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5 - Transformacion Vegetal
5 - Transformacion Vegetal
Curso 2011
Sistemas de transformación vegetal
Transparencias 3-6
Transparencias 7-19
Todos los plásmidos Ti tienen una estructura similar. Las especies de Agrobacterium
sintetizan diferentes tipos de opinas y son referidas de acuerdo con ello. La
transparencia 12 muestra las regiones de homología entre los plásmidos Ti de dos
cepas comunes de Agrobacterium, una de octopina (oct) y otra de nopalina (nop).
Dichas regiones abarcan principalmente la región T y la región vir. Una característica
del plásmido Ti de octopina es que contiene tres regiones T cortas de 13, 1,5 y 7,8
Kpb, los cuales son transferidos independientemente unos de los otros, mientras que
el de nopalina lleva un único plásmido Ti de 22 Kpb. Existen muchas otras opinas,
tales como manopina, agropina agrocitopina, etc. En los plásmidos representados en
esta transparencia se muestran cuatro regiones de homología que contienen
respectivamente a los genes que codifican proteínas involucradas en la síntesis de
auxinas y citoquininas (región A), el origen de replicación (región B), los genes que
codifican proteínas involucradas en el catabolismo de octopinas y nopalinas (región C)
y los genes de virulencia (región D).
Una vez inducidos los genes vir, se produce la escisión de la hebra T libre. Este evento
se inicia en el borde derecho, continúa en dirección 5’-3’, y termina en el borde
izquierdo de la hebra antisentido. Un complejo de proteínas denominadas VirD1/D2,
que funcionan como endonucleasas específicas, se une a la forma supercoiled del
plásmido Ti, relajan el plásmido, hace un corte entre la tercera y cuarta base de los
bordes derecho e izquierdo en la hebra antisentido de la región T y liberan dicha
hebra. La reacción de corte comprende la unión covalente de la proteína VirD2 al
extremo 5’ del borde derecho. Luego, la maquinaria de síntesis de ADN repara la
brecha entre los bordes derecho e izquierdo de la hebra antisentido. La proteína VirD2
permanece unida al ADN-T durante todo el trayecto hasta la célula huésped. Las
proteínas VirD2 y VirE2 (una proteína de unión a ADN de simple cadena) junto con la
hebra T constituyen el complejo T maduro. La unión de VirE2 ocurre antes de que la
hebra T sea transportada a través del canal de pasaje a través de las membranas de
la bacteria. Otra proteína recientemente identificada, la proteína VirE1, se une a VirE2,
facilitando la unión de VirE2 al ADN, pero no interviene en la exportación de la hebra T
a la célula de la planta.
Una vez formado el complejo T maduro, éste interactúa con distintos complejos
proteicos involucrados en su exportación al citoplasma de la célula vegetal. El
dispositivo de transporte del complejo T contiene alrededor de 12 proteínas que
forman dos componentes funcionales: un complejo secretorio que transporta sustratos
a través de la membrana celular y un pilus filamentoso. La transparencia 18 muestra
un modelo que da cuenta de la estructura de estos complejos, elaborado sobre la base
de evidencia indirecta. El complejo secretorio está compuesto por la proteína
codificada por el gen virD4 y por un conjunto de proteínas codificado por el operón
virB, el que contiene once marcos abiertos de lectura. El pilus está compuesto
mayoritariamente por la proteína VirB2 y, en menor proporción, por la proteína VirB5.
El pilus censaría el contacto con la célula vegetal y traduciría la información al
complejo secretorio para iniciar la exportación del complejo T. Se piensa que la
proteína VirB1 tiene actividad transglucosilasa e interviene en la degradación de los
peptidoglicanos bacterianos. Las proteínas VirB3 y VirB4 promoverían el ensamblado
del pilus. Además de VirD4, VirB4 y VirB11 poseen también actividad ATPasa. Se
asume que el transporte del complejo T implica la hidrólisis de ATP y que por lo tanto
se trata de un proceso de transporte activo. La proteína VirB6 participaría en la
formación del poro del complejo secretorio de transporte. Se desconocen aún las
funciones de las proteínas VirB7, 8, 9 y 10.
