Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar

Escuela de Ciencias de la Salud

Virología

INMUNOFLUORESCENCIA

Prof: Alumna:

Angelica Farreras. Farfán Luimore

C.I: 25.493.050

Ciudad Bolívar, Abril del 2015

La fluorescencia es un fenómeno por el cual algunas sustancias tienen la capacidad de absorber luz
a una determinada longitud de onda, por lo general en el rango ultravioleta, y luego emiten luz
visible en una longitud más larga. Dicho de otra manera, absorben fotones con una determinada
energía, y liberan fotones con menor energía. Este proceso es casi inmediato, la luz es recibida y
vuelta a emitir en millonésimas de segundo, por lo tanto podemos decir que la fluorescencia dura
tanto como el estímulo, ya que cuando éste cesa, también cesa el fenómeno de fluorescencia. Esta
es la principal diferencia con el fenómeno de fosforescencia, en el cual la luz absorbida se vuelve a
emitir luego de transcurrido un cierto lapso.

¿Como se produce la fluorescencia?

La absorción de luz por parte de la molécula de fluorocromo la eleva a un estado de excitación en

el cual contiene mayor energía. La molécula permanece en el estado de excitación por un período
de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energía menor es acompañado por emisión de luz
(fluorescencia)

Inmunofluorescencia;Directa

El procedimiento se realiza en un paso básico de reacción. La muestra clínica que presuntamente

contiene antígenos del microorganismo bajo estudio es puesta en contacto con un anticuerpo
monoclonal dirigido contradicho microorganismo conjugado con fluoresceína. Si el antígeno
esperado está presente se formará un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción positiva en forma
de fluorescencia verde manzana puede verse con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

Inmunofluorescencia;Indirecta

Los detalles técnicos son idénticos a los del método directo, excepto porque el suero especifico no
esta marcado; en vez de ello, se une el colorante a un segundo suero preparado contra las
globulinas de las especies en que se formo el suero especifico, por ejemplo con frecuencia los
anticuerpos preparados contra inmunoglobulina humana se preparan en conejos o cabras. A este
método se le conoce como sándwich debido a que se forman tres capas

El proceso consta de dos etapas:

Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido
específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca el suero de
quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará
formación de complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado

Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el
anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.
FLUOROCROMOS

Sustancias que emiten un fotón cuando son excitados por un fotón incidente. Formen uniones con
las proteínas (Ac) pero sin afectar los grupos de combinación específica del anticuerpo.

El pH afecta la fluorescencia y por esta razón se debe trabajar a pH estable y adecuado

dependiendo del colorante: fluoresceína (pH 8), rodamina (pH 7), DANS (pH 1.6-14)

VENTAJAS
- Se pueden obtener resultados rápidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto.
-Es sensible.

DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos (como toda técnica serológica).

1. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA2.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO. Ac

Policlonal Ac Monoclonal Pool de Ac monoclonalesFuerza de señal Excelente Regular a
Buena ExcelenteEspecificidad Buena, pero a Excelente pero con Excelente veces el posible
reacción cruzada background es altoVentajas Señal fuerte Específico Señal
fuerteDesventajas No renovable Baja señal Específico Background Disponibilidad Se
necesita titular2.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE. Es una
técnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac específicos en el suero.
En esta técnica la visualización del IC no es directa, sino que se lleva a cabo por
intervención de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que recibe el nombre
genérico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son formes o partículas (cortes de
tejidos, bacterias, parásitos o cortes de parásitos, etc).2.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA
DIRECTA (IFD).
2. 11. Se añade la solución de Ac fluorescente sobre el Ag, previamente fijado en un porta o
placa, se incuba, se lava y seleen los resultados.2.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
(IFI).El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego
seañade el anti-Ac fluoresceinado contra la región Fc del primero, se lavan y se leen
losresultados.Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con
enfermedadesautoinmunes.2.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA
PORCOMPLEMENTO.Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo
paso, después deañadir el Ac, se añade complemento fresco, que se fija alrededor de donde
se hanfijado los Ac. Debido a los pasos de amplificación de la vía clásica del
complemento,una molécula de Ac puede fijar muchas moléculas de C3b al Ag, que se
revelan con Acanti C3b fluoresceinado. Es una técnica mucho más sensible.En los tres
casos, los IC formados se ponen de manifiesto por observación del porta enun microscopio
provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). Elpatrón de
fluorescencia es característico de cada Ag.3. HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICAHistoquímica
es el estudio químico de los tejidos independientemente del método deanálisis empleado.
En la práctica se emplea la palabra para designar el método juntocon el auxilio de los
microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME).Esta técnica permite la identificación y
localización de compuestos o radicales químicosen las células y tejidos. Esto se consigue
 provocando reacciones que dan productosinsolubles que son coloreados o electrodensos y
visibles por el MO y el ME

3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (1)

A. Métodos de conjugación : Es posible conjugar las proteínas en el suero
completo o en fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos.
Se debe añadir al suero un amortiguador de
carbonato-bicarbonato para mantener condiciones
óptimas de pH (9.0), se agita en baño de hielo
añadiendo fluorocromo en un período de 15
minutos, se debe permitir una agitación toda la
noche ya que la conjugación es del orden del
100% en 24 horas.

