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2011
PROFESOR PATROCINANTE:
_______________________________________
Marcia Costa Lobo
Ingeniero Civil Químico
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
PROFESORES INFORMANTES:
_______________________________________
Renate Schöbitz Twele
Tecnólogo Medico, M. Sc en Microbiología de los
Alimentos
Institución de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
_______________________________________
María Adela Martínez Sanguinetti
Bioquímico, Master en Nutrición y Dietética
Instituto de Farmacia
Esta Tesis fue financiada y forma parte del
proyecto FONDEF 1153 titulado “Desarrollo
de biocontroladores de Listeria
monocytogenes para su incorporación al
procesamiento industrial del salmon”. De
acuerdo a lo informado por el honorable
consejo universitario sobre derechos
intelectuales, los resultados de esta tesis se
encuentran encriptados para no interferir y
alterar procesos de obtención de patentes y
otros derechos.
AGRADECIMIENTO
En primer lugar quiero agradecer a Dios, ya que gracias a su gran guía espiritual durante todos
mis años de universidad y de vida ha sido mi mejor compañía, cuya fe en él logro que termine
este largo camino que en muchas oportunidades pensé dejar inconcluso.
También quiero agradecer a mi familia, especialmente en estos momentos dedico todo este
trabajo a mi abuelita Ema que ahora está en un lugar viviendo de una forma muy especial
recordando los tiempos de antaño cuando era joven, también agradezco a mis padres y
hermanos Carlos y María Fernanda. A mis sobrinitas que llegaron a alegrar nuestras vidas
También quiero agradecer de forma muy pero muy especial a mi mejor amiga, la cual conocí
durante mis a años de universidad Carito, gracias por su infinita amistad, preocupación y
gracias por esa pequeñita que es tu hija Javiera que nos alegro la vida y a tu esposo Javier. Son
una muy linda familia.
Gracias a mis amigos que conocí en el ICYTAL Alexandra, Sandy, Susana, Luchito y a todos
que por motivos de espacio y tiempo no puedo nombrar.
También a mis compañeros de laboratorio mientras desarrollo la parte practica de mi tesis sobre
todo a Deysi quien en estos momentos se debe encontrar devuelta en Colombia.
i
INDICE DE MATERIAS
Capítulo Página
RESUMEN 1
SUMMARY 3
1 INTRODUCCION 5
2 REVISION BIBLIOGRAFICA 6
3. MATERIAL Y METODO 19
5 CONCLUSION 37
6 BIBLIOGRAFIA 38
ANEXOS 41
iii
INDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1 Composición medio de cultivo, MRS, utilizado para la cepa 20
BAL-C
2 Concentraciones proteicas para los diferentes medios 22
iv
INDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Medios de cultivo, testigo MRS y y formulados con 23
constituyentes de reemplazo
2 Esquema de propagación de cepa láctica BAL-C 23
3 Preparación del césped con Listeria monocytogenes 24
4 Esquema diluciones y gota sobre césped 25
5 Crecimiento de la cepa BAL-C y producción de la STB a nivel 26
de matraces
6 Cultivo de la cepa BAL-C con el medio modificado en mini 27
fermentador artesanal
7 Efecto del reemplazo del extracto de levadura en el medio MRS 29
por agua de levadura (AL) en distintas concentraciones
8 Efecto de la modificación de la fuente de carbohidrato del 30
medio original
9 Efecto de la modificación fuentes proteicas en el medio: F7 32
HL:HP=!%:6%; F8: 0,5%:3%; F9: 0,25:1,5
10 Curva de crecimiento y curva de de NaOH 33
11 Crecimiento de la BAL-C y actividad inhibitoria de la STB 34
12 Consumo de la fuente de carbohidrato y gasto de NaOH 4 N 36
v
INDICE DE ANEXOS
Anexo Página
1 Modificación del extracto de levadura por agua de levadura 42
2 Modificación fuente de carbono de medio MRS 43
3 Modificación fuentes de nitrógenos del medio 44
4 Medio alternativo utilizado para la prueba de mini fermentador 45
5 Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY 46
et al. (1951)
6 Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a 48
método propuesto por LOWRY et al. (1951)
