Manual de Tecnicas de Laboratorio en Hematologia

M anual de técnicas de laboratorio
en hem atología
Manual de técnicas de laboratorio
en hematología
4.a edición
Joan Lluís Vives Corrons

Jefe de la Unidad de Eritropatología
Catedrático de Medicina Acreditado (ANECA)
Centro de Diagnóstico Biomédico (CDB-IDIBAPS),
Hospital Clinic, Universitat de Barcelona
Josep Lluís Aguilar i Bascompte

Consultor Sénior de la Unidad de Hematopatología
Profesor Asociado de Hematología,
Centro de Diagnóstico Biomédico (CDB-IDIBAPS),
ERRNVPHGLFRVRUJ
ELSEVIER A m sterd a m B arcelona B eijing B o sto n Filadelfia L ondres

MASSON M éxico M ilá n M u n ich O rla n d o París Rom a S idney T okio
ELSEVIER
MASSON
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Travessera de Grácia, 17-21.08021 Barcelona, España
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Advertencia
La medicina es un área en constante evolución. Aunque deben seguirse unas precauciones de seguridad
estándar, a medida que aumenten nuestros conocimientos gracias a la investigación básica y clínica habrá
que introducir cambios en los tratamientos y en los fármacos. En consecuencia, se recomienda a los lectores
que analicen los últimos datos aportados por los fabricantes sobre cada fármaco para comprobar las dosis
recomendadas, la vía y duración de la administración y las contraindicaciones. Es responsabilidad del
médico prescribir el tratamiento y las dosis más indicadas para cada paciente. Así mismo, la enfermera
debe realizar una correcta administración a cada paciente. Ni los editores ni los directores asumen res
ponsabilidad alguna por los daños que pudieran generarse a personas o propiedades como consecuencia
del contenido de esta obra.
E l Editor
Coautores
Josep Lluís Agu ilar i Bascom pte Josep E Nomdedéu

Consultor Sénior, Unidad de Hematopatología, Jefe del Servicio de Hematología Biológica,
CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona
Universitat de Barcelona
Francesc Solé Ristol
Dolors Colom er Pujol Jefe del Laboratorio de Citogenética, Institut de
Consultor Sénior, Unidad de Hematopatología, Recerca contra la Leucémia Josep Carreras (IJC),
CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic, Badalona
Neus V illam or Casas
Jo rdi Fontcuberta Consultora Sénior, Unidad de Hematopatología,
Jefe de la Unidad de Hemostasia y Trombosis, CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic,
Servicio de Hematología, Hospital de la Santa Creu Universitat de Barcelona
i Sant Pau, Barcelona
Eduard M uñiz D íaz

Director de la División de Inmunohematología,
Banc de Sang i Teixits, Barcelona
V
Colaboradores
V era Adem á Rosa M ontero

Laboratori de Citogenética, Institut de Recerca División de Inmunohematología,
contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona Banc de Sang i Teixits, Barcelona
Isabel Besson M aspla Roser Navarro García

Bióloga exbecaria de la Fundació Privada Clinic Unidad de Medicina Tropical,
per a la Recerca Biomédica, Hospital Clinic, Centro de Asistencia Primaria de Drassanes,
Universitat de Barcelona Barcelona
Montserrat Borrell N ú ria Nogués

Unidad de Hemostasia y Trombosis, Servicio de División de Inmunohematología,
Hematología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Banc de Sang i Teixits, Barcelona
Barcelona
C arlos Piera Peña
Carm en Canals Unidad de Radiofarmacia, CDIC-IDIBAPS,
División de Inmunohematología. Hospital Clinic, Universitat de Barcelona
A n na Puiggrós
M aribel D íaz-Ricart Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca
Unidad de Hemostasia, contra la Leucémia Josep Carreras (IJC),
Servicio de Hemoterapia y Hemostasia, Badalona
CDB-IDIBAPS, Hospital Clinic,
M .a Assum pció Pujades Beneit
Unidad de Eritropatología, CDB-IDIBAPS,
Blanca Espinet Hospital Clinic, Universitat de Barcelona
Laboratorio de Citogenética, Institut de Recerca
Án gel Remacha
contra la Leucémia Josep Carreras (IJC),
Servicio de Hematología Biológica,
Badalona
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona.
M ar M allo
M . Leticia Ribeiro
Directora de la Unidade de Anemias Congénitas,
contra la Leucémia Josep Carreras (IJC),
Centro Hospitalar de Coimbra, Portugal
Badalona
Josep M aría Ribera Santasusana
M .a del M a r M añ ú Pereira
Servicio de Hematología Clínica,
Unidad de Eritropatología, CDB-IDIBAPS,
Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona
M arta Salido
Carm en M artín Vega
Laboratorio de Inmunohematología,
contra la Leucémia Josep Carreras (IJC), Badalona
Isabel Tirado
Eva M artínez
Unidad de Hemostasia y Trombosis, Servicio de
División de Inmunohematología,
Hematología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau,
Barcelona
Jaum e M iró Balagué
Laboratori d’Análisis Clíniques,
Hospital de Viladecans, Viladecans (Barcelona)
Prólogo
Me enorgullezco de pertenecer a una generación de personas que hemos sido capaces de

adaptarnos con eficacia y mesura al m undo digital, pero sin caer en la obsesión adictiva de
las redes sociales. Personalmente empleo Internet para acceder a numerosas novedades
médicas e incluso no médicas, pero me sigue em ocionando coger entre mis manos
cualquier libro. Defiendo con firmeza la idea de que en el entorno editorial deberían
coexistir el formato digital e impreso. Por esta razón, me alegra tener la oportunidad de
escribir el prólogo a la cuarta edición de este valioso manual, al igual que pude hacerlo
en las tres ocasiones precedentes.
El diagnóstico hematológico se basa en dos fundamentos principales: a) un cuidadoso
estudio clínico del paciente realizado mediante la anamnesis y la exploración física, y
b) una detallada observación microscópica de la sangre y de la médula ósea. Por supuesto,
existen, además, interesantes m étodos complementarios cuyos avances se exponen con
detalle en este texto. Sin embargo, si se intentan obviar los dos fundamentos principales
pueden surgir en el proceso diagnóstico errores de bulto. Se ha llegado a afirmar que sin
el microscopio no existiría la hematología.
El padre del microscopio óptico fue el holandés Anton van Leeuwenhoek (1632-1723).
Este extraordinario personaje comenzó su carrera como aprendiz en un almacén, donde
los vidrios de aumento se empleaban para contar las fibras de ropa. Después desarrolló
pequeñas lentes de gran curvatura para conseguir aumentos de hasta 270 veces, el máxi
mo conocido en aquellos tiempos. Ello le permitió construir el microscopio óptico, con
el que consiguió muchos hallazgos biológicos, entre los que destaca el descubrimiento
de los corpúsculos sanguíneos.
El estudio de la sangre y de la médula ósea se puede realizar en el ámbito de las ciencias
básicas (biología y fisiología), de los laboratorios de análisis clínicos, y en departamentos
asistenciales (Medicina Interna y Pediatría). La profundización en los mecanismos de
la coagulación sanguínea, en especial la trombosis, hace que la hematología pueda ser
de interés para diferentes especialidades colaterales, como Neurología, Cardiología o
Angiología. Finalmente, en algunos países, como España, la especialidad de Hematología
asume también la hemoterapia, es decir, la obtención, almacenamiento y administración
de los productos de la sangre y sus derivados.
Como especialidad asistencial, la Hematología forma parte del gran tronco de la Me
dicina Interna, puesto que se ocupa de la etiología, diagnóstico, pronóstico, tratamiento
y prevención de las enfermedades de la sangre. Pero a diferencia de otras ramas de la
Medicina Interna, la Hematología se ha de ejercer con gran énfasis sobre los estudios
biológicos, entre los que destacan los realizados con el microscopio óptico. En más de
una ocasión hemos repetido la frase: «El microscopio óptico es para el hematólogo
clínico lo que es el fonendoscopio para el cardiólogo». Como queda ya referido, es muy
importante que no se pretenda sustituir los estudios citológicos realizados con el micros
copio con diversas técnicas más m odernas (citometría de flujo, citogenética y otras).
Por esta razón, me parece muy acertada la idea de colocar en el centro de la portada un
microscopio. Finalmente, es esencial que el citólogo y el clínico que asisten al paciente
actúen de forma coordinada.
X Prólogo
En alguna ocasión anterior me atreví a pronosticar un gran éxito para esta publica
ción. Los acontecimientos han corroborado mis predicciones, pues el hecho de contar
ya con varias reimpresiones y hallarse en su cuarta edición denota la gran aceptación
que está teniendo entre el público médico. Animo a los autores a que con su reconocida
ilusión, sigan ofreciendo en el futuro este gran servicio a la com unidad sanitaria del
ámbito hispano, consistente en la periódica actualización de su valioso manual.
C iril R ozm an
Prefacio
Después de más de siete años desde la última edición de este libro, han sido muchos
los avances que se han producido en el campo de la hematología diagnóstica, también
conocida como hematología biológica, lo que nos ha obligado a realizar una profunda
revisión y actualización de su contenido. Asimismo, la jubilación de algunos de nuestros
colaboradores ha llevado a la incorporación de nuevos autores elegidos entre los mejores
especialistas de cada una de las áreas del laboratorio hematológico. Una de ellas, quizá
la que ha experimentado un cambio más espectacular, ha sido la biología molecular y
citogenética aplicada al diagnóstico y seguimiento clínico de las hemopatías malignas.
Pero la biología molecular también ha sido clave para el diagnóstico y caracterización
molecular precisa de las anemias minoritarias (prevalencia < 5/10.000). Un ejemplo
de ello son las talasemias y hemoglobinopatías, cuyo capítulo ha sido íntegramente
actualizado, aportando los últimos métodos para su caracterización genética y m o
lecular, imprescindibles para realizar u n consejo genético y diagnóstico prenatal. Este
progreso ha seguido un curso paralelo y en gran parte promovido por el aumento de
la prevalencia de estas enfermedades en nuestra población, especialmente de la anemia
falciforme, como consecuencia del impacto inmigratorio de los últimos diez años. Otros
aspectos novedosos son todos aquellos procedimientos diagnósticos relacionados con
el análisis morfológico de las células sanguíneas y hematopoyéticas: se ha realizado
una total renovación y actualización del capítulo sobre métodos para la clasificación
de las hemopatías malignas, que incluye tablas y una extensa iconografía, inexistente
en ediciones anteriores. El capítulo dedicado a los trastornos del hierro se ha ampliado
con los procedimientos para el diagnóstico de las anemias ferropénicas refractarias al
hierro (IRIDA) y otras microcitosis familiares atípicas, que cursan con exceso de hierro,
y que hasta hace muy poco eran de mecanismo desconocido. Asimismo, se ha procurado
reflejar, con mayor precisión, el progreso experimentado p or los sistemas de análisis
celular m ediante citometría de flujo, tanto los aplicados al diagnóstico de laboratorio
general (analizadores hematológicos automatizados) como al diagnóstico hematológico
específico (citofluorómetros). Así, la descripción de los analizadores hematológicos
automatizados, actualmente empleados por prácticamente todos los laboratorios clínicos
para la obtención del hemograma y otras magnitudes hematimétricas, se ha centrado
en sus diferentes sistemas de análisis, que, en los últimos años, han alcanzado una fase
de plenitud. Asimismo, se ha actualizado y ampliado el capítulo sobre citofluorometría
aplicada al diagnóstico hematológico y su importancia en el estudio de las hemopatías
malignas y de ciertas enfermedades raras de la sangre como la hemoglobinuria paroxís-
tica nocturna (HPN). Como no puede ser de otra manera, en esta edición se han am
pliado y puesto al día los conceptos, en constante transformación y actualización, sobre
aseguramiento y control de la calidad pre- y postanalítica, estandarización, acreditación
y certificación y sistemas para la evaluación externa de la calidad. Finalmente, se han
renovado y actualizado en profundidad los capítulos dedicados a la inmunohematología
y el diagnóstico de las citopenias inmunes, así como también al examen morfológico de
hemoparásitos, tan importante en la actualidad debido al aumento de enfermedades tro
picales como consecuencia del trasiego poblacional y el aumento de los desplazamientos
a grandes distancias facilitados por el turismo low-cost.
X ll Prefacio
En resumen, como ya m encionábamos en ediciones anteriores, seguimos creyendo

que este M anual continuará siendo útil, no solo para el especialista en hematología,
sino de manera muy especial para el profesional del laboratorio clínico, a quien la des
cripción detallada y sistematizada de las diferentes técnicas diagnósticas, con su base
fisiopatológica e interpretación de resultados, facilitará su reproducción y puesta a
punto. Con el paso de los años, este Manual ha demostrado también su utilidad para el
médico general, ya que le introduce en el campo de la exploración directa de la sangre
y m édula ósea, aspectos escasamente considerados en el currículo universitario para
obtener el grado de Medicina.
Los Autores
Agradecimientos
Esta obra ha sido realizada en parte gracias a diversas ayudas a la investigación, es
pecialmente del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS), del Ministerio de Educación
(CAYCIT y MCyT) y de la C om unidad Europea (Health Program o f the European
Union). Asimismo, queremos expresar nuestro agradecimiento a la colaboración que
nos ha prestado el Dr. Josep M .a Ribera Santasusana en la descripción de aspectos
morfológicos especiales de los leucocitos («Características morfológicas especiales de
las células sanguíneas: el cuerpo Y», capítulo 2, pág. 57), y a las técnicos de laboratorio
de eritropatología M ontserrat Corbella y Pilar Gómez por su ayuda en la preparación de
algunos de los capítulos.
Indice de capítulos
1 La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes 1

/. L. Vives Corrons
2 Las células sanguíneas 30
/. L. Vives Corrons y J. L. Aguilar i Bascompte
3 Examen morfológico de las células sanguíneas 59
J. L. Vives Corrons y J. L. Aguilar i Bascompte
4 Métodos para el recuento manual de las células sanguíneas 105
J. L. Vives Corrons y M.aA. Pujades
5 Métodos para el recuento automatizado de las células sanguíneas 125
J. L. Vives Corrons
6 Hemoglobina 154
J.L. Vives Corrons y M.a A. Pujades
7 Eritrosedimentación y otras propiedades físicas 179
J. L. Vives Corrons y C. Piera Peña
8 Métodos para el estudio de la médula ósea 202
/. L. Aguilar i Bascompte y M. Díaz-Ricart
9 Funcionalismo granulocitario y métodos de estudio citoquímico 232
/. L. Vives Corrons y J. L. Aguilar i Bascompte
10 Métodos inmunológicos en hematopatología 262
N. Villamor
11 Métodos citogenéticos en hematopatología 288
V. Adema, M. Mallo, A. Puiggrós, M. Salido, B. Espinety F. Solé
12 Métodos de biología molecular en hematopatología 322
D. Colomer
13 Métodos para la clasificación de las hemopatías malignas 337
/. F. Nomdedéu
14 Métodos para la clasificación y el diagnóstico de las anemias 366
/. L. Vives Corrons
15 Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y el exceso de hierro 390
M. Sánchez y J. L. Vives Corrons
16 Métodos para el diagnóstico de la anemia megaloblástica 434
A. Remacha y J. L. Vives Corrons
17 Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasemias 452
M. M. Mañú Pereira y J. L. Vives Corrons
18 Métodos para el diagnóstico de las membranopatías eritrocitarias 496
M. L. Ribeiro, I. Besson y J. L. Vives Corrons
19 Diagnóstico de las eritroenzimopatías 536
M.aA. Pujades y J. L. Vives Corrons
XV
ERRNVPHGLFRVRUJ
xvi ín d ice de capítulos
20 Una visión práctica de los grupos sanguíneos eritrocitarios 587

E. Muñiz-Díaz, N. Nogués, R. Montero y C. Canals
21 Métodos para el diagnóstico de las citopenias inmunes 623
E. Muñiz-Díaz, C. Canals, R. Montero, E. Martínez y C. Martín-Vega
22 Hemostasia y trombosis. Conceptos básicos 665
/. Fontcuberta y M. Borrell
23 Métodos para el diagnóstico de los trastornos hemorrágicos y trombofilia 691
M. Borrell, I. Tirado y J. Fontcuberta
24 Identificación de hemoparásitos en sangre periférica 740
R. Navarro García
25 La calidad en el laboratorio de hematología 758
/. Miró y J. L. Vives Corrons
Indice alfabético 783
Incluye contenido web:

• Preguntas de autoevaluación a todos los capítulos
• Galería de imágenes
• Galería extra de imágenes: Atlas de citología básica para el laboratorio clínico.
• Vídeos (Loa Loa, Mansonella perstans, Oncocerca volvulus, Trypanosoma cruzi).
ERRNVPHGLFRVRUJ
C A P í T U L O 1
La sangre. Métodos de extracción y empleo

de anticoagulantes
Hematocrito e índices eritrocitarios
J. L. Vives Corrons
LA SANGRE. CARACTERÍSTICAS GENERAT ES

La sangre es un tejido líquido que circula perm anentem ente por el sistema vascular;
está formado por vasos sanguíneos de diverso calibre y en íntimo contacto con todas
las células del organismo. Ello es posible gracias a las contracciones del corazón, la re
tracción de los grandes vasos, el movimiento muscular y la fuerza de la gravedad. Gracias
al sistema vascular, la sangre puede realizar importantes e imprescindibles funciones
para la supervivencia de los tejidos. En ellos, el sistema vascular se ramifica y disminuye
progresivamente su calibre hasta constituir lo que se denom ina «microcirculación»,
formada principalmente por capilares (sistema capilar) y vasos de muy pequeño calibre.
Las paredes de los capilares perm iten el intercambio de agua y de sustancias diversas
entre el interior del sistema vascular y los tejidos del organismo, con ello se facilita la
oxigenación y el metabolismo celular (fig. 1-1).
La sangre tiene dos componentes fundamentales y bien diferenciados: las células
y el plasma que, junto al sistema vascular, constituyen el llamado «sistema sanguíneo».
Las células constituyen aproximadamente el 45% del volumen total de la sangre,
porcentaje que se conoce con el nom bre de valor hematocrito y confieren a la sangre
su carácter espeso. Todas ellas derivan de una única célula progenitora presente en la
médula ósea, llamada célula madre germinal o totalmente indiferenciada (stem-cell), que
puede ser de tres tipos concretos muy diferentes entre sí, tanto desde el punto de vista
morfológico como estructural y funcional: eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Cuando
envejecen, las células de la sangre son eliminadas de la circulación por los macrófagos
del sistema mononuclear fagocítico (SMF) presentes en la m édula ósea, pero también
en el bazo y el hígado.
Los eritrocitos son el componente celular más abundante, carecen de núcleo y organe-
las citoplasmáticas, y su única misión es el transporte de la hemoglobina a lo largo del sis
tema vascular con el fin de garantizar la oxigenación de los tejidos (función respiratoria).
Los leucocitos se clasifican en tres subtipos: granulocitos, linfocitos y monocitos.
Todos ellos tienen una función defensiva. Los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y
basófilos) la llevan a cabo mediante fagocitosis o ingestión de las sustancias extrañas
al organismo (formación de pus); los linfocitos, mediante un proceso de inmunidad al
producir anticuerpos contra las sustancias extrañas al organismo (inmunidad humoral)
o actuando directamente sobre las mismas (inmunidad celular). Los monocitos, aunque
fundam entalm ente tienen una función fagocítica (sangre) y m acrofágica (tejidos),
intervienen también en el proceso de inmunidad m odulando algunas de sus etapas.
2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos 1

ERRNVPHGLFRVRUJ
2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
FIGU RA 1-1. Esquema de la

microcirculación sanguínea.
Las plaquetas son fragmentos de unas células presentes en la médula ósea llamadas
megacariocitos. Tienen forma ovalada o redondeada, no tienen núcleo y son las células
sanguíneas más pequeñas. Debido a su capacidad para agregarse constituyen el prim er
tapón hemostático en caso de hemorragia. Contienen en su interior varias sustancias
que intervienen en la coagulación de la sangre (factores de coagulación), cuya misión
es prevenir la extravasación de sangre y contribuir a la coagulación sanguínea, impres
cindible para el cese de la hemorragia.
El plasma es un componente líquido transparente de color ambarino en el que se
hallan suspendidas las células. Constituye, aproximadamente, un 55% del volumen total
de la sangre y está formado por un 90% de agua y un 10% de sustancias sólidas que se
encuentran disueltas en el agua. Entre estas destacan las siguientes:
• Glúcidos (glucosa).
• Lípidos (colesterol, triglicéridos, etc.).
• Proteínas (albúmina, globulinas, fibrinógeno, etc.).
• Electrólitos (iones sodio, potasio, calcio, cloruro, etc.).
• Sustancias reguladoras (vitaminas, enzimas, hormonas).
• Productos de desecho (ácido úrico, urea, creatinina, bilirrubina, etc.).
Como puede apreciarse, estas sustancias son de naturaleza m uy diversa, aunque
entre todas ellas destacan las proteínas que, vertidas al plasma por diferentes células de
los tejidos a través de mecanismos diversos (excreción, exocitosis y recambio celular),
tienen en su mayoría funciones muy concretas, como por ejemplo: catálisis (enzimas),
defensa (inmunoglobulinas y complemento), transporte (transcobalamina, ceruloplas-
mina, transferrina), endocrina (hormonas) o hemostasia (factores de la coagulación),
entre otras. El plasma contribuye, también de forma muy importante, a la regulación del
pH y el transporte de gases respiratorios (oxígeno y dióxido de carbono).
La sangre realiza múltiples funciones y de todas ellas, las más importantes son las
siguientes:
• Función respiratoria: transporta oxígeno ( 0 2) desde los pulmones hasta las células
de los distintos tejidos, y el anhídrido carbónico o dióxido de carbono (C 0 2), desde
estas hasta los pulm ones, donde es eliminado. Esta función es realizada en gran
medida, por la hemoglobina.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 1 La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes 3
• Función nutritiva: vehiculiza sustancias nutritivas, absorbidas tras la digestión

y procedentes de los alimentos, hasta las células que las precisan.
• Función hormonal: transporta las diversas secreciones hormonales desde las glán
dulas que las producen hasta los órganos donde actúan (órganos diana).
• Función excretora: conduce los productos de desecho resultantes del catabolismo
celular hasta los órganos donde son eliminados, fundamentalmente los riñones.
• Función reguladora de la temperatura corporal: distribuye el calor a lo largo de
todo el organismo.
• Función de mantenimiento del volum en intersticial: conserva inalterado el vo
lumen del líquido contenido en el compartimento existente entre las células de los
tejidos (intersticio celular).
• Función de mantenimiento del pH a 7,4: contribuye al equilibrio entre las sustancias
de carácter ácido y las de carácter básico o alcalino.
• Función defensiva: protege al organismo de las infecciones. Esta función es desempe
ñada por los leucocitos y por algunas sustancias presentes en el plasma (anticuerpos y
componentes del complemento). Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B.
• Función hemostática: junto a las plaquetas, contribuye al cese de la hemorragia en
caso de lesión vascular mediante diversas sustancias denominadas genéricamente
factores de la coagulación (fibrinógeno, protrombina, etc.).
COMPONENTES DEL PLASMA. VALORES DE REFERENCIA

El estudio de la bioquímica plasmática constituye hoy en día, un importante capítulo del
laboratorio clínico general, y un complemento indispensable del diagnóstico. Resulta,
por tanto, de gran valor conocer los límites de referencia de las sustancias presentes en
el plasma, ya que constituyen un elemento de juicio para dem ostrar la presencia de
determ inados trastornos del organismo o para confirm ar el diagnóstico de muchas
enfermedades.
Actualmente, gracias a Internet existe una oferta tan amplia sobre valores de referencia
o interpretación de las variaciones de los constituyentes plasmáticos que muchas veces
resulta difícil realizar la elección más adecuada o correcta. Igualmente, las referencias
bibliográficas son tan extensas que la búsqueda de información útil conlleva un impor
tante consumo de tiempo. A ello hay que añadir las recientes recomendaciones sobre
term inología y unidades para la expresión de las m agnitudes biológicas realizadas
por sociedades internacionales relacionadas con las ciencias del laboratorio clínico como, por
ejemplo, las sociedades International Union o f Pure and Applied Biochemistry (IUPAC)
e International Federation o f Clinical Chemistry (IFCC).
Todos los aspectos relacionados con su variabilidad fisiológica, iatrogénica o
patológica, así como las recomendaciones internacionales sobre su nom enclatura y
valores de referencia pueden ser consultadas en el códex del laboratorio clínico. En
la tabla 1-1 se desarrolla una lista, no exhaustiva, de las principales sustancias que se
hallan en el plasma; la gran mayoría son ampliamente utilizadas para el diagnóstico
clínico, motivo p or el que se conocen como pruebas generales de bioquím ica plas
mática. En general, la m edida de su concentración se realiza a partir del suero, que es
el plasma desprovisto de fibrinógeno y factores de la coagulación. El suero se obtiene
de sangre coagulada y resulta más práctico que el plasma como material para el es
tudio de la bioquímica plasmática. En la tabla se indican los valores de referencia de
cada una de estas sustancias en unidades clásicas o convencionales y en unidades del
sistema internacional (SI).
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 1-1. Principales componentes del plasma y valores de referencia
Unidades Unidades Factor

clásicas internacionales de conversión
a j-antitripsina 150-350 mg/dl 1,5-3,5 g/1 0,184
a-fetoproteína 0-20 ng/ml 0-20 mg/1 1
Ácido ascórbico (vitamina C) 2-21 mg/dl 110-110 (xmol/l 56,78
Ácido hidroxibutírico <4,4 mg/dl <422,6 |xmol/l 96,05
Ácido láctico (lactato) 0,5-2,2 mEq/1 0,5-2,2 mmol/1 1
Ácido úrico (urato) 2-7 mg/dl 120-420 (xmol/l 59,48
Ácidos grasos libres 8-20 mg/dl 0,08-0,2 g/1 0,01
Adrenalina 20-60 pg/ml 116-669 nmol/1 0,00591
Alanina-aminotransferasa (ALT, 0-35 UI/1 0-0,58 nkat/1 0,016
SGPT)
Albúmina 3,2-5 g/dl 32-50 g/1 10
Aldolasa 0-6 UI/1 0-100 nkat/1 16,67
Aldosterona (adultos sentados) 40-310 ng/1 0,11-0,86 nmol/1 0,0227
Amilasa pancreática 0-130 UI/1 0-2,17 |xkat/l 0,016
Amonio 10-65 |xg/dl 5-0 mol 0,71
Angiotensina (ECA) 8-52 UI/1 0,957
Antígeno carcinoembrionario:
- CEA 12-5 <20 Ul/ml <20 kUI/1 1
- CEA 15-3 <35 Ul/ml <35 kUI/1
- CEA 19-9 <37 Ul/ml <37 kUI/1 1
Antígeno prostético específico
(PSA):
- Hombres < 40 años 0-2 ng/ml 0-2 n-g/1 1
- Hombres > 40 años 0-4 ng/ml 0-4 fxg/1 P A l
- Mujeres
Antitrombina III (inmunológica)
0-0,5 ng/ml
20-40 mg/dl
0-0,5 (xg/1
200-400 mg/1
>10d V / U I
Aspartato-aminotransferasa (AST, 0-35 UI/1 0-0,58 nkat/1 0,016
SGOT)
Bicarbonato 21-25 mEq/1 21-25 mmol/1
Bilirrubina:
- Total 0,1-1,2 mg/dl 2-20,5 |xmol/l 17,1
- Conjugada 0-0,2 mg/dl 0-4 (i,mol/l 17,1
Calcio 8,5-10,5 mg/dl 2,1-2,6 mmol/1 0,25
Calcio (iónico) 2-2,3 mEq/1 1-1,5 mmol/1 0,5
Calcitonina <100 pg/ml <100 ng/1 1
Carboxihemoglobina 2-5% SatHb (%) 0,2-0,5 Prop. SatHb 0,01
Carotenoides 50-250 |¿g/dl 0,9-4,6 |xmol/l 0,019
Ceruloplasmina 22-61 mg/dl 220-610 mg/1 10
17-cetosteroides (orina):
- Hombres 6-20 mg/día 20-70 (xmol/día 3,46
- Mujeres 6-17 mg/día 20-60 (xmol/día 3,46
Cinc 60-150 |xg/dl 9,18-22,95 (xmol/1 0,153
Citrato 1,3-2,6 mg/dl 67,7-135,3 (xmol/1 52,05
Cloruro 95-5 mEq/1 95-105 mmol/1 1
Cobre 70-140 |xg/dl 11-22 |xmol/l 0,157
Colesterol:
- Deseable <200 mg/dl <5,18 mmol/1 0,026
- Límites elevados 200-239 mg/dl 5,18-6,19 mmol/1 0,026
-Alto >240 mg/dl >6,2 mmol/1 0,026
Colesterol-HDL <35 mg/dl <0,91 mmol/1 0,026
Colesterol-LDL:
- Deseable <130 mg/dl <3,36 mmol/1 0,026
- Límites de riesgo 130-159 mg/dl 3,36-4,11 mmol/1 0,026
- Alto riesgo >160 mg/dl >4,13 mmol/1 0,026
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TABLA 1-1. Principales componentes del plasma y valores de referencia* (cont.)

Colinesterasa
Complemento C3 85-180 mg/dl 0,85-1,8 g/1 0,01
Complemento C4 10-40 mg/ml 0,1-0,4 g/1 0,01
Cortisol libre (8 h) 4-19 |xg/dl 10-52 nmol/1 27,59
Creatinina 0,6-1,2 mg/dl 50-10 mmol/1 88,4
Creatinina (aclaramiento) 72-140 ml/min 1,2-2,33 ml/s 0,017
Creatincinasa (CK) 0-150 UI/1 0-2,5 (xkat/1 0,016
Creatincinasa fracción MB >5% en infarto Fracción de 1 0,01
de miocardio
Diacepam:
- Terapéutico 0,1-1 |xg/ml 0,35-3,512 |j,mol/l 3,512
- Tóxico >5 (xg/ml >17,56 |xmol/l
Digoxina 0,9-2 ng/ml 1,15-2,56 nmol/1 1,281
Dióxido de carbono (C 02) 22-28 mEq/1 22-28 mmol/1 1
Enzima conversora de la <40 UI/1 <670 nkat/1 16,67
angiotensina (ECA)
Eritropoyetina 5-25,2 mUI/ml
Estradiol:
- Hombres Hasta 80 pg/ml Hasta 277 pmol/1
- Mujeres:
a) Fase folicular 25-120 pg/ml 86,7-400,16 pmol/1 3,467
b) Pico ovulatorio 160-400 pg/ml 554-1.386 pmol/1
c) Fase luteínica 80-250 pg/ml 277-867 pmol/1
d) Embarazo 500-26.600 pg/ml 1.733-92.222 pmol/1
e) Menopausia Hasta 30 pg/ml Hasta 104 pmol/1
Fenobarbital 15-40 mg/1 65-172 n-mol/l 4,31
Fenilalanina 6-27 mg/dl 63-1.634 (xmol/1 60,54
Fenitoína 10-20 |xg/ml 39,6-79,2 ixmol/1 3,96
Ferritina 15-300 ng/ml 33,7-674 pmol/1 2,247
Fibrinógeno 200-400 mg/dl 5,88-11,76 |xmol/l 0,0294
Folato 2,2-17 ng/ml 4,98-38,52 nmol/1 2,266
Foliculoestimulante (hormona)
- Hombres 1,3-19,3 mUI/ml 1,3-19,3 UI/1
- Mujeres:
a) Fase folicular 3,8-8,8 mUI/ml 3,8-8,8 UI/1 1
b) Pico ovulatorio 4,5-22,5 mUI/ml 4,5-22,5 UI/1
c) Fase luteínica 1,8-5,1 mUI/ml 1,8-5,1 UI/1
d) Posmenopausia 16,7-114 mUI/ml 16,7-114 UI/1
Fosfatasa ácida, prostética 0-0,8 UI/1 0-13,3 nkat/1 16,67
Fosfatasa alcalina 30-120 UI/1 0,5-2 (xkat/1 0,016
Fosfolípidos 150-250 mg/dl 48,3-80,5 mmol/1 0,323
Fósforo inorgánico 2,5-5 mg/dl 0,80-1,6 mmol/1 0,323
Fructosa 3,6-5,04 mg/dl 200-280 mmol/1 55,5
Galactosa <5 mg/dl <277,53 |Amol/l 55,506
Gammaglutamil transpeptidasa 0-30 UI/1 0-0,5 |xkat/l 0,016
(GGT)
Gases (arterial):
- Presión parcial de C 0 2 (PaC02) 35-45 mmHg 4,7-6 kPa 0,133
- Presión parcial de 0 2 (Pa02) 80-105 mmHg 10,6-14 kPa 0,133
-pH Unidades de pH Unidades de pH 1
Glicina 0,6-3,67 mg/dl 81-490 |xmol/l 133,3
Glucagón 60-170 pg/ml 60-170 ng/1 1
(Continúa)
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Glucosa 70-110 mg/dl 3,9-6,1 mmol/1 0,055
Glucohemoglobina 4,7-6,4 % de Hb 47-64 Prop, de Hb 1 0,01
Glutamina + histidina 6,59-12,86 mg/dl 451-880 |xmol/l 68,42
Gonadotropina coriónica humana Hasta 5 mUI/ml 5 UI/1 1
(HCG)
Haptoglobina 34-200 mg/dl 3,4-20 |xmol/l 0,1
25-hidroxivitamina D 18-36 ng/ml 45-90 nmol/1 2,49
Hidroxiprolina <1,3 mg/dl <10 |xmol/l 76,3
Hierro (total) 50-150 (xg/dl 8,95-26,85 |j,mol/l 0,179
Hierro (CTS) 200-400 |xg/l 35,8-71,6 |xmol/l 0,179
Histidina 5-16,6 mg/dl 32-107 |j,mol/l 64,45
Homocisteína (total) 0-1,68 mg/ml 0-12,4 |xmol/l 7,397
Hormona luteinizante:
- Hombres 0,6-12 mUI/ml 0,6-12 UI/1 1
- Mujeres:
a) Fase folicular 0,5-5 mUI/ml 0,5-5 UI/1 1
b) Pico ovulatorio 5-30 mUI/ml 5-30 UI/1 1
c) Fase luteínica 0,5-5 mUI/ml 0,5-5 UI/1 1
d) Menopausia > 12 mUI/ml >12 UI/1 1
Inmunoglobulina A (IgA) 70-400 mg/dl 0,7-4 g/1 0,01
Inmunoglobulina D (IgD) Hasta 15 mg/dl 150 mg/1 10
Inmunoglobulina E (IgE) <100 Ul/ml <160 int.u./l 10
Inmunoglobulina G (IgG) 680-1.530 mg/dl 6,8-15,3 g/1 0,01
Inmunoglobulina M (IgM) 40-240 mg/dl 0,4-2,4 g/1 0,01
Insulina 5-0 (¿Ul/ml 35-145 pmol/1 6,945
Isoleucina 4,8-12,8 mg/dl 37-98 pimol/1 76,24
Lactato deshidrogenasa: 105-350 UI/1 1,68-5,6 mkat/1 0,016
- LDH-1 10-60 UI/1 0,16-1 mkat/1 0,016
- LDH-2 20-70 UI/1 0,32-1,16 mkat/1 0,016
- LDH-3 10-45 UI/1 0,17-0,76 mkat/1 0,016
- LDH-4 5-30 UI/1 0,08-0,5 mkat/1 0,016
- LDH-5 5-30 UI/1 0,08-0,5 mkat/1 0,016
Lipasa 0-160 UI/1 0-2,66 mkat/1 0,016
Lípidos totales 400-850 mg/dl 4,0-8,5 g/1 0,01
Lipoproteína:
- (a) en suero <30 mg/dl <1,07 |xmol/l 0,0357
- X en suero Ausencia
Lipidograma:
-a 25-35% 0,25-0,35 0,01
- Pre-0 15-22% 0,15-0,22 0,01
-P 40-60% 0,4-0,6 0,01
- Quilomicrones 0% 0 0,01
- Triglicéridos <160 mg/dl <1,6 mmol/1 0,01
Litio:
- Fase aguda 0,8-1,4 mEq/1 0,8-1,4 nmol/1 1
- Mantenimiento 0,6-1,2 mEq/1 0,6-1,2 nmol/1
Magnesio 1,5-2 mEq/1 0,8-1 mmol/1 0,5
Metionina 0,16-0,64 mg/dl 11-43 p-mol/1 67,02
Nitrógeno ureico (BUN) 8-18 mg/dl 3-6,5 mmol/1 0,357
59-nucleotidasa 2-7 UI/1 0,03-0,28 mkat/1 0,016
Osmolalidad 280-300 mOsm/kg 280-300 mmol/kg 1
Osteocalcina:
- Hombres 11-46 jjLg/1 1,9-7,9 pmol/1 0,171
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- Mujeres:
a) Premenopausia 12-41 (xg/1 2,1-7 pmol/1 0,171
b) Posmenopausia 20-48 [xg/1 3,4-8,2 pmol/1 0,171
Parathormona <25 pg/ml <25 ng/1 1
Plasminógeno 1,2-3,3 mg/dl 0,136-0,373 mmol/1 0,113
Plasminógeno (activador/ 2-14 mUI/1 2-14 UI/1 1
inhibidor)
Potasio 3,5-5 mEq/I 3,5-5 mmol/1 1
Progesterona:
- Hombres Hasta 1,2 ng/ml Hasta 3,816 nmol/1
- Mujeres:
a) Fase folicular Hasta 1,6 ng/ml Hasta 5,09 nmol/1 3,18
b) Fase luteínica 1,6-23 ng/ml 5,09-73,14 nmol/1
c) Embarazo 7,4-110 ng/ml 23,53-349,8 nmol/1
d) Menopausia Hasta 0,9 ng/ml Hasta 2,86 nmol/1
Prolactina:
- Hombres 3-16 (xg/1 0,13-0,7 nmol/1 43,478
- Mujeres 3-19 (xg/1 0,13-0,83 nmol/1 43,478
Prolina 11,7-38,6 mg/dl 102-336 |xmol/l 86,86
Proteínas totales 6-8 g/dl 60-80 g/1 10
Proteínas por electroforesis:
- Albúmina 3,6-5,2 g/dl 36-52 g/1 10
- Globulina a t 0,1-0,4 g/dl 1-4 g/1 10
- Globulina a 2 0,4-1 g/dl 4-10 g/1
- Globulinas (3 0,5-1,2 g/dl 5-12 g/1 m
- Globulinas y 0,6-1,6 g/dl 6-16 g/1 10
Protoporfirina <4,5 |xg/g Hb 254 mmol/1 0,0177
Salicilato:
- Antipirético-analgésico 2-10 mg/dl 0,014-0,0724 mmol/1 0,00724
- Antiinflamatorio 10-25 mg/dl 0,0724-0,18 mmol/1 0,00724
- Nivel tóxico >30 mg/dl 0,2172 mmol/1 0,00724
Serotonina (5-hidroxitriptamina):
- Hombres 40-400 ng/ml 0,2272-2,272 (xmol/1 0,00568
- Mujeres 80-450 ng/ml 0,454-2,56 (xmol/1 0,00568
Sodio 135-145 mEq/1 135-145 mmol/1 1
Testosterona:
- Hombres 4-8 ng/ml 14-28 nmol/1 3,46
- Mujeres <0,6 mi <2 mmol/1 3,46
Teofilina 10-20 mg/1 55-111 (xmol/1 5,55
Tiroglobulina 0-60 ng/ml 0-60 mg/1 1
Tirotropina (TSH) 2-11 |xUI/ml 2-11 mUI/1 1
Tiroxina (T4) total 4-11 |xg/dl 51-142 nmol/1 12,87
Tiroxina (T4) libre 0,8-2,7 ng/dl 10-35 pmol/1 12,87
Transferrina 200-370 mg/dl 2-3,7 g/i 0,01
Triptófano mg/dl |xmol/l 48,97
Triyodotironina (T3) total 75-220 ng/dl 1,2-3,4 nmol/1 0,0154
Triyodotironina (T3) libre 1,4-4,4 pg/dl 0,022-0,068 pmol/1 0,0154
Troponina I (cardíaca) Hasta 1,5 ng/ml 1,5 mg/1 1
Troponina T (cardíaca) 0-10 ng/ml 0-10 mg/1 1
Valina mg/dl |xmol/l 85,5
Vitamina A (retinol) 10-50 (xg/dl 0,35-1,75 p,mol/l 0,035
Vitamina B6 (piridoxina) 4-43 mg/1 18-175 nmol/1 4,046
Vitamina B (cobalamina) 270-730 ng/1 200-540 pmol/1 0,738
(Continúa)
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Vitamina D:
- 1,25-dihidroxivitamina D 18-78 pg/ml 46,8-202,6 pmol/1 2,6
- 25-hidroxivitamina D 18-80 ng/ml 44,93-199,68 nmol/1 2,496
Vitamina E (tocoferol) 5-20 (xg/ml mg/dl 116-465,5 (xmol/1 23,22
Vitamina K 0,2-1,5 (jLg/1 ng/ml 0,44-3,33 nmol/1 2,22
* La terminología de algunos de estos com ponentes sanguíneos más utilizados en el diagnóstico, expresada siguiendo
el sistema internacional (SI) d e la IUPAC, se resume en el anexo.
MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE SANGRE

El estudio de la sangre requiere su previa extracción del organismo, que suele realizarse
generalmente por punción venosa o capilar. Las extracciones arteriales y las gasometrías ca
pilares requieren cuidados especiales, y no se utilizan para los exámenes que normalmente
se realizan en el laboratorio de hematología. Mediante sangre venosa, junto al estudio de
las llamadas magnitudes hematológicas generales (hematimetría), pueden hacerse otros
exámenes de laboratorio como, por ejemplo, la medida de las magnitudes bioquímicas
del plasma (o suero) y ciertos estudios microbiológicos. Mediante sangre capilar puede
realizarse un número mucho más limitado de procedimientos diagnósticos, por lo que
este método suele reservarse para pediatría cuando no existen venas accesibles, o cuando
lo único que se pretende es realizar un escrutinio neonatal de enfermedades raras
o minoritarias (prueba del talón). Al igual que cualquier otra técnica o práctica clínica,
tanto la extracción sanguínea como la recogida del espécimen deben realizarse en condi
ciones precisas. Ello es así ya que los resultados de los análisis de sangre dependen en gran
medida de la correcta obtención y manipulación inicial del espécimen, de forma que una
extracción deficiente puede ser la causa de resultados erróneos a pesar de emplear una co
rrecta metodología. Por ejemplo, una extracción dificultosa puede ser motivo de una falsa
trombocitopenia o de variaciones en el valor del hematocrito, que pueden alcanzar hasta
un 8% según que la extracción sanguínea se realice con el paciente sentado o en decúbito.
Punción venosa (venopuntura o flebotom ía)

La punción venosa es la forma de extracción sanguínea más empleada en la práctica
clínica, y su procedimiento ha sido estandarizado por el Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI), antiguo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
de EE. UU. El lugar de elección puede ser diverso (v. tabla 1-1), pero la zona más utilizada
es la fosa antecubital (venas basílica, mediana o cefálica), ya que a este nivel existe una piel
fina y móvil y las venas son de grueso calibre y relativamente superficiales (fig. 1-2). La
obtención de sangre mediante punción venosa con jeringa de extracción de un solo uso,
muy utilizada hace unos años, se ha reemplazado por alguno de los sistemas siguientes:
• Sistema colector de tubo al vacío que incorpora una aguja y un portatubos.
• Sistema de portatubos con dispositivo para expulsar la aguja.
• Adaptador para acoplar un catéter o una aguja de alas a un portatubos.
El sistema colector de tubo al vacío (fig. 1-3) es actualmente uno de los más empleados
ya que perm ite recoger la sangre directamente desde la vena o la jeringa en el tubo, y
evita así cualquier tipo de contaminación o contacto de la sangre con el operador. Con
ello se ha conseguido disminuir drásticamente el riesgo de contaminación del personal
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Capítulo 1 La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes
FIGU RA 1-2. Punción venosa. La aguja se halla

introducida en una vena superficial (mediana
cefálica) de la flexura del codo.
sanitario por virus en caso de muestras procedentes de pacientes HBV+ (hepatitis B),
HCV+ (hepatitis C) o HIV+ (virus de la inmunodeficiencia humana). En nuestro país
existen normativas referentes a las precauciones que ha de adoptar el personal sanitario,
especialmente el que realiza extracciones de sangre.
El volumen de sangre extraída mediante este sistema depende del tamaño del tubo y de
la intensidad de vacío, lo que permite, además, conseguir siempre una proporción correcta
entre la cantidad de sangre extraída y el anticoagulante. Además, la succión aplicada a la
vena puede controlarse manualmente, lo cual es importante en pacientes con venas de
pequeño calibre y que se colapsan fácilmente por efecto del vacío inducido por los tubos.
La cantidad total de sangre recogida con este sistema dependerá de la capacidad del tubo
recolector que, según las necesidades, varía generalmente entre 5 y 60 mi.
Si el empleo de una jeringa resulta inevitable, al transferir la sangre al tubo se debe ex
traer previamente la aguja de la jeringa y, una vez destapado el tubo, el cono o punta de esta
FIGU RA 1-3. Tubo al vacío para

la recogida de muestras sanguíneas.
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se introduce apoyándolo sobre la pared interna del mismo y, mediante una ligera presión
sobre el émbolo, se deja que la sangre resbale suavemente a lo largo de la superficie interna.
Las agujas a emplear para la extracción de sangre deben tener unas características es
tandarizadas, tanto en lo que atañe al diámetro interno (0,5 para el calibre 16 y 0,79 mm
para el calibre 21) como a su longitud (25 m m para el calibre 16 y 50 mm para el calibre
21). Las agujas de calibre 21 son las más empleadas para la punción venosa, mientras
que las de calibre 16 se utilizan frecuentemente en hemodonación y sangrías terapéuticas
(banco de sangre), ya que al tener mayor calibre facilitan el paso de los eritrocitos y
permiten la extracción de una mayor cantidad de sangre en un m enor tiempo.
Sistemática de la punción venosa:
• Se identifica al individuo que va a someterse a la punción venosa.
• Sistemática y preparación del material. Toda exploración y procedim iento sobre
pacientes debe hacerse con guantes de goma, protectores como medida de asepsia
propia de todo procedimiento invasivo. El material imprescindible (tubos, algodón,
torniquete, agujas, líquido antiséptico, etc.) debe estar preparado antes de iniciar el
proceso de la punción.
• Se coloca una cinta elástica, manguito o torniquete alrededor de la parte superior de
la zona donde se va a realizar la punción, con el fin de aplicar una presión próxima a la
diastólica y facilitar el acceso local de la sangre. Poco antes de la punción se aconseja
cerrar el puño, ya que de esta forma las venas se hacen más visibles.
• Una vez seleccionada la vena adecuada, se procede a la limpieza de la zona con un
algodón humedecido en alcohol etílico al 70%, y la introducción suave de la aguja
con un ángulo de aproximadamente 45°. Cuando la aguja penetra, se reorienta en
sentido paralelo a la vena y se procede a recolectar la sangre en el tubo. Al objeto de
evitar una concentración excesiva de las células sanguíneas en el lugar de la punción
(hemoconcentración), el m anguito debe retirarse inmediatamente después de in
troducida la aguja en la vena, y una vez extraída la sangre y retirada la aguja, la zona
de la punción se limpia con un poco de algodón aplicando cierta presión para evitar la
salida de sangre y prevenir la formación de un hematoma. Una vez que se ha recogido
la muestra de sangre, la zona elegida se cubre con una tirita o pequeña tira de es
paradrapo u otro material adhesivo, de tamaños diversos, con un preparado especial
en su centro, para desinfectar y proteger heridas pequeñas.
El esquema general de las etapas imprescindibles para realizar una buena punción
venosa viene indicado en el cuadro 1- 1. Existen diversas circunstancias que imposibilitan
o desaconsejan la práctica de la punción venosa en el lugar señalado (cuadro 1-2), por
lo que en tales casos es necesario recurrir a otras zonas (cuadro 1-3).
Punción capilar
La punción capilar fue, durante muchos años, el procedimiento de elección para extraer
sangre destinada a la realización de los recuentos sanguíneos. No obstante, el empleo de
sistemas automáticos para el análisis y la generalización del sistema de colección mediante
tubos al vacío ha limitado su práctica a pediatría (recién nacidos) para obtener una muestra
de sangre destinada al cribado neonatal de enfermedades metabóücas y hemoglobinopatías
(prueba del talón), o a pacientes que, por diversos motivos, no pueden ser sometidos a
una punción venosa. Mediante la punción capilar se extraen una o varias gotas de sangre,
y constituye el procedimiento de elección para el control de la glucemia en pacientes
diabéticos y para la realización de análisis sanguíneos en niños de corta edad y recién
nacidos. En adultos, el lugar de elección para realizar una punción capilar es el pulpejo
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CUADRO 1-1. Etapas imprescindibles para realizar la punción venosa
Preparación del paciente

1. Correcta identificación del paciente (nombre y dos apellidos)
2. Haga constar siempre la edad
3. Condiciones de la extracción (reposo y ayunas)
4. Pregunte si es fumador
5. Posición (sentado)
Técnica
1. Aplique el torniquete (esfigmomanómetro o cinta elástica)
2. Cierre el puño del paciente
3. Seleccione la vena o lugar de punción
4. Limpie con alcohol el lugar elegido para realizar la punción
5. Revise que la aguja y la jeringa se hallen en perfectas condiciones
6. Sujete el brazo del paciente
7. Practique la punción
8. Libere el torniquete
9. Abra el puño del paciente
10. Extraiga la aguja
11. Presione suavemente el lugar de la punción con un algodón humedecido en alcohol
12. Recoja el espécimen y realice la correcta identificación del mismo
13. Agite con suavidad la sangre total con anticoagulante y compruebe que no existan
microcoágulos
CUADRO 1-2. Causas que dificultan la práctica de la punción venosa
• Edad
• Recién nacidos y niños de corta edad: venas pequeñas y poco visibles
• Adultos y personas de edad avanzada: venas esclerosadas o difíciles de visualizar
• Obesidad
• Quemaduras extensas
• Enfermos sometidos a tratamientos que utilizan predominantemente la vía intravenosa
(p. ej., administración de citostáticos)
• Enfermos con tendencia a desarrollar tromboembolismos
CUADRO 1-3. Zonas diferentes de la región antecubital donde se puede practicar

una punción venosa
• Recién nacidos
• Vena yugular o femoral
• Vena umbilical
• Senos venosos del cráneo
• Niños de corta edad
• Vena yugular o femoral
• Adultos
• Venas superficiales del dorso de la mano
• Venas superficiales del dorso del pie
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FIGURA 1-4. Gota de sangre a la

altura del pulpejo del dedo después de
practicar una punción capilar.
del dedo (mediano o anular) cerca del borde (fig. 1-4); en niños de corta edad, el lóbulo
de la oreja, y en recién nacidos, el talón del pie (fig. 1-5).
Sistemática de la punción capilar:
1. Para la punción capilar se emplea una microlanceta estéril desechable (fig. 1-6)
de 2,5 m m de largo o un dispositivo automático especial.
2. La zona de elección es la yema del dedo índice o mediano (v. fig. 1-6) o el talón,
evitando la almohadilla (v. fig. 1-5). Antes de realizar la punción, y para mejorar
el flujo local de sangre, puede aplicarse una ligera presión longitudinal a lo largo
del dedo o calentar la extremidad con agua tibia o compresas a una temperatura
no superior a 40 °C.
FIGURA 1-5. Región del talón del pie para

realizar la punción en recién nacidos.
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FIGU RA 1-6. Microlanceta estéril

y desechable para la realización de
la punción capilar.
3. Una vez realizada la punción es recomendable desechar la prim era gota, pero si
la salida de sangre ha sido dificultosa, y se ha exprimido excesivamente la zona,
es aconsejable repetirla, ya que la m uestra puede haber sufrido hemodilución.
4. Para recoger la m uestra de sangre obtenida suele utilizarse una micropipeta o
un tubo capilar, aunque según la finalidad del estudio a realizar puede utilizarse
también un portaobjetos, tiras reactivas o papel de filtro especial para el estudio
de enfermedades metabólicas o el cribado neonatal de enfermedades minoritarias.
Existe también la posibilidad de utilizar tubos tipo BD Microtainer® para recoger,
transportar y almacenar muestras de sangre obtenidas por punción capilar, pero
únicamente para pruebas en las que se usa suero o plasma. En cualquier caso,
no debe olvidarse recoger también una pequeña gota de sangre para realizar una
extensión.
Causas de e rro r en la extracción sanguínea

La correcta interpretación de los valores hematimétricos obtenidos con la sangre extraída
mediante los procedimientos citados depende, en gran parte, de la correcta metodología
empleada en la realización de la extracción sanguínea. Así, una extracción deficiente
puede falsear m uchos resultados obtenidos m ediante procedimientos analíticos co
rrectos. Las causas de error pueden ser muy diversas, y las más importantes se resumen
en el cuadro 1-4.
EMPLEO DE ANTICOAGULANTES
Hacia los 3-7 min de practicada una extracción, la sangre sufre un proceso espontáneo de
coagulación. En una prim era etapa se forma una masa semisólida de color rojo llamada
coágulo, constituido por una red de fibrina que engloba todas las células sanguíneas, y que
posteriormente se contrae liberando un líquido de composición similar al plasma que se
conoce como suero. El suero tiene la misma composición que el plasma, a excepción del
fibrinógeno y diversos factores de coagulación que son consumidos durante el proceso.
Una vez finalizada la coagulación, el suero aparece como una fase bien diferenciada del
coágulo, constituido por una red de fibrina que engloba en su interior la totalidad de las
células sanguíneas. El suero se emplea para casi todos los estudios bioquímicos habituales
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CUADRO 1-4. Causas de error en la extracción sanguínea mediante punción venosa
• Empleo de tubos o jeringas de recogida húmedos o sucios

• Empleo de anticoagulantes inadecuados o en proporción equivocada
• Colocación del manguito esfigmomanométrico durante un tiempo excesivo
antes de practicar la punción venosa
• Perforación de la vena por la parte profunda con formación de un hematoma
y la subsiguiente lesión de tejidos, que al producir la entrada de factores hísticos puede
acelerar el proceso de la coagulación sanguínea
• Extracción excesivamente lenta con coagulación parcial de la sangre en la jeringa
o en el tubo de recogida
• Introducción de la sangre en el tubo de recogida por vaciamiento de la jeringa
bajo presión y con la aguja puesta, lo que facilita la formación de espuma y hemolisis
• Agitación defectuosa de la mezcla sangre-anticoagulante: excesiva (hemolisis)
o insuficiente (microcoágulos)
• Errores en la identificación del paciente al realizar la recogida del espécimen sanguíneo:
• Nombre equivocado o incompleto
• Código numérico erróneo
• Fecha de extracción incorrecta
• Llenado insuficiente de los tubos al vacío que contienen una cantidad fija
de anticoagulante
• En caso de punción digital, realizar una presión excesiva en la yema del dedo para forzar
la salida de la sangre
de la analítica sanguínea y el coágulo puede utilizarse para investigar la presencia de las

células de lupus eritematoso (células LE).
Para evitar el fenóm eno de la coagulación puede emplearse la desfibrinación o
los anticoagulantes. C uando se desea obtener sim ultáneam ente suero y células sin
contaminación plaquetaria, la sangre debe someterse a una desfibrinación, pero si se
desea analizar la sangre total (hematimetría), el plasma (hemostasia) o fraccionar sus
componentes celulares (eritrocitos, leucocitos o plaquetas) es imprescindible el uso de
anticoagulantes.
Para los estudios de la sangre se debe saber cuál es en cada momento el anticoagulante
idóneo y mantener siempre una adecuada proporción entre este y el volumen de sangre
extraída. Excepto la heparina, que actúa inhibiendo la acción de la trom bina, prácti
camente todos los anticoagulantes empleados habitualmente actúan fijando el calcio
y evitando el desarrollo de la coagulación sanguínea. Existen diversos efectos adversos
que los anticoagulantes pueden producir sobre las células sanguíneas (cuadro 1-5),
por lo que, en hematología, los anticoagulantes que se emplean para los estudios de las
mismas (hemograma y examen morfológico de sangre periférica) deben cumplir los
siguientes requisitos:
• No alterar el volumen de los eritrocitos.
• No producir hemólisis.
• Evitar la agregación de las plaquetas.
• No alterar la morfología de los leucocitos.
A diferencia de lo que sucede con el suero, cuyo análisis puede realizarse mucho
tiempo después de la extracción debido a la posibilidad de su congelación o liofiliza-
ción, la sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, ya que se
deteriora con gran facilidad incluso m antenida bajo refrigeración (4 °C). El tiempo
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 1-5. Efectos adversos de los anticoagulantes sobre las células sanguíneas
Eritrocitos
Crenación (equinocitosis)
Plaquetas
Hidratación (aumento del tamaño)
Leucocitos
• Citoplasma
• Vacuolización (neutrófilos y monocitos)
• Refuerzo de la granulación azurófila (granulación tóxica)
• Núcleo
• Apoptosis y cariorrexis (neutrófilos)
• Hidratación (linfocitos y monocitos)
• Desestructuración de la cromatina (todas las células)
máximo que puede transcurrir entre la extracción y la realización de las diversas pruebas
hematológicas depende de la naturaleza de las mismas, pero, en general, no debe ser
superior a las 24 h (tabla 1-2). Esto debe tenerse especialmente en cuenta si se ha de
emplear sangre mantenida anticoagulada con EDTA para realizar el examen morfológico
del frotis sanguíneo. Actualmente, la centralización del laboratorio clínico obliga al tras
lado de las muestras sanguíneas, con lo que la realización de los análisis puede tener lugar
después de muchas horas de haberse efectuado la extracción. Si bien esto puede carecer
de importancia para las pruebas de bioquímica plasmática, ya que son muy estables
TABLA 1-2. Tiempo máximo de conservación de la sangre total para la realización

de las pruebas hematológicas más habituales
Prueba Tiempo máximo Temperatura (°C) Anticoagulante

de conservación (h)
Recuento de eritrocitos 48 4 EDTA
24 25 EDTA
Hemoglobina 48 4 EDTA
24 25 EDTA
Hematocrito 48 4 EDTA
24 25 EDTA
Indices eritrocitarios (VCM, 24 4 EDTA
HCM yCCM H) 8 25 EDTA
Recuento de leucocitos 24 4 EDTA
8 25 EDTA
Fórmula leucocitaria 12 4 EDTA
4 25 EDTA
Recuento de eosinófilos 4 4 EDTA
2 25 EDTA
Recuento de plaquetas 8 4 EDTA
4 25 EDTA
Eritrosedimentación 4-5 25 Citrato
Pruebas de hemólisis 2 25 Heparina
ERRNVPHGLFRVRUJ
bajo refrigeración, no sucede lo mismo con las células sanguíneas, que pueden sufrir
importantes alteraciones morfológicas, fáciles de confundir con las que se observan en
algunos síndromes mielodisplásicos.
Los anticoagulantes se suministran en forma sólida o líquida. Los primeros están es
pecialmente indicados para la determinación de las magnitudes generales de la sangre
(hemograma) puesto que no producen, como los anticoagulantes líquidos, dilución
de la sangre. Actualmente pueden adquirirse tubos sellados al vacío que contienen los
diferentes anticoagulantes. El tipo de anticoagulante que contiene el tubo viene indicado
por el color del tapón (fig. 1-7).
Sal sódica o potásica del ácido etilenodiam inotetraacético:

tubos de tapón color violeta
Las sales de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) realizan su acción mediante un
efecto quelante sobre el calcio (Ca++), fijándolo pero sin llegar a precipitarlo (fig. 1-8).
En la práctica se han empleado sales de EDTA (C 10H 16N2O8) disódicas (EDTA-Na2),
dipotásicas (EDTA-K2) y tripotásicas (EDTA-K3); las de potasio son más recomendables
que las de sodio por su mayor solubilidad en la sangre, especialmente en su forma seca.
El EDTA-K3al suministrarse en forma líquida puede ejercer un cierto efecto de dilución
sobre el espécimen de sangre total. Además, esta sal de EDTA tiene el inconveniente
de que a determinada concentración disminuye el tamaño de los eritrocitos (volumen
corpuscular medio, VCM), especialmente a partir de las 2 h de realizada la extracción, y
puede inducir una agregación de las plaquetas in vitro que puede ser causa de una falsa
plaquetopenia cuando su recuento se realiza mediante métodos electrónicos. Por todo
ello, el Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH, International
Council p o r Standardization in H aematology) considera com o anticoagulante de
elección en hematimetría a la sal dipotásica del EDTA (EDTA-K2), ya que posee cuatro
ventajas:
Separador Citrato
Nada ae gel ED TA sódico Heparina
V T W V 1
J L
FIGU RA 1-7. Tubos al vacío para la recogida de sangre con diferentes tipos de coagulante. A. Sin
coagulante. B. Con coagulante.
ERRNVPHGLFRVRUJ
o
//
c
-O"
CH-
n
CH.
-O
FIGURA 1-8. Esquema

de la estructura tridimensional de
la molécula del EDTA.
1. Respeta la morfología eritrocitaria y leucocitaria, de m anera que perm ite una

demora de 2 h en la realización de la extensión sanguínea después de la extracción.
2. Asegura la conservación de las células sanguíneas durante 24 h si la sangre se
mantiene a 4 °C.
3. Al suministrarse en forma seca no ejerce ningún efecto de dilución sobre la sangre
total.
4. Al inhibir la aglutinación de las plaquetas, facilita el recuento de las mismas o su
apreciación semicuantitativa a partir de la extensión.
La concentración de EDTA-K2 recomendada es de 1,5 a 2,2 mg (3,7-5,4 jimol) por
cada mililitro (mi) de sangre. Esta proporción debe cumplirse siempre, ya que un exceso
de anticoagulante puede inducir modificaciones leucocitarias o de la morfología eri
trocitaria (retracción celular con disminución del valor hematocrito y un aumento de la
concentración corpuscular media de hemoglobina). Por el contrario, un exceso de sangre
en relación con la cantidad de anticoagulante conduce a una insuficiente coagulación
sanguínea y formación de microcoágulos que pueden alterar los resultados de diversas
pruebas diagnósticas. En este sentido, el empleo de tubos al vacío con una cantidad fija
de EDTA-K2para un volumen determinado de sangre es la práctica más recomendable.
H eparina: tubos de tapón color verde

La heparina es un anticoagulante fisiológico y, por tanto, ideal para evitar la coagulación
sanguínea in vivo. El nombre de heparina proviene del griego r\nap (hepar), que significa
hígado, ya que fue aislada por primera vez de las células de este tejido. Estructuralmente es
un mucopolisacárido ácido (fig. 1-9). Presenta el inconveniente de que, si no se agita rápida
y uniformemente con la sangre inmediatamente después de extraída, pueden formarse m i
crocoágulos. Aunque tiene la ventaja de no alterar el volumen eritrocitario ni la morfología
de los leucocitos, su empleo no es recomendable para la realización de la extensión sanguínea
ya que mediante los colorantes habituales produce una coloración de fondo excesivamente
azulada. Este fenómeno se intensifica sensiblemente cuando en el plasma existen proteínas
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FIGU RA 1-9. Estructura química de la molécula de heparina.
anormales debido al consiguiente cambio de pH. La heparina es el anticoagulante de elección

para realizar estudios eritrocitarios (pruebas de hemólisis, principalmente) o pruebas es
peciales como el estudio de las actividades enzimáticas o hemoglobinopatías. También es el
anticoagulante recomendado para recoger las muestras destinadas a estudios de citogenética.
La heparina (de sodio o de litio) puede usarse en forma seca o líquida. La proporción
aconsejable es de 15-20 UI (0,1-0,2 mg) de heparina p o r 1 mi de sangre (1 mg de
heparina en polvo equivale aproximadamente a 125 UI).
C itrato sódico: tubos de tapón color azul

El citrato sódico es el anticoagulante de elección para determinar la eritrosedimentación
o velocidad de sedimentación globular (VSG) y para las pruebas de coagulación. Al
igual que la mezcla de W introbe, actúa a través de la precipitación de calcio. Se emplea
en forma de solución de citrato trisódico de 0,106 M (31,3 g/1 de C6H 50 7Na3, 2 H 20 o
bien 38 g/1 de C6H50 ?Na3, 11 H 20 ) . La proporción de anticoagulante-sangre depende
de la prueba que hay que realizar.
• Para la determinación de la VSG, la proporción utilizada es de 1/4 (1 vol. de solución
de citrato sódico y 4 vol. de sangre).
• Para las pruebas de coagulación se emplea en proporción de 1/9 (1 vol. de solución
de citrato sódico y 9 vol. de sangre).
Solución de ácido cítrico-(citrato)-dextrosa:

tubos de tapón color amarillo
El ácido cítrico-(citrato)-dextrosa (ACD) tiene las mismas indicaciones que el citrato
sódico, pero debido a las características de su pH es el anticoagulante de elección para
asegurar una buena conservación de los eritrocitos (banco de sangre, transfusiones y
estudios metabólicos eritrocitarios).
La mezcla está constituida por:
• Ácido cítrico m onohidrato, 8 g.
• Citrato trisódico dihidrato, 22 g.
• Dextrosa, 25 g.
• H20 destilada, cantidad suficiente para (c.s.p.) 1.000 mi.
Se emplea en la proporción de 1/4 (1 vol. de solución ACD y 4 vol. de sangre) y se recomien
da para la realización de estudios inmunofenotípicos leucocitarios y cultivos de médula ósea.
O tros anticoagulantes de uso m enos frecuente

Mezcla de oxalato amónico y potásico (mezcla de Wintrobe)
Este anticoagulante, empleado durante m ucho tiempo para la realización del hemo-
grama, ha sido sustituido en la actualidad p or el EDTA. A diferencia de este, actúa
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por precipitación del calcio, con lo que este último deja de actuar en el proceso de la
coagulación sanguínea. Es fácil de preparar, pero tiene el inconveniente de que, al alterar
sensiblemente la morfología eritrocitaria, puede producir variaciones imprevisibles del
VCM. Se emplea en forma de polvo, constituido por oxalato amónico y oxalato potásico
en la proporción de 3:2, respectivamente. La cantidad recomendada es de 2 mg de mezcla
por cada mililitro de sangre.
Oxalato sódico
Recomendado, al igual que el citrato sódico, para las pruebas de hemostasia, se emplea en
forma de solución de oxalato sódico (0,1 M) en la proporción de 1/4 (1 vol. de solución
por 4 vol. de sangre).
VALOR HEMATOCRITO E ÍNDICES ERITROCITARIOS

(VCM, HCM Y CMHC)
El hematocrito (Hto) es el nombre que se da a la fracción de volumen eritrocitario (fr), y
corresponde al volumen (vol.) ocupado por los eritrocitos (Ers) en relación al volumen
total de sangre (ir.vol.). Es por ello que, siguiendo las recomendaciones del SI, se expresa
como San-Ers; fir.vól.
Al tratarse de una relación entre dos magnitudes volumétricas, su unidad equivale a
1 (1/1) y su valor está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina.
Es por ello que su m edida constituye el procedimiento más simple para el diagnós
tico de anemia. Así, un descenso de H to es indicativo de anem ia, m ientras que un
aum ento de eritrocitosis o aum ento de la masa eritrocitaria lo es de poliglobulia. No
obstante, debe tenerse siempre en cuenta que el valor diagnóstico del Hto depende en
gran medida de que el volumen plasmático sea normal. Así, un descenso del volumen
de plasma (hemoconcentración) se traducirá en un aumento relativo del Hto (y también
de la concentración de hemoglobina) y, por tanto, en una falsa eritrocitosis (o poliglo
bulia). Por el contrario, un aumento del volumen plasmático (hemodilución) producirá
un descenso del Hto (y también de la concentración de hemoglobina) y, por tanto, una
falsa anemia. O tro factor a tener en cuenta es que el H to medido a partir de sangre
venosa es siempre algo inferior al que se obtiene cuando se emplea sangre capilar. Las
punciones digitales suministrarán valores ligeramente más elevados de hematocrito que
las punciones venosas. De la misma manera, el valor hematocrito medido mediante sis
temas electrónicos (analizadores hematológicos automatizados) tiene también un valor
algo inferior al obtenido por centrifugación, porque no tiene en consideración el plasma
atrapado entre los eritrocitos.
El método de referencia para determinar el valor H to es la centrifugación de sangre
total en tubo capilar (micrométodo) o m ediante tubo de W introbe (macrométodo),
aunque este último es menos recomendable debido a su mayor grado de inexactitud e
imprecisión.
Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos
cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga.
Por ello, entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos
empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. Ello obedece a
que, por elevada que sea la fuerza centrífuga a que se somete la columna de sangre total,
siempre permanece cierta cantidad de plasma atrapado entre los eritrocitos (fig. 1-10),
fenómeno que es todavía más acusado cuando estos son poco deformables y presentan
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Plasma
CENTRIFUGACIÓN
Paquetes
de eritrocitos
FIGU RA 1-10. Esquema del

hematocrito por centrifugación.
Suspensión Plasma Obsérvese el efecto del plasma
sanguínea atrapado atrapado entre los eritrocitos que
falsea el valor del hematocrito real.
una alteración de la forma. Este efecto es siempre más notable en el macrométodo que
en el micrométodo, hecho por lo que este último es preferible al anterior.
En la actualidad, todos los analizadores hematológicos automatizados suministran,
dentro del contexto del hemograma, un valor de hematocrito «electrónico» calculado por
el propio sistema a partir del valor del VCM (obtenido por conductividad o dispersión
lumínica) y la concentración de Ers. Este valor (Hto electrónico), como se ha mencionado
anteriorm ente, no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el
efecto de las restantes células sanguíneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3%)
al obtenido por centrifugación.
M étodo del m icrohem atocrito

Consiste en aplicar a la sangre total colocada en un tubo capilar una fuerza centrifuga
de 12-15 X 103 r.p.m. Por su mayor rapidez, simplicidad y fiabilidad, es el m étodo
recomendado por el ICSH y el CLSI.
Material
• Sangre total (50 |xl) tratada con EDTA-K3 (1,5-2,2 mg/ml).
• Tubos capilares de vidrio desechables y no graduados (Soda lime glass type II. Federal
Specification DD-G-541) cuyas dimensiones son: 1 m m de diámetro interior, 7,5 cm
de longitud y grosor de pared entre 0,18 y 0,23 m m (fig. 1-11). Estos tubos capilares
vienen comercializados con y sin anticoagulante. Los capilares con anticoagulante
FIGU RA 1-11. Tubos capilares para la determinación del hematocrito. La franja en el tubo superior
indica que lleva anticoagulante en su pared interna.
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contienen heparina a la concentración de 2 UI y una franja roja en uno de sus ex

tremos. Los capilares sin anticoagulante carecen de la franja roja. Este tipo de capilares
son los que se recomiendan en la práctica clínica.
• Cera o plastilina para cerrar uno de los extremos del tubo capilar una vez lleno de
sangre.
• Centrífuga de microhematocrito (fig. 1-12) con radio superior de 8 cm, que permite
aplicar una fuerza centrífuga que varía entre 10.000 y 15.000 r.p.m. durante un tiempo
controlado automáticamente.
• Lector de microhematocrito capaz de indicar directamente la relación entre la lon
gitud total de la columna sanguínea y la correspondiente a la columna de eritrocitos
(fig. 1-13).
Método
1. Se llena hasta un máximo de 3/4 partes de la capacidad del tubo capilar con sangre
total y se sella un extremo del mismo con cera o plastilina.
2. Se centrifuga el capilar durante 5 m in (o 10 m in si el hem atocrito es >0,5).
La temperatura no debe ser superior a 40 °C durante todo el tiempo que dure la
centrifugación.
3. Una vez finalizada la centrifugación, se comprueba que no se haya producido
salida de sangre del capilar y se extrae de la centrífuga. Para leer el resultado puede
emplearse un lector de microhematocrito, colocando el tubo en una ranura al
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A f3
FIGU RA 1-13. A. Lector de microhematocrito para determinar el valor hematocrito. B. Vista superior
del plato giratorio de la centrifugadora.
efecto, de modo que la línea de separación plasma/eritrocitos coincida con la línea

vertical de la ranura. Se mueve el disco giratorio de manera que una de las líneas
que lleva grabadas pase por el límite inferior de la columna eritrocitaria y la otra
por el límite superior del plasma (fig. 1-14). El valor del hematocrito puede leerse
directamente sobre el lector. Si no se dispone de lector, el hem atocrito puede
determinarse mediante una simple regla graduada (fig. 1-15). La determinación
del hematocrito debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores
obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01.
M étodo del m acrohem atocrito

Material
• Sangre total (0,6 mi) tratada con EDTA-K3 (1,5 a 2,2 mg/ml).
• Tubo de W introbe con diámetro interno de 3 m m (fig. 1-16).
• Centrífuga cuyos brazos tengan una longitud de 15 cm aproximadamente, medida
desde el eje de rotación hasta la base de los recipientes que contienen los tubos y que
tenga un plano de giro horizontal. En estas condiciones la fuerza centrífuga aplicada
es de aproximadamente 2.000 a 2.300 r.p.m. (aproximadamente por gramo para un
radio interno de 15 cm).
• Pipeta Pasteur con extremo largo (de 15 cm como mínimo) para el llenado de los
tubos de Wintrobe.
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Tubo de
microhematocrito
Regla
graduada
B (mm)
FIGU RA 1-14. Detalle del lector de

microhematocrito. Obsérvese la posición del tubo FIGU RA 1-15. Esquema para determinar el
capilar dispuesto para ser leído. valor hematocrito mediante una regla graduada.
Método
1. Se llena el tubo de Wintrobe con sangre total bien homogeneizada utilizando la pipeta
Pasteur. Debe procurarse evitar la formación de burbujas de aire en la columna de
sangre, así como conseguir que, una vez finalizado el llenado, la parte superior de la
columna de sangre se halle exactamente a la altura de la marca 10 grabada en el tubo.
2. Se centrifugan los tubos (2.000-2.300 r.p.m.) durante 30 min, procurando que la
tem peratura de la centrífuga no exceda de 40 °C durante todo el tiem po que
dure la centrifugación. Si el hematocrito es superior a 0,55, el tiempo total de
centrifugación debe ser de 1 h.
3. La lectura del resultado se realiza extrayendo los tubos de la centrífuga y
valorando la altura en milímetros de la columna eritrocitaria, que corresponde
a una fracción de la longitud original de la columna sanguínea (100 mm). Debe
excluirse de la lectura la columna de leucocitos y plaquetas.
4. Una vez usados, los tubos de W introbe deben ser lavados con agua abundante,
inyectada a presión en el interior del mismo, al objeto de eliminar cualquier resi
duo de sangre. Es recomendable, al menos una vez por semana, colocar los tubos
en una solución diluida en ácido clorhídrico (HC10,1 N = 0,1 mol/1) durante 24
o 48 h, con el fin de arrastrar cualquier resto orgánico que hubiera podido quedar
adherido a sus paredes internas.
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FIGU RA 1-16. Tubo de Wintrobe para la realización

del macrohematocrito. Obsérvese el volumen ocupado
por el paquete de eritrocitos después de la centrifugación.
Causas de e rro r en la determ inación del hem atocrito

Algunas de las causas que con mayor frecuencia pueden ser motivo de error en la deter
minación del hematocrito p or centrifugación se resumen en el cuadro 1-6. Asimismo,
cuando se emplean analizadores automatizados, deben tenerse también en cuenta ciertas
causas de error debidas muchas veces a alteraciones patológicas de los propios especímenes,
que también pueden falsear el resultado del valor hematocrito obtenido electrónicamente
(cuadro 1-7).
Valores de referencia e interpretación del resultado

El valor hematocrito, al igual que la concentración de eritrocitos y hemoglobina en
sangre, varía con la edad y el sexo (tabla 1-3). El aumento del hematocrito se corresponde
al aumento de la concentración de hemoglobina y cuando su valor es superior a 0,55 en
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CUADRO 1-6. Causas de error en la determinación del hematocrito por centrifugación
Manejo defectuoso de la muestra

• Empleo de una relación sangre/anticoagulante incorrecta. El exceso de EDTA
con relación a la cantidad de sangre produce un falso descenso del hematocrito
por retracción de los eritrocitos
• La falta de suficiente anticoagulante puede producir una coagulación parcial
• Extracción de sangre en condiciones defectuosas (hemoconcentración, hemodilución
o hemolisis)
• Oxigenación excesiva de la sangre (falso descenso del valor hematocrito)
• Retraso (>6 h) en la realización de la determinación después de haberse extraído
la sangre (falso aumento del valor hematocrito)
• Cuando la sangre se obtiene directamente de un catéter, puede producirse su dilución
por el suero, líquido de perfusión o anticoagulante local
• Cuando la temperatura ambiente es elevada y se emplea heparina como anticoagulante,
debe conservarse a 4 °C hasta el momento de realizar la determinación
• Homogeneización defectuosa de la sangre antes de llenar el capilar
Fallo en la realización de la técnica
• Errores en la identificación de los tubos
• Empleo de tubos no excesivamente limpios o húmedos
• Variaciones en el calibre del tubo empleado o uso de capilares con medidas incorrectas
• Llenado insuficiente de los tubos (Wintrobe o capilares) con la sangre total
• Empleo de una fuerza centrífuga insuficiente
• Recalentamiento de la centrífuga (temperatura de centrifugación excesiva > 40 °C)
por uso excesivamente prolongado de la misma (causa de hemolisis)
• Fallo del sellado y pérdida del contenido del tubo capilar (método de microhematocrito)
EDTA, ácido etilenodiaminotetraacético.
la mujer o a 0,6 en el hombre, puede considerarse la existencia de un aumento real del

volumen o masa eritrocitaria. En ambos casos se establece el diagnóstico de eritrocitosis
(llamada también poliglobulia). No debe confundirse el término «poliglobulia», que casi
siempre se refiere a la eritrocitosis, con el de «policitemia», que es la denominación de un
síndrome mieloproliferativo crónico (SMPC) en el que, si bien la poliglobulia es la mani
festación clínica más destacada, suele cursar también con leucocitosis y/o trombocitosis,
aunque más moderadas que en la leucemia mieloide crónica (LMC) y/o trombocitemia
esencial (TE) respectivamente. C uando se determ ina el hem atocrito, debe tenerse
siempre en cuenta que su valor varía al cambiar el volumen plasmático. Un aumento del
volumen plasmático, no acompañado de un aumento del volumen celular, condicionará
una disminución del hematocrito (falsa anemia por hemodilución), mientras que un
descenso exclusivo del volumen plasmático (hemoconcentración) producirá un aumento
del hematocrito (falsa poliglobulia por hemoconcentración). Las variaciones del volumen
plasmático pueden explicar a veces la llamada falsa anemia del embarazo, ya que en tal
situación fisiológica existe a menudo un aumento del volumen plasmático. Igualmente,
dichas variaciones explican también el excesivo descenso del hematocrito, que puede
observarse después de una hemorragia aguda en relación al volumen total de sangre
perdida y que obedece a la hemodilución compensadora del descenso de la volemia.
Finalmente, en un sujeto normal, el hematocrito es también diferente según el lugar
elegido para realizar la extracción sanguínea. Así, el hematocrito venoso es diferente
del arterial y del capilar. La eventual influencia que sobre el valor hematocrito pueden
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CUADRO 1-7. Causas de error en la determinación de hematocrito obtenido

electrónicamente
Falsos aumentos del valor hematocrito

• Falsos aumentos del volumen corpuscular medio (VCM)
• Empleo de sangre envejecida
• Leucocitosis intensa
• Estados de hiperosmolaridad
• Disminución ficticia de la concentración de eritrocitos
• Panaglutinación celular por efecto del ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)
Falsos descensos del valor hematocrito
• Falsa disminución del VCM
• Empleo de excesivo anticoagulante EDTA líquido
• Temperatura ambiente muy elevada
• Estados de hipoosmolaridad
• Disminución ficticia de la concentración de eritrocitos
• Hemolisis in vitro
• Microcitosis extrema (VCM < 50 fl)
• Presencia de crioaglutininas
Alteraciones del hematocrito por defectos del autoanalizador
• Sistema electrónico defectuoso
• Equipo mal calibrado
• Aspiración defectuosa de la muestra
• Depósitos de proteínas en el orificio de apertura
• Alteraciones del líquido de lavado
TABLA 1-3. Valores de referencia del hematocrito (X ± 2DE)
Unidades clásicas (%) Unidades SI (1/1)

Recién nacidos 54 ± 10 0,54 ±0,1
Niños (hasta 10 años) 38 ± 5 0,38 ± 0,05
Mujeres:
-18-50 años 42 ± 5 0,42 ± 0,05
- Embarazadas 39 ± 5 0,39 ± 0,05
Hombres (18-50 años) 45 ± 5 0,45 ± 0,05
DE, desviación estándar; SI, sistema internacional; X , media.
tener las variaciones del volumen plasmático y el hecho de que no tenga el mismo valor
en todos los territorios vasculares del organismo lo hacen poco útil en la práctica para
conocer el volumen eritrocitario a partir de la volemia (volumen sanguíneo total) cuando
esta es determinada directamente mediante métodos isotópicos (v. capítulo 10).
ÍNDICES ER1TROCITARIOS
Introducción
El prim er paso en el estudio del tam año celular fue dado a principios del pasado
siglo por Price-Jones, quien midió el diámetro de los eritrocitos (extendidos, fijados
ERRNVPHGLFRVRUJ
y teñidos sobre u n portaobjetos) m ediante un ocular m icrom étrico y elaboró una

curva de distribución de frecuencias en función del diám etro celular (fig. 1-17). Este
procedimiento se utilizó durante m uchos años como complemento en el diagnóstico
de ciertas anemias (p. ej., la esferocitosis hereditaria) y otras alteraciones del tamaño de
los hematíes, pero debido a su imprecisión y realización laboriosa solo lo utilizaron
laboratorios altam ente especializados o de investigación. Su carácter engorroso, el
elevado núm ero de artefactos necesarios para realizar la extensión, la falta de hom o
geneidad en la calidad de la misma, la retracción variable de las células, etc. hicieron
que su utilización en la práctica clínica fuera prácticamente nula. En todo caso, este
procedimiento fue siempre considerado más cualitativo que cuantitativo hasta que su
principio fue incorporado a los primeros analizadores hematológicos comerciales para
la realización de la fórm ula leucocitaria semiautomatizada. Estos equipos se basaron
en el análisis digitalizado de imágenes de células obtenidas m ediante extensión de
sangre y tinción panóptica (Hematrak® de Geometric Data) y la incorporación de la
curva de Price-Jones fue un in ten to de m ejorar su fiabilidad, cosa que nunca se
consiguió del todo por las causas de error antes citadas. Obviamente, al tratarse de un
procedimiento óptico basado en el examen microscópico digitalizado de las células,
no consiguió obviar m uchos de los inconvenientes citados, como tam poco el de la
lentitud en la obtención de resultados, lo que llevó a la desaparición de estos equipos
(y, con ellos, la curva de Price-Jones) al introducirse con fuerza el análisis celular
m ediante citometría, base de los actuales analizadores hematológicos automatizados
para la realización del hem ogram a. La in tro d u cció n de esta nueva tecnología se
inició en el año 1953, cuando Wallace H. C oulter obyuvo la patente para utilizar
la conductividad (campo eléctrico) para m edir el núm ero y tam año de las células
Esferocitosis
hereditaria Normal M acrocitosis
Diámetro longitudinal eritrocitario (|jm)
FIGU RA 1-17. Esquema de la curva de Price-Jones en una situación normal y en dos situaciones
patológicas.
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sanguíneas en suspensión (medios para contar partículas suspendidas en un fluido).