4.
B. Purificación del conjugado : Se logra mediante
eliminación por diálisis de las sales
amortiguadoras y los elementos utilizados como
solventes del fluorocromo (acetona). Se utiliza extracción con carbón o
filtración en columna de sephadex para eliminar las sustancias fluorescentes
Que. no reaccionaron lo cual puede ocasionar tinción inespecífica.

5. C. Concentración del Anticuerpo : Se logra mediante tratamiento

con sales de amonio saturado. El almacenamiento es el solución
salina amortiguada con fosfato a pH 7.1.

6. D. Preparación de anticuerpos : Se obtienen mediante inmunización

en animales, la globulina humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a
intervalos de 3-4 semanas, la respuesta de anticuerpos se mide
mediante métodos serológicos y el suero se recoge 7-10 días luego
de la última inyección.

7. E. Manejo de cortes y tejidos : Los frotis y cortes montados que no

se estudien de inmediato se pueden proteger por sumersión en
carbowax y almacenamiento a -20°C. Los cortes liofilizados
protegidos con resina de poliester se pueden conservar varios
meses en un desecador a 0°C sin que pierda sus antígenos.
Es preferible trabajar con cortes fijados ya que.la tinción
inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaña de difusión o pérdida del
antígeno además se reduce la autoinmunofluorescencia tisular (vesículas y
partículas).
Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-
anticuerpo, el más empleado es alcohol etílico al 95% entre 4-30°C, alcohol
metílico, acetona o formol. Para bacterias es muy útil la fijación mediante
calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una
localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en
congelación.

8. FLUOROCROMOS - Sustancias que emiten un fotón

cuando son excitados por un fotón incidente.
9. Se deben utilizar colorantes que formen uniones con las proteínas pero
sin afectar los grupos de combinación específica del anticuerpo. La reacción
de unión ocurre entre los grupos amino y carboxilo de la proteína y los
grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El fenómeno de
fijación disminuye la fluorescencia de los fluorocromos de tal manera que los
conjugados solo muestran de 15-30% de la fluorescencia del colorante libre.
El pH afecta la fluorescencia y por esta razón se debe trabajar a pH
estable y adecuado dependiendo del colorante : fluoresceína (pH 8), rodamina
(pH 7), DANS (pH 1.6-14) (1).
El colorante fluorescente es una molécula que absorbe luz en una longitud
de onda, lo que excita los electrones y los lleva a un nivel energético mayor y
al volver a su nivel energético inicial emite luz en una segunda longitud de
onda. El isocianato de fluoresceína y el DANS muestran una
fluorescencia verde manzana bajo la luz ultravioleta y la
rodamina anarajando brillante (1).
Cuando el lapso de tiempo entre la absorcion de la luz activamente y la
emision de la nueva luz es mayor de 1/10000 segundos el fenomeno se
define como fosforescencia, pero cuando el fenomeno es menor de 1/10000
segundos se define como fluorescencia.

10.VENTAJAS Y DESVENTAJAS

11. VENTAJAS
- Se pueden obtener resultados rápidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto.
-Es sensible.Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis.

12. DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos (como toda técnica serológica).
 13.APLICACIONES
Esta técnica tiene múltiples
aplicaciones en diagnóstico e
investigación. Se ha utilizado en estudios
bacteriológicos, virales, parasitológicos. Se
ha utilizado en el estudio de la distribución
intracelular de las moléculas.

14. Microscopio de luz polarizada

15. Es un microscopio de campo claro al cual

se le adicionan filtros que modifican la luz.
También se denomina microscopio petrográfico o metalúrgico por su uso
inicial en el estudio de minerales, sin embargo su aplicación se ha
extendido al campo de la biología, medicina, química y muchas otras
disciplinas. Esta técnica microscópica puede emplear tanto la luz
transmitida como la luz incidente (trans-iluminación y epi-iluminación
respectivamente).

16. Comparada con las otras técnicas de incremento de contraste, el uso de la

luz polarizada es la más efectiva en el estudio de muestras ricas en
materiales birrefringentes, puesto que mejora de manera incomparable la
calidad de la imagen.
La luz proveniente de una fuente estándar de iluminación vibra y se
propaga en todas las direcciones, pero al pasar por un filtro polarizador las
ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un mismo plano. El polarizador
es un dispositivo que solo deja pasar la luz que vibra en un plano
determinado denominado eje de polarización.
17.