Transparencias 20-31
Los vectores binarios surgen como una alternativa al uso de los vectores
cointegrativos debido a la fácil implementación de su uso en todo tipo de laboratorios.
Estos vectores se basan en que la región T y los genes vir se encuentran en dos
replicones separados. Cuando estos replicones son introducidos en Agrobacterium, los
productos de los genes vir pueden actuar en trans sobre la región T procesando y
transfiriendo el ADN T a la célula vegetal. El plásmido que contiene la región T es
denominado vector binario, mientras que el replicón que lleva los genes vir se
denomina plásmido helper o plásmido Ti desarmado. En general, el plásmido helper
contiene deleciones de la región T y es incapaz de generar tumores. En la
transparencia 23 se muestran cuatro tipos de plásmidos binarios, todos los cuales
contienen genes con secuencias no homólogas que confieren resistencia a
kanamicina. Los plásmidos binarios son pequeños y fáciles de manipular tanto en
Escherichia coli como en Agrobacterium. Generalmente, contienen sitios múltiples
para enzimas de restricción dentro de la región T donde puede clonarse fácilmente el
gen de interés. Muchos de los primeros plásmidos binarios tienen los genes de
selección para plantas cerca del borde derecho (por ejemplo, pBIN19). Más
recientemente, los nuevos vectores binarios se desarrollaron con el gen marcador de
selección para plantas más cerca del borde izquierdo, lo que asegura que el gen de
interés sea transferido antes que el gen selector (por ejemplo, pGreen0029). Debe
recordarse que el borde derecho precede borde izquierdo en la transferencia del ADN-
T.
Los vectores binarios que hoy se utilizan proveen un amplio número de genes
selectores para plantas. Esta gama de genes permite así responder a requerimientos
de las técnicas de cultivo de tejidos y expandir el rango de especies transformables.
De esta forma, se han desarrollado en muchos casos diversas versiones de un mismo
vector binario. El vector pGreen, por ejemplo, permite realizar distintas combinaciones
de genes selectores con el propósito de desarrollar protocolos de selección con uno o
más marcadores. Este grado de flexibilidad permitirá también la incorporación de
nuevos genes selectores en el futuro. En la mayoría de los casos, la selección se basa
en el agregado de una sustancia tóxica para el tejido no transformado al medio de
cultivo (selección negativa). Al expresarse en las células transformadas, el gen
selector permite su supervivencia y la regeneración de plantas a partir de las mismas.
Los genes de resistencia a antibióticos han sido frecuentemente utilizados como
selectores. El más utilizado de ellos es el gen nptII que confiere resistencia al
antibiótico kanamicina. Otros genes ampliamente utilizados son los que confieren
resistencia a espectinomicina e higromicina y los que confieren resistencia a
herbicidas, como glufosinato y glifosato. El uso de un determinado selector está
vinculado con la susceptibilidad específica de cada especie vegetal, por lo que la
transformación de una especie nueva implica generalmente ensayos con distintos
selectores. Es conveniente disponer de más de un gen selector si se prevé la
necesidad de retransformar una especie con varios transgenes de interés. El debate
sobre el uso de genes de resistencia a antibióticos en plantas transgénicas
comerciales promovió la búsqueda de selectores más aceptables para la percepción
pública que no poseen propiedades tóxicas para el tejido (selección positiva).
Asimismo, se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar los genes
selectores en el cultivo transgénico.
Transparencias 32-37
La transparencia 36 resume los tiempos estimados para cada uno de los pasos de un
protocolo de una transformación estándar mediado por Agrobacterium tumefaciens.
Estos tiempos son variables y dependen de la especie a ser transformada, la variedad
elegida, el explanto utilizado y el protocolo elegido para la selección.
Transparencias 38-42
Genes reporteros
Transparencias 43-52
Los genes reporteros son ampliamente usados en muchos vectores de expresión para
medir la actividad de distintas regiones reguladoras. Idealmente, un gen reportero
debe ser fácil de ensayar, si es posible en condiciones no destructivas del tejido. Se
requiere también que la actividad endógena asociada al gen reportero sea muy baja o
inexistente en las plantas a transformar. Actualmente, se cuenta con un pequeño
número de genes reporteros de uso frecuente, siendo los más utilizados el de la -
glucuronidasa, la proteína de fluorescencia verde, los de luciferasa y, en menor grado,
el de cloranfenicol acetiltransferasa. La transparencia 44 enumera los orígenes y tipos
de ensayos que se utilizan para detectar las actividades asociadas con estos genes.
