Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Ingeniería en Alimentos

Reducción del uso del Antifúngico Natamicina

en la Elaboración del Queso Tipo Gauda

Memoria presentada como parte de los

requisitos para optar al título de
Ingeniero en Alimentos

Ariel Alexis Sáez Rodríguez

Valdivia – Chile
2017
PROFESOR PATROCINANTE:

____________________________________
Sr. Bernardo Carrillo López
Ingeniero Agrónomo, Master en Ciencias e
Ingeniería de los Alimentos
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias

PROFESORES INFORMANTES:

____________________________________
Sr. Ociel Muñoz Fariña
Bioquímico, Doctor en Ciencias Químicas
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias

___________________________________
Sra. Sandra Jofré Navarrete
Jefe Desarrollo de Productos
Prolesur S.A.
 AGRADECIMIENTOS

En primera instancia agradezco a mis padres por la paciencia, el amor incondicional, el

apoyo y la confianza durante mi desarrollo personal y profesional.

Doy gracias al profesor Bernardo Carrillo por su dedicación como tutor, además de
haber sido un importante consejero y guía durante toda mi formación como profesional.

También dar las gracias a mi casa de estudio y a la industria donde realice mi memoria
de título, y a todas aquellas personas que me facilitaron ayuda y conocimientos para
realizar éste trabajo.

Finalmente agradecer a todos aquellos que estuvieron presentes, aportando a la

realización de esta memoria de título.
 i

ÍNDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1 INTRODUCCIÓN 3

1.1 Características del queso tipo gauda 3

1.2 Factores que determinan la maduración del queso 3

1.2.1 Crecimiento de microorganismos sobre la superficie del queso 4

1.2.2 Hongos y levaduras en el queso 5

1.3 Control de micotoxinas en el queso 6

1.4 Natamicina 7

1.4.1 Uso y aplicación del antifúngico 9

1.4.2 Límite máximo permitido 9

1.4.3 Estructura de la natamicina 10

1.5 Natamicina como antibiótico polieno 11

1.5.1 Resistencia de los polienos 12

2 MATERIAL Y MÉTODO 14

2.1 Lugar de estudio 14

2.2 Materias primas 14

 ii

2.3 Ensayos con discos de inhibición 14

2.4 Análisis microbiológicos realizados en el estudio 15

2.4.1 Metodología para el análisis de hongos, levaduras y enterobacterias 15

2.4.2 Criterios microbiológicos para enterobacterias 16

2.4.3 Muestreo en diferentes zonas de proceso 17

2.5 Diseño experimental 18

2.6 Análisis microbiológicos en la pasteurización del remanente de la 19

solución antifúngica

2.7 Análisis de la concentración de natamicina (compuesto activo) 19

2.8 Análisis estadísticos 19

3 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 20

3.1 Prueba de inhibición del hongo del género Penicillium spp frente a la 20
acción de la natamicina

3.2 Análisis microbiológicos en diferentes zonas de elaboración de 22

queso gauda

3.2.1 Recuento de cepas fúngicas en diferentes zonas de proceso 23

3.2.2 Recuento de levaduras en diferentes zonas de proceso 23

3.2.3 Recuento de enterobacterias en diferentes zonas de proceso 25

3.3 Recuento de hongos, levaduras y enterobacterias en la superficie 26

del queso gauda durante la maduración

3.3.1 Recuento de hongos en la superficie del queso durante la 27

maduración
 iii

3.3.2 Recuento de levaduras en la superficie del queso durante la 27

maduración

3.3.3 Recuento de enterobacterias en la superficie del queso durante la 29

maduración

3.4 Pasteurización del remanente de la solución de NATAMAX 30

3.4.1 Concentración de natamicina en la solución pasteurizada 31

3.5 Concentración de natamicina inicial y final de la solución antifúngica 32

utilizada durante la producción diaria

3.6 Concentración de natamicina en la elaboración de queso gauda 34

4 CONCLUSIONES 36

5 BIBLIOGRAFÍA 37

ANEXOS 44
 iv

ËNDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Concentración del compuesto activo natamicina en la solución 32

remanente antifúngica NATAMAX

2 Concentración de la solución antifúngica al inicio y luego de ser 33

utilizada

3 Concentración de natamicina en la superficie del queso gauda en 34

diferentes días de maduración

4 Concentración de natamicina a 5 mm de profundidad del queso 35

gauda en diferentes días de maduración
 v

ËNDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Estructura química del antibiótico polieno natamicina o pimaricina 11

2 Muestreo en diferentes zonas de elaboración del queso tipo gauda 17

3 Concentraciones utilizadas en los diferentes tratamientos sobre la 18

superficie del queso gauda

4 Halo de inhibición promedio usando el antifúngico natamicina frente al 20

hongo del género Penicillium spp

5 Recuento de hongos en las diferentes zonas de elaboración del queso 22

gauda, durante el uso diario del antifúngico

6 Recuento de levaduras en las diferentes zonas de elaboración del 24

queso gauda, durante el uso diario del antifúngico

7 Recuento de enterobacterias en las diferentes zonas de elaboración 25

del queso gauda, durante el uso diario del antifúngico

8 Recuento de levaduras durante la maduración del queso gauda 28

utilizando diferentes tratamientos a 0, 1000, 2000 y 4000 mg L -1 de la
solución fungistática

9 Recuento de enterobacterias durante la maduración del queso gauda 29

utilizando diferentes tratamientos a 0, 1000, 2000 y 4000 mg L -1 de la
solución fungistática

10 Recuento de microorganismos antes y después de la pasteurización a 31

80°C por 15 segundos del remanente antifúngico
 vi

ËNDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Características del compuesto antifúngico NATAMAX 45

2 Diseño experimental utilizado para analizar la presencia de hongos, 46

levaduras y enterobacterias

3 Concentraciones de NATAMAX durante el antibiograma del antifúngico 46

4 Pesaje del compuesto NATAMAX a diferentes concentraciones 47

5 Diámetros del halo de inhibición, obtenidos al usar diferentes 47

concentraciones del fungicida

6 Antibiograma realizado con natamicina frente al hongo del género 48

Penicillium spp

7 Análisis de varianza ANOVA para la formación del halo de inhibición, 49

usando diferentes concentraciones del antifúngico natamicina

8 Recuento de hongos en diferentes zonas de proceso durante el uso de 50

la solución antifúngica (inicio, intermedio y final)

9 Análisis de varianza ANOVA para la presencia de hongos en 52

diferentes zonas de proceso, durante el uso diario de la solución
antifúngica

10 Recuento de levaduras en diferentes zonas de proceso durante el uso 53

de la solución antifúngica (inicio, intermedio y final)

11 Análisis de varianza ANOVA para la presencia de levaduras en 55

diferentes zonas de proceso, durante el uso diario de la solución
antifúngica

12 Recuento de enterobacterias en diferentes zonas de proceso durante 56

el uso de la solución antifúngica (inicio, intermedio y final)
 vii

13 Análisis de varianza ANOVA para la presencia de enterobacterias en 58

diferentes zonas de proceso, durante el uso diario de la solución
antifúngica

14 Recuento de hongos durante 16 días de maduración en la superficie 59

del queso tipo gauda a diferentes concentraciones de la solución
antifúngica

15 Recuento de levaduras durante 16 días de maduración en la superficie 62

del queso tipo gauda a diferentes concentraciones de la solución
antifúngica

16 Análisis de varianza ANOVA para el recuento de levaduras durante 16 65

días de maduración utilizando diferentes concentraciones de la
solución antifúngica

17 Recuento de enterobacterias durante 16 días de maduración en la 66

superficie del queso tipo gauda a diferentes concentraciones de la
solución antifúngica

18 Análisis de varianza ANOVA para el recuento de enterobacterias 69

durante 16 días de maduración utilizando diferentes concentraciones
de la solución antifúngica

19 Concentraciones de natamicina en salmuera, superficie y profundidad 70

del queso tipo gauda
 1

RESUMEN

En el presente estudio se evaluó el efecto de la natamicina (NATAMAX), sobre la

presencia de hongos y levaduras en la superficie del queso tipo gauda elaborado por
una industria de la Región de Los Ríos, durante un periodo de maduración de 16 días
en condiciones controladas, utilizando diferentes concentraciones de la solución
antifúngica, mediante un tratamiento control de la solución y en diversas
concentraciones (1000, 2000 y 4000 mg L-1).

Con el fin de establecer la concentración mínima inhibitoria se realizó una prueba de

difusión en agar, utilizando concentraciones de 500, 1000, 1500, 2000 y 4000 mg L-1 de
la solución antifúngica. Estos presentaron halos de inhibición mayores a 16 mm de
diámetro frente al hongo del género Penicillium spp, incluso al utilizar la concentración
más baja (500 mg L-1), de la solución antifúngica, lográndose obtener la inhibición del
hongo frente al antifúngico natamicina.

La propuesta de la industria fue disminuir la concentración de la solución fungistática

de 4000 a 2000 mg L-1; mostrando esta última también un resultado eficaz frente a la
presencia de hongos y levaduras, también resultó eficaz al utilizarse una de las
concentraciones más bajas (1000 mg L-1), durante la maduración de los quesos al cabo
de los 16 días. Por lo tanto, los tratamientos utilizados resultaron ser eficaces para
evitar el crecimiento de hongos en la superficie del queso. En el caso de las levaduras,
estas disminuyeron durante la maduración del mismo, debido a que deben estar
expuestas al compuesto activo de la solución durante un tiempo más prolongado.
 2

SUMMARY

In the present study was evaluated the effect of natamycin (NATAMAX), about the
presence of fungi and yeasts on the surface of the cheese gouda elaborated by an
industry of the Region of Los Ríos, during a ripening period of 16 days under controlled
conditions, using different concentrations of the antifungal solution, through a treatment
control of the solution and various concentrations (1000, 2000 and 4000 mg L-1).

In order to establish the minimum inhibitory concentration, it was used an agar diffusion
test, using concentrations of 500, 1000, 1500, 2000 and 4000 mg L-1 of the antifungal
solution. These presented inhibition halos greater to 16 mm of diameter against the
fungi of the genus Penicillium spp, include using the lowest concentration (500 mg L-1),
of the antifungal solution, getting obtain the inhibition of the fungal in front of the
antifungal natamycin.

