Biotecnología

Docentes: Ing. José Reynoso – Ing. Aldana

Chesta

Alumno: Federico Rodríguez

[GIBBERELLA FUJIKUROI –
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO
GIBERÉLICO.]
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA NACIONAL – Facultad Regional Villa María.
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Índice

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 3
GIBBERELLA FUJIKUROI ................................................................................................................. 4
ACIDO GIBERELICO ........................................................................................................................ 4
CRITERIOS DE CULTIVO ................................................................................................................. 5
Cultivo sobre sustrato solido..................................................................................................... 5
Cultivo sumergido ..................................................................................................................... 5
PRODUCCIÓN DE ACIDO GIBERÉLICO............................................................................................ 6
Desarrollo de inóculos............................................................................................................... 6
Requerimientos nutricionales ................................................................................................... 7
CONDICIONES DE FERMENTACIÓN ............................................................................................... 7
pH .............................................................................................................................................. 7
Temperatura ............................................................................................................................. 7
Aireación / Agitación ................................................................................................................. 7
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN ..................................................................................................... 8
ASPECTOS ECONÓMICOS. ............................................................................................................. 8
DISEÑO DE UN BIORREACTOR AIR LIFT PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO. ............. 8
FACTORES DE FORMA Y ASPECTOS IMPORTANTES DE DISEÑO.................................................... 9
ESCALAMIENTO DEL REACTOR A VOLUMEN INDUSTRIAL .......................................................... 10
ESTERILIZACIÓN DEL BIORREACTOR Y DEL MEDIO DE CULTIVO ................................................. 10

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INTRODUCCIÓN
El siguiente informe tiene por objetivo resaltar el interés industrial de la biotecnología
como herramienta fundamental para el desarrollo de la ciencia y la tecnología.

Se estudió la producción del ácido giberélico que es un metabolito secundario que se

encuentra durante la fermentación de Gibberella Fujikuroi. Este producto es de gran
importancia en el campo de la agricultura.

Además de resaltar las características más importantes del microorganismo, se

pretende a través de este trabajo, conocer los parámetros más importantes de la
fermentación como diseño del biorreactor, tipos de cultivo y rendimiento entre otros.

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GIBBERELLA
FUJIKUROI
Gibberella fujikuroi es un hongo patógeno
de plantas descubierto
por Eishii Kurosawa en 1926. Este hongo
causa la enfermedad bakanae en las
plántulas de arroz, que consiste en la sobreproducción de la fitohormona giberelina
dando lugar a un fenotipo en la planta alta y delgada. Es un hongo del género de
Fusarium que presenta colonias inicialmente blancas cubiertas por un micelio aéreo
plumoso bien desarrollado. Al madurar produce un pigmento de delicado color lavanda
o rojo púrpura en la parte superior e inferior del hongo.

Eishii Kurosawa estaba estudiando una enfermedad en los cultivos de arroz, en los
cuales observaba que éstas eran extremadamente altas y delgadas, provocando que
eventualmente se rompiesen. Descubrió que esta enfermedad o fitopatología que
presentaban, estaba causada por un hongo al que se le llamó Gibberella fujikuroi. Este
hongo produce una sustancia que en ese momento se desconocía. Esta sustancia
que Eishii Kurosawa descubrió inducía una elongación extrema en la planta, que más
tarde se conoció como la fitohormona giberelina.

ACIDO GIBERELICO
El acido puro es un sólido cristalino blanco algo soluble en agua y fácilmente soluble
en solventes orgánicos. Su fórmula empírica es C19H22O16.

Alemania, USA, China, Italia y Japón son algunos de los países productores siendo
California, Chile e Israel los puntos que más lo consumen, para ser más precisos,
estos últimos tres consumen el 90% del acido giberélico producido en el mundo. Los
principales usos agrícolas del GA3 incluyen tanto a frutas como hortalizas y cereales
dentro de los cuales se puede destacarse su uso para cerezos y vides. La aplicación
de GA3 a la uva es la única forma de regular el crecimiento de las bayas para obtener
racimos de calidad exportable.

Comercialmente es definido como un bioestimulante que

funciona como regulador de crecimiento de acción hormonal y
actúa sobre la planta produciendo división y elongación celular
en tallos y hojas, retraso de maduración en algunas especies y
aceleración del ciclo de maduración en otras.

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CRITERIOS DE CULTIVO
En la mayoría de los procesos biotecnológicos comerciales, la producción de enzimas
y compuestos orgánicos son realizadas en exceso de agua libre. Este tipo de
fermentaciones son conocidas como cultivos sumergidos y generalmente son llevadas
a cabo en reactores agitados. En cambio, aquellas realizadas bajo condiciones
restringidas de agua, se les denomina cultivos sobre sustrato sólido (CSS).