7 Resultados 49
7.1 Resultados expresados en UA/mL para agua de levadura. 49
7.2 Resultados expresados en UA/mL para nuevos carbohidratos. 49
7.3 Resultados expresados en UA/mL para nuevas fuentes 49
proteicas
8 Análisis estadístico utilizando la prueba de Friedman 51
8.1 Resultados prueba de Friedman para datos no paramétricos 51
reemplazo de extracto de levadura por agua de levadura
8.2 Resultados prueba de Friedman para datos no paramétricos 51
reemplazo de la fuente de carbohidratos por una mezcla de
sacarosa y melaza
8.3 Resultados prueba de Friedman para datos no paramétricos 51
reemplazo de la fuente de proteínas por una mezcla de dos
proteínas, una de origen animal y otra de origen vegetal
9 52
Resultados cultivo batch en mini fermentador
10 53
Resultados de proteínas solubles presentes y de consumo de
glucosa por parte de la BAL-C
1
RESUMEN
En esta investigación se diseñó un medio de cultivo para la bacteria acido láctica, cepa
BAL-C, aislada de salmón ahumado en frío, la cual produce una sustancia tipo
bacteriocina (STB) que inhibe al microorganismo patógeno Listeria monocytogenes.
Se puede mencionar que para el reemplazo del extracto de levaduras, se probaron tres
niveles de agua de levadura siendo los resultados con 10% de agua de levadura muy
superiores incluso al testigo (MRS).
Para el reemplazo de la fuente de carbono, se probaron tres fórmulas (F4 con 40 g/L
de melaza, F5 con 20 g/L melaza y 10 g/L de sacarosa y F6 con 10 g/L de melaza y 10
g/L de sacarosa) siendo los resultados para F5 muy superiores incluso al testigo
(MRS).
De los resultados obtenidos a nivel de mini fermentador se puede concluir que la cepa
BAL-C es capaz de crecer y de producir la sustancia tipo bacteriocina (STB) la cual al
medir su actividad inhibitoria frente a L. monocytogenes presenta buenos niveles
inhibitorios por lo cual el medio alternativo es factible ya que cumple con el objetivo.
3
SUMMARY
In this research is designed a new culture medium for the lactic acid bacteria LAB-C
isolated from cold smoked salmon that produces a bacteriocin like substance (BLS) that
inhibits Listeria monocytogenes.
The LAB-C develops and releases the BLS growing in the MRS medium, who was
replaced: protein source, carbon and micronutients sources. That is how it was first
worked at Erlenmeyer flask making parcial replacements in the MRS and spot on lawn
techniques were used how index the inhibitory activity of BLS.
For the replacement of yeast extract, were tested three levels of water yeast with the
results being 10% water yeast well above even the witness (MRS).
To replace the source of carbon, were tested three formulas (F4 with 40 g/l molasses,
F5 with 20 g/l molasses and 10 g/l sucrose and F6 with 10 g/l molasses and 10 g/l
sucrose) to F5 being the results far superior even to witness (MRS).
To replace the source of nitrogen, were tested three formulas (F7 with lupin extract 1%
and 6% fishmeal extract; F8 with lupin extract 0.5% and 3% fishmeal extract and F9
with lupin extract of 0.25% and 1.5% fishmeal extract). The results with F9 are the best
but well below the witness MRS.
At mini-fermenter with the medium changed with 10% water yeast, 20 g/l molasses and
10 g/l of sucrose, 1.5% extract of fishmeal and 0.25% lupin flour extract was obtained
inhibitory activity levels 12800 UA/mL and 109 CFU / mL
4
1 INTRODUCCION
Por otra parte, se debe señalar que además de nisina, que es la sustancia tipo
bacteriocina más conocida y comercializada, se están estudiando otras sustancia tipo
bacteriocina que presentan un mayor efecto antilisterial. Es así como, a nivel de
laboratorio se han estudiado condiciones de crecimiento, de la bacteria acido lactica
BAL-C, que libera una sustancia tipo bacteriocina contra L. monocytogenes en caldo
MRS, sin embargo una producción de la STB a nivel industrial se requiere formular un
5
medio de cultivo económico y que permita que la cepa BAL-C crezca y produzca la
STB.