Nació así el llamado principio Coulter, base de una im portante saga de analizadores
hematológicos automatizados aún muy utilizados en la actualidad, y del cual existen
muchas otras implementaciones prácticas.
Bastantes años antes, en 1930, Maxwell W introbe, en un intento de extraer informa
ción adicional del valor hematocrito (Hto), la concentración de hemoglobina (Hb) y el
recuento de eritrocitos (Ers), estableció una relación matemática entre ellos y obtuvo
tres nuevas magnitudes que denominó «índices eritrocitarios»: el volumen corpuscular
medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración media
de hemoglobina corpuscular (CMHC). Hasta la aparición del principio Coulter para el
recuento de las células sanguíneas, la utilización de las fórmulas matemáticas descritas
bajo el nom bre de «índices eritrocitarios», rebautizados más tarde como «índices de
Wintrobe», era la base para la clasificación de las anemias, con el inconveniente de su
poca exactitud debido a la gran imprecisión del recuento de hematíes mediante la cámara
cuentaglóbulos o hemocitómetro. No obstante, a partir de los años sesenta, cuando para
el recuento celular se empleó el principio Coulter, la mayor reproductibilidad de los
resultados permitió conferir a los índices eritrocitarios un valor diagnóstico definitivo,
especialmente del VCM, ultilizado actualmente como el procedimiento más fiable para
la clasificación de las anemias en la práctica clínica.
Volumen corpuscular medio o VCM (San-Ers; vol. entítico [fl])

El VCM es el valor medio del volumen ocupado por cada eritrocito expresado en femtoli-
tros (fl); se calcula dividiendo el Hto por la concentración de eritrocitos (Ers):
Hto (1/1)
VCM =
Ers(xl0“ /1)
Ejemplo:
Si el hematocrito es de 0,45 quiere decir que 11 de sangre posee 0,451 de eritrocitos. Si
la concentración de eritrocitos es de 5 X 1012/1, el volumen ocupado por cada uno de
ellos será:
VCM = = 90 x 10“151, es decir, 90 fl

5x10
Hemoglobina corpuscular media o HCM (Ers [San]-Hb; masa entítica [pg])

Corresponde al valor medio de la cantidad (en peso o masa) de hemoglobina contenida
en cada eritrocito; se expresa en picogramos (pg). Se calcula dividiendo la concentración
de hemoglobina en sangre (Hb) por el número de eritrocitos (Ers):
HCM = Hb(g^
Ers(xl0 /l)
Ejemplo:
Si una m uestra de sangre tiene 150 g/1 de hemoglobina y 5 X 1012/1 de eritrocitos, la
hemoglobina de cada eritrocito será:
HCM = ^ = 30 xlO-12 g, es decir, 30 pg

5x10
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Concentración media de hemoglobina corpuscular o CMHC

(Ers [San]-Hb; c. masa)
Es la concentración de hem oglobina por litro de sangre sin plasma, es decir, exclu
sivamente de la hemoglobina contenida en los hematíes. Teniendo en cuenta que la
sangre tiene aproximadamente un 50% de eritrocitos y un 50% de plasma, el valor de
la CMHC es de aproximadamente el doble del de la concentración de hemoglobina en
sangre total, expresadas ambas magnitudes en gramos por litro (g/1). La CMHC puede
calcularse dividiendo la concentración de hemoglobina en sangre (Hb) p or el valor
hematocrito (Hto).
ccm h = ™ M
H to (1/1)
Ejemplo:
Si una muestra de sangre tiene 150 g/1 de hemoglobina y el hematocrito es de 0,45,
la CCMH será:
CCMH = — = 333g/l
0,45
Utilidad de los índices eritrocitarios

De los tres índices, el de mayor valor es el VCM, ya que inform a sobre el tam año de
los eritrocitos, algo muy im portante para la clasificación de la anemia en microcítica
(VCM < 82 fl), macrocítica (VCM > 98 fl) o normocítica (VCM: 82 a 98 fl).
Como se ha mencionado al inicio, la utilidad del VCM en la práctica clínica no fue
real hasta la llegada de la automatización a los laboratorios de hematología, ya que des
plazó m étodos tan clásicos como la microcentrifugacion para calcular el hematocrito y
el recuento en cámara cuentaglóbulos para conocer el número de hematíes en sangre.
Mediante este método de recuento se obtienen resultados con coeficientes de variación
superiores al 30%, por lo que su utilidad para calcular el valor del VCM resulta inviable,
y no recomendable para uso clínico.
LECTURAS RECOMENDADAS
CLSI. Procedures for the Collection o f Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture. Villanova PA.
NCCLS Approved Standard D ocument. 6th ed. Docum ent H3-A6. Wayne PA: CLSI; 2007.
Departamento de Sanidad y Seguridad Social de la Generalitat de Catalunya. Precauciones y medidas
de aislamiento para evitar la transmisión de infecciones en los centros sanitarios. Generalitat de
Catalunya; 1999.
Fuentes X, Castiñeiras MJ, Farre M. Códex del laboratorio clínico. Madrid: Elsevier; 2003.
H07-A3 (Electronic D ocument). Procedure for Determining Packed Cell Volume by the
M icrohematocrit Method; Approved Standard. 3.a ed. Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI), 2012.
International U nion o f Pure, Applied Chemistry. International Federation o f Clinical Chemistry.
Properties and units in the clinical laboratory sciences-I. Syntax and semantic rules
(Recommendations 1995). Pure Appl Chem 1995;67:1563-74.
Van Assendelft OW, Simmons A. Specimen collection handling, storage and variability.
En: Lewis SM, Koepke IA editors. Haematology. Laboratory Management and Practice. Oxford:
Butterworth-Heinemann; 1995. p. 109-27.
Vives-Corrons JL et al. Effect of EDTA-anticoagulated whole blood storage on cell morphology
examination. A need for standardization. Int I Lab Haematol 2013 (in press).
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Capítulo 1 La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes 2 9 .e l
Autoevaluación
1. Los eritrocitos o hematíes son células sanguíneas cuya función prim ordial es:
(a) Transportar oxígeno de los tejidos a los pulmones.
(b) Transportar oxígeno de los pulmones a los tejidos.
(c) Sintetizar hemoglobina para la respiración.
(d) Contribuir al característico color rosado de la piel.
(e) Transportar anhídrido carbónico p or la sangre.
Respuesta correcta: b.
Respuesta razonada: los eritrocitos son el componente celular más abundante, carecen de núcleo
y organelas citoplasmáticas, y su única misión es el transporte de la hemoglobina a lo largo del
sistema vascular con el fin de garantizar la oxigenación de los tejidos (función respiratoria).
2. Los leucocitos son las células nucleadas de la sangre cuya función prim ordial es:
(a) Contribuir a la defensa del organismo contra los agentes extraños.
(b) Producir anticuerpos contra virus.
(c) Fagocitar las células sanguíneas envejecidas y contribuir a su eliminación.
(d) M antener los depósitos de hierro del organismo en buen estado.
(e) Ninguno de los anteriores.
Respuesta correcta: a.
Respuesta razonada: los leucocitos se clasifican en tres subtipos: granulocitos, linfocitos y m o
nocitos. Todos ellos tienen una función defensiva. Los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y
basófilos) mediante fagocitosis o ingestión de las sustancias extrañas al organismo (formación
de pus), los linfocitos m ediante un proceso de inm unidad produciendo anticuerpos contra
las substancias extrañas al organismo (inm unidad humoral) o actuando directamente sobre las
mismas (inmunidad celular). Los monocitos, aunque su función es fundamentalmente fagocítica
(sangre) y macrofágica (tejidos), intervienen también en el proceso de la inmunidad modulando
algunas de sus etapas.
3. Las plaquetas son fragmentos de citoplasma que intervienen en:
(a) La hemostasia.
(b) La coagulación de la sangre.
(c) La trombosis.
(d) La activación de factores plasmáticos de la coagulación.
(e) Todos los anteriores.
Respuesta correcta: e.
Respuesta razonada: las plaquetas son fragmentos de unas células presentes en la m edula ósea
llamadas megacariocitos. Tienen forma ovalada o redondeada, no tienen núcleo y son las células
sanguíneas más pequeñas. Contienen en su interior varias sustancias que intervienen en la
coagulación de la sangre (factores de coagulación), cuya misión es prevenir la extravasación de
sangre y contribuir a la coagulación sanguínea en caso de hemorragia.
4. Uno de los aspectos importantes de la fase preanalítica del laboratorio clínico consiste en:
(a) Procurar que las muestras de sangre se obtengan en condiciones correctas.
(b) Iniciar los procedimientos analíticos previos a la realización de las medidas.
(c) Calibrar los analizadores automatizados.
(d) Realizar la extracción de sangre m ediante tubos colectores al vacío.
(e) Ninguna de las anteriores.
Respuesta razonada: los resultados de los análisis sanguíneos dependen en gran m edida de la
correcta obtención y manipulación inicial del espécimen, de forma que una extracción deficiente
puede ser la causa de resultados erróneos a pesar de emplear una correcta m etodología. Por
ejemplo, una extracción dificultosa puede ser causa de una falsa trombopenia, y el valor hemato
crito puede variar hasta en u n 8%, dependiendo de si la extracción sanguínea se realiza con el
paciente sentado o en decúbito.
5. La principal ventaja de los tubos colectores de sangre al vacío es:
(a) Impiden la contaminación de la sangre recién extraída antes de su análisis.
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2 9 .e 2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
(b) Impiden que la sangre se coagule al ser extraída.

(c) Permiten obtener una mayor cantidad de sangre.
(d) Facilitan separar el plasma de las células sanguíneas.
(e) Disminuyen el riesgo de contaminación del personal sanitario por virus HBV+ y HIV+.
Respuesta razonada: el sistema colector de tubo al vacío es actualmente u n o de los más em
pleados, ya que perm ite recoger la sangre directamente desde la vena o de la jeringa en el tubo,
evitando cualquier tipo de contaminación o contacto de la sangre con el operador. Con ello se
ha conseguido dism inuir el riesgo de contam inación del personal sanitario por virus en caso
de muestras procedentes de pacientes HBV+ (hepatitis B), HCV+ (hepatitis C) o HIV+ (virus de
la inmunodeficiencia humana).
6. El anticoagulante de elección para la realización del hemograma es:
(a) Citrato sódico.
(b) Heparina sódica.
(c) Solución de ácido-citrato-dextrosa.
(d) Sal dipotásica del etilenodiaminotetraacetato sódico (EDTA).
(e) Mezcla de Wintrobe.
Respuesta correcta: d.
Respuesta razonada: el anticoagulante de elección en hem atim etría es la sal dipotásica del
EDTA (EDTA-K2) porque a) respeta la morfología eritrocitaria y leucocitaria, de m anera que
perm ite una demora de 2 h en la realización de la extensión sanguínea después de la extracción;
b) asegura la conservación de las células sanguíneas durante 24 h si la sangre se mantiene a 4 °C;
c) al suministrarse en form a seca no ejerce ningún efecto de dilución sobre la sangre total, y
d) al inhibir la aglutinación de las plaquetas, facilita el recuento de las mismas o su apreciación
semicuantitativa a partir de la extensión.
7. El valor hematocrito se define como:
(a) El resultado de la centrifugación de la sangre.
(b) La relación porcentual entre la hemoglobina y el núm ero de hematíes.
(c) Volumen ocupado por los hematíes en relación al volumen total de sangre.
(d) Cociente entre volumen corpuscular medio y concentración total de hemoglobina.
Respuesta correcta: c.
Respuesta razonada: cuando se determina el hematocrito, debe tenerse siempre en cuenta que su
valor varía al variar el volumen plasmático. Un aumento del volumen plasmático, no acompañado
de un aumento del volumen celular, condicionará una disminución del hematocrito (falsa anemia
por hemodilución), mientras que un descenso exclusivo del volumen plasmático (hemoconcen-
tración) producirá un aumento del hematocrito (falsa poliglobulia p or hemoconcentración).
8. El volumen corpuscular medio (VCM) corresponde a:
(a) Valor del volumen ocupado por cada hematíe de forma individual.
(b) Valor medio del volumen eritrocitario obtenido a partir de un análisis de más de 30.000
hematíes.
(c) El volumen de la masa eritrocitaria.
(d) Un parámetro estadístico.
(e) Un cociente calculado automáticamente por el analizador.
Respuesta razonada: el VCM es el valor medio del volumen ocupado por cada eritrocito expresado
en femtolitros (fl) y se calcula dividiendo el H to por la concentración de eritrocitos (Ers).
9. La hemoglobina corpuscular media (HCM ) corresponde a:
(a) Peso de la hemoglobina contenida en toda la masa eritrocitaria.
(b) Valor medio de la hemoglobina circulante.
(c) Valor medio del peso de hemoglobina que contiene cada hematíe obtenido a partir de
un análisis de más de 30.000 hematíes.
(d) Un parámetro estadístico.
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Capítulo 1 La sangre. Métodos de extracción y empleo de anticoagulantes 2 9 .e 3
Respuesta razonada: la HCM corresponde al valor m edio de la cantidad (en peso o masa) de
hemoglobina contenida en cada eritrocito, y se expresa en picogramos (pg). Se calcula dividiendo
la concentración de hemoglobina en sangre (Hb) por el núm ero de eritrocitos (Ers).
10. La concentración media de hemoglobina corpuscular (CMHC) corresponde a:
(a) La concentración de hemoglobina en cada litro de sangre una vez eliminado el plasma.
(b) El valor medio de la concentración de hemoglobina en la sangre.
(c) El peso medio de la hemoglobina sanguínea.
(d) Un parám etro estadístico.
Respuesta razonada: la CM HC es la concentración de hemoglobina por litro (1) de sangre sin
plasma, es decir, exclusivamente de la eritrocitaria. Teniendo en cuenta que la sangre tiene
aproximadamente un 50% de eritrocitos y un 50% de plasma, su valor es, aproximadamente,
el doble del de la concentración de hemoglobina en sangre total. Puede calcularse dividiendo la
concentración de hemoglobina en sangre (Hb) por el valor hematocrito (Hto) y se expresa en g/1.
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C A P Í T U L O 2
Las células sanguíneas

Origen y características morfológicas
J. L. Vives C orrons y J. L. Aguilar i Bascompte
ORIGEN Y FORMACIÓN DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS.

HEMATOPOYESIS
Tejido hematopoyético
Todas las células de la sangre derivan de una única célula, o progenitor común, conocida
como célula madre pluripotente (CMP), o stem-cell en la terminología anglosajona. En
el sujeto adulto normal la CMP se halla en el tejido hem atop oyético de la médula ósea,
y el proceso por el cual las CMP se transform an en células de la sangre se denomina
h em atop oyesis. En el organismo humano, la localización de la hematopoyesis varía con
el desarrollo, de manera que durante la etapa embrionaria (primeras semanas de la ges
tación) se localiza en el saco vitelino; durante la primera etapa fetal (hasta los 6 o 7 meses
de vida intrauterina), en el bazo e hígado; durante la segunda etapa fetal (séptimo mes de
vida hasta las 2 semanas del nacimiento), en la médula ósea con un pequeño componente
hepatoesplénico que persiste hasta unas 2 semanas después del parto (hematopoyesis
fetal), y, finalmente, a partir de las 2 semanas de vida y durante toda la edad adulta, en
la médula ósea exclusivamente (fig. 2-1). No obstante, mientras que durante la primera
infancia, prácticamente toda la medula ósea tiene actividad hematopoyética, a partir de
la pubertad existe una progresiva sustitución de las células hematopoyéticas por células
grasas de manera que hasta los 5 años de edad, aproximadamente, todos los huesos del
organismo poseen tejido hematopoyético y a partir de los 20, la hematopoyesis se limita al
esqueleto axial y a las epífisis de los huesos largos (fig. 2-2). Debe señalarse que, incluso en
esta localización, el 50% de la médula es tejido graso. Esta tendencia a la transformación
grasa de la médula ósea aumenta progresivamente con la edad y en la vejez adquiere su
mayor intensidad. Pese a ello, en un individuo adulto normal, el tejido hematopoyético
es de los más abundantes y su volumen, de aproximadamente 1 o 2 1 en condiciones
basales, puede expandirse varias veces en caso de estímulo.
La sangre se halla som etida a un recambio celular perm anente que se m antiene
a lo largo de toda la vida gracias a una actividad hematopoyética muy flexible y con
una elevada capacidad de adaptación a las necesidades del organismo. Esta actividad
se encuentra estrechamente regulada por la existencia en la m édula ósea del llamado
«microambiente específico», los factores de regulación y los factores de maduración o
nutrientes (hierro y vitaminas).
El m icroam b ien te específico, formado por el estroma (endotelio de los vasos, fibro
blastos y macrófagos) y la matriz intercelular, realiza actividades fundamentales para el
desarrollo de la hematopoyesis como, tales como: 1) mantener el pool de las células madre
pluripotentes y su capacidad de duplicación (regeneración); 2) proteger a precursores
30 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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Capítulo 2 Las célu las sanguíneas 31
--------------------------------M e s e s ---------------------------------
Periodo fetal Recién nacido
FIGU RA 2-1. Ontogenia del sistema hematopoyético en el ser humano.
y progenitores frente a la acción de agentes oxidantes; 3) regular las cascadas de señales

celulares; 4) modular la expresión genética, y 5) modular los factores epigenéticos.
Los factores de crecimiento o citocinas son glucoproteínas producidas por el es-
troma, los osteoblastos, ciertos linfocitos y otras células que actúan sobre los procesos de
diferenciación y maduración celular regulando el proceso de la hematopoyesis.
Los factores de maduración intervienen en la última etapa de la hematopoyesis,
cuando las células precursoras ya tienen u n elevado grado de diferenciación hacia
Adulto
Médula roja (18 a 60 años)

= 90% M édula roja
^50%
1. Período embrionario (hematopoyesis mesoblástiea): saco vitelino.
2. Período fetal {hematopoyesis hepática): hígado.
3. Período adulto (hematopoyesis mieloide): médula ósea del diploe. FIGU RA 2-2. Localización
costillas, esternón, cresta ilíaca, vértebras y epífisis de los huesos del tejido hematopoyético según
largos. las etapas del desarrollo. Evolución
del tejido hematopoyético con la edad.
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sus formas m aduras, que son las que circulan p o r la sangre (hematíes, leucocitos y
plaquetas).
Sistema hematopoyético
En la médula ósea coexisten CMP y células hematopoyéticas progenitoras y precursoras
que, junto con las células maduras de la sangre circulante, constituyen el llamado «sistema
hematopoyético». El conjunto de CMP constituye entre un 0,01 y un 0,05% del total de la
celularidad hematopoyética norm al y, en su gran mayoría, se hallan en fase de intervalo
intermitótico prolongado, es decir, no se dividen ni se diferencian (compartimento de
reserva). Estas células se caracterizan por su elevada capacidad de autoduplicación y
diferenciación y de ellas, una pequeña proporción se duplica pero no se diferencia, lo
que perm ite m antener una cantidad m ínim a y constante de CMP a lo largo de toda
la vida (compartimento de autoduplicación). En un determinado momento, y por un
mecanismo no bien conocido, estas células inician un proceso de diferenciación hacia
cualquiera de las dos líneas celulares de maduración hematopoyética: mieloide o linfoide
(compartimento de diferenciación). Una de las características de la CMP es su elevada
capacidad de regeneración y autoduplicación, de m anera que, en teoría, una única
CMP podría producir todas las células sanguíneas que necesita un organismo humano
normal. En una proporción m uy pequeña, las CMP circulan por la sangre y son trans
portadas de un lugar a otro de la médula ósea, lo que contribuye a mantener la uniformidad
de su distribución entre com partim entos. Las CMP pueden ponerse de manifiesto
mediante cultivo in vitro de progenitores hematopoyéticos (de sangre o médula ósea),
y su morfología se considera m uy similar a la de un linfocito. Para su identificación en
la práctica clínica se emplea un anticuerpo monoclonal (AM) específico (CD34) que
permite también la obtención de concentrados de CMP utilizados en el trasplante de
progenitores hematopoyéticos (TPH) o trasplante de médula ósea (TM O), o para la
realización de estudios celulares con fines diagnósticos o terapéuticos. Las CMP son las
únicas células responsables de la reconstitución del sistema hematopoyético después de
un tratamiento ablativo (quimioterapia y/o radioterapia) de la médula ósea, de manera
que solo entre 100 y 500 CMP son suficientes para regenerar totalmente la médula ósea
de un ser hum ano gravemente dañada por agentes químicos y/o físicos.
Sistema linfoide
Además del tejido hematopoyético mieloide, localizado exclusivamente en la médula
ósea, la homeostasis de la sangre depende también de la función del tejido linfoide,
formado por órganos y folículos linfoides distribuidos p o r todo el organismo y que
constituyen el llamado sistema linfático (fig. 2-3). El sistema linfático está formado
por dos tipos de tejido linfoide: prim ario y secundario. El tejido linfoide primario es el
lugar donde maduran los linfocitos, estos se diferencian en células B y T (médula ósea
y timo); el secundario es donde se producen las respuestas inmunológicas (ganglios
linfáticos, folículos linfoides y bazo). A diferencia de los folículos linfoides, los gan
glios linfáticos y el bazo están encapsulados por una barrera de tejido conectivo y por
ello se los considera órganos.
El tim o es una glándula situada en el mediastino, detrás del esternón. Consta de
una cápsula fibrosa que engloba dos áreas globulosas que contienen linfocitos estre
chamente apiñados, células epiteliales (reticulares) y macrófagos. Las células reticulares
producen hormonas túnicas, que contribuyen a la maduración de las células T. Además,
en la m édula existen los corpúsculos del timo (o de Hassall) característicos, que son
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M édula ósea
Ganglios linfáticos
FIGU RA 2-3. Localización de los órganos del sistema hematopoyético.
capas concéntricas de células epiteliales reticulares aplanadas y llenas de gránulos de

queratohialina y queratina.
Los ganglios linfáticos son órganos situados en el curso de los vasos linfáticos más
abundantes en las regiones mamaria, axilar e inguinal. Su función es contribuir a la
regulación de la actividad defensiva de los linfocitos.
El bazo es el órgano linfoide más grande del organism o y se halla situado en el
hipocondrio izquierdo, entre el estómago y el diafragma. Como sucede con los gan
glios linfáticos, el bazo está recubierto por una cápsula de tejido conectivo densa que
junto a las trabéculas, que derivan de ella, y los fibroblastos constituyen el estroma.
El parénquim a del bazo está form ado por la pulpa blanca y roja. La pulpa blanca es
tejido linfático formado por linfocitos y macrófagos dispuestos alrededor de ramas de
la arteria esplénica. La pulpa roja está form ada por senos venosos llenos de sangre y
cordones de tejido esplénico (cordones de Billroth), que se componen de eritrocitos,
macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y granulocitos. La sangre llega al bazo por la
arteria esplénica y alcanza la pulpa blanca, donde los linfocitos T y B realizan funciones
inmunitarias y los macrófagos eliminan posibles agentes patógenos (fagocitosis). Las
funciones de la pulpa roja no tienen que ver con funciones defensivas y fundam en
talm ente son tres: 1) elim inación de células sanguíneas y plaquetas envejecidas o
defectuosas; 2) reservorio o almacenamiento de plaquetas, y 3) hematopoyesis (solo
durante el período fetal).
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Los folículos linfáticos o tejido linfoide relacionado con mucosas (TLRM) son
áreas de tejido linfoide acapsuladas que se encuentran dispersas en la lámina propia
(tejido conectivo) de la mucosa que reviste los aparatos digestivo, urinario, reproductor
y respiratorio. Entre estos se incluyen las amígdalas de la región faríngea, las placas de
Peyer en el íleon y los folículos linfáticos del apéndice. Las amígdalas están dispuestas
estratégicamente (tejido adenoide, palatino y sublingual) y participan en respuestas in-
munitarias contra sustancias extrañas inhaladas o ingeridas.
Regulación de la hem atopoyesis

La hematopoyesis es el resultado de un conjunto de factores entre los cuales destacan: la
interacción de las células hematopoyéticas entre sí, con la matriz intercelular y las células
del estroma (endotelio, fibroblastos y macrófagos); la liberación de factores reguladores
(citocinas) por parte de diferentes células (fibroblastos, linfocitos, macrófagos, osteoblas-
tos y endotelio principalmente), y la acción de nutrientes que, procedentes del exterior,
deben ser ingeridos con los alimentos (factores de m aduración). Dichos factores son
fundamentalmente el hierro, imprescindible para la síntesis de la hemoglobina, y ciertas
vitaminas (cobalamina y folato) imprescindibles para la síntesis de ADN.
La diferenciación de una CMP hacia las diferentes líneas celulares de la hematopoyesis
va precedida de un compromiso madurativo (commitment) que se caracteriza por una
disminución del antígeno CD34y la aparición progresiva de nuevos antígenos específicos
de diferenciación (CD 13 y CD33, CD41, CD42, CD64, y otros). En pacientes sometidos
a TPH, las CMP transfundidas, gracias a su antígeno CD34, reconocen inmediatamente
la matriz intercelular y anidan en ella para iniciar un proceso de diferenciación y ma
duración que terminará con la reconstitución de la celularidad hematopoyética. Con la
maduración, las células van perdiendo su adherencia al estroma, de manera que cuando
esta llega a un determinado punto las células, maduras o prácticamente maduras, son
liberadas a la circulación. Las directrices del proceso madurativo vienen dadas por el
correspondiente espectro de factores de regulación al que se ven expuestas las CMP.
Los factores reguladores de la hematopoyesis se conocen con el nombre de citocinas,
glucoproteínas de peso molecular (PM) entre 20 y 70 kDa que actúan como hormonas
con doble actividad endocrina y paracrina. En situación basal, la concentración san
guínea de citocinas es muy pequeña, pero ante estímulos banales como, p or ejemplo,
una infección, esta puede aumentar de forma rápida y significativa. La mayoría de las
citocinas conocidas en la actualidad fueron descubiertas a mediados de los años sesenta
del siglo pasado con motivo del desarrollo de los cultivos in vitro de médula ósea en
medio semisólido. A principios de los años ochenta, muchas de ellas fueron purificadas
y algo más tarde se clonaron los genes que codifican su síntesis, lo que ha perm ito
obtenerlas in vitro mediante procedimientos de genética recombinante. Actualmente, se
han clonado y secuenciado más de 20 citocinas diferentes, aunque este número aumenta
progresivamente. Las principales propiedades de las citocinas se resumen en la tabla 2-1.
La mayoría de estas son multifuncionales, es decir, actúan sobre más de una línea celular
o en varios niveles ontogénicos de la hematopoyesis (regeneración, diferenciación y
maduración celulares). Otras tienen una actuación doble difícilmente explicable como,
por ejemplo, la interleucina 4 (IL-4) que puede actuar junto a la eritropoyetina y el factor
estimulante de colonias granulocíticas (G-CSF) y, posiblemente, con el factor estimulante
de colonias monocíticas (M-CSF), así se incrementa el crecimiento de colonias eritroides
y monocíticas. Muchas son claramente específicas de línea y actúan en etapas tardías de
la hematopoyesis como, por ejemplo, el G-CSF que estimula la formación de neutrófilos,
el M-CSF que estimula la formación de monocitos, la eritropoyetina (Epo) que estimula
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TABLA 2-1. Citocinas que intervienen en la regulación de la hematopoyesis
Citocina Célula final Características

Eritropoyetina Eritrocitos Sintetizada en el riñón
Induce la proliferación de CFU-E
Su síntesis aumenta cuando disminuye
la hemoglobina
Trombopoyetina Megacariocitos Sintetizada por el riñón y el hígado
Induce la megacariopoyesis
GM-CSF Eosinófilos y neutrófilos Segregada por linfocitos T, células del endotelio,
Monocitos-macrófagos fibroblastos, macrófagos y osteoblastos
Megacariocitos Estimula la producción de granulocitos y monocitos
Eritrocitos Aumenta cuando disminuye la hemoglobina
G-CSF Neutrófilos Segregada por macrófagos, células del estroma,
osteoblastos
Estimula la producción y la función de los granulocitos
Su síntesis aumenta en respuesta a infecciones
M-CSF Monocitos-macrófagos Segregada por células del endotelio, fibroblastos
y macrófagos
Estimula la producción y la función
de los monocitos
IL-1 CPTI Facilita la interacción entre diferentes tipos
Linfocitos T de leucocitos
Modula la acción de los leucocitos sobre la
hematopoyesis
IL-2 Linfocitos T Segregada por linfocitos T
IL-3 Neutrófilos y eosinófilos Segregada por linfocitos T, células del endotelio,
Monocitos-macrófagos mastocitos y células NK
Basófilos-mastocitos
Megacariocitos
Eritrocitos
CPTI
IL-5 Linfocitos B Segregada por linfocitos T, mastocitos
Eosinófilos
IL-6 Basófilos-mastocitos Segregada por linfocitos T y B, monocitos, células
Neutrófilos del estroma y osteoblastos
Megacariocitos
CPTI
IL-7 Linfocitos B y T Segregada por linfocitos T
Megacariocitos
Eritrocitos
IL-10 Linfocitos T
IL-11 Linfocitos B
Megacariocitos
IL-12 Células NK
C-kit-LIGANDO CPTI Segregada por células del estroma
Neutrófilos y eosinófilos Estimula la CPTI e induce su diferenciación
Megacariocitos
CFU-E, unidades formadoras de colonias eritroides; CPTI, célula progenitora totalm ente indiferenciada o célula madre
pluripotente (CMP); G-CSF, factor estimulador de colonias granulocíticas; GM-CSF, factor estimulador de colonias
granulomonocíticas; IL, interleucina; M-CSF, factor estimulador de colonias monocítico-macrofágicas; NK, natural killer.
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la formación de eritrocitos, o la trom bopoyetina (Tpo) que estimula la formación de

plaquetas. Finalmente, u n m enor número de ellas, intervienen en etapas muy iniciales
de la hematopoyesis como, por ejemplo, el factor estimulante de células madre o la IL-3
que actúan sobre progenitores m uy inm aduros, o el factor estim ulante de colonias
granulomonocíticas (GM-CSF) que actúa sobre los progenitores comprometidos hacia
varias series celulares, especialmente la granulocítica y la monocítica.
Junto a esta actividad ontogénica, las citocinas contribuyen también a mantener la
integridad de las membranas celulares y a modular el proceso de la apoptosis. Su acción
sobre las células hematopoyéticas se realiza mediante unión a receptores de la membrana
y transmisión de señales específicas al núcleo que modifican la actividad genética. La
transmisión de señales se realiza mediante un mecanismo «en cascada», en el que intervie
nen numerosos «mensajeros» intracelulares. Con muy pocas excepciones, los receptores
celulares implicados en la hematopoyesis son bioquímicamente similares y muy diferentes
de cualquier otro receptor celular del organismo. Por ello, constituyen una superfamilia de
receptores hematopoyéticos que cuando se unen a la citocina específica forman unos
complejos de membrana resultado de la unión a otro receptor idéntico (homodímero) o
diferente (heterodímero). Estos complejos diméricos mediante activación de un sistema
de tirosina cinasas (cinasas-JAK) transmiten el estímulo al núcleo celular que determinará
el inicio de la división mitótica. Muchos de estos receptores se hallan agrupados en una
pequeña región del brazo largo del cromosoma 5, cuya deleción se ha asociado al desa
rrollo de ciertas hemopatías malignas. La síntesis de estas citocinas corresponde a células
y tejidos muy diversos. Por ejemplo, la eritropoyetina (Epo), que es la hormona que regula
la producción de eritrocitos, es sintetizada por ciertas células del tejido renal sensibles a la
hipoxia. Así cuando el oxígeno que reciben es insuficiente sintetizan Epo, que a través
del plasma alcanza los receptores específicos (Epo-R) de los precursores eritrocitarios y
estimula la mitosis y la maduración celular. En esta función, por tanto, la Epo actúa como
una horm ona endocrina. Las citocinas, que estimulan la producción de granulocitos
neutrófilos, son sintetizadas a través de un proceso algo más complejo y sensible a la
presencia de gérmenes u otras células extrañas al organismo (infecciones). Cuando estos
compuestos extraños son fagocitados, los macrófagos producen monocinas, como por
ejemplo la IL-1 y el factor de necrosis tum oral a (T N F-a), que a su vez actúan sobre
linfocitos T, células endoteliales y fibroblastos, así activan la producción de citocinas o
G-CSF y M-CSF. A través del plasma, estas citocinas se dirigen a la médula ósea donde
actúan sobre los precursores granulocíticos y monocíticos e inducen su m aduración
a polimorfonucleares neutrófilos y m onocitos, respectivamente. De esta forma estas
citocinas pueden actuar como hormonas endocrinas pero también paracrinas, es decir,
por acción directa, sin necesidad de previa circulación sanguínea.
El desarrollo de cultivos in vitro de progenitores en medio semisólido ha permitido
la purificación y clonación de todos estos factores glucoproteicos. Su acción sinérgica
estimula la regeneración y la diferenciación de progenitores granulocíticos y monocí
ticos, y su disminución induce una apoptosis inmediata con rápida disminución de los
fagocitos circulantes.
LINEAS MADURATIVAS DE LA HEMATOPOYESIS.

ASPECTOS MORFOLÓGICOS
Las células de la hematopoyesis, situadas siempre en la médula ósea, se clasifican según su
grado de diferenciación en progenitoras y precursoras. Las células progenitoras se hallan
en etapas muy iniciales del proceso madurativo y morfológicamente son indistinguibles
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de la CMP. Las células precursoras pueden ser identificadas morfológicamente como

pertenecientes a alguna de las líneas de maduración celular propias de la hematopoyesis
normal: mieloide y linfoide (fig. 2-4). El proceso madurativo de los precursores hema-
topoyéticos, aunque sigue una línea propia para cada estirpe celular, presenta algunos
aspectos comunes entre los que cabe mencionar los siguientes:
• Entre el precursor com prom etido y la célula m adura de sangre periférica existen
etapas celulares intermedias de diferenciación (maduración y mitosis).
• Cada estadio madurativo consta de dos mitosis, aunque teóricamente el número de
células crece en progresión geométrica conforme avanza la maduración.
• El proceso de diferenciación de un precursor comprometido a célula m adura com
porta en general las siguientes transformaciones:
• Disminución del tamaño celular.
• Condensación de la cromatina nuclear.
• Disminución o desaparición de la basofilia citoplasmática.
• Aparición de granulación específica (en determinadas líneas celulares).
Línea m ieloide
Comprende tres series celulares de maduración, las cuales terminan en la formación de
eritrocitos (serie eritropoyética o eritroblástica), granulocitos (serie granulopoyética o
granulocítica) y plaquetas (serie megacariocítica o plaquetaria), respectivamente.
Serie granulocítica
La maduración de la serie granulopoyética termina en la formación de los granulocitos
(neutrófilos, eosinófilos, basófilos), los mastocitos y los monocitos. Esta serie posee una
célula progenitora común llamada unidad formadora de colonias granulomonocíticas
CFU-GEMM
(CFU-S)
Precursor
mieloide
FIGU RA 2-4. Esquema de la hematopoyesis normal.
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(GM-CFU) que se diferencia en cuatro líneas de maduración distintas que darán lugar
a los granulocitos neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y monocitos (v. fig. 2-4).
De la GM-CFU derivan las unidades formadoras de colonias granulocíticas (G-CFU) y
de colonias monocíticas (M-CFU). A partir de la G-CFU, y en series celulares indepen
dientes, m aduran los granulocitos neutrófilos, los eosinófilos y los basófilos.
La prim era célula de la serie granulopoyética identificable morfológicamente es el
mieloblasto, que posee un tamaño comprendido entre 15 y 20 |±m con un núcleo de cro-
matina laxa (inmadura) que contiene entre dos y tres nucléolos y un citoplasma basófilo
y sin granulación o con m uy escasa granulación azurófila (primaria). Esta granulación
corresponde a los lisosomas, por lo que posee un elevado contenido en mieloperoxidasa
(MPO). La concentración de mieloblastos en la médula ósea es de aproximadamente
un 1% y normalmente estos no circulan nunca por la sangre. El mieloblasto madura a
promielocito, un citoplasma menos basófilo de tamaño algo superior (16-25 (xm) y con
abundante granulación azurófila. El núcleo presenta una cromatina algo más densa y
menos nucléolos. Su concentración en la médula ósea es algo mayor al 5% y en condicio
nes normales nunca se halla en la circulación. Cuando aparece la granulación específica
(neutrófila, eosinófila o basófila) y desaparecen los nucléolos, el promielocito se trans
forma en mielocito, de tamaño algo m enor (12-18 |xm) y caracterizado por la intensidad
de la granulación citoplasmática. Los mielocitos más abundantes son los neutrófilos, que
importan entre un 10 y un 20% del total de la celularidad medular. Conforme progresa la
maduración del mielocito, va disminuyendo la granulación primaria y el tamaño celular
hasta que se transforma en un metamielocito, cuya característica diferencial es la forma
peculiar del núcleo. Así, esta deja de ser redonda para hacerse arriñonada y la cromatina
aumenta de densidad. El diámetro del metamielocito (10-15 |xm) es algo inferior al del
mielocito y el citoplasma presenta abundante granulación específica. Su concentración
en la médula ósea es similar a la del mielocito (15-20% del total de la celularidad) y en
condiciones normales nunca circula por la sangre. Al continuar el proceso madurativo,
el tamaño de la célula disminuye significativamente y la escotadura del núcleo se hace
cada vez más pronunciada hasta adquirir la forma de un cayado, momento en el que a la
célula se la conoce como neutrófilo en cayado o banda. Los neutrófilos no segmentados
presentes en la médula ósea representan, aproximadamente, el 30% del total de la celu
laridad y en su mayoría alcanzan la etapa final del proceso madurativo consistente en la
segmentación del núcleo en varios lóbulos unidos mediante finos puentes cromatínicos.
En este estadio de la m aduración, a la célula se la denom ina neutrófilo segmentado o
polimorfonuclear. Aunque todos los neutrófilos segmentados pasan en la médula ósea
por la fase de cayado o banda, el pequeño porcentaje (1-6%) de estas células que alcanza
la sangre periférica ya no maduran a segmentados sino que permanecen como tales hasta
su eliminación por el sistema mononuclear fagocítico (SMF).
La maduración de la serie granulocítica viene regulada por diversas citocinas, entre
las que destaca el G-CSF, el GM-CSF y la IL-3. A cada etapa de la granulopoyesis le
corresponde una mitosis; existen norm alm ente cuatro mitosis entre el mieloblasto y
el metamielocito, el cual no sufre ya ninguna división ulterior. La duración total de la
maduración granulocítica varía entre 4 y 7 días.
Serie monocítica
La maduración de la serie monocítica sigue un proceso similar al de la serie granulocítica.
En la fase de progenitores existen dos células comprometidas, una com ún a la serie
granulocítica (GM-CFU) y otra específica para la serie monocítica (M-CFU) de la cual
deriva el monoblasto, que es el prim er precursor identificable morfológicamente como
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de estirpe monocítica. El m onoblasto es u n a célula de características morfológicas

parecidas al mieloblasto (aunque es de mayor tam año) p or lo que, en condiciones
normales, resulta difícil distinguirlas con solo la observación morfológica. Citoquí-
micamente, al contrario de lo que sucede con el mieloblasto, posee escasa actividad
MPO pero una intensa actividad esterásica inespecífica: naftol-ASD-acetatoesterasa
(NASDA), a-naftilacetatoesterasa (ANAE) y a-butiratoesterasa (ANBE). La siguiente
etapa madurativa es el promonocito de aspecto morfológico semejante al promielocito
(aunque también es de mayor tamaño).
La m aduración del m onocito viene regulada por factores estimulantes de colonias
(CSF), especialmente el M-CSF, el GM-CSF y la IL-3. La IL-3 y el GM-CSF actúan
sobre las CMP y los progenitores, m ientras que el M-CSF actúa sobre progenitores
más diferenciados de la línea monocítica. Los factores G-CSF, GM-CSF y M-CSF son
también potentes activadores de la función fagocítica de los monocitos m aduros y de
los neutrófilos, y el GM-CSF contribuye a la proliferación, movilización y diferenciación
de las células dendríticas.
Los macrófagos derivados del monocito tienen una localización exclusivamente hís-
tica (histiocitos), poseen un núcleo redondo o ligeramente lobulado, y se caracterizan
por poseer cuerpos multilaminares y abundantes seudópodos o prolongaciones en su
superficie celular. Los macrófagos varían según el tejido en el que anidan los monocitos
y por ello reciben nombres específicos (tabla 2-2).
La función de los macrófagos es la de fagocitar y digerir agentes patógenos, a la vez
que elaboran citocinas (IL-1, IL-2 y TN F-a), cuya función modula la actividad de otras
células del sistema inmune e incrementa su capacidad defensiva. Los precursores de la
médula ósea, los monocitos circulantes y los histiocitos forman el SMF cuya función
fundam ental es eliminar, m ediante fagocitosis, las sustancias extrañas al organismo
pero también modular la respuesta inmune aumentando el potencial microbicida y la
citotoxicidad dependiente de anticuerpos o de la síntesis de ciertos factores, como el
interferón y las prostaglandinas. Otra de las funciones del SMF es contribuir al recambio
celular sanguíneo mediante fagocitosis de las células envejecidas que han cumplido su
ciclo vital o que presentan algún defecto congénito o adquirido (por ejemplo, hemólisis
y enfermedades inmunes). Las células del SMF son fácilmente identificables a través de
diversas características propias (cuyo estudio es im portante en el diagnóstico de ciertas
enfermedades): 1) poseen escasa actividad MPO y abundante actividad esterásica ines
pecífica; 2) producen cantidades significativas de lisozima o muramidasa, y 3) los cultivos
in vitro de progenitores hematopoyéticos en medio semisólido de agar y condiciones
determinadas pueden dar lugar a colonias de macrófagos.
TABLA 2-2. Tipos de macrófagos hísticos derivados del monocito y su localización
Nombre Tejido
Histiocitos Conectivo
Células de Kupffer Hígado
Macrófagos alveolares Pulmón
Macrófagos de los cordones y senos esplénicos Bazo
Células sinusoidales Ganglio linfático
Macrófagos medulares Médula ósea
Macrófagos de las serosas Pleura y peritoneo
Osteoclastos Hueso
Células de la microglia Sistema nervioso
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Serie eritropoyética
Es la que conduce a la formación de eritrocitos o hematíes. Su proceso de diferenciación
se caracteriza fundamentalmente p o r la síntesis de hemoglobina, principal pigmento
respiratorio del organismo. Este proceso, que depende fundamentalmente de la Epo, se
acompaña de un conjunto de modificaciones celulares m uy características:
• Disminución de la basofilia del citoplasma que se acompaña de un aum ento pro
gresivo de la acidofilia debido a la sustitución del ARN por hemoglobina.
• Pérdida del núcleo (extrusión).
• Desaparición de todas las organelas citoplasmáticas (maduración).
La diferenciación de la serie eritropoyética se inicia con el progenitor BFU-E que, a
su vez, se transforma en CFU-E. Este proceso requiere la presencia de GM-CSF e IL-3.
El prim er precursor reconocible morfológicamente como de serie eritropoyética es el
proeritroblasto, que se caracteriza por su gran tamaño (20-25 |xm), la intensa basofilia
citoplasmática y la presencia de un núcleo grande con crom atina laxa y finamente
reticulada en el que suelen apreciarse dos o más nucléolos. Es frecuente la existencia
de un halo blanquecino perinuclear y clasmatosis en la m em brana citoplasmática. La
diferenciación del proeritroblasto se produce mediante una sucesión combinada de
procesos de división m itótica y m aduración celular que term inan en la form ación
de eritrocitos adultos (fig. 2-5).
En este proceso de maduración, cada proeritroblasto da lugar a la formación de dos
eritroblastos basófilos que se caracterizan p o r un m enor tamaño (16-18 |xm) y mayor
m adurez citoplasmática, aunque conservan u n a intensa basofilia ju n to a una pro
gresiva condensación de la cromatina. A su vez, cada eritroblasto basófilo da lugar, por
división mitótica, a dos nuevos eritroblastos de idénticas características morfológicas
(eritroblastos basófilos tipo I y tipo II, respectivamente) que después de una nueva
mitosis se transform an en un eritroblasto policromatófilo (8-12 |xm) caracterizado
por su citoplasma gris rosado debido a la hemoglobina que inicia su síntesis en esta
etapa madurativa de la eritropoyesis. Esta célula ya no sufre ninguna otra división y
se transform a finalmente en eritroblasto ortocromático (7-10 |xm), caracterizado por
un mayor contenido citoplasmático en hemoglobina (color rosa-azulado) y un núcleo
picnótico. Del 20 al 45% de los eritroblastos ortocrom áticos presentan hierro en su
FIGU RA 2-5. Esquema de la línea madurativa eritroblástica.
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FIGURA 2-6. Islote eritroblástico.

Obsérvese el macrófago (célula
nodriza) rodeado de eritroblastos
(M G G , X 1.000).
citoplasma y se denominan sideroblastos. El hierro de los sideroblastos se halla bajo la

forma de hemosiderina, compuesto no hemínico derivado de la ferritina que puede
ponerse fácilmente de manifiesto mediante la tinción de Perls del aspirado de médula
ósea basado en la formación de un compuesto verde-azulado muy característico (azul
de Prusia). El hierro es transportado a los eritroblastos directamente por la transferrina
(llamada también siderofilina) del plasma, pero puede ser transferido directamente
desde los macrófagos a través del llamado «islote eritroblástico» (fig. 2-6). El número de
sideroblastos puede variar en diferentes situaciones patológicas, por lo que tiene valor
diagnóstico en hematología.
La maduración final del eritroblasto ortocromático consiste en la pérdida del núcleo
(probablemente a través de un mecanismo de extrusión) y su transformación final en
reticulocito, célula caracterizada por poseer aún intensa capacidad de síntesis hemoglobí-
nica. El reticulocito tiene un tamaño algo superior al del eritrocito (8-10 |xm) y, al poseer
cierta cantidad de ARN en su citoplasma, suele presentar, mediante la tinción panóptica,
una tonalidad azulada (eritrocito policromático). Antes de m adurar completamente a
eritrocito adulto, el reticulocito permanece de 2 a 4 días en la médula ósea y 1 día en
sangre periférica. Debe señalarse que, aunque de cada proeritroblasto pueden formarse
hasta 16 eritrocitos, esto no sucede casi nunca en la realidad, debido a la existencia de un
cierto grado de eritropoyesis ineficaz fisiológica (1/8 de la eritropoyesis total). Asimismo,
aunque el tiempo necesario para la maduración completa de u n proeritroblasto es de
unos 5 días, en caso de anemia muy intensa, este disminuye al producirse un adelanto
de la expulsión del núcleo. Este fenómeno explica la aparición en sangre de eritrocitos de
tamaño superior al normal (macrocitosis) y leve tonalidad azulada (policromasia).
A cada u na de las etapas madurativas de la línea eritroblástica le corresponde una
mitosis con las siguientes excepciones:
• Parecen existir dos mitosis sucesivas en el estadio de eritroblasto basófilo (eritroblasto
basófilo I y eritroblasto basófilo II).
• El eritroblasto ortocromático no sufre mitosis alguna, y al expulsar el núcleo se trans
forma directamente en reticulocito.
• No todas las mitosis son eficaces, ya que algunas de ellas no dan lugar a maduración
celular, sino que terminan con la destrucción del eritroblasto (eritropoyesis ineficaz
fisiológica).
El regulador humoral más importante de la eritropoyesis es la Epo, glucoproteína de
PM de 34,4 kDa, producida en un 90% por las células del intersticio peritubular renal
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y en un 10% por las células hepáticas que promueven la supervivencia y la capacidad

regenerativa y de diferenciación de los progenitores com prom etidos hacia la línea
eritroide. La Epo actúa sobre un receptor específico (R-Epo) presente en la superficie
de las CFU-E y en los proeritroblastos m anteniendo la viabilidad de la línea celular,
ya que cuando su concentración disminuye p or debajo de cierto límite estas células
sufren un proceso de apoptosis o muerte celular programada. Los R-Epo disminuyen
progresivamente con la m aduración celular y desaparecen en la fase de eritroblasto
ortocromático. En condiciones normales, la concentración de Epo se mantiene estable
pero puede aum entar varias veces p or encima de su valor norm al en condiciones de
hipoxia (hemorragia, hemólisis, disminución de la P 0 2 o disminución de la síntesis
de hemoglobina).
Serie m egacariocítica
La trombocitopoyesis es el mecanismo fisiológico responsable de la formación con
tinuada de las plaquetas. El prim er precursor de esta línea celular reconocible m or
fológicamente es el megacarioblasto, que inicia un proceso de aproximadamente siete
reduplicaciones sin división celular (endomitosis) cada una de las cuales se acompaña
de un aumento progresivo de la ploidía, la lobulación nuclear, así como del tamaño para
transformarse en diferentes formas de megacariocito. Suele m edir entre 25 y 30 jim de
diám etro, y su citoplasm a es intensam ente azul con unas prolongaciones a modo
de seudópodos (clasmatosis) que facilitan su identificación al examen morfológico
con el microscopio. El m egacarioblasto se transform a en promegacariocito, que es
una célula de tamaño algo superior al del megacarioblasto (30-55 (Jim) y muy fácil de
identificar por el aspecto multilobulado del núcleo, el citoplasma basófilo, desflecado
y con abundantes granulaciones. Por endomitosis (división del núcleo, pero no del
citoplasma), el promegacariocito se transforma en megacariocito, célula de gran tamaño
(80-100 (Jim) y elevada ploidía. Posee un citoplasma amplio de color rosado y repleto de
gránulos azurófilos, la mayoría de los cuales (especialmente en la periferia de la célula)
se agrupan y rodean lo que se denomina «membrana de demarcación», que delimitará
las futuras plaquetas. La fragmentación definitiva del citoplasma del megacariocito da
lugar a las plaquetas, que solas o formando cúmulos penetrarán finalmente en la sangre
después de atravesar la pared de los capilares.
El principal regulador de la trombocitopoyesis es la Tpo, horm ona que estimula la
regeneración y diferenciación de los megacariocitos y su fragmentación en plaquetas.
Junto a la Tpo en la megacariopoyesis intervienen también otros factores como la IL-3,
el SCF, la IL-11 y la Epo, que posee una gran analogía estructural con la Tpo.
Línea linfoide
La línea de diferenciación linfoide consta de tres series celulares de m aduración dife
renciadas: serie linfoide B, serie linfoide T (linfocitos colaboradores Th y citotóxicos
Te) y células natural killer (NK). Todas ellas derivan de un mismo progenitor linfoide
(CFU-L) que a su vez deriva de la CMP de la médula ósea. De este progenitor parecen
derivar también algunas células dendríticas.
La prim era célula reconocible morfológicamente de esta línea es el linfoblasto, que
resulta muy difícil de diferenciar del mieloblasto y el monoblasto, a no ser por el empleo
de técnicas complementarias como, por ejemplo, la citoquímica (MPO) o los anticuerpos
monoclonales (inm unofenotipo). A diferencia del resto de células hematopoyéticas,
los precursores de serie linfoide abandonan la médula ósea para term inar su proceso
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madurativo en los tejidos del llamado sistema inmune. Es de señalar que mientras el
proceso de maduración de los linfocitos B se realiza fundamentalmente bajo influencia
del estroma de la médula ósea, la maduración de los linfocitos T se realiza bajo influjo del
estroma tímico.
Serie linfoide B
Los precursores linfoides m aduran a linfocitos B en la propia m édula ósea, ya que el
organismo hum ano carece de ellos, como sucede en las aves de un órgano específico
para la maduración de esta población celular («bursa de Fabricius»). La maduración de
los precursores linfoides de línea B en la médula ósea requiere de células del estroma
medular y se realiza a dos niveles: uno precoz, mediado por contactos intercelulares o
directos, y otro tardío, mediado por factores solubles. Al objeto de evitar la formación
de linfocitos B con capacidad reactiva frente al propio organism o (autorreactiva),
en el proceso madurativo existe un mecanismo de selección negativa p o r el cual los
linfocitos B inmaduros solo expresan IgM (no IgD) que reconocen los antígenos (Ag)
de su entorno, es decir, los de la propia médula ósea. Con ello se consigue un estado de
tolerancia inmunológica frente a estos Ag y se evita la aparición de linfocitos B activados
con capacidad autorreactiva. A medida que avanza el proceso madurativo de la línea
linfocitaria B, van apareciendo nuevas subpoblaciones con nuevos antígenos, como por
ejemplo el receptor para los eritrocitos de ratón (que originan las rosetas M), los recep
tores para la fracción Fe de la IgG o para las fracciones C3b, C3d y C4 del complemento.
Estos linfocitos presentan también receptores para la fracción Fe de la IgM (como los
linfocitos T colaboradores), pero su capacidad para unirse a esta inmunoglobulina es
muy inferior a la que presentan los linfocitos TM. Los linfocitos B presentan un receptor
característico para el virus de Epstein-Barr (VEB).
Los linfocitos B tienen, en general, menos longevidad que los T y su recirculación
(sangre-órganos linfoides y viceversa) es menos notoria. Su ubicación en los órganos
linfoides periféricos se establece preferentemente en los folículos linfoides de los ganglios,
en los folículos de la pulpa blanca del bazo y dispersos en la pulpa roja del mismo, así
como en los folículos del tejido linfático bucofaríngeo e intestinal.
Una vez maduros, los linfocitos B migran a órganos linfoides secundarios, funda
mentalm ente los ganglios linfáticos en donde se localizan en centros germinales de
los folículos linfoides, y a otros tejidos del sistema inmune como el timo, el bazo y las
mucosas del aparato digestivo. El antígeno extraño, solo o transportado por células de
Langerhans o similares, llega a los ganglios linfáticos en cuya paracorteza las células
transportadoras se transform an en células dendríticas y lo presentan a los linfocitos
B que, en 3 o 4 días, se diferencian en células plasmáticas secretoras de inmunoglobulinas
(IgM e IgG) y células B memoria. El resto de células B en fase de activación (y también
algunas células T) emigran a la corteza y a los folículos primarios donde interaccionan
con las células dendríticas foliculares, los macrófagos, las células Th y las células B. En este
proceso de maduración linfoide B el folículo primario del ganglio linfático se transforma
en secundario y aparece un centro germinal donde continúa la activación de las células B
que, después de pasar por la fase de centroblastos, se transforman en nuevas células plas
máticas y células B memoria. Las células plasmáticas, de mayor tamaño que los linfocitos
B, con citoplasma intensamente basófilo y el núcleo excéntrico de cromatina densa («en
rueda de carro») tienen como función primordial sintetizar inmunoglobulinas (Ig) que
salen a la circulación y actúan como anticuerpos (Ac). Las células B memoria se quedan
en el folículo, especialmente en la zona del manto.
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La linfa sale por el único linfático eferente, y se halla enriquecida en Ac y linfocitos B.

Este incremento de linfocitos se debe tanto a la regeneración que se produce dentro del
ganglio como a los linfocitos que ingresan en el mismo procedentes de la sangre a través
de las vénulas poscapilares de endotelio alto (HEV). Cuando existe una estimulación
antigénica (infección, p o r ejemplo), la mayor entrada de linfocitos a través de las HEV
en los ganglios linfáticos explica el aumento de su tamaño (adenomegalia).
Serie linfoide T
Los progenitores linfoides de la médula ósea y los precursores de la serie T (células pre-T)
no tienen capacidad de reconocer antígenos, ya que no expresan el receptor específico
de la serie (TCR) ni moléculas accesorias. Esas células migran preferentemente hacia el
timo y, en parte también, hacia la piel y el aparato digestivo. Ya en el timo, en el córtex, las
células T inmaduras, llamadas también timocitos inician un intenso proceso de división
mitótica del que más del 95% de los linfocitos resultantes mueren por apoptosis y el
resto, después de interaccionar con células del estroma (células nodriza, células corti
cales epiteliales y células dendríticas) m aduran a linfocitos T inmunocompetentes (Th
vírgenes) capaces de reconocer antígenos o moléculas extrañas al propio individuo. La
maduración de los linfocitos T inmunocompetentes se realiza mediante un mecanismo
de selección en el que intervienen dos fases: positiva, en la que sobreviven los timocitos
con receptores (TCR, CD4 o CD8 y moléculas accesorias) capaces de reconocer moléculas
de histocompatibilidad (MHC) propias, y negativa, en la que se eliminan por apoptosis
los timocitos que al haber superado la selección positiva reconocen moléculas del propio
individuo (autoantígenos) o tienen una afinidad excesiva por los componentes del MHC
propios. Este proceso asegura que mueran aquellos clones de células T no restringidos
por las M HC propias y aquellos que reconocen antígenos propios, de m anera que el
repertorio de células T maduras que salen del timo son clones de células T restringidos
por el patrón M HC propio y, por ello, «autotolerantes», es decir, sin inmunidad contra
células del propio organismo. Estos linfocitos, después de atravesar la m édula tímica,
abandonan el timo y, junto a los linfocitos B, recirculan por la sangre y el sistema linfático
de manera que cuando acceden a un tejido infectado pasan primero a los ganglios linfá
ticos regionales donde son activados y luego a la sangre en la que alcanzan los órganos
y tejidos linfoides periféricos.
En el proceso madurativo los timocitos TCR + , CD4+ y CD8+ van sufriendo cambios
profundos hasta dar lugar a una población de linfocitos T maduros que pueden ser de
dos tipos: colaboradores (Th), con receptores para la fracción Fe de la IgM y que facilitan
la diferenciación de los linfocitos B, y supresores (Te) con receptores para la fracción Fe
de la IgG, que la inhiben. Ambas subpoblaciones de linfocitos T pueden diferenciarse
mediante el empleo de anticuerpos monoclonales, ya que en cada caso presentan un
correceptor diferente (CD4 [colaboradores] yCD8 [supresores]) que reconoce porciones
conservadas de los antígenos HLA de clase II y clase I, respectivamente. El TCR (CD3)
también va madurando y finalmente se dividirá en dos tipos a|3 o X8. Estos receptores
reconocen el patógeno en pequeños péptidos dentro del antígeno HLA.
Transportados por la sangre, los linfocitos T llegan a los diferentes órganos linfoides
periféricos (ganglios linfáticos, bazo, placas de Peyer intestinales, órganos linfoides bu-
cofaríngeos), donde ocupan unas zonas concretas: zona cortical profunda y espacio
interfolicular de los ganglios, región periarteriolar del bazo y áreas interfoliculares de las
placas de Peyer y de los órganos linfoides bucofaríngeos. Estos linfocitos vuelven de nuevo
a la circulación general, por lo que esta recirculación se prolonga durante mucho tiempo
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(meses e incluso años). Cuando entran en contacto con un antígeno, sufren un proceso
de regresión al estadio inmaduro (T-inmunoblasto) con producción de linfocinas, que
son unas glucoproteínas que actúan de mediadoras en la hipersensibilidad retardada.
Después de un prim er contacto con el antígeno, los linfocitos T adquieren memoria
inmunológicay, cuando entran nuevamente en contacto con el mismo antígeno, elaboran
linfocinas que son las responsables de los fenómenos de inmunidad celular.
En la piel, los linfocitos T coexisten con las células epiteliales de la epidermis (querati-
nocitos) y las células de Langerhans que captan antígenos (por endocitosis o fagocitosis)
y emigran por vía linfática hacia la paracorteza de los ganglios regionales. Aquí, las células
de Langerhans se diferencian en células dendríticas interdigitantes, actúan como potentes
células presentadoras de antígeno (CPA) a los linfocitos Th vírgenes y producen su
activación. Los queratinocitos pueden también secretar citocinas que inducen la reacción
inflamatoria local. Finalmente, y dispersos en la dermis, se pueden encontrar también
macrófagos y linfocitos B y T activados o memoria.
Células natural killer (NK)

Son de tam año algo superior al de los linfocitos T o B y su citoplasma, generalmente
más abundante, suele contener escasa granulación azurófila. Por ello, a estas células se
las conoce también con el nombre de linfocitos grandes granulados (LGG), aunque esta
característica morfológica no permita distinguirlas de ciertas subpoblaciones T activadas
que presentan un aspecto superponible.
Las células NK reaüzan una función de vigilancia de ausencias. Es decir, cuando una
célula pierde algunos de sus marcadores específicos la destruyen. Esto sucede principal
mente en el curso de proliferaciones tumorales e infecciones víricas. Las células NK tienen
la capacidad de destruir otras células de forma directa sin necesidad de reconocimiento
mediante el sistema HLA. Para realizar esta función presentan diversos receptores de
superficie entre los que destacan el receptor de lisis (NKPR1), que reconoce azúcares en
la superficie de otras células, y el receptor de inhibición (KIR), que reconoce péptidos
propios en la cavidad de moléculas M HC de clase I. Existe un equilibrio entre ambos
receptores para decidir si la célula NK va a proceder o no a la lisis de la célula diana.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS

El diagnóstico de las enfermedades de la sangre, pero también el estudio de muchos
trastornos del organismo, requiere de la observación morfológica del frotis o extensión
de sangre periférica. Por ello, es m uy im portante saber reconocer las características
morfológicas de las células sanguíneas circulantes (leucocitos, hematíes y plaquetas) y
diferenciarlas de todas aquellas alteraciones que pueden obedecer a una enfermedad de
la sangre o una alteración secundaria o de causa no hematológica.
Leucocitos o glóbulos blancos

Constituyen un conjunto de células con función diversa, aunque relacionada con la
defensa del organismo frente a diferentes sustancias extrañas o agentes patógenos me
diante fagocitosis y mecanismo inmune. A diferencia de las restantes células sanguíneas
circulantes poseen núcleo como cualquier otra célula del organismo, aunque inactivo, y
organelas citoplasmáticas que intervienen en los procesos de fagocitosis y eliminación
de agentes extraños o patógenos Existen tres subpoblaciones de leucocitos: granulocitos,
monocitos y linfocitos.
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FIGURA 2-7. Granulocito

ylinfocito normales.
Granulocitos
Reciben este nom bre p o r poseer una granulación citoplasmática m uy abundante y
característica que, según su afinidad por los colorantes que se utilizan para su tinción
(tipo Romanowsky) se subclasifican en neutrófilos, eosinófilos y basófilos.
Granulocitos neutrófilos
Constituyen el 40-75% del total de leucocitos (2,5-7,5 X 109/1) y son el tipo de leucocitos
predom inante en sangre periférica. Su diámetro varía entre 10 y 15 jxm y poseen un
citoplasma ligeramente acidófilo (rosa pálido) con abundante granulación que, cuando
se emplea la tinción panóptica de Romanowsky, muestra afinidad por los colorantes
neutros y adquiere una tonalidad parda característica.
El núcleo es violeta-púrpura y está compuesto por cromatina muy densa y sin funcio
nalidad, cuya característica morfológica más destacada es la de presentar de tres a cuatro
lóbulos o fragmentos unidos p or puentes cromatínicos muy delgados lo que hace que
estas células tengan el núcleo de aspecto lobulado o polinucleado, hecho por el que se las
conoce también con el nombre de polimorfonucleares (fig. 2-7). En las formas menos ma
duras, el puente cromatínico que separa los lóbulos es mucho más ancho y, a veces, tanto
como el propio núcleo, por lo que este presenta forma de una banda o cayado (fig. 2-8).
En algunos granulocitos neutrófilos (GN) polimorfonucleares, el núcleo presenta un
O
FIGURA 2-8. Granulocito
neutrófilo con el núcleo en cayado
(MGG, X 1.000).
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FIGURA 2-9. Polimorfonuclear

neutrófilo que presenta un apéndice
nuclear en forma de palillo de tambor
(MGG, X 1.000).
pequeño apéndice o protuberancia (apéndice nuclear) en forma de gota pendiente o

palillo de tambor, que corresponde al cromosoma sexual femenino inactivo (fig. 2-9).
La cromatina sexual (corpúsculo X o de Barr) corresponde al cromosoma X de repli-
cación tardía, genéticamente inactivo desde la época fetal. En los GN adopta la forma de
un palillo de tam bor con una cabeza redonda, hipercromática de 1,5-2 |xm de diámetro,
compuesta de heterocromatina, unida a uno de los lóbulos de núcleo de los granulocitos
mediante un puente filiforme. Hay tres tipos de apéndices nucleares de los granulocitos:
de tipo A, son los palillos de tam bor o drumstick ya comentados anteriormente; de tipo B,
idénticos a los anteriores, aunque unidos directamente al núcleo, y de tipo C, de m enor
tam año que los anteriores, tienen una form a variada y generalmente son múltiples
(fig. 2-10). Se considera a un individuo cromatín-positivo (sexo femenino) cuando
la suma de los apéndices A y B es superior a 6. El recuento de los apéndices nucleares
permite obtener el diagnóstico citológico del sexo cromatínico. El número mínimo en
el sexo femenino es de seis apéndices por cada 500 polimorfonucleares.
Observados mediante el microscopio electrónico de transmisión (MET), los polimor
fonucleares se caracterizan por poseer un aparato de Golgi muy desarrollado, numerosas
mitocondrias y escaso retículo endoplásmico rugoso (fig. 2-11). Las granulaciones neu-
trófilas, cuyo número es de aproximadamente 500 por célula, son de forma alargada y
con una longitud de 0,2 a 0,5 jim . Su estructura es homogénea. En núm ero escaso se
FIGURA 2-10. Apéndice nuclear.
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FIGU RA 2-11. Polimorfonuclear

neutrófilo observado mediante
el MET (X 10.000).
observan también granulaciones primarias, que corresponden a las que, m ediante el

microscopio convencional, se denominan azurófilas.
La función principal de los GN es la defensa del organism o frente a agentes ex
traños o patógenos, gracias a su capacidad quimiotáctica y fagocítica. Esta capacidad
defensiva va ligada a una intensa actividad oxidante generada por la presencia de ciertas
enzimas presentes en la granulación específica, como, por ejemplo, la MPO con marcada
acción bactericida. En condiciones basales, la médula ósea libera mayoritariamente GN
segmentados y muy pocos no segmentados (bandas). La vida media de los neutrófi
los segmentados es de unas 9 h y de ellos un 50% se hallan en la sangre (compartimento
circulante) y el resto adheridos a las paredes vasculares (compartimento marginal). Esta
distribución puede variar ampliamente a lo largo del día, lo que explica que el recuento
leucocitario en ayunas sea significativamente inferior al obtenido en condiciones pos-
prandiales. En casos de estimulación granulopoyética de origen infeccioso, aumenta la
liberación de neutrófilos no segmentados y se produce un significativo aumento de GN
en banda (desviación a la izquierda).
Granulocitos eosinófilos
Los granulocitos eosinófilos constituyen entre el 1-6% del total de leucocitos circulantes
(0,05-0,5 X 109/1) con una im portante variabilidad a lo largo del día (máxima concen
tración por la m añana y m ínim a p or la tarde). Su diámetro es de aproximadamente
12 m m y poseen un citoplasma basófilo repleto de gránulos bien individualizados,
redondos y de gran tamaño, que casi nunca cubren el núcleo. Estos gránulos contienen
sustancias de intenso carácter básico (espermina y esperm idina, principalm ente) y
cuando se emplea la tinción panóptica de Romanowsky fijan los colorantes ácidos,
esencialmente la eosina (gránulos eosinófilos) adquiriendo un color naranja intenso
(fig. 2-12). Observada mediante MET, esta granulación se compone de vesículas volu
minosas que contienen en su interior una o varias estructuras cristalinas de bordes rec
tangulares (fig. 2-13). El núcleo muestra una coloración violeta-púrpura algo más débil
que la del granulocito neutrófilo y, en general, es bilobulado, con dos masas nucleares
simétricas unidas por un puente de cromatina (forma de gafas). La polisegmentación
nuclear es rara en el eosinófilo maduro normal. La función del eosinófilo se relaciona
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eosinófilo. Apréciese la característica
forma del núcleo con dos lobulaciones
en forma de gafas.
con la defensa frente a procesos parasitarios y alérgicos (hipersensibilidad inmediata),

debida a su capacidad para inactivar las SRS de la anafilaxia, neutralizar la histamina
e inhibir la desgranulación de los mastocitos. Poseen también actividad fagocítica que
se desarrolla en un elevado núm ero de enfermedades autoinm unes y conectivopatías,
así como tam bién en ciertas hem opatías del sistema linfoide como, p or ejemplo, la
enfermedad de Hodgkin.
Granulocitos basófilos
Constituyen el tipo de leucocitos menos abundante de la sangre donde su proporción en
condiciones fisiológicas es siempre inferior al 1% (0,01-0,15 X 109/1). Su diámetro varía
entre 12 y 14 (xm, y su citoplasma acidófilo se halla repleto de una granulación grosera
que debido a su elevado contenido en compuestos ácidos (heparina, principalmente)
fija los colorantes básicos de Romanowsky y adquiere un color azul oscuro muy intenso
(fig. 2-14). Mediante tinción con azul de toluidina los gránulos basófilos adquieren un
color rojizo característico que destaca sobre el fondo azul del citoplasma (metacromasia).
La granulación basófila recubre prácticamente siempre un núcleo polilobulado solo
visible cuando existe desgranulación parcial, como sucede después de fijar las extensiones
de sangre en metanol absoluto o de un lavado excesivamente prolongado. A veces, la des
granulación es tan intensa que puede apreciarse bien el carácter acidófilo del citoplasma

eosinófilo observado mediante
el MET (X8.000).
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basófilo. Obsérvense las características
granulaciones citoplasmáticas
que llegan a cubrir el núcleo (MGG,
X 1.000).
celular junto a los huecos dejados por la pérdida de los gránulos. Observados mediante
MET, los gránulos basófilos pueden presentar características diferentes. Así, pueden ser
homogéneos, granulados o lamelares (fig. 2-15).
Los gránulos basófilos contienen compuestos diversos entre los que destacan la his-
tamina, conocido mediador de reacciones inflamatorias (hipersensibilidad y alergia), la
heparina, las proteasas, los compuestos lipídicos y también las citocinas (interleucinas:
IL-4 e IL-12) moduladoras de las reacciones inmunes. Ello explica la basofilia que puede
observarse en enfermedades sistémicas relacionadas con la patología inmune como, por
ejemplo, los síndromes inflamatorios crónicos y el hipotiroidismo. El contenido de los
gránulos basófilos es liberado por estímulo de los receptores IgE presentes en la superficie
celular. Durante un tiempo se creyó que, dada su similitud morfológica, los basófilos eran
la contrapartida circulante de los mastocitos presentes en los tejidos. Hoy se sabe que
son dos estirpes celulares diferentes con un progenitor comprometido (CPC) común y
funciones similares como, por ejemplo, la liberación de mediadores inflamatorios, pero
también con importantes diferencias (cuadro 2-1).

basófilo observado mediante
el MET (X8.000). Se observan
las granulaciones características
de los gránulos basófilos.
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CUADRO 2-1. Diferencias entre basófilos y células cebadas
• Los basófilos son siem pre células circulantes, m ientras que los m astocitos son siem pre
com ponentes hísticos
• Los basófilos tienen núcleo bilobulado y los m astocitos núcleo sencillo
• El diám etro de los basófilos es de 10 |xm y el de los m astocitos llega a las 30 |xm
• Los basófilos tienen g ránulos de glucógeno y los m astocitos no
• Los g ránulos en los m astocitos son m ás pequeños y están en m ayor núm ero
Linfocitos
Son, en frecuencia, la segunda población leucocitaria circulante, ya que constituyen
entre un 20-40% del total (1,5-4,5 X 109/1). De estos, entre un 70-75% son linfocitos
T y entre un 15-20% son linfocitos B. El resto, entre un 5-10% son células linfoides
nulas (noB-noT) la mayoría de las cuales corresponden a células NK. Cuando no están
activados, los linfocitos son células de pequeño tamaño (6 a 9 |xm), con citoplasma escaso
y basófilo, sin granulación o con pocos gránulos azurófilos y con un núcleo redondo, de
contorno regular y cromatina densa (predominio de heterocromatina), sin nucléolos
(fig. 2-16). El tamaño del citoplasma aumenta con la activación, de manera que un linfocito
activado puede alcanzar entre 7 y 18 pm (linfocito grande). En la sangre de un individuo
normal circulan un 3-5% de linfocitos grandes, generalmente linfocitos B en recirculación
hacia los tejidos linfoides y células NK. Los espacios libres de heterocromatina están
ocupados por cromatina laxa (eucromatina). Observados mediante MET, el citoplasma
de los linfocitos presenta escasas mitocondrias y algunos ribosomas (fig. 2-17).
Para realizar sus funciones, los linfocitos presentan receptores en su superficie,
algunos de los cuales reconocen estructuras del propio patógeno y otros patógenos
opsonizados por proteínas del sistema inmune (inmunoglobulinas o fragmentos de ac
tivación del sistema complemento). Los linfocitos B maduros se caracterizan por poseer
inm unoglobulinas de superficie, que van apareciendo progresivamente a m edida que
avanza el proceso de m aduración. La prim era en aparecer es la IgM y posteriormente
la IgD, m ientras que las IgG, IgA e IgE solo lo hacen cuando el linfocito ha sufrido un
estímulo antigénico. Los linfocitos de la línea B todavía inmaduros (linfocitos pre-B)
y que no presentan los marcadores Ig antes citados pueden identificarse m ediante
la demostración de cadenas pesadas jx (de la inm unoglobulina M) en el interior del
FIGU RA 2-16. Linfocitos.

El situado en posición inferior
muestra granulación azurófila
en el citoplasma (MGG, X750).
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citoplasma. Después del estímulo antigénico, el linfocito B sufre, en el interior del folículo
linfoide ganglionar, una transformación morfológica que lo transforma en un linfocito
B con m em oria inmunológica o bien en célula plasmática. Esta transformación pasa
por una serie de etapas que van desde la aparición de una profunda hendidura en el
núcleo del linfocito con progresivo aumento del tamaño celular (centrocito pequeño y
centrocito grande), hasta convertirse en una célula con signos de inmadurez morfológica
(centroblasto pequeño y centroblasto grande, respectivamente). Este último, ya fuera
del folículo linfoide, se transforma en un inmunoblasto, que presenta tamaño notable
(20-30 (xm), núcleo redondeado de cromatina laxa y varios nucléolos de localización
periférica y con un citoplasma intensamente basófilo que presenta marcada pironinofilia
(gran célula pironinófila). A partir de este estadio evolutivo, el inmunoblasto puede re
gresar al estadio de linfocito B pequeño, quiescente, o bien convertirse en una célula plas
mática, secretora de inmunoglobulinas. La célula plasmática se localiza en los cordones
medulares de los ganglios linfáticos, el bazo, el tim o y también en la médula ósea, la
piel y el intestino. Su morfología es m uy peculiar, presenta un núcleo excéntrico de
cromatina densa («en rueda de carro»), con un citoplasma intensamente basófilo que
posee una zona yuxtanuclear más clara (arcoplasma), donde se encuentra el aparato
de Golgi m uy hipertrofiado (fig. 2-18).
Aunque morfológicamente los linfocitos B no se distinguen de los linfocitos T, poseen
a diferencia de estos, escasa o nula actividad enzimática para las hidrolasas ácidas. La
desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) puede detectarse en algunas células pre-B.
Por el contrario, Los linfocitos T, además de los atributos inmunológicos (receptores
antigénicos), poseen también unas características citoquímicas que pueden contribuir
a su identificación cuando no se dispone de métodos inmunológicos. Entre ellas des
taca la positividad para la ANAE ácida y la positividad granular fina, de preferencia
centrosómica, para las enzimas fosfatasa ácida y la P-glucuronidasa. Por el contrario, a
diferencia de los timocitos o linfocitos T inmaduros, los linfocitos T maduros carecen
de actividad TdT.
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FIGURA 2-18. Linfocito reactivo.

Las características de esta célula son
el citoplasma abundante y ligeramente
basófilo, y el aspecto laxo de la
cromatina (MGG, X 1.000).
Monocitos
Constituyen el 2-10% del total de leucocitos (0,2-0,8 X 109/1) y su diámetro varía entre
14 y 20 (xm. El citoplasma, muy abundante y de color gris azulado, posee una fina gra
nulación azurófila dispersa pero algo más abundante en las proximidades del núcleo.
Este normalmente tiene una localización central y su forma siempre redondeada puede
presentar una o varias escotaduras que le confieren un aspecto arriñonado (fig. 2-19).
Debido a su gran tamaño, ocupa gran parte del citoplasma y su crom atina es laxa, fila
mentosa e irregular de aspecto ondulado (cromatina «peinada»). Observado mediante
el MET, el citoplasma del m onocito presenta un abundante retículo endoplásmico y
un aparato de Golgi muy desarrollado (área centrosómica). La granulación es también
abundante y el núcleo presenta una configuración característica con un predominio de
eucrom atina y un ribete periférico de heterocrom atina (fig. 2-20). A diferencia de los
polimorfonucleares, el m onocito circula solo temporalmente p o r la sangre periférica,
ya que muy pronto (antes de los 5 días) emigra a diferentes tejidos, donde permanece
bajo la forma de histiocito con actividad macrofágica durante meses o incluso años.
Los macrófagos derivados del monocito tienen una localización exclusivamente hística,
poseen un núcleo redondo o ligeramente lobulado y se caracterizan por poseer cuerpos
multilaminares y abundantes seudópodos o prolongaciones en su superficie celular.
FIGURA 2-19. Monocitos.

Obsérvese la característica forma
arriñonada del núcleo y la presencia
.V de una fina granulación azurófila
en el citoplasma (MGG, X 1.000).
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FIGURA 2-20. Monocito

observado mediante el MET (X 6.000)
con su característico núcleo en forma
de riñón. Junto a él (derecha)
se observa un polimorfonuclear
SSvE*-' neutrófilo.
Además de su función fagocítica, los monocitos circulantes juegan un importante

papel en la presentación de antígenos a los linfocitos T, p o r lo que intervienen muy
activamente en la respuesta inmune.
Hem atíes, eritrocitos o glóbulos rojos

Constituyen el componente celular más abundante de la sangre (el 50% del volumen
sanguíneo, aproximadamente). Debido a su elevada diferenciación carecen de núcleo y
organelas citoplasmáticas, estructuras que han sido sustituidas por hemoglobina, que
ocupa en solución acuosa la totalidad del citoplasma celular («saco de hemoglobina»).
La tinción de la extensión sanguínea mediante los colorantes habituales permite apreciar
muy bien la morfología eritrocitaria, ya que les confiere una característica tonalidad
rosada. Su observación es de gran interés en hematología, pues en muchos casos hace
posible por sí sola el diagnóstico etiológico de ciertos tipos de anemia.
En un sujeto sano, los eritrocitos se caracterizan p or la uniform idad de tamaño,
forma e intensidad de color. Así, cuando la extensión sanguínea ha sido bien realizada,
los eritrocitos destacan como corpúsculos redondeados (7-8,5 |xm de diámetro), con una
coloración más intensa en la periferia que en la región central, donde se aprecia una zona
clara (fig. 2-21). Ello se debe a la forma de disco bicóncavo que poseen, por lo que el
fe
I
FIGURA 2-21. Eritrocitos

normales. Obsérvese la característica
zona clara central en la mayoría
de ellos (MGG, X 1.000).
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Volumen <fl) Superficie (m 2)
mm 90 140
O 90 97
Eritrocito

forma bicóncava característica
del eritrocito, que pone de manifiesto
el exceso de superficie respecto
al volumen.
grosor del área central es menor que el de la periferia, lo que pone de manifiesto un exceso
de superficie en relación con el volumen (fig. 2-22). Esta forma tan peculiar del eritrocito,
que puede apreciarse muy bien cuando se observa mediante microscopia electrónica de
barrido (fig. 2-23), es fundamental para asegurar una elevada capacidad de deformación,
imprescindible para atravesar la microcirculación y los espacios intercelulares que cons
tituyen el llamado «filtro esplénico».
Debido a que la realización de la extensión supone siempre un artefacto mecánico
im portante sobre la morfología eritrocitaria, existe la posibilidad de evitarlo mediante
la fijación previa de los eritrocitos directamente a partir de sangre total con una solu
ción de glutaraldehído (2%) y observarlos posteriormente en suspensión mediante el
FIGU RA 2-23. Eritrocito

observado mediante el MEB.
Destaca la concavidad característica
en el centro del mismo (X4.000).
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FIGU RA 2-24. Eritrocitos

observados en suspensión,
previa fijación con solución
de glutaraldehído al 2% (X 1.000).
microscopio óptico. La óptica de Nomarski (filtro interferencial) contribuye a que se

puedan apreciar con mayor detalle las características de la superficie de los eritrocitos,
en especial la presencia de vacuolas eritrocitarias (pits) (fig. 2-24). La cuantificación del
número de vacuolas eritrocitarias por eritrocito y número de eritrocitos constituye un
procedimiento muy asequible en la práctica clínica para conocer la función de filtro del
bazo (tabla 2-3). Ello es así ya que en condiciones fisiológicas siempre existen vacuolas
eritrocitarias en proporción significativa que son eliminadas p or el bazo gracias a
su función de filtro. En caso de esplenectomía o asplenia, las vacuolas eritrocitarias
persisten y pueden ser fácilmente contabilizadas mediante microscopía óptica con filtro
interferencial.
Plaquetas o trom bocitos

Las plaquetas son corpúsculos discoides de pequeño tamaño (2 a 5 |xm) que carecen
de núcleo y cuyo citoplasma, de color rosa pálido, contiene cuatro tipos de granulación
distintos:
1. Gránulos a (contienen moléculas de adhesión, factores de coagulación y factores
de crecimiento).
2. Gránulos densos (contienen serotonina).
3. Lisosomas (contienen enzimas líticos).
4. Microperoxisomas (contienen catalasa).
TABLA 2-3. Cuantificación de vacuolas eritrocitarias
Vacuolas Grado Número de eritrocitos Puntuación

0 0 A (% A ) 0
1 1 B (% B ) 1 X B = B'
2-3 2 C (% C ) 2 X C = C'
4-5 3 D (% D ) 3 X D = D'
>5 4 E (% E ) 4 X E = E'
El recuento debe hacerse sobre u n m ínim o de 200 eritrocitos.