The industry proposal was to decrease the concentration of the fungistatic solution from
4000 to 2000 mg L-1; the latter also showing an effective result against the presence of
fungi and yeasts, was also effective in using one of the lowest concentrations (1000 mg
L-1), during ripening of cheeses after 16 days. Therefore, the treatments used proved to
be effective in preventing the growth of fungi on the cheese surface. In the case of
yeasts, these decreased during maturation of the same, because they must be exposed
to the active compound of the solution for a prolonged time.
 3

1INTRODUCCIÓN

El queso se presenta en diferentes formatos al consumidor; este debe ser inocuo para
el consumo humano, y debe conservar sus características fisicoquímicas a través de
su vida útil. La elaboración de quesos se ve afectada por hongos, y el uso de
antifúngicos tiene el objetivo de extender la vida útil del producto. REPS et al. (2002a),
mencionan que los conservantes más utilizados en la industria de los alimentos son el
sorbato de potasio y la natamicina, utilizándose en diferentes concentraciones. Estos
fungicidas actúan destruyendo las hifas y esporas de los mohos. El uso del sorbato de
potasio afecta las características organolépticas del queso, puesto que difunde en éste,
en cambio la natamicina permanece mayormente en la superficie del queso además,
se utiliza en bajas concentraciones.

1.1 Características del queso tipo gauda

Para el queso tipo gauda FOX et al. (2004), describen que la leche debe ser de vaca
pasteurizada, y descremada parcialmente (40% materia grasa en la materia seca del
queso). La cuajada se formará por la adición de un cuajo, uso de cepas mixtas; el
contenido del agua debe estar por debajo de los 63%; con el prensado se debe obtener
una corteza cerrada, salazón en salmuera, acidificación (que permite dar textura a la
cuajada), y durante la maduración debe presentar una proteólisis significativa.

Por su parte, la norma NCh 2478 (1999), establece que el queso gauda es un queso
madurado, sin cáscara, que se elabora con leche de vaca. Se obtiene por la
coagulación enzimática ayudado por la acidez que se desarrolla por los cultivos
lácticos que se agregan a la mezcla. La maduración de este tipo de queso es durante
un mínimo de 15 días en condiciones controladas (CHILE, INSTITUTO NACIONAL DE
NORMALIZACIÓN, INN, 1999a).

1.2 Factores que determinan la maduración del queso

El CÓDEX ALIMENTARIUS (2011a), menciona que el queso sometido a maduración

no está listo para el consumo humano, poco después de la fabricación, ya que se debe
mantener un determinado tiempo en condiciones controladas, para que se produzcan
los cambios necesarios en el queso.
 4

Durante la maduración el queso sufre cambios microbiológicos, bioquímicos y físicos,

como la fermentación de la lactosa, degradación de la proteína y la grasa. La
maduración dependerá del tipo de queso que se quiere elaborar, ya sea queso de tipo
duro, semiduro o blando (GÖSTA, 2003).

HERNÁNDEZ (2003), plantea que durante la maduración del queso, este sufre
modificaciones esenciales, como la hidrolisis de la lactosa, formación de ácido láctico,
lisis de proteínas y la grasa. Durante su almacenamiento la temperatura de la cámara
debe variar entre 2 °C y 16 °C; además, la humedad relativa debe oscilar entre 75% y
90%. Los principales microorganismos involucrados en la maduración son las bacterias
lácticas, donde el producto principal es el ácido láctico y compuestos aromáticos, y
proteasas que transforman la caseína en péptidos. Las bacterias propiónicas forman
ácido propiónico, succinato, prolina, ácidos grasos volátiles y dióxido de carbono (CO 2).
McSWEENEY (2004), establece que el lactato es producido a partir de la lactosa, un
sustrato importante para las reacciones que se produzcan en la maduración; la
proteólisis ayuda a la textura del queso, hidrolizando la caseína en la cuajada,
disminuyendo la actividad de agua, y durante la lipólisis, se hidrolizan los triglicérido
por las lipasas, liberando ácidos grasos durante la maduración.

Las proteínas que sufren lisis por enzimas son las caseínas αs1, αs2 y β-caseína y los
polipéptidos del cuajo residual. La caseína se trasforma en péptidos, luego en péptidos
más pequeños y aminoácidos que darán origen a la formación de CO 2, aminas, NH3,
aldehídos, alcoholes o ácidos primarios. De la lipolisis se obtendrá la liberación de
ácidos grasos libres, con la oxidación resultarán β-cetoácidos, sufriendo
descarboxilación, que luego se producen metil cetonas y alcoholes secundarios, dando
lugar a aromas y sabores (CABALLERO et al., 2003).

1.2.1. Crecimiento de microorganismo sobre la superficie del queso. Los factores

que controlan el crecimiento de microorganismos en los quesos, son debidamente
establecidos por la actividad de agua, concentración de sal, potencial oxido-reducción,
pH, nitratos, temperatura de maduración, presencia o ausencia de bacteriocinas.
 5

Además, otros compuestos que se producen en la maduración inhiben el crecimiento

de microorganismos (FOX et al., 2000).

PINTADO et al. (2010), dan a conocer que el queso es fácilmente contaminado en la

superficie por microorganismos indeseables, y los principales microorganismos que
cambian la apariencia visual del queso es la Yarrowia lipolytica, Pseudomonas
aeruginosa y Penicillium spp. Pero también los hay patógenos como la Listeria
monocytogenes. Las bacterias psicrótrofas Pseudomonas spp, son las que predominan
en la microflora de la leche cruda. La levadura Y. lipolytica y la bacteria Ps. aeruginosa
son asociadas a la reacción indeseables del dorado en la superficie del queso.
Penicillium spp., es el género de los hongos más frecuentes, que además pueden
contener cepas micotoxigénicas. Los microorganismos mencionados son de
características psicrótrofas, por lo tanto aumentan su crecimiento en frío.

Tal como mencionan LUCERA et al. (2012), algunos microorganismos pueden causar
enfermedades trasmitidas por los alimentos por microorganismos patógenos como
Listeria monocytogenes, E. coli O157, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, Campylobacter, Clostridium perfringens, Aspergillus niger y Saccharomyces
cerevisiae. Se ven afectados por el pH de los alimentos, presencia de oxígeno o
factores extrínsecos como las condiciones de almacenamiento (temperatura, tiempo y
humedad relativa).

1.2.2 Hongos y levaduras en el queso. El Ministerio de Agricultura y Ganadería con

el Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura de Paraguay (MAG/IIAC,
2001), estipulan que los hongos son multicelulares y forman estructuras ramificadas
conocidas como micelios, pues son un conjunto de hifas que constituyen a los hongos.
Además, algunos hongos liberan micotoxinas que son perjudiciales para la salud. La
microbiota de la maduración de los quesos es formada por hongos. En algunos casos
los hongos se utilizan para la formación de diferentes tipos de quesos, modificando
textura, gusto y aroma.
 6

Como expresan FOX et al (2017a), las levaduras son de consistencia blanda, redondas
o en forma de pera, mientras que la del hongo es más rígida, grandes, presentan
diferentes colores y presenta una red micelial de hifas filamentosas. Ambos se
clasifican como hongos y se dividen en tres grupos, Ascomimycetes (producen
ascoesporas), Zygomycetes y Deuteromycetes (producen conidias y esporangióforos).
La reproducción de las levaduras forma una brotación formando una protuberancia en
la pared de la célula, rompiéndose, y formará más brotación. Las hifas crecen
considerablemente, luego se detiene y forma los septos trasversales, para separar las
hifas en compartimientos cortos, fragmentándose en conidios separados. También da a
conocer que Geotrichum candidum (Oospora lactis) es conocido como el hongo de
productos lácteos.

HERNÁNDEZ (2003), menciona que las levaduras generan compuestos aromáticos a

partir del lactato, poseen enzimas proteolíticas y lipolíticas modificando el aroma y el
sabor del queso. Las levaduras más frecuentes en la maduración del queso son las del
género kluyveromyces, Debaromyces, Saccharomyces y Torulopsis. Y los hongos más
frecuentes son del género Penicillum spp. Además, como expresan HYMERY et al
(2014a), los hongos del género Aspergillus, Cladosporium, Geotrichum, Mucor y
Trichoderma también son importantes por su crecimiento en los quesos.

1.3 Control de micotoxinas en el queso

Como señalan HYMERY et al. (2014b), algunas especies fúngicas producen

micotoxinas y se presentan en el queso, como la ocratoxina A y la aflatoxina M 1. Los
hongos del género Penicillium spp, Aspergillus spp y Fusarium spp, son los principales
productores de micotoxinas. Las cuales son clasificadas como metabolitos
secundarios, ya que no son esenciales para el crecimiento fúngico. La contaminación
puede ser directa desde el queso, crecimiento intencional o accidental, también puede
ser indirecta, desde la leche al queso, por contaminación del alimento que ingiere el
animal. El queso se considera que es susceptible al crecimiento de hongos, y por lo
tanto, a la posible presencia de micotoxinas. Estudios mencionan que el queso es un
medio favorable para el crecimiento de los hongos, pero no para los hongos
 7

productores de micotoxinas. Además, el queso es un sustrato pobre para la producción

de micotoxinas si se almacena a bajas temperaturas (5 a 7 °C). El control debe ser
abordado, evitando las micotoxinas en la leche, durante la producción, almacenamiento
y respectivo consumo. La natamicina retarda el crecimiento de hongos, por lo tanto
evita las micotoxinas.

SENGUN et al. (2008), establecen que el queso es un buen sustrato para el

crecimiento de hongos, siendo más predominante el género Penicillium spp., el cual
produce cambios indeseables, afectando la calidad del producto. Las micotoxinas más
estables en el queso son las critinina, penitrem A, roquefortina C, esterigmatocistina y
la aflatoxina. La patulina tiene baja toxicidad oral y además no persiste en el queso. En
cambio la más preocupante es la esterigmatocistina por ser cancerígena. Cabe señalar
que la producción de micotoxinas en alimentos puede verse afectada por diferentes
factores, como la temperatura, actividad de agua, el sustrato del alimento, el tipo de
cepa, oxígeno, conservantes y las interacciones microbianas. Las aflatoxinas se
producen por el hongo Aspergillus flavus y A. parasiticus, y producen AFB1, AFB2,
AFG1 y AFG2. La que se presenta generalmente con mayor concentración es la AFB1,
precursora de la aflatoxina M1, y AFB2 en AFM2. Se da a conocer que el queso no es
un buen sustrato para la producción de micotoxinas, debido a su bajo contenido de
carbohidratos, necesarios para producir este tipo de toxinas, más aun si se madura a
bajas temperaturas. FOX et al. (2017b), sostienen que los hongos del género
Aspergillus spp., involucrados en el queso no producen toxinas, pues las condiciones
fisiológicas para su producción no son favorables para la presencia de toxinas en el
queso.