Hipótesis
Objetivo general
Objetivos específicos
Formular y reemplazar las fuentes proteicas de origen animal y vegetal del caldo
MRS correspondientes a extracto de carne y proteosa peptona por extracto de harina
de pescado y extracto de harina de lupino, respectivamente.
2 REVISION BIBLIOGRAFICA
Las bacterias ácido lácticas representan un grupo heterogéneo de bacterias del tipo
Gram positivas, las que difieren morfológicamente entre sí, encontrándose tanto
aquellas con forma bacilar como cocoides. Son microorganismos no esporulados,
anaerobios facultativos, carecen de citocromo y catalasa; y fisiológicamente, se
pueden caracterizar como: bacterias que no tienen movilidad y no reducen el nitrito
como característica bioquímica. Presentan necesidades nutritivas complejas, debido a
su metabolismo de tipo homofermentativo, donde los carbohidratos, además de
proporcionar la fuente de energía para sus requerimientos, son transformados en acido
láctico (SCHLEGEL, 1997).
Según YING et al., (2007) las bacterias acido lácticas (BAL) fueron introducidas en los
alimentos fermentados hace miles de años para lograr un aumento en la vida útil de
éstos, produciendo cambios en su textura y sabor mientras producen y liberan
metabolitos inhibitorios, como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo y
sustancias tipo bacteriocinas, entre otros.
Según CRIADO et al., (2006), las BAL contribuyen a preservar una buena calidad
higiénica de los alimentos, mediante mecanismos de competencia por el sustrato y la
producción de metabolitos con actividad inhibitoria, entre los cuales se encuentran las
sustancias tipo bacteriocinas STB, que son péptidos antimicrobianos de síntesis
ribosomal.
7
Las bacteriocinas, por otra parte, presentan características que favorecen su empleo
como bioconservantes tales como las mencionadas a continuación:
8
Por otra parte, las bacteriocinas son consideradas como biopreservantes y son
degradas en el tracto gastrointestinal (YING et al., 2007). Según lo señalado por
BORQUEZ (2000) exhiben una acción bactericida o bacteriostática contra algunas
especies bacterianas.
9
Las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas presentan una serie de
características comunes que permiten agruparlas en tres clases principales (ZENDO et
al., 2005).
Clase lll: Constituida por bacteriocinas de alto peso molecular (mayor a 30 kDa),
también son termolábiles, pero se inactivan con tratamientos térmicos a temperaturas
entre 60ºC y 100ºC durante un periodo de tiempo de 10 a 15 min. La mayoría de estas
sustancias son producidas por especies del género Lactobacillus (ZENDO et al., 2005).
2.3.3 Aplicación de STB en alimentos. El uso de las BAL y/o sus bacteriocinas para
el uso como biopreservantes en alimentos es un área de gran interés. Las
características que debe cumplir una bacteriocina para su uso en alimentos son: ser
estable frente a procesos térmicos, estable durante el almacenamiento del alimento,
efectiva a bajas concentraciones, ser parte activa de la molécula de origen proteico, ser
degradada por enzimas digestivas, no afectar negativamente las características
sensoriales del alimento y ser de costo razonable (SCHÖBITZ, 2006).
Listeria se ha aislado de diversos ambientes, tales como: suelo, agua, múltiple fuentes
animales y vegetales, pienso y agua residuales; además L. monocytogenes forma
parte de la microbiota intestinal del 1 al 10% de la población.
Se distinguen claramente seis especies dentro del género Listeria, las cuales
corresponden a: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri y L. gray.
Siendo Listeria monocytogenes la principal causante de enfermedades en humanos
(CLIVE, 2002).