Cultivo sobre sustrato solido

Específicamente, los procesos CSS se refieren al crecimiento microbiano y a la

formación de productos sobre y en el interior de una matriz sólida, bajo condiciones de
humedad restringida. Este tipo de procesos presenta varias características favorables
para su desarrollo industrial. En primer lugar, mayores rendimientos, lo cual hace que
el CSS sea económicamente viable. Lo anterior lleva a que los reactores sean de
menor tamaño y, por lo tanto, que los costos de producción sean menores. Por último,
esta tecnología genera una menor cantidad de efluentes, reduciendo el impacto
ambiental y los costos de tratamiento.

A pesar de sus ventajosas características, los cultivos sobre sustrato sólido han tenido
escasas aplicaciones en la industria. En parte esto se explica debido a los problemas
inherentes que enfrenta esta tecnología: tasas relativamente lentas de crecimiento;
capacidades limitadas para la disipación del calor metabólico generado; problemas en
la transferencia de masa, en particular, en la difusión de nutrientes del sustrato al
microorganismo.

Aunque las bacterias y levaduras pueden crecer sobre un sustrato sólido, son los
hongos filamentosos los microorganismos que mejor se adaptan a este tipo de cultivo
y, por lo tanto, son los más utilizados en CSS. El modo de crecimiento, su tolerancia a
bajas actividades de agua y altas presiones osmóticas lo hacen eficiente y competitivo
para este tipo de medio. La forma filamentosa que poseen, les otorga ventajas sobre
los organismos unicelulares en lo relativo a la colonización del sustrato sólido y a la
utilización de los nutrientes disponibles.

Cultivo sumergido

La fermentación sumergida ha sido la técnica mas empleada para la producción de

GA3, además de presentar ventajas como reducidos espacios de equipamiento, de los
que además existe variedad según los requerimientos del cultivo, inoculación
homogénea, mejor control de la contaminación y precisos controles de los parámetros
de fermentación, además permite el empleo de diferentes estrategias de fermentación
como procesos en una sola etapa (batch), multietapa, con alimentación incrementada
y continuo.

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PRODUCCIÓN DE ACIDO GIBERÉLICO

Por todo lo antes expuesto sobre los tipos de cultivos puede resumirse que la
fermentación industrial convencional hasta ahora conocida se basa fundamentalmente
en un cultivo feed batch de una cepa mejorada genéticamente, en un medio limitado
en nitrógeno con lenta alimentación de carbohidratos y nitrógeno, que permite una
prolongada fase productiva con altos rendimientos.

Desde el descubrimiento del microorganismo hasta el día de la fecha se han

realizados inmensas cantidades de investigaciones con los fines de obtener los
parámetros exactos para obtener el máximo rendimiento mediante cambios en las
cepas utilizadas, preparación del inoculo, formulación de medios de cultivo y control de
parámetros tales como temperatura, pH y aireación entre otros. La observación más
relevante de estos estudios tiene que ver con las grandes modificaciones de
rendimientos ante mínimas variaciones de los factores antes mencionados.

Cabe destacar que si bien este proceso es el más importante, es posible obtener ácido
giberélico a través de síntesis química o de la misma extracción de la plantas.

La producción fermentativa de GA3 es un ejemplo clásico de metabolismo secundario,

donde el crecimiento exponencial cesa cuando el nitrógeno se ha agotado en el medio,
entonces el metabolismo cambia de la fase de crecimiento exponencial a la fase de
mantenimiento comenzando la síntesis de GA3 y es importante destacar que los
microorganismos deben tener al alcance fuente de carbono necesaria para su
mantenimiento.

Teniendo en cuenta que la producción de GA3 comienza luego del agotamiento del
nitrógeno en el medio y que un mayor número de células crecidas en medios con bajo
contenido de nitrógeno permiten una mayor producción, se han desarrollados
procesos multietapas, donde en una primera etapa se busca desarrollar micelio en
medio balanceado con relaciones C/N 10:1 a 25:1 y en una segunda etapa inocular
este micelio en medio sin nitrógeno o con mayores relaciones C/N, buscando
incrementar la producción de GA3

Desarrollo de inoculo.

El desarrollo del inoculo es una de las operaciones más importante para el éxito de la
fermentación, tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. En general se
evidencia que es importante considerar en la producción de GA3, el % y tipo de
inoculo a emplear, la edad, las condiciones de cultivo, por lo que las condiciones
optimas de desarrollo del inoculo deben ser estudiadas para cada cepa en cuestión.
Los mejores resultados fueron obtenidos empleando como inoculo un cultivo
vegetativo de 48 horas y en relación del 10 % v/v.