Por su parte el Reglamento Sanitario de los Alimentos, declara los límites máximos de
micotoxinas presentes en los alimentos para la leche, la aflatoxina M1 no debe exceder
los 0,5 μg L-1 (CHILE, MINISTERIO DE SALUD, 2017a).

1.4 Natamicina

La pimaricina o también llamada natamicina es producida por la fermentación de la

bacteria Streptomyces natalensis, y se usa en varios países como conservador contra
 8

los hongos y levaduras. Su uso es de hasta 100 mg kg-1 en la elaboración de quesos.

La acción principal es inhibir la síntesis de proteínas, inhibir alteraciones enzimáticas y
actuar en la permeabilidad celular de la membrana fúngica de los antibióticos polienos
(BADUI, 2006).

La comisión del Códex Alimentarius, establecido por la Organización de las Naciones

Unidas para la Alimentación y la Agricultura en conjunto con la Organización Mundial
de la Salud (CODEX ALIMENTARIUS, 2000), menciona que la natamicina es un
polieno macrólido (posee un anillo de lactona) fúngico, contra levaduras y mohos, sin
efecto en las bacterias; siendo eficaz en concentraciones muy bajas, entre los 3 y 10
mg kg-1 de producto terminado. Es ligeramente soluble en agua, por lo tanto
permanece en la superficie de los alimentos, evitando la proliferación de hongos. Su
aplicación en quesos es superficial, ya sea mediante rociado, baño con una suspensión
acuosa o aplicarse como parte del recubrimiento del queso con una emulsión. Su
eficacia se puede prolongar por más de 3 meses en el queso, según las condiciones de
almacenamiento.

OLLÉ RESA et al. (2014), manifiestan que los alimentos son propensos al deterioro
durante su almacenamiento y distribución. La adición de antifúngicos reduce o impide
el crecimiento de microorganismos patógenos o de deterioro. La natamicina es
aplicada en productos lácteos previniendo la contaminación por hongos y levaduras.
Además da a conocer que los antifúngicos pueden presentar una pérdida de actividad
debida a la reducción del compuesto activo, dada por la interacción con otros aditivos o
componentes presentes en la matriz alimentaria. Con el objetivo de reducir la velocidad
de difusión, se recomienda incorporar el antimicótico en películas comestibles
manteniendo el ingrediente activo en su concentración inicial. También agrega que las
levaduras más comunes son organismos anaeróbicos facultativos, Saccharomyces
spp., y Zygosacchoromyce spp. La cepa Yarrowia lipolytica es frecuentemente
encontradas en los quesos, pero la incapacidad para sobrevivir en condiciones
anaeróbicas permite su fácil eliminación. DZIGBORDI et al. (2013), destacan que las
levaduras son la principal causa de deterioro, debido a los bajos pH, actividad de agua,
temperatura y de la capacidad para asimilar azúcares, lactosa y ácidos orgánicos. En
 9

algunos casos la resistencia a los conservantes podría ser la causa de que

permanezcan en los productos. Por lo tanto, en ausencia de la incorporación de
natamicina se produce un aumento de levaduras, tampoco muestra una reducción
inicial al incorporar este antifúngico, pero sí a lo largo del almacenamiento.

1.4.1 Uso y aplicación del antifúngico. Como señalan DAVIDSON et al. (2005), el
crecimiento de los hongos en la superficie de los quesos es un factor importante que
limita la vida útil del producto. En la cámara de maduración las temperaturas óptimas
deben fluctuar entre los 10 a 12°C, por lo tanto los hongos son muy susceptibles a su
proliferación y crecimiento.

Hay varias formas de aplicar el fungicida, ya sea por pulverización, pintura, inmersión o
adición en un revestimiento. Al añadir natamicina por inmersión, se recomienda añadir
10% de sal a la solución. Se demostró con un estudio realizado en cromatografía de
alta resolución (HPLC), que la natamicina no produce cambios organolépticos en el
queso, en comparación del sorbato de potasio. Además, la profundidad que alcanza la
natamicina dependerá de la concentración inicial añadida, tiempo y temperatura de
almacenamiento, como también el tipo queso.

REPS et al. (2002b), consideran que la concentración de natamicina en la superficie

depende del tipo de queso, rendimiento de la corteza y el método de aplicación de la
solución antifúngica. Además, sostienen que ésta se inactiva a las cuatro semanas de
maduración del queso. También enfatizan que el antifúngico se puede aplicar por
inmersión del queso o remojando las bolsas retráctil, evitando el crecimiento de
hongos, incluso cuando el revestimiento es dañado.

1.4.2 Límite máximo permitido. El Reglamento Sanitario de los Alimentos (CHILE,

MINISTERIO DE SALUD, 2017), considera que el límite máximo de natamicina
equivale a las buenas prácticas de fabricación (BPF), establecidas en el Codex
Alimentarius, y de aplicación externa en los quesos duros, al respecto el CODEX
ALIMENTARIUS (2011b), recomienda un límite máximo de natamicina de 2 mg dm-2 en
la superficie del queso, y debe estar ausente a los 5 mm de profundidad, utilizado para
 10

el tratamiento de la superficie, y también se usa como conservante de alimentos

rebanados, cortados, desmenuzados y rallados, con una concentración máxima de 20
mg kg-1 aplicado en la superficie, amasado y estirado de los alimentos, según la Food
and Drug Administration (FDA, 2014b). El Reglamento de la Comisión Europea señala
que el uso de la natamicina es un tratamiento en superficie para quesos duros,
semiduros y semiblandos, y el límite máximo permitido es de 1 mg dm -2 sobre la
superficie y debe estar ausente a la profundidad de 5 mm (DIARIO OFICIAL DE LA
UNIÓN EUROPEA, 2011)

El Comité Mixto de Expertos en Aditivos Alimentarios JECFA (2002), establece que la

IDA (ingesta diaria admisible) para la natamicina es de 0 a 0,3 mg kg-1 por peso
corporal, y no se esperaría que la ingesta sea mayor a la ingesta diaria permitida,
según el estudio realizado en quesos, utilizando una concentración de natamicina a 40
mg kg-1 en el producto.
Las levaduras gastrointestinales son aproximadamente de 105 UFC/g en un individuo
sano, como éstas se encuentran en baja cantidad, las consecuencias en trazas de
natamicina serían mínimas, sin resistencia adquirida.

1.4.3 Estructura de la natamicina. Según lo señalado por APARICIO et al. (2016a),

la conformación del polieno pimaricina o natamicina está dada por un anillo de
macrolactona de 26 miembros con cuatro enlaces dobles conjugados. La característica
esencial es la presencia de un grupo epóxido, en el carbono 4 y 5 (C-4 y C-5), que se
origina a partir de dobles enlaces. Este antifúngico es anfipático, pues el cromóforo
tiene una región lipófila e hidrófila. De ahí que los polienos tienen la particularidad de
interactuar con las partes hidrófobas de los esteroles con el esterol de la membrana.
De acuerdo con lo señalado por KARALOMLU et al. (2017), es un antibiótico tetraeno
debido a sus cuatro dobles enlaces conjugados. La natamicina tiene una masa molar
de 665,73 g mol-1, y la solubilidad es de 20 a 50 mg L-1 de agua, estable a los alimentos
que se encuentran en un pH entre 5 y 9, y la forma molecular es de C33H47NO13 (Figura
1).
 11

Figura 1 Estructura química del antibiótico polieno natamicina o pimaricina

Fuente: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria EFSA (2009)

La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, EFSA, (2017), sostiene que la

natamicina tiene una cadena lipófila rígida que contiene doble enlaces conjugados y
una porción hidrófila flexible, que contiene grupos hidroxilos. La región hidrófoba de los
antifúngicos polienos se complementa con el ergosterol, permeabilizando la
membrana, por lo tanto los iones pequeños, aminoácidos, y otros metabolitos salen de
la célula fúngica causando la muerte celular.

1.5 Natamicina como antibiótico polieno

De acuerdo con ENRÍQUEZ et al. (2006), de la bacteria Strepromyces natalensis se

obtiene el polieno macrófilo llamado pimaricina o natamicina, este antifúngico es
conocido por tener un anillo tetraeno. Además, es utilizada en el tratamiento de la
queratitis producida por hongos, y en la industria alimentaria, previniendo la
contaminación por mohos en la superficie de los quesos y otros alimentos no estériles.
La eficacia de los antibióticos polienos radica principalmente en la interacción con los
esteroles de la membrana fúngica, provocando alteración de la estructura de la
membrana, en consecuencia conduce a la fuga de material celular.

Este antibiótico es un eficaz agente antimicótico que muestra una amplia inhibición de
la actividad fúngica, principalmente dirigida a los esteroles de la membrana de los
 12

mohos y levaduras. La característica antimicótica no presenta resistencia microbiana,

dado que el objetivo de la natamicina es actuar con el ergosterol de la membrana
fúngica. Además, su uso es en concentraciones muy bajas. Los polienos generalmente
actúan permeabilizando la membrana, formando poros permeables a los iones al
unirse al ergosterol; también se plantea que se formaría una fragmentación de la
membrana y la fuga celular en la membrana fúngica.

Desde los punto de vista de TE WELSCHER et al. (2008), la interacción de los

antibióticos polienos con el ergosterol causan fugas de los componentes esenciales
para la célula, debido a la formación de poros en la membrana, provocando la muerte
celular, bloqueando el crecimiento de los hongos y levaduras. Posteriormente TE
WELSCHER et al. (2010), demostraron que la actividad inhibitoria de la natamicina
dependía de la estructura del ergosterol, permitiendo la unión de ambos, inhibiendo la
fusión y la fisión para la reorganización de los lípidos en la membrana de la vacuola,
principalmente dirigida a la fusión de la membrana unida al ergosterol. La fusión
homotípica de la membrana tiene lugar a tres etapas, el cebado, el acoplamiento y la
fusión dependiendo de proteínas específicas. Resultando la fragmentación de estas
proteínas, por consiguiente, se perturba el reordenamiento como resultado de la unión
con el ergosterol. Por lo tanto, la natamicina actúa afectando las proteínas de trasporte
de la membrana fúngica, pero sin matar la célula fúngica, inhibiendo el crecimiento
celular de hongos y levaduras (TE WELSCHER et al. 2012). También se sostiene que
tiene efecto contra los protozoos, puesto que algunos tienen compuestos derivados del
ergosterol en la membrana, siendo eficaz como agente antiparasitario (APARICIO et
al., 2016b).

