la variabilidad debida a diferentes lotes
pureza esperada para el tipo de célula deseado. de células o vectores y ayuda a distinguir la variabilidad asociada a
Si se usa una desoxirribonucleasa para descomponer el ADN los diferentes lotes de AM. Si la prueba de desempeño implica
celular, se podrı́an analizar los nuevos lotes para verificar la valoraciones para demostrar que el nuevo lote de AM no afecta el
capacidad de la desoxirribonucleasa para descomponer el ADN. perfil de impurezas del producto terapéutico final, ya sea generando
nuevas impurezas o aumentando el nivel de impurezas existentes, es
USP 30 Información General / h1043i Materiales Auxiliares 459
útil valorar ambos respecto al nivel de impurezas totales, al igual que Al generar una vacuna contra un tumor utilizando una biopsia
buscar la presencia de nuevas impurezas. Un análisis de inmuno- de tumor de un paciente como material inicial, se introduce una
detección en general puede evaluar solamente el nivel de impurezas entidad quı́mica para desnaturalizar las proteı́nas de la super-
totales. Por ejemplo, un Western blot del producto de terapia génica ficie celular y los antı́genos del tumor para aumentar su
que se investiga tanto con anticuerpos del producto como con antigenicidad. Se sabe que la entidad quı́mica es muy tóxica.
anticuerpos de proteı́nas de células anfitrionas, es útil para detectar Se pueden agregar antibióticos a una solución de transporte
nuevas especies de proteı́nas y aumentos significativos de los niveles para células humanas para contrarrestar la contaminación
de impurezas de las células anfitrionas. Esta calificación inicial se microbiana asociada con el procedimiento de obtención. Los
incrementa por medio de una valoración de desempeño que tiene una niveles residuales del antibiótico pueden afectar la capacidad de
lectura cuantitativa con un cambio marcado en la señal cuando se proliferación del producto celular final producido por bioin-
introduce en la valoración un cambio importante en la cantidad de genierı́a. Los antibióticos residuales también pueden provocar
AM (por ejemplo, respuesta de dosis). Una respuesta tipo umbral (es una respuesta anafiláctica en algunos individuos.
decir, hay dos niveles de respuesta para el AM y la respuesta no El FBS, empleado en el cultivo de un injerto de piel humana
cambia ni con cambios grandes en el AM por debajo de una dosis realizado mediante bioingenierı́a, puede provocar una respuesta
determinada ni por encima de una dosis determinada) puede hacer de anticuerpos humorales contra las proteı́nas bovinas.
más difı́cil seleccionar una concentración de AM que dé como Las inmunoglobulinas aglomeradas de ratón, una traza de
resultado el efecto deseado de manera uniforme y minimice los impureza en una preparación purificada de anticuerpo mono-
niveles residuales del AM en el producto terapéutico final. clonal de ratón dirigido contra una población celular para
inmunoselección, pueden ser inmunógenas.
Una citocina empleada como inmunomodulador en la creación
EVALUACIÓN Y ELIMINACIÓN DEL NIVEL de una vacuna autóloga contra tumores producida por
RESIDUAL DE MATERIALES AUXILIARES modificación génica, puede provocar una reacción grave en el
receptor.
Los AM no están destinados a estar presentes en la forma La toxina del cólera, empleada como parte de un medio de
farmacéutica final en los productos celulares, génicos y de ingenierı́a cultivo celular para un producto de terapia celular destinado a la
tisular. Su presencia en el producto final podrı́a provocar efectos administración intravenosa, resultará sumamente tóxica para el
indeseables en la persona que los reciba o tener un efecto perjudicial receptor si no se elimina durante el procesamiento.
en la potencia del producto. Los efectos indeseables en seres Estos riesgos se pueden mitigar si se diseñan procesos que
humanos consisten en la toxicidad directa del AM o en una respuesta incluyen pasos de eliminación satisfactoria del AM, mediante
inmunogénica no deseada. Algunos ejemplos incluyen lo siguiente: dilución, separación o inactivación, y se desarrollan valoraciones
460 h1043i Materiales Auxiliares / Información General USP 30
de detección analı́tica para evaluar los niveles de AM durante el bilidad entre este proceso en pequeña escala y el proceso completo.
procesamiento y en el producto terapéutico final. Las estrategias de En general esto significa que el proceso en pequeña escala se realiza
evaluación y eliminación de AM residuales se deben considerar en con los mismos parámetros crı́ticos que el proceso completo y que el
las fases iniciales del desarrollo del proceso. Hay dos métodos producto generado en cada paso tiene una pureza y rendimiento
diferentes para evaluar los niveles de AM residual en el producto similares. (3) Igual que con cualquier tipo de estudio con muestras
terapéutico final: (1) Los estudios de validación pueden demostrar adicionadas, se debe demostrar que el nivel adicional más alto de
que el proceso es capaz de eliminar más del AM de lo que estarı́a AM no ha afectado el proceso de purificación. Si se emplea el
presente en el peor caso hipotético. (2) Los niveles residuales de un segundo método de medición de niveles residuales de AM en cada
AM se pueden medir en cada lote en un paso apropiado durante el lote, la especificación de la cantidad máxima de AM en el producto
proceso de fabricación. terapéutico final se basa en la cantidad de AM en los lotes utilizados
La validación de un AM con frecuencia se realiza mejor en estudios toxicológicos o clı́nicos o en datos toxicológicos
agregando al producto impuro con el ‘‘peor caso’’ o niveles conocidos.
superiores de AM y demostrando que el proceso de purificación es El desarrollo de valoraciones analı́ticas sensibles y reproducibles
capaz de eliminar el AM hasta ‘‘niveles no detectables’’. De este para AM es otro componente importante de un método de reducción
modo se pueden generar factores de depuración para cada paso de del riesgo. Dos tipos de valoraciones son útiles en la evaluación de
purificación de manera análoga a la realizada en estudios de los niveles de impurezas residuales de AM: una prueba lı́mite y una
depuración viral. Al diseñar los estudios de validación se deben prueba cuantitativa. Ambas pruebas deben ser exactas, precisas,
incluir los tres factores siguientes: (1) La valoración debe ser capaz robustas y tener un lı́mite de detección bajo. Se pueden llevar a cabo
de cuantificar con exactitud el AM en cada matriz de muestra. (2) Si valoraciones para detectar AM residuales en el producto antes de
la validación se lleva a cabo a una escala menor que la utilizada en la formularlo (por ejemplo, en el fármaco) para evitar cualquier tipo de
producción de lotes de rutina, es necesario demostrar la compara- interferencia de los componentes empleados en la formulación con la
USP 30 Información General / h1043i Materiales Auxiliares 461
Productos de Terapia Génica y Celular h1046i métodos de fabricación tradicionales, con la adición de requisitos
Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas h1047i especı́ficos adecuados para los productos obtenidos por biotecnolo-
21 CFR 211 Subparte E, 211.80 a 211.94 y 211.101 gı́a. Los requisitos generales se describen principalmente en las
21 CFR 312 partes correspondientes del Código de Reglamentaciones Federales,
21 CFR 314 Tı́tulo 21. Los Institutos Nacionales de la Salud (National Institutes
21 CFR 801.109 (b) (1) of Health o NIH) han publicado pautas relativas a la investigación de
21 CFR 807.81 a 21 CFR 807.97 ADNr que son obligatorias para cualquier investigación, tanto de
21 CFR 812 carácter público como privado, subvencionada por los NIH. Estas
21 CFR 814 pautas tienen amplia aceptación y es frecuente que instituciones y
Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA empresas que no se encuentran especı́ficamente bajo su jurisdicción
(CBER) ‘‘Draft Guidance for Monoclonal Antibodies Used as las cumplan voluntariamente.2 Las prácticas de seguridad para
Reagents in Drug Manufacturing’’ (1999) laboratorios, en particular la protección contra materiales potencial-
Center for Biologics Evaluation and Research de la FDA mente infecciosos, son un motivo de preocupación.3 La producción
(CBER) ‘‘Points to Consider in the Characterization of Cell de artı́culos macromoleculares mediante procesos biotecnológicos
Lines Used to Produce Biologicals’’ (1993) consiste inicialmente en la clonación de un gen especı́fico en el
Center for Devices and Radiological Health de la FDA (CDRH) laboratorio, o en la construcción de un gen sintético, con su posterior
‘‘Class II Special Controls Guidance Document: Tissue Culture inserción en una célula anfitriona y su subclonación en un
Media for Human ex vivo Tissue and Cell Culture Processing microorganismo o cultivo celular; luego, se lleva a cabo un
Applications; Final Guidance for Industry and FDA desarrollo de proceso a escala piloto para optimizar su rendimiento
Reviewers’’ (16 de mayo de 2001) y calidad y, finalmente, tienen lugar la fermentación o los procesos
CDRH Blue Book Memorandum G95-1 de cultivo celular a gran escala. El paso siguiente, que es el más
ISO 10993-1: 1997 Evaluación Biológica de Dispositivos importante en el desarrollo de las monografı́as farmacopeicas, es la
Médicos—Parte 1: Evaluación y Análisis ‘‘Biological Evalu- purificación de las proteı́nas macromoleculares. Luego siguen
ation of Medical Devices—Part 1: Evaluation and Testing’’ pruebas en animales, pruebas clı́nicas, la aprobación reglamentaria
Conferencia Internacional de Armonización (ICH, por sus y la comercialización del producto.
siglas en inglés) Q5A ‘‘Guidance for Viral Safety Evaluation of Por lo general, el desarrollo de normas públicas adecuadas para
Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human and estos artı́culos macromoleculares está estrechamente vinculado a la
Animal Origin’’ tecnologı́a de procesamiento empleada y a las caracterı́sticas
Conferencia Internacional de Armonización (ICH) Q5D fisicoquı́micas y biológicas de un fármaco especı́fico. En las
‘‘Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: caracterizaciones de estos artı́culos para asegurar su seguridad,
Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for pureza y actividad se deben incorporar técnicas clásicas ası́ como
Production of Biotechnological/Biological Products’’ métodos especı́ficos a esa tecnologı́a. Existe siempre la posibilidad
Public Health Service Guideline on Infectious Diseases Issues de que estos artı́culos puedan causar efectos secundarios en los
in Xenotransplantation (18 de octubre de 2000) pacientes que los emplean debido a una sensibilización inmuno-
lógica como resultado de una única (o múltiple) modificación
molecular. Esta posibilidad requiere una caracterización precisa de
estas sustancias. Aunque teóricamente es posible elaborar normas
públicas para un artı́culo macromolecular, no es posible desarrollar
normas especı́ficas que contemplen todos los métodos de produc-
h1045i ARTÍCULOS OBTENIDOS ción. La perspectiva de la Farmacopea es elaborar normas públicas
que puedan aplicarse a un producto final y que aseguren el
POR BIOTECNOLOGÍA mantenimiento de su seguridad, identidad, contenido, calidad y
pureza aun cuando no exista un conocimiento total de los detalles de
su producción.
Las pruebas de identidad, pureza y actividad normalmente
Las sustancias macromoleculares se pueden obtener mediante requieren el uso de Estándares de Referencia USP. Es necesario
varios métodos, entre ellos la extracción desde fuentes naturales, la tener en cuenta qué Estándares de Referencia USP podrı́an requerirse
modificación de proteı́nas de origen natural, el cultivo in vitro o in y cuál podrı́a ser su pertinencia con respecto al método de
vivo de células de mamı́feros, la producción mediante microorga- producción y su relación con las caracterı́sticas de un producto
nismos y la sı́ntesis quı́mica. Desde el punto de vista de la final. Estas decisiones deben tomarse en forma individual según cada
Farmacopea, los artı́culos constituidos por macromoléculas que se producto. Se considera deseable el uso de Estándares de Referencia
obtienen a partir de procesos biotecnológicos —o más especı́fica- USP representativos de los productos especı́ficos que se han
mente a partir de la tecnologı́a de ADN recombinante (ADNr), la evaluado mediante pruebas clı́nicas y que están plenamente
tecnologı́a de hibridomas y lı́neas celulares continuas transforma- caracterizados.
das— son artı́culos que tienen nombres oficiales y normas públicas Aunque la temprana incorporación de métodos generales de
oficiales para establecer su identidad, contenido (potencia), calidad y análisis de fármacos macromoleculares en la USP podrı́a conducir a
pureza. Los avances logrados en genética y en las aplicaciones de la una rápida estandarización de los métodos, la tecnologı́a y los
ingenierı́a genética han permitido que la producción de artı́culos procedimientos analı́ticos están evolucionando muy rápidamente.
macromoleculares existentes y nuevos sea tecnológica y económi- Los procedimientos analı́ticos —quı́micos, fı́sicos, microbiológicos
camente factible. e inmunológicos— se incluyen en las monografı́as especı́ficas de
Se han documentado ampliamente las tecnologı́as utilizadas para cada producto.
producir una proteı́na mediante procesos biotecnológicos y el
gobierno federal ha establecido pautas generales. Los productos
biotecnológicos pueden reglamentarse como fármacos, productos
biológicos o de diagnóstico, según su origen, su composición y el
uso al que estén destinados. La biotecnologı́a permite nuevos
enfoques que pueden dificultar la aplicación de las definiciones
clásicas de estas categorı́as; por consiguiente, la FDA ha aconsejado
a los fabricantes que soliciten aclaraciones en las primeras etapas de 2
Estas pautas se publicaron originalmente en el Federal Register, Guidelines
desarrollo, para determinar cómo se reglamentará un producto for Research Involving Recombinant DNA Molecules (Pautas para la
cuando no es obvia su clasificación.1 El esquema regulatorio general Investigación de Moléculas de ADN Recombinante) 1986; 51 (88): 16957-
para los productos obtenidos mediante biotecnologı́a es el mismo 16985. Se pueden obtener copias en: Office of Recombinant DNA Activities,
que para los productos de la misma categorı́a producidos por 12441 Parklawn Drive, Suite 58, Rockville, MD 20852.
1 3
Existe una serie de documentos titulados Points to Consider (Puntos a Tener Existen unas pautas integrales, Biosafety in Microbiological and Biomedical
en Cuenta) que pueden solicitarse al Director de la FDA a la siguiente Laboratories (Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos),
dirección: Director, FDA Center for Biologics Evaluation and Research, que pueden solicitarse a: Superintendent of Documents, U.S. Government
HFB-1, 8800 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892. Printing Office, Washington, DC 20402, N8 107-040-000508-3.
USP 30 Información General / h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a 463
Los productos obtenidos por biotecnologı́a no son significativa- complican el uso de los sistemas de fermentación de E. coli. En
mente diferentes de otros fármacos proteicos después del proceso de algunos casos, el producto proteı́nico expresado puede causar
purificación de proteı́nas. Por lo tanto, los requisitos básicos para la toxicidad celular y/o ser sumamente difı́cil de recuperar o purificar
validación de procesos, el control ambiental, la fabricación aséptica ya que puede quedar atrapado en cuerpos de inclusión bacteriana
y los sistemas de control de calidad y garantı́a de calidad son como grandes aglomerados semisolubles. Los recientes avances en
fundamentalmente los mismos para todos los productos farmacéu- la biologı́a molecular de E. coli han permitido expresar proteı́nas en
ticos. Sin embargo, la complejidad de estos sistemas suele ser mayor el espacio periplásmico, facilitando la eliminación de grupos
para los productos obtenidos por biotecnologı́a ya que su producción metionina N-terminales no deseados y la obtención de proteı́nas
requiere, por lo general, procesos de propagación de células más fáciles de purificar.
altamente desarrollados, métodos de purificación complicados y un
control analı́tico para asegurar su homogeneidad, uniformidad entre
lotes y seguridad. PRODUCCIÓN EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS (CÉLULAS DE
Esta sección describe con cierto detalle sólo aquellos factores MAMÍFEROS Y LEVADURAS)
significativos caracterı́sticos del procesamiento de productos obte-
nidos por biotecnologı́a. Entre ellos se encuentran las descripciones El uso del cultivo de células eucarióticas para la producción de
de los distintos sistemas de producción biológicos utilizados vacunas se ha establecido hace tiempo en la industria farmacéutica y
actualmente y un análisis de los problemas relacionados con la se ha desarrollado una extensa base de datos para asegurar la aptitud
purificación. del uso de tales productos proteicos en seres humanos. La extensión
de esta tecnologı́a a los productos de ADNr fue principalmente una
respuesta a las limitaciones en el uso de E. coli. En particular, en lo
Producción de ADNr que se refiere a proteı́nas o glicoproteı́nas grandes, la expresión de
células eucarióticas es una alternativa atractiva a un sistema
En la actualidad, los productos de ADNr se generan en sistemas bacteriano, ya que las células eucarióticas pueden secretar proteı́nas
procarióticos (bacterias) o eucarióticos (por ejemplo, levaduras o que se pliegan adecuadamente y cuya estructura primaria, secundaria
cultivo de células de mamı́feros). Por lo general, la elección del y terciaria es idéntica a la de la proteı́na humana natural. La
organismo de producción depende directamente de la complejidad preocupación por los aspectos económicos de este sistema de
molecular de la proteı́na que se va a producir, ası́ como de la producción obstaculizó en un principio su desarrollo. Sin embargo,
economı́a y eficiencia de la fermentación o el cultivo celular. Los los recientes avances en la obtención de mejores niveles de
primeros productos obtenidos por biotecnologı́a se produjeron en E. expresión, en el cultivo celular a gran escala mediante el empleo
coli debido a la amplia comprensión de su biologı́a molecular. En los de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en
últimos años, sin embargo, el uso del cultivo de células eucarióticas inglés) y en la formulación de medios de crecimiento más definidos
a gran escala se ha vuelto relativamente común. han mejorado mucho la factibilidad económica de los sustratos de
células eucarióticas. El número de pasajes celulares requeridos para
la clonación, selección, amplificación y la creación de bancos
PRODUCCIÓN EN CÉLULAS PROCARIÓTICAS (BACTERIAS) celulares antes de la producción requiere, en general, el uso de lı́neas
de células inmortales, ya que las cepas no inmortalizadas (es decir,
La producción bacteriana de productos obtenidos por biotecno- los cultivos diploides) no pueden propagarse suficientemente como
logı́a ofrece varias ventajas caracterı́sticas, ası́ como ciertas para proporcionar tiempos económicamente convenientes en la etapa
desventajas. Como se ha señalado antes, se ha estudiado y de producción. Las dudas iniciales en lo referente a la seguridad de
documentado ampliamente la biologı́a bacteriana y el uso seguro y estas lı́neas de células inmortales reflejaban una preocupación por la
eficaz de E. coli como organismo anfitrión en la producción. Por lo presencia de posibles oncogenes y una posible contaminación viral y
tanto, la expresión de una proteı́na nueva en E. coli, cuando es retroviral. Estas preocupaciones se han disipado considerablemente
posible, suele ser más fácil que en otros sistemas de expresión gracias al análisis y caracterización exhaustivos de bancos de células
teóricamente más apropiados. Esta ventaja puede verse atenuada, sin maestras para determinar agentes adventicios (introducidos acciden-
embargo, por el hecho de que E. coli produce proteı́nas generalmente talmente), mediante estudios eficaces de la validación de procesos y
en un estado quı́micamente reducido. Para plegarse adecuadamente, datos de seguridad obtenidos hasta la fecha para productos
tales proteı́nas requieren la producción de uniones disulfuro elaborados con este método. El banco de células maestras resultante
intramoleculares por oxidación. Una segunda desventaja es que y completamente caracterizado se emplea para la producción a gran
todas las proteı́nas de E. coli empiezan su secuencia con un residuo escala. Otras lı́neas de células eucarióticas, como por ejemplo las
de N-formil-metionina que no siempre puede eliminarse con los provenientes de células de insectos, pueden ser útiles para lograr
sistemas proteolı́ticos de E. coli, por lo cual posiblemente se muchas de las ventajas de conformación y postraduccionales que se
produzca un derivado metionilo de la proteı́na natural deseada. Una han descrito para el cultivo de células de mamı́feros.
tercera desventaja de la expresión en E. coli es la posibilidad de que Se ha explorado ampliamente el uso de cepas de levaduras, como
el producto se deteriore debido a trazas de impurezas de proteasa. por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, para la producción. La
Una cuarta desventaja es el requisito de eliminación de endotoxinas producción de proteı́nas en levaduras ofrece muchas más ventajas
durante la purificación. A pesar de estas limitaciones, la facilidad de teóricas con respecto al uso de E. coli, aunque plantea nuevas
uso de E. coli y sus rendimientos de expresión generalmente altos preocupaciones. Al igual que E. coli, las levaduras pueden mantener
para la mayorı́a de las proteı́nas han propiciado el uso preferencial plásmidos estables en forma extracromosómica; sin embargo, a
continuado de esta bacteria siempre que sea posible. diferencia de E. coli, las levaduras tienen la capacidad de producir
Como se describió anteriormente, el elemento clave en la glicoproteı́nas.
tecnologı́a de ADN recombinante es el plásmido recombinante,
que contiene el gen que codifica la proteı́na de interés. Los
plásmidos son segmentos extracromosómicos circulares, sencillos y PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
pequeños de ADN bacteriano que se aı́slan de una bacteria y que se
autorreplican. La tecnologı́a básica emplea el corte enzimático Los anticuerpos monoclonales pueden producirse de dos maneras
especı́fico de un plásmido mediante el empleo de endonucleasas, principales, dependiendo de si son de origen humano o murino
seguido de la inserción de una nueva pieza de ADN que contiene el (ratón). En el caso de los anticuerpos de origen murino, los linfocitos
gen de interés. El plásmido recombinante resultante se considera la apropiados se seleccionan de los bazos de ratones o ratas
materia prima clave de la tecnologı́a de ADNr. El plásmido previamente inoculados. La célula se fusiona luego con una lı́nea
recombinante se introduce en el organismo anfitrión mediante un celular transformada, como por ejemplo una lı́nea de células de
proceso llamado transformación, por el cual transmite su nueva mieloma, lo cual produce una célula hibridoma. A continuación, se
información genética y genera el producto proteico. El crecimiento a seleccionan las células hibridomas por clonación y se emplean para
gran escala de organismos recombinantes puede realizarse en generar productos de anticuerpos monoclonales. En el caso de los
fermentadores comerciales de más de 100 000 litros, lo que hace anticuerpos de origen humano, los linfocitos B humanos pueden
que estos tipos de sistemas de producción sean sumamente seleccionarse por clonación según la especificidad de unión entre el
económicos. Existen, sin embargo, una serie de problemas que hapteno y los anticuerpos resultantes; estas células seleccionadas
USP 30 Información General / h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a 465
luego pueden inmortalizarse mediante la infección con un virus. La fermentaciones de E. coli con técnicas como el análisis de las
célula resultante fusionada o transformada puede proliferar indefi- secuencias del plásmido, ya que el gen que codifica el producto se
nidamente en un entorno de cultivo celular o en un biorreactor o bien incorpora al genoma de las células y no se recupera fácilmente. Una
puede inyectarse en ratones de cuyo lı́quido ascı́tico puede extraerse alternativa es el mapeo de péptidos de la proteı́na expresada, que
la proteı́na. El anticuerpo se produce según lo indica la información requiere una suficiente resolución y sensibilidad para detectar
cromosómica que reside en la célula o que se adquirió durante la mutaciones sutiles.
fusión y se secreta en el medio, a partir del cual puede purificarse La ausencia de organismos adventicios en cultivos celulares es
fácilmente. Las células hibridoma se deben analizar y caracterizar crı́tica. Además de demostrar que no hay bacterias, levaduras ni
exhaustivamente de la misma manera que un banco de células hongos presentes en los cultivos de células, el fabricante debe
ADNr. El banco de células resultantes se emplea para la elaboración proporcionar evidencia, para cada cultivo, de que no hay
del producto por cultivo celular a gran escala o mediante la micoplasmas ni virus adventicios. Es importante tener en cuenta
recolección de lı́quido ascı́tico de ratones inoculados con células que algunos hibridomas usados para la producción de anticuerpos
transformadas. monoclonales pueden contener retrovirus endógenos. Sin embargo,
debe demostrarse que cualquier virus presente en el cultivo es
eliminado del producto final. Esto exige el desarrollo de técnicas
Control de los Procesos de Fermentación y Cultivo analı́ticas apropiadas que aseguren la ausencia de contaminación por
de Células micoplasmas o virus adventicios humanos y animales.
El grado y tipo de glicosilación pueden ser importantes para el
Como el proceso de producción a través de un sistema vivo es la diseño de las condiciones de cultivo celular necesarias para la
base fundamental de la biotecnologı́a, es necesario considerar los producción de proteı́nas glicosiladas. El grado de glicosilación puede
problemas que implica el control de los procesos biotecnológicos. afectar la vida media del producto in vivo ası́ como su potencia y
Las principales preocupaciones para la producción de proteı́nas en antigenicidad. Aunque el estado de glicosilación de un producto de
bacterias, por ejemplo, involucran el desarrollo de sistemas que cultivo celular es difı́cil de determinar, puede comprobarse su
permitan asegurar la estabilidad genética, un rendimiento uniforme uniformidad si las condiciones de cultivo son altamente reproduci-
del producto y la evidencia de que no existe contaminación por bles.
microorganismos adventicios. Estas mismas preocupaciones valen
para el cultivo de células eucarióticas a gran escala, donde, como se
ha indicado anteriormente, también existen problemas importantes Proceso de Recuperación y Purificación
relacionados con el uso de lı́neas celulares inmortalizadas, como por
ejemplo la presencia putativa de ADN y ARN oncogénico e Por lo general, la recuperación de productos proteicos obtenidos a
impurezas de proteı́nas de los medios. partir de fermentación o cultivo celular se basa en técnicas eficientes
de separación proteica, como las listadas en la Tabla 1. El proceso de
recuperación comienza con el aislamiento de la proteı́na deseada del
FERMENTACIONES (BACTERIAS Y LEVADURAS) medio de fermentación o de cultivo celular, a menudo en una forma
muy impura. La ventaja del cultivo celular y de los productos
Se han acumulado muchos conocimientos sobre la producción de obtenidos a partir de levaduras es que muchas de estas proteı́nas se
proteı́nas recombinantes en bacterias y levaduras; en consecuencia, secretan directamente hacia el medio y, por lo tanto, sólo requieren la
los principales problemas del proceso de fermentación suelen separación de las células para obtener una purificación significativa.
resolverse mediante la demostración de que existe uniformidad en En el caso de productos obtenidos a partir de E. coli, suele requerirse
las condiciones de fermentación. Las fermentaciones con bacterias y la lisis de las bacterias para recuperar la proteı́na deseada. Es
levaduras se realizan generalmente durante perı́odos breves y bien importante en cada caso lograr una rápida purificación de la proteı́na
definidos para vigilar y controlar la velocidad de crecimiento y las deseada ya que las proteasas liberadas por los organismos lisados
condiciones de expresión del producto. Se puede detectar la pueden escindir el producto deseado. Estas trazas de proteasas
presencia de organismos contaminantes extraños por sus efectos adquieren especial importancia durante la purificación de productos
sobre la velocidad del crecimiento, la pureza del cultivo, el perfil de obtenidos mediante biotecnologı́a, ya que pueden ser muy difı́ciles
ácidos grasos, etc.; esta presencia es razón suficiente para terminar la de eliminar, pueden complicar el proceso de recuperación y pueden
fermentación. La estabilidad genética del plásmido producido por afectar considerablemente la estabilidad del producto final.
bacterias puede controlarse mediante el aislamiento y el análisis de la
secuencia de nucleótidos o mediante el mapeo del ADN con enzimas
de restricción. Estos resultados pueden verificarse por mapeo de Tabla 1. Métodos de Purificación Cromatográficos Empleados
péptidos de la proteı́na expresada en cada lote del producto para Productos Obtenidos por Biotecnologı́a
elaborado. Es muy importante optimizar las condiciones de Cromatografı́a focalizada
fermentación para limitar o evitar el procesamiento proteolı́tico de Cromatografı́a en fase reversa
la proteı́na objetivo. El procesamiento proteolı́tico suele ser un Cromatografı́a de interacción hidrofóbica
problema en las fermentaciones de E. coli y puede producir Cromatografı́a por transferencia de carga
dificultades en la recuperación y un bajo rendimiento del producto. Cromatografı́a de exclusión por tamaño (tamizado molecular)
Finalmente, el proceso de fermentación debe contemplar la Cromatografı́a de intercambio iónico
conformación de la proteı́na y sus posibles efectos sobre la potencia. Aniónico
Catiónico
Cromatografı́a de afinidad
CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS Quı́mica
Anticuerpos monoclonales
Las técnicas de cultivo celular a gran escala para la elaboración de Receptores celulares
productos obtenidos por biotecnologı́a se remontan a la producción Colorante/Ligando
de vacunas. Ciertos avances, como el cultivo de células en Quelatos metálicos
suspensión a gran escala usando organismos recombinantes que
secretan la proteı́na deseada hacia el medio de cultivo, han tenido
una importante repercusión en la biotecnologı́a. En la actualidad, Por lo general, el proceso de recuperación está diseñado para una
pueden producirse grandes proteı́nas glicosiladas en cantidades elevada purificación del producto final. El requisito de pureza para
suficientes para el mercado. Sin embargo, el uso de cultivos de un producto depende de muchos factores, aunque puede exigirse que
células eucarióticas se complica por aspectos tales como la los productos de uso continuo tengan una pureza mucho mayor que
estabilidad genética, el plegado de proteı́nas y las condiciones del aquellos concebidos para un solo uso. Los productos biotecnológicos
cultivo, incluyendo la viabilidad de las células y su velocidad de contienen ciertas impurezas que los procesos de recuperación están
crecimiento. La estabilidad genética de los cultivos celulares, por especı́ficamente diseñados para eliminar o reducir al mı́nimo. Estas
ejemplo, no puede controlarse tan fácilmente como en el caso de las impurezas incluyen cantidades detectables de ADN, factores de
crecimiento, proteı́nas residuales del anfitrión, endotoxinas y
466 h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a / Información General USP 30
proteı́nas celulares residuales provenientes de los medios. Las purificación. Como ya se ha señalado, las vacunas pueden diferir en
impurezas más comunes de interés y los métodos de valoración este aspecto debido a los antecedentes clı́nicos acumulados sobre
apropiados para detectarlas se presentan en la Tabla 2. estos productos.
La cromatografı́a focalizada y la cromatografı́a en fase reversa son
métodos de purificación que emplean productos quı́micos, ya sea en
la fase estacionaria (unida) o en la fase móvil, que pueden CONTROL DE CALIDAD
convertirse en impurezas en el producto final. Como sucede con
cualquier tecnologı́a nueva, la responsabilidad de la validación (es En general, los sistemas de control de calidad para productos
decir, de demostrar la supresión de productos quı́micos potencial- obtenidos por biotecnologı́a son muy similares a los utilizados
mente nocivos) recae en el fabricante. La validación es necesaria rutinariamente en productos farmacéuticos tradicionales en áreas
cuando se están aislando los anticuerpos monoclonales del producto tales como pruebas y liberación de materias primas, documentación
final o empleando una técnica que contiene una etapa de purificación de control de proceso y fabricación, y procesamiento aséptico. Los
de anticuerpos monoclonales. El proceso debe probar que se han sistemas de control de calidad de productos obtenidos por
eliminado los fragmentos de anticuerpos o anticuerpos lixiviados. Es biotecnologı́a incorporan algunas de las mismas filosofı́as aplicadas
necesario asegurar la ausencia de agentes adventicios, como por al análisis de productos farmacéuticos de bajo peso molecular, como
ejemplo virus y micoplasmas, en la lı́nea celular de origen de los el uso de estándares de referencia quı́micos y métodos validados,
anticuerpos monoclonales. La principal preocupación es la posibi- para evaluar un amplio espectro de impurezas del producto
lidad de contaminación del producto con una sustancia antigénica conocidas y/o potenciales, ası́ como posibles productos de
que podrı́a ser perjudicial para los pacientes. Es necesario un descomposición. Los sistemas de control de calidad para productos
continuo control del proceso para evitar o limitar tal contaminación. obtenidos mediante biotecnologı́a suelen ser análogos a los
El problema de la antigenicidad relacionada con las proteı́nas activas establecidos para productos biológicos tradicionales en lo que se
y con las proteı́nas anfitrionas es caracterı́stico de los productos refiere a la determinación de la esterilidad del producto, la seguridad
obtenidos por biotecnologı́a, en contraste con los fármacos del producto para animales de experimentación y la potencia del
tradicionales. Los métodos de fabricación que emplean ciertos producto. Consultar por ejemplo, Inyectables h1i, pH h791i,
disolventes deben controlarse si son capaces de provocar reordena- Partı́culas en Inyectables h788i, Prueba de Endotoxinas Bacteria-
mientos quı́micos que alterarı́an el perfil antigénico del ingrediente nas h85i e Impurezas en Artı́culos Oficiales h1086i.
activo. El fabricante también está obligado a comprobar la La diferencia fundamental entre los sistemas de control de calidad
uniformidad en el funcionamiento de las nuevas columnas para productos obtenidos por biotecnologı́a y productos farmacéu-
cromatográficas. Las consideraciones para los productos de un ticos tradicionales reside en el tipo de métodos que se emplean para
solo uso, como por ejemplo las vacunas, pueden diferir ya que no se determinar la identidad del producto, su uniformidad, su pureza y el
administran continuamente y su antigenicidad es deseable. Por otro perfil de las impurezas. Además, en el control de calidad
lado, es necesario validar la eliminación de la contaminación con biotecnológico, frecuentemente es necesario combinar pruebas para
proteı́nas extrañas o ligandos. A diferencia de los fármacos de origen el producto final y pruebas durante el proceso validadas, y la
natural, los fabricantes de productos obtenidos mediante biotecno- validación del proceso para asegurar la eliminación de impurezas no
logı́a deben validar la eliminación de los ácidos nucleicos durante la deseadas reales o posibles, hasta alcanzar los niveles sugeridos por
los organismos reguladores. Por lo general, los productos obtenidos
Tabla 2. Posibles Impurezas y Contaminantes en Productos Obtenidos por Biotecnologı́a.
Impurezas o Contaminantes Método de Detección
Impurezas
Endotoxinas Prueba de Endotoxinas Bacterianas h85i, Prueba de Pirógenos h151i
Proteı́nas de células anfitrionas SDS-PAGEa, Valoraciones inmunológicas
Otras impurezas proteicas (medios) SDS-PAGE, HPLCb, Valoraciones inmunológicas
ADN Hibridación de ADN, Espectrofotometrı́a UV
Unión a proteı́nas
Proteı́nas mutantes Mapeo de péptidos, HPLC, IEFc, MSd
Formil-metionina Mapeo de péptidos, HPLC, MS
Metioninas oxidadas Mapeo de péptidos, análisis de aminoácidos, HPLC, análisis de degradación
de Edman, MS
Escisión proteolı́tica IEF, SDS-PAGE (reducido), HPLC,
análisis de degradación de Edman
Proteı́nas aglomeradas SDS-PAGE, HPSECe
Desamidación IEF, HPLC, MS, análisis de degradación
de Edman
Anticuerpos monoclonales SDS-PAGE, valoraciones inmunológicas
Sustituciones de aminoácidos Análisis de aminoácidos, mapeo de péptidos, MS, análisis de
degradación de Edman
Contaminantes
Microbianos (bacterias, levaduras, hongos) Pruebas de Lı́mite Microbiano h61i, Pruebas de Esterilidad h71i,
pruebas microbiológicas
Micoplasmas Método del 21 CFR Modificadof, DNAFg
Virus (endógenos y adventicios) CPEh y HAdi (virus exógenos exclusivamente), actividad de
transcriptasa reversa, MAPj
a
Electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio.
b
Cromatografı́a lı́quida de alta resolución.
c
Isoelectroenfoque.
d
Espectrometrı́a de masas.
e
Cromatografı́a de alta resolución de exclusión por tamaño.
f
Borradores de lineamientos relativos al Código de Reglamentaciones Federales, Tı́tulo 21.
g
Fluorocromo de unión con ADN.
h
Efecto citopático.
i
Hemoadsorción.
j
Producción de anticuerpos murinos.
USP 30 Información General / h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a 467
por biotecnologı́a requieren una caracterización detallada del métodos, como por ejemplo la valoración de impurezas de la
organismo de producción (célula), una evaluación completa de los célula anfitriona y los procedimientos para ADN residual, pueden ser
medios de crecimiento y propagación de las células y un análisis muy especı́ficos para el producto y para el proceso en particular; por
explı́cito del proceso de recuperación del producto final. lo tanto, deben incluirse en cada monografı́a.
La complejidad de los sistemas de control de calidad para
productos obtenidos por biotecnologı́a se relaciona con el tamaño y
con las caracterı́sticas estructurales del producto y el proceso de Consideraciones sobre Estándares de Referencia
fabricación. En general, los sistemas de control de calidad requeridos
por los productos elaborados en células procarióticas son menos El uso de estándares y materiales de referencia apropiados es
complejos que los sistemas requeridos para los elaborados en células sumamente importante para el análisis de los productos obtenidos
eucarióticas. Entre los sistemas de control de calidad para los por biotecnologı́a. Estos estándares pueden ser materiales naturales o
organismos de producción procarióticos generalmente se encuentran proteı́nas producidas por ingenierı́a genética. Muchos productos
la documentación del origen de la cepa productora y las pruebas obtenidos por biotecnologı́a requieren estándares de referencia
tradicionales para la detección de organismos adventicios, cariologı́a, exactamente caracterizados disponibles de fuentes internacional-
caracterización del fenotipo y resistencia a los antibióticos. Además, mente reconocidas, como por ejemplo la USP (ver Estándares de
pueden ser útiles otras técnicas nuevas, como el mapeo por Referencia USP h11i), OMS, NIH y FDA. Actualmente, los
restricción de ADN, el análisis de secuencias de ADN y el control estándares de referencia de algunos productos biológicos con
de rutina, que puede incluir la medición de concentraciones de ADN unidades de actividad definidas se obtienen en dichas organiza-
de plásmido o ARNm. El control de calidad del banco de células ciones. Los fabricantes emplean estos estándares para probar o
maestras y el banco de células de trabajo para organismos calibrar estándares secundarios aplicando muchas de las valoracio-
eucarióticos de producción incluye, por lo general, pruebas para nes descritas en esta sección. El valor de potencia del estándar de
detección de organismos adventicios, cariologı́a, identidad y el referencia se obtiene por estudios colaborativos que, cuando se
control de la estabilidad. Todas las lı́neas de células eucarióticas evalúan estadı́sticamente, permiten determinar el valor de potencia
(excepto las levaduras) suelen analizarse para detectar la presencia máxima asignado al estándar de referencia. El estándar secundario
de retrovirus, marcadores de actividad retroviral y tumorigenicidad, puede emplearse para determinar la cantidad declarada del fármaco o
aunque muchas de estas pruebas pueden tener un valor limitado. la potencia definida en la etiqueta del producto. Por lo tanto, la USP
aprueba y proporciona los estándares o materiales de referencia para
productos obtenidos mediante biotecnologı́a utilizados con los fines
FORMULACIÓN DE PRODUCTOS analı́ticos descritos en las monografı́as USP correspondientes. En
una situación ideal, estos estándares de referencia deberı́an utilizarse
Los productos biotecnológicos son proteı́nas y péptidos que son mundialmente y siempre deberı́an estar calibrados en comparación
moléculas relativamente inestables comparadas con la mayorı́a de las con el estándar de los EE.UU. que el fabricante entrega a la FDA
sustancias farmacéuticas orgánicas. En la mayorı́a de los procesos para productos autorizados por la FDA. Esto asegura la determina-
biotecnológicos hay una transferencia de proteı́nas desde un ción exacta y uniforme de la actividad, contenido y pureza de estos
amortiguador de pH estabilizante o solubilizante a otro durante la productos. Debido a diversas caracterı́sticas especiales de los
purificación. En último término, la proteı́na se transfiere a una productos obtenidos por biotecnologı́a, como por ejemplo la
solución en su forma farmacéutica final, donde se logra su especificidad del proceso y del producto, es posible que otros
estabilidad a largo plazo. Además, estos productos requieren a productos similares necesiten estándares de referencia diferentes.
menudo la liofilización para lograr una estabilidad a largo plazo, Además, la USP realiza el desarrollo minucioso y la recalibración de
debido a su tendencia a degradarse mediante una variedad de los estándares de referencia para reemplazar estándares agotados o
mecanismos, entre ellos, la desamidación, aglomeración, oxidación y caducos a fin de asegurar que no cambien las indicaciones en las
posible proteólisis causada por trazas de proteasas de las células etiquetas de los productos farmacéuticos. Un punto que se debe
anfitrionas. Por lo general, la forma farmacéutica final de la proteı́na considerar en la asignación de la potencia al estándar primario
contiene compuestos estabilizantes que proporcionan el pH óptimo y mediante estudios colaborativos es que las unidades de actividad
las condiciones de solución necesarias para la estabilidad a largo definidas sólo son significativas cuando se comparan en una sola
plazo del producto y/o las propiedades deseadas para su adminis- valoración exacta y bien descrita. Si se intenta comparar actividades
tración (tonicidad). Entre estos compuestos se encuentran las obtenidas con valoraciones que son ligeramente diferentes, es
proteı́nas, alcoholes polihı́dricos, aminoácidos, carbohidratos, probable que se obtengan resultados marcadamente distintos.
agentes de volumen, sales inorgánicas y agentes tensoactivos no
iónicos. Además, estos excipientes pueden ser necesarios para la
obtención de un liofilizado estable. Existen requisitos especiales para Metodologı́a Caracterı́stica
los productos liofilizados, como por ejemplo el control de la
humedad, que, en general, se definen en la monografı́a USP de cada Existen varios métodos analı́ticos especı́ficos para productos
producto y que pueden ser importantes para su estabilidad. Vale obtenidos mediante biotecnologı́a. Muchas de las valoraciones y
notar que la evaluación de la estabilidad proteica suele exigir pruebas descritas pueden realizarse de diferentes maneras y, como
múltiples métodos analı́ticos, cada uno de los cuales puede algunas pueden ser también especı́ficas para un determinado
emplearse para evaluar una modalidad especı́fica de degradación producto, se necesitan normas claras sobre la aplicación de métodos
proteica. Muchas de estas valoraciones se describen en la siguiente especı́ficos en cada situación en particular. Ver los capı́tulos Diseño y
sección. El uso de estudios de estabilidad acelerada para predecir la Análisis de Valoraciones Biológicas h111i y Validación de Métodos
vida útil de formulaciones proteicas a veces se complica por los Farmacopeicos h1225i para información general sobre la metodo-
efectos de la temperatura sobre la conformación de las proteı́nas, logı́a.
produciéndose un comportamiento que no se ajusta a la teorı́a de
Arrhenius. Por lo tanto, suelen requerirse con frecuencia estudios de
estabilidad en las condiciones de almacenamiento recomendadas en CONTENIDO PROTEICO
tiempo real para establecer la fecha de caducidad de los productos
obtenidos mediante biotecnologı́a. Las valoraciones de contenido proteico se emplean para
determinar cuantitativamente la cantidad de proteı́nas en un producto
dado obtenido por biotecnologı́a. La determinación del contenido
METODOLOGÍA ANALÍTICA proteico suele ser una de las mediciones más difı́ciles y
frecuentemente requiere una verificación independiente mediante
El análisis de los productos obtenidos mediante biotecnologı́a métodos alternativos. Siempre que sea pertinente, pueden emplearse
depende en gran medida de métodos analı́ticos sofisticados para métodos tales como la espectrofotometrı́a UV con una absortividad
demostrar la identidad estructural y la homogeneidad de las proteı́nas válida y el análisis de nitrógeno por Kjeldahl para determinar las
y para evaluar su vida útil o estabilidad. Esta sección trata sobre la cantidades absolutas de proteı́na independientemente de los
exactitud, la precisión, el contenido informativo y la aplicabilidad estándares de referencia. Sin embargo, otros métodos, como
general de los métodos más comúnmente utilizados. Algunos Lowry, Biuret y el análisis cuantitativo de aminoácidos, que
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requieren el uso de sustancias de referencia, también permiten agregar diversas sales, como por ejemplo sulfato de potasio, para
obtener valores exactos. Las valoraciones de contenido proteico se aumentar el punto de ebullición de la solución de ácido sulfúrico.
encuentran entre los métodos más importantes para estos productos También se han empleado agentes oxidantes, como por ejemplo
ya que los resultados de otros tipos de valoraciones, como por ácido perclórico o permanganato de potasio, para mejorar la
ejemplo la potencia, también dependen de ellos. descomposición. La segunda etapa de la valoración incluye la
Existen varios métodos comunes de valoración para determinar el determinación directa del amonı́aco. En la mayorı́a de las
contenido proteico. Estos métodos de valoración pueden emplearse macrodeterminaciones, el amonı́aco se destila por corriente de
en distintos puntos del proceso de elaboración de un determinado vapor a partir de la mezcla después de la alcalinización con
producto obtenido por biotecnologı́a. En el caso de proteı́nas de alta hidróxido de sodio. Por lo general, el amonı́aco destila cuantitati-
pureza, el método más sencillo para evaluar el contenido proteico se vamente de la mezcla en 5 a 20 minutos y se absorbe
basa en la determinación espectrofotométrica de la absorbancia en el cuantitativamente en una solución ácida estandarizada, de volumen
UV de una solución de proteı́nas. La absorbancia se determina al y normalidad conocidas. El exceso de ácido se retrovalora
máximo de absorción y se calcula la concentración proteica volumétricamente con una base estandarizada. Para las determina-
empleando una absortividad determinada empı́ricamente. Esta ciones de proteı́na bruta, el valor del amonı́aco (y, por lo tanto, del
técnica se aplica a proteı́nas que contienen los residuos aromáticos contenido de nitrógeno) se multiplica por un factor de 6,25 mg de
triptofano, tirosina, y/o fenilalanina. A menudo, la longitud de onda proteı́na por mg de nitrógeno, que corresponde a un contenido de
de absorción empleada es de 280 nm. El coeficiente de extinción, o nitrógeno de 16%. El valor proteico obtenido de esta forma es
absortividad molar, debe determinarse en el mismo disolvente usado generalmente válido para la mayorı́a de las proteı́nas. Si se requiere
para la muestra que se va a medir. Si fuera necesario, el producto un valor más exacto, como en una medición de absortividad,
puede diluirse antes de analizarlo para obtener soluciones con entonces el factor de conversión debe calcularse para el contenido de
valores de absorbancia en el intervalo lineal de detección. Los nitrógeno de cada proteı́na pura a partir de su composición
aglomerados y partı́culas de mayor peso molecular pueden dispersar aminoacı́dica. En el caso de las glicoproteı́nas que contienen
la luz, que artificialmente aumenta la absorbancia. Los excipientes aminoazúcares, el valor calculado produce un valor atificialmente
que tienen absorbancia significativa a 280 nm también interfieren. La alto a menos que se aplique una corrección.
espectrofotometrı́a UV es única entre los métodos de valoración de El análisis de aminoácidos se emplea en la determinación de la
contenido proteico, ya que es una medida absoluta de concentración absortividad apropiada de la proteı́na y también puede emplearse
de una proteı́na especı́fica que no requiere calibración con cuantitativamente para la determinación del contenido proteico. Este
estándares. procedimiento, aunque es más complicado que los descritos
Un método general comúnmente utilizado para medir el contenido anteriormente, también produce resultados exactos.
proteico es la valoración de Lowry. Este método se basa en la
reacción de Biuret de proteı́nas con cobre (II) en una solución básica
y la reducción del ácido fosfomolı́bdico-fosfotúngstico de Folin- ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS
Ciocalteu a azul de heteropolimolibdeno mediante la oxidación
catalizada por cobre de los aminoácidos aromáticos tirosina, El análisis de aminoácidos es un método quı́mico clásico para
triptofano y fenilalanina en la proteı́na. Los productos de reacción determinar la composición de aminoácidos en proteı́nas y péptidos.
son azules y se cuantifican en forma espectrofotométrica en la región El método consiste en la hidrólisis completa de una proteı́na o
visible entre 540 y 560 nm. Esta reacción es lineal para microgramos péptido hasta sus aminoácidos componentes, que luego se separan
de proteı́na. La valoración, sin embargo, es susceptible de por cromatografı́a y se cuantifican. Por consiguiente, el análisis de
interferencias de varias sustancias, como por ejemplo alcoholes, aminoácidos puede emplearse para determinar la composición de un
azúcares y detergentes. En algunos casos, sustancias de interferencia producto (es decir, la identidad) y la cantidad de proteı́nas totales
o el producto pueden extraerse antes del análisis, por ejemplo presente. El método tiene algunas dificultades inherentes (como por
mediante su precipitación. Además, la preparación de controles que ejemplo la destrucción total o parcial de algunos aminoácidos) que
contienen sustancias interferentes presentes en el producto farma- pueden evitarse empleando la metodologı́a analı́tica apropiada. El
céutico puede permitir la corrección. Aunque históricamente se ha aminoácido triptofano se destruye por hidrólisis con ácido
empleado la albúmina sérica bovina para preparar la curva estándar, clorhı́drico 6 N y, por lo tanto, requiere otras condiciones de
se sabe que cada proteı́na puede reaccionar con una intensidad hidrólisis. Los aminoácidos serina y treonina pueden destruirse
diferente y por lo tanto se debe emplear un material de referencia del parcialmente, mientras que las uniones peptı́dicas entre residuos
mismo producto para la calibración. La valoración del ácido hidrófobos voluminosos tales como la valina y la isoleucina pueden
bicinconı́nico (BCA) es una alternativa útil a la valoración de ser más resistentes a la hidrólisis, proporcionando en ambos casos
Lowry, ya que es menos sensible a sustancias interferentes. El valores inferiores a los reales. En consecuencia, se puede emplear el
reactivo de trabajo es una solución de BCA-cobre (II). El complejo análisis de muestras a lo largo de la hidrólisis para compensar estos
de cobre (II) se reduce a cobre (I) en presencia de proteı́nas y el color factores. La cisteı́na y la metionina pueden requerir la oxidación
morado puede cuantificarse por espectrofotometrı́a a aproximada- previa a ácido cisteico y metionina sulfona, respectivamente, para su
mente 560 nm. cuantificación exacta. Cada proteı́na especı́fica puede requerir un
También pueden emplearse otras valoraciones colorimétricas. El procedimiento de hidrólisis en condiciones optimizadas para el
método de Bradford, por ejemplo, emplea la unión del colorante análisis de sus aminoácidos a fin de obtener buenos resultados.
Azul de Coomassie Brillante a la proteı́na en un medio ácido. La El análisis de aminoácidos se realiza en dos etapas. La primera
concentración de la proteı́na en la solución se determina mediante la etapa es la hidrólisis de la proteı́na que genera sus aminoácidos
comparación de la absorbancia a 595 nm con una curva estándar de componentes. Esta hidrólisis se realiza normalmente con ácido
un material de referencia. clorhı́drico 6 N a aproximadamente 1108 durante 24 horas. Algunas
Los métodos de fluorescencia empleados se basan normalmente proteı́nas pueden requerir condiciones de hidrólisis más largas o más
en fluorescamina o en o-ftaldialdehı́do (OPA). La principal ventaja enérgicas. La segunda etapa es la separación y cuantificación de los
de estas valoraciones es su mayor sensibilidad. Otra ventaja es su uso aminoácidos individuales mediante alguna forma de cromatografı́a
con proteı́nas hidrófobas. La fluorescamina y el OPA reaccionan con que se pueda realizar por derivatización anterior o posterior al paso
aminas primarias en el extremo N-terminal del polipéptido y en las por la columna. Se dispone de varios procedimientos de derivatiza-
cadenas laterales de aminoácidos tales como la lisina. ción anteriores al paso por la columna, como por ejemplo con OPA,
El método de Kjeldahl para nitrógeno, Determinación de fenilisotiocianato (PITC) y fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC). Estos
Nitrógeno h461i, es una determinación exacta y precisa de la derivados se separan luego mediante cromatografı́a lı́quida de alta
concentración proteica y suele emplearse en la determinación de resolución (HPLC) en fase reversa (FR) y se cuantifican por
absortividades UV de proteı́nas. La valoración se realiza en dos detección en el UV o por fluorescencia. Dentro de los métodos de
etapas. En primer lugar, la muestra se descompone con ácido derivatización posteriores al paso por la columna se encuentran la
sulfúrico produciéndose sulfato de amonio, dióxido de carbono y separación en componentes aminoacı́dicos por cromatografı́a de alta
agua. La descomposición se realiza al punto de ebullición del ácido resolución de intercambio iónico (HPIEC), seguida por una reacción
sulfúrico en matraces de cuello largo con forma de pera. Estos postcolumna con un cromóforo tal como la ninhidrina, y la
matraces sirven para condensar el vapor de agua e impedir la pérdida cuantificación mediante la detección en la región UV/visible.
de material. Según la eficiencia de la descomposición, se pueden Todos estos métodos son apropiados para análisis de aminoácidos
USP 30 Información General / h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a 469
y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Los derivados de proteı́nas o junto con el mapeo de péptidos por HPLC para
OPA son muy fáciles de preparar y sensibles y sólo requieren una identificar el extremo C-terminal de la proteı́na. Sin embargo, estos
pequeña cantidad de muestra, pero son inestables y tienen que pasar métodos son solamente semicuantitativos.
a la cromatografı́a de inmediato una vez preparados. Por otro lado,
los derivados del feniltiocarbamilo (PTC) son relativamente más
estables. La derivatización con ninhidrina postcolumna a menudo se MAPEO DE PÉPTIDOS POR HPLC
realiza a baja presión y tiene la ventaja de la estabilidad del
hidrolizado. Sus desventajas son la necesidad de detección dual a El mapeo de péptidos cumple dos propósitos principales en
440 y 570 nm y el equipo necesario para la derivatización relación con las proteı́nas de uso farmacéutico: es un método de
postcolumna. identidad altamente especı́fico y, en el caso de los productos
obtenidos mediante biotecnologı́a, puede servir como una confirma-
ción de la estabilidad genética. Este método se emplea para comparar
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS la estructura proteica de un lote especı́fico de material con la de un
material o estándar de referencia apropiado o con la estructura de
La secuenciación de proteı́nas es útil para el control de calidad de lotes anteriores para verificar si la estructura primaria es correcta y
productos biológicos proteicos ya que puede proporcionar informa- comprobar la uniformidad de la estructura primaria en cada lote
ción sobre su estructura primaria, es decir, la estructura amino- (dentro de los lı́mites de esta técnica). Por lo general, los grupos
terminal y carboxi-terminal. En el caso de productos biológicos amino-terminales y carboxi-terminales de los péptidos, y de los
provenientes del ADNr, esta metodologı́a también sirve para péptidos que contienen carbohidratos se pueden separar e identificar.
confirmar la secuencia aminoacı́dica predicha por el ADN Estos últimos son valiosos en los mapeos de los péptidos de
complementario (ADNc), la homogeneidad de la proteı́na y el proteı́nas glicosiladas tales como los anticuerpos monoclonales. Los
número potencial de cortes proteolı́ticos. En cuanto a los anticuerpos mapas de péptidos pueden emplearse para determinar la presencia de
monoclonales, esta técnica se emplea para determinar su homo- aminoácidos incorrectos simples o múltiples como resultado de una
geneidad proteica. La secuenciación de proteı́nas se divide en mutación puntual o errores en la traducción de la secuencia de
aplicaciones y procedimientos de secuenciación amino-terminal y ADNc.
carboxi-terminal. El procedimiento implica la fragmentación selectiva de la
Secuenciación Amino-Terminal—El análisis de la secuencia proteı́na, formándose péptidos diferenciados que se separan por
amino-terminal es una técnica quı́mica clásica que proporciona alguna técnica cromatográfica. La fragmentación se logra con
información importante sobre la estructura primaria (secuencia), la endoproteasas tales como la tripsina, quimotripsina, termolisina,
homogeneidad y la presencia de escisiones conocidas o desconoci- proteasa V8, o mediante la degradación quı́mica selectiva con
das en el polipéptido. El análisis de las secuencias N-terminales se bromuro de cianógeno, que divide la molécula en sitios especı́ficos.
realiza con varios secuenciadores de péptidos automáticos comer- La selección de la endoproteasa apropiada depende de la secuencia
cialmente disponibles. El método se basa en la reacción de primaria de la proteı́na. La tripsina escinde los residuos básicos de
acoplamiento del residuo amino-terminal de una proteı́na o de un lisina y arginina en su extremo C-terminal; la quimotripsina escinde
péptido con PITC. El derivado aminoácido-PTC resultante se separa después de los residuos aromáticos a fenilalanina, tirosina y
de la proteı́na con un ácido orgánico perfluorado (por lo general triptofano; la termolisina escinde después de los residuos hidrófobos
ácido trifluoroacético o heptafluorobutı́rico), que expone el amino- a leucina, isoleucina y valina; la proteasa V8 escinde después los
ácido adyacente. Este aminoácido adyacente sirve como un nuevo residuos de ácido glutámico y ácido aspártico; y, finalmente, el
N-terminal y se derivatiza en el siguiente ciclo de acoplamiento y bromuro de cianógeno escinde los residuos metionilo. También se
escisión. Este proceso se repite hasta extraer un número apropiado, pueden emplear otras enzimas, como por ejemplo clostripaı́na
normalmente de 8 a 10 aminoácidos. Por lo general, el residuo (arginina) y endoproteinasa lis-C (lisina) y métodos quı́micos tales
aminoácido modificado resultante del ciclo de escisión [anilinotia- como el ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico (cisteı́na). Cada uno de
zolinona (ATZ)] se convierte en un feniltiohidantoı́n-aminoácido estos métodos tiene sus propias ventajas y desventajas. Una
(PTH-AA) en presencia de ácido y calor. Luego, el PTH-AA puede desventaja común a todas estas técnicas es que, en cierta medida,
determinarse mediante un análisis por RP-HPLC. Cualquier escisión se producen escisiones no especı́ficas. Es importante que los
dentro de la cadena, ası́ como la heterogeneidad de los terminales N péptidos generados por la digestión sean lo suficientemente grandes
(por ejemplo, metionina N-terminal) en el polipéptido, también se para proporcionar información estructural sobre la proteı́na y a la vez
secuencian simultáneamente. Esto da lugar a picos más pequeños en lo suficientemente pequeños para permitir su análisis y separación
el cromatograma y permite la cuantificación relativa y de los mediante una técnica del tipo RP-HPLC. Por este motivo y como la
terminales N y la identificación del lugar de escisión en el escisión con esta enzima es casi cuantitativa, la tripsina es la enzima
polipéptido. Este procedimiento para la secuenciación de proteı́nas de aplicación general para la mayorı́a de las proteı́nas. En el caso de
también puede realizarse manualmente. Las limitaciones del método proteı́nas grandes de más de 60 000 daltons (aproximadamente 520
de secuenciación con PITC son que es solamente semicuantitativo aminoácidos), la escisión con tripsina podrı́a producir demasiados
(es decir, la cantidad de terminales N sólo puede estimarse) y que los fragmentos y, por lo tanto, puede elegirse otra endoproteasa.
derivados PTH de la serina y la treonina se pueden degradar mucho, Normalmente, se emplea la tripsina tratada con L-TPCK (tosil-L-
lo cual dificulta su determinación. Para determinar los residuos de fenilalanina clorometil cetona), ya que el TPCK inhibe la acción de
cisteı́na es necesario modificarlos, por ejemplo mediante alquilación. la quimotripsina, un contaminante presente en muchas preparaciones
Además, los aminoácidos glicina y prolina se reordenan lentamente, de tripsina. Aunque la reacción con bromuro de cianógeno escinde
lo que presenta un pequeño problema para su determinación. en los residuos de metionilo, las proteı́nas no contienen muchos de
Secuenciación Carboxi-Terminal—La secuenciación de pro- estos residuos. Por lo tanto, se obtienen relativamente pocos péptidos
teı́nas a partir del extremo carboxi-terminal también proporciona y es posible que sean demasiado grandes o excesivamente
valiosa información sobre la estructura primaria ası́ como posibles hidrófobos para la separación por HPLC.
escisiones de C-terminales. La degradación secuencial de una Una vez terminada la digestión, los péptidos suelen separarse por
proteı́na desde el extremo C-terminal puede realizarse mediante RP-HPLC y HPIEC. La selección de la columna apropiada es
métodos quı́micos o enzimáticos. Se puede usar la reacción de empı́rica y depende del tipo de proteı́nas. Para el RP-HPLC,
hidrazina, tiocianato de amonio o bromuro de cianógeno con una funcionan bien los soportes que tienen un tamaño de poro de 100 Å y
proteı́na para degradar secuencialmente la proteı́na en el extremo C- 300 Å y la selección del soporte de sı́lice puede ser un criterio
terminal o en sus proximidades. Se ha extendido el uso de la importante para una separación óptima. Para los péptidos más
reacción de tiocianato de amonio para proteı́nas acopladas a soportes pequeños generados por estas digestiones, se ha comprobado que las
sólidos. Los aminoácidos C-terminales pueden escindirse secuen- fases estacionarias C8 y C18 son en general más eficientes que los
cialmente en forma enzimática usando exopeptidasas tales como las soportes C4. Los disolventes más comunes empleados para
carboxipeptidasas. Las limitaciones de las carboxipeptidasas son la separaciones en fase reversa son agua y acetonitrilo con una
posible contaminación con endopeptidasas, su inherente dificultad y cantidad constante (0,1%) de ácido trifluoroacético. Las fases
la naturaleza impredecible de la secuenciación. La espectrometrı́a de móviles amortiguadas que contienen fosfato también ofrecen una
masas puede emplearse ya sea directamente en digeridos de excelente selectividad según su pH. Al examinar el efecto del pH
entre 3,0 y 5,0 se produce un desplazamiento en los péptidos que
470 h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a / Información General USP 30
contienen los residuos ácido glutámico y ácido aspártico. Hay menos nes multiantigénicas, no se puede garantizar la exactitud absoluta de
información disponible para las separaciones de intercambio iónico, los métodos multiantı́geno ni la capacidad de detectar todos los
pero son útiles los soportes de sı́lice, ası́ como los poliméricos con antı́genos posibles.
soporte estacionario de intercambio iónico débil y fuerte. Como
muchos péptidos son ligeramente hidrófobos, puede requerirse la
adición de pequeñas cantidades de disolventes orgánicos en la fase ELECTROFORESIS
móvil, por ejemplo 5% a 10% de metanol o acetonitrilo. Una posible
desventaja del análisis HPIEC para mezclas de péptidos es que, a Los métodos electroforéticos se encuentran entre las valoraciones
veces existe la posibilidad de no retener en la columna los péptidos más comunes y potentes empleadas para la evaluación de la pureza y
neutros o los que tienen la misma carga que el soporte y, por lo tanto, homogeneidad proteica. Son valiosas no sólo para la evaluación
este método quizás no permita separarlos o identificarlos. inicial y la separación de productos obtenidos mediante biotecno-
logı́a sino también como métodos indicadores de estabilidad para
detectar cambios moleculares o quı́micos en la molécula, debidos a
VALORACIONES INMUNOLÓGICAS la desnaturalización, aglomeración, oxidación, desamidación, etc. Se
facilita el uso de estos métodos dada su sencillez y el hecho de que
Las valoraciones inmunológicas se emplean para identificar y sólo requieren microgramos de muestra. Los dos tipos de
cuantificar la proteı́na de interés en ingredientes farmacéuticos valoraciones electroforéticas más frecuentemene usadas para pro-
activos o para detectar y cuantificar las impurezas proteicas ductos obtenidos por biotecnologı́a son la electroforesis en gel de
conocidas provenientes de la célula anfitriona. Dado que estas poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y el isoelec-
impurezas proteicas pueden representar un gran número de trazas de troenfoque (IEF).
impurezas posibles en lugar de una sola impureza, las valoraciones El método SDS-PAGE separa proteı́nas principalmente según su
inmunológicas deben ser sensibles y selectivas para detectar la peso molecular ya que, en presencia del detergente aniónico Dodecil
mayor cantidad posible de estas impurezas. Se han desarrollado Sulfato de Sodio, se forma un complejo proteı́na-Dodecil Sulfato de
valoraciones inmunológicas capaces de medir estas impurezas en Sodio con carga neta negativa. En primer lugar, se desnaturaliza la
concentraciones muy bajas en las proteı́nas de E. coli (ECP) y CHO. muestra en el detergente, que rompe las uniones no covalentes intra e
Además, las valoraciones inmunológicas pueden servir como intermoleculares que le dan estructura a las proteı́nas y a
valoraciones de la potencia para anticuerpos monoclonales con el continuación se somete a electroforesis en un soporte de gel de
empleo de un antı́geno apropiado. poliacrilamida. La migración de las proteı́nas a través del gel es
Las valoraciones inmunológicas incluyen un gran grupo de proporcional a su tamaño; las proteı́nas más pequeñas migran más
valoraciones basadas en interacciones especı́ficas anticuerpo: rápido que las grandes a través del gel. Con frecuencia, las muestras
antı́geno de alta afinidad del complejo, tales como los radioinmu- se separan electroforéticamente bajo condiciones reducidas y no
noanálisis (análisis RIA) y las pruebas de inmunoabsorción reducidas para determinar la existencia de impurezas con el mismo
enzimática (prueba ELISA). Los análisis RIA se realizan en fase peso molecular o escisiones proteolı́ticas intramoleculares de la
lı́quida o sólida con un anticuerpo no marcado dirigido contra la proteı́na de interés. Aunque la SDS-PAGE no reductora se emplea
proteı́na radiomarcada de interés. Este análisis consiste en comparar normalmente para estimar el estado de aglomeración o de
la inhibición de la unión de un antı́geno marcado a un anticuerpo no oligomerización de la proteı́na de interés, este método sólo permite
marcado con la inhibición mediante estándares conocidos, lo cual observar aglomerados u oligómeros estables en presencia del
permite la cuantificación de la proteı́na de interés. Dodecil Sulfato de Sodio y en las condiciones usadas para la
Las valoraciones inmunorradiométricas (IRMA) o los análisis preparación y electroforesis de la muestra. Las proteı́nas que constan
RIA de fase doble utilizan dos preparaciones de anticuerpos entre las de cadenas múltiples unidas por uniones disulfuro se descomponen y
que se coloca la proteı́na de interés. El primer anticuerpo no se dividen en cadenas polipeptı́dicas individuales. La detección de la
está marcado y está dirigido contra la proteı́na; el segundo anticuerpo muestra después de la electroforesis puede ser cuantitativa mediante
está radiomarcado y puede estar dirigido contra la proteı́na o el un análisis densitométrico de tinción con Azul Brillante Coomassie o
primer anticuerpo. El complejo anticuerpo:antı́geno se aı́sla en su cualitativa, pero con mayor sensibilidad cuando la muestra
totalidad y se determina la radioactividad y, en consecuencia, la está presente en cantidades de nanogramos si se realiza la tinción
proteı́na de interés. El desarrollo de un análisis RIA o una valoración con plata. El SDS-PAGE con tinción con plata también puede
IRMA para un producto obtenido por biotecnologı́a requiere una llevarse a cabo cuantitativamente bajo condiciones apropiadas. Con
cuidadosa atención a la producción de los antisueros, a la una validación adecuada, se puede usar la tinción con Azul
preparación del trazador marcado, a la preparación de un estándar Coomassie Brillante y la densitometrı́a para obtener una determina-
de referencia apropiado y a los métodos para la separación del ción cuantitativa de nanogramos de polipéptidos. El SDS-PAGE
antı́geno libre a partir del antı́geno unido. junto con la tinción con Azul de Coomassie Brillante se emplean
El formato de prueba ELISA para el análisis de trazas de para determinar cuantitativamente la pureza de la muestra con
impurezas más utilizado es la prueba ELISA de fase doble, que respecto a dı́meros y aglomerados y fragmentos peptı́dicos
emplea dos preparaciones de anticuerpos en forma similar a las covalentes más grandes. Cuando el método se combina con la
valoraciones IRMA, pero sin marca radioactiva. El primer técnica de tinción con plata, se puede hacer una evaluación de
anticuerpo no está marcado y al segundo anticuerpo se le ha niveles bajos o de trazas de una nueva impureza al comparar
agregado una enzima, como por ejemplo peroxidasa de rábano directamente la muestra sometida a electroforesis con el material o el
(HRP) o fosfatasa alcalina. A grandes rasgos, la prueba ELISA estándar de referencia sometido a electroforesis en condiciones
consiste en aplicar una capa de anticuerpos purificados a las reducidas y no reducidas. En general, la tinción con plata se emplea
proteı́nas de las células anfitrionas sobre placas de microtitulación, cualitativamente porque podrı́a haber una variación importante en la
seguida del producto proteico. Se agrega el conjugado anti- unión con plata entre una proteı́na y otra y debido a una tinción de
cuerpo:enzima y se deja que se una a las proteı́nas de las células fondo heterogénea en ensayos de rutina. Se puede estimar la cantidad
anfitrionas unidas al anticuerpo. Se agrega un substrato apropiado de una impureza mediante la electroforesis de una cantidad conocida
para que se desarrolle un color, que se analiza con un lector de placas de un estándar interno, como por ejemplo la albúmina sérica bovina,
por espectrofotometrı́a. Un ELISA multiantı́geno de tales caracte- o mediante diluciones menores de la proteı́na de interés en otros
rı́sticas requiere una preparación de estándares de referencia carriles del mismo gel. La separación SDS-PAGE de una proteı́na
apropiados representativos de las impurezas proteicas de las células puede combinarse con un método inmunológico, como por ejemplo
anfitrionas, para ası́ servir como el inmunógeno en la preparación de la inmunotransferencia (immunoblotting). La transferencia Western
los anticuerpos que se emplean en la valoración. Estos estándares de (Western blot) resultante se emplea para identificar las bandas
referencia generalmente se preparan mediante un proceso de electroforéticas (es decir, la impureza relacionada con el producto o
fabricación que proporciona todas las proteı́nas esperadas de las con las proteı́nas de las células anfitrionas). Después de la
células anfitrionas excepto la proteı́na producto. Es necesaria la electroforesis, se transfieren las proteı́nas separadas a una membrana
ausencia total de la proteı́na producto en esta preparación para evitar de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y se hacen
la producción de anticuerpos contra el propio producto cuando el reaccionar con el anticuerpo de interés. La visualización del
estándar de referencia se emplea como inmunógeno. Debido a la complejo se realiza con un anticuerpo marcado enzimáticamente o
diversa afinidad de los anticuerpos policlonales con las preparacio- radiomarcado.
