Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al

medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un
importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate
es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos
ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos
exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos
si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas,
denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.)
contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades
nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios
inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo
clásico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa
que un agar chocolate enriquecido al cual se ha añadido unamezcla de tres antibióticos
específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante.

La sangre de carnero es la más adecuada para la preparación de Agar Sangre y Agar Chocolate.
Comúnmente se utiliza la sangre de carnero entre 5 - 10% como un medio de enriquecimiento
nutritivo en la preparación de medios de cultivo. Éste es utilizado principalmente para el
crecimiento, identificación y observación de las reacciones hemolíticas causadas por algunas
bacterias con importancia clínica.

El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio un importante elemento para
el crecimiento: el factor X o Hemina termoestable.

Otros factores, en particular el factor V (dicotín-adenina nucleótido) termosensible, que

no se encuentran en el Agar chocolate pueden aportarse en una mezcla químicamente
definida: el PolyViteX.

El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los gérmenes
encontrados en patología humana o veterinaria.

La siembra de líquidos cefalorraquídeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es

favorable en este medio, pero está particularmente indicado para aislamiento de las
Neisserias patógenas y de los Haemophilus.

Aislamiento e identificación de Haemophilus

Los microorganismos del género Haemophilus se cultivan en Agar chocolate con

PolyVitex. Como en el caso del gonococo el cultivo es rápido y abundante sobre todo
en atmósfera rica en C02. Estos gérmenes encuentran en este medio los factores X y V
necesarios para su crecimiento. El diagnóstico de la serie al respecto puede conducirse
de la manera siguiente:

Si se siembra en cuatro medios diferentes:

- Agar Trypcase-soja que no contenga ni factor V, ni factor X

- Agar Trypcase-soja con PolyViteX (factor V)
- Agar chocolate (factor X)
- Agar chocolate con PolyVitex (factores X y V)

El recuadro que se da a continuación indica los resultados obtenidos en estas

condiciones con los principales Haemophilus:

H. parainfluenzae crece en Trypcase soja con PolyViteX (V) y en chocolate con

PolyViteX (V yX)
H. aphrophilus crece Chocolate (X) y en chocolate con PolyViteX (V yX)
H. influenzae, H. haemolyticus, H. aegiptius crecen en los 4 medios

otras pruebas que ayudan a diferenciarlos:

H. aegiptius aglutina hematies humanos (prueba en porta), H. influenzae no los

aglutina
H. haemolyticus da hemólisis en Agar con 5% de sangre de caballo
Debido a que Haemophilus influenzae no crece en los medios rutinarios para
efectuar antibiograma, se necesita preparar un medio especial que además de la
base de Mueller-Hinton contiene 15ug/mL de beta-NAD, 15ug/mL de hematina
bobina, 5mg/mL de extracto de levadura y un pH de 7.2 a 7.4. De acuerdo con el
Comité Nacional de Estándares en Laboratorio Clínico (NCCLS-USA) el Agar
chocolate no debe usarse para efectuar antibiograma de Haemophilus.

Agar Chocolate Thayer Martin

Medio enriquecido preparado con un medio base tal como agar tripticasa (TSA) o agar
infusión cerebro corazón (BHIA) suplementado con sangre animal desfibrinada y calentada a
80ºC durante 10 min. A veces el calentamiento excesivo destruye el factor V (NAD), por lo que
se suele adicionar este factor. Es un medio adecuado para el cultivo de N. gonorrhoeae y varias
especies de Haemophilus, entre otras bacterias.

Recuento del inoculo bacteriano utilizado

El recuento del inóculo se realiza con el fin de determinar la exactitud de la concentración de

bacterias de la suspensión utilizada en la siembra.

Extienda el inóculo en cada caja de agar con un bastón de vidrio o con asa bacteriológica, tenga
cuidado de no tocar los bordes de la caja, ya que es difícil contar las colonias que crecen en los
bordes. Incube las cajas en 5% de CO2, de 18-20 horas a 35ºC.

Para realizar la lectura después del período de incubación, cuente las colonias aisladas en cada
una de las placas, actividad que puede realizar con ayuda de un cuenta-colonias. Si alguna de las
placas presenta demasiadas colonias, informe el recuento como "demasiadas para contar".

Para calcular la cantidad de bacterias en cada placa, multiplique el número de colonias en cada
una por el factor de dilución y por la inversa del volumen de inoculo utilizado y expresar el
conteo como UFC/ml.

# UFC / ml = # de colonias * factor de dilución

ml sembrados en la placa