1.5.1 Resistencia de los polienos. La natamicina es eficaz contra levaduras y hongos

filamentosos, como Candida spp., Aspergillus spp., Cephalosporium spp., Fusarium
spp. y Penicillium spp., pero es inactiva frente a las bacterias. Es posible que la adición
de los antifúngicos en los alimentos se pueda trasferir a los seres humanos por
diferentes medios, ya sea por animales tratados con estos antifúngicos polienos y/o la
cadena alimentaria del animal. La fijación del ergosterol de la membrana fúngica se
une con el grupo micosamina y el anillo de lactona de los polienos se inserta en la
 13

bicapa lipídica de los hongos. También se expresa que altas concentraciones de

natamicina, puede desencadenar una posible resistencia al polieno. Pero se demostró
que ninguna cepa se volvió resistente a los polienos. La microflora humana residente
es la principal importancia a la resistencia del antifúngico. La transferencia horizontal
de genes (HGT) entre la microflora residente, hongos y levaduras, pueden contribuir a
un aumento de microorganismos resistentes. Los polienos son más eficaces a la
resistencia que los otros antifúngicos (DALHOFF et al., 2015).

Considerando el uso de natamicina en la superficie del queso, y considerando lo

sugerido por la industria en la que se desarrolló la presente Memoria de Título; se
plantea lo siguiente:

Hipótesis

Es factible reducir los niveles actuales del preservante natamicina, manteniendo el

mismo efecto sobre el control de hongos y levaduras.

Objetivo general

Evaluar la reducción de los niveles de natamicina durante el proceso de elaboración de

queso tipo gauda, manteniendo el control sobre el desarrollo y crecimiento de hongos y
levaduras.

Objetivos específicos

 Establecer la concentración mínima inhibitoria del compuesto natamicina a ser

utilizada durante el proceso de elaboración de quesos.

 Analizar la presencia de hongos y levaduras en los quesos sometidos a

diferentes concentraciones de natamicina.

 Evaluar las condiciones para la reutilización de la solución antifúngica residual.

 Medir los niveles de natamicina en los quesos, una vez aplicada la solución
antifúngica durante el proceso.

 Determinar la presencia de enterobacterias en los quesos.

 14

20ATERIAL Y MÉTODO

2.1 Lugar del estudio

El estudio se realizó en una planta láctea, ubicada en la Décimo Cuarta Región de Los
Ríos, comuna de Los Lagos. Los análisis microbiológicos se realizaron en el laboratorio
de la planta. Y la medición de la concentración del compuesto activo natamicina de las
muestras de queso y solución antifúngica se realizaron en el Instituto Nacional de
Tecnología Industrial (INTI-Lácteos), ubicada en Buenos Aires, Argentina.

2.2 Materias primas

Queso gauda elaborado por la planta con concentrado proteico lácteo (CPL) al 4%. El
antifúngico utilizado por el proveedor, DANISCO, Dinamarca, correspondió a la mezcla
de 50% lactosa y 50% de natamicina como compuesto activo (Anexo 1). La lactosa
monohidrato se utiliza como portadores para mejorar la fluidez del compuesto activo,
además las ventajas de su utilización se basa en el perfil de toxicidad, su estabilidad
física y química, la compatibilidad frente a sustancias farmacológicas, amplia
disponibilidad y precios relativamente bajos (RAHIMPOUR y HAMISHEHKAR, 2012).

2.3 Ensayo con discos de inhibición

En los discos de papel filtro se agregó la solución antifúngica en diferentes

concentraciones (500, 1000, 1500, 2000 y 4000 mg L -1), utilizando un volumen de 100
μL, los que fueron depositados en cada papel filtro, Una vez que el hongo del género

Penicillium spp., se inoculó en la placa Petri con un hisopo estéril en agar YGC, se
 15

agregaron los disco de papel filtro impregnados con la solución antifúngica. El ensayo
se realizó por inoculación en superficie (NCh 2047, INN, 1999b). Se midió el diámetro
de la zona de inhibición alrededor de cada disco con un pie de metro, tomando tres
mediciones en diferentes placas

2.4 Análisis microbiológicos realizados en el estudio

Se analizaron diferentes zonas durante el proceso de elaboración del queso, previos a

la inmersión de éste en la solución antifúngica e incluida la última etapa mencionada
para determinar el recuento de microorganismos (tina de salado, pozo de descarga y el
baño de natamicina). La tina de salado es donde los quesos son salados en una
salmuera a 18° bé por 12 horas, el pozo de descarga contiene la misma salmuera, pero
el objetivo de esta etapa es limpiar los quesos de impurezas indeseables y el baño de
la solución antifúngica previene el crecimiento de hongos y levaduras. La obtención de
las muestras microbiológicas fue con tubos Falcon, utilizando hisopos, pipetas
desechables y estériles, además de la utilización de guantes de nitrilo desechable y
alcohol para tomar las muestras en las diferentes etapas de los procesos mencionados
y en la superficie del queso utilizando los diferentes tratamientos de la solución
antifúngica.

2.4.1 Metodología para el análisis de hongos, levaduras y enterobacterias. En el

laboratorio de microbiología se realizaron análisis para determinar la presencia de
hongos y levaduras, utilizando Chloramphenicol glucose agar (YGC). Como señala la
International Organization for Standardization (ISO) y la International Dairy Federation
(IDF) el agar se debe esterilizar a 121 °C ± 1 °C por 15 minutos. Las muestras se

incubaron verticalmente a 25 °C durante 3 a 5 días. Además, para realizar el recuento

 16

de hongos y levadura, se tomaron las placas que contenían entre 10 a 150 colonias
(ISO6611/IDF94, 2004).

Para el recuento de enterobacterias se utilizó Violet red bile glucose (VRBD); con base
a la International Organization for Standardization (ISO); este medio de cultivo no se
debe esterilizar. Además, las condiciones de incubación fueron de 37 °C por 24 horas,
en placa Petri invertida. Se consideró que se deben contar las colonias que se
encuentren entre 0 a 150 (ISO 21528-2, 2004).

Teniendo en cuenta la norma NCh 2047 (1999), al utilizar un medio sólido, se aplicó la
inoculación en profundidad para el recuento de hongos, levaduras y enterobacterias.
(CHILE, INN, 1999a).

2.4.2 Criterios microbiológicos para enterobacterias. El Reglamento Sanitario de

los Alimentos (CHILE, MINISTERIO DE SALUD, 2017b), considera que en los quesos
maduros incluido el rallado, el parámetro microbiológico para enterobacterias, debe ser
menor a 2x102 UFC/g, para no presentar un riesgo para la salud, y por sobre los 103
UFC/g se corre un riesgo para la salud.

El antifúngico natamicina no tiene efecto en las bacterias debido a que éstas no

poseen ergosterol en la membrana celular. Por lo tanto, en éste ensayo se midieron
los recuentos de enterobacterias, para establecer la contaminación microbiológica
durante la fabricación del queso gauda.
 17

2.4.3 Muestreo en diferentes zonas de procesos. Se analizaron 3 zonas de proceso;

tina de salado, pozo de descarga y baño de natamicina, como se desprende en la
Figura 2.

Figura 2 Muestreo en diferentes zonas de elaboración del queso tipo gauda

El primer muestreo se midió en la tina de salado, donde se encontraban los quesos

sumergidos por 12 horas a una concentración de 18 °Bé, el segundo muestreo se
analizó en el pozo de descarga, donde se sumergían los racks de queso que procedían
de la tina de salado una vez que finalizaba el tiempo de salado, luego el tercer
 18

muestreo se midió en el baño de natamicina, que tiene como propósito prevenir el

crecimiento de hongos en la superficie del queso.

2.5 Diseño experimental

Se estudiaron 3 tratamientos a diferentes concentración de la solución antifúngica, más

un control sin la solución antifúngica como muestra la Figura 3. La variable del diseño
es la concentración utilizada durante el proceso de elaboración conocida como el “baño
de natamicina” y el tiempo (días de maduración), analizando el recuento general de
hongos, levaduras y enterobacterias al tiempo 0, 4, 8, 12 y 16 días de maduración.
Como se mencionaba anteriormente el queso gauda debe permanecer por lo menos
durante 15 días de maduración, con los tratamientos utilizados. A una temperatura de 7
°C ± 1°C de la cámara de maduración.

Figura 3 Concentraciones utilizadas en los diferentes tratamientos sobre la

superficie del queso gauda
 19

Utilizando un diseño experimental de 3 tratamientos diferente de la solución de

NATAMAX mas el control (sin NATAMAX) x 5 días de maduración (cada 4 días de
maduración durante 16 días) (Anexo 1).

2.6 Análisis microbiológicos en la pasteurización del remanente de la solución

antifúngica

Se realizaron análisis microbiológicos de hongos, levaduras y enterobacterias de la

solución de natamicina, por consiguiente a ser reutilizada. Se procedió a la aplicación
de un tratamiento térmico a 80 °C por 15 segundos, ya que la inactivación de la Listeria
monocytogenes a una pasteurización de alta temperatura y corto tiempo (HTST) es de
72°C por 15 segundos (VAN DER VEEN et al., 2009). La natamicina es estable a un
pH 6 ± 1, por lo tanto, si el pH del remanente era bajo se debía corregir agregando una
base que se encuentra permitida en el país, para poder reutilizar la solución
antifúngica.

2.7 Análisis de la concentración de natamicina (compuesto activo)

En un laboratorio externo se midió la concentración de natamicina en la superficie del

queso, profundidad, remanente pasteurizado, comienzo y cambio de la solución de
natamicina durante el proceso. La metodología utilizada por el laboratorio se basó en
la norma ISO/FDIS9233-2 / IDF 140-2:2007 (Determination of natamycin content – Part
2: High performance liquid chromatography for cheese, cheese rind and processed
cheese).

2.8 Análisis estadísticos

Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA), para determinar si existe diferencia

significativa entre los tratamientos utilizados en la presencia de hongos y levaduras.
Del mismo modo se analizó si existían diferencias entre los tratamientos utilizados y la
maduración del queso gauda; con test de Tukey. Se utilizó el software MINITAB para
los análisis estadísticos mencionados.
 20

33RESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

3.1 Prueba de inhibición del hongo del género Penicillium spp frente a la
acción de la natamicina

En el antibiograma de este estudio se agregaron diferentes concentraciones del

compuesto NATAMAX (Anexo 2 y 3), para determinar el halo de inhibición que
presentó frente al hongo del género Penicillium spp. Se agregaron 100 μL a cada papel
filtro de la solución antifúngica a diferentes concentraciones; compuestas de
NATAMAX, agua destilada y salmuera a 18° baumé. Que son las condiciones
originales utilizadas de la solución antifúngica para las piezas de queso gauda.