Expresión del resultado:
A. Eritrocitos con vacuolas (%) = (%B) + (%C) + (% D) + (%E).
B. Puntuación (P) = B ' + C ' + D ' + E '.
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Mediante la coloración panóptica resulta difícil distinguir estas granulaciones, aunque

puede reconocerse fácilmente mediante microscopía electrónica de barrido (fig. 2-25).
Desde el punto de vista funcional son muy importantes los gránulos a , ya que contienen
el factor plaquetario 4 (FP4) fundamental, al igual que otras estructuras de la plaqueta
(membrana plaquetaria), en el proceso de la coagulación sanguínea (v. capítulo 23). Las
plaquetas intervienen en la reparación de lesiones vasculares y facilitan la formación
de trom bos para evitar la hemorragia. Asimismo, poseen un citoesqueleto muy bien
desarrollado con una banda marginal de m icrotúbulos que se despolimerizan cuando
se inicia el proceso de agregación plaquetaria.
Características m orfológicas especiales de las células sanguíneas:

el cuerpo Y
El cuerpo Y, llamado también cuerpo cromatínico, es un corpúsculo m uy brillante que
puede identificarse al observar con el microscopio de fluorescencia las células en interfase
o en metafase de los individuos de sexo masculino. Corresponde a la parte distal de los
brazos largos del cromosoma Y, que es una zona rica en heterocromatina.
Las extensiones de sangre periférica, m edula ósea o cualquier otra preparación
citológica se fijan en una solución 1:1 de ácido acético y metanol, se tiñen durante 20 min
con una solución acuosa de quinacrina al 0,5%, se lavan en tampón fosfato a pH 5,5, se
cubren y se observan al microscopio de fluorescencia.
En las células en interfase, el cuerpo Y se observa como un punto fluorescente en el
núcleo (fig. 2-26). En las células con dotación genética poliploide (p. ej., osteoclastos, me-
gacariocitos) se observan varios cuerpos Y en cada célula. Se aconseja evaluar un mínimo
de 100 células. La frecuencia con que se observa el cuerpo Y varía en cada línea celular.
En lo que respecta a las células hematopoyéticas, según la experiencia de los autores, el
cuerpo Y se observa en un 25-35% de los eritroblastos, un 40-60% de los precursores
mieloides, un 60-90% de los megacariocitos, un 10-20% de los granulocitos, un 35-60%
de los linfocitos y un 50-75% de los monocitos.
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FIGU RA 2-26. Cuerpo Y en una

célula en interfase.
■
La existencia de cuerpo Y indica que un individuo tiene un sexo cromosómico mas
culino. La principal utilidad del estudio del cuerpo Y radica en la demostración de la im
plantación de la médula ósea alogénica cuando no hay identidad sexual entre el donante y
el receptor del trasplante de médula ósea. El hecho de que pueda efectuarse el estudio en
células en interfase permite demostrar la implantación de cada serie hematopoyética por
separado, así como demostrar la procedencia de otras células derivadas de precursores
hematopoyéticos, como los osteoclastos, las células de Kupffer, los macrófagos alveolares,
las células de Langerhans y la microglia.
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Capítulo 2 Las célu las sanguíneas 5 8 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuándo se inicia la hematopoyesis medular?
(a) Primera etapa fetal (intrauterina).
(b) Segunda etapa fetal (extrauterina).
(c) El período embrionario.
(d) A las 2 semanas de la edad adulta.
(e) Durante la prim era infancia.
Respuesta razonada: todas las células de la sangre derivan de una única célula o progenitor común
conocida como célula madre pluripotente (CMP) (stem-cell en la terminología anglosajona).
En el sujeto adulto normal la CMP se halla en el tejido hematopoyético de la m édula ósea y el
proceso por el cual las CMP se transform an en células de la sangre, se denomina hematopoyesis.
En el organismo hum ano, la localización de la hematopoyesis varía con el desarrollo, de manera
que durante la etapa embrionaria (primeras semanas de la gestación) se halla en el saco vitelino;
durante la prim era etapa fetal (hasta los 6 o 7 meses de vida intrauterina), en el bazo e hígado,
y durante la segunda etapa fetal (7.° mes de vida hasta las 2 semanas del nacimiento) en la médula
ósea con un pequeño componente hepatoesplénico que persiste hasta unas 2 semanas después
del parto (hematopoyesis fetal). Finalmente, a partir de las 2 semanas de vida y durante toda la
edad adulta, en la médula ósea, exclusivamente.
2. ¿Cuál de las siguientes funciones realizan las citocinas?
(a) M aduración final de las células hematopoyéticas.
(b) Diferenciación de los progenitores hematopoyéticos.
(c) Regulación funcional del sistema linfoide.
(d) Control de toda la hematopoyesis.
(e) Todas las anteriores.
Respuesta razonada: los factores de crecimiento, o citocinas, son glucoproteínas producidas
por el estroma, osteoblastos, ciertos linfocitos y otras células, que actúan sobre los procesos de
diferenciación y m aduración celular regulando el proceso de la hematopoyesis. Los factores
de m aduración intervienen en la última etapa de la hematopoyesis, cuando las células ya tienen
un elevado grado de maduración para producir las células que circulan por la sangre (hematíes,
leucocitos y plaquetas).
3. ¿Cuál es la función más im portante del bazo?
(a) Hematopoyesis adulta.
(b) Regulación de la función de los linfocitos T.
(c) Reservorio de hematíes.
(d) Eliminación de células sanguíneas envejecidas.
(e) Regulación de la formación de plaquetas.
Respuesta razonada: el bazo es el órgano linfoide más grande del organismo y está situado en el
hipocondrio izquierdo, entre el estómago y el diafragma. El parénquima del bazo esta formado
por la pulpa blanca y roja. La pulpa blanca es tejido linfático formado por linfocitos y macrófagos
dispuestos alrededor de ram as de la arteria esplénica. La pulpa roja está form ada por senos
venosos llenos de sangre y cordones de tejido esplénico (cordones de Billroth) que se componen
de eritrocitos, macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y granulocitos. La sangre llega al bazo
y alcanza la pulpa blanca, cuyas funciones son fundamentalmente tres: 1) eliminación de células
sanguíneas y plaquetas envejecidas o defectuosas; 2) reservorio o almacenamiento de plaquetas,
y 3) hemopoyesis (solo durante el período fetal).
4. ¿Cómo se denom inan las células de la hematopoyesis norm al cuya línea de m aduración
puede ser identificada morfológicamente?
(a) Células madre.
(b) Progenitoras.
(c) Precursoras.
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5 8 .e 2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
(d) Células tronco.

(e) Stem-célls.
Respuesta razonada: las células de la hematopoyesis, situadas siempre en la médula ósea, se
clasifican según su grado de diferenciación en progenitoras y precursoras. Las células progeni-
toras se hallan en etapas m uy iniciales del proceso m adurativo y morfológicamente son indis
tinguibles de la CMR Las células precursoras pueden ser identificadas morfológicamente como
pertenecientes a alguna de las líneas de maduración celular propias de la hematopoyesis normal:
mieloide y linfoide.
5. La serie granulocítica form a la línea m adurativa m ieloide que dará origen a las células
siguientes:
(a) Polinucleares neutrófilos y monocitos.
(b) Linfocitos B.
(c) Hematíes.
(d) Plaquetas.
(e) Linfocitos T.
Respuesta razonada: la m aduración de la serie granulopoyética term ina en la form ación de
los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos), mastocitos y m onocitos. Esta serie posee
una célula progenitora com ún llamada unidad form adora de colonias granulom onocíticas
(GM-CFU), que se diferencia en cuatro líneas de m aduración distintas que darán lugar a los
granulocitos neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos y monocitos. De la GM-CFU derivan
las unidades formadoras de colonias granulocíticas (G-CFU) y de colonias monocíticas (M-CFU).
A partir de la G-CFU y en series celulares independientes m aduran los granulocitos neutrófilos,
los eosinófilos y los basófilos.
6. ¿Cuál de las siguientes células no pertenecen a la serie mieloide?
(a) Hematíes.
(b) Plaquetas.
(c) Granulocitos neutrófilos.
(d) Mastocitos.
(e) Linfocitos.
Respuesta razonada: la serie mieloide comprende tres series celulares de m aduración, las cuales
term inan en la form ación de eritrocitos (serie eritropoyética o eritroblástica), granulocitos
(serie granulopoyética o granulocítica) y plaquetas (serie megacariocítica o plaquetaria), res
pectivamente.
7. ¿En cuál de las siguientes etapas de m aduración eritroblástica aparece el hematíe?
(a) Síntesis de hemoglobina con descenso del ARN.
(b) Desaparición de las mitocondrias.
(c) Desaparición de los ribosomas (ARN).
(d) Extrusión (pérdida) del núcleo.
Respuesta razonada: la eritropoyesis conduce a la form ación de eritrocitos o hematíes, y su
proceso de diferenciación se caracteriza fundam entalm ente p o r la síntesis de hemoglobina,
principal pigmento respiratorio del organismo. Este proceso, que depende fundamentalmente de
la eritropoyetina (Epo), se acompaña de un conjunto de modificaciones celulares muy caracterís
ticas: 1) disminución de la basofilia del citoplasma que se acompaña de un aumento progresivo
de la acidofilia por sustitución del ARN por hemoglobina; 2) pérdida del núcleo (extrusión), y
3) desaparición de todas las organelas citoplasmáticas (maduración).
8. Las plaquetas proceden de una célula denominada:
(a) Megacarioblastro.
(b) Proeritroblasto.
(c) Megacariocito.
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Capítulo 2 Las célu las sanguíneas 5 8 .e 3
(d) Megaloblasto.
(e) Promonocito.
Respuesta razonada: el megacariocito es una célula de gran tam año y elevada ploidía. Posee un
citoplasma amplio de color rosado y repleto de gránulos azurófilos, la mayoría de los cuales (es
pecialmente en la periferia de la célula) se agrupan y rodean lo que se denomina «membrana de
demarcación», que delimitará las futuras plaquetas. La fragmentación definitiva del citoplasma
del megacariocito da lugar a las plaquetas, que solas o formando cúmulos penetrarán finalmente
en la sangre después de atravesar la pared de los capilares.
9. ¿Qué leucocitos de la sangre se identifican morfológicamente por las características tintoriales
de su granulación?
(a) Los monocitos.
(b) Los linfocitos grandes granulados.
(c) Los polinucleares.
(d) Los precursores granulopoyéticos.
Respuesta razonada: el diagnóstico de las enfermedades de la sangre, pero tam bién el estudio de
muchos trastornos del organismo, requiere de la observación morfológica del frotis o extensión
de sangre periférica. Por ello, es m uy im portante saber reconocer las características m orfoló
gicas de las células sanguíneas circulantes (leucocitos, hematíes y plaquetas) y diferenciarlas de
todas aquellas alteraciones que pueden obedecer a una enfermedad de la sangre o una alteración
secundaria o de causa no hematológica.
10. ¿Qué es el cuerpo Y?
(a) Una forma que adquiere a veces la granulación neutrófila en la leucemia aguda.
(b) Una prominencia del citoplasma celular que tiene forma de Y.
(c) Una translocación cromosómica característica de ciertos síndromes linfoproliferativos.
(d) Un corpúsculo brillante presente en algunos neutrófilos observados m ediante m icros
copio de fluorescencia.
(e) Un artefacto de tinción en condiciones especiales.
Respuesta razonada: el cuerpo Y, llamado tam bién cuerpo cromatínico, es un corpúsculo muy
brillante que puede identificarse al observar con el microscopio de fluorescencia las células en
interfase o en metafase de los individuos de sexo masculino. Corresponde a la parte distal de los
brazos largos del cromosoma Y, que es una zona rica en heterocromatina. Se observan mediante
al microscopio de fluorescencia.
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C A P Í T U L O 3
Examen morfológico de las células sanguíneas

INTRODUCCIÓN
El examen morfológico de la sangre periférica es una prueba de gran valor diagnóstico;
sin embargo, debido al uso, cada vez más extendido, de la automatización en hematología,
su utilización ha disminuido en proporción inversa hasta el punto de llegar a menos
preciarse en favor de las «alarmas» o señales que suministran los analizadores para indicar
la existencia de posibles anomalías. En cualquier caso, debe tenerse m uy en cuenta que
un sistema electrónico nunca podrá sustituir la apreciación morfológica realizada por un
experto y, p or tanto, el examen morfológico del frotis de sangre continuará siendo
un complemento fundamental para el diagnóstico hematológico y clínico en general.
Como contrapartida, debe señalarse que la automatización del examen morfológico de
la sangre ha contribuido de manera decisiva a la mejora de la asistencia, ya que puede ser
realizado en un gran número de pacientes de forma muy rápida y precisa, de manera que
solo cuando existe alguna alteración se generará una «alarma» indicativa de la necesidad
de revisión manual o mediante examen morfológico convencional.
Actualmente, la proporción de muestras (hemogramas) que requieren una obser
vación morfológica del frotis viene determinada por diferentes circunstancias entre las
que destaca la sistemática de trabajo de cada laboratorio, aunque puede serlo también
una necesidad clínica concreta, criterios económicos o la implantación de protocolos.
Una particularidad m uy im portante que tiene el examen morfológico del frotis es
que requiere personal experto con conocimientos de citología apropiados. En España, el
profesional especialista en este campo es el hematólogo, aunque pueden serlo también los
patólogos o los profesionales del laboratorio clínico cualificados. En Europa, este examen
es responsabilidad prácticamente exclusiva del laboratorio clínico, mientras que en EE. UU.
son muchas veces los médicos generales {general practitioners o GP) quienes lo realizan,
aunque cada vez menos, debido al creciente control reglamentario del personal de labora
torio que necesita un certificado para realizarlo. Ello debe ser así porque, a diferencia de un
simple hemograma automatizado, el examen morfológico del frotis de sangre requiere pe
ricia y conocimientos que solo poseen personas con la formación adecuada, lo que supone
un mayor coste y, por tanto, la necesidad de limitar su realización solo a aquellos casos en
que se crea necesaria para el diagnóstico. En este sentido, la Sociedad Internacional de Labo
ratorio de Hematología (ISLH) ha publicado los criterios de consenso (www.islh.org) para
el examen morfológico del frotis de sangre sobre la base de los resultados del hemograma
automatizado. Es por esto que todos los laboratorios deberían tener un protocolo para el
examen de un frotis de sangre que siga, a ser posible, las recomendaciones de la ISLH.
Con todo existen diferentes circunstancias que pueden influir en la decisión de realizar un
examen morfológico del frotis como, por ejemplo, la edad y el sexo del paciente, si se trata
de una primera solicitud o es un examen de control, es decir, ha existido un cambio de
comportamiento clínico significativo con respecto a una situación anterior (delta check).
2014. Elsevier E spaña, S.L. R eservados todos los d erechos 59

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MÉTODO PARA LA PREPARACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

Para poder realizar una correcta observación morfológica, la calidad de la extensión o
frotis de sangre debe ser impecable, ya que constituye un medio m uy asequible para
confirm ar la existencia de posibles alteraciones de las células sanguíneas, a veces de
tectadas por los analizadores automatizados mediante «alarmas». Dado que hoy en día
las extensiones difícilmente pueden realizarse a partir de sangre sin anticoagulante, es
fundamental, y de gran relevancia, realizarlas cuanto antes para que este efecto sea el
mínimo. Igualmente las extensiones deben ser efectuadas dentro de las 4 h de practicada
la extracción, con el objeto de evitar la posible aparición de artefactos que pueden dificul
tar la observación morfológica y la realización de la fórmula leucocitaria (v. capítulo 1).
Aunque desde el punto de vista técnico la realización de una extensión de sangre es
muy simple, conseguir que no sea excesivamente gruesa ni excesivamente fina requiere
práctica. Es prim ordial resaltar que, en cualquier caso, la calidad de la extensión es
decisiva para poder apreciar la morfología eritrocitaria y muy importante para realizar
el recuento diferencial de leucocitos o fórmula leucocitaria.
Una extensión de sangre puede hacerse m anualmente o empleando sistemas meca
nizados (automáticos o semiautomáticos). El procedimiento de elección en la práctica
clínica para realizar una extensión sanguínea consiste en extender una gota de sangre
sobre un portaobjetos mediante el canto esmerilado de otro portaobjetos de iguales
dimensiones. La realización manual de una extensión de sangre exige observar siempre
las precauciones siguientes:
• Todo el material debe estar escrupulosamente limpio y desengrasado.
• Si se parte de una punción digital, deberá despreciarse siempre la primera gota.
• Si se parte de una punción venosa, la extensión deberá hacerse con la máxima rapidez
y, a ser posible, antes de mezclar la sangre con el anticoagulante. Aunque lo ideal
es realizar las extensiones con sangre sin anticoagulante en la misma cabecera del
enfermo, la imposibilidad logística de hacerlo así en prácticamente todos los casos,
obliga a realizarlas en el laboratorio a partir de sangre con anticoagulante.
M uestra de sangre
En prácticamente todos los laboratorios clínicos, las extensiones se realizan a partir de
una muestra recogida en anticoagulante, y siempre dentro de las 4 h de practicada la
extracción de sangre. El anticoagulante de elección para preservar la morfología de las
células sanguíneas es la sal potásica del ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) a una
concentración de 3,7 a 5,4 |xm (1,5 a 2,2 mg) para la sal dipotásica (EDTA-K2, 2H20 )
que es la recomendada por el International Council for Standardization in Haematology
(ICSH). Según el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), puede
utilizarse también la sal tripotásica (EDTA-K3) a una concentración de 3,3 a 4 |xm. La
heparina no debe emplearse como anticoagulante para la tinción de células sanguíneas
porque favorece la agregación de las plaquetas y con ello la apreciación de su morfología
o de su concentración a partir de la extensión (recuento directo por el método de Fonio).
Además, la heparina también favorece la aparición de un refuerzo de la tonalidad azul de
las tinciones cuando se emplea la coloración panóptica.
Características del portaobjetos

Los portaobjetos, de vidrio incoloro y resistente a la corrosión, han de tener un tamaño
estándar (75 X 25 X 1 mm ) y deben emplearse perfectamente limpios y desengrasados.
Es muy im portante también que no presenten polvo y que su superficie sea lisa y sin
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Capítulo 3 Examen m orfológico de las células sanguíneas 61
ralladuras o improntas digitales. Para su conservación, antes del empleo, pueden guar
darse en un contenedor sellado al vacío y con un pequeño recipiente que contenga una
mezcla de tres partes de alcohol metílico y una de acetona.
En el caso de que sea necesario reciclar portaobjetos usados o sucios, deben lavarse
mediante inmersión en un medio detergente a 60 °C durante un mínimo de 30 min y, a
continuación, introducirlos varias veces en un recipiente con abundante agua caliente (50-
60 °C) hasta que hayan liberado todo el detergente. Después de este lavado ya pueden secarse.
O tro procedimiento para limpiar portaobjetos es sumergirlos en una solución de
dicromato potásico (20 g de Cr2K20 7en 100 mi de agua y 900 mi de H2S 0 4concentrado)
durante 48 h y, a continuación, lavarlos con abundante agua corriente.
Una vez limpios los portaobjetos pueden conservarse en una solución de alcohol
metílico al 95% hasta su empleo, aunque en la actualidad se utilizan portaobjetos dese-
chables ya que no son excesivamente caros en comparación con la labor que supone su
lavado y secado, especialmente cuando se analizan muchas muestras al día.
Preparación m anual de la extensión de sangre

Para preparar una buena extensión de sangre deben seguirse los siguientes pasos:
1. Se homogeneíza bien la sangre anticoagulada mediante 10 inversiones manuales,
como m ínim o, del tubo de sangre bien tapado o agitación suave del mismo
durante un mínimo de 2 min en un homogeneizador (fig. 3-1).
2. Se coloca una gota de sangre de 2 a 5 (xl a 1 cm, aproximadamente, del borde es
merilado del portaobjetos. Es recomendable el empleo de una micropipeta para
que la cantidad de sangre contenida en la gota sea siempre la misma.
FIGU RA 3-1. Homogeneizador rotatorio o circular de tubos de sangre.
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Gota de sangre
Aproximación
FIGURA 3-2. Esquema para llevar

a cabo una extensión sanguínea
por el método de los dos portaobjetos.
La flecha indica la dirección en que debe
deslizarse el portaobjetos esmerilado.
Se coloca un segundo portaobjetos justo delante de la gota situada en la superficie

del prim er portaobjetos, form ando u n ángulo de aproxim adam ente 45° y, a
continuación, se desplaza suavemente hacia atrás hasta que alcanza la gota de
sangre (fig. 3-2).
Se espera a que por capilaridad toda la sangre se distribuya uniformemente. Es
aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos sobre el que se
realizará la extensión.
Se desliza suavemente y a una velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro
en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre
la superficie del prim er portaobjetos form ando una fina película (extensión
sanguínea). El grosor de la extensión obtenida dependerá de la cantidad de sangre
en la gota, de la concentración de hemoglobina, del ángulo empleado para rea
lizar la extensión y de la velocidad con que se haya realizado la misma. Así, si se
emplea un ángulo superior a 45° la extensión será gruesa y corta, mientras que
si se emplea uno inferior será larga y fina. Igualmente, a mayor velocidad mayor
grosor y viceversa.
Teniendo en cuenta estas variables, el grosor de una extensión puede ser modificado
de acuerdo con la concentración de hemoglobina (o hematocrito) de forma que
mientras en pacientes con anemia (hematocrito disminuido) es recomendable
aumentar el ángulo, en pacientes con hematocrito elevado es recomendable dis
minuirlo. Obviamente, solo la pericia del técnico que realiza la extensión puede
optimizar el ángulo y la velocidad, adaptándolo en cada caso a las condiciones de
la muestra.
Se seca la extensión durante un m ínim o de 30 min, en posición horizontal y
a tem peratura ambiente. El secado debe ser siempre espontáneo, es decir, sin
aplicación de factores que aceleren el proceso tales como aire a presión, estufas de
secado, etc., ya que de lo contrario puede alterarse la morfología de los elementos
mononucleados (monocitos y linfocitos). Una vez secas, las extensiones se tiñen
lo antes posible (nunca después de 24 h), esto se debe a que el plasma presente
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Zona de linfocitos
Origen Cuerpo Cola\

(barbas)
Sentido de
la extensión Zona de
neutrófilos
y monocitos
FIGURA 3-3. Esquema de una extensión sanguínea con indicación de las diferentes áreas que la
componen y la distribución celular de las mismas. En la línea de puntos se indica la dirección que hay que
seguir en el recuento diferencial leucocitario.
en la m uestra puede interferir en el proceso de tinción y producir un fondo

excesivamente azul.
Una buena extensión realizada mediante esta técnica debe tener entre 3 y 4 cm de
longitud (el mínimo aceptable es de 2,5 cm) y presentar tres áreas de diferente grosor y
con una distribución también distinta de leucocitos (fig. 3-3).
1. Zona gruesa: se halla en la región inmediata al punto de partida de la extensión
(«cabeza»). En ella se aprecia siempre un aumento del número de linfocitos.
2. Zona fina: se encuentra al final de la extensión y termina con un área donde las
células adoptan una disposición acordonada («barbas»). En esta región se observa
un exceso de granulocitos y monocitos.
3. Zona ideal: corresponde a la región situada entre las dos anteriores («zona
intermedia») y en ella existe un reparto equilibrado de las células.
O btener una buena distribución y conservación de las células en una extensión
es fundam ental para la correcta interpretación de la morfología pero, en ocasiones,
existen circunstancias inherentes a la muestra de sangre que disminuyen la calidad de
la extensión.
Empleo de extensor m ecanizado de sangre sobre portaobjetos

Consiste en el empleo de sistemas que mecanizan el proceso de realización de la extensión
de sangre y que consiguen una mayor homogeneidad en la distribución de las células
sobre el portaobjetos. Actualmente, existen tres métodos para mecanizar la realización
de una extensión de sangre:
1. Centrifugación.
2. M étodos semiautomáticos.
3. Método automático.
El método de la centrifugación consiste en emplear una fuerza centrífuga para dis
tribuir la sangre sobre la superficie del portaobjetos (spinner). Con este procedimiento
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se consigue una película de sangre muy delgada (monocapa) en la que la distribución

de los leucocitos es homogénea, por lo que es innecesaria la selección de un área ideal
para realizar la fórm ula leucocitaria. Tiene la ventaja de que la cantidad de sangre
necesaria es mucho m enor que la del método m anual y de que no se forman agregados
plaquetarios. Por el contrario, es frecuente observar una desaparición de la palidez central
de los eritrocitos con lo que resulta difícil apreciar su contenido en hemoglobina. Otros
inconvenientes del empleo de spinners son la posibilidad de dañar las células por la
fuerza centrífuga empleada y su posible contaminación ambiental. Esto último sucede
especialmente cuando se emplean sistemas antiguos que carecen de una adecuada
protección contra la formación de aerosoles durante el proceso de centrifugación.
Los métodos semiautomáticos se basan en el empleo de dispositivos que mecanizan
el procedimiento manual. Entre los más empleados destaca el sistema AutoPrep®, de
manejo extraordinariamente simple y en el que basta con depositar una gota de sangre
sobre el portaobjetos para que, con una leve presión sobre una palanca, se realice una
extensión de gran calidad, cuyo grosor puede modificarse a voluntad variando la velo
cidad del proceso (fig. 3-4). Este sistema no requiere ninguna fuente de alimentación
y debido a su reducido peso es fácilmente transportable, lo que perm ite practicar las
extensiones en la misma cabecera del enfermo.
Los métodos automáticos son los que vienen acoplados a los analizadores hemato
lógicos de elevadas prestaciones. Estos sistemas realizan la extensión sanguínea a partir
de muestras preseleccionadas por ordenador según se requiera o no realizar la fórmula
leucocitaria. El método se basa en un sistema mecánico que automáticamente desplaza
un cristal esmerilado sobre la superficie del portaobjetos. Con el objeto de que la calidad
de la extensión sea óptima, la realización de la misma se adapta a cada muestra de forma
individualizada, de manera que el grosor (inclinación del portaobjetos y velocidad de
su desplazamiento) se ajusta automáticamente según el valor del hematocrito (fig. 3-5).
FIGURA 3-4. Extensor

semiautomático (mecanizado)
de sangre (AutoPrep®).
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FIGU RA 3-5. Extensor de teñido

automático acoplado a un analizador
hematológico.
MÉTODOS DE TINCIÓN
Principio general
Prácticamente todos los métodos empleados para teñir las células de la sangre se basan
en el empleo de colorantes tipo Romanowsky constituidos, fundamentalmente, por la
mezcla de eosinas y derivados de las tiazinas. Romanowsky utilizó por vez prim era es
ta mezcla de colorantes para poner en evidencia el núcleo del parásito del paludismo o
malaria; para ello se basó en la idea del llamado «teñido neutro» de Ehrlich, que consiste
en dejar que un colorante básico reaccione con otro ácido para dar lugar a un compuesto
con nuevas propiedades. De esta forma, combinando la eosina (colorante ácido) con el
azul de metileno (colorante básico derivado de las tiazinas), obtuvo no solo una aceptable
visualización del parásito del paludismo, sino también una amplia gama de colores que,
aplicada a las células sanguíneas, constituye hoy en día el principio básico para su obser
vación morfológica mediante microscopio. Posteriormente, la técnica de Romanowsky
fue perfeccionada por Leishman y Jenner, en Inglaterra, y por May-Grünwald y Reuter, en
Alemania, que consiguieron mayor estabilidad de los colorantes y mejor reproducibilidad
del método de tinción aplicado a las células sanguíneas en extensión.
El método de Romanowsky aplica dos principios básicos de tinción: a) la fijación de
la sangre extendida sobre el portaobjetos, y b) el empleo, junto a los colorantes clásicos
(eosina y azul de metileno), de unos derivados por oxidación del azul de metileno (me-
tiltioninas), que se conocen como azures (azur A, azur B y azur C). Estas sustancias son
metacromáticas, responsables de la coloración púrpura o roja de la cromatina nuclear leu-
cocitariay de ciertas granulaciones citoplasmáticas, que por ello se denominan azurófilas.
La coloración de Romanowsky permite distinguir los siguientes aspectos morfológicos
y estructuras celulares:
• Forma, dimensiones y contorno de las células sanguíneas.
• Núcleo celular y restos de cromatina (color púrpura).
• Citoplasma de los linfocitos (color azul).
• Citoplasma de los monocitos (color grisáceo).
• Granulaciones de los polimorfonucleares:
• Eosinófilos: color naranja.
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• Basófilos: color azul oscuro.

• Neutrófilos: color pardo.
• Eritrocitos: color rosa pálido.
• Reticulocitos: color azulado.
Las variaciones en la calidad de la tinción dependen del tipo y las características del
colorante y del método de tinción empleado. La calidad de los colorantes es esencial
para obtener una tinción reproductible, y el método de tinción debe respetar escrupu
losamente el tiempo de fijación de las células y el de la acción del colorante. Finalmente,
la temperatura es también un factor a tener en cuenta, ya que sus variaciones influyen
en la calidad de la tinción.
Los colorantes tipo Romanowsky son m uy sensibles a las variaciones de pH , de
m anera que las estructuras celulares con carácter básico fijan los colorantes ácidos
(eosina), mientras que las que poseen carácter ácido fijan los colorantes básicos (azul de
metileno). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo (nucléolo)
o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes
acidófilos como la hemoglobina adquieran un color rosado. La diferente afinidad de
las granulaciones citoplasmáticas específicas de los PMN permite clasificarlos en tres
grandes grupos:
1. Granulocitos neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos
neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente. El color resultante es pardo
y a las granulaciones se las denomina neutrófilas.
2 . Granulocitos eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias
de intenso carácter básico (espermina y derivados), que fijan fundamentalmente
los colorantes ácidos (compuestos acidófilos). El color resultante es rojo-naranja.
3. Granulocitos basófilos, en los que la granulación específica posee sustancias
de fuerte carácter ácido (heparina, principalmente), que fijan los colores básicos
como el azul de metileno (compuestos basófilos). El color resultante es azul os
curo.
El azur B tiñe de color p úrpura la granulación prim aria de los neutrófilos, la fina
granulación de los monocitos y la que puede observarse en ciertos linfocitos de gran
tam año y abundante citoplasma (linfocitos grandes granulados). Asimismo, dicho
colorante tiñe ciertas inclusiones eritrocitarias derivadas de la cariorrexis (punteado
azurófilo o polvillo nuclear) o los hemoparásitos.
Entre los métodos de tinción basados en el empleo de colorantes Romanowsky, los
más utilizados son el de Giemsa y May-Grünwald/Giemsa (MGG). La preparación de
ambos colorantes se detalla en el cuadro 3-1.
Tinción de Giemsa
Material
• Extensión sanguínea bien seca.
• Alcohol metílico (metanol) absoluto (totalmente libre de acetona).
• Solución de Giemsa.
• Microscopio con objetivo de inmersión.
• Aceite de inmersión.
Método
1. Se fija la extensión en metanol absoluto durante 5 m in (las extensiones de médula
ósea precisan unos 15 min).
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CUADRO 3-1. Preparación de los colorantes más empleados en hematología
Solución amortiguadora (guardar siempre a 4 °C)

Solución madre (A) (tampón fosfato 1/15 M según Sórensen apH 6,8)a
• KH2P 0 4, 6,63 g
• Na2HP04 • 2H20 , 2,56 g
• Agua3, 1.000 mi
Guardar a 4 °C.
Solución de trabajo (B) (preparación extemporánea)
• Solución madre, 1 parte
• Agua3, 19 partes
Colorante de Giemsab
Solución madre (A)
• Giemsa, 1 g
• Glicerol puro, 66 mi
• Calentar a 56 °C durante 120 min
• Alcohol metílico (metanol) absoluto, 66 mi
Mezclar y dejar reposar durante 2 días en un recipiente cerrado a temperatura ambiente.
Filtrar antes de usarla.
Solución de trabajo (B) (debe usarse dentro de las 4 h de su preparación)
• Solución madre, 1 parte
• Solución tampón de trabajo, 9 partes
Colorante de May-Grünwaldc
Solución madre (A)
• May-Grünwald, 0,3 g
• Alcohol metílico (metanol) absoluto, 100 mi
Mezclar y dejar reposar durante 2 días en un recipiente cerrado a temperatura ambiente.
Filtrar antes de usarla.
Solución de trabajo (B) (debe usarse dentro de las 4 h de su preparación)
• Solución madre de May-Grünwald, 1 parte
• Solución tampón de trabajo, 1 parte
“ N eutra y desmineralizada o destilada (calidad reactiva).
h Existe u n preparado comercial de colorante Giemsa (Merck cat. n.° 35123 5C).
cExiste u n preparado comercial de colorante May-Grünwald (Merck cat. n.° 35135 5C).
2. Se sumerge verticalmente en solución Giemsa (de trabajo).

3. Se espera 10 min.
4. Se lava la extensión con abundante agua destilada y se deja secar al aire libre. Una
vez seca, está lista para ser observada al microscopio.
Tinción de M ay-Grünwald/Giem sa
El empleo com binado de los colorantes M ay-Grünwald y Giemsa se conoce con el
nombre de tinción panóptica de May-Grünwald/Giemsa. Esta tinción resalta de manera
especial las granulaciones leucocitarias y mejora la coloración de los eritrocitos. De uso
recomendado para programas de evaluación externa de la calidad (PEEC), esta tinción
ha sido recientemente estandarizada por el External Quality Assurance Programmes in
Laboratory Medicine (EQALM).
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Material
• Extensión sanguínea bien seca.
• Solución de May-Grünwald.
• Solución de Giemsa.
• Microscopio con objetivo de inmersión.
Método
1. Se aplica la solución A de M ay-G rünwald durante 5 m in sobre la extensión
(método horizontal) o se introduce el portaobjetos en un recipiente con el colo
rante (método vertical).
2. Se elimina el exceso de colorante lavando directam ente el portaobjetos con
solución amortiguadora B o introduciéndolo en un recipiente con dicha solución
durante 1 min.
3. Se aplica solución B de Giemsa durante 20 m in sobre la extensión (método ho
rizontal) o se introduce el portaobjetos en un recipiente que contenga dicha
solución (método vertical).
4. Se lava la extensión con agua corriente (o solución amortiguadora B) durante un
mínimo de 2 min.
5. Se deja secar al aire espontáneamente. Una vez seca, la extensión está lista para su
observación mediante el microscopio.
Características de la tinción con May-Grünwald/Giemsa y causas de error

Una extensión de sangre bien teñida debe poseer una coloración rosada en su parte más
delgada, y azulada en la más gruesa; cuando se observa al microscopio debe permitir una
fácil apreciación de las estructuras celulares en los leucocitos; del tamaño, el color y la
forma, en los eritrocitos, y del contenido granular de las plaquetas. Además, la intensidad
de la coloración ha de ser uniforme a lo largo de toda la extensión y no deben observarse
precipitados ni vacuolización de las células. El núcleo de leucocitos debe ser más púrpura
que azul y los eritrocitos tienen que poseer una tonalidad rosada.
Los defectos más frecuentes observados en la tinción de la extensión sanguínea son
una coloración excesivamente azul o rosada, y la presencia de precipitados y artefactos
morfológicos (cuadro 3-2).
Tinción de W right
La tinción de W right es una modificación de la de Leishman (especialmente indicada
para la visualización de parásitos del paludismo) y sus características son similares a las
de la tinción de May-Grünwald/Giemsa.
Colorante de Wright
1. Se disuelve 1 g de colorante en 600 mi de alcohol metílico absoluto.
2. Se calienta a 56 °C hasta la disolución completa del colorante.
3. Se deja enfriar, filtrar y guardar en un envase bien tapado, así se evita siempre el
contacto con acetona o ácidos en general.
Método
1. Se fija la extensión de sangre añadiendo sobre la misma un volumen de solución
colorante (sin diluir) durante 1 min.
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CUADRO 3-2. Causas de error en la tinción de la extensión sanguínea
Coloración excesivamente azul

• Causas debidas al espécimen:
• Presencia de u na paraproteína (gam m apatía m onoclonal)
• Em pleo de heparina com o anticoagulante
• Intensa leucocitosis con elevado n ú m ero de células blásticas
• H em atocrito excesivamente bajo (anem ia intensa)
• Causas m etodológicas:
• Extensión excesivamente gruesa
• Extensión envejecida (el plasm a al secarse colorea de azul el fondo)
• Tam pón excesivamente alcalino (p H > 6,4)
• Tiem po de tinción dem asiado prolongado
• Lavado insuficiente
• Tiem po de secado insuficiente
Medidas correctoras: com probar el p H del tam p ó n em pleado. A um entar el tiem po de
lavado y/o d ism inuir el tiem po de tinción. C u an d o los núcleos de los leucocitos quedan
poco teñidos significa que el tiem po de tinción ha sido insuficiente, m ientras que cuando
se observan alteraciones nucleares (cariorrexis y apoptosis) significa que se h a em pleado
u na m uestra envejecida ( > 8 h después de practicarse la extracción)
Coloración excesivamente rosada
• Extensión excesivamente delgada
• Tam pón excesivamente ácido (p H < 6,8)
• Tiem po de tinción insuficiente
• Lavado excesivo
• Em pleo de colorantes envejecidos ( > 4 sem anas). O xidación del m etanol y aparición
de ácido fórm ico
• Exposición del tam p ó n o el colorante a vapores ácidos
Medidas correctoras: com probar el p H del tam p ó n em pleado y, si es necesario, preparar
nueva solución de colorante con m etanol n o aireado (abrir u n frasco nuevo)
Presencia de precipitados
• Uso de portaobjetos sucios o con polvo adherido a su superficie
• Uso de soluciones d e colorante sin filtrar cu an d o n o se em plean preparados
comerciales
• Evaporación del m etanol de la solución colorante
• Lavado insuficiente o realizado en condiciones defectuosas
Presencia de artefactos
• Acción del anticoagulante (sangre con EDTA > 2 h):
• Vacuolización del citoplasm a (m onocitos)
• Alteraciones de la segm entación nuclear (polilobulación, núcleos en trébol
o en margarita)
• Satelitism o plaquetario en to rn o a los leucocitos
• Crenación (espiculación) de los eritrocitos
• Suciedad, deterioro o presencia de grasa en el portaobjetos:
• M icroburbujas
• Falsas imágenes de gérm enes
• Partículas de polvo y ralladuras del cristal
• Fijación inadecuada p o r em pleo de m etanol no absoluto o hidratado:
• Im agen de eritrocitos h idratados
EDTA, ácido etilenodiaminotetraacético.
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2. Se añade al colorante dos o tres gotas de agua destilada-PBS (pH 6,8), procurando
no desparramar la mezcla fuera del portaobjetos.
3. Se mezcla bien la solución colorante con el diluyente y se espera 10 min.
4. Se lava bien la extensión con abundante agua destilada y finalmente se deja secar
al aire. Una vez seca, la preparación está lista para ser observada al microscopio.
Tinción de Romanowsky (m étodo de referencia)

El ICSH recomienda el empleo de un método de referencia para la tinción de la extensión
de sangre basado en el empleo de soluciones puras de azur B y eosina Y. El principal
inconveniente de este procedimiento para su empleo cotidiano es la necesidad de emplear
colorantes de gran pureza que deben ser preparados siempre de forma extemporánea.
Además, una vez preparados son poco estables, p or lo que sus propiedades varían
significativamente con el tiempo de preparación. Todo ello supone un inconveniente
no solo de índole técnica, sino también económica, especialmente para los laboratorios
que deben procesar un elevado número de muestras por día.
Reactivos
Solución madre de colorante
1. Se disuelven 3 g de azur B puro (C I52010) en 300 mi de dimetilsulfoxido (DMSO).
Antes de añadir el azur B, se calienta el DMSO a 37 °C y una vez añadido se agita
vigorosamente la solución durante 30 s a intervalos de 5 min.
2. Se disuelve 1 g de eosina Y (CI 45380) en 250 mi de DMSO y se realiza la misma
operación que para preparar la solución de azur B.
3. Se mezclan las soluciones de azur B y eosina lentamente (durante unos 30 min
como mínimo), empleando un agitador magnético hasta que la disolución sea
completa.
Esta solución puede mantenerse estable durante varios meses si se conserva a tem
peratura ambiente y alejada de la luz (frasco oscuro).
Solución fijadora
Se prepara mezclando 1 vol. de la solución madre con 14 vol. de metanol absoluto.
Solución amortiguadora de HEPES (pH 6,6)

Se prepara disolviendo 2,38 g de HEPES en 11 de agua destilada ajustando el pH a 6,6
mediante NaOH 1 mol/1. Una vez preparada la solución se añaden 50 m i de DMSO.
Solución amortiguadora de fosfato (pH 5,8; 67 mmol/1)

Se prepara mezclando 92,2 mi de KH2P 0 4 (9,1 g/1) y 7,8 mi de Na2H P 0 4 (9,5 g/1).
Solución extemporánea de colorante

Inm ediatam ente antes de realizar la tinción se mezcla 1 vol. de solución madre con
14 vol. de solución amortiguadora HEPES (pH 6,6). Esta solución tiene una estabilidad
de 8 h.
Método
1. Se fija la extensión durante 3 min en solución fijadora.
2. Se aplica la solución colorante extemporánea durante 10 min.
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3. Se reemplaza la solución colorante por solución amortiguadora de fosfato pH 5,8

y se espera 1 min.
4. Se lava con agua abundante y se deja secar.
OBSERVACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

Hay m uchas razones p or las que los médicos solicitan un hem ogram a con examen
morfológico del frotis de sangre (cuadro 3-3). En ocasiones, tal exploración es im
prescindible para realizar el diagnóstico, como por ejemplo sucede en ciertas formas
de anemia congénita (esferocitosis y eliptocitosis hereditarias) y adquirida (púrpura
trom bótica trom bocitopénica), o en prácticam ente todas las hem opatías malignas
(leucemias agudas y crónicas, principalmente). Otras veces constituye una herramienta
para poder orientar un diagnóstico y establecer una pauta para la realización de otras
pruebas diagnósticas.
El frotis de sangre tiene también la ventaja de que puede guardarse y ser revisado
tantas veces como sea necesario. Además, puede ser digitalizado y almacenado en formato
electrónico para fines diagnósticos y educacionales, con la ventaja de que no requiere
espacio como sucede con el archivo de las preparaciones teñidas que, transcurrido cierto
tiempo, han de ser desechadas.
La posibilidad de la digitalización del frotis abre también un campo ilimitado a la in
terconsulta online mediante discusión a distancia de los casos difíciles (telehematología),
además permite la implementación de segundas opiniones a través de la red (telemedicina)
e Internet (telediagnóstico), la colección de imágenes digitalizadas en bancos para su
publicación en revistas o sitios web especializados y la puesta en marcha de programas
educacionales o de formación médica continuada (e-learning). Actualmente, existen
equipos automatizados que pueden digitalizar u n elevado núm ero de imágenes que
almacenan en su memoria con el objeto de desarrollar la tecnología de reconocimiento
necesaria para u n examen automatizado del frotis sanguíneo capaz de sustituir, en un
futuro no muy lejano, al clásico microscopio óptico convencional (fig. 3-6).
CUADRO 3-3. Motivos justificados para solicitar un examen morfológico del frotis
• Sospecha de anem ia o anem ia de carácter crónico o agudo

• Trom bocitopenia
• N eutropenia
• Expansión del sistema linfoide
• A denopatías
• Esplenomegalia
• Lesiones cutáneas sugestivas
• D olores óseos generalizados
• Síntom as generales (fiebre, sudoración, p ru rito y pérdida de peso)
• H em orragias de origen desconocido, equim osis o petequias
• Insuficiencia renal aguda o de reciente aparición o au m ento del tam año
de u n o o los dos riñones (especialm ente en niños)
• Alteraciones retinianas (hem orragias, exudados, signos de hiperviscosidad o atrofia
óptica)
• Sospecha de una enferm edad bacteriana, vírica o parasitaria que pueda ser sospechada o
diagnosticada m ediante u n exam en m orfológico del frotis de sangre
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FIGU RA 3-6. Equipos de digitalización de imágenes que permiten los exámenes automatizados del frotis
sanguíneo.
D isponer de estos sistemas perm ite también estandarizar los actuales Programas
de Evaluación Externa de la Calidad (PEEC) para el examen morfológico del frotis,
sustituyendo el envío de frotis control teñidos a los laboratorios participantes por un
sistema a través de Internet donde todos los miembros de un mismo programa puedan
visualizar online la misma extensión de sangre. De esta forma se eliminan las variables
no debidas al observador, como son los defectos inherentes a la preparación de las
extensiones (homogeneidad en la distribución de las células) o la tinción no siempre
exactamente igual en todas ellas.
El resurgim iento de estos equipos en la práctica clínica nos dem uestra, una vez
más, que incluso en la era de los estudios moleculares el examen del frotis de sangre
continúa siendo una herram ienta indispensable en el diagnóstico clínico general
y hematológico en particular; obviamente no m ediante su realización sistemática,
sino solo cuando lo aconseje la clínica o las restantes exploraciones complementarias
practicadas al paciente.
Asimismo, este hecho refuerza la vitalidad del examen del frotis como complemento
de ciertos hemogramas cuyo resultado no puede ser interpretado solo con las magnitudes
automatizadas. Más aún, el examen del frotis puede ser decisivo para confirmar la exis
tencia de ciertas alteraciones cuantitativas o verificar la importancia de algunas alarmas
suministradas por los analizadores hematológicos automatizados. En definitiva, continúa
plenamente vigente aquella frase de principios del siglo xx que dice: «El microscopio es
al hematólogo lo que el fonendoscopio es al cardiólogo», lo que, en realidad, nos viene
a decir que son muy pocas las enfermedades de la sangre que pueden ser diagnosticadas
sin u n examen morfológico del frotis.
REAI.I7.ACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA

Introducción
La fórmula leucocitaria o recuento diferencial de leucocitos (RDL) es la cuantificación
en tantos por cien (%) o valores absolutos (X109/1) de los granulocitos (neutrófilos,
eosinófilos y basófilos), linfocitos y monocitos circulantes. Los granulocitos neutrófilos
son, en su gran mayoría, polisegm entados o polim orfonucleares (PM N) y en una
pequeña proporción, no segmentados (neutrófilos «en cayado» o «en banda»). Junto al
recuento celular y la concentración de hemoglobina, el RDL es uno de los componentes
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fundamentales del llamado examen hematológico básico o hemograma (v. capítulo 4).
Desde que la tinción panóptica de Romanowsky se aplicó de m anera sistemática al
estudio morfológico de las células sanguíneas, hasta la llegada de la automatización al
laboratorio de hematología, el RDL se ha realizado mediante observación microscópica
del frotis de sangre teñido y análisis de 100 o 200 células.
Como todo procedimiento manual, el resultado depende de tres variables fundamen
tales que se han de tener siempre en cuenta:
1. El grosor de la extensión.
2. La calidad de la tinción.
3. La pericia del observador.
Grosor de la extensión
El grosor de la extensión es un aspecto clave para la correcta observación de un frotis de
sangre y debe siempre ser tenido en cuenta antes de la tinción. Una buena extensión no
debe ser excesivamente gruesa ni excesivamente fina, ya que, en el prim er caso, además
de dificultar la observación de la morfología eritrocitaria, la distinción entre linfocitos y
monocitos será difícil, mientras que si es excesivamente delgada, la mayoría de neutrófilos
y monocitos se hallarán en las áreas periféricas.
Todo ello, además de dificultar el recuento, alterará la relación normal existente entre
las células (falsas linfocitosis, neutrofilias o monocitosis) y dificultará la apreciación de la
morfología eritrocitaria y plaquetaria. La distribución irregular de los leucocitos obedece al
diferente tamaño de las células, de forma que las más pequeñas (linfocitos) tienen tendencia
a situarse hacia el centro de la extensión, y las de mayor tamaño (monocitos), en las regiones
más periféricas. La única forma de conseguir una distribución regular y uniforme de los
leucocitos sobre el portaobjetos es el empleo de sistemas mecanizados para realizar la
extensión de sangre. Con todo, no debe olvidarse que incluso en una extensión de calidad,
la distribución de los leucocitos no es siempre del todo uniforme, de manera que en las
barbas y en los laterales de la misma el número de células es siempre superior al existente
en el cuerpo o región central, que es la zona ideal para realizar el recuento (v. capítulo 2).
Calidad de la tinción
Depende del tipo y las características del colorante y del método de tinción empleados. La
calidad y garantía de los colorantes es fundamental para obtener tinciones reproductibles.
Igualmente, el método de la tinción es también de gran importancia, por lo que se debe
respetar escrupulosamente el tiempo de fijación de las células y el de la acción del colorante.
Otros factores a tener en cuenta son la temperatura, cuyas variaciones pueden m o
dificar la coloración, y el empleo de portaobjetos totalmente libres de polvo y grasa, ya
que de lo contrario es muy posible observar importantes alteraciones de la morfología
eritrocitaria. La gran dificultad que normalmente tiene un laboratorio clínico para con
trolar de forma estricta todas estas variables hace aconsejable el empleo de sistemas
automatizados de tinción que, al estandarizar el procedimiento, consiguen coloraciones
más reproducibles.
Pericia del observador

La variabilidad debida al observador es un factor a tener siempre en cuenta, ya que es
inherente a todo procedimiento no automático. No hace falta decir que, incluso en las
condiciones técnicas más favorables, la habilidad y pericia del observador en citología
sanguínea son esenciales para obtener un resultado fiable.
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Con todo, y dando por supuesto que se han tenido en cuenta los requisitos m eto
dológicos m encionados, es habitual apreciar notables variaciones en los resultados,
especialmente en aquellas células de baja concentración, con variable definición m or
fológica (neutrófilos no segmentados o «en banda») o con similitudes que inducen a
confusión (ciertos linfocitos frente a monocitos y viceversa). A pesar de ello, una fórmula
leucocitaria convencional realizada a 100 elementos tiene un gran valor informativo,
ya que alerta siempre sobre posibles alteraciones morfológicas o presencia de células
anormales. Tal es así que, cuando una fórmula leucocitaria es realizada por un observador
experimentado y conocedor de los aspectos clínicos del paciente, tiene mucho mayor
valor e interés clínico que el grado de exactitud estadística que puedan tener los valores
numéricos ofrecidos por el clásico recuento porcentual de los leucocitos.
M étodo
La realización del RDL debe iniciarse observando la extensión mediante un objetivo de
poco aumento ( X 10), lo que permitirá apreciar la calidad de la tinción, el grado de con
servación de las células (presencia o no de artefactos) y su distribución. A continuación,
y mediante un objetivo de mayor aumento (X50 o X100), puede iniciarse el recuento
mediante un recorrido sobre la zona elegida procurando que en el trayecto el 50% de
las células analizadas pertenezcan a las zonas periféricas o bordes del cuerpo y el 50%
restante a la zona central propiamente dicha, prestando siempre atención de no duplicar
la observación de las mismas células, Normalmente, la fórmula leucocitaria se valora en
tantos por cien (%) y se realiza sobre la base de la observación microscópica de 100 leu
cocitos. En ambos casos, el límite de confianza (95%) es excesivamente amplio como para
poder considerar un resultado fiable. Así, un resultado del 5% debería realizarse sobre
un mínimo de 1.000 células para que pudiera empezar a considerarse fiable (tabla 3-1).
La variabilidad entre observadores para identificar las «bandas» o «cayados» es un
hecho bien conocido; obedece a la dificultad que existe ante un núcleo aparentemente
segmentado de conocer si el grosor del puente que une los segmentos nucleares entre sí
cumple el criterio según el cual un fragmento de cromatina tiene una anchura superior
al tercio del grosor de las zonas más anchas o lobulaciones (v. capítulo 2). Siguiendo este
criterio, en un individuo aparentemente sano el tanto por ciento de bandas varía entre
un 1 y un 6% del total de leucocitos (0,05-0,8 X 109/1) y un ligero aumento por encima
de este margen puede atribuirse a la variabilidad inherente a la observación morfológica.
De hecho, la existencia de desviación a la izquierda no debe ser considerada hasta que
después de la observación de 200 células, el porcentaje de «bandas» es superior al 10%.
Este método debe aplicarse ante cualquier otra variación leucocitaria que a juicio del
observador pueda considerarse anómala, y emplear la prueba estadística de Rümke; para
ello se coloca el valor obtenido en el prim er recuento en las abscisas y el obtenido en el
segundo en las ordenadas (fig. 3-7). Si el punto de interacción de estos dos valores se
TABLA 3-1. Variabilidad estadística de la fórmula leucocitaria visual
Resultado del recuento (%) Células contadas IC al 95%

5 100 1-12
5 500 3-8
5 1.000 3-7
5 10.000 4,6-5,4
IC, intervalo de confianza.
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FIGURA 3-7. Área no significativa

(95%) de dos recuentos leucocitarios
diferentes sucesivos.
halla en el interior del área rayada, es muy probable que la diferencia no sea significativa.
Por el contrario, si el punto de interacción se halla fuera de esta área, es posible que los
valores sean significativamente diferentes. En cualquier caso, cuando existe una des
viación a la izquierda, esta no pasa inadvertida, dado el elevado número de células con
las características morfológicas descritas anteriormente y representadas en la figura 3-7.
La influencia de todos los factores sobre la fiabilidad del recuento realizado visualmen
te se representa en el cuadro 3-4. La reproductibilidad del método obtenido mediante
anáfisis repetido de un mismo espécimen es relativamente aceptable para los neutrófilos
y linfocitos, pero m ucho menos para las restantes clases de leucocitos, especialmente
aquellos que se hallan en muy escasa proporción (como los basófilos). Igualmente, el
estudio de la inexactitud relativa realizado mediante análisis comparativo (coeficiente
CUADRO 3-4. Variables que pueden influir en la fórmula leucocitaria realizada

mediante el método óptico
• D istribución irregular y n o aleatoria de los leucocitos en la extensión
• Realización del recuento en u n lugar de la extensión inadecuado
• Variaciones en la calidad y las características de la tinción
• Observación de u n n úm ero insuficiente de células
• Pericia del o bservador en la identificación de determ inados leucocitos:
• N eutrófilos segm entados frente a no segm entados (bandas)
• M onocitos frente a linfocitos estim ulados o atípicos
• Form as inm aduras de granulocitos neutrófilos
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de correlación, r) de los resultados obtenidos por dos grupos diferentes de observadores

pone de manifiesto una correlación tam bién aceptable para neutrófilos y linfocitos,
pero igualmente m enor para las células restantes, especialmente monocitos, bandas y
eosinófilos, y es prácticamente nula para basófilos.
Pese a su escasa fiabilidad, el recuento diferencial óptico continúa siendo, hoy en día, el
método de referencia para la realización de la fórmula leucocitaria, tanto para el Clinical
and Laboratory Standards Institute (CLSI) como para el ICSH. Según el protocolo H20-A
del CLSI, este método consiste en realizar un recuento visual de 800 células por cuatro
observadores que analizan 200 en cuatro extensiones del mismo espécimen; se considera
como valor de referencia la media de los cuatro resultados.
En la actualidad, existen intentos de obtener un método de referencia para la rea
lización de la fórmula leucocitaria basado en el empleo de anticuerpos monoclonales.

Los valores de referencia del RDL y de la concentración en sangre de los diferentes
leucocitos según la edad y el sexo se representan en la tabla 3-2. Estos valores han sido
obtenidos a partir de fórmulas realizadas con el método de referencia (protocolo H20-A
del CLSI). La fórmula leucocitaria tiene dos objetivos:
1. Medir la concentración en sangre de neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos
y basófilos.
2. Indicar eventuales alteraciones, como la existencia en la sangre de células anorma
les o no presentes normalmente en ella (blastos, mielocitos, eritroblastos y otras) o
el aumento de algunas (bandas o células linfoides reactivas), que indica patología.
Por ello, las alteraciones de la fórmula leucocitaria pueden clasificarse en dos grandes tipos:
cuantitativas y cualitativas. Las primeras se refieren exclusivamente a variaciones en el número
TABLA 3-2. Valores de referencia de los diferentes tipos de leucocitos
Niños Adultos
(18-50 años)
Recién
nacido 1 semana 1 mes-2 años 4 años 10 años
LEU CO CITO S (X109) 9 -30 5-21 6 -18 6 -1 6 5 -14 5 -11
Neutrófilos
Relativo (%) 50 39 28 40 51 55-75
Absoluto (XI 09/l) 9 4,7 3,1 3,6 4,1 2,5-7,5
Eosinófilos
Relativo (%) 2 3 3 3 3 1-4
Absoluto (X109/l) 0,36 0,36 0,33 0,27 0,24 0,05-0,5
Basófilos
Relativo (%) 0,6 0,4 0,4 0,6 0,5 0,2-1,2
Absoluto (X109/l) 0,108 0,05 0,044 0,054 0,04 0,01-0,15
Linfocitos
Relativo (%) 31 41 60 50 38 17-45
Absoluto (X109/l) 5,6 4,92 6,6 4,5 3,04 1,5-4,5
Monocitos
Relativo (%) 6 9 5 5 4 2-8
Absoluto (X109/l) 1,1 1,1 0,55 0,45 0,32 0,2-0,8
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de las células presentes en cada subpoblación, y las segundas, a alteraciones morfológicas

que pueden o no asociarse a variaciones de las células normalmente presentes en la sangre.
Alteraciones cuantitativas
Pueden ser de tres tipos:
1. Aumento de una subpoblación determinada de leucocitos.
2. Disminución de una subpoblación de leucocitos.
3. Presencia de células inmaduras o juveniles.
Aumento de una subpoblación determinada de leucocitos
Neutrofilia
Debe considerarse neutrofilia cuando la cifra absoluta de neutrófilos es superior a
7,5 X 109/1 y puede obedecer a una de las siguientes causas:
• Infecciones bacterianas. Endocarditis bacteriana subaguda, abscesos intraabdomina-
les, tuberculosis. En estos casos, el aumento de neutrófilos es tan acusado que, debido a
que en ocasiones se acompaña de la salida a sangre periférica de elementos inmaduros
de la serie mieloide, puede confundirse con una leucemia (reacción leucemoide).
• Síndromes mieloproliferativos. Entre los síndromes mieloproliferativos (SMP) cró
nicos que se acompañan de neutrofilia destacan la leucemia mieloide crónica (LMC)
y la policitemia vera (PV). En estos casos, es característica la marcada leucocitosis, es
pecialmente en la LMC, donde, a veces, es superior a 500 X 109/1. Prácticamente, toda
la población leucocitaria está constituida por neutrófilos maduros (PMN y bandas),
aunque es característica la aparición de elementos mieloides juveniles (mielocitos y
metamielocitos, principalmente) y eritroblastos. También puede observarse una neu
trofilia absoluta en las fases iniciales de la mielofibrosis idiopática (MI).
• Leucemia de neutrófilos. Es una entidad muy rara considerada por algunos como una
mielodisplasia y cuya característica hematológica más destacada es un gran aumento
del número de neutrófilos circulantes, muchos de ellos con rasgos displásicos.
• Síndromes inflamatorios agudos y crónicos. Cuando no existe un proceso infeccioso
bacteriano que explique la neutrofilia, y una vez descartada la presencia de un síndrome
mieloproliferativo, deben indagarse las siguientes causas de neutrofilia absoluta:
• Artritis reumatoide juvenil, periarteritis nudosa, fiebre reumática aguda, colitis
ulcerosa, esclerodermia, polimialgia reumática y colagenosis en general.
• Enfermedades neoplásicas (carcinomas epiteliales con o sin metástasis y ocasio
nalmente la enfermedad de Hodgkin). En tales casos puede observarse a veces una
verdadera reacción leucemoide o un síndrome leucoeritroblástico.
• Infartos y necrosis hísticas. Infarto de miocardio, embolismo pulm onar, pan
creatitis aguda, grandes quemaduras, resecciones quirúrgicas amplias, reacciones
transfusionales y púrpura trombótica trombocitopénica (PTT).
• Enfermedades metabólicas. Cetoacidosis diabética, hipertiroidismo y enfermedad
gotosa aguda.
• Medicamentos o sustancias químicas. Aunque la acción de medicamentos sobre
los granulocitos neutrófilos mejor conocida es la agranulocitosis, existen algunos
medicamentos que pueden producir una marcada neutrofilia (cuadro 3-5).
• Otras causas. Entre otras causas de neutrofilia destacan las de índole fisiológica
(período neonatal, embarazo, parto, puerperio y ejercicio extenuante), las producidas
por el tabaco (fumadores crónicos) y la anoxia. Finalmente, existe una forma muy
rara de neutrofilia absoluta de origen congénito y formas transitorias de neutrofilia
asociadas a la esplenectomía o a una hemorragia intensa.
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 3-5. Medicamentos que pueden asociarse a neutrofilia
• Alopurinol
• Atropina
• Barbitúricos
• Corticoides
• Dietilcarbamacina
• Eritromicina
• Estreptomicina
• Litio
• Sulfamidas
Eosinofilia
La eosinofilia debe establecerse cuando el número absoluto de eosinófilos es superior a
0,5 X 109/1. Las causas de eosinofilia pueden ser muchas y muy diversas, pero aquí solo
se hará mención a las de mayor interés clínico.
• Enfermedades alérgicas y autoinmunes. Son la causa más frecuente de eosinofilia,
en general m oderada. Entre ellas destacan el asma, la fiebre del heno, las alergias
medicamentosas, la enfermedad del suero, el eccema atópico, la urticaria, la hipersen-
sibilidad a ciertos alimentos y el edema angioneurótico. También puede observarse
intensa eosinofilia en una forma de periarteritis nudosa (variante de Churg-Strauss)
y vasculitis sistémica necrotizante.
• Parasitosis. Descartada la enfermedad alérgica, la parasitosis constituye otra causa
frecuente de eosinofilia, en general más intensa (> 2 X 109/1). Entre las parasitosis que
suelen cursar con eosinofilia destacan: hidatidosis (equinococosis), esquistosomiasis,
filariasis, triquinosis, cisticercosis y larva migrans visceral.
• Parásitos intestinales. Suelen ser causa de eosinofilia, pero mucho menos que los
parásitos que invaden tejidos como los anteriormente citados.
• Ingesta de medicamentos. Además de la posibilidad de eosinofilia que acompaña a
reacciones alérgicas causadas por determinados medicamentos, es posible también
la existencia de eosinofilia después de la ingesta de ciertos medicamentos sin reacción
alérgica aparente a los mismos. La lista de tales medicamentos es relativamente larga
y los más importantes se citan en el cuadro 3-6.
• Enfermedades de la piel. Existen un conjunto de enfermedades cutáneas, en general
de naturaleza alérgica, que pueden cursar con eosinofilia moderada (eccema, pénfigo,
dermatitis exfoliativa, psoriasis y dermatitis herpetiforme).
• Infecciones. La eosinofilia en el curso de infecciones solo suele verse en caso de
tuberculosis (rara vez) o cuando el paciente es alérgico a alguno de los medicamentos
administrados para curar la infección.
• Eosinofilia pulmonar. Con esta denominación se pretende describir una enfermedad
que puede expresarse bajo diferentes formas clínicas (síndrome de Lóffler autolimita-
do o enfermedad sistémica de evolución grave) y en la que es característica la presencia
de eosinofilia periférica e infiltrados eosinofilicos pulmonares o en otros tejidos.
• Síndrome hipereosinofílico. Se denomina síndrome hipereosinofílico a la persis
tencia prolongada de una cifra elevada de eosinófilos sin que exista una causa clara
que lo justifique. Cuando existen signos clínicos o biológicos (eosinofiloblastos en
médula ósea) de agresividad, lo más probable es que se trate de un síndrome mielo-
proliferativo o una leucemia de eosinófilos.
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CUADRO 3-6. Medicamentos que pueden asociarse a eosinofilia
• Ácido aminosalicílico
• Ácido nalidíxico
• Adrenalina
• Ampicilina
• Antimonio
• Capreomicina
• Cefalotina
• Clorpromacina
• Cloxacilina
• Derivados de la hidantoína
• Digital
• Estreptocinasa
• Fenotiacina
• Isoniacida
• Kanamicina
• Meticilina
• Metildopa
• Novobiocina
• Preparados de oro
• Ristocetina
• Triamtereno
• Vancomicina
• Yoduros
• Neoplasias. La aparición de eosinófilos es un signo relativamente frecuente en el

curso de neoplasias diversas (páncreas, bronquios, tubo digestivo y útero) pero muy
especialmente en la enfermedad de Hodgkin y en ciertos linfomas de estirpe T como
el síndrome de Sézary (micosis fungoide). Con todo, la eosinofilia puede observarse
también como signo que acompaña a determinados SMP no debidos a lesión primaria
de la línea eosinófila (LMC y policitemia vera).
• Endocrinopatías. Con relativa frecuencia puede apreciarse eosinofilia en ciertas endo-
crinopatías, como la enfermedad de Addison y enfermedades de la hipófisis en general.
Basofilia
Los basófilos son los leucocitos que se encuentran en proporción más baja en la sangre
circulante. Por ello, un aumento de los mismos es siempre fácilmente detectable al realizar
la fórmula leucocitaria (0,15 X 109/1). La basofilia puede obedecer a las siguientes causas:
• Fenómeno reaccional. Al igual que la eosinofilia, constituye un fenóm eno reac-
cional o de respuesta frente a situaciones diversas tales como ciertos estados de
hipersensibilidad, mixedema, urticaria pigmentosa, colitis ulcerosa, hiperlipidemia
o administración de estrógenos.
• Síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC). Cualquiera de los SMPC puede
acompañarse de una ligera basofilia. Ello es especialmente manifiesto en la LMC
y la policitemia vera, aunque puede verse también en la mielofibrosis idiopática y
la trom bocitem ia esencial. En la LMC un aum ento significativo de los basófilos
circulantes es considerado un signo de agudización de la enfermedad (crisis blástica).
• Otras situaciones. Una cierta basofilia puede observarse ocasionalmente en algún
caso de anemia crónica p o r falta de hierro, hemólisis, cirrosis hepática o síndrome
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inflamatorio crónico. La esplenectomía, ciertas infecciones víricas (viruela y varicela)

y la diabetes descompensada pueden acompañarse de elevaciones temporales del
número de basófilos, pero siempre de m uy escasa intensidad.
Linfocitosis
Se considera linfocitosis cuando el núm ero de linfocitos circulantes es superior a
4,5 X 109/1. Este es un hecho que debe tenerse siempre en cuenta al interpretar la fórmula
leucocitaria, ya que no es infrecuente que se considere la existencia de linfocitosis solo
sobre la base de una cifra porcentual elevada sin tener en cuenta el núm ero total de
leucocitos. Así, por ejemplo, en un individuo con 3,5 X 109/1 leucocitos, un porcentaje
de linfocitos del 60% no tiene el mismo significado que en un individuo con 10 X 109g/1.
En el prim er caso, el número absoluto de linfocitos será de 2,1 X 109/1, o sea, en el límite
inferior de la normalidad, mientras que en el segundo será de 6 X 109/1, es decir, franca
mente aumentado. Entre las causas más importantes de linfocitosis destacan las siguientes:
• Linfocitosis fisiológica de la infancia. Como puede m uy bien apreciarse en la ta
bla 3-2 durante el desarrollo y crecimiento se producen importantes variaciones de la
cifra de linfocitos y neutrófilos, de manera que desde el nacimiento hasta los 2 años
existe un aumento absoluto de la cifra de linfocitos (>4,5 X 109/1).
• Infecciones. Las infecciones bacterianas, como se ha citado anteriormente, pueden
ser causa de leucocitosis neutrofilica, pero esto sucede fundamentalmente en el estado
adulto, porque estas mismas situaciones pueden producir en los niños y adultos jóve
nes linfocitosis importantes. Entre las infecciones que, independientemente de la edad,
suelen cursar con linfocitosis en general intensa destacan: tos ferina, rubéola, varicela,
influenza y enfermedades exantemáticas de la infancia, en las que la cifra de linfocitos
puede ser superior a 40 X 109/1 (cuadro 3-7). La linfocitosis infecciosa propia de niños
y adultos jóvenes es generalmente secundaria a infecciones por virus de Epstein-Barr
(VEB), mononucleosis infecciosa, Coxsackie, adenovirus tipos 25 y 12, toxoplasmosis y
citomegalovirus. No es infrecuente observar linfocitosis moderadas en otras infecciones,
tales como la hepatitis A, la brucelosis, la tuberculosis, la sífilis secundaria y la infección
por HIV. Finalmente, otra causa de importante linfocitosis puede ser una infección por
rickettsias.
• Leucemia linfática crónica. Constituye una causa de linfocitosis absoluta gene
ralmente m uy intensa que afecta a individuos de edad superior a los 50 años. La
imagen característica de la leucemia linfática crónica (LLC) es la elevada leucocitosis
(en general superior a 20 X 109/1) con un predominio absoluto de linfocitos de as
pecto morfológico normal o m aduro (>75% ). Además de la LLC, puede observarse
también linfocitosis absoluta en otros síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC)
y en los linfomas no hodgkinianos (LNH) leucemizados.
• Otras situaciones. Ocasionalmente, puede observarse linfocitosis en situaciones
diversas entre las que destacan: alergias medicamentosas, enfermedad del suero, es
plenectomía, enfermedad de Addison, hipopituitarismo, hipertiroidismo y tabaquis
mo (fumadores crónicos). Con cierta frecuencia suele observarse también linfocitosis
en la (3-talasemia intermedia y otros síndromes hemolíticos crónicos.
Monocitosis
Al igual que en el caso de la linfocitosis, solo debe considerarse la existencia de una
monocitosis real cuando la cifra absoluta de monocitos sea superior a 0,8 X 109/1. No debe
olvidarse que las causas de variabilidad de la fórmula leucocitaria, en especial la distribu
ción de las células en la extensión, puede llevar a falsas interpretaciones, especialmente
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CUADRO 3-7. Situaciones en las que pueden observarse linfocitosis con linfocitos
estimulados
• Infecciones virales
• Mononucleosis infecciosa (infección por el virus de Epstein-Barr)
• Citomegalovirus
• Rubéola
• Varicela
• Gripe (influenza)
• Hepatitis infecciosa por virus A
• Adenovirus
• Herpes (simple y zóster)
• Virus de la inmunodeficiencia humana
• Infecciones bacterianas
• Brucelosis
• Tuberculosis
• Sífilis
• Infección por Mycoplasma pneumoniae
• Infecciones por protozoos
• Malaria o paludismo
• Toxoplasmosis
• Babesiosis
• Hipersensibilidad a medicamentos
• Ácido paraaminosalicílico
• Sulfasalacina
• Fenotiacinas
• Dapsona
• Lupus eritematoso sistémico
• Sarcoidosis
• Enfermedad del injerto contra el huésped
• Enfermedad de Hodgkin
como en el caso de los monocitos donde el número de estas células es relativamente bajo,
comparado con el de linfocitos y neutrófilos. La subjetividad de un observador no experi
mentado, al catalogar de monocitos ciertas formas de linfocitos (linfocitos estimulados),
puede contribuir también a la existencia de falsos aumentos del número de monocitos.
Entre las causas de monocitosis destacan las siguientes:
• M onocitosis fisiológica del recién nacido. Como puede apreciarse en la tabla 3-2,
poco después del nacimiento se observa una ligera monocitosis, pero desaparece
mucho antes que la linfocitosis.
• Infecciones bacterianas. En las infecciones bacterianas la monocitosis predomina
fundamentalmente en las de tipo crónico y granulomatoso como, por ejemplo, la
tuberculosis miliar, la endocarditis bacteriana y la brucelosis. No obstante, puede
observarse también en otras infecciones o parasitosis, en las que interviene de forma
importante el sistema mononuclear fagocítico: paludismo, kala-azar, tripanosomiasis,
fiebre tifoidea y fiebre de las M ontañas Rocosas.
• Enfermedad de Hodgkin y otras neoplasias. No es infrecuente observar monocitosis
importantes acompañando a enfermedades neoplásicas, especialmente carcinomas
de origen epitelial.
• Enfermedades reumáticas y autoinmunes. Entre ellas destacan la artritis reuma-
toide, el lupus eritematoso sistémico (LES), la colitis ulcerosa y el esprúe tropical.
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• Hemopatías. Suelen observarse monocitosis intensas en el curso de ciertas hemopa

tías entre las que destacan la leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), la leucemia
aguda monocítica, el linfogranuloma de Hodgkin y las histiocitosis en general (his-
tiocitosis X, especialmente). Asimismo, suele observarse monocitosis acompañando
diversas hemopatías malignas tales como otros SMPC además de LMMC (LMC
del adulto y juvenil), leucemia aguda m onocítica (LAM tipo M5), leucemia aguda
mielomonocítica (LAM tipo M4) e histiocitosis maligna.
• Destrucción de tejidos. Especialmente cuando existe amplia destrucción de tejidos,
como por ejemplo accidentes, aplastamientos y cirugía muy extensa.
• Fase de recuperación medular. En ciertas enfermedades hematológicas, después de
tratamiento con quimioterapia, existe durante un período más o menos prolongado
una aplasia m edular y una im portante dism inución de la formación de fagocitos
(neutrófilos y monocitos). Tal sucede en la aplasia medular (idiopática o secundaria
a tóxicos), en la agranulocitosis o en el condicionamiento previo al trasplante de
médula ósea. En todos estos casos, si se consigue superar el proceso y se inicia una
etapa de regeneración mieloide, en la m édula ósea suele observarse como prim er
signo de la misma la aparición de una monocitosis transitoria que poco después
es sustituida por la aparición de la población neutrofílica. Ello es debido a que el
período de maduración de los m onocitos en la médula ósea es más corto que el de
los neutrófilos.
Disminución de una subpoblación determinada de leucocitos

Las disminuciones del número de leucocitos más significativas son las que afectan indi
vidual o simultáneamente los PMN neutrófilos (neutropenia) o linfocitos (linfopenia).
Entre las causas de neutropenia destacan, como más importantes, la agranulocitosis y
la aplasia medular. En esta última, además de la neutropenia, se observa la simultánea
disminución de todas las series hematopoyéticas (pancitopenia). En la agranulocitosis
se observa la reducción selectiva de los PMN neutrófilos y un aum ento relativo del
número de linfocitos.
Neutropenia
Se considera neutropenia cuando el valor absoluto de PMN neutrófilos es inferior a
2,5 X 109/1. Dado que la neutropenia suele cursar con una disminución de la cifra total
de leucocitos (leucopenia), la valoración del núm ero absoluto de PMN neutrófilos es
fundam ental. Por ejemplo, en un paciente que tenga una cifra de leucocitos totales
de 3,5 X 109/1 y en cuya fórmula leucocitaria se aprecia un 60% de linfocitos y un 30% de
PMN neutrófilos, aunque la leucopenia no sea excesivamente intensa, existe una franca
neutropenia, ya que el número total de neutrófilos es de 1,5 X 109/1 (límite inferior de
normalidad = 2,5 X 109/1).
La neutropenia puede ser debida a diferentes causas, que p or orden de frecuencia
son las siguientes:
1. Ingesta de ciertos medicamentos. Hasta la actualidad, se han descrito más de
100 medicamentos capaces de producir neutropenia. No obstante, solo algunos
de ellos parecen asociarse de forma constante a una disminución del número de
PMN neutrófilos o agranulocitosis medicamentosa (cuadro 3-8).
2. Enfermedades reumáticas y autoinmunes. Entre ellas destacan el LES, la artritis
reumatoidea y el síndrome de Felty (con esplenomegalia).
3. Infecciones. En general, cuando una infección cursa con neutropenia, lo más
probable es que sea de origen vírico. Si la infección es bacteriana o fungica, su
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CUADRO 3-8. Medicamentos que pueden producir neutropenia
Neutropenia relativa y/o agranulocitosis

• Analgésicos antipiréticos
• Aminopirina (Piramidón®, Novalgin®, Allonal®, Cibalgina®, Veramon®, Irgapirina®,
Butapirina® y Optalidon®)
• Novaminopirina (Dipirona®)
• Antitiroideos
• Tiouracilo
• Metiltiouracilo
• Propiltiouracilo
• Metimazol (Topazol®)
• Carbimazol (Neomercazol®)
• Antihistamínicos
• Tripelenamina (Piribenzamina®)
• Prometacina (Fenergan®)
• Tenalidina (Tenofenopiperidina®, Sandosten®)
• Tranquilizantes
• Clorpromacina (Largactil®)
• Meprobamato (Equanil®)
• Triflupromacina (Vesprin®)
• Imipramina (Tofranil®)
• Amitriptilina (Tripanol®)
• Promacina (Sparina®)
• Procaína (Pacatal®, Mepazina®)
• Trifluoroperacina (Stelacina®)
• Proclorperacina (Stemetil®, Compacina®)
• Bactericidas
• Novobiocina (Catomicina®)
• Ristocetina (Riston®, Spontin®)
• Tetraciclina (Acromicina®, Panmicina®)
• Salicilazosulfapiridina (Salazopirin®)
• Meticilina sódica (Calbenin®)
• Anticoagulantes
• Fenidona (Dindevan®, Indema®, Fenilindanodiona®)
• Dicumarol (Temperin®, Dicumarin®)
• Tuberculostáticos
• Isoniacida
• Tiacetona
• Antipalúdicos
• Pamaquina (Primaquina®, Plasmoquina®)
• Amodiaquina (Camoquin®)
• Diuréticos
• Tiazidas (Clorotiazida®)
• Mercuriales
• Otros
• Dietacina (Diparol®)
• Procainamida (Primetil®)
• Fenacetina
• Metronidazol (Flagil®)
• Penicilina
• Dinitrofenol
(Continúa)
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CUADRO 3-8. M edicam entos q ue p u e d e n p ro d u c ir n e u tro p e n ia (cont.)
Aplasia medular
• M edicam entos de alto riesgo
• A m inopterina, am etopterina
• 6-m ercaptopurina (Purinetol®)
• A zatioprina (Imurel®)
• Busulfano (Mileran®)
• Cloram bucilo (Leukeran®)
• Calcem id
• M ostazas nitrogenadas
• Ciclofosfam ida (Endoxan®, Citoxan®)
• Vincristina y vim blastina
• M elfalán (Alkeran®)
• D aunorrubicina
• Arabinósido de citosina
• M edicam entos con riesgo m oderado
• A ntiepilépticos: m etilfenilhidantoína (Mesantoin®), trim etad io n a (Tridiona®)
y param etadiona (Paradiona®)
• Antirreum áticos: oxifenilbutazona (Tanderil®), fenilbutazona (Butazolidina®),
indom etacina (Indocid®), ácido acetilsalicílico (Aspirina®) y sales de oro
• Bacteriostáticos: cloranfenicol (Clorom icetina®), sulfamidas, am picilina y cloroquina
• H ipoglucem iantes: tolbutam ida (Rastinon®) y clorpropam ida
presencia denota una cierta incapacidad medular para responder a las necesidades
defensivas de la periferia (agotamiento medular). Así sucede en el alcoholismo
crónico, en el que esta situación puede favorecer el desarrollo de una neumonía
o una septicemia por falta de defensas.
4. Otras infecciones bacterianas suelen cursar con neutropenia como dato biológico
relativamente constante: tuberculosis diseminada, salmonelosis y brucelosis.
5. Dentro de las infecciones, la neutropenia suele observarse con mayor frecuencia en
las de origen vírico (rubéola, influenza, mononucleosis infecciosa, citomegalovirus
y hepatitis). Respecto a otro tipo de infecciones, la neutropenia es relativamente
constante en la histoplasmosis (infección fungica), en la leishmaniosis visceral o
kala-azar (infestación protozoaria) y en la fiebre de las Montañas Rocosas (rickett-
siosis).
6. Neutropenia crónica idiopática. Constituye u n trastorno de mecanismo des
conocido, en el que son características la neutropenia persistente y la presencia
de frecuentes infecciones intercurrentes. Dentro de este cuadro biológico puede
incluirse también la neutropenia idiopática de la infancia (de origen congénito o
adquirido) y la llamada neutropenia cíclica o periódica.
7. Neutropenia con linfocitosis T. Es una entidad rara que se observa en ciertas
linfocitosis absolutas de origen desconocido, aunque prácticamente siempre de
estirpe T. En general, se trata de linfocitos T supresores (CD3+ o CD8) y oca
sionalmente células NK (CD3—). Morfológicamente, estos linfocitos tienen un
tamaño superior al normal, tienen gran citoplasma y presentan una granulación
azurófila por lo que se conocen como linfocitos grandes granulados (fig. 3-8). Por
ello, se dice que este tipo de neutropenia está asociada a linfocitosis de linfocitos
grandes granulares (LGG). Cuando la linfocitosis es muy persistente, intensa,
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&
FIGU RA 3-8. Linfocito grande
granulado.
invasiva y acompañada de esplenomegalia suele considerarse la existencia de un

síndrome linfoproliferativo.
8. Enferm edades hem atológicas. Cuando falla la hematopoyesis uno de los pri
meros signos es la neutropenia. Las causas de esta situación pueden ser diversas,
las más frecuentes son la aplasia medular, los síndromes mielodisplásicos o la
infiltración de la médula por células blásticas (leucemia aguda). O tra causa de
neutropenia de origen hematológico es el hiperesplenismo cuando existe intensa
esplenomegalia.
9. T ratam ien to con cito stático s. En este caso la neutropenia es tem poral y su
seguimiento es fundamental para evaluar la capacidad de respuesta de la médula
ósea a la quimioterapia o al trasplante de médula ósea (TMO).
Linfopenia
La linfopenia se define como el descenso de la cifra absoluta de linfocitos por debajo
de 1,5 X 109/1. En general, existe linfopenia en todos los casos de leucopenia severa,
independientemente de su origen. No obstante, es característica en el curso de la in
suficiencia cardíaca congestiva, en el estadio inicial de la enfermedad de Hodgkin y de
forma transitoria después de la administración de corticoesteroides. Asimismo, es muy
característica la linfopenia absoluta en el curso del síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA) por HIV, donde constituye un signo de indudable valor diagnóstico.
En tal caso, la linfopenia obedece a una marcada disminución del número de linfocitos
T CD4+.
Finalmente, otras situaciones en las que la linfopenia es un dato característico son la
aplasia tímica y el tratamiento mediante inmunosupresores.
Eosinofilopenia y basofilopenia
Estas alteraciones leucocitarias resultan m ucho más difíciles de apreciar que la neu
tropenia o la linfopenia, debido al escaso núm ero de eosinófilos y especialm ente
de basófilos circulantes. Solo los instrum entos que realizan la fórm ula leucocitaria
sobre un elevado núm ero de células directamente a partir de sangre total permiten la
detección sistemática de estas raras alteraciones leucocitarias. En ambos casos, suelen
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asociarse a trastornos metabólicos y endocrinos tales como la enfermedad de Cushing

y el hipertiroidism o (basofilopenia), o a la adm inistración de horm onas esteroides
(eosinofilopenia) o heparina (basofilopenia) y a infecciones bacterianas en su fase
inicial (eosinofilopenia).
Presencia de células inmaduras o juveniles

El paso a la sangre de células inmaduras (normalmente presentes solo en la médula ósea)
es siempre patológico y puede hacerse de tres formas diferentes: mielemia, eritroblastosis
y presencia de blastos.
Presencia de precursores m ieloides (reacción leucemoidea)

Esta situación suele asociarse a leucocitosis y aum ento absoluto del núm ero de neu
trófilos (neutrofilia). Se caracteriza por la aparición en sangre periférica de mielocitos
y metamielocitos (mielemia), así como de algún promielocito, y casi siempre también
un elevado núm ero de bandas (desviación a la izquierda). Puede observarse en dos
situaciones m uy diferentes:
1. Como respuesta medular a un estímulo periférico (reacción leucemoide y síndrome
leucoeritroblástico) en el curso de una infección, inflamación u otros trastornos
citados en el apartado «Aumento de una subpoblación determinada de leucocitos».
2. Como manifestación periférica de un síndrome mieloproliferativo crónico (LMC,
policitemia vera, mielofibrosis idiopática o trombocitemia esencial).
La LMC constituye una hemopatía en la que un mayor núm ero de elementos in
m aduros de la serie mieloide y, ocasionalmente, también de la eritroide y plaquetaria
se observa en sangre periférica. En general, el número total de leucocitos es superior a
20 X 109/1, aunque puede llegar a más de 500 X 109/1, y prácticamente todos ellos son
mielocitos, metamielocitos y neutrófilos maduros.
Presencia de precursores eritroides (síndrom e leucoeritroblástico)