USP 30 Información General / h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a 471
El método IEF separa proteı́nas según su carga en un campo se emplean otros amortiguadores del pH, como por ejemplo fosfato o
eléctrico. Las cargas en una proteı́na provienen de distintos sitios en Tris [tris(hidroximetil)aminometano], donde el pH puede ajustarse
la cadena de aminoácidos, tales como grupos amino protonados, para aumentar la selectividad y lograr separaciones óptimas.
grupos carboxilo no protonados, grupos sulfhidrilo no protonados, El HPIEC es un método importante para la determinación de la
residuos de tirosina no protonados, residuos de cisteı́na oxidados y pureza. Estas separaciones se basan en cambios en la carga de la
residuos desamidados. Sin embargo, existe un pH para cada proteı́na molécula y son útiles para identificar y cuantificar impurezas
que es el punto isoeléctrico o, en el cual estas cargas se anulan comunes en proteı́nas de uso farmacéutico, tales como formas
mutuamente, siendo la carga neta efectivamente cero. El IEF se oxidadas (principalmente metionina oxidada) y desamidadas (gluta-
realiza con proteı́nas nativas en un soporte de poliacrilamida de mina y la asparagina) y formas fragmentadas o truncadas. Pueden
poros grandes o de gel de agarosa con anfolitos (iones anfóteros de emplearse fases estacionarias de intercambio iónico fuertes o débiles
bajo peso molecular) que establecen un gradiente de pH debido a su en soportes de sı́lice o poliméricos. La cromatografı́a de intercambio
migración dentro de la matriz del soporte cuando se aplica un campo catiónico puede realizarse en resinas de tipo sulfopropilo y se usa
eléctrico. Simultáneamente, en presencia del campo eléctrico, las para productos de oxidación y desamidación. Por lo general, las
proteı́nas con carga positiva migran hacia el cátodo y las proteı́nas proteı́nas se cargan sobre una columna equilibrada con agua o una
con carga negativa migran hacia el ánodo. La migración finaliza solución amortiguadora débil y se eluyen con una gradiente salina,
cuando cada proteı́na alcanza el valor de pH en el gradiente del tal como cloruro de sodio de 0 a 1 M.
soporte, donde su carga neta es cero. Este es el punto pI o El HPSEC es una técnica que puede proporcionar información
isoeléctrico aparente de la proteı́na. Como la migración de una sobre la cantidad de aglomeración y fragmentación de las proteı́nas
proteı́na depende de su composición de aminoácidos, las formas de uso farmacéutico. Según la información que se necesite la fase
alteradas de la proteı́na y otras proteı́nas migrarán a diferentes puntos móvil puede mantener la proteı́na nativa y contener un amortiguador
en el soporte. Los geles IEF pueden teñirse para visualizar las de pH acuoso tal como fosfato 100 mM, pH 7, o bien puede
proteı́nas con colorante Azul Brillante Coomassie o plata. El IEF se desnaturalizar la proteı́na con concentraciones bajas de un agente
emplea para identificación o para asegurar la homogeneidad de una caotrópico o detergente tal como Dodecil Sulfato de Sodio al 0,1%.
proteı́na (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales) como se Los análisis se realizan isocráticamente, con una lectura caracterı́s-
demuestra mediante el patrón de bandas en el intervalo de pI tica entre 210 y 220 nm según el amortiguador de pH usado.
correcto. También se puede emplear el método para evaluar la También puede emplearse la detección a 280 nm pero es menos
estabilidad de un producto biológico. La desamidación proteica (es sensible. La cromatografı́a de exclusión por tamaño clásica se lleva a
decir, la desamidación de la glutamina o de la asparagina), con el cabo en soportes poliméricos blandos tales como dextranos,
tiempo, produce nuevos ácidos carboxı́licos que generan moléculas poliacrilamida o agarosa entrecruzados. Estos, sin embargo, son
con un pI más ácido. El IEF puede proporcionar información sobre más adecuados para aplicaciones a baja presión. Como resultado, se
el estado de glicosilación de glicoproteı́nas tales como anticuerpos han desarrollado varios soportes de mayor resistencia mecánica.
monoclonales, que pueden aparecer como muchas bandas debido a Actualmente, es común el uso de soportes basados en sı́lice y
cambios aparentes en la carga de la molécula proteica debidos a los agarosa, entrecruzados disponibles en el mercado. También se utiliza
grupos de ácido siálico. La interpretación de los resultados del gel de el HPSEC para la determinación de fragmentos de proteı́nas. Las
IEF suele ser más difı́cil que los de SDS-PAGE y pueden exigir cadenas fragmentadas suelen permanecer unidas a través de uniones
muchas suposiciones o juicios subjetivos. disulfuro de residuos de cisteı́na. El tratamiento de la muestra con un
Se está investigando exhaustivamente la electroforesis capilar de agente reductor tal como ditiotreitol o mercaptoetanol rompe la
alta resolución (HPCE), debido a recientes avances en la tecnologı́a, unión disulfuro y separa las cadenas. Por consiguiente, las cadenas
ya que ofrece las ventajas potenciales de una alta resolución de las fragmentadas pueden separarse de formas no fragmentadas mediante
proteı́nas. el HPSEC.
El HIC separa proteı́nas en base a diferencias en su hidrofobicidad
bajo condiciones de adsorción y elución moderadas que impiden en
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS general la desnaturalización y posterior pérdida de actividad
biológica. Una fase estacionaria moderadamente hidrófoba se
Durante mucho tiempo, se han empleado métodos cromatográfi- emplea con una fase móvil acuosa de amortiguador de pH y una
cos para determinar la pureza de moléculas orgánicas y proteı́nas concentración inicial de sal alta para adsorber la proteı́na, la cual
pequeñas, tales como la insulina (ver Cromatografı́a h621i) y para luego se eluye selectivamente empleando una gradiente salina
determinar la concentración de ingredientes activos y/o excipientes decreciente. Se producen interacciones entre los residuos amino-
de productos farmacéuticos. Los métodos cromatográficos también acı́dicos no polares expuestos en la superficie de la proteı́na y los
son muy eficaces para la determinación de la pureza de productos grupos hidrófobos presentes en la matriz cromatográfica. Para su uso
farmacéuticos obtenidos por la técnica de recombinación. Sin en el HIC se han desarrollado varios soportes poliméricos y de sı́lice
embargo, la cromatografı́a de proteı́nas es mucho más difı́cil combinados con ligandos ligeramente hidrófobos tales como
debido a las múltiples modalidades de interacción con el soporte poliéteres, éteres de fenilo o cadenas alquı́licas cortas. Esta técnica
cromatográfico producidas por el tamaño y la forma, la carga y la puede emplearse en el análisis, purificación y caracterización de
hidrofobicidad de las proteı́nas. Los métodos cromatográficos proteı́nas hidrófobas más lábiles. Se puede modificar la selectividad
comúnmente empleados para aislar y caracterizar proteı́nas recom- y la retención de la proteı́na mediante el control de variables tales
binantes son el RP-HPLC, HPIEC, cromatografı́a de exclusión por como el tipo y la concentración de sal, el pH y efectos selectivos de
tamaño (HPSEC) y cromatografı́a de interacción hidrofóbica (HIC). iones, temperatura y diseño degradiente, ası́ como mediante una
Estos métodos incluyen la separación de proteı́nas y se emplean para cuidadosa selección de la fase estacionaria.
determinar la pureza de los ingredientes farmacéuticos activos,
ası́ como los niveles de impurezas o productos de degradación
conocidos. Una complicación en todos los métodos cromatográficos VALORACIONES CUANTITATIVAS
por columna es la determinación del equilibrio de masas entre la
carga de la columna y el eluato. Sin embargo, las técnicas de HPLC Las valoraciones biomiméticas (valoraciones que imitan el efecto
son valiosas cuando es necesario determinar la pureza y la potencia biológico del producto) son de suma importancia en la consideración
de los productos farmacéuticos proteicos. de las valoraciones para productos obtenidos mediante biotecnolo-
Los análisis RP-HPLC más comunes se llevan a cabo en columnas gı́a. Estas valoraciones miden la actividad del producto y aseguran su
que contienen una fase estacionaria C4 o C8 sobre un soporte de eficacia. A grandes rasgos, existen tres tipos principales de
sı́lice o un soporte polimérico. También se utilizan fases estaciona- valoraciones cuantitativas: las valoraciones en modelos animales,
rias C18, pero más frecuentemente con péptidos más pequeños en valoraciones basadas en cultivos de células y los ensayos in vitro
aplicaciones como el mapeo de péptidos. Se prefieren soportes con (fisicoquı́micos). Cada una de estas valoraciones tiene una aplicación
poros de un tamaño de al menos 300 Å para proteı́nas con un peso
molecular mayor de 10 000. En la mayorı́a de los análisis RP-
HPLC, las proteı́nas se eluyen con gradientes de acetonitrilo acuoso
y se mantiene constante el ácido trifluoroacético en 0,1%. También
472 h1045i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a / Información General USP 30
glicoproteı́nas incluyen los azúcares neutros (D-galactosa, D-manosa cencia; la inoculación de animales no infectados y el seguimiento de
y L-fucosa), los aminoazúcares (N-acetilglucosamina y N-acetilga- la patologı́a y muerte; la inoculación de animales y, después de
lactosamina) y el azúcar acı́dico conocido como ácido siálico. cuatro semanas, la recolección y evaluación del suero para detectar
Se pueden aplicar dos enfoques principales para determinar los anticuerpos contra virus especı́ficos de importancia; y valoraciones
azúcares covalentemente unidos a la glicoproteı́na. Ambos aceptan inmunológicas especı́ficas o sondas genéticas para detectar algunos
que la microheterogeneidad es un fenómeno común entre las virus importantes que no se pueden detectar mediante los otros
glicoproteı́nas y que la información obtenida representa la composi- métodos indicados.
ción promedio o la estructura representativa. La expresión de genes de retrovirus endógenos es muy variable en
El primer enfoque es la determinación de la composición de diferentes células y lı́neas celulares de mamı́feros. La naturaleza
azúcares en una glicoproteı́na, que puede realizarse mediante varios impredecible de su manifestación y la diversidad de sus propiedades
métodos. Se pueden determinar los azúcares neutros y el ácido bioquı́micas y biológicas hacen imposible el uso de una sola prueba
siálico por pruebas colorimétricas sencillas. El total de azúcares y exigen una estrategia de pruebas combinadas. Los métodos de
neutros puede determinarse mediante la reacción con fenol y ácido prueba generalmente empleados incluyen la microscopı́a electrónica
sulfúrico y midiendo la absorbancia de la solución a 490 nm, de transmisión de las células del banco de siembra maestro y de
comparada con una curva estándar. Luego de una hidrólisis sedimentos obtenidos por ultracentrifugación de medios de cultivos
ligeramente ácida y la oxidación con peryodato, se puede determinar post-cosecha y exentos de células, diversas valoraciones de retro-
el contenido de ácido siálico libre, utilizando ácido tiobarbitúrico y virus infecciosos que emplean lı́neas de células indicadoras
la absorbancia de la solución aproximadamente a 550 nm comparada susceptibles a retrovirus; la actividad de transcriptasa reversa; y la
con una curva estándar. Los azúcares neutros individuales pueden inducción de retrovirus en las células del banco de células maestras
determinarse después de la hidrólisis ácida, por varios métodos. Si usando sustancias quı́micas que inducen los retrovirus. Además de
no están derivatizados, se pueden separar mediante HPIEC a un pH los métodos virológicos clásicos, también se están comenzando a
alto y se pueden cuantificar por detección amperométrica de pulsos. emplear otras técnicas más novedosas tales como la hibridación de
También se pueden convertir en peracetatos de alditol usando sondas moleculares.
anhı́drido acético o en acetatos de aldononitrilo utilizando
clorhidrato de hidroxilamina y piridina antes de la peracetilación,
y los compuestos derivatizados se pueden separar por cromatografı́a
de gases.
El segundo enfoque para determinar la composición de carbohi-
dratos consiste en liberar y separar las estructuras de oligosacáridos
individuales unidas covalentemente a la glicoproteı́na. Esto requiere h1046i PRODUCTOS DE TERAPIA
el conocimiento de los tipos de estructuras unidas. La unión de
azúcares a las proteı́nas puede ocurrir principalmente de dos GÉNICA Y CELULAR
maneras: mediante una unión O-glicosı́dica que incluye el grupo
hidroxilo de la serina, treonina o aminoácidos modificados tales
como la hidroxilisina o la hidroxiprolina, o mediante la unión N-
glicosı́dica de la asparagina. Los oligosacáridos unidos en O pueden INTRODUCCIÓN
liberarse de la proteı́na por eliminación beta en condiciones alcalinas
y la reducción de los azúcares terminales reductores con borohidruro Definiciones Generales
de sodio. Los oligosacáridos unidos en N pueden liberarse
quı́micamente por la hidrazinólisis o enzimáticamente usando una Los recientes avances en biotecnologı́a han contribuido al
variedad de glicosidasas especı́ficas tales como endo H, endo F, o desarrollo de dos nuevas categorı́as de productos—productos de
péptido-N-glicanasa. Los oligosacáridos se pueden separar por terapia celular y productos de terapia génica. Los ingredientes
HPIEC a un pH alto y se pueden cuantificar mediante una detección activos de los productos de terapia celular incluyen células vivas de
amperométrica por pulsos. Esto produce un mapa de oligosacáridos mamı́feros, mientras que los productos de terapia génica contienen
o carbohidratos análogo al mapa de péptidos para la proteı́na. fragmentos de ácidos nucleicos, por lo general de ácido desoxirri-
bonucleico (ADN). Algunos productos combinan ambas categorı́as y
ofrecen, como resultado, una terapia que utiliza células que expresan
DETECCIÓN DE AGENTES ADVENTICIOS Y ENDÓGENOS un nuevo producto génico. Tanto los productos de terapia génica
como celular se pueden combinar con biomateriales sintéticos o
Las valoraciones especı́ficas de la biotecnologı́a se centran en la naturales para formar construcciones tisulares.
detección de bacterias, hongos, micoplasmas y virus. Éstos son A efectos del presente capı́tulo, los productos de terapia celular y
ejemplos de los posibles contaminantes que pueden aparecer en la génica incluyen todo producto que tenga células vivas o fragmentos
fermentación bacteriana y en el cultivo de células de mamı́feros. Se de ácido nucleico, cualquiera que sea su formulación. Se excluyen:
ejerce control de varias maneras, incluyendo la caracterización del (1) productos elaborados con tejidos donde las células han sido
banco de siembra maestro y los bancos de células de trabajo para extraı́das o destruidas, (2) métodos de reproducción asistida, como
asegurar la ausencia de estos contaminantes, la evaluación de por ejemplo, la fertilización in vitro, (3) productos fabricados a partir
materias primas, el diseño y funcionamiento de sistemas de de células que no provengan de mamı́feros, (4) vacunas tradicionales
fabricación cerrados, el análisis de lotes de producción y la como virus vivos atenuados y (5) productos no celulares ni génicos
validación de procesos de fabricación especı́ficos para asegurar la fabricados con células o tecnologı́a de ADN recombinante (ADNr),
inactivación o la eliminación de posibles contaminantes. que se analizan en Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a h1045i.1
La ausencia de bacterias y hongos en las formas farmacéuticas
estériles finales se evalúa por lo general mediante pruebas de
esterilidad según se describe en Pruebas de Esterilidad h71i. Las Productos de Terapia Celular
valoraciones de micoplasmas se realizan mediante métodos de
cultivo estándar, empleando la incubación aeróbica y anaeróbica en Los productos de terapia celular son aquellos que contienen
medios sólidos en placas y caldos semisólidos en tubos de ensayo y células vivas que reemplazan, aumentan o modifican la función de
deben cumplir con el Código de Reglamentaciones Federales (21 las células enfermas, disfuncionales o ausentes de un paciente. Un
CFR 610.12). Además, los micoplasmas no cultivables se detectan ejemplo de este tipo de productos es el transplante de médula ósea
microscópicamente por el método de tinción con bisbenzimida de para reemplazar una médula destruida por quimioterapia y radiación.
Hoechst. A éstos también se los llama productos de terapia celular somática
Entre los diversos métodos empleados para detectar la contami- porque se utilizan células que no pertenecen a la lı́nea germinal.
nación por virus adventicios en lı́neas celulares se encuentran la Además, las células se pueden combinar con biomateriales. Por
inoculación de lı́neas celulares indicadoras seleccionadas porque ejemplo, se pueden hacer crecer células dérmicas o epidérmicas
permiten la reproducción de una amplia gama de virus y su control 1
para detectar indicadores de infección viral tales como la El término ingenierı́a de tejidos no se utiliza en este capı́tulo. Las
definiciones e información sobre ingenierı́a de tejidos están siendo elaboradas
citopatologı́a, hemoadsorción, hemoaglutinación e inmunofluores- por la ASTM.
474 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
sobre un sustrato de colágeno para producir una capa celular para el inducir su diferenciación, tanto durante el proceso de fabricación
tratamiento de heridas o quemaduras. En la Tabla 1 se incluyen como después de su administración. Se prefieren las lı́neas celulares
algunos ejemplos de productos de terapia celular. a las células recientemente aisladas, ya que se pueden analizar
exhaustivamente para detectar virus, tumorigenicidad y otras
Tabla 1. Ejemplos de Productos de Terapia Celular caracterı́sticas. Asimismo, garantizan un producto constante y
reproducible al reducir al mı́nimo la variabilidad entre donantes.
Indicación Producto Los productos de terapia celular se pueden modificar mediante el
tratamiento con ADN u otro ácido nucleico, de modo que cambie el
Transplante Dispositivos y reactivos para propagar células patrón de expresión génica. A este nuevo producto, una combinación
de médula madre y progenitoras, para de terapia génica y celular, se lo denomina producto de terapia
ósea seleccionar células madre y génica ex vivo. Por lo general, se extraen células de un paciente, se
progenitoras, o para eliminar células modifican fuera de su cuerpo y luego se retornan al paciente.
enfermas (cancerosas) Los productos de terapia celular afrontan desafı́os de fabricación
Cáncer Linfocitos T, células dendrı́ticas o macrófagos singulares, que se analizan en otras secciones de este capı́tulo. En
expuestos a péptidos especı́ficos del primer lugar, las células no se pueden esterilizar o filtrar
cáncer para provocar una respuesta terminalmente, por lo que la extracción o inactivación de micro-
inmunitaria organismos o virus sin destruir las células es un problema. En
Células cancerosas autólogas o alogénicas segundo lugar, toda materia prima empleada en la fabricación podrı́a
inyectadas con una citokina e irradiadas quedar asociada a las células. La calificación y origen de todas las
para producir una respuesta inmunitaria materias primas son fundamentales para generar un producto seguro
Dolor Células secretoras de endorfinas o catecola- y eficaz. En tercer lugar, el almacenamiento de los productos de
minas (encapsuladas en fibra hueca) terapia celular puede representar un desafı́o. Si bien la forma
Diabetes Células b de los islotes pancreáticos principal de almacenamiento a largo plazo es la congelación, algunos
encapsuladas secretoras de insulina en res- productos no se pueden congelar sin que cambien sus caracterı́sticas
puesta a concentraciones de glucosa esenciales, en particular, las correspondientes a sus funciones
Curación de Lámina de queratinocitos autólogos o diferenciadas. Es posible que este tipo de productos tenga que
heridas fibroblastos dérmicos alogénicos en una administrarse a los pacientes en un lapso de horas o dı́as, como
matriz biocompatible máximo, desde la finalización del proceso de fabricación. En cuarto
Lámina de queratinocitos alogénicos dis- lugar, es habitual que la necesidad de administrar el producto al
puesta sobre una capa de paciente sea urgente por razones clı́nicas. En quinto lugar, las
fibroblastos dérmicos partidas de algunos productos tienen un tamaño equivalente a una
Reparación Tisular sola dosis, con frecuencia, de pequeño volumen. Para estos tres
Defectos focales Condrocitos autólogos últimos desafı́os, no siempre se pueden aplicar métodos analı́ticos
en el cartı́lago tradicionales, especialmente los de esterilidad, micoplasma y
de la rodilla potencia, ya sea porque no son métodos rápidos o porque no son
Estructuras Condrocitos autólogos o alogénicos en una aptos para volúmenes pequeños. Aún cuando se utilizan estos
derivadas matriz biocompatible métodos tradicionales, los resultados no están disponibles a tiempo
de cartı́lago para los productos que requieren liberación rápida. A menudo, estos
Reparación ósea Células madre mesenquimales en una matriz productos se liberan de acuerdo con los resultados de métodos
biocompatible nuevos, muy rápidos o de pequeño volumen. En la actualidad, no
Enfermedades Células neuronales alogénicas o xenogénicas existen normas farmacopeicas para tales métodos, aunque, según se
neurodegene- indica en las Advertencias Generales y en 21 CFR 610.9, se aceptan
rativas métodos alternativos a las pruebas oficiales, siempre que demuestren
Asistencia hepática Hepatocitos alogénicos o xenogénicos en un que son equivalentes. A medida que esas nuevas metodologı́as sean
(temporaria sistema de fibra hueca extracorpóreo correctamente validadas, se irán incluyendo en los compendios.
hasta
transplante
hepático
o recupera- Productos de Terapia Génica
ción) Los productos de terapia génica son aquellos que utilizan ácidos
Enfermedad Linfocitos T activados nucleicos para modificar el material genético de las células. Un
infecciosa ejemplo de un producto de terapia génica es un vector retroviral
utilizado para introducir el gen del factor IX en las células de
Existen tres fuentes de células donantes para los productos de pacientes con hemofilia B. Los productos de terapia génica se
terapia celular: (1) las células propias del paciente (productos pueden clasificar, en términos generales, según el sistema de
celulares autólogos), (2) las células de otro ser humano (productos introducción del gen terpéutico. Estos sistemas de introducción de
celulares alogénicos) y (3) las células derivadas de animales como los productos de terapia génica incluyen vectores virales (virus con
cerdos, primates o vacas (productos celulares xenogénicos). Si bien los genes de interés pero, generalmente, sin el mecanismo de
las células autólogas no son rechazadas por el paciente, no están autorreplicación in vivo), ácidos nucleicos en una formulación
disponibles para muchos tratamientos por estar ausentes, no ser simple (ADN desnudo) o ácidos nucleicos formulados con agentes
funcionales o estar enfermas. En estas situaciones, se pueden tales como los liposomas, que mejoran su capacidad para penetrar en
emplear células alogénicas y xenogénicas. La ventaja de las células la célula. Algunas formas de terapia génica bloquean la expresión de
alogénicas es que no producen una reacción de rechazo tan fuerte un gen mediante la administración de oligonucleótidos antisentido,
como la que causan las células xenogénicas. Las células xenogénicas que son complementarios a un ácido ribonucleico (ARN) natural y
se utilizan cuando no se dispone de células humanas con las bloquean su expresión. La mayor parte del trabajo clı́nico inicial se
caracterı́sticas deseadas o la oferta de donantes humanos es ha realizado con vectores virales. La elección de un vector génico es
demasiado limitada. A veces, los productos de terapia celular se compleja (ver Consideraciones de Diseño de Vectores Génicos en
encapsulan en un dispositivo que impide que las células y los Fabricación de Productos de Terapia Génica). Los virus más
anticuerpos del paciente destruyan las células xenogénicas. Sin comunes utilizados hasta el momento incluyen retrovirus murinos,
embargo, el uso de células xenogénicas puede causar zoonosis en adenovirus humano y virus humanos asociados a adenovirus (VAA).
seres humanos. Existen muchos estudios de investigación centrados Los productos de oligonucleótidos antisentido se encuentran en
en la identificación y propagación de células madre, cualquiera sea desarrollo clı́nico y en el mercado. En la Tabla 2 se incluyen
su origen, dado que las células madre se pueden manipular para ejemplos de productos de terapia génica.
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Tabla 2. Ejemplos de Productos de Terapia Génica los reglamentos y guı́as correspondientes. Las metodologı́as
empleadas para realizar estas actividades, incluyendo los métodos
Categorı́as o Estrategias Indicación: Producto Administrado de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en
Reemplazo de genes inglés), son susceptibles de normalización farmacopeica.
Corto plazo Enfermedad cardiovascular: vector de
factor de crecimiento en un
soporte biocompatible1 Objetivos y Organización del Capı́tulo
Largo plazo Fibrosis quı́stica: vector para la
regulación de la conductancia Los usos clı́nicos de los productos de terapia génica y celular, sus
transmembrana procesos de fabricación y los esquemas analı́ticos para determinar la
Hemofilia: vector para el factor VIII ó IX identidad, dosis, potencia, pureza y seguridad están evolucionando a
Inmunoterapia Cáncer o artritis: células tumorales o gran velocidad y son tan diversos como los productos mismos. Este
linfocitos autólogos, respecti- capı́tulo informativo sintetiza las mejores prácticas vigentes y
vamente, transducidos con cuestiones inherentes a la fabricación, pruebas y administración de
genes para citokinas productos de terapia génica y celular. Por lo general, los capı́tulos
Genes condicional- Cáncer (tumor sólido): vector que inserta informativos se concentran en los materiales que ya están
mente letales 2 el gen de la timidina quinasa (TK) disponibles comercialmente. Sin embargo, este capı́tulo no sola-
o citokina desaminasa (CD) en mente analiza productos con aplicaciones comerciales, sino que
las células tumorales también está dirigido a la producción de materiales para ensayos
Enfermedad del injerto contra el clı́nicos y otros usos no reglamentados, tal como el transplante de
anfitrión (GVHD, por sus siglas en médula ósea. Cuando se pueden usar diferentes enfoques para el
inglés): vector con el gen de la TK o material utilizado en ensayos clı́nicos, en comparación con aquellos
CD transducido en linfocitos T utilizados en productos comerciales, ası́ se indica.
donantes La farmacopea tradicionalmente desarrolla normas públicas
Antisentido Cáncer: vector con antioncogen aplicables a un producto final particular, sin definir expresamente
Retinitis por citomegalovirus: vector los detalles de producción. En este capı́tulo se ha procurado
antiviral especificar cuándo es posible adaptar las metodologı́as o normas
Ribozima Virus de la inmunodeficiencia humana tradicionales. También se señalan las metodologı́as nuevas aplicables
(VIH): vector con ribozima a las terapias celular y génica. A medida que estas nuevas
antiviral insertado en linfocitos metodologı́as sean correctamente validadas, se irán incluyendo en
autólogos las publicaciones sucesivas.
Este capı́tulo es extenso por la naturaleza diversa de los productos
Anticuerpos Cáncer o VIH: anticuerpo monocate- y las consideraciones especiales que requieren. La fabricación se ha
intracelulares nario contra proteı́na tumoral o viral, dividido en tres secciones. La primera, Aspectos Generales de la
respectivamente Fabricación, aborda las generalidades de la fabricación y el
1 desarrollo de procesos. Las otras dos secciones sobre fabricación
Este producto favorece la formación de nuevos vasos sanguı́neos. son Fabricación de Productos de Terapia Celular y Fabricación de
2
Las células con genes condicionalmente letales, ası́ como sus células
vecinas, se destruyen después de la administración de un segundo fármaco in Productos de Terapia Génica. Esta última incluye una subsección
vivo. Para la timidina quinasa (TK, por sus siglas en inglés), el fármaco es sobre el diseño de vectores génicos. La Preparación y Administra-
ganciclovir. Para la citokina desaminasa (CD, por sus siglas en inglés), el ción In Situ aparece después de las secciones sobre fabricación, ya
fármaco es 5-fluorocitosina. que el manejo de estos productos en la clı́nica requiere una
infraestructura y experiencia profesional que no se encuentran
Aunque la fabricación de vectores o ácidos nucleicos puede ser comúnmente en un hospital convencional. Las cuestiones de
similar a la de productos o vacunas de ADN recombinante (ADNr), almacenamiento, transporte y etiquetado se tratan en Almacena-
surgen algunos desafı́os únicos. Las metodologı́as analı́ticas para miento y Transporte y en Etiquetado. Reglamentos, Normas y
vectores (ver Metodologı́as Analı́ticas) aún se encuentran en la etapa Nuevas Metodologı́as resume las pautas existentes y destaca la
de desarrollo. Los métodos para cuantificar partı́culas de vectores necesidad de desarrollar y validar nuevas metodologı́as para evaluar
virales y determinar el número de partı́culas activas (potentes) son la calidad de los productos. Las últimas secciones de este capı́tulo,
temas importantes en plena evolución. Las valoraciones tradicionales Definición de Términos y Abreviaturas, enumeran y definen los
de la dosis viral, como la de placa o la de dosis infectiva del cultivo términos y las abreviaturas utilizados en este capı́tulo y los
tisular, detectan una fracción de las partı́culas activas del vector. La comúnmente empleados en este campo.
precisión de tales valoraciones es de aproximadamente un factor de
tres (media unidad logarı́tmica). Además, la fabricación de grandes
partidas de vectores virales sin virus competentes para la replicación ASPECTOS GENERALES DE LA FABRICACIÓN
(VCR), o con cantidades mı́nimas de los mismos, no es un
procedimiento sencillo. Es difı́cil detectar una pequeña cantidad de Introducción
partı́culas de VCR en presencia de grandes cantidades de un vector
deficiente en replicación. Al igual que en los productos de terapia La fabricación de productos de terapia celular y génica se ha
celular, la fuente de materias primas es fundamental. Puede ser dividido en tres secciones. Esta sección, Aspectos Generales de la
imposible eliminar agentes adventicios u otros contaminantes de los Fabricación, analiza cinco temas que se aplican a la fabricación de
vectores virales. Incluso definir la pureza es un problema en vectores productos de terapia celular y génica: (1) materias primas, (2)
virales con envoltura, tales como los retrovirus o el virus del herpes, caracterización de materiales provenientes de bancos, (3) controles
ya que incorporan proteı́nas celulares en su envoltura al brotar de la de proceso, (4) especificaciones y (5) validación. La sección
célula. Por esta razón, es difı́cil determinar si las proteı́nas celulares Fabricación de Productos de Terapia Celular aborda la fabricación
no virales contaminantes han sido adecuadamente eliminadas. de estos productos, incluidos los productos celulares en los que se
En el caso de vectores de terapia génica administrados haya introducido material genético. Bajo el tı́tulo Fabricación de
directamente a pacientes, hay cuestiones de seguridad relativas al Productos de Terapia Génica se tratan las cuestiones relativas a la
destino de sus ácidos nucleicos. Por ejemplo, no es deseable la fabricación de vectores de terapia génica, tanto virales como no
alteración del ADN de la lı́nea germinal. La integración de productos virales, y se analiza, en detalle, el diseño de vectores génicos.
de terapia génica en el ADN de células somáticas conlleva un riesgo Todos los principios generales sobre buenas prácticas de
teórico de mutación insercional, que podrı́a modificar la expresión fabricación vigentes (BPFV) establecidos por la FDA en 21 CFR
génica y alterar la regulación de la célula. En las terapias génicas 210, 21 CFR 211, 21 CFR 600s (especialmente, 21 CFR 610), 21
virales, puede ser necesario controlar a los pacientes para verificar la CFR 820 y analizados en capı́tulos informativos de la USP, como el
presencia de VCR. Para evaluar los riesgos asociados a productos de Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a h1045i, se aplican a la
especı́ficos, es necesario realizar estudios preclı́nicos, de control de fabricación de productos de terapia génica y celular. Las instala-
calidad (CC) y desarrollar estrategias de control de pacientes según ciones, equipos y procesos de fabricación, al igual que las materias
476 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
primas, sistemas de calidad y personal capacitado son algunos de los desarrollarse completamente y cumplir con las BPFV. Fundamen-
elementos fundamentales de las BPFV. Las BPFV se aplican al talmente, cada una de las materias primas empleadas en la
proceso y a la planta de fabricación, a lo largo de todo el desarrollo fabricación de un producto de terapia celular o génica han de
clı́nico. El nivel de control aumenta a medida que avanza el elaborarse de acuerdo con las BPFV. En contadas ocasiones,
desarrollo clı́nico y, para el momento de iniciar la Fase III de los sustancias complejas o únicas que resultan esenciales para el control
ensayos clı́nicos clave, se espera un cumplimiento total de las BPFV. de procesos o la producción, pueden no estar disponibles a través de
La planta se debe diseñar, construir y validar tomando las proveedores que las producen de acuerdo con las BPFV. En este
precauciones necesarias para que se ajuste a las caracterı́sticas caso, el fabricante de productos de terapia celular o génica tiene que
singulares del proceso de fabricación. Los equipos deben ser desarrollar una estrategia cientı́ficamente sólida para calificar la
resistentes, deben suministrar un producto uniforme y permitir la materia prima.
calibración periódica. Los equipos crı́ticos, como las incubadoras o Un programa de calificación de materias primas utilizadas en la
los congeladores, deben contar con sistemas de alarma capaces de fabricación de productos de terapia génica y celular debe incluir los
emitir señales de falla en lugares remotos. Los programas de control siguientes puntos: (1) identificación y selección, (2) aptitud para uso
de calidad (CC) y de garantı́a de calidad (GC) deben ejercer control en fabricación, (3) caracterización, (4) suero fetal bovino y (5)
sobre las instalaciones y los procesos de fabricación, los procesos de garantı́a de calidad.
validación y las pruebas de las materias primas, los materiales en Identificación y Selección—En las primeras etapas de desarrollo
proceso, los productos a granel y el producto formulado final. Los del producto, hay que tomar decisiones importantes sobre el tipo de
programas de capacitación y certificación son fundamentales para materia prima a emplear en la fabricación. A medida que avanza la
mantener un personal técnicamente competente en el área de fabricación y los productos maduran, la calificación de ciertos
fabricación. Debe implementarse un programa de documentación materiales que se consideran necesarios en este punto puede tornarse
para respaldar las operaciones de fabricación, capacitación y calidad. imposible o excesivamente costosa. Aspectos como la aptitud, la
Los cambios en los procesos y procedimientos deben ajustarse a un toxicidad, la disponibilidad, la uniformidad, la contaminación y la
programa formal de control de cambios basado en principios bien rastreabilidad merecen particular atención. Es posible que aquellas
establecidos de BPFV y de normas ISO. materias primas que sean difı́ciles de calificar deban ser investigadas
e identificadas en las etapas iniciales del desarrollo del producto.
Debe rendirse cuenta de cada material usado en el proceso de
Materias Primas fabricación. Debe determinarse la fuente y el uso previsto de cada
material, ası́ como la cantidad y la concentración necesarias de cada
TIPOS DE MATERIAS PRIMAS uno. Deben identificarse las fuentes primarias de cada material y, si
fuera posible, las secundarias. En todos los casos, los proveedores
Se puede utilizar una amplia variedad de materias primas en la deben informar sobre la rastreabilidad de cada material, especial-
fabricación de los productos. Pueden incluir materiales relativamente mente para las materias primas derivadas de seres humanos y
simples o sustancias complejas como células, tejidos, lı́quidos animales. Por ejemplo, antes de usar albúmina sérica humana y suero
biológicos, matrices poliméricas, soportes mecánicos, hidrogeles, humano no A no B alogénico procesado, es necesario obtener
medios de cultivo, amortiguadores del pH, factores de crecimiento, información sobre la presencia de enfermedades infecciosas en el
citokinas, componentes de cultivo y procesamiento, anticuerpos donante; asimismo, un material como el suero fetal bovino (SFB)
monoclonales y dispositivos de separación de células. Estos requiere la calificación de la manada y la certificación del paı́s de
materiales pueden permanecer en el producto terapéutico final origen antes de usarse en el proceso de fabricación (ver Suero Fetal
como sustancias activas o excipientes. También se pueden usar en el Bovino).
proceso de fabricación como productos auxiliares. Los productos Aptitud—Es necesario evaluar la aptitud de cada materia prima
auxiliares son componentes o sustancias que tienen efecto en la utilizada en la fabricación para estimar el riesgo que puede
sustancia terapéutica (por ejemplo, una citokina puede activar una representar para la seguridad, potencia y pureza del producto
población de células). Sin embargo, el modo de acción del producto terapéutico final. Si se conoce la fuente y los procesos empleados en
auxiliar se limita a su interacción con la entidad terapéutica y no la fabricación de cada materia prima, se puede determinar el grado
está destinado a estar presente en el producto terapéutico final. Las relativo de riesgo de cada sustancia. La cantidad de material y su
‘‘células alimentadoras’’, que suministran nutrientes o factores de punto de introducción en el proceso de fabricación también afecta al
crecimiento al producto celular, son un ejemplo de producto auxiliar. perfil de riesgo de una materia prima. Se debe prestar especial
La calidad de las materias primas utilizadas en la elaboración de un atención a los materiales que pueden tener efectos tóxicos o que
producto de terapia génica o celular puede influir en la seguridad, la impliquen algún riesgo de seguridad biológica. Estos materiales
potencia y la pureza del producto. Por lo tanto, es necesario calificar deben ser sometidos a varias pruebas antes de su uso o deben ser
las materias primas para garantizar la uniformidad y la calidad de los controlados en el producto final. Para la obtención final de la licencia
productos de terapia celular y génica. de cada producto, también es necesario efectuar estudios de
validación que demuestren que los materiales siempre se eliminan
o inactivan eficazmente durante la fabricación. La biocompatibilidad
CALIFICACIÓN de los biomateriales naturales o sintéticos utilizados en los productos
de terapia celular se puede evaluar sometiendo el material a los
Es responsabilidad del fabricante del producto garantizar la protocolos de prueba descritos en el Blue Book Memorandum de la
correspondiente calificación de todas las materias primas utilizadas FDA (18 de mayo de 1995), que es una modificación del documento
en la fabricación. La calificación es el proceso de obtención y ISO 10993-1 : 1997 titulado ‘‘Biological Evaluation of Medical
evaluación de datos para establecer la fuente, la identidad, la pureza, Devices (Evaluación Biológica de Dispositivos Médicos)—Parte 1:
la seguridad biológica y la aptitud general de una materia prima Evaluación y Prueba’’. También se deben consultar los capı́tulos de
especı́fica para garantizar la calidad de todas las materias primas la USP Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro h87i y Pruebas
utilizadas en el proceso de fabricación. La diferente naturaleza de los de Reactividad Biológica, In Vivo h88i.
productos de terapia génica y celular y de los materiales utilizados Caracterización—Una vez evaluada la aptitud de cada materia
para fabricar estos productos dificulta la recomendación de pruebas o prima empleada en la fabricación, se desarrollan o implementan
protocolos especı́ficos para un programa de calificación. En pruebas de caracterización de CC especı́ficas para cada material. El
consecuencia, deben crearse programas razonables y cientı́ficamente panel de pruebas para cada materia prima evalúa diversos atributos
sólidos para cada materia prima. de calidad, como la identidad, la pureza, la funcionalidad, la
Las actividades de calificación de materias primas varı́an a medida ausencia de contaminantes adventicios o microbianos y la aptitud
que los productos avanzan en las diferentes etapas, desde los ensayos para el uso previsto. El nivel de prueba de cada componente es el
clı́nicos hasta la obtención de la licencia y la comercialización. Un resultado de su perfil de evaluación de riesgo y de los conocimientos
programa de calificación bien diseñado se torna más exhaustivo a adquiridos sobre cada componente durante el desarrollo. Deben
medida que avanza el desarrollo del producto. En las etapas iniciales desarrollarse especificaciones de prueba para cada materia prima a
de desarrollo del producto, las cuestiones de seguridad son un punto efectos de garantizar la uniformidad y el rendimiento del proceso de
clave del plan de calificación de materias primas. En las etapas fabricación. Los criterios de aceptación se establecen y justifican a
posteriores, las actividades de calificación de materias primas deben
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partir de datos obtenidos de lotes utilizados en estudios preclı́nicos y utilizados en la fabricación, incluyendo proteı́nas recombinantes u
estudios clı́nicos iniciales, lotes utilizados para demostrar la otros componentes de medios definidos, pueden ser potencialmente
uniformidad en la fabricación y de datos pertinentes relativos al antigénicos.
desarrollo, como los obtenidos de los procedimientos analı́ticos y los Garantı́a de Calidad—Los componentes de esta parte del
estudios de estabilidad. programa de calificación son multifacéticos y deben ser representa-
Muchas materias primas, como las células aisladas de la sangre, tivos de los que se suelen encontrar en un entorno de fabricación
los lı́quidos y extractos derivados del suero o los factores de tı́pico de un producto farmacéutico elaborado de acuerdo con las
crecimiento, son de naturaleza biológica; por lo tanto, son muy BPFV. Estas actividades deben incluir los siguientes sistemas o
complejas y difı́ciles de caracterizar por completo. Estos materiales programas: (1) recepción, segregación, inspección y liberación de
también deben ser sometidos a pruebas de esterilidad, pirogenicidad, materiales antes de usarlos en la fabricación, (2) auditorı́a y
micoplasma y agentes adventicios o virales infecciosos, incluidos los certificación del distribuidor, (3) pruebas de verificación de
VCR. El panel de pruebas especı́fico para agentes virales adventicios certificados de análisis, (4) procedimientos y polı́ticas formales
depende del origen del componente y de cómo se fabrica o se para materiales fuera de especificación, (5) pruebas de estabilidad y
prepara. Dado que estos materiales ejercen su efecto a través de (6) almacenamiento de muestras de archivo.
actividades biológicas complejas—y las pruebas bioquı́micas pueden
no predecir el rendimiento del proceso—, a veces es necesario llevar
a cabo pruebas funcionales o de rendimiento. La variabilidad del Caracterización de Bancos de Células y de Virus
rendimiento de tales materiales puede tener un efecto perjudicial
sobre la potencia del producto terapéutico final. Algunos ejemplos de
pruebas de funcionalidad complejas para materias primas son las Bancos de Células—Un banco de células es un conjunto de viales
pruebas de promoción del crecimiento de lotes individuales de SFB que contienen células almacenadas en condiciones definidas, con una
en la lı́nea celular utilizada en la fabricación, las pruebas de composición uniforme y obtenidas a partir de células combinadas
rendimiento de las preparaciones de enzimas digestivas y las derivadas de un único clon celular. El sistema de bancos de células,
valoraciones de citotoxicidad en cultivo de tejidos in vitro. por lo general, se compone de un banco de células maestras (MCB,
por sus siglas en inglés) y un banco de células de trabajo (WCB, por
Suero Fetal Bovino—Un material derivado de animales común- sus siglas en inglés), aunque hay otras categorizaciones posibles. El
mente utilizado en la fabricación es el suero fetal bovino (SFB). El MCB se produce de acuerdo con las BPFV y, preferentemente, se
SFB suele agregarse al medio de cultivo para favorecer la obtiene de una fuente repositoria calificada (exenta de agentes
proliferación celular de una amplia variedad de tipos celulares, adventicios) de antecedentes conocidos y documentados. El WCB se
incluidos los cultivos celulares provenientes de explantes de tejido obtiene o produce mediante la expansión de uno o más viales del
primario y muestras de biopsias. Los factores de crecimiento, las MCB. El WCB, o el MCB en los ensayos iniciales, se transforma en
hormonas y otros componentes nutritivos presentes en el SFB, la fuente de células para cada partida producida para uso humano.
muchos de los cuales están indefinidos o presentes en pequeñas Los sistemas de bancos de células contribuyen en gran medida a la
cantidades, aportan los componentes requeridos por muchas células uniformidad en la elaboración de partidas de productos clı́nicos o
para sobrevivir y dividirse in vitro. La producción de vectores para con licencia, porque el material celular inicial es siempre el mismo.
terapia génica de tı́tulo alto a partir de lı́neas celulares también puede Las fuentes de células de mamı́fero y de bacterias se utilizan para
requerir un medio de cultivo rico que incluya SFB en concen- establecer sistemas de bancos celulares.
traciones comprendidas entre 10% y 15%. Se han desarrollado
medios definidos, sin suero, para varios tipos celulares. Aunque Bancos de Virus—El banco de virus maestro (MVB, por sus
algunas lı́neas celulares se pueden adaptar gradualmente a siglas en inglés) se parece al MCB en que deriva de un ciclo de
condiciones de cultivo sin suero o con poco suero, esto a veces no producción único y en que la composición es uniforme. El banco de
es posible para ciertas células exigentes que necesitan SFB. virus de trabajo (WVB, por sus siglas en inglés) deriva directamente
Aunque se requiera el uso de SFB, debe considerarse el desarrollo del MVB. Tal como sucede con los bancos de células, el papel
y la evaluación de medios de cultivo sin suero o con poco suero. Es fundamental de los bancos de virus es contar con una fuente de virus
sabido que un número de bacterias, micoplasmas y virus de origen uniforme, sin agentes adventicios, para uso en la producción de
bovino están asociados con el SFB. Estos organismos podrı́an partidas clı́nicas o de productos. De acuerdo con las pautas de las
penetrar en el flujo del proceso y contaminar el producto final. El BPFV, las pruebas de los bancos de células a utilizar en la
riesgo potencial de transmisión de BSE (encefalopatı́a espongiforme producción de bancos de virus, incluidas las pruebas de garantı́a de
bovina) -la forma bovina de la TSE (encefalopatı́a espongiforme calidad, deben completarse antes de usar este banco de células para
transmisible)- con este material ha sido objeto de análisis en el la producción de bancos de virus.
ámbito internacional. Aunque el SFB ha sido clasificado como Calificación—La caracterización de los bancos de células y de
material de bajo riesgo, las pruebas y las fuentes de los lotes de SFB virus es un paso importante para obtener un producto final uniforme,
deben someterse a un programa de calificación adecuado. La manteniendo una coherencia entre lotes y la ausencia de agentes
reducción o eliminación de SFB durante el proceso de fabricación adventicios. Las pruebas para calificar los MCB o MVB se realizan
puede reducir los riesgos de contaminación por agentes adventicios. una vez y se pueden hacer con una alı́cuota del material del banco o
El SFB debe obtenerse de manadas que se controlan para verificar con cultivos de células derivados del banco de células. Hay que
la ausencia de enfermedades especı́ficas de entornos agrı́colas (como establecer especificaciones para la calificación del MCB o MVB. Es
tuberculosis o brucelosis) y que provengan de regiones libres de importante documentar los antecedentes del MCB o MVB, los
BSE. Cada lote debe cumplir con las pautas de esterilidad y métodos y reactivos empleados para crear el banco y las condiciones
contenido de endotoxinas establecidas y debe estar exento de virus de almacenamiento. Todas las materias primas requeridas para la
bovinos especı́ficos. Para aumentar la garantı́a de seguridad, debe producción de los bancos, a saber, los medios, los sueros, la tripsina
considerarse el empleo de métodos como la irradiación o la y similares, también deben someterse a pruebas para descartar la
nanofiltración, que retiran o inactivan entidades virales relacionadas presencia de agentes adventicios.
con el SFB. Calificación del Banco de Células Maestras—Las pruebas para
Cabe destacar que las formulaciones de medios definidos, por lo calificar el MCB incluyen: (1) pruebas para demostrar la ausencia de
general, incluyen componentes como la albúmina y la transferrina, agentes adventicios y virus endógenos y (2) pruebas de identidad. La
depuradas a partir de plasma humano o animal. La purificación, el pruebas de agentes adventicios pueden incluir pruebas que detecten
procesamiento y el análisis de estos componentes minimizan aún microbios, micoplasmas, bacteriófagos y virus no anfitriones. La
más el riesgo de contaminación viral o microbiana, si bien no lo ausencia de virus adventicios debe comprobarse utilizando pruebas
eliminan. Además de los riesgos asociados a los agentes adventicios, de virus tanto in vitro como in vivo y pruebas adecuadas especı́ficas
el SFB residual del producto final puede desencadenar una respuesta para la especie, como la prueba de producción de anticuerpos
inmunitaria en los pacientes. El nivel de SFB residual en el producto murinos (MAP, por sus siglas en inglés). Las pruebas de identidad
final no está necesariamente relacionado con la cantidad inicial de del banco de células deben establecer las propiedades de las células y
SFB y puede depender de la naturaleza del producto y del proceso de la estabilidad de estas propiedades durante la fabricación. Los
purificación. Aunque el SFB no esté incluido en el proceso de bancos de células se caracterizan con respecto a la expresión de
fabricación, las cantidades residuales de otros componentes isoenzimas y el fenotipo y genotipo de las células, que pueden
incluir la expresión de un gen insertado o la presencia de un vector
478 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
Las especificaciones para el producto están sustentadas por un especificación, se debe rechazar el lote. En situaciones excepcio-
estándar de referencia adecuado para el producto. El estándar de nales, es posible que se deba administrar a un paciente un producto
referencia para el producto garantiza que el proceso, según lo que no cumpla con todas las especificaciones. No obstante, deben
determinado por los ensayos de liberación, no cambie significativa- existir procedimientos establecidos para la comunicación de los
mente con el tiempo. El estándar de referencia se crea a partir de un resultados OOS al médico o a la persona responsable de decidir si se
lote producido según las BPFV y cumple con todas las pruebas de utiliza o no el producto, y para dar indicaciones sobre pruebas de
proceso y de liberación final. Además, este estándar de referencia seguimiento, control del paciente y comunicación de dichos
está sujeto a un nivel adicional de caracterización, que incluye resultados.
pruebas que no se suelen realizar para la liberación de productos. No
es necesario que el estándar de referencia esté almacenado en la
misma dosis, formulación o temperatura que el producto. No Consideraciones para la Validación
obstante, se debe determinar la estabilidad de este estándar de
referencia. El estándar de referencia verifica que una prueba produce El potencial para producir una amplia variación biológica en
resultados aceptables (cumple con las pruebas de aptitud del productos de terapia génica y celular, particularmente en tratamien-
sistema). Alternativamente, se puede usar un estándar de valoración tos especı́ficos para pacientes, afecta el proceso de validación. No
especı́fico (estándar de trabajo). En ese caso, debe comportarse, en la obstante, los principios básicos de validación de procesos para
prueba, de forma similar al estándar de referencia. El cambio a un cualquier producto biológico, incluidos los recomendados por los
nuevo estándar (lote) de referencia debe incluir muchas pruebas y documentos ICH y las guı́as de la FDA que se recomiendan en
todas ellas se deben realizar paralelamente al estándar de referencia Validación de Métodos Farmacopeicos h1225i y en Validación de
existente. Se debe evaluar, con sumo cuidado, el impacto de Recuperación Microbiana en Artı́culos Farmacopeicos h1227i se
cualquier cambio en las propiedades del nuevo estándar de referencia aplican a la validación de la mayorı́a de los productos de terapia
antes de adoptarlo. Una opción de estándar de referencia para un génica y celular. Las pautas para la validación de vacunas virales
producto celular con una vida útil corta, o para una aplicación pueden ser pertinentes para los procesos de terapia génica que
especı́fica para un paciente, puede ser un banco de células donantes producen vectores virales. Las etapas de espera en un proceso de
normales del tipo celular apropiado. Este banco de células se puede fabricación deben ser validados para garantizar que los productos
utilizar para asegurar que el proceso de fabricación es capaz de intermedios del proceso estén dentro de la especificación y que el
generar un producto uniforme. producto final se pueda formular satisfactoriamente. Antes de iniciar
La elaboración de un producto seguro y eficaz implica establecer, la validación del proceso, deben validarse todas las valoraciones
no solamente especificaciones de liberación de lotes, sino también utilizadas.
especificaciones diseñadas para mantener el control del proceso de La validación de procesos para productos especı́ficos para un solo
fabricación y del producto final. Esto incluye especificaciones de paciente, como los productos autólogos de terapia celular o
proceso (ver Controles de Proceso), especificaciones para materias productos de terapia génica especialmente diseñados para casos
primas y excipientes (ver Materias Primas), especificaciones de particulares, presenta problemas excepcionales. En principio, los
liberación de productos y especificaciones de vida útil. Se deben materiales iniciales para los productos especı́ficos para un solo
establecer especificaciones para la aceptación de las materias primas paciente tı́picamente provienen del paciente, como el material de
y excipientes utilizados en la formulación final del producto. biopsia o los productos celulares obtenidos por aféresis. El proceso
Asimismo, deben realizarse pruebas en las etapas de fabricación que debe estar diseñado de modo que admita una amplia gama de
requieren tomar decisiones crı́ticas o en etapas en las que la calidades y cantidades de material inicial. En ocasiones, cuando el
información obtenida sirve para confirmar la uniformidad del material inicial es de mala calidad o su cantidad no alcanza los
proceso. Deben establecerse especificaciones de liberación para valores especificados, es necesario el uso de procedimientos
cada etapa de control durante el proceso. La heterogeneidad puede alternativos con pasos adicionales. La validación debe confirmar
resultar del proceso de fabricación o almacenamiento del producto. que, aun ası́, estos procedimientos alternativos den como resultado
En consecuencia, el fabricante debe definir el patrón de hetero- un producto final que cumple con las especificaciones de liberación.
geneidad dentro del producto y establecer los lı́mites que Asimismo, también deben existir procedimientos para manejar la
mantendrán la eficacia terapéutica y la seguridad del producto. recepción de una cantidad de material considerablemente mayor que
En algunos casos, se pueden establecer especificaciones tanto para la normalmente prevista. Estos procedimientos deben incluir la
la liberación de lotes como para la vida útil. Según la guı́a Q5C de la disposición del material sobrante. En segundo lugar, el procesa-
Conferencia Internacional sobre Armonización de Requisitos miento manual de células y tejidos debe demostrar un grado de
Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos destinados variabilidad inherente. Es fundamental desarrollar pasos de proce-
para Uso en Seres Humanos (ICH por sus siglas en inglés) samiento que sistemáticamente produzcan componentes de proceso y
presentada en Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas de un producto final apropiados, aun si durante el proceso hubiera que
Estabilidad de Productos Biotecnológicos/Biológicos h1049i, el uso usar materiales de tejido variables o no estándar, como por ejemplo,
de diferentes especificaciones se debe respaldar con información suspensiones de linfocitos T contaminadas con eritrocitos o material
suficiente para demostrar que el rendimiento clı́nico no resulta de biopsia de bajo peso. La validación del proceso debe tener en
afectado. Los criterios de aceptación se deben establecer y justificar a cuenta esta variabilidad y garantizar que los puntos finales crı́ticos
partir de los datos obtenidos de lotes utilizados en estudios del proceso de fabricación y de las pruebas cumplan uniformemente
preclı́nicos y clı́nicos, y de lotes utilizados para demostrar la con las especificaciones. La validación del proceso demuestra que
uniformidad en la fabricación, y a partir de datos de desarrollo los procedimientos pueden generar un producto sin contaminación
pertinentes, como los surgidos de procedimientos analı́ticos microbiana. Asimismo, debe probar que no hay contaminación
validados y estudios de estabilidad. Los criterios de aceptación cruzada entre los lotes de productos de distintos pacientes. Si fuera
también deben guardar correlación con las evaluaciones de seguridad posible, el proceso debe validarse con respecto a la depuración del
y eficacia. virus, como se indica en la guı́a Q5A de la ICH: Evaluación de
Una vez establecidas las especificaciones, los resultados de las seguridad viral de productos biotecnológicos derivados de lı́neas
pruebas deben ser sometidos a un análisis de tendencia. Los celulares de origen humano o animal. Si no fuera posible, debe-
resultados fuera de especificación (OOS, por sus siglas en inglés), o rá evaluarse la capacidad que tienen las células utilizadas en la
incluso aquellos que están fuera de la tendencia, se deben investigar elaboración del producto para propagar los virus capaces de
antes de desechar el material. El objeto de esta investigación es contaminar estas células o materiales de origen. Esto incluye
determinar la causa del resultado discordante. La Guı́a de la FDA materias primas utilizadas como productos auxiliares.
para la Industria: Investigación de Resultados de Pruebas Fuera de Como consecuencia de esta variabilidad, deberán evaluarse la
Especificación en la Producción Farmacéutica [Draft Guidance for uniformidad y la robustez del proceso de fabricación analizando más
Industry: Investigating Out of Specification (OOS) Test Results for de tres lotes. No se espera que todos los intentos de fabricación
Pharmaceutical Production] ofrece un enfoque sistemático para funcionen para las terapias especı́ficas para un solo paciente. Sin
llevar a cabo una investigación. El resultado de un ensayo se puede embargo, se debe establecer la tasa de éxito y realizar un
rechazar si es posible confirmar que ha ocurrido un error, como el de seguimiento para detectar cualquier reducción en esta tasa y, en tal
un analista, un error de cálculo o la falla de un equipo. Si la caso, tomar las medidas necesarias para corregir el problema. Las
investigación revela que el producto no está dentro de la células primarias bien caracterizadas de un banco de células se
480 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
pueden utilizar en la validación del proceso si el perfil de los asépticos durante la obtención y el procesamiento inicial son
donantes se encuentra dentro del intervalo deseado para la población esenciales para garantizar la seguridad del producto final, dado que
de pacientes que, en última instancia, recibirá la terapia. Un análisis la esterilización terminal de las células no es posible.
de tendencia de un número aceptable de administraciones de
producto que sea estadı́sticamente aceptable también puede resultar
apropiado. TEJIDO HUMANO
Tabla 4. Prueba de Enfermedades Infecciosas para las Células y Tejidos Humanos Utilizados en Productos de Terapia Celular
Pruebas*
Treponema
Tipo de Célula VIH 1; 2 Hepatitis C Hepatitis B HTLV Citomegalovirus pallidum
Células madre autólogas R R R R
Otros tejidos autólogos R R R
Células madre alogénicas de X X X X X X
donantes emparentados
Otros tejidos alogénicos X X X X X X
X
—se requiere
R
—se recomienda; se puede requerir que el etiquetado declare ‘‘resultado negativo’’ o ‘‘no se realizaron pruebas de riesgos biológicos’’
*
Para los donantes autólogos o alogénicos de sangre del cordón o tejido fetal, se puede utilizar una muestra de la madre para la prueba.
La médula ósea para uso clı́nico se obtiene, principalmente, por Con una técnica de recolección abierta, que consiste en drenar la
aspiración percutánea con aguja en la cresta ilı́aca anterior o sangre por gravedad a través del extremo cortado del cordón y hacia
posterior o bien del esternón. El personal especialmente capacitado tubos estériles que contienen el anticoagulante, no se logra el mismo
emplea prácticas corrientes de salas de operación de hospitales. Se nivel de asepsia que con la técnica mencionada anteriormente.
utilizan jeringas de plástico y agujas de aspiración comercialmente El riesgo potencial de transmisión de trastornos genéticos
disponibles para extraer volúmenes de 3 a 5 mL de médula ósea, de desconocidos al receptor constituye un área de especial preocupación
cada sitio de penetración. El material se transfiere a una solución en cuanto al uso de sangre placentaria y de cordón umbilical. La
salina equilibrada estéril o un medio de cultivo de tejidos que idoneidad del donante se establece mediante un estudio común de
contenga suficiente anticoagulante, como la heparina, para prevenir detección de enfermedades infecciosas y un cuestionario médico. La
la coagulación. La eliminación de espı́culas óseas se puede lograr donación es anónima y sin ningún seguimiento a largo plazo del
pasando el material a través de un tamiz de malla de acero inoxidable niño.
o con equipos de recolección formados por bolsas de plástico
estériles con filtros en lı́nea con una porosidad de aproximadamente
200 mm. El volumen de médula ósea recolectado depende del peso TEJIDO ANIMAL
corporal y de otras caracterı́sticas, tanto del donante como del
receptor. El máximo volumen que se puede obtener de un donante es El área de mayor preocupación en cuanto al uso de tejido animal
aproximadamente 10 a 15 mL por kg de peso corporal. se relaciona con los riesgos conocidos y desconocidos de la posible
Las células progenitoras de sangre periférica (CPSP) circulantes transmisión de enfermedades infecciosas a seres humanos; por este
comprenden una pequeña población de células mononucleares de motivo, el transplante de células animales suscita especial inquietud
sangre periférica que se puede utilizar en lugar de la médula ósea o en el ámbito de la salud pública. La introducción y propagación de
junto con ésta. Las CPSP se recolectan por aféresis, un procedi- agentes infecciosos xenogénicos en la población humana en general
miento mediante el cual la sangre donada se extrae de una vena y se es un riesgo a tener en cuenta. Al desarrollar productos de terapia
separa ex vivo en todos o algunos de sus componentes. Uno o más celular para uso en xenotrasplante, debe consultarse la Draft Public
de los componentes se retienen como cosecha y las partes restantes Health Service (PHS, por sus siglas en inglés) Guideline on
se devuelven al donante. La preparación del donante puede Infectious Disease Issues in Xenotransplantation (Guı́a del Servicio
incrementar la proporción de CPSP circulantes en la cosecha. de Salud Pública sobre Aspectos Relacionados con las Enferme-
Algunos ejemplos de tal preparación son la recolección durante la dades Infecciosas en el Xenotransplante) (agosto de 1996) y otros
etapa de recuperación de un tratamiento de quimioterapia mielosu- documentos regulatorios relacionados que se generan a medida que
presora y la administración de factores de crecimiento hemato- se avanza en este campo. Quienes desarrollan estos productos deben
poyéticos, como el factor estimulante de colonias de granulocitos comprender que los receptores serán sometidos a un alto nivel de
(FEC-G) y el factor estimulante de colonias de granulocitos y investigación (por ejemplo, vigilancia clı́nica y de laboratorio, o
macrófagos (FEC-GM), o los esteroides. La recolección también inscripción en bases de datos de xenotrasplante), dadas las
mejora aumentando la frecuencia o el volumen de las aféresis. La inquietudes mencionadas en materia de salud pública.
aféresis requiere uno o dos catéteres venosos periféricos de calibre El uso de tejido animal en la fabricación de productos de terapia
grueso en las extremidades superiores, o un solo catéter venoso celular requiere que el origen del tejido esté controlado y
central de calibre grueso, paredes gruesas, de luz doble o triple (tipo documentado y que provenga de animales criados en cautiverio,
Mahurkur). Existen dos tipos de tecnologı́as de aféresis: los en paı́ses o regiones geográficas con sistemas nacionales de salud y
separadores celulares de flujo discontinuo (Haemonetics) y los de prevención y control de enfermedades adecuados. Asimismo, el
sistemas de flujo continuo (COBE o Fenwall). La anticoagulación cuidado y uso de animales debe ser aprobado por una comisión
para velocidades de flujo normales a altas se realiza basada en institucional acreditada para el cuidado y uso de animales. Los
citratos. En un sistema cerrado, el riesgo de contaminación es bajo. animales donantes deben tener un linaje documentado, provenir de
Por lo general, el procedimiento lo realiza el personal capacitado y manadas o colonias cerradas y estar en programas de mantenimiento
especializado en un banco de sangre o en un centro de donaciones y control de salud. Las instalaciones para albergar a estos animales
asociado a un banco de sangre. deben estar certificadas por el USDA (Departamento de Agricultura
La sangre placentaria y de cordón umbilical proporciona una de los Estados Unidos) (para animales vertebrados grandes) o por la
tercera fuente de células progenitoras hematopoyéticas. En compara- Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal
ción con la médula ósea y las CPSP, las células madre de la sangre de Care International (Asociación para la Evaluación y la Acreditación
placenta y de cordón umbilical tienen mayor capacidad proliferativa del Cuidado de Animales de Laboratorio; AAALAC, por sus siglas
y de autorrenovación. El volumen de recolección y, por tanto, el en inglés) (para animales vertebrados pequeños) y deben cumplir
número de células son limitados y dependen del momento escogido con las recomendaciones establecidas por la Guide for the Care and
para realizarla y de la presencia de un buen equipo de trabajo. Las Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996) (Guı́a
recolecciones se realizan durante la tercera fase del parto. para el Cuidado y la Utilización de Animales de Laboratorio del
Tı́picamente, se utiliza un método de recolección cerrado con Consejo de Investigación Nacional, 1996), que se puede obtener a
canulación o punción de la vena umbilical, seguida de la recolección través de la AAALAC. Estas instalaciones deben contar con
con jeringas de plástico o bolsas de extracción de sangre con veterinarios y demás personal capacitado que garantizará la salud
anticoagulantes basados en citrato. El procedimiento se realiza en de los animales y la prevención de enfermedades. Los procedi-
una sala de acceso restringido, apartada del lugar del nacimiento. El mientos empleados en la planta deben estar documentados y se
contenido de células de la recolección incluye un gran número de deben guardar registros. Los programas de mantenimiento y control
eritrocitos, leucocitos, plaquetas y células mononucleares blanco. de salud se basan en la atención veterinaria estándar para cada
482 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
especie e incluyen exploraciones fı́sicas, monitoreo, pruebas de procesamiento de células deben garantizar la reproducibilidad y
diagnóstico de laboratorio y vacunaciones. Se recomienda un seguridad de los productos fabricados a través de programas
método de partidas sucesivas o de ingresos y egresos totales (all- adecuados de CC y GC.
in–all-out) para trasladar a los animales a través de las instalaciones, Independientemente de la ubicación, el procesamiento se debe
en lugar de un movimiento de reemplazo continuo. Permite la llevar a cabo en un lugar especialmente destinado a tal fin y
descontaminación de las instalaciones antes del ingreso de un nuevo fı́sicamente separado del sitio de extracción. En la mayor medida
grupo de animales, de modo que se reduce el riesgo de transmisión posible, el diseño de las instalaciones y los procedimientos de
de enfermedades. Los componentes alimenticios deben estar procesamiento deben estar de acuerdo con lo establecido en las
documentados y excluir, siempre que sea posible, material reciclado Guı́as de la FDA sobre Productos Farmacéuticos Estériles
o procesado posiblemente asociado a la transmisión de enferme- Fabricados mediante Procesamiento Aséptico (Guidelines on Sterile
dades. Drug Products Produced by Aseptic Processing) (junio de 1987) o en
Para garantizar al máximo la seguridad del producto, tanto los Preparación Magistral—Preparaciones Estériles h797i para proce-
donantes como sus tejidos deben ser examinados en varias etapas del sos de manipulación abierta. Generalmente, esto requiere que el
proceso para descartar la presencia de agentes microbianos. Estos personal, debidamente entrenado y equipado para estos procesos,
controles deben basarse en ensayos suficientemente sensibles y trabaje con las muestras de sangre y tejidos en una zona crı́tica con
especı́ficos para detectar bacterias, micoplasma, hongos o virus de aire filtrado por HEPA de clase 100, proporcionada por una cabina
interés. A efectos de descartar la presencia de ciertas enfermedades de seguridad biológica ubicada en un cuarto limpio con aire filtrado
en los animales donantes, se pueden realizar estudios antes de la por HEPA de clase 10 000. En las instalaciones y lugares de
donación, mediante diversas pruebas de control serológico. Los procesamiento debe controlarse la calidad del aire para lograr un alto
tejidos se pueden someter a una variedad de pruebas que incluyen, grado de asepsia en todos los procesos. Para más información sobre
pero no se limitan a los siguientes: este tema, consultar Evaluación Microbiológica de Cuartos Limpios
1. prueba de esterilidad; y Otros Ambientes Controlados h1116i. El material debe ser
2. prueba de micoplasma; envasado en recipientes estériles a prueba de fugas y transportado
3. prueba de virus cultivables in vitro; desde el lugar de extracción al lugar de procesamiento en
4. prueba de virus desconocidos, por inoculación de diversos condiciones controladas que mantengan la viabilidad de las células.
animales de laboratorio; El medio lı́quido en el cual se sumergen las muestras durante el
5. pruebas de retrovirus endógenos xenotrópicos y otros retrovirus transporte debe ser óptimo para mantener la viabilidad de células y
animales por técnicas de cocultivo in vitro, métodos bioquı́mi- tejidos. Este medio de transporte puede suplementarse con
cos (por ejemplo, para detectar la transcriptasa inversa viral) y antibióticos. Si ası́ fuera, los niveles de antibiótico en los
ensayos de biologı́a molecular (como el ensayo por PCR para amortiguadores del pH disminuyen y, finalmente, se eliminan
detectar secuencias genómicas virales); y durante las etapas subsiguientes del procesamiento; ası́, los
6. métodos de detección u observación directa, como la antibióticos no están presentes en el producto celular final. En el
microscopı́a electrónica, detección de antı́genos virales espe- caso de productos sanguı́neos o de tejidos con gran cantidad de
cı́ficos por microscopı́a con anticuerpos fluorescentes o sangre, el medio de transporte o solución amortiguada de electrólitos
métodos de inmunoensayo enzimático. debe contener un anticoagulante como heparina o otro basado en
La mayorı́a de estas pruebas se tratan en Metodologı́as Analı́ticas citrato.
o en Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a h1045i y en Evaluación
de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de
Lı́neas Celulares de Origen Humano o Animal h1050i. Las AISLAMIENTO
necropsias posteriores a la extracción de tejidos, los programas de
animales centinela y el archivo de órganos, tejidos, sangre y otras Por lo general, se realiza una disección de órganos o tejidos
muestras de donantes son componentes adicionales del programa sólidos para dejar expuesta la región deseada. Este material se puede
general para garantizar la seguridad del tejido animal para usar tal como está para transplante o se puede someter a mayor
aplicaciones de terapia celular. procesamiento. Si se requieren organoides multicelulares (por
La mayorı́a de las condiciones de extracción aséptica se aplican ejemplo, los islotes de Langerhans) o suspensiones de célula
tanto a la obtención de tejido animal como humano. Nuevamente, el única, el tejido se puede someter a disgregación mecánica o
tejido debe obtenerse bajo controles y condiciones ambientales que enzimática. La disgregación fı́sica se puede lograr con instrumentos
permitan la recuperación aséptica con un alto grado de seguridad. Se de gran fuerza de corte (es decir, que homogeneizan) o dividen el
suelen utilizar instalaciones especialmente diseñadas para la tejido en partes más pequeñas. Alternativamente, el material se
extracción de tejidos, por lo general, en estrecha relación con el puede comprimir o pasar a través de tamices de tamaños de malla
establecimiento de mantenimiento de animales. Estas instalaciones determinados.
tienen atributos y caracterı́sticas de diseño especı́ficos que pueden no La digestión enzimática de tejido conectivo extracelular, que
estar presentes o no ser aplicables en una sala de operaciones de mantiene las células unidas dentro del tejido, es otro método común
hospital. Tales caracterı́sticas incluyen: (1) organización por etapas para disociar el tejido sólido. Tı́picamente, se corta en pequeños
(afeitado, sedación, preparación para la sala de operaciones) en cubos, por lo general mayores de 1 mm3, que se incuban en una
diferentes salas, generalmente separadas con esclusas de aire para solución amortiguada que contiene una enzima de digestión. Otra
control ambiental; (2) filtración de partı́culas del aire de alta alternativa es colocar el órgano intacto en una solución para eliminar
eficiencia (HEPA, por sus siglas en inglés); (3) instalaciones la sangre del tejido y luego en la solución enzimática, que ayuda en
contiguas pero separadas para continuar con el procesamiento de la digestión. Para esto, se utilizan diversas enzimas, tales como
tejidos; y (4) áreas destinadas al retiro de cadáveres. Todo lo relativo colagenasa, tripsina, elastasa, hialuronidasa, papaı́na y quimotrip-
a la capacitación del personal, la manipulación y punción del sina. Se pueden agregar enzimas con actividad nucleasa, como la
intestino y la desinfección, aplicables a tejidos humanos, se aplican desoxirribonucleasa, para contribuir en la digestión de los ácidos
también a la extracción quirúrgica de tejidos de animales (ver Tejido nucleicos liberados de las células dañadas y evitar la aglomeración
Humano). excesiva de las células. Al final de la incubación, la suspensión de
células puede ser sometida a una acción de bombeo leve para dividir
aún más los cúmulos multicelulares hasta lograr el tamaño o la
Aislamiento y Selección de Células composición deseados. Habitualmente, los métodos de disgregación
enzimática y fı́sica se combinan para lograr el resultado deseado.