La listeriosis ha surgido como una de las principales enfermedades transmitidas por los
alimentos a fines del siglo XX. A pesar de que su incidencia es baja, es de indudable
importancia en lo que se refiere a salud pública debido a los graves síntomas que se le
asocian (meningitis, septicemia y aborto), alta mortalidad de sus infecciones (alrededor
de un 20 a un 30%), el largo periodo de incubación, el elevado riesgo que representa
para niños de corta edad, en especial en neonatos, mujeres embarazadas, ancianos y
personas inmunocomprometidas (BLACKBURN y MAcCLURE, 2002).
2.5.1 Medios de cultivo. Son una mezcla equilibrada de nutrientes (fuente de carbono,
nitrógeno y azufre, y factores de crecimiento) que en concentraciones adecuadas y
condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos
(CAMACHO, 2005).
12
CAMACHO (2005) señala que los medios pueden ser de dos tipos: definidos o bien
complejos en función de que se conozca o no la composición química de los nutrientes
que la componen. Además, los cultivos pueden clasificarse, también, en selectivos
(medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos mientras
inhibe el desarrollo de otros), diferenciales (medio que permite revelar características
fisiológicas de los microorganismo) y los medios enriquecidos (medio que tiene un gran
exceso de nutrientes y que se utiliza para microorganismos que tienen grandes
exigencias nutricionales). Siendo la efectividad de un medio de cultivo dependiente de
muchos factores: el tipo de microorganismo, los requerimientos nutricionales, las
interacciones de cada componente en el medio, las condiciones ambientales
(temperatura, humedad y atmosfera) y la presencia de factores tóxicos que puedan
inhibir el crecimiento bacteriano.
Para algunos microorganismos exigentes, para los cuales aun no se conocen bien sus
requerimientos nutricionales, se utilizan en su medio de cultivo: extracto de levadura,
autolisiado de levadura, peptona o extracto de carne. Pero debido a su alto costo por la
presencia de los mencionados componentes se reemplaza: melaza, lactosuero, agua
de maíz, extracto de soya que corresponden a productos de desecho en industrias
procesadoras, siendo por lo tanto más económicos (SCHLEGEL, 1997). Por otra parte,
BROCK (1998) señala que un medio complejo es aquel que se encuentra compuesto
por sustancias digeridas, no definidas químicamente, tales como: extracto de carne y
levadura.
El medio de cultivo MRS fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe (1960) como un
medio de enriquecimiento, cultivo y aislamiento de Lactobacillus y otras bacterias
ácidos lácticos desde diferentes tipos de muestras, tanto clínicas como provenientes de
alimentos (NILSSON et al., 2002 y LEAL-SANCHEZ et al., 2002). Sobre sus
13
Como es sabido algunos de los componentes del medio de cultivo MRS son: el
extracto de carne el cual constituye una solución acuosa de péptidos, aminoácidos,
fracciones de ácidos nucleicos, ácidos orgánicos, minerales, vitaminas, sales y otros
nutrientes. Probablemente durante mucho tiempo fue utilizado como fuente de carbono
y nitrógeno. El extracto de carne se obtiene de carne de vaca, la cual es tratada a altas
temperaturas durante un periodo de tiempo, obteniéndose un extracto acuoso que
normalmente es un suplemento con digestos de proteínas para incrementar el
contenido de nitrógeno amino mejorando el desarrollo bacteriano. El extracto de carne
concentrado es rico en carbohidratos y fosfatos con lo cual puede interaccionar y sufrir
reacciones de Maillard conduciendo a un oscurecimiento del producto como
consecuencia de la aparición de compuestos pardos. Su contenido en tiamina es bajo y
tiene una alta proporción de ácidos orgánicos lo que le hace que sea una adecuada
fuente de carbono para algunos microorganismos. Su alto contenido de fosfatos le
permite actuar como buffer regulando los valores de pH (CAMACHO, 2005).