Al igual que en el caso de la reacción leucemoidea, la presencia de eritroblastos circulantes
puede ser una respuesta a un estímulo extramedular (síndromes hemolíticos intensos
y crónicos, eritroblastosis fetal, anemias carenciales en tratamiento, principalmente) o
tener un origen m edular de diferente tipo (diseritropoyesis congénita o adquirida, y
eritremias primarias o asociadas a diferentes SMP agudos o crónicos).
La hemopatía en la que es característica la abundancia de elementos inmaduros de
la serie eritroide circulantes (eritroblastos y algún proeritroblasto) es la eritremia aguda,
eritroleucemia o enfermedad de Di Guglielmo, que constituye una hemopatía aguda en
la que se afecta selectivamente la serie roja (LAM6).
Presencia de progenitores (células blásticas o m uy inm aduras)

Constituye la salida de células muy inmaduras pertenecientes a una o más series celulares
hematopoyéticas (leucemia aguda) o de células linfoides en diferentes estadios m adu
rativos (linfoma leucemizado).
• Leucemia aguda. Según la estirpe celular de los blastos que invaden la sangre perifé
rica, las leucemias agudas se clasifican en dos grandes grupos: linfoides y mieloides. La
diferenciación entre ambas puede establecerse sobre la base de criterios morfológicos,
citoquímicos, inmunológicos y citogenéticos en médula y sangre periférica. La com
binación de los criterios morfocitoquímicos establecidos por el grupo cooperativo
francoamericano-británico (FAB) y el empleo de anticuerpos monoclonales permiten
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FIGU RA 3-9. Aspecto de la sangre

en un caso de tricoleucemia
(MGG, X 1.000).
en la actualidad la catalogación de los diferentes subtipos citológicos existentes en

cada uno de los dos grandes grupos de leucemias mencionadas en más del 98% de
los casos (v. capítulo 14).
Linfoma leucemizado. Un linfoma se leucemiza cuando los elementos linfoides
atípicos aparecen en la sangre. En general, estos elementos linfoides tienen un origen
variable y a veces con la sola observación morfológica puede establecerse el diagnós
tico. En otros síndromes linfoproliferativos, los elementos linfoides circulantes suelen
presentar características morfológicas que orientan el diagnóstico: tricoleucemia
(fig. 3-9), enfermedad de Sézary (fig. 3-10) o linfoma de células del manto con núcleo
de aspecto convoluto, como el que se observa en la leucemia de células T inmaduras
(fig. 3-11).
Alteraciones cualitativas
Al realizar una fórm ula leucocitaria, debe tenerse en cuenta la posible presencia de
alteraciones morfológicas de las células normalmente presentes en la sangre periférica
y que pueden ser de valor en el diagnóstico clínico. Este tipo de alteraciones se suelen
observar, fundamentalmente, en los PMN neutrófilos y los linfocitos y m ucho menos
en los restantes leucocitos sanguíneos.
FIGU RA 3-10. Aspecto de la sangre

en un caso de enfermedad de Sézary
(MGG, XI.000).
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FIGURA 3-11. Célula muy

inmadura con núcleo de contorno
irregular, característica de una leucemia
linfoblástica aguda de estirpe T.
Polimorfonucleares neutrófilos
Alteraciones de la granulación
C on relativa frecuencia se observan alteraciones de la g ranulación de los PM N
neutrófilos, que pueden ser fundam entalm ente de dos tipos: granulación tóxica o
exceso de granulación prim aria y desgranulación o dism inución de la granulación
secundaria.
La granulación tóxica suele aparecer en el curso de diversos procesos infecciosos,
generalmente bacterianos, y consiste en la presencia de abundante granulación primaria
o azurófila (fig. 3-12). Dicha granulación corresponde a lisosomas que muestran abun
dante actividad mieloperoxidásica. Otras alteraciones menos corrientes de la granulación
pueden observarse también en los PMN neutrófilos: los cuerpos de Dóhle y las anomalías
de Alder-Reilly y de Chédiak-Higashi.
Los cuerpos de Dóhle son unas inclusiones ovaladas que se sitúan hacia la periferia
del citoplasma del PMN neutrófilo. Están compuestos fundamentalmente por ARN y
a la tinción panóptica adquieren un color azul pálido (fig. 3-13). Su aparición puede
observarse en el curso de infecciones de diverso tipo (sepsis e infecciones víricas), así
como después de la administración de citostáticos. La anomalía de Alder-Reilly consiste
FIGU RA 3-12. Aspecto

de un neutrófilo con granulación
tóxica (MGG, X 1.000).
ERRNVPHGLFRVRUJ
* /
A '
o w _ FIGU RA 3-13. Aspecto
. a . Ô üC de un neutrófilo con un cuerpo

de Dóhle (flecha) (MGG, X 1.000).
en la aparición de gruesas granulaciones de color violeta, m uy visibles y que suelen

ocasionar ciertas enfermedades tesaurismóticas, como por ejemplo, las mucopolisaca-
ridosis. Finalmente, la anomalía de Chédiak-Higashi se observa asociada a un síndrome
clínico peculiar (albinismo oculocutáneo), y consiste en la aparición de inclusiones
citoplasmáticas, de color azul oscuro y que casi siempre se hallan rodeadas de un halo
claro (fig. 3-14).
La desgranulación de los PMN neutrófilos se puede deber a una disminución del
número de gránulos específicos o a un defecto de su tinción (fig. 3-15). Es un fenómeno
que se observa con relativa frecuencia en las enfermedades hematológicas con afectación
de la célula madre pluripotente o de la serie mieloide (leucemia aguda, SMPC y ciertos
síndromes dishematopoyéticos adquiridos o estados preleucémicos, tales como los sín
dromes mielodisplásicos [SMD]).
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FIGU RA 3-14. Neutrófilos en un
paciente con síndrome de Chédiak-
Higashi.
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FIGU RA 3-15. Desgranulación

de los polimorfonucleares neutrófilos
(MGG, XI.000).
Alteraciones del núcleo

El núcleo del polimorfonuclear neutrófilo presenta normalmente tres o cuatro lóbulos,
que en el curso de ciertas anemias (megaloblástica, principalmente) pueden aumentar
considerablemente (neutrófilos hipersegmentados o pleocariocitos cuando, además,
son de mayor tamaño). En otros casos se observa una disminución del número de neu
trófilos con segmentación normal, a expensas de un aumento del número de neutrófilos
no segmentados o cayados en banda. Esta situación se conoce con el nom bre de des
viación a la izquierda y puede observarse en el curso de diversos procesos inflamatorios
o infecciones agudas o crónicas, como ya se ha dicho anteriormente. La persistencia de
un predominio de neutrófilos no segmentados (97% o más), en ausencia de cualquier
causa que la explique, debe hacer pensar en la existencia de una anomalía de Pelger-
H uét o defecto congénito de la segmentación nuclear de los neutrófilos (fig. 3-16). La
anomalía de Pelger-Huét en estado heterocigoto (la forma homocigota es excepcional)
carece de manifestaciones clínicas.
La aparición de neutrófilos con aspecto similar al heterocigoto, en el curso de ciertas
enfermedades, especialmente hematológicas, es un hecho que se observa con relativa
frecuencia y obedece a un trastorno adquirido en el curso de las mismas (seudo-Pelger).
FIGU RA 3-16. Aspecto típico

de un neutrófilo hiposegmentado en
un caso de anomalía de Pelger-Huét.
Apréciese el característico núcleo
bilobulado, con una condensación
especial de la cromatina (MGG,
X 1.000).
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Linfocitos
Normalmente, los linfocitos presentan un tamaño variable al igual que el color de su
citoplasma o las características del núcleo. En general, el citoplasma es escaso, azul claro
y ocasionalmente de escasa granulación azurófila. En realidad, aunque existe cierto grado
de pleomorfismo en los linfocitos normales, este aum enta notablemente en diversas
situaciones patológicas.
En el curso de ciertas infecciones víricas (rubéola, influenza, hepatitis aguda o in
fección por citomegalovirus) pueden observarse linfocitos que poseen un citoplasma
más abundante e intensamente basófilo. Estas células reciben el nom bre de linfocitos
reactivos, estimulados o virocitos, y pueden observarse normalmente en la sangre de los
recién nacidos y en niños de corta edad hasta en un 5%, mientras en los adultos hasta
un 2% (v. fig. 2-18).
En la mononucleosis infecciosa y en otras enfermedades relacionadas con el VEB
se suelen observar linfocitos con características morfológicas especiales, tales como un
gran tamaño y un citoplasma azul claro, sin granulaciones, que se adapta al contorno de
los hematíes vecinos y que posee un núcleo con cromatina poco densa (fig. 3-17). En la
actualidad se sabe que estas células son linfocitos T estimulados, y aunque se observan
frecuentemente en la mononucleosis infecciosa, no son específicas de esta enfermedad,
sino que pueden aparecer también en otras infecciones víricas y situaciones patológicas.
Monocitos
Normalmente, un monocito se distingue fácilmente de un neutrófilo o de un linfocito,
tanto por su mayor tamaño como por su morfología peculiar. No obstante, en ciertas con
diciones patológicas, dicha distinción es más difícil. Así, en la mononucleosis infecciosa
resulta a veces difícil distinguir un linfocito reactivo de un monocito y en el curso de una
septicemia o de una LMC es difícil poder distinguir un neutrófilo no segmentado de un
metamielocito desgranulado o de un monocito, especialmente cuando la desgranulación
es muy intensa. No debe olvidarse que el empleo de sangre extraída con anticoagulante
o de anticoagulantes inadecuados para hacer las extensiones o la realización inadecuada
de las mismas pueden alterar la morfología de los monocitos hasta el punto de hacerlos
irreconocibles.
FIGU RA 3-17. Aspecto característico

de una célula linfoide reactiva
en el curso de una mononucleosis
infecciosa (MGG, X 1.000).
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FIGU RA 3-18. Pequeño agregado

de plaquetas.
Plaquetas
La realización de la fórmula leucocitaria, además de hacernos apreciar las caracterís
ticas morfológicas de los leucocitos, permite observar simultáneamente las de las plaquetas
y los hematíes. Cuando la extensión sanguínea se realiza directamente de sangre total
sin anticoagulante, las plaquetas tienden a formar agregados de mayor o m enor tamaño
(fig. 3-18). Cuando la extensión se efectúa a partir de sangre mantenida con EDTA, las
plaquetas se reparten uniformemente por toda la extensión, y se puede realizar una es
timación cuantitativa aproximada de las mismas. Las plaquetas presentan tamaños varia
bles (3-5 |im ) y su número puede aumentar después de una hemorragia o en la anemia
ferropénica. En ciertas hemopatías (mielofibrosis y trombocitemia esencial) se observan
plaquetas de tamaño superior al normal (plaquetas gigantes) o con abundante dismorfia.
La observación de las plaquetas en el frotis tiene, además, otro aspecto de indudable
interés práctico. Debido a que prácticamente todos los laboratorios clínicos realizan el
recuento automático de plaquetas a partir de sangre con EDTA-K3 no es raro observar
falsas plaquetopenias debidas a que, en algunos individuos, existe un efecto aglutinador
del anticoagulante sobre las plaquetas, que a veces no es detectado por el instrumento.
En tales casos se aprecia u na clara disociación entre el recuento automatizado de las
plaquetas y las que se observan en la extensión. Por ello, la observación sistemática de
las plaquetas en la extensión constituye uno de los aspectos que nunca debe olvidarse
al practicar la fórmula leucocitaria que, en todo caso, es obligado cuando se dispone de
un recuento automático de plaquetas inferior al normal.
Finalmente, el llamado satelitismo plaquetario o adsorción de las plaquetas en la
superficie de los PMN neutrófilos puede ser también una causa de falsa plaquetopenia
en el recuento automático. En tal caso, solo la observación morfológica de la extensión
permitirá apreciar el fenómeno, cuya causa, en realidad, se desconoce.
EL MICROSCOPIO Y SU UTILIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA

El microscopio es el instrumento más empleado en hematología para la observación de
las células sanguíneas y de la médula ósea. La palabra microscopio deriva de dos voca
blos griegos: micros (¡xixpod), que significa «pequeño», y scopein (CTXOJteiv), «ver».
Aunque su invención se atribuye a Galileo en 1610, el microscopio constituido por una
combinación de dos lentes fue desarrollado por vez primera por el holandés Zacharias
Jansen a principios del siglo xvn. A partir de dicho modelo se diseñaron muchos tipos
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de microscopios, pero el gran avance técnico fue el paso del sistema de dos lentes a uno de
tres, que es el que se mantiene en los microscopios actuales. Anton van Leeuwenhoek
logró aumentos de hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez, y fue el primero en describir
los eritrocitos de la sangre y los capilares por los que circulan. En los años sucesivos, el
microscopio se fue perfeccionando progresivamente hasta que en 1820, Joseph Jackson
Lister, óptico inglés, consiguió eliminar la llamada «aberración cromática» por la cual los
objetos más pequeños se veían rodeados de anillos de colores. Tras sucesivos perfeccio
namientos se consiguió el microscopio óptico tal y como lo conocemos en la actualidad.
En 1930, el m undo submicroscópico se amplió con la aparición del microscopio
electrónico, cuya principal ventaja con respecto al microscopio óptico es un aumento
de 1.000 veces en la magnificación del material observado, acompañado de una mayor
capacidad de resolución que genera una mejor definición y una ampliación del m undo
microscópico. El ADN, virus y pequeñas organelas fueron observados p or prim era
vez con este microscopio. La mayoría de los pioneros en la microscopía electrónica en
biología siguen vivos; dos de los más importantes son Albert Claude y George Palade,
quienes recibieron el Premio Nobel de M edicina en 1974 p or sus logros en biología
celular al utilizar el microscopio electrónico.
M icroscopio óptico
El microscopio óptico convencional permite aumentos de hasta X 1.000 y un poder de
resolución aproximado de 0,22 |xm. Su funcionamiento se basa en el principio de la lupa,
pero para comprender cómo funciona un microscopio primero es necesario entender
cómo las lentes desvían la luz (refracción). Los rayos de luz atraviesan el aire en línea
recta y al entrar en una sustancia como el agua o el vidrio chocan contra la superficie y se
desvían o refractan. Las lentes de aumento son piezas de vidrio especiales, con superficies
curvas que producen imágenes aumentadas de los objetos. El microscopio óptico permite
examinar las células en estado fresco o fijadas y teñidas sobre un portaobjetos. El examen
de las células sanguíneas en fresco se realiza a partir de una suspensión de las mismas en
medio isotónico. Este tipo de observación no permite apreciar grandes detalles de las
células debido a la escasa diferencia del índice de refracción existente entre sus estructuras
y solo se emplea para recuentos celulares, como se verá más adelante. En ciertas ocasiones,
no obstante, se suelen añadir a la suspensión algunos colorantes que al fijarse sobre las
células permiten la apreciación de algunas diferencias, así como una mejor visualización
de los detalles. Tales colorantes reciben el nombre de vitales o supravitales y su empleo
está limitado a estudios muy concretos. El examen de células fijadas es el habitual en he
matología y se realiza a partir de una extensión de sangre periférica, médula ósea u otros
órganos hematopoyéticos convenientemente teñidos. Mediante el microscopio se realiza
también el examen de biopsias de tejidos hematopoyéticos (médula, bazo y ganglios),
así como secciones semifinas de dichos tejidos, teñidas con las coloraciones adecuadas.
Además de la microscopía óptica convencional, en hematología suelen emplearse
también la de contraste de fases y la de fluorescencia que se aplican a exámenes muy
concretos. La microscopía de contraste de fases se emplea para la visualización de
células en estado fresco y permite, gracias a que transforma las diferencias de fases en
diferencias de amplitud lumínica, observar los detalles de los diferentes órganos y es
tructuras intracelulares, imposibles de ver mediante el microscopio óptico convencional.
El microscopio de contraste de fases permite apreciar lo siguiente:
• El núcleo, su membrana, la estructura cromatínica y el nucléolo.
• Las granulaciones intracitoplasmáticas, las mitocondrias y la zona del centrosoma.
• El movimiento de las células sanguíneas y el de sus partículas intracelulares.
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Partes que componen un microscopio óptico

El microscopio óptico o convencional funciona según el principio de la lupa y está
formado por dos lentes. El objeto que se quiere estudiar se coloca en la platina. La luz
procedente del objeto penetra en el microscopio p o r el objetivo, que desempeña la
función de una lupa; es decir, produce una imagen muy ampliada del objeto. Esta imagen
se modifica mediante otro sistema de lentes, el ocular. El aumento final conseguido es
igual al producto de los aum entos del objetivo por los del ocular. En el microscopio
óptico este aumento tiene un límite, que se denomina «poder de resolución» y que es
aproximadamente de 1.200 aumentos. Un microscopio óptico común está conformado
por tres sistemas (fig. 3-19):
Ocular
Tubo
Prisma
Revólver
Objetivo
Platina ----- Brazo
Condensador
Diafragma (iris) -----Macrométrico
Luz Micrométrico
FIGU RA 3-19. A. Microscopio
Pie
binocular. B. Representación
B esquemática del microscopio óptico
con sus componentes principales.
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1. El sistema mecánico, constituido p or piezas en las que van instaladas las lentes
que permiten el movimiento para el enfoque.
2. El sistema óptico, formado por un conjunto de lentes dispuestas de tal manera
que produce el aumento de las imágenes.
3. El sistema de iluminación, o las partes del microscopio que reflejan, transmiten
y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación.
Sistema mecánico
La parte mecánica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina,
el carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen
la parte óptica y de iluminación, además permiten los desplazamientos necesarios para
el enfoque del objeto.
• Pie: constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene, por lo general,
forma de Y o bien es rectangular.
• Tubo: contiene el sistema de lentes existentes entre el objeto y el ocular. Generalmente
mide unos 160 mm. Tiene forma cilindrica y está ennegrecido internam ente para
evitar las molestias que ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se
colocan los oculares.
• Revólver: es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan los
objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en
posición de trabajo, la cual se nota por el ruido de un piñón que lo fija.
• Columna: también llamada asa o brazo, es una pieza colocada en la parte posterior del
aparato. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie.
• Platina: es la pieza metálica plana y colocada horizontalmente sobre la que se coloca
la preparación a observar. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite
el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso
permanece inmóvil; pero lo más frecuente es que sea móvil o giratoria, es decir, que
puede centrarse o producir movimientos circulares mediante tornillos laterales.
• Carro: es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la preparación
con un movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda.
• Tornillo macrométrico: cuando se gira, asciende o desciende el tubo del microscopio,
deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos movimientos largos
permiten el enfoque rápido de la preparación.
• Tornillo micrométrico: mediante el movimiento casi imperceptible que produce al
deslizar el tubo o la platina se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva
acoplado un tam bor graduado en divisiones de 0,001 mm que se utiliza para precisar
sus movimientos y puede m edir el espesor de los objetos.
Sistema óptico
El sistema óptico es el encargado de reproducir y aum entar las imágenes mediante el
conjunto de lentes que lo componen. Está formado por los oculares y los objetivos:
• Oculares: son las lentes situadas a mayor proximidad del ojo y poseen generalmente
un aumento de 10 (X significa el número de veces que aumenta el diámetro del objeto
visualizado). Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes dispuestas
sobre un tubo corto. Normalmente, los más utilizados son: X8, X 10, X 12,5, X 15. El
signo X se utiliza para expresar de forma abreviada los aumentos. Los microscopios
que solo poseen un ocular se llaman monoculares, y los que poseen dos, binoculares.
Para la enseñanza se suelen emplear microscopios con varios cabezales, que permiten
la observación de diversas personas a la vez.
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• Objetivos: son las lentes más próximas al objeto que se observa y producen el aumento
de las imágenes de los objetos y organismos objeto de estudio. Los objetivos utilizados
corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión.
• Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la
preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que
producen, la abertura numérica y otros datos. Así por ejemplo, si un objetivo tiene los datos
de plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y
su abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número
de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de
los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: X4, X 10, X20, X40 y X60.
• El objetivo de inmersión está compuesto p or un complicado sistema de lentes. Para
observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre
el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el
aceite de cedro (aceite de inmersión). Su misión consiste en concentrar los rayos de
luz que proceden del foco luminoso y evitar así su refracción en caso de atravesar el
aire. Generalmente, estos objetivos son de X 100 y se distinguen por uno o dos círculos
o anillos de color negro que rodean su extremo inferior.
Un microscopio posee, por lo general, varios objetivos de distinto aumento, que van
atornillados a una pieza giratoria denominada revólver.
Sistema de iluminación
Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal m anera que
ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende los
siguientes elementos:
• Foco de luz: es una lámpara de tungsteno con fuerte poder lumínico colocada en
el eje del microscopio. En los microscopios más antiguos estaba constituida por un
espejo con dos caras: una cóncava y otra plana. Gozaba de movimientos en todas las
direcciones. Preferentemente, la cara cóncava se emplea con iluminación artificial, y
la plana, con iluminación natural (luz solar).
• Condensador: se halla debajo de la platina y está formado por un sistema de lentes,
cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. El
condensador puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo
que determina su movimiento ascendente o descendente.
• Iris o diafragma: generalmente, el condensador está provisto de un diafragma-iris, que
regula su abertura y controla la calidad de luz que debe pasar a través del condensador.
El haz luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma
al condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concen
trada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el
tubo hasta llegar al ocular, donde es captado por el ojo del observador.
Propiedades del microscopio

• A umento del microscopio: es la relación existente entre el tam año de un objeto
percibido a simple vista y el apreciado con el microscopio, es decir, el número de veces
que se ve el tamaño del objeto por encima de su valor real. Esto quiere decir que si
el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es
100 veces mayor que el tamaño real del objeto. Para calcular el aumento de u n mi
croscopio, basta multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por
ejemplo, si estamos utilizando un ocular de X10 y un objetivo de X50, el aumento
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a que estamos viendo la preparación será: (X10) X (X50) = X500, lo cual quiere
decir que la imagen del objeto está ampliada 500 veces. El aumento se simboliza con
el signo «por» (X) seguido de un número.
• Poder de resolución: es la capacidad del microscopio para revelar detalles adyacentes
a un objeto. Se define como la distancia m ínim a entre dos puntos próximos que
pueden verse separados. El ojo norm al no puede ver separados dos puntos cuando
su distancia es m enor a una décima de milímetro. En el microscopio óptico, el poder
de resolución máximo conseguido es de 0,2 décimas de miera, y en el microscopio
electrónico, el poder separador puede llegar hasta 10 angstroms.
• Poder de definición: se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo res
pecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las
aberraciones de las lentes utilizadas.
• Profundidad de foco: es el espesor del objeto estudiado que se aprecia enfocado.
• Contraste: es la diferencia en la absorción de luz entre el objeto estudiado y el medio
que lo rodea. Puede aumentarse mediante procedimientos de tinción.
• Campo del microscopio: se denomina «campo del microscopio» al círculo visible que
se observa a través del microscopio. También podemos definirlo como la porción del
plano visible observado a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo
disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento
del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de
los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el siguiente punto.
Sistemática de empleo y mantenimiento del microscopio óptico

Sistem ática de empleo
1. Se coloca el microscopio en una mesa fija, de modo que la observación resulte fácil,
es decir, que permita m irar a través del ocular sin tener que apoyarse o adoptar
posturas incómodas.
2. Se coloca el portaobjetos con la extensión de sangre debidamente teñida sobre
la platina, de tal manera que la parte que se quiere observar se encuentre bajo la
lente. A continuación, se sujeta el portaobjetos mediante la pinza del carro.
3. Para comenzar, se selecciona siempre un objetivo de poco aumento que permita
ver mejor el objeto y encontrar fácilmente la parte que interesa observar. Luego se
mira a través del ocular del microscopio y se ajusta la altura del objetivo (enfoque)
hasta que la imagen del objeto sea nítida.
4. Para observar las células de la sangre (o de la médula ósea) se requiere muchas
veces aum entos mínimos de X500. Ello requiere el empleo de aceite de cedro
llamado también aceite de inmersión. Se deposita una gota del mismo sobre la
zona de la extensión que se desee observar y se desplaza el objetivo hasta que entre
en contacto con la gota.
5. Mediante el tornillo macrométrico se ajusta la altura del objetivo hasta que se
observe la imagen y se consiga el enfoque, al accionar el tornillo micrométrico.
Es muy importante efectuar esta operación con gran cuidado para evitar romper
el portaobjetos. Este accidente com porta también el peligro de producir movi
mientos y ralladuras en la lente del objetivo que pueden dañarlo.
M antenim iento
El microscopio tiene que estar protegido siempre del polvo, la humedad y otros agentes
que puedan estropearlo. Por ello, cuando no se utilice debe guardarse en una caja o
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taparse con una bolsa de plástico o campana de vidrio. Las partes mecánicas hay que
limpiarlas con un paño suave; en algunos casos, este se puede humedecer con xileno
para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Para la limpieza
de las partes ópticas se han de tom ar precauciones especiales. Así pues, debe emplearse
papel m uy fino (un pañuelo de papel es suficiente) y nunca deben tocarse las lentes del
ocular, el objetivo y el condensador con los dedos ya que las huellas digitales perjudican
la visibilidad, y cuando se secan resulta difícil eliminarlas. Para limpiar los objetivos
se recomienda humedecer un pañuelo de papel con una solución formada por etanol
absoluto y éter etílico (en proporción 1:1/2) y suavemente pasarlo p or la superficie
varias veces sin realizar ninguna presión. El aceite de cedro que queda sobre la lente
frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de finalizada la
observación. Para ello se puede pasar el pañuelo de papel impregnado con una gota de
xileno. Para guardar el microscopio al final de la jornada de trabajo, se gira el revólver
de manera que quede colocado el objetivo de menor aumento en el punto de observación
y con el tornillo macrométrico se aproxima la platina hasta notar un tope. Es aconsejable
también bajar ligeramente la posición del condensador.
Complementos de la microscopía óptica

La microscopía óptica de luz fotónica puede modificarse mediante accesorios y procedi
mientos complementarios diversos que permiten observar otros aspectos morfológicos
de las células.
• Microscopía de campo oscuro.
• Microscopía de contraste de fases.
• Microscopía de fluorescencia.
• Microscopía confocal.
M icroscopía de cam po oscuro

Consta de un condensador especial que debe estar m uy cercano a la preparación y
que lanza sobre la m uestra un cono hueco de luz. Con esto se logra que solamente los
rayos que chocan con las estructuras sometidas a estudio y que son reflejados hacia
arriba, puedan ser visualizados a través del ocular. La utilidad de la ilum inación en
campo oscuro estriba en que perm ite observar objetos que p or su transparencia son
difíciles de ver con los métodos corrientes de iluminación (microorganismos del tipo de
algas, infusorios, diatomeas, aglutinaciones sobre portaobjetos o células y formaciones
eliminadas en sedimentos urinarios). En estos casos es más im portante aum entar el
contraste entre el objeto y su fondo que la resolución. Esta técnica solo permite poner
de manifiesto la forma y el tam año de la cubierta externa del objeto, así como ver si es
móvil o no, pero permanece invisible la estructura interna del mismo. La microscopía
de contraste de fases hace posible ver la estructura interna de objetos muy transparentes.
M icroscopía de contraste de fases

Se emplea para la visualización de células en estado fresco, y perm ite transform ar las
diferencias de fases en diferencias de amplitud lumínica y observar detalles de los dife
rentes órganos y estructuras intracelulares, imposibles de ver mediante el microscopio
común. Permite apreciar lo siguiente:
• El núcleo, su membrana, la estructura cromatínica y el nucléolo.
• Las granulaciones citoplasmáticas, las mitocondrias y la zona del centrosoma.
• El movimiento de las células sanguíneas y el de sus partículas intracelulares.
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Aplicación Tinción
Bacterias ácido-resistentes Auramina O
Sustancia amiloide Tioflavina T
Tinción cromosómica en bandas (banding) Quinacrina
Reacciones de afinidad FITC, TRITC, rojo Texas, PE
Lípidos de membrana Rojo Nilo
Neuronas Dil
Ácidos nucleicos Naranja de acridina, bromuro de etidio
FITC, isotiocianato de fluoresceína; PE, ficoeritrina; TRITC, rodamina.
M icroscopía de fluorescencia
Cuando una sustancia es excitada p o r u n a radiación lum ínica de una determ inada
longitud de onda (p. ej., ultravioleta) y emite luz de una longitud de onda superior
(visible) se dice que tiene propiedades fluorescentes o que es fluorescente. Esta emisión
de luz cesa poco después de hacerlo el foco de excitación. Este fenómeno se ha utilizado
en microscopía para poder identificar determinados antígenos celulares de forma fácil
y rápida después de marcarlos con anticuerpos (inmunofluorescencia). También se ha
empleado para investigar sustancias autofluorescentes o después de marcarlas con sus
tancias fluorescentes (fluorocromos). Los fluorocromos más usados son la fluoresceína,
la rodamina y la ficoeritrina que se aplican a diferentes tinciones según el material que
se desea observar (tabla 3-3). Los microscopios de fluorescencia más modernos utilizan
la llamada epiiluminación (Ploem, 1970) en la que la luz empleada para la excitación
es reflejada sobre el objeto a observar a través del objetivo que actúa de condensador.
La combinación de epiiluminación y microscopía de fluorescencia se conoce como epi-
fluorescencia, y la correcta dirección de los dos haces de luz (excitación, descendente y
emisión, ascendente) se realiza mediante un espejo dicromático que se coloca por encima
del objetivo y que refleja ondas electromagnéticas de baja longitud hacia el objetivo y
las de mayor longitud (luz), hacia el ocular (fig. 3-20). Debido a que el objetivo actúa
Ocular
Foco de luz ] Filtro
Filtro de excitación
Objetivo
Muestra FIGU RA 3-20. Fundamento de la

microscopia de fluorescencia.
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de condensador, la iluminación se concentra de forma selectiva sobre la zona observada de

manera que pueden verse objetos opacos o muy densos que de otra forma no podrían
visualizarse. Las lámparas emisoras de luz para microscopía de fluorescencia son de
mercurio (a alta presión) o de xenón (XBO), ya que emiten ondas de longitud mucho
m enor que las clásicas de tungsteno empleadas en la luz halógena.
La microscopía de fluorescencia ofrece la ventaja de que al observar el objeto en un en
torno oscuro pueden apreciarse muy bien sus diferentes constituyentes (estructura celular),
incluso cuando se hallan en muy pequeña concentración. Sus desventajas son las siguientes:
• La imagen es mucho menos brillante que la que se obtiene con el microscopio óptico,
y al emplear luz de baja longitud de onda disminuye la capacidad del ojo humano
para apreciar los colores, lo que puede dificultar la interpretación. Estas condiciones
obligan a extremar todos aquellos dispositivos para evitar pérdidas de luz del sistema.
• La intensidad de emisión lumínica por parte del objeto varía durante el proceso de
observación, por lo que siempre se recomienda emplear un sistema fotográfico que
perpetúe la imagen.
Aunque la epifluorescencia tiene un poder de resolución superior al de la micros
copía convencional, utiliza un sistema de análisis de imagen bidimensional por lo que
no permite observar los objetos en su forma natural, es decir, tridimensional. Para ello
puede recurrirse a la microscopía confocal.
M icroscopio confocal
Es una variante de la epifluorescencia que utiliza luz láser en lugar de luz de xenón (mi
croscopía láser confocal) y que se basa en iluminar el objeto y eliminar la luz reflejada o
fluorescente de los planos fuera de foco. La luz procedente de u n láser se refleja gracias
a un espejo dicromático enfocado en u n punto del espécimen mediante la lente de un
objetivo. La señal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve
por el mismo camino óptico y pasa a través del espejo y es dirigida hacia un fotomulti-
plicador. Un diafragma (pinhole) colocado delante del fotom ultiplicador elimina las
señales procedentes de zonas distintas de la situada a la distancia focal y perm ite la
detección de un solo plano focal (fig. 3-21). Aunque el principio de la microscopía
confocal fue descrito hace ya muchos años (Minsk, 1957), y empleado en unos pocos
microscopios (Petran, 1968), su espectacular desarrollo ha tenido lugar hace poco con
la utilización de la luz láser y los avances aportados por la informática. La microscopía
láser confocal (MLC) aumenta la nitidez, el contraste y la resolución de las imágenes
a la vez que perm ite realizar un análisis tridim ensional de los objetos examinados
(Boyde, 1988). Para ello, el sistema de análisis de imágenes realiza múltiples «secciones
ópticas» de los mismos que luego son analizadas m ediante un sofisticado programa
informático. La MLC puede aplicarse a objetos autofluorescentes o susceptibles de ser
marcados con fluorocromos y está logrando excelentes resultados en diversas ramas
de la ciencia (medicina, biología y estudio de materiales diversos). Así, actualmente la
MLC se emplea ampliamente en biología celular y molecular (estudios de estructuras
celulares y citoesqueleto), estudios de microbiología, genética, biología vegetal, anatomía
patológica, neurología, ciencias de los alimentos y en muchas otras aplicaciones de uso
industrial. O tra de las aplicaciones de la MLC es el estudio de la colocalización de dis
tintos marcadores en una región concreta. Además, gracias a las características espec
trales del equipo se consiguen excitar muestras en el rango del ultravioleta, estudiar las
características de los espectros de emisión, eliminar o minimizar los típicos problemas
de solapamiento de espectros así como separar la emisión de los mareajes fluorescentes
de la posible autofluorescencia de la muestra.
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FIGURA 3-21. Fundamento de la microscopía confocal.
M icroscopio electrónico
La potencia amplificadora de u n microscopio óptico está limitada p o r la longitud de
onda de la luz visible, mientras que el microscopio electrónico utiliza electrones en vez
de luz. Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho m enor que la de
la luz pueden m ostrar estructuras mucho más pequeñas, por lo que se pueden conseguir
aumentos que varían entre 250.000 y 1.500.000 de veces el tamaño normal y una resolu
ción puntual de 0,16 mm. El microscopio electrónico consta fundamentalmente de un
tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacío. El cátodo está constituido
por un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente emite los electrones, los
cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de potencial de 50.000 a 100.000
voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el objeto que se observa,
cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan contra la preparación,
sobre la cual se desvían de manera desigual.
Con el objetivo se enfoca la imagen, que es ampliada por la lente de proyección. Para
modificar los aumentos en el microscopio electrónico basta variar la distancia focal de
la lente proyectora. Como los electrones no impresionan la retina del ojo humano, debe
recogerse la imagen del microscopio electrónico en una pantalla fluorescente, la cual
posee una superficie impregnada con fósforo o sulfuro de cinc. La imagen obtenida en
esta pantalla puede fotografiarse. Se acostumbra a utilizar el término «microfotografias»
para las fotografías tomadas a través del microscopio óptico y «micrografía» o «elec-
tromicrografía» para las que se tom an en el microscopio electrónico.
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FIGURA 3-22. Aspecto general de

un microscopio electrónico.
Los aumentos máximos conseguidos en el microscopio electrónico son del orden

de 2.000.000 (¡dos millones de aumento!) mediante el acoplamiento al microscopio
electrónico de un amplificador de imagen y una cámara de televisión. En resumen, el
microscopio electrónico consta esencialmente de:
• Filamento de tungsteno (cátodo), que emite electrones (cañón de electrones).
• Condensador o lente electromagnética, que concentra el haz de electrones (enfoque).
• Objetivo o lente electromagnética, que amplía el cono de proyección del haz de luz.
• Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen.
• Proyector o lente proyectora, que amplía la imagen.
• Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano.
• Sistema de registro (ordenador), que muestra la imagen que producen los electrones.
Tanto su complejidad como la tecnología implicada en la preparación de las muestras
para su examen, hacen que estos instrumentos solo se hallen al alcance de laboratorios
especializados. Las imágenes que producen son siempre en blanco y negro (fig. 3-22).
Existen dos tipos básicos de microscopios electrónicos, los cuales fueron inventados
al mismo tiempo pero tienen diferentes usos. El microscopio electrónico de transmisión
(MET), que trabaja «iluminando» un ejemplar en la platina con un haz de electrones
y enfocando y aumentando la «imagen» con lentes magnéticas, y el microscopio elec
trónico de barrido (MEB), que produce una imagen que da la impresión de ser en tres
dimensiones.
Microscopio electrónico de transmisión

El MET emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una
parte de los electrones rebota o se absorbe por el objeto y otra lo atraviesa formando
una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un MET debe cortarse la muestra en
capas finas, no mayores de un par de miles de angstroms. El primer MET fue desarrollado
por Riska entre 1931 y 1933, y comercializado en 1939 por Siemens. La óptica básica de
ese prim er microscopio electrónico se mantiene hasta nuestros días; los cambios en los
microscopios m odernos consisten en adicionar más lentes para incrementar el ámbito
de aumentos y darle mayor versatilidad. El MET proyecta electrones a través de una fina
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capa de tejido o material a observar, que produce una imagen en dos dimensiones. Esta
imagen electrónica, invisible, se transforma en una imagen visible mediante una pantalla
fluorescente. Mediante el MET pueden ser visualizadas las siguientes estructuras:
• En el núcleo: las características de la crom atina (eucromatina y heterocromatina)
y de la m embrana nuclear (poros nucleares y características estructurales).
• En el citoplasma: vacuolas (grandes y pequeñas), mitocondrias, ribosomas y lisosomas,
retículo endoplásmico y el centrosoma con el centríolo y los cuerpos dictiosómicos
en la periferia (aparato de Golgi).
Microscopio electrónico de barrido

El MEB crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. Utiliza dos o tres puntos
de la muestra donde llegan los electrones que escanean la superficie del espécimen a
observar y salen de este como electrones secundarios que son detectados por un sensor.
Así pues, no es necesario cortar el objeto en capas para observarlo como en un MET, sino
que puede colocarse en el microscopio con m uy pocos preparativos. El MEB explora la
superficie de la imagen punto por punto, al contrario del MET, que examina una gran
parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un
haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de elec
trones p or la pantalla de un televisor. Los electrones del haz pueden dispersarse de la
muestra o provocar la aparición de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los
secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrónico situado a los lados
del espécimen. Cada punto leído de la muestra corresponde a un pixel en un monitor de
televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones contados por el dispositivo, mayor
será el brillo del pixel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra,
se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrónicos
de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más. Este tipo de microscopio
es muy útil porque, a diferencia del MET y la microscopía óptica, produce imágenes
tridimensionales de las células sanguíneas y las características de su superficie. También
en oposición al MET no permite observar estructuras intracelulares. D urante mucho
tiempo ha sido utilizado para apreciar las alteraciones morfológicas de los eritrocitos y
poder determinar mejor las características de las mismas en diferentes tipos de anemia
hemolítica. La observación de los eritrocitos mediante MEB ha contribuido tanto al
reconocimiento de la forma real de las diferentes alteraciones morfológicas de los eri
trocitos como al diagnóstico de ciertas formas raras de anemia hemolítica hereditaria.
Por todo ello, tanto el MET como el MEB constituyen un complemento muy valioso
a la microscopía óptica convencional.
M icroscopio digital
Es un microscopio óptico que, conectado a un ordenador mediante sistema USB, puede
producir imágenes o vídeos a todo color en la pantalla del monitor. Estas imágenes son
digitales, lo que permite el almacenamiento, el retoque, la eliminación o la edición en
diferentes soportes. Asimismo, pueden ser insertadas en presentaciones multimedia,
documentos de Internet, páginas web o fácilmente enviadas por correo electrónico.
M icroscopio cuántico
Es un microscopio que permite observar objetos de tamaño nanométrico o incluso más
pequeño. Se conoce también como microscopio de barrido de efecto túnel (STM), y su
diseño se debe a los premios Nobel Binning y Róhrer (1982).
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International Committee for Standardization in Haematology. Guidelines for blood cell analyzers
evaluation including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting and cell
marker applications. ICSH Expert Panel on Cytometry. Clin Lab Haematol 1994;16:157-74.
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(proportional) and evaluation o f instrum ent method; Approved Standard. NCCLS Document
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Capítulo 3 Examen m orfológico de las células sanguíneas 1 0 4 .e l
Autoevaluación
1. ¿La fórmula leucocitaria automatizada que ofrece un analizador hematológico es suficiente
cuando no m uestra alteraciones?
(a) Sí, cuando el hemograma automatizado es normal.
(b) No, debe revisarse manualmente en todos los casos.
(c) Solo debe realizase la revisión m anual cuando existe una persona experta en morfología.
(d) La revisión m anual de la fórmula leucocitaria no es necesaria con los datos que ofrece
hoy en día un analizador hematológico automatizado.
Respuesta razonada: a diferencia de un hemograma automatizado, la realización de un examen
m orfológico del frotis de sangre requiere conocim ientos que solo poseen personas con la
formación adecuada. Debido a ello, esta prueba resulta mucho más costosa que un simple hemo
grama y debe ser realizada solo cuando sea necesaria. En este sentido, la Sociedad Internacional
de Laboratorio de Hematología (ISLH) ha publicado los criterios de consenso para el examen
morfológico del frotis de sangre sobre la base de los resultados del hemograma automatizado.
2. Para realizar una fórmula leucocitaria m anual a partir de sangre total es imprescindible lo
siguiente:
(a) Disponer del hemograma automatizado.
(b) Utilizar May-Grünwald/Giemsa como colorante.
(c) Esperar 24 h antes de realizar el frotis.
(d) Realizar el frotis dentro de las 6 h de la extracción sanguínea.
(e) Utilizar sangre desfibrinizada.
Respuesta razonada: para poder realizar una correcta observación morfológica, la calidad de la
extensión o frotis de sangre debe ser impecable, ya que constituye un medio muy asequible para
confirmar la existencia de posibles alteraciones de las células sanguíneas, a veces detectadas por
los analizadores automatizados mediante «alarmas». U n hecho muy importante es que dado que
hoy en día las extensiones difícilmente pueden realizarse a partir de sangre sin anticoagulante,
es m uy im portante realizarla cuanto antes para que este efecto sea el m ínimo. Igualmente, las
extensiones deben ser realizadas dentro de las 4 h de practicada la extracción, con el objeto de
evitar la posible aparición de artefactos que pueden dificultar la observación morfológica y la
realización de la fórmula leucocitaria.
3. En Europa, el colorante de elección para la tinción de las células sanguíneas es:
(a) Giemsa.
(b) May-Grünwald/Giemsa.
(c) Wright.
(d) Romanowsky.
Respuesta razonada: prácticam ente todos los m étodos empleados para teñir las células de la
sangre se basan en el empleo de colorantes tipo Romanowsky, constituidos, fundamentalmente,
por la mezcla de eosinas y derivados de las tiazinas. Romanowsky utilizó por vez prim era esta
mezcla de colorantes para poner en evidencia el núcleo del parásito del paludismo o malaria.
Para ello se basó en la idea del llamado «teñido neutro» de Ehrlich, que consiste en dejar que un
colorante básico reaccione con otro ácido para dar lugar a un compuesto con nuevas propiedades.
De esta forma, combinando la eosina, colorante ácido, con el azul de metileno, colorante básico
derivado de las tiazinas, obtuvo no solo una aceptable visualización del parásito del paludismo,
sino también una amplia gama de colores que, aplicados a las células sanguíneas, constituye hoy
en día el principio básico para su observación morfológica mediante microscopio. Posteriormente
la técnica de Romanowsky fue perfeccionada por Leishman y Jenner, en Inglaterra, y por May-
Grünwald y Reuter, en Alemania, que consiguieron mayor estabilidad de los colorantes y mejor
reproducibilidad del método de tinción aplicado a las células sanguíneas en extensión.
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104.e2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
4. La observación morfológica del frotis sanguíneo es especialmente im portante para:

(a) Diagnóstico de la anemia.
(b) Clasificación internacional de los linfomas malignos.
(c) Diagnóstico diferencial entre trombocitosis y trombocitemia esencial.
(d) Diagnóstico de la policitemia vera (PV).
Respuesta razonada: incluso en la era de los estudios moleculares, el examen del frotis de sangre
continúa siendo una herramienta indispensable en el diagnóstico clínico general y hematológico
en particular. Indispensable. Obviam ente no m ediante la práctica de realizarlo a todos los
pacientes de forma sistemática, sino cuando lo aconseje la clínica o las restantes exploraciones
complementarias.
Asimismo, este hecho refuerza la vitalidad del examen del frotis como complemento de ciertos
hemogramas cuyo resultado no puede ser interpretado solo con las magnitudes automatizadas.
Más aún, el examen del frotis puede ser decisivo para confirmar la existencia de ciertas alteracio
nes cuantitativas o verificar la importancia de ciertas alarmas suministradas por los analizadores
hematológicos automatizados.
5. La eosinofilia es una alteración de la sangre relativamente frecuente y suele observarse
asociada a una de las enfermedades siguientes:
(a) Incontinencia urinaria.
(b) Anemia.
(c) Parasitosis intestinal.
(d) Enfermedad celíaca.
(e) Hipotiroidismo.
Respuesta razonada: la causa más frecuente de eosinofilia (y, en ocasiones, basofilia, en general
m oderadas) son las enfermedades alérgicas (asma, fiebre del heno, alergias m edicamentosas,
enfermedad del suero, eczema atópico, urticaria, hipersensibilidad a ciertos alimentos y edema
angioneurótico). Eosinofilias más intensas se observan en una forma de periarteritis nudosa (va
riante de Churg-Strauss) y vasculitis sistémica necrotizante. Descartada la enfermedad alérgica,
la parasitosis constituye otra causa frecuente de eosinofilia, en general más intensa ( > 2 X 109/1).
Entre las parasitosis que suelen cursar con eosinofilia destacan: hidatidosis (equinococosis), es-
quistosomiasis, filariasis, triquinosis, cisticercosis y larva migrans visceral.
Los parásitos intestinales suelen ser causa de eosinofilia, pero mucho menos que los parásitos
que invaden tejidos, como los anteriorm ente citados.
6. La monocitosis es la alteración de la sangre característica de:
(a) La mononucleosis infecciosa.
(b) La fiebre del heno.
(c) La aplasia de medula ósea.
(d) La leucemia mielomonocítica crónica (LMMC).
(e) La leucemia aguda mieloblástica.
Respuesta razonada: al igual que en el caso de la linfocitosis, solo debe considerarse la existencia
de una monocitosis real cuando la cifra absoluta de m onocitos sea superior a 0,8 X 109/1. No
debe olvidarse que las causas de variabilidad de la fórmula leucocitaria, en especial la distribu
ción de las células en la extensión, pueden llevar a falsas interpretaciones, especialmente en el
caso de los monocitos, en que el núm ero de estas células es relativamente bajo, comparado con
el de linfocitos y neutrófilos. La subjetividad de un observador no experimentado, al catalogar
de m onocitos ciertas formas de linfocitos (linfocitos estimulados), puede contribuir también a
la existencia de falsos aumentos del núm ero de monocitos.
7. La desviación a la izquierda con anomalía de Pelger-Huét puede ser una manifestación de:
(a) Infección por estafilococos.
(b) Apendicitis aguda.
(c) Síndrome mielodisplásico.
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Capítulo 3 Examen m orfológico de las células sanguíneas 1 0 4 .e3
(d) Síndrome leucoeritroblástico.

(e) Síndrome falciforme.
Respuesta razonada: el núcleo del polim orfonuclear neutrófilo presenta norm alm ente 3 o 4
lóbulos, que en el curso de ciertas anemias (megaloblástica, principalmente) pueden aumentar
considerablemente (neutrófilos hipersegmentados o pleocariocitos cuando, además, son de mayor
tamaño). En otros casos se observa una disminución del número de neutrófilos con segmentación
normal, a expensas de un aumento del de neutrófilos no segmentados o cayados en banda. Esta
situación se conoce con el nom bre de desviación a la izquierda y puede observarse en el curso de
diversos procesos inflamatorios o infecciones agudas o crónicas. La persistencia de un predominio
de neutrófilos no segmentados, en ausencia de cualquier causa que la explique, debe hacer pensar
en la existencia de una anomalía de Pelger-Huét o defecto congénito de la segmentación nuclear
de los neutrófilos. Cuando aparece en la edad adulta y afecta a un porcentaje de las células, la
anomalía de Pelger-Huét puede ser la manifestación de un síndrome mielodisplásico.
8. Ante el hallazgo casual de plaquetopenia m oderada (entre 50 y 100 X 109/1), lo prim ero que
se debe descartar es:
(a) El carácter portador de hemofilia.
(b) Coagulación intravascular diseminada.
(c) Agregación plaquetaria inducida por el EDTA.
(d) Hepatopatía crónica.
(e) Enfermedad de von Willebrand.
Respuesta razonada: la observación de las plaquetas en el frotis tiene, además, otro aspecto de
indudable interés práctico. Debido a que todos los laboratorios clínicos realizan el recuento au
tomático de plaquetas a partir de sangre con EDTA-K3, no es raro observar falsas plaquetopenias
debidas a un efecto aglutinador del anticoagulante sobre las plaquetas, que a veces no es detectado
por el instrumento. En tales casos se aprecia una clara disociación entre el núm ero de plaquetas
suministrado por el analizador y las que se observan en la extensión. Por ello, la observación
sistemática de las plaquetas en la extensión constituye uno de los aspectos que nunca deben
olvidarse al practicar la fórmula leucocitaria que, en todo caso, es obligado cuando se dispone
de un recuento automático de plaquetas inferior al normal.
9. El componente más delicado del microscopio óptico es:
(a) La platina.
(b) El revólver.
(c) El sistema de iluminación.
(d) El sistema óptico.
Respuesta razonada: el sistema óptico es el la parte más delicada del microscopio convencional
porque es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes m ediante el conjunto de lentes
que lo componen. Está formado p or los oculares y los objetivos.
Los oculares: son las lentes situadas a mayor proximidad del ojo y poseen generalmente un
aumento de 10 X ( X significa el número de veces que aumenta el diámetro del objeto visualizado).
Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto. Los
oculares más utilizados son los de 8X, 10X, 12,5X, 15X. Los microscopios que solo poseen un
ocular se llaman monoculares, y los que poseen dos, binoculares. Para la enseñanza se suelen em
plear microscopios con varios cabezales, que permiten la observación de varias personas a la vez.
Los objetivos: son las lentes más próximas al objeto que se observa y producen el aumento
de las imágenes de los objetos y organism os objeto de estudio. Los objetivos utilizados co
rrientem ente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión.
10. El microscopio electrónico de transmisión se usa básicamente para:
(a) Observar la superficie de las células.
(b) Analizar la movilidad de los polinucleares neutrófilos.
(c) Diagnóstico de los linfomas malignos.
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(d) Análisis de las subestructuras celulares.

(e) Análisis de la cromatina nuclear.
Respuesta razonada: el microscopio electrónico (de transm isión o de barrido), p o r su com
plejidad y tecnología implicada en la preparación de las m uestras, solo se halla al alcance de
laboratorios especializados. Las imágenes que producen son siempre en blanco y negro. Existen
dos tipos básicos de microscopios electrónicos, los cuales fueron inventados al m ismo tiempo,
pero tienen diferentes usos: el m icroscopio electrónico de transm isión (MET) que trabaja
«iluminando» un ejemplar en la platina con un haz de electrones y enfocando y aum entando la
«imagen» con lentes magnéticas, y el microscopio electrónico de barrido (MEB), que produce
una imagen que da la impresión de ser en tres dimensiones.
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C A P Í T U L O 4
Métodos para el recuento manual

de las células sanguíneas
J. L. Vives C orrons y M M . Pujades
CONCEPTO DE HEMOGRAMA
El recuento celular sanguíneo es la medida de la concentración de eritrocitos, leucocitos
y plaquetas expresada en unidades entíticas (es decir, de células) p or litro de sangre.
Junto a la concentración de hemoglobina (Hb), el valor hematocrito (Hto), los índices
eritrocitarios (volumen corpuscular medio [VCM], hemoglobina corpuscular media
[HCM] y concentración media de la hemoglobina corpuscular [CMHC]) y el recuento
diferencial de leucocitos (RDL), constituye lo que hoy en día se conoce como «perfil
hematológico básico» o hemograma. Durante más de un siglo, no obstante, el significado
de este térm ino se ha ido adaptando a los avances experimentados por la tecnología
diagnóstica aplicada al laboratorio de hematología.
El térm ino hemograma fue introducido por vez prim era p o r J. A rneth en el año
1904, después de analizar a un elevado núm ero de pacientes con procesos infeccio
sos, y clasificar sus granulocitos neutrófilos en subgrupos de acuerdo con el núm ero
de lobulaciones (o segmentos) nucleares. Siguiendo este criterio, situó a la izquierda
los granulocitos con escasas lobulaciones o sin ellas (más inmaduros) y a la derecha los
más lobulados (más maduros), elaborando por vez primera u n patrón de clasificación
leucocitaria que denom inó «hemograma» y que actualmente se conoce como hemo
grama de Arneth (fig. 4-1). Sobre la base del hemograma de Arneth, en 1933, el patólogo
alemán J. Schilling definió el térm ino desviación a la izquierda como un aum ento
de los granulocitos más inmaduros, no segmentados o «bandas», y completó el patrón de
clasificación leucocitaria estableciendo un procedimiento para el recuento individuali
zado de las diferentes subpoblaciones leucocitarias, o fórmula leucocitaria. Es por ello
que durante muchos años, a la fórmula leucocitaria se la ha conocido también como
hemograma de Schilling.
Hasta bien entrada la década de los sesenta, el hem ogram a de Schilling, o fórmula
leucocitaria, se com plem entaba con el recuento m anual de las células sanguíneas
mediante una cám ara cuentaglóbulos o hemocitómetro, pero a p artir de 1970, con
la introducción de los sistemas autom atizados para realizar el perfil hematológico
básico, los conceptos de «hemograma» y «fórmula leucocitaria» sufrieron u n cambio
radical.
Fue en la década de los o ch en ta cuando el uso generalizado de los prim eros
analizadores hematológicos autom atizados hizo que se utilizara la denom inación
de hem ogram a para referirse al recuento celular de hem atíes y leucocitos, la con
centración de hem oglobina y los índices eritrocitarios (VCM, HCM y C M H C). A
lo largo de esta m ism a década, algunos equipos introdujeron tam bién la fórm ula

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Neutrófilos
Leucocitos
Meta miel, Núcleo Núcleo Eo sinó filos Basófilos Linfocitos M onocitos
por mm? M ielocitos
ju veniles en cayado segm ent.
6 a 8.000 0
# ©© n ® » CP
0-1 3-5 55-85 2-4 0-1 20-25 4-8
17.000 , 6 32 4G i 0 0 12 4
12.000 18 54, 2 0 20 16
8.000 ,2 I 38, 8 1 40 11
------------ Él -----
FIGURA 4-1. Hemograma de Arneth.
leucocitaria a tres poblaciones (Diff-3): granulocitos, linfocitos y células de tam año

mediano, y algo más tarde se añadió el recuento de plaquetas. De esta forma, gracias
a la autom atización, el hem ogram a (autom atizado) e n tró a fo rm ar parte de las
pruebas incluidas en el protocolo de admisión de pacientes y a realizarse de forma
sistemática, para un simple recuento de leucocitos o para conocer la concentración
de hemoglobina. Esto supuso un extraordinario avance en el diagnóstico de muchas
enfermedades, especialmente las de la sangre, ya que no solo p erm itió realizar un
elevado núm ero de hemogramas en m uy poco tiempo, de gran calidad y a un precio
razonable, sino tam bién realizarlos tantas veces como fuera preciso de acuerdo con
los requerim ientos clínicos del paciente.
En la década de los noventa, se observó un explosivo avance en la sofisticación de los
analizadores hematológicos automatizados con una intensa competencia entre diferentes
firmas comerciales para ofrecer el mayor número posible de magnitudes automatizadas.
De esta form a no solo se consolidó el nuevo concepto de hemograma, sino que fue
adquiriendo personalidad propia, e incluía cada vez un mayor núm ero de magnitudes
en consonancia con el desarrollo de los sistemas de análisis celular en sistemas de flujo
continuo. Hoy en día un hemograma puede llegar a tener más de 10 magnitudes, entre
las que, además de las clásicas (recuentos celulares, hem atocrito, concentración de
hemoglobina y VCM) incluyen, por ejemplo, la amplitud de la curva de distribución
eritrocitaria (RDW o IDE o ADE) y plaquetaria (PDW), el plaquetocrito y la fórmula
leucocitaria a cinco elementos (Diff-5). Conceptos como plaquetas reticuladas o concen
tración de hemoglobina reticulocitaria forman parte de algunos analizadores actuales de
alta gama, que pueden llegar a realizar de forma sistemática el recuento de reticulocitos
como parte integral del hemograma.
En resumen, hoy en día, cuando se solicita un análisis de sangre, ya no se consideran
la fórmula leucocitaria o el recuento de plaquetas como complementos del hemograma,
sino parte integrante del mismo de manera que este aglutina de forma definitiva el clásico
«recuento y fórmula» solicitado por los médicos al laboratorio durante la primera mitad
del siglo xx.
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Capítulo 4 Métodos para e l recuento manual de las célu las sanguíneas 107
RECUENTO CELULAR MEDIANTE CÁMARA CUENTAGLÓBULOS

O HEMOCITÓMETRO
El recuento no autom atizado de las células sanguíneas se basa, fundam entalm ente,
en la utilización de la llamada cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro. Como se ha
mencionado anteriormente, este procedimiento de recuento celular fue de uso corriente
en los laboratorios de hematología hasta bien entrada la década de los sesenta y durante
los primeros años de la automatización, en la década de los setenta. Desgraciadamente,
adolece de escasa exactitud y precisión, por lo que los valores obtenidos son siempre
aproximativos. Es por ello que, si bien en los laboratorios clínicos m odernos este pro
cedimiento ha sido totalmente reemplazado por analizadores hematológicos, no se ha
suprimido de esta nueva edición porque creemos que aún puede ser útil en determinadas
circunstancias, como por ejemplo:
• Regiones geográficas del m undo donde resulte imposible utilizar procedimientos
automatizados, debido a la carencia de recursos suficientes o de un medio idóneo
para su correcta utilización.
• Laboratorios especiales o de experimentación donde no resulte necesario, ni rentable,
adquirir un equipo de recuento celular electrónico, como por ejemplo el recuento de
células en líquidos biológicos diferentes a la sangre (orina, líquido cefalorraquídeo,
ascítico, pleural y articular, entre otros).
• Laboratorios clínicos que todavía utilizan el recuento en cámara para verificar el valor
de un recuento automatizado de plaquetas cuando este resulte excesivamente elevado
(falsas trom bocitosis) o dism inuido (falsas plaquetopenias). Debe m encionarse
que en casos de plaquetopenia intensa detectada por un analizador hematológico,
la comprobación del resultado mediante el recuento en cámara puede ser de gran
utilidad clínica. Ejemplo de ello son las falsas trombocitopenias debidas a una ex
tracción dificultosa de la sangre (formación de microcoágulos), a la presencia de
plaquetas gigantes (megatrombocitos) o a la aglutinación espontánea por efecto del
anticoagulante EDTA.
C ám ara cuentaglóbulos
La cámara cuentaglóbulos es una microcámara de cristal excavada en u n portaobjetos
especial que se cierra m ediante un cubreobjetos. Permite realizar una dilución de las
células sanguíneas y su posterior visuaüzación mediante el microscopio.
Existen distintas marcas y modelos de cámara cuentaglóbulos, aunque todas ellas res
ponden a un diseño similar. Se trata de un portaobjetos de vidrio grueso (unos 3 mm de
espesor), una de cuyas superficies lleva esculpidos tres prismas paralelos, de los cuales el
central está dividido en dos hemiprismas idénticos separados por un surco transversal.
Ello permite colocar dos muestras distintas simultáneamente sin que se mezclen entre
ellas. Sobre estas últimas se hallan grabados sendos retículos cuyo diseño varía según
el modelo de cámara (fig. 4-2). Los prismas laterales se encuentran sobreelevados res
pecto al central, a una altura que puede ser de 0,1 mm (cámaras de Neubauer, Thom a y
Bürker), de 0,2 m m (cámaras de Malassez, Fuchs-Rosenthal) o de 0,5 mm, de manera
que, al colocar sobre aquellas un cubreobjetos grueso y de caras planas, se constituye
un espacio entre el prisma central y el cubreobjetos, en el que se pone una muestra de
sangre diluida para efectuar el recuento.
El trazado de los retículos tiene unas dimensiones variables: 1 m m 2 para la cámara
de Thoma y 9 mm2 para las de Neubauer y Bürker. El modelo de retículo más utilizado
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 4-2. Modelo de una cámara cuentaglóbulos.
es el de Neubauer, constituido por nueve cuadros grandes de 1 m m 2 de superficie cada

uno (fig. 4-3, A). Los cuatro cuadros de las esquinas se destinan al recuento de leucocitos
y plaquetas, y el cuadro central, que presenta mayor núm ero de líneas de referencia, al
recuento de eritrocitos. La intersección de las líneas de referencia delimitan en el cuadro
central 400 cuadritos pequeños con una superficie de 1/400 mm 2cada uno. Como puede
apreciarse en la citada figura, cada 16 cuadros pequeños se agrupan formando cuadrados
de mediano tamaño, de forma que en el cuadro central existen 16 cuadros de mediano
tamaño que contienen cada uno de ellos 16 cuadritos. El retículo de Thoma es de cuadro
único (fig. 4-3, B), con un diseño y unas dimensiones idénticos a los del cuadro central
del retículo de Neubauer. El retículo de Bürker (fig. 4-4) presenta un trazado muy regular
e idéntico para cada uno de los cuadros que lo constituyen.
M aterial
• Sangre capilar o venosa (utilizando EDTA como anticoagulante).
• Líquido de dilución:
• Para el recuento de células sanguíneas pueden emplearse diferentes líquidos de
dilución, cuya naturaleza varía según el tipo de célula analizada (tabla 4-1).
• Para el recuento de eritrocitos se han empleado líquidos neutros o isotónicos,
mientras que para el de leucocitos son necesarios líquidos que tiñan ligeramente
el núcleo de los mismos y produzcan una hemolisis de los eritrocitos (líquido de
Türk). Para el recuento de plaquetas se emplea un líquido hemolizante que impide
la agregación de las plaquetas.
• Pipeta de dilución (o microcapilar calibrado). Puede ser de dos tipos, según vaya des
tinada al recuento de eritrocitos o leucocitos (fig. 4-5). El diseño de ambas es similar y
consiste en un capilar adecuadamente calibrado (error, 1%) con una dilatación o bulbo
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 4-3. A. Esquema del
retículo de la cámara de Neubauer.
B. Esquema del retículo de la cámara
de Thoma.
FIGURA 4-4. Esquema del retículo

de la cámara de Bürker.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 4-1. Líquidos diluyentes empleados para el recuento celular mediante cámara
cuentaglóbulos
Recuento de eritrocitos (solución salina fisiológica)

Líquidos neutros o isotónicos Proporción
Cloruro sódico 0,85 g
Agua destilada c.s.p., 100 mi
Recuento de leucocitos (líquido de Türk)
Líquidos que tiñen el núcleo_________________________ Proporción
Ácido acético glacial 2 mi
Violeta de genciana (1%) 1 mi
Agua destilada c.s.p., 1.000 mi
Recuento de plaquetas
Líquidos hemolizantes Proporción
Oxalato sódico 1g
Agua destilada c.s.p., 100 mi
FIGU RA 4-5. Pipetas

cuentaglóbulos. La del bulbo más
pequeño se utiliza para el recuento
leucocitario (y plaquetario), mientras
que la del bulbo grande es para el
eritrocitario.
en su extremo proximal, de tal forma que el volumen que puede contener esta dilatación
sea siempre un múltiplo entero del correspondiente al propio capilar. Así, la pipeta para
el recuento leucocitario permite hacer una dilución al 1/20, puesto que la capacidad
del bulbo es 20 veces superior a la del capilar, mientras que la pipeta para el recuento
de eritrocitos tiene un bulbo con una capacidad 200 veces superior a la del capilar, por
consiguiente, se permite realizar una dilución al 1/200. Ambas pipetas llevan, asimis
mo, un enrase en la m itad exacta del capilar (0,5), así se pueden realizar, enrasando
en él la muestra de sangre, diluciones dobles de las citadas. En caso de no disponer de
las pipetas de dilución, la dilución de la sangre puede obtenerse también empleando
cualquier microcapilar calibrado de 20 (xl, con un error inferior al 1%.
• Cámara húmeda (cápsula de Petri con un algodón empapado con H20 en su interior).
• Microscopio óptico con sistema de contraste de fases (para recuento de plaquetas).
Recuento de eritrocitos
1. Se enrasa la pipeta de dilución para eritrocitos (bulbo de dilución 1/200) hasta
0,5 con sangre total.
2. Se aspira líquido de dilución isotónico hasta 101 (final del enrase), por lo que se
consigue una dilución de la sangre del 1/200. Para facilitar la aspiración se conecta
el extremo proximal de la pipeta de dilución a un tubo de goma de 25 a 30 cm
que lleve incorporada una boquilla.
3. Se agita suavemente el contenido del bulbo, una vez desechadas las tres primeras
gotas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
4. Se llena la cámara cuentaglóbulos (Bürker o Neubauer) por capilaridad.

5. Se observa al microscopio mediante el objetivo de 40X .
Si se emplea la cám ara de B ürker (20 X 4 = 80 cuadritos), el recuento se realiza
con los eritrocitos situados sobre cuatro cuadros, cada uno de ellos equivalente a 20
cuadritos (20 X 4 = 80).
Si se emplea la cám ara de N eubauer (16 X 5 = 80 cuadritos), el recuento se realiza
con los eritrocitos situados sobre 80 cuadritos que corresponden a los cuatro cuadros
de las esquinas y el situado en el centro. Cada uno de ellos equivale a 16 cuadritos
(1 6 X 5 = 80) (v. fig. 4-3, A).
Cálculo del resultado

Superficie de recuento (80 cuadritos X 1/400 m m 2) = 1/5 m m 2
Altura de la cámara (0,1 m m ) = 1/10 mm
Volumen de la cámara (1/5 X 1/10) = 1/50 m m 3
Dilución de los eritrocitos = 1/200
Eritrocitos/mm3 de sangre diluida = A (células contadas) X 50 = B
Eritrocitos/mm3 de sangre sin diluir* = B X 200 = C
Concentración de eritrocitos (1012/1) = C X 106
Ejemplo:
Eritrocitos depositados sobre 80 cuadros = 390
Eritrocitos por litro (1) de sangre = 390 X 10.000 X 106 (3,9 X 1012/1)
Recuento de leucocitos
1. Se enrasa la pipeta de dilución para leucocitos (bulbo de dilución 1/20) hasta 0,5
con sangre total. Alternativamente puede emplearse un capilar graduado a 0,05 mi.
2. Se aspira líquido de Turk hasta el siguiente enrase, por lo que se consigue una
dilución de la sangre del 1/20. Para facilitar la aspiración se conecta el extremo
proximal de la pipeta de dilución a un tubo de goma de 25 a 30 cm que lleve
incorporada una boquilla.
3. Se agita suavemente el contenido del bulbo y una vez desechadas las tres primeras
gotas, se procede a llenar la cámara cuentaglóbulos por capilaridad.
4. Se observa al microscopio mediante el objetivo de 40X .
5. En general, se emplea la cámara de Neubauer que consta de nueve cuadros de
1 mm2.

Cuatro cuadros de 1 m m 2 = 4 m m 2
Altura de la cámara = 0,1 mm
Dilución leucocitos = 1/20
Células por m m 3 = X 10
Leucocitos/mm3de sangre diluida = A (células contadas) X 1/4 X 10 = B
Leucocitos/mm3de sangre sin diluir** = B X 20 = C
Concentración de leucocitos (X109/1) = C X 106
Ejemplo:
Leucocitos depositados sobre cuatro cuadros =100
Leucocitos por litro (1) de sangre = 100 X 50 X 106 (5 X 109/1)
* Factor de dilución = 200
** Factor de dilución = 20
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Corrección del resultado en caso de eritroblastos circulantes

Los eritroblastos no se encuentran normalmente circulando por la sangre, pero pueden
hacerlo en el curso de intensos estímulos de la eritropoyesis (anemias hemolíticas), de
ciertos síndromes mieloproliferativos o en caso de metástasis neoplásica de la médula
ósea (mieloptisis). Al poseer núcleo y no ser destruidos p or el líquido de Turk, se
cuentan como leucocitos, pudiendo falsear su recuento; p o r ello se ha de aplicar un
factor de corrección. Para esto se examina la extensión de sangre, se calcula el número
de eritroblastos p or cada 100 leucocitos (n.° de eritroblastos) y se aplica la fórmula
siguiente:
N.° de eritroblastos . . . ,_ 9f1v

Eritroblastos/I = --------------------------------x leucocitos (xlO /l)
N.° de eritroblastos+100
Leucocitos corregidos = leucocitos (x l0 9/l) - eritroblastos/1
Ejemplo:
Eritroblastos por 100 leucocitos = 25
Concentración de leucocitos = 10 X 109/1
Eritroblastos/1 = 25/100 + 25 = 0,2
0.2.X 10 = 2 X 1071
Leucocitos corregidos = 10 X 109/1 — 2 X 109/1 = 8 X 109/1
Recuento de plaquetas
La sangre total se diluye en una solución que im pide la agregación de las plaquetas.
El recuento puede hacerse, al igual que en el caso de eritrocitos y leucocitos, m e
diante un microscopio óptico aunque para una m ejor visualización de las plaquetas
y gracias a su carácter birrefringente es recomendable em plear uno de contraste de
fases.
1. Se incide en el pulpejo del dedo tras desechar la prim era gota.
2. Se llena por capilaridad la micropipeta, m anteniéndola horizontal.
3. Se diluye el contenido de la pipeta en 1,98 mi de solución de oxalato amónico 1%.
4. Se deja la muestra en reposo durante 15 min.
5. Se llena la cámara cuentaglóbulos y se deja en reposo en cámara húmeda durante
otros 15 min.
6. Mediante el microscopio de contraste de fases o bien con uno de óptica conven
cional (m anteniendo el condensador bajo) se cuentan las plaquetas presentes
en ocho cuadros de los 16 que existen en uno de la cámara; se aconseja contar
los cuadros situados en diagonal. Luego se cuentan otros ocho cuadros en otro
situado en el ángulo opuesto de la cámara. Si se utiliza óptica de contraste de
fases, las plaquetas aparecen como puntos negros rodeados de un halo claro
(refringencia).
7. Se cuentan las plaquetas depositadas sobre ocho cuadros de dos de los grandes,
situados en diagonal, de las cámaras de Bürker o Neubauer.
8. Si se utiliza la cámara de Thoma, se deben contar los 16 cuadros medianos que la
forman. Se aconseja considerar los cuadros medianos situados en la diagonal de
ambos cuadros grandes.
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La suma de los dos recuentos (16 cuadritos) corresponde a las plaquetas presentes en un
volumen de 0,1 m m 3. Se multiplica por 10 (valor de 1 m m 3), luego por 100 (factor de
dilución) y finalmente por 106para expresar el resultado en litros (109/1), según el sistema
internacional de unidades. La suma de los dos recuentos (16 cuadritos) corresponde a
las plaquetas presentes en u n volumen de 0,1 m m 3 (A).
Plaquetas/mm3de sangre diluida = A (células contadas) X 10 = B
Plaquetas/mm3de sangre sin diluir* = B X 100 = C
Concentración de plaquetas (109/1) = C X 106
Ejemplo:
Recuento de plaquetas (A) = 150
Plaquetas por litro de sangre (C) = 150 X 1.000 X 106 = 150 X 109/1
Causas de e rro r del recuento en cám ara

Todos los métodos de recuento manual están sometidos a variables diversas que pueden
influir en mayor o m enor grado sobre los resultados, disminuyendo su exactitud y
precisión (fiabilidad). Esta variabilidad inherente a los procedimientos manuales puede
constituir u na causa de error a la que pueden sumarse otras que deben ser siempre
tenidas en cuenta cuando se utiliza un procedimiento de recuento manual con finalidades
clínicas (cuadro 4-1).
CUADRO 4-1. Causas de error en el recuento celular mediante cámara cuentaglóbulos

• Extracción sanguínea
• Punción capilar: no despreciar las primeras gotas (efecto sobre el recuento de
plaquetas debido a su adherencia al tejido lesionado)
• Punción venosa: agitación insuficiente de la misma
• Envejecimiento del espécimen (lisis de leucocitos)
• Pipetas de dilución (o capilares)
• Mal calibradas, sucias o húmedas
• No eliminar el exceso de sangre de las paredes antes de introducir la pipeta en el
líquido de dilución
• Llenado incompleto o excesivo de la pipeta de dilución (presencia de burbujas de aire
en el capilar)
• Falta de suficiente agitación de la sangre diluida en la pipeta o tiempo de espera
insuficiente
• Cámara cuentaglóbulos
• No desechar las tres primeras gotas de la pipeta antes de llenar la cámara
cuentaglóbulos
• Cámara cuentaglóbulos mal ajustada, sucia o mojada
• Llenado incompleto de la cámara cuentaglóbulos
• Empleo de un cubreobjetos deformable, no rígido
• Células mal distribuidas en el fondo de la cámara
• Errores al realizar el recuento
• Errores al efectuar los cálculos
* Factor de dilución = 100
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RECUENTO DE PLAQUETAS MEDIANTE EL MÉTODO DE FONIO

El recuento m anual de plaquetas puede realizarse tam bién directam ente a partir de
una extensión de sangre teñida, al relacionar el número de plaquetas observadas con el
núm ero de eritrocitos presentes en los mismos campos examinados y deduciendo de
ambos datos la concentración de plaquetas en sangre. Algunos autores han realizado la
misma operación calculando el número de plaquetas observadas por cada 100 leucocitos
y obteniendo un cociente leucocitos/plaquetas.
Al igual que el recuento en cámara, ambos procedimientos son lentos, engorrosos y
adolecen de escasa fiabilidad pero son útiles en caso de trombocitopenias muy intensas
o presencia de m acroplaquetas (plaquetas gigantes), situaciones en las que los sis
temas automatizados pierden parte de su fiabilidad. Con todo, no debe olvidarse que
el recuento en cámara continúa siendo el método de referencia internacional (ICSH)
para determinar la concentración de plaquetas en sangre, aunque con sus limitaciones:
además del elevado tiem po necesario para la preparación de la m uestra y su lectura
al microscopio, el elevado coeficiente de variación interlaboratorio que se sitúa entre
un 20 y 30%.
M aterial
• Sangre capilar o venosa con EDTA.
• Extensión de sangre.
• Microscopio óptico convencional o de contraste de fases.
• Ocular de Miller.
M étodo
1. Punción digital: se desengrasa la pulpa del dedo y se coloca una gota de sulfato
de magnesio (S 0 4Mg).
2. Se practica una incisión con una lanceta. Se toma la prim era gota y se realiza una
extensión.
3. Se tiñe la extensión mediante May-Grünwald/Giemsa (MGG).
4. Se observa la preparación mediante el objetivo de inmersión.
5. Se cuentan las plaquetas presentes en 10 campos y mediante el ocular de Miller se
van contando al mismo tiempo el número de eritrocitos presentes en el recuadro
central del mismo. En cada observación (campo) se multiplica el núm ero de
eritrocitos contabilizados por 10.
6. Se analizan un total de 10 campos.