En la Figura 4, se muestra el promedio establecido del diámetro que se obtuvo del

antibiograma realizado con diferentes concentraciones de la solución de NATAMAX
(Anexo 4, 5 y 6).

32,0

30,0
Diámetro (mm)

28,0

26,0

24,0

22,0

20,0
500 1000 1500 2000 4000

Concentración de NATAMAX (mg L-1)

Figura 4 Halo de inhibición promedio usando el antifúngico natamicina frente al

hongo del género Penicillium spp
 21

La concentración de 4000 mg L-1 de la solución de NATAMAX, presenta un halo de

inhibición promedio de 31,33 ± 0,58 mm, que comienza a decrecer hasta obtener un
diámetro de 23,67 ± 0,58 mm con la concentración de 500 mg L-1. Aun así la
concentración más baja que se utilizó en el antibiograma, muestra que sigue siendo
factible de utilizar a bajas concentraciones, es decir 500 mg L-1 de solución de
NATAMAX, lo que equivale a 250 mg kg-1 del compuesto activo natamicina.

La concentración mínima inhibitoria (CMI) para el género Penicillium spp, utilizando el

antifúngico natamicina es de 2,3 μg mL-1 establecida por la Food and Drug
Administration (FDA, 2014a). Aún no se encuentran disponibles las zonas de inhibición
sobre la difusión en agar que estima la sensibilidad del hongo del género Penicillium
spp. frente al antifúngico natamicina, en las tablas del instituto de normas clínicas y de
laboratorio (CLSI, 2010), por lo tanto, para establecer la susceptibilidad del hongo del
género Penicillium spp., frente al antibiótico poliénico natamicina se eligió otro
antibiótico polieno similar; Anfotericina B, que forma un halo de inhibición ≥ 16 mm
(ESPINEL-INGROFF et al, 2007), lo que permite deducir que, utilizando la
concentración más baja con 500 mg L-1 de la solución antifúngica, siguió siendo eficaz
frente al hongo del género Penicillium spp., ya que presentó halos mayor a 16 mm.

El análisis estadístico de los resultados (ANOVA), mostró que el valor-p es menor a

0,05, luego se rechaza la hipótesis nula H0, por lo tanto existe diferencia significativa
con un 95% de confianza, respecto a los tratamientos utilizados, utilizando el
antifúngico natamicina a diferentes concentraciones. El tratamiento con 4000 mg L-1 de
solución de NATAMAX fue significativamente diferente respecto al tratamiento de 500,
1000 y 1500 mg L-1 y no mostró diferencia con 2000 mg L -1. De la misma forma se
presenta una diferencia significativa para el tratamiento de 500 mg L-1 con todos los
otros tratamientos (Anexo 7).

El mejor tratamiento frente al hongo del género Penicillium spp., fue utilizando una
concentración de la solución antifúngica a 4000 mg L -1. Al bajar la concentración de la
solución a 500 mg L-1, aunque existe diferencia entre los tratamientos, no disminuyó
notoriamente el diámetro del halo de inhibición, por lo tanto sigue siendo eficaz frente
al hongo Penicillium spp a bajas concentraciones, ya que presenta un halo mayor a 16
 22

mm. Además, no se presenta diferencia entre el tratamiento con 2000 y 4000 mg L -1,
para poder reducir a la mitad la concentración de natamicina. Esto puede deberse a
que la natamicina no es muy soluble en agua, lo cual podría disminuir la difusión a
través del agar.

3.2 Análisis microbiológico en diferentes zonas de elaboración de queso

gauda

Se realizaron análisis microbiológicos de hongos, levaduras y enterobacterias en 3

zonas de proceso. Tina de salado, pozo de descarga y el baño de natamicina, las
muestras se tomaron durante un determinado tiempo; inicio, intermedio y final de la
producción diaria en la elaboración de queso gauda

3.2.1 Recuento de cepas fúngicas en diferentes zonas de proceso. En la Figura

5, se expone la presencia de hongos en las diferentes zonas de proceso. Las
muestras se tomaron durante el trascurso del tiempo, respecto al uso diario del
antifúngico (Anexo 8).

3,5
3
3

2,5
log (ufc/mL)

2 2 2
2
Tina salado
1,5 Pozo descarga
1 1 1 Baño NATAMAX
1

0,5
<1 <1 <1 <1 <1
0
Inicio Intermedio 1 Intermedio 2 Final
Utilización diaria de NATAMAX

Figura 5 Recuento de hongos en las diferentes zonas de elaboración del queso

gauda, durante el uso diario del antifúngico
 23

Durante la utilización diaria de la solución antifúngica se tomaron muestras al inicio de

la utilización del antifúngico, muestras intermedias y muestras tomadas al final del uso
de la solución. Las muestras se tomaron en la tina de salado, pozo de descarga y el
baño de natamicina.

En la tina de salado y el pozo de descarga se observaron cepas de hongos, en cambio

en el baño de NATAMAX, no se presentaron cepas fúngicas; cuando el recuento es
cero se reporta como < 1 UFC mL-1. Por lo tanto, se estima que el crecimiento de
hongos en la tina de salado y el pozo de descarga se detiene en el baño de
natamicina, debido a que dicha solución es un antifúngico que evita el crecimiento y la
proliferación de las hifas de los hongos.

EL análisis estadístico de los resultados (ANOVA), mostro que el valor-p obtenido fue
de 0,044, por lo tanto, existe diferencia significativa, entre el baño de natamicina y las
otras zonas de proceso donde se tomaron las muestras (tina de salado y pozo de
descarga), con un 95% de confianza (Anexo 9). Las muestras que se analizaron en la
tina de salado y el pozo de descarga (intermedio 2), presentaron cepas fúngicas, en
comparación con el baño de natamicina, que no presentaron hongos en los análisis
realizados.

El crecimiento de hongos y levaduras pueden ser de diferentes fuentes de

contaminación; cultivo utilizado en la elaboración del queso, mediante el medio
ambiente, la salmuera utilizada, en los equipos de producción y los manipuladores de
alimentos, durante la elaboración del tipo de queso (BANJARA et al., 2015).

3.2.2 Recuento de levaduras en diferentes zonas de proceso. En la Figura 6, se

muestra el recuento de levaduras obtenido en las diferentes zonas de proceso (tina de
salado, pozo de descarga y baño de NATAMAX), durante el seguimiento de la
producción de elaboración de queso gauda (Anexo 10).
 24

70

59
60
52
50
log (ufc/mL)

39
40 35 35
Tina salado
29
30 25 Pozo descarga
Baño NATAMAX
20 17
14 15
12
10 5

0
Inicio Intermedio 1 Intermedio 2 Final
Utilización diaria de NATAMAX

Figura 6 Recuento de levaduras en las diferentes zonas de elaboración del

queso gauda, durante el uso diario del antifúngico

En el baño de salmuera las levaduras tienden a disminuir en el tiempo, en cambio en el

pozo de descarga el recuento de levaduras aumentó, debido a que durante este
proceso hubo mayor manipulación de las piezas de queso; por los manipuladores de
alimentos y utensilios utilizados en este proceso. SPERBER y DOYLE (2010),
mencionan que una alta incidencia de la contaminación de los quesos sumergidos en
salmuera, es por la presencia de levaduras, que se trasmiten al queso. El recuento de
levaduras en el baño de NATAMAX es mayor mientras avanzó la producción diaria, al
final de la producción diaria, disminuye la presencia de levaduras, debido a la acción
antifúngica de la natamicina, volviéndose más eficaz entre más tiempo de exposición
se encuentre la natamicina a las levaduras.

El análisis estadístico de los resultados (ANOVA), mostró que el valor-P fue de 0,008,
por lo tanto, existe diferencia significativa entre el recuento de levaduras analizadas en
 25

las diferentes zonas de la elaboración de queso durante un determinado tiempo de

producción con un 95% de confianza (Anexo 11). El pozo de descarga es la zona de
proceso con mayor presencia significativa de levaduras. Por lo tanto, se deduce que la
presencia de levaduras en el pozo de descarga fueron trasferidas al queso y alojadas
en el posterior proceso, baño de NATAMAX, lo que evidencia el aumento de levaduras
en el antifúngico. La tina de salado es la que presentó menor recuento de levaduras.

3.2.3 Recuento de enterobacterias en diferentes zonas de proceso. La Figura 7,

evidencia el recuento de enterobacterias en las diferentes zonas de proceso, durante
un determinado tiempo de producción (Anexo 12).

80
68
70

60 55
log (ufc/mL)

50

40 35 Tina salado
31 Pozo descarga
30
Baño NATAMAX
20
11
8,5 6,5 8,2
10 4,3
1 3 3,5
0
Inicio Intermedio 1 Intermedio 2 Final
Utilización diaria de NATAMAX

Figura 7 Recuento de enterobacterias en las diferentes zonas de elaboración

del queso gauda, durante el uso diario del antifúngico

La natamicina en los alimentos es utilizada para prevenir hongos y levaduras, pero no

tiene ningún efecto en las bacterias (HONDRODIMOU et al., 2011). Por lo tanto, en
este estudio el recuento de enterobacterias, se analizó para conocer las condiciones
 26

higiénicas de la producción. Las muestras analizadas fueron de diferentes zonas de

procesos (tina de salado, pozo de descarga y baño de NATAMAX), durante un
determinado tiempo de producción. El recuento de enterobacterias es mayor en el
baño de NATAMAX, en comparación con las otras zonas de proceso. Además, durante
este proceso, la solución fungistática arrastrada por las piezas de quesos y superficie
de la línea de producción, se acopió en un balde, que posteriormente es ingresado a la
solución antifúngica, por lo tanto, se puede deducir que, este proceso aumentó el
recuento de enterobacterias en la solución de NATAMAX. Y otro factor importante es la
higiene de los equipos, utensilios utilizados y del personal. El recuento de
enterobacterias en las zonas de proceso no debe aumentar, ya que puede afectar la
inocuidad de los alimentos.