Con respecto al extracto de levadura, se puede decir que consiste en una solución
concentrada de hidrolizado proteico de células, Saccharomyces cereviciae, producido
por una reacción autolítica de dichas células. Siendo una buena fuente de
aminoácidos, carbohidratos y vitaminas especialmente del complejo B y tiene un bajo
contenido de sales. Los principales carbohidratos presentes son: glucógeno y trehalosa
aunque por hidrólisis enzimática durante el proceso éstos pueden fraccionarse en
moléculas de glucosa. Dependiendo del origen del extracto de levadura el crecimiento
bacteriano se ve influenciado (CAMACHO, 2005).
Para las fermentaciones industriales se utilizan medios de cultivos, los cuales son
formulados con productos de desecho de diversas industrias para así optimizar y bajar
costos de producción. Es el caso de la utilización de melaza, la cual es un subproducto
del proceso de extracción de azúcar desde la remolacha, presentando un bajo costo.
Nutricionalmente la melaza presenta un alto contenido de azúcares, como la sacarosa
que se encuentra presente entre un 40 y 50% del peso total, además posee otros
componentes, como minerales, tiamina, acido fólico y biotina, que se podrían utilizar
como una buena fuente de carbono para microorganismos con metabolismo
fermentativo. Otras fuentes de carbono son: desechos de almidón de maíz y de papa,
lactosuero, n-alcanos, desechos de licor de sulfito, aguas residuales de origen
domestico, desechos de la celulosa y leguminosas ricas en carbohidratos (SHULER y
KARGI, 2002).
Por otra parte, como fuente de nitrógeno alternativo a los utilizados en los medios de
laboratorio se pueden mencionar: extracto de semilla de algodón, licor de maíz, harina
de cacahuate, harina de soya, harina de pescado, entre otras SHULER y KARGI
(2002). Como fuente de proteínas se puede utilizar además harina de pescado y
harina de lupinos, proporcionando los requerimientos necesarios para un óptimo cultivo
de microorganismos, según lo señalado por SERRANO (2004), quien menciona
algunas de las características nutricionales más relevantes de la harina de pescado,
entre las cuales se puede mencionar su alto contenido en aminoácidos esenciales,
además de un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3. Es
también una buena fuente de vitaminas del complejo B y acido fosfórico. Por otra parte,
este mismo autor señala las ventajas que presenta la harina de lupino frente a otras
harinas, como la de soya, ya que esta harina presenta un alto contenido de ácido graso
linoleico Las especies cultivadas en Chile del género Lupinus incluyen al lupino dulce
(Lupinus albus), lupino amargo (Lupinus angustifolius) y el lupino amarillo (Lupinus
luteus). Dentro de las variedades de lupinos, los niveles de proteína cruda oscila entre
un 31 – 34%. El contenido de aminoácidos en las harinas de lupino, en general, son
ricas en lisina, pero deficientes en aminoácidos azufrados como la metionina y cistina,
de acuerdo a lo señalado por PETERSON (1997), citado por SERRANO (2004). La
composición de lípidos y proteínas, presentes en el lupino, constituyen la mayor parte
15
3 MATERIAL Y METODO
Componentes g/1000 mL
Glucosa 20,0
Tween 80 1,0
Se probó reemplazar la dextrosa del MRS por melaza y una mezcla de melaza y
sacarosa, aún cuando éstas no corresponden estrictamente al mismo carbohidrato
utilizado.
40 g/L de melaza
Se tomó como testigo una solución de dextrosa en cantidad de 20 g/L del MRS.
(ANEXO 2).
Los testigos fueron extracto de carne en una proporción de 10 g/L para la harina de
pescado, mientras que para la harina de lupino fue la proteosa peptona en una
proporción de 10 g/L (ANEXO 3).
6,0 1,0
3,0 0,5
1,5 0,25
Se debe señalar que durante las pruebas utilizando las concentraciones proteicas,
tanto de origen animal como vegetal, ninguna de estas sufrió algún proceso de
hidrolizado (de tipo enzimático o químico) como sus testigos presentes en el caldo
MRS, extracto de carne y proteosa peptona.