La concentración aproximada (apreciación) de plaquetas se calcula aplicando la siguiente
fórmula:
N.° de plaquetasxÍO’/I = N-°de plaquetasxN.° de hematíes (en 10 campos)
N.° de hematíes (en 10 campos)
Interpretación del resultado

Mediante este procedimiento, la cifra de recuento obtenida es solo un valor aproximado
y no puede considerarse como valor real de concentración de plaquetas en sangre. No
obstante, su realización sum inistra una inform ación m uy próxim a a la realidad del
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número de plaquetas circulantes. El método de Fonio, junto a la apreciación plaquetaria

a p artir de la observación morfológica de la extensión de sangre puede resultar muy
útil para verificar discordancias entre el recuento de plaquetas automático y la realidad
clínica del paciente.
VALORES DE REFERENCIA DEL RECUENTO CELULAR

E INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO
La concentración de eritrocitos (San-Eritrocitos; c), leucocitos (San-Leucocitos; c) y pla
quetas (San-Plaquetas; c) en sangre varía con la edad y el sexo (tabla 4-2). En la práctica
clínica, pueden observarse aumentos o disminuciones patológicos de la concentración
de eritrocitos, leucocitos y de plaquetas que no siempre obedecen a enfermedades del
sistema hematopoyético. Entre ellas destacan las debidas a situaciones fisiológicas como
el embarazo, el ejercicio y el ritm o circadiano.
Un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico nor
mal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina, y recibe
el nom bre de eritrocitosis o poliglobulia. Las causas más importantes de poliglobulia
aparecen en el cuadro 4-2. Cuando el aum ento de la concentración de eritrocitos se
acom paña de una dism inución del contenido hemoglobínico no puede hablarse de
poliglobulia, sino de seudopoliglobulia. La seudopoliglobulia puede acom pañarse
de microcitosis e incluso de anemia, como por ejemplo, en la talasemia o en la anemia
ferropénica (seudopoliglobulia microcítica).
El descenso de la concentración de eritrocitos en sangre se acom paña siempre
de una dism in u ció n de la co n cen tració n de hem o g lo b in a (anem ia), que puede
obedecer a u n a pérdida p o r h em orragia o hem ólisis o a u n a falta de form ación
en la m édula ósea (v. capítulo 15). El aum ento de la concentración de leucocitos
se deno m in a leucocitosis y p uede aparecer debido a m uchas causas; entre estas
destacan los procesos infecciosos e inflam atorios agudos y crónicos (cuadro 4-3;
v. tam bién capítulo 3, «Aumento de u na subpoblación determ inada de leucocitos»,
pág. 77).
C uando se utilizan sistemas autom áticos de recuento, debe recordarse que los
especímenes de sangre con elevado núm ero de leucocitos (> 1 5 X 109/1) pueden
contam inar al espécimen siguiente, lo que producirá falsos aum entos de la concen
tra c ió n de leucocitos, especialm ente cu an d o este ú ltim o los posee de m anera
escasa.
TABLA 4-2. Valores de referencia de los recuentos celulares
Eritrocitos (X1012/1) Leucocitos (X109/!) Plaquetas (X109/1)

Recién nacidos 4,7-6,3 9-30 150-400
Niños (2-12 años) 4-5,3 5-14 200-450
Adultos jóvenes (12-18 años):
- Hombres 4,5-5,3 4,5-11 130-360
- Mujeres 4,1-5,1 4,2-11 170-380
Adultos (18-50 años):
- Hombres 4,6-5,9 4,1-11 143-390
- Mujeres 4,1-5,2 3,9-11 160-420
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CUADRO 4-2. Causas de poliglobulia (eritrocitosis)
Primaria (eritropoyetina normal o disminuida)

• Policitemia vera
Secundaria (aumento de eritropoyetina)
• Con oxigenación hística disminuida:
• Grandes alturas
• Enfermedad pulmonar crónica
• Shunt cardiovascular derecha-izquierda
• Hemoglobinopatías con afinidad aumentada por el oxígeno
• Carboxihemoglobinemia (eritrocitosis del fumador)
• Disminución del 2,3-DPG eritrocitario
• Con oxigenación hística normal:
• Tumores productores de eritropoyetina u otros factores eritropoyéticos: carcinoma de
células renales, carcinoma hepatocelular, hemangioblastoma cerebeloso, leiomioma
uterino, carcinoma de ovario y feocromocitoma
• Enfermedades renales: quistes, hidronefrosis, síndrome de Bartter, trasplante renal,
síndrome nefrótico y hemodiálisis crónica
• Hipersecreción corticosuprarrenal: andrógenos exógenos
• Poliglobulia relativa
• Síndrome de Gaisbóck (eritrocitosis espuria o de estrés)
2,3-DPG, 2,3-difosfoglicerato.
La disminución de la concentración de leucocitos se denomina leucopenia, y en caso

de insuficiencia medular grave (aplasia medular) se acompaña prácticamente siempre de
anemia y plaquetopenia (pancitopenia). La leucopenia afecta siempre la totalidad de los
leucocitos circulantes, en especial los más abundantes, como por ejemplo los granulo
citos y los linfocitos. La disminución selectiva de granulocitos neutrófilos se denomina
agranulocitosis y la de linfocitos, linfopenia. Las causas más importantes de estos tras
tornos se detallan en el capítulo 8.
Las razones más im p o rtan tes de la aparición de leucopenia se resum en en el
cuadro 4-4. Debe descartarse que una leucopenia aislada de evolución prolongada
pueda ser el prim er signo de una enfermedad hematológica grave (leucemia aguda,
linfoma o anemia refractaria) (v. también capítulo 3, «Disminución de una subpoblación
determinada de leucocitos», pág. 82).
El aum ento de la concentración de las plaquetas se denom ina trombocitosis. Las
causas más importantes de la misma se refieren en el cuadro 4-5. La disminución de la
concentración de plaquetas se conoce como trombocitopenia. Sus principales causas se
refieren en el cuadro 4-6.
RECUENTO MANUAL DE RETICULOCITOS

Consiste en contar los reticulocitos m ediante el microscopio óptico convencional
después de incubar la sangre en presencia de un colorante no fijador (supravital) que
precipita el ARN y da lugar a una imagen reticulada de color violeta m uy caracterís
tica (fig. 4-6), que no ha de confundirse con otros precipitados intraeritrocitarios.
Este procedim iento de recuento m anual constituye el m étodo de referencia interna
cional para el recuento de reticulocitos recom endado p or el International Council
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CUADRO 4-3. Principales causas de leucocitosis

• Fisiológicas
• Ejercicio físico intenso
• Embarazo
• Recién nacidos
• Digestión
• Infecciones agudas y crónicas
• Síndrome leucoeritroblástico: neumonía, meningitis, difteria, tuberculosis
• Linfocitosis: mononucleosis infecciosa, linfocitosis asociada a enfermedades virales,
tuberculosis
• Intoxicaciones, eclampsia, quemaduras profundas, intoxicación por mercuriales
• Enfermedades malignas
• Neoplasias con metástasis óseas, mieloma múltiple, mielofibrosis, enfermedad de
Hodgkin, leucemias
• Hemorragia aguda
• Otras
• Estrés nervioso, ingesta de corticoides
• Falsas leucocitosis por errores de recuento electrónico
• Lisis de eritrocitos insuficiente o incompleta
• Presencia de eritroblastos circulantes
• Trombocitosis
• Presencia de una hemoglobinopatía inestable
• Presencia de megatrombocitos (plaquetas gigantes)
• Presencia de agregados plaquetarios
• Hiperfibrinogenemia
• Hiperlipidemia
• Parásitos circulantes (malaria o paludismo)
• Heparina
• Mucina circulante
• Crioglobulinemia
for Standardization in H aem atology (ICSH) y el National Committee for Clinical

Laboratory Standards.
M aterial
• Sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA-K2 (1,5 m g/m l).
• Microscopio óptico con ocular de Miller. El ocular de Miller lleva grabado un doble
recuadro (disco de Miller), que está constituido p or dos campos cuadrangulares
(concéntricos); el área del mayor es 10 veces la del pequeño (fig. 4-7). Si no se dis
pone de este tipo de ocular, se puede colocar una pieza de papel negro y rígido en el
ocular del microscopio, con un orificio de 5 mm de diámetro.
• Balanzas.
• Pipeta Pasteur.
• Portaobjetos de 25 X 75 mm.
• Tubo de ensayo (75 X 10 mm).
• Solución colorante.
Se puede utilizar cualquiera de los colorantes vitales conocidos: azur B (CI 52010),
azul de cresilo brillante (ACB; CI51010) o azul de metileno nuevo (AMN; CI2030),
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CUADRO 4-4. P rincipales causas de leucopenia
• Ciertas infecciones no leucocitósicas

• Bacterianas: fiebre tifoidea, brucelosis
• Virales: Influenza, hepatitis infecciosa, rubéola
• Infecciones generalizadas muy graves
• Tuberculosis miliar diseminada, septicemia
• Sustancias químicas o agentes físicos (hipoplasia y aplasia medular)
• Radiaciones ionizantes
• Benceno y derivados
• Citostáticos
• Medicamentos (aminopirinas, fenotiacina, sulfamidas, anticonvulsivos,
tranquilizantes, antihistamínicos)
• Enfermedades hematológicas o sistémicas
• Insuficiencia medular idiopática o secundaria (leucemia aguda, metástasis neoplásica)
• Utilización o destrucción excesiva de leucocitos (cirrosis hepática con esplenomegalia,
lupus eritematoso, enfermedad de Gaucher)
• Alcoholismo crónico y caquexia
• Shock anafiláctico
• Leucopenia congénita
• Falsas leucopenias por errores de recuento electrónico
• Lisis celular: espécimen envejecido, linfocitosis tipo leucemia linfoide crónica,
leucemia, administración de inmunosupresores y uremia
• Agregados celulares: presencia de autoanticuerpos y presencia de mucina circulante
CUADRO 4-5. Principales causas de trombocitosis
Mecanismo primario
• Trombocitopenia esencial
• Leucemia mieloide crónica
• Mielofibrosis idiopática (en su etapa inicial)
• Síndromes mielodisplásicos (síndrome 5q- y anemia refractaria sideroblástica)
• Leucemia megacariocítica aguda
• Síndrome mieloproliferativo asociado a síndrome de Down
Mecanismo secundario
• Infecciones
• Inflamaciones crónicas
• Hemorragia
• Traumatismos y cirugía extensa
• Enfermedades malignas
• Ferropenia y anemia ferropénica
• Recuperación en el tratamiento del alcoholismo crónico
• Tratamiento de una anemia megaloblástica
• Anemia hemolítica intensa
• Administración de adrenalina
• Administración de alcaloides de la vinca
• Prematuridad y déficit de vitamina E
• Hiperostosis cortical infantil
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CUADRO 4-6. Principales causas de trom bocitopenia
D is m in u c ió n d e la p r o d u c c ió n d e p la q u e ta s
Congénitas
• A nom alía de M ay-Hegglin
• Síndrom e de B ernard-Soulier
• Síndrom e de Epstein-Barr (trom bocitopenia, sordera e insuficiencia renal)
• O tras trom bocitopenias congénitas con o sin m egatrom bocitos
• Hipoplasia m egacariocítica
• A nem ia de Fanconi
Adquiridas
• Efecto de m edicam entos
• M ielodisplasia
• Ferropenia intensa
• Infección por Parvovirus B19 (infrecuente)
• A dm inistración de tiazida
• Tratam iento con interferón
• H em oglobinuria paroxística n o ctu rn a
• T rom bocitopenia am egacariocítica adquirida
A u m e n to d e la d e s tru c c ió n p e rifé ric a d e p la q u e ta s
Mecanismo inmunitario
• C ongénito
• T rom bocitopenia aloinm une del recién nacido
• T rom bocitopenia inm une pasiva del recién nacido
• H ipersensibilidad m aterna m edicam entosa
• Adquirido
• M ecanism o autoinm une
• P ú rp u ra trom bocitopénica a u to in m u n e p rim aria
• P ú rp u ra trom bocitopénica a u to in m u n e asociada al lupus eritem atoso sistémico,
artritis reum atoide, LLC, linfom as y enferm edad de H odgkin, sarcoidosis
• T rom bocitopenia inm unom edicam entosa
• T rom bocitopenia postinfecciosa (rubéola, virus y vacunas)
• T rom bocitopenia asociada a virus de la inm unodeficiencia h um ana
• P ú rp u ra trom bocitopénica postransfusional
• P ú rp u ra anafiláctica
Mecanismo no inmunitario
• C ongénito
• Síndrom e de S chulm an-U pshaw
• Adquirido
• Coagulación intravascular disem inada
• P ú rp u ra trom bótica trom bocitopénica
• Infecciones víricas
M u ltifa c to ria l
Congénito
• Síndrom e de W iskott-Aldrich
• Síndrom e de las plaquetas grises
• A nom alía de C hédiak-H igashi
• Disgenesia trom bocitopénica cíclica
• M acrotrom bocitosis m editerránea
Adquirido
• Alcoholismo
• H eparina
• Enferm edad de Graves
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FIGURA 4-6. Recuento manual de

reticulocitos.
aunque el método de referencia (ICSH) recomienda el AMN. Se prepara del siguiente

modo:
• Colorante vital (AMN, ACB o azur B): 1 g.
• Solución salina citratada: 100 mi.
• Citrato trisódico 30 g/1 (1 vol.).
• Cloruro sódico 9 g/1 (4 vol.).
• Se mezcla y se filtra.
M étodo
1. M ediante la pipeta Pasteur se añade al tubo de ensayo dos gotas de solución
colorante y dos gotas de sangre. En caso de valores de hematocrito muy bajos, se
añade cuatro gotas de sangre.
FIGURA 4-7. Trazado de un ocular

de Miller.
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2. Se agita suavemente la suspensión sangre/colorante y se deja incubar a 37 °C

durante 15-20 min.
3. Se resuspenden las células y se realiza u na extensión sobre un portaobjetos. Se
deja secar (como mínimo 30 min) y se observa al microscopio. No es necesario
fijar ni contrateñir.
4. Recuento:
(a) Mediante el objetivo de inm ersión se busca, en prim er lugar, el área más
adecuada correspondiente a la zona de la extensión, donde los eritrocitos se
hallan bien distribuidos e individualizados.
(b) Se analiza un mínimo de 1.000 eritrocitos y se anota el número de reticulocitos
presentes.
(c) Si se utiliza un objetivo de Miller, el recuento se efectúa contando los eri
trocitos situados sobre el recuadro pequeño (incluidos los reticulocitos) y
los reticulocitos del recuadro grande (incluyendo los del recuadro pequeño).
Se prosigue de este m odo hasta llegar a observar 100 células en el cuadro
pequeño. Cuando la distribución de los eritrocitos es uniforme, la relación
entre el núm ero de células situadas en el recuadro grande y el pequeño es de
aproximadamente nueve.
(d) Cálculo del resultado: el porcentaje de reticulocitos corresponde al n ú
m ero de reticulocitos observados en 2.000 eritrocitos contados. Es de
cir, que si después de analizar 2.000 eritrocitos el núm ero de reticulocitos
observados es de 10, el valor del recuento porcentual será de 5 por 1.000
o 0,5 p or 100 (0,5%). Si se conoce el núm ero de hematíes (4,5 X 1012/1)
puede obtenerse el valor absoluto de la concentración de reticulocitos
p o r litro de sangre (San-Reticulocitos; c. núm ) multiplicando el número
de hematíes (4,5) por el número de reticulocitos contados en 1.000 hematíes (5):
Reticulocitos (109/1) = 4 ,5 x 5 = 22,5 x l0 9/l.
(e) Factores de corrección: cuando el valor del recuento se expresa únicamente en

%, debe aplicarse un factor de corrección, ya que su interpretación depende de
la concentración de hematíes. Este factor de corrección se denomina índice
de reticulocitos corregido (IRC) y se calcula de acuerdo con el valor hematocrito.
IRC = Recuento de reticulocitos (% )x Hematocrito (paciente)/Hematocrito normal (0,45)
Ejemplo:
Reticulocitos paciente = 2,5%
Hematocrito del paciente = 0,25%
Hematocrito normal = 0,45
IRC = 2,5 X 0,25/0,45 = 1,3 (referencia: 0,5 a 1,5)
En caso de anem ia m uy intensa, el núm ero de reticulocitos circulantes no ex
presa la intensidad de la regeneración eritroblástica porque, debido al estímulo de la
eritropoyesis p o r la eritropoyetina, salen a sangre periférica más reticulocitos de lo
normal (desviación reticulocitaria o fenómeno shift). Debido a ello, los reticulocitos
m aduran durante más tiem po en la periferia que en la m édula ósea y, aparentemente,
su recuento es superior al que corresponde a la intensidad de la anemia. Este fenómeno
se caracteriza p o r la aparición de eritrocitos de gran tam año y tonalidad azulada
cuando se observa un frotis de sangre teñido con MGG (fig. 4-8). Para corregir el error
debido a la desviación reticulocitaria se debe aplicar un factor de corrección (F) que
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FIGURA 4-8. Frotis de sangre

teñido con MGG en que se observan
eritrocitos de gran tamaño y tonalidad
azulada.
corresponda al período de m aduración reticulocitaria (días) de valor inversamente

proporcional al hematocrito, y se calcula el llamado índice de producción reticulocitaria
(IPR) (tabla 4-3).
Para calcular el IPR puede partirse del IRC aplicando la fórmula IPR = IRC/factor.
Ejemplo:
IRC = 1,3
Factor (F) = 2 días
IPR = 1,3/2 = 0,65 (referencia: 2-3)
El IPR también puede calcularse a partir de la cifra absoluta de reticulocitos aplicando
la fórmula siguiente:
IPR = (Reticulocitos paciente [xl09/l] / Reticulocitos basales [xl09/l)]/F
Ejemplo:
Hematocrito = 0,25
Reticulocitos paciente = 70 X 109/1
Reticulocitos basales* = 50 X 109/1
Factor (F) = 2 días
IPR = (70/50)/2 = 0,7 (referencia: 2-3)
TABLA 4-3. Corrección de la desviación reticulocitaria (IPR)
Hematocrito (1/1) Factor (días)
* El valor basal de reticulocitos se obtiene considerando que u n sujeto normal, en condiciones basales, produce diariamente
un núm ero de reticulocitos que equivale al 1% de la concentración total de eritrocitos (5 X 10l2/l, aproximadamente), es
decir, 50 X 1071.
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TABLA 4-4. Valores de referencia y variaciones patológicas de la concentración

de reticulocitos en sangre (San-Reticulocitos; c. núm.)
Valor relativo (%) Valor absoluto (X lO V l)

Recién nacido (sangre del 3,2-6 110-330
cordón)
Niños y adultos jóvenes 0,2-2,2 25-89
(4-19 años)
Adultos (20-50 años):
- Hombres 0,5-2,8 32-97
- Mujeres 0,2-2,5 25-86
VARIACIONES PATOLÓGICAS
Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia)
• Aplasia medular
• Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica)
• Anemias diseritropoyéticas (adquiridas y congénitas)
• Anemias inflamatorias
AUMENTO DE LA CIFRA DE RETICULOCITOS (RETICULOCITOSIS)
Período neonatal
• Embarazo
• Anemias hemolíticas
• Anemias posthemorrágicas
• Anemias carenciales en fase inicial de tratamiento
• Mieloptisis (infiltración neoplásica de la médula ósea)
• Mielofibrosis idiopática
Cuando el valor IPR es de 3 o superior, significa que la actividad eritropoyética

medular se halla aum entada (anemia regenerativa), m ientras que si es inferior a 2
significa que está disminuida (anemia arregenerativa).

Los valores de referencia de la concentración de reticulocitos en sangre (San-Reticulo-
citos; c) y sus posibles causas de variación están indicados en la tabla 4-4.
Al practicar el recuento de reticulocitos debe prestarse especial atención a la posible
presencia de inclusiones intraeritrocitarias de diversa índole, diferentes a la del material
reticulado propio del ARN (cuadro 4-7): cuerpos de Pappenheimer, cuerpos de Howell-
Jolly (restos de ADN), cuerpos de Heinz (precipitados de hemoglobina desnaturalizada
en caso de hemoglobinopatía inestable o déficit de G6PD). Una forma especial de cuerpos
CUADRO 4-7. Causas de error en el recuento visual de reticulocitos

• Relación sangre/colorante insuficiente (anemia intensa)
• Realizar el recuento sobre un mínimo reducido de eritrocitos
• Realizar el recuento en áreas donde los eritrocitos se hallan mal distribuidos o mal
individualizados
• Confundir los precipitados de ARN con cuerpos de Heinz, cuerpos de Howell-Jolly,
cuerpos de Pappenheimer o precipitados del propio colorante
• En caso de esplenectomía, confundir las inclusiones intraeritrocitarias con reticulocitos
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FIGURA 4-9. Cuerpos de Heinz espontáneos en un caso de hemoglobinopatía inestable. Obsérvese su

aspecto único y de localización excéntrica (ACB, X 1.000).
de Heinz son los precipitados de H bH propios de la a-talasem ia que se distinguen

fácilmente de los de ARN por su forma redonda y disposición característica (fig. 4-9).
El recuento visual de reticulocitos presenta diversos inconvenientes que explican la
variabilidad de los resultados y, por tanto, la escasa fiabilidad del método, especialmente
para valores bajos:
• La propia definición de lo que es un reticulocito basada en un concepto esencialmente
morfológico.
• La variable calidad de los colorantes vitales habitualmente utilizados.
• El error estadístico debido al pequeño tam año de la m uestra analizada y a la dis
tribución irregular de las células sobre el portaobjetos, que puede reducirse mediante
empleo del retículo de Miller.
• La forma de expresar los resultados.
Clinical and Laboratory Standards Institute and International Council for Standardization in
Haematology. M ethods for the reticulocyte counting (automated blood cell counters, flow
cytometry and supravital dyes): Approved Guideline. 2.a ed. Docum ent H44-A2. Vol. 24(8).
Wayne PA: CLSI; 2004.
International Council for Standardization in Haematology. Proposed reference m ethod for
reticulocyte counting based on the determination o f the reticulocyte to red cell ratio. Clin Lab
Haematol 1998;20:77-9.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 4 Métodos para e l recuento manual de las célu las sanguíneas 1 2 4 .e l
A utoevaluación
1. ¿Qué es un hemograma?
(a) La concentración de leucocitos, hematíes y plaquetas.
(b) La medida de la concentración de hemoglobina.
(c) El recuento diferencial de leucocitos.
(d) El hematocrito y los índices eritrocitarios.
Respuesta razonada: hasta bien entrada la década de los sesenta, el hemograma de Schilling, o fór
mula leucocitaria, se complementaba con el recuento m anual de las células sanguíneas mediante
cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro, pero a partir de 1970, con la introducción de los sis
temas automatizados para realizar el perfil hematológico básico, los conceptos de «hemograma»
y «fórmula leucocitaria» sufrieron un cambio radical. Fue en la década de los ochenta cuando el
uso generalizado de los analizadores hematológicos automatizados introdujo la denominación
de hemograma para referirse al recuento celular de hematíes y leucocitos, la concentración de
hemoglobina y los llamados índices eritrocitarios (VCM, HCM y CM HC). Poco después los
equipos introdujeron también la fórmula leucocitaria a 3 poblaciones y 5 poblaciones. De esta
forma, gracias a la automatización, el hemograma (automatizado) entró a formar parte de las
pruebas incluidas en el protocolo de admisión de pacientes y a realizarse de forma sistemática,
para un simple recuento de leucocitos o para conocer la concentración de hemoglobina.
2. ¿Qué alteración de la sangre puede falsear el recuento de leucocitos como para requerir aplicar
un factor de corrección?
(a) Los aglomerados de plaquetas.
(b) La presencia de eritroblastos circulantes.
(c) La macrocitosis.
(d) La leucemia mieloide crónica.
(e) La leucemia linfática crónica.
Respuesta razonada: los eritroblastos no se encuentran normalmente circulando por la sangre,
pero pueden hacerlo en el curso de intensos estímulos de la eritropoyesis (anemias hemolíticas),
de ciertos síndromes mieloproliferativos o en caso de metástasis neoplásica de la m édula ósea
(mieloptisis). Al poseer núcleo y no ser destruidos por el líquido de Turk, son contados como
leucocitos, pudiendo falsear su recuento. Por ello, se ha de aplicar u n factor de corrección.
Para esto se examina la extensión de sangre, se calcula el núm ero de eritroblastos por cada 100
leucocitos (n.° de eritroblastos) y se aplica la fórmula siguiente:
N.° de eritroblastos 9
Eritroblastos/1 = -------------------------------- x leucocitos (x 10/1)
N.° de eritroblastos +100
Leucocitos corregidos = leucocitos (x 109/1) - eritroblastos/1
3. ¿Qué es lo que define la poliglobulia o eritrocitosis?

(a) El aumento del núm ero de eritrocitos o hematíes.
(b) El aumento de la concentración de hemoglobina.
(c) El aumento del volumen corpuscular medio (VCM).
(d) El aumento de la concentración de todas las células de la sangre.
Respuesta razonada: un aumento de la concentración de eritrocitos con contenido hemoglobínico
normal suele acompañarse de un aumento de la concentración de hemoglobina, y se conoce como
poliglobulia o eritrocitosis. Cuando el aumento de la concentración de eritrocitos se acompaña
de una dism inución del contenido hem oglobínico no hay aum ento de la concentración de
hemoglobina y, por ello, existe una falsa poliglobulia o seudopoliglobulia. La seudopoliglobulia
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es la alteración sanguínea característica de la talasemia, en la que el aum ento del núm ero de
eritrocitos puede acompañarse de anemia (seudopoliglobulia microcítica).
4. ¿Cuál es la causa más importante de leucopenia?
(a) La neutropenia.
(b) La linfopenia.
(c) La infección por el HIV.
(d) La insuficiencia hepática.
Respuesta razonada: la disminución de la concentración de leucocitos se denomina leucopenia
y, en caso de insuficiencia medular grave (aplasia medular), se acompaña prácticamente siempre
de anemia y plaquetopenia (pancitopenia). La leucopenia afecta siempre a la totalidad de los
leucocitos circulantes, en especial a los más abundantes, como, por ejemplo, los granulocitos y
linfocitos. La disminución selectiva de granulocitos neutrófilos se denomina granulopenia, y la
de linfocitos linfopenia. Casi siempre una neutropenia obedece a una granulopenia.
5. Los reticulocitos son hematíes jóvenes cuyo método de recuento m anual se basa en:
(a) Que poseen mitocondrias.
(b) Que poseen restos de cromatina nuclear.
(c) Que poseen ribosomas (ARN).
(d) Que poseen núcleo.
(e) Que se tiñen con colorantes panópticos.
Respuesta razonada: el recuento m anual de reticulocitos consiste en contarlos m ediante el
microscopio óptico convencional después de incubar la sangre en presencia de un colorante no
fijador (supravital), que precipita el ARN y da lugar a una imagen reticulada de color violeta
muy característica. Este procedimiento constituye aún el m étodo de referencia internacional
para el recuento de reticulocitos recomendado por el International Council for Standardization
in Haematology (ICSH) y el National Committee for Clinical Laboratory Standards de EE. UU.
6. En caso de anemia intensa, el color azulado de algunos eritrocitos (policromasia) obedece a:
(a) El incremento de la síntesis hemoglobinita debido al estrés eritropoyético.
(b) La salida de la medula ósea de un gran núm ero de reticulocitos muy inmaduros.
(c) El aumento de producción de ARN por los eritrocitos en la anemia.
(d) Un artefacto de tinción cuando se utiliza MGG en casos de anemia grave.
(e) La presencia de un mayor núm ero de macrocitos.
Respuesta razonada: en caso de anemia m uy intensa, el núm ero de reticulocitos no expresa la
intensidad de la regeneración eritroblástica porque debido al estímulo de la eritropoyesis por
la eritropoyetina, salen m uchos más reticulocitos que en condiciones normales (desviación
reticulocitaria o fenóm eno shift). Debido a ello, los reticulocitos m aduran más tiem po en la
periferia que en la m édula ósea y, aparentemente, su recuento es superior al que corresponde a
la intensidad de la anemia. Este fenómeno se caracteriza por la aparición de eritrocitos de gran
tam año y tonalidad azulada cuando se observa un frotis de sangre teñido con MGG. Para corregir
el error de recuento debido a la desviación reticulocitaria, debe aplicarse un factor de corrección
(F) que corresponde al período de m aduración reticulocitaria (días) de valor inversamente
proporcional al hematocrito, y calcular el llamado índice de producción reticulocitaria (IPR).
7. En una anemia ¿cómo puede conocerse de forma inmediata la capacidad de respuesta de la
médula ósea?
(a) Mediante la medida de la eritropoyetina plasmática.
(b) Mediante la determinación del VCM.
(c) Mediante el recuento de reticulocitos.
(d) Mediante la realización de un aspirado y examen morfológico de la médula ósea.
(e) Mediante la medida de la ferritina plasmática.
Respuesta razonada: el recuento de reticulocitos es siempre una forma indirecta de determinar
la capacidad regenerativa de la m edula ósea. Por tanto, en toda anemia, cuando la m edula ósea
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Capítulo 4 Métodos para e l recuento manual de las célu las sanguíneas 1 2 4 .e3
funciona normalmente, existe una relación directa entre la concentración de hemoglobina y el

núm ero de reticulocitos. Cuando esta relación se pierde, y el núm ero de reticulocitos es inferior
al que debería existir de acuerdo con la intensidad de la anemia, significa que la capacidad
regenerativa de la m édula se halla dism inuida. Es p o r ello que, de acuerdo con el núm ero
de reticulocitos, las anemias se clasifican en regenerativas (con reticulocitos aum entados) y
arregenerativas (con reticulocitos normales o disminuidos).
8. Cuando se desea com probar un recuento autom atizado de plaquetas y no se dispone de
cámara cuentaglóbulos, ¿cuál es el procedimiento de elección?
(a) La microscopía de fluorescencia.
(b) La citometría de flujo.
(c) La observación morfológica simple del frotis.
(d) El recuento de plaquetas en el frotis de sangre m ediante el método de Fonio.
(e) Realizar el recuento automatizado de plaquetas a partir de sangre total nitratada (tubo
de laVSG).
Respuesta razonada: m ediante este procedim iento, la cifra de recuento obtenida es solo un
valor aproxim ado y no puede considerarse com o valor real de concentración de plaquetas en
sangre. N o obstante, su realización sum inistra una inform ación m uy próxim a a la realidad
del núm ero de plaquetas circulantes. El m étodo de Fonio, ju n to a la apreciación plaquetaria
a p a rtir de la observación m orfológica de la extensión de sangre, puede resultar m uy útil
para verificar discordancias entre el recuento de plaquetas autom ático y la realidad clínica
del paciente.
9. El recuento de las células sanguíneas mediante cámara cuentaglóbulos es un procedimiento
aconsejado cuando:
(a) No existe posibilidad de disponer de u n analizador hematológico.
(b) Análisis de líquidos biológicos con finalidad experimental.
(c) Confirm ación de un recuento bajo de plaquetas obtenido m ediante un analizador
hematológico.
(d) Confirmación de una falsa poliglobulia.
(e) Existen muchos eritroblastos circulantes.
Respuesta razonada: el recuento de hematíes y leucocitos en cámara cuentaglóbulos adolece de es
casa exactitud y precisión, por lo que los valores obtenidos son siempre aproximativos. Es por ello
que, si bien en los laboratorios clínicos m odernos este procedimiento ha sido totalmente reem
plazado por analizadores hematológicos, existen situaciones en las que su empleo es obligado:
1. Regiones geográficas donde sea imposible utilizar analizadores.
2. Laboratorios experimentales donde no resulte necesario, ni rentable, adquirir un equipo
de recuento celular electrónico.
3. Laboratorios clínicos que aún utilizan el recuento en cámara para verificar el valor de un
recuento automatizado de plaquetas cuando este resulte excesivamente elevado (falsas
trombocitosis) o disminuido (falsas plaquetopenias).
10. Hoy en día el recuento de las células sanguíneas mediante procedimientos manuales ha sido
totalmente sustituido por métodos automatizados. Ello obedece a que:
(a) Son más fiables y precisos.
(b) Son más económicos.
(c) Requieren m enos conocimientos técnicos.
(d) Son m ucho más rápidos.
Respuesta razonada: todos los m étodos de recuento m anual están som etidos a variables
diversas que pueden influir en mayor o m enor grado sobre los resultados, dism inuyendo su
exactitud y precisión (fiabilidad). Esta variabilidad inherente a los procedimientos manuales
puede constituir una causa de error a la que pueden sum arse otras causas que deben ser
siem pre tenidas en cuenta cuan d o se utiliza u n p rocedim iento de recuento m anual con
finalidades clínicas.
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C A P Í T U L O 5
Métodos para el recuento automatizado

de las células sanguíneas
J. L. Vives Corrons
RESEÑA HISTÓRICA
La automatización ha contribuido decisivamente al aumento de la rapidez y fiabilidad
del recuento de las células sanguíneas, a la vez que ha perm itido obtener u n examen
hematológico básico que incluye todas las magnitudes del hemograma que antiguamente
debían realizarse de forma separada y mediante métodos e instrumental diferentes. Como
se ha comentado en el capítulo anterior, a lo largo de los últimos 30 años, el hemograma
autom atizado, llamado tam bién hemograma estándar o examen hematimétrico, ha
reemplazado por completo los procedimientos de recuento manual, cuya utilidad queda
restringida a situaciones especiales o requerimientos muy concretos. Ello ha sido posible
gracias al enorme progreso de los procedimientos de análisis de células en suspensión
mediante sistemas de flujo continuo (citometría de flujo), a los que se ha sumado, más
recientemente, el elevado potencial de la informática.
Aunque la comercialización de instrumentos para el recuento electrónico de células
sanguíneas no se inició hasta 1956, la autom atización del recuento celular tuvo su
inicio en 1949, cuando Wallace Coulter desarrolló un contador de partículas basado en
el cambio que estas producen al pasar individualmente por un orificio o apertura que
separa dos medios con diferente potencial eléctrico (principio de la resistencia eléctrica
o de la impedancia). Con todo, no fue hasta bien entrada la década de los sesenta en
que los equipos suministraron, de manera sistemática, no solo el recuento celular sino
también el tamaño de los hematíes o volumen corpuscular medio (VCM). El recuento
de plaquetas no se automatizó hasta unos 10 años más tarde. En 1953, Parker y Horst
describieron el prim er analizador autom ático para el recuento celular mediante luz
halógena, previa tinción de las células gracias a un colorante rojo para eritrocitos y azul
para leucocitos. En 1965, Kamentsky introdujo dos nuevos principios para el análisis
automatizado de las células sanguíneas: 1) espectrofotometría, o medida de la absorción
lumínica, y 2) dispersión de luz, o medida multiparamétrica de la luz m onocromática
dispersada por las células individualizadas cuando incide sobre ellas en un campo oscuro
(principio del fondo oscuro).
En 1966 se introdujo el análisis celular mediante cambios en ondas electromagnéticas
de radiofrecuencia (RF); y a partir de 1980, se incorporó la medida de la dispersión de
luz láser a dos ángulos diferentes. De acuerdo con este principio, la intersección
de cada célula con la luz provoca la emisión de una serie de señales luminosas que,
analizadas convenientemente, permiten diferenciar muchas de sus propiedades (tamaño,
granulaciones, complejidad estructural, características del núcleo, entre otras) o su
comportamiento cuando se ponen en contacto con diferentes sustancias o marcadores
(anticuerpos monoclonales, enzimas, colorantes, etc.). La incorporación de sustancias

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fluorescentes, al permitir una mejor relación señal/ruido que los colorantes de absorción,
ha significado una importante mejora en la sensibilidad y precisión de las mediciones.
Entre los años 1972 y 1978, se iniciaron los prim eros intentos para autom atizar
la fórmula leucocitaria mediante el desarrollo de equipos que realizaban un análisis
óptico digitalizado de imágenes a partir de extensiones de sangre en portaobjetos y
teñidas, generalmente con el colorante May-Grünwald/Giemsa (MGG). Tales sistemas
realizaban un recuento diferencial de leucocitos (RDL) siguiendo los mismos criterios
morfológicos del método óptico convencional. Debido a ello, era imprescindible dis
poner, además del equipo propiamente dicho, de un extensor automático para obtener
extensiones con distribución uniforme de las células y de un teñidor automático para
conseguir una coloración homogénea de la extensión de sangre. Tales sistemas realizaban
un recuento de 100 células empleando para ello un tiempo similar al de un observador,
por lo que, si bien fueron considerados útiles para la revisión de patologías o para
fines docentes y/o educacionales, nunca llegaron a introducirse como método para la
realización sistemática de la fórmula leucocitaria como parte integral del hemograma
automatizado. Actualmente, los equipos con estas características son microscopios
altamente sofisticados que incorporan un analizador de imágenes capaz de reconocer
cualquier célula de la sangre o médula ósea y un potente sistema informático (software)
para su procesamiento y clasificación (CellaVision DM 200).
Los primeros recuentos diferenciales de leucocitos a partir del análisis de células en
suspensión se realizaron utilizando el sistema Coulter (impedancia), que proporcionaba
una curva de distribución de los leucocitos de acuerdo con su volumen celular (CDV)
y permitía obtener un RDL elemental formado por una (linfocitos), dos (neutrófilos y
linfocitos) o tres poblaciones (neutrófilos, linfocitos e intermedia). Ejemplos de estos
analizadores fueron diferentes versiones del sistema Coulter (Coulter S, modelos Plus,
STKR) y Sysmex (TOA Sysmex E-4000 y E-5000).
En 1974, Technicon (Tarrytown, EE. UU.) comercializó el prim er analizador hema
tológico automatizado capaz de realizar una fórmula leucocitaria de cinco poblaciones
(neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos), tal y como fue descrita por
vez primera en 1891 por Paul Ehrlich, el padre de la hematología. Este equipo, bautizado
como «autoanalizador Hemalog-D», realizaba la fórmula leucocitaria combinando la
medida del volumen celular y la de determinadas reacciones citoquímicas específicas
de las diferentes poblaciones leucocitarias: actividad peroxidasa (M PO) propia de
neutrófilos y eosinófilos, reacción al azul alcián propia de los basófilos y actividad es
terásica propia de los monocitos. Al igual que el sistema Coulter, que introdujo por vez
primera la impedancia para el análisis automatizado de las células sanguíneas, el sistema
Technicon marcó otro hito en la historia de la automatización al introducir, también
por vez primera, la citoquímica para la realización del RDL. Pese a la rapidez y calidad
del RDL ofrecido por el Hemalog-D (analizaba 10.000 células en cada determinación,
frente a las 100 del método óptico convencional), su precio era excesivamente elevado
para la mayoría de los laboratorios de la época, incluidos los hospitalarios. Este he
cho, sum ado a la natural resistencia del hematólogo a sustituir el m icroscopio por
una «caja negra» que no permitía visualizar la morfología celular (por más novedoso
que fuera el sistema), retrasó hasta principios de los ochenta su im plantación defi
nitiva como método para realizar el RDL equiparable en velocidad y precisión al del
hemograma automatizado. A principios de los noventa, la empresa Technicon dio un
nuevo y definitivo paso al fundir en un mismo equipo el recuento celular y la fórmula
leucocitaria (Technicon, Hemalog H-6000®). Para ello eliminó el canal de las esterasas
(quedó solamente el de las peroxidasas), y se introdujeron mejoras en la identificación de
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Capítulo 5 Métodos para e l recuento autom atizado de las célu las sanguíneas 127
basófilos y neutrófilos «en banda» al incorporar un nuevo canal llamado de lobularidad.

A partir de este m om ento pudo ofrecerse un hemograma completo que en un único
perfil aglutinaba todas las magnitudes de las células sanguíneas, incluyendo el RDL y,
más recientemente, el recuento automatizado de reticulocitos. Aunque en la actualidad
el principio «Technicon» subsiste con gran éxito en los modernos y sofisticados sistemas
ADVIA de Siemens®, ha tenido que competir con el desarrollo de otras tecnologías que
combinan diferentes principios de análisis celular automatizado sobre la base del método
de la impedancia y el empleo de ondas electromagnéticas (tabla 5-1). La realidad es que
todos estos sofisticados analizadores hematológicos automatizados han eliminado los
inconvenientes de los métodos manuales (relacionados con una mayor inexactitud e
imprecisión) y han facilitado la obtención de mucha más información en mucho menos
tiempo, y a un coste también mucho menor.
En resumen, un analizador hematológico automatizado es, hoy en día, un citómetro
de flujo cuya complejidad y prestaciones han ido evolucionando de forma progresiva
a lo largo de los últimos años. Como se ha mencionado, la ventaja de la citometría de
flujo reside en la posibilidad de com binar diferentes procedimientos para el análisis
de células en suspensión, como la impedancia (corriente continua), la dispersión lumí
nica (láser o polarizada), la fluorescencia (F), la radiofrecuencia (RF) o la focalización
hidrodinámica (FH), con o sin tratamiento previo de las mismas, y analizar de forma
rápida y fiable un elevado núm ero de células (de 10.000 a 50.000). Algunos de estos
equipos poseen accesorios que realizan sistemáticamente una extensión y tinción.
TABLA 5-1. Magnitudes del hemograma automatizado y métodos de análisis
Magnitud Coulter Sysmex Abbott Siemens

Leucocitos Impedancia Impedancia/FH Dispersión/ Dispersión láser/FH
impedancia
Eritrocitos (Ers) Impedancia Impedancia/FH Impedancia Dispersión láser/FH
Hemoglobina CianMetaHb Hb-SLS CianMetaHb CianMetaHb
(Hb)
Hematocrito Ers XVCM/10 Altura pulsos Ers X VCM/10 Ers X VCM/10
(Hto)
VCM Histograma Hto/Ers X 10 Histograma Histograma
HCM Hb/Ers X10 Hb/Ers X 10 Hb/Ers X 10 Histograma
CMHC Hb/Hto X100 Hb/Hto X 100 Hb/Hto X 100 Histograma
Plaquetas Impedancia Impedancia/FH Impedancia Dispersión láser
VPM Histograma Histograma Histograma Histograma
RDW (ADE) Histograma Histograma CV del VCM Histograma
PDW (ADP) Histograma Histograma CV del MPV Histograma
Fórmula leucocitaria
- Neutrófilos VSC RF/impedancia MAPSS Dispersión láser/MPO
- Linfocitos ves RF/impedancia MAPSS Dispersión láser/MPO
- Monocitos ves RF/impedancia MAPSS Dispersión láser/MPO
- Eosinófilos VCS Lisis/impedancia MAPSS Dispersión láser/MPO
- Basófilos VCS Lisis/impedancia MAPSS Lisis/dispersión láser
CianMetaHb, cianometahemoglobina; CM HC, concentración m edia de hemoglobina corpuscular; FH, focalización
hidrodinámica; H CM , hemoglobina corpuscular media; MAPSS, tecnología de los equipos Abbott que realiza la separación
de las células mediante dispersión polarizada con múltiples ángulos; PDW, curva de am plitud de distribución plaquetaria
(CAP); RDW, curva de am plitud de distribución eritrocitaria (ADE); VCM, volumen corpuscular medio; VCS, tecnología
de los equipos Coulter que perm ite la clasificación de las células mediante aplicación simultánea de tres tecnologías:
im pedancia para la m edida del volumen (V), radiofrecuencia o conductividad (C) para el análisis de su complejidad
y dispersión de luz o scatter (S) para ambas cosas.
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La posibilidad de incorporar un tratam iento y registro inform atizado de los re

sultados constituye otra gran ventaja, ya que perm ite obtener información adicional
muy completa y detallada, imprescindible como complemento al examen morfológico
convencional del frotis de sangre en el diagnóstico de las enfermedades de la sangre.
El Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH) ha elaborado un
método de referencia para el recuento electrónico normalizado de leucocitos, hematíes
y plaquetas, dejando el recuento en cámara cuentaglóbulos como método recomendado
para el recuento de plaquetas siempre que para ello se sigan las recomendaciones del
propio comité.
FUNDAMENTOS DEL ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE CÉLULAS

SANGUÍNEAS
Son muchos los analizadores hematológicos automatizados existentes en el mercado que
muestran diferentes grados de complejidad y sofisticación, pero para su funcionamiento
utilizan diversos principios de m edida entre los que destacan la corriente eléctrica
(impedancia), las ondas electromagnéticas (radiofrecuencia) o la dispersión de luz.
M étodo de la im pedancia
El m étodo de la impedancia consiste en la m edida de los cambios que producen las
células (partículas no conductoras) suspendidas en un diluyente conductor en la resis
tencia al paso de la corriente continua (CC) de bajo voltaje cuando atraviesan un campo
eléctrico. Este método, introducido p o r Wallace Coulter en 1956 (método Coulter),
continúa siendo el más empleado en la actualidad. El uso de reactivos hemolizantes
permitió también separar los leucocitos y obtener un recuento diferencial leucocitario
de tres poblaciones (granulocitos, linfocitos y células de tam año medio) que fue el
único suministrado durante años por los analizadores hematológicos automatizados
de segunda generación.
Cada vez que u na célula atraviesa u n orificio que separa dos medios con diferente
potencial eléctrico se produce un impulso que es proporcional al volumen del elec
trólito desplazado. La corriente eléctrica, continua y de baja frecuencia, genera una
diferencia de potencial entre un electrodo externo, situado en la cámara de recuento, y
uno interno, alojado en el tubo donde se halla el orificio de apertura. A medida que las
células atraviesan este orificio, se produce una resistencia eléctrica al paso de la corriente
(impedancia) que genera impulsos que son detectados, analizados y registrados por
sensores específicos (fig. 5-1). El número de impulsos generados por unidad de tiempo
corresponde al número de células que atraviesan el orificio de apertura (concentración),
y su amplitud al tamaño de las células (volumen). Hay que tener siempre en cuenta que
no se puede obtener el recuento celular absoluto a menos que se conozca el volumen
preciso de sangre total diluida que atraviesa el orificio capilar durante el ciclo de recuento.
Los datos de los impulsos generados p o r el paso de las células son registrados en
gráficos de distribución de frecuencia, o histogramas de distribución de tamaño, con el
núm ero relativo en el eje Y, y el tamaño (núm ero del canal equivalente al tamaño es
pecífico) en el eje X (fig. 5-2). Cuando se emplea esta metodología, debe tenerse siempre
en cuenta que existen factores electrónicos, o inherentes al sistema de análisis, que pueden
influir en el resultado de la medida. Entre ellos destacan dos fundamentales:
1. Diámetro del orificio de apertura.
2. Coincidencia en el paso de las células a través del orificio.
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FIGU RA 5-1. Esquema de funcionamiento del método de la impedancia.
El d iám etro d el orificio de apertura depende del tamaño de las células a analizar
(eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y viene determinado por el analizador. Así, el diáme
tro del orificio de apertura es m enor para eritrocitos y plaquetas que para leucocitos.
Uno de los problemas que más han interferido en el recuento mediante la impedancia
es el de las variaciones en la permeabilidad del orificio de apertura. Ello significa que
para un correcto registro de los impulsos es fundamental que el orificio de apertura
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se halle siempre en perfecto estado de permeabilidad. Este puede verse alterado por
depósitos de sustancias orgánicas del plasma (proteínas, principalmente) alrededor
del mismo, que disminuyen el diám etro y dan lugar a valores de recuento inferiores
y de VCM superiores a los que correspondería sin este artefacto. Es p or ello que los
analizadores hematológicos automatizados de primera generación (Coulter y Coulter S)
incorporaban un m onitor que perm itía visualizar en todo m om ento ese orificio y
proceder a su limpieza cuando fuera necesario para garantizar su permeabilidad (os-
ciloscopio). Para evitar este inconveniente, los analizadores de segunda generación
incorporaron «circuitos de quemado» (resistencia eléctrica alrededor del orificio de
apertura generador de calor o alto voltaje) o sistemas internos de lavado automático
que solucionaron el problem a. Los analizadores hematológicos autom atizados de
últim a generación ya incorporan sofisticados sistemas de limpieza autocontrolada
con chequeos sistemáticos y periódicos del sistema que incluyen cebado con desobs
trucción de los inyectores y tratam iento de los residuos. Para minimizar aún más este
tipo de artefactos, se han diseñado también mecanismos electrónicos o mecánicos, en
ocasiones muy sofisticados, tales como el barrido posterior de la cámara o la colocación
de un doble transductor.
La co in cid en cia en el p aso de las célu las a través d el orificio de apertura puede
incrementar la intensidad de los impulsos al generar falsos aumentos del VCM (falsas
macrocitosis) y valores de recuento celular falsamente bajos. Este fenómeno suele darse
cuando la concentración de células a analizar es m uy elevada (leucemias mieloides/
linfoides crónicas), o cuando las células tienden a agregarse p o r efecto a inm uno-
globulinas plasmáticas (crioaglutininas). En estos casos el equipo puede no dar ningún
resultado o generar una alarm a característica que obliga a procesar nuevam ente la
muestra, previa dilución o calentamiento durante 30 m in a 37 °C, respectivamente.
Para evitar esta coincidencia de paso, se ha incorporado un sistema de enfoque hi
drodinámico (EH) que obliga a las células a fluir hacia la región sensible del orificio de
apertura con una trayectoria bien definida, estrecha y estable (en hilera). Con ello no
solo se impide que varias células pasen simultáneamente p or el borde del orificio de
apertura, sino también que, una vez atravesado este, retrocedan e interfieran en el paso
de las células que las siguen.
Pese a todo ello, no es infrecuente que pequeñas desviaciones en el funcionamiento
del equipo se traduzcan en alteraciones en el recuento que pueden pasar desapercibidas.
Algunos ejemplos prácticos de estas situaciones son: el «ruido electrónico», generado por
el propio sistema o por otros equipos situados cerca de él; los fallos en el sistema de vacío
o en el m anómetro de presión que impiden una correcta aspiración de la muestra; los
fallos en el EH, o la excesiva rigidez de los eritrocitos. Por ello, el correcto funcionamiento
de estos equipos requiere siempre un control permanente y de calibración por parte del
personal técnico responsable.
M étodo de la radiofrecuencia (conductividad)

La RF o conductividad, es una onda electromagnética de alta frecuencia (onda de radio)
que suele utilizarse asociada a la impedancia. De esta forma, mientras que la impedancia
(resistencia), guarda una relación directa con el volumen celular, la RF (conductividad),
guarda una relación inversa con la densidad de los componentes intracelulares (núcleo,
gránulos, organelas, etc.) de forma que los impulsos de RF disminuyen por efecto de
la relación núcleo-citoplasma, la densidad del núcleo y la granulación del citoplasma.
Aunque los cambios de voltaje (impulsos) detectados mediante impedancia y RF son
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Corriente de radiofrecuencia
registrados simultáneamente, su procesamiento se realiza a través de circuitos diferentes

(fig. 5-3). Ello permite, además del recuento, ofrecer un valor del tamaño celular (volu
men) y una separación de los leucocitos en cinco subpoblaciones: neutrófilos, linfocitos,
monocitos, eosinófilos y basófilos (fórmula leucocitaria).
M étodo de la dispersión lum ínica

Cuando un rayo de luz incide sobre una célula modifica su dirección, pero no su longitud
de onda, lo que da lugar a una dispersión en todas las direcciones del espacio, que me
diante diodos electroópticos o fotomultiplicadores se transforma en impulsos eléctricos
que son procesados convenientemente. La cantidad de luz dispersada es proporcional a
la superficie celular y, por tanto, a su volumen. Los equipos que utilizan el método de la
dispersión lumínica incluyen sistemáticamente el sistema de EH que dirige las células una
a una y «en hilera» hacia un capilar de cuarzo sobre el que incide un haz de luz halógena,
de tungsteno, o láser. La luz láser posee una única longitud de onda (monocromática) de
alta intensidad y escasa diseminación. Al igual que el m étodo de la RF, la dispersión
de luz, además del tamaño celular, analiza diferentes propiedades celulares tales como
la rugosidad de su superficie y los componentes intracitoplásmicos estructurales como,
por ejemplo, la granulación y las características del núcleo. Ello permite diferenciar las
características de las células de la sangre como si de un examen morfológico se tratara.
El método de la dispersión lumínica puede utilizarse individualmente o combinado
con otros pero, hoy en día, constituye el método de elección para la automatización de
la fórmula leucocitaria.
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Los emisores láser más empleados son de helio-neón (atómicos), argón-kriptón

(iónicos) y helio-cadmio (moleculares), aunque más recientemente se han empezado a
introducir los basados en semiconductores (láser diodo).
En general, los analizadores suelen equiparse con varios emisores láser, aunque los
que se usan para el recuento celular utilizan una longitud de onda fija (casi siempre de
488 nm ). Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz láser, se produce una
interrupción del paso de fotones o «sombra», que se proyecta sobre un fotomultiplicador
de cam po oscuro, y una dispersión en todas direcciones con ángulos de desviación
diferentes en función de la densidad y el tam año de la misma que, mediante sensores
(fotoelectrodos), se transform a en señal eléctrica. La luz dispersada p o r las células
sanguíneas puede ser de tres tipos: a) difracción o cambio de sentido por efecto de la
superficie celular; b) refracción o cambio de velocidad por efecto de la estructura celular,
y c) reflexión o cambio de sentido por efecto de las estructuras opacas. La suma de todos
estos efectos constituye la llamada dispersión lumínica, que es recogida por fotoelectrodos
situados a diferentes ángulos (fig. 5-4):
• Fotomultiplicador que capta las señales de luz dispersada en ángulo recto (90°) o dis
persión lateral (side scatter, SSC). Estas señales son las más débiles y están producidas
por la refracción y reflexión sobre la superficie de las células (rugosidad) y las es
tructuras intracelulares de gran tamaño (núcleo) o mayor complejidad (lobularidad
del núcleo y granulaciones citoplasmáticas).
• Fotodetector que capta las señales de luz dispersada en ángulo pequeño (2 a 3o) o grande
(5 a 15°), conocidas como dispersión frontal (forward scatter, FSC). Ambas formas de
dispersión frontal se correlacionan con el volumen celular y el índice de refracción, o
complejidad de las estructuras celulares, respectivamente. La intensidad de luz dis
persada en ángulo pequeño o a 0o, es directamente proporcional al tamaño de la célula y,
por tanto, al volumen. Al igual que con el método de la impedancia, a partir del número
de veces por unidad de tiempo que se interrum pe el paso de la luz sobre el campo
Cámara de flujo
Fotomultiplicador
Ángulo de 90° (dispersión lateral)
Esquema del recuento celular en los aparatos basados en el método de dispersión de luz
F I G U R A 5 -4 .
(láser). Un fotomultiplicador detecta la luz dispersada a 90° y analiza la composición intracelular, mientras
que un fotodetector recoge la luz dispersada a 5-10° y mide el volumen celular.
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oscuro se calcula también su concentración. Asimismo, la sensibilidad y exactitud de

la lectura dependen de que las células en suspensión fluyan por un espacio central, en
hilera, sin mezclarse con el líquido diluyente dentro de la llamada cámara de flujo. Las
células acceden a ella en pequeños grupos, transportadas por el líquido diluyente (o de
arrastre), y una vez en su interior, mediante el sistema de EH son alineadas de manera
que queden bien centradas en relación con el haz de luz láser para poder ser analizadas
una a una, requisito imprescindible para la correcta definición de cada población celular.
Además, el punto en el que el láser incide sobre las células debe ser siempre el mismo.
La recopilación de las señales electrónicas registradas constituye la inform ación
«primaria» que, mediante procedimientos de digitalización, selección informática del
umbral y cálculos matemáticos y estadísticos, permite obtener los correspondientes datos
analíticos y su representación gráfica, uni-, bi- o multiparamétrica. Estos datos para ser
clínicamente inteligibles pueden ofrecerse de tres formas diferentes (fig. 5-5):
1. Datos numéricos.
2. Histogramas.
3. Citogramas (o escatergramas).
D ato s n u m érico s
00
05
W BC
% #
NE 52,6 3,6
LY 36,7 2,5 Histograma
MO 7,8 0,5
EO 2,5 0,2
BA 0,4 0 RBC
RBC 5,29
HGB 16,2 REL#
H CT 47
MCV 88,8
MCH 30,7
MCHC 34,5
50 100 200 300
RDW 12,5
PLT 179
MPV 8,4
W BC 6,2 10*/pl
NE 4,4 |70,6%]
LY 1,3 [21,2%] WBC Flag
MO 0,2 [2,5%]
RBC Atypical Lymphocytes, Basophilia
EO 0,2 [5,4%]
Blast, Leukocytosis, Neutrophilia,
BA 0 [0,3%]
Monocytosis, Eosinophilia
RBC 5,1 10*/pl
HGB 14,4 g/dl
H CT 42,3 %
WBC Flag
MCV 86,2 fl Erythrocytosis, Anem ia, Anisocytosis,
MCH 28,5 PLT M icrocytosis, Hypochromia
pg
MCHC 33,1 %
RDW 11,5 fl
PLT Flag
PLT 280 10*/pl PLT Clam ps. Thrombocytopenia
PCT 0,15 %
MPV 7,2 fl
PDW 18,5 %
FIGURA 5-5. Datos numéricos e histogramas suministrados por un analizador hematológico automatizado.
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Los d a to s n u m é r ic o s son la representación cuantitativa, em pleando el sistema

internacional (SI) de unidades, de los constituyentes sanguíneos analizados. De esta
forma, el valor de la concentración de eritrocitos, leucocitos y plaquetas se ofrece en
unidades entíticas (c, núm.) por litro de sangre (1).
Los h isto g ra m a s son representaciones gráficas biparam étricas de cada variable
numérica; corresponden a una gráfica de distribución de frecuencias en la que la base
representa la amplitud del intervalo (recuento de eritrocitos, leucocitos o plaquetas) y
la altura, la frecuencia.
Los citogram as son representaciones gráficas multiparamétricas, especialmente útiles
para el RDL ya que ofrecen imágenes tridimensionales de las diferentes subpoblaciones
leucocitarias, desde varios ángulos de incidencia.
En la actualidad, los analizadores hematológicos, incluso los más sencillos, ofrecen
una inform ación m uy completa, que incluye no solo los datos num éricos o valores
cuantitativos de las mediciones, es decir, lo que denominamos recuento, sino también
un conjunto de gráficos (histogramas y eventualmente citogramas) cuya interpretación
puede ser de gran utilidad para conocer m ejor el estado de las células sanguíneas del
paciente.
ANALIZADORES HEMATOLÓGICOS AUTOMATIZADOS

Todos los analizadores hematológicos automatizados existentes en el mercado suministran
un hemograma de calidad, aunque utilizan diferentes principios de análisis, algunos de
forma individualizada y otros, combinada. El interés en conocer ciertos detalles del fun
cionamiento de los analizadores hematológicos automatizados más utilizados actualmente
por el laboratorio clínico reside en la necesidad que tiene el profesional de conocer las
diferentes formas en las que cada uno de ellos procesa las muestras y emite los resultados
que, si bien es la misma en sus aspectos básicos, puede diferir en algunos aspectos cuyo
conocimiento contribuye a la mejor interpretación de los resultados.
Características com unes

Todos los equipos existentes en el mercado tienen componentes básicos comunes, como
son, por ejemplo, los sistemas hidráulico, neumático y eléctrico. El sistema hidráulico
incluye la unidad de aspiración, los dispensadores, los diluyentes, las cámaras de mez
clado, los baños de apertura, el flujo de células y un hemoglobinómetro. El sistema
neumático incluye el mecanismo de vacío y las presiones requeridas para que operen las
válvulas y transporten la muestra a través del sistema hidráulico. El sistema eléctrico con
trola las secuencias operacionales del sistema total, e incluye analizadores electrónicos y
circuitos computarizados para el procesamiento de los datos. Algunos de los analizadores
están equipados con pantallas que m uestran los impulsos eléctricos en tiem po real a
medida que se cuentan las células (osciloscopio). Existe también un sistema de recogida
de datos que recibe la información generada por el analizador e imprime resultados
cuantitativos, los diferentes histogramas y, eventualmente, también los citogramas.
El manejo de la muestras depende del grado de automatización de cada equipo, el
cual puede variar desde el más simple, que requiere realizar las operaciones «paso a
paso», hasta los más sofisticados, que prácticamente lo realizan todo sin requerir apenas
intervención del operador. Estos poseen también un microprocesador con un programa
de gran capacidad para realizar un elevado número de funciones entre las que destacan
las siguientes:
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• Manejo de un elevado número de datos, realización de cálculos, gráficos, promedios

dinámicos y almacenamiento de los mismos.
• Realización de autocontroles con chequeo automático de funcionamiento y diagnós
tico de fallos.
• Control interno de calidad (CIC) periódico con revisión automática de los datos.
• Archivo y recuperación de datos del paciente con controles delta-check, y com
probación automática de los resultados de pacientes basados en algoritmos definidos
del usuario.
• Indicación de valores críticos o de emergencia.
• Presentaciones interactivas con el sistema informático del laboratorio (SIL) o del
hospital para perm itir la comprobación separada con acceso aleatorio, e incluso con
un programa informático basado en datos experimentales o de la bibliografía.
• Encendido y apagado automáticos del equipo.
Todos los analizadores generan dos tipos de alarm as o indicadores de posibles
alteraciones de los leucocitos o de la fórm ula leucocitaria: a) las definidas por el
usuario, sobre todo para detectar alteraciones en su distribución como, por ejemplo,
aum ento de eosinófilos (eosinofilia) o dism inución de linfocitos (linfopenia) sobre
la base del recuento en valores absolutos de estas células, y b) las que indica el propio
sistema de lectura del analizador tales como, por ejemplo, alteraciones morfológicas
de leucocitos, hem atíes y plaquetas. Para las prim eras, el usuario establece, a su
criterio, unos «límites de referencia» y program a el equipo para que reconozca las
diferentes m agnitudes como fuera de estos límites. Para las segundas, cada equipo
establece sus propios indicadores de sospecha m orfológica y emite la alarm a bajo
diferentes térm in o s o condiciones. Por ejem plo, algunos equipos señalan como
indicadores sospechosos granulocitos inm aduros, granulocitos en cayado, blastos,
linfocitos atípicos, eritroblastos y agregados de plaquetas. M uchas veces la emisión
de estas alarm as va acom pañada de la indicación sobre la necesidad de revisar la
fórmula leucocitaria m ediante el sistema óptico convencional (examen morfológico
del frotis de sangre teñido).
Características peculiares
Conocer el com portam iento peculiar de algunos de los analizadores hematológicos
automatizados es hoy en día muy importante porque existen diferentes marcas y modelos
que utilizan principios diferentes de análisis, algunos de los cuales aportan innovaciones
metodológicas de gran utilidad como información adicional al informe de resultados.
Tanto para el profesional del laboratorio clínico como para el médico general, conocer
estos aspectos contribuye a comprender mejor el nivel alcanzado por la tecnología actual
para determinar una prueba, en principio tan simple, como es el examen básico de la
sangre o hemograma. Dado que es imposible ofrecer un análisis exhaustivo de todos
sistemas que actualmente existen en el mercado para obtener un hemograma, se han
seleccionado aquí cuatro de ellos que, además de ser los de uso más extendido, ofrecen
características metodológicas innovadoras que han contribuido a la mejora de exactitud
y precisión de los resultados, así como de la automatización y rapidez en la entrega de
los mismos.
Sistemas Coulter (Beckman-Coulter)

Los instrumentos Coulter más actuales generan el hemograma siguiendo el principio
Coulter (impedancia), pero utilizan una tecnología registrada para realizar el recuento
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FIGU RA 5-6. Tecnología VCS que

combina análisis del volumen celular
(V), índice de refracción mediante
conductividad (C) y componentes
intracelulares mediante scatter
o dispersión lumínica (S) para realizar
la fórmula leucocitaria.
diferencial leucocitario o fórm ula leucocitaria conocida como VCS (fig. 5-6). Esta
tecnología perm ite la clasificación de las células com binando la m edida simultánea
del volum en (tam año) m ediante im pedancia con las p articularidades internas y
propiedades de superficie celular medidas mediante conductividad (radiofrecuencia)
y dispersión lumínica (o scatter de la terminología anglosajona). Para ello, los leucocitos
son conducidos a un canal especial donde una vez lisados los eritrocitos, se tratan con
un reactivo estabilizador y se dirigen p o r EH hacia la zona de sensores. El método
singular que se utiliza para la detección de la dispersión lumínica permite la separación
de células con tam año similar, pero características de dispersión diferentes. En cada
muestra pueden analizarse unos 10.000 leucocitos. Recientemente, a esta tecnología
se ha añadido el A ccuCount (citocinética) que combina el principio Coulter con un
sistema de control de la cinética de análisis, con lo que se incrementa la precisión de
los resultados.
Sistemas Sysmex (Sysmex Corporation)

En estos equipos, dos características especiales refuerzan la tecnología de la impedancia:
a) el canal de eritrocitos utiliza una corriente laminada por centrado hidrodinámico y
dirige las células a través del orificio de apertura, lo que reduce aún más la coincidencia
de paso, la distorsión del tam año de las células y su recirculación, y b) los canales de
leucocitos y eritrocitos utilizan los umbrales «flotantes» para diferenciar cada población
celular. Esto permite separar poblaciones celulares sobre la base de las características
de cada m uestra analizada, de m anera que los recuentos celulares presentan impulsos
solo entre niveles autodiscriminatorios generados por la dilución, el volumen celular y
el error de coincidencia de paso. De esta forma se consigue una buena discriminación
de microcitos (VCM < 50 fl) y plaquetas. Los sistemas Sysmex poseen tam bién un
circuito de citofluorometría que mejora la discriminación entre las células sanguíneas
analizadas, permite el recuento directo de eritroblastos y realiza un recuento óptico de
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Situación normal Trombopenia

Plaquetas 250 X 109/l Plaquetas 20 X 109/l
Reticuloplaquetas: 3% Reticuloplaquetas: 13%
FIGU RA 5-7. Identificación y recuento de plaquetas reticuladas o reticuloplaquetas, equivalente a los

reticulocitos de serie roja.
plaquetas con identificación de las llamadas plaquetas reticuladas, plaquetas inmaduras

o reticuloplaquetas. Se trata de una nueva magnitud aportada al hemograma consis
tente en plaquetas jóvenes, de 1 a 2 días, con alto contenido de ARN y que pueden ser
coloreadas mediante un fluorocromo, como la auramina O, y cuantificadas de forma
independiente mediante sistema de dispersión lumínica por láser incorporado a la cuarta
generación de estos equipos (fig. 5-7). La identificación de plaquetas reticuladas es útil
en pacientes con plaquetopenia, ya que su concentración se correlaciona directamente
con la intensidad de regeneración megacariocítica de la médula ósea. Se hallan, por tanto,
aumentadas en la trombocitopenia inmune (PTI) y disminuidas cuando esta obedece a
una insuficiencia medular. También se han descrito aumentadas en otras enfermedades
como la arteriosclerosis y sus complicaciones, incluido el síndrome coronario agudo. Al
igual que los reticulocitos jóvenes, constituyen un indicador de recuperación de la médula
ósea después de un trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH). Finalmente,
los sistemas Sysmex utilizan el reactivo lauril sulfato de sodio (SLS), libre de cianuro,
para medir la concentración de hemoglobina por espectrofotometría (modificación del
método de la cianometahemoglobina).
Sistem as C ELL-D YN (Abbott)

Los recuentos de leucocitos y la fórmula leucocitaria se realizan mediante un sistema
patentado y basado en la dispersión de luz polarizada con múltiples ángulos de detección
(M.A.P.S.S.). La muestra se hace pasar mediante el sistema de EH por el capilar de cuarzo
sobre el que incide una fuente de luz láser de helio-neón polarizada en sentido vertical.
Con el paso de cada célula, la luz se dispersa y la dispersión se mide a cuatro ángulos
diferentes: frontal (0o), para el tamaño celular; lateral (90°), para la lobularidad nuclear;
cónico (10°), para la complejidad celular, y lateral con luz despolarizada (90° D), para
diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitarias: neutrófilos, linfocitos,
monocitos, eosinófilos y basófilos. Se utilizan combinaciones de estas cuatro mediciones.
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Sistemas ADVIA (Siemens)

La fabricación de los ADVIA Hematology System fue iniciada por Bayer C orporation
sobre la base tecnológica de los antiguos equipos Technicon H -l, H-2 y H-3, pero con
sistemas hidráulicos simplificados y m ejorados. Los sistemas ADVIA utilizan cua
tro canales de medición independientes para determ inar el hemograma y la fórm u
la leucocitaria: 1) canal para eritrocitos y plaquetas; 2) canal para la hemoglobina;
3) canal para la mieloperoxidasa (PEROX), y 4) canal para la lobularidad de los basófilos
(BASO). Antes de entrar en sistema de EH, los eritrocitos son sometidos a un proceso
de esfericidad isovolumétrica y el recuento, medida del volumen celular (VC) y concen
tración de hemoglobina corpuscular (HC) se realiza simultáneamente mediante dis
persión de la luz láser a dos intervalos angulares: 2 a 3o para el VC, y 5 a 15° para la HC
(índice de refracción). Esta técnica, denominada de dispersión diferencial, constituye
una patente de los sistemas ADVIA, y permite analizar el VC y la H C de cada hematíe
de forma individualizada e independiente. Su principio reside en la utilización de la
esfericidad isovolumétrica, que elimina la interferencia que las variaciones de concen
tración de HC pueden producir sobre la m edida del VC, como sucede con el sistema
de impedancia. Para el análisis de los datos suministrados por la dispersión diferencial
se utiliza el principio de la teoría de Mié (dispersión de la luz de esferas dieléctricas),
que analiza a dos ángulos diferentes la dispersión de luz que produce cada hematíe para
medir de forma independiente el VC y HC. Con los datos obtenidos de cada hematíe
analizado, se realiza un análisis matemático a partir del cual se obtiene un histograma
para el VCM y o tro para la hem oglobina corpuscular m edia (HCM ), así como un
porcentaje de cada una de las subpoblaciones eritrocitarias. Esto permite obtener lo que
podríamos denominar «fórmula eritrocitaria», ya que es posible conocer el porcentaje
de hematíes hipocromos (HYPO) e hipercromos (HYPER) en sus diferentes variedades
microcítica, macrocítica y normocítica (fig. 5-8). Además, como la CMCH deriva de la
FIGURA 5-8. Análisis de las magnitudes eritrocitarias (VCM y HCM) de forma independiente mediante
dispersión de luz láser y aplicación de la teoría de Mié.
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medición directa e individual de la concentración de hemoglobina individual de cada

célula, las interferencias que puedan producir ciertas alteraciones del plasma (p. ej.,
lipidemia, hiperbilirrubinemia) no afectan a esta medida, a diferencia de los sistemas
que utilizan la colorimetría. Como sistema de CIC, el equipo suministra también el
valor de la CMHC calculada matemáticamente tal y como se realiza con el método de
la impedancia (CCMH).
Este análisis de dispersión bidim ensional se utiliza tam bién para distinguir las
plaquetas de los fragmentos de eritrocitos (esquistocitos) y para el diagnóstico de ciertas
anemias (esferocitosis hereditaria) que cursan con aum ento selectivo de la concen
tración media de la hemoglobina corpuscular (CM HC > 360 g/1). Para realizar el RDL
o fórmula leucocitaria, estos equipos combinan el análisis del tamaño celular mediante
dispersión de luz láser con el citoquímico mediante la incorporación de un canal para
el análisis de la m ieloperoxidasa (PEROX). De esta form a se obtiene u n a fórm ula
leucocitaria de seis poblaciones: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos
y células grandes «no teñidas» o large unstained cells (LUC). En el canal PEROX, los
eritrocitos se lisan y los leucocitos con actividad mieloperoxidasa (MPO) específica de
la serie granulomonocítica se tiñen debido a una reacción citoquímica catalizada por la
MPO, y se produce un precipitado de color pardo. La absorbancia producida por el
precipitado es proporcional a la MPO de la célula, y la dispersión frontal proporcional
a su tam año o VC de form a que com binando todos estos datos se obtiene un his
tograma característico donde cada nube de células ocupa una posición bien diferenciada
(fig. 5-9). Para el recuento de los basófilos se utiliza un canal especial o canal BASO,
donde las células son tratadas con un reactivo que contiene un surfactante no iónico
en una solución ácida. Los basófilos tienen una resistencia particular a la lisis en esta
reacción controlada por la temperatura, mientras que los eritrocitos y las plaquetas se
FIGURA 5-9. Análisis de la población leucocitaria (fórmula leucocitaria) mediante combinación de

reacción peroxidásica (MPO) y tamaño celular (VC).
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FIGU RA 5-10. Canal de basófilos

y neutrófilos no segmentado.
lisan y los restantes leucocitos pierden el citoplasma, quedando su núcleo desnudo. Al

utilizar el mismo canal de eritrocitos y plaquetas, y mediante el sistema de dispersión de
luz frontal a dos ángulos diferentes (2-3° y 5-15°), los basófilos intactos son identificables
por su gran dispersión a 2-3°. Los restantes núcleos se clasifican como mononucleares
(M N), a la izquierda, y como polimorfonucleares (PMN), a la derecha según la dis
persión a 5-15°. Los basófilos quedan comprendidos por encima del umbral horizontal
del citograma y los núcleos desnudos debajo de los basófilos (los PMN a la derecha y
los M N a la izquierda). La ausencia de una separación bien definida entre PMN y MN
indica inmadurez de los PMN y sugiere la existencia de una desviación a la izquierda
(fig. 5-10) que ha de confirmarse mediante el examen morfológico convencional del
frotis. Finalmente, este equipo tiene incorporado el recuento sistemático de reticulocitos
que se describirá en el apartado correspondiente.
SISTEMÁTICA DE TRABAJO
En general, todos los analizadores hematológicos automatizados aspiran un volumen
exacto de sangre total (20-50 |xl, según el equipo) que diluyen automáticamente (1:200
para WBC, 1:40.000 para RBC) en una cámara de mezclado. Esta aspiración la realizan
a partir de un tubo que, de acuerdo con la normativa GLP (buenas prácticas de labora
torio), ha de cumplir el nivel 2 de bioseguridad.
Dado que no existe una garantía absoluta de ausencia de virus (HIV, hepatitis B,
principalmente) y otros agentes infecciosos, la manipulación de las muestras y del ana
lizador hace obligatorio el uso no solo de tubo cerrado para manipular las muestras, sino
también de guantes, para evitar cualquier posible contacto entre la sangre y el operador.
En todo laboratorio de hematología, la elección de un determinado tipo de analizador
constituye siempre una decisión im portante y en ella deben intervenir factores diversos,
entre los que destacan los requerimientos y las necesidades propias del laboratorio. En
centros asistenciales con un elevado número de muestras, es siempre recomendable que
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se puedan constatar in situ las prestaciones del equipo y el cumplimiento de los reque
rimientos que se le exigen de acuerdo con las peculiaridades propias y las necesidades
del centro al cual el laboratorio de hematología da servicio.
Cada analizador tiene su propia sistemática de trabajo, que debe seguirse con riguro
sidad. No obstante, para la utilización de los analizadores hematológicos más sencillos
(semiautomatizados) y asequibles a laboratorios con nivel asistencial mediano (100 a
200 muestras/día), existen un conjunto de recomendaciones simples pero suficientes
para su buen manejo y control.
Puesta en m archa del equipo

1. Se verifica que el nivel de líquido reactivo sea suficiente para realizar la labor de
la jornada.
2. Se pone en marcha el equipo (proceso hidráulico) de acuerdo con el m anual de
procedimientos y se espera a que se complete la carga del programa informático.
3. Se espera a que el sistema realice un autolavado o se realiza manualmente, cebando
primero el equipo con los reactivos y completando el proceso con tres lavados
consecutivos mediante suero fisiológico. Al final de este proceso el recuento de
plaquetas ha de ser inferior a 5 X 109/1 y el de leucocitos inferior a 0,15 X 109/1.
Si no es así debe repetirse el proceso de lavado.
4. Se procesa una muestra de sangre del día anterior (conservada a 4 °C) para com
probar que los resultados (datos cuantitativos e histogramas) se correspondan
con los obtenidos ese día.
5. Se verifica periódicamente (según el equipo) el estado de la calibración, proce
sando dos veces consecutivas una muestra de control comercial (según el equipo)
con valores asignados (mal llamado «calibrador»), después de la puesta a punto
inicial.
6. Se tratan todas las muestras del día y se verifica la estabilidad del sistema a lo
largo de la jornada, procesando una m uestra aleatoria tres veces consecutivas,
al inicio del trabajo y a lo largo del mismo. La muestra control que se intercala
aleatoriamente entre las muestras de los pacientes ha de mantener sus valores con
respecto a los iniciales, a lo largo de toda la jornada.
Calibración
Consiste en corregir las desviaciones que puedan aparecer en el sistema mediante la com
paración de los valores obtenidos con los de una muestra control (v. paso 4 del apartado
anterior). Para ello existen los siguientes procedimientos recomendados por el ICSH:
• Los controles comerciales utilizados para verificar la exactitud de los resultados
obtenidos, es decir, que el resultado obtenido coincida con el indicado en el control.
Son los mal llamados «calibradores», y cada firm a comercial fabrica los corres
pondientes al equipo que representa. En general, tienen un precio elevado y no se
utilizan diariamente.
• Las muestras de pacientes utilizadas para controlar la reproducibilidad (precisión) de
los resultados a lo largo de la jornada laboral.
• Los controles propios preparados de acuerdo con las recomendaciones del ICSH.
Requieren unos procedimientos técnicos de preparación especiales que no se hallan
al alcance de cualquier laboratorio, por lo que son preparados exclusivamente por
centros reconocidos, tales como organizadores de program as para la evaluación
externa de la calidad u otros centros oficiales.
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La calibración depende de cada equipo en particular, pero existen circunstancias en

las que debe realizarse para evitar que los resultados suministrados por el analizador se
sitúen mayoritariamente fuera de rango. Son las siguientes:
• Al inicio de la utilización del equipo.
• Cuando después de cambiar algún componente del sistema hidráulico o de lote de
reactivos, se observe una desviación significativa (2 DE) en los valores de la muestra
control.
• Cuando las desviaciones entre las medias poblacionales (de las muestras procesadas)
y las de las muestras control sean ostensibles.
Antes de realizar la calibración:
1. Se com prueba que las unidades neumática e hidráulica del equipo funcionen
correctamente.
2. Se verifica que el sistema óptico funcione de manera adecuada.
3. Se confirm a que el sistema informático no acumula resultados anteriores que
puedan interferir en el resultado de la calibración. En caso de que sea así deberá
hacerse un borrado inicial de toda esta información.
4. Se procesa el calibrador y se obra de acuerdo con el manual de procedimientos.
Terminada la calibración, debe comprobarse que la desviación estándar (DE) de cada
magnitud calibrada cumpla los siguientes requisitos:
• Leucocitos <0,16.
• Eritrocitos < 0,04.
• Hemoglobina < 1 0 .
• Plaquetas < 8,8.
• VCM < 0 ,7 .
Si una de las magnitudes no cumple estas especificaciones, deben comprobarse los
valores obtenidos calculando un margen de 2 DE.
• Leucocitos: x ± 0,32.
• Eritrocitos: x ± 0,08.
• Hemoglobina: x ± 0,08.
• Plaquetas: x ± 17,6.
• VCM: x ± 1,4.
Si una m uestra presenta valores fuera de estos márgenes, se descarta; pero si son
más de dos las que no cumplen los requisitos debe revisarse el proceso de calibración y
resolver el problema de acuerdo con las instrucciones especificadas en el manual de pro
cedimientos. Una vez resuelto el problema, se aceptan los nuevos factores de calibración
y se comprueba el estado de la misma siguiendo siempre el manual de procedimientos.
C ontrol de calidad
Prácticamente todos los analizadores hematológicos, incluso los más sencillos, llevan
incorporado un sistema de autocontrol que incluye un programa de control interno de la
calidad (CIC), basado en el empleo de estadísticas acumuladas y rutinas de movimiento
promedio de resultados de los pacientes y muestras control. Diariamente, los resultados
se acumulan y procesan estadísticamente de acuerdo con una sistemática estándar (www.
westgard.com) realizada por el propio equipo, de forma que no es nunca necesario que el
operador modifique las condiciones de lectura o rectifique las respuestas de los diferentes
canales para obtener los histogramas (fig. 5-11). Con todo, es interesante que conozca la
forma de poder variarlas, por si alguna vez es necesario; para ello debe recurrir al manual
de procedimientos correspondiente.
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FIGU RA 5-11. Pantallas para el control diario de la calidad de los resultados obtenidos mediante un
analizador hematológico automatizado.
La base de estos sistemas de CIC se fundamenta en la utilización de gráficas control

(Levey-Jennings), las sumas acumulativas (CUSUM) y el algoritmo de Bull que se des
criben en el capítulo 25.
Validación de los resultados

A pesar de los enormes avances que han experim entando los analizadores hem ato
lógicos en los últim os años, algunos de sus resultados conllevan un cierto grado de
incertidumbre, lo que nos obliga a su revisión, comprobación y validación. Gran parte
de esta validación se realiza de form a automática, aplicando para ello unas reglas y
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1 44 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
CUADRO 5-1. Ejemplos de especímenes inadecuados para la realización del hemograma

mediante un analizador hematológico
• Em pleo de u n anticoagulante inadecuado (color del tapón)
• Presencia de m icrocoágulos en la m uestra
• Volum en inadecuado de la m uestra
• M uestra posiblem ente contam inada
criterios preestablecidos en el SIL, lo que perm ite la revisión de un gran núm ero de
resultados en poco tiem po. La validación de los resultados obtenidos m ediante un
analizador hematológico implica el conocimiento de todas las fases que intervienen en
el proceso analítico (preanalítica, analítica y postanalítica), la edad y el sexo del paciente,
la procedencia de la muestra (hospital o ambulatorio) y todas aquellas posibles causas de
variabilidad clínica o biológica (actuales o anteriores); se debe tener siempre en cuenta
la población de referencia a la que pertenece el paciente. Para ello, deben considerarse,
en prim er lugar, dos etapas previas a la inclusión del resultado en el SIL y que se refieren
a la verificación de la idoneidad de las muestras para ser procesadas y la verificación de
la idoneidad de los resultados.
Verificación de la idoneidad de las muestras para ser procesadas

Esta actividad corre a cargo de la persona que recibe los tubos en el laboratorio o del res
ponsable técnico del analizador. En general, consiste en una simple inspección visual del
espécimen para comprobar la posible existencia de factores capaces de alterar el resultado
del análisis (falta de idoneidad), algunas de las cuales se resumen en el cuadro 5- 1. En estos
casos, el espécimen se desecha para el análisis y debe ser reemplazado por una nueva mues
tra. Otras veces, la falta de idoneidad obedece a alteraciones del propio espécimen debidas
a situaciones patológicas que interfieren en el sistema electrónico de lectura. Todo ello ge
nera una dilución inadecuada de la muestra y un error en el resultado de la concentración
de las células, como falsas leucopenias o trombocitopenias (cuadro 5-2). Por ello, siempre
que existe alguna duda sobre la veracidad del recuento electrónico de plaquetas o leucoci
tos debe realizarse un examen de la extensión sanguínea para efectuar la correspondiente
CUADRO 5-2. Causas más frecuentes de interferencia electrónica en la realización

del hemograma automatizado
• Paraproteína (aumentos de la CMHC y HCM)
• Hiperlipidemia (aumentos de la CMHC y HCM)
• Muestra ictérica (bilirrubina > 30 mg/dl) (alteraciones de la Hb)
• Presencia de crioglobulinas (alteraciones de la relación Ers/Hb/VCM)
• Hiperglucemia (glucosa > 300 mg/dl) (aumento del VCM y disminución de la CMHC)
• Poliglobulia (Ers > 8 X 1012/1) (arrastre sobre el recuento siguiente)
• EDTA (seudotrombocitopenia, seudoleucopenia)
• Eritroblastos circulantes (falsa leucocitosis)
• Agregación plaquetaria (seudoleucocitosis)
• Leucocitosis intensa (>100 X 109/1) (arrastre sobre el recuento siguiente, seudobasofilia)
CM H C, concentración m edia de hemoglobina corpuscular; EDTA, ácido etilenodiaminotetraacético;
Ers, concentración de eritrocitos; Hb, hemoglobina; HCM, hemoglobina corpuscular media; VCM, volumen
corpuscular medio.
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comprobación. En condiciones normales, las plaquetas suelen agregarse form ando

cúmulos visibles, siempre que la muestra se haya recogido sin anticoagulante. Como ya
se ha mencionado en el capítulo 3, cuando se emplea sangre con anticoagulante (EDTA),
que es imprescindible para el recuento electrónico, en algunos pacientes, p or causas
desconocidas se producen agregados de plaquetas que constituyen una causa frecuente
de seudoplaquetopenia. En estos casos debe realizarse un examen morfológico del frotis
o un nuevo recuento empleando otro procedimiento automático (sangre recogida con
citrato sódico o tubo de la VSG) o manual (recuento en cámara o método de Fonio).
Verificación de la idoneidad de los resultados

Una vez que se ha completado la fase analítica, es decir, se han procesado las muestras,
es necesario realizar una primera inspección (visual o informática) del resultado al objeto
de comprobar su «credibilidad». Los resultados aberrantes o fuera de rango deben ser
eliminados del proceso de validación por el propio SIL y sometidos a verificación del
resultado. En estos casos deben sospecharse posibles interferencias debidas a la com
posición del plasma o de las propiedades reológicas de las células inducidas por ciertas
enfermedades que, al modificar las condiciones de lectura electrónica pueden facilitar
la aparición de artefactos o lecturas erróneas (cuadro 5-3). Igualmente, los artefactos
pueden ser generados por el propio sistema de análisis e inducir a errores de lectura.
Entre ellos destaca una deficiente aspiración de la muestra (falta de reactivo) o un fallo
de filtración debido a la formación de fibrina (microcoágulos).
El objetivo del profesional que valida los resultados es discernir entre las m ues
tras que hay que revisar y las que no, reduciendo al mínimo las revisiones y los falsos
negativos. De form a general, deben revisarse todos aquellos resultados con alarmas
num éricas o inform ación insuficiente, alarmas morfológicas, valores que excedan
los rangos de revisión preestablecidos, alarmas de funcionamiento propias del equipo,
interferencias, muestras que no cum plan el delta-check y otras. Es por ello que cada
laboratorio debe establecer los criterios de validación del hem ogram a sobre la base
de: 1) rangos de referencia (según sexo y edad); 2) población analizada (oncológica,
ambulatoria, donantes de sangre, etc.); 3) limitaciones del equipo (porcentaje de falsos
positivos y falsos negativos, principalm ente), y 4) límites de tolerancia (valores que
requieren revisión) (tabla 5-2).
Existe un sencillo algoritmo conocido como regla del tres, solo aplicable para valores
de VCM entre 82 a 98 fl (normales), que resulta muy práctico para un control «casero» de
las magnitudes eritrocitarias.
3 X Eritrocitos = Hemoglobina en g/dl (± 3%)
3 X Hemoglobina = Hematocrito en % (± 3%)
CUADRO 5-3. E nferm edades que p u e d e n p ro d u c ir alteraciones e sp u rias

en el h e m o g ra m a o b ten id o m ed ian te u n a n a liz ad o r hem atológico
• Hemoglobinopatía SS
• Hemoglobinopatía CC
• Paludismo
• Eritroblastosis fetal
• Anemias hemolíticas (eritrocitos fragmentados)
• Megatrombocitos (trombocitopenia de May-Hegglin)
CC, homocigoto de HbC; SS, homocigoto de HbS.
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Ejemplo 1 (resultado correcto):
Eritrocitos = 3 X 10 l2/l 3X 3 = 9
Hemoglobina = 9,2 g/dl 3 X 9,2 = 2 7,6
Hematocrito = 2 6 %
Ejemplo 2 (resultado incorrecto):
Eritrocitos = 4 X 10 l2/l 3 X 4 = 12
Hemoglobina = 8,2 g/dl 3 X 8,2 = 24,6
Hematocrito = 3 8 %
La fórmula leucocitaria automatizada constituye, por sí misma, un criterio de validación

importante para verificar la idoneidad de los resultados, siempre que cada laboratorio
establezca sus propios criterios de revisión manual. Ello depende del tipo de analiza
dor empleado de la sensibilidad (comprobada) de sus alarmas y del tipo de muestras
procesadas, es decir, de su procedencia y nivel de patología. Un ejemplo de los criterios
generales de validación mediante RDL en un laboratorio de hematología general donde
se procesan muestras procedentes de hospitalización (adultos y pediatría), ginecología,
oncología y cuidados intensivos, se muestra en la tabla 5-2.
Con las muestras de oncología y hepatología, es el clínico quien decide la conveniencia
o no de realizar un RDL «manual» según el tipo de tratamiento o estadio de la enferme
dad. En las muestras procedentes de cuidados intensivos, se sigue el criterio de realizar
un RDL «manual» cada 48 h según petición supervisada p o r el clínico responsable, y en
las de pediatría suelen realizarse manualmente todos los RDL debido a la presencia de
eritroblastos circulantes. En caso de que se solicite, la realización del RDL «manual»
debe acompañarse, además de un examen morfológico completo de sangre periférica.
Superadas estas fases, el resultado puede acceder al SIL para su validación definitiva.
De hecho, y mediante los sistemas informáticos que ya llevan incorporados los analiza
dores junto al propio SIL, los resultados son sometidos a diversos «filtros» y solo los que
TABLA 5-2. Límites de tolerancia de los recuentos automáticos
Límites de tolerancia
Media DE Alarma Superior Inferior
Leucocitos ( X 1 0 9/1) 7 ,34 0,85 <20 50 0,5
Eritrocitos ( X 1 0 l2/1) 4,46 0,2 < 6 ,5 8,8 1,5
- Hemoglobina (g/1) 131 5 < 10 220 30
- Hematocrito (1/1) 0,38 0 ,27 <28 0,7 0 ,15
- V C M (fl) 8 5,2 4 < 7 0 / > 11 0 120 55
- H C M (p g ) 29,4 1,8 <25 37 20
- C M H C (g/1) 345 29 < 280 400 230
- A D E (% ) 13,5 2 ,1 <24 6
Pía quetas ( X 1 0 9/l) 2 19 30 < 6 0 /> 6 0 0 800 15
- V P M (fl) 8,1 1,2 12 4,5
ADE, am plitud de la curva de distribución eritrocitaria; CMHC, concentración media de hemoglobina corpuscular;
DE, desviación estándar; HCM , hemoglobina corpuscular media; VCM, volumen corpuscular medio; VPM, volumen
plaquetario medio.
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logran superarlos pasan de forma automática a la llamada «firma electrónica». Los res
tantes quedan retenidos y deberán someterse a un proceso de comprobación y validación
personal por parte del facultativo hematólogo responsable. El informe definitivo debe
ser único, comprensivo, con toda la información útil derivada tanto de los resultados
obtenidos por el analizador como de los obtenidos por los métodos alternativos em
pleados, sin que existan resultados contradictorios.
Registro y archivos de datos

Una gran ventaja de los analizadores es que poseen un sistema propio para el archivo
de los resultados que transfieren directamente, vía informática, al SIL o al servidor del
laboratorio para que puedan ser validados, transcritos y entregados. Igualmente, estos
equipos archivan los datos de los controles procesados y sus correspondientes cálculos
estadísticos así como los resultados de las calibraciones diarias, todo lo cual puede ser
fácilmente visualizado en la pantalla. Paralelamente, al final de la jornada puede obtenerse
una copia impresa de todos estos datos correspondientes a control de calidad y calibración.
Las hojas de registro (incluyendo todos los resultados) deben conservarse durante un
período mínimo de 6 meses; el registro de incidencias y el mantenimiento del equipo
deben actualizarse cada día.
CAUSAS DE ERROR DEL RECUENTO AUTOMATIZADO