CONSIDERACIONES GENERALES Dado que las células aisladas de los productos sanguı́neos y de
médula ósea son inherentemente suspensiones de células, la
Los principios generales para el procesamiento de tejidos manipulación mecánica se limita a la extracción de plasma, que se
humanos y animales después de su extracción aséptica son realiza por centrifugación y extracción fı́sica de coágulos formados
independientes del origen del tejido. La fabricación de productos durante el transporte, pasando el material por un filtro de 200 mm.
celulares puede desarrollarse en un centro médico o en una planta
central de procesamiento de células. Los sitios utilizados para el
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 483
fuente, la seguridad, la toxicologı́a y las pruebas de residuos para Introducción de Material Genético en las Células
cualquier reactivo utilizado para liberar células adherentes durante la
fabricación. Una extensión común de la terapia celular es la introducción de
Se han desarrollado algunos sistemas especı́ficos para ciertos material genético, por lo general ADN, en las células para alterar su
productos que no requieren la liberación de células adherentes. En patrón de expresión génica. A los fines de esta sección, se supone
estos sistemas, las células se expanden sobre una matriz sintética o que el ácido nucleico es ADN. El ARN o un derivado del ADN
natural, que luego se aplica en forma tópica (por ejemplo, en pueden ser sometidos a procesos similares, excepto que la
productos de reparación dérmica) o se cultivan dentro o fuera de estabilidad y la solubilidad de cada ácido nucleico puede exigir la
fibras para perfusión ex vivo (por ejemplo, hepatocitos en modificación de ciertos pasos. Este proceso se suele denominar
dispositivos de fibra hueca para tratar hepatopatı́as). En estas terapia génica ex vivo, ya que las células se extraen del paciente o
aplicaciones, las composiciones de la matriz y del dispositivo deben del donante y la introducción del material genético se lleva a cabo
ser biocompatibles y, en algunos casos, biodegradables. con las células fuera del cuerpo. A continuación, las células
En todos los sistemas mencionados, los parámetros estándar de modificadas genéticamente son administradas al paciente. El
cultivo de células deben ser optimizados para maximizar la eficiencia material genético introducido puede causar la expresión de nuevos
del proceso. Tales parámetros incluyen la composición del material genes y productos o la inhibición de la expresión de genes y
celular de origen, la densidad de siembra inicial, la composición de productos ya expresados. Esta última representa un tipo de terapia
los medios, la velocidad de recambio de los medios, la temperatura, antisentido. El material genético puede ser introducido por la misma
la composición gaseosa y la velocidad de entrega. Según la gama de reactivos que se utiliza en terapia génica: vectores virales,
naturaleza del producto, es necesario definir el efecto potencial de ácidos nucleicos en una formulación simple (ADN desnudo) o
los parámetros del proceso sobre la potencia y la función de las ácidos nucleicos formulados con agentes como liposomas, que
células blanco. mejoran su habilidad para penetrar en la célula. La mayorı́a de los
En los sistemas de biorreactor cerrados, puede ser difı́cil observar pasos y consideraciones analizados se aplican también a la
u obtener muestras de células para determinar y controlar la tasa de introducción ex vivo de material genético en las células. No
proliferación y, por lo tanto, el momento de la cosecha. La medición obstante, el objetivo principal de la terapia ex vivo es desarrollar
de los parámetros de fermentación tradicionales, como la tasa de procesos robustos que funcionen con la mayorı́a de las células de los
consumo de nutrientes o generación de productos metabólicos, pacientes o de los donantes. Esto conlleva un esfuerzo mucho mayor
puede servir de método sustituto, susceptible de validación, con el que los procesos para lı́neas celulares.
cual evaluar la tasa de proliferación y predecir cuándo cosechar el El método de introducción de material genético nuevo en las
producto celular. Debe definirse bien la relación entre tales células depende de la biologı́a del sistema y de la estabilidad deseada
parámetros y la viabilidad, la potencia y la función del producto de la expresión génica. Si un vector retroviral simple, como por
celular. Puede ser necesaria la purificación y el enriquecimiento de ejemplo el virus de la leucemia murina de Moloney, se usa para la
las células deseadas después de la expansión mediante métodos transducción, las células deben estar en división activa, ya que el
como los descritos anteriormente. ADN del vector sólo se integra al ADN celular durante la
replicación. Esto, habitualmente, conduce a una expresión prolon-
gada del producto génico deseado. Los vectores adenovirales, el
DIFERENCIACIÓN ADN desnudo o el ADN formulado se pueden introducir en células
que no están en división. Sin embargo, la expresión génica se-
Algunas terapias celulares requieren diferenciación de linaje o rá transitoria, ya que el ADN introducido generalmente
funcional de las células de origen. Por ejemplo, a través de los será extracromosómico.
procesos de expansión de células madre hematopoyéticas, normal- El desafı́o principal es lograr una transducción o transfección
mente se generan productos que contienen una mezcla de células eficiente, introduciendo suficiente ADN en la célula antes de la
madre multipotentes, células progenitoras comprometidas hacia un degradación del ADN. En el caso de la transducción por vectores
linaje y células diferenciadas hacia un linaje. La composición de retrovirales, vectores derivados de retrovirus simples, las células son
estos productos se puede manipular mediante diferentes combina- estimuladas por reactivos que las colocan en la fase S (replicación)
ciones de factores de crecimiento y citokinas durante el proceso de en el momento de aplicación del vector. En un cultivo de células, la
expansión. Lo opuesto se aplica a aquellos procesos donde las mayorı́a de los vectores retrovirales son estables durante algunas
células maduras son desdiferenciadas para permitir que luego horas. Dado que la difusión es mı́nima, sólo una pequeña fracción de
vuelvan a comprometerse hacia un linaje determinado (por ejemplo, partı́culas virales entra en contacto con las células durante este
los condrocitos en la reparación de cartı́lago). perı́odo. Se pueden utilizar las siguientes técnicas para aumentar el
Algunos ejemplos especı́ficos de manipulación ex vivo son la número de partı́culas virales que entran en contacto con la célula en
programación de células presentadoras de antı́genos profesionales, un perı́odo de tiempo determinado:
como las células dendrı́ticas y los monocitos o macrófagos, y la 1. maximizar la concentración de partı́culas virales y minimizar
producción de linfocitos T especı́ficos para antı́genos destinados a volumen de los medios durante la transducción
tratar determinadas enfermedades. En estas aplicaciones, las células 2. realizar múltiples aplicaciones del virus
manipuladas pueden modificarse para lograr que se dirijan y ataquen 3. centrifugar las partı́culas de virus sobre las células
a un tumor o tipo de célula tumoral, para inducir una respuesta de 4. colocar las células en un filtro y pasar lentamente los medios
anticuerpos especı́ficos u otra respuesta celular o bien para vacunar virales por el filtro
al paciente. Los procesos de fabricación de tales productos pueden 5. agregar a los medios polı́meros que refuerzan la unión.
incluir una o más exposiciones de las células relevantes a NOTA—No se recomienda el cocultivo de las células blanco con las
inmunógenos sintéticos especı́ficos para una enfermedad (por células productoras de virus. Esta técnica aumenta las posibilidades
ejemplo, péptidos) o inmunógenos naturales (por ejemplo, células de recombinación y de producción de VCR. Asimismo, cualquier
tumorales muertas, virus, fracciones de membrana celular o producto para el que se utilice el cocultivo para transducir células
moléculas naturales purificadas) antes, después o durante la humanas serı́a considerado un xenotrasplante si las células
expansión del cultivo. Alternativamente, las células blanco pueden productoras no son de origen humano. El segundo tipo de célula,
ser modificadas por ingenierı́a genética con un producto génico sea o no sea humano, puede causar inflamación.
especı́fico, como un receptor especı́fico para VIH. En algunas Cada una de las técnicas mencionadas tiene sus propios problemas
aplicaciones, las células relevantes se cultivan junto con células que hay que considerar para poder desarrollar un proceso robusto.
tumorales, otras células enfermas o células que producen una En la técnica 1, la reducción del volumen durante la transducción
construcción génica susceptible de transducción o transfección para provoca un rápido agotamiento del medio, por lo que debe agregarse
generar un producto especı́ficamente buscado. medio suplementario pocas horas más tarde. En la técnica 2, las
De nuevo, antes de la distribución, las células blanco manipuladas células pueden no estar ya en la fase correcta del ciclo celular
pueden requerir mayor purificación y enriquecimiento mediante los durante aplicaciones posteriores o pueden haberse tornado refracta-
métodos descritos en esta sección. En el caso de ciertos productos de rias por transformación improductiva durante la aplicación anterior.
linfocitos T, las células especı́ficas para ciertos antı́genos se pueden Las técnicas 3 y 4 pueden funcionar bien en una escala muy
clonar y luego expandir aún más hasta obtener la dosis terapéutica. pequeña, pero es posible que el número de células que se puede
transducir sea insuficiente para obtener una dosis eficaz. En la
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 485
técnica 5, es posible que los polı́meros no ofrezcan un beneficio, ya 5%-10% con o sin hidroxietil almidón (por lo general al 6%) y una
que la unión al virus puede involucrar receptores especı́ficos, cuya proteı́na plasmática, como albúmina sérica humana al 4%-10%, en
densidad de superficie puede resultar el factor limitante. una solución salina balanceada. El DMSO impide la deshidratación
A otros virus o preparaciones de ADN pueden caberles técnicas y al cambiar la concentración de solutos extracelulares no penetrantes
problemas similares. El problema de la difusión lenta es aun más durante la formación de hielo en el momento de la congelación. La
marcado en el caso de preparaciones de ADN. Factores como el tipo solución de polı́mero hidroxietı́lico, de alto peso molecular, protege
de célula donde se ha producido el vector viral, los medios utilizados a las células de la deshidratación, pues el agua se incorpora en los
para la producción del vector y la pureza del vector pueden tener un cristales de hielo extracelulares. El empleo de una proteı́na, a
efecto significativo sobre la eficacia de la transducción. menudo, determina una recuperación y una viabilidad máximas de
Ciertos métodos no exigen que las células estén en ciclo activo células después de descongelar. Se ha utilizado suero (5%-90%) en
pero, en la práctica, la mayorı́a de los procesos requieren que las lugar de proteı́nas especı́ficas. Algunas formulaciones para criocon-
células sean capaces de replicarse debido a las siguientes servación carecen por completo de proteı́nas. Si la solución contiene
consideraciones: un amortiguador del pH, los cambios de temperatura no deben
1. Por motivos de seguridad, puede ser necesario que solamente afectar el pH del amortiguador. La concentración óptima de células
células que expresen el nuevo ADN sean devueltas al paciente, para crioconservación depende del tipo de células pero suele estar
lo cual exige la selección de dichas células. Como se describe a comprendida entre 106 y 107 células por mL. La pureza de la
continuación, el método de selección más común utiliza un gen población de células también puede influir en la recuperación. Por
resistente a antibióticos, que se introduce junto con el nuevo ejemplo, el crioconservante puede dañar los granulocitos y reducir su
material genético. viabilidad celular. Estos efectos dependen de la concentración del
2. Puede requerirse mayor propagación para lograr la dosis crioconservante. Ambos efectos exponen al paciente a mayor
terapéutica de las células. toxicidad relacionada con la infusión, aunque esto se asocia con el
3. Por razones económicas, biológicas o técnicas, es posible que la volumen administrado y la concentración final del crioconservante.
introducción de ADN deba llevarse a cabo en un número Las formulaciones para suspensiones celulares almacenadas sin
pequeño de células y que la población celular deseada sea congelar, por lo general, contienen medios de cultivo celular, a
posteriormente expandida hasta obtener la dosis requerida. menudo, sin ninguna proteı́na. Como las células continúan
Por lo tanto, en casi todos los casos, deben desarrollarse las metabolizando sus medios, aun a las bajas temperaturas de
condiciones que permitan que la célula prolifere o que mantenga su almacenamiento, el medio suministra los aminoácidos y otros
capacidad de proliferar. La biologı́a de las células, la tecnologı́a nutrientes que contribuyen a mantener la viabilidad celular.
disponible y la economı́a de procesos determinarán si las células se
propagarán antes, después o durante la introducción del nuevo
material genético. En realidad, la mayorı́a de los procesos expanden PRODUCTOS COMBINADOS CON MATRICES BIOCOMPATIBLES
la población después de la introducción del nuevo gen.
La posible administración a pacientes de células que no expresan Muchos productos de terapia celular se administran en combina-
productivamente el gen depende de la biologı́a de la aplicación, de la ción con una matriz biocompatible. Por ejemplo, los productos para
dosis requerida en comparación con la capacidad de manejo del cicatrización de heridas o sustitutos de piel contienen células
sistema de fabricación y, principalmente, de la toxicidad de la sembradas en una matriz. La estructura bioquı́mica y fı́sica de la
población de células no productivas. La selección de la población de matriz y el método para combinar células con la matriz son
células modificadas genéticamente, por lo general, se lleva a cabo especı́ficos de la aplicación. Algunos ejemplos frecuentes son:
utilizando un gen marcador de resistencia a antibióticos, como la 1. Células cargadas en un dispositivo de membrana semi-
neomicina, que se introduce en la célula junto con el material permeable—Por lo general, los poros de la membrana son
genético nuevo. Para la selección por neomicina, las células en suficientemente grandes para permitir el paso de los factores
cultivo se tratan con el antibiótico G418, a una concentración y terapéuticos secretados por las células, pero suficientemente
durante un perı́odo que han demostrado que matan las células de pequeños para impedir que las inmunoglobulinas y las células
expresión no productiva, mientras permiten la proliferación de anfitrionas entren en contacto con las células terapéuticas, las
células de expresión productiva. De esta manera, se supone que las destruyan o desencadenen una respuesta inmunitaria. El
células resistentes al antibiótico también expresan el ADN de interés. dispositivo puede ser una fibra hueca o una cápsula semiperme-
La expresión debe ser probada como requisito de liberación de lotes able con células en el interior que secretan compuestos
o verificada en una serie de pruebas simuladas. Dado que la mayorı́a terapéuticos o bien puede formar parte de un sistema más
de los antibióticos disminuyen la proliferación celular, puede ser grande de bombas y filtros, como módulos de fibra hueca con
necesario optimizar la composición de los medios de cultivo para la hepatocitos para tratar enfermedades hepáticas.
selección y propagación eficientes de las células modificadas 2. Células sembradas sobre una matriz tridimensional, con
genéticamente. capacidad para propagarse y formar una estructura de tipo
Después de la selección por antibiótico, puede requerirse una tisular—En el producto resultante, las células están orientadas
segunda fase de propagación celular sin antibióticos para lograr la de una manera singular que es importante para el uso previsto
dosis deseada y eliminar del sistema el G418 residual. El medio del producto (por ejemplo, sustitutos de piel). En algunos casos,
seleccionado y el perı́odo total de cultivo pueden ser decisivos para se han utilizado fuerzas mecánicas para lograr una orientación
mantener la expresión deseada de funciones diferenciadas originales. apropiada de las células.
Otro problema relacionado con el uso de marcadores de selección es 3. Células encapsuladas en un gel o una solución de polı́meros
que, generalmente, son genes no humanos. La expresión de estos entrecruzables—La estructura implantable puede servir de
genes suele inducir una respuesta inmunitaria. recipiente de cultivo para proteger las células del sistema
El desarrollo del proceso suele realizarse con células de donantes inmunitario del anfitrión, o para moldear las células y darles una
sanos. Es preciso tener en cuenta que en pacientes muy enfermos, forma definida. Algunos de los polı́meros utilizados son
puede ser difı́cil obtener células sanas que puedan ser estimuladas de alginato, ácido hialurónico, colágeno, quitina o polı́meros
modo que se repliquen en forma eficiente y sostenida. sintéticos. Se han implantado células b pancreáticas a pacientes
para tratar la diabetes. Para la incontinencia urinaria, se han
mezclado condrocitos con alginato, a fin de formar una
Formulación de Productos de Terapia Celular estructura al inyectarlos.
4. Células adheridas a matrices de forma definida que luego se
SUSPENSIONES implantan—Algunos ejemplos son las células precursoras
osteogénicas sobre matrices de hueso desmineralizado obtenido
Las formulaciones para productos de terapia celular dependen del de cadáveres humanos, cerámica de hidroxiapatita, cerámica de
tiempo de almacenamiento deseado y de si las células se administran hidroxiapatita–fosfato tricálcico, o vidrio biodegradable, que se
como una suspensión o en combinación con una matriz. Indepen- pueden emplear para corregir defectos óseos.
dientemente de la vı́a de administración, las células en suspensión se Al fabricar estos productos, lo más importante es disponer de un
pueden congelar o no. La formulación más frecuente para células material de buena calidad para la matriz. Debe ser biocompatible, no
crioconservadas es una solución de dimetil sulfóxido (DMSO) al interferir con la función celular ni desencadenar una respuesta
486 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
inmunitaria en el paciente. Si se pretende que las células proliferen relacionados con el diseño de vectores para terapia génica y la
después de cargarlas sobre la matriz o dentro de ella, la matriz y el selección de una tecnologı́a de producción; no se centra la atención
sistema de cultivo de apoyo deben permitir el intercambio de en tecnologı́as de producción especı́ficas.
nutrientes y productos de desecho. Las células pueden formar
estructuras similares a tejidos en condiciones favorables y cuando las
aplicaciones ası́ lo requieran. Una matriz gruesa e impermeable Consideraciones de Diseño para Vectores Génicos
conducirá a la formación de zonas de tejido necrótico. Muchos de
estos dispositivos están diseñados para que se puedan extraer del TIPOS DE VECTORES
paciente después de un perı́odo determinado.
Siempre que las células se combinen con matrices biocompatibles, Un vector tı́pico para terapia génica está compuesto de (1) el
es preferible utilizar sistemas cerrados para fabricar y administrar el esqueleto del vector, viral o plasmı́dico, (2) un promotor, (3) el gen
producto. Como estos productos de terapia celular pueden ser terapéutico de interés, incluyendo intrones y (4) una señal de
bastante complejos, sus detalles de fabricación exceden el alcance de poliadenilación. Se están desarrollando retrovirus murinos y
este capı́tulo. humanos, adenovirus, parvovirus como los virus adenoasociados
(VAA), virus herpes, poxvirus, virus toga, sistemas de terapia con
plásmidos no virales y sistemas de terapia con oligonucléotidos
FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DE TERAPIA antisentido sintéticos para aplicaciones de terapia génica. Estos
GÉNICA vectores (ver Tabla 5) tienen capacidades muy diferentes para
transportar genes a las células. Algunos vectores virales se dirigen,
Introducción por preferencia, a células en división, mientras que otros son capaces
de transducir células en división o células que no están en división.
Los principios aplicables a la fabricación de productos farmacéu- La capacidad transgénica varı́a mucho; esto significa que hay
ticos o biológicos también son pertinentes al desarrollo de vectores limitaciones con respecto al tamaño del fragmento de ADN extraño
de terapia génica para uso terapéutico en seres humanos. Se pueden que se puede incorporar en el genoma recombinante. Con frecuencia,
aplicar los mismos requisitos de BPFV para determinar la se ha descrito el vector ideal para terapia génica como uno capaz de
homogeneidad del producto, validar el proceso, calificar la materia transducción eficaz, liberación dirigida y expresión génica con-
prima y determinar la conformidad de las instalaciones de trolada. La magnitud, el momento y la duración de la expresión
fabricación. Los fabricantes afrontarán problemas de desarrollo, génica requeridos dependen de la indicación clı́nica. Se cree que,
tales como la capacidad de producción en escala, el rendimiento, la para algunas enfermedades como la deficiencia de adenosina
rentabilidad y la estabilidad del producto. desaminasa (ADA) o la hemofilia tipo A o tipo B, es necesaria
La mayorı́a de los vectores para terapia génica se han producido una expresión génica prolongada de bajo nivel. La expresión breve
sólo en partidas relativamente pequeñas para satisfacer las de alto nivel puede ser más apropiada para el cáncer, cuando se
necesidades de los primeros ensayos clı́nicos en pocos pacientes. emplean genes que inducen la apoptosis o para enfermedades
Sin embargo, se ha avanzado rápidamente en la producción de cardiovasculares donde la prevención de la hiperproliferación de
vectores a gran escala, la purificación de vectores y las técnicas células musculares lisas puede impedir la reestenosis de injertos de
analı́ticas apropiadas. En esta sección se analizan aspectos vena safena.
Tabla 5. Tipos de Vectores Génicos
INACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO blanco que son susceptibles pueden ser transducidas eficientemente
con una dosis significativamente inferior a la necesaria para células
Los vectores retrovirales también están sujetos a otro mecanismo que no son blanco.
de defensa del anfitrión—el complemento del sistema inmunitario. Los vectores no virales normalmente se diseñan como sistemas no
Se ha comprobado que los vectores retrovirales son rápidamente replicantes, pero algunos grupos están realizando experimentos con
inactivados por el complemento en sueros de primates, pero no de plásmidos no virales replicantes para aumentar los niveles de
mamı́feros inferiores. Al considerar el ciclo de replicación de los expresión génica, dada la baja eficiencia de transducción de la
retrovirus, se sabe que los epı́topos de glucosilación son extraı́dos de mayorı́a de los sistemas no virales, y para incrementar la duración de
la célula del anfitrión durante el proceso de gemación. Muchos la expresión génica. Se necesitan más estudios preclı́nicos para
vectores retrovirales utilizados en terapia génica son de origen establecer la seguridad de estos sistemas. Asimismo, se han diseñado
murino y se han desarrollado en lı́neas celulares de empaquetamiento cromosomas artificiales para aprovechar los mecanismos normales a
de ratón que le confieren al retrovirus envolturas que contienen fin de conservar la expresión génica en células tratadas que están en
glucoproteı́nas de ratón. Cuando se desarrollan vectores retrovirales división rápida.
en células humanas, son sustancialmente más resistentes al
complemento humano. Es razonable suponer que el mecanismo de
resistencia implica la incorporación de proteı́nas naturales de control INTEGRACIÓN DEL VECTOR
del complemento a las membranas de células humanas, que han sido
incorporadas en la envoltura del vector durante la etapa de gemación La duración de la expresión génica también es una función de la
en el ensamblaje de partı́culas. estabilidad del genoma del vector. Los vectores retrovirales pueden
integrarse de manera estable al genoma de las células anfitrionas.
Los adenovirus no se integran, porque su ADN permanece episomal.
LOCALIZACIÓN DEL VECTOR DENTRO DE LA CÉLULA BLANCO Los vectores de virus adenoasociados (VAA) recombinantes se
integran, pero como los genes rep responsables de la integración
Una vez que el vector llega a la célula blanco, varios factores especı́fica de sitio suelen ser excluidos de la construcción para
pueden alterar la magnitud y la duración de la expresión génica aumentar la capacidad de empaquetamiento del vector, la integración
terapéutica; estos factores rigen la elección de un sistema apropiado no es especı́fica de sitio, como ocurre en el caso del VAA salvaje. El
de vectores para una indicación clı́nica especı́fica. La localización ADN de plásmidos no virales no se integra eficientemente. Sin
del genoma del vector dentro de la célula, la fuerza de los elementos embargo, se han observado episomas estables en ciertos tipos de
de control de la expresión génica, la estabilidad del mensaje y la células, como las musculares. La integración especı́fica de sitio
estabilidad de la proteı́na traducida influirán en el efecto terapéutico. puede ser una caracterı́stica conveniente en vectores destinados a
Los vectores basados en Alfavirus, como los que provienen del virus corregir trastornos genéticos. El control del sitio de integración es
Sindbis o el virus del bosque Semliki, residen en el citoplasma y conveniente para prevenir la mutagénesis por inserción, aunque en la
normalmente presentan un nivel muy alto de expresión génica. Los actualidad, esto no es posible. La mutagénesis por inserción posee el
vectores retrovirales, adenovirales o de otros virus otorgan ventajas potencial de matar una célula si un gen de funcionamiento crı́tico se
en la liberación génica, con sus mecanismos naturales para la inactiva, o de predisponer la célula a una transformació maligna si un
distribución nuclear del gen terapéutico y niveles razonables de gen supresor de tumores está inactivado.
expresión génica a partir de promotores virales o de otro tipo. Los El éxito de cualquier producto génico depende de la relación entre
vectores plasmı́dicos no virales son episomales y, con frecuencia, el sistema de liberación del vector y los requisitos de aplicación de la
susceptibles a la degradación del ADN cuando se introducen en los enfermedad, en relación al lugar, el nivel y la duración de la
endosomas celulares. Sin embargo, algunos sistemas no virales expresión génica terapéutica. Es improbable que algún dı́a exista un
incorporan señales que los dirigen hacia el núcleo con el propósito vector universal; el desafı́o consiste en adaptar el vector a la
de incrementar la eficiencia de la transcripción génica terapéutica. enfermedad.
virus SV40 o la hormona de crecimiento humana. La caracterización adenovirales necesarias para la replicación del VAA cuando hay
y las pruebas de vectores para terapia génica se describen en genes rep y cap (ARN de VA, E1a, E1b, E2a y E4).
Metodologı́as Analı́ticas. 4. Adenovirus Sin Genes Virales ("Gutless")—Los sistemas de
fabricación de estos adenovirus son similares a los utilizados
para vectores de VAA clásicos, pues se realiza la transfección
SISTEMAS DE FUNCIÓN COLABORADORA (HELPER) transitoria de células humanas 293 con un plásmido colabo-
rador que posee las funciones adenovirales requeridas.
A menudo, los vectores virales recombinantes se modifican para
que tengan una replicación defectuosa, una condición creada por
deleción o modificación de los genes virales necesarios para la VECTORES DE TERAPIA GÉNICA VIRAL
replicación y la producción del virus infeccioso. Como resultado,
estos vectores requieren ayuda para producir partı́culas de vectores Los retrovirus y adenovirus se han desarrollado clásicamente a
infecciosos. Las funciones colaboradoras se suelen proporcionar escala de laboratorio utilizando métodos de cultivo tradicionales para
mediante lı́neas celulares empaquetadoras que aportan el elemento lı́neas de células dependientes de suero y de anclaje, empleando
viral necesario desde una fuente externa al gen de interés (en trans). frascos, bandejas y botellas tipo roller. Inicialmente, los vectores de
Las lı́neas celulares empaquetadoras se deben diseñar para minimizar terapia génica se producı́an con estos métodos exactos porque no se
el riesgo de producción de VCR por recombinación entre el vector y necesitaban grandes volúmenes del producto para los primeros
los elementos de envoltura. estudios clı́nicos. Los sistemas de bancos de células se emplean
Los plásmidos que codifican los elementos necesarios se como fuente de células y los bancos de virus, como fuente de virus
introducen en la célula empaquetadora con métodos estándar, para la producción clı́nica. En la mayorı́a de los casos, el
como la transfección mediada por fosfato de calcio o electropora- sobrenadante se recolecta, clarifica y congela y se almacena en
ción. Si se necesitan múltiples elementos que actúan en trans, se los bolsas a –708. En muchos de los primeros estudios clı́nicos, se
introduce en plásmidos separados para incrementar la cantidad de utilizaron sobrenadantes no purificados para transferencia génica ex
episodios de recombinación requeridos para formar un genoma viral vivo.
salvaje y, ası́, disminuir la frecuencia del episodio. Otro enfoque para Recientemente, se han comunicado métodos de producción en
eliminar la producción de VCR es suprimir las secuencias comunes etapas iniciales a gran escala, que incluyen métodos de cultivo en
entre los plásmidos de células empaquetadoras y el vector de terapia suspensión, en biorreactor y en lecho fijo o microtransportador.
génica. Algunos grupos han informado que adaptan sus células de proceso a
Se deben seleccionar lı́neas celulares empaquetadoras estables y condiciones de cultivo sin suero. Las células se cosechan y lisan o se
preparar MCB (bancos de células maestras) clonales. En los sistemas recolecta el sobrenadante. La cosecha se clarifica y purifica para
de producción de vectores retrovirales, normalmente se incorpora eliminar desechos de las células anfitrionas, ADN de las células
permanentemente la forma proviral del vector retroviral en la célula anfitrionas y otros contaminantes derivados del proceso.
empaquetadora, lo que genera la lı́nea celular productora. Una lı́nea Tradicionalmente, los virus se purifican por ultracentrifugación de
de banco estable productor de células empaquetadoras determina una gradiente, pero es un método que exige mucho tiempo y no es
producción homogénea y el control de agentes contaminantes adecuado para la producción a gran escala. La selección de pasos en
extraños. Como alternativa, el sistema puede ser transitorio, con los etapas finales del proceso y su secuencia está determinada por la
plásmidos empaquetadores transfectados junto con el vector de naturaleza del virus en sı́ mismo y las etapas iniciales del proceso
terapia génica para cada ronda de producción de vectores. No utilizado para fabricar el virus. A medida que se desarrollan procesos
obstante, un sistema de transfección transitoria es menos eficiente y para fabricar vectores de terapia génica, se informan diferentes pasos
tiene una capacidad limitada de producción en escala. de purificación, como la cromatografı́a de intercambio iónico, la
Los sistemas de función colaboradora tı́picos son: cromatografı́a en celulosa sulfonada, la cromatografı́a de afinidad de
1. Sistemas de Vectores Retrovirales—La lı́nea celular de iones cinc, la cromatografı́a de exclusión por tamaño y el tratamiento
fibroblastos murinos NIH 3T3 ha sido la base de varias lı́neas con ADNasa u otras nucleasas. La producción de VAA y lentivirus se
celulares empaquetadoras. Las funciones gag, pol y env se complica por la necesidad de transfección o cotransfección
pueden colocar en un solo plásmido (PA317) o en plásmidos transitoria del plásmido o del virus colaborador. Hasta ahora, estos
individuales (psi-CRIP). Esto aumenta el número de aconteci- procesos han requerido lı́neas de células que necesitan anclaje, que
mientos recombinantes necesarios para producir un VCR. La son difı́ciles de producir a gran escala. El desarrollo de lı́neas
lı́nea celular 293 del riñón embrionario humano ha sido celulares transfectadas establemente permitirı́a la producción a gran
modificada para ser una lı́nea celular empaquetadora de escala.
retrovirus, porque el uso de una lı́nea celular humana permite
producir un vector retroviral que no es afectado por el sistema
del complemento humano. VECTORES PLASMÍDICOS
2. Sistemas de Vectores Adenovirales—Las células HEK 293 se
utilizan ampliamente para proporcionar la función E1 necesaria Los plásmidos son moléculas de ADN bicatenario circular que
para la replicación adenoviral eficiente, que se elimina de los existen en bacterias, como moléculas extracromosómicas autorrepli-
vectores adenovirales de primera generación. Otras lı́neas cantes. Se han modificado para servir de sistemas de clonación, para
celulares complementarias, como las células A549 modificadas contar con múltiples sitios de reconocimiento por endonucleasas de
por E1 (carcinoma pulmonar humano) y la lı́nea celular restricción para la inserción del transgén clonado y para tener
PER.C6 (retinoblasto embrionario humano) también se han marcadores genéticos seleccionables para identificar las células que
creado para aportar funciones E1 u otras funciones faltantes. portan el vector recombinante. Los vectores no virales basados en
Esta última contiene la región E1 bajo el control de un activador plásmidos se suelen utilizar como sistemas de suministro de genes,
de fosfoglicerato quinasa (PGK, por sus siglas en inglés) y no tanto en terapias génicas in vivo como ex vivo. Están en forma de
posee secuencias adenovirales flanqueantes, a fin de eliminar la ADN desnudo o forman complejos con lı́pidos u otros agentes que
producción de adenovirus competentes para la replicación facilitan la transferencia a través de la membrana celular y la
(ACR). introducción en el núcleo de la célula sin degradación. Una ventaja
3. Sistemas de Vectores de VAA—Clásicamente, utilizan lı́neas de un sistema de vector plasmı́dico es la producción eficiente de
celulares 293 humanas infectadas por adenovirus, transitoria- grandes cantidades del vector, que es fácil de caracterizar y no
mente transfectadas con plásmido colaborador de VAA que implica riesgo de contaminación con el VCR.
contiene los genes rep y cap necesarios para la replicación del Los vectores no virales suelen producirse con un sistema
VAA y la formación de la cápside, respectivamente, y que son bacteriano de Escherichia coli. Los plásmidos son transfectados en
eliminados del vector de VAA. La lı́nea celular HeLa (de Escherichia coli y se selecciona y se expande una colonia bacteriana
carcinoma cervical humano) también se ha empleado como un única apropiada para crear un MCB. Después de volver a seleccionar
sistema de producción transitorio. Recientemente, ambas lı́neas una colonia a partir de una placa bacteriana inoculada a partir del
celulares se han utilizado para establecer lı́neas de células MCB, se aı́sla el ADN del plásmido a partir de los cultivos cuyo
empaquetadoras establemente transfectadas, que expresan los tamaño varı́a entre 1 litro, a escala de laboratorio, y cientos de litros,
genes rep y cap y, en algunos casos, expresan las funciones en fermentadores bacterianos. El ADN plasmı́dico puede ser
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 491
purificado por varios métodos, como la cromatografı́a de afinidad o La naturaleza singular e irremplazable de muchos productos de
de intercambio iónico y los gradientes de densidad de cloruro de terapia celular y génica, muchos de los cuales provienen de un tejido
cesio–bromuro de etidio. Estos últimos no se recomiendan para autólogo o alogénico seleccionado, da lugar a consideraciones
producir material de grado clı́nico. especiales para su fabricación, liberación y administración. Es
fundamental prever y establecer polı́ticas y procedimientos para la
modificación y administración de productos en los casos en que no
VECTORES DE OLIGONUCLEÓTIDOS se pueda cumplir con los criterios de liberación predefinidos. Estos
procedimientos deben incluir un mecanismo de consulta médica para
Los oligonucleótidos antisentido se fabrican con procedimientos evaluar los riesgos y beneficios para los pacientes y suministrar toda
de sı́ntesis quı́mica. En la actualidad, el método de elección es el la documentación referente a cualquier decisión de modificar
método quı́mico de fosforamidita en fase sólida. La sı́ntesis es lineal, especificaciones de producto predefinidas.
más que convergente, y se debe mantener un alto nivel de eficiencia
en cada paso de la sı́ntesis. Esto se logra con excesos molares de
materias primas de alta pureza para impulsar la cinética de reacción Preparación In Situ
hacia la completitud. La fabricación de oligonucleótidos sintéticos
puede requerir cantidades de nucleósidos de fosforamiditas en
toneladas métricas y otros compuestos tales como reactivos
activadores y reactivos de transferencia de azufre para la fabricación MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS
a escala comercial. Un problema de la fabricación de oligonucleo-
tidos es que durante la preparación de las materias primas y la La preparación de los productos de terapia génica y celular en el
sı́ntesis de oligonucleótidos, se deben tomar precauciones respecto sitio de su utilización y antes de su administración puede involucrar
de la humedad, porque puede causar deterioro en el rendimiento y en una o más manipulaciones. Éstas incluyen:
la pureza. La purificación de oligonucleótidos monocatenarios 1. Cambio en el Envase Final—El producto fabricado puede
requiere eliminar los disolventes residuales y los subproductos de haber sido almacenado o transportado en un envase pero, en
cadena sintética. No obstante, la actual tecnologı́a de fabricación de ciertos casos, es necesario transferirlo a otro recipiente para su
oligonucleótidos es rentable y fácil de producir en gran escala y administración.
genera productos con grados de pureza similares a la de los fármacos 2. Cambio en el Estado Fı́sico o Temperatura—Puede ser
clásicos de pequeñas moléculas. necesario descongelar un producto congelado o entibiar un
producto refrigerado.
3. Cambio en Solución o Suspensión—Algunos productos deben
FORMULACIÓN DE PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA ser disueltos, diluidos o suspendidos en un lı́quido.
4. Combinación con Material Estructural Biocompatible—
Las formulaciones finales para vectores aún están en etapas Algunos productos de terapia celular o génica deben ser
iniciales de desarrollo. Hasta ahora, se han utilizado estabilizadores, combinados con matrices o tejidos estructurales vivos, naturales
como manitol, sacarosa, lı́pidos, polı́meros y albúmina sérica. o sintéticos. La matriz puede estar constituida por materiales
Pueden surgir inconvenientes con el llenado aséptico de grandes como: fibras huecas, láminas fibrosas, geles, tapones, cápsulas,
cantidades de viales si se emplean procesos clásicos de fabricación. esponjas o gránulos.
Por ejemplo, algunos vectores virales son sensibles a la temperatura 5. Mezclado o Preparación Magistral con Otros Materiales No
y se deben almacenar frecuentemente a temperaturas ultrabajas. Se Estructurales—Algunos productos pueden requerir el mez-
está avanzando en la liofilización de vectores virales y no virales y clado o la preparación magistral con fármacos, citokinas,
en el uso de estabilizadores para formulaciones lı́quidas. productos biológicos u otros materiales no estructurales.
6. Filtrado o Lavado—En algunos casos es necesario lavar o
filtrar para eliminar los materiales no deseados en el producto
PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN IN SITU fabricado, como partı́culas, restos celulares, metabolitos o
compuestos restantes de manipulaciones anteriores.
7. Muestreo—Determinados protocolos clı́nicos requieren el
muestreo del producto final inmediatamente antes de la
Consideraciones Generales administración.
liberación o especificaciones fundamentales a los ya exigidos Además de estos pasos, siempre se debe evaluar cuidadosamente
inmediatamente después de la fabricación inicial. Los requisitos la necesidad de anestesia y medicación previa adecuadas antes de
previos a la liberación incluyen: administrar el producto. Por ejemplo, si se preve que el producto
1. la inspección fı́sica del producto, que, por lo general, incluye celular crioconservado descongelado contendrá DMSO, se prescribe
medidas para garantizar que el producto tenga el aspecto al paciente un antihistamı́nico antes de administrar las células con el
adecuado en cuanto a color, turbidez, materia o partı́culas fin de bloquear los efectos colaterales asociados a la liberación de
extrañas, integridad del envase, temperatura del producto, y histamina inducida por el DMSO. El examen del paciente antes de la
etiquetado apropiado y exacto; administración también debe evaluar los tratamientos concomitantes
2. revisión de los registros de los procesos; y, que puedan interactuar con el producto de terapia celular o génica y
3. para productos especı́ficos para un solo paciente, inspección modificar sus efectos. Algunos tratamientos pueden considerarse
administrativa del etiquetado del producto o de los registros auxiliares de la terapia celular o génica, como las citokinas que
relativos a la identidad del receptor previsto. promueven la proliferación o la diferenciación del tejido infundido o
Además, los productos considerados de alto riesgo según la implantado. Se deben analizar otros fármacos frecuentes, como
descripción en Preparación Magistral—Preparaciones Estériles antibióticos, agentes antineoplásicos, anticoagulantes y antiinflama-
h797i deberı́an someterse a pruebas adicionales. Para todos los torios, y determinar sus posibles efectos sobre la eficacia del
productos de alto riesgo, se deben definir y efectuar ensayos de producto de terapia celular o génica.
calidad que contemplen la identidad, la potencia y la pureza de los
principios activos. Los productos de alto riesgo en la categorı́a II se
deben someter a pruebas de esterilidad y de endotoxinas. TRATAMIENTO DEL PACIENTE
Productos de Terapia Génica Basada en Vectores Retrovirales complejo formulado. La formación y la estabilidad del complejo de
Durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios Clı́nicos con terapia génica no viral formulado se establecen mediante estudios de
Vectores Virales de la FDA (octubre de 2000). Esto implica un validación durante el desarrollo del producto.
seguimiento activo durante el primer año y el archivo de muestras de Como se especifica en la normativa CFR, se deben conservar
los pacientes de ahı́ en adelante, si no se detectan RCR inicialmente. muestras del producto después de la prueba de liberación rápida. Si
Los sistemas de bases de datos para ordenar y rastrear resultados se emplean estrategias de liberación rápida, puede ser necesario
del seguimiento de pacientes son fundamentales para manejar esta conservar muestras adicionales para poder reevaluar la calidad del
información. A fin de establecer la seguridad global de la terapia producto con metodologı́as de prueba alternativas o tradicionales, si
génica, se deben considerar los registros nacionales y la publicación fuera necesario.
de datos.
Al igual que todos los métodos analı́ticos empleados para liberar ácidos nucleicos para producir el material inicial (ADN o ARN).
un producto, los ensayos de PCR deben validarse. La validación Esto se puede llevar a cabo mediante estudios de adición (spiking)
debe fundamentar la selección del cebador y las secuencias de la bien diseñados en los que se agregan cantidades conocidas a las
sonda y demostrar la especificidad y la eficacia de los cebadores, y muestras antes y después de la extracción.
también de la sonda cuando se hace la PCR cuantitativa en tiempo Los ensayos de PCR a veces arrojan resultados falsos positivos
real. Los cebadores y las sondas son los principales componentes de debido a la contaminación del equipo o de las muestras durante su
un sistema de detección basado en ácidos nucleicos; por lo tanto, el manejo al preparar el ensayo. La fuente más abundante de ácido
resultado del ensayo depende mucho de la calidad de estos reactivos. nucleico que contamina la secuencia amplificada es el amplicón
La especificidad se demuestra generalmente evaluando el producto generado previamente. Sin embargo, se puede modificar la reacción
resultante de la PCR por electroforesis en gel para confirmar que el por PCR para que el amplicón resultante sea sensible a la digestión
amplicón tiene el tamaño previsto. Asimismo, se debe analizar el por uracil-N-glucosilasa y pueda ser eliminado. Asimismo, suele ser
diseño y la naturaleza de los estándares de cuantificación en los necesario aislar los recintos de preparación de la muestra de otras
ensayos cuantitativos. fases del ensayo y usar un equipo especı́fico para cada fase, con el
La validación también debe comprender la linealidad, la exactitud, propósito de impedir la contaminación con el amplicón de las
la robustez y la reproducibilidad del propio ensayo y de la muestras de prueba y, de esta manera, las señales falsas positivas.
preparación de la muestra, es decir, la extracción del ADN de Los protocolos de ensayos que incluyan controles adecuados, como
muestra para PCR o del ARN de muestra para RT-PCR. Además, controles integrados por secuencias no deseadas y controles sin
debe incorporar una demostración del lı́mite especı́fico de detección ácidos nucleicos, pueden ayudar a determinar la fuente y el sitio de
en el tipo de muestra empleado, porque algunos tipos de muestras contaminación, si la hubiera. La validación debe incluir los
contienen inhibidores de la PCR. La validación también debe procedimientos implementados para prevenir la contaminación.
considerar la reproducibilidad del esquema de obtención de muestras
y la eficiencia de los procedimientos de extracción y purificación de
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Consideraciones para la Obtención de Muestras porcinos, se han descrito ensayos de PCR y RT-PCR para retrovirus
endógeno porcino (PERV, por sus siglas en inglés) que se aplican a
La obtención de muestras para pruebas de liberación de lotes debe células y tejidos del donante. Estas pruebas también se utilizan para
basarse en la posible distribución del parámetro analizado. Ver otras el control de pacientes. Además, se han desarrollado con anticuerpos
consideraciones en Desarrollo de Protocolos de Estabilidad en anti-PERV para monitorear pacientes. Los estudios publicados
Estabilidad. Se deben conservar muestras de cada lote ante la indican que el riesgo de transmisión del PERV a pacientes puede
posibilidad de que surjan problemas de seguridad o calidad con un ser bajo.
lote. Aunque la vida útil del producto sea muy breve, se pueden La vida útil de los productos de terapia celular suele ser más breve
utilizar estas muestras conservadas para detectar impurezas y otras que el tiempo necesario para examinar la esterilidad y detectar
sustancias. Se subraya la necesidad de un buen diseño del esquema agentes adventicios con métodos celulares tradicionales. Sin
de obtención de muestras en la prueba de seguridad de agentes embargo, como ya se ha indicado, el desarrollo de métodos de
adventicios en los productos de terapia génica celular o viral o en la PCR rápidos y validados permite la evaluación y la liberación
evaluación de VCR para productos de terapia génica viral. En estos oportuna. La PCR y el análisis de hibridación del ADN o ARN por
casos, la validación del proceso ayuda a determinar el diseño dot blot permiten detectar micoplasmas y una gama de virus y
apropiado de obtención de muestras estadı́sticamente fundado. bacterias adventicios especı́ficos. La prueba de esterilidad de 14 dı́as
no siempre es una alternativa viable para la liberación final de
productos de terapia celular; en estos casos, pueden resultar
Seguridad adecuados los métodos automáticos basados en la detección
colorimétrica o en el control continuo, si están validados. La
validación de instalaciones y procesos es necesaria para garantizar la
seguridad en cuanto a la esterilidad y micoplasmas, sobre todo
CONSIDERACIONES GENERALES cuando se emplean estrategias de liberación rápida.
Pueden requerirse pruebas adicionales de seguridad cuando se
Las pruebas de seguridad para productos de terapia celular y usan los productos de terapia celular con un fin diferente del que
génica tienen tres objetivos: (1) prevenir el uso inadvertido de tienen las células o tejidos en su estado natural, o cuando se colocan
células, tejidos o agentes de terapia génica contaminados y con en un sitio corporal donde normalmente no ocurre dicha función
riesgo de transmitir enfermedades infecciosas, (2) evitar el uso de estructural. Las pruebas deben estar diseñadas para predecir el
productos mal manejados o procesados y, en consecuencia, comportamiento del producto en estas condiciones y según el
contaminados y (3) garantizar la seguridad cuando se adaptan contexto de uso. Por ejemplo, en el caso de un producto de terapia
terapias celulares y génicas para un uso diferente del de sus celular para pacientes oncológicos, donde se usan células que se
funciones o contextos normales. activan por cultivo sobre una capa de células nodrizas durante el
El principal método para evaluar la seguridad es por medio de procesamiento, puede ser necesario examinar las células del
ensayos biológicos que detectan agentes adventicios de forma producto para detectar la presencia de células nodrizas. Estas células
directa. También se utilizan valoraciones con técnicas de biologı́a residuales en el producto final pueden desencadenar una respuesta
molecular que detectan ADN o ARN de agentes adventicios. inflamatoria. Además, los productos con células nodrizas no
humanas se consideran xenogénicos. Las terapias celulares están
eximidas de las pruebas de seguridad generales.
PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR
Si las células son modificadas por un vector génico viral durante la
fabricación, se debe verificar si hay VCR presentes. Por lo general, la
La transmisión directa de enfermedades infecciosas es un prueba de VCR (ver Productos de Terapia Génica Viral en
problema importante en los productos de terapia celular. El grado Seguridad) está limitada cuando la vida útil exige una liberación
de riesgo depende de diversos factores, por ejemplo, si las células o rápida. Nuevamente, se pueden utilizar métodos de biologı́a
tejidos se usarán en un paciente que no sea la persona de origen; si molecular, como PCR, para la detección sistemática rápida. En
provienen de un banco, fueron transportadas o procesadas en una estos casos, durante el desarrollo del producto, se realizan pruebas
instalación que maneja células y tejidos de múltiples donantes; y que emplean ensayos basados en células (por ejemplo, detección del
cuán extensamente fueron procesadas. El manejo inadecuado puede efecto citopático en lı́neas celulares indicadoras) después de la
alterar la integridad y la función de los productos de terapia celular al liberación para validar el resultado de la prueba de biologı́a
introducir microorganismos o contaminar los productos celulares molecular.
terapéuticos con células de otro donante o paciente durante la
recolección, el procesamiento o el almacenamiento.
Además de efectuar la detección sistemática y las pruebas de PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL
enfermedades transmisibles a los donantes alogénicos de todos los
tejidos viables y no viables que se pretenden emplear como Uno de los problemas principales de seguridad relacionados con
productos de terapia celular, se requiere el etiquetado y el rastreo vectores virales para terapia génica son los VCR. Independiente-
apropiados. Estos requisitos se basan no sólo en el posible riesgo de mente del virus, estos problemas se fundan en que no siempre es
transmisión de enfermedades del donante al receptor, sino también posible prever la patogenicidad de un virus contaminante para una
en: (1) la posible transmisión infrecuente, pero documentada, de un vı́a especı́fica de administración, en especial si no es la vı́a habitual
producto a otro producto (por ejemplo, la contaminación viral entre de infección o si los seres humanos no son el anfitrión habitual para
bolsas rotas en la fase lı́quida de un congelador de nitrógeno lı́quido) el virus.
o (2) la posible administración errónea de un producto al receptor Se conoce la patogenia de la infección por adenovirus salvaje,
equivocado. Los requisitos de detección sistemática y de pruebas pero no siempre es útil para predecir la patogenia por las vı́as de
especı́ficas de los donantes para productos celulares alogénicos se administración de vectores adenovirales recombinantes. En la
basan en los que actualmente se exigen para productos sanguı́neos actualidad, se acepta un lı́mite de un ACR por dosis en vectores
humanos: (1) pruebas especı́ficas para VIH tipo 1, VIH tipo 2, adenovirales; se han establecido otros lı́mites para dosis superiores a
hepatitis B, hepatitis C y sı́filis y (2) detección sistemática de 1 6 109 partı́culas, indicaciones especı́ficas y vı́as de administración
antecedentes médicos que indiquen alto riesgo de sufrir infección por basadas en estudios preclı́nicos de seguridad y de control de
VIH, hepatitis B, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y tuberculosis. pacientes durante el desarrollo clı́nico. Se han informado lı́mites de
También se aconsejan, pero no se exigen, algunas de estas pruebas y hasta varios miles de ACR por dosis. Tı́picamente, los niveles de
detecciones sistemáticas para tejidos autólogos. ACR se determinan mediante un ensayo celular que permite la
Aún se desconoce el riesgo de infección entre diferentes especies amplificación del ACR y, al mismo tiempo, impide la replicación del
durante el xenotransplante. Es difı́cil evaluar el riesgo de infección producto. La lı́nea celular recomendada para amplificar y detectar
por un nuevo agente transmisible. Se deben desarrollar ensayos de ACR es la A549. Sin embargo, algunos vectores adenovirales
cocultivo in vitro que incluyan lı́neas celulares indicadoras humanas recombinantes expresan genes terapéuticos que interfieren en el
sensibles para las especies donantes. En particular, se necesita un análisis con células A549. En estos casos, se emplea una valoración
ensayo de retrovirus endógenos (ERV, por sus siglas en inglés) biológica con dos lı́neas celulares: la primera de ellas se selecciona
presentes en las células o tejidos xenogénicos. Para células y tejidos por su resistencia a los efectos de la expresión del gen terapéutico de
496 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
interés y luego se realiza pasaje del lisado celular a las células A549 No están especificadas las metodologı́as para detectar RCR en
para amplificar y detectar el ACR. El ACR se suele detectar por productos de vectores sin elaborar, a granel, purificados o finales. La
observación visual del efecto citopático, pero también se puede FDA ha presentado a la ATCC un estándar de referencia de un VLM
detectar en cultivo de células A549 mediante métodos de PCR o hı́brido anfotrópico. A este depósito viral se le ha asignado un tı́tulo
inmunológicos. La cuantificación de ACR se basa en la cantidad de de marcación, que debe emplearse en la validación del ensayo. La
la muestra probada y el lı́mite de detección de la valoración. validación debe demostrar la capacidad de detectar, de manera
Tı́picamente, las valoraciones biológicas de ACR se validan si son reproducible, una única partı́cula de RCR en tipos individuales de
capaces de detectar 1 unidad formadora de placa o unidad infecciosa productos, porque el producto y sus impurezas pueden interferir en la
de ACR en la muestra de prueba sobre una amplia gama de tamaños detección del RCR. En la actualidad, no hay lı́mites aceptables para
de muestras. Los tamaños de las muestras pueden variar de 1 6 108 a la contaminación de productos con RCR. No se pueden usar en
1 6 1012 partı́culas, pero en general, se basan en el tamaño de la humanos lotes de productos que contengan RCR.
dosis clı́nica. Para verificar los lı́mites de detección, deberı́an No se han desarrollado estándares de referencia para evaluar VCR
incorporarse controles con cantidades agregadas conocidas a la en otros vectores virales, como el VLM ecotrópico, xenotrópico o
prueba, aun con valoraciones validadas. Para adenovirus recombi- seudotipado, adenovirus y lentivirus. La amplificación y detección
nantes producidos con células 293, la detección de ACR por PCR de VIH competente para la replicación, especialmente en sus
puede alterarse por la detección de ADN de células anfitrionas 293 variantes seudotipadas, pueden justificar procedimientos de conten-
residuales (detección de la región E1). Sin embargo, las valoraciones ción y manejo especı́ficos.
por PCR se pueden diseñar para cuantificar especı́ficamente la Otras pruebas de seguridad suelen centrarse en métodos similares
contaminación del ADN de células anfitrionas y hacerlas especı́ficas a los descritos en Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a h1045i, en
para formas particulares de ACR de crecimiento lento. Las ensayos Pruebas de Seguridad—Productos Biológicos en Pruebas de
cuantitativos por PCR se pueden utilizar junto con un método basado Reactividad Biológica, In Vivo h88i y en Pruebas de Esterilidad
en células para cuantificar los ACR de manera precisa. Cuando se h71i. Para terapias génicas virales producidas con una lı́nea celular
detecta una muestra de prueba positiva, la identidad del ACR suele humana, se recomiendan las valoraciones biológicas con agentes
confirmarse mediante un análisis por PCR. Esto descarta la adventicios in vitro utilizando 3 lı́neas celulares en el producto a
posibilidad de que la contaminación del ensayo con adenovirus granel o final. En vectores adenovirales, también se recomiendan
salvajes exógenos u otros agentes adventicios sea responsable del pruebas especı́ficas de virus adeno-asociados en el producto a granel
resultado positivo. o final. Para los virus adeno-asociados, se recomiendan pruebas
Para vectores retrovirales, se exige una prueba de RCR en bancos especı́ficas de adenovirus y virus herpes en el producto a granel o
de células, lotes de producción de vectores virales y cualquier lote de final.
productos ex vivo resultante (ver la Guı́a para la Industria: Guı́a
Complementaria de Pruebas para Retrovirus Competente para la
Replicación en Productos de Terapia Génica basada en Vectores PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL
Retrovirales durante el Seguimiento de Pacientes en Estudios
Clı́nicos con Vectores Virales de la FDA, octubre de 2000). Se han Las pruebas de seguridad suelen basarse en métodos similares a
desarrollado ensayos estándar para detectar el virus de la leucemia los descritos en Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a h1045i, en
murina (VLM) competente para la replicación. No se conoce la Pruebas de Seguridad—Productos Biológicos en Pruebas de
patogenia y la toxicidad potencial a largo plazo del VLM anfotrópico Reactividad Biológica, In Vivo h88i y en Pruebas de Esterilidad
de bajo nivel en seres humanos. Los métodos habituales para h71i. Sin embargo, no se exige la prueba de Seguridad General para
detectar RCR incluyen una amplificación del tı́tulo viral aplicando productos plasmı́dicos de ADN terapéuticos (aun si están formula-
producto a una lı́nea celular que puede replicarse, como Mus dunni. dos). Las pruebas de seguridad deberı́an realizarse en material
Como la infección está limitada por la capacidad de un virus de formulado no viral. Si la vida útil de la terapia no viral formulada es
llegar a las células a través del movimiento browniano, se pueden muy corta, entonces deberı́an examinarse los componentes por
usar procedimientos (por ejemplo, centrifugación y filtración) que separado.
pongan al virus en contacto con las células a fin de mejorar la
detección. Sin embargo, los tı́tulos elevados de vector recombinante
pueden interferir con la detección de RCR de bajo nivel y dichos Ensayos para Determinación de Dosis
métodos pueden aumentar esta interferencia. Se realizan varios
pasajes de células infectadas para permitir la replicación viral. El
medio de cultivo se cosecha al final del perı́odo de cultivo y se
detecta RCR mediante una lı́nea celular indicadora. Si el producto es CONSIDERACIONES GENERALES
un VLM anfotrópico, se puede hallar RCR con un ensayo de PG4
S+L– basado en células felinas, un ensayo MiCl S+L– basado en Un ensayo que mide, con precisión, la cantidad de producto se
células de visón o un ensayo de rescate con marcadores. En los denomina ensayo de determinación de dosis y se selecciona sobre la
ensayos S+L–, el RCR expresa proteı́nas que conducen a la base de su precisión y exactitud. Un ensayo que mide la actividad
transformación y la posterior formación de placas en la monocapa. terapéutica de un producto recibe el nombre de valoración de
En un ensayo de rescate con marcadores, el RCR infecta una lı́nea potencia y se diseña para medir la función del producto. El diseño
celular que expresa un vector retroviral que codifica un gen del ensayo depende del tipo de producto. En el caso de
marcador, como la b-galactosidasa, resistencia a fármacos o una medicamentos, los ensayos que determinan la cantidad de fármaco
proteı́na fluorescente. El vector es empaquetado por las proteı́nas que (dosis) se llaman valoraciones de contenido.
le son suministradas en trans por el RCR. El sobrenadante La dosis del producto se puede definir como la concentración o la
potencialmente cargado con vectores es transferido a células cantidad de producto farmacéutico administrado al paciente y, por lo
blanco vı́rgenes que luego se someten a una detección sistemática general, se mide en masa de producto. En los productos de terapia
para hallar la expresión del vector marcador. celular y génica, se suelen emplear atributos, como el número de
La prueba de RCR se lleva a cabo mediante el cocultivo de la células viables, miligramos de plásmido u oligonucleótido anti-
lı́nea celular o la amplificación del sobrenadante del vector con una sentido, o número de partı́culas virales para definir la dosis del
lı́nea celular de RCR permisiva para replicación, generalmente Mus producto.
dunni, durante varios pasajes. El medio de cultivo se cosecha al final
de este proceso de cocultivo y se aplica a una lı́nea de células
indicadoras apropiada, como se ha descrito anteriormente. Es
importante señalar que se pueden generar artefactos durante el PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR
ensayo de cocultivo por la expresión de un virus endógeno en la Los productos de terapia celular se pueden dosificar sobre la base
lı́nea de células permisivas o mediante fusión, si la lı́nea de células de la enumeración de una población de células o más. Para la terapia
productoras del vector se cultiva directamente con una lı́nea de génica ex vivo, la dosis puede basarse en el número de células y
células de rescate con marcadores. Además, puede no ser posible el también en el nivel de expresión del producto génico. Cuando el
cocultivo de productos celulares ex vivo que exigen condiciones de producto está en una suspensión homogénea de célula única, el
cultivo especı́ficas o tienen una vida en cultivo limitada. ensayo más utilizado es el número de células viables. Estos ensayos
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 497
pueden incluir la enumeración de todas las células, células nucleadas estimar simultáneamente la concentración viral a partir de múltiples
totales u otro subgrupo celular. Los ensayos de viabilidad, por lo proteı́nas estructurales, lo que permite utilizar esta valoración en
general, se basan en la capacidad de una célula de excluir un preparados de virus relativamente impuros. Este método se ha
colorante vital, como el azul tripano. Los resultados se expresan en aplicado a adenovirus y deberı́a ser aplicable a otros tipos de
número de células que excluyen el colorante y que, por lo tanto, se vectores virales.
consideran viables. El compuesto 7-AAD, una sustancia fluorescente Los métodos biofı́sicos para determinar el número de partı́culas
roja que se une a proteı́nas nucleares y también es excluido por incluyen la cuantificación directa de ácidos nucleicos del vector por
células viables, puede ser incorporado en los métodos de citometrı́a hibridación con sonda radiomarcada y la cuantificación indirecta por
de flujo para la determinación simultánea de viabilidad y marcadores amplificación de un molde de ácido nucleico (por ejemplo, PCR y
de identidad celular. RT-PCR) o por amplificación de señales (por ejemplo, ADN de
El recuento celular puede llevarse a cabo rápidamente con cadena ramificada, empleando hibridación con sondas múltiples).
métodos manuales o automatizados. El recuento manual por Cuando no se dispone de métodos biofı́sicos, se recurre
enumeración visual de células en una cámara hematocitométrica es valoraciones biológicas que miden el tı́tulo del gen-vector. Estas
una técnica fácil, de exactitud aceptable, pero de menor precisión incluyen infección, transfección o transducción de una lı́nea de
que la mayorı́a de los métodos automatizados. Los instrumentos células susceptible in vitro, seguida de alguna medición de la
habituales para el recuento celular automático proporcionan una captación del producto. Los métodos para cuantificar o estimar el
enumeración reproducible de células no nucleadas (por ejemplo, número de episodios de infección, transfección o transducción
eritrocitos y plaquetas) y de células nucleadas y un recuento incluyen valoraciones de unidades formadoras de placa, valoraciones
diferencial en poblaciones de leucocitos mononucleares y polimor- de dosis infecciosa en cultivo de tejidos, determinaciones de TCID50
fonucleares. Una discriminación mayor de poblaciones celulares (dosis infectiva 50 del cultivo tisular), basadas en efectos citopáticos
especı́ficas, por lo general, requiere el análisis de fenotipos de o detección inmunofluorescente de una proteı́na expresada del vector
superficie celular por citometrı́a de flujo u otros métodos (ver o un ensayo cuantitativo de hibridación de ADN. Los ejemplos son
Productos de Terapia Celular en Identidad). La proporción de una los siguientes.
subpoblación celular especı́fica puede determinarse por FACS o por En productos de terapia génica retroviral o lentiviral o VAA que
citometrı́a de flujo. portan un marcador selectivo (por ejemplo, para resistencia a
Un ejemplo de un ensayo de enumeración celular es la neomicina) o un gen indicador (por ejemplo, b-galactosidasa),
enumeración de células progenitoras hematopoyéticas positivas además del gen terapéutico, el tı́tulo infeccioso se suele determinar
para CD34 (CD34+), en la cual el número se expresa como midiendo el número de células transducidas o infectadas que
número de células por peso corporal del receptor. En numerosos expresan estas proteı́nas no terapéuticas. Por lo general, el tı́tulo del
estudios, se ha demostrado que esta medición predice la reconstitu- vector se expresa como el número de unidades formadoras de
ción hematológica después de la terapia mielosupresora o la colonias (ufc) por mL para células transducidas con vectores virales
ablación, en el transplante hematopoyético autólogo o alogénico. que contengan marcadores de resistencia a fármacos y seleccionadas
En el caso de productos celulares en una suspensión no para crecer en un medio que contenga el fármaco. El tı́tulo basado en
homogénea, con células que forman una estructura bi o tridimen- b-galactosidasa se puede expresar como unidades formadoras de
sional, se han utilizado mediciones alternativas para la enumeración, colonias azules (ufc) por mL, después de teñir y contar las células
como el área total de una capa de células, el peso húmedo, las que convierten el sustrato X-Gal de la b-galactosidasa en un
proteı́nas totales y el ADN total. Si se emplean estas medidas para cromóforo azul. Para vectores sin un gen marcador, la transducción
determinar la dosis del producto, se deben llevar a cabo pruebas se ha medido con precisión mediante la PCR cuantitativa.
complementarias que demuestren la actividad terapéutica. La mayorı́a de los productos de terapia génica no viral contiene
ADN plasmı́dico y su medida habitual de dosis es la masa de ADN.