50 uL 5 mL
100 µL.
de BAL
50 µL de la
dilución
Cepa
BAL-C
10 mL de caldo 5 mL de caldo
50 mL de caldo
MRS MRS
modificado y testigo
MRS
3.7.1.1 Preparación del césped. Se dispuso de una placa de Petri que contenía una
delgada capa de agar Soya tripticasa (ST). Sobre esta capa se adicionó 7 mL de agar
semisólido que contenía un cultivo de 18h de la cepa indicadora Listeria
monocytogenes (Lm 4/00) de concentración conocida. En la FIGURA 3 se muestra un
esquema de preparación del césped, aquí observan los medios utilizados. El césped se
preparó en campana de flujo laminar y se dejó secar por 40 min antes de depositar en
su superficie las gotas de sustancia tipo bacteriocina previamente obtenidas.
100 µL 700 µL
100 µL.
Solución stock
de Listeria
monocytogenes
9
1,0 x 10 ufc/mL
1:1 1:2048*
Control E350
Gota de dilución 1:
2048 ** Gota de
dilución 1:1
Césped de L..
monocytogenes
Gota de
dilución 1: 2
** Nota: Como se realizan diluciones seriadas que parten desde 1:1 hasta llegar a 1:2048. Sobre el
césped de Listeria se colocan gotas de un volumen de 20 μL cada una.
Siendo incubadas las placas durante 48 h a una temperatura de 4ºC y luego incubadas
a 25º C por 24 h, para finalmente proceder a la lectura de las placas y asi poder
cuantificar su antagonismo frente a Lm/400.
Observación microscópica (tinción Gram) para verificar pureza del cultivo durante el
proceso
FIGURA 7 Efecto del reemplazo del extracto de levadura en el medio MRS por agua de
levadura (AL) en distintas concentraciones.
Los resultados obtenidos con agua de levadura de alguna manera se relacionan con lo
que señalan SHULER y KARGI (2002), sobre la conveniencia de utilizar subproductos,
derivados de procesos productivos y de desecho. El agua de levadura se obtuvo a
partir de crema de levadura, producto intermedio del proceso de elaboración de
levaduras de panificación, este le proporcionó al medio sales minerales, vitaminas y
factores de crecimiento en reemplazo del extracto de levadura ingrediente
convencional del medio MRS. Llama la atención que a menores niveles de agua de
30
levadura se observan mejores resultados, lo que puede inferir que excesos pueden ser
inhibitorios de la STB.
Además, en la FIGURA 8 se puede observar que las dos formulaciones que presentan
la combinación melaza – sacarosa, en diferentes concentraciones, favorecen un
ambiente estresado nutricionalmente y a la vez una mayor producción de la STB
debido posiblemente a una menor presencia de monosacáridos.
Existen diversos estudios que concuerdan con los resultados obtenidos en la presente
investigación, es así como LEROY et al., (2006) obtuvieron mayor actividad inhibitoria
de una bacteriocina de Lactobacillus amylovorus DCE 471 al usar fuentes de carbono
compuestas por combinaciones de azúcares. Por otra parte, TODOROV y DICKS,
31
En cambio ZENDO et al., (2005), al modificar la fuente de carbono por sacarosa y otros
azúcares en el medio MRS no obtuvieron diferencias significativas en la producción de
una STB por Enterococcus mundtii QU2, lo cual no es concordante con los resultados
obtenidos en esta investigación.
Por otra parte, PAYKOV et al., (2008), utilizando las mismas tres cepas de
Enterococcus y estudiar el efecto de concentraciones crecientes de diversos azucares,
encontraron que concentraciones superiores a 3% resultaban inhibitorias para la
producción de STB, resultados similares se obtuvieron en la presente investigación, por
cuanto con niveles menores al 2% y superiores al 3% de azúcares disminuye la
producción de STB.