Al igual que sucede con el recuento mediante cámara cuentaglóbulos, el empleo de méto
dos electrónicos puede verse sometido a grandes errores, si se olvida el control periódico
y el calibrado diario de los instrumentos. En general, el error debido al propio método
de recuento electrónico, cuando este se realiza en óptimas condiciones, suele ser inferior
al 1%, pero puede verse notablem ente incrementado p or las causas que se resumen
en el cuadro 5-4. El recuento de plaquetas puede presentar situaciones especialmente
críticas debido a la posible existencia de falsas trombocitosis o trombocitopenias debidas
a artefactos. Las principales causas de estos errores vienen referidas en el cuadro 5-5.
Por ello, siempre que existe alguna duda sobre la veracidad del recuento electrónico de
plaquetas debe realizarse la correspondiente comprobación.
VERIFICACIÓN DE LA IDONEIDAD DE UN EQUIPO PARA REALIZAR

EL RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
Todo analizador hematológico automatizado tiene que ser capaz de ofrecer un RDL como
parte integral del hemograma. Debe cumplir dos requisitos fundamentales:
1. Reconocer y cuantificar las cinco poblaciones leucocitarias normales (neutrófilos,
linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos) al objeto de detectar posibles alte
raciones en su distribución fisiológica (cálculo de la inexactitud e imprecisión).
2. Identificar la presencia de anomalías morfológicas m ediante alarmas con el
objetivo de detectar la posible presencia de células atípicas o patológicas (cálculo
de la sensibilidad y la especificidad).
Recientemente la FDA ha publicado la segunda versión de una guía (FDA Guidance)
donde se detallan las características técnicas que deben cumplir los analizadores auto
matizados de fórmula leucocitaria para cuantificar las células inmaduras y patológicas.
Estas son, básicamente, las mismas que las citadas, especificando además la necesidad
de cumplir con los requerimientos indispensables de exactitud, precisión, sensibilidad,
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CUADRO 5-4. C ausas d e e rro r al realizar el rec u e n to celular m ed ian te m éto d o s

electrónicos
• Errores de extracción sanguínea o m anipulación del espécim en

• D ilución o hem oconcentración
• Coagulación parcial
• Lisis celular (hemolisis)
• Alteraciones del líquido diluyente
• Uso de u n diluyente incorrecto
• Presencia de partículas extrañas en el líquido diluyente
• Agitación incorrecta del espécim en
• Defectos del sistema electrónico d e recuento
• Lisis incom pleta de eritrocitos e n el canal d e leucocitos
• Presencia de agregados celulares en el orificio de recuento
• O bstrucciones de los capilares u orificios de recuento
• D ilución incorrecta de la m uestra p o r el líquido diluyente
• Presencia de m icroburbujas, que son contadas com o células
• C ontam inación po r arrastre de u n espécim en con el siguiente
• Presencia de interferencias electrónicas y averías en los com ponentes electrónicos
del instrum ento
• Desajustes electrónicos del equipo
• Desajustes en la calibración del equipo
• Alteraciones del plasm a (interferencias)
• Paraproteínas, crioglobulinas, m ucinas, hem oglobinas inestables
• Hiperlipidem ia, hiperfibrinogenem ia, h eparina, hiperglucem ia
• Leucocitosis, trom bocitosis, eritroblastos, m egatrom bocitos
• Agregados plaquetarios (seudotrom bocitopenia)
• Defectos en la lisis eritrocitaria
• U rem ia (T linfocitos e inversión de la fórm ula leucocitaria)
• N eonatos con hem oglobinopatías (HbS, dianocitos)
• Gam m apatías m onoclonales (m ielom a)
• Crioglobulinem ia (T VCM)
HbS, hemoglobina S; VCM, volumen corpuscular medio.
CUADRO 5-5. Causas de error en el recuento electrónico de plaquetas

Falsas trombocitosis
• Hemolisis con fragmentación eritrocitaria (esquistocitosis)
• Microcitosis extrema (VCM < 50 fl)
• Hemoglobinopatía H
• Fragmentación leucocitaria (LLC, SLPC con leucocitosis)
• Paludismo
• Crioglobulinemia
• Bacteriemia
Falsas trombocitopenias
• Coagulación parcial del espécimen (microcoágulos)
• Plaquetas gigantes (megatrombocitos)
• Satelitismo plaquetario
• Agregación espontánea de las plaquetas por el EDTA
EDTA, ácido etilenodiaminotetraacético; LLC, leucemia linfática crónica; SLPC, síndrome linfoproliferativo crónico;
VCM, volumen corpuscular medio.
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especificidad, linealidad y arrastre, todas ellas incluidas en el proceso de evaluación de

los equipos.
Es por ello que se ha de tener en cuenta lo siguiente:
• Al adquirir un analizador de cinco poblaciones que no forme parte de los de uso más
generalizado, es siempre aconsejable realizar una previa evaluación de sus prestaciones
con el fin de com probar su capacidad para reconocer y cuantificar los leucocitos
normales (fiabilidad) y para detectar los especímenes que presentan alteraciones poco
frecuentes (sensibilidad y especificidad). La fiabilidad puede determinarse mediante
dos procedimientos estadísticos complementarios:
• El análisis de regresión lineal (y = a + bx, donde «a» es el punto de intersección
con el eje de ordenadas y «b», la pendiente de la recta) con cálculo del índice de
regresión lineal (r) y su significación estadística (p).
• La prueba de la t de Student para datos apareados destinada a comprobar si las
medias de las diferencias entre pares de observaciones difieren significativamente
de una media hipotética igual a cero.
En general, todos los equipos identifican perfectamente neutrófilos, linfocitos de
pequeño tamaño, eosinófilos, basófilos y monocitos. No obstante, cuando se comparan
con el método de referencia (protocolo H20-A del NCCLS), el índice r es muy bajo
para los basófilos (debido a su escasa cantidad) y, por motivos aún no bien conocidos,
algo bajo también para los monocitos. La evaluación de la sensibilidad y especificidad
puede hacerse empleando el m étodo de Galen y G ambino (1975) que establece una
clasificación de los resultados en verdaderos negativos (VN), verdaderos positivos
(VP), falsos negativos (FN) y falsos positivos (FP), y su posterior cálculo mediante las
ecuaciones del cuadro 5-6.
RECUENTO AUTOMATIZADO DE RETICULOCITOS

Al igual que para el recuento de las células sanguíneas (eritrocitos, leucocitos y plaque
tas), la automatización del recuento de reticulocitos ha significado una extraordinaria
m ejora en la rapidez y fiabilidad de los resultados, ya que ha sustituido el criterio
morfológico, inherente al m étodo óptico, p o r un análisis cuantitativo, objetivo y
muy preciso del contenido en ARN de los hematíes jóvenes o reticulocitos. Además,
un analizador autom atizado para el recuento de reticulocitos proporciona nuevas
CUADRO 5-6. C riterio s p a ra ev alu ar u n a n a liz ad o r de fó rm u la leucocitaria
VP + VN
VP + FP + VN + FN
VP
VPP = ---------- xlOO
VN
VPN= -----------xlOO
VN+FN
EG, eficiencia global: porcentaje global de aciertos tanto en m uestras normales como patológicas; FN, falsos negativos;
FP, falsos positivos; VN, verdaderos negativos; VP, verdaderos positivos; VPN, valor de predicción negativa: porcentaje
de aciertos de las muestras normales; VPP, valor de predicción positiva: porcentaje de aciertos de las muestras
ERRNVPHGLFRVRUJ
Eritrocitos
FIGU RA 5-12. Fundamento de los sistemas de recuento automatizado de reticulocitos.
m agnitudes e índices que pueden ser útiles en el diagnóstico y el tratam iento de las
anemias.
D urante varios años se comercializaron equipos específicamente diseñados para el
recuento automatizado de reticulocitos (Becton Dickinson FACS o Coulter EPICS),
aún asequibles actualmente, pero su uso ha disminuido sensiblemente debido al he
cho de que m uchos de los analizadores hematológicos automatizados de alta gama ya
incorporan la realización sistemática de este recuento En general, todos ellos utilizan
el m ism o principio que el m étodo m anual; es decir, em plean colorantes básicos
supravitales que precipitan el ARN y tiñen el material resultante para que pueda ser
reconocido po r absorción o dispersión lumínica. Entre dichos colorantes destaca la
auramina O, que emite fluorescencia lateral cuando un haz de luz láser de argón incide
sobre las células circulando en flujo laminar (fig. 5-12). Las señales se representan en
un diagrama que correlaciona el tam año celular con la intensidad de la fluorescencia,
obteniéndose u n a im agen que contiene cuatro poblaciones: eritrocitos m aduros
y reticulocitos de baja fluorescencia (LFR), fluorescencia interm edia (MFR) y alta
(HFR) (fig. 5-13).
Lafracción de reticulocitos inmaduros (IRF) es la suma de las poblaciones MFR y HFR
e indica la proporción de reticulocitos inmaduros con respecto al total en una muestra.
Las diferencias entre colorantes, fluorocromos y sistemas de detección empleados por
diferentes analizadores automatizados existentes en el mercado hacen que los resultados
del recuento puedan ser muy variables. Asimismo, como en toda técnica de citometría
de flujo, pueden existir situaciones capaces de interferir en la precisión o exactitud de
los resultados. Estas interferencias dependen en gran medida del fluorocromo empleado
para marcar el ARN e inciden de forma especial en el análisis de las subpoblaciones
reticulocitarias con elevado contenido en ARN (cuadro 5-7). La necesidad de unificar
criterios ha llevado a proponer un procedimiento (Davis, 1993) consistente en establecer
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FIGU RA 5-13. Citograma del recuento automatizado de reticulocitos. H , alto contenido en AR N ,

reticulocitos jóvenes; L, bajo contenido en A R N , reticulocitos maduros; M , contenido intermedio de
A R N , reticulocitos semimaduros.
el grado de maduración de la población reticulocitaria normal (0,2 a 0,4) en función del

valor de la IRF, lo que facilita la detección de pequeñas variaciones de subpoblaciones
reticulocitarias con contenido más variable de ARN y, por tanto, con variable intensidad
de fluorescencia. El conocimiento del grado de maduración de las diferentes subpo
blaciones de reticulocitos permite abordar con precisión el estudio de la eritropoyesis,
especialmente cuando la concentración absoluta de reticulocitos circulantes es normal
o disminuida.
El sistema ADVIA, gracias a la teoría de dispersión de Mié, perm ite medir el volu
men y la concentración de hemoglobina para cada reticulocito individualmente, de
forma que proporciona los siguientes índices: volumen reticulocitario medio (MCVr),
concentración de hemoglobina reticulocitaria media (CHCMr) y contenido de hemo
globina reticulocitaria (CH r). Los valores de MCVr y CHCM r son de escasa utilidad
CUADRO 5-7. Causas de error en el recuento automático de reticulocitos
C o n n a ra n ja d e tia z o l q u e se fija al A R N y A D N (FACScan®)

• Agregados plaquetarios y m icrom egacariocitos circulantes
• Parásitos intraeritrocitarios (paludism o)
• C rioaglutininas
• Eritroblastosis
• A um ento de plaquetas
• M egatrom bocitos (plaquetas gigantes)
• Leucocitosis
• C uerpos de H einz y de H owell-Jolly
• Hem oglobinopatías
C o n a u ra m in a O q u e se fija al A D N (R-3000®)
• Leucocitosis
• Eritroblastosis
• Inclusiones y parásitos intraeritrocitarios
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clínica porque sufren importantes variaciones, pero la CHr, al ser una medida directa de
la concentración de hemoglobina de cada reticulocito, se correlaciona con el porcentaje
de eritrocitos hipocromos (HYPO) y ha demostrado ser de gran valor para el control
y seguimiento de los estados deficitarios en hierro (ferropenia y anemia ferropénica).
Así, valores de C H r m enores a 26 pg constituyen u n signo m uy preciso de estado
ferropénico, es decir, de una inadecuada disponibilidad de hierro para la síntesis de
hemoglobina, lo que hace de la C H r un método m uy útil para el diagnóstico precoz
de ferropenia; incluso mejor que la concentración de ferritina plasmática o el propio
índice de saturación de la transferrina, magnitudes que pueden verse influenciadas
por factores diversos. Además, con cada aum ento unitario del C H r se reduce en un
30 a un 45% la probabilidad de padecer ferropenia o anem ia ferropénica. Debido a
ello, el valor de la C H r se utiliza para evaluar el estado del hierro en niños prematuros
y pacientes sometidos a hemodiálisis, de form a que un valor de C H r inferior a 26 pg
en estos últimos constituye un indicador muy sensible de requerimiento de hierro, y
este valor asciende rápidamente a las 48 h de la administración de hierro endovenosa.
Igualmente, la m edida de la C H r es útil para el seguimiento del tratam iento con eri-
tropoyetina recom binante hum ana (rHuEPO), ya que perm ite controlar y prevenir
la posible aparición de ferropenia como consecuencia del estím ulo eritropoyético
inducido por la rHuEPO, incluso cuando los valores de ferritina plasmática y trans
ferrina se hallen dentro de los límites de referencia.
RECUENTOS AMBULATORIOS
A lo largo de los últimos años, la implantación de nuevos sistemas de asistencia hos
pitalaria y extrahospitalaria menos centralizada como, por ejemplo, las llamadas pruebas
diagnósticas cerca del paciente o p o in t o f care testing (PCT), ha m arcado una cierta
tendencia a favor de los equipos de tamaño y prestaciones más reducidas pero compactos
y adaptados a realizar su trabajo fuera del laboratorio y más cerca de la cabecera del
enfermo. La utilización de estos equipos, más simple que la de los grandes analizadores,
debe cumplir no obstante las mismas premisas de garantía de calidad propias de sus
hermanos mayores:
• La determinación se debe realizar por personal capacitado para el manejo y mante
nimiento del equipo y la vaüdación de los resultados.
• Debe existir una evaluación permanente del correcto funcionamiento.
• Debe existir una sistemática de CIC y de evaluación externa de la calidad.
• Debe existir un control de los suministros y reactivos.
• Debe existir un manual de procedimientos actualizado.
• Debe existir un sistema normalizado para el registro e informe de los resultados.
Briggs C, Carter J, Lee SH, Sandhaus L, Simon-Lopez R, Vives Corrons JL. ICSH Guideline for
worldwide point-of-care testing in haematology with special reference to the complete blood
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CLSIH20-A2: Reference Leukocyte (WBC) Differential C ount (Proportional) and Evaluation o f
Instrumental Methods; Approved Standard. 2.a ed. Recognition N um ber 7-165,2012.
England JM, Rowan RM, Bins M, et al. Recommended m ethods for the visual determination o f white
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leukocytes. Clin Lab Haem at 1994;16:131-8.
International Committee for Standardization in Haematology. The assignment o f values to fresh
blood used for calibrating autom ated blood cell counters. Prepared by the ICSH Expert panel on
Cytometry. Clin Lab Haematol 1988;10:203.
International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on Cytometry and
International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting-American
Journal o f Clinical Pathology 2001;115:460-4.
National Institute o f Health. Centre for Disease Control. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories; 1984.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 5 Métodos para e l recuento autom atizado de las célu las sanguíneas 1 5 3 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuál es el principio de funcionamiento de los analizadores hematológicos automatizados
más utilizados?
(a) Impedancia.
(b) Citoquímica.
(c) Dispersión de luz láser.
(d) Dispersión de luz.
(e) Radiofrecuencia.
Repuesta correcta: a.
Respuesta razonada: los analizadores hematológicos autom atizados existentes en el mercado
muestran diferentes grados de complejidad y sofisticación, pero para su funcionamiento utilizan
diversos principios de medida, entre los que destacan la corriente eléctrica (impedancia) las ondas
electromagnéticas (radiofrecuencia) o la dispersión de luz.
2. ¿Cuál de los siguientes sistemas de funcionamiento es utilizado por todos los analizadores
hematológicos automatizados?
(a) El sistema de análisis colorimétrico.
(b) El sistema de flujo continuo.
(c) El sistema hidráulico.
(d) El sistema lumínico.
(e) El sistema valvular.
Respuesta razonada: todos los analizadores hematológicos automatizados del mercado tienen
componentes básicos comunes, como son los sistemas hidráulico, neumático y eléctrico. El sis
tema hidráulico incluye la unidad de aspiración, los dispensadores, los diluyentes, las cámaras de
mezclado, los baños de apertura, el flujo de células o ambos, y un hemoglobinómetro. El sistema
neumático incluye el mecanismo de vacío y las presiones requeridas para que operen las válvulas y
transporten la muestra a través del sistema hidráulico. El sistema eléctrico controla las secuencias
operacionales del sistema total, e incluye analizadores electrónicos y circuitos computarizados
para el procesamiento de los datos.
3. Cuando un analizador no puede identificar células dentro de los parám etros establecidos
genera un indicador que recibe el nom bre de:
(a) Patología.
(b) Disconformidad.
(c) Alarma.
(d) Revisión.
(e) Repetir análisis.
Respuesta razonada: todos los analizadores generan dos tipos de alarmas o indicadores de posibles
alteraciones de los leucocitos o de la fórmula leucocitaria: a) las definidas por el usuario, sobre
todo para detectar alteraciones en su distribución, como por ejemplo, aum ento de eosinófilos
(eosinofilia) o dism inución de linfocitos (linfopenia) sobre la base del recuento en valores
absolutos de estas células, y b) las que indica el propio sistema de lectura del analizador como,
por ejemplo, alteraciones morfológicas de los leucocitos, hematíes y plaquetas.
4. Los equipos pioneros de la automatización en hematología fueron los diseñados por Wallace
Coulter. ¿Cuál de los siguientes principios de funcionamiento utiliza?
(a) Impedancia.
(b) Radiofrecuencia.
(c) Dispersión lumínica.
(d) Combinación de todos ellos.
(e) Solo la impedancia.
Respuesta razonada: los instrumentos Coulter más actuales generan el hemograma siguiendo
el principio C oulter (im pedancia), pero utilizan una tecnología registrada para realizar el
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recuento diferencial leucocitario o fórm ula leucocitaria conocida como VCS. Esta tecnología
permite la clasificación de las células combinando la medida simultánea de su volumen (tamaño)
mediante impedancia y de sus particularidades internas y propiedades de superficie mediante
conductividad (radiofrecuencia) y scatter o dispersión lumínica.
5. ¿Cuál de los siguientes analizadores hematológicos automatizados utiliza dispersión de luz
polarizada?
(a) Sistemas ADVIA.
(b) Sistemas Cell-Dyn.
(c) Sistemas Coulter.
(d) Sistemas Sysmex.
Respuesta razonada: con el Sistema Cell-Dyn, los recuentos de leucocitos y la fórmula leucocitaria
se realizan m ediante un sistema patentado y basado en la dispersión de luz polarizada con
múltiples ángulos de detección (M.A.RS.S.) La m uestra se hace pasar m ediante el sistema de
EH por el capilar de cuarzo sobre el que incide una fuente de luz láser de helio-neón polarizada
en sentido vertical.
6. ¿Cuál es la condición impuesta por el nivel 2 de bioseguridad para trabajar con analizadores
hematológicos automatizados?
(a) Que los tubos para m antener las muestras sean cerrados.
(b) Que se utilice EDTA como anticoagulante.
(c) Que el personal técnico se lave las manos antes de iniciar el manejo del equipo.
(d) Que se utilice un sistema automático para la distribución de los tubos.
(e) No existe ninguna condición de bioseguridad que deba ser aplicada.
Respuesta razonada: en general, todos los analizadores hematológicos automatizados aspiran
un volumen exacto de sangre total (20-50 p,l) según el equipo, que diluyen automáticamente
(1:200 para WBC, 1:40.000 para RBC) en una cámara de mezclado. Esta aspiración la realizan
a partir de un tubo que ha de cumplir el nivel 2 de bioseguridad. Dado que no existe una garantía
absoluta de ausencia de virus (HIV, hepatitis B, principalmente) y otros agentes infecciosos, la
manipulación de las muestras y del analizador hace obligatorio el uso no solo de tubo cerrado
para m anipular las muestras, sino tam bién de guantes, para evitar todo posible contacto entre
la sangre y el operador.
7. Los llamados «calibradores» generalmente utilizados para la calibración de los analizadores
hematológicos automatizados son:
(a) Muestras de sangre calibradas por el propio laboratorio.
(b) Muestras de pacientes guardadas como calibradores.
(c) Muestras comerciales suministradas por los fabricantes de los equipos.
(d) M uestras de sangre estabilizada sum inistradas p o r los organism os oficiales de es
tandarización.
(e) Muestras de animales que simulan sangre humana.
Respuesta razonada: los procedimientos recomendados por el ICSH para la calibración de los
analizadores hematológicos automatizados son: 1) utilización de controles comerciales para veri
ficar la exactitud de los resultados obtenidos. Cada firma comercial fabrica los correspondientes
al equipo que representa. En general tienen un precio elevado y no se utilizan diariamente;
2) utilización de muestras de pacientes para controlar la reproducibilidad (precisión) de los resul
tados a lo largo de la jornada laboral, y 3) utilización de controles propios preparados de acuerdo
con las recomendaciones del ICSH, que solo están al alcance de de laboratorios especializados.
8. ¿Cuál es la m agnitud hematológica del hemograma que, una vez term inada la calibración,
debe m ostrar la m enor desviación estándar (DS)?
(a) El VCM.
(b) La hemoglobina.
(c) El recuento de eritrocitos.
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Capítulo 5 Métodos para e l recuento autom atizado de las célu las sanguíneas 1 5 3 .e3
(d) El recuento de plaquetas.

(e) El recuento de leucocitos.
Respuesta razonada: term inada la calibración, debe comprobarse que la desviación estándar
(DS) de cada m agnitud calibrada cumpla los siguientes requisitos:
• Leucocitos < 0,16.
• Eritrocitos < 0,04.
Hemoglobina < 1 0 .
Plaquetas < 9.
• V C M < 0,7.
9. ¿Qué aspectos han de ser tenidos en cuenta al realizar la validación de los resultados obtenidos
a partir de un analizador hematológico automatizado?
(a) La información suministrada por la clínica del paciente.
(b) El control de calidad interno del equipo.
(c) Los resultados de la evaluación externa de la calidad.
(d) Las fases del proceso analítico en su totalidad.
(e) El sistema informático del laboratorio (SIL).
Respuesta razonada: a pesar de los enormes avances que han experimentando los analizadores
hematológicos en los últimos años, algunos de sus resultados conllevan un cierto grado de
incertidumbre, lo que nos obliga a su revisión, comprobación y validación. Gran parte de esta
validación se realiza de form a autom ática, aplicando para ello unas reglas y criterios prees
tablecidos en el sistema inform ático del laboratorio (SIL). La validación de los resultados
obtenidos mediante un analizador hematológico implica el conocimiento de todas las fases que
intervienen en el proceso analítico (preanalítica, analítica y postanalítica), de la edad y sexo del
paciente, de la procedencia de la muestra (hospital o ambulatorio) y de todas aquellas posibles
causas de variabilidad clínica o biológica (actuales o anteriores), teniendo siempre en cuenta la
población de referencia a la que pertenece el paciente.
10. ¿Cuál es la causa más frecuente de error en el recuento automatizado de células sanguíneas
que suele pasar desapercibido, incluso utilizando un correcto sistema de control?
(a) La aglutinación espontánea de los hematíes por efecto de la temperatura.
(b) La adhesión de los leucocitos a las paredes de los tubos hidráulicos.
(c) La existencia de saltos en la corriente eléctrica.
(d) La agregación de las plaquetas por efecto del anticoagulante EDTA.
Respuesta razonada: al igual que sucede con el recuento m ediante cámara cuentaglóbulos, el
empleo de métodos electrónicos puede verse sometido a grandes errores, si se olvida el control
periódico y el calibrado diario de los instrumentos. En general, el error debido al propio método
de recuento electrónico, cuando este se realiza en óptim as condiciones, suele ser inferior al 1%,
pero puede verse notablem ente increm entado por causas diversas. El recuento de plaquetas
puede presentar situaciones especialm ente críticas debido a la posible existencia de falsas
trom bocitosis o trom bocitopenias causadas por artefactos como, por ejemplo, los debidos al
empleo de EDTA, imprescindible en el recuento electrónico. En algunos pacientes, p or causas
desconocidas, se producen agregados de plaquetas que constituyen una causa frecuente de
seudotrombocitopenia. En estos casos debe realizarse el recuento m anual en cámara a partir
de sangre recogida con oxalato.
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C A P Í T U L O 6
Hemoglobina
Métodos para la medida de su concentración
J. L. Vives C orrons y M .aA. Pujades
HEMOGLOBINA. CARACTERISTICAS GENERATES

E structura
La hemoglobina es el pigmento rojo que da color a la sangre y constituye el 95% del
peso seco eritrocitario. Su molécula es una proteína conjugada de 64.400 daltons (Da)
y formada por cuatro subunidades (tetrámero), cuya misión es el transporte sanguíneo
de prácticamente todo el oxígeno ( 0 2) y la mayor parte del dióxido de carbono (C 0 2).
Cada molécula de hemoglobina está formada por cuatro cadenas de globina, iguales
dos a dos, y cuatro grupos hemo idénticos y unidos a cada una de las cadenas de globina
(fig. 6-1). La estructura conformacional (espacial) de cada cadena de globina habilita
un espacio para el grupo hemo que se conoce con el nom bre de «cavidad del hemo».
La unión entre el hem o y la globina se realiza a través del hierro (quinta valencia de
coordinación) y otros puntos de anclaje (uniones covalentes), entre cadenas laterales
de los grupos pirrol y aminoácidos de la globina.
Globina
La globina es una proteína redondeada (globular) cuyas características moleculares
varían con el desarrollo del organismo, de manera que difieren según se trate del período
embrionario, fetal o edad adulta. Un individuo adulto norm al posee cuatro formas
moleculares o cadenas de globina:
1. Cadena alfa (a).
2. Cadena beta (P).
3. Cadena delta ( 8 ).
4. Cadena gamma (7 ).
Estas cadenas se com binan entre sí de diferente m anera dando lugar a variantes
norm ales de la hem oglobina que difieren según las distintas etapas del desarrollo
(tabla 6-1). Durante la edad adulta estas son fundamentalmente tres: HbA (97%), HbA 2
(<3,5% ) y una pequeña fracción de hemoglobina fetal (HbF) que no supera el 1,5%
del total. Durante la etapa fetal existe un predominio casi absoluto de la HbF (97%),
que desaparece casi por completo a los 6 meses de vida extrauterina. Durante la etapa
embrionaria, existen cadenas de globina totalmente diferentes a las del feto y el adulto
que, al unirse entre sí, dan lugar a las llamadas hemoglobinas embrionarias: Hb Gower I,
Hb Gower II y Hb Portland.
Las uniones globina-globina m antienen la estabilidad de la molécula y son muy
importantes para que esta realice su función respiratoria. En la HbA normal existen dos
tipos de uniones fundamentales:
154 2014. Elsevier España, S.L. Reservados to d o s los d erechos

ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 6 Hemoglobina 155
Cadena a
Grupo
hemo

molécula de hemoglobina. Obsérvese
la situación del grupo hemo en cada
cadena de globina, así como la cavidad
central o el lugar de inserción de la
molécula de 2,3-difosfoglicerato.
1. Uniones débiles, a ,-P 2 (contacto entre 19 aminoácidos).

2. Uniones fuertes, o^-p, (contacto entre 34 aminoácidos).
Las uniones entre cadenas idénticas (aj-ot 2 y P ,-0 2) están formadas por un escaso
número de enlaces.
Hemo
El grupo hemo es el com ponente no proteico (prostético) de la hemoglobina y a él
se debe el color rojo de la sangre. Estructuralm ente, se com pone de una porfirina
(protoporfirina IX), form ada p or cuatro pirróles en disposición espacial bidim en-
sional o plana y un átom o de hierro en estado reducido (Fe++), situado en el centro
(fig. 6-2). La protoporfirina IX es sintetizada en el eritroblasto a partir de glicocola y
ácido succínico, reacción que requiere fosfato de piridoxal (vitamina B6) y el átom o de
hierro, siempre bajo forma reducida o ferrosa (Fe++), que se halla fijado a los cuatro
grupos pirróles mediante valencias de coordinación. La estructura espacial que adopta
el átom o de Fe++ en su unión con la protoporfirina IX hace que posea un total de seis
valencias de coordinación, p or lo que dos de ellas quedan libres, una para unirse a
la cadena de globina (quinta valencia) y o tra para fijar reversiblemente el oxígeno
TABLA 6-1. Hemoglobinas normales
Tipo Cadenas Etapa del desarrollo

HbA “ 202 Adulta normal (96%)
HbA2 «282 Adulta normal (3-3,5%)
HbF ai \ Adulta normal (1%)
Fetal (98%)
Gower I «A
Gower II a 2e2 Embrionaria (100%)
Portland ^2
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N — Fe+*— N
CH2 FIGU RA 6-2. Esquema de la

COOH estructura del grupo hemo.
(sexta valencia). La capacidad del hierro para fijar el oxígeno solo existe cuando se
halla en form a reducida (Fe++), ya que cuando se halla en form a oxidada (Fe+++) la
hemoglobina se transform a en metahemoglobina (Hi), que es incapaz de fijar el hie
rro y, por tanto, de realizar función respiratoria. Gracias a la actividad de la enzima
diaforasa, presente en el interior del propio eritrocito, en condiciones fisiológicas la
concentración de Hi siempre es inferior al 1% del total de hemoglobina. Ello obedece
a que la diaforasa (N A D H -m etahem oglobina-reductasa o citocrom o b 5 reductasa)
m antiene perm anentem ente el hierro de la hemoglobina en estado reducido evitando
posibles aum entos de la Hi que, p or circunstancias diversas, pueden llegar a superar
el 10%. Esta situación que se pone de manifiesto por la aparición de un característico
color azulado de la piel (cianosis).
Función
La función prim ordial de la hemoglobina es el transporte del oxígeno desde los pul
mones a los tejidos y, en parte, también, del C 0 2 en sentido inverso. Cada molécula de
hemoglobina puede fijar un máximo de cuatro moléculas de 0 2 (u ocho átomos); en
este caso se dice que está saturada. A diferencia del transporte de oxígeno, el de C 0 2
por la hemoglobina se realiza mediante la unión covalente con los grupos amino de las
cadenas globínicas, lo que da lugar a la carbaminohemoglobina que posee un color algo
más oscuro que la oxihemoglobina. El resto de C 0 2, que constituye la mayor parte, es
transportado por el plasma en forma de bicarbonato.
Para realizar su función tra n sp o rta d o ra de oxígeno, la hem oglobina presenta
dos estructuras diferentes: 1 ) oxihemoglobina (preferentemente en los pulm ones),
y 2) desoxihemoglobina (preferentemente en los tejidos). C uando la concentración
o presión parcial de 0 2 ( P 0 2) es elevada, como sucede en los pulm ones, todas las
moléculas de hem oglobina se saturan de oxígeno y, cuando esta disminuye, como
sucede p or ejemplo en los tejidos, la hemoglobina libera progresivamente su oxígeno
y quedan m uy pocas moléculas saturadas. En su conform ación desoxigenada o T
(tensa), tal y como existe en los tejidos, la hemoglobina tiene m uchos puentes salinos
entre subunidades y dentro de ellas, pero a m edida que se oxigena (capta sucesivas
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100- Sin 2,3-DPG Curva normal
FIGU RA 6-3. Curva de

disociación de la oxihemoglobina.
La presencia o la ausencia de
2,3-difosfoglicerato disminuye
0 o aumenta, respectivamente, la
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
PO 2 (mmHg) afinidad de la hemoglobina por el
oxígeno.
moléculas de oxígeno), estos puentes se rom pen y alcanza la conformación oxigenada

o R (relajada), tal y como existe en los pulmones. Es interesante mencionar que estas
reacciones ocurren de form a secuencial y cooperativa, de m anera que la unión de
cada molécula de oxígeno favorece la unión de las demás. Esto obedece a que cada
vez que una molécula de oxígeno se une a la hem oglobina, se produce u n cambio
conform acional que facilita la unión de otra molécula de oxígeno, de m anera que
la últim a unión se realiza m ucho más fácilmente que la prim era. La representación
gráfica de este com portam iento cinético m uestra una característica forma sigmoide
conocida como «curva de disociación oxígeno-hemoglobina», en la que el valor de la
P 0 2 para el cual un 50% la Hb se halla saturada se denomina P 50 (fig. 6-3). La medida de
la P50 constituye el procedim iento de elección para analizar la capacidad funcional
de la hemoglobina para liberar oxígeno y es el único existente para el diagnóstico de
ciertas hemoglobinopatías con alteración de la afinidad p o r el oxígeno (eritrocitosis
o poliglobulia familiar). Este com portam iento cinético de la hem oglobina en pre
sencia del oxígeno puede verse modificado p o r factores diversos, algunos de ellos
reguladores de la función respiratoria de la hemoglobina, como, p or ejemplo, el pH
intraeritrocitario (concentración de hidrogeniones), la concentración de C 0 2 y un
metabolito de la glucolisis conocido como 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG). Todos ellos,
y muy especialmente el 2,3-DPG, actúan disminuyendo la afinidad de la Hb por el 0 2,
favoreciendo con ello la liberación del oxígeno en los tejidos (es decir, su oxigenación).
La u n ió n del oxígeno a la hem oglobina en los pulm ones y su liberación en los
tejidos están controladas p o r la propia concentración parcial de oxígeno y, en m enor
grado, p or la de C 0 2. En condiciones patológicas, la Hb puede fijar otros gases, como,
por ejemplo, el ácido sulfhídrico (SH2) o el monóxido de carbono (CO), dando lugar a
sulfohemoglobina y carboxihemoglobina, respectivamente. Ambos gases son tóxicos para
el organismo, ya que impiden el transporte de oxígeno al ocupar su lugar en la molécula
de hemoglobina. Hay que señalar que el C 0 2 tiene u na afinidad por la hem oglobina
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250 veces superior a la del oxígeno, con lo que en presencia de una excesiva concen
tración ambiental de C 0 2 aum enta m ucho la concentración de carboxihemoglobina,
incapaz de tran sp o rtar oxígeno, lo que puede causar intoxicación y/o m uerte por
asfixia. Esto es lo que sucede con la intoxicación p o r braseros o quemadores en mal
estado y, en m ucho m enor grado, con la poliglobulia del fum ador p o r exceso de
carboxihemoglobina secundaria a la com bustión del cigarrillo.
Recambio m etabólico y hom eostasis

Los eritrocitos, desde que salen de la m édula ósea, circulan p o r la sangre unos 120
días, tiem po durante el cual van perdiendo progresivamente su capacidad metabólica
y antioxidante (envejecimiento) hasta que son eliminados p o r el sistema m on onu
clear fagocítico (SMF). A su vez, los eritrocitos elim inados son reem plazados por
otros nuevos, y de esta forma se m antiene la homeostasis de la masa eritrocitaria del
organismo. En el SMF, los eritrocitos fagocitados son descompuestos en sus elementos
constituyentes, y la hemoglobina, que es el componente fundamental, se degrada en
hemo y globina. A su vez, la globina se descompone en sus aminoácidos constituyentes,
que son reutilizados para la síntesis de proteínas, y el hemo pierde el hierro que también
se reutiliza para la síntesis de hemoglobina (fig. 6-4). El com ponente estructural del
grupo hemo sin el hierro, conocido como protoporfirina IX se degrada a bilirrubina,
Riñón
Urobilina
(orina)
Hígado
FIGU RA 6-4. Esquema del
(heces) catabolismo de la hemoglobina.
SMF, sistema monocular fagocítico.
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un pigm ento biliar que después de un proceso metabólico hepático se elimina por
las heces y la orina. El hierro liberado del grupo hemo se acum ula en el citoplasma
de los macrófagos bajo la forma de ferritina (hierro de reserva) y periódicamente se
va liberando al plasma, donde es transportado p o r la transferrina a la m édula ósea y
otros tejidos. Una pequeña cantidad de esta ferritina, debido al proceso de recambio
celular, va a parar al plasm a donde constituye un buen indicador del estado de las
reservas de hierro del organismo (ferritina plasmática). La bilirrubina, producto de
degradación de la protoporfirina IX, es liberada al plasma (bilirrubina libre) y llega al
hígado donde se le une una molécula de ácido glucurónico m ediante un proceso de
glucuronoconjugación (bilirrubina conjugada) que como tal se elimina por las heces.
Si bien la formación de bilirrubina es un producto propio del recambio eritrocitario
fisiológico, cuando por alguna razón aum enta la intensidad de destrucción de los eri
trocitos (hemolisis) se produce un aumento paralelo de la concentración de bilirrubina
en plasma (hiperbilirrubinemia), que al depositarse en la piel y las mucosas les confiere
un característico color amarillo (ictericia). La hemólisis es siempre un trastorno que
genera un exceso de bilirrubina que aún no ha pasado por el hígado (bilirrubina libre
o no conjugada), y su determinación cuantitativa constituye un criterio utilizado para
diferenciar la ictericia hemolítica (exceso de bilirrubina libre) de la hepática (exceso
de bilirrubina conjugada). Existe un trastorno congénito conocido como enfermedad de
Gilbert en el que el hígado tiene disminuida su capacidad para conjugar la bilirrubina.
Debido a ello estos pacientes cursan con moderada ictericia y aum ento variable de la
bilirrubina libre, hecho que se suele confundir con un proceso hemolítico. La diferencia
reside en que en la enfermedad de Gilbert no existe anemia ni aumento de reticulocitos.
Además, el valor de la b ilirrubina libre suele sufrir im portantes variaciones en el
curso de la vida, y se observan aum entos de hasta dos a tres veces los valores basales
después de un ayuno de 24 h. Aunque todos estos criterios son útiles para establecer
una prim era orientación diagnóstica, la confirm ación definitiva exige dem ostrar la
existencia de la m utación genética propia de esta enfermedad (mutación en el exón 1
del gen UGT1A1).
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA

Introducción
La m edida de la concentración de la hem oglobina en sangre constituye una de las
pruebas diagnósticas más solicitadas en la clínica, ya que resulta imprescindible para el
diagnóstico de la anemia y también de la eritrocitosis o poliglobulia. Debido a que existe
un patrón de referencia internacional, la medida de la concentración de hemoglobina
puede realizarse con gran exactitud y precisión gracias a la trazabilidad de los reactivos
empleados frente al patrón de referencia internacional. Los valores de concentración
de hemoglobina dependen fundamentalmente de la edad y el sexo, pero también de la
etnia o localización geográfica de la población analizada, aunque en los países desarro
llados la variabilidad individual de la concentración de hemoglobina es, en general, muy
pequeña. Es por ello que para evaluar correctamente la concentración de hemoglobina
de u n paciente deberían conocerse siempre los valores previos a la enfermedad, lo cual
solo suele ser posible en m uy pocos casos.
En 1967, el C om ité Internacional de Estandarización en H em atología (ICSH)
recomendó como método de referencia para m edir la concentración de hemoglobina
el de la cianometahemoglobina (HiCN), un método colorimétrico basado en el cálculo
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de la absorbancia (A) lumínica de una solución de hemoglobina (Hb), previa trans

form ación en alguno de sus derivados coloreados. Este método, caracterizado por
su elevada fiabilidad debido tanto a la estabilidad de la solución de HiCN como a su
trazabilidad frente al patrón de referencia internacional (patrón primario), fue también
adoptado por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) de
EE. UU. (que en 2005 cambió su denom inación p or Clinical and Laboratory Stan
dards Institute [CLSI]) y oficialmente reconocido p or la Organización M undial de la
Salud (OMS). En la actualidad, prácticamente todos los analizadores hematológicos
autom atizados utilizan este m étodo para m edir la concentración de hem oglobina
elaborando patrones secundarios comerciales propios (calibradores), trazables con el
patrón prim ario o de referencia internacional.
Además del método de la cianometahemoglobina existen otros procedimientos, algu
nos más asequibles y económicos, que ocasionalmente pueden utilizarse como alternativa
al método de referencia internacional. Entre ellos destacan el método colorimétrico de
la oxihemoglobina y los hemoglobinómetros de lectura directa como, por ejemplo, el
de Sahli y el sistema HemoCue. En países no desarrollados, donde los medios técnicos
son prácticamente inexistentes, se está imponiendo un método que recientemente ha
sido recomendado por la OMS para situaciones concretas conocido como Haemoglobin
Colour Scale. Este método consiste en emplear un papel especial donde se deposita una
gota de sangre y comparar, transcurridos 30 s, el color obtenido con el de una escala
de seis intensidades de color, cada una de las cuales corresponde a una concentración
aproximada ( ± 1 0 g/1) de hemoglobina en sangre.
M étodo de la cianom etahem oglobina

Principio
Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en
HiCN, que es muy estable, posee un color característico y cuya absorbancia, a 540 nm,
puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentración cono
cida de hemoglobina, preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración).
La transformación de la hemoglobina en HiCN tiene lugar según el siguiente proceso:
Hb+Ferrocianuro potásico = Metahemoglobina (MetaHb)

M etaHb+ Cianuro potásico = CianmetaHb
Material
Para la medida de la concentración de hemoglobina se parte de sangre venosa total, m an
tenida incoagulable con EDTA-K3 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 Ul/m l). Puede em
plearse también sangre capilar. El material imprescindible para la medida es el siguiente:
• Colorímetro o espectrofotómetro. Estos instrumentos deben ser calibrados perió
dicamente mediante la solución patrón de HiCN, preparada de acuerdo con las es
pecificaciones del ICSH, y cuya absorbancia a 540 nm debe ser de aproximadamente
0,4 (cociente entre absorbancia a 540 y 504 nm comprendida entre 1,6 y 1,62).
• Tubos de 12 X 100 mm.
• Pipetas volumétricas calibradas (±0,5 %) de cristal de 5 mi (terminales).
• Pipetas automáticas de 0 ,0 2 mi (2 0 (jlI) perfectamente calibradas.
• Reactivo de Drabkin (tabla 6-2).
• El detergente no iónico (saponina) acelera la transformación de la hemoglobina en
HiCN, de forma que aquella se completa en aproximadamente 3 min. Este reactivo
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TABLA 6-2. Reactivo de Drabkin (pH 7-7,4)
Componentes Proporción
Ferrocianuro potásico 200 mg
Cianuro potásico 50 mg
Fosfato monopotásico 140 mg
Tritón X-100® 1 mi
Agua destilada hasta 1.000 mi
ALTERNATIVAS AL TRITÓN X-100®
Sterox SE® 0,5 ml/1
Nomic218® 1 ml/1
Nonidet 40® 1 ml/1
debe tener un color amarillo pálido, ser completamente transparente y un pH com

prendido entre 7 y 7,4.
La lectura de su absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco ha de
calibrarse a 0 .
Para su conservación deben utilizarse botellas de vidrio borosilicatado (color topacio)
y a temperatura ambiente (20-25 °C), ya que el frío o la congelación pueden modificar
la intensidad del color.
Patrón de referencia o calibrador (solución comercial). Es una solución de HiCN
cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina.
Todo patrón de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario
HiCN.
Patrón primario de HiCN. Solución estable preparada por un organismo inter
nacional oficialmente reconocido p or la OMS, cuyas propiedades y características
físico-químicas han sido certificadas por el ICSH de acuerdo con el peso molecular
(64,458) y el coeficiente de extinción (44) de la hemoglobina. Sus propiedades físicas
son las siguientes:
• Pico máximo de absorción a 540 e inflexión a 504 nm (fig. 6-5).
0,7
0,6
FIGU RA 6-5. Gráfica que muestra

el espectro de absorción característico
de la HiCN.
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• Absorbancia a 540 (A540): entre 0,4 y 0,404.

• Absorbancia a 504 (A504): entre 0,248 y 0,251.
• CocienteA..n/A 540
„, entre 1,6y' 1,62.
504:
El patrón prim ario de HiCN, o patrón de referencia internacional, se suministra
en ampollas ám bar selladas al vacío (fig. 6 - 6 ), que contienen 10 mi de solución 500 y
850 mg/1 de HiCN. La concentración exacta de hemoglobina en cada lote viene siempre
indicada en la ampolla, y el valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro
(g/1) se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada conveniente
mente para realizar la lectura fotocolorimétrica. De este modo, si en el frasco se indica
una concentración de 572 mg/1, significa que dicha solución patrón posee la misma
absorbancia que la de una solución hemoglobínica de 143 g/1, si la sangre total se ha
diluido 251 veces, o de 114 g/1, si la dilución ha sido de 201 veces.
Método
1. Se conecta el fotocolorímetro o el espectrofotómetro según las especificaciones
de la casa comercial.
2. Se homogeneíza bien la sangre con el anticoagulante mediante agitación suave,
bien de forma manual por inversión del tubo 2 0 veces o bien con un sistema de
rodillos o disco giratorio durante un tiempo mínimo de 5 min.
3. Se pipetean 2,5 mi de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo (12 X 100 mm).
4. Se añaden 0,02 mi (20 |xl) de sangre homogeneizada al tubo con los 2,5 mi de reac
tivo de Drabkin, para ello se emplea una micropipeta. Al realizar esta operación,
es fundam ental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes
externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar, asimismo, que
no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.
5. Se agita el tubo mediante inversión (4-5 veces) al objeto de conseguir homoge-
neizar bien la mezcla sangre-reactivo y se espera u n mínimo de 5 m in para que
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se produzca la hemolisis total y se complete la transformación de toda la hemo

globina en cianometahemoglobina.
6 . Se lee la absorbancia de la solución a 540 nm (o si se emplea un fotocolorímetro,
con filtro verde-amarillo). Como blanco puede emplearse agua destilada o la
propia solución de reactivo de Drabkin.
7. Para calcular la concentración de hemoglobina se recomienda disponer de una grá
fica o curva de calibración. En caso contrario, y siempre que exista la seguridad de
que el instrumento de lectura se halla calibrado correctamente, la concentración
de hemoglobina puede determinarse aplicando la siguiente fórmula:
Hemoglobina (g/1) = J^ 54Q(muestra) x Cianmeta-Hb patrón (m g/l)x ^

A 540 (patrón) F & 1.000
A = absorbancia o densidad óptica.

F = factor de dilución de la sangre total en Drabkin (125).
La concentración de hemoglobina en milimoles por litro de sangre (mmol/1) puede
calcularse multiplicando el valor en g/1 por 0,621.
Nota: Si se form a turbidez en la sangre diluida, puede obedecer a la existencia de
proteínas anormales en el plasma o bien a una concentración elevada de leucocitos. Se
debe centrifugar el líquido antes de hacer la lectura en el fotocolorímetro.
Elaboración de la gráfica o recta de calibración

La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar un instrumento para una lectura
determinada, calculando la corrección existente entre los valores de absorbancia leídos
por el mismo y los correspondientes valores de concentración hemoglobínica.
Para elaborar la gráfica patrón se preparan cinco soluciones de concentración de
HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas
de la misma en reactivo de Drabkin (tabla 6-3).
La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo es determ inada a
partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN. Una
vez preparadas las soluciones patrón, se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene
solo reactivo (tubo 5) y se ajusta a cero la absorbancia del instrumento (100% de trans-
mitancia).
A continuación, y partiendo de la solución de HiCN concentrada (tubo 1), se leen
las restantes soluciones patrón. Finalmente, la relación entre los valores de absorbancia
obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en
TABLA 6-3. Soluciones de concentración de cianometahemoglobina
Tubo Solución Reactivo Volumen Dilución Hemoglobina

estándar de Drabkin final
1 3 0 3 0 150
2 1,5 1,5 3 1:2 75
3 1 2 3 1:3 50
4 0,5 2,5 3 1:6 25
5 0 3 3 — 0
C on el gráfico elaboramos el cuadro de valores de hemoglobina.
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o 20 40 60 80 loo 120 140 Hemoglobina (g/1)
FIGU RA 6-7. Recta de calibración elaborada con una solución de HiCN de concentración conocida.
una gráfica colocando en ordenadas los valores de absorbancia transitoria y en abscisas,

los valores de hemoglobina (fig. 6-7).
Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina

Com o cualquier técnica, la determ inación de la concentración de hem oglobina
está som etida a posibles errores que deben ser tenidos siempre en cuenta. Algunos
de ellos obedecen a características peculiares de la muestra, tales como la presencia de
hiperlipemia o leucocitosis intensa (> 50 X 109/1). La mayoría de las veces, no obstante,
los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis de la muestra
(cuadro 6 - 1 ).
Valores de referencia de la concentración de hemoglobina

Como ya se ha m encionado anteriorm ente, los valores de la concentración de hem o
globina en sangre varían con la edad y el sexo. Así, son especialmente elevados en recién
nacidos a térm ino (170-190 g/1) y bajos durante el embarazo (100-110 g/1). Asimismo,
el hom bre tien e u n a concentración de hem oglobina en sangre su p erio r al de la
mujer, m ientras que los niños m uestran valores inferiores a los de la edad adulta
(tabla 6-4).
D ebido a estas diferencias, y al hecho de que el diagnóstico de anem ia solo debe
establecerse sobre la base del valor de la concentración de hemoglobina, la OMS ha es
tablecido que existe anemia cuando esta es inferior a 13 g/dl (130 g/1) en el hombre, a
1 2 g/dl ( 1 2 0 g/ 1) en la mujer no embarazada y a 1 1 g/dl ( 1 1 0 g/ 1) en niños ( < 6 años) y
mujeres embarazadas.
Finalmente, cuando se consideran los valores de referencia de hemoglobina, hay
que tener siempre en cuenta el grupo étnico o población al que pertenece el individuo
estudiado, ya que pueden verse influenciados p or factores fuera de control como la
alimentación, hábitos tóxicos y otros factores de carácter individual.
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CUADRO 6-1. C ausas d e e rro r e n la d e te rm in a c ió n de la c o n cen tració n de h em o g lo b in a
Errores en la obtención de la muestra de sangre

• Errores de extracción
• Empleo de anticoagulantes no recomendados
• Coagulación parcial de la sangre
Errores de dilución
• Empleo de pipetas volumétricas mal calibradas, sucias o húmedas
• No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de
introducirlo en el reactivo
• Dilución incompleta de la sangre en el reactivo
Errores en la transformación de la hemoglobina en cianometahemoglobina (HiCN)
• Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o caducado
• Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la hemoglobina
en HiCN
Errores en la realización de la técnica
• Empleo de instrumentos no calibrados
• Cubetas sucias, deterioradas o no ajustadas
• Soluciones turbias de HiCN
Errores en la conservación del reactivo
• Congelación del reactivo. Con ello se produce la transformación de K3Fe(CN)6 en
K4Fe(CN)6y una oxidación parcial de la hemoglobina
• Conservación del reactivo en botellas de polietileno. En este caso se pierden grupos CN
con formación exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, por lo que los valores de
concentración hemoglobínica obtenidos son inferiores a los reales
TABLA 6-4. Valores de referencia de la hemoglobina (±2 DE)
Sistema clásico (g/dl) Sistema internacional (g/1)

Recién nacidos 15-23 150-230
Niños de 1-5 años 9,4-14,6 94-146
Mujeres 11,5-15,5 115-155
Embarazadas 9-13 90-130
Hombres 12,5-16,5 125-165
DE, desviación estándar.
M étodo de la oxihem oglobina

Principio
Es el método más rápido y simple para la determinación colorimétrica de la concen
tración de hemoglobina y se basa en la transformación de hemoglobina en oxihemo
globina mediante una solución de hidróxido de amonio. A diferencia del método de la
cianometahemoglobina, tiene el inconveniente de que no existe una solución patrón
estable de oxihemoglobina.
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Material
• Espectrofotómetro o colorímetro capaz de leer una longitud de onda de 540 nm.
• Tubos de ensayo.
• Cubetas de cristal o de plástico para colorímetro.
• Pipetas de (20 jxl o m m 3).
• Tubo de goma y boquilla.
• Pipetas de 5 mi.
• Solución de hidróxido de amonio a 0,4 g/1.
• Sangre venosa con anticoagulante EDTA o heparina, o bien sangre capilar.
Método
1. Se conecta el espectrofotómetro o el colorímetro siguiendo el m anual de proce
dimientos.
2. Se agita suavemente la sangre con EDTA.
3. Se pipetean 2,5 mi de hidróxido de amonio en un tubo de ensayo.
4. Se aspiran 20 |xl de sangre total con una micropipeta calibrada y se limpia bien
la punta con papel absorbente.
5. Se vierte el contenido de sangre en el tubo y se agita varias veces por inversión.
6 . Se espera 5 m in para que se produzca la hemólisis total y el paso de hemoglobina
a oxihemoglobina.
7. Se leen las absorbancias a 540 nm enrasando el fotocolorímetro a 0 con el reactivo
de hidróxido de amonio.
Cálculo de la concentración de hemoglobina
Hemoglobina (g/1) = ^ sor^ ancâ (muestra) x c oncentractán patrón (g/l)xF

Absorbancia (patrón)
donde F = factor de dilución (125).

Nota: El patrón consiste en una muestra de sangre total con (EDTA-K3) cuya concentra
ción de hemoglobina se ha determinado mediante el método de la cianometahemoglobina.
M étodos de lectura directa

Método de Sahli
Este método es mucho más lento que los anteriores, carece de patrones y, por tanto, su
fiabilidad es sensiblemente inferior a la del método de la cianometahemoglobina. Su
margen de error se calcula entre el 15 y el 20%. Por ello, aunque no se recomienda para la
práctica clínica por su simplicidad, puede ser el único método disponible en determinadas
situaciones fuera de un ambiente norm al de desarrollo tecnológico (áreas geográficas
muy aisladas o de difícil acceso) y, sobre todo, zonas geográficas con notable estado de
subdesarrollo.
Principio
El m étodo de Sahli se basa en la hemólisis m ediante ácido clorhídrico (HC1), que
transform a la hemoglobina en hematina. La solución obtenida se diluye hasta que su
color se hace igual al de un cristal coloreado, cuya intensidad de color corresponde a
una concentración conocida de hemoglobina. La lectura se obtiene directamente en
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g/ 1, y se observa el valor de la escala graduada grabada sobre el tubo en el que se va

realizando la dilución.
Este procedimiento, además de su escasa reproducibilidad, tiene el inconveniente
de que la transform ación de toda la hem oglobina en hem atina precisa un tiem po
prolongado ( 1 h, aproximadamente).
Material
• Hemoglobinómetro de Sahli con un tubo graduado.
• Pipeta calibrada de 0,02 mi.
• Solución de HC10,1 N.
• Agua destilada.
Método
1. Se coloca solución de HC10,1 N en el tubo de Sahli hasta la marca 20.
2. Se añaden 20 (xl (0,02 mi) de sangre total bien homogeneizada al tubo anterior.
3. Se espera entre 30 y 45 min.
4. Se diluye el contenido del tubo de Sahli con agua destilada, hasta que la intensidad
del color de la solución sea igual a la del patrón.
5. Se lee directam ente la concentración de hem oglobina en la escala graduada
grabada en el tubo, empleando los meniscos de la superficie como niveles para
realizar la lectura. Es conveniente disponer de una sangre control de concentración
conocida de hemoglobina, a ser posible determ inada m ediante el m étodo de
cianometahemoglobina.
Causas de error
• Error de pipeteo.
• Variaciones del color del patrón. Si al emplear una sangre control se aprecia que han
variado las características en el color del patrón, hay que proceder a su recalibración
y obtener un factor de corrección para futuras determinaciones.
• Transformación incompleta de la hemoglobina en hematina. Es una causa frecuente de
error, ya que puede ser causa de variaciones de hasta el 60% con respecto al valor verdadero.
• Errores de lectura en el tubo de Sahli.
• Dilución excesiva con respecto al color del patrón.
• Variaciones de la luz que incide sobre el patrón, capaces de hacer variar la apreciación
visual de su color.
• Presencia en la sangre de compuestos no hemoglobínicos (proteínas y lípidos) capaces
de modificar el color de la hematina ácida.
Hemoglobinómetro HemoCue
Existe en el comercio un pequeño hemoglobinómetro de lectura directa que se caracteriza
por su simplicidad de manejo, rapidez de medida y elevada fiabilidad. Se conoce como
HemoCue y por su versatilidad ha desplazado a todos los restantes procedimientos de
lectura directa, siendo actualmente el método de elección para el control domiciliario
de la concentración de hemoglobina (fig. 6 - 8 ).
Se trata de un fotóm etro de doble longitud de onda que corrige automáticamente
cualquier interferencia debida a turbidez de la muestra analizada, como sucede en casos
de hiperlipemia o leucocitosis. Como muestra puede emplearse 10 (xl de sangre venosa,
arterial, capilar u obtenida directamente del dedo mediante microlanceta.
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FIGU RA 6-8. Hemoglobinómetro simple tipo HemoCue. Mediante una lanceta se obtiene una gota de
sangre que se coloca sobre un pequeño soporte y, a su vez, este se introduce en el hemoglobinómetro.
Para la lectura se emplea una cubeta irrompible y desechable que permite recoger una
cantidad precisa de sangre y se agita automáticamente con los reactivos ya preparados.
La cubeta se coloca en el fotóm etro portátil y el resultado en gramos de Hb por litro
(g/1) aparece antes de 1 min en la pantalla que tiene incorporada. Los resultados pueden
obtenerse impresos en papel mediante conexión a una impresora, almacenarse (hasta
un total de 600 datos) o ser transferidos a un PC. Las ventajas de este instrumento son
importantes y al no requerir una calibración sistemática constituye un buen sistema para
ofrecer una atención más próxima a la cabecera del enfermo.
M étodo de la escala de color (Haemoglobin Colour Scale)

Constituye un sistema patentado por la OMS (hbcolourscale@who.int) para la aprecia
ción de la concentración de hemoglobina y diseñado especialmente para el diagnóstico
de anemia cuando resulta imposible disponer de electricidad ni de ningún tipo de
equipamiento para medir la concentración de hemoglobina.
El principio de funcionam iento se basa en la apreciación del color de la sangre
cuando se com para con una escala de color rojo de intensidad decreciente. Como es
sabido, el descenso de la concentración de hemoglobina de la sangre produce un des
censo en la intensidad de su color rojo característico y esto es fácilmente apreciable
a la vista de cualquier observador. El hem oglobinóm etro de escala de color es muy
sencillo de usar, y consiste en una cartulina con seis franjas de diferente intensidad de
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14
12 g/dl NORMAL
12
A N E M IA
10 8 - 1 1 g/dl
M O D ERADA
8
A N E M IA
6-7 g/dl
IN T E N S A
6
A N E M IA
4-5 g/dl
M U Y IN T E N S A
4
4 g/dl FIGU RA 6-9. Hemoglobinómetro
óptico conocido como escala de color.
color rojo correspondientes a diferentes concentraciones de hemoglobina (fig. 6-9); en

cada una de ellas hay u n círculo blanco donde se ha de depositar una gota de sangre
y esperar 30 s. Pasado este tiempo solo es cuestión de comparar el color de la gota de
sangre impregnada en el papel con la escala de color y ver con cuál de las franjas muestra
mayor coincidencia. De esta forma puede conocerse la concentración aproximada de la
hemoglobina en sangre del paciente y con ello la intensidad de la anemia.
Estudios realizados bajo auspicios de la OMS han demostrado que la sensibilidad y
especificidad de este método para distinguir valores normales de concentración de hemo
globina en sangre de valores propios de anemia leve son del 98 y el 8 6 % respectivamente,
suficientes como para atribuir a este método fiabilidad en su uso clínico.
El empleo del hemoglobinómetro de escala de color ha demostrado también ser de
utilidad en programas de neonatología y salud infantil, control de ferroterapia y anemia
por parasitosis intestinal, control de la anemia del paludismo, control de donantes de
sangre y cualquier situación que requiera conocer de forma inmediata la existencia o
no de anemia.
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA EN PLASMA

Principio
La cantidad de hemoglobina circulante en plasma es, en condiciones normales, prácti
camente nula, aunque puede aumentar en el curso de procesos hemolíticos. De todas
formas, pronto se transforma en bilirrubina. El m étodo que se describe aquí se basa en
el empleo de la bencidina.
Reactivos
• Solución de bencidina. En 90 m i de ácido acético glacial se disuelve 1 g de bencidina
básica pura, y la dilución se completa hasta 100 mi con agua destilada. Esta solución
se conserva varios días si se mantiene en frasco topacio bien cerrado y a 4 °C (nevera).
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• Solución de peróxido de hidrógeno (H 20 2). Formada por la dilución de un volumen

de H 20 2 al 3% en dos volúmenes de agua destilada.
• Solución de ácido acético glacial.
• Heparina o citrato sódico al 3,8%.
• Solución testigo o control de hemoglobina a partir de una m uestra de sangre. La
solución de hemoglobina se prepara mediante la adición de agua destilada al hemo-
lizado, hasta que se consigue una concentración de 2 0 0 mg/1.
M étodo
1. Se extrae cuidadosamente la sangre con aguja gruesa y anticoagulante en la jeringa.
2. Se mezcla, sin agitar, y se vierte en un tubo de centrífuga, procurando que no se
forme espuma.
3. Se centrifuga a poca velocidad (500 r.p.m) durante 10 min y se separa el plasma,
que es centrifugado a mayor intensidad (1.500 r.p.m) durante otros 10 min.
4. A tres tubos P (problema), B (blanco) y T (testigo), se añade 1 mi de la solución
de bencidina.
5. Al tubo P se añaden 0,02 mi de plasma; al B, 0,02 mi de agua destilada, y al T,
0 , 0 2 mi de solución testigo.
6 . A cada uno de los tubos se añade 1 mi de agua oxigenada. Se mezcla bien (sin
agitar) y se deja reposar durante 2 0 min.
7. Se agrega a cada tubo 10 m i de solución de ácido acético. Se mezcla (sin agitar) y
se espera 1 0 min.
8 . Se lee la densidad óptica (A) de cada tubo a 515 nm y se aplica el siguiente cálculo:
Hemoglobina (g/1) = A ^ (problem a)x20Q

A sl5 (testigo)

Los valores de referencia de H b plasmática oscilan entre 10 y 40 mg/1. Pueden elevarse
después de un ejercicio violento y durante un episodio hemolítico agudo de predominio
intravascular. En este último caso, los valores elevados persisten durante varias horas
después del proceso hemolítico. Esta técnica es útil también para determinar la presencia
de hemoglobina en pacientes sometidos a circulación extracorpórea con motivo de
intervenciones de cirugía cardíaca.
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE HEMOGLOBINA EN ORINA

Introducción
En numerosas situaciones patológicas puede encontrarse pigmento hemoglobínico en la
orina, bien porque este ha sido eliminado directamente por el riñón (hemoglobinuria),
como sucede en las anemias hemolíticas, o bien por pérdida de eritrocitos en las vías
urinarias (hematuria). Cuando la hematuria es muy intensa, el diagnóstico diferencial con
la hemoglobinuria no resulta fácil, aunque se considera que, cuando la hemoglobinuria
es consecuencia de una hematuria, pueden observarse también eritrocitos o restos de
estas células en el sedimento urinario.
C uando aum enta la hemoglobina libre del plasma debido a una crisis de hemolisis
el glomérulo renal deja filtrar la hemoglobina, p or lo que esta pasa al túbulo renal.
No obstante, si su concentración no supera el valor de 1,35 g/1, el túbulo renal la
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reabsorbe y transform a en bilirrubina, que pasa a la sangre, y hemosiderina, que es

eliminada con las células del tracto tubular en el proceso de descamación. Debido
a ello, su presencia puede detectarse fácilm ente m ediante la tin ció n de Perls del
sedim ento urinario (hem osiderinuria). C uando la hem oglobina plasm ática supera
el citado um bral (1,35 g/1), gran parte de ella se elimina directamente p o r la orina en
forma de hemoglobinuria.
M étodo (reacción de Adler o de la bencidina)

Este método está basado en la reacción de la hemoglobina con la bencidina en presencia
de peróxido de hidrógeno.
1. En un tubo de ensayo se introducen 0,1 g de bencidina y 2 mi de ácido acético,
procurando que se forme una solución saturada.
2. Se añaden 10 gotas de peróxido de hidrógeno de 12 volúmenes.
3. Se añaden 3-4 gotas del sedimento urinario.

En caso de positividad (presencia de hemoglobina en la orina) aparece, a los pocos
segundos, una coloración azul-verdosa, de intensidad variable.
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE LOS DERIVADOS

DE LA HEMOGLOBINA
M etahem oglobina
Principio
Se basa en la lectura espectrofotom étrica del hemolizado a dos longitudes de onda
diferentes: 522 y 578 nm, antes y después de tratarlo con ferrocianuro potásico para
transformar toda la Hb en metahemoglobina.
Material
• Sangre heparinizada (5 ml) del paciente y de un control normal.
• Solución salina fisiológica (NaCl, 0,15 mol/1).
• Tampón fosfato, 0,01 mol/1, a pH 6,5.
• Tubos de hemolisis.
• Micropipetas capilares.
• Tubos de Eppendorf.
• Ferrocianuro potásico (en cristales).
• Espectrofotómetro o colorímetro.
Método
1. Se lavan los eritrocitos (paciente y control) tres veces consecutivas con solu
ción de NaCl, 0,15 mol/1 y, de form a paralela, se procede para el paciente y el
control.
2. Se suspenden 20 (jlI de eritrocitos lavados en 3 mi de tampón fosfato, 0,01 mol/1,
a pH 6,5.
3. Se agita vigorosamente y después de 5 min se deja en la nevera durante 10 min.
Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 10 min.
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4. Se separa 1 mi de los sobrenadantes y se diluye en otros 2 mi de solución tampón

fosfato, a pH 6,5.
5. Se lee la absorbancia (A) de ambos hemolizados (paciente y control) a 522 y
578 nm de longitud de onda, utilizando como blanco la solución tampón.
6 . Se añade solamente al hemolizado control una pequeña cantidad (uno o dos
microcristales) de ferrocianuro potásico y se lee a dos longitudes de onda de 522
y 578 nm. Esta lectura corresponde al 100% de metahemoglobina.
7. Tanto para la m uestra del paciente como para la del control (antes y después de
añadir ferrocianuro potásico) se calcula la relación:

El valor R, correspondiente al control (sin ferrocianuro potásico), se lleva al eje de orde
nadas de una hoja de papel milimetrado, y se le asigna un valor de metahemoglobina del
0%. De forma análoga, se lleva sobre el eje de abscisas el valor de R del control después
de añadir ferrocianuro potásico, el cual corresponde al 1 0 0 % de metahemoglobina.
A continuación, se traza u na recta que una ambos puntos (fig. 6-10). Para calcular el
tanto por ciento de metahemoglobina del hemolizado problema, se coloca en el eje de
ordenadas del gráfico patrón su valor de R. Si este es igual o superior al valor del con
trol sin adición del ferrocianuro (0% de m eta-Hb), significará que la m uestra carece de
metahemoglobina. Por el contrario, si es inferior, podremos calcular el tanto por ciento
de metahemoglobina, trazando una paralela al eje de abscisas desde el valor situado en
el eje de ordenadas hasta la recta patrón y de ahí una perpendicular al eje de abscisas
que nos dará el resultado. En condiciones normales, la metahemoglobina plasmática
es del 0%. Puede observarse aum ento de la misma en el transcurso de determinados
tratamientos farmacológicos (sulfonas).
A57R
A522
Control 2,1
Paciente 1,5
Control 0,5
0 Resultado 50 FIGU RA 6-10. Recta patrón

Metahemoglobina {%) utilizada en la determinación de la
metahemoglobina.
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Sulfohem oglobina en sangre

Principio
Una lectura de absorbancia a 620 nm m ide la sum a de oxihem oglobina (H b 0 2) y
sulfohemoglobina (SHb) en una muestra de sangre. A diferencia de la H b 0 2, la banda de
absorción debida a la SHb no se altera por la adición de cianuro. La absorbancia residual
a 620 mm es, por consiguiente, proporcional a la concentración de SHb.
La absorbancia a 620 nm de la H b 0 2 sola ú nicam ente puede ser deducida de
una lectura a 578 nm y se tiene que determ inar experim entalm ente un factor de
conversión A 578/A 620 para cada instrum ento sobre una serie de m uestras de sangre
norm al. La absorbancia de SHb se obtiene restando la absorbancia de la H b 0 2 de
la H b total.
Material
• Muestra de sangre.
• Solución (20 ml/1) de un detergente no iónico (Sterox SE o N onidet 40).
• Solución (50 g/1) de KCN.
• Espectrofotómetro.
Método
1. Se mezclan 0,1 mi de sangre con 10 mi de la solución de detergente.
2. Se anota la absorbancia (A) a 620 nm (Hb total).
3. Se añade una gota de solución de KCN y pasados 5 min, se anota A, a 620 nm y
a 578 nm.
SHb% = 2 x A” ° SHb
^620 H b 0 2
donde A,„
oil)
HbO.¿ = Lectura de absorbancia a 578 nm y‘ A,„
ozU
SHb = A,,n
ozO
Hb total - A,,n
oil)
HbO_.¿

La SHb se forma habitualmente al mismo tiempo que la metahemoglobina, y representa
el estadio último e irreversible en la degradación de esta. Ocasiona los mismos efectos
que la metahemoglobina pero a mucha m enor concentración.
Carboxihem oglobina en sangre

Introducción
La carboxihemoglobina (COHb) resulta de la combinación de monóxido de carbono
(CO) con hemoglobina; su afinidad para esta proteína es 210 veces superior a la del
oxígeno. Esto significa que el CO se fija a la hemoglobina, aunque su concentración en
el aire sea muy baja (0,02-0,04%).
La COHb no puede fijar el oxígeno, por lo que no sirve para su transporte, lo cual
hace que un sujeto intoxicado por CO sufra anoxia. Para desplazar este equilibrio, se
somete a estos pacientes a atmósferas ricas en 0 2 y así lograr la conversión de COHb en
0 2-Hb. La sangre que posee COHb tiene un color rojo cereza brillante característico.
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La intoxicación por CO se produce p o r respirar aire que contiene este gas, el cual
se produce en grandes cantidades p or com bustión defectuosa de braseros, estufas,
calentadores de gas, hornos o motores de gasolina. No obstante, en la actualidad se
ha dem ostrado que la com bustión del tabaco produce tam bién cierta cantidad de
CO que es inhalada al fumar. La inhalación de CO puede tener efectos adversos en grandes
fumadores, ya que la hipoxia secundaria a cantidades significativas de carboxihemoglobina
genera un estímulo crónico de eritropoyetina y, con ello, un aumento de regeneración
eritroblástica y eritrocitosis (poliglobulia) compensatoria. Existen diversos métodos cua
litativos útiles en la práctica clínica para detectar la presencia de carboxihemoglobinemia.
Entre los más empleados destacan la llamada prueba con álcali y la prueba de Katayama.
Prueba con álcali

1. Se colocan en una placa de Petri dos gotas de sangre normal y dos del enfermo.
A cada muestra se añaden dos gotas de hidróxido sódico al 25%.
2. El control normal se vuelve color castaño, m ientras que la sangre que contiene
COHb no cambia de color.
Prueba de Katayama
1. En sendos tubos de ensayo se introducen 10 mi de agua destilada.
2. A uno de ellos se añaden cinco gotas de sangre del paciente, y al otro, cinco gotas
de sangre control.
3. Una vez agitados suavemente ambos tubos, se añade una gota de ácido acético
para acidificar el medio.
4. La sangre con carboxihemoglobina (COHb) adquiere un color rojo o rosado según su
concentración, mientras que la del control normal adquiere un color pardo o castaño.
Otros métodos
La detección de COHb de una m uestra puede hacerse tam bién determ inando el es
pectro de absorción, ya que presenta dos máximos para longitudes de onda de 572 y
535 nm. Sin embargo, resulta difícil de diferenciar de la oxihemoglobina ( 0 2-H b), ya
que esta presenta sus máximos de absorción muy próximos a los de la prim era (578
y 540 nm).
Actualmente existen analizadores automatizados capaces de determ inar con gran
rapidez y exactitud la concentración de COHb a partir de una pequeña muestra de sangre
(CO-Oximeter 282®), lo que se realiza determinando simultáneamente su contenido en
0 2-H b y metahemoglobina.
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE HAPTOGLOBINA PLASMÁTICA

Principio
La haptoglobina (Hp) es una a 2-globulina, con un peso molecular de 85.000, que es
capaz de fijar la hemoglobina (Hb) cuando esta se halla circulando libre en el plasma.
Gracias a ello se evita la eliminación renal de hemoglobina en condiciones fisioló
gicas, ya que el complejo H p-H b no puede atravesar el filtro glomerular. No obstante,
cuando en ciertas situaciones patológicas el nivel de hemoglobina libre en el plasma
sobrepasa los 125 mg/100 mi, se supera la capacidad de fijación de la haptoglobina, y
la hemoglobina se elimina por la orina (hemoglobinuria). La haptoglobina existe bajo
tres formas moleculares diferentes ( 1 - 1 , 1 - 2 y 2 - 2 ), que pueden ponerse de manifiesto
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mediante electroforesis. La determinación de la concentración de haptoglobina se basa

en su capacidad de aumentar la actividad peroxidásica de la metahemoglobina, la cual
se mide utilizando la oxidación del guayacol.
Reactivos
• Reactivo de guayacol. A 700 m i de agua destilada se añaden 3,72 g de guayacol. Una
vez lograda la disolución, se añaden 1 0 0 mi de ácido acético, 1 mol/ 1, ajustando el
pH a 4 mediante hidróxido sódico, 1 mol/1. Finalmente, el volumen de la solución se
completa hasta 1 . 0 0 0 mi con agua destilada.
• Peróxido de hidrógeno (H 20 2), 0,05 mol/1.
• Ferrocianuro (sódico o potásico) en solución (1 g/1).
• Solución de metahemoglobina. A ocho volúmenes de eritrocitos hum anos lavados
tres veces con solución salina fisiológica se añaden tres volúmenes de agua destilada
y tres de éter. Después de agitar y centrifugar, se separa el hemolizado, en el que
se determina la concentración de hemoglobina y, a continuación, se diluye con agua
destilada hasta 10 g/1. A 25 mi de esta solución recién preparada se añaden 10 mi
de una solución de ferrocianuro ( 1 g/1), con lo que la hemoglobina se convierte en
metahemoglobina. Transcurridos 10 min, se completa el volumen a 500 mi mediante
agua destilada. Esta solución puede guardarse varias semanas a +4 °C (nevera).
• Cloruro sódico, 0,15 mol/1 (solución salina fisiológica).
M étodo
1. Se diluye un volumen de suero problema con cuatro volúmenes de cloruro sódico
0,15 mol/1.
2. En dos tubos de ensayo se añade 1 mi de la solución anterior; a uno de ellos
(paciente) se le añade 1 mi de solución de metahemoglobina y al otro (blanco)
1 mi de agua destilada.
3. A continuación se añaden 5 ml del reactivo de guayacol a ambos tubos m an
teniéndolos en baño maría a 25 °C durante 10 min. A continuación, se añaden
0 ,1 mi de la solución de suero del paciente (problema-metahemoglobina) a uno
de ellos y 0 , 1 ml del control (blanco) al otro.
4. Inm ediatam ente, se añade a ambos tubos 1 mi de la solución de peróxido de
hidrógeno y se mezcla vigorosamente.
5. A los 8 min, se leen las densidades ópticas de ambos tubos a 470 nm.
6 . La concentración de haptoglobina se lee a partir de una curva de calibración
previamente preparada y se expresa en términos de metahemoglobina fijada.
Elaboración de la curva de calibración

1. Se añade 1 m i de solución de m etahem oglobina a l l tubos en batería. A
continuación, se añaden a cada uno cantidades crecientes (0, 0,1, 0,2, 0,3...
1 m i) de u n a mezcla de sueros frescos hu m an o s norm ales. Finalm ente, el
volum en final de todos los tubos se com pleta a 2 mi con solución de NaCl,
0,15 mol/1.
2. Cada muestra y un blanco preparado con 0,1 mi de cloruro sódico, 0,15 mol/1, y
5 mi de guayacol se someten al procedimiento descrito en el método anterior.
3. El espectrofotómetro se calibra a cero con el blanco.
4. Las lecturas de absorbancia se registran gráficamente en el eje de ordenadas
frente a la cantidad de suero (en mililitros) de cada uno de los tubos. El punto
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FIGU RA 6-11. Esquema de la curva de calibración de la haptoglobina.
de inflexión de la curva, a partir del cual esta se hace plana, indica la cantidad de
mezcla de suero no diluido que fija toda la hemoglobina presente (la adición
de más suero no modifica la lectura de absorbancia). Este punto corresponde a
una capacidad de fijación de metahemoglobina de 0,5 g/1 (fig. 6-11). No obstante,
el suero problema se diluye norm alm ente a una proporción de 1:5, de manera
que las lecturas corresponden a un contenido en haptoglobina de 2,5 g/1 (como
metahemoglobina).