El análisis estadístico de los resultados (ANOVA), mostró que el valor-p resultó menor
a 0,05 para las diferentes zonas de proceso, por lo tanto existe diferencia significativa
entre el recuento de enterobacterias en las diferentes zonas de proceso con un 95% de
confianza. Existe una diferencia estadísticamente significativa entre del baño de
natamicina que presenta un mayor recuento de enterobacterias en comparación con la
tina de salado y el pozo de descarga (Anexo 13).

3.3 Recuento de hongos, levaduras y enterobacterias en la superficie del

queso gauda durante la maduración

El recuento de microorganismos en el queso gauda, se midió cada cuatro días de

maduración, utilizando diferentes tratamientos durante el proceso de inmersión en la
solución antifúngica. El recuento se realizó hasta los 16 días de maduración, por lo
señalado en el Reglamento Sanitario de los Alimentos, donde se indica que el queso
gauda debe estar por lo menos 15 días en maduración. Además de establecer un límite
máximo de enterobacterias. Los tratamientos utilizados fueron en concentraciones de
0, 1000, 2000 y 4000 mg L-1 de la solución fungistática y analizadas cada 4 días por 16
días de maduración.
 27

3.3.1 Recuento de hongos en la superficie del queso durante la maduración. El

recuento obtenido de hongos en la superficie del queso durante los 16 días de
maduración, fueron evaluados con un tratamiento control sin el uso de la solución
fungistática y tres diferentes tratamientos a una concentración de la solución
antifúngica de 1000, 2000 y 4000 mg L-1 (Anexo 14).

Durante la maduración del queso tipo gauda, este no presentó crecimiento de cepas
fúngicas en la superficie. Incluso con la menor concentración de la solución. Por lo
tanto, se estima que resulta eficaz utilizar bajas concentraciones de la solución
antifúngica NATAMAX en la superficie del queso gauda, para evitar el crecimiento de
hongos indeseables.

Los quesos que fueron sometidos al tratamiento control, sin la solución antifúngica, no
presentaron hongos en la superficie del queso, durante los 16 días de maduración.
Puesto que, un factor importante durante la elaboración del queso gauda, son las
condiciones de envasado que se les otorga a éstos, para su posterior maduración
(envasados al vacío en bolsas cryovac termocontraíbles), lo que impide que se facilite
el crecimiento de cepas fúngicas en la superficie del queso, durante la maduración.
ROBERTSON (2013), establece que la concentración de O2 en el envasado
determinará el crecimiento microbiológico en la superficie del queso. No obstante
durante el envasado al vacío, el O2 no se elimina por completo, por lo tanto, el
crecimiento de hongos y levaduras no es controlado completamente (HOTCHKISS et
al., 2006).

3.3.2 Recuento de levaduras en la superficie del queso durante la maduración.

En la Figura 8, se muestran los niveles de levaduras, en la superficie del queso gauda,
durante un tiempo de maduración establecido de 16 días de maduración. Se utilizó un
tratamiento control, sin la solución fungistática y tres tratamientos diferentes a
concentraciones de 1000, 2000 y 4000 mg L-1 (Anexo 15).
 28

25

20
log (ufc/mL) 20

15 0 mg/L
11,5 1000 mg/L
10 2000 mg/L
7,5 7
6 4000 mg/L
5 4 3,5
3
1,5 2 2 1,5
1 1 1
<1 <1<1<1 <1
0
día 0 día 4 día 8 día 12 día 16
Días de maduración

Figura 8 Recuento de levaduras durante la maduración del queso gauda

utilizando diferentes tratamientos a 0, 1000, 2000 y 4000 mg L-1 de la
solución fungistática

El recuento de levaduras en la superficie del queso gauda con el tratamiento control,

sin la solución antifúngica, comenzó a decaer desde el cuarto día, pero se apreciaron
niveles similares entre el decimosexto y duodécimo día de maduración respecto al
cuarto día, debido posiblemente a que el queso es un buen sustrato, y las condiciones
de maduración podrían ser favorables para la presencia de levaduras en la superficie
del queso.

Cuando se utilizaron los diferentes tratamientos en la superficie del queso a una

concentración de 1000, 2000 y 4000 mg L-1 de la solución antifúngica, se pudo
observar que el recuento de levaduras disminuyó durante la maduración. GALLO y
PILOSOF (2006), mencionan que la natamicina no muestra una actividad fungistática
inmediata frente a las levaduras, ya que tiene mayor eficacia sobre las levaduras
durante la maduración del queso.
 29

Por su parte, el análisis estadístico de los resultados (ANOVA), demostró que existen
diferencias estadísticamente significativas con un 95% de confianza, debido a que el
valor-p es de 0,004, por lo tanto existen diferencias significativas entre el recuento de
levaduras durante la maduración del queso gauda (Anexo 16), en el tratamiento
control, sin la solución antifúngica y las diferentes concentraciones de la solución
antifúngica usadas en la elaboración de queso gauda.

3.3.3 Recuento de enterobacterias en la superficie del queso durante la

maduración. En la Figura 9, se muestra el recuento de enterobacterias en la superficie
del queso donde se utilizaron diferentes concentraciones de la solución antifúngica
NATAMAX (0, 1000, 2000 y 4000 mg L-1), durante la maduración de 16 días. Aunque la
natamicina no tiene efecto sobre las bacterias, en este estudio se realizó el recuento de
enterobacterias para conocer las condiciones higiénicas y de inocuidad que tienen los
quesos durante su producción (Anexo 17).

4
3,5
3,5

3
log (ufc/mL)

2,5
2 2 2 0 mg/L
2
1000 mg/L
1,5 2000 mg/L
1 1 1
1 4000 mg/L

0,5
<1 <1<1<1 <1<1<1 <1<1<1 <1<1<1
0
día 0 día 4 día 8 día 12 día 16
Días de maduración

Figura 9 Recuento de enterobacterias durante la maduración del queso gauda

utilizando diferentes tratamientos a 0, 1000, 2000 y 4000 mg L-1 de la
solución fungistática
 30

Durante los 16 días maduración del queso, sin la utilización de la solución de

NATAMAX, indica que las enterobacterias se encuentran ausentes en la superficie del
queso. Y se incrementa el recuento de enterobacterias mientras más se utilice el baño
de NATAMAX, durante el trascurso de la producción.

El incremento de enterobacterias aumenta, y se debe a un arrastre de enterobacterias

de los demás procesos hacia la solución de NATAMAX, y posiblemente a las
condiciones higiénicas baño de natamicina. El recuento para quesos se encuentra por
debajo del límite permitido de enterobacterias, por lo tanto no presenta un riesgo para
la salud.

El análisis estadístico de los resultados (ANOVA), mostró que el valor-p obtenido del
recuento de enterobacterias fue de 0,028, indicando que existe diferencia significativa,
con un 95% de confianza, entre el tratamiento sin la solución antifúngica y la
concentración 0,4% de la solución fungistática (Anexo 18). Durante este proceso las
enterobacterias se fueron alojando en el baño de NATAMAX, por consiguiente mientras
más piezas de queso pasen por la solución, tendrá mayor cantidad de enterobacterias,
debido a la propagación desde procesos anteriores y las condiciones higiénicas
durante este proceso.

3.4 Pasteurización del remanente de la solución de NATAMAX

La planta láctea se planteó reutilizar la solución antifúngica, por lo tanto se decidió

pasteurizar la solución antifúngica resultante al término de la producción diaria, para
poder reutilizar la solución de NATAMAX, dependiendo de las concentraciones del
compuesto activo natamicina, que se obtuvieran de la solución al término de la
producción diaria. En la Figura 10 se evidencia el recuento de hongos, levaduras y
enterobacterias, antes de la pasteurización y una vez realizada la pasteurización a
80°C por 15 segundos (Anexo 19).
 31

45
39
40
35
log (ufc/mL) 30
25 22
20 18
15 15
15
10 7,7
Pasteurización 1
5 <1<1<1 <1<1<1 <1<1<1 <1<1<1
0 Pasteurización 2

Hongos
Hongos

Enterobacterias
Enterbacterias
Levaduras

Levaduras
Pasteurización 3

Antes Después
Microorganismos

Figura 10 Recuento de microorganismos antes y después de la pasteurización a

80°C por 15 segundos del remanente antifúngico

Se realizó la pasteurización del remanente de la solución antifúngica al término de la

producción diaria, etapa donde se cambia la solución de NATAMAX. Utilizando la
bomba del baño de NATAMAX, acopiando la solución hacia la olla Stephan (utilizada
para queso fundido). Para que no ingrese vapor de agua a la solución de NATAMAX se
decidió hacer la pasteurización por la camisa de doble pared. Posteriormente se
realizaron los análisis microbiológicos antes y después de la pasteurización, realizada
a 80 °C por 15 segundos (temperatura registrada con una termocupla). El recuento
inicial de hongos, levaduras y enterobacterias fue eliminado con la pasteurización,
informando el recuento de microorganismos < 1 UFC mL-1, lo que se desprende
claramente de la Figura 10.

3.4.1 Concentración de natamicina en solución pasteurizada. El Cuadro 1,

muestra la concentración del compuesto activo natamicina en la solución antifúngica
antes de pasteurizar y después de la pasteurización realizada a 80°C por 15 segundos.
 32

Se realizaron 3 ensayos para medir la concentración de natamicina en la solución

fungistática. La concentración obtenida antes de la pasteurización; es el remanente de
la solución al término de la producción, y se midió la concentración obtenida una vez
pasteurizado el remanente (Anexo 19).

Cuadro 1 Concentración del compuesto activo natamicina en la solución

remanente antifúngica NATAMAX

Natamicina (mg L-1)

Pasteurización
(80°Cx15s)
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

P-Antes 547,20 106,00 362,50

P-Después 410,80 102,50 331,60

Al pasteurizar el remanente de la solución antifúngica se pudo observar que la

concentración disminuyó una vez pasteurizada. En el primer ensayo éste disminuyó un
24,93% equivalente a una concentración final de 136 mg L -1, en el segundo ensayo la
concentración disminuyó 3,50 mg L-1, equivalente al 3,30% y en el último ensayo la
concentración disminuyó 30,90 mg L-1 correspondiente a un 8,52% de la solución
antifúngica NATAMAX cuando se sometió a la pasteurización. La disminución del
compuesto activo, es posible debido a las pérdidas en los filtros y en el fondo de la olla
Stephan, también probablemente por la baja solubilidad de la natamicina, ésta
precipita.