Los genes reporteros han utilizados desde muy temprano como indicadores de que la
transformación vegetal realmente ha ocurrido. En general, los genes reporteros son
codificados por enzimas que actúan sobre sustratos que normalmente no están
presentes en la célula huésped. Uno de los genes reporteros más comúnmente
utilizado en plantas es el gen de la -glucuronidasa (uidA) de Escherichia coli. La
proteína GUS es bastante estable y conserva su actividad aún cuando está fusionada
a otras proteínas. La actividad GUS puede detectarse a través de una sencilla
reacción histoquímica usando una variedad de sustratos que están disponibles
comercialmente. Desafortunadamente, la mayoría de los sustratos son caros y la
reacción histoquímica es destructiva, por lo que este ensayo no puede realizarse en
tejido vivo. Sin embargo, la detección de la actividad GUS es muy sensible,
pudiéndose detectar a nivel de unas pocas células. La transparencia 45 muestra la
tinción de óvulos, sacos embrionarios y lóculos enteros de Arabidopsis thaliana
mediante la reacción histoquímica de la enzima -glucuronidasa luego de la infiltración
con Agrobacterium tumefaciens. En este caso, el gen uidA está regulado por un
promotor constitutivo y lo que se visualiza son los tejidos inicialmente transformados
por este método. A: fotografía de una flor completa donde se observan varios óvulos
teñidos. B: Fotografía ampliada de un segmento floral donde se pueden ver óvulos
completamente teñidos y óvulos no teñidos. C: Tinción del embrión o saco
embrionario, en vez del óvulo entero. D: Cavidad del lóculo completamente teñido.
Los genes reporteros son comúnmente usados para explorar la localización espacio-
temporal de la expresión génica. Para ello, las regiones reguladoras de los genes que
se desea estudiar son ligadas al gen reportero y las construcciones así obtenidas son
transferidas al genoma de la planta. El panel de la parte superior de la transparencia
46 muestra la expresión del gen reportero uidA mediada por el promotor tejido
específico AtpT2 en flores y frutos de Arabidopsis thaliana. 1) Expresión del gen uidA
en flores, 2) La expresión del gen uidA es confinada a la porción entre la silicua y el
pecíolo. 3 y 4). Cortes histológicos del fruto donde se observa la expresión del gen
uidA en células del estrato superior (3) y en algunas células del tejido vacuolar (4). El
panel de la parte inferior de la transparencia muestra la expresión del gen reportero
uidA bajo la regulación de un promotor tejido específico AtpT2 en raíces de Nicotiana
tabacum. (5) y (6): Fotografías de las raíces completamente teñidas debido a la
expresión del gen uidA. (7): Corte transversal de raíz mostrando la expresión del gen
uidA.
luciferasa
ATP + luciferina + O2 oxiluciferina + ampicilina + PPi + CO2 + luz
Transparencias 53-99
Transparencias 55-82
En 1987, Klein et al. reportaron que era posible introducir ADN plasmídico en células
epidérmicas de Allium cepa mediante bombardeo con partículas de tungsteno, y que el
gen marcador cat de la enzima cloranfenicol acetiltransferasa era expresado en
niveles muy altos. Poco después, numerosos investigadores pusieron a prueba este
método en diferentes organismos obteniendo resultados positivos. Desde entonces, el
bombardeo de micropartículas se constituyó en el segundo método de transformación
genética de plantas más empleado, luego del de Agrobacterium. El bombardeo de
micropartículas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza,
permite introducir ADN desnudo virtualmente en cualquier tipo de tejido o célula. Ha
sido utilizado para introducir y expresar material genético no sólo en el genoma de
plantas superiores sino también en bacterias, protozoarios, algas, hongos, células y
tejidos animales (insectos, peces, aves y mamíferos) y aún animales y plantas in vivo.
Hasta el presente, constituye el único medio que permite transformar organelas
celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible.