Un aspecto interesante, producto de la morfología de los hongos, es que se

desarrollan micelios y esporas a la vez. Las esporas se desarrollarán dependiendo la
cepa utilizada para este caso GF NRRL - 2278 y el cultivo que se utiliza.

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Luego de pasadas las 48 horas conviene filtrar el inoculo favoreciendo la

homogeneidad del mismo.

Requerimientos nutricionales

La existencia de dos fases en la producción fermentativa de GA3, una de crecimiento

de biomasa y otra de producción de GA3, reguladas por las concentraciones de
carbono y nitrógeno en el medio permite establecer la importancia de la relación C/N
para este tipo de biosíntesis, ya que al momento del agotamiento de la fuente de
nitrógeno, aun debe quedar glucosa disponible para pasar a la fase de mantenimiento
y la producción de GA3, sin embargo esta última no debe exceder concentraciones
inhibitorias para el metabolismo de GA3, que se plantea ser de 4% en fase de
producción, de ser mayores pudiera ocurrir inhibición por sustrato de la síntesis de
GA3. Muy importantes para la fermentación de GA3 son la cantidad y calidad del
nitrógeno usado.

Altos niveles de crecimiento son obtenidos cuando se usa como fuente de nitrógeno, la
glutamina, el glutamato y el amonio. Sin embargo el crecimiento es menor cuando se
emplean fuentes más complejas de nitrógeno como proteínas y amidas

En lo referente a la fuente de carbono es ideal un proceso de liberación gradual o lenta

de sustrato para evitar un fenómeno de inhibición catabólica. Se ha demostrado que la
sacarosa es mejor que la glucosa como fuente de carbono pero también es posible
utilizar aceites de semillas, de cereales o de maíz.

CONDICIONES DE FERMENTACIÓN
pH

El valor del pH inicial mas reportado en la literatura es alrededor de 5.5 o en el rango

entre 3.5-5.8; pero se plantea no encontrar diferencia significativa en la producción de
GA3 entre pH inicial 3.5-5.5. De forma general no se acostumbra a controlar el pH
durante la fermentación el cual no tiene cambios drásticos, llegando a un pH final entre
3.9 y 5.2. Sin embargo cuando el pH tiende a la neutralidad se favorece la producción
de intermediarios como GA4 y GA7.

Temperatura

El efecto de la temperatura sobre la producci6n de GA3 es dependiente de la cepa

empleada. Tanto para Gibberella Fujikuroi como Fusarium Moniliforme, la temperatura
ambiente (25-30°C) ha sido la más utilizada, aunque estudios específicos han
encontrado rangos estrechos, entre 28.5-29.5 o 29+0.5OC, valores mayores de
temperatura alrededor de 32°C se ha visto que favorecen la producción de GA4 y GA7.
Ha sido especificado que temperaturas entre 31-32°C favorecen mas el crecimiento,
siendo la temperatura optima para la producción algo menor alrededor de 29°C.

Aireación / Agitación

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Se plantea la necesidad de un continuo suministro de oxigeno al fermentador para

poder satisfacer la demanda bioquímica de este nutriente que conllevan las múltiples
etapas de oxidación de la ruta biosintética.

Estas condiciones de restricción de oxigeno también son favorecidas por los aumentos
de viscosidad que provocan en el medio el incremento de la biomasa fúngica.

Es conocido el beneficioso efecto del CO2 sobre los rendimientos de GA3,

comprobándose que bajos niveles de inoculo o suministro de aire libre de CO2,
aumentan la fase de latencia, de forma contraria un suministro de aire enriquecido con
CO2 puede reducir el tiempo entre la inoculación y la fase productiva, incrementándose
además la velocidad de crecimiento y el rendimiento de GA3; no obstante se ha
comprobado que el uso de altas relaciones de inoculo provocan similares resultados
quizás debido a que de esta manera se produce el CO2 necesario para satisfacer la
propia demanda del cultivo. En fermentaciones fúngicas en general y en especifico en
la fermentación de GA3, se ha comprobado la influencia de la agitación sobre la
transferencia de oxigeno.

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
La recuperación de GA3 es por extracción liquido-liquido y es desarrollado empleando
solventes inmiscibles en agua, tales como acetato de etilo y acetona, acidificados a pH
entre 2 y 4; el recobrado de tas GA3 a partir del solvente, se basa en la relativa
solubilidad de las giberelinas libres en la fase orgánica y de sus sales en la fase
acuosa. La eficiencia de extracción puede variar entre 40-100%. La principal
desventaja de esta técnica es la gran cantidad de solventes que emplea y esta etapa
del proceso es la de mayor costo.