Los resultados al reemplazar las fuentes de nitrógeno por extractos de harina de lupino
y de harina de pescado (FIGURA 9) en diferentes proporciones, muestran que dicho
reemplazo no es tan efectivo como el medio MRS en la producción de la STB con la
cepa BAL-C. Se puede apreciar, por lo tanto, que ninguna de las tres formulaciones
lograron ser mejor que los ingredientes testigos, extracto de carne y proteosa peptona,
del caldo MRS. Es importante señalar que dentro de las formulaciones probadas la que
genera una mayor actividad inhibitoria corresponde a la que presentó las más bajas
concentraciones de los extractos alternativos (harina de lupino y harina de pescado).
Con respecto a los resultados obtenidos en las pruebas a nivel de matraces para
determinar la mejor concentración de proteínas para un medio alternativo SHULER y
KARGI (2002) y SAHM (1993) señalan que, para el normal crecimiento de una bacteria
es necesaria una fuente de nitrógeno para proveerle de los aminoácidos necesarios
para su estructura y otras funcione celulares.
32
Los resultados obtenidos muestran que las fuentes de proteínas utilizadas no fueron
las adecuadas debido, probablemente, a su gran estructura molecular, que produjo que
la cepa BAL-C fuera incapaz de utilizar estas fuentes para sintetizar la STB como si lo
hizo con MRS, medio que dispone de aminoácidos libres y péptidos de estructura más
simple y accesible a la bacteria para sintetizar debidamente la STB.
Es así como, VASQUEZ et al., (2007) estudiaron el efecto del reemplazo de las
fuentes proteicas en los medios MRS, APT y TGE por peptonas de origen marino
obtenidas a partir de vísceras hidrolizadas con diferentes enzimas, y la producción de
STB a partir de BAL, concluyendo que se obtienen mejores resultados con los
extractos hidrolizados.
Del análisis anterior se puede señalar que el uso de extractos proteicos hidrolizados
debido a la presencia de aminoácidos libres facilita la producción de la STB a partir de
una cepa láctica.
Para este cultivo se utilizaron las formulaciones parciales que obtuvieron los mejores
resultados en cada uno de los ensayos en matraces, trabajado con formulación de
agua de levadura que presento altos niveles de actividad inhibitoria, otro componente
fue mezcla de melaza y sacarosa que proporcionaron niveles más altos de actividad
inhibitoria que el medio testigo, para la mezcla de extracto de harina de lupino y
extracto de harina de pescado se utiliza aquella que presento los mejores niveles de
actividad proporcionados entre estas formulaciones, ya que no se lograron obtener
niveles de actividad superiores a las proporcionadas por el medio testigo.
1,00E+10 18
1,00E+09 16
1,00E+08
14
1,00E+07
12
1,00E+06
Consumo
NaOH 4N
10
UFC/mL
1,00E+05
8
1,00E+04
6
1,00E+03
UFC/mL 4
1,00E+02
Consumo NaOH 2
1,00E+01
1,00E+00 0
0 6 12 18 22 26 30 36 42 48
Tiempo (h)
La FIGURA 11, también permite apreciar que la STB producida por la cepa BAL-C es
un metabolito primario, puesto que la producción de esta sustancia se observa sólo a
partir de la hora 6 cuando se logra el máximo crecimiento y hasta la hora 22, cuando el
cultivo se encuentra en evidente fase exponencial. Posteriormente, a partir de la hora
36 se produce un descenso en el recuento de células viables, con lo cual se inicia la
fase de muerte, con la consecuente liberación de toxinas, proteasas y otras enzimas
líticas, lo que probablemente conduce a la pérdida de actividad de la STB entre las 42
y 48 horas.
VINCENT et al. (1998), señalan que el caldo MRS es el mejor medio de cultivo para
Enterococcus spp. y E. faecium para la producción de la bacteriocinas; estos autores,
adicionando un 0,5 % peso/volumen de glucosa y suprimiendo la presencia de una de
las tres fuentes de nitrógeno presentes en el MRS (extracto de levadura, extracto de
carne y proteosa peptona) no se produce STB y no se presenta crecimiento de la cepa,
como era de esperar.
Todos estos factores que pudieron haber afectado el nivel de estrés en el medio.