18. Esquema que muestra el efecto de filtros polarizadores en un rayo de luz. A

la izquierda la luz no polarizada se distribuye en todos los planos, pero al
pasar por el primer filtro (horizontal) éste sólo deja pasar las ondas que se
propagan en un plano horizontal. Si se interpone un filtro polarizador
orientado de manera vertical (rotado 90º en relación al horizontal) la luz
polarizada no pasa y se detiene. Tomada de Multimedia Encarta Luz
Polarizada (28).

19.

20. Muchos materiales tienen sus átomos uniformemente distribuidos en las

tres direcciones principales del espacio y presentan una máxima simetría
(cúbica o regular) o por el contrario, en algunos materiales sus átomos
 carecen de organización. Los primeros tienen las mismas propiedades
ópticas, independientemente de la dirección en que se midan. Cuando la
luz atraviesa sustancias con estas características, la velocidad es la misma
en todas las direcciones y gracias a ello se denominan isótropos. Por el
contrario, los materiales cuya organización cristalina es diferente
(hexagonal, trigonal, tetragonal, rómbico, entre otras) poseen sus
constituyentes dispuestos de manera asimétrica y varían según la dirección;
en consecuencia el comportamiento de las ondas luminosas también en
diferente, denominándose anisótropos (101). La estructura interna del
espécimen determina su comportamiento isótropo o anisótropo.

21.
Cuando se estudia el comportamiento de la luz al atravesar un espécimen,
los materiales anisótropos presentan distintos índices de refracción en
relación a la dirección del haz de luz; por el contrario, los materiales
isótropos presentan un índice de refracción constante. Cuando un rayo de
luz incide sobre la superficie de un material anisótropo transparente se
presenta el fenómeno de la doble refracción o birrefringencia; esto quiere
decir que se producen dos rayos refractados distintos que vibran en planos
diferentes que se propagan con diferentes velocidades en el interior del
material.

22.
Este microscopio facilita la investigación de las propiedades ópticas de los
especímenes y es ideal para observar y fotografiar aquellos elementos que
son visibles gracias a la anisotropía, de allí su uso en cristalografía; sin
embargo, también se emplea para estudiar el carácter birrefringente de
muchas estructuras celulares anisótropas.

23.
El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción de la luz
polarizada con los elementos birrefringentes del espécimen que producen
 las dos ondas refractadas, cada una de ellas polarizada en planos
perpendiculares. Una vez que las ondas de luz salen del espécimen lo
hacen de manera desfasada (ver fig. 6-9) pero son recombinadas al pasar
por otro filtro o filtro analizador. De esta manera, el microscopio de luz
polarizada permite el estudio comparativo entre minerales tomando en
cuenta la absorción del color e índices de refracción. Sin embargo, en
biología su principal utilidad consiste en distinguir las sustancias isotrópicas
de las anisotrópicas, revelando información detallada sobre la estructura y
composición de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines
diagnósticos (102). El ojo humano no capta las direcciones en las que vibra
la luz y la luz polarizada puede ser detectada como un incremento en la
intensidad luminosa o como un efecto de color. O en lo cotidiano, por
ejemplo, con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el
resplandor de la luz ambiental.

24. El 90% de las sustancias sólidas son anisotrópicas y como materiales

isotrópicos se pueden enumerar una variedad de gases, líquidos y cristales.

25. Este microscopio está equipado con:

26.
• Polarizadores: Un primer filtro polarizador colocado entre la fuente de luz y
el condensador que se puede rotar 360º y un analizador o segundo
polarizador, colocado por encima del objetivo, entre su lente posterior y el
tubo de observación o cámara fotográfica. También puede rotarse 90º o
360º. Los polarizadores antiguos conocido como nicoles estaban
conformados por un sistema de prismas de calcita descrito por W. Nicol y.
En los microscopios actuales el polarizador está constituido por una lámina
polaroid, que consiste en una película de un polímero transparente
(revestida de cristales minúsculos de sulfato de iodoquinina orientados en la
misma dirección) interpuesta entre dos placas de vidrio (102).
 27. • Condensador polarizador: Debe estar libre de desperfectos en sus
componentes ópticos.

28. • Platina circular: Con capacidad de rotar 360º para facilitar la orientación
del eje óptico con el campo de visión. Puede contener un vernier para medir
los ángulos de rotación. El espécimen debe rotarse y colocarse en una
posición diagonal en la cual los elementos anisotrópicos se observarán más
brillantes (birrefringentes).

29. • Objetivos polarizadores: Diferentes a los objetivos comunes, estos deben

estar libres de desperfectos y tener capacidad polarizadora. Son
ensamblados de manera que se evita en lo posible el daño de las lentes ya
que cualesquier daño por mínimo que sea compromete el rendimiento del
objetivo. Poseen la inscripción P, PO, o Pol.

30. • Ocular con una cruz visible en el campo visual: Para marcar el centro del
campo visual.

31. • Lente de Bertrand: Situada inmediatamente debajo del ocular, es

removible y sirve para ver la interferencia con la finalidad de ajustar la
iluminación de una manera precisa.

La figura muestra un ejemplo de fagocitosis.