ASPECTOS ECONÓMICOS.
Con vistas a disminuir los costos de producción, no solo es importante la etapa de
aislamiento y purificación, ya que también inciden todos aquellos factores que influyen
en la productividad y rendimiento, como son el mejoramiento de la cepa, optimización
de la composición del medio, extensión de la fase de producción por técnicas de
alimentación y control del metabolismo para disminuir la biosíntesis de otros
productos, o evitar el almacenamiento de carbohidratos por la célula.

DISEÑO DE UN BIORREACTOR AIR

LIFT PARA LA PRODUCCIÓN DE
ÁCIDO GIBERÉLICO.

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Los parámetros más importantes para el desarrollo de Gibbberella Fujikuroi en el

reactor AirLift son:

 Potencia del gas

 Velocidad del fluido
 Velocidad del fluido en tubos ascendentes y descendentes
 Determinación del tiempo de mezclado
 La velocidad determinada del gas que fluye hacia la superficie

En biorreactores fluidizados la producción de este ácido puede alcanzar un promedio

de 3.9 g/l

FACTORES DE FORMA Y ASPECTOS

IMPORTANTES DE
DISEÑO
Para el caso de la producción de ácido giberélico
se requiere utilizar un reactor cuyos factores de
forma faciliten la generación del producto,
mediante la fermentación sumergida, como el
caso de un AirLift.

Los factores de forma del biorreactor son

diseñados en base a una relación patrón del tipo
de reactor que se desea diseñar (1:3 o 1:6) entre
el diámetro y la altura de este, partiendo de un
volumen de operación establecido para el tanque
modelado, que permita determinar el diámetro
adecuado. Con lo cual a partir del diámetro y del
esquema del reactor se calcularán los demás factores.

La inyección de gas en este tanque permite se realice la aireación del medio y se

facilita la fluidización de sólidos presentes en el mismo, debido al constante
movimiento del fluido inducido por burbujas, por lo tanto se presentan altos valores de
transferencia de oxígeno y la demanda se satisface adecuadamente en este reactor.

Otro factor a considerar es que el diseño del equipo y el flujo del líquido, ocasionan
que el calor sea distribuido rápida y uniformemente.

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ESCALAMIENTO DEL REACTOR A

VOLUMEN INDUSTRIAL
La selección del criterio para el crecimiento de escalamiento dependerá de cuál es la
variable más importante para el crecimiento del microorganismo y para la producción
del producto deseado. El escalamiento se hace en base de principios de semejanzas
entre dos sistemas:

 Similitudes Geométricas: Las razones entre las longitudes deben ser iguales en
ambos sistemas.
 Similitudes Dinámicas: Las razones entre las fuerzas en puntos equivalentes
deben ser iguales.

Para este caso se deberán tener en cuenta dos aspectos a la hora de hacer
escalamiento:

 Mantener el nivel de transferencia de oxígeno

(𝐾𝐿 𝑎)𝐸1 = (𝐾𝐿 𝑎)𝐸2

 Potencia por unidad de volumen: Resulta un criterio clásico ya que gracias a

este se permite en nivel establecido de agitación.
𝑃𝑔 𝑃𝑔
( ) =( )
𝑉 𝐸1 𝑉 𝐸2

Si se considera un volumen de 500 L y comparando con un volumen de 7 L los

resultados son:

V= 7 L V= 500 L
Transferencia de O2 0.01567 m/s 0.0727 m/s
Potencia 140,9638 w 10068,84 w

ESTERILIZACIÓN DEL BIORREACTOR

Y DEL MEDIO DE CULTIVO
Para que el medio de cultivo pueda ser aprovechado adecuadamente por el
microorganismo debe ser suministrado estéril o ser esterilizado en el biorreactor. La
esterilización del medio de cultivo puede ser con calor, filtración, tratamientos químicos
entre otros, pero el más utilizado es el calor tanto para el medio como para el reactor
por cuestiones de practicidad. El calor es aportado por medio de vapor de agua
saturado. En la práctica se alcanzan los 120º C durante 20 minutos y
aproximadamente una hora lleva el proceso de esterilización completo considerando
los tiempos de enfriamiento y mantención.

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BIBLIOGRAFIA

 Gonzales Baños, Sonia Michel – Optimización de la producción de ácido

giberélico por gibberella fujikuroi.
 Molina Manuel – Estudio cinético de la producción dde ácido giberélico
utilizando el hongo gibberella fujikuroi
 Delgado Arrieta, Grizel – Procedimiento biotecnológico para la obtención de
giberelinas.
 Gelimi, Claudio Andrés – Análisis, modelación y simulación del crecimiento de
ácido giberélico sobre sustrato sólido inerte.
 Barrientos, Enrrique/Ortiz Victor/Granados José/Martinez Adrián – Diseño de
un biorreactor airlift para la producción de acido giberélico.

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