4.2.1 Consumo de glucosa durante el cultivo por parte de la BAL-C. Debido a que
la mezcla de melaza y sacarosa usada como fuente de carbono en el minifermentador,
contiene una incierta cantidad de azúcares, se aplicó el Gluco test (GOD-PAP) al
medio y a las muestras extraídas, luego de haber sido tratadas con HCl (20 uL
HClfumante/mL de muestra) y llevadas a ebullición por 10 min, ello para poder determinar
el uso de la fuente de carbono por parte de la BAL C.
5. CONCLUSIONES
Para la reemplazo del extracto de levadura del medio MRS por agua de levadura, se
obtuvieron valores de actividad inhibitoria frente a L. monocytogenes 4/00 de 51.200
UA/mL para la fórmula de un 10% de agua de levadura (F3), valor que analizado en
contraste con las otras dos formulaciones y el testigo arrojó un valor promedio de 4,00
(prueba de Friedman), superando al testigo MRS.
37
38
6. BIBLIOGRAFIA
BATT, C.A. 2000. Listeria. En: ROBINSON, R.K.; BATT, C.A. y PATEL, P.D. (eds.)
Encyclopedia of Food Microbiology. pp: 1197-1198.
CINTAS, L.M., CAUSAUS, M.P., HERRANZ, C., NES, L.F. y HERNANDEZ, P.E., 2001.
Review: bacteriocins of lactic acid bacteria. Food science technology. 7(4): 281-
305.
GRAVESEN, A.; JYDEGAARD AXELSE, A.M.; MENDES DA SILVA, J.; HANSEN, T.B
y KNOCHEL, S. 2002. Frecuency of Bacteriocins Resistance Development and
Associated Fitness Cost in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental
Microbiology 68 (2): 756-764.
GRAVESEN, A.; RAMNATH, M.; RECHINGER, B.; ANDERSEN, N.; JANSCH, L.;
HÈCHARD. Y.; HASTING, J.W. y KNOCHEL, S. 2002. High-level resistance to
class lla bacteriocins is associated with one general mechanism in Listeria
monocytogenes. Microbiology 148:2361-2369.
JAY, J. 2000. Microbiología moderna de los Alimentos. Editorial Acribia, S.A. España.
804 p.
NILSSON, L., NIELSEN, M., NG, Y y GRAM, L., 2002. Role of acetate in production of
an autoinducible Class IIa bateriocin in Carnobacterium piscícola A9b. Applied
and Enviromental Microbiology. 68(5): 2251 – 2260.
PRESCOTT, S.C. y DUNN, C.G. 1952. Microbiología industrial. Madrid: Aguilar. 950 p.
ANEXOS
42
ANEXO 1
Sulfato de magnesio
(*) 0,05 g 0,05 g 0,05 g
Sulfato de
manganeso (*)
Tampón fosfato de potasio pH 7,0. Utilizando un volumen que complete los 50 mL.
ANEXO 2
Sulfato de magnesio
(*) 0,05 g 0,05 g 0,05 g
Sulfato de
manganeso (*)
ANEXO 3
Dextrosa 1g 1g 1g
Sulfato de
magnesio (*) 0,05 g 0,05 g 0,05 g
Sulfato de
manganeso (*)
ANEXO 4
10% de agua de
Extracto de levadura levadura y 90% de
tampón fosfato.
(10% AL)
20 g/L de melaza,
Dextrosa
- -
10 g/L de sacarosa
(F5)
Sulfato de magnesio
(*) 0,05 g 0,05 g 0,05 g
Sulfato de
manganeso (*)
ANEXO 5
Principio.
Equipos y materiales.
- espectrofotómetro
Determinación.
ANEXO 6
Curva estándar.
- Medir de la solución de BSA 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µl (20, 40, 60, 80, 100 y 120 µg
de proteína) en tubos de ensayo, agregar agua hasta completar 0,6 ml.
ANEXO 7
ANEXO 8
Rangos
Rango
promedio
TESTIGO 2, 00
F4 1, 83
F5 3, 50
F6 2, 67
52
ANEXO 9
ANEXO 10