3.5 Concentración de natamicina inicial y final de la solución antifúngica

utilizada durante la producción diaria

Se realizaron dos ensayos para determinar la concentración de natamicina, al inicio y

al término del uso de la solución fungistática, para poder estimar la concentración
 33

ocupada en la superficie de los quesos y la concentración que se estaría eliminando al

final del uso de la solución (Anexo 19).

A continuación en el Cuadro 2, se presenta la concentración de natamicina de la

solución antifúngica utilizada durante la producción diaria, determinando la
concentración al inicio de la utilización de la solución fungistática y al final del uso de la
solución antifúngica.

Cuadro 2. Concentración de la solución antifúngica al inicio y luego de ser

utilizada

Concentración de natamicina
Etapa solución (mg L-1)
NATAMAX
Ensayo 1 Ensayo 2

Inicio 1749,6 1198,1

Final 125,8 240,4

La concentración de la solución de NATAMAX, utilizada en la producción diaria es de

0,4%, equivalente al 50% de lactosa, la cual es utilizada como un carrier
(transportador), y 50% del compuesto activo natamicina, para controlar el crecimiento
de hongos y levaduras en la superficie del queso durante el uso de la solución. Según
las muestras analizadas en INTI-LÁCTEOS, la concentración inicial de natamicina fue
de 1749,6 mg L-1, y una concentración final de 125,8 mg L-1, lo que nos permitió
deducir que, el 92,81% de la natamicina quedará sobre los quesos y el 7,19% se
eliminaría al término de su uso, y en el segundo ensayo la concentración inicial fue de
1198,1% quedando un 79,93% en los quesos que fueron pasando por la solución
antifúngica, y al final del uso de la solución se eliminó un 20,07% de la concentración
del compuesto natamicina al término de la producción diaria.
 34

3.6 Concentración de natamicina en la elaboración de queso gauda

La concentración de natamicina en el queso gauda se midió en la superficie del queso

gauda (mg dm-2) y la presencia del antifúngico a 5 mm de profundidad (mg kg-1); cuyos
resultados se muestran en el Cuadro 3 y 4, realizados por el laboratorio INTI-Lácteos.
Las muestras se tomaron a tres quesos diferentes, pero de la misma elaboración o
partida de queso gauda, a diferentes días de maduración (inicio, intermedio y final).

Cuadro 3 Concentración de natamicina en la superficie del queso gauda en

diferentes días de maduración

Concentración de natamicina en la
Muestras
superficie del queso (mg dm-2)

Muestra 1 (Inicio) 0,63

Muestra 2 (Intermedio) 0,29

Muestra 3 (Final) 0,42

Como se mencionaba anteriormente sobre la concentración del antifúngico en la

superficie del queso, el límite máximo permitido varía de 1 a 2 mg dm-2, además debe
estar ausente a los 5 mm de profundidad (mg kg-1). Por lo tanto, según los análisis
realizados en el laboratorio externo (Anexo 19), la concentración en la superficie del
queso gauda, al final de la maduración fue de 0,42 mg dm -2, encontrándose ésta por
debajo del límite máximo permitido en la superficie del queso.
 35

Cuadro 4 Concentración de natamicina a 5 mm de profundidad del queso gauda

en diferentes días de maduración

Concentración de natamicina a 5 mm
Muestras
profundidad (mg kg-1)

Muestra 1 (Inicio) 0,55

Muestra 2 (Intermedio) 0,53

Muestra 3 (Final) 0,65

La concentración de natamicina a 5 mm de profundidad al final de la maduración, nos

indica una concentración de 0,65 mg kg-1, lo que es complicado, ya que a esa
profundidad la concentración se debe encontrar por debajo del límite permitido (0,5 mg
kg-1) según PASEIRO-CERRATO et al., (2013) y VIERIKOVA et al., (2013) y las
normas mencionan que la concentración del antifúngico debe estar ausente a este
nivel.
 36

4.&ONCLUSIONES

Al ser evaluados los niveles del preservante natamicina, estos resultaron ser eficaces
al disminuir la concentración de la solución fungistática de 4000 mg L -1 (actual) a 2000
mg L-1, controlando el crecimiento de hongos y levaduras en el queso al cabo de 16
días de maduración.

Una vez que se midieron los halos de inhibición frente al hongo del género Penicillium
sp, utilizando la solución antifúngica, se pudo establecer que la concentración mínima
inhibitoria en este estudio fue de 500 mg L-1, ya que esta presentó un halo de inhibición
mayor a 16 mm de diámetro.

La solución fungistática utilizada a diferentes concentraciones fue eficaz frente al

crecimiento de hongos en la superficie del queso gauda, no encontrándose éstos
incluso a los 16 días de maduración, ejerciendo también un efecto positivo frente a las
levaduras, las que fueron disminuyendo durante la maduración del queso.

Al realizar la pasteurización de la solución antifúngica, esta presentó una disminución

en la concentración de natamicina, obteniendo concentraciones entre los 100 y 400 mg
L-1 al término de la pasteurización. Sin embargo, se obtuvieron recuentos de
microorganismos menores a 1 UFC mL -1, por lo tanto, es posible reutilizar la solución
fungistática.

Sobre la superficie del queso la natamicina, presentó niveles aceptables respecto de

las dosis permitidas según las normas; estando éstos por debajo de 1 a 2 mg dm -2 y a
los 20 mg kg-1.

Las concentraciones de natamicina a 5 mm de profundidad estuvieron por sobre los 0,5

mg kg-1, por lo que existía presencia a éste nivel de profundidad, sin embargo las
normas mencionan que la concentración del antifúngico debe estar ausente a este
nivel.

Durante la elaboración de queso gauda, se demostró que existe mayor presencia de

enterobacterias en el baño de la solución fungistática, corroborándose el hecho que la
natamicina no tiene acción frente a este tipo de bacterias. Sin embargo, el recuento en
la superficie de los quesos fue menor a 2x102 UFC g-1; nivel que no presenta un riesgo
para la salud.
 37

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 44

ANEXOS
 45

Anexo 1 Características del compuesto antifúngico NATAMAX

 46

Anexo 2 Diseño experimental utilizado para analizar la presencia de hongos,

levaduras y enterobacterias

Concentración Días de maduración

Tratamiento 0,4%
0 4 8 12 16
NATAMAX

Tratamiento 0,2%
0 4 8 12 16
NATAMAX

Tratamiento 0,1%
0 4 8 12 16
NATAMAX

Tratamiento 0%
NATAMAX 0 4 8 12 16
(control)

Anexo 3 Concentraciones de NATAMAX durante el antibiograma del

antifúngico

Concentración de Agua purificada +

NATAMAX (g)
NATAMAX (%) salmuera (mL)

0,40 50 0,200

0,20 50 0,100

0,15 50 0,075

0,10 50 0,050

0,05 50 0,025
 47

Anexo 4 Pesaje del compuesto NATAMAX a diferentes concentraciones

Concentraciones de NATAMAX
Muestras
0,40% 0,20% 0,15% 0,10% 0,05%

M1 (g) 0,2006 0,1003 0,0752 0,0500 0,0251

M2 (g) 0,2001 0,1010 0,0749 0,0500 0,0254

M3 (g) 0,2009 0,1005 0,0752 0,0501 0,0251

Promedio 0,2005 0,1006 0,0751 0,0500 0,0252

SD 0,0004 0,0004 0,0002 0,0001 0,0002

CV 0,2015 0,3584 0,2306 0,1154 0,6873

Anexo 5 Diámetros del halo de inhibición, obtenidos al usar diferentes

concentraciones del fungicida

Concentración de la solución de NATAMAX

Muestras
0,40% 0,20% 0,15% 0,10% 0,05%

M1 (mm) 31,00 30,00 29,00 29,00 23,00

M2 (mm) 31,00 30,00 29,00 28,00 24,00

M3 (mm) 32,00 31,00 29,80 30,00 24,00

Promedio 31,33 30,33 29,27 29,00 23,67

SD 0,5774 0,5774 0,4619 1,0000 0,5774

CV 1,8426 1,9034 1,5782 3,4483 2,4395

 48

Anexo 6 Antibiograma realizado con natamicina frente al hongo del género

Penicillium spp
 49

Anexo 7 Análisis de varianza ANOVA para la formación del halo de

inhibición, usando diferentes concentraciones del antifúngico
natamicina

Fuente GL SC CM F P
Tratamientos 4 106,037 26,509 59,89 0,000
Error 10 4,427 0,443
Total 14 110,464

TEST de Tukey HSD con un nivel de confianza del 95%

Tratamientos
N Media Agrupación
(%)
0,40 3 31,333 A
0,20 3 30,333 A B
0,15 3 29,267 B
0,10 3 29,000 B
0,05 3 23,667 C

Diferencia estadísticamente significativa

Tratamientos Significancia Diferencia +/- Límites
0,4 - 0,2 1,0 1,78801
0,4 - 0,15 * 2,06667 1,78801
0,4 - 0,1 * 2,33333 1,78801
0,4 - 0,05 * 7,66667 1,78801
0,2 - 0,15 1,06667 1,78801
0,2 - 0,1 1,33333 1,78801
0,2 - 0,05 * 6,66667 1,78801
0,15 - 0,1 0,266667 1,78801
0,15 - 0,05 * 5,6 1,78801
0,1 - 0,05 * 5,33333 1,78801
(*) Denota que existe diferencia significativa
 50

Anexo 8 Recuento de hongos en diferentes zonas de proceso durante el uso

de la solución antifúngica (inicio, intermedio y final)

RECUENTO DE HONGOS (UFC/mL)

14:30 horas del 25 enero 2017
25-01-2017 14:30
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
2 0 0
Tina de salado 2,0x100
0 0 0

1 0 0
Pozo de descarga 1,0x100
0 0 0

0 0 0
Baño de NATAMAX < 100
0 0 0

RECUENTO DE HONGOS (UFC/mL)

18:30 horas del 25 enero 2017
25-01-2017 18:30
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
100 10-1 10-2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
Baño de Salmuera < 100
0 0 0

1 0 0
Pozo de descarga 1,0x100
0 0 0

0 0 0
Baño de NATAMAX < 100
0 0 0
 51

(Continuación Anexo 8)

RECUENTO DE HONGOS (UFC/mL)

10:00 horas del 26 enero 2017
26-01-2017 10:00
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
100 10-1 10-2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
2 0 0
Baño de Salmuera 2,0x100
0 0 0

0 0 0
Pozo de descarga 3,0x100
3 0 0

0 0 0
Baño de NATAMAX < 100
0 0 0

RECUENTO DE HONGOS (UFC/mL)