El método es sencillo, pero delicado. La sensibilidad del reactivo de guayacol disminuye
lentamente con el tiempo, y la curva debe realizarse por lo menos una vez cada semana.
Asimismo, el suero ha de estar libre de hemólisis y no debe diluirse si el contenido en
haptoglobina es inferior a 0,4 g/1.
El valor de referencia de la haptoglobina varía entre 0,33 y 2,13 g/1. Se observan marca
dos aumentos en diversos estados inflamatorios, mientras que, por el contrario, disminuye
en las hepatopatías agudas o graves, en el curso inicial de las anemias hemolíticas y en los
casos raros de ahaptoglobinemia congénita.
CURVA DE DISOCIACIÓN DE LA OXIHEMOGLOBINA

La hemoglobina, cuando se encuentra en un medio pobre en oxígeno, tiende a perderlo,
mientras que lo capta con avidez cuando se encuentra en un medio rico en este gas;
esto explica el que sea una proteína idónea para su transporte. El comportamiento de
la hemoglobina frente a presiones parciales de oxígeno crecientes es muy característico,
de m anera que, al aum entar la concentración de oxígeno, el ascenso de hemoglobina
oxigenada es lento para subir luego rápidamente. Así, entre 0 y 20 m m H g de P 0 2, la
hemoglobina se ha oxigenado poco, mientras que entre 20 y 30 m mHg la oxigenación
es máxima. Si esto se representa en un sistema de coordenadas en el que figuren las P 0 2
crecientes en m mHg en las abscisas, y el porcentaje de oxihemoglobina, en las ordenadas,
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veremos que el gráfico obtenido corresponde a una curva sigmoide con tres partes: una de
fuerte pendiente que corresponde a valores de P 0 2 baja (<60 mmHg); una aplanada que
corresponde a valores más elevados (> 70 m mHg), y entre ambas, una de transición
que corresponde a valores intermedios (60-70 mmHg). Esta curva expresa, la relación en
tre la P 0 2 y el porcentaje de saturación de la Hb de forma que a nivel de sangre arterial
donde la P 0 2 normal es de 95 mmHg, el porcentaje de saturación de la Hb es de 97. En
la práctica clínica los valores se expresan en m mHg necesarios para saturar el 50% de la
hemoglobina o P50 (v. fig. 6-3). En condiciones normales la P 50 es de 27 mmHg y aumenta
en aquellas hemoglobinopatías con disminución de la afinidad por el 0 2, mientras que
disminuye en aquellas otras con aum ento de la misma. Por ello, el interés clínico de
esta determinación reside en el diagnóstico de ciertas hemoglobinopatías con afinidad
alterada por el oxígeno causantes de eritrocitosis (poliglobulia) o anemia relativa. En
el prim er caso la m utación de la hemoglobina genera un aumento de la afinidad por el
oxígeno (P 50 disminuida), mientras que en el segundo, una disminución de la misma
(P 50 aumentada). El valor de la P50 es, por tanto, un buen indicador de la función de la
hemoglobina y del grado de oxigenación de los tejidos.
Este peculiar com portam iento es exclusivo de la hemoglobina y va ligado a su es
tru ctu ra de cuatro subunidades capaces de ofrecer un com portam iento alostérico.
Otras hemoproteínas, como la mioglobina (que posee una única cadena de globina),
se comportan de manera bien distinta frente a presiones crecientes de oxígeno, dando
una curva hiperbólica en lugar de sigmoide, lo que demuestra su incapacidad para el
transporte de oxígeno.
La determinación de la curva de disociación de la oxihemoglobina puede hacerse
manualmente, al introducir cantidades crecientes de oxígeno a una solución de hemo
globina contenida en un tonómetro y determinar espectrofotométricamente, para cada
volumen de oxígeno añadido, el porcentaje de oxihemoglobina formada. No obstante,
existen en el mercado equipos semiautomatizados (Hem-0-Scan®; Hemox-Analyzer®)
que perm iten realizar esta función y obtener el registro gráfico de la curva mediante
aporte de cantidades paulatinamente crecientes de oxígeno a una muestra de sangre (o
de solución de hemoglobina) previamente desoxigenada.
Factores que m odifican la curva

Los factores no debidos a la hemoglobina que pueden también modificar este valor son
la concentración de iones hidrógeno (pH) del medio, cuyo aum ento (disminución del
pH) disminuye la afinidad e incrementa la liberación de oxígeno a los tejidos y la con
centración del substrato 2,3-DPG que realiza una actividad similar. El desplazamiento
de la curva en respuesta al aum ento del C 0 2 y los iones de hidrógeno, como sucede
durante el ejercicio muscular, facilita la liberación de oxígeno a los tejidos (efecto Bohr).
En los capilares pulmonares el valor más elevado de pH y la difusión del CO hacia la
atmósfera facilita el efecto contrario, es decir, la saturación de la hemoglobina por el
oxígeno.
El 2,3-DPG es un substrato cuya concentración eritrocitaria es muy elevada, y se
halla unida a las cadenas (3 de globina solo cuando la hemoglobina se encuentra en su
forma desoxigenada (desoxi). Cuando aumenta la concentración del 2,3-DPG disminuye
la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno y desplaza la curva hacia la derecha, lo
que facilita la liberación del oxígeno. Esto es lo que sucede con el ejercicio, en casos de
anemia intensa, en condiciones de hipoxia (desplazamiento a zonas muy elevadas como,
p. ej., montañas de más de 3.000 m de altura), en la insuficiencia pulm onar crónica o
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con la inhalación crónica de pequeñas cantidades de CO, como en el caso de los fuma
dores crónicos. En todas estas situaciones se produce una eritrocitosis (poliglobulia)
compensadora por estímulo eritropoyético inducido por la hipoxia, que puede variar
ampliamente de un caso a otro.
Ingram C, Lewis S. Clinical use o f W H O haemoglobin colour scale: validation and critique. Clin
Pathol 2000;53(12):933-7.
International Committee for Standardization in Haematology. Recommendations for reference
m ethod for haemoglobinometry in hum an blood and specification for international
haemoglobincyanide reference preparation. 3rd ed. Clin Lab H aematol 1987;9:73-9.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference and selected procedures for
the quantitative determination o f hemoglobin in blood. 2.a ed. Approved Standard. NCCLS
Docum ent H 15-A 2,4,1994.
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Capítulo 6 Hemoglobina 1 7 8 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuál de las siguientes posibilidades define m ejor la estructura de la molécula de hem o
globina?
(a) Dos grupos hemo y dos globinas.
(b) Cuatro grupos hemo y tres globinas.
(c) Cuatro globinas y un grupo hemo.
(d) Cuatro globinas y cuatro grupos hemo.
Respuesta razonada: la hemoglobina es el pigmento rojo que da el color en la sangre y constituye
el 95% del peso seco eritrocitario. Su m olécula es una proteína conjugada de 64.400 daltons
y constituida po r cuatro subunidades (tetrám ero), cuya m isión es el transporte sanguíneo
de prácticam ente todo el oxígeno ( 0 2) y la m ayor p arte del dióxido de carbono ( C 0 2). Es
tructuralmente, la molécula de hemoglobina está formada por cuatro cadenas de globina iguales
dos a dos y cuatro grupos hemo, cada uno de los cuales se halla unido a una cadena de globina.
2. ¿Cuál es la forma molecular de hemoglobina propia del individuo adulto normal?
(a) La hemoglobina HbA2.
(b) La hemoglobina F.
(c) La hemoglobina A.
(d) La hemoglobina Barts.
(e) La hemoglobina H.
Respuesta razonada: durante la vida adulta la forma de hemoglobina predom inante (97%) es
la HbA, existiendo una pequeña fracción (3%) denominada HbA2. Durante la etapa fetal del
desarrollo predomina la llamada hemoglobina fetal (HBF), que en la edad adulta existe siempre
en m uy pequeña proporción (<0,5% ). En el embrión coexisten otras hemoglobinas formadas
por cadenas globínicas inexistentes durante el período fetal o adulto del desarrollo (Hb Gower I,
Hb Gower II y Hb Portland).
3. ¿Dónde se fija el oxígeno para ser transportado por la hemoglobina?
(a) A las cadenas a-globina.
(b) Directamente a la protoporfirina IX del grupo hemo.
(c) Al hierro de la protoporfirina IX, siempre que se halle en forma reducida.
(d) Al hierro de la protoporfirina IX, siempre que se halle en forma oxidada.
(e) A las cadenas (3-globina.
Respuesta razonada: el grupo hemo es el componente no proteico de la hemoglobina y a él se
debe el color rojo de la sangre. Estructuralm ente se com pone de la protoporfirina IX (4 pi
rróles) y 1 átom o de hierro en estado reducido (Fe++). La protoporfirina IX es sintetizada por
los eritroblastos con el concurso de fosfato de piridoxal (vitamina B6). La estructura espacial que
adopta el átom o de Fe++ en su unión con la protoporfirina IX hace que posea una valencia de
coordinación (6.a valencia) para unirse reversiblemente el oxígeno molecular. Este solo se fija al
hierro en su forma reducida (Fe++).
4. En comparación con los pulmones ¿cómo está el grado de saturación de la hemoglobina en
los tejidos?
(a) Aumentado.
(b) Disminuido.
(c) Novaría.
(d) Varía poco.
(e) Su variación depende de la concentración de C 0 2.
Respuesta razonada: para realizar su función transportadora de oxígeno, la hemoglobina presenta
dos estructuras diferentes: 1 ) oxihemoglobina (preferentemente en los pulmones), y 2) desoxi-
hemoglobina (preferentemente en los tejidos). Cuando la concentración de 0 2 o presión parcial
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de 0 2 (P 0 2) es elevada, como sucede en los pulmones, todas las moléculas de hemoglobina se

saturan de oxígeno y, cuando esta disminuye (como sucede, p. ej., en los tejidos), la hemoglobina
libera progresivamente su oxígeno y quedan m uy pocas moléculas saturadas.
5. ¿Por qué la medida de la concentración de hemoglobina es la técnica analítica hematológica
más exacta y precisa?
(a) Porque está directamente relacionada con la edad y el sexo.
(b) Porque es un procedimiento de referencia para el diagnóstico hematológico.
(c) Porque existe u n patrón de referencia internacional para m edir la concentración de
hemoglobina en sangre.
(d) Porque el procedimiento colorimétrico empleado es m uy preciso y exacto.
(e) Porque el m étodo colorimétrico para medir la concentración de hemoglobina es el de
referencia internacional.
Respuesta razonada: la medida de la concentración de la hemoglobina en sangre constituye una
de las pruebas diagnósticas m ás solicitadas en la clínica, ya que resulta imprescindible para el
diagnóstico de la anemia, y también de la eritrocitosis. Debido a que existe un patrón de referencia
internacional trazable, la medida de la concentración de hemoglobina puede realizarse con gran
exactitud y precisión. Los valores de concentración de hemoglobina dependen fundamentalmente
de la edad y el sexo, pero tam bién de la etnia o localización geográfica de la población analizada.
Así, en una determ inada población sana, la variabilidad individual de la concentración de
hemoglobina, exceptuando la edad y el sexo, es muy pequeña.
6. ¿Cuál es el procedimiento de referencia para la determinación de la concentración de hem o
globina?
(a) El método de la cianometahemoglobina.
(b) El método de Sahli (lectura directa).
(c) El método de la oxihemoglobina.
(d) El método de la escala de color.
(e) El método Hemo-Cue.
Respuesta razonada: el procedim iento de referencia para la m edida de la concentración de
hemoglobina adoptado por el ICSH y reconocido por la OMS es el de la cianometahemoglobina.
Tiene com o fundam ento la transform ación previa de la hem oglobina en cianom etahem o
globina (HiCN), que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia, a 540 nm,
puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentración conocida
de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Para esta
determinación existe un patrón HiCN de referencia internacional.
7. En una mujer no embarazada, ¿cuál es el valor de la concentración de hemoglobina en sangre
por debajo del cual se considera que existe anemia?
(a) 100 g/1.
(b) 120 g/1.
(c) 110 g/1.
(d) 130 g/1.
(e) Depende de los valores de referencia del laboratorio.
Respuesta correcgta: b.
Respuesta razonada: los valores de la concentración de hemoglobina en sangre varían ampliamen
te con la edad y el sexo. Así, son especialmente elevados en recién nacidos a térm ino (170-190 g/1)
y bajos durante el embarazo (100-110 g/1). Asimismo, el hom bre tiene una concentración de
hemoglobina en sangre superior a la de la mujer. Debido a estas diferencias y al hecho de que
el diagnóstico de anemia solo debe establecerse sobre la base del valor de la concentración de
hemoglobina, la OMS ha establecido que existe anemia cuando esta es inferior a 13 g/dl (130 g/1)
en el hom bre, a 12 g/dl (120 g/1) en la m ujer no embarazada y a 1 1 g/dl ( 110 g/1) en niños
(< 6 años) y mujeres embarazadas.
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Capítulo 6 Hemoglobina 1 7 8 .e3
8. ¿Por qué la medida de la concentración de carboxihemoglobina en sangre tiene interés clínico?

(a) Porque es un índice indirecto de dopaje en carreras de atletismo.
(b) Porque es una m edida de su grado de saturación.
(c) Porque aumenta cuando un individuo se desplaza a regiones geográficas de gran altitud.
(d) Porque es un índice de intoxicación por el tabaco.
(e) Solo tiene interés diagnóstico en ciertas enfermedades raras.
Respuesta razonada: la carboxihemoglobina (COHb) resulta de la combinación del monóxido
de carbono (CO) con la hemoglobina, y su afinidad para esta proteína es 210 veces superior a
la del oxígeno. Esto significa que el CO se fija a la hemoglobina, aunque su concentración en el
aire sea muy baja (0,02-0,04%).
La CO Hb no puede fijar el oxígeno, p o r lo que no sirve para su transporte, lo cual hace que
un sujeto intoxicado por CO sufra anoxia. La intoxicación por CO se produce por respirar aire
que contiene este gas, como sucede en casos de com bustión defectuosa de braseros, estufas,
calentadores de gas, hornos o motores de gasolina. Más recientemente se ha demostrado que
la combustión del tabaco produce tam bién CO que se fija a la hemoglobina e impide el trans
porte de oxígeno. Es por ello que los fumadores intensos sufren un grado de hipoxia crónica
que puede condicionar un aum ento compensatorio del núm ero de hematíes (poliglobulia o
eritrocitosis del fumador).
9. ¿Para qué sirve la haptoglobina?
(a) Para regular el pH de la sangre.
(b) Para eliminar la hemoglobina libre disuelta en el plasma sanguíneo.
(c) Para sintetizar nuevas moléculas de globina.
(d) Para transportar reversiblemente el oxígeno desde los pulmones a los tejidos y viceversa.
(e) Para eliminar los residuos metabólicos de la hemoglobina.
Respuesta razonada: la haptoglobina (Hp) es capaz de fijar la hemoglobina (Hb) cuando ésta se
halla circulando libre en el plasma. Gracias a ello se evita la eliminación renal de hemoglobina
en condiciones fisiológicas, ya que el complejo H p-H b no puede atravesar el filtro glomerular.
No obstante, cuando en ciertas situaciones patológicas el nivel de hemoglobina libre en el plasma
sobrepasa los 125 mg/100 mi, se agota la capacidad de fijación de la haptoglobina y se elimina por
la orina (hemoglobinuria). Se observan marcados aumentos en diversos estados inflamatorios,
m ientras que, por el contrario, disminuye en las hepatopatías agudas o graves, y en el curso
inicial de las anemias hemolíticas.
10. ¿Cómo se expresa el resultado de la curva de disociación oxígeno-hemoglobina?
(a) En función de la concentración total de hemoglobina en sangre (g/1).
(b) En función del valor de presión parcial de oxígeno necesaria para conseguir el 50% de
saturación (P50) expresado en m ilímetros de mercurio.
(c) En función de la presión creada por una bom ba peristáltica de acuerdo con la presión
parcial de oxígeno (tor).
(d) En función de la concentración de 2,3-DPG.
Respuesta razonada: el comportamiento de la hemoglobina frente a presiones parciales de oxígeno
crecientes es muy característico, de m anera que, al aum entar la concentración de oxígeno, el as
censo de hemoglobina oxigenada es lento, para subir luego rápidamente. Así, entre 0 y 20 mmHg
de P 0 2, la hemoglobina se ha oxigenado poco, mientras que entre 20 y 30 mmHg sufre la máxima
oxigenación. Si esto se representa en un sistema de coordenadas en el que en abscisas figuren
las P 0 2 crecientes en m mHg, y en ordenadas, el porcentaje de oxihemoglobina, veremos que el
gráfico obtenido corresponde a una curva sigmoide característica que en condiciones normales
presenta un valor de P50 (valor de la P 0 2 para el que la hemoglobina se halla saturada de oxígeno
a la mitad) que oscila entre 24-27 mmHg.
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C A P Í T U L O 7
Eritrosedim entación
y otras propiedades físicas
Métodos isotópicos
J. L. Vives C orrons y C. Piera Peña
PROPIEDADES FÍSICAS DE LA SANGRE

Las propiedades físicas de la sangre cuyo estudio tiene interés clínico son tres:
1 . La eritrosedimentación o velocidad de sedimentación globular (VSG).
2. La viscosidad plasmática y de sangre total.
3. Los volúmenes sanguíneos (volumen plasmático y masa eritrocitaria).
Eritrosedim entación o velocidad de sedim entación globular

Principio
Si se deja reposar verticalmente la sangre con anticoagulante en un tubo o en una pipeta
especial, se observa cómo los eritrocitos sedimentan espontáneamente, de manera que
por encima de ellos se forma una columna de plasma. Este proceso se denomina eri
trosedimentación (ES) y la rapidez con que se realiza, velocidad de sedimentación globular
(VSG). La ES es un fenómeno empírico que se altera en muchas situaciones sin que pueda
ser atribuido a una causa concreta, por lo que es considerada una alteración inespecífica,
pero que alerta sobre la posible existencia de un trastorno orgánico o enfermedad
subyacente. De hecho, el fenómeno de la eritrosedimentación constituye un indicador
de la presencia de reactantes de fase aguda y, por ello, su aumento se correlaciona con
el de ciertas citocinas (p. ej., las interleucinas 1 y 6 [IL-1 e IL-6 ]) y la proteína C reactiva,
aunque no exista una relación precisa entre el aum ento de la VSG y el inicio o fase
evolutiva del proceso inflamatorio. Con todo, la simplicidad de su medida y el escaso
coste del método empleado hacen que la VSG sea, aún hoy en día, una de las pruebas de
laboratorio más solicitadas en la práctica clínica.
El fenómeno de la ES obedece a varios factores, entre los que destacan las interaccio
nes electrostáticas que existen entre los eritrocitos debido a su carga de superficie. En
estas últimas intervienen de forma determinante las proteínas del plasma, de manera
que mientras algunas las favorecen (fibrinógeno y globulinas), otras las disminuyen
(albúmina). El mecanismo que rige este fenómeno depende, a su vez, de cuatro factores
relacionados entre sí mediante la ley de Stokes.
• Tamaño y rigidez de los eritrocitos (VCM).
• Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma.
• Viscosidad del plasma.
• Temperatura.

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De acuerdo con ello, el aumento de la ES que se observa en la práctica clínica puede

obedecer a alteraciones del VCM con o sin aumento de la rigidez eritrocitaria, disminu
ciones de la concentración de hemoglobina (anemia) o a alteraciones de las proteínas
del plasma (fibrinógeno, albúmina y globulinas). De todos estos factores, el más deter
minante es el aumento del fibrinógeno, aunque también pueden influir un aumento de
inmunoglobulinas y/o una disminución de la relación albúmina/globulinas. El mecanis
mo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación eritrocitaria no es
aún bien conocido, aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que
normalmente existe entre los eritrocitos debido a su energía superficial o potencial zeta.
El potencial zeta se produce p or una intensa carga negativa en la superficie de los
eritrocitos, la cual explica que estas células se mantengan separadas. La intensidad del
potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y, especial
mente, de la relación entre las concentraciones de albúmina, globulinas y fibrinógeno.
Así, mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo
el fibrinógeno, tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las
globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la
albúmina, lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta
eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los eritrocitos tiene como consecuencia
una mayor tendencia de estos a agregarse y formar las llamadas «pilas de monedas». De
acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las
principales proteínas plasmáticas.
La ES tiene lugar en tres fases (fig. 7-1):
1. Fase de agregación. Los eritrocitos forman agregados o cadenas donde adoptan
el aspecto de «pilas de monedas» o rouleaux (de la terminología francesa). Cons
tituye la fase más im portante, ya que de ella dependerá la velocidad de todo el
proceso. Ello obedece a que los factores que más influyen sobre la ES inciden solo
en esta fase.
2. Fase de sedim entación. Los agregados de eritrocitos formados en la etapa anterior
sedimentan a una velocidad constante hasta completarse del todo. En condiciones
fisiológicas el tiempo máximo necesario para que se complete esta fase es de unos
40 min. Cuanto mayores sean los agregados, más rápidamente sedimentarán y
mayor será la ES.
3. Fase de empaquetam iento. Tanto los agregados como los eritrocitos que han sedi
mentado individualmente se empaquetan y cesa el movimiento de sedimentación.
i II ill
Hemaglutinación Sedim entación Depósito
de eritrocitos FIGURA 7-1. Etapas en el desarrollo
de la eritrosedimentación.
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Capítulo 7 Eritrosedim entación y otras propiedades físicas 181
Los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoide, polimialgia reumática y

tuberculosis) y ciertas neoplasias (linfomas y gammapatías monoclonales), al alterar
la relación albúmina/globulinas, constituyen la causa más frecuente de aum ento de
VSG en la práctica clínica y, por ello, la medida de esta magnitud contribuye no solo
a su diagnóstico, sino también al seguimiento de su curso evolutivo, especialmente la
respuesta al tratamiento.
Métodos para determinar la velocidad de sedimentación globular

Tradicionalmente la VSG (San-Eritrosedimentación; long) se determ ina midiendo la
longitud de la columna de plasma (en milímetros) que queda por encima de los eri
trocitos después de 1 h de sedimentación. Dado que el tiempo mínimo necesario para
completar todo el proceso es de 40 min, la medida se ha estandarizado en 60 min (1 h),
por lo que carece de significado la medida a las 2 h, al igual que el cálculo del «índice de
Katz», que relaciona ambas mediciones entre sí. El método tradicionalmente empleado
para medir la ES es el descrito por Westergren en el año 1921, que aún es considerado
por el International Council for Standardization in Haematology (ICSH) y el Clinical
and Laboratory Standards Institute (CLSI) de EE. UU. como de referencia para la medida
de la VSG.
M étod o de W estergren (m étod o de referencia)

Aunque se trata de un procedimiento poco reproductible y sometido a variables difíciles
de controlar, el método de Westergren (MW) constituye el m étodo de referencia para
medir la ES.
Material
• Sangre total (1-2 mi) tratada con citrato trisódico (dihidrato).
• Solución anticoagulante de citrato trisódico, 109 mmol/1 (32,05 g/1) que viene ya
preparado comercialmente en tubo (a veces sellado al vacío). El ICSH considera que
puede emplearse también EDTA.
• Pipeta de sedim entación. Es u n tu b o calibrado de cristal o m aterial de plás
tico desechable con medidas bien definidas de longitud (300 ± 1 ,5 mm ) y calibre
(2,55 ± 0 ,1 5 m m), que deben m antenerse estrictamente constantes a lo largo del
mismo. En su superficie externa, el tubo, llamado también pipeta de Westergren,
tiene grabada una escala graduada en milímetros (mm) desde 0 (fig. 7-2).
• Soporte con capacidad variable, que inmovilice la pipeta en posición estrictamente
vertical (± 1 °) e impida la salida de sangre por el extremo inferior de la misma.
Método
1. Se extrae sangre venosa (1-2 mi) y se mezcla bien con el anticoagulante en pro
porción exacta (variación ±5%) de cuatro volúmenes de sangre por volumen de
solución anticoagulante. Una vez realizada la mezcla, la ES debe determinarse en
2 h (si la mezcla se conserva a tem peratura ambiente) o en 6 h (si la mezcla se
conserva a +4 °C). En este último caso debe tenerse m uy en cuenta la necesidad
de equilibrar la temperatura de la muestra con la del ambiente (20-25 °C) antes de
realizar la prueba.
2. A p artir de la m uestra bien homogeneizada, se llena la pipeta de Westergren
mediante una propipeta o cualquier otro sistema de succión mecánico hasta que
la sangre alcance el enrase o la marca de 0 mm.
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ñ
*
5 6 7
H
FIGU RA 7-2. Pipeta de Westergren.

Obsérvese junto a una pipeta vacía
un valor de eritrosedimentación
patológico (pipeta n.° 9) y otro normal
(pipetan.0 10).
3. Se coloca la pipeta en el soporte, procurando que quede estrictamente vertical. Se

debe vigilar de modo especial la temperatura ambiente (siempre entre 20 y 25 °C)
o la presencia de vibraciones, la incidencia directa de la luz solar u otros factores
capaces de modificar la ES. La pipeta debe permanecer en dicha posición durante
un tiempo de 60 min.
4. Una vez transcurrido este tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco
de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada
en la marca 0 de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm,
corresponde al de la ES durante la prim era hora (mm/h).
M étod o de W introbe
En 1935, M. Wintrobe describió u na variante metodológica del MW que utilizaba una
mezcla de oxalatos como anticoagulante y tubos (tubos de Wintrobe) en lugar de pipetas.
El m étodo se describe brevemente a continuación:
• Se recoge la sangre m ediante punción venosa y un tubo con mezcla de oxalatos
(oxalato amónico y oxalato potásico).
• Mediante una pipeta Pasteur se llena con la sangre un tubo de W introbe (descrito
para la determinación del valor hematocrito) y se enrasa la columna de sangre hasta
la marca 0 ; se debe procurar que no queden burbujas de aire en la misma.
• Se coloca el tubo en posición estrictamente vertical y transcurrida 1 h se lee la longitud
de la columna de plasma (mm) situada por encima de los eritrocitos sedimentados.
• El valor se expresa en m m/h.
La medida de la VSG en la segunda hora o a las 24 h, muy utilizada durante el pasado
siglo, ha demostrado ser poco fiable y de escasa significación clínica, p or lo que no se
recomienda su uso.
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TABLA 7-1. Analizadores automatizados para medir la velocidad de sedimentación globular
SM® SC® VM®

Tiempo de determinación 30 min 30 min 26 min
Número de tubos 100 50 60
Lectura Infrarrojos Vídeo Infrarrojos
Resultados mm/h mm/h mm/h
Volumen necesario de muestra 1,7 mm 5 mm 1 mm
Precisión 0,1 0,2 0,2
Anticoagulante Citrato sódico Citrato sódico Citrato sódico
SC®, Sediscan, Becton-Dickinson; SM®, Sedimatic 100, Ral; VM®, Ves-Matic 60, Menarini.
M étod os autom atizados

Para aumentar la rapidez y evitar la contaminación del personal con la muestra de sangre,
se han diseñado dispositivos automatizados que emplean material plástico desechable
para medir la VSG. Dichos sistemas, aunque basados en el método de referencia, utilizan
recipientes cerrados que en algunos casos son los mismos tubos cerrados al vacío que
se emplean para la determinación del hemograma automatizado y que contienen una
cantidad precisa de anticoagulante. De esta forma, algunos analizadores hematológicos
automatizados incorporan la posibilidad de ser programados para m edir la VSG sin
necesidad de cambiar de tubo, realizando un mezclado automático de la muestra con el
anticoagulante (EDTA) y utilizando sistemas de lectura basados en fotometría de luz infra
rroja que cuantifica el progreso de los procesos de agregación y sedimentación de los eri
trocitos en función del tiempo. Al objeto de disminuir el tiempo necesario para colocar las
muestras en el analizador, los tubos incorporan lectores de código de barras que permiten
procesar más de 200 muestras en 1 h. Aunque el valor de la VSG puede ya conocerse a los
10-15 min de iniciada la lectura, el resultado siempre viene expresado en mm/h.
Existen en el m ercado varios analizadores autom atizados para m edir la VSG
(tabla 7-1) que completan la determinación en 30 m in o menos y que disminuyen la
posibilidad de errores técnicos y humanos.
Como contrapartida existe también un sistema m ucho más simple y económico,
donde la introducción de la sangre en tubos o pipetas se realiza m ediante bombas
peristálticas y otros artilugios que aumentan la rapidez y precisión del llenado, y evitan
la contam inación del personal técnico. Un ejemplo de este sistema se conoce como
Sediplast® (Polymedco) que utiliza pipetas regladas con citrato de sodio al 3,8% para
un volumen de muestra de 1 mi. El procedimiento que se sigue es muy simple (fig. 7-3):
1. Se destapa el recipiente base, se llena hasta la marca indicada con la sangre del
paciente y se vuelve a tapar.
2. Se introduce la pipeta de ES y automáticamente esta se llena de sangre hasta el
enrase 0 .
3. Se deja la pipeta en posición vertical durante 1 h y se lee la longitud alcanzada por
la columna de plasma (en mm).
C ontrol de calidad
Para la ES existen sistemas de control interno de la calidad y también de evaluación
externa, y se emplean para ello muestras de sangre estabilizadas comerciales de origen
humano o animal. No obstante, dado que la sedimentación eritrocitaria es un fenómeno
exclusivo y transitorio de la sangre fresca, algunos de los materiales de control existentes
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FIGURA 7-3. Método semiautomático para la medida de la eritrosedimentación.
no son apropiados para determinados sistemas automáticos Por ello, y desde un punto
de vista práctico, el mejor procedimiento de control de este método es el interno, que
se basa en: 1 ) cálculo y monitorización de la media diaria acumulada; 2 ) comparación
de muestras de sangre del día guardadas durante 24 h a 4 °C, y 3) comparación entre
resultados del método utilizado con el de referencia. También se han definido límites de
variación aceptables para grupos de muestras con distintos valores de ES.
Valores de referencia e in terpretación d el resultado

Los valores de referencia de la VSG se expresan en m m /h y varían fundamentalmente
con el sexo y, en cierto grado, también con la edad (tabla 7-2). La VSG constituye una
manifestación de la existencia de reactantes de fase aguda y generalmente se acompaña
de alteraciones proteicas del plasma que contribuyen decisivamente a modificar su
valor (cuadro 7-1). Entre ellas destacan los aum entos de VSG debidos a infecciones
agudas, enfermedades crónicas (enfermedad de H orton y polimialgia reumática) o
paraproteinemias (gammapatía m onoclonal). En este últim o caso el aum ento de la
VSG es especialmente manifiesto cuando la proteína posee un elevado peso molecular
(p. ej., IgM). Por ello, la VSG suele ser mucho más elevada en la macroglobulinemia de
Waldenstrom (gammapatía monoclonal tipo IgM) que en el mieloma múltiple, donde
la gammapatía monoclonal es casi siempre del tipo IgG o IgA.
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TABLA 7-2. Valores de referencia de la eritrosedimentación (en mm/h)
Edad (años) X + 2 DE Límite superior

de normalidad
Niños y jóvenes 0-15 5 ± 10 15
Hombres adultos 17-50 4±3 10
51-60 6± 3 12
61-70 6+4 14a
Mujeres adultas 17-50 6± 3 12
51-60 9± 5 19
61-70 10 ± 5 20a
“ Por encima de los 70 años resulta muy difícil establecer valores de referencia para la población aparentemente sana de esta edad.
DE, desviación estándar; X, media.
CUADRO 7-1. Situaciones del organismo que alteran la eritrosedimentación
Causan aumento
Fisiológicas
• Embarazo (a partir del tercer mes)
• Envejecimiento (ocasional)
• Crecimiento (ocasional)
Patológicas
• Aumento moderado"
• Anemia intensa
• Fiebre reumática
• Artritis reumatoide
• Lupus eritematoso diseminado
• Enfermedad renal
• Enfermedad tiroidea
• Infarto de miocardio
• Neoplasias
• Tuberculosis
• Sífilis
• Aumento intenso
• Arteritis de la temporal (células gigantes)
• Polimialgia reumática (enfermedad de Horton)
• Vasculitis necrosante
• Hiperfibrinogenemia (concentraciones elevadas de fibrinógeno)
• Macroglobulinemia de Waldenstrom
• Mieloma múltiple
• Enfermedad de las crioaglutininas
Causan disminución
• Insuficiencia cardíaca congestiva
• Síndrome de hiperviscosidad
• Hipofibrinogenemia (concentraciones disminuidas de fibrinógeno)
• Hipoproteinemia (enfermedad hepática o renal)
• Anemia de células falciformes
" Incrementos propios de la reacción de fase aguda.
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CUADRO 7-2. Factores m etodológico s q u e p u e d e n in flu ir en la m ed id a

de la e ritro sed im en tació n
Causas de aumento
• Desviación de la verticalidad de la pipeta
• Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta
• Elevación de la temperatura ambiente
• Dilución de la sangre
Causas de disminución
• Reducción del diámetro de la pipeta
• Utilización tardía de la sangre
• Cambio del anticoagulante
En otras enfermedades como, por ejemplo, en la llamada enfermedad por crioagluti-

ninas, la presencia en el plasma de globulinas que aglutinan los eritrocitos a temperatura
inferior a la del organismo (37 °C) produce, cuando se trata la sangre a la temperatura del
laboratorio (20-25 °C), marcados aumentos de la VSG. Debido a ello, estas proteínas se co
nocen también con el nombre de aglutininas frías y, ocasionalmente, pueden comportarse
como autoanticuerpos. La presencia de crioaglutininas puede demostrarse generalmente
realizando la determinación de la VSG a 37 °C, ya que con ello se observará la normalización
de su valor o bien un descenso importante de la misma.
Además de las enfermedades que se acompañan de aumentos de la VSG, existen ciertas
situaciones fisiológicas en las que pueden observarse también aumentos, a veces notables,
de la esta; entre ellas destacan el embarazo y la edad. Finalmente, debe tenerse muy en
cuenta que la realización de la VSG, a pesar de su simplicidad, exige mucha atención,
por cuanto diversos factores metodológicos pueden ser la causa de falsos aumentos o
disminuciones de su valor (cuadro 7-2).
Viscosidad plasm ática y sanguínea

Principio
La viscosidad es la resistencia que oponen los fluidos a deformarse. La sangre p or su
naturaleza presenta un comportamiento viscoso característico al circular por el interior
de los vasos sanguíneos. Cuando a un líquido se le aplica u na fuerza tangencial o de
cizallamiento (Z), tiende a deformarse en el sentido de la m isma a una velocidad ( 7 )
que depende de su viscosidad aparente (i\ ).
En el plasma, la relación entre Tiap y 7 es de tipo lineal, lo que significa que este
líquido tiene u n com portam iento new toniano, y el valor de Tia es independiente
del valor de 7 . Por el contrario, en la sangre total, el valor de Tia aum enta de forma
exponencial al dism inuir 7 . Esto significa que, a valores bajos de 7 , la sangre total
presenta u n com portam iento fluido no new toniano; m ientras que, a valores muy
elevados de 7 , el com portam iento de la sangre total se hace newtoniano como el plas
m a (fig. 7-4). El com portam iento no newtoniano de la sangre, a valores bajos de 7 ,
obedece a la tendencia de los eritrocitos a form ar agregados (pilas de monedas) como
consecuencia de un aum ento del potencial zeta generado p o r proteínas plasmáticas
de elevado peso m olecular (fibrinógeno y globulinas). En condiciones fisiológicas
norm ales, el factor determ inante más im portante de la viscosidad sanguínea es el
ERRNVPHGLFRVRUJ
*lap
<cp|
- Sangre total
- Plasma
FIGU RA 7-4. Gráfica que expresa
la relación entre la viscosidad aparente
(■ti ) y la velocidad de deformación (7 )
en sangre total y plasma.
hematocrito. A valores normales de hem atocrito existe una relación lineal entre este y
el logaritmo de la viscosidad, pero esta relación se pierde para valores de hematocrito
muy elevados o muy bajos.
La medida de la visco sid a d p lasm ática (t] ) tiene gran interés en el diagnóstico y
seguimiento de todos aquellos procesos patológicos caracterizados por un aum ento
de las proteínas plasmáticas capaces de aum entar el potencial zeta existente entre los
eritrocitos: fibrinógeno (hiperfibrinogenemias) y globulinas (gammapatías policlonales
y monoclonales).
En consecuencia, estudios realizados bajo los auspicios de la ICSH demuestran que
la medida de la viscosidad plasmática tiene el mismo valor clínico que la VSG en el
diagnóstico y seguimiento de la llamada fase de reacción aguda propia de los procesos
inflamatorios.
Ciertas enfermedades, como el mieloma y la macroglobulinemia de Waldenstrom,
caracterizadas por la presencia en el plasma de una paraproteína a elevada concentración
(IgG, IgA o IgM) presentan generalmente valores elevados de viscosidad plasmática
(> 2 mPa/s) que, en ocasiones, se acom pañan de manifestaciones clínicas propias del
llamado síndrome de hiperviscosidad sanguínea (dificultad que la sangre tiene para
circular por los vasos sanguíneos de pequeño tamaño). La determinación de la viscosidad
plasmática en estos enfermos es de gran valor clínico, no solo para el diagnóstico sino
para monitorizar el tratamiento.
Estudios recientes han dem ostrado tam bién que la viscosidad plasmática guarda
correlación con la presión arterial. Por ello esta m agnitud es hoy en día considerada de
utilidad como medida de factor de riesgo frente a enfermedades cardiovasculares, es
pecialmente la aterosclerosis y el infarto de miocardio.
Material y método
El principio de los métodos aplicados a la medida de la viscosidad depende de cómo se
trate de medir la viscosidad plasmática o la de sangre total. Si se trata de m edir la vis
cosidad plasmática (n ), debido a que el plasma se comporta como un fluido newtoniano,
el valor de la velocidad de deformación empleado tiene poca importancia. Por ello, puede
utilizarse un simple viscosímetro capilar, en el que la viscosidad viene determinada por
el tiempo que el plasma tarda en atravesar un tubo capilar a temperatura controlada y
constante. El viscosímetro capilar más empleado en la práctica clínica para determinar la
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FIGU RA 7-5. Viscosímetro de

Harkness.
viscosidad plasmática ha sido, desde hace ya muchos años, el de Harkness (fig. 7-5). Este
instrumento de fácil y cómodo manejo, es muy preciso y presenta un sistema de control
de la temperatura que permite trabajar siempre a temperatura constante. La cantidad de
plasma necesario para realizar la determinación es, asimismo, muy pequeña (0,3-0,5 mi)
y los resultados se expresan en milipascales p or segundo. A ctualmente existen en el
comercio instrumentos muy versátiles, de fácil instalación y manejo (viscosímetros de
Brookfield) que permiten medir la viscosidad plasmática de forma rápida y precisa. Su
elevado automatismo permite que sean utilizados por personal sin excesiva formación
técnica (fig. 7-6).
Si se trata de determinar la viscosidad de sangre total, debe emplearse un sistema en
el que, además de la temperatura, se controle también de manera m uy precisa el valor
de la velocidad de deformación. En la actualidad, existen dos tipos de viscosímetros
para sangre total que permiten trabajar en un margen muy amplio de velocidades de
deformación:
• Viscosímetros con sistema cono-plato.
• Viscosímetros de ejes coaxiales.
En los viscosímetros con sistema cono-plato, la muestra de sangre se sitúa entre dos
piezas: el cono y el plato (fig. 7-7), de forma que el primero gira sobre el segundo y somete la
sangre a fuerzas de cizallamiento variables. En los viscosímetros de ejes coaxiales, la muestra
de sangre se coloca entre dos cilindros concéntricos, de forma que, en este sistema, la fuerza
de cizallamiento es producida por la rotación del cilindro exterior sobre el interior (fig. 7-8).
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U7 FIGU RA 7-8. Esquema de un

viscosímetro de ejes coaxiales.
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La viscosidad plasmática varía normalmente con la edad, el sexo, el régimen alimenticio, la
práctica de ejercicio físico, la menstruación y el embarazo, y aumenta en todas aquellas
enfermedades en las que existen elevaciones del fibrinógeno, la a 2-macroglobulina o
las 7 -globulinas (inmunoglobulinas) en su forma policlonal (aumento generalizado de
todas las globulinas) o monoclonal (aumento exclusivo de un solo tipo de 7 -globulinas).
Los valores normales de viscosidad plasmática a 25 y 37 °C para adultos de edades com
prendidas entre 25 y 75 años se indican en la tabla 7-3.
Los valores norm ales de la viscosidad sanguínea dependen, además de la te m
peratura empleada en su determ inación, del valor hem atocrito y de la velocidad de
deform ación ( 7 ) utilizada. A valores de 7 m uy elevados, los valores de viscosidad
sanguínea son solamente algo superiores a los de la viscosidad plasmática. Ello obedece
a que, en estas condiciones, la sangre se com porta como un líquido newtoniano, al
igual que el plasma .6
La viscosidad sanguínea se modifica también en todas aquellas situaciones donde
existe una alteración de la viscosidad plasmática (cuadro 7-3). No obstante, existen
enfermedades en las que se observa un gran aumento de la viscosidad sanguínea, sin
que necesariamente varíe la viscosidad plasmática. Entre ellas destacan los grandes
aumentos del hematocrito (poliglobulia), de las plaquetas (trombocitemia esencial) o
de los leucocitos (leucemia mieloide crónica).
D eterm inación del volum en sanguíneo o volemia

Principio
El principio general que se emplea en la determinación de volúmenes corporales del
plasma y eritrocitos es el del análisis de dilución mediante un trazador adecuado.
En la actualidad, los isótopos han sustituido ampliamente los trazadores coloreados,
tales como el azul de Evans, y su empleo ha sido estandarizado por el ICSH. Tanto en
determinadas situaciones fisiológicas (embarazo) como patológicas, la principal causa
de variaciones en la volemia corresponde a las alteraciones del volumen plasmático.
Debido a ello, en todas estas situaciones, ni el hematocrito ni el recuento de eritrocitos
TABLA 7-3. Valores de referencia de la viscosidad plasmática (mPa/s)
A 25 °C A 37 °C
X Límites X Límites
Población global 1,74 ±0,1 1,54-1,74 1,25 ± 0,5 1,15-1,35
Variaciones con la edad:
- 25 a 34 años <1,83 <1,42
- 35 a 44 años <1,88 <1,46
- 45 a 75 años <1,93 <1,5
Variaciones inespecíficas de las 2,15 ± 0,4 1,75-2,55 1,7 ± 0,3 1,36-1,99
proteínas del plasma
Síndrome de hiperviscosidad >2,55 >2
(paraproteinemias)
mPa/s, milipascales po r segundo.
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CUADRO 7-3. Situaciones que pueden cursar con aumento de la viscosidad plasmática
• Infecciones agudas
• Neumonía
• Síndromes inflamatorios crónicos
• Polimialgia reumática"
• Tuberculosis
• Sífilis
• Artritis reumatoide
• Lupus eritematoso diseminado
• Necrosis de tejido
• Infarto de miocardio
• Enfermedades metabólicas
• Diabetes mellitus
• Hipertensión arterial
• Neoplasias
• Metástasis
• Gammapatías monoclonales
• Hemodilución
• Embarazo
• Hábitos tóxicos
• Tabaquismo
" Aumento superior a 100 m m /h m uy característico y constante.
son reflejo del contenido hemoglobínico del organismo. Así, un aumento del volumen
plasmático no acompañado de variaciones en el número total de eritrocitos producirá
un descenso del hematocrito y de la concentración de hemoglobina (falsa anemia por
hemodilución). Por el contrario, una disminución del volumen plasmático cursará con
aumento del hematocrito y de la concentración de hemoglobina (falsa poliglobulia por
hemoconcentración).
Medida del volumen eritrocitario

E m pleo de eritrocitos m arcados con crom o 51
Los trazadores isotópicos más utilizados para la determ inación del volumen de eri
trocitos son el cromato sódico 51Cr (E = 320 kiloelectronvoltio [keV]; T l/2 = 27 días) y
el pertecnetato sódico 99mTc (E = 140 keV; Tl/2 = 6 h). Este último, por sus características
físicas, es el ideal en pediatría y sobre todo en situaciones en las que se precise determinar
volemias seriadas en cortos períodos de tiempo.
Material
• Cromato sódico (Na2 51Cr20 4): actividad específica superior a 740 megabequerelio
[MBq]/mg.
• ACD-A: citrato trisódico dihidratado (22 g), ácido cítrico ( 8 g), dextrosa (25 g) y agua
destilada (c.s.p. 1 . 0 0 0 mi).
• S aponinaal0,l% .
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• Hidróxido amónico (0,4 g/1).

• EDTA disódico o dipotásico en la proporción de 1,5 ± 0,25 mg/ml de sangre.
• Heparina: 10 UI o 0,1 mg/ml de sangre.
• Solución salina isotónica (NaCl, 0,15 mol/1): 9 g de NaCl en 1 1 de agua destilada
(9 g/1).
• Centrífuga de microhematocrito.
• Contador de centelleo para emisores de radiación -y.
Método
1. Se extraen 10 mi de sangre venosa y se tratan con 1,5 mi de solución ACD-A.
2. Se centrifuga a 1.000 g durante 5 min y se descarta el sobrenadante. Si la cifra de
leucocitos es superior a 25 X 109/1 y/o la de plaquetas, mayor de 500 X 109/1, se
descarta también esta capa de células.
3. Se añade lentamente, bajo agitación suave y continua, el cromato sódico (5lCr)
a los eritrocitos. La cantidad d el 51 Cr utilizada debe ser inferior a 7,4 MBq/kg de
peso corporal y hallarse en un volumen superior a 0 , 2 mi, diluido con solución
salina isotónica.
4. Se incuba la mezcla a 37 °C durante 15 min.
5. Se lavan las células dos veces con 4-5 volúmenes de solución salina isotónica. La
actividad remanente en el sobrenadante tras el segundo lavado debe ser inferior
al 1 %.
6 . Si la fragilidad osmótica de los eritrocitos está aumentada (esferocitosis heredi
taria), se utiliza solución salina más concentrada ( 1 2 g/1).
7. Se resuspenden las células con solución salina a un volumen de aproximadamente
1 0 mi y se preparan dos jeringas con volúmenes conocidos de la suspensión de
eritrocitos marcados (p. ej., 8 y 2 mi), que se utilizarán como dosis de inyección
y dosis estándar, respectivamente.
8 . La m edida de la actividad de la dosis estándar nos p erm itirá determ inar la
actividad total inyectada, ya que conocemos la relación volumen de dosis de
inyección/volumen de dosis estándar. En la práctica se cometen menos errores si
se pesan las jeringas antes y después de su utilización. La relación del peso sería
igual a la relación de volúmenes, ya que partimos de una misma resuspensión
de eritrocitos.
9. Se diluye la dosis estándar, una vez pesada la jeringa que la contiene, a un volumen
determinado (p. ej., 11) con solución de NH4OH y se pesa posteriormente la
jeringa vacía.
10. Se colocan partes alícuotas (p. ej., 1 mi) de la solución del matraz, por triplicado,
en tubos de recuento.
11. Se pesa la jeringa con la dosis de inyección, antes y después de la administración,
cronometrando el tiempo hacia la mitad de la inyección.
12. Si el paciente ha sido sometido a alguna exploración isotópica previa, deberá rea
lizarse una extracción basal de sangre antes de la administración de los eritrocitos
51 Cr para descontar la actividad residual.
13. Se extraen 5-10 mi de sangre a los 20 min, por una vena distinta a la de la inyección,
utilizando EDTA como anticoagulante.
14. Si se sospecha un retraso en la homogeneización de los hematíes 51Cr inyectados
(pacientes con esplenomegalia), se efectuará la extracción a los 60 m in de la
inyección.
ERRNVPHGLFRVRUJ
15. Se colocan partes alícuotas de sangre del mismo volumen que el estándar (p. ej.,
1 mi) por triplicado en tubos de recuento.
16. La adición de unas gotas de solución de saponina a las muestras sanguíneas, que
deben ser contadas, evitará la sedimentación de los eritrocitos y, por tanto, errores
de geometría de recuento.
17. Se determina el hematocrito con la sangre residual.
18. Se mide la radiactividad de las muestras en un contador de centelleo para emisores
de radiación 7 ; previamente se han seleccionado las condiciones de recuento para
e l 51 Cr. El coeficiente de variación debido a las estadísticas de recuento no debe
exceder del 2 %.

Para calcular el resultado hay que determinar la media de los triplicados de cada muestra
y restar la radiación de fondo.
T. , . . . Actividad administrada (c.p.m.) S x V x P/p Hvc

Volumen entrocitano = ----------------------------------- £-------= -------------- - x ------
Actividad eritrocitaria (c.p.m./ml) A 100
S = concentración radioactiva de la solución estándar (c.p.m./ml).

V = volumen de dilución del estándar (mi).
P/p = relación de pesos (o volúmenes) de dosis inyectada/dosis estándar.
Hvc = hematocrito venoso corregido por atrapamiento plasmático (%).
A = concentración radiactiva de la sangre extraída (c.p.m./ml).
Em pleo de eritrocitos m arcados con tecnecio 99 m etaestable (99mTc)

Material
• Pertecnetato sódico (Na99mT c 0 4): obtenido del generador de molibdeno (99mMo).
• Pirofosfato de estaño: 15 mg de pirofosfato de estaño decahidratado y 2 mg de cloruro
de estaño dihidratado (SnCl2*2H20 ).
• Los mismos reactivos y material que para la determinación del volumen eritrocitario
con 51Cr, excepto el Na251Cr20 4.
Método
1. Se extraen 7 mi de sangre venosa con 1 mi de ACD-A.
2. Se centrifuga a 1.000 g durante 5 min y se descarta el sobrenadante.
3. Se diluye el vial de pirofosfato de estaño con 10 mi de suero fisiológico y se añaden
0,1 mi (10 (xg de Sn2+) al concentrado de eritrocitos, resuspendiendo al volumen
inicial con suero fisiológico.
4. Se incuba 10 m in a temperatura ambiente.
5. Se centrifuga a 1.000 g durante 5 m in y se elimina el sobrenadante.
6 . Se resuspende con suero fisiológico y se repite el paso anterior.
7. Se añaden entre 1,8 a 3,8 MBq de Na99mT c 0 4 en aproximadamente 3 mi de suero
fisiológico.
8 . Se incuba 10 m in a temperatura ambiente.
9. Se repiten los pasos 5 y 6 .
10. Se resuspenden los eritrocitos marcados hasta 5 mi con suero fisiológico.
La preparación de las dosis de inyección y estándar, la administración y extracción de
muestras y el recuento y cálculo de resultados se realizan de forma similar a lo expuesto
ERRNVPHGLFRVRUJ
en la determinación del volumen de eritrocitos con 51Cr. Únicamente se deberá tener en

cuenta que, debido a la rápida elución del 99mTc de los eritrocitos, este método no podrá
aplicarse en aquellos sujetos en los que la extracción de sangre deba efectuarse a los 60 min.
M edida del volum en plasm ático

Para la medida del volumen plasmático se utiliza como trazador la seroalbúmina humana
marcada con 125I (E = 35 keV; T 1/2 = 60 días) o 131I (E = 364 keV; T 1/2 = 8 días) (ASH-125I
o ASH- 131I).
Material
• ASH (125I o 131I): concentración proteica, 20 g/1, con menos del 2% de yodo libre.
• Heparina: 10 UI o 0,1 mg/ml de sangre.
• Alcohol etílico.
• Solución salina isotónica (NaCl), 0,15 mol/1 (9 g/1).
• Contador de centelleo para emisores de radiación 7 .
Método
1. Se extraen 20 m i de sangre con heparina.
2. Se centrifuga a 1.000 g durante 10 min.
3. Se colocan aproximadamente 7 m i de plasma en un segundo tubo y se añaden
3,7 kBq/kg de peso corporal de ASH (125I o 131I), agitando suavemente.
4. Se incuba durante 30 m in a temperatura ambiente.
5. Se preparan dos jeringas con las dosis de inyección y estándar, de forma similar
a la utilizada en la determinación del volumen eritrocitario, pesándolas antes y
después de su utilización.
6 . Se diluye el contenido de la dosis estándar en un volumen conocido de solución
salina (p. ej., 1 1 ), y se añade una pequeña cantidad de alcohol etílico.
7. Se colocan partes alícuotas (p. ej., 1 mi) de la solución estándar, por triplicado,
en tubos de recuento.
8 . Se administra la dosis y se extraen muestras sanguíneas por una vena distinta a la
de la inyección, a los 10,20 y 30 min, utilizando heparina como anticoagulante.
9. Se centrifugan las muestras, se obtiene plasma y se dispensan partes alícuotas
del mismo volumen que el estándar en tubos de recuento.
10. Se procede al recuento de las muestras en las condiciones del 125I o 13II con un
coeficiente de variación no superior al 2 %.

Hay que determ inar la media de los triplicados de cada muestra y restar la radiación
de fondo.
, , .. Actividad administrada (c.p.m.) SxVxP/p

V o lu m e n p lasm á tic o = ----------------------------------------- -------- = ---------------- —
Actividad plasmática (c.p.m./ml) A0
S = concentración radioactiva de la solución estándar (c.p.m./ml).

V = volumen de dilución del estándar (mi).
P/p = relación de pesos (o volúmenes) de dosis inyectada/dosis estándar.
Ao = concentración radiactiva del plasma a T 0 (extrapolación a tiempo 0 de la recta
obtenida representando en coordenadas semilogarítmicas las actividades de las mues
tras plasmáticas extraídas a los 10,20 y 30 min en c.p.m./ml).
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CUADRO 7-4. F orm as d e expresar la volem ia
• Peso corporal (m l/kg)

• Peso corporal ideal (ml/kg)
• A p a rtir de tablas estándar"
• A p a rtir del cálculo: peso (kg) = altura (cm ) - 100
• A p a rtir de volem ia n orm al deducida m ediante el tejido g raso*1
• Fracción de volem ia n orm al deducida a p a rtir de fórm ulas em píricas, en las que
intervienen el peso, la talla y la superficie corporal totalc
“ Diew L, Lenter C, editors. Body measurements in Documenta Seigg. Scientific Tables. 7th ed. Basilea: Seigt; 1970. p. 712.
b H uff R, Filler DD. Relation o f circulating red cell volume to body density and obesity. J Clin Invest 1956;35:1.
cSchmidt RD, editor. H andbook series in clinical laboratory sciences. Palm Beach: CRC Press; 1979. p. 33-9.

Los valores de referencia de la volemia y los del volumen plasmático y eritrocitario
pueden expresarse de diferentes formas (cuadro 7-4). En general, la forma de expresión
más frecuentemente empleada es la de ml/kg de peso corporal, y los valores normales
con límite de confianza del 95% están resumidos en la tabla 7-4.
Las condiciones que pueden modificar la volemia son todas aquellas que, de una
u otra forma, alteran los valores del volumen eritrocitario (cuadro 7-5) y plasmático
(cuadro 7-6).
PRUEBAS FUNCIONALES E ISOTÓPICAS

Supervivencia eritrocitaria o vida m edia
La utilización de trazadores radiactivos proporciona resultados de gran interés en el
estudio de las anemias debidas a aum entos en la destrucción de los eritrocitos (ane
mias hemolíticas). Así, mediante inyección de eritrocitos marcados con 51Cr, podemos
determinar no solamente su supervivencia, de forma semicuantitativa, sino también
los lugares de destrucción o secuestro. Para ello, el ICSH recomienda el empleo de un
método estandarizado.
Los estudios de supervivencia de eritrocitos tienen que realizarse marcando las células
del propio paciente, aunque deberán utilizarse los de un donante compatible en los casos
en que se trate de diferenciar si el proceso hemolítico es debido a un defecto intrínseco
de los eritrocitos o a causas patológicas extrínsecas al mismo.

El paciente no debe haber recibido transfusiones al menos durante las 8 semanas previas
al estudio, ya que el mareaje de las células del donante alteraría considerablemente el
TABLA 7-4. Valores de referencia de la volemia
Volemia Volumen plasmático Volumen eritrocitario

Hombres 69 ± 10 ml/kg 39 ± 5 ml/kg 30 ± 5 ml/kg
Mujeres 65 ± 10 ml/kg 40 ± 5 ml/kg 25 ± 5 ml/kg
“ Debido a la variabilidad del volumen plasmático, no se ha conseguido un nivel de precisión suficiente para poder
establecer unos intervalos de confianza adecuados.
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CUADRO 7-5. Causas que pueden modificar la volemia.

Variaciones de la masa eritrocitaria
A u m e n to
• Policitem ia vera
• Eritrocitosis (poliglobulia secundaria)
• A ltitud
• Enferm edad obstructiva p ulm onar crónica
• S h u n t cardiovascular
• O besidad intensa (síndrom e de Pickwick)
• Hipoventilación
• H em oglobinopatía con a um ento de la afinidad p o r el oxígeno
• D ism inución congénita del 2,3-D PG eritrocitario
• Tabaquism o (carboxihem oglobinem ia) y síndrom e de G aisbóck
• Excesiva producción de eritropoyetina
• Carcinom a renal o hepático
• Poliquistosis renal
• H idronefrosis
• Trasplante renal
• H em angioblastom a cerebeloso
• Fibrom a uterino
• Carcinom a de ovario
• Hiperplasia corticosuprarrenal
• Poliglobulia fam iliar
D is m in u c ió n
• Anem ia
• H em orragia aguda
• Posparto
2,3-DPG, ácido difosfoglicerato.
resultado. Por otro lado, es absolutamente necesario que el paciente se halle en situación de
equilibrio, es decir, cuando el ritmo de producción sea igual al ritmo de destrucción celular.
Un hematocrito constante antes del período de estudio o durante este será un índice
del estado de equilibrio. En condiciones ideales, el recuento de reticulocitos y la concen
tración de hemoglobina deben ser también constantes al menos 2 meses antes de iniciarse
la prueba.
Material y método
El material utilizado y también el método de mareaje son los que se han descrito para
la determinación del volumen eritrocitario, utilizando 18,5 kBq/kg de peso corporal de
Na 251Cr20 4.
1. Se extraen 10 mi de sangre venosa a los 20 m in de la inyección de los eritrocitos
marcados (a los 60 min en pacientes con esplenomegalia) y posteriormente a las
24 h, cada 2 días durante la prim era semana y cada 3 días durante la segunda y
tercera semana del estudio.
2. Se determina el hematocrito de cada muestra sanguínea y se colocan 2 o 3 mi de
sangre, por duplicado, en un tubo de recuento, añadiendo unas gotas de saponina.
3. Se cuentan todas las muestras el mismo día, una vez finalizado el estudio, así se
evita la corrección por decaimiento físico del isótopo.
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CUADRO 7-6. Causas que pued en m odificar la volemia. Variaciones del volum en plasm ático
Aumento
• Insuficiencia cardíaca congestiva
• N efritis intersticial
• M ielom a m últiple
• M acroglobulinem ia de W aldenstrom
• Cirrosis hepática
• Esplenom egalia tropical e idiopática
• Esplenom egalia secundaria intensa
• Em barazo (segundo y tercer trim estre)
• Policitem ia vera
• H em orragia intensa (varias h oras después de producida)
Disminución
• Síndrom e de Gaisbóck
• Insuficiencia circulatoria
• H ipertensión esencial
• Deshidratación
• Edem a intersticial
• O rtostatism o
• A ltitud
• A nem ia grave
• H em orragia aguda e intensa (inm ediatam ente después de producirse)
• Enferm edades m etabólicas y carenciales
Cálculo e interpretación del resultado

La radiactividad de las muestras sanguíneas decrecerá a medida que transcurra el estudio,
fundamentalmente debido a tres mecanismos:
1. Elución del trazador. El 51Cr se eluye de los eritrocitos a razón de aproximadamente
un 1 % por día, aunque varía según las enfermedades.
2. Senescencia diaria de, aproximadamente, el 1% de los eritrocitos, para una su
pervivencia eritrocitaria de 1 0 0 a 1 2 0 días.
3. Destrucción aleatoria de eritrocitos, en general por hemólisis.
Si se corrigen los valores obtenidos en cada muestra de eritrocitos por la elución del
trazador (tabla 7-5) y se representan las actividades por mililitro (mi) de sangre total en
función del tiempo, pueden obtenerse dos trazados:
1. Una línea recta: indica que la destrucción se efectúa únicamente por senescencia.
La supervivencia se expresará como la inversa de la pendiente obtenida por ex
trapolación de la línea de puntos a tiempo cero.
2. Una exponencial: indica que la destrucción es predominantemente aleatoria o al
azar. En este caso, los valores se representan en coordenadas semilogarítmicas y
la supervivencia se determina dividiendo el T l/2 de la recta por 2 (0,693).
En ocasiones, se observa la existencia de una doble función exponencial. Esto puede
ser debido a dos causas fundamentales:
1. Error en las condiciones de la exploración como, por ejemplo, la realización del
estudio en un sujeto portador de hemólisis congénita y que ha sido transfundido
recientemente.
2. Ciertas afecciones o defectos no repartidos homogéneamente en todas las células:
déficit de piruvato cinasa, hemoglobinuria paroxística nocturna o p-talasemia.
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TABLA 7-5. Factor de corrección por elución del 51Cr de los eritrocitos
Día Factor Día Factor Día Factor

1 1,03 11 1,16 21 1,29
2 1,05 12 1,17 22 1,31
3 1,06 13 1,18 23 1,32
4 1,07 14 1,19 24 1,34
5 1,08 15 1,2 25 1,36
6 1,1 16 1,22 26 1,38
7 1,11 17 1,23 27 1,4
8 1,12 18 1,25 28 1,42
9 1,13 19 1,26 29 1,45
10 1,14 20 1,27 30 1,47
En pacientes fuera de la situación de equilibrio no es posible determ inar la super

vivencia con precisión, ya que esta situación conlleva una variabilidad incontrolable
del resultado. Al efectuar el estudio será necesario realizar una medida de la volemia al
objeto de corregir el recuento de los especímenes de sangre en cuentas/ml de sangre total.
En la práctica, especialmente cuando no se requiera una excesiva precisión, puede
determinarse el T 50 del 51Cr, es decir, el tiem po que tarda la actividad obtenida al ex
trapolar los puntos a tiem po cero (coordenadas semilogarítmicas) en reducirse a la
mitad (fig. 7-9).
La existencia de pérdidas sanguíneas digestivas durante el desarrollo del estudio in
troduce una fuente de error importante en el cálculo de la supervivencia. Por ello, ante
la sospecha de hemorragia es aconsejable cuantificarla para excluir un acortamiento
de la supervivencia debido a este mecanismo.
Valores de referencia
La supervivencia eritrocitaria norm al es de 120 ± 15 días, mientras que es de 28 días
(25-30) calculada mediante la T50. Valores inferiores a los límites expuestos indican la
existencia de un proceso hemolítico.
Detecciones externas
Los estudios de secuestro esplénico se realizan habitualmente y de forma simultánea a la
determinación de la supervivencia eritrocitaria mediante empleo de un detector externo
FIGU RA 7-9. Gráfica de la

supervivencia eritrocitaria expresada
en (51Cr, t|/2). H, hemólisis;
N, supervivencia normal.
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FIGU RA 7-10. Deleciones

externas del 51Cr en un paciente con
esferocitosis hereditaria. El trazo
discontinuo representa los cocientes
área esplénica/área precordial. Es
evidente el secuestro exclusivo a nivel
esplénico.
de la radiación 7 . Las detecciones externas se practican normalmente en el área precor

dial, esplénica y hepática durante los días en que se realiza el estudio de supervivencia
eritrocitaria. El cociente entre la actividad esplénica y la precordial es el mejor índice
de secuestro esplénico. Así, mientras cocientes entre 0,4 y 0,8 son considerados como
normales, valores superiores a 1,5 son francamente patológicos (fig. 7-10). No obstante,
un secuestro inicial con elevación constante refleja un incremento del pool esplénico
(esplenomegalia), mientras que un incremento progresivo y gradual indica un secuestro
activo de los eritrocitos marcados.
La realización previa de una gammagrafía esplénica con eritrocitos marcados con
99mTc y alterados por calor contribuirá a la mejor localización de los detectores en la
zona de máxima actividad esplénica. En la tabla 7-6, se señalan los lugares de secuestro
en las principales causas de anemia hemolítica.
Medida de la concentración de eritropoyetina plasm ática

Principio
La determinación de eritropoyetina (EPO) se realiza según una técnica inm unorra-
diométrica (IRMA), en una sola etapa, con dos anticuerpos monoclonales. La muestra
TABLA 7-6. Secuestro de los eritrocitos marcados con 51Cr
Enfermedades Lugar predominante

Esferocitosis hereditaria Bazo
Anemias hemolíticas adquiridas Bazo
Afecciones renales y hepáticas Bazo
Déficit de piruvato cinasa Hígado
Anemia de células falciformes Hígado
Hemoglobinuria paroxística nocturna Bazo e hígado
Anemia hemolítica hereditaria no esferocítica Bazo e hígado
Anemias hemolíticas inmunológicas Bazo y/o hígado
Déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa Vascular
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problema reacciona simultáneamente con antieritropoyetina marcada con 125I y con otra
ligada a la pared del tubo de ensayo (técnica «sándwich»).
Material
La dosificación de EPO se realiza en suero o en plasma (sangre recogida sobre heparina
o EDTA). En caso de que la m edida no se realice inmediatamente, el espécimen debe
guardarse a —20 °C. El instrumental necesario para realizar esta técnica es el siguiente:
• Contador de centelleo para emisiones de radiación 7 .
• Vórtex.
• Agitador de gradillas.
• Dispositivo de aspirado o succión de líquidos.
Reactivos
• Antieritropoyetina 1251,11 mi de solución que contenga inmunoglobulina monoclonal
de ratón, antieritropoyetina purificada, albúmina bovina y 0 , 1 % de azida de sodio en
tampón Tris 0,1 M a pH 7,4. Actividad < 740 kBq.
• Tubos recubiertos con antieritropoyetina: 100 tubos de poliestireno recubiertos con
inmunoglobulina monoclonal de ratón antieritropoyetina.
• Calibradores: un vial de calibrador 0 y seis viales de diferente concentración de
eritropoyetina, liofilizados, que contengan albúmina bovina y mertiolato. Disueltos
con 3 y 2 mi de agua destilada, respectivamente, se obtienen siete preparaciones de
diferente concentración de eritropoyetina (0,5,15,50,150, 300 y 800 mU/ml).
• Sueros control: dos viales liofilizados que contengan suero hum ano (control I) y
suero hum ano con eritropoyetina (control II). Al realizarse una reconstitución con
2 mi de agua destilada se obtienen dos sueros de concentración conocida destinados
al control de calidad del ensayo.
Método
1. Se reconstituyen los calibradores y sueros control con agua destilada y se espera
a que todos los reactivos y sueros problema alcancen la temperatura ambiente.
2. Se marca el suficiente número de tubos recubiertos de antieritropoyetina para iden
tificar los calibradores, las muestras problema y los sueros control, por duplicado.
3. Se añaden 200 mi por duplicado de calibradores, sueros problema y controles a
los tubos correspondientes.
4. Se dispensan 100 mi de antieritropoyetina 125I a cada tubo y se mezcla suavemente
al vórtex.
5. Se incuba durante 3 h a temperatura ambiente con agitación constante.
6 . Se aspira el contenido cuidadosamente.
7. Se añaden 2 mi de agua destilada y se aspira el contenido de los tubos.
8 . Se repite el paso 7.
9. Se colocan los tubos en el contador de centelleo y se determinan las c.p.m. de cada
tubo en las condiciones del 125I.

Para calcular el resultado hay que elaborar la recta de calibración con los puntos obtenidos
al representar en el eje de ordenadas la media de las c.p.m. de cada pareja de calibradores y
en el eje de abscisas, las concentraciones correspondientes. La concentración de EPO de una
muestra problema se obtiene interpolando en la recta de calibración la media de las c.p.m.
de la pareja de tubos correspondiente a cada factor desconocido o problema (fig. 7-11).
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FIGU RA 7-11. Representación

gráfica para el estudio de la
eritropoyetina.

Los valores normales de eritropoyetina oscilan entre 4 y 16 mU/ml. Mediante la deter
minación de eritropoyetina podemos realizar el diagnóstico diferencial entre las poli-
globulias primarias, en las que se observa una secreción normal o disminuida de EPO,
y las poliglobulias secundarias con producción aumentada. Se observan aumentos de
EPO en pacientes con anemia ferropénica y megaloblástica, talasemia, aplasia medular y
síndromes inflamatorios. La tasa de EPO aumenta progresivamente durante el curso del
embarazo, y también en sujetos bajo tratamiento citostático. Pueden encontrarse bajos
niveles de EPO en pacientes con insuficiencias renales, hipofisariay tiroidea y con cirrosis.
Berga Ll, Vives Corrons JL, Feliu E, Woessner S, Rozman C. Hemorreología. Bases teóricas y
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ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 7 Eritrosedim entación y otras propiedades físicas 2 0 1 .e l
Autoevaluación
1. ¿Qué es la velocidad de sedimentación globular?
(a) Un signo de enfermedad o trastorno orgánico.
(b) La velocidad con que sedimentan espontáneamente los hematíes en un tubo vertical.
(c) Un fenómeno físico de la sangre que aumenta con la edad.
(d) Una alteración de la sangre que se observa cuando existe una infección.
Respuesta razonada: si se deja reposar verticalmente la sangre con anticoagulante en un tubo
o en una pipeta especial, se observa cóm o los eritrocitos sedim entan espontáneam ente, de
manera que p or encima de ellos se form a una columna de plasma. Este proceso se denomina
eritrosedimentación (ES) y la rapidez con que se realiza, la velocidad de sedimentación globular
(VSG). La ES es un fenómeno empírico que puede alterarse en muchas situaciones sin que pueda
ser atribuido a una causa concreta (alteración inespecífica), pero que alerta sobre la posible exis
tencia de un trastorno orgánico o enfermedad subyacente.
2. ¿Cuál es factor que mayormente contribuye al fenómeno de la eritrosedimentación?
(a) La mayor densidad que los hematíes tienen respecto al plasma.
(b) Las interacciones electrostáticas que existen entre los eritrocitos debido a su carga de
superficie.
(c) Ciertas proteínas del plasma que inhiben el factor antiagregante eritrocitario.
(d) La disminución de la concentración de fibrinógeno plasmático.
(e) La agregación de las inm unoglobulinas que se produce en determinadas situaciones
patológicas.
Respuesta razonada: el fenómeno de la ES obedece a varios factores, entre los que destacan las
interacciones electrostáticas que existen entre los eritrocitos debido a su carga de superficie.
En estas últimas intervienen de form a determ inante las proteínas del plasma, de m anera que
mientras algunas las favorecen (fibrinógeno y globulinas), otras las disminuyen (albúmina). El
mecanismo que rige este fenómeno depende, a su vez, de cuatro factores relacionados entre sí
mediante la ley de Stokes.
3. ¿Por qué mecanismo las proteínas del plasma influyen en la eritrosedimentación?
(a) Alteración de la relación albúmina/globulinas.
(b) Interferencia entre proteínas y factores reactantes de fase aguda.
(c) Disminución de la concentración de globulina a .
(d) Unión entre el fibrinógeno y la albúmina.
(e) Formación de precipitados proteicos insolubles que se fijan a los hematíes.
Respuesta razonada: los procesos inflam atorios crónicos (artritis reum atoide, polimialgia
reum ática y tuberculosis) y ciertas neoplasias (linfom as y gam m apatías m onoclonales), al
alterar la relación albúm ina/globulinas, constituyen la causa más frecuente de aum ento de
VSG en la práctica clínica y, po r ello, la m edida de esta m agnitud contribuye no solo a su
diagnóstico, sino tam bién al seguim iento de su curso evolutivo, especialmente la respuesta
al tratam iento.
4. ¿Cuál es el método de referencia para m edir la velocidad de sedimentación globular?
(a) M étodo de Churg-Strauss.
(b) M étodo de W introbe.
(c) M étodo de Westergren.
(d) M étodo de Sediplast.
Respuesta razonada: tradicionalm ente la VSG (San-Eritrosedimentación; long) se determ ina
midiendo la longitud de la columna de plasma (en mm) que queda por encima de los eritrocitos
después 1 h. Dado que el tiem po mínimo necesario para completar todo el proceso es de 40 min,
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la m edida se ha estandarizado en 60 m in (1 h). El m étodo tradicionalm ente empleado para

m edir la ES es el descrito en 1921 por Westergren, considerado p o r el Com ité Internacional
de Estandarización en Hematología (ICSH) y el National Com mittee for Clinical Laboratory
Standards (NCLLS) de EE. UU. como de referencia para su determinación.
5. ¿En cuál de las siguientes situaciones no suele observarse un aumento de la VSG?
(a) Enfermedad de H orton.
(b) Polimialgia reumática.
(c) Macroglobulinemia de Waldenstrom.
(d) Poliglobulia o eritrocitosis.
(e) Mieloma múltiple.
Respuesta razonada: la VSG constituye un reactante de fase aguda y existen numerosas situacio
nes patológicas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones de su valor.
Entre ellas destacan los aum entos de VSG que acompañan a infecciones agudas, enfermedades
reumáticas (enfermedad de H orton y polimialgia reumática) o paraproteinemias secundarias
a una gam m apatía m onoclonal. En este últim o caso el aum ento de VSG es especialm ente
manifiesto cuando la proteína posee un elevado peso molecular (p. ej., IgM). Por ello, la VSG
suele ser m ucho m ás elevada en la macroglobulinemia de W aldenstrom (gammapatía m ono
clonal tipo IgM) que en el mieloma múltiple, donde la gammapatía m onoclonal es casi siempre
del tipo IgG o IgA.
6. ¿Cómo se mide la viscosidad de la sangre?
(a) Aplicando una fuerza tangencial o de cizallamiento a la sangre y midiendo la deforma-
bilidad.
(b) Haciendo pasar la sangre a través de u n orificio capilar y midiendo la resistencia.
(c) Directamente por cinematografía capilar.
(d) Deslizando la sangre p or un tubo capilar ilum inado tangencialmente y m edir la dis
persión lumínica que se produce.
(e) Actualmente no existe ningún procedimiento capaz de medir con precisión la viscosidad
sanguínea.
Respuesta razonada: la viscosidad es la resistencia que oponen los fluidos a deformarse. La
sangre, por su naturaleza, presenta un com portam iento viscoso característico al circular por
el interior de los vasos sanguíneos. Cuando a un líquido se le aplica una fuerza tangencial o de
cizallamiento (Z), tiende a deformarse en el sentido de la misma a una velocidad (7 ) que depende
de su viscosidad aparente (ti ).
7. ¿En qué situación clínica tiene interés m edir la viscosidad del plasma sanguíneo?
(a) En caso de hipotiroidismo crónico.
(b) El caso de policitemia vera (PV).
(c) En caso de hipergammaglobulinemia intensa.
(d) En caso de déficit de IgA.
(e) En caso de desnutrición grave.
Repuesta correcta: c.
Respuesta razonada: la viscosidad plasmática varía normalmente con la edad, el sexo, el régimen
alimenticio, la práctica de ejercicio físico, la m enstruación y el embarazo, y aumenta en todas
aquellas enfermedades en las que existen elevaciones del fibrinógeno, la a 2-macroglobulina o
las 7 -globulinas (inmunoglobulinas) en su forma policlonal (aumento generalizado de todas las
globulinas) o monoclonal (aum ento exclusivo de un solo tipo de 7 -globulinas).
8. ¿En cuál de las situaciones siguientes tiene interés la m edida de la vida media eritrocitaria?
(a) En los síndromes inflamatorios crónicos.
(b) En los síndromes mielodisplásicos (SMD).
(c) En la policitemia vera (PV).
(d) En las anemias hemolíticas.
(e) En las anemias carenciales.
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Capítulo 7 Eritrosedim entación y otras propiedades físicas 2 0 1 .e 3
Respuesta razonada: la utilización de trazadores radioactivos proporciona resultados de gran
interés en el estudio de las anemias debidas a aum entos en la destrucción de los eritrocitos
(anemias hemolíticas). Así, m ediante inyección de eritrocitos m arcados con 51Cr, podem os
determinar no solamente su supervivencia, de form a semicuantitativa, sino también los lugares
de destrucción o secuestro. Para ello, el ICSH recomienda el empleo de un método estandarizado.
Los estudios de supervivencia de eritrocitos deben realizarse m arcando las células del propio
paciente, aunque deberán utilizarse las de un donante compatible en los casos en que se trate de
diferenciar si el proceso hemolítico es debido a un defecto intrínseco de los eritrocitos o a causas
patológicas extrínsecas al mismo.
9. ¿Para qué sirven las llamadas «detecciones externas» mediante radiación gamma?
(a) Para comprobar si todas las exploraciones practicadas al paciente se han realizado co
rrectamente.
(b) Para detectar posibles lesiones de la piel que han pasado desapercibidas m ediante el
examen físico convencional.
(c) Para conocer el grado de secuestro de hematíes p or parte de ciertos tejidos, como, por
ejemplo, el bazo.
(d) Para conocer la sensibilidad de un paciente a alérgenos de contacto.
Respuesta razonada: los estudios de secuestro esplénico se realizan habitualmente y de forma
simultánea a la determinación de la supervivencia eritrocitaria mediante empleo de un detector
externo de la radiación gamma. Las detecciones externas se practican normalmente en el área
precordial, esplénica y hepática durante los días en que se realiza el estudio de supervivencia
eritrocitaria. El cociente entre la actividad esplénica y la precordial es el mejor índice de secues
tro esplénico. Así, mientras cocientes entre 0,4 y 0,8 son considerados como normales, valores
superiores a 1,5 son francamente patológicos.
10. ¿En cuál de las siguientes enfermedades la m edida de la concentración de eritropoyetina
plasmática tiene utilidad diagnóstica importante?
(a) En la anemia sideroblástica.
(b) En la anemia hemolítica.
(c) En la anemia diseritropoyética.
(d) En la policitemia vera (PV).
(e) En la poliglobulia del fumador.
Respuesta razonada: los valores normales de eritropoyetina oscilan entre 4 y 16 mU/ml. Mediante
la determinación de eritropoyetina podem os realizar el diagnóstico diferencial entre las poli-
globulias primarias, en las que se observa una secreción normal o disminuida, y las poliglobulias
secundarias con producción aumentada. Se observan aumentos de eritropoyetina en pacientes
con anemia ferropénica y megaloblástica, talasemia, aplasia medular y síndromes inflamatorios.
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C A P Í T U L O 8
Métodos para el estudio de la médula ósea

J. L. A guilar i B ascom pte y M . D íaz-R icart
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA MÉDULA ÓSEA

La médula ósea es el tejido donde se originan los elementos formes de la sangre. En el niño,
ocupa la cavidad esponjosa de prácticamente todos sus huesos, pero con el desarrollo,
parte de ella es reemplazada por tejido graso, por lo que finalmente queda reducida a unas
zonas concretas tales como el cráneo, el esqueleto axial (columna vertebral) y la epífisis de
los huesos largos (v. fig. 2-2). Histológicamente, la médula ósea presenta una arquitectura
constituida por cordones de células que irradian hacia el interior a partir del endostio. Una
fina estructura reticular sirve de soporte a los cordones celulares y a los capilares sinusoides
(fig. 8-1). Las características especiales de las paredes de estos capilares sinusoides permiten
el intercambio de sustancias nutritivas y de desecho entre el plasma y las células, pero
impiden la salida de estas hacia la circulación, hasta que sus características físicas (dadas
principalmente por la madurez celular) lo permiten. El medio intercelular (microambiente
medular), que está principalmente condicionado por el estroma, constituido a su vez por el
soporte reticular y el sistema vascular, es esencial para la duplicación de los progenitores y su
maduración a elementos más diferenciados y finalmente a células sanguíneas. Una alteración
del estroma (p. ej., fibrosis medular) imposibilita el desarrollo del tejido hematopoyético, el
cual se desarrolla en otros tejidos diferentes a la médula ósea (hígado y bazo, principalmente),
dando origen a la llamada metaplasia mieloide. Las células que normalmente se hallan en la
médula ósea son de varios tipos (cuadro 8 - 1 ), pero todas ellas derivan de una única célula
madre, cuyo número permanece siempre constante por el mecanismo de autoduplicación
(compartimento funcional de células madre). Un primer grado de diferenciación da lugar
a los llamados progenitores comprometidos para una determinada línea celular, cuya es
tirpe no es aún reconocible morfológicamente por lo que deben ser explorados mediante
métodos indirectos, como por ejemplo, los cultivos in vitro de médula ósea.
El estudio de la médula ósea puede realizarse a nivel morfológico y funcional: el nivel
morfológico consiste en el examen microscópico de los precursores hematopoyéticos
(mielograma) o citológico de sus cromosomas (citogenética), el nivel funcional, en el
estudio de los progenitores mediante cultivos in vitro de médula ósea.
EXAMEN MORFOLÓGICO DE LA MÉDULA ÓSEA

La exploración de la médula ósea es obligada ante cualquier trastorno de origen des
conocido que altere el núm ero y/o la proporción norm al de las células sanguíneas.
Asimismo, debe realizarse siempre que se observen células o precursores inmaduros
(blastos) en sangre periférica.
Existen dos procedimientos para explorar la médula ósea:
1. Punción aspirativa.
2. Biopsia ósea.