Ésta se puede determinar en el estado formulado y, si se incluye
PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL Y NO VIRAL proteı́na recombinante en la formulación, se puede emplear la masa
combinada total de todos los componentes, basada en un cociente
La concentración de partı́culas es una medida habitual de la dosis especı́fico. La medición por densidad óptica a 260 nm es la manera
de productos de vectores virales. Se puede medir con ensayos más simple de calcular concentraciones de ADN superiores a 500 ng
fı́sicos, biofı́sicos o celulares in vitro. Por ejemplo, es posible por mL. Este método, por lo general, no se puede aplicar al ADN en
cuantificar las partı́culas adenovirales purificadas empleando la formulación lipı́dica. Como el ARN y las proteı́nas también tienen
densidad óptica de una solución viral en solución de dodecil sulfato absorbancias significativas a 260 nm, se deben efectuar otros análisis
de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) al 0,1% (p/v), a 260 nm, para demostrar que hay una contaminación mı́nima con ARN,
porque se ha publicado una relación entre la absorción y la proteı́nas o ADN cromosómico residual de células anfitrionas. Los
concentración de partı́culas de adenovirus. La concentración de colorantes que se unen especı́ficamente al ADN bicatenario permiten
partı́culas es equivalente al producto de la absorbancia a 260 nm en medir con exactitud concentraciones de ADN inferiores a 500 ng por
una celda de 1 cm, el factor de dilución y 1,1 6 1012 partı́culas.2 mL, cuando se calculan con respecto a una curva estándar de ADN
Entre otros métodos para calcular la concentración de partı́culas se autenticada. PicoGreen es uno de estos colorantes fluorescentes y el
encuentra el recuento por microscopı́a electrónica y la integración ADN monocatenario, el ARN, las proteı́nas, las sales y los
del área del pico viral, en comparación con un estándar de referencia detergentes influyen muy poco sobre él. El colorante fluorescente
autenticado, en una valoración de cromatografı́a lı́quida de alta Hoechst 33258 también se une al ADN bicatenario y monocatenario
resolución (HPLC) basada en resina de intercambio aniónico. y puede ser útil para determinar concentraciones de ADN de tan sólo
La concentración viral también se puede estimar midiendo 0,3 ng por mL. No se une a proteı́nas o ARN, y permite determinar
proteı́nas estructurales seleccionadas con masas moleculares y con exactitud las concentraciones de ADN en muestras impuras.
cantidades de copias conocidas dentro del virión. En este método, Asimismo, es posible recurrir a métodos como electroforesis
es necesario lisar el virus y separar las proteı́nas estructurales con un capilar, que emplean un material de referencia autenticado, para
procedimiento cromatográfico de alta recuperación apropiado (por determinar la concentración de productos no virales o de
ejemplo, HPLC en fase reversa). La separación cromatográfica y la oligonucleótidos antisentido.
identidad y la pureza de la proteı́na estructural seleccionada deben
verificarse durante la validación de la valoración con métodos, como
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), Potencia
secuenciación de péptidos y espectroscopı́a de masas. Las proteı́nas
estructurales seleccionadas deben ser cuantificadas, por ejemplo, CONSIDERACIONES GENERALES
integrando los picos cromatográficos a 214 nm y comparando el área
con un estándar de referencia autenticado. Luego se puede calcular la La potencia se define como la actividad terapéutica del producto
concentración viral sobre la base de la masa molecular, el número de farmacéutico. Junto con la dosis, la potencia define la actividad
copias y la masa medida de proteı́na. Cabe señalar que es posible biológica de cada lote (ver Consideraciones Generales en Ensayos
2
De Points to Consider for Human and Somatic Cell and Gene Therapy para Determinación de Dosis). La potencia se puede evaluar con
(Puntos a Tener en Cuenta para la Terapia Génica y Celular Somática y valoraciones biológicas in vitro o in vivo. Es común que estas
Humana) del CBER, abril de 1998 valoraciones tengan coeficientes de variación entre 30% y 50%.
498 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
Estas valoraciones requieren un material de referencia representa- Las pruebas in vivo también se pueden usar para medir la potencia
tivo, bien definido, que se pueda utilizar como control positivo. El del producto del vector. Las lecturas se pueden basar en una
control positivo sirve para calificar el rendimiento de una valoración respuesta por animal (por ejemplo, los niveles sanguı́neos de la
individual. El desarrollo de las valoraciones de potencia debe proteı́na terapéutica a las 24 horas del tratamiento) o una tasa de
centrarse en la caracterización y control de la variabilidad. Los respuesta grupal (por ejemplo, el porcentaje de animales que obtuvo
ensayos de alta precisión son herramientas más eficaces para una respuesta inmunitaria o sobrevivió al desafı́o del virus). La
controlar la calidad del producto. Se debe incluir información sobre disponibilidad de un sistema de pruebas in vivo apropiado depen-
la variabilidad de la valoración de potencia en el diseño del estudio derá del intervalo vector-anfitrión (para vectores virales), la
de estabilidad y sobre el enfoque estadı́stico propuesto para asignar farmacocinética y la distribución biológica del vector y su producto
la fecha de caducidad (ver Estabilidad). génico resultante comparado con su equivalente humano y del
tiempo necesario para observar el efecto terapéutico o el efecto
indirecto. Factores como el costo, las instalaciones, la validación y la
PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR ética determinarán si una prueba de potencia in vivo resulta práctica.
necesario un ELISA cuantitativo para proteı́nas séricas residuales. Si PAGE (electroforesis en gel de polacrilamida con dodecil sulfato de
las células son modificadas genéticamente durante la fabricación, se sodio), secuenciación de péptidos o espectroscopı́a de masas. Es
deben realizar pruebas para detectar el vector residual. posible identificar genéticamente la partida mediante la cuantifica-
En terapias celulares con modificaciones génicas, la determinación ción de las proteı́nas estructurales seleccionadas y su comparación
de la pureza del producto depende de la disponibilidad de reactivos y con un estándar de referencia. Cuando el método incluye la
métodos para distinguir células terapéuticas de otras células en el espectroscopı́a de masas, también se pueden detectar impurezas,
producto. Al igual que en los productos de terapia génica, es posible como las variantes estructurales. Se pueden monitorear algunos
distinguir células con modificaciones génicas de células no precursores y la mayorı́a de las proteı́nas viriónicas maduras en
modificadas a partir de la expresión del transgén. El FACS, que preparaciones adenovirales; de esta manera, es posible controlar el
emplea un anticuerpo que detecta la proteı́na terapéutica o sondas producto y las formas viriónicas inmaduras.
fluorescentes que detectan el ARN expresado, permiten separar y Las proteı́nas derivadas de células anfitrionas se pueden
cuantificar las células que expresan el transgén de las que no lo considerar impurezas en algunos productos de vectores virales y se
expresan. Al agregar un anticuerpo a un marcador fenotı́pico las puede separar y cuantificar por PAGE o HPLC o detectar por
especı́fico para una población de células o emplear una técnica de análisis de aminoácidos, Western blot o ensayos inmunológicos. Sin
doble clasificación, se puede utilizar el FACS para identificar la embargo, para virus con envoltura, como los retrovirus, las proteı́nas
subpoblación celular modificada. de membrana derivadas de células anfitrionas son una parte integral
Asimismo, se requieren pruebas de endotoxinas. También se debe del producto. En esos sistemas de vectores, puede ser difı́cil
analizar la biocompatibilidad de los biomateriales utilizados en determinar la presencia de proteı́nas exógenas contaminantes
productos de terapia celular. provenientes del anfitrión.
El proceso de fabricación y purificación de cada tipo de vector o
producto determina si habrá impurezas especı́ficas relacionadas. No
PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL obstante, la mayorı́a de los productos deberán ser analizados para
detectar endotoxinas residuales (ver Prueba de Endotoxinas
En vectores virales, las impurezas relacionadas con el producto Bacterianas h85i). Se han establecido lı́mites aceptables de
incluyen agregados y partı́culas defectuosas e inmaduras que se endotoxinas, que se pueden aplicar directamente a productos de
pueden generar durante la fabricación o purificación del vector vectores virales.
recombinante. Los agregados se pueden formar si el producto es- Históricamente, se ha considerado que el ADN genómico
tá muy concentrado, se almacena en determinadas condiciones (por proveniente de sustratos celulares continuos empleados para fabricar
ej., a cierto pH o temperatura) o se reconstituye después de la productos biológicos era potencialmente tumorı́geno, pero estudios
liofilización. Los ensayos para detectar agregados incluyen el recientes sugieren que los riesgos son muy bajos. Sin embargo,
análisis del tamaño de las partı́culas por un método de dispersión durante el desarrollo del proceso, deberı́a intentarse reducir los
de luz láser y PAGE no desnaturalizante y no reductora, seguida de niveles de ADN contaminantes. Se deberı́a evaluar, de manera
tinción del gel o transferencia y detección de proteı́nas virales por individual, si es necesario buscar ADN residual como parte de la
Western blot. El análisis de velocidad de sedimentación también liberación del lote de productos, lo cual puede depender de la
permite separar agregados de monómeros según el tamaño. Los distribución del tamaño del ADN, su asociación con el producto o
análisis de densidad óptica de dispersión de luz se emplean para sus componentes de formulación y la vı́a de administración. Se han
evaluar el agregado de vectores. desarrollado cuantitativas por PCR cuantitativas para determinar la
Las partı́culas defectuosas son partı́culas virales sin el genoma cantidad de ADN residual de células anfitrionas utilizando cebadores
recombinante apropiado, es decir, contienen algún otro ácido diseñados para amplificar secuencias abundantes y conservadas
nucleico o no contienen ningún genoma o el vector contiene algún evolutivamente, como 18S para células 293.
componente estructural defectuoso o alterado de alguna otra manera Los componentes séricos residuales como la albúmina sérica
que disminuye su capacidad de transducir una célula. En sistemas de bovina (ASB) se pueden cuantificar con ELISA y un estándar de
vectores virales con simetrı́a capsomérica, que requiere la incorpora- referencia de ASB. Tal vez sea necesario desarrollar métodos
ción apropiada de ácido nucleico para la configuración, es posible funcionales o inmunológicos especı́ficos para otros productos
distinguir con facilidad las partı́culas vacı́as de las que portan auxiliares, que incluyan otros medios de cultivo o componentes
genomas. Es probable que no se puedan separar tan fácilmente las del proceso de purificación, como citokinas o enzimas (por ejemplo,
partı́culas vacı́as de aquellas con ácido nucleico encapsidado en nucleasas, tales como la ADNasa I o la nucleasa benzon).
virus con envoltura.
La HPLC analı́tica es útil para separar partı́culas virales activas de
las defectuosas en algunos productos de vectores virales. Se han PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL
empleado resinas de intercambio aniónico para separar el adenovirus
activo de partı́culas virales defectuosas. Sin embargo, este método Por lo general, las pruebas se llevan a cabo en los componentes
podrı́a no ser útil para un vector adenoviral purificado por individuales, el ADN plasmı́dico, los componentes lipı́dicos o
cromatografı́a de intercambio aniónico, a menos que la resina del lipoplex y los componentes proteicos (recombinantes) de la
ensayo sea diferente de la utilizada durante la fabricación. Según la formulación. El ADN plasmı́dico se caracteriza para determinar la
naturaleza del vector viral y sus formas no activas o defectuosas, se presencia de diversas impurezas, como ADN residual de células
pueden necesitar otros métodos de separación, como la centrifuga- anfitrionas, ARN residual y proteı́nas residuales. Las pruebas de
ción de equilibrio en un gradiente de densidad con cloruro de cesio proteı́nas residuales se suelen incluir en las pruebas de liberación de
antes de cuantificar la partı́cula activa. Idealmente, el método de lotes. En las especificaciones de pureza para ADN plasmı́dico se
separación permite la cuantificación. suelen usar los cocientes de densidad óptica, generalmente el
Las partı́culas defectuosas que portan un gen oncogénico no cociente entre la medición a 260 nm y a 280 nm.
celular u otros genes no deseados pueden plantear un problema Además, el ADN plasmı́dico también deberı́a caracterizarse de
especial. Por ejemplo, en lı́neas de células murinas que aportan la acuerdo con su conformación: monomérica superenrollada, mono-
envoltura al retrovirus, se pueden empaquetar pequeños elementos mérica relajada y lineal. Para lograr la uniformidad del producto, se
virales, llamados secuencias VL30, en aproximadamente un tercio de deben controlar sus caracterı́sticas de conformación. Además, es
las partı́culas. Si la presencia de partı́culas defectuosas especı́ficas es posible que la conformación guarde relación con la capacidad de
suficiente para generar un problema de seguridad, puede ser transfección in vivo. Se ha determinado que el plásmido super-
necesario desarrollar valoraciones para cuantificarlas. enrollado monomérico es más eficiente que las conformaciones
La calidad del virus y la comparabilidad de las preparaciones relajada, lineal o multimérica para transfectar lı́neas celulares in
también se pueden evaluar midiendo proteı́nas estructurales vitro, pero se ha comprobado que la transfección in vitro no siempre
seleccionadas con masas moleculares y números de copias predice el comportamiento in vivo. La formulación, el método de
conocidos dentro del virión. Con este método, se lisa el virus y se distribución y la vı́a pueden influir en la transfección in vivo. La
separan las proteı́nas estructurales mediante HPLC en fase reversa o electroforesis en gel de agarosa puede separar estas formas que luego
algún otro procedimiento cromatográfico de alta recuperación. Se se detectan por UV mediante tinción con bromuro de etidio. Este
debe validar la separación cromatográfica y verificar la identidad de método aporta información sobre las proporciones de las distintas
las proteı́nas estructurales seleccionadas con métodos como SDS- formas de plásmidos, pero no es altamente cuantitativo para cada
500 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
especie. Se puede emplear HPLC analı́tica de intercambio aniónico modificado con gen autólogo en una planta donde se fabrican
como análisis cuantitativo para la conformación superenrollada y los múltiples productos para pacientes que para un producto de vector
porcentajes de otras conformaciones, como los concatémeros. Se han viral elaborado en un sitio que fabrica un único producto.
propuesto otros métodos sofisticados, como electroforesis capilar de
zona, dicroı́smo de flujo lineal y microscopı́a de fuerza atómica, para
reemplazar el análisis en gel de agarosa. Hasta que estén validados, PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR
estos métodos analı́ticos pueden ser más apropiados para estudios de
caracterización en pos del desarrollo y la validación del proceso que Las pruebas de identidad deben ser apropiadas para el tipo de
como prueba de liberación de lotes. Los métodos adecuados para la células y las manipulaciones durante el procesamiento. Con
liberación de lotes dependerán de qué efecto tengan estas formas frecuencia, se utilizan marcadores de superficie diferenciales (por
plasmı́dicas alternativas sobre la potencia del producto. Muchos de ejemplo, CD3, CD4, CD34 y CD45) para determinar la identidad del
estos métodos, como la HPLC, también son aplicables a la producto. Las inmunoensayo por citometrı́a de flujo son los métodos
evaluación de la pureza de productos con oligonucleótidos más comunes para detectar y cuantificar estos marcadores. En este
antisentido y la determinación del nivel de subproductos. tipo de ensayo, se colorea una muestra de las células con anticuerpos
También se deben realizar pruebas para detectar impurezas marcados con fluorescencia dirigidos contra marcadores especı́ficos
relacionadas con el proceso, como el cloruro de cesio. En productos de identidad y luego se la hace pasar como una suspensión de células
con oligonucleótidos antisentido, se deben cuantificar los disolventes únicas frente a una fuente de luz láser. La identificación y
residuales. Se deben analizar también los componentes de cuantificación de subgrupos individuales de células se realiza
formulaciones lipı́dicas y lipoplex para determinar su pureza mediante análisis multiparamétrico, por lo general, según el
quı́mica. Las pruebas para impurezas quı́micas especı́ficas común- tamaño y la granularidad (medida por dispersión de luz frontal y
mente se hacen con cromatografı́a de gases –espectroscopı́a de lateral) y de uno o más marcadores de identidad (medidos por
masas (GC–MS), cromatografı́a lı́quida de alta presión (HPLC) o emisión de fluorescencia). La cuantificación simultánea de la
cromatografı́a en capa delgada (TLC). viabilidad celular es posible agregando 7-amino-actinomicina D
Si la proteı́na forma parte del complejo formulado, también se (7-AAD) a suspensiones celulares marcadas con anticuerpos
debe comprobar su pureza. En Artı́culos Obtenidos por Biotecno- conjugados a compuestos fluorescentes verdes (por ejemplo, FITC)
logı́a h1045i o en Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas o anaranjados (por ejemplo, ficoeritrina).
h1047i se reseñan los métodos pertinentes. También se utilizan análisis tales como los de isoenzimas, que
Las proteı́nas, las endotoxinas, el ADN y el ARN bacterianos son emplean marcadores bioquı́micos. Por ejemplo, los análisis de
los principales contaminantes del proceso derivados del anfitrión. Se isoenzimas son útiles para confirmar la especie en los xenotras-
pueden emplear valoraciones estándar de proteı́nas (por ejemplo, plantes. La morfologı́a celular se puede utilizar si es capaz de
Lowry, Bradford o Coomassie), PAGE seguida de tinción argéntica o distinguir tipos de células especı́ficos o una función singular. La
Western blot, o ELISA a fin de detectar proteı́nas residuales del morfologı́a se puede combinar con parámetros de tiempo de
anfitrión con sensiblidad de nanogramos. El ADN cromosómico del duplicación para distinguir mejor los tipos celulares.
anfitrión se puede detectar por hibridación slot blot (detección en
picogramos) o por PCR utilizando secuencias altamente conservadas
(por ejemplo, 18S para Escherichia coli). Sin embargo, la PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA VIRAL
contaminación de fondo puede resultar inevitable en ensayos por
PCR, porque las polimerasas recombinantes utilizadas para ampli- El mapeo por enzimas de restricción y la secuenciación de la
ficar la secuencia deseada también contienen ADN bacteriano unidad de ADN que se transcribe son los métodos más empleados
residual. Se puede emplear PAGE o electroforesis en gel de agarosa, para establecer la identidad de vectores virales para su caracteriza-
seguidas de tinción fluorescente, para detectar ARN residual. Es ción. La PCR, el mapeo por enzimas de restricción y los
posible que la cuantificación no sea necesaria, dada la naturaleza inmunoensayos basados en la expresión del transgén son los
lábil del ARN y su escasa toxicidad. recursos más comunes para confirmar la identidad durante las
Ciertos antibióticos, como la kanamicina, que se pueden emplear pruebas de liberación de lotes.
en la fermentación, deben ser eliminados durante el proceso y se
debe realizar la validación del proceso o la prueba de liberación de
lotes para confirmar la eliminación durante la purificación del PRODUCTOS DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL
plásmido. La HPLC es útil para detectar niveles bajos de antibiótico
residual. El mapeo por enzimas de restricción es el método de identidad
más frecuente para productos de ADN plasmı́dico y de oligonu-
cleótidos antisentido. El número de enzimas utilizadas para crear el
PRODUCTOS LIOFILIZADOS DE VECTORES VIRALES Y NO patrón genético del vector varı́a según la complejidad del ADN y la
VIRALES similitud entre múltiples productos. Si se emplean lı́pidos, agentes
lipoplex o proteı́nas para formular el ADN, también se debe analizar
La humedad residual puede afectar la estabilidad de un producto su identidad. Los procedimientos usados para productos farmacéu-
liofilizado. La Guı́a de Determinación de Humedad Residual en ticos tradicionales, como GC-MS, TLC y similares, permiten
Productos Biológicos Secos de la FDA (enero de 1990) recomienda identificar lı́pidos y sustancias quı́micas lipoplex. Los componentes
una humedad residual del 1%, aunque se consideran aceptables los proteicos de la formulación se pueden identificar por mapeo de
datos que indiquen que no hay efectos adversos sobre la estabilidad péptidos u otros métodos que se resumen en Artı́culos Obtenidos por
del producto a niveles más altos. Los niveles de humedad residual se Biotecnologı́a—Pruebas h1047i.
pueden determinar con un método estándar (ver Determinación de
Agua h921i) compatible con el producto formulado.
ESTABILIDAD
Identidad Consideraciones Generales
CONSIDERACIONES GENERALES La vida útil de los productos de terapia celular y génica varı́a
mucho en función de su naturaleza, el uso clı́nico previsto, sus
Las pruebas de liberación de lotes para productos de terapia atributos especı́ficos y las condiciones recomendadas de almacena-
celular y génica deben incluir una prueba de identidad, que sirve para miento, envasado y transporte. Por lo tanto, es difı́cil redactar pautas
identificar especı́ficamente el producto. Su complejidad depende de uniformes sobre la duración de estudios de estabilidad y la
la naturaleza del producto especı́fico y la gama de productos que se frecuencia de las pruebas, aplicables a todos los productos de
fabriquen. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo pruebas más terapia celular y génica. El estudio de estabilidad siempre debe
exhaustivas y rigurosas para un producto de terapia celular diseñarse sobre la base de principios y enfoques cientı́ficamente
sólidos, y un conocimiento cabal del producto terapéutico final y su
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 501
uso previsto. Asimismo, se debe determinar la estabilidad durante los suele tener un alto grado de variabilidad intrı́nseca. Medir y calcular
pasos de espera en el proceso, de los bancos de células y virus, de el deterioro de la actividad del producto empleando las metodologı́as
materias primas fundamentales y los estándares de referencia. Un estadı́sticas estándar puede requerir múltiples y frecuentes intervalos
programa de estabilidad bien diseñado y ejecutado asegurará, en de toma de muestras en un perı́odo prolongado y el análisis de más
gran medida, que el producto sea estable dentro de la vida útil de tres lotes para compensar la variabilidad de las valoraciones. Se
especificada. deben efectuar estudios iniciales para establecer una fecha de
Para productos de terapia génica con vectores virales y no virales caducidad provisional antes de la administración al primer paciente.
y productos de terapia celular no especı́ficos para un solo paciente, la Estos estudios también son útiles para determinar qué análisis son
selección de partidas para respaldar la solicitud de licencia y el indicadores de estabilidad, es decir, los indicadores óptimos de
etiquetado del producto final deberı́an llevarse a cabo de acuerdo con degradación del producto. Como los métodos farmacopeicos
los principios de las pruebas de estabilidad, como los descritos en la vigentes no contemplan las caracterı́sticas singulares de los
guı́a Q5C de la ICH, presentada en Calidad de Productos productos de terapia celular y génica, se recomienda desarrollar
Biotecnológicos: Pruebas de Estabilidad de Productos Biotecnolo- ensayos que consideren estas caracterı́sticas singulares.
gicos/Biológicos h1049i. Además, se deben reunir datos sobre
estabilidad para el material a granel y otros puntos dentro del
proceso, si el material es almacenado antes del procesamiento y el Condiciones de Desafı́o Acelerado y Apropiado
llenado finales.
Los vectores plasmı́dicos de ADN no viral con frecuencia están El perfil indicador de estabilidad de un producto de terapia celular
formulados con una mezcla especı́fica de lı́pidos, proteı́nas o o génica puede variar con el tiempo a causa de la influencia de una
lipoconjugados para formar liposomas o complejos encapsulados. gran variedad de condiciones ambientales, como la temperatura, las
Según la formulación, se puede lograr una vida útil de horas a años. condiciones extremas de almacenamiento fisiológico y la luz. En el
Si un producto tiene una vida útil corta, es posible que la desarrollo de un programa que investigue los efectos de estos
formulación final tenga que ser preparada en la clı́nica justo antes parámetros sobre la estabilidad de los productos, se deben considerar
de la administración. La inestabilidad se suele observar como vı́as de degradación multifactoriales. Los estudios deben incluir
agregación y precipitación. La formación y la estabilidad del condiciones que superen los intervalos de almacenamiento especi-
complejo formulado se deben establecer mediante estudios de ficados, es decir, condiciones de desafı́o como las halladas durante
validación durante el desarrollo del producto. Asimismo, se deben perı́odos de almacenamiento, transporte o manejo anormales.
recolectar datos de estabilidad para los componentes principales del Algunos ejemplos son el mal funcionamiento de incubadoras por
complejo formulado, como lı́pidos, liposomas y el ADN. un breve lapso de tiempo, fallas de la incubadora o del
Para muchos productos celulares especı́ficos para un solo almacenamiento en frı́o, perı́odos de fluctuaciones térmicas extremas
paciente, inclusive los transducidos, cada producto es único y debido al transporte hacia climas calurosos o frı́os, condiciones
suele prepararse solamente un lote para un solo paciente. En general, hipobáricas en el sector de carga de una aerolı́nea comercial o
los volúmenes de los lotes tienden a ser pequeños, a veces, menos de temperaturas probables en la sala de cirugı́a. Una exposición breve a
10 mL, y pueden contener productos que no se pueden congelar, por una condición ambiental muy alejada de un lı́mite establecido y una
lo que tienen una vida útil corta (entre 24 y 72 horas), pues las exposición prolongada a un ambiente que apenas exceda el intervalo
células continúan metabolizando su medio. Los protocolos para aceptable establecido pueden ser igualmente dañinas. Si se aplican
determinar la estabilidad de la terapia especı́fica para un solo condiciones de almacenamiento diferentes, la velocidad lenta y
paciente deben emplear materiales de múltiples donantes y, al constante de degradación del producto a una temperatura especı́fica
menos, tres lotes. Se pueden utilizar células primarias de banco bien puede aumentar. Si existe una justificación cientı́fica, se deberı́a
caracterizadas en la validación de los datos de almacenamiento, investigar el efecto de la luz sobre el perfil indicador de estabilidad.
transporte y fecha de caducidad si los perfiles de los donantes son los Se debe prestar especial atención a los productos almacenados en
esperados para la población de pacientes a la que estará dirigida la lı́quidos con componentes fotosensibles o reactivos, que puedan
terapia. Se debe validar la estabilidad del producto bajo las originar subproductos citotóxicos.
condiciones de espera en el centro médico. Los estudios análogos a los de envejecimiento acelerado
habitualmente usados en programas de control de la estabilidad de
productos farmacéuticos también son útiles para determinar cómo se
Desarrollo del Protocolo de Estabilidad degrada el producto y qué ensayos son indicadores de estabilidad.
Pueden ser los mismos estudios que algunos de los mencionados en
Los estudios formales de estabilidad para respaldar la licencia y el párrafo precedente. Otros estudios consisten en exponer un
también la información reunida sobre estabilidad del producto en la producto a 378 o 188 cuando su temperatura normal de almacena-
fase inicial deben estar detallados en un plan escrito que determine miento es de 258 + 28 o colocar un producto liofilizado en un
cómo se obtendrán y analizarán los datos de estabilidad a fin de ambiente muy húmedo. Este tipo de estudio debe llevarse a cabo
avalar el perı́odo de caducidad del producto. Los protocolos deben antes de los estudios formales de estabilidad, de manera que los
seguir el formato recomendado en las guı́as vigentes e incluir el estudios formales incorporen los ensayos indicadores de estabilidad
alcance, las condiciones de almacenamiento, el número de lotes a validados en el protocolo.
analizar, el cronograma de prueba, las valoraciones que se utilizarán,
el análisis de los datos y las especificaciones del producto. Todo
ensayo empleado en un estudio de estabilidad formal para obtener la ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE
licencia debe ser validado antes de comenzar el estudio. El diseño
especı́fico del estudio debe tener en cuenta las posibilidades Consideraciones Generales
razonablemente previstas que pueden surgir (ver Condiciones de
Desafı́o Acelerado y Apropiado) y deberı́a incorporar los co- Las condiciones de almacenamiento se seleccionan para preservar
nocimientos más actualizados de las ciencias biológicas y aplicar los la pureza y la potencia a fin de que se mantengan las especificaciones
requisitos de la reglamentación vigente. Por ejemplo, si la del producto durante el almacenamiento, transporte y manejo en la
formulación final del producto se realiza en un centro médico, se clı́nica. Antes de la administración, deben realizarse estudios para
deben realizar estudios de estabilidad en esta formulación con el determinar si las condiciones aceptables de almacenamiento,
propósito de determinar la duración y las condiciones de su transporte y manejo son aceptables. Las condiciones iniciales de
conservación. almacenamiento y transporte no necesariamente deben ser las
Los estudios de estabilidad deben verificar que las condiciones de previstas para el producto comercial. Deben garantizar que se
almacenamiento conserven la pureza y la potencia, de manera que mantengan las especificaciones del producto más allá de la fecha de
cuando el producto se administre al paciente, siga cumpliendo con caducidad propuesta inicialmente. Para los productos con una vida
las especificaciones de estabilidad. Estas especificaciones pueden útil breve, es importante considerar las condiciones de almacena-
diferir de las estipuladas para la liberación. Sin embargo, las miento y transporte en conjunto, aún dentro de un centro médico,
especificaciones de estabilidad deben ser verificadas con datos porque el transporte constituye la mayor parte del tiempo de
clı́nicos. La evaluación de la estabilidad debe incluir el análisis de la almacenamiento después de la fabricación. Se debe prestar especial
funcionalidad del producto (potencia). La valoración de potencia atención a la posible entrada de gas en el embalaje para el transporte,
502 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
sobre todo si el producto de terapia celular o génica se almacena o frecuencia, el laboratorio que maneja las células y la clı́nica donde
transporta en hielo seco. Una vez desarrollados los métodos se administra el producto deben actuar en estrecha colaboración,
indicadores de estabilidad y seleccionadas las condiciones finales porque las células en una suspensión concentrada sobreviven sólo
de almacenamiento y transporte, estas condiciones se validan según unas pocas horas.
se analiza en Estabilidad. Productos No Congelados—Otros productos de terapia celular se
La mayorı́a de los productos con vida útil limitada se transportan almacenan sin congelar. Como las células mantienen su metabolismo
mediante sistemas confiables de correo con entrega al dı́a siguiente. durante el almacenamiento, el perı́odo de caducidad habitualmente
Algunos productos crı́ticos son transportados a mano en aviones está comprendido entre 24 y 96 horas. La fecha de caducidad se
comerciales. Se deben obtener permisos especiales de los transpor- puede extender a varias semanas si se aumenta el volumen del medio
tistas comerciales si es preciso evitar el control con equipos de rayos de almacenamiento, si se reduce la temperatura de almacenamiento o
X en el aeropuerto. Durante el desarrollo de sistemas de embalaje, se si se conecta a una serie de bolsas o compartimientos que permitan
deben diseñar estudios de transporte de carga para identificar las cambiar el medio sin violar la esterilidad del sistema. Estos
condiciones adversas que podrı́an afectar a los productos biológicos. productos se transportan en recipientes aislantes con bolsas
Luego se deben seleccionar y validar los materiales de refuerzo y refrigerantes para conservar un intervalo de temperatura definido.
aislamiento para armar un sistema de embalaje que mitigue las Para impedir desviaciones de temperatura de estos intervalos
condiciones extremas de transporte. definidos y validados, se emplean configuraciones de envases bien
diseñadas con aislamiento de espuma densa, que protege al producto
de los cambios de temperatura del ambiente exterior. La pureza y la
Productos de Terapia Celular potencia no se deben alterar durante los intervalos prácticos de
transporte, es decir, de 24 a 96 horas, a temperaturas más altas o más
Crioconservación—La crioconservación es la forma principal de bajas. Sin embargo, si es probable que se altere la potencia, se debe
almacenar células a largo plazo, es decir, por más de 1 año. (Ver rediseñar la configuración de la caja de transporte para mantener la
también Suspensiones en Formulación de Productos de Terapia potencia óptima durante los perı́odos más prolongados posibles. El
Celular.) La velocidad de enfriamiento de las soluciones de células producto debe ser colocado en un recipiente a prueba de fugas y al
es importante debido a los daños mecánicos y de deshidratación que resguardo de la luz, con un soporte fı́sico adecuado, que garantice la
resultan de la formación y el crecimiento de cristales de hielo. Las estabilidad y la prevención de fugas durante las condiciones
temperaturas ideales dependen del tipo de células que se criocon- normales de transporte.
servan y la concentración del crioconservante. La velocidad de
enfriamiento óptima para la mayorı́a de las células está comprendida
entre 18 y 38 por minuto. Los congeladores con velocidad controlada Productos de Terapia Génica
que pueden alcanzar de manera reproducible esta velocidad de
enfriamiento óptima son fundamentales cuando se congelan un gran La mayorı́a de los productos de terapia génica se pueden liofilizar
número de viales o grandes volúmenes de células en bolsas. Una vez o formular mediante técnicas similares a las empleadas para muchos
enfriadas por debajo del punto de congelación, las células deben productos proteicos recombinantes o de terapia celular. Estas
almacenarse a temperaturas por debajo de –1308. Esto se puede formulaciones de almacenamiento tı́picamente tienen perı́odos de
lograr con congeladores eléctricos o con nitrógeno lı́quido. El caducidad superiores a un año y carecen de requisitos de transporte
almacenamiento de células en la fase de vapor de un congelador de especiales. Los productos de terapia génica no viral, que pueden ser
nitrógeno lı́quido reduce el riesgo de contaminación cruzada con inestables en su formulación final, pueden tener fechas de caducidad
otros materiales en el congelador. Sin embargo, es necesario generar similares si se almacenan en un equipo de viales múltiples con el
un mapa de temperaturas del congelador para que las células no ácido nucleico en un vial y un vehı́culo como lı́pidos, en el otro. La
queden almacenadas tan lejos del nitrógeno lı́quido y, por ende, formulación final se elabora en el centro médico justo antes de la
sometidas a temperaturas superiores a –1308 a medida que el administración.
nitrógeno lı́quido se evapora o cuando se abre el congelador.
Algunas células se pueden almacenar a –808 si se pretende usarlas en
unas pocas semanas. ETIQUETADO
Descongelación—El proceso de descongelación es bastante
rápido. Si se intenta reinfundir o trasplantar una pequeña cantidad El etiquetado de un producto está reglamentado por la FDA y
de células, no es necesario extraer el DMSO de la suspensión, cumple con la reglamentación vigente. El etiquetado de productos de
porque la mayorı́a de las preparaciones celulares pueden ser terapia celular o génica como productos biológicos reglamentados
concentradas adecuadamente para mantener la concentración de estará sujeto a esta reglamentación. Los requisitos de etiquetado para
DMSO dentro de lı́mites tolerables. El uso de DMSO ejerce dos los productos biológicos y dispositivos (21 CFR 610 Subparte G y
efectos sobre las células después de la descongelación: se pueden 21 CFR 801, respectivamente) están divididos en requisitos de
agrupar si están dañadas y el DMSO reduce la viabilidad celular en etiquetado del envase y del empaque. Tanto la etiqueta del envase
minutos. Si es necesario extraer el DMSO o concentrar las células como la del empaque deben incluir la fecha de caducidad. Si el
para la administración, por lo general, se diluye la suspensión de envase está empacado, se deben incluir las condiciones de
células descongelada de forma seriada para evitar el choque almacenamiento recomendadas en la etiqueta del embalaje. Si no
osmótico y se la vuelve a suspender en un medio con proteı́nas. está empacado, las condiciones de almacenamiento y todos los
La viabilidad celular y la potencia se suelen determinar después de la demás requisitos de una etiqueta de embalaje deben aparecer en la
descongelación, pero la información puede no influir en el uso etiqueta del envase. El etiquetado también debe cumplir con los
clı́nico del material. requisitos nacionales e internacionales pertinentes.
Productos Congelados—Los productos de terapia celular con- Si se emplean antibióticos en el procesamiento de células y, por lo
gelados son transportados al centro médico en hielo seco o en tanto, están presentes en el producto final, el etiquetado debe
transportadores secos de nitrógeno lı́quido. Se prefieren estos indicarlo. Para los productos de terapia celular que deben aplicarse al
últimos, porque resulta más fácil mantener la temperatura durante paciente en una orientación fı́sica particular, la etiqueta que indica la
el transporte. El hielo seco y el nitrógeno lı́quido son materiales orientación correcta debe ser evidente aún después de abrir el
considerados peligrosos durante el transporte. Se deben definir las embalaje. De manera similar, si el dispositivo sólo debe injertarse en
condiciones de almacenamiento en la clı́nica. La mayorı́a de las un lugar definido, ésto debe advertirse claramente en una etiqueta
farmacias no tiene acceso a congeladores de nitrógeno lı́quido. En el que sea visible una vez abierto el embalaje. A menos que el producto
mejor de los casos, disponen de congeladores mecánicos que pueden haya sido analizado para detectar contaminantes patógenos o
mantener la temperatura a –708. Las clı́nicas que cuentan con centros microbianos antes de la liberación, se exige un etiquetado de
de procesamiento celular o realizan trasplantes de médula ósea, riesgo biológico apropiado. Para productos con vida útil muy breve,
poseen congeladores de nitrógeno lı́quido. Si el producto celular es la fecha de caducidad requerirá ajustes y correcciones según los
sometido a un procesamiento posterior en la clı́nica, por ejemplo, husos horarios para brindar al usuario una estimación exacta de la
descongelación y administración, se deben especificar las con- vida útil. Los procedimientos clı́nicos se deben programar próximos
diciones de almacenamiento y la fecha de caducidad. Con a estos marcos temporales cruciales. Las etiquetas de productos
especı́ficos para un solo paciente deben tener el nombre completo del
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 503
paciente, sus iniciales o una combinación de ambos, además de la ADN COMPLEMENTARIO (ADNC) —ADN sintetizado a partir de un
designación del lote, a fin de garantizar que el producto se administre ARN mensajero (ARNm) y no de un molde de ADN. Se emplea para
al paciente correcto. clonar o como sonda de ADN para localizar genes especı́ficos.
ADN DESNUDO—ADN aislado, purificado y no complejado (sin
proteı́nas o lı́pidos).
REGLAMENTOS, NORMAS Y NUEVAS ADN RECOMBINANTE—ADN producido por la unión de fragmentos
METODOLOGÍAS de ADN de diferente origen mediante manipulaciones in vitro.
AFÉRESIS—Procedimiento de extracción de sangre de un donante,
remoción de componentes selectos de la misma (por ejemplo,
Resumen de Reglamentos y Normas plaquetas o leucocitos) y retransfusión del remanente al donante.
AGENTE ADVENTICIO—Agente extraño que se introduce accidental
Las tecnologı́as empleadas en productos de terapia celular y
génica han sido ampliamente documentadas en la bibliografı́a y se o inadvertidamente; no es natural ni hereditario (como en la
encuentran en constante evolución. Estos productos pueden estar contaminación microbiana, quı́mica o bioquı́mica de una sustancia
reglamentados como fármacos, productos biológicos o dispositivos, purificada).
ALOGÉNICO—De un integrante no emparentado de la misma
o no estar reglamentados en absoluto, según cómo se fabriquen y
utilicen. Los nuevos enfoques que estas tecnologı́as permitan pueden especie; de la misma especie pero con un genotipo diferente.
ANTICUERPOS INTRACELULARES—Anticuerpos que se encuentran
dificultar la determinación de qué centros de la FDA estarán a cargo
de su reglamentación; la FDA ha recomendado a los fabricantes dentro de las células, que no son secretados y que están diseñados
solicitar aclaraciones en las primeras etapas del desarrollo. La para unirse a moléculas blanco dentro de las células e inactivarlas.
ANTICUERPOS MONOCLONALES—Anticuerpos derivados de un
reglamentación es la misma que para los productos derivados de la
biotecnologı́a. Los requisitos generales se describen principalmente único clon celular.
ANTÍGENOS DE LEUCOCITOS HUMANOS (ALH)—Proteı́nas con-
en 21 CFR. El gobierno federal ha publicado muchas guı́as generales
en forma de documentos titulados Puntos a Tener en Cuenta o Guı́as troladas por el complejo principal de histocompatibilidad. Estas
(Points to Consider o Guidance; ver www.fda.gov). Las guı́as ICH proteı́nas tienen un papel preponderante en la determinación de la
para muchos temas relacionados con la calidad son directamente compatibilidad para trasplantes.
AUTÓLOGO—Que se origina dentro del propio organismo.
pertinentes a la calificación de productos de terapia celular y génica
BIOTECNOLOGÍA—Toda técnica que utilice organismos vivos (o
(ver www.ifpma.org/ich1.html) y algunos de estos documentos se
reproducen en USP 25 como capı́tulos de información general. Los partes de éstos) para producir o modificar productos, mejorar plantas
Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos [National o animales o desarrollar microorganismos para usos especı́ficos. La
Institutes of Health (NIH, por sus siglas en inglés)] han publicado las definición más nueva se refiere al uso industrial y farmacéutico del
Guı́as para la Investigación de Moléculas de ADN Recombinante ADN recombinante, fusión celular, nuevas técnicas de bioprocesa-
(Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules) miento y terapia génica.
BPFV—Buenas prácticas de fabricación vigentes. La FDA
(ver el texto del documento y sus modificaciones en http://
www4.od.nih.gov/oba/guidelines.html) que requieren la revisión de establece las BPFV en el 21 CFR y en el Diario Oficial (Federal
la investigación por parte de NIH, incluso investigaciones o ensayos Register) y sus Puntos a Tener en Cuenta (Points to Consider).
CD34—(Cluster of Differentiation) Marcador 34 de superficie
clı́nicos realizados o patrocinados por instituciones que reciben
fondos de NIH. Estas guı́as se aplican a muchos productos de terapia celular. El CD34 es una proteı́na que distingue las células madre y
génica. El AATB ha elaborado pautas para obtener tejido alogénico. progenitoras de las células sanguı́neas más maduras.
CÉLULA DENDRÍTICA—Célula que sensibiliza los linfocitos T a los
El Public Health Service (PHS), con datos de NIH, FDA, los Centros
de Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos antı́genos.
CÉLULA DIPLOIDE—Célula con dos juegos completos de cromo-
(Centers for Disease Control and Prevention; CDC, por sus siglas en
inglés) y la Administración de Servicios de Investigación de la Salud somas (ver Célula Haploide).
CÉLULA GERMINAL—Célula reproductora (espermatozoide u
de los Estados Unidos (Health Research Services Administration;
HRSA, por sus siglas en inglés) han creado guı́as para el uso de óvulo), gameto o célula sexual.
CÉLULA MADRE—Célula inmortal capaz de proliferar y diferen-
productos xenogénicos (Guı́a del Public Health Service (PHS) sobre
Aspectos Relacionados con las Enfermedades Infecciosas en el ciarse en distintos tipos de células especializadas. Se supone que
Xenotransplante, agosto de 1996). Asimismo, la ASTM cada sistema de tejidos importante tiene su propia célula madre.
CÉLULA PROGENITORA—Célula madre o ancestral generalmente ya
está desarrollando estándares para productos médicos creados por
métodos de ingenierı́a tisular. comprometida a diferenciarse en un tipo o linaje celular especı́fico.
CÉLULAS ENDOTELIALES—Células epiteliales de origen mesodér-
mico que recubren las cavidades internas del cuerpo como el corazón
y los vasos sanguı́neos y linfáticos.
Necesidad de Nuevas Metodologı́as CÉLULAS EPITELIALES—Células del revestimiento de distintos
órganos. Ejemplos: células epiteliales respiratorias, intestinales o
La comercialización rentable de productos de terapia celular y vasculares.
génica requiere el desarrollo y la validación de nuevas metodologı́as CÉLULAS DE LOS ISLOTES—Células b del páncreas, que secretan
para evaluar la calidad de los productos. La USP adoptará estas insulina.
nuevas metodologı́as cuando estén adecuadamente validadas. De CÉLULAS DE MÉDULA ÓSEA—Una variedad de células indiferen-
manera similar, si se necesitan estándares o materiales de referencia ciadas (células madre) y diferenciadas (linfocitos, granulocitos,
y se dispone de ellos, podrı́an incluirse en el inventario de la USP eritrocitos y plaquetas) que se encuentran en las cavidades internas
para permitir el análisis comparativo entre diversos estudios clı́nicos de los huesos o la médula ósea.
o como puntos de referencia para los fabricantes de estos productos CÉLULAS OSTEOGÉNICAS—Provenientes del hueso o que participan
respecto a las materias primas, los componentes y las impurezas del en el crecimiento o reparación ósea.
proceso. CÉLULAS SOMÁTICAS—Las células que no son germinales.
CITOKINA—Todo factor que actúa sobre las células; por lo general,
una proteı́na que favorece el crecimiento.
DEFINICIONES DE TÉRMINOS CITOPLASMA—Material celular contenido dentro de la membrana
celular y que rodea al núcleo.
ADENOVIRUS—Virus perteneciente a la familia Adenoviridae de CITOTÓXICO—Capaz de causar la muerte celular.
virus de ADN con virión sin envoltura, 252 capsómeros y un CLASIFICADOR DE CÉLULAS ACTIVADO POR FLUORESCENCIA (FACS,
diámetro de 70 a 90 nm; una molécula lineal de ADN bicatenario (36 por sus siglas en inglés)—Máquina que clasifica las células
a 38 kb); un mı́nimo de 10 proteı́nas estructurales resistentes al éter y basándose en marcadores fluorescentes unidos a ellas.
estables en un medio ácido; los viriones se liberan por destrucción CLONAL—Genes, células u organismos enteros derivados de y
celular. genéticamente idénticos a un único gen, célula u organismo ancestral
común.
504 h1046i Productos de Terapia Génica y Celular / Información General USP 30
COLORANTE SUPRAVITAL —Colorante que tiñe células vivas HIBRIDACIÓN DOT BLOT (ADN o ARN)—Técnica para detectar,
solamente. analizar e identificar proteı́nas; similar a la técnica de Western blot
CONDROCITOS—Células que producen los componentes del pero sin la separación electroforética de proteı́nas.
cartı́lago. HUMORAL—Perteneciente a elementos de los lı́quidos corporales
CONSTRUCCIÓN GÉNICA—Vector de expresión que contiene la (por ejemplo, inmunidad humoral y anticuerpos neutralizantes).
secuencia de codificación de una proteı́na y los elementos necesarios IMPLANTE EN CONTRASTE CON TRANSPLANTE—Implante es la
para su expresión. inserción o injerto de material biológico, vivo, inerte o radioactivo
CULTIVO EN SUSPENSIÓN —Células capaces de crecer en dentro del organismo. Transplante es el injerto de tejidos del cuerpo
suspensión sin la necesidad de adherirse a un soporte para del mismo paciente o de otra persona.
desarrollarse. IN VITRO—Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un
DIFERENCIACIÓN—Proceso de cambios bioquı́micos y estructura- organismo vivo. Puede involucrar células o tejidos provenientes de
les mediante el cual las células adquieren forma y función organismos.
especializadas. IN VIVO—Procedimiento que se lleva a cabo dentro de un
ELECTROPORACIÓN—Medio fı́sico de transferencia de genes organismo vivo.
(mediante el uso de un campo eléctrico breve) por el cual se crean INJERTO—Proceso mediante el cual se implantan o trasplantan
poros transitorios en la membrana celular para introducir el ADN. células, tejidos u órganos en otro organismo. Se refiere tanto a los
ELISA—Ensayo por inmunoabsorción de enzimas ligadas. Inmu- procesos mecánicos como biológicos necesarios para obtener un
noensayo que utiliza un antı́geno o anticuerpo marcado con una injerto plenamente funcional.
enzima para detectar la unión de una molécula a una matriz sólida. INJERTO CONTRA LEUCEMIA (GVL, por sus siglas en inglés)—
ENDONUCLEASA DE RESTRICCIÓN—Endonucleasa que reconoce Rechazo de las células de la leucemia del anfitrión por los linfocitos
una secuencia especı́fica de bases dentro de un ADN bicatenario. T del donante.
ENFERMEDAD DEL INJERTO CONTRA EL ANFITRIÓN (GVHD, por sus INMUNOENSAYO—Técnica para identificar sustancias basada en el
siglas en inglés)—Rechazo del tejido trasplantado por parte del uso de anticuerpos.
anfitrión. Es la causa principal de muerte del paciente cuando se INMUNOFLUORESCENCIA—Técnica para identificar una marca
utiliza un tejido alogénico mal homologado en el receptor. fluorescente.
ENSAYO CLONOGÉNICO—Procedimiento basado en la capacidad de INMUNÓGENO—Sustancia capaz de inducir una respuesta inmuni-
producir un clon de células. taria; una forma de antı́geno que induce una respuesta inmunitaria,
ENSAYO DE TCID 50—Ensayo de Dosis Infectiva 50 del Cultivo contrario a un tolerógeno, que induce tolerancia.
Tisular. Determinación de la cantidad de producto capaz de matar INTEGRACIÓN—Asimilación del material genético (ADN) en el
50% de las células de cultivo en el ensayo (efecto citopático) o de cromosoma de una célula receptora.
lograr que el 50% exprese una proteı́na de vector. INTERLEUKINA (IL)—Linfokina que regula el crecimiento y
EPIDÉRMICO—Perteneciente a la capa más externa y avascular de desarrollo de leucocitos. Se han identificado más de 12.
la piel, derivada del ectoderma embrionario. ISOGÉNICO—Del mismo genotipo.
EPISOMAL—Perteneciente al material genético extracromosómico LEUCEMIA—Neoplasma maligno de los tejidos formadores de
accesorio. sangre.
ESTROMAL—Se refiere a los elementos de soporte celular que LINAJE (CÉLULAS PROGENITORAS COMPROMETIDAS, CÉLULAS
contienen nutrientes o factores de crecimiento esenciales. DIFERENCIADAS)—Vı́a especı́fica de diferenciación celular que se
EX VIVO—Procedimiento que se lleva a cabo fuera de un puede rastrear a una célula única de origen.
organismo vivo. LÍNEA CELULAR EMPAQUETADORA—Lı́nea de células que produce
EXTRACORPÓREO—Situado o producido fuera del cuerpo. todas las proteı́nas requeridas para la envoltura y la producción de
FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS Y MACRO- vectores virales en una forma activa, pero que no produce virus
FAGOS (FEC-GM)—Hormona natural que estimula la producción de competente para la replicación.
leucocitos, especialmente de granulocitos y monocitos. LÍNEA CELULAR PRODUCTORA—Lı́nea celular establecida que se
FACTORES DE CRECIMIENTO—Factores responsables de regular la utiliza para producir vectores virales, por lo general, a gran escala.
proliferación, función y diferenciación celular. LÍNEAS CELULARES—Células provenientes de cultivos primarios
FASE S—Parte del ciclo celular durante la que se produce la de embriones, tejidos u órganos. Estas lı́neas de células pueden tener
replicación del ADN. un perı́odo de vida limitado o ser inmortalizadas (modificadas para
FIBROBLASTOS—Células de tejido conectivo capaces de producir replicarse indefinidamente).
colágeno. LINFOCITOS B (células B)—Una clase de linfocitos provienentes de
FORMULADO—Preparado de acuerdo con condiciones o métodos la médula ósea que producen anticuerpos.
prescritos. LINFOCITOS T—Linfocitos que adquieren su repertorio de
FUSIÓN—Unión de las membranas de dos células mediante la cual funciones y su capacidad de discriminación autóloga en el timo, y
se crea una célula hija que contiene algunas propiedades de cada una son responsables de la inmunidad mediada por células. Hay varios
de las células progenitoras. Se utiliza en la producción de células de subgrupos de linfocitos T (linfocitos T colaboradores, linfocitos T
hibridoma en las que se fusionan células productoras de anticuerpos supresores y linfocitos T citotóxicos).
con células de mieloma de ratón. LINFOKINA—Clase de proteı́nas solubles producidas por los
G-418—El antibiótico empleado para seleccionar y aislar células leucocitos que interviene en la respuesta inmunitaria.
que contienen el gen de resistencia a la neomicina. LINFOMA—Tipo de cáncer que afecta el tejido linfático.
GEN p53—Gen cuya mutación es la alteración más común LIPOPLEX—Una formulación de lı́pidos y polı́meros o proteı́nas.
observada en el cáncer en seres humanos. No se requiere para el LIPOSOMA—Bicapa lipı́dica esférica que encierra un comparti-
desarrollo normal del cáncer, pero la ausencia de este gen aumenta miento acuoso.
significativamente el riesgo de padecer la enfermedad. MACRÓFAGO—Cualquiera de las diversas formas de fagocitos
GENOMA—Material hereditario completo de una célula. mononucleares que se encuentran en los tejidos y que surgen de las
GRANULOCITO—Uno de los tres tipos de leucocitos. Estas células células madre hematopoyéticas en la médula ósea.
digieren bacterias y otros parásitos. MESOTELIO PERITONEAL—Revestimiento de la cavidad peritoneal
HAPLOIDE —Célula con la mitad del número habitual de que consiste en una capa simple de células que cubren una superficie
cromosomas o con un solo juego de cromosomas. Las células amplia. Tiene abundante drenaje linfático y permite la difusión de
germinales son haploides. macromoléculas.
HEMACITÓMETRO—Dispositivo para el recuento manual células. MICROINYECCIÓN—Medio fı́sico de transferencia génica que
HEMATOPOYÉTICO—Perteneciente o con influencia sobre la involucra la inyección directa de la célula con una jeringa y una
formación de células sanguı́neas. aguja.
HEPATOCITOS—Células predominantes del hı́gado, que cumplen MIELOSUPRESIÓN—Inhibición de la actividad de la médula ósea
una función importante en el metabolismo y son productoras de que produce una depleción de eritrocitos, leucocitos y plaquetas.
proteı́nas séricas. Por lo general, estas células no están en división MIOCITOS—Células fundamentales del tejido muscular. Células
pero si se dañan, se pueden dividir y regenerar hasta reponer las blanco para la inserción de genes que codifican proteı́nas secretoras.
células dañadas.
USP 30 Información General / h1046i Productos de Terapia Génica y Celular 505
MONOCITOS—Uno de los tres tipos de leucocitos. Son precursores TRANSDUCCIÓN—Transferencia y expresión de material genético
de los macrófagos. en una célula mediante un vector viral o un bacteriófago.
MUTAGÉNESIS INSERCIONAL—Tipo de mutación que resulta de la TRANSFECCIÓN—Transferencia de ADN a las células a través de
inserción de un gen extraño en un cromosoma de la célula anfitriona. un medio fı́sico como la coprecipitación de fosfato de calcio.
Este procedimiento tiene muchas consecuencias negativas, TRANSGÉN—Se refiere al ADN extraño o terapéutico que es parte
incluyendo la muerte de una célula si se inactiva un gen esencial o de una construcción de vector.
la predisposición al cáncer si se inactiva un gen supresor de tumores. TRANSPLANTE DE MÉDULA ÓSEA—Transplante de células de la
NEOMICINA—Antibiótico derivado del Streptomyces fradiae. médula ósea capaces de mantener las funciones hematológicas
OLIGONUCLEÓTIDO—Polı́mero integrado por un número pequeño indefinidamente. Técnica empleada en el tratamiento de trastornos
de nucleótidos, por lo general, de 5 a 30. inmunitarios (deficiencias inmunitarias combinadas graves, tales
ONCOGENES—Genes asociados a la proliferación neoplásica como la deficiencia de ADA), trastornos hematológicos (anemia),
(cáncer) después de una mutación o perturbación de sus expresiones. metabólicos (enfermedad de Gaucher) y enfermedades malignas
ONCOGÉNICO—Que produce cáncer. (leucemia, linfoma o tumor sólido).
PAR DE BASES—Dos bases de nucleótidos de diferentes cadenas de TUMORIGENICIDAD—Propiedades que favorecen la inducción de
la molécula de ácido nucleico, que están unidas. un neoplasma maligno.
PARVOVIRUS—Virus de ADN de la familia Parvoviridae. La VALIDACIÓN DE PROCESOS—Método para suministrar documenta-
variedad de anfitriones incluye muchas especies de vertebrados. ción probatoria de que el proceso de fabricación está controlado, es
PERCUTÁNEO—Realizado a través de la piel. Un ejemplo de reproducible y capaz de generar uniformemente un producto que
procedimiento percutáneo es la inyección de un agente o la cumple con especificaciones predeterminadas.
extracción de un tejido (muestra para biopsia) con una aguja. VALORACIÓN BIOLÓGICA—Medición de la eficacia de un com-
PLÁSMIDO—Molécula de ADN pequeña y circular que contiene puesto por su efecto en animales o células, en comparación con una
ciertos genes y es capaz de replicarse independientemente en una preparación estándar. (Ver también Potencia).
célula anfitriona. VECTOR—Agente (plásmido, virus o complejo liposoma–proteı́na
POLICLONAL—Derivado de una población celular integrada por o ADN–proteı́na) utilizado para introducir ADN en una célula.
diversos tipos de clones. VIABILIDAD—Condición de vivo y funcional.
POTENCIA—Medida cuantitativa de actividad biológica basada en VIRIÓN—Partı́cula viral básica que consta de material genético
el atributo de un producto vinculado a las propiedades biológicas (nucleocápside) y una cubierta proteica.
correspondientes. VIRUS—Organismo submicroscópico que contiene información
PRODUCTO BIOLÓGICO—Todo virus, suero terapéutico, toxina, genética necesaria para su reproducción. Es un parásito intracelular
antitoxina o producto análogo aplicable a la prevención, tratamiento obligatorio.
o cura de enfermedades o lesiones en seres humanos. (El término VIRUS ADENO-ASOCIADO (VAA)—El parvovirus humano contiene
producto análogo indica que incluye esencialmente productos un genoma de ADN monocatenario y depende de un virus
obtenidos por biotecnologı́a y procedimientos que incluyen la colaborador (adenovirus, virus del herpes o virus vaccinia) para
terapia génica, los productos transgénicos y la terapia celular poder replicarse. Sin coinfección, los viriones salvajes se integran en
somática). un sitio especı́fico del cromosoma 19 y permanecen latentes.
PRODUCTOS AUXILIARES—Componentes usados durante la fabri- VIRUS ANFOTRÓPICO—Virus que infecta y se replica en células de
cación que no deberı́an estar presentes en el producto final. especies múltiples.
Ejemplos: factores de crecimiento, citokinas, anticuerpos mono- VIRUS COLABORADOR—Colabora en el desarrollo de un virus
clonales, dispositivos de separación de células, medios y compo- defectuoso al suministrar o restaurar la actividad de un gen viral o
nentes de medios. permitiendo que el virus defectuoso forme una envoltura funcional.
PROMOTOR—Secuencia de ADN situada por delante de un gen y VIRUS COMPETENTE PARA REPLICACIÓN—Virus que puede com-
que controla la expresión génica. Se requiere para la unión de la pletar un ciclo de replicación sin la necesidad de un virus
ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. colaborador; virus de replicación autónoma.
QUERATINOCITOS—Células epidérmicas diferenciadas que consti- VIRUS ECOTRÓPICO—Virus que infecta y se replica únicamente en
tuyen la capa celular superior de la piel. células de la especie del anfitrión original.
RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)—Técnica para cuantificar una VIRUS CON ENVOLTURA—Virus con una bicapa lipoproteica que
sustancia midiendo la reactividad de las formas de la misma rodea la cápside, adquirida por gemación a través de la membrana de
marcadas radioactivamente. las células anfitrionas.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR, por sus siglas en VIRUS DEL HERPES SIMPLE (VHS)—Virus de ADN integrante de la
inglés)—Técnica para amplificar cientos de miles de veces una familia Herpesviridae. Puede infectar a vertebrados homeotermos y
secuencia especı́fica de nucleótidos de ADN o ARN. poiquilotermos por contacto entre membranas mucosas húmedas.
RETROVIRUS—Virus que contiene la transcriptasa inversa, que WESTERN BLOT—Método de electrotransferencia de proteı́nas
convierte el ARN viral en ADN, y que luego se integra a la célula mediante el cual éstas se transfieren desde un gel a un soporte
anfitriona en forma de provirus. delgado y rı́gido (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa),
SIMULACRO DE PRUEBA—Corrida de prueba que omite delibera- sobre el que posteriormente se detectan mediante la unión de
damente algunos reactivos crı́ticos. anticuerpos unidos a enzimas, que permiten el uso de un sustrato de
SIN SUERO—Se refiere al medio de crecimiento celular que carece precipitación cromogénico o quimioluminiscente, o de anticuerpos
de suero. marcados radioactivamente.
TERAPIA ANTISENTIDO—Uso de oligonucleótidos antisentido XENOGÉNICO—De una especie diferente.
(segmento complementario al ARN) para controlar o inhibir la XENOTRASPLANTE—Transplante de órganos de una especie a otra
expresión génica. (por ejemplo, de cerdos a seres humanos).
TERAPIA CELULAR—Terapia que utiliza células completas para ZOONOSIS—Enfermedad de los animales que se transmite a los
tratar una enfermedad, afección o lesión. seres humanos, ya sea por exposición rutinaria al material de origen
TERAPIA GÉNICA—Terapia que utiliza ADN para tratar una o por su consumo en forma de alimento.
enfermedad o afección. La FDA define los productos de terapia
génica como aquellos que contienen material genético, adminis-
trados para modificar o manipular la expresión del material genético
con el fin de alterar las propiedades biológicas de células vivas.
506 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
Precauciones Generales
La contaminación es siempre una preocupación en el análisis de
aminoácidos. Se requieren reactivos de alta pureza (por ejemplo, el
ácido clorhı́drico de baja pureza puede contribuir a la contaminación
con glicina). Los reactivos analı́ticos se cambian rutinariamente cada
varias semanas y se usan solamente disolventes para cromatografı́a
de lı́quidos de alta presión (grado HPLC). La posible contaminación
microbiana y los materiales extraños presentes en los disolventes se
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 507
punto cuando se interpretan los resultados. También se pueden uniones peptı́dicas que se escinden lentamente (por ejemplo, uniones
agregar estándares internos a la mezcla de aminoácidos después de la Ile-Val). Sin embargo, esta técnica permite al analista dar cuenta de
hidrólisis para corregir por las diferencias en la aplicación de las cierta destrucción de residuos. Se ha empleado la hidrólisis ácida por
muestras y los cambios en la estabilidad del reactivo y las microondas y ésta es rápida, pero exige equipo y precauciones
velocidades de flujo. Idealmente, un estándar interno es un especiales. Las condiciones óptimas para la hidrólisis por micro-
aminoácido primario que no se encuentra naturalmente y que ondas se deben investigar para cada muestra de proteı́na o péptido.
está disponible comercialmente a bajo precio. También debe ser La técnica de hidrólisis por microondas tı́picamente toma sólo unos
estable durante la hidrólisis, su factor de respuesta debe ser función minutos, pero una desviación de 1 minuto puede proporcionar
lineal de su concentración y debe eluir con un tiempo de retención resultados inadecuados (por ejemplo, hidrólisis incompleta o
único, sin superponerse con otros aminoácidos. Los estándares de destrucción de aminoácidos lábiles). Se ha empleado la proteólisis
aminoácidos comúnmente empleados incluyen la norleucina, la completa usando una mezcla de proteasas pero puede ser
nitrotirosina y el ácido a-aminobutı́rico. complicada, exige controles adecuados y, por lo general, se puede
aplicar más a péptidos que a proteı́nas. [NOTA—Durante los análisis
iniciales de una proteı́na desconocida, se realizan experimentos con
Hidrólisis de Proteı́nas diferentes tiempos de hidrólisis y condiciones de temperatura para
determinar las condiciones óptimas.]
La hidrólisis de muestras de proteı́nas y péptidos es necesaria para
el análisis de aminoácidos de estas moléculas. El material de vidrio
usado para la hidrólisis debe estar muy limpio para evitar resultados MÉTODO 1
erróneos. Los polvos para guantes y las huellas dactilares en los
tubos de hidrólisis pueden causar contaminación. Para limpiar los La hidrólisis ácida usando ácido clorhı́drico que contenga fenol es
tubos de vidrio para hidrólisis, hay que hervir los tubos durante 1 el procedimiento más comúnmente usado para la hidrólisis de
hora en ácido clorhı́drico 1 N o sumergirlos en ácido nı́trico proteı́nas o péptidos antes del análisis de aminoácidos. La adición de
concentrado o en una mezcla de ácido clorhı́drico concentrado y fenol a la reacción evita la halogenación de la tirosina.
ácido nı́trico concentrado (1 : 1). Los tubos de hidrólisis limpios se Solución de Hidrólisis: ácido clorhı́drico 6 N que contenga
enjuagan con agua de alta pureza, seguido por un enjuague con entre 0,1% y 1,0% de fenol.
metanol de grado HPLC, se secan de un dı́a para el otro en una Procedimiento—
estufa y se almacenan cubiertos hasta su uso. Alternativamente, el
material de vidrio limpio se puede someter a pirólisis a 5008 durante Hidrólisis en Fase Lı́quida—Colocar la muestra de proteı́na o
4 horas para eliminar la contaminación de los tubos para hidrólisis. péptido en un tubo para hidrólisis y secar. [NOTA—La muestra se seca
También se puede usar material de laboratorio desechable adecuado. para que el agua de la muestra no diluya el ácido empleado para la
La hidrólisis ácida es el método más común para hidrolizar una hidrólisis.] Agregar 200 mL de la Solución de Hidrólisis por cada 500
muestra de proteı́na antes del análisis de aminoácidos. La técnica de mg de proteı́na liofilizada. Congelar el tubo de la muestra en un baño
hidrólisis ácida puede aumentar la variabilidad del análisis debido a de hielo seco y acetona y sellar a la llama en vacı́o. Las muestras
la destrucción completa o parcial de varios aminoácidos. El tı́picamente se hidrolizan a 1108 durante 24 horas al vacı́o o en una
triptófano se destruye; la serina y la treonina se destruyen atmósfera inerte para evitar la oxidación. Se investigan tiempos
parcialmente; la metionina puede oxidarse; y la cisteı́na tı́picamente mayores de hidrólisis (por ejemplo, 48 y 72 horas) si existe la
se recupera como cistina (pero la recuperación de la cistina suele ser preocupación de que la proteı́na no esté totalmente hidrolizada.
mala debido a la destrucción o reducción parcial a cisteı́na). La Hidrólisis en Fase de Vapor—Éste es uno de los procedimientos
aplicación de vacı́o adecuado (menos de 200 mm de mercurio o 26,7 de hidrólisis ácida más comunes y se prefiere para el microanálisis
Pa) o la introducción de un gas inerte (argón) en la cámara gaseosa cuando sólo se dispone de pequeñas cantidades de muestra. La
superior del recipiente de reacción puede reducir la destrucción contaminación de la muestra por el reactivo ácido también se
oxidativa. En las uniones peptı́dicas que involucran isoleucina y minimiza usando la hidrólisis en fase de vapor. Colocar los viales
valina, las uniones amida de Ile-Ile, Val-Val, Ile-Val y Val-Ile se que contengan las muestras secas en un recipiente con un cantidad
escinden parcialmente; y la asparagina y la glutamina se desamidan, adecuada de la Solución de Hidrólisis. La Solución de Hidrólisis no
dando como resultado ácido aspártico y ácido glutámico, respecti- entra en contacto con la muestra de prueba. Aplicar una atmósfera
vamente. La pérdida de triptófano, asparagina y glutamina durante inerte o vacı́o (menos de 200 mm de mercurio o 26,7 Pa) a la cámara
una hidrólisis ácida limita la cuantificación a 17 aminoácidos. gaseosa del recipiente y calentar aproximadamente a 1108 durante un
Algunas de las técnicas de hidrólisis descritas se usan para tratar tiempo de hidrólisis de 24 horas. El vapor ácido hidroliza la muestra
estos problemas. Algunas de las técnicas de hidrólisis descritas (es seca. Minimizar toda condensación del ácido en los viales de la
decir, los Métodos 4–11) pueden modificar otros aminoácidos. Por lo muestra. Después de la hidrólisis, secar la muestra al vacı́o para
tanto, hay que considerar las ventajas de usar una técnica de eliminar el ácido residual.
hidrólisis en comparación con sus problemas; estas ventajas se
analizan adecuadamente antes de emplear un método que no sea la
hidrólisis ácida. MÉTODO 2
A menudo se emplea un estudio en función del tiempo (es decir,
un análisis de aminoácidos con tiempos de hidrólisis ácida de 24, 48 La oxidación del triptófano durante la hidrólisis disminuye si se
y 72 horas) para analizar la concentración inicial de aminoácidos que usa ácido mercaptoetanosulfónico (MESA) como ácido reductor.
se destruyen parcialmente o que se escinden lentamente. Al graficar Solución de Hidrólisis: solución de MESA 2,5 M.
la concentración observada de aminoácidos lábiles (es decir, serina y Hidrólisis en Fase de Vapor—Secar aproximadamente de 1 a
treonina) en función del tiempo de hidrólisis, se puede extrapolar la 100 mg de la proteı́na o péptido en análisis en un tubo de hidrólisis.
lı́nea hasta su origen para determinar la concentración inicial de estos Colocar el tubo de hidrólisis en un tubo más grande con
aminoácidos. Los estudios de hidrólisis en función del tiempo aproximadamente 200 mL de la Solución de Hidrólisis. Sellar al
también se usan con aminoácidos que se escinden lentamente (por vacı́o el tubo más grande (aproximadamente a 50 mm de mercurio o
ejemplo, isoleucina y valina). Durante el transcurso del tiempo de 6,7 Pa) para vaporizar la Solución de Hidrólisis. Calentar el tubo de
hidrólisis, el analista observa una meseta en estos residuos. El nivel hidrólisis entre 1708 y 1858 durante aproximadamente 12,5 minutos.
de esta meseta se considera la concentración de residuo. Si el tiempo Después de la hidrólisis, secar el tubo de hidrólisis al vacı́o durante
de hidrólisis es demasiado largo, la concentración del residuo en la 15 minutos para eliminar el ácido residual.
muestra comienza a disminuir, indicando una destrucción por las
condiciones de hidrólisis.