13:00 horas del 26 enero 2017
26-01-2017 13:00
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
2 0 0
Baño de Salmuera 2,0x100
0 0 0

1 0 0
Pozo de descarga 1,0x100
0 0 0

0 0 0
Baño de NATAMAX < 100
0 0 0
 52

Anexo 9 Análisis de varianza ANOVA para la presencia de hongos en

diferentes zonas de proceso, durante el uso diario de la solución
antifúngica

Fuente GL SC CM F P

Factor 2 6,000 3,000 4,50 0,044

Error 9 6,000 0,667

Total 11 12,000

Test de Tukey HSD con un nivel de confianza del 95%

Zonas de
N Media Agrupaciones
proceso

P.Descarga 4 1,5000 A

T.Salado 4 1,5000 A

B.Natamax 4 0,0000 A

Diferencia estadísticamente significativa

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

T.Salado - P.Descarga 0 1,61178

T.Salado - B.Natamax 1,5 1,61178

P.Descarga - B.Natamax 1,5 1,61178

(*) Denota que existe diferencia significativa

 53

Anexo 10 Recuento de levaduras en diferentes zonas de proceso durante el

uso de la solución antifúngica (inicio, intermedio y final)

RECUENTO DE LEVADURAS (UFC/mL)

14:30 horas del 25 enero 2017
25-01-2017 14:30
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
30 4 0
Baño de Salmuera 2,9x101
28 4 0

40 8 0
Pozo de descarga 3,5x101
23 6 0

3 0 0
Baño de NATAMAX 5,0x100
7 0 0

RECUENTO DE LEVADURAS (UFC/mL)

18:30 horas del 25 enero 2017
25-01-2017 18:30
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
23 0 0
Baño de Salmuera 2,5x101
27 1 0

31 3 0
Pozo de descarga 3,9x101
46 4 0

15 1 0
Baño de NATAMAX 1,4x101
12 0 0
 54

(Continuación Anexo 10)

RECUENTO DE LEVADURAS (UFC/mL)

10:00 horas del 26 enero 2017
26-01-2017 10:00
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
100 10-1 10-2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
14 1 0
Baño de Salmuera 1,5x101
16 3 0

66 5 0
Pozo de descarga 5,9x101
51 6 0

32 8 0
Baño de NATAMAX 3,5x101
30 6 0

RECUENTO DE LEVADURAS (UFC/mL)

13:00 horas del 26 enero 2017
26-01-2017 13:00
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
11 0 0
Baño de Salmuera 1,2x101
13 0 0

55 6 0
Pozo de descarga 5,2x101
48 5 0

18 5 0
Baño de NATAMAX 1,7x101
15 3 0
 55

Anexo 11 Análisis de varianza ANOVA para la presencia de levaduras en

diferentes zonas de proceso, durante el uso diario de la solución
antifúngica

Fuente GL SC CM F P

Factor 2 1957 978 8,64 0,008

Error 9 1020 113

Total 11 2976

Test de Tukey HSD con un nivel de confianza del 95%

Zonas de N Media Agrupación
proceso
P.Descarga 4 46,00 A
T.Salado 4 20,25 B
B.Natamax 4 17,75 B

Diferencia estadísticamente
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

T.Salado - P.Descarga * -25,75 21,0099

T.Salado - B.Natamax 2,5 21,0099

P.Descarga - B.Natamax * 28,25 21,0099

(*) Denota que existe diferencia significativa.

 56

Anexo 12 Recuento de enterobacterias en diferentes zonas de proceso

durante el uso de la solución antifúngica (inicio, intermedio y final)

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS (UFC/mL)

25-01-2017 14:30
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
100 10-1 10-2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
4 1 0
Baño de Salmuera 4,3 x100
4 0 0

5 0 0
Pozo de descarga 8,5 x100
12 0 0

42 24 0
Baño de NATAMAX 5,5 x101
39 15 0

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS (UFC/mL)

18:30 del 25 enero 2017
25-01-2017 18:30
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
6 0 0
Baño de Salmuera 6,5x100
7 0 0

1 0 0
Pozo de descarga 1,0x100
0 0 0

58 22 0
Baño de NATAMAX 6,8x101
50 19 0
 57

(Continuación Anexo 12)

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS (UFC/mL)
10:00 horas del 26 enero 2017
26-01-2017 10:00
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
100 10-1 10-2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
4 0 0
Baño de Salmuera 3,0x100
2 0 0

4 0 0
Pozo de descarga 3,5x100
3 0 0

24 8 0
Baño de NATAMAX 3,1x101
27 9 0

RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS (UFC/mL)

13:00 horas del 26 enero 2017
26-01-2017 13:00
Diluciones N
ZONAS DE PROCESOS
10 0
10 -1
10 -2 (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
12 4 0
Baño de Salmuera 1,1x101
8 0 0

5 1 0
Pozo de descarga 8,2x100
10 2 0

21 12 0
Baño de NATAMAX 3,5x101
27 17 0
 58

Anexo 13 Análisis de varianza ANOVA para la presencia de enterobacterias

en diferentes zonas de proceso, durante el uso diario de la solución
antifúngica
Fuente GL SC CM F P

Factor 2 4594 2297 21,05 0,000

Error 9 982 109

Total 11 5576

Test de Tukey HSD con un nivel de confianza del 95%

Zonas de N Media Agrupación
proceso
B.Natamax 4 47,25 A
T.Salado 4 6,20 B
P.Descarga 4 5,30 B

Diferencia estadísticamente significativas

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

T.Salado - P.Descarga 0,9 20,621

T.Salado - B.Natamax * -41,05 20,621

P.Descarga - B.Natamax * -41,95 20,621

(*) Denota que existe diferencia significativa

 59

Anexo 14 Recuento de hongos durante 16 días de maduración en la

superficie del queso tipo gauda a diferentes concentraciones de la
solución antifúngica

0 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE HONGOS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0

4 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE HONGOS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0
 60

(Continuación Anexo 14)

8 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE HONGOS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de
10 0
10-1 10-2 N (UFC/mL)
natamicina
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0

12 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE HONGOS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0
 61

(Continuación Anexo 14)

16 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE HONGOS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de N
100 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0
 62

Anexo 15 Recuento de levaduras durante 16 días de maduración en la

superficie del queso tipo gauda a diferentes concentraciones de la
solución antifúngica

0 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
14 2 0
0,00% 1,2x101
9 0 0
1 0 0
0,10% 3,0x100
2 0 0
5 0 0
0,20% 8,0x100
3 0 0
3 0 0
0,40% 3,0x100
0 0 0

4 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
11 1 0
0,00% 7,5 x100
4 0 0
1 0 0
0,10% 1,0 x100
0 0 0
2 0 0
0,20% 2,0 x100
0 0 0
5 0 0
0,40% 7,0 x100
2 0 0
 63

(Continuación Anexo 15)

8 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
0 N
Concentración de natamicina 10 10-1 10-2
(UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
18 7 0
0,00% 2,0 x101
16 3 0
2 0 0
0,10% 2,0 x100
0 0 0
2 0 0
0,20% 3,0 x100
1 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0

12 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
0 N
Concentración de natamicina 10 10-1 10-2
(UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
8 0 0
0,00% 7,0 x100
6 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% < 100
0 0 0
 64

(Continuación Anexo 15)

16 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE LEVADURAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
0 N
Concentración de natamicina 10 10-1 10-2
(UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
7 1 0
0,00% 6,0 x100
5 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
1 0 0
0,20% 1,0x100
0 0 0
1 0 0
0,40% 1,0x100
0 0 0
 65

Anexo 16 Análisis de varianza ANOVA para el recuento de levaduras durante

16 días de maduración utilizando diferentes concentraciones de la
solución antifúngica

Fuente GL SC CM F P
Factor 3 273,2 91,1 6,80 0,004
Error 16 214,4 13,4
Total 19 487,6

Test de Tukey HSD con un nivel de confianza del 95%

Concentraciones
N Media Agrupación
de NATAMAX
0% 5 10,500 A
0,2% 5 2,800 B
0,4% 5 2,200 B
0,1% 5 1,200 B

Diferencia estadísticamente significativa

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

0% - 0,1% * 9,3 6,62678
0% - 0,2% * 7,7 6,62678
0% - 0,4% * 8,3 6,62678
0,1% - 0,2% -1,6 6,62678
0,1% - 0,4% -1,0 6,62678
0,2% - 0,4% 0,6 6,62678
(*) Denota que existe diferencia significativa
 66

Anexo 17 Recuento de enterobacterias durante 16 días de maduración en la

superficie del queso tipo gauda a diferentes concentraciones de la
solución antifúngica

0 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
2 0 0
0,10% 2,0x100
0 0 0
1 0 0
0,20% 2,0x100
3 0 0
3 0 0
0,40% 3,5x100
4 0 0

4 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% 2,0 x100
2 0 0
 67

(Continuación Anexo 17)

8 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
0 0 0
0,40% 1,0 x100
1 0 0

12 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
1 0 0
0,40% 1,0 x100
0 0 0
 68

(Continuación Anexo 17)

16 DÍAS DE MADURACIÓN
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN LA SUPERFICIE
Diluciones
Concentración de 0 N
10 10-1 10-2
natamicina (UFC/mL)
UFC/mL UFC/mL UFC/mL
0 0 0
0,00% < 100
0 0 0
0 0 0
0,10% < 100
0 0 0
0 0 0
0,20% < 100
0 0 0
1 0 0
0,40% 1,0x100
0 0 0
 69

Anexo 18 Análisis de varianza ANOVA para el recuento de enterobacterias

durante 16 días de maduración utilizando diferentes
concentraciones de la solución antifúngica

Fuente GL SC CM F P
Factor 3 8,238 2,746 3,92 0,028
Error 16 11,200 0,700
Total 19 19,438

Test de Tukey HSD con un nivel de confianza del 95%

Concentraciones
N Media Agrupación
de NATAMAX
0,4% 5 1,7000 A
0,2% 5 0,4000 AB
0,1% 5 0,4000 AB
0% 5 0,0000 B

Diferencia estadísticamente significativa

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
0% - 0,1% -0,4 1,5146
0% - 0,2% -0,4 1,5146
0% - 0,4% * -1,7 1,5146
0,1% - 0,2% 0 1,5146
0,1% - 0,4% -1,3 1,5146
0,2% - 0,4% -1,3 1,5146
(*) Denota que existe diferencia significativa
 70

Anexo 19 Concentraciones de natamicina en salmuera, superficie y

profundidad del queso tipo gauda
71