Entre las modificaciones más notables introducidas al diseño de los cañones génicos
figura el reemplazo de la carga de pólvora por presión de gas para generar el impulso
de las micropartículas. El primer dispositivo que utilizó esta forma de impulsión fue el
cañón PDS-1000 de Dupont, basado en una descarga de helio o nitrógeno
comprimido. El modelo más utilizado en la actualidad es el cañón de alta presión de
helio PDS-1000/He, el que fue patentado por Dupont y es comercializado por la
compañía BioRad (transparencias 61 y 62). El mismo consta de los componentes
necesarios para la transferencia de alta presión de helio (regulador del helio, válvula
solenoide, tubos conectores, membrana de ruptura), de un componente portador del
macroproyectil y de una cámara principal en donde se bombardea el tejido blanco en
condiciones de vacío parcial. Al accionar el sistema, se establece vacío dentro de la
cámara de disparo y el helio es liberado hacia la misma luego que la membrana de
ruptura se rompe por exceso de presión. El movimiento del helio a alta velocidad
impulsa el macroproyectil que porta las micropartículas recubiertas de ADN, las que
son así aceleradas hacia el tejido blanco. Este dispositivo asegura una aceleración
reproducible de las micropartículas y los tejidos resultan menos dañados que en el
caso de los cañones impulsados por pólvora.
Las transparencias 63-64 ilustran los distintos pasos del procedimiento de bombardeo.
El primer paso involucra la preparación de las micropartículas, la precipitación del ADN
sobre las mismas y el ensamblaje de las distintas partes del cañón que comprenden el
sistema de impulsión de los microproyectiles. Para ello, se desenrosca el soporte de la
membrana de ruptura, se escoge una membrana de ruptura del espesor apropiado y
se la coloca en el soporte correspondiente. A continuación, se ajusta el soporte al
extremo del tubo de salid de gas. El espesor de la membrana de ruptura varía según la
presión de helio con la que se quiera trabajar (existen membranas que van de los 300
psi hasta los 2.200 psi). La presión de ruptura determina el poder de la onda de
choque que impacta en la cámara. Si se incrementa la presión de helio, se incrementa
la aceleración de las micropartículas y, en consecuencia, su penetración en el tejido
blanco.
Existen modelos alternativos al cañón PDS 1000/He que permiten regular la presión
del gas a la cual se desea producir el bombardeo. La regulación se efectúa por medio
de una válvula eléctrica, dentro de un rango de presiones de 200 a 1500 psi. Al
accionar un control eléctrico, la fuerza electromagnética generada por un solenoide
produce el desplazamiento de una aguja que perfora las membranas de ruptura
permitiendo la salida del helio (en contraste con el cañón PDS1000/He en que la
membrana de ruptura se rompe pasivamente por exceso de presión). El dispositivo
que se muestra en la transparencia 67 fue desarrollado en EMBRAPA-CENARGEN
(Brasil) y ha sido utilizado exitosamente en la transformación de Glycine max,
Phaseolus vulgaris, Gossypium hirsutum, entre otros.
El Genebooster (transparencia 68) es otro tipo de cañón génico, producido por ELAK
(Budapest) y desarrollado por el Centro de Biotecnología Agrícola del Instituto de
Ciencias Vegetales de Hungría. Mediante este dispositivo, las partículas son
impulsadas hacia el tejido blanco por liberación de nitrógeno comprimido a alta
presión. En este caso, los controles de presión y vacío se encuentran en una unidad
separada de la cámara de disparo. El proceso de disparo es controlado por un sistema
electrónico automático. La energía del disparo es ajustada según el espesor de la
pared celular del tejido blanco. Los ajustes de los parámetros de cada disparo pueden
ser archivados por una computadora conectada al dispositivo. Este cañón ha sido
usado con éxito en la transformación de Oryza sativa y también para obtener
expresión transitoria en estudios de promotores específicos para diferentes tejidos
(hoja, hipocótilo, embrión, escutelo, callo, cotiledón) de varias especies vegetales.
Entre sus ventajas, pueden mencionarse: a) control automático de los disparos; b)
registro computarizado de los ajustes de cada disparo; c) control continuo de la
energía de disparo; d) alta penetración a través de paredes celulares; e) alta
frecuencia de transformación en especies recalcitrantes; f) bajo costo (gas barato,
placas de retención reciclables).