Una alternativa aceptable al estudio en función del tiempo es
someter un estándar de calibración de un aminoácido a las mismas
condiciones de hidrólisis que la muestra de prueba. El aminoácido
libre puede no ser totalmente representativo de la velocidad de
destrucción de los aminoácidos lábiles dentro de un péptido o una
proteı́na durante la hidrólisis. Esto es especialmente válido para las
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 509
reversa. La muestra recolectada se puede secar en una centrı́fuga de intercambio iónico seguida por derivatización postcolumna (por
vacı́o antes de la hidrólisis ácida. La S-carboxiamidometilcisteı́na ejemplo, con ninhidrina u o-ftalaldehı́do). Las técnicas de detección
formada se convierte en S-carboximetilcisteı́na durante la hidrólisis postcolumna se pueden utilizar con muestras que contienen
ácida. pequeñas cantidades de los componentes de las soluciones
amortiguadoras, tales como sales y urea, y por lo general necesitan
entre 5 y 10 mg de muestra de proteı́na por análisis. Las demás
MÉTODO 10 técnicas de aminoácidos generalmente involucran la derivatización
precolumna de los aminoácidos libres (por ejemplo, isotiocianato de
La cisteı́na-cistina se hace reaccionar con el ácido ditiodiglicólico fenilo; carbonato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo; cloru-
o el ácido ditiodipropiónico para producir un disulfuro mixto. ro de (dimetilamino)azobencensulfonilo; 9-fluorenil-metilclorofor-
[NOTA—La elección del ácido ditiodiglicólico o del ácido ditiodi- miato; y 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol) seguida de HPLC
propiónico depende de la resolución exigida por el método de en fase reversa. Las técnicas de derivatización precolumna son muy
análisis de aminoácidos.] sensibles y por lo general necesitan entre 0,5 y 1,0 mg de la muestra
Solución Reductora: una solución que contenga 10 mg de de proteı́na por análisis, aunque pueden ser influenciadas por sales
ácido ditiodiglicólico (o ácido ditiodipropiónico) por mL de amortiguadoras presentes en las muestras. Las técnicas de deriva-
hidróxido de sodio 0,2 M. tización precolumna también pueden producir múltiples derivados de
un aminoácido dado, lo cual complica la interpretación de los
Procedimiento—Transferir aproximadamente 20 mg de la mues- resultados. Las técnicas de derivatización postcolumna generalmente
tra de prueba a un tubo de hidrólisis y agregar 5 mL de la Solución están menos influenciadas por variaciones en el desempeño de la
Reductora. Agregar 10 mL de alcohol isopropı́lico y luego eliminar valoración que las técnicas de derivatización precolumna.
todo el lı́quido de la muestra mediante centrifugación al vacı́o. Se pueden usar los siguientes Métodos para el análisis cuantitativo
Luego, hidrolizar la muestra usando el Método 1. La ventaja de este de aminoácidos. Los instrumentos y reactivos para estos procedi-
método es que no se derivatizan otros residuos aminoacı́dicos por mientos están disponibles comercialmente. Además, existen muchas
reacciones secundarias y no es necesario desalinizar la muestra antes modificaciones de estas metodologı́as con diferentes preparaciones
de la hidrólisis. de reactivos, procedimientos de reacción, sistemas cromatográficos,
etc. Los parámetros especı́ficos pueden variar según los equipos y
procedimientos usados. Muchos laboratorios usan más de una
MÉTODO 11 técnica de análisis de aminoácidos para aprovechar la ventajas de
cada una. En cada uno de estos Métodos, la señal analógica se
La asparagina y la glutamina se convierten en ácido aspártico y visualiza mediante un sistema de captación de datos y las áreas de
ácido glutámico, respectivamente, durante la hidrólisis ácida. Los los picos se integran con fines de cuantificación.
residuos de asparagina y ácido aspártico se suman y se representan
con Asx, y los residuos de glutamina y ácido glutámico se suman y
se representan con Glx. Las proteı́nas o péptidos pueden hacerse
MÉTODO 1—DETECCIÓN POSTCOLUMNA CON NINHIDRINA
reaccionar con bis(1,1-trifluoroacetoxi)yodobenceno (BTI) para
convertir los residuos de asparagina y glutamina en residuos de La cromatografı́a de intercambio iónico con detección postco-
ácido diaminopropiónico y ácido diaminobutı́rico, respectivamente, lumna con ninhidrina es uno de los métodos más comúnmente
en la hidrólisis ácida. Estas conversiones permiten al analista usados para el análisis cuantitativo de aminoácidos. Por lo general,
determinar el contenido de asparagina y glutamina de una proteı́na o se emplea un sistema de intercambio catiónico a base de Li para el
péptido en presencia de residuos de ácido aspártico y ácido análisis de muestras fisiológicas más complejas y un sistema de
glutámico. intercambio catiónico a base de Na, que es más rápido, para mezclas
Soluciones Reductoras—Preparar y filtrar tres soluciones: una de aminoácidos más simples obtenidas de hidrolizados proteicos
solución de ácido trifluoroacético 10 mM (Solución 1), una solución (que tı́picamente contienen 17 aminoácidos). La separación de los
de clorhidrato de guanidina 5 M y ácido trifluoroacético 10 mM aminoácidos en una columna de intercambio iónico se logra a través
(Solución 2) y una solución recién preparada de dimetilformamida de una combinación de cambios en el pH y en la fuerza catiónica. A
que contenga 36 mg de BTI por mL (Solución 3). menudo se emplea un gradiente de temperatura para mejorar la
Procedimiento—A un tubo de hidrólisis limpio, transferir separación.
aproximadamente 200 mg de la muestra de prueba y agregar 2 mL Cuando el aminoácido reacciona con la ninhidrina, el reactante
de la Solución 1 o la Solución 2 y 2 mL de la Solución 3. Sellar el adquiere un color púrpura o amarillo caracterı́stico. Los aminoáci-
tubo de hidrólisis al vacı́o. Calentar la muestra a 608 durante cuatro dos, a excepción de los iminoácidos, dan un color púrpura y
horas en un lugar oscuro. Luego, dializar la muestra con agua para muestran máxima absorción a 570 nm. Los iminoácidos, como por
eliminar el exceso de reactivos. Extraer la muestra dializada tres ejemplo la prolina, dan un color amarillo y muestran una absorción
veces con volúmenes iguales de acetato de n-butilo y luego liofilizar. máxima a 440 nm. La reacción postcolumna entre la ninhidrina y
Después, se puede realizar la hidrólisis ácida de la proteı́na usando cada aminoácido eluido de la columna se controla a 440 nm y 570
los procedimientos descritos previamente. Los residuos de ácido a- nm y el cromatograma obtenido se usa para determinar la
,b-diaminopropiónico y ácido a-, g-diaminobutı́rico tı́picamente no composición de aminoácidos.
se resuelven de los residuos de lisina en la cromatografı́a de Se considera que el lı́mite de detección es 10 pmol para la mayorı́a
intercambio iónico basada en el análisis de aminoácidos. Por lo de los derivados de aminoácidos, pero es 50 pmol para la prolina. Se
tanto, cuando se usa el intercambio iónico para separar los obtiene una respuesta lineal entre 20 y 500 pmol con coeficientes de
aminoácidos, el contenido de asparagina y glutamina es la diferencia correlación superiores a 0,999. Para obtener buenos datos de
cuantitativa entre el ácido aspártico y ácido glutámico determinados composición, es mejor contar con muestras de más de 1 mg antes de
por hidrólisis ácida sin derivatizar y el contenido que se obtiene por la hidrólisis para este análisis de aminoácidos de proteı́nas o
derivatización con BTI. [NOTA—El contenido determinado para péptidos.
treonina, metionina, cisteı́na, tirosina e histidina puede cambiar por Más adelante se muestra un método para la detección postcolumna
la derivatización con BTI; se debe realizar una hidrólisis sin BTI si el con ninhidrina. Existen muchos otros métodos, con instrumental y
analista está interesado en el contenido de estos otros aminoácidos reactivos disponibles comercialmente.
en proteı́nas o péptidos.] Preparación de la Fase Móvil—
Solución A—Transferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio
anhidro y 1,5 mL de ácido clorhı́drico a un matraz volumétrico de
Metodologı́as de Análisis de Aminoácidos 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar, si
fuera necesario, con ácido clorhı́drico hasta un pH de 3,0.
Existen muchas técnicas de análisis de aminoácidos y la elección
de una de estas técnicas a menudo depende de la sensibilidad que Solución B—Transferir aproximadamente 1,7 g de citrato de sodio
requiera la valoración. En general, aproximadamente la mitad de las anhidro y 0,7 mL de ácido clorhı́drico a un matraz volumétrico de
técnicas de análisis de aminoácidos empleadas se basan en la 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar. Ajustar con
separación de los aminoácidos libres mediante cromatografı́a de ácido clorhı́drico, si fuera necesario, hasta un pH de 4,3.
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 511
Solución C—Preparar una solución que contenga 5% de cloruro reactivos para esta forma de análisis de aminoácidos están
de sodio, 1,9% de citrato de sodio anhidro y 0,1% de fenol en agua y disponibles comercialmente. Existen muchas modificaciones de
ajustar hasta un pH de 6. este método.
Solución Regeneradora de la Columna—Preparar una solución Si bien el OPA no reacciona con aminas secundarias (iminoácidos,
que contenga 0,8% de hidróxido de sodio en agua y ajustar hasta un como por ejemplo la prolina) para formar sustancias fluorescentes, la
pH de 13. oxidación con hipoclorito de sodio permite que las aminas
Fase Móvil—Usar mezclas variables de Solución A, Solución B y secundarias reaccionen con OPA. El procedimiento emplea una
Solución C como se indica en el Sistema Cromatográfico. columna de intercambio catiónico fuertemente ácida para la
separación de aminoácidos libres seguida de una oxidación
Reactivo Postcolumna—Transferir aproximadamente 18 g de postcolumna con hipoclorito de sodio y derivatización postcolumna
ninhidrina y 0,7 g de hidrindantina a 900 mL de una solución que usando OPA y un compuesto tiol, como por ejemplo N-acetil-L-
contenga 76,7% de dimetil sulfóxido, 0,7% de acetato de litio cisteı́na y 2-mercaptoetanol. La derivatización de aminoácidos
dihidrato y 0,1% de ácido acético y mezclar durante un mı́nimo de 3 primarios no se altera perceptiblemente con el aporte continuo de
horas bajo un gas inerte, como por ejemplo nitrógeno. [NOTA—Este hipoclorito de sodio.
reactivo es estable durante 30 dı́as si se mantiene a una temperatura La separación de los aminoácidos en una columna de intercambio
entre 28 y 88 bajo un gas inerte.] iónico se logra a través de una combinación de cambios en el pH y
Solución Amortiguadora—Preparar una solución que contenga en la fuerza catiónica. Después de la derivatización postcolumna con
2% de citrato de sodio anhidro, 1% de ácido clorhı́drico, 0,5% de OPA de los aminoácidos eluidos, el reactante pasa a través de un
tiodiglicol y 0,1% de ácido benzoico en agua y ajustar hasta un pH detector fluorométrico. La intensidad de la fluorescencia de los
de 2. aminoácidos derivatizados con OPA se controla con una longitud de
Sistema Cromatográfico—Equipar un cromatógrafo de lı́quidos onda de excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de
con un detector con filtros de interferencia apropiados a 440; 570 o 450 nm.
690 nm y una columna de 4,0 mm 6 120 mm rellena con Se considera que el lı́mite de detección es de unas pocas decenas
copolı́mero sulfonado de estireno-divinilbenceno de 7,5 mm. La de picomoles para la mayorı́a de los derivados de aminoácidos. La
velocidad de flujo es de aproximadamente 14 mL por hora. respuesta es lineal entre unos pocos picomoles y unas pocas decenas
Programar el sistema del siguiente modo. Inicialmente, equilibrar de nanomoles. Para obtener buenos datos de composición en este
la columna con Solución A; a los 25 minutos, cambiar la análisis de aminoácidos de proteı́nas o péptidos, es mejor contar con
composición de la Fase Móvil a 100% de Solución B; y a los 37 muestras de más de 500 ng antes de la hidrólisis.
minutos, cambiar la composición al 100% de Solución C. A los 75 A continuación se muestra un método para la detección
minutos de la corrida, eluye el último aminoácido de la columna y se postcolumna fluorométrica con OPA.
regenera la columna con la Solución Regeneradora de la Columna Preparación de la Fase Móvil—
durante 1 minuto. Equilibrar luego la columna con Solución A Solución A—Preparar una solución de hidróxido de sodio, ácido
durante 11 minutos antes de la siguiente inyección. Programar la cı́trico y alcohol en agua de grado HPLC con una concentración de
temperatura de la columna del siguiente modo. La temperatura sodio 0,2 N y que contenga 7% de alcohol (p/v), ajustada hasta un
inicial es 488; después de 11,5 minutos, aumentar la temperatura a pH de 3,2.
658 a una velocidad de 38 por minuto; aproximadamente a los 35
minutos, aumentar la temperatura a 778 a una velocidad de 38 por Solución B—Preparar una solución de hidróxido de sodio y ácido
minuto; y finalmente aproximadamente a los 52 minutos, disminuir cı́trico en agua de grado HPLC con una concentración de sodio
la temperatura a 488 a una velocidad de 38 por minuto. 0,6 N, ajustada a un pH de 10,0.
Procedimiento y Reacción Postcolumna—Reconstituir el hidro- Solución C: hidróxido de sodio 0,2 N.
lizado proteico o peptı́dico liofilizado en la Solución Amortiguadora, Fase Móvil—Usar mezclas variables de Solución A, Solución B y
inyectar una cantidad adecuada en el cromatógrafo y proceder como Solución C como se indica en Sistema Cromatográfico.
se indica en Sistema Cromatográfico. Cuando los aminoácidos Preparación de Reactivo Postcolumna—
eluyen de la columna, se mezclan con el Reactivo Postcolumna, que Solución Amortiguadora Alcalina—Preparar una solución que
se suministra a una velocidad de flujo de 7 mL por hora, a través de contenga carbonato de sodio 384 mM, ácido bórico 216 mM y
una llave T. Después de mezclar, el efluente de la columna y el sulfato de potasio 108 mM y ajustar hasta un pH de 10,0.
Reactivo Postcolumna pasan a través de un reactor tubular a una Reactivo de Hipoclorito—Agregar 0,4 mL de una solución de
temperatura de 1358, donde se forma un color púrpura o amarillo hipoclorito de sodio (10% de cloro) a 1 L de la Solución
caracterı́stico. Desde el reactor, el lı́quido pasa a través de un Amortiguadora Alcalina. [NOTA—La solución de hipoclorito es
colorı́metro con una cubeta de flujo de 12 mm. La luz que emerge de estable durante 2 semanas.]
la cubeta se divide en tres haces que son analizados por el detector
con filtros de interferencia a 440; 570 ó 690 nm. La señal de 690 nm Reactivo OPA—Transferir 2 g de N-acetil-L-cisteı́na y 1,6 g de
se puede restar electrónicamente de las otras señales para obtener OPA a un matraz volumétrico de 15 mL, disolver con alcohol, diluir
mejores relaciones señal-ruido. Las señales de 440 nm (iminoácidos) a volumen con alcohol y mezclar. Transferir esta solución y 4 mL de
y de 570 nm (aminoácidos) se pueden sumar para simplificar el una solución acuosa al 10% de éter polietilenglicol (23) laurı́lico2 a
manejo de datos. un matraz volumétrico de 1 litro, diluir con 980 mL de Solución
Amortiguadora Alcalina y mezclar.
Sistema Cromatográfico—Equipar el cromatógrafo de lı́quidos
MÉTODO 2—DERIVATIZACIÓN FLUOROMÉTRICA POSTCOLUMNA con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de
excitación de 348 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm
CON OPA
y con una columna de 4,0 mm 6 150 mm rellena con material L17
Se usa la cromatografı́a de intercambio iónico con detección de 7,5 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente 0,3 mL por
postcolumna fluorométrica con o-ftalaldehı́do (OPA). El procedi- minuto y la temperatura de la columna se ajusta a 508. Programar el
miento emplea una columna de intercambio iónico para la separación sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con Solución A;
de aminoácidos libres seguida de una oxidación postcolumna con durante los siguientes 20 minutos, cambiar linealmente la composi-
hipoclorito de sodio y derivatización usando OPA y N-acetil-L- ción de la Fase Móvil a 85% de Solución A y 15% de Solución B;
cisteı́na. El paso de oxidación con hipoclorito de sodio permite a las luego cambiar abruptamente a 40% de Solución A y 60% de Solución
aminas secundarias, como por ejemplo la prolina, reaccionar con el B; durante los siguientes 18 minutos, cambiar linealmente la
reactivo OPA. composición a 100% de Solución B y mantenerla durante 7 minutos;
El OPA reacciona con las aminas primarias en presencia de un tiol luego cambiar abruptamente a 100% de Solución C y mantenerla
para formar productos de isoindol altamente fluorescentes. Esta durante 6 minutos; luego cambiar abruptamente a la Solución A,
reacción se utiliza para la derivatización postcolumna en el análisis mantener esta composición durante los siguientes 8 minutos.
de aminoácidos por cromatografı́a de intercambio iónico. La regla de
separación es la misma que la del Método I. Los instrumentos y 2
Un grado adecuado está disponible comercialmente como ‘‘Palladium
Catalyst, Type I (Paladio al 5% en Carbonato de Calcio),’’ de Engelhard
Industries, Inc., número de fax (864) 885-1375.
512 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con la Solución A; minuto y la temperatura de la columna se mantiene a 378. Programar
durante los siguientes 0,5 minutos, cambiar linealmente la composi- el sistema del siguiente modo. Equilibrar la columna con 92% de
ción de la Fase Móvil a 98% de Solución A y 2% de Solución B; Solución A y 8% de Solución B; durante los siguientes dos minutos,
luego durante los siguientes 14,5 minutos a 93% de Solución A y 7% cambiar la composición de la Fase Móvil a 83% de Solución A y
de Solución B; durante los siguientes 4 minutos a 87% de Solución A 17% de Solución B y mantener durante 3 minutos más; después
y 13% de Solución B; durante los siguientes 14 minutos a 68% de durante los siguientes 5 minutos cambiar a 54% de Solución A y 46%
Solución A y 32% de Solución B; luego cambiar abruptamente a de Solución B y mantener durante 2 minutos más; después durante
100% de Solución B para un lavado de 5 minutos; durante los los siguientes 2 minutos cambiar a 34% de Solución A y 66% de
siguientes 10 minutos, cambiar abruptamente a 100% de Solución A Solución B y mantener durante 1 minuto; después durante los
y dejar que la columna se equilibre antes de la siguiente inyección. siguientes 0,3 minutos cambiar a 20% de Solución A y 80% de
Procedimiento—Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente Solución B y mantener durante 2,6 minutos más; y finalmente
0,05 nmol de cada aminoácido-AQC en análisis y proceder como se durante 0,6 minutos cambiar a 92% de Solución A y 8% de Solución
indica en Sistema Cromatográfico. B y mantener durante 0,6 minutos más.
Procedimiento—Inyectar aproximadamente 0,02 nmol de cada
derivado aminoácido-OPA en análisis en el cromatógrafo y proceder
MÉTODO 5—DERIVATIZACIÓN PRECOLUMNA CON OPA como se indica en Sistema Cromatográfico.
recipiente de la muestra con un tapón de goma de silicona y calentar Sistema Cromatográfico—Equipar el cromatógrafo de lı́quidos
a 708 durante 10 minutos. Mientras se calienta la muestra, la mezcla con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de
se disuelve. Después de la derivatización, diluir la muestra de prueba excitación de 260 nm y una longitud de onda de emisión de 313 nm
con una cantidad adecuada de Solución Amortiguadora de Dilución y con una columna de 4,6 mm 6 125 mm rellena con material L1 de
de la Muestra. 3 mm. La velocidad de flujo es de aproximadamente de 1,3 mL por
Sistema Cromatográfico—Equipar un cromatógrafo de lı́quidos minuto. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la
con un detector a 436 nm y una columna de 4,6 mm 6 250 mm columna con Solución A y mantener esta composición durante
rellena con material L1. La velocidad de flujo es de aproximada- 3 minutos; durante los siguientes 9 minutos, cambiar a 100% de
mente 1 mL por minuto y la temperatura de la columna se mantiene Solución B; durante los siguientes 0,5 minutos, aumentar la
a 408. Programar el sistema del siguiente modo. Equilibrar la velocidad de flujo a 2 mL por minuto y mantenerla hasta que el
columna con 85% de Solución A y 15% de Solución B; durante los último aminoácido-FMOC eluya de la columna. El tiempo total de la
siguientes 20 minutos, cambiar la composición de la Fase Móvil corrida es de aproximadamente 20 minutos.
a 60% de Solución A y 40% de Solución B; durante los siguientes 12 Procedimiento—Inyectar en el cromatógrafo no menos de 0,01
minutos, cambiar la composición a 30% de Solución A y 70% de nmol de cada aminoácido-FMOC en análisis y proceder como se
Solución B y mantener durante 2 minutos más. indica en Sistema Cromatográfico. El derivado histidina-FMOC por
Procedimiento—Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente lo general dará una respuesta menor que los demás derivados.
0,05 nmol de los aminoácidos-DABS y proceder según se indica en
Sistema Cromatográfico.
MÉTODO 8—DERIVATIZACIÓN PRECOLUMNA CON NBD-F
MÉTODO 7—DERIVATIZACIÓN PRECOLUMNA CON FMOC-CL Se usa la derivatización precolumna de aminoácidos con 7-fluoro-
4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) y después se separan por
Se usa derivatización precolumna de aminoácidos con 9- HPLC en fase reversa con detección fluorométrica.
fluorenilmetil cloroformiato (FMOC-Cl) y luego se separan por El 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) reacciona con
HPLC en fase reversa con detección fluorométrica. aminoácidos primarios y secundarios para formar productos
El FMOC-Cl reacciona con aminoácidos primarios y secundarios altamente fluorescentes. Los aminoácidos se derivatizan con NBD-
para formar productos altamente fluorescentes. La reacción del F calentándolos a 608 durante 5 minutos.
FMOC-Cl con aminoácidos se realiza bajo condiciones moderadas, Los derivados aminoácidos-NBD se separan en una columna ODS
en solución acuosa y se completa en 30 segundos. Los derivados son de HPLC en fase reversa empleando un sistema de elución por
estables y sólo el derivado de histidina muestra descomposición. Si gradiente constituido por una mezcla de acetonitrilo y una solución
bien el FMOC-Cl es fluorescente por sı́ mismo, el exceso de reactivo amortiguadora acuosa. En estas condiciones se separan 17 derivados
y los subproductos fluorescentes se pueden eliminar sin pérdida de de aminoácidos en 35 minutos. Se puede usar el ácido E-
aminoácidos-FMOC. aminocaproico como estándar interno ya que eluye en una región
Los aminoácidos FMOC se separan por HPLC en fase reversa cromatográfica despejada. Cada derivado que eluye de la columna se
usando una columna ODS. La separación se lleva a cabo mediante controla mediante un detector fluorométrico ajustado a una longitud
elución por gradiente que varı́a linealmente de una mezcla de de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión
solución amortiguadora de ácido acético, metanol y acetonitrilo de 530 nm.
(50 : 40 : 10) a una mezcla de acetonitrilo y solución amortiguadora La sensibilidad de este método es casi igual que la del método de
de ácido acético (50 : 50). En estas condiciones, se separan 20 derivatización precolumna con OPA (Método 5), excluyendo la
derivados de aminoácidos en 20 minutos. Cada derivado que eluye prolina, que no reacciona con el OPA. Esto puede ser una ventaja del
de la columna se controla a través de un detector fluorométrico NBD-F con respecto al OPA.
ajustado a una longitud de onda de excitación de 260 nm y una El lı́mite de detección para cada aminoácido es aproximadamente
longitud de onda de emisión de 313 nm. 10 fmol. El análisis de perfil se logró con aproximadamente 1,5 mg
El lı́mite de detección se encuentra en el intervalo inferior de fmol. de hidrolizado proteico en la mezcla final de reacción para HPLC.
Para la mayorı́a de los aminoácidos la respuesta es lineal entre 0,1 A continuación se muestra un método de derivatización
mM y 50 mM. precolumna con NBD-F.
A continuación se muestra un método de derivatización Preparación de la Fase Móvil—
precolumna con FMOC-Cl. Solución A: una solución de citrato de sodio 10 mM que
Preparación de Fase Móvil— contenga perclorato de sodio 75 mM, ajustada con ácido clorhı́drico
Solución Amortiguadora de Ácido Acético—Transferir 3 mL de hasta un pH de 6,2.
ácido acético glacial y 1 mL de trietilamina a un matraz volumétrico Solución B: una mezcla de acetonitrilo y agua (50 : 50).
de 1 litro y diluir a volumen con agua de grado HPLC. Ajustar con Preparación del Reactivo de Derivatización—
hidróxido de sodio hasta un pH de 4,20. Solución Amortiguadora de Muestra: una solución de ácido
Solución A: una mezcla de Solución Amortiguadora de Ácido bórico 0,1 M ajustada con hidróxido de sodio a un pH de 9,2.
Acético, metanol y acetonitrilo (50 : 40 : 10). Reactivo de Derivatización—Disolver 5 mg de NBD-F en 1,0 mL
Solución B: una mezcla de acetonitrilo y Solución Amortigua- de alcohol y mezclar.
dora de Ácido Acético (50 : 50). Procedimiento de Derivatización de la Muestra—Disolver la
Fase móvil—Usar mezclas variables de Solución A y de Solución muestra de prueba en 20 mL de Solución Amortiguadora de Muestra,
B según se indica en el Sistema Cromatográfico. agregar 10 mL de Reactivo de Derivatización y mezclar. Calentar el
Preparación del Reactivo de Derivatización— recipiente de la muestra a 608 durante 5 minutos. Después de la
Solución Amortiguadora de Borato—Preparar una solución de derivatización, diluir la muestra de prueba con 300 mL de la Solución
ácido bórico 1 M y ajustar con hidróxido de sodio hasta un pH de A.
6,2. Sistema Cromatográfico—Equipar el cromatógrafo de lı́quidos
Reactivo FMOC-Cl—Disolver 155 mg de 9-fluorenilmetil cloro- con un detector fluorométrico ajustado a una longitud de onda de
formiato en 40 mL de acetona y mezclar. excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm
Procedimiento de Derivatización de la Muestra—Agregar 0,1 y una columna de 4,6 mm 6 150 mm rellena con sı́lice ODS con un
mL de Solución Amortiguadora de Borato y 0,5 mL de Reactivo tamaño de partı́cula de 5 mm. La velocidad de flujo es de
FMOC-Cl a 0,4 mL de la muestra de prueba. Después de aproximadamente 1,0 mL por minuto y la temperatura de la
aproximadamente 40 segundos, extraer la mezcla con 2 mL de columna se mantiene a 408. Programar el sistema del siguiente
pentano y luego extraer una vez más con otra porción de pentano. La modo. Equilibrar la columna con 94% de Solución A y 6% de
solución acuosa con los derivados de aminoácidos queda lista para la Solución B; durante los siguientes 16 minutos, cambiar linealmente
inyección. la composición a 63% de Solución A y 37% de Solución B; durante
los siguientes 5 minutos, cambiar linealmente la composición a 62%
de Solución A y 38% de Solución B; durante los siguientes 9
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 515
minutos, cambiar linealmente la composición a 100% de Solución B Muestras de Proteı́nas Conocidas—Esta técnica de análisis de
y mantener durante otros 5 minutos; finalmente durante 2 minutos, datos se puede usar para investigar la composición de aminoácidos y
cambiar linealmente la composición a 94% de Solución A y 6% de la concentración proteica de una muestra de proteı́na de peso
Solución B y luego dejar equilibrar la columna antes de la siguiente molecular y composición aminoacı́dica conocidos usando los datos
inyección. de análisis de aminoácidos. Cuando se conoce la composición de la
Procedimiento—Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente proteı́na que se está analizando, se puede aprovechar el hecho de que
15 pmol de cada aminoácido-NBD en análisis y proceder como se algunos aminoácidos se recuperan bien, mientras que la recuperación
indica en Sistema Cromatográfico. de otros aminoácidos puede verse comprometida debido a la
destrucción total o parcial (por ejemplo, triptófano, cisteı́na, treonina,
serina, metionina), la escisión incompleta de uniones (es decir, para
Cálculo y Análisis de los Datos isoleucina y valina) y la contaminación por aminoácidos libres (es
decir, por glicina y serina).
Cuando se determina el contenido de aminoácidos de un Los aminoácidos que se recuperan mejor representan a la proteı́na
hidrolizado de proteı́na o péptido, se debe tener en cuenta que el y se eligen para cuantificarla. Los aminoácidos que se recuperan bien
paso de hidrólisis ácida destruye el triptófano y la cisteı́na. La serina son, tı́picamente, aspartato-asparagina, glutamato-glutamina, ala-
y la treonina se destruyen parcialmente con la hidrólisis ácida, nina, leucina, fenilananina, lisina y arginina. Esta lista se puede
mientras que la isoleucina y la valina podrı́an escindirse sólo modificar según la experiencia con el sistema de análisis utilizado.
parcialmente. La metionina puede oxidarse durante la hidrólisis Dividir la cantidad, en nmol, de cada uno de los aminoácidos bien
ácida y algunos aminoácidos (por ejemplo, glicina y serina) son recuperados por el número esperado de residuos de ese aminoácido
contaminantes comunes. La aplicación de un vacı́o adecuado (menos con el fin de obtener el contenido proteico basado en cada
de 200 mm de mercurio o 26,7 Pa) o la introducción de un gas inerte aminoácido bien recuperado. Promediar los resultados de contenido
(argón) en la cámara gaseosa del recipiente de reacción durante la proteico calculados. El contenido proteico determinado para cada
hidrólisis en fase de vapor puede reducir la destrucción oxidativa. uno de los aminoácidos bien recuperados se debe distribuir
Por lo tanto, los resultados cuantitativos obtenidos para cisteı́na, uniformemente en torno a la media. Descartar los valores de
triptófano, treonina, isoleucina, valina, metionina, glicina y serina de contenido proteico para esos aminoácidos que se alejan demasiado
un hidrolizado de proteı́nas o péptidos pueden variar y pueden de la media. Tı́picamente, una variación mayor de 5% con respecto a
requerir posterior investigación y consideración. la media se considera inaceptable, pero esto es arbitrario. Recalcular
la media del contenido proteico de los valores restantes para obtener
el contenido proteico de la muestra. Dividir el contenido de cada
aminoácido por el contenido proteico medio calculado para
CÁLCULOS
determinar la composición de aminoácidos de la muestra.
Calcular el error relativo de composición, en porcentaje, por la
Porcentaje Molar de los Aminoácidos—Es el número de fórmula:
residuos de cada aminoácido por cada 100 residuos en una proteı́na.
Este resultado puede ser útil para evaluar los datos de análisis de 100m / mS
aminoácidos cuando se desconoce el peso molecular de la proteı́na o
péptido a investigar. Esta información se puede usar para corroborar en donde m es la cantidad determinada experimentalmente, en nmol
la identidad de una proteı́na y tiene otras aplicaciones. Identificar e por residuo aminoacı́dico, del aminoácido en análisis; y mS es el
integrar cuidadosamente los picos obtenidos como se indica para valor conocido para los residuos de ese aminoácido. El error relativo
cada Procedimiento. Calcular el porcentaje molar de cada amino- promedio de composición es el promedio de los valores absolutos de
ácido presente en la muestra de prueba, por la fórmula: los errores relativos de composición de los aminoácidos indivi-
duales, excluyendo tı́picamente el triptófano y la cisteı́na de este
100rU / r cálculo. El error relativo promedio de composición puede propor-
cionar información importante acerca de la estabilidad de los análisis
en donde rU es la respuesta correspondiente al pico, en nmol, del en función del tiempo. La coincidencia en la composición
aminoácido de prueba y r es la suma de respuestas correspondientes aminoacı́dica entre la muestra de proteı́na y la composición conocida
a los picos, en nmol, de todos los aminoácidos presentes en la se puede usar para corroborar la identidad y pureza de la proteı́na en
muestra de prueba. La comparación entre el porcentaje molar de la muestra.
aminoácidos de prueba y los datos de proteı́nas conocidas puede
ayudar a establecer o corroborar la identidad de la proteı́na de
muestra.
ELECTROFORESIS CAPILAR
Muestras de Proteı́nas Desconocidas—Esta técnica de análisis
de datos se puede usar para estimar la concentración proteica de una La electroforesis capilar es un método fı́sico de análisis basado en
muestra de proteı́na desconocida usando los datos de análisis de la migración, dentro de un capilar, de analitos cargados disueltos en
aminoácidos. Calcular la masa, en mg, de cada aminoácido una solución de electrolito, bajo la influencia de un campo eléctrico
recuperado, por la fórmula: de corriente continua. En esta sección se describen cuatro métodos
de electroforesis capilar, Electroforesis Capilar en Solución Libre,
mMW/1000 Electroforesis Capilar en Gel, Isoelectroenfoque Capilar y Croma-
en donde m es la cantidad recuperada, en nmoles, del aminoácido en tografı́a Electrocinética Micelar.
análisis; y MW es el peso molecular promedio, en mg, para ese
aminoácido, corregido por el peso de la molécula de agua que se
eliminó durante la formación de la unión peptı́dica. La suma de las Principio General
masas de los aminoácidos recuperados permite estimar la masa total
de la proteı́na analizada después de corregir adecuadamente por los La velocidad de migración del analito en un campo eléctrico de
aminoácidos destruidos parcial o completamente. Si está disponible intensidad, E, está determina por la movilidad electroforética del
el peso molecular de la proteı́na desconocida (es decir, por análisis analito y la movilidad electroosmótica de la solución amortiguadora
SDS-PAGE o espectrometrı́a de masas), se puede predecir la dentro del capilar. La movilidad electroforética de un soluto (mep)
composición de aminoácidos de la proteı́na desconocida. Calcular el depende de las caracterı́sticas del soluto (carga eléctrica, tamaño
número de residuos de cada aminoácido por la fórmula: molecular y forma) y de las caracterı́sticas de la solución
amortiguadora en donde ocurre la migración (tipo y fuerza iónica
m/(1000M/MWT)
en donde m es la cantidad recuperada, en nmol, del aminoácido en
análisis; M es la masa total, en mg, de la proteı́na; y MWT es el peso
molecular, en mg, de la proteı́na desconocida.
516 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
del electrolito, pH, viscosidad y aditivos). La velocidad electro- Desde un punto de vista práctico, otros fenómenos como por
forética (Vep) de un soluto, suponiendo una forma esférica, es la ejemplo la disipación de calor, la adsorción de la muestra en la pared
siguiente: del capilar, la conductividad no coincidente entre la muestra y la
solución amortiguadora, el largo del tapón de inyección, el tamaño
de celda del detector y los recipientes no nivelados de solución
amortiguadora pueden contribuir significativamente a la dispersión
de banda. La separación entre dos bandas (expresada por la
resolución, RS) se puede lograr modificando la movilidad electro-
forética de los analitos, por la movilidad electroosmótica inducida
por el capilar y aumentando la eficiencia para la banda de cada
en donde q es la carga efectiva de la partı́cula, Z es la viscosidad de analito del siguiente modo:
la solución amortiguadora, r es el tamaño del ión soluto, V es el
voltaje aplicado y L es el largo total del capilar.
Cuando se aplica un campo eléctrico a través del capilar lleno con
solución amortiguadora, se genera un flujo de disolvente dentro del
capilar que se denomina flujo electroosmótico. Su velocidad depende
de la movilidad electroosmótica (meo) que a su vez depende de la
densidad de la carga en la pared interna del capilar y de las
caracterı́sticas de la solución amortiguadora. La velocidad electro- en donde mepa y mepb son las movilidades electroforéticas de los dos
osmótica (Veo) es la siguiente: compuestos a separar; mep es la movilidad electroforética promedio
de los dos solutos calculada como:
mep = ½ (mepb þ mepa)
y los demás términos son los definidos anteriormente.
Aparato
en donde es la constante dieléctrica de la solución amortiguadora,
es el potencial zeta de la superficie del capilar y los otros términos Un aparato de electroforesis capilar se compone de una fuente de
son los definidos anteriormente. alimentación controlada de alto voltaje; dos recipientes de soluciones
Las movilidades electroforética y electroosmótica del analito amortiguadoras que se mantienen en el mismo nivel y que contienen
pueden tener el mismo sentido o sentido opuesto, según la carga soluciones anódicas y catódicas especificadas; dos electrodos
(positiva o negativa) del soluto, siendo la velocidad del soluto (v) la (cátodo y ánodo) sumergidos en los recipientes de las soluciones
siguiente: amortiguadoras y conectados a la fuente de alimentación; un capilar
de separación, generalmente de sı́lice fundido, a veces con una
V = Vep + Veo ventana de visualización óptica alineada con el detector, depen-
Se usa la suma o la diferencia entre las dos velocidades (Vep y Veo) diendo del detector, con los extremos del capilar ubicados en los
dependiendo de si las movilidades tienen el mismo sentido o sentido recipientes de las soluciones amortiguadoras y el capilar lleno con
opuesto. En condiciones de una Veo rápida, con respecto a la Vep de una solución que se especifica en la monografı́a correspondiente; un
los solutos, se pueden separar analitos cargados tanto negativa como sistema de inyección adecuado; un detector capaz de controlar la
positivamente en la misma corrida. El tiempo (t) que tarda el soluto cantidad de sustancia de interés que pasa a través de un segmento del
en migrar la distancia (l) del extremo de inyección del capilar al capilar de separación en un tiempo dado, generalmente basado en la
punto de detección (largo efectivo del capilar) es el siguiente: espectrofotometrı́a de absorción (UV y visible), fluorometrı́a, o
detección conductimétrica, amperométrica o espectrométrica de
masas, dependiendo de las aplicaciones especı́ficas, o incluso la
detección indirecta para detectar compuestos no fluorescentes y que
no absorben luz UV y un sistema termostático capaz de mantener la
temperatura dentro del capilar.
El método de inyección de muestras y su automatización son
crı́ticos para realizar análisis cuantitativos precisos. Los métodos de
en donde los otros términos son los definidos anteriormente. inyección incluyen la gravedad, la presión o vacı́o o la inyección
En general, los capilares de sı́lice fundida usados en electroforesis electrocinética. La cantidad de cada componente de muestra
tienen cargas negativas en la pared interna, produciendo un flujo introducida electrocinéticamente depende de su movilidad electro-
electroosmótico hacia el cátodo. El flujo electroosmótico tiene que forética, introduciendo un posible sesgo en los resultados.
mantenerse constante de corrida a corrida para obtener una buena Se espera que el capilar, los recipientes de las soluciones
reproducibilidad en la velocidad de migración de los solutos. Para amortiguadoras, el método de preacondicionamiento, la solución
algunas aplicaciones, puede ser necesario reducir o suprimir el flujo de muestra y las condiciones de migración estén especificadas en la
electroosmótico modificando la pared interna del capilar o monografı́a correspondiente. La solución electrolı́tica empleada se
cambiando el pH de la solución amortiguadora. puede filtrar para eliminar partı́culas y desgasificar para evitar la
Cuando la muestra se introduce en el capilar, cada ión del analito formación de burbujas que pueden interferir con el sistema de
de la muestra migra dentro del electrolito de fondo como una zona detección. Para lograr un tiempo de migración reproducible de los
independiente de acuerdo con su movilidad electroforética. El solutos, es necesario crear, para cada método analı́tico, una rutina de
extendido de cada banda de soluto (zona de dispersión) es el enjuague riguroso después de cada inyección.
resultado de un fenómeno diferente. En condiciones ideales, el
ensanchamiento de la zona del soluto se debe solamente a la difusión
molecular del soluto a lo largo del capilar (difusión longitudinal). En Electroforesis Capilar en Solución Libre
este caso, la eficiencia de la zona se expresa como el número de
platos teóricos (N), del siguiente modo: En la electroforesis capilar en solución libre, los analitos se
separan en un capilar que contiene únicamente una solución
amortiguadora sin ningún medio anticonvectivo. En esta técnica, la
separación ocurre debido a que los distintos componentes de la
muestran migran como bandas discretas con velocidades diferentes.
La velocidad de cada banda depende de la movilidad electroforética
del soluto y del flujo electroosmótico en el capilar. Se pueden usar
en donde D es la difusión molecular del soluto en la solución
amortiguadora y los otros términos son los definidos anteriormente.
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 517
capilares recubiertos, con flujo electroosmótico reducido, para hasta por debajo del punto isoeléctrico cambia la carga neta del
aumentar la capacidad de separación de las sustancias que se soluto de negativo a positivo. Un aumento en el pH de la solución
absorben en las superficies de sı́lice fundido. amortiguadora generalmente aumenta el flujo electroosmótico.
Este método de electroforesis capilar es apropiado para el análisis Disolventes Orgánicos—Los modificadores orgánicos, como por
de moléculas pequeñas (PM 5 2000) y grandes (2000 5 ejemplo el metanol, el acetonitrilo y otros, se agregan a la solución
PM 5 100 000). Debido a la alta eficiencia lograda, se pueden amortiguadora acuosa para aumentar la solubilidad del soluto o de
separar moléculas que presenten diferencias diminutas en su relación otros aditivos o para afectar la ionización de los componentes de la
carga-masa. Este método también permite la separación de muestra. Estos modificadores orgánicos agregados a la solución
compuestos quirales al agregar selectores quirales a la solución amortiguadora suelen disminuir el flujo electroosmótico.
amortiguadora de separación. Para lograr una separación óptima hay Aditivos para Separaciones Quirales—Para separar isómeros
que tener en cuenta varios parámetros instrumentales y de la solución ópticos, se agrega un selector quiral a la solución amortiguadora de
electrolı́tica. separación. Los selectores quirales más comúnmente usados son las
ciclodextrinas, aunque en algunos casos se pueden usar éteres
corona, algunos polisacáridos o incluso proteı́nas. Como el
PARÁMETROS INSTRUMENTALES reconocimiento quiral depende de las distintas interacciones entre
el selector quiral y cada uno de los enantiómeros, la resolución
Voltaje—El tiempo de separación es universalmente proporcional lograda para los compuestos quirales depende en gran medida del
al voltaje aplicado. Sin embargo, un aumento en el voltaje empleado tipo de selector quiral usado. Mientras se desarrolla una separación
puede producir calor excesivo, aumentando los gradientes de dada, puede ser útil analizar las ciclodextrinas que tengan distintos
temperatura y viscosidad en la solución amortiguadora dentro del tamaños de cavidad (a, b o -ciclodextrina) o ciclodextrinas
capilar, lo cual ensancha la banda y disminuye la resolución. modificadas con grupos neutros (metilo, etilo, hidroxialquilo, etc.)
Temperatura—El principal efecto de la temperatura se observa o ionizables (aminometilo, carboximetilo, sulfobutiléter, etc.). La
en la viscosidad y conductividad eléctrica del amortiguador del pH, resolución de separaciones quirales también está controlada por la
por lo tanto afecta la velocidad de migración. En algunos casos, un concentración del selector quiral, la composición y el pH de la
aumento en la temperatura del capilar puede alterar la conformación solución amortiguadora y la temperatura de separación. Los aditivos
de algunas proteı́nas, modificando su tiempo de migración y orgánicos, como por ejemplo el metanol o la urea, también pueden
eficiencia de separación. afectar la resolución de la separación.
Capilar—El largo y diámetro interno del capilar afectan el tiempo
de análisis, la eficiencia de las separaciones y la capacidad. El
aumento del largo efectivo y del largo total permiten disminuir los Electroforesis Capilar en Gel
campos eléctricos, a un voltaje constante, lo cual aumenta el tiempo
de migración. Para una solución amortiguadora y un campo eléctrico La separación ocurre dentro de un capilar lleno con un polı́mero
dados, la disipación de calor (por lo tanto el ensanchamiento de que actúa como tamiz molecular. Los componentes más pequeños en
banda de la muestra) depende del diámetro interno del capilar. Este la muestra se mueven más rápidamente por el capilar que los
último también afecta el lı́mite de detección, dependiendo del componentes más grandes. Se puede usar este método para la
volumen de muestra inyectado en el capilar y del sistema de separación de biopolı́meros-proteı́nas y fragmentos de ADN, según
detección usado. sus masas moleculares.
La adsorción de los componentes de la muestra en la pared del
capilar limita la eficiencia; por lo tanto, hay que considerar métodos
para evitar estas interacciones cuando se desarrolla un método de CARACTERÍSTICAS DE GELES QUÍMICOS Y FÍSICOS
separación. Esto es crı́tico en muestras que contienen proteı́nas. Se
han diseñado estrategias para evitar la adsorción de proteı́nas en la Geles Quı́micos—Los geles quı́micos se preparan dentro del
pared del capilar. Estas estrategias incluyen el uso de un pH extremo capilar por reacción de monómeros. Un ejemplo de dicho gel es una
y la absorción de aditivos de amortiguadores de pH con carga poliacrilamida entrecruzada. Este tipo de gel está unido a la pared de
positiva que sólo necesitan la modificación de la composición del sı́lice fundida y no se puede eliminar sin destruir el capilar. Para el
amortiguador del pH. Otras estrategias incluyen el recubrimiento de análisis de proteı́nas, la solución amortiguadora de separación
la pared interna del capilar con un polı́mero unido por enlace contiene dodecilsulfato de sodio y la muestra se desnaturaliza por
covalente a la sı́lice lo cual evita la interacción entre las proteı́nas y calor en una mezcla de dodecilsulfato de sodio y 2-mercaptoetanol o
la superficie de la sı́lice negativamente cargada. Capilares con ditiotreitol antes de la inyección. La optimización de la separación en
recubrimiento de polı́meros hidrófilos neutros, catiónicos y anióni- un gel entrecruzado se obtiene modificando la solución amortigua-
cos están disponibles comercialmente. dora de separación (ver Electroforesis Capilar en Solución Libre) y
controlando la porosidad del gel cuando se prepara. Para un gel de
poliacrilamida entrecruzada, la porosidad se puede modificar
PARÁMETROS DE LA SOLUCIÓN ELECTROLÍTICA cambiando la concentración de acrilamida o la relación del agente
de entrecruzamiento. Como regla, al disminuir la porosidad del gel
Tipo de Solución Amortiguadora y Concentraciones—Las ser reduce la movilidad de los solutos. Debido a la rigidez de este
soluciones amortiguadoras apropiadas para la electroforesis capilar tipo de gel, sólo se puede usar la inyección electrocinética.
tienen una capacidad amortiguadora adecuada en el intervalo de pH Geles Fı́sicos—Los geles fı́sicos son polı́meros hidrófilos (es
de elección y baja movilidad para minimizar la generación de decir, poliacrilamida lineal, derivados de celulosa, dextrano, etc.)
corriente. que se pueden disolver en soluciones amortiguadoras acuosas de
Para minimizar la distorsión del pico, es importante hacer separación, dando lugar a un medio de separación que también actúa
coincidir la movilidad de los iones en la solución amortiguadora como tamiz molecular. Estos medios de separación poliméricos son
con la movilidad del soluto, siempre que sea posible. Es importante más fáciles de preparar que los polı́meros entrecruzados. Se pueden
el tipo de disolvente de la muestra empleado para lograr el enfoque preparar en un vial y llenar por presión un capilar de pared recubierta
de la muestra en la columna, lo que aumenta la eficiencia de sin flujo electroosmótico. Si se reemplaza el gel antes de cada
separación y mejora la detección. Además, el aumento en la inyección generalmente mejora la reproducibilidad de la separación.
concentración de las soluciones amortiguadoras hasta un pH dado La porosidad de los geles fı́sicos se puede aumentar usando
disminuye el flujo electroosmótico y la velocidad del soluto. polı́meros de un peso molecular mayor (a una concentración de
pH de la Solución Amortiguadora—El pH de la solución polı́mero dada) o disminuyendo la concentración de polı́mero (para
amortiguadora puede afectar la separación al modificar la carga del un peso molecular de polı́mero dado). Al disminuir la porosidad del
analito o de otros aditivos y al cambiar el flujo electroosmótico. Para gel se reduce la movilidad del soluto para la misma solución
la separación de proteı́nas y péptidos, un cambio en el pH de la amortiguadora. Se pueden usar técnicas de inyección hidrodinámica
solución amortiguadora desde por encima del punto isoeléctrico y de electromigración ya que la disolución de estos polı́meros en la
solución amortiguadora produce soluciones poco viscosas.
518 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
Ecuaciones similares, aunque no idénticas, dan valores de K’ y RS discriminadores quirales, como por ejemplo ciclodextrinas agregadas
para compuestos con carga eléctrica. a las soluciones electrolı́ticas que contienen agentes tensoactivos
Parámetros de Optimización—Los principales parámetros a aquirales micelizados.
considerar en el desarrollo de separaciones por CECM son los Otros Aditivos—La selectividad se puede modificar agregando
parámetros instrumentales y de la solución electrolı́tica. productos quı́micos al amortiguador del pH. También se emplea la
adición de varios tipos de ciclodextrinas al amortiguador del pH para
reducir la interacción de solutos hidrófobos con la micela,
PARÁMETROS INSTRUMENTALES aumentando la selectividad para este tipo de compuesto. La adición
de sustancias modificadoras de las interacciones soluto-micela por
Voltaje—El tiempo de separación es inversamente proporcional al adsorción en las micelas, se ha usado para mejorar la selectividad de
voltaje aplicado. Un aumento en el voltaje podrı́a generar calor las separaciones en CECM. Estos aditivos pueden ser un segundo
excesivo, aumentando los gradientes de temperatura y de viscosidad agente tensoactivo (iónico o no iónico) que da lugar a la formación
de la solución amortiguadora en la sección transversal del capilar. de micelas mixtas, o cationes metálicos que se disuelven en la micela
Este efecto puede ser significativo con amortiguadores del pH de alta y forman complejos de coordinación con los solutos.
conductividad, como por ejemplo aquellos que contienen micelas.
La disipación insuficiente del calor ensancha la banda y disminuye la
resolución. ANÁLISIS CUANTITATIVO
Temperatura—Las variaciones en la temperatura del capilar
afectan el coeficiente de partición del soluto entre la solución Las áreas de los picos se dividen por el tiempo de migración
amortiguadora y la micela, la concentración crı́tica de micelas y la correspondiente para obtener el área corregida a fin de compensar el
viscosidad de la solución amortiguadora. Estos parámetros con- cambio en el tiempo de migración de corrida a corrida, reduciendo la
tribuyen al tiempo de migración de los solutos. variación de la respuesta. También compensa las distintas respuestas
de los constituyentes de la muestra que tienen diferentes tiempos de
Capilar—El largo y el diámetro interno contribuyen al tiempo de migración. Cuando se usa un estándar interno, hay que verificar que
análisis y a la eficiencia de las separaciones. El aumento del largo no enmascare ninguno de los picos de la sustancia a examinar.
efectivo y del largo total puede disminuir los campos eléctricos,
trabajando a un voltaje constante, aumenta el tiempo de migración y Cálculos—A partir de los valores obtenidos, calcular el contenido
mejora la eficiencia de la separación. El diámetro interno controla la del componente o componentes que se están determinando. Cuando
disipación de calor, con un amortiguador del pH dado y a un campo se indique, se calcula el porcentaje de uno o más componentes de la
eléctrico dado y ensancha la banda de la muestra. muestra a examinar determinando las áreas del pico o picos como
porcentaje de las áreas totales corregidas de todos los picos,
excluyendo aquellos debidos a disolventes o reactivos agregados. Se
recomienda usar un sistema de integración automático (sistema
PARÁMETROS DE LA SOLUCIÓN ELECTROLÍTICA integrador o de adquisición y procesamiento de datos).
Tipo y Concentración del Agente Tensoactivo—El tipo de
agente tensoactivo, al igual que la fase estacionaria en cromatografı́a, Aptitud del Sistema de Electroforesis Capilar
afecta la resolución ya que modifica la selectividad de la separación.
El logaritmo de K’ de un compuesto neutro aumenta linealmente con La elección de los parámetros de aptitud a usar depende del tipo
la concentración de detergente en la fase móvil. La resolución en de electroforesis capilar. Estos parámetros son el factor de capacidad
CECM alcanza un máximo cuando K’ se acerca al valor de (K’) usado únicamente para la Electroforesis Electrocinética Micelar,
el número de platos teóricos (n), el factor de simetrı́a (AS) y la
resolución (RS). Es de destacar que las expresiones teóricas para n y
RS se han descrito en las secciones anteriores, pero las ecuaciones
la modificación de la concentración del agente tensoactivo en la fase más prácticas que permiten la determinación de estos parámetros de
móvil cambia la resolución. aptitud usando electroforetogramas se describen a continuación.
pH de la Solución Amortiguadora—El pH no modifica el El número de platos teóricos (n) se puede calcular a partir de la
coeficiente de partición de solutos no ionizados, pero puede fórmula:
modificar el flujo electroosmótico en capilares sin recubrimiento. n = 5,54 (t / b0,5)2
Una disminución en el pH de la solución amortiguadora disminuye
el flujo electroosmótico y por lo tanto aumenta la resolución de los en donde t es la distancia, en mm, a lo largo de la lı́nea base entre el
solutos neutros, aumentando el tiempo de análisis. punto de inyección y la perpendicular trazada desde el máximo del
Disolventes Orgánicos—Se pueden agregar modificadores pico en cuestión; y b0,5 es el ancho del pico, en mm, a la mitad de su
orgánicos (metanol, propanol, acetonitrilo, etc.) a la solución altura.
electrolı́tica de separación para mejorar la separación de compuestos La resolución (RS) se puede calcular a partir de la fórmula:
hidrófobos. La adición de estos modificadores generalmente RS = 1,18(tb – ta / b0,5b þ b0,5a)
disminuye el tiempo de migración y la selectividad de la separación.
La adición de modificadores orgánicos afecta la formación de en donde tb y ta son las distancias, en mm, a lo largo de la lı́nea base,
micelas, por lo tanto sólo se puede usar una concentración dada de entre el punto de inyección y la perpendicular trazada desde el
un agente tensoactivo con un cierto porcentaje de un modificador máximo de los dos picos adyacentes (tb 4 ta); y b0,5b y b0,5a son los
orgánico antes de eliminar o alterar el equilibrio de micelación, con anchos de los picos, en mm, a la mitad de su altura.
lo cual desaparecen las micelas y desaparece el mecanismo de La resolución (RS) también se puede calcular midiendo la altura
partición de la CECM. La eliminación de micelas en presencia de un del valle (c) entre dos picos parcialmente resueltos en una
alto contenido de disolvente orgánico no siempre significa que la preparación estándar, la altura del pico más pequeño (d) y
separación ya no será posible, dado que en ciertos casos, la especificando que (c/d)5x, en donde x es el lı́mite indicado en la
interacción hidrófoba entre el monómero tensoactivo iónico y los monografı́a correspondiente.
solutos neutros forman complejos solvofobos que se pueden separar El factor de simetrı́a de un pico (AS) se puede calcular usando la
electroforéticamente. fórmula:
Aditivos para Separaciones Quirales—Se incluye un selector
quiral en el sistema micelar ya unido al agente tensoactivo por enlace AS = b0,05/2A
covalente o agregado al electrolito de separación micelar. Las en donde b0,05 es el ancho del pico a una vigésima parte de la altura
micelas que tienen un grupo con propiedades de discriminación del pico; y A es la distancia entre la perpendicular trazada desde el
quiral incluyen sales, ácidos N-dodecanoil-L-aminoácidos, sales máximo del pico y el borde frontal del pico a una vigésima parte de
biliares, etc. La resolución quiral también se puede lograr usando la altura del pico.
520 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
Otros parámetros de aptitud del sistema incluyen pruebas para la por centı́metro y –dm/dpH es la variación de la movilidad del soluto
repetibilidad del área (es decir, la desviación estándar de las áreas o en función del pH en la región cercana al pI. Como no se pueden
del área/tiempo de migración) y pruebas para la repetibilidad del alterar D y –dm/dpH para una proteı́na dada, la separación se puede
tiempo de migración (es decir, la desviación estándar del tiempo de mejorar usando un intervalo de pH más estrecho y aumentando la
migración). Para la repetibilidad del tiempo de migración, es intensidad del campo eléctrico.
necesario usar una prueba para medir la aptitud de los procedi- Desde un punto de vista operativo, se debe prestar especial
mientos de lavado del capilar. Para evitar tiempos de migración no atención a las caracterı́sticas de la muestra o a su preparación. La sal
repetibles, una práctica alternativa es usar un tiempo de migración en una muestra puede ser un problema y en lo posible es mejor
relativo al estándar interno. preparar la muestra en agua desionizada o anfolitos al 2% usando
Una prueba para verificar la relación señal-ruido de una diálisis o filtración con gel si fuera necesario. Se han usado
preparación estándar o para determinar el lı́mite de cuantificación potenciales de 2500 voltios y se consideran óptimos en ciertas
es un parámetro útil para medir la aptitud del sistema. El lı́mite de condiciones. Se pueden aplicar hasta 30 vatios de potencia constante
detección y el lı́mite de cuantificación corresponden a una relación y generalmente se produce una separación completa en 1,5 a 3,0
señal-ruido mayor que 3 y 10, respectivamente. La relación señal- horas. El tiempo necesario para completar el enfoque en capas
ruido (S/N) se calcula del siguiente modo: delgadas de gel de poliacrilamida se determina colocando una
proteı́na coloreada (p. ejemplo: hemoglobina) en distintas posiciones
S/N = 2H/hn en la superficie del gel y aplicando el campo eléctrico: el estado
en donde H es la altura del pico correspondiente en el estacionario se alcanza cuando todas las aplicaciones dan un patrón
electroforetograma obtenido con la solución de referencia especifi- de banda idéntico. En algunos procedimientos, se determina que el
cada; y hn es el valor absoluto de la máxima fluctuación de ruido enfoque está completo según el tiempo transcurrido después de la
desde la lı́nea base en un electroforetograma obtenido después de aplicación de la muestra.
inyectar un blanco y observado sobre una distancia igual a veinte La resolución entre las bandas de proteı́nas en un gel de IEF
veces el ancho a la mitad de la altura del pico en el preparado con anfolitos transportadores puede ser muy buena. Se
electroforetograma obtenido con la solución de referencia y situado puede lograr una mejor resolución usando gradientes de pH
equitativamente alrededor del lugar donde se encontrarı́a este pico. inmovilizados donde las sustancias amortiguadoras, que son
análogas a los anfolitos transportadores, se copolimerizan dentro
de la matriz de gel. Las proteı́nas que muestran pI que difieren tan
sólo en 0,02 unidades de pH se pueden resolver usando un gel
ISOELECTROENFOQUE preparado con anfolitos transportadores, mientras que los gradientes
El isoelectroenfoque (IEF, por su sigla en inglés) es un método de de pH inmovilizados pueden resolver proteı́nas que difieran en
electroforesis que separa proteı́nas según sus puntos isoeléctricos. La aproximadamente 0,001 unidades de pH.
separación se lleva a cabo en una capa gruesa de gel de El gel de IEF se puede usar como prueba de identidad cuando la
poliacrilamida o agarosa que contiene una mezcla de electrólitos migración en el gel se compara con una preparación estándar y
anfotéricos (anfolitos). Cuando se aplica un campo eléctrico, los proteı́nas de calibración de IEF; el gel de IEF se puede usar como
anfolitos migran en el gel, creando un gradiente de pH. En algunos prueba de lı́mite cuando la densidad de una banda en el IEF se
casos, se usan geles que contienen un gradiente de pH inmovilizado, compara subjetivamente con la densidad de las bandas que aparecen
preparado por incorporación de ácidos y bases débiles en regiones en una preparación estándar, o se puede usar como prueba semi-
especı́ficas de la red de gel durante su preparación. Cuando las cuantitativa cuando la densidad se mide usando un densitómetro o
proteı́nas aplicadas alcanzan la zona del gel que tiene un pH igual a instrumental similar para determinar la concentración relativa de
su punto isoeléctrico, su carga se neutraliza y la migración cesa. Los proteı́na en las bandas.
gradientes se pueden formar en diversos intervalos de pH, según la
mezcla de anfolitos elegida.
Aparato
Un aparato para isoelectroenfoque consiste en un generador de
Principios Generales corriente continua controlable, de salida estabilizada; una cámara
Cuando una proteı́na está en la posición de su punto isoeléctrico, plástica rı́gida de isoelectroenfoque que contienen una placa enfriada
no tiene carga neta y el campo eléctrico no la puede mover en una de un material adecuado para sostener el gel; y una cubierta plástica
matriz de gel. Sin embargo, se puede mover de dicha posición por con electrodos de platino que se conectan al gel por medio de papel
difusión. El gradiente de pH obliga a la proteı́na a mantenerse en la absorbente de largo, ancho y grosor adecuados, impregnado con
posición de su punto isoeléctrico, concentrándola, este efecto de soluciones de electrólitos anódicos y catódicos.
concentración se denomina "enfoque". Al aumentar el voltaje
aplicado o reducir la carga de la muestra, hay una mejor resolución
de las bandas. El voltaje aplicado está limitado por el calor generado, Procedimiento
que necesita ser disipado. El uso de geles delgados y una placa de
enfriamiento eficiente que esté controlada por un circulador A menos que se indique lo contrario en una monografı́a dada, se
termostático evita que el gel se queme y permite un enfoque usará el procedimiento siguiente en geles de poliacrilamida en capa
nı́tido. La separación se estima mediante la diferencia de pI mı́nima gruesa.
que es necesaria para separar dos bandas vecinas, del siguiente
modo:
Preparación de los Geles— mezcla de las proteı́nas estándar se haya estabilizado. Usando pinzas,
Montaje—Está compuesto de una placa de vidrio (A) sobre la cual retirar las tiras de aplicación de la muestra y los dos papeles
se coloca la pelı́cula de poliéster (B) para facilitar la manipulación absorbentes de los electrodos. Sumergir el gel en la Solución
del gel, uno o más espaciadores (C), una segunda placa de vidrio (D) Fijadora para Gel de Poliacrilamida de Isoelectroenfoque. Incubar
y pinzas para mantener unida la estructura (ver Figura 1). con agitación suave a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Escurrir la solución y agregar 200 mL de la Solución de
Decoloración. Incubar con agitación durante 1 hora. Escurrir el
gel y agregar la Solución de Tinción Coomassie. Incubar durante 30
minutos. Desteñir el gel por difusión pasiva con la Solución de
Decoloración hasta que las bandas se vean bien contra un fondo
transparente. Ubicar la posición e intensidad de las bandas en el
electroferograma como se prescribe en cada monografı́a.
Procedimiento Alternativo—Cuando una monografı́a hace refe-
rencia al método general para el isoelectroenfoque antes descrito, se
pueden usar variaciones en la metodologı́a o el procedimiento,
sujetas a validación. Estas variaciones incluyen el uso de geles
previamente moldeados disponibles comercialmente; el uso de
gradientes de pH inmovilizados; el uso de varillas de gel; y el uso
de cartuchos de distintas dimensiones, incluyendo geles ultra
delgados (0,2 mm); las variaciones en el procedimiento de aplicación
de la muestra, incluyendo distintos volúmenes de muestra o el uso de
máscaras de aplicación de la muestra o tiras absorbentes que no sean
de papel; el uso de distintas condiciones de corrida, incluyendo
variaciones en el campo eléctrico dependiendo de las dimensiones
del gel y el equipo y el uso de tiempos de migración fijos en lugar de
la interpretación subjetiva de la estabilidad de la banda; la inclusión
de un paso previo al enfoque; el uso de instrumentación
automatizada; y el uso de geles de agarosa.
Otros Parámetros—Generalmente es necesario controlar la Si los picos que inicialmente eluyeron con tiempos de retención
temperatura de la columna para lograr una buena reproducibilidad. relativos significativamente diferentes luego se observan como picos
Las velocidades de flujo para las fases móviles varı́an de 0,1 a 2,0 únicos en la mezcla 1 : 1, la diferencia inicial serı́a una indicación de
mL por minuto y la detección de péptidos se realiza con un detector la variabilidad del sistema. Sin embargo, si se observan picos
UV entre 200 nm y 230 nm. Se han usado otros métodos de separados en la mezcla 1 : 1, esto indicarı́a la no equivalencia de los
detección (por ejemplo: derivatización postcolumna), pero no son péptidos en cada pico. Si un pico en la mezcla 1 : 1 es
tan robustos ni tan versátiles como la detección UV. significativamente más ancho que el pico correspondiente en la
Aptitud del Sistema—El apartado Aptitud del Sistema en muestra y el digerido del Estándar de Referencia USP o material de
Cromatografı́a h621i suministra un medio experimental para medir referencia, podrı́a indicar la presencia de péptidos diferentes. Se ha
el desempeño global del método de prueba. El criterio de aceptación propuesto y aplicado un software de reconocimiento de patrones
para la aptitud del sistema depende de la identificación de los para el análisis de los datos del mapeo de péptidos, pero los
parámetros crı́ticos de prueba que afectan la interpretación y problemas relacionados con la validación del software impiden que
aceptación de los datos. Estos parámetros crı́ticos también son pueda usarse en una prueba farmacopeica en el futuro cercano. Se
criterios que controlan la digestión y el análisis de péptidos. Un han usado otros enfoques automatizados que emplean fórmulas
indicador de que se logró el punto final de digestión deseado es la matemáticas, modelos y reconocimiento de patrones. Se han
comparación con un estándar de referencia o un material de propuesto enfoques tales como, por ejemplo, la identificación
referencia, el cual se trata exactamente como el artı́culo en análisis. automatizada de compuestos por espectroscopia IR y la aplicación
El uso de un Estándar de Referencia USP paralelamente con la de análisis espectral UV con arreglo de diodos para la identificación
proteı́na en análisis es crı́tico en el desarrollo y establecimiento de de péptidos. Estos métodos tienen limitaciones debido a resoluciones
los lı́mites de aptitud del sistema. Además, se debe incluir un inadecuadas, elución conjunta de fragmentos o diferencias en las
cromatograma de muestra con el Estándar de Referencia USP o respuestas absolutas de los picos entre el Estándar de Referencia
material de referencia a los efectos de la comparación. Otros USP o material de referencia y los fragmentos de la muestra.
indicadores pueden incluir la inspección visual de la solubilidad de La comparación numérica de los tiempos de retención y áreas o
la proteı́na o el péptido, la ausencia de proteı́nas intactas, o la alturas de los picos se puede realizar para un grupo seleccionado de
medición de respuestas de un péptido dependiente de la digestión. picos relevantes correctamente identificados en los mapas peptı́dicos.