En 1996 hizo su aparición la pistola génica de mano como una alternativa al cañón
PDS 1000/He. En contraste con los cañones génicos convencionales, en que el
tamaño del tejido blanco está limitado por el tamaño de la cámara y el explanto es
sujeto a vacío durante el bombardeo, este nuevo diseño no requiere vacío, permite
trabajar con virtualmente cualquier tipo de células o tejido blanco y provee una
herramienta para transformar organismos in vitro o in vivo. El instrumento que se
muestra en la transparencia 69 es comercializado por la compañía BioRad. La pistola
trabaja con microproyectiles de oro recubiertos de ADN o ARN que son precipitados en
la pared interna de un cartucho de plástico y acelerados por un flujo de helio a presión.
Es posible preparar 50 cartuchos a la vez conteniendo cantidades conocidas de
microproyectiles, los cuales pueden conservarse hasta dos meses previos a su
utilización. Los cartuchos se colocan en un soporte (figura C), el cual se ensambla en
la pistola y se dispara. El sistema es rápido, versátil y permite la co-transformación con
más de un transgén. En la práctica los dos sistemas de helio, el cañón PDS1000/He y
la pistola Helios, se complementan, dado que en el primero el vacío provee
condiciones ambientales más controladas en su cámara de disparo, mientras que el
último permite trabajar con una amplia variedad de tejidos o células blanco, incluidos
organismos vivos. La transparencia muestra la pistola génica (figura A), el porta
cartuchos (figura C), y un dispositivo (figura B) utilizado para preparar hasta 50
cartuchos por vez. El esquema inferior muestra el diseño interno de la pistola génica.
La pistola génica constituye una valiosa herramienta para transferir ADN o ARN en
organismos vivos sin utilizar cámara de vacío. Debido a que la pistola puede ser
dispuesta muy cerca del tejido a ser bombardeado, la trayectoria de las partículas es
reducida y la desaceleración por fricción es muy baja. Estos cambios reducen el
trauma en tejidos frágiles y facilitan las manipulaciones. Sin embargo, los parámetros
de bombardeo deben ser ajustados de acuerdo con el tipo de tejido blanco. Algunos
reportes mencionan que una desventaja del sistema es la poca reproducibilidad entre
experimentos. Sin embargo, este problema es frecuente en todos los sistemas de
bombardeo de partículas. Algunos autores recomiendan tomar recaudos especiales
para controlar mejor este problema, tales como trabajar con material vegetal crecido
en las mismas condiciones o utilizar explantos de misma edad fisiológica.
Un dispositivo de bajo costo, que puede usarse como alternativa a los instrumentos
más sofisticados, es el cañón de chorro de partículas (PIG; Particle Inflow Gun). El
mismo puede ser fácilmente construido en el laboratorio con medios relativamente
económicos. Este cañón hace uso de una válvula eléctrica para generar un chorro de
helio a baja presión, el cual acelera las micropartículas dentro de una cámara de vacío
(28-30 pulgadas de Hg) y las proyecta hacia las células blanco. La micropartículas
recubiertas de ADN son dispuestas en una jeringa con filtro que se acopla a un
adaptador conectado a la válvula solenoide. Este instrumento ha sido exitosamente
usado para transformar Glycine max, Zea mays, Manihot esculenta y Musa spp. Existe
una versión del PIG en el cual se ha eliminado la cámara de vacío y que se ha usado
para transformar Oryza sativa. A pesar del bajo costo del sistema, su uso no ha sido
tan difundido como el de los cañones mencionados anteriormente.
Transparencias 83-93
Luego de la digestión, los protoplastos deben ser aislados y lavados. Por otro lado,
con el objetivo de optimizar la transferencia de ADN a protoplastos, se utilizan distintas
técnicas que incrementan la permeabilidad de las membranas plasmáticas. Es común
el uso de policationes tales como polietilenglicol (PEG), polivinil alcohol (PVA) y DEA-
dextrano que actúan como fusógenos e incrementan la endocitosis del ADN debido a
que sus cargas positivas interaccionan con las cargas negativas del ADN y de la
membrana plasmática. Además del uso de fusógenos, los tratamientos con Ca 2+ y
calor pueden incrementar la precipitación del ADN. La obtención de la primera planta
transgénica viable derivada de protoplastos de Nicotiana sp. se reportó en 1984. La
transformación de protoplastos en soluciones que contienen PEG provee frecuencias
relativamente bajas de plantas transgénicas. Sin embargo, debido al gran número de
células disponibles en estos sistemas, si se dispone de buenos métodos de selección
y de protocolos de regeneración eficientes, es siempre posible obtener plantas
transgénicas. Una contribución a la transformación mediada por PEG fue la fusión con
liposomas. En este caso, el ADN es previamente incorporado a liposomas, a partir de
las cuales es transferido a las células. Los liposomas están constituidos por lípidos de
carga neutra similares a los que componen la membrana plasmática y pueden ser
producidos en diversos tamaños. El ADN es empaquetado in vitro y luego transferido a
los protoplastos. Para hacer más eficiente la fusión se utilizan tratamientos con PEG u
otros policationes. Aunque el sistema es muy laborioso y la eficiencia de
transformación es baja, se ha reportado la obtención de plantas transgénicas de
tabaco y trigo por esta técnica. La transparencia 84 muestra un esquema
representativo del aislamiento y purificación de protoplastos de hojas de Nicotiana
tabacum. Las hojas cosechadas son puestas en contacto con la solución enzimática
durante 16 h, al cabo de las cuales se procede a separar los protoplastos del tejido no
digerido.
Transparencias 94-95
En 1990 se reportó una nueva técnica de transferencia de ADN que utiliza fibras muy
finas, conocidas como whiskers, para generar orificios en las paredes celulares. Las
fibras más utilizadas en este método son cristales de carburo de silicio de 0,3-0,6 m
de diámetro y 10-100 m de longitud. Las fibras de silicio se agregan a una
suspensión conteniendo el tejido vegetal (por ejemplo suspensiones celulares,
embriones o callos) y ADN plasmídico, y luego se mezclan con un agitador tipo Vortex.
Como resultado de la agitación, los whiskers penetran la pared celular y la membrana
plasmática, permitiendo el ingreso del ADN. La eficiencia de la técnica depende del
tamaño de la fibra, los parámetros de mezcla (agitación), la forma de los recipientes
utilizados, el material vegetal y las características de las células vegetales,
especialmente el espesor de la pared celular. Las principales ventajas de este método
residen en su bajo costo y en la rapidez y sencillez con que pueden realizarse los
ensayos. Sus principales desventajas son la baja eficiencia de transformación, la
disminución de la capacidad regenerativa de los tejidos dañados por el proceso y la
necesidad de trabajar con extrema precaución debido a la toxicidad del carburo de
silicio para la salud humana. Aunque el proceso ha sido utilizado con callos friables,
este tipo de callo está limitado a unos pocos genotipos de maíz y avena. Muchos
cereales producen callos embriogénicos muy compactos y duros que no son
fácilmente transformables por este método. Sin embargo, se han introducido mejoras a
la técnica que permitieron la transformación transitoria y estable de Oryza sativa,
Triticum sp., Hordeum vulgare, Zea mays, Nicotiana tabacum, Lolium multiflorum,
Lolium perenne, Festuca arundinacea y Agrostis stolonifera, sin necesidad de iniciar
suspensiones celulares. La transparencia 95 muestra la transformación de
suspensiones celulares de maíz con whiskers de carburo de silicio. Las suspensiones
celulares fueron puestas en una solución conteniendo los whiskers y el ADN
plasmídico portando los genes uidA y bar. La mezcla fue agitada con la ayuda de un
dispositivo de tipo Vortex (figura A). La incorporación del ADN fue corroborada por la
expresión transitoria del gen uidA (figura B). Las células transformadas formaron callos
en selección con fosfinotricina (figura C) y regeneraron plantas transgénicas (figuras D,
E y F). El tratamiento con herbicida reveló que las plantas han heredado el gen bar en
forma mendeliana (figura F). Este trabajo fue el primero en que se reportó la
producción de plantas transgénicas mediante whiskers de carburo de silicio.
Transparencias 96-99
Transparencia 100