Los parámetros crı́ticos de aptitud del sistema para el análisis de Las áreas de los picos se pueden calcular usando un pico como
péptidos dependerá de cada modo de separación y detección de referencia interna con relativamente poca variación, teniendo en
péptidos y de los requisitos de análisis de datos. cuenta que la integración del área del pico es sensible a la variación
Cuando se usa el mapeo de péptidos como prueba de identifica- de la lı́nea base y posiblemente introduzca un error en el análisis. De
ción, los requisitos de aptitud del sistema para los péptidos modo alternativo, se puede calcular la altura porcentual del pico de
identificados incluyen la selectividad y la precisión. En este caso, cada péptido con respecto a la suma de todas las alturas de los picos
al igual que cuando se realiza la identificación de variantes de para la muestra de prueba. El porcentaje se compara luego con el del
proteı́nas, la identificación de la estructura primaria de los pico correspondiente del Estándar de Referencia USP o material de
fragmentos peptı́dicos en el mapa peptı́dico suministra una referencia. La posibilidad de autohidrólisis de la tripsina se controla
verificación de la estructura primaria conocida y la identificación mediante la producción de un mapa peptı́dico blanco que es el mapa
de las variantes de las proteı́nas por comparación con el mapa obtenido cuando la solución blanco se trata con tripsina.
peptı́dico del Estándar de Referencia USP o material de referencia El requisito mı́nimo para la cuantificación de un mapeo de
para la proteı́na especificada. El uso de un material de referencia o péptidos es un procedimiento de prueba aprobado que incluye la
Estándar de Referencia USP digerido para una proteı́na dada en la aptitud del sistema como control de prueba. En general, para un
determinación de la resolución peptı́dica es el método de elección. IND, basta con la calificación del mapeo de péptidos para una
Para el análisis de una variante de una proteı́na, se puede usar una proteı́na. A medida que que avanza el proceso de aprobación
mezcla caracterizada de una variante y un estándar de referencia, reglamentario de la proteı́na, calificaciones adicionales de la prueba
especialmente si la variante del péptido se encuentra en una región pueden incluir una validación parcial del procedimiento analı́tico con
menos resuelta del mapa. El ı́ndice de uniformidad del patrón puede el fin de asegurar que el método funciona en la forma planeada en el
ser simplemente el número de péptidos principales detectados. La desarrollo del mapa peptı́dico para la proteı́na especificada.
uniformidad del patrón de péptidos se puede definir mejor por
resolución de los picos de los péptidos. Los parámetros cromato-
gráficos —tales como la resolución pico a pico, el ancho máximo de ANÁLISIS E IDENTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS
picos, factores de asimetrı́a de los picos y la eficiencia de la
columna— se pueden usar para definir la resolución peptı́dica. Esta sección es una guı́a para el uso del mapeo de péptidos
Dependiendo de la proteı́na en análisis y el método de separación durante la investigación que respalda las solicitudes reglamentarias.
que se use, pueden ser necesarios requisitos de resolución de un solo El uso de un mapa peptı́dico como herramienta cualitativa no
péptido o de múltiples péptidos. exige la caracterización completa de los picos de péptidos
El análisis repetido del digerido del Estándar de Referencia USP o individuales. Sin embargo, la validación del mapeo de péptidos en
material de referencia para la proteı́na en análisis produce medidas respaldo de las solicitudes reglamentarias exige la caracterización
de precisión y recuperación cuantitativa. La recuperación de los rigurosa de cada pico en el mapa peptı́dico. Los métodos para
péptidos identificados generalmente se puede determinar por el uso caracterizar picos varı́an desde la secuenciación N-terminal de cada
de estándares peptı́dicos internos o externos. La precisión se expresa pico seguida por un análisis de aminoácidos hasta el uso de
como la desviación estándar relativa (RSD). Es de esperar espectroscopı́a de masas (MS, por sus siglas en inglés).
diferencias en la recuperación y precisión de los péptidos A los efectos de la caracterización, cuando se usan la secuencia-
identificados; por lo tanto, hay que establecer los lı́mites de aptitud ción N-terminal y el análisis de aminoácidos, la separación analı́tica
del sistema tanto para la recuperación como para la precisión de los se aumenta en escala. Ya que el aumento en escala puede afectar la
péptidos identificados. Estos lı́mites son exclusivos para cada resolución de los picos de péptidos, es necesario asegurar con datos
proteı́na y se especificarán en las monografı́as individuales. empı́ricos que no haya pérdida de resolución debida al aumento en
La comparación visual de los tiempos de retención relativos, las escala. Se recogen los eluatos correspondientes a picos de péptidos
respuestas de los picos, el número de picos y el patrón de elución especı́ficos, se concentran al vacı́o y se cromatografı́an nuevamente,
global se completa inicialmente. Luego se complementa y respalda según sea necesario. El análisis de aminoácidos de los fragmentos
con el análisis matemático de los cocientes de respuesta de los picos puede estar limitado por el tamaño del péptido. Si el N-terminal
y el perfil cromatográfico de una mezcla 1 : 1 (v/v) de la muestra y el está bloqueado, puede ser necesario desbloquearlo antes de la
digerido del Estándar de Referencia USP o material de referencia. Si secuenciación. También se puede usar la secuenciación del C-
todos los picos en el digerido de la muestra y en el digerido del terminal de las proteı́nas con carboxipeptidasa y MALDITOF-MS
Estándar de Referencia USP o material de referencia tienen los para su caracterización.
mismos tiempos de retención relativos y cocientes de respuesta de El uso de MS para la caracterización de fragmentos peptı́dicos se
los picos, se confirma la identidad de la muestra en análisis. hace por infusión directa de péptidos aislados o por LC-MS en lı́nea
para el análisis estructural. En general, incluye el electrospray y la
ionización por desorción láser asistida por matriz acoplada a un
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 525
analizador de tiempo de vuelo (MALDITOF, por sus siglas en de péptidos individuales es más problemática y se maneja caso por
inglés) ası́ como también el bombardeo atómico rápido (FAB, por caso. Los factores crı́ticos de la validación de un mapa peptı́dico son
sus siglas en inglés). También se ha usado la MS en serie para los siguientes.
secuenciar una proteı́na modificada y para determinar la modifica- Procedimientos de Prueba Documentados por Escrito—Estos
ción aminoacı́dica producida. La comparación de los espectros de procedimientos incluyen una descripción detallada del método
masas de los digeridos antes y después de la reducción proporciona analı́tico en donde se definen los reactivos, equipos, preparación
un método para asignar las uniones disulfuro a los diferentes de la muestra, método de análisis y análisis de los datos.
péptidos que contienen sulfhidrilos. Protocolo de Validación—Se prepara un protocolo que incluye
Si hay regiones de la estructura primaria que no se demuestran un procedimiento para la validación de la prueba.
claramente en el mapa peptı́dico, podrı́a sea necesario realizar un
mapa peptı́dico secundario. El objetivo de un método validado de Criterio de Aceptación—El criterio puede ser mı́nimo en las
caracterización de una proteı́na a través del mapeo de péptidos es primeras etapas, pero debe definirse mejor a medida que progresan
conciliar y explicar al menos el 95% de la composición teórica de la los estudios de validación.
estructura de la proteı́na. Informe de los Resultados—En los resultados del estudio de
validación se documentan los parámetros analı́ticos indicados en el
protocolo de validación.
El Uso del Mapeo de Péptidos para la Evaluación de Revalidación del Procedimiento de la Prueba—Si el método
Estabilidad Genética empleado exige alteraciones que podrı́an afectar los parámetros
analı́ticos previamente evaluados en la validación, es necesario
Se puede usar un mapa peptı́dico validado para evaluar la volver a validar el procedimiento de la prueba. Si hay cambios
integridad de la secuencia primaria prevista de un producto proteı́co significativos en el procesamiento del artı́culo, en los laboratorios
(es decir, su estabilidad genética). También se puede usar para que realizan el análisis, en la formulación de los productos a granel o
determinar la uniformidad lote a lote de productos biotecnológicos. terminados y en cualquier otro parámetro importante, se exigirá la
Además, la expresión de la proteı́na en el sistema de producción se revalidación de los métodos.
evalúa mejor a través del mapeo de péptidos de la proteı́na
expresada. Los mapas peptı́dicos de proteı́nas producidos en diversas
etapas de la expresión de la proteı́na, incluyendo un punto más alla REQUISITOS
del tiempo normal de expresión de la proteı́na, comparados con los
de un Estándar de Referencia USP o material de referencia, sirven Precisión—
para evaluar la estabilidad genética del sistema de expresión en Precisión Intra Prueba—Es una medida de la reproducibilidad del
función del tiempo. mapeo de péptidos. Los dos pasos crı́ticos en el mapeo de péptidos
Pueden surgir variantes de las secuencias de las proteı́nas a partir son la fragmentación (es decir, digestión) y la separación de
de una variación genética en el ADN (mutación puntual) o como un péptidos. La precisión es aceptable cuando los tiempos de retención
error en la traducción. El mejor enfoque es un mapa peptı́dico absolutos y las áreas de los picos relativos son constantes de corrida
validado para la detección de variantes de proteı́nas. Sin embargo, se a corrida y la variación promedio en el tiempo de retención es
deben considerar las limitaciones inherentes del mapeo de péptidos. pequeña en relación con la del pico de referencia interno
La detección de una variante estructurada es posible únicamente si el seleccionado. La reproducibilidad del mapa se puede mejorar si se
péptido variante correspondiente es fácil de aislar y caracterizar. Para usa un horno de columna con control de temperatura, si se equilibra
establecer la estabilidad genética es necesario usar una baterı́a de exhaustivamente el sistema antes de comenzar la prueba, si primero
métodos bioquı́micos, siempre que las variantes tengan propiedades se realiza una determinación con un blanco (mezcla de digerido
distintas de las de la proteı́na ‘‘normal’’. control sin proteı́na) para minimizar los ‘‘efectos de la primera
corrida’’ y si se intercala periódicamente un digerido del material de
referencia o del Estándar de Referencia USP con las muestras de
Validación prueba para evaluar la variación sistemática de la cromatografı́a.
Los criterios para validar el paso de fragmentación son similares a
FACTORES CRÍTICOS los descritos a continuación para la separación de péptidos, pero se
cumplen para pruebas consecutivas de una serie de digeridos
La validación del mapeo de péptidos exige el diseño de un preparados por separado de la proteı́na en análisis.
protocolo que describa detalladamente el experimento a realizar y los Los criterios para la validación del paso de separación de péptidos
criterios para la aceptación del mapa. Los criterios para la aceptación incluyen lo siguiente:
del mapeo incluyen lı́mites de detección, especificidad, linealidad, 1. La desviación estándar promedio de los tiempos de retención
rango, exactitud, precisión y estabilidad de los reactivos. La absolutos de todos los picos principales para un conjunto de
reproducibilidad del mapa peptı́dico es un elemento crı́tico en su pruebas consecutivas del mismo digerido no excede un criterio
utilización como prueba de identidad y para confirmar la estabilidad de aceptación especificado.
genética. Se analizarán aquellos aspectos técnicos del mapeo de 2. La desviación estándar promedio del área de pico absoluta para
péptidos que influencian la reproducibilidad del mapa. todos los picos principales totalmente resueltos no excede un
El ajuste de los lı́mites, con respecto a la cuantificación (área o porcentaje especificado.
altura del pico) e identificación (tiempos de retención) para el grupo Precisión Inter Pruebas—Esta es una medida de la reproducibi-
seleccionado de picos relevantes se basa en observaciones empı́ricas. lidad del mapeo de péptidos cuando la prueba se realiza en distintos
Estos lı́mites detectan diferencias significativas entre la muestra y el dı́as, por distintos analistas, en distintos laboratorios, con reactivos o
Estándar de Referencia USP o material de referencia dentro de una enzimas de distintos proveedores o con distintos lotes del mismo
serie de análisis. proveedor, con instrumental diferente, en columnas de fabricación
Otro problema crı́tico es la recuperación de péptidos y su efecto distinta o columnas de igual fabricación pero de lotes distintos y en
sobre la determinación y reproducibilidad de las áreas de los picos y columnas individuales de la misma fabricación y el mismo lote. Si
en el establecimiento de criterios de aceptación. Los criterios de bien serı́a preferible, desde una perspectiva cientı́fica, validar el
recuperación tratan todos los aspectos de metodologı́a de la prueba, efecto de todas estas variables sobre la precisión, un enfoque
desde la digestión hasta las condiciones cromatográficas. La práctico es validar la prueba usando aquellas variables que sean más
determinación de la recuperación de péptidos incluye el análisis probables de encontrar en condiciones operativas. Se pueden incluir
cuantitativo de aminoácidos, el agregado de cantidades conocidas, el variables adicionales cuando sea necesario.
marcado radioactivo y la sumatoria UV. Una recuperación general de El diseño experimental permite al analista realizar comparaciones
aproximadamente el 80% se considera satisfactoria. La recuperación usando tiempos de retención de picos y áreas de picos que se
expresen con relación a un pico de referencia interno altamente
reproducible dentro del mismo cromatograma. El área de pico
relativa se expresa como el cociente entre el área del pico y el área
del pico de referencia interna. El tiempo de retención relativo se
526 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
puede expresar como la diferencia entre el tiempo de retención Estabilidad del Digerido—Se evalua el tiempo de almacenamiento
absoluto y el tiempo de retención del pico de referencia. El uso de de un digerido y las condiciones de almacenamiento antes de la
valores relativos elimina la necesidad de realizar correcciones cromatografı́a. Se almacenan varias alı́cuotas de un mismo digerido
separadas por diferencias de volumen de un inyector a otro, por en distintas condiciones de almacenamiento y se cromatografı́an.
unidades de medición de las áreas de los picos, por dimensiones de Estos mapas luego se evaluan para buscar diferencias significativas.
la columna y por volúmenes de espacio muerto de los instrumentos. Reproducibilidad—Se repite la determinación de varios de los
Se espera que la variabilidad en los tiempos de retención y en las parámetros indicados anteriormente usando el mismo Estándar de
áreas de los picos para los experimentos de Precisión Inter Pruebas Referencia USP o material de referencia y la misma muestra de la
sea ligeramente mayor que la variabilidad observada para la prueba en al menos dos laboratorios distintos y por dos analistas,
Precisión Intra Prueba. equipados con sistemas HPLC similares. Luego se evalúan los
Robustez—La composición de la Fase Móvil, la calidad de la mapas peptı́dicos generados para ver si existen diferencias
proteasa o la pureza de los reactivos quı́micos, la variación y edad de significativas.
una columna y la estabilidad del digerido son todos factores que
podrı́an afectar el desempeño general de la prueba y su
reproducibilidad. Se evalúan las tolerancias para cada parámetro ELECTROFORESIS EN GEL DE
clave y se establecen los lı́mites de la lı́nea base en caso de que la POLIACRILAMIDA
prueba se use para la liberación rutinaria de lotes.
Fase Móvil—La composición de la Fase Móvil se optimizará para La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se usa para la
obtener la máxima resolución de péptidos en todo el perfil de caracterización cualitativa de proteı́nas en preparaciones biológicas,
elución. Se prefiere un equilibrio entre la resolución óptima y la para control de pureza y para determinaciones cuantitativas. Este
reproducibilidad general. Un pH menor podrı́a mejorar la separación procedimiento se limita al análisis de proteı́nas con un peso entre
entre los picos pero podrı́a acortar la vida de la columna, dando 14 000 y 100 000 Da. Es posible ampliar la extensión de pesos de
como resultado una falta de reproducibilidad. Los mapas peptı́dicos una electroforesis en gel con diversas técnicas (por ejemplo, geles de
a un pH por encima o por debajo del pH del procedimiento se gradiente o ciertos sistemas amortiguadores de pH), pero dichas
comparan con el mapa peptı́dico obtenido al pH del procedimiento y técnicas no se tratarán en este capı́tulo. La electroforesis en gel
se observa si hay diferencias significativas; también se revisan con analı́tica es un método adecuado para identificar y evaluar la
respecto a los criterios de aceptación establecidos en el protocolo de homogeneidad de las proteı́nas en los fármacos. Estos métodos se
validación. usan de forma rutinaria para estimar los pesos moleculares de
Calidad de la Proteasa o Pureza de los Reactivos Quı́micos—Se subunidades proteı́cas y para determinar las composiciones de
prepara y digiere una muestra del Estándar de Referencia USP o subunidades proteı́cas purificadas.
material de referencia para la proteı́na en análisis con distintos lotes Hay geles y reactivos listos para usar disponibles comercialmente,
del agente de escisión. En los cromatogramas para cada digerido se que pueden usarse en lugar de los que se describen en este capı́tulo,
comparan las áreas de los picos, su forma y el número de picos. Se siempre que proporcionen resultados equivalentes y que cumplan
puede aplicar el mismo procedimiento a otras sustancias quı́micas o con los requisitos de validación.
tratamientos previos usados durante la preparación de la muestra,
como por ejemplo los reactivos reductores y de carboximetilación.
Consideraciones de la Columna—La variabilidad entre una Principio General de la Electroforesis
columna y otra, incluso dentro de un mismo lote, puede afectar el
desempeño de la columna en el desarrollo de mapas peptı́dicos. El Bajo la influencia de un campo eléctrico, las partı́culas cargadas
tamaño de la columna también puede producir diferencias migran en la dirección del electrodo que tiene polaridad opuesta. En
significativas. Se digiere un Estándar de Referencia USP o material la electroforesis en gel, los movimientos de las partı́culas se retrasan
de referencia de la proteı́na de prueba y el digerido se cromatografı́a por interacciones con la matriz de gel que las rodea, la cual actúa
en distintos lotes de columna de un mismo fabricante. Luego se como un tamiz molecular. Las interacciones opuestas de la fuerza
evalua el perfil de elución general, los tiempos de retención, la eléctrica y del tamiz molecular dan como resultado velocidades de
resolución de selectividad y la recuperación de los mapas. Para migración diferenciales, de acuerdo a los tamaños, formas y cargas
evaluar la robustez de la columna durante toda su vida útil, se debe de las partı́culas. Debido a sus diferentes propiedades fisicoquı́micas,
realizar una prueba de mapeo de péptidos en distintas columnas y las distintas macromoléculas de una mezcla migran a distintas
variar significativamente el número de inyecciones (por ejemplo, de velocidades durante la electroforesis y ası́ se separan, formando
10 inyecciones a 250 inyecciones). Los mapas resultantes se fracciones discretas. Las separaciones electroforéticas pueden
comparan buscando diferencias significativas en el ensanchamiento realizarse en sistemas sin fases de soporte (por ejemplo, separación
de los picos, área de los picos y resolución general. A medida que la por electroforesis capilar en solución libre) y en medios estabiliza-
columna envejece, podrı́a observarse un aumento en la contrapresión dores, tales como placas de capa delgada, pelı́culas o geles.
que podrı́a afectar los mapas peptı́dicos.
Una precaución razonable en el uso de columnas de mapeo de
péptidos es seleccionar columnas alternativas, en caso de que las Caracterı́sticas de Geles de Poliacrilamida para
columnas originales no estén disponibles o dejen de fabricarse. Electroforesis de Proteı́nas
Realizar una prueba de mapeo de péptidos usando columnas
equivalentes de distintos fabricantes y examinar los mapas. Las Las propiedades de tamizado de los geles de poliacrilamida se
diferencias en la forma y el tamaño de las partı́culas, el tamaño y establecen mediante la red tridimensional de fibras y poros formada
volumen de los poros, la carga de carbono y el recubrimiento cuando la bisacrilamida bifuncional se entrecruza en forma
terminal pueden dar lugar a diferencias significativas en los tiempos adyacente a las cadenas de poliacrilamida. La polimerización se
de retención, la selectividad del perfil de elución, la resolución y la cataliza con un sistema generador de radicales libres compuesto de
recuperación. Podrı́a ser necesario hacer ligeras modificaciones en el persulfato de amonio y N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED).
perfil del gradiente para lograr mapas equivalentes cuando se usen A medida que aumenta la concentración de acrilamida de un gel,
columnas de distintos fabricantes. [NOTA—Debe considerarse la disminuye el tamaño efectivo de sus poros. El tamaño efectivo del
equivalencia entre la instrumentación usada para la validación de la poro de un gel se define operacionalmente por sus propiedades de
prueba y para la prueba de control de calidad de rutina. Podrı́a ser tamizado, es decir, por la resistencia que imparte a la migración de
preferible usar el mismo sistema HPLC para todas las aplicaciones. macromoléculas. Existen lı́mites con respecto a las concentraciones
De lo contrario, se determina la equivalencia del sistema, lo cual de acrilamida que se pueden usar. En concentraciones altas de
puede exigir algunos cambios en las condiciones de la prueba acrilamida, los geles se rompen con mucha más facilidad y son
cromatográfica.] difı́ciles de manipular. A medida que disminuye el tamaño del poro
de un gel, disminuye la velocidad de migración de una proteı́na a
través del gel. Al ajustar el tamaño de poro de un gel, mediante la
modificación de la concentración de acrilamida, se puede optimizar
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 527
la resolución del método para un producto proteı́co dado. Por lo ciones similares para que las comparaciones sean válidas. Sin
tanto, un gel se caracteriza fı́sicamente por su composición de embargo, la tinción de una única banda en un gel de este tipo es un
acrilamida y bisacrilamida. indicador de pureza.
Además de la composición del gel, el estado de la proteı́na es un
factor importante para la movilidad electroforética. En el caso de las
proteı́nas, la movilidad electroforética depende del valor pK de los CARACTERÍSTICAS DE UN SISTEMA AMORTIGUADOR DE PH
grupos cargados y del tamaño de la molécula. Está influenciada por DISCONTINUO
el tipo, la concentración y el pH del amortiguador, por la temperatura
y la fuerza del campo y por la naturaleza del material de soporte. El método eletroforético más popular para la caracterización de
una mezcla compleja de proteı́nas usa un sistema amortiguador de
pH discontinuo compuesto por dos geles contiguos pero diferencia-
Desnaturalización con Dodecilsulfato de Sodio dos: un gel de resolución o separador (inferior) y un gel concentrador
(superior). Los dos geles están conformados con diferentes
La desnaturalización de PAGE con dodecilsulfato de sodio (SDS) porosidades, pH y fuerzas iónicas. Además, se usan distintos iones
es el modo más común de electroforesis para evaluar la calidad móviles en el gel y en los amortiguadores de pH de los electrodos.
farmacéutica de productos proteicos. Tı́picamente, la electroforesis La discontinuidad del amortiguador del pH concentra grandes
analı́tica de proteı́nas se realiza bajo condiciones que aseguran la volúmenes de muestra en el gel concentrador, mejorando ası́ la
disociación de las proteı́nas en sus subunidades polipeptı́dicas resolución. Cuando se aplica electricidad, se produce una caı́da de
individuales y que minimizan la aglomeración de estas subunidades. voltaje a través de la solución de muestra que conduce a las proteı́nas
El detergente Dodecil Sulfato de Sodio fuertemente aniónico se usa hacia el gel concentrador. Los iones de glicinato del amortiguador de
combinado con calor para disociar las proteı́nas antes de que se pH de los electrodos siguen a las proteı́nas hacia el gel concentrador.
coloquen en el gel. Los polipéptidos desnaturalizados se unen al Se forma rápidamente un frente móvil con los iones de cloruro de
SDS, adquieren carga negativa y exhiben una relación carga-peso alta movilidad adelante y los iones relativamente lentos de glicinato
estable, sin importar el tipo de proteı́na. Como la cantidad de SDS atrás. Se forma un gradiente de alto voltaje localizado entre los
unido casi siempre es proporcional al peso molecular del polipéptido frentes de iones delanteros y traseros, haciendo que los complejos
y es tı́picamente independiente de su secuencia, los complejos SDS- SDS-proteı́na se acumulen en una zona delgada (concentrado) y
polipéptido migran a través de los geles de poliacrilamida en forma migren entre las fases de cloruro y glicinato. Dentro de un amplio
razonablemente proporcional al tamaño del polipéptido. lı́mite, sin importar la altura de la muestra aplicada, todos los SDS-
Las movilidades electroforéticas de todos los complejos deter- proteı́nas se condensan en una región muy estrecha e ingresan al gel
gente-polipéptido resultantes adoptan la misma relación funcional separador como una zona delgada, bien definida, de alta densidad
con los pesos moleculares de los polipéptidos. La migración de los proteica. El gel concentrador, de grandes poros, no retrasa la
derivados SDS es hacia el ánodo de un modo predecible, migración de la mayorı́a de las proteı́nas y sirve principalmente
observándose que los complejos de bajo peso molecular migran como un medio anticonvectivo. En la interfase entre el gel
más rápido que los complejos más grandes. Esto significa que el concentrador y el gel separador, las proteı́nas sufren un marcado
peso molecular de una proteı́na se puede estimar por su movilidad retardo, debido al tamaño de poro restrictivo del gel separador. Una
relativa en SDS-PAGE calibrada y que una banda única en un gel de vez en el gel separador, las proteı́nas continúan siendo ralentizadas
este tipo es un indicador de pureza. por el tamizado de la matriz. Los iones de glicinato sobrepasan a las
Sin embargo, las modificaciones de la cadena principal, tales proteı́nas, que se mueven entonces en un espacio de pH uniforme
como la N-glicosilación o la O-glicosilación, tienen un efecto formado por TRIS y glicina. El tamizado molecular hace que los
significativo sobre el peso molecular aparente de una proteı́na. Esto complejos SDS-polipéptido se separen según sus pesos moleculares.
se debe a que el SDS no se une a los grupos carbohidrato de la
misma manera que a los polipéptidos. Por lo tanto, no se mantiene
una relación estable carga-peso. El peso molecular aparente de PREPARACIÓN DE GELES
proteı́nas con modificaciones postraduccionales no refleja con
exactitud el peso de la cadena polipeptı́dica. En una solución amortiguadora discontinua de gel de SDS-
poliacrilamida, es importante verter el gel separador, dejarlo
solidificar y verter luego el gel concentrador, porque los geles
CONDICIONES REDUCTORAS tienen diferente composición de acrilamida-bisacrilamida, solución
amortiguadora y pH.
Las subunidades de polipéptidos y su estructura tridimensional se Soluciones Madre de Gel—
mantienen en las proteı́nas mediante uniones disulfuro. Un objetivo
del análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras es romper esta Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 30%—Preparar una
estructura por reducción de las uniones disulfuro. La desnaturaliza- solución que contenga 290 g de acrilamida y 10 g de metilen-
ción y disociación completa de proteı́nas por tratamiento con 2- bisacrilamida por L de agua tibia y filtrar. [NOTA—La acrilamida y la
mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) despliega el esqueleto polipep- metilen-bisacrilamida se convierten, lentamente, durante el almace-
tı́dico, formándose luego un complejo con SDS. En estas namiento, en ácido acrı́lico y ácido bisacrı́lico respectivamente. Esta
condiciones, el peso molecular de las subunidades de polipéptidos reacción de desamidación es catalizada por la luz y los álcalis. El pH
se puede calcular por regresión lineal, en presencia de estándares de la solución debe ser de 7,0 o inferior. Almacenar la solución en
adecuados de peso molecular. frascos oscuros, a temperatura ambiente. Preparar todos los meses
soluciones nuevas.]
Solución de Persulfato de Amonio—Preparar una pequeña
CONDICIONES NO REDUCTORAS cantidad de solución, con una concentración de 100 g de persulfato
de amonio por L y almacenar a 48. [NOTA—El persulfato de amonio
Para algunos análisis, no es conveniente la disociación completa proporciona los radicales libres que impulsan la polimerización de la
de la proteı́na en subunidades peptı́dicas. En ausencia de tratamiento acrilamida y la bisacrilamida. El persulfato de amonio se
con agentes reductores, los enlaces disulfuro covalentes permanecen descompone lentamente; por lo tanto, se deben preparar soluciones
intactos, preservando la forma oligomérica de la proteı́na. Los nuevas semanalmente.]
complejos de SDS-proteı́na oligomérica migran más lentamente que TEMED—Usar un reactivo de grado electroforético. [NOTA— El
sus subunidades SDS-polipéptido. Además, las proteı́nas no TEMED acelera la polimerización de acrilamida y bisacrilamida,
reducidas no se pueden saturar por completo con SDS y, por lo catalizando la formación de radicales libres a partir del persulfato de
tanto, no pueden unirse al detergente en una relación de peso amonio. Como el TEMED sólo funciona cuando es una base libre, a
constante. Esto hace que las determinaciones de peso molecular de un pH bajo la polimerización se inhibe.]
estas moléculas sean menos sencillas que los análisis de polipéptidos Solución de SDS—Usar un reactivo de grado electroforético.
completamente desnaturalizados, porque es necesario que las Preparar una solución con una concentración de aproximadamente
proteı́nas estándar y las proteı́nas desconocidas tengan configura- 100 g de SDS por L y almacenar a temperatura ambiente.
528 h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas / Información General USP 30
Acrilamida al 8%
Agua 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3
30%
Solución Amortiguadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Solución de SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
Solución de Persulfato de Amonio 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03
Acrilamida al 10%
Agua 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7
30%
Solución Amortiguadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Solución de SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
Solución de Persulfato de Amonio 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Acrilamida al 12%
Agua 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0
30%
Solución Amortiguadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Solución de SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
Solución de Persulfato de Amonio 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Acrilamida al 14%
Agua 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2
30%
Solución Amortiguadora 1,5 M 1,2 2,5 3,6 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Solución de SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
Solución de Persulfato de Amonio 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Acrilamida al 15%
Agua 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5
Solución de Acrilamida-Bisacrilamida al 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0
30%
Solución Amortiguadora 1,5 M 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5
Solución de SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
Solución de Persulfato de Amonio 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5
TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Solución Fijadora 2—Transferir 250 mL de metanol a un matraz Inmediatamente después de correr el gel, se marca la posición del
volumétrico de 500 mL, agregar 0,27 mL de formaldehı́do, diluir a colorante de rastreo de azul de bromofenol para identificar el borde
volumen con agua y mezclar. frontal de iones electroforéticos. Esto se puede realizar cortando
Reactivo de Nitrato de Plata—A una mezcla de 40 mL de muescas en los bordes del gel, o insertando una aguja empapada en
hidróxido de sodio 1 M y 3 mL de hidróxido de amonio, agregar gota tinta china en el gel, en el frente de tinción. Después de la tinción,
a gota 8 mL de una solución de nitrato de plata de 200 g por L, con medir las distancias de migración de cada banda de proteı́na
agitación; diluir con agua a 200 mL y mezclar. (marcadoras y desconocidas) desde la parte superior del Gel
Solución de Desarrollo—Transferir 2,5 mL de solución de ácido Separador. Dividir la distancia de migración de cada proteı́na por
cı́trico (2 en 100) y 0,27 mL de formaldehı́do a un matraz la distancia recorrida por el colorante de rastreo. Las distancias de
volumétrico de 500 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. migración normalizadas ası́ obtenidas se denominan movilidades
relativas de las proteı́nas (con respecto al frente de tinción) y se
Solución de Detención—Preparar una solución de ácido acético al denominan convencionalmente RF. Construir un gráfico (semiloga-
10% (v/v). rı́tmico) del logaritmo de los pesos moleculares (MR) de los
Tinción Coomassie—Sumergir el gel en un exceso de Solución estándares de proteı́nas en función de los valores RF. [NOTA—Las
de Tinción Coomassie e incubar durante al menos 1 hora. Retirar la gráficas son levemente sigmoideas.] A partir de la gráfica
Solución de Tinción Coomassie. Desteñir el gel con un exceso de ası́ obtenida, estimar los pesos moleculares desconocidos, por
Solución de Decoloración. Cambiar la Solución de Decoloración análisis de regresión lineal o interpolación, siempre que las muestras
varias veces, hasta que las bandas de proteı́na teñidas se distingan desconocidas caigan en la parte lineal de la gráfica.
claramente sobre un fondo transparente. Cuanto más completamente Si las proteı́nas del marcador de peso molecular no están
se destiña el gel, menor será la cantidad de proteı́na detectable. La distribuidas a lo largo del 80% de la extensión del gel y en el
decoloración se puede acelerar incluyendo unos pocos gramos de intervalo de separación requerido (es decir, el intervalo que cubre el
resina de intercambio aniónico o una esponja pequeña en la Solución producto y su dı́mero o los productos y sus impurezas relacionadas)
de Decoloración. [NOTA—Las soluciones alcohol ácido usadas en y la separación obtenida para las bandas de proteı́na relevantes no
este procedimiento no fijan completamente las proteı́nas en el gel. muestra una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular y el
Esto puede conducir a pérdidas de algunas proteı́nas de bajo peso RF, entonces la prueba no es válida.
molecular durante la tinción y decoloración de geles delgados. La
fijación permanente se puede lograr por incubación del gel en
Solución Fijadora 1 durante 1 hora antes de sumergirla en la CUANTIFICACIÓN DE IMPUREZAS
Solución de Tinción Coomassie.]
Tinción con Plata—Sumergir el gel en un exceso de Solución Cuando se especifica el lı́mite de impurezas en la monografı́a
Fijadora 2, e incubar durante 1 hora. Retirar la Solución Fijadora 2, individual, se prepara una solución de referencia correspondiente a
agregar Solución Fijadora 2 recién preparada e incubar durante al ese nivel de impureza, diluyendo la solución de prueba. Por ejemplo,
menos 1 hora, o durante la noche si fuera conveniente. Desechar la cuando el lı́mite es 5,0%, la solución de referencia es una dilución 1
Solución Fijadora 2, lavar el gel en un exceso de agua durante 1 en 20 de la solución de prueba. Ninguna impureza —cualquier banda
hora. Empapar el gel durante 15 minutos en una solución de que no sea la banda principal— en el electroforetograma obtenido a
glutaraldehı́do al 1% (v/v). Lavar el gel dos veces, durante 15 partir de la solución de prueba es más intensa que la banda principal
minutos cada vez, con un exceso de agua. Empapar el gel en obtenida con la solución de referencia.
Reactivo de Nitrato de Plata recién preparado durante 15 minutos, Bajo condiciones validadas y cuando se usa el procedimiento de
en la oscuridad. Lavar el gel tres veces, durante 5 minutos cada vez, tinción de Coomassie, las impurezas se pueden cuantificar por
con un exceso de agua. Sumergir el gel durante aproximadamente 1 normalización con respecto a la banda principal usando un
minuto en la Solución de Desarrollo hasta obtener una tinción densitómetro de integración. En este caso, las respuestas deben ser
satisfactoria. Detener el desarrollo mediante incubación en la validadas para linealidad.
Solución de Detención durante 15 minutos; enjuagar luego el gel
con agua y proceder con el secado según se indica a continuación.
VALORACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
SECADO DE GELES Los siguientes procedimientos se proporcionan para ilustrar la
determinación del contenido de proteı́nas totales en las preparaciones
Para la tinción de Coomassie, después del paso de decoloración, farmacopeicas. Otras técnicas, tales como HPLC, también son
incubar el gel en una solución de glicerol (1 en 10) durante al menos aceptables si se demuestra la recuperación total de proteı́nas.
2 horas. Para la tinción con plata, agregar al paso final de enjuague Muchos de los métodos de valoración de proteı́nas totales descritos a
una incubación de 5 minutos en una solución de glicerol (1 en 50). continuación se pueden realizar con equipos comerciales. [NOTA—
Sumergir dos láminas de celofán poroso en agua, e incubar de 5 a Siempre que se necesite agua, usar agua destilada.]
10 minutos. Colocar una de las láminas en un marco de secado.
Levantar el gel cuidadosamente y colocarlo sobre la lámina de
celofán. Eliminar todas las burbujas de aire atrapadas y verter Método 1
algunos mL de agua alrededor de los bordes del gel. Colocar la
segunda lámina por encima y eliminar todas las burbujas de aire La proteı́na en solución absorbe la luz UV a una longitud de onda
atrapadas. Completar el montaje del marco de secado. Colocar en de 280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos,
una estufa de secado, dejar a temperatura ambiente hasta que principalmente tirosina y triptófano. Esta propiedad es el fundamento
esté seco, o usar un secador de gel comercial. de este método. La determinación de proteı́nas a 280 nm es
principalmente una función del contenido de tirosina y triptófano de
la proteı́na. Si la solución amortiguadora usada para disolver la
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR proteı́na tiene una absorbancia alta en relación a la del agua, hay una
sustancia que interfiere en la solución amortiguadora. Esta
Los pesos moleculares de las proteı́nas se determinan por interferencia se puede compensar cuando el espectrofotómetro se
comparación de sus movilidades con las de varias proteı́nas ajusta a cero con la solución amortiguadora. Si la interferencia da
marcadoras de peso molecular conocido. Para la calibración de como resultado una gran absorbancia que desafı́a el lı́mite de
geles, hay mezclas disponibles de proteı́nas con pesos moleculares sensibilidad del espectrofotómetro, los resultados podrı́an ser
conocidos con precisión, combinadas para una tinción uniforme. erróneos. Además, en concentraciones bajas, la proteı́na puede ser
Están disponibles en diversos intervalos de pesos moleculares. Las absorbida en la cubeta, reduciendo ası́ el contenido en solución. Esto
soluciones madre concentradas de proteı́nas de peso molecular puede evitarse preparando muestras más concentradas, o usando un
conocido se diluyen en un amortiguador del pH de muestra y se
cargan en el mismo gel que la muestra de proteı́na a analizar.
USP 30 Información General / h1047i Artı́culos Obtenidos por Biotecnologı́a—Pruebas 531
detergente no iónico en la preparación. [NOTA—Mantener la Solución Solución de Prueba—Disolver una cantidad adecuada de la
de Prueba, la Solución Estándar y la solución amortiguadora a la proteı́na en análisis, en la solución amortiguadora adecuada para
misma temperatura durante la prueba.] obtener una solución con una concentración comprendida dentro del
Solución de Prueba—Disolver una cantidad adecuada de la intervalo de concentraciones de las Soluciones Estándar. Una
proteı́na en análisis en la solución amortiguadora adecuada para solución amortiguadora adecuada producirá un pH entre 10,0 y 10,5.
obtener una solución con una concentración de 0,2 a 2 mg por mL. Blanco—Usar la solución amortiguadora utilizada para la
Solución Estándar—A menos que se especifique algo diferente Solución de Prueba y las Soluciones Estándar.
en la monografı́a individual, preparar una solución del Estándar de Reactivos y Soluciones—
Referencia USP o material de referencia para la proteı́na en análisis Reactivo de Sulfato de Cobre—Disolver 100 mg de sulfato
en la misma solución amortiguadora y a la misma concentración que cúprico y 200 mg de tartrato de sodio en agua, diluir con agua a 50
la Solución de Prueba. mL y mezclar. Disolver 10 g de carbonato de sodio en agua a un
Procedimiento—Determinar concomitantemente las absorbancias volumen final de 50 mL y mezclar. Verter lentamente la solución de
de la Solución Estándar y de la Solución de Prueba en celdas de carbonato de sodio en la solución de sulfato de cobre, mezclando.
cuarzo a una longitud de onda de 280 nm, con un espectrofotómetro Preparar esta solución a diario.
adecuado (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz h851i), Solución de SDS—Disolver 5 g de dodecilsulfato de sodio en agua
usando la solución amortiguadora como blanco. Para obtener y diluir con agua a 100 mL.
resultados exactos, la respuesta debe ser lineal para el intervalo de Solución de Hidróxido de Sodio—Disolver 3,2 g de hidróxido de
concentraciones de proteı́na a ser valoradas. sodio en agua, diluir con agua a 100 mL y mezclar.
Dispersión de Luz—La exactitud de la determinación espec- Reactivo de Cobre Alcalino—Preparar una mezcla de Reactivo de
troscópica UV de la proteı́na puede disminuir si la muestra dispersa Sulfato de Cobre, Solución de SDS y Solución de Hidróxido de Sodio
la luz. Si las proteı́nas en la solución existen como partı́culas de (1 : 2 : 1). Este reactivo se puede almacenar a temperatura ambiente
tamaño comparable con la longitud de onda de la luz de medición hasta 2 semanas.
(250 a 300 nm), la dispersión del haz de luz produce un aumento
aparente en la absorbancia de la muestra. Para calcular la Reactivo Folin-Ciocalteu para Fenoles Diluido—Mezclar 10 mL
absorbancia a 280 nm causada por la dispersión de luz, hay que de Folin-Ciocalteu para Fenoles SR con 50 mL de agua. Almacenar
determinar las absorbancias de la Solución de Prueba a longitudes de en un frasco ámbar, a temperatura ambiente.
onda de 320; 325; 330; 335; 340; 345 y 350 nm. Usando el método Procedimiento—Agregar a 1 mL de la Solución Estándar, a 1 mL
de regresión lineal, trazar la gráfica del logaritmo de la absorbancia de la Solución de Prueba y a 1 mL de Blanco, 1 mL de Reactivo de
observada en función del logaritmo de la longitud de onda y Cobre Alcalino y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente
determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos durante 10 minutos. Agregar 0,5 mL del Reactivo Folin-Ciocalteu
graficados. A partir de la gráfica ası́ obtenida, extrapolar el valor de para Fenoles Diluido a cada solución, mezclar inmediatamente cada
absorbancia causada por la dispersión de luz a 280 nm. Restar la tubo y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
absorbancia por dispersión de luz de la absorbancia total a 280 nm Determinar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las
para obtener el valor de absorbancia de la proteı́na en la solución. Soluciones Estándar y la Solución de Prueba a la longitud de onda
Para reducir el efecto de la dispersión de luz, en especial si la de absorbancia máxima a 750 nm, con un espectrofotómetro
solución está muy turbia, se puede pasar la solución por un filtro con adecuado (ver Espectrofotometrı́a y Dispersión de Luz h851i),
un tamaño de poro de 0,2 mm o se puede clarificar por usando la solución del Blanco para ajustar el instrumento a cero.
centrifugación. Cálculos—[NOTA—La relación de absorbancia no es función
Cálculos—Calcular la concentración, CU, de la proteı́na en la lineal de concentración proteica; sin embargo, si el intervalo de
muestra de la prueba, por la fórmula: concentración de la curva estándar es lo suficientemente pequeño, se
aproxima a la linealidad.] Usando el método de regresión lineal,
CS(AU / AS) graficar las absorbancias de las soluciones obtenidas de las
Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteı́na
en donde CS es la concentración de la Solución Estándar; y AU y AS y determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos
son las absorbancias corregidas de la Solución de Prueba y la graficados. A partir de la curva estándar ası́ obtenida y de la
Solución Estándar, respectivamente (ver Espectrofotometrı́a y absorbancia de la Solución de Prueba, determinar la concentración
Dispersión de Luz h851i). proteica de la Solución de Prueba.
cloruro de sodio (9 en 1000). Diluir porciones de esta solución con constituyentes de la proteı́na quedan disponibles para reaccionar con
solución de cloruro de sodio (9 en 1000) para obtener no menos de el reactivo o-ftalaldehı́do. El método requiere cantidades muy
tres Soluciones Estándar con concentraciones entre 0,5 y 10 mg por pequeñas de la proteı́na.
mL, con concentraciones uniformemente espaciadas. [NOTA—Pueden Las aminas primarias, tales como el tris(hidroximetil)aminome-
observarse respuestas bajas si la muestra en análisis tiene un nivel de tano y las soluciones amortiguadoras de aminoácidos, reaccionan
prolina significativamente diferente al de la Albúmina Humana. En con el o-ftalaldehı́do y deben evitarse o eliminarse. El amonı́aco en
dichos casos se puede emplear una proteı́na estándar diferente.] concentraciones altas reacciona también con el o-ftalaldehı́do. La
Solución de Prueba—Preparar una solución de la proteı́na de fluorescencia obtenida cuando la amina reacciona con el o-
prueba en solución de cloruro de sodio (9 en 1000), con una ftalaldehı́do puede ser inestable. El uso de procedimientos
concentración comprendida dentro del intervalo de las concentra- automatizados para estandarizar este procedimiento puede mejorar
ciones de las Soluciones Estándar. la exactitud y la precisión de la prueba.
Blanco—Usar solución de cloruro de sodio (9 en 1000). Soluciones Estándar—A menos que se especifique algo diferente
Reactivo de Biuret—Disolver aproximadamente 3,46 g de sulfato en la monografı́a individual, disolver el Estándar de Referencia USP
cúprico en 10 mL de agua caliente y dejar enfriar (Solución 1). o el material de referencia para la proteı́na en análisis, en la solución
Disolver aproximadamente 34,6 g de citrato de sodio dihidrato y amortiguadora usada para preparar la Solución de Prueba. Diluir
20,0 g de carbonato de sodio en 80 mL de agua caliente y dejar porciones de esta solución con la misma solución amortiguadora
enfriar (Solución 2). Mezclar la Solución 1 y la Solución 2 y diluir para obtener no menos de cinco Soluciones Estándar con
con agua a 200 mL. Este Reactivo de Biuret es estable a temperatura concentraciones entre 10 y 200 mg de proteı́na por mL, con
ambiente durante 6 meses. No usar el reactivo si aparece turbidez o concentraciones uniformemente espaciadas.
contiene algún precipitado. Solución de Prueba—Disolver una cantidad adecuada de la
Procedimiento—A un volumen de una solución de la Solución de proteı́na en análisis en la solución amortiguadora adecuada para
prueba, agregar un volumen igual de solución de hidróxido de sodio obtener una solución con una concentración comprendida dentro del
(6 en 100) y mezclar. Agregar inmediatamente un volumen de intervalo de concentraciones de las Soluciones Estándar.
Reactivo de Biuret equivalente a un volumen de 0,4 de la Solución Blanco—Usar la solución amortiguadora utilizada para preparar
de Prueba y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente entre la Solución de Prueba y las Soluciones Estándar.
158 y 258, durante no menos de 15 minutos. Dentro de los 90 Reactivos—
minutos siguientes a la adición del Reactivo de Biuret, determinar las Solución Amortiguadora de Borato—Disolver aproximadamente
absorbancias de las Soluciones Estándar y de la solución obtenida de 61,83 g de ácido bórico en agua y ajustar con hidróxido de potasio,
la Solución de Prueba a la longitud de onda de absorbancia máxima hasta un pH de 10,4. Diluir con agua a 1 L y mezclar.
a 545 nm, con un espectrofotómetro adecuado (ver Espectrofotome- Reactivo OPA Madre—Disolver aproximadamente 120 mg de o-
trı́a y Dispersión de Luz h851i), usando el Blanco para ajustar el ftalaldehı́do en 1,5 mL de metanol, agregar 100 mL de Solución
instrumento a cero. [NOTA—Toda solución que desarrolle turbidez, o Amortiguadora de Borato y mezclar. Agregar 0,6 mL de éter
un precipitado, no es aceptable para el cálculo de la concentración polietilenglicol (23) laurı́lico y mezclar. Esta solución es estable a
proteica.] temperatura ambiente durante al menos 3 semanas.
Cálculos—Usando el método de regresión lineal de cuadrados Reactivo OPA—A 5 mL de Reactivo OPA Madre, agregar 15 mL
mı́nimos, graficar las absorbancias de las Soluciones Estándar en de 2-mercaptoetanol. Preparar al menos 30 minutos antes de usar.
función de las concentraciones de proteı́na, determinando la curva Este reactivo es estable durante un dı́a.
estándar que mejor se ajuste a los puntos graficados y calcular el
coeficiente de correlación para la lı́nea. [NOTA—Dentro del intervalo Procedimiento—Ajustar cada una de las Soluciones Estándar y
dado de los estándares, la relación entre la absorbancia y la la Solución de Prueba a un pH entre 8 y 10,5. Mezclar 10 mL de la
concentración proteica es aproximadamente lineal.] Un sistema Solución de Prueba y cada una de las Soluciones Estándar con 100
adecuado es aquel que produce una lı́nea con un coeficiente de mL de Reactivo OPA y dejar reposar a temperatura ambiente durante
correlación de no menos de 0,99. A partir de la curva estándar y de la 15 minutos. Agregar 3 mL de hidróxido de sodio 0,5 N y mezclar.
absorbancia de la Solución de Prueba, determinar la concentración Usando un fluorómetro adecuado (ver Espectrofotometrı́a y
proteica de la muestra, haciendo las correcciones necesarias. Dispersión de Luz h851i), determinar las intensidades de fluores-
cencia de las soluciones obtenidas de las Soluciones Estándar y de la
Sustancias de Interferencia—A fin de minimizar el efecto de las Solución de Prueba a una longitud de onda de excitación de 340 nm
sustancias de interferencia, se puede precipitar la proteı́na en la y a una longitud de onda de emisión entre 440 y 455 nm. [NOTA—La
muestra de prueba inicial, como se indica a continuación. Agregar fluorescencia de una muestra individual se lee sólo una vez, porque
0,1 volumen de ácido tricloroacético al 50 por ciento a 1 volumen de la irradiación disminuye la intensidad de la fluorescencia.]
una solución de la muestra de prueba, retirar la capa sobrenadante y
disolver el precipitado en un volumen pequeño de hidróxido de Cálculos—La fluorescencia es función lineal de la concentración
sodio 0,5 N. Usar la solución ası́ obtenida para preparar la Solución proteica. Usando el método de regresión lineal, graficar las
de Prueba. intensidades de fluorescencia de las soluciones obtenidas de las
Soluciones Estándar en función de las concentraciones de proteı́na y
Comentarios—Esta prueba muestra una diferencia mı́nima entre determinar la curva estándar que mejor se ajuste a los puntos
muestras de IgG y de albúmina equivalentes. La adición de graficados. A partir de la curva estándar ası́ obtenida y de la
hidróxido de sodio y del Reactivo de Biuret como reactivo intensidad de fluorescencia de la Solución de Prueba, determinar la
combinado, la mezcla insuficiente después de la adición del concentración proteica de la muestra.
hidróxido de sodio o un tiempo prolongado entre la adición de la
solución de hidróxido de sodio y la adición del Reactivo de Biuret
produce para las muestras de IgG una respuesta más alta que para las
muestras de albúmina. El método de ácido tricloroacético usado para Método 7
minimizar los efectos de sustancias de interferencia también se
puede usar para determinar el contenido proteico en muestras de Este método se basa en el análisis de nitrógeno como un medio de
prueba con concentraciones por debajo de 500 mg por mL. determinación de proteı́na. La interferencia causada por la presencia
de otras sustancias nitrogenadas en la muestra pueden afectar la
determinación de proteı́na por este método. Las técnicas de análisis
de nitrógeno destruyen la proteı́na en análisis, pero no se limitan a
Método 6 las proteı́nas en un medio acuoso.
Este método fluorométrico se basa en la derivatización de la Procedimiento 1—Determinar el contenido de nitrógeno de la
proteı́na con o-ftalaldehı́do (OPA), que reacciona con las aminas proteı́na en análisis según se indica en Determinación de Nitrógeno
primarias de la proteı́na (es decir, el aminoácido NH2-terminal y el h461i. Hay instrumental disponible comercialmente para la valora-
grupo E-amino de los residuos lisina). La sensibilidad de la prueba ción de nitrógeno por el método de Kjeldahl.
puede aumentarse hidrolizando la proteı́na antes de realizar la
prueba. Mediante hidrólisis los grupos a-amino de los aminoácidos
534 h1048i Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis / Información General USP 30
Procedimiento 2—Hay instrumental disponible comercialmente La construcción expresable se define como el vector de expresión
para análisis de nitrógeno. La mayorı́a de los instrumentos para que contiene la secuencia codificadora de la proteı́na recombinante.
análisis de nitrógeno emplean pirólisis (es decir, la combustión de la Para asegurar la calidad y la uniformidad del producto final, se deben
muestra en oxı́geno a temperaturas cercanas a los 10008), analizar los segmentos de la construcción expresable utilizando
produciéndose óxido nı́trico (NO) y óxidos de nitrógeno similares técnicas para ácidos nucleicos junto con otras pruebas realizadas
(NOx) a partir del nitrógeno presente en la proteı́na de prueba. sobre la proteı́na recombinante purificada. Se debe considerar al
Algunos instrumentos convierten los óxidos nı́tricos en gas análisis de la construcción expresable a nivel del ácido nucleico
nitrógeno, que se cuantifica con un detector de conductividad como una parte de la evaluación general de calidad, teniendo en
térmica. Otros instrumentos mezclan el óxido nı́trico (NO) con cuenta que esta prueba sólo evalúa la secuencia codificadora de un
ozono (O3) formándose dióxido de nitrógeno excitado (NO2), que gen recombinante y no la fidelidad de la traducción ni otras
emite luz cuando se desintegra y se puede cuantificar con un detector caracterı́sticas de la proteı́na recombinante, tal como su estructura
de quimioluminiscencia. Se usa un material de referencia de proteı́na secundaria, su estructura terciaria y las modificaciones posteriores a
o un estándar de referencia que sea relativamente puro y similar en la traducción.
composición a las proteı́nas de la prueba para optimizar los II. FUNDAMENTOS PARA EL ANÁLISIS DE LA
parámetros de inyección y pirólisis y para evaluar la uniformidad CONSTRUCCIÓN EXPRESABLE
en el análisis. El propósito de realizar el análisis de la construcción expresable es
Cálculos—La concentración proteica se calcula dividiendo el establecer que se ha incorporado la secuencia codificadora correcta
contenido de nitrógeno de la muestra por el contenido conocido de del producto en la célula anfitriona y que esta secuencia se mantiene
nitrógeno de la proteı́na. El contenido conocido de nitrógeno de la sin cambios desde el comienzo del cultivo hasta el final de la
proteı́na se puede determinar a partir de la composición quı́mica de producción. La secuencia genética de las proteı́nas recombinantes
la proteı́na, o por comparación con el contenido de nitrógeno del que se producen en células vivas puede sufrir mutaciones que
Estándar de Referencia USP o del material de referencia. podrı́an alterar las propiedades de la proteı́na con probables
consecuencias adversas para los pacientes. No se puede esperar
que un único enfoque experimental detecte todas las modificaciones
posibles de una proteı́na. Se pueden emplear técnicas de análisis de
proteı́nas para evaluar la secuencia de aminoácidos de una proteı́na y
h1048i CALIDAD DE PRODUCTOS las caracterı́sticas estructurales de la proteı́na expresada debidas a
modificaciones posteriores a la traducción, tal como el procesa-
BIOTECNOLÓGICOS: ANÁLISIS miento proteolı́tico, la glicosilación, la fosforilación y la acetilación.
Los datos del análisis del ácido nucleico podrı́an ser útiles ya que los
DE LA CONSTRUCCIÓN métodos de análisis de proteı́nas pueden no detectar todos los
EXPRESABLE EN CÉLULAS cambios estructurales de la proteı́na que resultan de mutaciones en la
secuencia codificadora de la proteı́na recombinante. La importancia
USADAS PARA LA PRODUCCIÓN relativa del análisis del ácido nucleico y del análisis de la proteı́na
varı́an de un producto a otro.
DE PRODUCTOS PROTEÍNICOS El análisis del ácido nucleico se puede emplear para verificar la
secuencia codificadora y el estado fı́sico de la construcción
OBTENIDOS CON ADN expresable. El análisis de ácido nucleico se realiza para asegurar
que la proteı́na expresada tendrá la secuencia de aminoácidos
RECOMBINANTE 1
correcta, pero no está concebido para detectar niveles bajos de
secuencias variantes. Cuando las células de producción tienen
múltiples copias integradas de la construcción expresable y no todas
ellas son activas para la transcripción, un examen del producto de
I. INTRODUCCIÓN transcripción en sı́ mediante un análisis de ARN mensajero (ARN-
Este documento proporciona una guı́a para caracterizar construc- m) o ADN codificador (ADN-c) puede ser más adecuado que un
ciones expresables para la producción de productos proteı́nicos a análisis del ADN genómico. Los enfoques analı́ticos que examinan
partir de ADN recombinante (ADN-r) en células eucarióticas y el grueso de una población de ácidos nucleicos, como por ejemplo
procarióticas. El propósito de este documento es describir las clases los que se realizan sobre combinaciones de clones o sobre material
de información importantes para evaluar la estructura de la amplificado por reacción en cadena con polimerasa, pueden ser
construcción expresable para producir proteı́nas obtenidas con considerados como una alternativa a los enfoques que dependen de
ADN-r. Este documento no pretende cubrir todos los aspectos la selección de clones de ADN individuales. Se podrán tener en
relativos a la calidad de los productos medicinales obtenidos con cuenta otras técnicas que permitan la confirmación rápida y sensible
ADN-r. de la secuencia codificadora de la proteı́na recombinante en la
1
La presente guı́a ha sido desarrollada por el Grupo de Trabajo de Expertos construcción expresable.
(en Calidad) de la Conferencia Internacional para la Armonización de En las siguientes secciones se describe la información que se debe
Requisitos Técnicos para el Registro de Medicamentos destinados para Uso suministrar con respecto a la caracterización de la construcción
de Seres Humanos (ICH por sus siglas en inglés) y para su redacción se han expresable durante el desarrollo y la validación del sistema de
consultado a diversos organismos regulatorios, de conformidad con los producción. Deben validarse las metodologı́as analı́ticas previstas
procedimientos de la ICH. Este documento ha sido ratificado por el Comite
Directivo de la ICH en la Etapa 4 del procedimiento de la ICH, el 29 de para la confirmación de la secuencia. La documentación de
noviembre de 1995. Al llegar a la Etapa 4 del procedimiento, se recomienda validación debe incluir, como mı́nimo, estimaciones de los lı́mites
la adopción del borrador final a los organismos regulatorios de la Unión de detección para las secuencias variantes. Esto debe llevarse a cabo
Europea, Japón y los Estados Unidos. Esta guı́a ha sido publicada en el Diario para los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos y de
Oficial (Federal Register) el 23 de febrero de 1996 (61 FR 7006) y es proteı́nas. Se deben revisar periódicamente la filosofı́a y las
aplicable a fármacos y productos biológicos. A pesar de que esta guı́a no crea recomendaciones referidas a los análisis que se expresan en este
ni confiere derecho alguno a persona alguna y que no obliga a la documento, con el fin de aprovechar los adelantos tecnológicos y los
Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en avances en la información cientı́fica.
inglés) ni al sector industrial, este documento representa la posición actual de
la FDA respecto de la producción de productos proteı́nicos obtenidos con III. CARACTERIZACIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN
ADN recombinante Para obtener copias adicionales de esta guı́a, comunicarse A. Construcción Expresable y Clon Celular Utilizado para
con: Drug Information Branch, HFD-210, CDER, FDA, 5600 Fishers Lane, Desarrollar el Banco de Células Madre
Rockville, MD 20857 (Teléfono: 301-827-4573) o con Manufacturers El fabricante debe describir el origen de la secuencia de
Assistance and Communication Staff (HFM-42), CBER, FDA, 1401 nucleótidos codificadora de la proteı́na. Debe incluirse la identifica-
Rockville Pike, Rockville, MD 20852-1448. Enviar una etiqueta autoadhe- ción y la fuente de la célula originaria de la secuencia nucleotı́dica.
siva con nombre y dirección impresos para facilitar el trámite de la solicitud.
También se encuentra disponible una versión en formato electrónico de esta También se deben describir los métodos empleados para preparar el
guı́a en Internet usando la Red Mundial (WWW) (conectarse a la Página ADN que codifica la proteı́na.
Inicial de CDER (CDER Home Page) en http://www.fda.gov/cder e ir a la
sección ‘‘Regulatory Guidance’’).
USP 30 Información General / h1048i Calidad de Productos Biotecnológicos: Análisis 535
Se deben describir detalladamente los pasos empleados para productoras se obtienen mediante la propagación del Banco de
ensamblar la construcción expresable. Esta descripción debe incluir Células de Trabajo; el Banco de Células Madre podrı́a emplearse
la fuente y la función de las partes que componen la construcción para preparar células de producción si se justifica debidamente.
expresable, por ejemplo los orı́genes de replicación, los genes de La construcción expresable de las células de producción debe
resistencia a antibióticos, promotores, potenciadores y si la proteı́na analizarse una vez para el Banco de Células Madre, según se indica
se sintetiza como una proteı́na de fusión. Se debe proporcionar un en la sección III.B., pero se podrı́a verificar la secuencia codificadora
mapa detallado de los componentes y una secuencia completa del de la proteı́na de la construcción expresable mediante pruebas de
plásmido con anotaciones, indicando las regiones secuenciadas ácido nucleico o bien mediante análisis del producto proteı́nico final.
durante la construcción y las secuencias extraı́das de la bibliografı́a. Todo incremento en el lı́mite de edad definido para las células
Se deben indicar otras proteı́nas expresables codificadas por el productoras in vitro debe basarse en datos obtenidos de células
plásmido. Se deben determinar la secuencia nucleotı́dica de la región propagadas in vitro hasta una edad igual o mayor que el nuevo lı́mite
codificadora del gen de interés y de las regiones adyacentes de edad para las células in vitro.
asociadas que se insertan en el vector, hasta el empalme de IV. CONCLUSIÓN
inserción, inclusive, mediante el secuenciamiento del ADN de la La caracterización de la construcción expresable y de la proteı́na
construcción. purificada final son importantes para asegurar la producción
Se debe describir del método de transferencia de la construcción uniforme de un producto obtenido con ADN-r. Según se ha descrito
expresable a la célula anfitriona. Asimismo, se deben describir anteriormente, para asegurar la calidad de un producto de proteı́na
detalladamente los métodos empleados para amplificar la construc- recombinante se deben evaluar los datos del análisis de ácidos
ción expresable y el criterio utilizado para la selección de clones nucleicos y de la evaluación de la proteı́na purificada final.
celulares para su producción. GLOSARIO DE TÉRMINOS
B. Sistema de Banco de Células Construcción Expresable
La producción de proteı́nas recombinantes debe basarse en un Es el vector de expresión que contiene la secuencia codificadora
Banco de Células Madre y en Bancos de Células de Trabajo bien de la proteı́na recombinante y los elementos necesarios para su
definidos. Un banco de células es un conjunto de ampollas con una expresión.
composición uniforme almacenadas en condiciones definidas; cada Regiones de Control Adyacentes
ampolla contiene una alı́cuota de una sola combinación de células. El Son secuencias nucleotı́dicas no codificadoras que están adya-
Banco de Células Madre por lo general proviene del clon celular centes a los extremos 5’ y 3’ de la secuencia codificadora del
seleccionado que contiene la construcción expresable. El Banco de producto y que contienen elementos importantes que afectan la
Células de Trabajo se obtiene por propagación de una o varias transcripción, traducción o estabilidad de la secuencia codificadora.
ampollas del Banco de Células Madre. Se deben detallar la historia Estas regiones incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras,
de la lı́nea celular y la producción de los bancos celulares, potenciadoras y de empalme y no incluyen los orı́genes de la
incluyendo los métodos y los reactivos utilizados durante el cultivo, replicación ni los genes de resistencia a los antibióticos.
la edad de las células in vitro y las condiciones de almacenamiento. Sitio de Integración
Todos los bancos de células deben caracterizarse mediante los Es el sitio donde una o varias copias de la construcción expresable
marcadores fenotı́picos y genotı́picos pertinentes, que podrı́an incluir se integran al genoma de la célula anfitriona.
la expresión de la proteı́na recombinante o la presencia de la Edad de Células In Vitro
construcción expresable. Es la medida del tiempo transcurrido desde la descongelación del
Se debe analizar la construcción expresable en el Banco de vial o viales del Banco de Células Madre hasta la cosecha del
Células Madre según se describe a continuación. Si la prueba no se recipiente de producción, medido en tiempo cronológico trascurrido
puede llevar a cabo en el Banco de Células Madre, se debe realizar en cultivo, mediante el número de duplicaciones de la población o el
en cada Banco de Células de Trabajo. número de transferencias de las células cuando se subcultivan
Se debe emplear el mapeo con endonucleasas de restricción mediante un procedimiento definido para la dilución del cultivo.
u otras técnicas adecuadas para analizar la construcción expresable Banco de Células Madre (BCM)
para determinar el número de copias, las inserciones o eliminaciones Es una alı́cuota de una combinación única de células que se ha
y el número de sitios de integración. Para los sistemas de expresión preparado por lo general a partir de un clon celular seleccionado en
extracromosómica, se debe determinar el porcentaje de células condiciones definidas, dispensada en múltiples recipientes y
anfitrionas que retienen la construcción expresable. almacenada en condiciones definidas. El Banco de Células Madre
Se debe verificar la secuencia codificadora de proteı́na para el se emplea para proporcionar todos los bancos de células de trabajo.
producto de proteı́na recombinante de la construcción expresable. Las pruebas que se realizan en un Banco de Células Madre nuevo (a
Para los sistemas de expresión extracromosómica, se debe aislar la partir de un previo clon celular inicial, Banco de Células Madre
construcción expresable y verificar la secuencia nucleotı́dica o Banco de Células de Trabajo) deben ser las mismas que las
codificadora del producto sin clonación adicional. Para las células realizadas en el Banco de Células Madre a menos que se justifique
con copias macrosómicas de la construcción expresable, la secuencia otra cosa.
nucleotı́dica codificadora del producto puede verificarse a través de Escala de Planta Piloto
una nueva clonación y secuenciamiento de las copias cromosómicas. La producción de una proteı́na recombinante mediante un
Alternativamente, se puede verificar la secuencia nucleotı́dica procedimiento que simula y es totalmente representativo de una
codificadora del producto empleando diversas técnicas, tales como escala de fabricación comercial. Los métodos de propagación
el secuenciamiento de clones de ADN-c combinados, o amplificando celular, la cosecha y la purificación del producto deben ser idénticos,
el material por la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia excepto por la escala de producción.
nucleotı́dica debe ser idéntica a la determinada para la construcción Marcadores Genotı́picos y Fenotı́picos Relevantes
expresable dentro de los lı́mites de detección de la metodologı́a, Son los marcadores que permiten identificar la cepa de la lı́nea
según se describe en la sección III.A., y debe corresponder a lo celular y que deben incluir la expresión de la proteı́na recombinante
esperado para la secuencia de la proteı́na. o la presencia de la construcción expresable.
C. Lı́mite de Edad para las Células de Producción In Vitro Banco de Células de Trabajo (BCT)
El lı́mite de edad para las células de producción in vitro se debe El Banco de Células de Trabajo se prepara a partir de alı́cuotas de
basar en datos obtenidos de células productoras propagadas a escala una suspensión homogénea de células obtenidas del cultivo de
de planta piloto o a escala normal de producción hasta la edad material del Banco de Células Madre en condiciones de cultivo
propuesta para las células in vitro o más. Por lo general, las células definidas.
536 h1049i Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad / Información General USP 30
de datos a escala de planta piloto, el fabricante debe establecer la En el momento de la presentación, los solicitantes deben haber
conformidad de tales datos utilizando el proceso a escala de validado los métodos que comprenden el perfil indicador de
fabricación. estabilidad y los datos deben estar disponibles para su revisión. La
C. Producto Farmacéutico (Producto del Envase Final) (4.3) determinación de las pruebas que deben incluirse será especı́fica para
Deberá proporcionarse información sobre la estabilidad de al cada producto. Los elementos enfatizados en las siguientes
menos tres partidas del producto del envase final, representativas de subsecciones no pretenden incluir todas las caracterı́sticas de un
aquellas que se usarán a escala de fabricación. Cuando sea posible, producto, sino representar aquellas que tı́picamente deben docu-
los partidas del producto del envase final incluidas en la prueba de mentarse para demostrar en forma adecuada la estabilidad del
estabilidad deben provenir de distintas partidas del material a granel. mismo.
Para los casos en los que se solicitan más de 6 meses de A. Protocolo (5.1)
almacenamiento, debe suministrarse, al momento de la presentación, El expediente que acompaña la solicitud para autorización de
un mı́nimo de datos de 6 meses de estabilidad. Para productos comercialización debe incluir un protocolo detallado de la evalua-
farmacéuticos con perı́odos de almacenamiento menores de 6 meses, ción de la estabilidad tanto del fármaco como del producto
la cantidad mı́nima de datos de estabilidad en la presentación inicial farmacéutico, que justifiquen las condiciones de almacenamiento y
se determinará en cada caso en particular. La fecha de caducidad del los perı́odos de vida útil propuestos. El protocolo debe incluir toda la
producto debe basarse en los datos reales presentados como aval de información necesaria que demuestre la estabilidad del producto
la solicitud. Dado que la fecha se basa en los datos de tiempo real/ biotecnológico o biológico durante el perı́odo de vida útil propuesto
temperatura real presentados para revisión, deben efectuarse incluyendo, por ejemplo, especificaciones bien definidas e intervalos
actualizaciones continuas de los datos de estabilidad inicial durante de prueba. Los métodos estadı́sticos que deben utilizarse se
los procesos de revisión y evaluación. La calidad del producto del describen en la guı́a tripartita sobre estabilidad.
envase final sometido a los estudios de estabilidad debe ser B. Potencia (5.2)
representativa de la calidad del material utilizado en los estudios Cuando el uso previsto de un producto está vinculado a una
preclı́nicos y clı́nicos. Los datos de partidas a escala de planta piloto actividad biológica definible y mensurable, las pruebas de potencia
del producto farmacéutico podrán proporcionarse en el momento en deben formar parte de los estudios de estabilidad. A efectos de las
que se presente el expediente ante las agencias reguladoras, con el pruebas de estabilidad de los productos descritos en esta guı́a, la
compromiso de incluir las primeras tres partidas a escala de potencia es la aptitud o capacidad especı́fica de un producto para
fabricación en el programa de estabilidad a largo plazo después de lograr su efecto previsto. Se basa en la medida de algún atributo del
su aprobación. Cuando las partidas a escala de planta piloto hayan producto y se determina por medio de un método cuantitativo in vivo
sido presentadas para establecer el perı́odo de vida útil de un o in vitro adecuado. En general, las potencias de los productos
producto y, en caso de que el producto elaborado a escala de biotecnológicos o biológicos probados por diferentes laboratorios
fabricación no cumpla con esas especificaciones de estabilidad a pueden compararse en forma significativa sólo si se expresan en
largo plazo durante todo el perı́odo de vigencia o que no sea relación con la de un material de referencia adecuado. Para tal
representativo del material usado en estudios preclı́nicos y clı́nicos, propósito, debe incluirse en la valoración un material de referencia
el solicitante debe notificar a las autoridades reguladoras correspon- calibrado directa o indirectamente con respecto al material de
dientes para determinar un curso de acción adecuado. referencia nacional o internacional correspondiente.
D. Selección de muestras (4.4) Los estudios de potencia deben realizarse a intervalos adecuados,
Cuando un producto es distribuido en partidas que difieran en según se define en el protocolo de estabilidad y los resultados deben
volumen de llenado (por ejemplo, 1 mililitro (mL), 2 mL o 10 mL), expresarse en unidades de actividad biológica calibradas, siempre
cantidad de unidades (por ejemplo, 10 unidades, 20 unidades o 50 que sea posible, en relación a estándares reconocidos nacional o
unidades), o masa (por ejemplo, 1 miligramo (mg), 2 mg o 5 mg), las internacionalmente. Cuando no existan estándares de referencia
muestras que se ingresen al programa de estabilidad podrán ser nacionales ni internacionales, los resultados de las valoraciones
seleccionadas basándose en un sistema de matriz y/o por podrán ser informados en unidades obtenidas internamente,
‘‘bracketing’’ (estudio de inferencia por extremos). utilizando un material de referencia caracterizado.
El matrizado, es decir, el diseño estadı́stico de un estudio de En algunos productos biotecnológicos o biológicos, la potencia
estabilidad en el cual se prueban diferentes fracciones de muestras en depende de la conjugación del ingrediente o ingredientes activos a
distintos puntos de muestreo, sólo debe aplicarse cuando se una segunda subunidad o de la unión con un adyuvante. La
proporciona documentación adecuada que confirma que la estabili- disociación del ingrediente o los ingredientes activos del transporta-
dad de las muestras probadas representa la estabilidad de todas las dor utilizado en conjugados o adyuvantes debe ser examinada en
muestras. Las diferencias en las muestras para el mismo producto estudios en tiempo real/temperatura real (incluyendo condiciones
farmacéutico deben ser identificadas indicando, por ejemplo, que que se encuentran durante el transporte). Es posible que la
cubren distintas partidas, distintas concentraciones, distintos tamaños evaluación de la estabilidad de tales productos sea dificultosa, ya
del mismo cierre y, posiblemente, en algunos casos, distintos que, en ciertos casos, las pruebas in vitro de actividad biológica y de
sistemas de envase y cierre. El matrizado no debe aplicarse a caracterización fisicoquı́mica son poco prácticas o proporcionan
muestras con diferencias que puedan afectar la estabilidad, tales resultados inexactos. Para superar las deficiencias de las pruebas in
como distintas concentraciones y distintos envases y cierres, donde vitro, habrá que considerar estrategias adecuadas (por ejemplo,
no pueda confirmarse que los productos responden de manera similar probar el producto antes de la conjugación o unión, evaluar la
a las condiciones de almacenamiento. liberación del compuesto activo de la segunda subunidad, valora-
Cuando se utilicen la misma concentración y exactamente el ciones in vivo) o el uso de una prueba alternativa adecuada.
mismo sistema de envase y cierre para tres o más volúmenes de C. Pureza y Caracterización Molecular (5.3)
llenado, el fabricante puede optar por incluir sólo los tamaños de A efectos de las pruebas de estabilidad de los productos descritos
envase más pequeño y más grande en el programa de estabilidad, es en esta guı́a, la pureza es un término relativo. Debido a los efectos de
decir, puede optar por el ‘‘bracketing’’. El diseño de un protocolo la glicosilación, desamidación u otras heterogeneidades, la pureza
que incorpore ‘‘bracketing’’ supone que la estabilidad de las absoluta de un producto biotecnológico o biológico es sumamente
muestras de condición intermedia están representadas por aquellas difı́cil de determinar. Por consiguiente, la pureza de un producto
de los extremos. En ciertos casos, se pueden necesitar datos para biotecnológico o biológico debe ser evaluada tı́picamente por más de
demostrar que todas las muestras están adecuadamente representadas un método y el valor de pureza que se obtenga dependerá del
por los datos reunidos para los extremos. método. A efectos de las pruebas de estabilidad, las pruebas de
V. PERFIL INDICADOR DE ESTABILIDAD (5) pureza deben concentrarse en los métodos para la determinación de
En general, no hay una valoración ni un parámetro único los productos de degradación.
indicador de estabilidad que ofrezca un perfil de las caracterı́sticas El grado de pureza, al igual que las cantidades individuales y
de estabilidad de un producto biotecnológico o biológico. Por totales de productos de degradación del producto biotecnológico o
consiguiente, el fabricante debe proponer un perfil indicador de biológico ingresado en los estudios de estabilidad, deben ser
estabilidad que garantice que los cambios en la identidad, pureza y informados y documentados siempre que sea posible. Los lı́mites
potencia del producto serán detectados. de degradación aceptables deben derivar de los perfiles analı́ticos de
las partidas del fármaco y del producto farmacéutico utilizados en los
estudios preclı́nicos y clı́nicos.
538 h1049i Calidad de Productos Biotecnológicos: Estabilidad / Información General USP 30
El uso de metodologı́as analı́ticas fisicoquı́micas, bioquı́micas e producto farmacéutico. Los estudios bajo condiciones de estrés
inmunoquı́micas pertinentes deberı́a permitir una caracterización pueden ser útiles para determinar si las exposiciones accidentales a
exhaustiva del fármaco y/o del producto farmacéutico (por ejemplo, condiciones que no sean las propuestas (por ejemplo, durante el
tamaño molecular, carga, hidrofobicidad) y la detección exacta de transporte) son perjudiciales para el producto y también para evaluar
cambios de degradación que puedan ser consecuencia de desamida- qué parámetros especı́ficos de prueba pueden ser los mejores
ción, oxidación, sulfoxidación, agregación o fragmentación durante indicadores de la estabilidad del producto. Los estudios de la
el almacenamiento. Como ejemplos, entre los métodos que pueden exposición del fármaco o del producto farmacéutico a condiciones
contribuir a este objetivo se incluyen la electroforesis (SDS09Page, extremas pueden ayudar a revelar patrones de degradación; si es ası́,
inmunoelectroforesis, Western blot, isoelectroenfoque), la cromato- dichos cambios deben ser monitoreados bajo las condiciones de
grafı́a de alta resolución (por ejemplo, cromatografı́a en fase reversa, almacenamiento propuestas. Pese a que la guı́a tripartita sobre
filtración a través de gel, intercambio iónico, cromatografı́a de estabilidad describe las condiciones de los estudios acelerados y de
afinidad) y el mapeo de péptidos. estrés, el solicitante debe tener en cuenta que esas condiciones
Siempre que se detecten cambios cualitativos o cuantitativos pueden no ser adecuadas para productos biotecnológicos o
significativos, que indiquen la formación de un producto de biológicos. Las condiciones deben seleccionarse cuidadosamente,
degradación durante los estudios de estabilidad a largo plazo, de acuerdo a cada caso en particular.
acelerados y/o de estrés, habrá que tener en cuenta los riesgos D. Luz (6.4)
potenciales y la necesidad de caracterización y cuantificación de los Los solicitantes deben consultar a las autoridades reguladoras
productos de degradación dentro del programa de estabilidad a largo correspondientes, en cada caso, a fin de determinar las pautas para
plazo. Deberán proponerse y justificarse lı́mites aceptables, teniendo las pruebas.
en cuenta los niveles observados en el material utilizado en estudios E. Envase/Cierre (6.5)
preclı́nicos y clı́nicos. Pueden ocurrir cambios en la calidad del producto, a causa de las
Para sustancias que no puedan caracterizarse adecuadamente, o interacciones entre el producto biotecnológico o biológico formulado
productos para los cuales no se pueda determinar un análisis exacto y el envase/cierre. Cuando no pueda excluirse la ausencia de
de la pureza por métodos analı́ticos de rutina, el solicitante debe interacciones en productos lı́quidos (que no sean ampollas selladas),
proponer y justificar procedimientos de prueba alternativos. los estudios de estabilidad deben incluir muestras mantenidas en
D. Otras Caracterı́sticas del Producto (5.4) posición invertida u horizontal (es decir, en contacto con el cierre),
Las siguientes caracterı́sticas del producto, pese a no estar como también en posición vertical, para determinar los efectos del
especı́ficamente relacionadas con productos biotecnológicos o cierre sobre la calidad del producto. Deben suministrarse datos para
biológicos, deben ser monitoreadas e informadas para el producto todas las combinaciones diferentes de envase/cierre que se vayan a
farmacéutico en su envase final: comercializar.
El aspecto visual del producto (color y opacidad para soluciones o Además de los datos estándar necesarios para un vial monodosis
suspensiones; color, textura y tiempo de disolución para polvos), las convencional, el solicitante debe demostrar que el cierre utilizado en
partı́culas visibles en soluciones o después de la reconstitución de un vial multidosis es capaz de tolerar las condiciones de inserciones
polvos o liofilizados, el pH y el nivel de humedad de polvos y y extracciones reiteradas, de modo tal que el producto conserve
productos liofilizados. completamente su potencia, pureza y calidad durante el perı́odo
Las pruebas de esterilidad o pruebas alternativas (por ejemplo, máximo especificado en las instrucciones de uso en los envases,
prueba de integridad del envase/cierre) deben realizarse, como empaques y/o folletos del empaque. Dicho etiquetado debe cumplir
mı́nimo, al inicio y al final de la vida útil propuesta. con los requisitos nacionales y regionales pertinentes.
Los aditivos (por ejemplo, estabilizadores, conservantes) o los F. Estabilidad después de la Reconstitución de Productos
excipientes se pueden degradar durante el perı́odo de vida útil del Liofilizados (6.6)
producto farmacéutico. Si hay alguna indicación, durante los Deberá demostrarse la estabilidad de los productos liofilizados,
estudios de estabilidad preliminares, de que la reacción o la después de su reconstitución, para las condiciones y el perı́odo de
degradación de tales materiales afectan adversamente la calidad almacenamiento máximo especificados en los envases, empaques y/o
del producto farmacéutico, puede que se precise controlar estos folletos del empaque. Este etiquetado debe cumplir con los requisitos
componentes durante el programa de estabilidad. nacionales y regionales pertinentes.
El envase/cierre tiene el potencial de afectar adversamente al VII. FRECUENCIA DE LAS PRUEBAS (7)
producto y debe ser evaluado cuidadosamente (ver a continuación). La vida útil de los productos biotecnológicos o biológicos puede
VI. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO (6) variar entre dı́as y varios años. Por lo tanto, es difı́cil elaborar guı́as
A. Temperatura (6.1) uniformes respecto de la duración de los estudios de estabilidad y de
Como la mayorı́a de los productos biotecnológicos o biológicos la frecuencia de prueba que corresponderı́an a todos los tipos de
terminados necesitan temperaturas de almacenamiento definidas con productos biotecnológicos o biológicos. No obstante, sólo con unas
precisión, las condiciones de almacenamiento para los estudios de pocas excepciones, la vida útil para los productos existentes y los
estabilidad en tiempo real/temperatura real pueden limitarse a la futuros productos potenciales oscila entre 0,5 y 5 años. Por lo tanto,
temperatura de almacenamiento propuesta. las pautas se basan en la vida útil esperada dentro de ese intervalo.
B. Humedad (6.2) Esto toma en cuenta el hecho de que la degradación de los productos
Los productos biotecnológicos o biológicos generalmente se biotecnológicos o biológicos puede no estar regida por los mismos
distribuyen en envases que los protegen contra la humedad. Por lo factores durante intervalos diferentes de un perı́odo de almacena-
tanto, donde pueda demostrarse que los envases propuestos (y las miento prolongado.
condiciones de almacenamiento) logran una protección suficiente Cuando se propone una vida útil de 1 año o menos, los estudios de
contra la alta y baja humedad, por lo general, se podrán omitir las estabilidad en tiempo real deben realizarse mensualmente durante los
pruebas de estabilidad a distintas humedades relativas. Cuando no se primeros 3 meses y a intervalos de 3 meses de allı́ en adelante. Para
utilicen envases que protejan contra la humedad, deben proporcio- productos con una vida útil propuesta de más de 1 año, los estudios
narse datos de estabilidad adecuados. deben realizarse cada 3 meses durante el primer año de
C. Condiciones Aceleradas y de Estrés (6.3) almacenamiento, cada 6 meses durante el segundo año y anualmente
Según se observó anteriormente, la fecha de caducidad debe desde ese momento en adelante.
basarse en datos de tiempo real/temperatura real. No obstante, se Mientras que los intervalos de prueba mencionados anteriormente
sugiere enfáticamente que se realicen estudios sobre el fármaco y el pueden ser adecuados en la etapa previa a la aprobación o licencia,
producto farmacéutico bajo condiciones aceleradas y de estrés. Los pruebas de estabilidad reducidas pueden ser adecuadas después de la
estudios bajo condiciones aceleradas pueden proporcionar datos aprobación o licencia, cuando se dispone de datos que demuestran
útiles para establecer la fecha de caducidad, proporcionar informa- una estabilidad adecuada. Cuando existan datos que indiquen que la
ción sobre la estabilidad del producto o sobre el futuro desarrollo del estabilidad de un producto no se ve comprometida, se recomienda al
producto (por ejemplo, la evaluación preliminar de los cambios de solicitante presentar un protocolo que avale la eliminación de
fabricación propuestos tales como cambios en la formulación, intervalos de prueba especı́ficos (por ejemplo, prueba a los 9 meses)
aumento de escala), ayudar a la validación de métodos analı́ticos para estudios a largo plazo posteriores a la aprobación o licencia.
para el programa de estabilidad, o generar información que pueda
ayudar a dilucidar el perfil de degradación del fármaco o del
USP 30 Información General / h1050i Evaluación de la Seguridad Viral 539
en cuenta incluyen el alcance de la caracterización y calificación del origen humano o provenientes de primates no humanos porque la
banco de células, la naturaleza de los virus detectados, los contaminación viral que surge de estas células puede representar un
componentes del medio de cultivo, los métodos de cultivo, el peligro importante.
diseño de las instalaciones y los equipos, los resultados de las Las pruebas para detectar virus no endógenos deberán incluir
pruebas virales después del cultivo de las células, la capacidad del pruebas de inoculación in vitro e in vivo y otras pruebas especı́ficas,
proceso para eliminar los virus, el tipo de producto y el uso clı́nico incluyendo pruebas especı́ficas para la especie que sean apropiadas,
para el cual está destinado. como por ejemplo la prueba de producción de anticuerpos en ratones
El propósito de este documento es describir un marco de (MAP, por sus siglas en inglés), según el historial de resiembra de la
referencia general para las pruebas de detección viral, los lı́nea celular, para detectar posibles virus contaminantes.
experimentos para la evaluación de la depuración viral y el enfoque 2. Banco de Células de Trabajo
recomendado para el diseño de pruebas para la detección de virus y Cada BCT empleado como sustrato inicial de células para la
estudios de depuración viral. En los apéndices se incluye informa- producción de medicamentos deberá ser examinado para detectar
ción relacionada mientras que en el glosario pueden encontrarse virus adventicios, ya sea realizando pruebas directas o mediante el
definiciones de algunos términos seleccionados. análisis de células que estén en el lı́mite de edad celular in vitro,
Los fabricantes deberán adaptar las recomendaciones presentadas obtenidas inicialmente del BCT. Cuando se hayan realizado pruebas
en este documento a su producto y proceso de producción adecuadas para detectar virus no endógenos en el BCM y se hayan
especı́ficos. Se deberá explicar y justificar el enfoque empleado obtenido del BCT células cultivadas hasta el lı́mite de edad celular in
por los fabricantes en su estrategia general para garantizar la vitro, o más allá de ese lı́mite y se las haya utilizado para detectar la
seguridad viral. Además del detalle de los datos que se proporcionan, presencia de virus adventicios, no será necesario realizar pruebas
podrı́a ser útil contar con un resumen general de la evaluación de la similares en el BCT inicial. Por lo general, no son necesarias las
seguridad viral a fin de facilitar la revisión por parte de las pruebas de producción de anticuerpos para el BCT. También se
autoridades regulatorias. Este resumen deberá contener una breve considerarı́a aceptable un enfoque alternativo en el cual se lleven a
descripción de todos los aspectos de los estudios de seguridad viral y cabo pruebas completas sobre el BCT en lugar de hacerlo en el
de las estrategias empleadas para impedir la contaminación viral en BCM.
relación con este documento. 3. Células en el Lı́mite de Edad Celular in Vitro Empleadas para
II. FUENTES POTENCIALES DE CONTAMINACIÓN Producción
VIRAL El lı́mite de edad celular in vitro usado para la producción de-
La contaminación viral de los productos biotecnológicos puede berá estar sustentado en los datos de células de producción
surgir de la fuente original de las lı́neas celulares o de la introducción expandidas a escala de planta piloto o condiciones de escala
accidental de virus durante los procesos de producción. comercial hasta la edad celular in vitro propuesta, o más allá de ésta.
A. Virus que Pueden Encontrarse en el Banco de Células Por lo general, las células de producción se obtienen por expansión
Maestras (BCM) del BCT; el BCM también puede utilizarse para preparar las células
Las células pueden sufrir una infección viral latente o persistente de producción. Las células que se encuentran en el lı́mite de la edad
(por ejemplo, virus del herpes) o tener retrovirus endógenos que celular in vitro deberán evaluarse una vez para detectar los virus
pueden transmitirse verticalmente desde una generación de células a endógenos que pueden no haber sido detectados en el BCM y BCT.
la siguiente, ya que el genoma viral persiste dentro de la célula. Tales La realización de pruebas adecuadas (por ejemplo, in vitro e in vivo)
virus pueden expresarse constitutivamente o inesperadamente como por lo menos una vez en las células utilizadas para la producción que
un virus infeccioso. Los virus pueden introducirse en el BCM por están en el lı́mite de edad celular in vitro proporcionarı́a una
diferentes vı́as, como por ejemplo: (1) derivación de lı́neas celulares seguridad adicional de que el proceso de producción no es propenso
de animales infectados; (2) empleo de virus para establecer la lı́nea a la contaminación por virus adventicios. Si se detecta algún virus
celular; (3) empleo de reactivos biológicos contaminados, como por adventicio a estos niveles, el proceso se deberá controlar
ejemplo, componentes séricos animales; (4) contaminación durante cuidadosamente para determinar la causa de la contaminación y, si
la manipulación de las células. fuera necesario, su diseño deberá modificarse por completo.
B. Virus Adventicios Que Pueden Introducirse Durante la B. Pruebas Recomendadas para la Detección e Identificación de
Producción Virus
Los virus adventicios pueden introducirse en el producto final por Se pueden emplear numerosas pruebas para la detección de virus
diferentes vı́as que incluyen, entre otras, las siguientes: (1) empleo endógenos y adventicios. En la Tabla 2 se enumeran ejemplos de
de reactivos biológicos contaminados, como por ejemplo, compo- estas pruebas. Estos ejemplos deberán ser considerados como
nentes de suero animal; (2) empleo de un virus para inducir la protocolos de valoración recomendados actualmente, pero la lista
expresión de genes especı́ficos que codifican una proteı́na deseada; no es exhaustiva ni definitiva. Puesto que las técnicas más
(3) empleo de un reactivo contaminado, como por ejemplo, una apropiadas pueden cambiar con los avances cientı́ficos, las
columna para cromatografı́a de afinidad con anticuerpos mono- propuestas de técnicas alternativas pueden considerarse aceptables,
clonales; (4) empleo de un excipiente contaminado durante la siempre y cuando se acompañen de datos que las avalen. Se
formulación; y (5) contaminación durante la manipulación de las recomienda a los fabricantes tratar estas alternativas con las
células y del medio. El control de los parámetros de cultivo de autoridades reguladoras. Puede ser necesario realizar otras pruebas
células puede ser útil para la detección temprana de la contaminación conforme a cada caso particular. Las pruebas deberán incluir
potencial por virus adventicios. controles apropiados para asegurar una adecuada sensibilidad y
especificidad. Pueden requerirse pruebas y/o enfoques especı́ficos en
III. CALIFICACIÓN DE LÍNEAS CELULARES: PRUEBA aquellos casos en los que se puede predecir con una probabilidad
PARA LA DETECCIÓN DE VIRUS relativamente alta la presencia de un virus especı́fico proveniente de
Una parte importante de la calificación de una lı́nea celular para su la especie de origen del sustrato celular. Si la lı́nea celular usada para
uso en la producción de un producto biotecnológico es la realización la producción es de origen humano o de primate no humano, deberán
de pruebas apropiadas para detectar la presencia de virus. realizarse pruebas adicionales para detectar virus de humanos, como
A. Pruebas Virales Sugeridas para BCM, Banco de Células de por ejemplo los que causan enfermedades de inmunodeficiencia y
Trabajo (BCT) y Células en el Lı́mite de Edad Celular in Vitro hepatitis, a menos que se justifiquen otra cosa. La reacción en cadena
Empleadas para Producción de polimerasa (RCP) puede ser apropiada para detectar las
La Tabla 1 muestra ejemplos de pruebas virales que se realizan secuencias de otros virus humanos, ası́ como otros virus especı́ficos.
una sola vez a diversos niveles de células, incluyendo el BCM, el A continuación, se incluye una breve descripción del marco de
BCT y las células en el lı́mite de edad celular in vitro usadas para referencia general y de los antecedentes filosóficos conforme a los
producción. cuales el fabricante deberá justificar lo realizado.
1. Banco de Células Maestras 1. Pruebas para Detectar Retrovirus
En el BCM se deberá realizar un examen exhaustivo para detectar Para el BCM y para células cultivadas hasta el lı́mite de edad
la contaminación viral, tanto endógena como no endógena. En el celular in vitro o más allá de éste usadas para la producción, se
caso de las lı́neas celulares heterohı́bridas en las cuales una o varias deberán realizar pruebas para retrovirus, incluidas las valoraciones
células asociadas son de origen humano o provienen de primates no de infectividad en cultivos celulares sensibles y estudios de
humanos, se deberán realizar pruebas para detectar los virus de microscopı́a electrónica (ME). Si no se detecta infectividad y no
USP 30 Información General / h1050i Evaluación de la Seguridad Viral 541
Tabla 1. Ejemplos de Pruebas de Virus a ser Realizadas Una Única Vez a Distintos Niveles Celulares
Células en el
BCM BCT1 Lı́mite2
Pruebas para Retrovirus y Otros Virus Endógenos
Infectividad + – +
Microscopı́a electrónica3 +3 – +3
Transcriptasa inversa4 +4 – +4
Otras pruebas especı́ficas para virus5 según corresponda5 – según corres-
ponda5
Pruebas para Virus No Endógenos o Adventicios
Valoraciones in vitro + –6 +
Valoraciones in vivo + –6 +
Pruebas de producción de anticuerpos7 +7 – –
Otras pruebas especı́ficas para virus8 +8 – –
1
Ver texto—sección III.A.2.
2
Células en el Lı́mite: Células en el lı́mite de edad celular in vitro utilizadas para la producción (Ver texto—sección III.A.3.).
3
También puede detectar otros agentes.
4
No es necesario si es positivo en la prueba de infectividad de retrovirus.
5
Según sea adecuado para las lı́neas celulares que se sabe están infectadas por tales agentes.
6
Para el primer BCT, esta prueba deberá hacerse sobre células en el lı́mite de la edad celular in vitro generadas a partir de ese BCT; para los BCT subsiguientes al
primer BCT, se puede llevar a cabo una única prueba in vitro e in vivo ya sea directamente sobre el BCT o sobre células en el lı́mite de la edad celular in vitro.
7
Por ejemplo, MAP, RAP, HAP— normalmente aplicables para las lı́neas celulares de roedores.
8
Por ejemplo, las pruebas para lı́neas celulares derivadas de lı́neas celulares humanas, de primates no humanos, u otras, según sea adecuado.
Tabla 2. Ejemplos de Uso y Lı́mites de Valoraciones Que Pueden Utilizarse para Detectar Virus
Prueba Artı́culo de Prueba Capacidad de Detección Limitaciones de la Detección
Producción de anticuerpos Lisado de células y su Antı́genos virales especı́ficos Antı́genos no infecciosos para
medio de cultivo sistema de prueba en animales
Examen de virus in vivo Lisado de células y su Amplia gama de virus Agentes que no se replican ni
medio de cultivo patogénicos para humanos producen enfermedades en el
sistema de prueba
Examen de virus in vitro para: Amplia gama de virus Agentes que no se replican ni
patogénicos para humanos producen enfermedades en el
sistema de prueba
1. Caracterización del banco de 1. Lisado de células y su
células medio de cultivo (para cultivos
conjuntos, las células
intactas deberán estar
en el artı́culo de prueba)
2. Examen de producción 2. Recolección a granel no
procesada o lisado de células
y su medio de cultivo celular
del reactor de producción
TEM sobre: Virus y partı́culas similares a virus Valoración cualitativa con
evaluación de identidad
1. Célula sustrato 1. Células viables
2. Sobrenadante de cultivo celu- 2. Sobrenadante de cultivo libre
lar de células
Transcriptasa inversa (TI) Sobrenadante de cultivo libre Retrovirus y Sólo detecta enzimas con
de células TI retroviral expresada actividad óptima bajo
condiciones preferidas. La
interpretación puede
ser difı́cil debido a la
presencia de enzimas
celulares; fondo con
algunas muestras concentradas
Infectividad con retrovirus (RV) Sobrenadante de cultivo libre de Retrovirus infecciosos RV que no se replican ni forman
células focos o placas discretos en
el sistema de prueba elegido
Cultivo conjunto Células viables Retrovirus infecciosos RV que no se replican
1. Punto final de infectividad 1. Ver más arriba en
infectividad de RV
2. Punto final de TEM 2. Ver más arriba en TEM1
3. Punto final de TI 3. Ver más arriba en TI
RCP (Reacción de cadena Células, lı́quido de cultivo y otros Secuencias de virus especı́ficas Las secuencias de los
de polimerasa) materiales iniciadores deben estar pre-
sentes. No indica si
el virus es infeccioso.
1
Además, es difı́cil distinguir el artı́culo de prueba de las células indicadoras.
542 h1050i Evaluación de la Seguridad Viral / Información General USP 30
se han observado ningún retrovirus o partı́culas similares a retrovirus virus contaminantes, su potencial para infectar o causar enferme-
por ME, deberá realizarse la valoración de transcriptasa inversa (TI) dades en los seres humanos, el proceso de purificación del producto
u otras valoraciones apropiadas para la detección de retrovirus que (por ejemplo, datos de evaluación de depuración viral) y el nivel de
pueden no ser infecciosos. Se ha descubierto que los estudios de pruebas virales realizadas en el material a granel purificado.
inducción no son útiles. IV. COMPROBACIÓN DE VIRUS EN EL MATERIAL A
2. Valoraciones In Vitro GRANEL SIN PROCESAR
Las pruebas in vitro se llevan a cabo mediante la inoculación de El material a granel sin procesar está constituido por uno o varios
un artı́culo de prueba (ver Tabla 2) en diversos cultivos celulares grupos de células y medios de cultivo recolectados mezclados.
indicadores, sensibles y capaces de detectar una amplia gama de Cuando las células no son accesibles fácilmente (por ejemplo, fibra
virus humanos y animales pertinentes. La selección de células usadas hueca o sistemas similares), el granel sin procesar estarı́a constituido
en la prueba se rige por la especie de origen del banco de células a por lı́quidos extraı́dos del fermentador. Una muestra representativa
evaluar, pero deberá incluir una lı́nea celular humana y/o de primates del material a granel sin procesar, tomada del reactor de producción
no humanos que sea sensible a los virus humanos. La naturaleza de antes del procesamiento adicional, representa uno de los niveles más
la valoración y de la muestra a analizar están regidas por el tipo de apropiados en el cual se puede determinar la posibilidad de
virus que posiblemente pueda estar presente considerando el origen contaminación viral adventicia con una alta probabilidad de
o manipulación de las células. Se deberán buscar los virus tanto detección. Se deberán realizar pruebas apropiadas para detectar
citopáticos como hemadsorbentes. virus al nivel de granel sin procesar, a menos que la prueba para
3. Valoraciones In Vivo detectar virus se haga más sensible mediante un procesamiento
Se deberá inocular un artı́culo de prueba (ver Tabla 2) en inicial parcial (por ejemplo, un granel sin procesar podrı́a ser tóxico
animales, incluyendo ratones adultos y lactantes, y en embriones de en cultivos de células de prueba, mientras que un granel
huevos para descubrir virus que no pueden crecer en cultivos parcialmente procesado podrı́a no serlo).
celulares. Se pueden emplear otras especies de animales, según la En ciertos casos, puede ser más apropiado probar una mezcla de
naturaleza y el origen de las lı́neas celulares que se van a analizar. Se células intactas y deshechas y el sobrenadante del cultivo celular
deberá vigilar la salud de los animales y deberá investigarse toda extraı́do del reactor de producción antes del procesamiento adicional.
anormalidad para establecer la causa de la enfermedad. Como parte de la solicitud y/o registro para la comercialización de
4. Pruebas de Producción de Anticuerpos un producto, se deberán presentar datos de, por lo menos, tres lotes
Los virus especı́ficos para la especie, presentes en lı́neas celulares de granel sin procesar a escala de planta piloto o comercial.
de roedores, pueden detectarse mediante inoculación del artı́culo de Se recomienda a los fabricantes elaborar programas para la
prueba (ver Tabla 2) en animales libres de virus, y mediante el evaluación de virus adventicios en lotes de producción. El alcance, el
examen, después de un perı́odo especı́fico, del nivel del anticuerpo grado y la frecuencia de pruebas virales en el granel sin procesar
sérico o la actividad enzimática. Ejemplos de tales pruebas son la deberán determinarse tomando en consideración varios puntos,
prueba de producción de anticuerpos en ratones (MAP), la prueba de incluyendo la naturaleza de las lı́neas celulares usadas para elaborar
producción de anticuerpos en ratas (RAP) y la prueba de producción los productos deseados, los resultados y el grado de las pruebas para
de anticuerpos en hámsteres (HAP). Los virus que actualmente se virus realizadas durante la calificación de las lı́neas celulares, el
examinan en las valoraciones de producción de anticuerpos se método de cultivo, las fuentes de materia prima y los resultados de
presentan en la Tabla 3. los estudios de depuración viral. Las pruebas de examen in vitro,
C. Aceptabilidad de las Lı́neas Celulares utilizando una o varias lı́neas celulares, generalmente se emplean
Se reconoce que algunas lı́neas celulares usadas para la para probar el material a granel no procesado. Si fuera apropiado,
fabricación de productos contienen retrovirus endógenos, otros puede utilizarse una prueba de RCP u otros métodos apropiados.
virus o secuencias virales. En tales circunstancias, el plan de acción En general, el material recolectado en el cual se han detectado
recomendado para la fabricación es el descrito en la Sección V de virus adventicios no deberá utilizarse para elaborar el producto. Si se
este documento. La aceptabilidad de las lı́neas celulares que detectan algunos virus adventicios a este nivel, se deberá controlar el
contienen virus distintos de los retrovirus endógenos será conside- proceso con cuidado para determinar la causa de la contaminación y
rada en forma individual por las autoridades regulatorias, teniendo tomar las acciones apropiadas al caso.
en cuenta un análisis de riesgo/beneficio basado en el beneficio del
producto y el uso clı́nico al que está destinado, la naturaleza de los
Tabla 3. Virus Detectados en las Pruebas de Producción de Anticuerpos
MAP HAP RAP
Virus de Ectromelia2, 3 Virus de Coriomeningitis Linfocı́tica Virus Hantaan1, 3
(LCM)1, 3
Virus Hantaan1, 3 Virus de la Pneumonı́a de Ratón (PVM)2, 3 Virus de Rata Kilham (KRV)2, 3
Virus K2 Reovirus Tipo 3 (Reo3)1, 3 Virus de la Encefalomielitis de Ratón
(Theilers, GDVII)2
Virus de Deshidrogenasa Láctica (LDM)1, 3 Virus Sendai1, 3 Virus de la Pneumonı́a de Ratón (PVM)2, 3
Virus de Coriomeningitis Linfocı́tica SV5 Coronavirus de Rata (RCV)2
(LCM)1, 3
Virus Diminuto de Ratón2, 3 Reovirus Tipo 3 (Reo3)1, 3
Adenovirus de Ratón (MAV)2, 3 Virus Sendai1, 3
Citomegalovirus de Ratón (MCMV)2, 3 Virus de Sialoacrioadenitis (SDAV)2
Virus de la Encefalomielitis de Ratón Virus Toolan (HI)2, 3
(Theilers, GDVII)2
Virus de la Hepatitis de Ratón (MHV)2
Rotavirus de Ratón (EDIM)2, 3
Virus de la Pneumonı́a de Ratón (PVM)2, 3
Virus de Polioma 2
Reovirus Tipo 3 (Reo3)1, 3
Virus Sendai1, 3
Virus Tı́mico 2
1
Virus de los que se tiene evidencia de su capacidad de infectar a seres humanos o primates.
2
Virus de los que no se tiene evidencia de su capacidad para infectar a seres humanos.
3
Virus capaces de replicarse in vitro en células de origen humano o de primates.
USP 30 Información General / h1050i Evaluación de la Seguridad Viral 543
V. JUSTIFICACIÓN Y PLAN DE ACCIÓN PARA LOS detectar la presencia de partı́culas no infecciosas en el material a
ESTUDIOS DE DEPURACIÓN VIRAL Y PRUEBAS granel purificado. Son apropiados los estudios con virus ‘‘modelo’’
VIRALES EN MATERIAL A GRANEL PURIFICADO no especı́ficos, como en el Caso A.
Es importante diseñar el protocolo más adecuado y racional para Caso C: Cuando se sabe que las células o el material a granel no
las pruebas virales a partir del nivel de BCM, a lo largo de los procesado contienen virus, distintos de un retrovirus de roedores, del
diversos pasos de la producción del fármaco hasta la obtención del que no hay ninguna evidencia de la capacidad de infección en seres
producto final, incluyendo la evaluación y la caracterización de la humanos [como aquellos identificados en la nota 2 al pie de la Tabla
depuración viral del material a granel sin procesar. La evaluación y 3, excepto los retrovirus de roedores (Caso B)], los estudios de
caracterización de la depuración viral cumple una función evaluación de eliminación e inactivación de los virus deberán usar el
fundamental en este esquema. El objetivo deberá ser obtener la virus identificado. Si no es posible usar el virus identificado, se
mayor seguridad razonable de que un producto está libre de deberán utilizar virus ‘‘relevantes’’ o ‘‘modelo’’ especı́ficos para
contaminación viral. demostrar una depuración aceptable. Se deberá obtener una
Al seleccionar los virus que se utilizarán en un estudio de inactivación dependiente del tiempo para los virus identificados (o
depuración, resulta útil distinguir entre la necesidad de evaluar los virus ‘‘relevantes’’ o ‘‘modelo’’ especı́ficos) en los pasos de
procesos con respecto a su capacidad de eliminar los virus que se inactivación fundamentales como parte de la evaluación del proceso
sabe están presentes y el deseo de calcular la solidez del proceso para estos virus. El material a granel purificado deberá analizarse
mediante la caracterización de la depuración de los virus de utilizando métodos apropiados que tengan una alta especificidad y
‘‘modelo’’ no especı́fico (descritos a continuación). En el glosario se sensibilidad para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de
incluyen las definiciones de virus ‘‘relevantes‘‘ y virus ‘‘modelo’’ la comercialización, se deberán proveer los datos de al menos tres
especı́ficos y no especı́ficos. La evaluación de procesos requiere un lotes de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala
conocimiento de la cantidad de virus que pueden estar presentes en comercial.
el proceso, como en el material a granel no procesado, y cuánto Caso D: En aquellos casos en que se identifica un agente
puede depurarse a fin de evaluar la seguridad del producto. El patógeno humano conocido, como los indicados en la nota 1 al pie
conocimiento de la dependencia del tiempo en los procedimientos de de la Tabla 3, el producto puede ser aceptable sólo en circunstancias
inactivación es útil para asegurar la eficacia del proceso. Cuando se excepcionales. En este caso, se recomienda usar el virus identificado
evalúa la depuración de contaminantes conocidos se deberán para los estudios de evaluación de eliminación e inactivación viral y
proporcionar estudios profundos de inactivación dependientes del emplear métodos especı́ficos con alta especificidad y sensibilidad
tiempo, una demostración de la reproducibilidad de la inactivación/ para detectar el virus en cuestión. Si no es posible usar el virus
eliminación y una evaluación de los parámetros del proceso. Cuando identificado, se deberán utilizar virus ‘‘relevantes’’ y/o ‘‘modelo’’
un proceso de fabricación está caracterizado por la robustez de especı́ficos (descritos a continuación). Se deberá demostrar que el
depuración utilizando virus ‘‘modelo’’ no especı́ficos, en el diseño proceso logra la eliminación e inactivación de los virus selecciona-
del estudio se deberá prestar atención especial a los virus no dos durante los procesos de purificación e inactivación. Se deberán
encapsulados. El alcance de los estudios de caracterización de obtener datos de inactivación dependientes del tiempo para los pasos
depuración viral puede estar influenciado por los resultados de las de inactivación fundamentales como parte de la evaluación del
pruebas en las lı́neas celulares y el material a granel sin procesar. proceso. Deberán hacerse pruebas en el granel purificado utilizando
Estos estudios deberán realizarse conforme a la descripción de la métodos apropiados que tengan una alta especificidad y sensibilidad
sección VI que sigue a continuación. para detectar el virus en cuestión. Para la autorización de la
La Tabla 4 muestra un ejemplo de un plan de acción en relación comercialización, se deberán proveer los datos de al menos tres lotes
con la evaluación del procesos y la caracterización de depuración de granel purificado elaborado a escala de planta piloto o escala
viral, ası́ como las pruebas virales en material a granel purificado en comercial.
respuesta a los resultados de las pruebas virales en células y/o el
material a granel sin procesar. Se consideran diversos casos. En Caso E: En aquellos casos en que se detecta un virus que no
todos los casos, se deberá realizar la caracterización de la depuración puede clasificarse según los métodos actualmente disponibles en
que utiliza virus ‘‘modelo’’ no especı́ficos. Las situaciones más células o material a granel no procesado, el producto se considera
comunes son los Casos A y B. Normalmente no se usan sistemas de por lo general inadmisible ya que el virus puede resultar patógeno.
producción contaminados con un virus que no sea un retrovirus de En el caso muy poco frecuente de que haya razones convincentes y
roedores. Cuando existen razones convincentes y bien justificadas bien justificadas para producir el fármaco usando dicha lı́nea celular,
para la producción de fármacos usando una lı́nea celular de los Casos deberá tratarse con las autoridades reguladoras antes de continuar
C, D o E, éstos deberán ser tratados con las autoridades reguladoras. avanzando.
Con los Casos C, D y E, es importante haber validado los pasos VI. EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS
eficaces para inactivar/eliminar el virus en cuestión del proceso de PROCEDIMIENTOS DE DEPURACIÓN VIRAL
fabricación. La evaluación y caracterización de los procedimientos de
Caso A: Cuando se ha demostrado que no hay ningún virus, eliminación y/o inactivación viral desempeñan un papel importante
partı́culas similares a virus o partı́culas similares a retrovirus en las a la hora de establecer la seguridad de un producto biotecnológico.
células o en el granel sin procesar, se deberán realizar estudios de Anteriormente, han ocurrido muchos casos de contaminación con
inactivación o eliminación viral con virus ‘‘modelo’’ no especı́ficos agentes cuya presencia no se detectó ni se sospechó y aunque esto
como se indicó anteriormente. sucedió con productos biológicos obtenidos de diversas materias
primas diferentes de las lı́neas celulares plenamente caracterizadas,
Caso B: Cuando hay presente solamente un retrovirus de roedor la evaluación de la depuración viral proporcionará una medida de
(o una partı́cula similar a un retrovirus que se piensa que es no seguridad que indica que puede eliminarse cualquier virus
patógena, como las partı́culas de roedor de tipo A y R), se de- desconocido, no sospechado y nocivo. Se deberán realizar estudios
berá realizar la evaluación del proceso utilizando un virus ‘‘modelo’’ de una manera bien documentada y controlada.
especı́fico, como un virus de leucemia murina. El material a granel El objetivo de los estudios de depuración viral es evaluar el paso o
purificado deberá analizarse utilizando métodos apropiados que los pasos del proceso que pueden considerarse eficaces para la
tengan una alta especificidad y sensibilidad para detectar el virus en inactivación o eliminación de los virus y hacer el cálculo cuantitativo
cuestión. Para la autorización de la comercialización, se deberán del nivel general de reducción viral obtenido por el proceso. Esto
proveer datos de al menos tres lotes de material a granel purificado a deberá realizarse mediante la introducción deliberada (‘‘adicio-
escala comercial o escala de planta piloto. Se han usado con nado’’) de cantidades significativas de un virus al material crudo y/o
frecuencia lı́neas celulares tales como las de ovario de hámsteres a diferentes fracciones obtenidas durante los diversos pasos del
chinos (CHO), de C127, de riñón de hámsteres recién nacidos proceso y la demostración de su eliminación o inactivación durante
(BHK) y lı́neas celulares de hibridoma murino como sustratos para la los pasos posteriores. No se considera necesario evaluar o
producción de medicamentos sobre los cuales no se han informado caracterizar todos los pasos de un proceso de fabricación si se
problemas de seguridad relacionados con la contaminación viral de demuestra una depuración adecuada mediante el uso de menos
los productos. Para estas lı́neas celulares en las cuales las partı́culas pasos. Deberá tenerse presente que otros pasos del proceso pueden
endógenas se han caracterizado ampliamente y se ha demostrado la
depuración, generalmente no es necesario hacer pruebas para
544 h1050i Evaluación de la Seguridad Viral / Información General USP 30
Tabla 4. Plan de Acción para la Evaluación del Proceso de Depuración Viral y Pruebas para Virus en Materiales a Granel Purificados
Caso A Caso B Caso C2 Caso D2 Caso E2
Estado
Presencia de virus1 – – + + (+)3
Partı́culas similares a virus1 – – – – (+)3
Partı́culas similares a retrovirus1 – + – – (+)3
Virus identificado no corresponde + + + –
Virus patógeno para humanos no corresponde –4 –4 + desconocido
Acción
Caracterización del proceso de depuración sı́5 sı́5 sı́5 sı́5 sı́7
viral utilizando virus ‘‘modelo’’
no especı́ficos
Evaluación de proceso de depuración viral no sı́6 sı́6 sı́6 sı́7
utilizando ‘‘virus relevantes’’ o
‘‘modelo’’ especı́ficos
Prueba para virus en material a granel no corresponde sı́8 sı́8 sı́8 sı́8
purificado
1
Resultados de las pruebas de detección de virus para el substrato celular y/o al nivel de granel no procesado. Los cultivos celulares utilizados para la producción
que estén contaminados con virus generalmente no serán aceptables. Los virus endógenos (tales como retrovirus) o los virus que forman parte integral del BCM
pueden ser aceptables si se utilizan procedimientos de evaluación de depuración viral apropiados.
2
El uso de material fuente que está contaminado con virus, ya sea que se sepa o no que son infecciosos y/o patógenos para el ser humano, solamente serán
aceptables en circunstancias muy excepcionales.
3
Se ha observado un virus por métodos directos o indirectos.
4
Se piensa que es no patógeno.
5
Se deberá llevar a cabo la caracterización de la depuración utilizando virus ‘‘modelo’’ no especı́ficos.
6
Se deberá llevar a cabo la evaluación del proceso con virus ‘‘relevantes’’ o virus ‘‘modelo’’ especı́ficos.
7
Ver texto para el Caso E.
8
Deberá confirmarse la ausencia de virus detectables para el material a granel purificado utilizando métodos apropiados de alta especificidad y sensibilidad para
la detección del virus en cuestión. Para la autorización de su comercialización, se deberán proporcionar los datos de por lo menos 3 lotes de material a granel
purificado y fabricado a escala de planta piloto o comercial. Sin embargo, para lı́neas celulares tales como células CHO, para las cuales las partı́culas endógenas
han sido caracterizadas extensivamente y se ha demostrado una depuración adecuada, normalmente no es necesario determinar la presencia de partı́culas no
infecciosas en el material a granel purificado.
tener un efecto indirecto sobre la inactivación o eliminación viral fabricante deberá justificar la elección de los virus en conformidad
lograda. Los fabricantes deberán explicar y justificar el enfoque con los objetivos de la evaluación y el estudio de caracterización y
utilizado en los estudios de evaluación de la depuración viral. las pautas proporcionadas en este documento.
La reducción de la infectividad viral puede lograrse mediante la 1. Virus ‘‘Relevantes’’ y Virus ‘‘Modelo’’
eliminación de las partı́culas virales o por inactivación de la Un aspecto importante en la realización de un estudio de
infectividad viral. Para cada etapa de producción evaluada, se debe- depuración viral es determinar qué virus deberán utilizarse. Estos
rá describir el posible mecanismo de pérdida de infectividad viral virus se clasifican en tres categorı́as: virus ‘‘relevantes’’, virus
estableciendo si se debe a inactivación o eliminación. Para los pasos ‘‘modelo’’ especı́ficos y virus ‘‘modelo’’ no especı́ficos.
de inactivación, el estudio deberá planificarse de tal manera que las Los virus ‘‘relevantes’’ son virus utilizados en la evaluación de los
muestras se tomen en diferentes tiempos y se deberá elaborar una procesos de estudios de depuración viral, que son los virus
curva de inactivación (ver Sección VI.B.5.). identificados o virus de la misma especie que los virus que se sabe
Los estudios de evaluación de depuración viral se realizan para que contaminan las células sustrato u otros reactivos o materiales
demostrar la depuración de un virus que se sabe está presente en el utilizados en el proceso de producción, o que tienen probabilidades
BCM y/o para proporcionar cierta seguridad de que se eliminarı́an de hacerlo. La purificación y/o proceso de inactivación de-
los virus adventicios que no pudieron detectarse o que pudieran berá demostrar la capacidad para eliminar y/o inactivar tales virus.
llegar a tener acceso al proceso de producción. Los factores de Cuando un virus ‘‘relevante’’ no está disponible o no se adapta bien
reducción se expresan normalmente en escala logarı́tmica, lo cual a la evaluación del proceso de estudios de depuración viral (por
implica que, aunque la infectividad viral residual nunca se reducirá a ejemplo, no puede multiplicarse in vitro a niveles suficientemente
cero, puede reducirse considerablemente en forma matemática. altos), se deberá utilizar un virus ‘‘modelo’’ especı́fico como
Además de los estudios de depuración para los virus que se sabe sustituto. Un virus ‘‘modelo’’ especı́fico apropiado puede ser un
están presentes, deberán realizarse estudios para caracterizar la virus que esté relacionado estrechamente con el virus conocido o
capacidad para eliminar y/o inactivar otros virus. El objetivo de los presunto (del mismo género o familia), con propiedades fı́sicas y
estudios con virus que presentan una variedad de propiedades quı́micas similares a las del virus observado o presunto.
bioquı́micas y biofı́sicas que no se sabe si están presentes o que no se Generalmente, las lı́neas celulares derivadas de roedores contienen
estima que lo estén es caracterizar la robustez del procedimiento en partı́culas de retrovirus endógenos o partı́culas similares a retrovirus
lugar de lograr una inactivación o eliminación especı́fica. Es que pueden ser infecciosas (partı́culas tipo C) o no infecciosas
aconsejable que se haga una demostración de la capacidad del (partı́culas citoplasmáticas tipo A y R). Deberá determinarse la
proceso de producción para inactivar o eliminar los virus (ver capacidad del proceso de fabricación para eliminar y/o inactivar los
Sección VI.C.). Tales estudios no se realizan para evaluar un riesgo retrovirus de roedores de los productos obtenidos de tales células.
especı́fico de seguridad. Por consiguiente, no se necesita llegar a un Esto puede realizarse utilizando un virus de leucemia murina, un
valor especı́fico de depuración. virus ‘‘modelo’’ especı́fico en el caso de células de origen murino.
A. Selección de Virus para la Evaluación y Caracterización de la Cuando se han obtenido lı́neas celulares humanas que secretan
Depuración Viral anticuerpos monoclonales mediante la inmortalización de linfocitos
Los virus para la evaluación de la depuración y los estudios de B por el Virus Epstein-Barr (EBV por sus siglas en inglés), se de-
caracterización de los procesos, deberán elegirse de manera tal que berá determinar la capacidad del proceso de fabricación para
se asemejen a los virus que puedan contaminar el producto y que eliminar y/o inactivar un virus de herpes. El virus de la pseudo-
representen una amplia gama de propiedades fı́sico-quı́micas para rabia también puede utilizarse como un virus ‘‘modelo’’ especı́fico.
probar la capacidad del sistema para eliminar los virus en general. El Cuando la finalidad es caracterizar la capacidad del proceso de
fabricación para eliminar y/o inactivar los virus en general, es decir,
caracterizar la robustez del proceso de depuración, los estudios de
caracterización de depuración viral deberán realizarse con virus
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‘‘modelo’’ no especı́ficos con propiedades diferentes. Los datos pH, la temperatura y la concentración de proteı́nas, sales y el
obtenidos de los estudios con virus ‘‘relevantes’’ y/o ‘‘modelo’’ producto son representativos de la fabricación a escala comercial.
especı́ficos también pueden contribuir a esta evaluación. No es Deberá obtenerse un perfil similar de elución. Para otros procedi-
necesario probar todos los tipos de virus. Se deberá dar preferencia a mientos, se aplicarán consideraciones similares. Las desviaciones
los virus que muestran una resistencia significativa a los tratamientos que no pueden evitarse deberán considerarse con respecto a su
fı́sicos y/o quı́micos. Los resultados obtenidos para tales virus influencia en los resultados.
proporcionan información útil acerca de la capacidad del proceso de 3. Análisis de la Eliminación Viral Escalonada
producción para eliminar y/o inactivar todo tipo de virus. La Cuando se están realizando estudios de depuración viral, es
selección y el número de virus utilizados dependerán de la calidad y aconsejable evaluar la contribución a la eliminación viral de más de
caracterización de las lı́neas celulares y del proceso de producción. una etapa de producción. Los pasos que tienen probabilidad de
En el Apéndice 2 y en la Tabla A-1 se incluyen ejemplos de virus eliminar virus deberán evaluarse individualmente con respecto a su
‘‘modelo’’ útiles con diferentes estructuras fı́sico-quı́micas y capacidad para eliminar e inactivar el virus y la definición exacta de
ejemplos de virus que se han utilizado en los estudios de depuración paso individual deberá considerarse meticulosamente. Se de-
viral. berá tener suficiente virus en el material utilizado en cada paso
2. Otras Consideraciones que se desea probar para obtener una evaluación adecuada de la
Deberán considerarse los siguientes puntos adicionales: eficacia en cada paso. Por lo general, se deberán agregar virus al
(a) Se aconseja usar virus que puedan multiplicarse hasta un tı́tulo material en proceso de cada paso que se desea probar. En algunos
alto, aunque esto no siempre es posible. casos, simplemente será suficiente agregar un virus de tı́tulo alto a un
(b) Deberá existir una prueba eficaz y confiable para la detección material a granel no purificado y evaluar su concentración entre cada
de cada virus utilizado, para cada etapa de fabricación sometida a uno de los pasos. Cuando la eliminación viral es el resultado de
prueba. procedimientos de separación, se recomienda investigar, si es
(c) Se deberán considerar los riesgos planteados por determinados apropiado y posible, la distribución de la carga viral en las diferentes
virus para la salud del personal que realiza los estudios de fracciones. Cuando se usan agentes reguladores virucidas en varios
depuración viral. pasos dentro del proceso de fabricación, se pueden utilizar
B. Diseño e Implicaciones de la Evaluación de la Depuración estrategias alternativas como por ejemplo la adición en paralelo de
Viral y de los Estudios de Caracterización cantidades conocidas en soluciones amortiguadoras menos virucidas
1. Instalaciones y Personal como parte de la evaluación general de los procesos. Se de-
Es inapropiado introducir cualquier tipo de virus en las berá determinar el tı́tulo viral antes y después de cada paso de la
instalaciones de producción debido a las restricciones impuestas prueba. Las valoraciones cuantitativas de infectividad deberán
por las buenas prácticas de fabricación (BPF). Por consiguiente, los poseer una sensibilidad y reproducibilidad adecuadas y realizarse
estudios de depuración viral deberán ser realizados en un laboratorio con suficientes repeticiones para asegurar una validez estadı́stica
separado, equipado para el trabajo virológico y por personal con adecuada del resultado. Se podrán utilizar valoraciones cuantitativas
experiencia en virologı́a conjuntamente con el personal de produc- no asociadas con infectividad si se justifica. Se deberán incluir
ción que participa en el diseño y preparación de una versión a menor controles virales apropiados en todas las valoraciones de infectividad
escala del proceso de purificación. para asegurar la sensibilidad del método. Además, se deberán
2. Sistema de Producción a Menor Escala considerar los datos del muestreo estadı́stico cuando el virus tiene
Se deberá demostrar la validez de la producción a menor escala. El baja concentración (Apéndice 3).
nivel de la purificación de la versión a menor escala deberá ser tan 4. Determinación de la Eliminación Fı́sica en Función de la
representativo del procedimiento de producción como sea posible. Inactivación
Para el equipo cromatográfico, se deberá demostrar que la altura del Se puede reducir la infectividad viral mediante la eliminación o
lecho de la columna, la velocidad lineal de flujo, el cociente entre la inactivación del virus. Para cada etapa de producción evaluada, se
velocidad de flujo y el volumen del lecho de la columna (es decir, el deberá describir el posible mecanismo de pérdida de infectividad
tiempo de contacto), los tipos de gel y soluciones amortiguadoras, el viral estableciendo si se debe a inactivación o eliminación. Si
Tabla A-1. Ejemplos de Virus que se Han Utilizado en Estudios de Depuración Viral
Virus Familia Género Huesped Genoma Med. Amb. Tamaño Forma Resisten-
Natural (nm) cia1
Virus de la Estomatitis Rhabdoviri- Virus Equinos, ARN sı́ 70 6 150 Cónica Baja
Vesicular dae vesicular Bovinos
Parainfluenzavirus P a r a m i x o - Virus Varios ARN sı́ 100–200þ Pleo/Esfér- Baja
viridae paramixo ico
MuL V Retroviridae Oncovirus Ratones ARN sı́ 80–110 Esférico Baja
Tipo C
Virus de Sindbis Togaviridae Alfavirus Humanos ARN sı́ 60–70þ Esférico Baja
BVDV Flaviviridae Pestivirus Bovinos ARN sı́ 50–70 Pleo/Esfér- Baja
ico
Virus de la Pseudo- Herpesviri- Porcinos ADN sı́ 120–200 Esférico Media
rabia dae
Poliovirus Sabı́n Picornaviri- Enterovirus Seres huma- ARN no 25–30 Icosahédrico Media
Tipo 1 dae nos
Virus de la Picornaviri- Cardiovirus Ratones ARN no 25–30 Icosahédrico Media
Encefalomiocardi- dae
tis (EMC)
Reovirus 3 Reoviridae Ortoreo- Varios ADN no 60–80 Esférico Media
virus
SV 40 Papova Polioma- Monos ADN no 40–50 Icosahédrico Muy alta
virus
Parvovirus (canino, Parvoviridae Parvovirus Caninos ADN no 18–24 Icosahédrico Muy alta
porcino) Porcinos
1
Resistencia a tratamientos fı́sico-quı́micos basados en estudios de procesos de producción. La resistencia se refiere al tratamiento especı́fico y se utiliza en el
contexto del entendimiento de la biologı́a del virus y la naturaleza del proceso de fabricación. Los resultados obtenidos varı́an según el tratamiento. Estos virus se
ofrecen a modo de ejemplo y su uso no se considera obligatorio.
546 h1050i Evaluación de la Seguridad Viral / Información General USP 30
mediante el proceso de producción se logra una escasa depuración de (g) Las soluciones amortiguadoras y el producto deberán
la infectividad y se considera que la depuración del virus es el factor evaluarse independientemente con respecto a la toxicidad o la
más importante para la seguridad del producto, se deberán introducir interferencia en las valoraciones usadas para determinar la valora-
pasos adicionales o especı́ficos de inactivación o eliminación. Puede ción viral, ya que estos componentes pueden afectar negativamente a
ser necesario distinguir entre la eliminación y la inactivación para un las células indicadoras. Si las soluciones son tóxicas para las células
paso en particular, por ejemplo, cuando existe la posibilidad de que indicadoras, quizá sea necesaria la dilución, el ajuste del pH o la
una solución amortiguadora utilizada en más de un paso de diálisis de la solución amortiguadora que contiene el virus agregado.
depuración pueda contribuir a la inactivación en todos ellos; es Si el producto en sı́ mismo tiene actividad antiviral, es posible que se
decir, se deberá distinguir entre la contribución de la inactivación por deba realizar el estudio de depuración sin el producto en una corrida
una solución amortiguadora utilizada en varios pasos cromato- ‘‘simulada’’, aunque la omisión del producto o el uso de una proteı́na
gráficos y la eliminación lograda en cada uno de estos pasos similar que no tiene actividad antiviral en su lugar podrı́a afectar el
cromatográficos. comportamiento del virus en algunas de las etapas de la producción.
5. Evaluación de la Inactivación Se deberán incluir suficientes controles para demostrar el efecto de
Para la evaluación de la inactivación viral, se deberá agregar un los procedimientos utilizados únicamente para preparar la muestra
virus infeccioso al material en crudo, no procesado o al material para la valoración (por ejemplo: diálisis, almacenamiento) en la
intermedio y deberá calcularse el factor de reducción. Se debe eliminación o inactivación del virus agregado en cantidades
reconocer que esa inactivación viral no es una reacción sencilla de conocidas.
primer orden, sino que generalmente es más compleja, con una ‘‘fase (h) Muchos esquemas de purificación usan repetitivamente las
1’’ rápida y una ‘‘fase 2’’ lenta. Por lo tanto, se deberá planificar el mismas soluciones amortiguadoras o columnas similares. Se deberán
estudio de tal manera que las muestras se tomen a diferentes tiempos considerar los efectos de este enfoque cuando se analicen los datos.
y se deberá elaborar una curva de inactivación. Se recomienda que La eficacia de la eliminación viral mediante un proceso especı́fico
los estudios para determinar la inactivación incluyan al menos un puede variar en las distintas etapas de fabricación en las cuales se
punto de tiempo menor al tiempo de exposición mı́nima y que sea usa.
mayor que cero, además del tiempo de exposición mı́nimo. Los datos (i) Los factores generales de reducción pueden subestimarse
adicionales son particularmente importantes cuando el virus es un cuando las condiciones de producción o las soluciones amortigua-
virus ‘‘relevante’’ que se sabe que es un agente patógeno humano y doras son demasiado citotóxicas o virucidas y cada caso de-
se está diseñando un proceso de inactivación eficaz. Sin embargo, berá tratarse individualmente. También se pueden sobreestimar los
para los estudios de inactivación en los cuales se usan virus factores generales de reducción debido a las limitaciones inherentes
‘‘modelo’’ no especı́ficos o cuando se usan virus ‘‘modelo’’ o al diseño inadecuado de los estudios de depuración viral.
especı́ficos como sustitutos de partı́culas virales, tales como las C. Interpretación de los Estudios de Depuración Viral;
partı́culas intracitoplasmáticas de CHO similares a retrovirus, se Aceptabilidad
deberá demostrar una depuración reproducible en al menos dos El objetivo de la evaluación de la inactivación o eliminación viral
estudios independientes. Siempre que sea posible, se de- es evaluar y caracterizar los pasos del proceso que pueden
berá determinar la carga viral inicial del virus que puede detectarse considerarse eficaces para inactivar o eliminar los virus, y estimar
en la cantidad conocida de material agregado inicial. Si esto no fuera cuantitativamente el nivel general de la reducción viral obtenida
posible, la carga viral inicial puede calcularse a partir del tı́tulo de la mediante el proceso de fabricación. En el caso de los contaminantes
preparación viral que se siembra. Cuando la inactivación es vı́ricos, como por ejemplo en los Casos B a E, es importante
demasiado rápida para graficar una curva de inactivación con las demostrar que el virus no solamente ha sido eliminado o inactivado,
condiciones del proceso, se deberán realizar controles apropiados sino que además existe una capacidad en exceso de depuración viral
para demostrar que la infectividad realmente se pierde mediante la en el proceso de purificación para garantizar un nivel apropiado de
inactivación. seguridad para el producto final. La cantidad de virus eliminado o
6. Función y Regeneración de Columnas inactivado por el proceso de producción deberá compararse con la
Con el transcurso del tiempo y después de un uso repetido, la cantidad de virus que puede estar presente en el material a granel no
capacidad de las columnas cromatográficas y otros dispositivos procesado.
utilizados en el sistema de purificación para eliminar los virus puede Para realizar esta comparación, es importante calcular la cantidad
variar. Algunas estimaciones de la estabilidad de la depuración viral de virus en el material a granel no procesado. Este cálculo estimado
después de varios usos pueden servir de respaldo para el uso repetido deberá obtenerse utilizando valoraciones de infectividad u otros
de tales columnas. Se deberá asegurar que cualquier virus métodos como por ejemplo la microscopı́a electrónica de transmi-
potencialmente retenido por el sistema de producción puede ser sión (TEM, por sus siglas en inglés). Todo el proceso de purificación
adecuadamente destruido o eliminado antes de la reutilización del deberá ser capaz de eliminar sustancialmente una cantidad de virus
sistema, por ejemplo demostrando que los procedimientos de mayor de la que se estima que hay presente en el equivalente de una
limpieza y de regeneración en realidad inactivan o eliminan el virus. dosis única de material a granel no procesado. Ver el Apéndice 4 para
7. Precauciones Especı́ficas el cálculo de los factores de reducción viral y el Apéndice 5 para el
(a) Se deberán tomar las precauciones necesarias al preparar el cálculo de partı́culas estimadas por dosis.
virus de tı́tulo alto para evitar la agregación que puede aumentar la Los fabricantes deben reconocer que los mecanismos de
eliminación fı́sica y disminuir la inactivación y, de esta manera, depuración pueden diferir entre las distintas clases de virus. Se
distorsionar la correlación con la producción real. deberá tomar en consideración una serie de factores cuando se
(b) Se deberá considerar la cantidad mı́nima de virus que puede evalúen los datos que avalan la eficacia de los procedimientos de
analizarse de manera confiable. inactivación o eliminación de virus. Estos incluyen:
(c) El estudio deberá incluir valoraciones de control paralelas para (i) La conveniencia de los virus de prueba utilizados;
evaluar la pérdida de la infectividad del virus debido a causas tales (ii) El diseño de los estudios de depuración;
como dilución, concentración, filtración o almacenamiento de las (iii) El reducción logarı́tmica lograda;
muestras antes de la titulación. (iv) La dependencia del tiempo de inactivación;
(d) El virus ‘‘agregado’’ en cantidades conocidas se de- (v) Los efectos potenciales de la variación en los parámetros del
berá agregar al producto en un volumen pequeño para no diluir ni proceso sobre la inactivación o eliminación viral;
cambiar las caracterı́sticas del mismo. La muestra de prueba de (vi) Los lı́mites de las sensibilidades de la valoración;
proteı́na cuando se diluye ya no es idéntica al producto obtenido a (vii) La posible selectividad de los procedimientos de inactivación
escala comercial. o eliminación para ciertas clases de virus.
(e) Las diferencias pequeñas, como por ejemplo en las soluciones Se puede lograr la depuración eficaz mediante cualquiera de los
amortiguadoras, el medio, o los reactivos, pueden afectar sustan- siguientes procedimientos: varios pasos de inactivación, varios pasos
cialmente la depuración viral. de separación complementarios o combinaciones de pasos de
(f) La inactivación viral es una función dependiente del tiempo y, inactivación y separación. Ya que los métodos de separación
por consiguiente, la cantidad de tiempo durante la cual el producto pueden depender de las propiedades fı́sico-quı́micas sumamente
agregado permanezca en una solución amortiguadora especı́fica o en especı́ficas de un virus, lo cual influye en su interacción con las
una columna cromatográfica especı́fica deberá reflejar las con- matrices de gel y las propiedades de precipitación, los virus
diciones del proceso a escala comercial. ‘‘modelo’’ pueden separarse de una manera diferente a la de un virus
USP 30 Información General / h1050i Evaluación de la Seguridad Viral 547
objetivo. Los parámetros de fabricación que influyen en la Cuando se hacen cambios significativos en la producción o en el
separación deberán definirse y controlarse adecuadamente. Las proceso de purificación, se deberá considerar el efecto de ese cambio
diferencias pueden originarse en cambios de la superficie, como por en la depuración viral, tanto directo como indirecto y deberá volver a
ejemplo en la glicosilación. Sin embargo, a pesar de estas variables evaluarse el sistema según cada caso. Por ejemplo, los cambios en
potenciales, se puede obtener la eliminación eficaz mediante la los procesos de producción pueden causar cambios significativos en
combinación de pasos de separación complementarios o combina- la cantidad de virus producida por la lı́nea celular; los cambios en los
ciones de pasos de inactivación y de separación. Por lo tanto, los pasos del proceso pueden cambiar el grado de depuración de los
pasos de separación bien diseñados, tales como los procedimientos virus.
cromatográficos, los pasos de filtración y las extracciones, pueden VII. RESUMEN
ser pasos eficaces de eliminación viral siempre que se realicen bajo Este documento sugiere enfoques para la evaluación del riesgo de
condiciones debidamente controladas. Un paso eficaz de eliminación contaminación viral y para la eliminación del virus del producto, y
viral deberá producir una reducción reproducible de la carga viral en de este modo contribuye a la producción de productos biotecno-
por lo menos dos estudios independientes. lógicos seguros derivados de lı́neas celulares de origen animal o
Un factor de reducción general se expresa normalmente como la humano, y enfatiza el valor de muchas estrategias, que incluyen:
suma de los factores individuales. Sin embargo, una reducción de A. La caracterización o examen minucioso del sustrato celular
tı́tulo viral del orden de 1 log10 o menos se considerarı́a inapreciable, usado como material inicial para identificar los contaminantes virales
y podrı́a descartarse a menos que se justifique. presentes, si los hubiera;
Si se logra una escasa reducción de la infectividad mediante el B. La evaluación del riesgo mediante la determinación del
proceso de producción, y la eliminación del virus es el factor más tropismo en seres humanos de los contaminantes;
importante para la seguridad del producto, se deberá introducir uno o C. La creación de un programa apropiado de pruebas para detectar
más pasos especı́ficos adicionales de inactivación o eliminación. Los virus adventicios en material a granel no procesado;
fabricantes deberán justificar la aceptabilidad de los factores de D. El diseño cuidadoso de los estudios de depuración viral que
reducción obtenidos para todos los virus. Los resultados deberán utilizan diferentes métodos de inactivación o eliminación viral en el
evaluarse sobre la base de los factores ya enumerados. mismo proceso de producción para lograr la máxima depuración
D. Lı́mites de los Estudios de Depuración Viral viral; y
Los estudios de depuración viral son útiles para ayudar a E. Estudios de rendimiento que evalúan la inactivación y la
garantizar el logro de un nivel de seguridad aceptable en el producto eliminación viral.
final, pero por sı́ solos no determinan que el producto es seguro. Sin
embargo, existen varios factores en el diseño y la ejecución de los GLOSARIO
estudios de depuración viral que pueden conducir a una estimación Virus Adventicio. Ver Virus.
incorrecta de la capacidad del proceso para eliminar la infectividad Sustrato Celular. Células utilizadas para la fabricación del
viral. Estos factores incluyen los siguientes: producto.
1. Las preparaciones virales utilizadas en los estudios de Virus Endógeno. Ver Virus.
depuración para un proceso de producción probablemente se Inactivación. Reducción de la infectividad del virus causada por
producen en un cultivo tisular. El comportamiento de un virus de una modificación quı́mica o fı́sica.
cultivo tisular en una etapa de producción puede ser diferente al del Edad Celular in Vitro. Es la medida del transcurso del tiempo
virus natural, por ejemplo, si los virus naturales y cultivados difieren entre el descongelamiento del vial o viales del BCM y la cosecha del
en la pureza o en el grado de agregación. recipiente de producción, calculado ya sea mediante el tiempo
2. A menudo la inactivación de la infectividad viral sigue una cronológico transcurrido en cultivo, por el nivel de duplicación de la
curva bifásica en la cual una fase inicial rápida está seguida de una población de células o por el nivel de pasaje de las células cuando
fase más lenta. Es posible que el virus que escapa al primer paso de están subcultivadas por un procedimiento definido para la dilución
inactivación sea más resistente a los pasos posteriores. Por ejemplo, del cultivo.
si la fracción resistente toma la forma de agregados virales, la Banco de Células Maestro (BCM). Es una alı́cuota de una fuente
infectividad puede ser resistente a una variedad de diferentes única de células, generalmente preparada a partir de un clon de
tratamientos quı́micos y al calentamiento. células seleccionado bajo condiciones definidas, dispensada en
3. La capacidad del proceso general de eliminar la infectividad se envases múltiples y almacenada bajo condiciones definidas. El
expresa como la suma del logaritmo de las reducciones en cada paso. Banco de Células Madre se emplea para proporcionar por derivación
La sumatoria de los factores de reducción de varios pasos, en todos los bancos de células de trabajo. Las pruebas que se realicen
particular de los pasos con poca reducción (por ejemplo, por debajo sobre un nuevo BCM (a partir de un clon de células inicial previo,
de 1 log10), puede sobreestimar el potencial real de la eliminación BCM o BCT) deberán ser las mismas que las realizadas sobre el
viral. Aún más, los valores de reducción logrados mediante la BCM, a menos que se justifique otra cosa.
repetición de procedimientos idénticos o casi idénticos no se deberán Perı́odo Mı́nimo de Exposición. El perı́odo más corto durante el
incluir a menos que se justifique. cual se mantendrá una fase de tratamiento.
4. La expresión de los factores de reducción como reducciones Virus No Endógeno. Ver Virus.
logarı́tmicas de la valoración implica que, aunque la infectividad Caracterización del Proceso de Depuración Viral. Estudios de
viral residual puede reducirse considerablemente, nunca se reducirá a Depuración Viral en los cuales se utilizan virus ‘‘modelo’’ no
cero. Por ejemplo, una reducción de la infectividad de una especı́ficos para evaluar la solidez del proceso de fabricación que
preparación que contenga 8 log10 unidades infecciosas por mililitro elimina y/o inactiva estos virus.
(mL) por un factor de 8 log10 da cero log10 por mL o una unidad Estudios de Evaluación del Proceso de Depuración Viral.
infecciosa por mL, considerando el lı́mite de la detección de la Estudios de Depuración Viral en los cuales se utilizan virus
valoración. ‘‘relevantes’’ y/o ‘‘modelo’’ no especı́ficos para evaluar la robustez
5. El procesamiento a escala de planta piloto puede ser diferente del proceso de fabricación que elimina y/o inactiva estos virus.
del procesamiento a escala comercial a pesar del cuidado tomado en Células de Producción. Las células sustrato utilizadas para
el diseño del proceso a menor escala. fabricar el producto.
6. La suma de factores individuales de reducción viral que son Material a Granel sin Procesar. Una o varias extracciones
resultado de mecanismos similares de inactivación a lo largo del combinadas de células y medios de cultivo. Cuando las células no
proceso de fabricación puede sobreestimar la depuración viral son fácilmente accesibles, el material a granel sin procesar serı́a el
general. lı́quido extraı́do del fermentador.
E. Estadı́stica Virus. Agentes infecciosos que se replican intracelularmente y que
Los estudios de depuración viral deberán incluir el uso del análisis son potencialmente patogénicos, poseen un único tipo de ácido
estadı́stico de los datos para evaluar los resultados. Los resultados nucléico [ya sea ácido ribonucléico (ARN) o ADN], no pueden
del estudio deberán ser estadı́sticamente válidos para avalar las crecer ni dividirse por fisión binaria y se multiplican en la forma de
conclusiones (ver Apéndice 3). su material genético.
F. Reevaluación de la Depuración Viral Virus Adventicio. Un virus contaminante introducido accidental-
mente.
548 h1050i Evaluación de la Seguridad Viral / Información General USP 30
valoraciones virales del material después del paso son +a, los lı́mites Esto se aplica a aquellos virus para los cuales puede hacerse una
de confianza del 95 por ciento para el factor de reducción son: estimación de una cifra inicial, como por ejemplo los retrovirus
endógenos.
Ejemplo:
I. Suposiciones
Concentración estimada o medida de virus en el cultivo celular
recolectado: = 106/mL
Factor de depuración viral calculado = 4 1015
Volumen de cultivo recolectado necesario para hacer una dosis del
B. Probabilidad de Detección de Virus en Concentraciones Bajas producto = 1 L (l03mL)
A concentraciones virales bajas (por ejemplo, dentro del intervalo II. Cálculo de Partı́culas/Dosis Estimadas
de 10 a 1000 partı́culas infecciosas por L) es evidente que una
muestra de unos pocos mililitros puede o no contener partı́culas
infecciosas. La probabilidad, p, de que esta muestra no contenga
virus infecciosos es:
p = ((V-v) / V)n,
en donde V (L) es el volumen total del material a analizar, v (L) es el
volumen de la muestra y n es el número absoluto de partı́culas
infecciosas estadı́sticamente distribuidas en V.
Si V 44 v, se puede realizar una aproximación a esta ecuación
mediante la distribución de Poisson:
Por lo tanto, se esperarı́a menos de una partı́cula por millón de dosis.
p = e–cv,
en la cual c es la concentración de partı́culas infecciosas por litro.
o, c = ln p / –v,
Como ejemplo, si se analiza una prueba con un volumen de 1 mL,
las probabilidades p a concentraciones virales que varı́an desde 10 h1051i LIMPIEZA DE MATERIAL
hasta 1000 partı́culas infecciosas por L son: DE VIDRIO
c 10 10 1000
p 0,99 0,90 0,37
El éxito de muchas valoraciones y pruebas farmacopeicas depende
Esto indica que para una concentración de 1000 virus por litro, en un de la limpieza exhaustiva del material de vidrio utilizado. Por
37 por ciento de las muestras, 1 mL no contendrá una partı́cula viral. ejemplo, la exactitud de las valoraciones de la actividad de la
Si solamente se prueba el virus en una porción de una muestra y la heparina sódica y de la vitamina B12, ası́ como las pruebas de
prueba es negativa, se deberá calcular la cantidad de virus que pirógenos y de carbono orgánico total, es especialmente dependiente
tendrı́a que haber presente en la muestra total para lograr un de la limpieza escrupulosa del material de vidrio.
resultado positivo y este valor deberı́a considerarse al calcular un Un método eficaz utilizado en el pasado para la limpieza del
factor de reducción. Es aconsejable que los lı́mites de confianza material del vidrio es la aplicación de ácido nı́trico caliente. El
alcancen el 95 por ciento. Sin embargo, en algunos casos, esto quizás segundo método tradicional para eliminar material orgánico que no
no sea factible debido a las limitaciones de los materiales. requiere calor es la utilización de una mezcla de ácido crómico y
APÉNDICE 4 ácido sulfúrico. Sin embargo, ya no se recomienda el lavado con
Cálculo de Factores de Reducción en Estudios para Determinar la ácido crómico dada la naturaleza peligrosa y tóxica del material.
Depuración Viral Varias alternativas más inocuas, incluyendo el empleo de agentes
El factor de reducción viral de un paso de purificación o de limpieza, tales como el fosfato trisódico y detergentes sintéticos,
inactivación individuales se define como el log10 del cociente de la han demostrado ser muy útiles, pero requieren un enjuague
carga viral en el material antes de la purificación y la carga viral en el prolongado. Puede ser útil enjuagar con ácido nı́trico o sulfúrico
material una vez purificado cuando está listo para ser empleado en el diluido antes de enjuagar con agua. Esta operación facilitará la
próximo paso del proceso. Si se utilizan las siguientes abreviaturas: eliminación del material alcalino residual.
Material inicial: volumen v’; concentración 10a’; Para mediciones ópticas, hay que prestar atención especial a la
carga viral: (v’)(10a), limpieza de los recipientes, pero no debe usarse el ácido crómico ni
Material final: volumen v’’; tı́tulo 10a’’; las soluciones altamente alcalinas.
carga viral: (v’’)(10a’’), La eliminación eficaz de material orgánico es muy importante para
los factores de reducción individual Ri se calculan según: la prueba de aguas farmacéuticas conforme al capı́tulo general
10Ri = (v’)(10a’) / (v’’)(10a’’) denominado Carbono Orgánico Total h643i. Se ha demostrado que
Esta fórmula considera las concentraciones y los volúmenes de los un detergente alcalino con hidróxido de potasio como ingrediente
materiales antes y después del paso de purificación. principal* deja la menor cantidad de residuos de materia orgánica. El
Debido a la imprecisión inherente de algunas valoraciones virales, calentamiento en una mufla produce resultados comparables y es el
un factor de reducción individual empleado para el cálculo de un procedimiento que requiere menos trabajo; sin embargo requiere un
factor de reducción general deberá ser mayor de 1. equipo especializado.
El factor de reducción total para un proceso de producción En todos los casos es importante verificar que el procedimiento de
completo es el logaritmo de la suma de los factores de reducción de limpieza sea adecuado para la prueba o valoración que se desea
los pasos individuales. Esto representa el logaritmo del cociente realizar. Esto se puede lograr mediante determinaciones con blancos,
entre la carga viral al comienzo del primer paso del proceso de opiniones cientı́ficas, datos de fabricantes sobre residuos de agentes
depuración y al final del último paso del proceso de depuración. Los de limpieza y detergentes u otros controles. Especı́ficamente, hay
factores de reducción se expresan normalmente en una escala que prestar atención especial a la limpieza de los recipientes para
logarı́tmica lo cual implica que, mientras que la contaminación viral mediciones ópticas; debe evitarse el uso de soluciones muy alcalinas,
residual nunca se reducirá a cero, puede reducirse considerablemente ası́ como el uso de soluciones de ácido crómico que ya no se
en forma matemática. recomiendan. Finalmente, deberá incluirse una declaración en el
protocolo de limpieza que describa cómo se evaluará el éxito del
APÉNDICE 5 procedimiento de limpieza.
Cálculo de Partı́culas Estimadas por Dosis *
CIP 100; que se puede conseguir en Steris Corporation, Mentor, Ohio,
44060-1824.
550 h1061i Color—Medición Instrumental / Información General USP 30
Procedimiento
h1061i COLOR—MEDICIÓN Las consideraciones que se tratan en Espectrofotometrı́a y
INSTRUMENTAL Dispersión de Luz h851i también se aplican a la medición
instrumental del color. En el método espectrofotométrico, los valores
de reflectancia o de transmitancia se obtienen a longitudes de onda
discretas en todo el espectro visible, a un ancho de banda de 10 nm o
El color observado (ver h631i Color y Acromatismo) de un objeto menor. Luego, estos valores se emplean para calcular los valores
depende de la energı́a espectral de la iluminación, las caracterı́sticas tricromáticos mediante el uso de factores de ponderación.1 En el
de absorción del objeto y la sensibilidad visual del observador en el método colorimétrico, la ponderación se realiza mediante el uso de
intervalo de luz visible. De manera similar, es esencial que todo filtros.
método instrumental de amplia aplicación tenga en cuenta estos En la medición de la reflectancia espectral de sólidos opacos, el
mismos factores. ángulo de visión está separado del ángulo de iluminación de manera
Los métodos instrumentales para medir el color proporcionan tal que sólo entran en el receptor los rayos que se reflejan
datos más objetivos que la determinación visual de color subjetiva difusamente de la muestra de prueba. Se excluyen el reflejo
realizada por un pequeño número de personas. Con un buen especular y la luz dispersada.
mantenimiento y calibración, los métodos instrumentales pueden Para la medición de la transmitancia espectral de lı́quidos
proporcionar mediciones exactas y precisas de color y de diferencias transparentes, la muestra se irradia desde un ángulo que no se
de color que no varı́an con el tiempo. Toda medición instrumental de diferencia en más de 5 grados con respecto a la normal a su
color se basa en el hecho de que el ojo humano detecta el color a superficie, y la energı́a transmitida medida está dentro de los
través de tres ‘‘receptores.’’ Por lo tanto, todos los colores se pueden 5 grados de la normal. El color de las soluciones cambia con el
descomponer en una mezcla de tres estı́mulos de radiación espesor de la capa medida. A menos que existan consideraciones
seleccionados adecuadamente para excitar los tres receptores del especiales que indiquen algo diferente, se debe emplear una capa de
ojo. Aunque no exista un solo conjunto de fuentes de luz reales que 1 cm de espesor.
se pueda emplear para comparar todos los colores (es decir, para tres Los métodos descritos en este documento no son aplicables a
luces cualesquiera que se elijan existen algunos colores que lı́quidos turbios o sólidos translúcidos.
requieren una cantidad negativa de una o más luces), se han
definido tres estı́mulos arbitrarios con los que se pueden definir todos
los colores reales. Mediante extensos experimentos de comparación CALIBRACIÓN
de color realizados con personas con una visión de colores normal,
se han medido los coeficientes de distribución para cada longitud de A los fines de la calibración, se puede utilizar alguno de los
onda visible (400 nm a 700 nm) que proporcionan la cantidad siguientes materiales de referencia, según lo requiera la geometrı́a
relativa de estimulación de cada receptor causada por la luz a esa del instrumento. Para mediciones de transmitancia, se puede utilizar
longitud de onda. Estos coeficientes de distribución x, y, z, se agua purificada como un estándar del color blanco y asignarle una
muestran a continuación. De manera similar, para cualquier color la transmitancia de 1,000 a todas las longitudes de onda. Luego, los
cantidad de estimulación de cada receptor en el ojo se define valores tricromáticos X, Y y Z para la fuente C de la Comisión
mediante un conjunto de Valores tricromáticos (X, Y y Z) para ese Internacional del Color (CIE, por sus siglas en francés) son 98,0;
color. 100,0 y 118,1, respectivamente. Para mediciones de reflectancia, se
En las siguientes ecuaciones se proporcionan las relaciones entre pueden usar placas de porcelana opaca, cuya base de calibración es
el coeficiente de distribución (ver la figura adjunta) y los valores el reflector difuso perfecto y cuyas caracterı́sticas de reflectancia han
tricromáticos sido determinadas para la geometrı́a instrumental apropiada.2 Si la
geometrı́a de la muestra presentada excluye el uso de tales placas, se
puede emplear sulfato de bario comprimido, de grado estándar de
reflectancia del color blanco.3
Después de llevar a cabo la calibración con los materiales
mencionados, es deseable, siempre que sea posible, medir un
material de referencia que tenga un color lo más semejante posible al
de la muestra. Si no es adecuado emplear una muestra del material
sometido a prueba como estándar a largo plazo, hay disponibles
tablas de color4 que abarcan todo el espacio de color uniforme
visualmente, en pequeños incrementos de color. Se recomienda el
uso de un estándar de referencia de este tipo como un método para
en donde supervisar el desempeño de un instrumento incluso para determina-
R 1 ciones de color absoluto.
Y’= 0 ylPldl,Pl
es la potencia espectral de la fuente luminosa y fl es la reflectancia
espectral (rl) o la transmitancia espectral (tl) del material.
Una vez que se han calculado los valores tricromáticos de un
color, se pueden emplear para determinar la coordenadas del color en
un espacio de color de tridimensional idealizado al que se denomina
espacio de color visualmente uniforme. En un intento por definir
dicho espacio se han desarrollado muchos conjuntos de ecuaciones
de color. Las ecuaciones proporcionadas en este capı́tulo representan
una solución intermedia entre la sencillez del cálculo y la adecuación
a lo ideal.
Las coordenadas de un color en un espacio de color visualmente 1
La norma ASTM Z58.7.1-1951 proporciona valores tı́picos de ponderación,
uniforme pueden emplearse para calcular la desviación de un color tal como se informa en el Journal of the Optical Society of America, Vol. 41,
con respecto a un punto de referencia seleccionado. Cuando se 1951, páginas 431-439.
utiliza el método instrumental para determinar el resultado de una 2
Los elementos adecuados se pueden conseguir en BYK-Gardner USA, 2431
prueba que requiere comparar el color de una preparación de prueba Linden Lane, Silver Spring, MD 20910 o en Hunter Associates Laboratory,
con el color de un estándar o un lı́quido de comparación, el Inc., 11491 Sunset Hills Road, Reston, VA 22090.
parámetro a comparar es la diferencia, en espacio de color 3
El material adecuado se puede conseguir en Eastman Kodak Company,
visualmente uniforme, entre el color del blanco y el color de la Rochester, NY 14650, como ‘‘White Reflectance Standard’’ (Estándar de
muestra de prueba o estándar. Reflectancia del Color Blanco).
4
Se pueden obtener Cartas de Colores Centroides de proveedores de
instrumentos para la medición del color.
USP 30 Información General / h1061i Color—Medición Instrumental 551
Determinar la reflectancia o transmitancia entre 380 y 770 nm a Operar un colorı́metro5 adecuado para obtener valores equivalen-
intervalos de 10 nm. Expresar el resultado como un porcentaje, tes a los valores tricromáticos, X, Y y Z. Las exactitud con la que los
siendo 100,0 el máximo. Calcular los valores tricromáticos X, Y y Z resultados, obtenidos a partir del colorı́metro de filtro, coinciden con
de la siguiente manera. los valores tricromáticos puede indicarse determinando los valores
Materiales Reflectantes—Para los materiales reflectantes, los tricromáticos de placas de colores fuertemente saturados y
valores X, Y y Z son comparando tales valores con los calculados a partir de mediciones
espectrales en un espectrofotómetro.
Interpretación
COORDENADAS DE COLOR
en donde
DIFERENCIA DE COLOR uso de este tipo de estrategias permite implementar las aplicaciones
de CI en sistemas HPLC con una configuración apropiada.
La Diferencia de Color total E* es Asimismo, las separaciones por exclusión iónica y la detección
amperométrica por pulsos amplı́an el campo de aplicación de la CI a
ácidos orgánicos alifáticos, ası́ como a analitos no iónicos de gran
interés farmacéutico, entre los que se incluyen alcoholes, alditoles,
carbohidratos y aminoácidos. El amplio intervalo dinámico de esta
metodologı́a hace posible su aplicación a la cuantificación de trazas
contaminantes ası́ como a los componentes principales de un
en donde L*, a* y b* son las diferencias en las coordenadas de producto.
color de las muestras comparadas. Dado que la CI suele utilizar soluciones salinas, álcalis o ácidos
Las variables instrumentales pueden influir en los resultados. diluidos como fase móvil y no utiliza un disolvente orgánico, no se
Aunque pueden hacerse comparaciones confiables entre colores requiere la compra de disolventes orgánicos costosos ni la
similares medidos al mismo tiempo, los resultados obtenidos por eliminación peligrosa de los efluentes de desecho. El efluente
distintos instrumentos o en diferentes condiciones de funcionamiento puede ser eliminado después de neutralizarlo debidamente (a ~pH 7)
deben compararse con cuidado. Si fuera necesario comparar datos y, en caso de ser necesario, después de diluirlo con agua.
obtenidos con distintos instrumentos o tomados en diferentes La CI permite la separación utilizando técnicas de intercambio
momentos etc., es muy útil tener datos concomitantes obtenidos iónico, exclusión iónica o pares iónicos. Las separaciones por CI se
con un material de referencia estándar, como por ejemplo tablas de basan en las diferencias entre las densidades de carga de las especies
color para materiales opacos. La comparación de las lecturas del de analito, las cuales, a su vez, dependen de la valencia y del tamaño
material de referencia ayuda a identificar variaciones debidas al de las especies iónicas individuales que se desea medir. Las
funcionamiento del instrumento. separaciones también se pueden realizar a partir de las diferencias en
las caracterı́sticas hidrofóbicas de las especies iónicas. Por lo
general, la CI se realiza a temperatura ambiente. Al igual que con
otras formas de HPLC, las separaciones por CI se basan en factores
de capacidad variables y, por lo general, siguen la ecuación de Knox.
h1065i CROMATOGRAFÍA IÓNICA La cromatografı́a iónica es una técnica que complementa las
utilizadas más comúnmente en el análisis farmacéutico: la HPLC
en fase reversa y en fase normal y las técnicas de absorción atómica
y con plasma de acoplamiento iónico (espectroquı́mica de plasma).
INTRODUCCIÓN
La cromatografı́a iónica (CI) es una técnica de cromatografı́a APARATOS
lı́quida de alta resolución (HPLC) instrumental que se utiliza en los
procedimientos de prueba USP, tales como pruebas de identificación Los instrumentos utilizados en la CI se asemejan en gran medida
y valoraciones para medir aniones y cationes inorgánicos, ácidos a los utilizados en la HPLC convencional. Los componentes tı́picos
orgánicos, carbohidratos, alcoholes de azúcar, aminoglicósidos, incluyen un muestreador automático, una bomba de alta presión, una
aminoácidos, proteı́nas, glicoproteı́nas y, potencialmente, otros válvula de inyección con un bucle de muestra de tamaño adecuado
analitos. (normalmente de 10 a 250 mL), un guarda columna, una columna
Según las caracterı́sticas del analito, la CI se ha aplicado a todos analı́tica, un supresor opcional u otras formas de sistema de reacción
los aspectos de la fabricación y disposición de productos posterior al paso por columna, un detector de flujo continuo y un
farmacéuticos, entre los que se incluye la caracterización de los sistema de datos cuya complejidad puede variar desde un integrador
ingredientes activos, excipientes, productos de degradación, impu- a un sistema de datos computarizado (Figura 1). Dado que, por lo
rezas y flujos de procesos. Se han analizado los siguientes tipos de general, las fases móviles constan de soluciones salinas, álcalis o
muestras, entre otras: materias primas, intermedios (incluidos medios ácidos diluidos, los componentes que están en contacto con la fase
y caldos de cultivo), ingredientes activos a granel, diluyentes, móvil y la muestra suelen realizarse a partir de materiales inertes,
productos formulados, soluciones de limpieza de equipos de como por ejemplo polieteretercetona (PEEK). También pueden
producción y flujos de desechos. Esta técnica es particularmente utilizarse los sistemas HPLC convencionales siempre que sus
valiosa para analitos iónicos o ionizables (en la fase móvil) que tiene componentes sean compatibles con la fase móvil y las soluciones
una absorbancia UV reducida o nula. La capacidad de combinar la de muestras inyectadas. Después de una preparación adecuada, la
separación por intercambio iónico con numerosas estrategias de muestra se introduce a través de la válvula de inyección. Después de
detección, como por ejemplo la detección amperométrica por pulsos la supresión quı́mica opcional u otra reacción posterior al paso por
(DAP), amplı́a las aplicaciones de la CI a aquellos casos en los que columna en el efluente de la columna, se detectan las especies de
las estrategias de detección especı́ficas para cada analito pueden analitos empleando conductividad, amperometrı́a, UV/VIS u otras
proporcionar el grado de sensibilidad o especificidad requerido. El técnicas de detección. Dado que la CI utiliza una fase móvil
Figura 1. Ilustración esquemática de los componentes de un sistema de CI tı́pico; DC = detector de conductividad y DAP = detector
amperométrico por pulsos
USP 30 Información General / h1065i Cromatografı́a Iónica 553
predominantemente iónica, suele requerirse un supresor antes de la sodio o de otro metal a formas ácidas altamente conductoras (debido
detección conductométrica, si bien la detección conductométrica no a la mayor conductancia equivalente de los iones de hidrógeno en
suprimida se ha utilizado con éxito en el análisis farmacéutico. comparación con otros cationes). Se producen reacciones análogas
en el supresor de forma de hidróxido en la CI de cationes, en la que
la fase móvil ácida se convierte en agua y los cationes del analito se
Fases Estacionarias y Fases Móviles convierten en formas de hidróxido altamente conductoras (debido a
la mayor conductancia equivalente de los iones de hidróxido en
Con el desarrollo y perfeccionamiento de la CI como técnica comparación con otros aniones).
instrumental, ha aumentado el número de materiales de intercambio La reducción en la conductancia de fondo y el aumento en la
iónico desarrollados para esta técnica gracias a la comprensión de los señal debido a las especies iónicas dan como resultado una relación
procesos que tienen lugar en la superficie de la fase estacionaria. A señal-ruido mejorada para la detección conductométrica de iones en
diferencia del relleno de columna de sı́lice predominante en la HPLC CI suprimida. Esto produce una reducción en el ruido de fondo y un
clásica, en la CI se utilizan principalmente polı́meros orgánicos aumento en la sensibilidad y en la capacidad de reproducción del
como materiales de soporte. Este tipo de materiales presenta una análisis. Los dispositivos de supresión quı́mica comúnmente
mayor estabilidad ante valores de pH extremos y, en muchos casos, utilizados pueden ser de tres categorı́as generales. En el primer
son compatibles con los disolventes orgánicos. Normalmente, la tipo, las reacciones se producen a través de una membrana de
separación de los aniones requiere el uso de intercambiadores de intercambio iónico y los iones regeneradores son proporcionados por
aniones a base de polı́meros y bases diluidas como fases móviles. un producto quı́mico o bien como productos de la electrólisis del
Sin embargo, para la separación de los cationes, la estabilidad en agua. En el segundo tipo, las reacciones de supresión se producen en
toda la gama de pH que es tı́pica de los polı́meros orgánicos no es un lecho de material de resina de alta capacidad de intercambio,
necesaria, ya que los ácidos diluidos sirven como fases móviles. En relleno, y la regeneración se obtiene mediante un producto quı́mico o
consecuencia, para la separación de cationes suelen utilizarse por la electrólisis del agua. En el tercer tipo, si bien no son muy
intercambiadores de cationes a base de sı́lice que presentan una utilizados, las reacciones de supresión tienen lugar cuando el flujo de
eficiencia cromatográfica considerablemente superior. eluyente se mezcla con el flujo de material de resina de alta
Según la técnica de separación empleada (intercambio iónico, capacidad.
exclusión iónica o pares iónicos), se utilizan diferentes tipos de fases En el caso de análisis farmacéuticos, la detección conductométrica
estacionarias. En el caso del intercambio iónico, se utiliza como fase suprimida puede utilizarse para detectar trazas de iones en aguas de
estacionaria un intercambiador de aniones o de cationes. Por lo alta pureza. Las fases móviles más utilizadas para la separación de
general, se utiliza un intercambiador de cationes fuerte para la aniones mediante CI suprimida incluyen iones de hidróxido o una
separación de ácidos orgánicos mediante exclusión iónica y una fase mezcla de iones de bicarbonato y carbonato. Las fases móviles
estacionaria en reversa cuando se utiliza la técnica de separación por normalmente utilizadas para la separación de cationes constan, por lo
pares iónicos. La capacidad de intercambio iónico de una resina se general, de ácidos minerales o de ácido metanosulfónico.
define como el número de sitios de intercambio iónico por peso Los análisis por cromatografı́a iónica también pueden realizarse
equivalente al relleno de la columna y suele expresarse en mEq por g sin supresión quı́mica, en cuyo caso el efluente de la columna
de resina. En el caso del intercambio iónico, los tiempos de retención analı́tica fluye directamente a un detector de conductividad. Los
de los iones de analito aumentan cuando aumenta la capacidad de eluyentes normalmente utilizados en CI no suprimida son ácido
intercambio iónico de la resina. Este efecto puede compensarse en ftálico y ácido p-hidroxibenzoico para la determinación de aniones y
parte utilizando fases móviles de mayor concentración iónica. En el ácido metanosulfónico para la determinación de cationes. Los
proceso de fabricación de los intercambiadores iónicos a base de valores de conductancia equivalentes del cloruro, del sulfato y de
polı́meros se utilizan copolı́meros de estireno/divinilbenceno, otros aniones comunes son considerablemente mayores que los del
polimetacrilato y resinas polivinı́licas como materiales de sustrato. anión del eluyente y, en consecuencia, se detecta un pico positivo
Los polı́meros orgánicos actúan directamente en su superficie, a cuando los aniones pasan por el detector. Los valores de
excepción de los intercambiadores iónicos a base de látex, en los que conductancia equivalentes del sodio, del potasio, del calcio, del
la partı́cula de látex totalmente porosa actúa como material de magnesio y de otros cationes comunes son considerablemente
intercambio iónico. Los sustratos ‘‘peliculares’’ que actúan en la menores que los del catión (H+) del eluyente. En este caso, se detecta
superficie presentan una eficiencia cromatográfica mucho mayor en un pico negativo cuando los cationes pasan por el detector.
comparación con las resinas de actuación integral. La CI no suprimida es más fácil de realizar y es una técnica útil
En el intercambio iónico, para lograr la separación se utiliza una para determinar los iones de ácidos débiles como cianuro y sulfuro,
fase móvil compuesta por especies iónicas monovalentes o que son no conductores después de la supresión quı́mica pero
divalentes, solas o mezcladas en una proporción óptima. En los presentan un ruido inicial más elevado. Los análisis farmacéuticos
métodos de exclusión iónica, particularmente para los ácidos pueden realizarse en el modo no suprimido debido a que los lı́mites
orgánicos, la fase móvil consta de ácidos minerales para mantener de cuantificación en mg por L suelen encontrarse en los niveles
los ácidos orgánicos en sus formas no disociadas. Con frecuencia, la porcentuales superiores a bajos. Si bien por lo general deben
naturaleza del analito determina la fase móvil y el método de implementarse metodologı́as con supresión quı́mica en los sistemas
detección utilizados. A continuación, en la sección sobre detectores, de instrumentos diseñados especı́ficamente para este propósito, la CI
se describen las fases móviles tı́picamente utilizadas en la CI. puede realizarse sin el supresor en una HPLC ya existente. Esto es
posible debido a que los eluyentes normalmente utilizados en la CI
incluyen bases diluidas o ácidos compatibles con los instrumentos de
Detectores HPLC ya existentes. Al considerar este método, se recomienda a los
analistas que consulten al fabricante del instrumento para verificar su
La detección por conductividad es, sin duda, el método de aplicabilidad para el análisis por CI.
detección más utilizado en CI. A pesar de que las tareas de desarrollo
original de la CI incluı́an el uso de resinas de intercambio iónico de
baja capacidad con el fin de lograr una separación cromatográfica y OTROS DETECTORES
una detección conductométrica de iones que fueran eficientes, en una
fase móvil quı́micamente suprimida, los avances en tecnologı́as de Otras técnicas de detección comúnmente utilizadas en CI
columna y el desarrollo del instrumental permiten en la actualidad el incluyen amperometrı́a por pulsos, detección UV directa o
uso de intercambio iónico de alta capacidad. derivación posterior al paso por columna seguida por detección
En la CI suprimida, la conductancia de fondo de la fase móvil UV/VIS.
iónica se reduce considerablemente a medida que fluye a través del Técnica de Detección Amperométrica Por Pulsos (DAP)—Esta
dispositivo de supresión. Por ejemplo, el NaOH diluido, aproxima- técnica es una variante especializada de la técnica amperométrica
damente 10 a 50 mM, usado como fase móvil en CI de aniones se convencional. Este tipo de detector suele utilizarse para la detección
convierte a H2O (escasa conductividad) cuando el efluente de la de especies electroactivas, por ejemplo, compuestos orgánicos como
columna que contiene NaOH fluye a través de un dispositivo por ejemplo carbohidratos, alcoholes de azúcar, aminoácidos y
supresor presente en forma ácida. Las especies iónicas del analito en especies de azufre orgánico. En esta técnica, los analitos se detectan
el efluente de la columna se convierten de su forma salina a base de mediante un proceso de desorción oxidativa en la superficie de un
554 h1072i Desinfectantes y Antisépticos / Información General USP 30
Agente Esporicida—Agente que destruye esporas fúngicas y Tabla 2. Clasificación General de Antisépticos, Desinfectantes y
bacterianas cuando se usa en una concentración suficiente durante un Agentes Esporicidas
tiempo de contacto especı́fico. Se espera que mate todo micro-
organismo vegetativo. Entidad Quı́mica Clasificación Ejemplo
Agente de Limpieza—Agente que elimina de la superficie de las
instalaciones y equipos residuos de productos que pueden inactivar Aldehı́dos Agente esporicida Glutaraldehı́do al 2%
a los agentes sanitizantes o albergar microorganismos. Alcoholes Desinfectante Alcohol
Descontaminación—Eliminación de microorganismos mediante de uso general, isopropı́lico al 70%,
desinfección o esterilización. antiséptico y alcohol al 70%
Desinfectante Quı́mico—Agente quı́mico que se emplea en agente antiviral
superficies y objetos inanimados para destruir virus, bacterias y Cloro e Agente esporicida Hipoclorito de
hongos infecciosos, aunque no necesariamente sus esporas. Los hipoclorito sodio al 0,5%
agentes antivirales y esporicidas pueden considerarse como una clase de sodio
especial de desinfectantes. Grupos relacionados con la medicina con Fenólicos Desinfectante 500 mg por g
frecuencia caracterizan a los desinfectantes de alto, mediano o bajo de uso general Clorocresol,
nivel según su eficacia frente a varios microorganismos. 500 mg por g
Desinfectante—Agente fı́sico o quı́mico que al aplicarse sobre cloroxilenol
una superficie destruye o elimina formas vegetativas de micro- Ozono Agente esporicida 8% de Gas en peso
organismos nocivos. Peróxido de Esterilizante de 4 mg por g de H2O2
Esterilizante—Agente que destruye toda forma de vida micro- hidrógeno fase vapor, vapor, solución del
biana, incluyendo hongos, virus y todas las formas de bacterias y sus agente 10% al 25%, solución
esporas. Los esterilizantes son agentes lı́quidos o de fase vapor. esporicida al 3%
Los microorganismos difieren mucho en su resistencia a los lı́quido, antisép-
agentes desinfectantes. En orden descendiente de resistencia a los tico
desinfectantes quı́micos se listan en la Tabla 1 los microorganismos Diguanidas Agente antiséptico Gluconato de clorhexi-
clı́nicamente importantes. sustituidas dina al 0,5%
Ácido peracético Esterilizante lı́quido, Ácido peracético
esterilizante de al 0,2%, 1 mg por g
Tabla 1. Resistencia de Algunos Microorganismos Clı́nicamente fase vapor ácido peracético
Importantes a los Desinfectantes Quı́micos (Se Listan en Orden Óxido de etileno Esterilizante de 600 mg por g
Descendiente de Resistencia) fase vapor Óxido de etileno
Compuestos Desinfectante 200 mg por g
Tipo de de amonio de uso general Cloruro de
Microorganismos Ejemplos cuaternario y antiséptico benzalconio
Esporas bacterianas Bacillus subtilis y Clostridium b-Propiolactona Agente esporicida 100 mg por g
sporogenes b-Propiolactona
Micobacterias Mycobacterium
tuberculosis
Virus con envoltura Poliovirus y rinovirus La eficacia de un desinfectante depende de su actividad biocida
no lipı́dica intrı́nseca, la concentración del desinfectante, el tiempo de contacto,
Esporas fúngicas Trichophyton, Cryptococcus y la naturaleza de la superficie desinfectada, la dureza del agua usada
y hongos filamento- Candida spp. para diluir el desinfectante, la cantidad de material orgánico presente
sos y levaduras en la superficie, y el tipo y la cantidad de microorganismos
vegetativas presentes. Conforme a la Ley Federal de Insecticidas, Fungicidas y
Bacterias vegetativas Pseudomonas aeruginosa, Rodenticidas (Federal Insecticide, Fungicide, and Rodenticide Act
Staphylococcus aureus y o FIFRA, por sus siglas en inglés), la Dirección de Protección
Salmonella spp. Ambiental de los EE.UU. (EPA) registra los desinfectantes quı́micos
Virus con envoltura Virus herpes simple, virus de hepa- que se comercializan en los Estados Unidos y exige que los
lipı́dica titis B y virus de inmuno- fabricantes suministren información del producto en cuanto a la
deficiencia humana dilución de uso, el tipo de microorganismos que eliminan y el tiempo
de contacto necesario. Ciertos esterilizantes quı́micos lı́quidos que se
destinan al uso en dispositivos médicos crı́ticos o semicrı́ticos se
encuentran definidos y regulados por la Administración de
Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA).
CLASIFICACIÓN DE DESINFECTANTES
Los desinfectantes quı́micos se clasifican según su composición SELECCIÓN DE UN ANTISÉPTICO PARA
quı́mica. Esto incluye aldehı́dos, alcoholes, halógenos, peróxidos, DESINFECCIÓN DE MANOS Y SITIOS DE
compuestos de amonio cuaternario y compuestos fenólicos (ver
Tabla 2). INTERVENCIÓN QUIRÚRGICA
En el ámbito de los hospitales se desinfectan las manos y los sitios
de intervención quirúrgica para reducir la flora residente y eliminar la
flora transitoria (por ejemplo, Streptococcus pyogenes) y los S.
aureus y P. aeruginosa resistentes a la meticilina, que se han visto
implicados en infecciones hospitalarias. Se ha demostrado que el uso
de antisépticos para la desinfección de manos es más efectivo que el
uso de agua y jabón para la reducción del recuento de bacterias en la
piel; el uso repetido de antisépticos reduce aún más el recuento. En la
industria farmacéutica, estos principios pueden aplicarse a los
operadores de cuartos limpios.
Los antisépticos comunes incluyen clorhexidina al 4%, povidona
yodada al 10%, hexaclorofeno al 3%, alcohol isopropı́lico al 70% y
clorhexidina al 0,5% en alcohol al 95%.
556 h1072i Desinfectantes y Antisépticos / Información General USP 30
Tabla 6. Organismos de Desafı́o Tı́picos desinfectante con Agua Purificada y luego esterilizar por filtración
para eliminar microorganismos que probablemente puedan persistir
Organismos de Desafı́o Aislamientos Ambientales en el desinfectante. Los desinfectantes diluidos deben tener una
AOAC Tı́picos fecha de expiración asignada basada en estudios de efectividad.
Bactericida: Escherichia coli, Bactericida: Micrococcus Dado que es teóricamente posible que la presión selectiva del uso
ATCC 11229; luteus, S. epidermidis, continuo de un único desinfectante pueda resultar en la presencia de
S. aureus, ATCC 6538; Coynebacterium microorganismos resistentes al desinfectante en el área de fabrica-
P. aeruginosa, ATCC jeikeium, P. vesiclaris ción, se recomienda la rotación de desinfectantes en algunos cuartos.
15442 Sin embargo, la literatura respalda la creencia de que la exposición
Fungicida: C. albicans, Fungicida: P. chrysoge- de un pequeño número de microorganismos en la superficie de los
ATCC 10231 ó 2091; num, A. niger equipos y las instalaciones dentro de un cuarto limpio en el que estos
Penicillium chrysogenum, microorganismos no han proliferado activamente no resultará en una
ATCC 11709; Aspergillus presión selectiva, que sı́ puede producirse con antibióticos. Es
niger, ATCC 16404 prudente reforzar el empleo diario de desinfectantes bactericidas con
Esporicida: B. subtilis, Esporicida: B. sphaericus, el uso semanal (o mensual) de un agente esporicida. La aplicación
ATCC 19659 B. thuringiensis diaria de agentes esporicidas no es generalmente recomendada dada
su tendencia a corroer equipos y debido a potenciales problemas de
seguridad ante la exposición crónica del operador. Otros esquemas
Dada la variedad de materiales usados en la construcción de de rotación del desinfectante pueden justificarse en la revisión de los
cuartos limpios y otras áreas controladas, se debe analizar cada datos históricos de control ambiental. Los desinfectantes que se
material por separado para validar la eficacia de un desinfectante aplican sobre superficies de contacto potencial con productos
determinado. La Tabla 7 contiene un listado de materiales generalmente se remueven con paños empapados con alcohol al
comúnmente usados en la construcción de cuartos limpios. 70%. Se deberı́a controlar la efectividad de la eliminación de
desinfectantes residuales como precaución contra la posibilidad de
contaminación del producto.
Tabla 7. Superficies Tı́picas a Descontaminar con Desinfectantes Los mayores problemas de seguridad se encuentran en el manejo
en el Área de Fabricación de Productos Farmacéuticos de desinfectantes concentrados y en la mezcla de desinfectantes no
compatibles. Por ejemplo, las soluciones concentradas de hipoclorito
Material Aplicación de sodio (a una concentración de más de 5%) son oxidantes fuertes
Acero inoxidable de Superficies de trabajo, equipo que se descomponen al calentarlas, al entrar en contacto con ácidos y
grados 304L y 316L de llenado y tanques bajo la influencia de la luz, despidiendo gases tóxicos y corrosivos,
Vidrio Ventanas y recipientes incluyendo cloro. Por lo contrario, las soluciones diluidas (a una
Plástico, vinilo Cortinas concentración de menos de 0,5%) no se consideran peligrosas. No se
Plástico, policarbonato Revestimiento aislante deben mezclar, bajo ninguna circunstancia, desinfectantes con
Lexan1 (plexiglás) Pantallas protectoras concentraciones diferentes. Las Hojas de Datos de Seguridad del
Yeso recubierto con epoxilo Paredes y techos Material de todo desinfectante usado en el área de fabricación
Plástico reforzado con Paneles de las paredes deberı́an estar a disposición del personal que maneja estos agentes.
fibra de vidrio Se deben suministrar equipos de seguridad adecuados tales como
Tyvek1 Envoltorio de equipos máscaras, lentes de seguridad, guantes y uniformes al personal que
Baldosas de terrazo Pisos prepara los desinfectantes, el cual también debe entrenarse en el uso
adecuado de dichos equipos. Las duchas de seguridad y las
estaciones para el lavado de ojos deben ubicarse en el área de
trabajo donde se preparan las soluciones desinfectantes.
DESINFECTANTES DE UN PROGRAMA DE
LIMPIEZA Y SANITIZACIÓN
La selección de desinfectantes adecuados y la verificación de su
eficacia en pruebas de desafı́o de superficie son cruciales en el h1074i GUÍAS PARA LA
desarrollo de un programa de limpieza y sanitización.
Aspectos relacionados con la implementación satisfactoria de
EVALUACIÓN DE LA
dichos programas se refieren a lo siguiente: desarrollo de SEGURIDAD BIOLÓGICA DE LOS
procedimientos escritos, capacitación del personal, decisiones
acerca de la rotación de los desinfectantes, establecimiento de los EXCIPIENTES
métodos de aplicación y tiempos de contacto, control ambiental para
demostrar la eficiencia, y seguridad del personal.
La sección 21 CFR 211.67 de las Buenas Prácticas de Fabricación
vigentes (cGMP, por sus siglas en inglés), Limpieza y Mantenimiento
de Equipos, especifica los requisitos de los procedimientos escritos
en cuanto a la limpieza, mantenimiento y sanitización de los equipos INTRODUCCIÓN
de fabricación de productos farmacéuticos. Estos procedimientos
deben especificar la asignación de responsabilidades, estableci- Este capı́tulo es de carácter informativo y presenta un enfoque
miento de horarios, detalles de las operaciones de limpieza, cientı́fico para la evaluación de la seguridad de nuevos excipientes
protección de equipos limpios antes de usar, inspección de limpieza farmacéuticos (es decir, los excipientes que no han sido previamente
inmediatamente antes del uso y mantenimiento de registros de utilizados o autorizados para su uso en una preparación farmacéu-
limpieza y sanitización. tica). Las guı́as aquı́ presentadas suministran un protocolo para el
El personal involucrado en la desinfección requiere capacitación desarrollo de una base de datos adecuada que permita establecer las
en microbiologı́a, prácticas industriales de limpieza y sanitización, condiciones para el uso seguro de un nuevo excipiente en productos
manejo seguro de desinfectantes concentrados, preparación y administrados por diferentes vı́as. [NOTA—La última sección de este
eliminación de desinfectantes, y métodos de aplicación adecuados. capı́tulo, Definición de Términos, contiene algunos de los términos a
Se deberı́a recalcar que la preparación de diluciones correctas es un los que aquı́ se hace referencia.]
punto crı́tico ya que las fallas de muchos desinfectantes pueden Un excipiente puede cumplir diferentes funciones en un producto
atribuirses al empleo de soluciones desinfectantes muy diluidas. Los farmacéutico pero, a diferencia de las sustancias farmacológicamente
desinfectantes que por lo general se usan en áreas de procesamiento activas, el excipiente no muestra ninguna actividad farmacológica o
y llenado asépticos se diluyen con Agua Purificada Estéril y se posee una actividad muy limitada y especı́fica. Debido a estas
preparan asépticamente. Como alternativa, se puede diluir el diferencias entre excipientes y fármacos activos en términos de
USP 30 Información General / h1074i Seguridad Biológica de Excipientes 559
relación riesgo-beneficio y actividades biológicas esperadas, los un producto farmacéutico que se administre durante menos de 10
procedimientos para la evaluación de seguridad de los excipientes y dı́as o de 30 a 90 dı́as consecutivos, respectivamente. En el caso de
de los fármacos activos varı́an. Por lo tanto, es importante tener en un excipiente propuesto que ha de utilizarse en un producto
cuenta que las guı́as presentadas en este capı́tulo informativo sólo farmacéutico de administración intermitente o crónica durante un
son válidas para la evaluación de la seguridad de los excipientes, y perı́odo prolongado, como por ejemplo para el tratamiento de la
no para la evaluación de la seguridad de los fármacos activos. psoriasis o una preparación de insulina, se requieren pruebas
Estas guı́as de evaluación son de carácter informativo y deben ser adicionales. Estas pruebas se enumeran en el Paso 7 de las guı́as y en
utilizadas por profesionales con conocimientos de toxicologı́a y otras la sección correspondiente en Requisitos Adicionales para Vı́as de
ciencias afines. En la propuesta para la comercialización de un Exposición Especı́ficas. Si bien las pruebas requeridas ofrecen
producto, también deberán cumplirse los requisitos pertinentes del orientación sobre la seguridad del producto para el consumidor,
método de prueba de seguridad establecidos por la autoridad algunas de ellas están diseñadas para proporcionar información que
reglamentadora receptora. Por ejemplo, si se presenta una propuesta permita evaluar su seguridad en el ámbito laboral (por ejemplo,
a la Administración de Alimentos y Fármacos (Food and Drug irritación de la piel y de los ojos).
Administration) de los EE.UU., deberán cumplirse con los requisitos Las guı́as se resumen en la Tabla 1. Las pruebas requeridas (R) en
de las pruebas de seguridad establecidos por dicho organismo. Estas las guı́as difieren de las pruebas que se recomiendan en forma
guı́as no proporcionan detalles especı́ficos relativos a la metodologı́a condicional (C). La realización de pruebas condicionales depende de
de prueba e interpretación de datos. Se deberán utilizar los las condiciones de uso y de los datos biológicos disponibles.
procedimientos de prueba reconocidos de manera general por También deben tenerse en cuenta los requisitos de las autoridades
expertos y organismos reglamentadores. Se alienta el uso de reglamentadoras al tomar la decisión de realizar una prueba.
métodos que no utilicen animales vivos siempre y cuando estos
procedimientos hayan sido validados para el propósito en cuestión y
pueda confirmarse que dichos procedimientos alternativos propor- GUÍAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA
cionarán suficientes datos para fundamentar un juicio sobre la SEGURIDAD
seguridad de un producto. En la realización de todos los
procedimientos de prueba, se recomienda ajustarse a los Principios
Orientativos sobre el Uso de Animales en Toxicologı́a de la Sociedad Información de Referencia
de Toxicologı́a (1996) y, en otros paı́ses, respetar los códigos legales Antes de proseguir con los pasos de la sección Requisitos y Puntos
y profesionales correspondientes. Todos los estudios deben cumplir de Control de Datos, deben analizarse y definirse los siguientes
los requisitos de las guı́as sobre buenas prácticas de laboratorio puntos:
nacionales, vigentes en el paı́s en que se realizan los estudios. Consultar la literatura pertinente utilizando las bases de datos
En los casos en que se cuente con una amplia experiencia en adecuadas
humanos basada en el consumo de alimentos, podrı́a existir Definir las propiedades quı́micas y fı́sicas
suficiente información para cumplir con los requisitos de las guı́as Definir el proceso de fabricación
para excipientes de administración oral únicamente. Asimismo, Definir las especificaciones del producto, incluyendo impurezas
podrı́an utilizarse datos basados en estudios con animales, y disolventes residuales (ver guı́as ICH aplicables)
originalmente desarrollados con otros propósitos, para cumplir con Estimar las condiciones de exposición (dosis, duración,
los requisitos de las guı́as de evaluación. Si se han cumplido con los frecuencia, vı́a)
requisitos de datos a través de la experiencia previa de uso por Definir la población de usuarios
humanos y se han recopilado datos pertinentes en humanos con un Evaluar el potencial de actividad farmacológica.
criterio cientı́fico, no es necesario proporcionar datos de animales En este punto, evaluar lo que se conoce y desarrollar el método
para aquellos resultados evaluados según experiencia clı́nica previa. inicial de prueba.
Algunas vı́as de administración presentan desafı́os toxicológicos
únicos y las guı́as incluyen disposiciones relativas a dichas vı́as de
administración (por ejemplo, inhalación). Además, se proporciona
una explicación detallada sobre la cantidad de especies y otra Requisitos y Puntos de Control de Datos
información básica (por ejemplo, dos especies, una roedora y una no
roedora).
La cantidad de información requerida para definir un grupo de PASO 1: Datos de Toxicidad (ver Datos de Toxicidad Iniciales)
datos de referencia iniciales, que conformen una base de datos Los datos de toxicidad deben tener en cuenta la siguiente
toxicológica y quı́mica, depende del uso previsto, de la duración y información:
dosificación del material de excipiente propuesto. Es fundamental Efectos de la exposición aguda por vı́a oral y las vı́as previstas
realizar un análisis profundo de la información de referencia antes de Efectos de exposiciones repetidas por las vı́as previstas
iniciar un régimen de pruebas. Además de consultar las bases de Efectos de los ensayos de genotoxicidad in vitro
datos de literatura relacionada, debe obtenerse información sobre las ADME/PK por vı́a oral o por las vı́as adecuadas; dosis únicas o
propiedades fı́sicas y quı́micas del compuesto, su proceso (o múltiples.
procesos) de fabricación y las especificaciones del producto, PASO 2: Según los resultados anteriores, evaluar los efectos de una
incluyendo lı́mites de impurezas, potencial de actividad farmaco- dosis única en humanos.
lógica, condiciones de exposición (es decir, dosis, duración, PASO 3: Punto de control: Evaluar los resultados de las condiciones
frecuencia de uso, formulación y vı́a de administración) y población de exposición anteriores y las condiciones propuestas y la población
potencial de usuarios. Además, es fundamental contar con informa- expuesta. Los datos anteriores podrı́an permitir el uso en un producto
ción sobre la toxicidad básica de los productos. Deberı́a prestarse único con una vida media corta (por ejemplo, un agente diagnóstico).
especial atención a los estudios de absorción/distribución/metabo- PASO 4: Reunir los siguientes datos adicionales:
lismo/excreción/farmacocinética (ADME/PK, por sus siglas en Efectos de exposición subcrónica en especies y vı́as adecuadas
inglés) ya que gran parte del proceso de decisión posterior dependera Estudios de desarrollo embrio-fetal a través de la vı́a de
de dichos datos. exposición adecuada
Estas guı́as proporcionan un mecanismo para obtener conjuntos de Pruebas de genotoxicidad in vitro e in vivo adicionales.
datos iniciales para todos los materiales propuestos como exci-
pientes. La información de referencia y de toxicidad inicial por PASO 5: Según los resultados anteriores, deberı́an considerarse las
sı́ mismas pueden avalar el uso del excipiente propuesto, ya sea en pruebas en humanos como parte de los ensayos clı́nicos de un
un producto de vida media corta que no se administre con una ingrediente activo o como un procedimiento independiente.
frecuencia tal que produzca una acumulación residual del excipiente PASO 6: Punto de control: Evaluar toda la información anterior. Los
en tejido corporal o en un producto utilizado solo una vez o dos en la datos podrı́an permitir el uso en diferentes productos destinados a
vida, como ser, un agente de diagnóstico. Se necesitan pruebas una ingesta repetida a corto plazo (por ejemplo, antibióticos). Si los
adicionales, enumeradas en el Paso 4 de las Guı́as de Evaluación de estudios ADME/PK para un excipiente no inyectable no muestran
Seguridad, para el excipiente propuesto cuyo uso resulte en una absorción, los datos pueden permitir el uso de un producto por 30 a
exposición repetida a corto o mediano plazo en humanos —es decir, 90 dı́as consecutivos.
560 h1074i Seguridad Biológica de Excipientes / Información General USP 30
R = Requerida
C = Condicional
*
Intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, etc.
PASO 7: Deben obtenerse datos adicionales para productos que se Genotoxicidad: por ejemplo, la Prueba Ames, prueba de
toman en forma crónica, ya sea a diario o intermitentemente, durante aberración cromosómica in vitro, ensayo de mutación celular en
un perı́odo prolongado, teniendo en cuenta lo siguiente: mamı́feros.
Resultados de estudios subcrónicos y toxicidad a largo plazo en Estudios de 28 Dı́as de Dosificación Repetida en Dos Especies
mamı́feros no roedores adecuados por las Vı́as Adecuadas (Un Roedor, Un Mamı́fero No Roedor):
Estudios de toxicidad reproductiva podrı́an requerirse una evaluación del sitio de la inyección o
Resultados de otras pruebas y datos de exposición humana y consideraciones similares según la vı́a de administración.
toxicidad a largo plazo o carcinogenicidad en roedores. NOTAS—1. En aquellos casos en que las restricciones de la vı́a
prevista (por ejemplo, volumen, concentración) impiden una
evaluación adecuada de la toxicidad del excipiente, podrı́a
Datos de Toxicidad Iniciales requerirse el desarrollo de un perfil de toxicidad mediante otras
vı́as pertinentes. 2. La comparación de los datos de toxicidad y
Deberı́an tenerse en cuenta los siguientes datos: ADME/PK entre las vı́as oral y la prevista es fundamental en este
Toxicidad Aguda Adecuada por las Vı́as de Administración punto ya que podrı́a indicar hacia dónde deberı́an apuntar las pruebas
Previstas: sensibilización cutánea, método de dosis letal aproxi- de toxicidad futuras (por ejemplo, pruebas de toxicidad reproductiva
mada, prueba de lı́mite, etc. realizadas por vı́a oral en lugar de la vı́a prevista). Asimismo, la
Otros Estudios de Toxicidad Aguda Adecuados: toxicidad realización de estudios pertinentes utilizando la vı́a prevista y la
oral por prueba de lı́mite o método de dosis letal aproximada, duración de exposición anticipada podrı́an hacer innecesaria la
irritación cutánea, etc. realización de estudios adicionales.
ADME/PK: dosis únicas o múltiples.
USP 30 Información General / h1075i Buenas Prácticas de Preparación Magistral 561
PARA EXPOSICIÓN ORAL: No hay requisitos adicionales aparte de Toxicidad por Inhalación Aguda—Una prueba de lı́mite que,
los presentados para los Datos de Toxicidad Iniciales. por ejemplo, utilice la concentración más alta obtenible en una
exposición de 4 horas a vapor, aerosol o partı́culas sólidas. La
PARA EXPOSICIÓN A TRAVÉS DE LAS MUCOSAS: No hay requisitos sensibilización pulmonar puede realizarse junto con otros
adicionales aparte de los presentados para los Datos de Toxicidad estudios adecuados. Si la exposición será a un aerosol o
Iniciales. partı́cula sólida, deben generarse partı́culas de un diámetro
PARA EXPOSICIÓN DÉRMICA, TÓPICA O TRANSDÉRMICA: medio en masa adecuado.
Datos de Toxicidad Iniciales— ADME/PK de Dosis Única y Repetidas por Inhalación o Vı́as
Intranasal y Oral
Efectos de Exposición Aguda por Vı́a de Administración Estudio de 28 Dı́as de Inhalación por Dosis Repetidas en Dos
Transdérmica: estudio de sensibilización dérmica para aplica- Especies de Mamı́feros Utilizando Vapor o Partı́culas de un
ciones repetidas Diámetro Medio de Masa Adecuado: comparar con datos de
Efectos de Exposiciones Repetidas por Vı́a Transdérmica toxicidad oral similar.
1. Estudio de fotoalergia/fototoxicidad PARA EXPOSICIÓN OFTÁLMICA:
2. Estudios en dos especies (un roedor, un mamı́fero no Información de Referencia: definir pH y osmolaridad de la
roedor) por vı́a transdérmica. forma farmacéutica ocular tópica.
Efectos de Exposición Subcrónica, Efectos de Toxicidad
Reproductiva—Los estudios de toxicidad iniciales pueden Datos de Toxicidad Iniciales—
realizarse por vı́a intravenosa para determinar en forma
adecuada el perfil de toxicidad del excipiente. De esta Efectos de Exposición Aguda por Vı́as Oftálmicas: pruebas de
manera, si no se puede suministrar una cantidad adecuada del citotoxicidad (p. ej. recubrimiento con agar)
compuesto a través de una forma farmacéutica transdermal, se Efectos de Exposiciones Repetidas por Vı́as Oftálmicas
puede evaluar qué órganos resultarán afectados. Esto depende 1. Estudios en dos especies (un roedor, un mamı́fero no
de los resultados de los estudios ADME/PK. roedor)
2. Examen de segmentos anterior y posterior del ojo
Los estudios reproductivos también pueden realizarse por vı́a 3. Estudios sobre potencial de alergenicidad.
oral o vı́a intravenosa con demostración de absorción (oral) y
comparaciones farmacocinéticas de la vı́a elegida en función de Otros datos—La comparación de los parámetros farmacocinéti-
la transdérmica. cos de la vı́a elegida para estudios reproductivos y la exposición
oftálmica son esenciales para la extrapolación de la toxicidad
Pueden requerirse estudios de fotocarcinogenicidad, y deben potencial a través de la vı́a oftálmica.
tenerse en cuenta, si los datos y el uso propuesto indican que los
materiales se han de colocar en la piel durante perı́odos
prolongados y que la exposición a la luz UV es un factor
importante (por ejemplo, protector solar). Esto también es DEFINICIÓN DE TÉRMINOS
válido para productos orales, parenterales y de inhalación en los
casos en que las concentraciones del fármaco en la piel superan Aguda: exposición a un agente de prueba dentro de un perı́odo
las concentraciones plasmáticas del fármaco durante un perı́odo único de 24 horas. Las dosis pueden ser únicas, múltiples o
considerable o en los casos en que el material propuesto continuas durante un perı́odo de 24 horas.
parecerı́a tener potencial de fotoactividad o ha demostrado Subaguda: administración repetida de un agente de prueba hasta
tenerlo. 29 dı́as. Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o continuas
PARA FORMAS FARMACÉUTICAS INYECTABLES: durante un perı́odo de 24 horas.
Información de Referencia— Subcrónica: administración repetida de un agente de prueba por
30 dı́as y hasta el 10% de la expectativa de vida de la especie de
1. Definir la compatibilidad de la forma farmacéutica con la prueba (90 dı́as en roedores). Las dosis diarias pueden ser únicas,
sangre, si corresponde, según la vı́a de exposición. múltiples o continuas durante un perı́odo de 24 horas.
2. Definir el pH y la tonicidad de la forma farmacéutica Crónica: dosis repetidas de un agente de prueba durante más del
inyectable, si corresponde, según la vı́a de exposición. 10% de la expectativa de vida de la especie de prueba (más de 90
Datos de Toxicidad Iniciales— dı́as en roedores). Las dosis diarias pueden ser únicas, múltiples o
continuas durante un perı́odo de 24 horas.
Efectos de la Exposición Aguda por las Vı́as de Administración
Inyectables Previstas
1. Incluir la evaluación de irritación en el lugar de inyección
en conejos o perros
2. Incluir una evaluación de la velocidad de administración. h1075i BUENAS PRÁCTICAS DE
PREPARACIÓN MAGISTRAL
todas las farmacias. Se espera que los farmacéuticos o preparadores Componente—Un componente es cualquier ingrediente utilizado
dedicados a la preparación magistral de medicamentos realicen su en la formulación de un producto farmacéutico, incluyendo
tarea de acuerdo con las leyes, reglamentos o guı́as estatales y cualquiera utilizado en su preparación, pero que puede no aparecer
federales vigentes para tales preparaciones. en el etiquetado de dicho producto. (Ver Preparación Magistral—
Preparaciones No Estériles h795i para obtener definiciones
adicionales.)
DEFINICIONES APLICABLES
Preparador—Un preparador es un profesional autorizado por el
Preparaciones magistrales (ver Preparación Magistral—Prepa- estado para realizar preparaciones magistrales de acuerdo con una
raciones No Estériles h795i)—Las preparaciones magistrales receta de un prescriptor matriculado.
involucran la preparación, mezclado, ensamblaje, envasado y
etiquetado de un fármaco o dispositivo de acuerdo con la
prescripción de una orden médica por parte de un profesional RESPONSABILIDADES DEL PREPARADOR
matriculado basado en la relación que existe entre el profesional que
solicita la receta, el paciente, el farmacéutico y el preparador en el
curso de una práctica profesional. La preparación magistral incluye a. Los preparadores que participan en la preparación de fármacos
lo siguiente: o de productos nutricionales-farmacéuticos deben ser compe-
tentes y deben incrementar continuamente sus conocimientos
a. La preparación de fármacos o dispositivos anticipando recetas acerca de la preparación mediante su participación en
de fármacos basadas en patrones rutinarios de prescripción seminarios o estudio de la literatura apropiada.
observados con regularidad. b. Un preparador debe estar familiarizado con todos los detalles de
b. La reconstitución o manipulación de productos comerciales que Preparación Magistral—Preparaciones No Estériles h795i,
puedan requerir el agregado de uno o más ingredientes como Preparación Magistral—Preparaciones Estériles h797i, Cálcu-
resultado de una prescripción de fármacos de un profesional los Farmacéuticos en la Preparación Magistral de Pre-
matriculado. scripcionesh1160i, y demás guı́as o leyes estatales o federales
c. La preparación de fármacos o dispositivos con el propósito de sobre las preparaciones magistrales. Además, el preparador
investigación, enseñanza o análisis quı́mico, o como resultado debe ser responsable de lo siguiente:
incidental de éstos. certificar todas las recetas médicas;
Categorı́as de una Preparación Magistral—Las categorı́as de aprobar o rechazar todos los componentes, envases de
preparaciones magistrales están diseñadas para que los preparadores productos farmacéuticos, cierres, materiales en proceso y
comprendan cuando se refieren a distintas formas de preparación. Se etiquetado;
debe entender que existen niveles de capacitación asociados a cada preparar y revisar todos los registros de preparación para
categorı́a. En las categorı́as de preparaciones magistrales descritas a asegurarse de que no hayan ocurrido errores en el proceso
continuación, se han usado ciertos criterios para determinar la de preparación;
clasificación general. asegurar el mantenimiento apropiado, la higiene y el uso
de todos los equipos utilizados en la práctica de
Categorı́a 1 No estéril—Simple preparación de recetas magistrales;
Por lo general, la mezcla de dos o más asegurar que sólo el personal autorizado se encuentre en
productos comerciales las inmediaciones de las operaciones de preparación
Categorı́a 2 No estéril—Compleja magistral;
Por lo general, preparaciones con asegurar que los productos farmacéuticos y sus compo-
los fármacos a granel o cuando se nentes no se encuentren en la lista de productos
exigen cálculos. farmacéuticos reconocidos federalmente que han sido
Categorı́a 3 Estéril—Nivel de Riesgo I retirados del mercado por razones de salud pública.
(Ver Nivel de Riesgo Bajo en el capı́tulo c. El preparador debe asegurar que el personal involucrado en la
general h797i de USP) preparación vista ropa limpia y apropiada para el tipo de
Categorı́a 4 Estéril—Nivel de Riesgo II preparación a realizar, por ejemplo, guardapolvos, batas,
(ver Nivel de Riesgo Medio en el capı́tulo general guantes, máscaras, zapatos, delantales u otros artı́culos
h797i de USP) necesarios para proteger al personal de las exposiciones
Categorı́a 5 Estéril—Nivel de Riesgo III quı́micas y para evitar que se contamine el fármaco.
(Ver Nivel de Riesgo Alto en el capı́tulo general d. El preparador debe implementar procedimientos para evitar la
h797i de USP) contaminación cruzada al preparar productos con fármacos (por
Categorı́a 6 Preparaciones radiofarmacéuticas ejemplo, penicilinas) que exigen una precaución especial para
Preparación de preparaciones radiofarmacéuticas evitar dicha contaminación cruzada.
Categorı́a 7 Veterinaria
Preparación de productos farmacéuticos-
veterinarios CAPACITACIÓN
Fabricación—La fabricación involucra la producción, propaga- Todo el personal involucrado en la preparación, evaluación,
ción, conversión o procesamiento de un fármaco o dispositivo, envasado y dispensación de preparaciones magistrales debe estar
directa o indirectamente, mediante extracción del fármaco a partir de adecuadamente capacitado para el tipo de preparación que se lleva a
sustancias de origen natural o por medio de sı́ntesis quı́mica o cabo. Todas las actividades de capacitación estarán contempladas por
biológica. La fabricación también incluye (1) el envasado o los procedimientos operativos estándares (POE) y documentación
reenvasado de las sustancias y el etiquetado o reetiquetado de los apropiados.
envases para la promoción y comercialización de tales fármacos o Todos los preparadores y todo el personal involucrado en la
preparación deben estar bien capacitados y deben participar en
dispositivos; (2) cualquier preparación de un fármaco o dispositivo programas de capacitación pertinentes y actualizados. Es responsa-
que sea entregado o vendido para su reventa en farmacias, por parte bilidad del preparador asegurar que se haya implementado un
de profesionales u otras personas; (3) la distribución de cantidades programa de capacitación y que éste sea constante. Las normas de la
desmesuradas de preparaciones magistrales o la copia de productos práctica exigen que todos los empleados estén adecuadamente
farmacéuticos disponibles comercialmente; y (4) la preparación de capacitados para realizar las funciones de su trabajo y que toda la
cualquier cantidad de un producto farmacéutico sin una relación capacitación esté documentada apropiadamente. Los pasos en el
entre el prescriptor matriculado, el paciente, el farmacéutico y el
preparador. procedimiento de capacitación incluyen:
USP 30 Información General / h1075i Buenas Prácticas de Preparación Magistral 563
a. Todos los empleados involucrados en la preparación magistral f. El área de preparación debe tener iluminación y ventilación
deben leer y familiarizarse con Preparación Magistral— satisfactorias.
Preparaciones No Estériles h795i, Preparación Magistral— g. El área de preparación no debe estar infestada de insectos,
Preparaciones Estériles h797i y Cálculos Farmacéuticos en la roedores u otras alimañas. La basura se debe depositar y
Preparación de Recetas Magistrales h1160i. desechar puntualmente y observando las normas sanitarias
b. Todos los empleados deben leer y familiarizarse con cada uno correspondientes.
de los procedimientos relacionados con la preparación h. Las aguas residuales y otros desechos en el área de preparación
magistral, incluyendo aquellos que incluyen la instalación, el se deben eliminar de forma segura y observando las normas
equipo, el personal, la preparación real, la evaluación, el sanitarias correspondientes.
envasado, el almacenamiento y la dispensación. i. Los fármacos a granel y otras sustancias quı́micas o materiales
c. El preparador debe reunirse con los empleados para revisar su utilizados en la preparación de fármacos se deben almacenar
trabajo y responder a sus preguntas sobre los POE. según las instrucciones del fabricante o de acuerdo con los
d. El preparador debe mostrarle los procedimientos al empleado, requisitos de la monografı́a de USP, en un área limpia y seca
ası́ como observarlo y guiarlo durante todo el proceso de bajo condiciones apropiadas de temperatura (temperatura
capacitación. Luego el empleado repetirá el procedimiento sin ambiente controlada, refrigerador o congelador). Las sustancias
ayuda, pero bajo la supervisión directa del preparador. quı́micas a granel se deben almacenar protegidas contra la
e. Cuando el empleado le haya demostrado al preparador un contaminación. Todos los envases deben estar correctamente
conocimiento verbal y funcional del procedimiento, entonces y etiquetados.
sólo entonces se le permitirá al empleado realizar el j. Si se preparan productos parenterales, el preparador debe
procedimiento sin la supervisión directa. Sin embargo, el remitirse a Preparación Magistral—Preparaciones Estériles
preparador debe estar fı́sicamente presente y debe comprobar la h797i e Inyectables h1i para aplicación de técnicas de
preparación final. preparación.
f. Cuando el preparador se encuentre satisfecho con el conoci-
miento y la competencia del empleado, firmará los registros de
documentación que indican que el empleado está debidamente EQUIPO DE PREPARACIÓN MAGISTRAL DE
capacitado. FÁRMACOS
g. El preparador debe controlar continuamente el trabajo del
empleado y asegurar que los cálculos y el trabajo del empleado (Ver también Preparación Magistral—Preparaciones No Estériles
sean exactos y se realicen adecuadamente. El preparador es h795i).
totalmente responsable de la preparación terminada. El
preparador responderá todas las preguntas que el empleado a. El equipo o los utensilios que se utilizan para la preparación
pueda tener con respecto a los POE. magistral de un fármaco deben tener el diseño y la capacidad
apropiados. El equipo se debe almacenar protegido contra la
contaminación y debe estar ubicado en un lugar que facilite las
PROCEDIMIENTOS Y DOCUMENTACIÓN operaciones para su uso, mantenimiento y limpieza.
b. El equipo debe tener una composición adecuada, de manera
Todos los procedimientos importantes que se realizan en el área de que las superficies que entran en contacto con los componentes
preparación magistral estarán contemplados en los POE y serán no sean reactivas, aditivas ni absorbentes y, por lo tanto, no
documentados. afecten o alteren la pureza de las preparaciones magistrales.
Se deben desarrollar procedimientos para la instalación, los c. Se debe inspeccionar rutinariamente, calibrar cuando sea
equipos, el personal, la preparación, el envasado y el almacena-