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Capítulo
Sección de hueso
Trabécula Arteria
8
ósea radial
Métodos para el estudio

de la médula ósea
Célula Célula Capilar Megacariocito
endotelial reticular
Adipocitos
FIGURA 8-1 . Esquema de la estructura general de la médula ósea.

to
CUADRO 8-1. Tipos de células presentes en la médula ósea
• Células de tejido óseo (osteoblastos y osteoclastos)

• Células de los endotelios vasculares
• Células soporte o estrom a (fibrocitos y fibroblastos)
• Células grasas
• Células hematopoyéticas:
• Células de la línea m adurativa eritropoyética (eritroblastos)
• Células de la línea m adurativa granulopoyética (prom ielocitos, m ielocitos
y m etam ielocitos)
• Células del sistema m ononuclear fagocítico
• M onocitos
• H istiocitos
• M egacarioblastos y m egacariocitos
• Linfocitos
Punción aspirativa de m édula ósea (aspirado m edular)

Principio
La punción ósea tiene como finalidad primordial realizar u n examen morfológico de
los elementos celulares presentes en la médula ósea. Este se realiza normalmente a partir
de una extensión del material medular obtenida por aspiración después de que se haya
practicado una punción en el hueso. La punción ósea suele realizarse casi siempre a la
altura del esternón (punción esternal), aunque en algunos casos es preferible realizarla
en la tuberosidad posterior de la cresta ilíaca (fig. 8 - 2 ).
Método
1. Se anestesia la piel, el tejido celular subcutáneo y el periostio.
2. Se realiza u na punción del hueso con aguja no muy gruesa, seguida de una as
piración de material medular (0,1-0,3 mi), que se depositará sobre un portaobjetos
bien limpio.
3. Se examinan las características morfológicas del grumo y su cantidad. De acuerdo
con ello, el grumo puede caracterizarse por:
(a) Ser muy escaso o incluso inexistente (punción blanca).
(b) Estar constituido casi exclusivamente por grasa o material necrótico.
(c) Ser abundante o incluso m uy abundante.
(d) Ser de tamaño grande, mediano o pequeño.
4. Se extiende el grumo sobre un portaobjetos, ayudándose de otro portaobjetos y
se procura aplastarlo suavemente al realizar la extensión (fig. 8-3).
5. Se tiñe la extensión por el método habitual (May-Grünwald/Giemsa o Wright).
6 . Se examina la extensión así teñida de acuerdo con la siguiente sistemática:
(a) C uando la p u n ció n de la m édula ósea no da salida a m aterial alguno
(ni grumo ni sangre medular) se habla de punción blanca o seca (dry-tap).
En una prim era etapa, la extensión del aspirado medular debe examinarse mediante
un objetivo de poco aumento (X 10 A). Ello permite apreciar la celularidad global y la
presencia, la ausencia o el aumento del núm ero de células grasas y/o de megacariocitos.
Los megacariocitos se encuentran en una proporción aproximada de 1:2 p or campo,
aunque este número varía de manera importante con la técnica empleada para realizar
la extensión. La celularidad hematopoyética puede ser de tres tipos: normal, aumentada
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F IG U R A 8 -2 . Zonas de elección para realizar el aspirado medular.
(hipercelularidad) o disminuida (hipocelularidad). La celularidad se valora de manera

precisa en el grum o aplastado. Debe señalarse, no obstante, que la apreciación de la
celularidad mediante el aspirado medular, aunque es muy útil, tiene a veces un valor
limitado, ya que existen situaciones patológicas en las que aquella no se corresponde
con la que existe realmente. Así, por ejemplo, en ciertas aplasias medulares en las que la
biopsia ósea demuestra una médula vacía, el aspirado puede presentar una celularidad
normal o incluso abundante. Lo contrario sucede en ciertas leucemias agudas con médula
empaquetada o en la mielofibrosis primaria con médula ahogada por la proliferación de
fibras de reticulina y/o colágeno, donde no es infrecuente obtener una punción blanca
a pesar de la existencia de una marcada proliferación celular. En todos estos casos,
la celularidad real de la médula ósea solo puede apreciarse con seguridad mediante la
práctica de una biopsia ósea.
En una segunda etapa, se debe proceder al examen a gran aumento (objetivo X 100 A),
lo que permitirá observar las características morfológicas de las diferentes células y rea
lizar un recuento diferencial de las mismas (mielograma). El recuento diferencial de cada
tipo celular se efectúa de forma similar al de la sangre periférica, aunque en la práctica
suele suministrarse un recuento global correspondiente a la proporción existente de las
ocho categorías principales de células presentes en la médula ósea (v. cuadro 8-1). En la
figura 8-4 se muestra un ejemplo de informe de examen de médula ósea o mielograma.
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FIGU RA 8-3. Extensión de aspirado medular.
Al iniciar el examen morfológico de la médula ósea destaca, en prim er lugar, el pre

dominio de los precursores granulopoyéticos sobre los eritroblásticos. Así, las células que
se ven con mayor frecuencia son mielocitos y metamielocitos neutrófilos, eritroblastos y
algún promielocito (fig. 8-5). La eosinofilia medular es, en general, algo superior a la que
existe normalmente en sangre periférica y se caracteriza por la presencia de un número
variable de mielocitos eosinófilos. Los elementos de la serie eritropoyética pertenecen en
su mayoría a eritroblastos policromáticos y ortocromáticos; son menos abundantes los
eritroblastos basófilos y los proeritroblastos, caracterizados por su tamaño y la inmadurez
nuclear así como por su elevada basofilia citoplasmática (fig. 8 - 6 ).
Al observar estas células, se debe consignar no solo su número, sino también la exis
tencia de posibles alteraciones morfológicas. Así, al analizar los elementos de la serie
eritropoyética, es im portante considerar las posibles alteraciones de la m aduración
(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentes
internucleares o alteraciones de la cromatina) y/o un aumento del número de mitosis.
En la serie granulopoyética debe considerarse la posible existencia de células inmadu
ras (mieloblastos) y/o alteraciones de la granulación (desgranulación o hipergranulación)
o de la segmentación del núcleo (hipo- o hipersegmentación).
Al analizar las restantes células, importa considerar la presencia de elementos atípicos
(generalmente blastos), células no hematológicas (metástasis carcinomatosa), eosinofilia,
basofilia y el aumento de células cebadas (mastocitos) o de macrófagos y del número de
linfocitos o de células plasmáticas.
Los megacariocitos norm ales son células poliploides que se caracterizan p o r su
gran tam año y la segmentación nuclear (fig. 8-7). Al realizar el examen m orfológico
de la m édula ósea, debe observarse detenidam ente el aspecto m orfológico de los
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 8 Métodos para e l estudio de la médula ósea 207
CLÍNIC S E R V I C IO D E L A B O R A T O R IO D E H E M A T O L O G IA
FECHA DE PETICION
M ili
M IE L O G R A M A
SERVICIO SO LIC ITA N TE: DISPEN SA R IO : □
MÉDICO: FECHA:
PUNCIÓN: C O N SISTEN C IA D E L H UESO :
GRU M O S: G R A SA :
C ELU LA R ID AD : M EGA CA RIO C ITO S:
R EC U EN TO PO RC EN TU AL: V.N. (%)

(según Wintrobe)
S E R IE P LA Q U ETA RIA ......
S E R IE R O JA 18,4-33,8
_
_ j
ER ITR O B LA ST O S P O U C R O M A T IC O S ..........................................................
ER ITR O B LA ST O S O R TO C R O M Á TIC O S............................................... - - 0,4-4,6
S E R IE B LANCA 50,4-70,3
B LA STO S .......................................................................................................................... - - 0,2-1,5
P R O M IE LO C IT O S......................................................................................................... - - 2,1-4,1
M E TA M IELO C IT O S....... - 10-26,8

NO SEG M EN TAD O S + S E G M E N T A D O S............................................. - - 15,7-31
O T R A S C É L U L A S ..............................................................................................
LIN FO C ITO S.................................................................................................... - - 11,1-23,2
P LA SM O C ITO S.............................................................................................. - - 0,4-3,9
MONOCITOS +■M A C R Ó F A G O S......................................................................... - - 0-0,8
RELAC IO N M IELO ER IT R O ID E.......... 1,5-3,3
COMENTARIO :
FIGU RA 8-4. Hoja-dictamen de un examen citológico de médula ósea realizado a partir de un aspirado
medular.
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FIGU RA 8-5. Imagen de una

médula ósea normal. Eritroblastos,
mielocitos y metamielocitos.
Neutrófilos (MGG, X 1.000).
FIGU RA 8-6. Imagen de un

proeritroblasto (MGG, X 1.000).
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m egacariocitos al objeto de po d er hallar alteraciones tales com o hip o - o hiper-

segm entación nuclear, alteraciones de la m adurez citoplasm ática o la presencia
de m egacariocitos de tam año m uy pequeño y escasa o nula segm entación nuclear
(megacariocitos de aspecto hipoploide).
El recuento diferencial de los elementos celulares presentes en la médula ósea está
también indicado en el análisis de la respuesta m edular a citostáticos, durante la fase
de recuperación de una agranulocitosis o en ciertas formas de dishematopoyesis de
mecanismo oscuro.
Interpretación del examen morfológico del aspirado de médula ósea

El mielograma normal viene detallado en la tabla 8 -1, y entre sus principales alteraciones
patológicas destacan:
• Aumento de la celularidad a expensas de la serie eritropoyética. Constituye
lo que se llam a hiperplasia eritroblástica, y se suele observar en casos de hi-
perregeneración m edular com o respuesta a la pérdida periférica de eritrocitos
por hem orragia o hem ólisis (anem ia regenerativa) o cuando existe una inca
pacidad de los eritroblastos para m ad u rar a eritrocitos (anem ias m egaloblás-
ticas y diseritropoyéticas). Estas últim as tienen carácter arregenerativo. En la
anem ia regenerativa p o r hem ólisis o hem orragia, el aum ento del núm ero de
eritroblastos se realiza a expensas de los más m aduros (eritroblastos ortocrom á-
ticos) y no se observan alteraciones de la m aduración celular. Por el contrario,
en la anem ia megaloblástica desaparecen los eritroblastos ortocrom áticos y dis
m inuyen los policrom atófilos, p o r lo que se observa un predom inio de eritro
blastos de gran tam año con intensa disociación m adurativa núcleo-citoplasm a
TABLA 8-1. Mielograma según Wintrobe
Límites de referencia (%)

Serie neutrofílica total 49,2-65
Mieloblastos 0,2-1,5
Promielocitos 2,1-4,1
Mielocitos 8,2-15,7
Metamielocitos 9,6-24,6
Bandas 9,5-15,3
Segmentados 6-12
Serie eosinofilica total 1,2-5,3
Mielocitos 0,2-1,3
Metamielocitos 0,4-2,2
Bandas 0,2-2,4
Segmentados 0-1,3
Basófilos y mastocitos 0-0,2
Serie eritroblástica total 18,4-33,8
Proeritroblastos 0,2-1,3
Eritroblastos basófilos 0,2-1,3
Eritroblastos policromatófilos 17,9-29,9
Eritroblastos ortocromáticos 0,4-4,6
Linfocitos 11,1-23,1
Células plasmáticas 0,4-3,9
Monocitos 0-0,8
Megacariocitos 0-0,4
Histiocitos y células reticulares 0-0,9
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(núcleo in m ad u ro y citoplasm a relativam ente bien hem oglobinizado) que se

denom inan m egaloblastos (v. capítulo 17). Existen ciertas form as de anem ia
arregenerativa, tales com o las diseritropoyesis congénitas o adquiridas, en las
que se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastos que afectan tanto
el núcleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares) como el
citoplasma (aumento de tamaño, hemoglobinización irregular, presencia de material
cromatínico o depósitos abundantes de ferritina). Aunque en estas formas de anemia
puedan observarse rasgos megaloblásticos, no deben confundirse con la anemia me-
galoblástica genuina, por cuanto esta responde inmediatamente al tratam iento con
factores vitamínicos: ácido fólico o vitamina B 12 (v. capítulo 17). Aunque el nombre de
diseritropoyesis se aplica de forma más específica a las formas congénitas, la presencia
de un mayor o m enor grado de diseritropoyesis adquirida puede observarse en el
curso de diversas hemopatías, tales como los llamados síndromes mielodisplásicos
(anemia refractaria o displasia multilineal) y ciertas leucemias agudas y crónicas.
Finalmente, existe una form a de leucemia aguda llamada eritroleucemia (forma
M 6 de la clasificación FAB), en la que es m uy característica la hiperplasia de serie
roja y su marcada diseritropoyesis.
Aumento de la celularidad a expensas de la serie granulopoyética. Puede observarse
como fenómeno acompañante en el curso de procesos infecciosos (septicemia), in
flamatorios, hepatopatía crónica o metástasis carcinomatosa. De forma característica se
observa un gran aumento de la proliferación granulopoyética en la leucemia mieloide
crónica (LMC), en la cual las células se hallan presentes en todos sus estadios madurativos
normales. Un aspecto celular parecido puede observarse también en el curso evolutivo
de otros síndromes mieloproliferativos crónicos afines a la LMC, tales como la fase
hipercelular de la mielofibrosis idiopática, la policitemia vera y la trombocitemia esencial.
A um ento del núm ero de linfocitos. La linfocitosis medular debe valorarse siempre
en relación con la clínica general y la celularidad global, ya que puede observarse en
dos situaciones completamente diferentes:
• Si se trata de una médula hipocelular, el diagnóstico más probable es el de aplasia
medular y su confirmación precisa una biopsia ósea.
• Si se trata de una m édula hipercelular, el diagnóstico puede ser una reacción de
la médula a estímulo externo, pero si se aprecia infiltración, lo más probable es
que se trate de una leucemia linfática crónica. Ocasionalmente, puede tratarse
también de una infiltración linfoide de la médula ósea en el curso de un linfoma.
El diagnóstico diferencial exige no solo una adecuada valoración clínica, sino la
práctica de una biopsia ósea.
Aumento del núm ero de células plasmáticas. Puede aparecer como fenómeno secun
dario en el curso de procesos diversos, principalmente infecciones víricas, trastornos
inmunes, neoplásicos o de una hepatopatía crónica (plasmocitosis reactiva) o constituir
el signo morfológico de un plasmocitoma, enfermedad caracterizada por la proliferación
clonal de células plasmáticas que infiltran en mayor o m enor grado la médula ósea.
Las células plasmáticas del plasm ocitom a suelen presentar un tam año superior al
de las células plasmáticas normales, y a veces rasgos de inmadurez (plasmoblastos).
P resen cia de m acró fag o s a b u n d a n te s o con asp ecto m o rfo ló g ic o p ecu liar.
La observación del núm ero y del aspecto morfológico de los macrófagos que se
hallan en la médula ósea puede ser de gran interés diagnóstico. Así, la cifra de m a
crófagos suele hallarse aum entada en diversas situaciones patológicas (síndromes
inflamatorios, anemia hemolítica autoinm une, hemopatías malignas y metástasis
neoplásicas), lo que se traduce en una respuesta m edular a la agresión. En otros
ERRNVPHGLFRVRUJ
casos, los macrófagos, además de hallarse aumentados, pueden contener parásitos

(leishmania) en su interior, que es un hallazgo fundam ental para el diagnóstico
del kala-azar (leishmaniosis visceral). Finalmente, en ciertas enfermedades con
afectación específica del sistema m ononuclear fagocítico, los macrófagos pueden
adquirir un aspecto peculiar que perm ite su diagnóstico. Tal sucede en las his
tiocitosis malignas y benignas o en las enfermedades acumulativas o tesaurismosis,
en las que los macrófagos se hallan repletos de material lipídico sin m etabolizar
(enfermedad de Gaucher, enfermedad de N iemann-Pick y síndrome del histiocito
azul marino) (fig. 8 - 8 ).
Infiltración medular por blastos leucémicos. Es característica de la leucemia aguda,
en la que dicha infiltración suele ser hom ogénea y m onom orfa con desaparición
completa de la celularidad normal y de los estadios madurativos de todas las series
celulares hematopoyéticas (hiato leucémico). Cuando las características morfológicas
de los blastos no permiten realizar una catalogación citológica, se hace necesaria la
práctica de tinciones citoquímicas o el análisis de marcadores inmunológicos tipo
CD mediante citometría de flujo (tabla 8-2) a partir del material m edular obtenido
en la punción (v. capítulos 12 y 13).
Presencia de metástasis. Una metástasis de células carcinomatosas en la médula ósea
suele caracterizarse por la aparición de uno o varios cúmulos de dichas células en
diferentes puntos de la extensión (fig. 8-9). La imagen característica que suministran
estos agregados celulares es suficiente para establecer el diagnóstico, y ante su sospecha
nunca está de más observar cuidadosamente varias de las extensiones practicadas al
enfermo, cuando su hallazgo no ha sido posible al analizar la primera de ellas. En otras
ocasiones, no obstante, la metástasis medular puede invadir totalmente la médula ósea,
sustituyendo incluso la celularidad hematopoyética normal. En tales casos, resulta a
veces difícil diferenciar la metástasis de una leucemia, por cuanto las características
morfológicas de las células carcinomatosas pueden ser muy similares a las de ciertos
blastos leucémicos, en especial los de estirpe monocítica o indiferenciada (es el caso
del carcinoma anaplásico de pulm ón). La práctica de estudios citoquímicos o de
marcadores celulares vuelve aquí a hacerse imprescindible para establecer el diagnós
tico diferencial.
Signos de afectación en pacientes HIV+. En individuos con el síndrome de la in-
munodeficiencia adquirida (SIDA) es frecuente la alteración de la hematopoyesis, que
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 8-2. Marcadores que pueden ser utilizados en la biopsia medular con la técnica
de inclusión en parafina
Marcador Dilución Reactividad

CD3 (1:30) Linfocitos T
CD4 (1:5) Subpoblación de linfocitos T (colaboradores)
Monocitos/histiocitos
CD5 (1:25) Linfocitos T y subpoblaciones de linfocitos B
CD8 (1:10) Subpoblación de linfocitos T (supresores)
CD 10 (CALLA) (1:25) Linfocitos B y T inmaduros, linfocitos B del centro
germinal y neutrófilos
CD15 (1:25) Neutrófilos, células de Reed-Sternberg
CD20 (1:100) Linfocitos B
CD21 (1:100) Célula dendrítica
CD23 (1:10) Célula dendrítica y linfocito B activado
CD30 (1:10) Células linfoides activadas y células de Reed-Sternberg
CD34 (1:20) Célula progenitora linfoide mieloide
CD56 (1:5) Célula natural killer (NK) y célula plasmática maligna
CD68 (1:6.000) Serie monocítica
CD79a (1:20) Linfocitos B
CD 117 (C-kitt) (1:100) Serie mieloide inmadura y mastocitos
CD 138 (1:5) Célula plasmática normal y mielomatosa
Bcl-2 (1:50) Sobreexpresa en linfoma reticular
Bcl-6 (1:1) Linfocitos B del centro germinal
Cadena ligera k (1:64.000) Linfocitos B
Cadena ligera 1 (1:64.000) Linfocitos B
Cam 5.2 (1:100) Metástasis epitelial
Ciclina 01 (1:10) Linfoma de células del manto y algunos mielomas
Tricoleucemia
Erna " *1:100) Célula epitelial y célula plasmática
Factor VIII (1:400) Megacariocito
Glucoforina C (1:200) Serie eritroide inmadura
Granzima B (1:50) Gránulos citotóxicos (indica fenotipo activado)
LMP-1 (1:100) Virus Epstein-Barr
Lisozima (1:4.000) Línea monocítica
Mieloperoxidasa (1:4.000) Línea mieloide
PGM1 (1:1.000) Línea monocítica
TdT (1:2/1:4) Linfocito inmaduro
TIA-1 (1:100) Gránulos citotóxicos (linfocito T citotóxico; linfocito
NK y neutrófilos)
LEX (1:250) Serie eritroide inmadura y megacariocito
en sangre periférica se caracteriza por una leucopenia con linfopenia y disminución

significativa de los linfocitos T CD4+ (T colaboradores o inductores). Resulta bas
tante frecuente también la plaquetopenia de origen probablemente periférico. En la
médula ósea aunque no puede hablarse de alteraciones específicas sí existen signos
bastante constantes. Entre ellos destaca la relativa frecuencia con que se obtienen
punciones «blancas» (dry-tap) en pacientes HIV+. Ello contrasta con la imagen de
la biopsia, caracterizada por una celularidad normal o incluso aumentada. Cuando
es posible obtener material del aspirado, el examen morfológico del mismo muestra
generalmente una celularidad abundante en la que destacan signos dishematopoyéti-
cos, especialmente en los precursores eritroides (megaloblastosis y diseritropoyesis) y
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un cierto grado de linfocitosis con plasmocitosis. La observación de hipoplasia de serie

roja, intensa plasmocitosis y aumento del número de macrófagos debe hacer pensar en
una infección diseminada por citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB),
Leishmania donovani o por el bacilo ácido-alcohol resistente a Mycobacterium avium
intracellulare (MAI) que afecta la médula ósea, lo que obliga a realizar los estudios
microbiológicos pertinentes.
Biopsia ósea
Introducción
La biopsia de m édula ósea o biopsia m edular (BMO) constituye en la actualidad un
procedim iento de indudable interés diagnóstico en hematología y, en algunos casos,
decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. Así, p o r ejemplo, es la única
exploración que nos perm ite establecer el diagnóstico de extensión de los linfomas
y conocer las características de su patró n invasivo, fundam ental para iniciar o con
trolar la conducta terapéutica adecuada. En la aplasia m edular resulta imprescindible
para conocer su grado de extensión y determ inar el pronóstico. En el SIDA, el es
tudio de la biopsia de m édula ósea puede tam bién tener interés clínico cuando la
punción m edular ha resultado «blanca» (cuadro 8-2). El hecho de que, para estudiar
la m édula ósea hem atopoyética, haya que abordar la p rofundidad del hueso y la
muestra extraída deba someterse a un proceso relativamente largo de preparación
antes de p o d e r ser o bservada al m icroscopio hace que su em pleo sea algo más
lim itado que la sim ple p u n ció n y el aspirado m edular. No obstante, su utilidad
diagnóstica se ha visto en los últim os años revalorizada debido sobre todo a tres
hechos fundamentales:
1. La mayor simplicidad y eficacia del instrumental empleado en la extracción de
las muestras.
2. El perfeccionamiento de los procedimientos histológicos que atenúan el problema
de la descalcificación. A este respecto cabe decir que hoy en día es posible utilizar
algunos marcadores monoclonales en las muestras de biopsia ósea incluidas en
parafina. Este hecho permite ampliar considerablemente la utilidad diagnóstica
de este procedimiento en la práctica clínica (v. tabla 8 - 2 ).
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CUADRO 8-2. Alteraciones de la biopsia ósea en pacientes HIV positivos
• Aumento de la celularidad y del número de megacariocitos

• Signos de mielodisplasia
• Eritrocitaria y megacariocítica
• Granulopoyesis + eritropoyesis
• Plasmocitosis
• Infiltración linfoide de aspecto maduro (26% de biopsias)
• Dilataciones vasculares y proliferación vascular anómala
• Granulomas (10% de biopsias)
• Eritrofagocitosis (6 % de pacientes)
• Aumento de macrófagos con pigmento férrico
• Parasitosis (leishmaniosis) (6 % de los casos)
• Fibrosis reticulínica grados I o II
HIV, virus de la inmunodeficiencia humana.
3. La tom a de conciencia de que la mayoría de las hem opatías son, en realidad,

enfermedades de la m édula ósea hematopoyética es fundamental, ya que solo
a través de su estudio morfológico e histológico minucioso podrá conseguirse
un diagnóstico correcto. Como se ha indicado ya anteriormente, ello no resta
im portancia al estudio del aspirado medular, ni hace que ambas técnicas sean
excluyentes, sino al contrario, complementarias (tabla 8-3).
La biopsia ósea es una técnica histológica que informa sobre las características estruc
turales de la médula hematopoyética respecto al tejido, y hace énfasis en la arquitectura
de la misma. El aspirado medular, en cambio, es una técnica citológica que permite
la descripción minuciosa y detallada de las características morfológicas de las células
hematopoyéticas.
En la actualidad, la tom a de biopsia se hace casi de form a exclusiva p or punción
transcutánea mediante un trocar, y se ha abandonado completam ente la práctica de
una biopsia quirúrgica debido al mayor riesgo que conlleva (sobre todo de hemorragia
e infección) y p o r producir mayores molestias al paciente. Dicha técnica empleaba el
llamado mielótomo de Burkhardt que, previa incisión cutánea, actuaba mediante un
m otor eléctrico que accionaba u na fresa dotada de dientes cortantes que después de
cortar el cilindro facilitaban su ulterior extracción mediante una pinza de tornillo. Esta
técnica no se utiliza prácticamente en la actualidad, aunque tiene la ventaja de permitir
la obtención de cilindros muy gruesos y no afectarse tanto como los trocares actuales
TABLA 8-3. Utilidad complementaria del aspirado y la biopsia de médula ósea (MO)
Característica Aspirado de MO (citología) Biopsia de MO (histología)

Sencillez +++ +
Rapidez +++ +
Morfología celular +++ +
Celularidad + +++
Arquitectura celular - +++
Fibrosis - +++
Progenitores - -
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FIGU RA 8-10. Trocar de Jamshidi utilizado

para la realización de la biopsia ósea.
frente a huesos muy duros, como en casos de osteoesclerosis donde la extracción del
cilindro óseo puede ser muy difícil.
Material
En nuestro medio, dos son los trocares que han demostrado ser más útiles:
1. Trocar de Tanzer.
2. Trocar de Jamshidi.
Ambos modelos consisten en una aguja hueca, con un extremo proximal en forma
de T, que perm ite sujetarlo fácilmente, y u n extremo distal cortante; en su interior
se inserta un m andril punzante y los dos van provistos de un expulsor. El trocar de
Jamshidi se diferencia del de Tanzer en que su extremo distal es algo más estrecho que el
resto del trocar, por lo que el cilindro seccionado no es comprimido en el interior de la
aguja (fig. 8-10). La expulsión del cilindro se hace, en el trocar de Jamshidi, en sentido
distal-proximal. En los últimos años han ido apareciendo en el mercado modelos de
trocares inspirados en el original de Jamshidi que no han hecho sino mejorarlo, concre
tamente el extremo proximal, realizado con material de plástico y que posee, en general,
un diseño muy cuidado, a menudo ergonómico que hace más idónea su adaptación a la
mano del operador. El estilete o mandril es punzante, suele ser muy afilado y posee tres
o cuatro facetas que facilitan la penetración y el ulterior anclaje en la cortical del hueso.
El extremo distal de la cánula o aguja es muy cortante (puede tener forma de corona o de
boca de pez), lo cual le confiere gran efectividad en el avance a través del hueso medular.
Recientemente, la mayoría de los sum inistradores de material para el diagnóstico
in vitro han ido incorporando a sus equipos de biopsia ósea un sistema capturador del
cilindro óseo o atrapa muestras. El sistema puede form ar parte inherente del propio
trocar o, lo que es más frecuente, consiste en una pieza adicional. Según el diseñador
esta novedad mejora la calidad técnica de la extracción, ya que aumenta el porcentaje
de éxitos en la obtención de la m uestra y evita en todos los casos los movimientos de
deflexión del trocar.
Método
1. Normalmente, se elige como punto de elección la cresta ilíaca, antero- o pos-
terosuperior.
2. Tras asepsia cuidadosa de la piel de la zona y anestesia local, se procede a la punción
con el trocar, provisto de su mandril. En los centros hospitalarios, dotados de
servicio de anestesia es posible mejorar la calidad de la extracción de la biopsia ósea
si se completa la anestesia local con sedación endovenosa o con analgesia espinal;
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ambas técnicas consiguen eliminar el dolor que provoca el avance del trocar en
la cavidad medular y que solo con anestesia local no se consigue anular. Los dos
procedimientos requieren la presencia de un anestesista. La sedación endovenosa
se efectúa con hipnóticos tipo midazolam, propofol u opioides como alfentanilo
o remifentanilo (analgésicos |x-receptores potentes de vida media corta). La
utilización de estos fármacos hace necesaria la m onitorización del paciente.
La analgesia espinal se consigue mediante punción lumbar, utilizando un anestési
co local (bupivacaín a en dosis analgésicas) asociado o no a un opioide liposoluble
tipo fentanilo o sufentanilo.
3. Se im prim en al trocar movimientos de rotación y de presión hasta conseguir
perforar la cortical del hueso. En este mom ento, el trocar queda anclado en la
cresta ilíaca.
4. Se extrae el m andril y se continúan los movimientos de rotación-presión, por
lo que el cilindro medular, que va cortándose por el extremo distal del trocar, se
introduce poco a poco en el interior del mismo. La aguja penetra hasta unos 3 cm
de profundidad.
5. Antes de proceder a la retirada de la aguja, se imprimen a esta movimientos laterales
algo enérgicos (deflexión) con el fin de romper la base del cilindro medular que
lo mantiene unido al resto del hueso. Seguidamente, se hunde algo más la aguja
con el fin de conseguir que el cilindro óseo cortado quede bien introducido en el
trocar y luego se procede a su extracción. En caso de utilizar los equipos con un
sistema de atrapa muestras (especialmente los de pieza adicional, que son los más
usuales), una vez finalizado el corte del hueso, se introduce el capturador hasta el
fondo, y se imprimen al trocar un par de vueltas de 360° y acto seguido se procede
a la extracción. Como los movimientos de deflexión se evitan en esta modalidad,
la técnica gana en comodidad para el enfermo, así como en seguridad, puesto que
no es excepcional que en huesos muy duros la m aniobra de deflexión comporte
el riesgo de rotura del trocar y la porción enclavada quede insertada en la cresta
ilíaca.
6 . El cilindro se obtiene mediante la introducción del expulsor en el interior del
trocar, al ejercer una ligera presión (fig. 8 - 1 1 ).
7. Procesamiento del cilindro óseo:
(a) Se introduce la pieza en líquido fijador (Bouin-Holanda) durante 24 h. Se
lava con H 20 del grifo un mínimo de 5 min. Si se introduce u n fragmento
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TABLA 8-4. Pauta para deshidratar el cilindro
Líquido Tiempo
Alcohol de 96° 45 min
Alcohol de 96° (renovado cada vez) 45 min
Alcohol de 99° 45 min
Alcohol de 99° (renovado cada vez) 45 min
Tolueno 45 min
Tolueno (renovado cada vez) lh
del cilindro óseo en formaldehído como líquido fijador es posible, sobre esa
muestra así fijada, efectuar técnicas de biología molecular.
(b) Se descalcifica la misma con ácido nítrico al 10% durante 24 h.
(c) Se lava durante 5-10 min con agua del grifo y se sumerge el cilindro en líquido
con capacidad creciente de deshidratación (tabla 8-4). El cilindro, después de
estos pasos, adopta un aspecto translúcido. De no ser así, debe permanecer
en el último paso por tolueno 1 h más.
(d) Se introduce el cilindro así preparado en un bloque de parafina (cuadro 8-3),
que permitirá la obtención de cortes de la pieza mediante un micrótomo. El
grosor de los cortes debería ser de 1-2 |x ((Jim). Sin embargo, la inclusión en
material de plástico presenta algunas ventajas frente a la inclusión en parafina:
a) no requiere descalcificación (de esta manera se evita la acción corrosiva
del ácido nítrico y, p or tanto, se conserva mejor el tejido medular), y b) la
retracción del cilindro es mínima. En contrapartida, esta técnica presenta
también algunos inconvenientes:
(i) Es relativamente prolongada y requiere gran meticulosidad en su rea
lización.
(ii) Una vez realizada la inclusión, no es posible retroceder para recuperar
el cilindro entero.
(iii) La polimerización que deben sufrir algunos tipos de plástico debido a
su carácter exotérmico (desprendimiento de calor) puede desnaturalizar
los componentes del cilindro óseo.
(iv) Requiere un m icrótom o especial capaz de cortar piezas m uy duras,
por tanto, su coste suele ser elevado.
CUADRO 8-3. Inclusión del cilindro en parafina
• Inmersión en parafina a 60° durante 1 h

• Inmersión en nueva parafina durante 2 h
• En el molde metálico que servirá para realizar el bloque de parafina se pone 1 mi
de parafina fundida
• Se deposita el cilindro y se coloca encima una pieza de plástico (casete), que lleva el
número de identificación de la muestra, la cual se acaba de rellenar con parafina fundida
• Se deposita la placa fría hasta la solidificación total (el bloque queda constituido
por el casete más la parafina sólida y la muestra)
• Los cortes obtenidos del micrótomo se extienden en un baño de agua a 45 °C y se
seleccionan cogiéndolos con portaobjetos que se colocan en estufa a 67 °C (30 min)
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CUADRO 8-4. Desparafinado y tinción de hematoxilina-eosina de los cortes
Desparafinado
Se introduce el portaobjetos con los cortes en:
• Xileno: 5 min
• Xileno: 5 min
• Xileno: 5 min
• Alcohol absoluto: 5 min
• Alcohol de 96°: 3 min
Se lava con agua corriente o agua bidestilada
Tinción de hematoxilina-eosina
1. Hematoxilina de Harris (preparado comercial): 5 min
2. Se lava con agua corriente
3. Ácido acético al 1%: 4-5 s
4. Se lava con agua corriente
5. Alcohol litiado: 4-5 s. Alcohol de 96° + una punta de cuchara de carbonato de litio
6 . Eosina alcohólica: 5 min
7. Se pasa por alcohol de 96°
8 . Se pasa por alcohol de 96°
9. Se pasa por alcohol de 96°
10. Se pasa por alcohol absoluto
13. Se pasa por xileno
18. Se monta la preparación con DPX de inmediato (sin dejar que se evapore el xileno)
(v) La utilización de marcadores monoclonales, si bien es posible, es más

restringida que en las muestras incluidas en parafina.
8 . Tinción del cilindro óseo: para la observación del conjunto de células y trabéculas
se emplea la tinción de hematoxilina-eosina (cuadro 8-4). Otras tinciones como
la impregnación argéntica (cuadro 8-5), que visualiza las fibras de reticulina,
o la del tricrómico de Masson (cuadro 8 - 6 ), que permite visualizar las fibras de
colágeno, son de gran utilidad, junto a la de hematoxilina-eosina, para la mejor
interpretación y diagnóstico de los diferentes trastornos medulares.
Sistemática para el examen histológico de la médula ósea y su interpretación

Antes de empezar el examen histológico de médula ósea deben tenerse presente algunos
aspectos importantes:
• Solo en un 20%, aproximadamente, de los aspirados y en un 3% de las biopsias se
obtiene material insuficiente para la interpretación del resultado.
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CUADRO 8-5. Impregnación argéntica (reticulina de Gordon-Sweet)
Solución A (baño argéntico de Wilder)

• Nitrato de plata: 1 g. Agua destilada: 10 mi
• Hidróxido sódico: 0,3 g. Agua destilada: 10 mi
Se toman 5 mi de solución de nitrato de plata; se añade amoníaco gota a gota hasta
que el precipitado casi se disuelva. Se precipita de nuevo la solución con 5 mi de hidróxido
sódico y, a continuación, amoníaco gota a gota hasta que la solución quede clara.
Se completa con agua destilada hasta 50 mi.
Solución B
• Cloruro de oro: 0,02 g
• Agua destilada: 10 mi
Solución C
• Ácido oxálico: 0,5 g
Solución D
• Alumbre de hierro: 0,2 g
Solución E
• Tiosulfato sódico: 0,5 g
Solución F
• Permanganato potásico: 0,5 g. Agua destilada: 100 mi
• Ácido sulfurico al 3%
Se mezclan 47,5 mi de la primera con 2,5 de la segunda
Solución G
• Formol al 10%: 100 mi
Método
1 . Se parte de los cortes desparafinados (v. cuadro 8-4, «Desparafinado»)
2 . Se oxida con permanganato potásico (solución F) durante 5 min
3. Se lava en agua destilada
4. Se blanquea con ácido oxálico durante 1 min
5. Se lava en tres cambios de agua destilada
6 . Se trata con mordiente de alumbre de hierro en solución acuosa al 2% durante 30 min
7. Se lava bien en dos cambios de agua destilada
8 . Se trata con el baño argéntico de Wilder durante unos segundos
1 0 . Se trata con formol al 10% durante 10 min
1 1 . Se lava en agua. Si los cortes aparecen poco impregnados, se repite desde el paso 7
1 2 . Se contrasta suplementariamente con cloruro de oro al 0,2% durante 5 min
14. Se fija con tiosulfato sódico durante 10 min
15. Se lava con agua destilada
16. Se deshidrata y se monta (siguiendo los pasos 7 a 18 del cuadro 8-4)
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CUADRO 8 -6 . Tricrómico de Masson

1. Se parte de los cortes desparafinados (v. cuadro 8-4, «Desparafinado»)
2. Solución de ácido pícrico o Bouin: 30 min
3. Se lava en agua corriente hasta que se decolora
4. Hematoxilina de Gills II o de Harris: 5 min
5. Se lava en agua corriente
6. Solución de Ponceau-Fucsina: 5 min
8. Solución de ácido fosfomolíbdico: 10 min
9. Solución de verde luz o azul de anilina: 5 min
11. Se deshidrata y se monta (siguiendo los pasos 7 a 18 del cuadro 8-4)
La biopsia es el único examen que ofrece una imagen en perspectiva de la situación

de la cavidad medular. El aspirado realiza el análisis de las células de un punto con
creto de la médula y, por tanto, nunca puede ofrecer una visión global del estado de
la celularidad hematopoyética ni de la arquitectura medular.
La relación celularidad/grasa varía con la edad y m ientras en una persona joven
todas las cavidades medulares contienen un predominio de células sobre la grasa, en
individuos adultos sucede lo contrario; este hecho es especialmente evidente en los
ancianos.
La médula ósea subcortical es más pobre en células que la situada en otras regiones.
La biopsia no debe repetirse en el mismo sitio hasta pasado más de 1 mes y no puede
utilizarse para realizar otros estudios que no sean de índole histoquímica.
La médula ósea hematopoyética está albergada entre la cortical ósea y las trabéculas
del hueso esponjoso (fig. 8 - 1 2 ).
En la lectura de una BMO hemos de considerar los siguientes apartados:
Trabéculas óseas: derivan de la cortical. En la superficie externa se observan los
conductos vasculares de Havers y el periostio. Es importante valorar siempre el grosor
de estas trabéculas, que puede hallarse aumentado o disminuido. En el interior de
las mismas podemos observar los osteocitos; se pueden ver adosados a las trabéculas
óseas los osteoblastos, que son células encargadas de la síntesis ósea endostal. Los
osteoclastos o células encargadas de la reabsorción ósea se observan rara vez en el
T rabéculas ó s e a s ------- ►
C a v ida d m e d u la r------- ►
Célu la g ra s a ------- ►
SE?'-.
FIGURA 8-12. Imagen de una
biopsia ósea normal (HE, X400).
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hueso normal, y se trata de células de gran tamaño polimorfonucleadas y albergadas

en huecos de la trabécula ósea, llamadas lagunas de Howship. Entre las trabéculas se
encuentran las células hematopoyéticas, separadas entre sí por células grasas (cavidad
medular).
• Cavidad medular: Se encuentra entre las trabéculas y en ella debe valorarse funda
mentalmente lo siguiente:
• Vascularización. Los vasos medulares contribuyen en gran m anera a mantener
el armazón del estroma medular. Pueden ser de cuatro tipos: arteriolas, vénulas,
capilares arteriales y sinusoides medulares.
• Celularidad hematopoyética. Está constituida por las tres series hematopoyéticas:
eritropoyética, granulom onocitopoyética y trom bocitopoyética. También se
observan algunas células plasmáticas y linfocitos. Los linfocitos pueden aparecer de
forma dispersa, junto al resto de las células hematopoyéticas o formando folículos
(más frecuentes en el anciano) de pequeño o mediano tamaño, que se sitúan hacia
el centro de la cavidad. Estos folículos se diferencian de los de los ganglios linfáticos
en que carecen de centro folicular claro.
• Células grasas. Son relativamente abundantes y se encuentran junto a las células
hematopoyéticas. El contenido en adipocitos del hueso medular aumenta con la
edad. Al analizar la celularidad de un cilindro óseo, es muy im portante establecer
la relación entre la celularidad hematopoyética propiamente dicha y la grasa. En la
aplasia medular, la celularidad hematopoyética se halla intensamente disminuida
al ser sustituida total o parcialmente p o r células grasas (relación celularidad/
grasa disminuida). Por el contrario, en los síndromes mieloproliferativos o hiper-
regenerativos, las células hematopoyéticas desplazan las células grasas y las hacen
desaparecer también parcial o totalmente (relación celularidad/grasa aumentada).
• Armazón de reticulina. El armazón de fibras de reticulina constituye un entramado
fibrilar que va de la adventicia de las arteriolas medulares al endostio y que, junto a las
células del estroma, proporciona el soporte necesario a las células hematopoyéticas.
Este armazón solo puede ser apreciado mediante la impregnación argéntica. En
condiciones normales es prácticamente invisible, pero puede aumentar en la mielofi-
brosis primaria, o secundaria, en el curso de diferentes hemopatías o enfermedades
diversas, con repercusión sobre el tejido hematopoyético (metástasis carcinomatosa).
Interpretación del examen histológico de la médula ósea (biopsia ósea)

La biopsia de médula ósea (BMO) constituye siempre una prueba, a veces indispensable y
complementaria, del examen morfológico de la médula ósea y sangre periférica. En rea
lidad, cuando se requiere una biopsia ósea, su examen nunca debe realizarse de forma
individualizada o independiente, sino siempre junto al examen morfológico del aspirado
(o impronta obtenida del cilindro), el de sangre periférica y la información clínica del pacien
te (fig. 8-13). Su utilidad práctica resulta especialmente evidente en aquellas situaciones
caracterizadas por un aspirado insuficiente o sin células (aspirado blanco o dry-tap, de la
terminología anglosajona). En estos casos, la práctica de una biopsia ósea es obligada para
poder hacer el diagnóstico. Fuera de aquellos raros casos de leucemia aguda sin expresi
vidad periférica y con médula empaquetada, la biopsia ósea permite distinguir fácilmente
entre una pancitopenia debida a una aplasia de médula ósea de una debida a mielofibrosis
idiopática. Ambas situaciones pueden cursar con una expresividad hemoperiférica bas
tante similar, pero su patrón histológico es diametralmente distinto. Mientras que en la
prim era se aprecia una ausencia prácticamente total de la celularidad hematopoyética
normal y sustitución por células grasas (fig. 8-14), en la segunda se aprecia un patrón
ERRNVPHGLFRVRUJ
Biopsia
F I G U R A 8 - 1 3 . Los tres procedimientos básicos de laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades de

la sangre: los frotis de sangre periférica y médula ósea teñidos con M G G , y la biopsia de médula ósea teñida
con hematoxilina-eosina.
F I G U R A 8 - 1 4 . Biopsia ósea. Patrón

histológico hipocelular de un paciente
con aplasia de médula ósea (H E X 40).
hipo- o hipercelular con desaparición prácticamente total de las células grasas y sustitución
por una densa trama de fibras de reticulina y colágeno que constituye una imagen muy
característica (fig. 8-15). La tinción de reticulina acaba de confirmar el diagnóstico de
mielofibrosis (fig. 8-16). La biopsia no solo tiene interés diagnóstico en hematología,
sino que constituye una herramienta extraordinariamente útil para la valoración inicial
de la enfermedad, como sucede en pacientes afectados de linfoma de Hodgkin y otros
tipos de linfomas no hodgkinianos o para el seguim iento del curso de la enferm e
dad, especialmente después de iniciar el tratamiento. Un ejemplo de esta situación lo
ERRNVPHGLFRVRUJ
F I G U R A 8 - 1 5 . Biopsia ósea. Patrón

histológico hipercelular con intensa
fibrosis en un caso de mielofibrosis
idiopática.
F I G U R A 8 - 1 6 . Biopsia ósea.
Tinción mediante el método de la
impregnación argéntica para poner
de manifiesto las fibras de reticulina
en un caso de mielofibrosis idiopática
acompañado de intensa fibrosis
reticulínica.
encontramos en la leucemia linfática crónica (fig. 8-17), y el linfoma folicular (fig. 8-18).
Finalmente, la biopsia ósea puede ser también de utilidad diagnóstica en enfermedades
no hematológicas como, p or ejemplo, tum ores malignos prim arios y metastásicos,
enfermedades granulomatosas y fiebre de origen desconocido, que en ocasiones pueden
acompañarse de punciones «blancas». Como técnicas complementarias a la biopsia
ósea destaca la histoquímica e inm unohistoquím ica que emplea anticuerpos m ono-
clonales. Al igual que sucede con las extensiones de sangre periférica y médula ósea, los
cortes histológicos de m édula ósea pueden ser sometidos a u na reacción inm unohis
toquímica mediante anticuerpos monoclonales (AM) contra determinadas poblaciones
celulares, como por ejemplo para conocer la estirpe celular de una infiltración linfoide
mediante la utilización de los AM CD 13 (específico de línea T) y CD20 (específico
de línea B). La m uestra histológica de leucemia linfática crónica representada en la
figura 8-17 puede ser tratada con anti-CD20 y anti-CD3, demostrando, de esta manera,
que la infiltración linfoide es mayoritariamente B (fig. 8-19) con muy escasas células T
(fig. 8 - 2 0 ), respectivamente.
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 8-17. Biopsia ósea.

Afectación de la médula ósea en un
paciente con leucemia linfática. Patrón
histológico de infiltración difusa por
linfocitos de aspecto maduro.
FIGURA 8-18. Biopsia ósea.

Afectación de la médula ósea en un
paciente con linfoma folicular. Patrón
histológico nodular con abundantes
folículos linfoides de mediano y gran
tamaño, situados en los espacios
intertrabeculares, aunque también
se aprecia infiltración linfoide
paratrabecular.
FIGURA 8-19. Biopsia ósea con

marcada infiltración linfoide de línea B,
intensamente positiva para el
anticuerpo monoclonal anti-CD20.
ERRNVPHGLFRVRUJ
CULTIVOS DE PROGENITORES HF.MATOPOYÉTICOS

Introducción
Los cultivos in vitro de progenitores hematopoyéticos, desarrollados a principios de los
años setenta, han permitido mejorar considerablemente nuestro conocimiento sobre
la hematopoyesis humana. Así, han contribuido a demostrar la existencia de una célula
madre pluripotencial (stem-cell) con capacidad de autorreplicación que, en su proceso
de diferenciación, se transforma en un progenitor hematopoyético comprometido hacia
una línea celular determinada. Ello puede evidenciarse por su capacidad de producir
colonias.
Desde los prim eros trabajos hasta hoy, ha habido un increm ento en el núm ero
de precursores hem atopoyéticos que puede detectarse en un laboratorio, si bien
se realizan, fundam entalm ente, determ inaciones de colonias granulomacrofágicas
(CFU-GM ), eritroblásticas (CFU-E, BFU-E), mixtas (CFU-GEMM) y megacariocí-
ticas (CFU-Meg).
El procesamiento de un cultivo consta, básicamente, de una fase inicial de separación
celular y posterior suspensión de las células en un medio de cultivo semisólido (metilce-
lulosa o agar, fundamentalmente), al que se añaden distintos factores estimuladores del
crecimiento en función de la línea celular que se investiga. Tras un período de incubación,
el examen al microscopio invertido nos permitirá la caracterización e identificación de
las colonias obtenidas.
M etodología clásica
Material fungible
• Matraces Erlenmeyer de 1 y 21.
• Frascos de cristal de 100 mi de boca ancha.
• Placas de cultivo Greiner de 30 mm de diámetro.
• Placas de cultivo Greiner de 150 mm de diámetro.
• Tubos Falcon estériles de 13 mi.
• Tubos Falcon estériles de base cónica de 50 mi.
• Filtros Millipore, 0,22 |xm, de 25 mm de diámetro.
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• Filtros Corning, 0,22 (xm, de 200 mi de capacidad.

• Jeringas de insulina.
• Jeringas de 20 y 2 mi.
• Agujas Becton Dickinson, 181/2 G.
• Recipientes Unopettes® para recuento de leucocitos 1/20.
• Pipetas Pasteur de plástico.
• Pipetas de plástico estériles de 5 y 10 mi.
Reactivos
• Metilcelulosa Fluka.
• Medio Iscove en polvo (IMDM) (con glutamina, sin N aH C 0 3) Gibco.
• Medio Iscove líquido (IMDM) (con glutamina) Gibco.
• Medio Hanks sin Ca2+, ni Mg2+ ni rojo de fenol.
• Ficoll-Hypaque, 1,077 g/cm3.
• Albúmina bovina desionizada (BSA).
• Suero fetal de ternera (FCS).
• Bicarbonato sódico (N aH C 03).
• Agua destilada estéril para cultivos celulares Gibco.
• 2 -mercaptoetanol.
• Factor e stim u lad o r de colonias gran u lo m o n o cíticas reco m b in an te hum ano:
GM-CSF rh.
• Interleucina 3 recombinante humana: IL-3 rh.
• Eritropoyetina recombinante humana: EPO rh.
Instrumental
• Cabina de flujo laminar vertical.
• Incubador de C 0 2.
• Microscopio invertido.
• Microscopio convencional.
• Agitador de tubos Vórtex.
• Bomba de vacío.
• Cámara de Neubauer.
• Pipetas automáticas Gilson P-1000, P-200, P-20 y P-10.
• Pipeteador automático.
• Agitador magnético y recogeagitador.
Preparación de la metilcelulosa
1. Se pesan 20 g de metilcelulosa en papel de aluminio y se deja toda la noche bajo
la luz ultravioleta.
2. A la m añana siguiente, se tom a un Erlenmeyer estéril de 2 1 de capacidad y se
añaden 500 mi de agua bidestilada para cultivos celulares dentro de la cabina.
Se cubre con un tapón de algodón y gasa estéril, y se hierve al baño maría (fuera
ya de la cabina).
3. Cuando el agua hierva, se retira del baño maría y se añade la metilcelulosa dentro
de la cabina. Se agita suavemente sin agitador hasta que no se aprecien grumos.
4. Se deja de nuevo al baño maría durante 1 h.
5. Mientras la metilcelulosa hierve, se disuelve u n frasco de medio de cultivo Is
cove en polvo en 500 mi de agua bidestilada especial para cultivos y se agita
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suavemente (si bien posteriormente se filtrará, es mejor realizarlo también bajo

la cabina).
6 . Se añaden 3,024 g de N aH C 0 3 al medio resuspendido y se mueve suavemente
sin agitador procurando eliminar todos los agregados de bicarbonato.
7. Se deja bajo la cabina durante 1 h y, a continuación, se esteriliza con los filtros
Corning.
8. Después de que la metilcelulosa haya hervido durante 1 h, se añade bajo la cabina
un agitador magnético. Se deja agitando durante 2 h a temperatura ambiente.
9. Pasadas las 2 h, se añade el medio con el bicarbonato filtrado y se deja agitando
4 h a temperatura ambiente.
10. Se deja toda la noche agitando en el frigorífico a 4 °C.
11. A la mañana siguiente, se dosifica en frascos estériles de 100 mi de boca ancha.
12. Se congela a -2 0 °C procurando que los frascos queden derechos. Se pueden
conservar durante 1 año.
Dosificación de los reactivos

Suero fetal de ternera (FCS)
1 . Se descomplementa a 56 °C durante 30 m in al baño maría y se filtra.
2. Se dosifican los volúmenes de 45 mi en tubos Falcon de 50 mi.
3. Se conserva a -2 0 °C.
Es necesario probar al menos cuatro lotes diferentes de FCS para asegurar el éxito de los
cultivos, pues mientras que unos lotes favorecen el crecimiento, otros lo inhiben por completo.
Albúmina bovina (BSA)

Es mejor utilizar BSA desionizada.
1. Se filtra y se dosifica en tubos Falcon de 50 ml, a unos volúmenes de 20 mi.
2. Se conserva a 4 °C.
Medio de cultivo
1. Se preparan para cada frasco de 100 mi cinco tubos Falcon cónicos de 50 mi y se
añade a cada uno de ellos:
(a) 2 0 mi de la mezcla de metilcelulosa y medio de cultivo con jeringas de 2 0 mi
sin aguja.
(b) 8 mi de FCS previamente descomplementado (al baño maría a 56 °C durante
30 min).
(c) 4 mi de BSA.
2. Se agita vigorosamente con un Vórtex y se deja reposar unos minutos.
3. Se preparan 100 tubos Falcon de 13 mi estériles y se añaden 2 mi por tubo de la
mezcla anterior. La concentración final de los diferentes componentes será:
(a) Metilcelulosa: 1,1%.
(b) FCS: 20%.
(c) Albúmina bovina: 1%.
4. Se agitan de nuevo, se colocan en gradillas y se conservan a -2 0 °C.
2-mercaptoetanol
1. Se prepara una concentración de 5 mM.
2. Se filtra.
3. Se dosifica en tubos Eppendorf estériles de 0,5 mi en volúmenes de 30 (xl.
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Eritropoyetina recombinante (EPO rh)

1. Se resuspende con agua bidestilada estéril para cultivos celulares y se dosifica en
tubos de Eppendorf de 0,5 mi una concentración de 500 U/ml.
Factor estimulador de colonias granulomonocíticas (GM-CSF rh)

1. Se resuspende con agua bidestilada estéril para cultivos celulares y se diluye con
IMDM +10% BSA hasta conseguir una concentración de 10.000 ng/ml.
2. Se dosifican volúmenes de 30 |jl1 en tubos Eppendorf de 0,5 mi.
Interleucina 3 recombinante (IL-3 rh)

1. Se diluye con (IMDM + 10% BSA) hasta conseguir u na concentración final de
1.000 U/ml.
2. Se dosifica en volúmenes de 30 |xl.
Medio de dilución
1. Se prepara en tubos Falcon de 50 mi una mezcla de medio Iscove líquido su-
plementado con el 20% de FCS descomplementado.
2. Se agita y se dosifican volúmenes de 1,5 mi en tubos Falcon de 13 mi.
3. Se colocan en gradillas y se conservan a -2 0 °C.
Medio para el lavado de las células

1. Se prepara en tubos Falcon de 50 mi una mezcla de medio Hanks suplementado
con el 10% de FCS descomplementado.
2. Se agita y se dosifica en volúmenes de 30 mi.
3. Se conserva a —20 °C.
Método (cultivo in vitro de células hematopoyéticas)

Recogida y procesamiento de la muestra
1. Se recoge 1 mi de médula ósea en un tubo de 13 mi que contenga 5 m i de medio
Iscove líquido y 1.000 U de heparina sódica.
2. Se añaden, a otro tubo de la misma capacidad, 3 mi de ficoll. Se deposita cuida
dosamente con una pipeta Pasteur de plástico la mezcla anterior sobre la capa de
ficoll. Es necesario que los componentes estén a temperatura ambiente, pues la
densidad del ficoll varía con la temperatura.
3. También podem os p artir de una m uestra de sangre periférica. En este caso,
se diluyen 1 0 m i de sangre periférica anticoagulada con heparina sódica hasta
40 mi con solución de H anks en u n tubo de plástico de 50 mi. Se depositan
1 0 mi de ficoll en la base del tubo con cuidado para que no se mezcle con la
muestra.
4. Se centrifuga a 400 g durante 30 m in a 25 °C.
5. Se recoge la capa de células mononucleadas y se efectúan tres lavados de 10 min
a 800 g y a 4 °C con el medio de lavado.
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6. Después del último lavado, se resuspende el paquete celular y se efectúa el recuento

de células.
7. Se ajusta la concentración celular a 5 X 105 cél./ml con el medio de dilución.
Montaje de cultivo
1. Se extraen, para cada muestra, dos tubos de medio de cultivo. Como se conservan
a -2 0 °C, es conveniente sacarlos durante los lavados para que se vayan des
congelando.
2. Se añade a cada tubo:
(a) Concentración final/placa
(b) 20 |jl1 de EPO rh a 500 U /m l = 4 U/ml
(c) 25 |xl de GM-CSF rh a 10.000 U /ml = 100 ng/ml
(d) 25 |xl de IL-3 rh a 1.000 U /ml = 10 U/ml
(e) 25 |xl de 2-mercaptoetanol a 5 10' 3 M = 5 X 10' 5 M
(f) 500 |xl de suspensión celular 5 X 105 |xl/ml = 1 X 105 cél./ml
3. Se agita vigorosamente con el Vórtex y se deja reposar unos minutos.
4. Se preparan dos placas de Petri para cada tubo, de 30 m m de diám etro, y se
añade, mediante una jeringa de insulina provista de una aguja de 181/2 G, 1 mi
del contenido del mismo.
5. Se reparte uniformemente por toda la base de la placa procurando que no queden
burbujas de aire.
6 . Se colocan las dos placas, y tres con el mismo volumen de agua en el interior de
una placa de Petri de 150 mm de diámetro.
7. Se incuba a 36,5 °C al 5% de C 0 2 y al 98% de humedad durante 14 días.
Recuento de colonias
El recuento de colonias se efectúa los días 7 y 14 de incubación mediante un micros
copio invertido; se considera como agregado la agrupación de 20 a 50 células y colonia,
la agrupación de más de 50 células. El resultado se expresa en número de colonias/105
células sembradas.
• CFU-E (unidad formadora de colonias eritroides): aparecen el día siete de incubación
(D?) y están constituidas por eritroblastos.
• BFU-E (unidad formadora de burst eritroides).
• CFU-GM (unidad formadora de colonias granulomonocíticas).
• CFU-GEMM (unidad formadora de colonias granulomonocíticas, megacariocíticas
y eritroides).
M etodología utilizando m edios comerciales

En la actualidad, pueden adquirirse medios semisólidos preparados para hacer los
estudios del crecim iento de colonias hem atopoyéticas. Estos m edios comerciales
contienen m etilcelulosa preparada en m edio Iscove M DM , suero fetal de ternera,
albúm ina bovina, 2-m ercaptoetanol y otros suplem entos (p. ej., MethoCult®). Es
te medio debe ser conservado a -2 0 °C en alícuotas, tal y como se ha indicado en
apartados anteriores.
En el m om ento de realizar el cultivo, aparte del núm ero necesario de células, se
añadirán los factores estimuladores (EPO, GM-CSF) de la formación de las colonias
que se quieran analizar.
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Interpretación del resultado y utilidad diagnóstica de los cultivos

Las colonias obtenidas con esta técnica son las siguientes: CFU-E, BFU-E, CFU-GM y
CFU-Meg.
Las CFU-E aparecen, aproxim adam ente, tras 7 días de incubación; estas co
lonias son pequeñas agrupaciones de eritroblastos y se caracterizan p o r su color
anaranjado debido a un ligero acúm ulo de hem oglobina en sus células (fig. 8 - 2 1 ).
A m edida que avanza el período de incubación, van desapareciendo y proliferan
otras de mayor tam año, las BFU-E; estas colonias están formadas p o r miles de eri
troblastos en distintos estadios de m aduración y se identifican fácilmente p o r su
aspecto com pacto e intensam ente coloreado (fig. 8-22). Las CFU-GM aparecen
entre los días 10 y 14 y están constituidas p o r u n a mezcla de células granulocí-
ticas y macrófagos; se identifican fácilm ente p o r su aspecto plano y translúcido
(fig. 8-23). Finalm ente, aunque no m uy frecuente, es tam bién posible obtener las
denom inadas CFU-GEM M que poseen, generalm ente, la apariencia de u n huevo
frito, con una zona central intensam ente hem oglobinizada y com pacta, rodeada
de una región con stitu id a p o r células más translúcidas. En general, las BFU-E,
CFU-GM y CFU-GEM M suelen contarse tras 14 días de incubación. Los cultivos
de progenitores mieloides han demostrado ser útiles para estudiar la potencialidad de
los progenito res de sangre de co rd ó n um bilical conservados. Por o tro lado, el
crecim iento de colonias eritroides en cultivos en ausencia de EPO se utiliza como
criterio m enor en el diagnóstico de la policitemia vera.
F I G U R A 8 - 2 2 . Imágenes de
colonias obtenidas mediante
cultivo de progenitores
hematopoyéticos (cultivo in
vitro de médula ósea o sangre
periférica). BFU-E, unidad
formadora de brotes eritroides
tardíos; CFU-E, unidad formadora
de colonias eritroides precoces.
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Capítulo 8 Métodos para e l estudio de la médula ósea 23 1
Las colonias de megacariocitos son de m enor interés clínico y muestran una aparien
cia característica (fig. 8-24).
FIGU RA 8-23. Cultivo in vitro

de médula ósea o sangre periférica.
CFU-GM, unidad formadora de
colonias granulomonocíticas.
FIGU RA 8-24. Cultivo in vitro

de médula ósea o sangre periférica.
CFU-M, unidad formadora de
colonias megacariocíticas.
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Capítulo 8 Métodos para e l estudio de la médula ósea 2 3 1 .e l
Autoevaluación
1. El tejido donde se originan las células de la sangre es:
(a) El bazo.
(b) El timo.
(c) Los ganglios linfáticos.
(d) La médula ósea.
(e) El hígado.
Respuesta razonada: la m édula ósea es el tejido donde se originan los elementos formes de la
sangre. En el niño, la médula ósea ocupa la cavidad esponjosa de prácticamente todos sus huesos,
pero con el desarrollo, parte de ella es reem plazada por tejido graso, quedando finalmente
reducida a unas zonas concretas tales como el cráneo, el esqueleto axial (columna vertebral) y
la epífisis de los huesos largos.
2. La diseritropoyesis es una forma de expresar la siguiente alteración:
(a) Aumento de eritropoyesis.
(b) Eritropoyesis fetal.
(c) M aduración anómala de los eritroblastos.
(d) Falta de factores de maduración nuclear.
Respuesta razonada: existen ciertas formas de anemia arregenerativa, tales como las diseritropo
yesis congénitas o adquiridas, en las que se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastos
que afectan tanto al núcleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares)
como al citoplasma (aum ento de tamaño, hemoglobinización irregular, presencia de material
cromatínico o depósitos abundantes de ferritina).
3. La biopsia de médula ósea es un complemento diagnóstico en hematología, especialmente
para establecer el diagnóstico diferencial entre:
(a) Síndrome inflamatorio crónico y síndrome mielodisplásico.
(b) Insuficiencia m edular y leucemia aguda.
(c) Gammapatía monoclonal y mielofibrosis idiopática.
(d) Aplasia de médula ósea y mielofibrosis idiopática.
Respuesta razonada: la biopsia de m édula ósea, o biopsia medular (BM), constituye en la actua
lidad un procedimiento complementario de indudable interés diagnóstico en hematología y, en
algunos casos, decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. Así, por ejemplo, es la única
exploración que nos perm ite establecer el diagnóstico de extensión de los linfomas y conocer las
características de su patrón invasivo, fundamental para iniciar la conducta terapéutica adecuada.
4. Un aum ento significativo de linfocitos en la médula ósea hipercelular es orientativo de:
(a) Leucemia linfática crónica.
(b) Aplasia de médula ósea.
(c) Enfermedad de Wilson.
(d) Infección por HIV.
Respuesta razonada: la linfocitosis medular debe valorarse siempre en relación a la clínica general
y a la celularidad global, ya que puede observarse en dos situaciones completamente diferentes.
5. La potencialidad regenerativa de una m édula ósea depende del núm ero y funcionalidad de
las células madre. Para poder conocer si el sistema hematopoyético responde correctamente
a los estímulos de las citocinas suele utilizarse el siguiente procedimiento:
(a) Análisis citogenético del aspirado medular.
(b) Cultivos in vitro de progenitores hematopoyéticos.
(c) Estudio inmunofenotípico del aspirado m edular m ediante anticuerpos monoclonales.
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(d) Análisis morfológico mediante microscopia confocal.

(e) Son correctas a y c.
Respuesta razonada: los cultivos in vitro de progenitores hemopoyéticos, han permitido mejorar
considerablemente nuestro conocimiento sobre la hemopoyesis humana. Así, han contribuido
a demostrar la existencia de una célula madre pluripotencial (stem-cell) con capacidad de auto-
rreplicación que, en su proceso de diferenciación, se transforma en un progenitor hemopoyético
comprometido hacia una línea celular determinada.
6. ¿En qué procedimiento diagnóstico hematológico se utiliza el microscopio invertido?
(a) Análisis de la relación entre linfocitos B y T.
(b) Como complemento a la citometría de flujo.
(c) En el examen morfológico y recuentro de colonias hematopoyéticas.
(d) En el recuento de cromosomas.
(e) En todas las anteriores.
Respuesta razonada: un microscopio invertido es un microscopio que está al revés comparado
con uno convencional. La fuente de luz y el condensador están sobre la plataforma apuntando
hacia abajo. Los objetivos y la torrecilla están debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Las
únicas cosas que están en disposición corriente son el tubo binocular o trinocular, así como la
muestra, que es colocada sobre la plataforma o platina mecánica. Con un microscopio invertido
se pueden observar cultivos de precursores hematopoyéticos bajo forma de colonias que pueden
ser de tres tipos: granulomonopoyéticas, eritroides o de megacariocitos. La observación se realiza
a través de las bases de diferentes recipientes con espesores y características ópticas variables,
utilizándose, en general, material de plástico.
7. En la actualidad, los cultivos de médula ósea son especialmente utilizados para:
(a) Analizar la potencialidad de los progenitores hematopoyéticos.
(b) El diagnóstico diferencial de los síndromes mieloproliferativos.
(c) El diagnóstico de la policitemia vera.
(d) La capacidad funcional de la sangre conservada para transfusión.
(e) Son correctas b y c.
Respuesta razonada: los cultivos de progenitores mieloides han demostrado ser útiles para es
tudiar la potencialidad de los progenitores de sangre de cordón umbilical conservados. Por otro
lado, el crecimiento de colonias eritroides en cultivos en ausencia de EPO se utiliza como criterio
m enor en el diagnóstico de policitemia vera.
8. En general las células del tejido hematopoyético se clasifican en tres tipos: célula madre
pluripotente (stem-cell), progenitores y precursores. Los precursores pueden ser identificados
fácilmente mediante:
(a) Cultivos in vitro de progenitores hematopoyéticos.
(b) Análisis inmunofenotípico mediante citometría de flujo.
(c) Fosfatasa alcalina granulocitaria.
(d) Examen morfológico convencional m ediante tinción del aspirado de médula ósea con
May-Grünwald/Giemsa (MGG).
Respuesta razonada: las células que norm alm ente se hallan en la m édula ósea son de varios
tipos, pero todas ellas derivan de una única célula madre. Un prim er grado de diferenciación
da lugar a los llamados progenitores comprometidos para una determinada línea celular, cuya
estirpe no es aún reconocible m orfológicamente, por lo que deben ser explorados mediante
métodos indirectos, como, por ejemplo, los cultivos in vitro de m édula ósea. El estudio de la
médula ósea puede realizarse a nivel morfológico y funcional. El nivel morfológico consiste en
el examen microscópico de los precursores hematopoyéticos, que son células ya reconocibles
morfológicamente como pertenecientes a una determinada estirpe celular.
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Capítulo 8 Métodos para e l estudio de la médula ósea 2 3 1 .e 3
9. Una punción «blanca» es aquella en la que se obtiene el siguiente material aspirado:

(a) Sangre medular.
(b) Ningún material.
(c) Grum os medulares my pequeños.
(d) Agregados de plaquetas.
(e) Partículas de hueso.
Respuesta razonada: cuando la punción de la m édula ósea no da salida a material alguno, o
únicamente sangre medular sin presencia de grumos, se habla de punción blanca o seca (dry-tap).
Com únmente la punción seca se ha atribuido a una técnica defectuosa, pero revisiones de los
casos con este hallazgo mediante biopsia ósea y otros datos clínicos y biológicos han demostrado
que puede obedecer a fibrosis, aplasia de m édula ósea o, más raramente, hipercelularidad con
«médula empaquetada», casi siempre debida a leucemia aguda. Otros diagnósticos pueden ser
el carcinoma metastásico y la leucemia de células peludas (hairy-cell leukaemia).
10. La observación de la morfología de las células sanguíneas puede sugerir la realización de un
examen morfológico de la médula ósea en las circunstancias siguientes:
(a) Presencia de precursores mieloides.
(b) Anisopoiquilocitosis con cuerpos de Howell-Jolly y eritroblastos circulantes.
(c) Desgranulación de más del 80% de los polinucleares neutrófilos.
(d) Marcada anisocitosis plaquetaria con presencia de plaquetas gigantes.
Respuesta razonada: al observar las células de la m édula ósea se debe consignar las posibles
alteraciones morfológicas de la serie eritropoyética, las posibles alteraciones de la maduración
(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentes internu
cleares o alteraciones de la crom atina), y/o un aum ento del núm ero de mitosis. En la serie
granulopoyética debe considerarse la posible existencia de células inmaduras (mieloblastos) y/o
alteraciones de la granulación (desgranulación o hipergranulación) o de la segmentación del
núcleo (hiposegmentación, hipersegmentación).
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C A P Í T U L O 9
Funcionalismo granulo citar io y métodos

de estudio citoquímico
INTRODUCCIÓN
La función primordial de los granulocitos (GN) y de las células del sistema mononuclear
fagocítico (SMF) es destruir los gérmenes y otras sustancias extrañas que puedan entrar
en el organismo. Esta función se desarrolla en cuatro etapas consecutivas:
1. Activación.
2. Migración transendotelial.
3. Quimiotactismo.
4. Fagocitosis.
Activación
En la activación de los granulocitos frente a un estímulo intervienen de manera decisiva
las llamadas moléculas de adhesión celular o cell adhesion molecules (CAM), producidas
por el endotelio y que actúan mediante tres etapas bien diferenciadas:
1. Redistribución de las CAM en la superficie de los GN como, por ejemplo, la de
la p-selectina presente en los gránulos de Weibel-Palade después del estímulo
producido p or la histamina, la trom bina y el factor activador de las plaquetas
(FAP).
2. Inducción de la síntesis de CAM por el endotelio. Como consecuencia de la etapa
anterior se sintetizan muchas más moléculas de adhesión que se van distribuyendo
sobre la superficie celular de los GN. En este proceso intervienen la interleucina 1
(IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF).
3. Aumento de la intensidad de fijación, inducido por factores quimiotácticos como,
por ejemplo, las quimiocinas, segregadas por el endotelio y otras células.
M igración transendotelial
Consiste en el paso de los granulocitos a través de los espacios intercelulares del endotelio
mediante un proceso conocido como diapédesis. Se caracteriza por lo siguiente:
• Actúa por intermedio de moléculas tipo CAM presentes en la superficie de los leucocitos
y de las células del endotelio (tabla 9-1). Entre ellas destaca hplatelet-endothelium cell
adhesion molecule (PECAM-1).
• Tiene lugar mayoritariamente en las vénulas.
• Detecta temporalmente los leucocitos en la lámina basal y destruye la misma gracias
al efecto de las colagenasas
• Se realiza predominantemente durante las primeras 6-24 h. La supervivencia de los
GN no supera las 48 h, p o r lo que son sustituidos por monocitos que tienen una

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Capítulo 9 Funcionalism o granulocitario y m étodos de estudio citoquím ico 233
TABLA 9-1. Moléculas que intervienen en la migración transendotelial leucocitaria
En leucocitos Tipo leucocito En células endoteliales Función

L-selectina N, L, M Gly-CAM-1, Mad-CAM-1 Rodamiento
y CD34
LFA-1 (integrina aL(32) y N, M ICAM-1 Primera adhesión
Mac-1 (integrina aM(32)
VLA-4 (integrina a4(31) E, L, M VCAM-1 Primera adhesión
LPAM-1 (integrina a4|37) L Mad-CAM-1 Primera adhesión
CLA-1 (glucano de Lewis X N, L, M E-selectina y P-selectina Adhesión reforzada
sializado)
PECAM-1 (CD31) N, E, L, M PECAM-1 Transmigración
E, eosinófilos; L, linfocitos; M, monocitos; N , neutrófilos.
vida media algo más larga y que más tarde se transforman en macrófagos de tejido.
En determinadas situaciones patológicas, este comportamiento puede variar como,
por ejemplo, en caso de infección por Pseudomonas donde los neutrófilos pueden
vivir más de 4 días; en las infecciones virales, donde predom inan los linfocitos, y
en algunas reacciones alérgicas, en las que se aprecia un predominio de eosinófilos.
Quim iotactism o
Se conoce como quimiotactismo al desplazamiento o la locomoción de los GN orientada
hacia el lugar donde se halla una sustancia que los atrae (agente quimiotáctico). Los
agentes quimiotácticos son imprescindibles para la salida de los granulocitos de la circu
lación sanguínea mediante diapédesis y su llegada al lugar de la infección. Este fenómeno
afecta también a los monocitos, que migran más lentamente y se transforman finalmente
en macrófagos de tejido y, en parte también, a una pequeña proporción de linfocitos.
Los agentes quimiotácticos son sustancias de naturaleza muy diversa; se clasifican en
endógenos (producidos por el propio organismo) o exógenos (procedentes del exterior):
• Los agentes quimiotácticos endógenos están constituidos por componentes del comple
mento (C5a fundamentalmente). Son productos de la vía de la lipooxigenasa (leucotrieno
B4 [LTB4], principalmente) y las citocinas (quimiocinas como la IL-8 , en particular).
• Los agentes quimiotácticos exógenos son, en general, productos bacterianos como,
por ejemplo, ciertos péptidos con AT-formilmetionina terminal o lípidos.
La fijación de los agentes quimiotácticos a los receptores de la superficie del leucocito
induce la activación de la fosfolipasa C (mediada por proteínas G) que, a su vez, hidroliza
elfosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) en inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol
(DAG), por lo que se produce un aumento del calcio (Ca++) intracelular que se libera del
retículo endoplásmico (REP) y penetra del exterior celular. El Ca++ modifica el citoes-
queleto, formado por microfilamentos de actina y proteínas asociadas, induciendo la
emisión de seudópodos y, con ello, el desplazamiento del granulocito neutrófilo.
Los leucocitos eligen entre los diferentes estímulos en función del gradiente de dicho
estímulo y de los receptores que posee. Los factores quimiotácticos inducen además las
siguientes respuestas conocidas como activaciones leucocitarias:
• Liberación de enzimas lisosómicas contenidas en sus gránulos y aparición del fenó
meno denominado explosión oxidativa. Ambos procesos son activados por la proteína
cinasa C (PK-C), activada, a su vez, por el DAG.
• Síntesis de metabolitos del ácido araquidónico a partir de fosfolípidos mediante la
acción de la fosfolipasa A2 (FL-A2), a su vez activada por el DAG y el calcio (Ca++).
ERRNVPHGLFRVRUJ
• Estimulación de moléculas de adhesión leucocitaria, que aumentan la adhesión de

la integrina aLpS2 (LFA-1) de los neutrófilos a la CAM-1 endotelial.
• Efecto cebador en los linfocitos gracias a la síntesis del TNF.
Fagocitosis
El granulocito neutrófilo engloba en su interior las partículas extrañas y los agentes
patógenos (gérmenes o bacterias) mediante un fenómeno conocido con el nombre de
fagocitosis. Ello se complementa con la formación de una «vacuola fagocítica» y la libera
ción en su interior del contenido de sus gránulos, tanto primarios (granulación azurófila)
como secundarios (granulación específica). Dicho contenido está compuesto por diversas
enzimas y sustancias que contribuyen a la destrucción de los gérmenes patógenos:
• Los gránulos azur áfilos o primarios contienen mieloperoxidasa (M PO), proteínas
catiónicas (bactericidas), lisozima (m uram idasa), fosfatasa ácida (FA), esterasas,
lipasas, (P-glucuronidasa, desoxirribonucleasas, elastasa, colagenasa y FL-A2.
• Los gránulos específicos o secundarios contienen lactoferrina, defensina (fagocitina),
fosfatasa alcalina granulocitaria (FAG), colagenasa (tipo IV), FL-A2, lisozima (mu
ramidasa), moléculas de adhesión leucocitaria y activador del plasminógeno.
Tras la fagocitosis, los fagocitos mueren por apoptosis y sus restos son eliminados por ma
crófagos o drenados por los vasos linfáticos. La integrina Mac-1 (Cdl Ib) actúa como receptor.
La fagocitosis comprende tres fases consecutivas (fig. 9-1):
0 -------- Anticuerpos lg (opsoninas)
Opsonización
Ingestión
Vacuola fagocítica
(fagosoma)
Desgranulación
Degradación
FIGU RA 9-1. Etapas de la fagocitosis. G, gránulos.
ERRNVPHGLFRVRUJ
1. Reconocimiento y fijación. Los neutrófilos y macrófagos pueden reconocer y

fagocitar bacterias y cuerpos extraños sin reconocimiento específico, aunque
generalmente lo hacen m ediante un proceso de reconocimiento en el que in
tervienen:
(a) Los anticuerpos IgG (a veces IgA), que recubren la bacteria (opsonización)
y a los que se unen los leucocitos a través de receptores para el fragmento Fe
(Fc(R y Fc(R) presentes en la superficie de los mismos.
(b) El C3b (y su forma estable C3bi) del complemento, para el que los leucocitos
también poseen receptores específicos (CR1, CR2 y CR3).
(c) Lectinas, proteínas plasmáticas que fijan carbohidratos y debido a ello se unen
a la pared bacteriana; así, son reconocidas por los receptores C lq presentes
en la superficie de los granulocitos neutrófilos.
2. Ingestión. Los seudópodos que emiten los fagocitos sirven también para en
globar las partículas extrañas en su citoplasma, proceso que se conoce con el
nombre de ingestión. En este proceso intervienen muchos de los mecanismos de la
activación ya citados (fosfolipasa C, producción de DAG e IP3, proteína cinasa C)
y el aumento del Ca++ intracelular que activa el m ovimiento del citoesqueleto.
3. Degradación del producto fagocitado. La destrucción y degradación de los
microorganismos fagocitados se consigue gracias a mecanismos dependientes de
la activación del oxígeno molecular y la formación de compuestos intermedios
conocidos con el nombre de radicales libres. Este proceso se inicia con la activación
de la enzima NADPH oxidasa citoplasmática mediante una reacción en la que se
produce consumo de oxígeno y radicales superóxido (0 2~) con elevada capacidad
oxidante (fig. 9-2). La reacción se conoce como explosión oxidativa porque en
ella predomina la formación de radicales superóxido que pasan al interior de la
vacuola fagocítica, donde son inmediatamente transformados en peróxido de
hidrógeno (H 20 2) mediante la siguiente reacción:
2 0 2 + e - +NADPH —>2 0 2 + N A D P++H +
2 0 2 +2Hh— >H 20 2 + 0 2
A continuación, el contenido de los gránulos específicos (secundarios) prim ero y

de los gránulos azurófilos (primarios) después, es liberado en el interior de la vacuola
fagocítica o fagosoma. Estos gránulos contienen las sustancias bactericidas e hidrolasas
lisosómicas que term inan de destruir la sustancia fagocitada, a la vez que destruyen
también al propio leucocito, que muere en el proceso (formación de pus).
MÉTODOS
En el laboratorio clínico existen cuatro métodos imprescindibles para el estudio de la
función granulocitaria:
• Fraccionamiento o aislamiento (obtención) de los granulocitos neutrófilos.
• Estudio del quimiotactismo (prueba de la migración).
• Estudio de la fagocitosis (prueba del nitroazul de tetrazolio [NAT]).
• Estudio de la capacidad oxidativa (quimioluminiscencia).
O btención de los granulocitos neutrófilos

Se describe aquí el método de Boyum, por ser el procedimiento más generalizado para
el aislamiento o la purificación de los granulocitos neutrófilos (GN).
ERRNVPHGLFRVRUJ
G lucosa H'
FIGU RA 9-2. Mecanismo de consumo de oxígeno por el polimorfonuclear, con formación radical
superóxido y peróxido de hidrógeno. COT, ciclo oxidativo tricarboxílico (ciclo de Krebs); CRM, cadena
respiratoria mitocondrial; SOD, superóxido dismutasa; VHM, vía de las hexosas monofosfato
(vía de las pentosas).
Material
• Sangre m antenida incoagulable con EDTA.
• Jeringa, tubos y pipetas de plástico.
• Tubos de plástico graduados de 1 mi.
• pH-metro.
• Histopaque-1119.
• Solución de cloruro de amonio (NH 4C1) a la concentración de 8,7 g/1.
• Solución amortiguadora de Krebs-Henseleit (tampón de Krebs).
• NaCl al 9% o (0,154 M): 18 g en 21 de agua; usar 1.600 mi.
• Na2P 0 4 H . 12H20 (0,1 M): 17,8 g. en 10 mi de HC11N y completar hasta 500 mi
con agua; usar 336 mi.
• M gS0 4.7H 20 (0,154 M): 1,91 g en 50 m i de agua; usar 16 mi.
• K P0 4H 2 (0,154 M): 1,05 g en 50 mi de agua; usar 16 mi.
• KC1 (0,154 M): 1,15 g en 100 mi de agua; usar 64 mi.
Sedimentación
A temperatura ambiente (25 °C) se introducen 20 mi de Histopaque-1119 en una jeringa
de plástico sustentada por su base y en posición vertical. A continuación, se deposita el
mismo volumen de sangre sobre el Histopaque, procurando que no se mezclen (des
cender la sangre por la pared de la jeringa).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Lavado
A las 2 h se han formado tres fracciones que en sentido ascendente son: 1) eritrocitos
(fracción inferior); 2) Histopaque (fracción intermedia), y 3) células nucleadas y pla
quetas con el plasma (fracción superior).
Mediante una cánula de plástico se transfiere la fracción superior en varios tubos
(del mismo material) y se añade a cada uno de ellos N H 4C1 (8,7 g/1) en proporción de
tres volúmenes p or volumen de fracción, y se agita la mezcla unas 50 veces mediante
una pipeta de plástico. A continuación, se deja reposar unos m inutos hasta completar la
hemólisis y se centrifuga (160-190 g) durante 8 min. Una vez finalizada esta, se obtiene
un sedimento blanquecino y un sobrenadante rojo que se desecha.
Finalmente, se lava el sedimento (compuesto fundamentalmente por leucocitos) dos
veces mediante solución amortiguadora de Krebs. Si el sobrenadante adquiere tonalidad
rojiza significa que todavía existe un exceso de eritrocitos, en cuyo caso es necesario un
nuevo lavado con solución de N H 4C1 y un tercero y último, con tam pón de Krebs.
Ajuste
Los diferentes sedimentos de los tubos obtenidos se mezclan en un único tubo de plástico
graduado de 1 mi y se realiza un recuento de leucocitos mediante cámara cuentaglóbulos,
ajustando la concentración de estos según se precise con solución salina fisiológica
(pH = 7,2).
Estudio del quim iotactism o (prueba de la m igración leucocitaria)

Reactivos
• Medio 199 modificado. Ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico (MOPS).
• Agarosa tipo V. Suero bovino fetal (SBF) descomplementado.
Material
• Estufa de cultivos convencional.
• pH-metro.
• Baño maría.
• Microscopio óptico y objetivo de X 10.
• Sistema para perforar la agarosa.
• Placas de Petri de plástico de 3,4 cm de diámetro.
• Material de vidrio (matraces Erlenmeyer).
• Pipetas Pasteur.
Método
1. En un vaso de sedimentación con 20 mi de agua destilada se introducen 392 mg
de medio 199 modificado, 80 mg de MOPS y 0,19 ml de NaOH N. El pH ideal
debe ser de 6 ,8 .
2. En un m atraz Erlenmeyer de 100 mi se introducen 24 mi de agua destilada y
375 mg de agarosa tipo V y se procede a hervir la mezcla durante 30-45 s.
3. A continuación, se coloca el m atraz al baño maría (entre 50 y 54 °C) durante
6 m in y luego se vierte en el mismo el medio de cultivo ya preparado, además se
añaden 5 mi de SBF descomplementado. Este proceso debe realizarse removiendo
la masa con una varilla de vidrio para que la mezcla sea homogénea. Se espera
5 min.
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4. Se aspira una cantidad de líquido con una jeringa y se depositan 2,2 mi en cada
una de dos placas de Petri de plástico. Se deja en reposo durante 10-15 m in en
posición completamente horizontal.
5. Se cubren las placas y se introducen en la estufa de cultivo a 37 °C durante unos
3-10 min.
6 . Se extraen las placas de la estufa y se colocan en una superficie horizontal. A
continuación, se practican dos pocilios de unos 2,5 m m sobre la agarosa, equidis
tantes 2,5 mm entre sí. Para ello se pueden emplear tubos metálicos perforadores;
la agarosa aprisionada en los mismos puede extraerse mediante una pipeta Pasteur
de vidrio.
7. Mediante una pipeta semiautomática se introducen 5 jxl de suero autólogo (agente
quimiotáctico) en uno de los pocilios de una placa y 5 |xl de suero fisiológico, en
un pocilio de la otra placa (movimiento leucocitario «al azar»). En los pocilios
restantes de ambas placas se introducen 5 (xl de suspensión de leucocitos aislados.
8 . Se introducen nuevamente las placas en la estufa de cultivo a 37 °C, se tapan y se
incuban durante 2 1 0 min.
Lectura e interpretación del resultado

Mediante un microscopio y colocando las placas al revés con un objetivo de 10 aumentos
se mide la distancia máxima recorrida por los leucocitos desde su pocilio correspondiente
hacia el pocilio con suero antólogo, que es donde se encuentra el agente quimiotáctico.
Los factores quim iotácticos proceden de la activación del com plem ento p o r la vía
alternativa, a causa de haber reaccionado con la agarosa.
El procedimiento aquí descrito es manual, aunque en el mercado existen métodos
estandarizados que se venden bajo forma de kits de utilización relativamente simple
(MIGRATEST® de OrpenGen.Pharma).
Estudio de la fagocitosis (prueba del nitrato de tetrazolio)

Principio
El trastorno de la capacidad bactericida (ingestión y lisis de bacterias) de los neutrófilos
se confirma mediante la prueba de nitroazul de tetrazolio (NAT).
Se observa la absorción de una sustancia extraña por el granulocito, con la ingestión
de bactolátex, y un aspecto de la función bactericida, con la reducción del NAT. El NAT
es una sal soluble de color amarillo, capaz de reducirse en presencia de NADH-oxidasa
con consumo de 0 2, y que se transforma en formazán, compuesto insoluble de un color
oscuro característico.
Reactivos
• Nitroazul de tetrazolio (NAT) de grado III.
• Bactolátex de 0,81 |xm de diámetro.
• Tampón de Krebs.
• Colorante de Giemsa.
Material
• Tubos y pipetas de plástico.
• Baño maría.
• Microscopio óptico con objetivo de inmersión.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Método
1. En un tubo de plástico se mezclan 350 |xl de suero autólogo, 100 (xl de una solu
ción con NAT (2 mg por mi de suero fisiológico), 100 (xl de suspensión leucocítica
y 15 |xl de suspensión de bactolátex formada por una emulsión de dicha sustancia
diluida al 10% en tampón de Krebs.
2. Se introduce el tubo al baño maría (37 °C) bajo agitación horizontal y, trans
curridos 15 min, se centrifuga (300 g) durante 8 min.
3. Se decanta el sobrenadante con la abertura hacia abajo y se coloca nuevamente el
tubo en posición vertical, agitándolo en sentido más o menos horizontal durante
2 min.
4. Mediante una pipeta de plástico se aspira el resto de sobrenadante (con el mínimo
sedimento existente) y se practica una extensión del mismo, sobre un portaobjetos,
hasta que esté completamente seco.
5. Se cubre la extensión con carbinol durante 2 m in, se lava con agua y se tiñe
m ed ian te tin c ió n de G iem sa (d ilu id a al 25% en agua destilada) d u ra n te
2 0 min.
6 . Se lava la extensión y se deja secar. Una vez seca, la preparación está lista para su
observación microscópica mediante objetivo de inmersión.
Lectura e interpretación del resultado

El bactolátex ejerce de sustancia extraña y su ingestión está facilitada por la propia cen
trifugación. La reducción del NAT depende básicamente de la cantidad de anión supe
róxido ( 0 2_) form ado a partir del oxígeno por los GN en el proceso de la fagocitosis.
La capacidad fagocítica se pone de manifiesto por la presencia de partículas de látex
en el interior de los fagocitos (GN y monocitos) y la capacidad de reducción del NAT
por la formación de depósitos oscuros de formazán. El formazán es el NAT reducido y se
reconoce por constituir manchas, en ocasiones apenas apreciables, de color azul oscuro
o negro en el interior del citoplasma celular (fig. 9-3). La coloración de la solución de
NAT no reducido es amarillenta.
La prueba de la reducción del NAT tiene un valor cualitativo, ya que la cuantificación
precisa del fenómeno viene dificultada por la frecuente presencia de células aglutinadas
que contienen diferente cantidad de bactolátex y precipitado de formazán.
El sistema de valoración que aquí se propone se basa en la consideración de la si
guiente clasificación:
t %
*
FIGU RA 9-3. Granulocito
que presenta un depósito oscuro
de formazán (MGG, X 1.000).
ERRNVPHGLFRVRUJ
1. Células látex-negativas, o que han ingerido menos de 10 partículas de bactolátex.

2. Células látex-positivas, o que han ingerido 10 o más partículas de bactolátex.
3. Células NAT-negativas o sin formazán en su citoplasma.
4. Células NAT-débilmente positivas o con un máximo de dos pequeños gránulos
de formazán.
5. Células NAT-intensamente positivas, es decir, con más de dos pequeños gránulos
o una mancha fácilmente apreciable.
En condiciones de normalidad, según el esquema anterior, en el tubo con partículas de
látex, debido a la estimulación de la capacidad bacteriolítica, el 60% de los GN contienen
formazán, mientras que la ingestión de bactolátex se sitúa en el 85%. En pacientes con
disminución de la capacidad bactericida (enfermedad granulomatosa crónica y déficit
intenso de glucosa-6 -fosfato deshidrogenasa), la reducción del NAT se halla muy dis
minuida tanto en ausencia como en presencia de partículas de bactolátex.
Al igual que el procedimiento del apartado anterior, se realiza de manera manual, pero
podemos encontrar métodos estandarizados en el mercado que se venden en forma de
kits de uso relativamente sencillo (PHAGOTEST® de OrpenGen.Pharma).
Estudio de la capacidad oxidativa (prueba de la quim iolum iniscencia)

Concepto
Se entiende por quimioluminiscencia la emisión de luz producida como resultado de
la reacción de componentes presentes en una mezcla de combinación y traducida grá
ficamente mediante un actinómetro. Como consecuencia de la fagocitosis, se producen
emisiones de ondas electromagnéticas que son absorbidas por un compuesto llamado
luminol, el cual emite radiaciones lumínicas que son captadas por el detector de un lu-
minómetro (actinómetro) y expresadas numéricamente. El procedimiento que se va a descri
bir a continuación es manual, aunque en el mercado se pueden adquirir métodos estanda
rizados que se venden como kits de utilización relativamente simple (BURSTTEST
[PHAGOBURST®] de OrpenGen.Pharma).
Material
• Actinómetro o luminómetro.
• Luminol (M -5-amino-2,3-dihidro-l,4-ftalizinediona).
• Zimosán (extracto del hongo Saccharomyces cerevisiae).
• Matraces Erlenmeyer.
Solución de lum inol en ácido bórico (pH = 7,9)

Se introducen 12,4 g de ácido bórico (H 3B 0 3) en polvo y 14,9 g de KCI en 11 de agua
destilada y, después de mezclarlos convenientemente, se extraen 250 ml a los que se
añaden 10 mi de NaOH 2N y agua destilada hasta completar 11. A continuación, se in
troducen 0,46 g de luminol sobre la superficie del líquido, se espera 5 min (con el fin de
que el luminol se impregne de agua) y se procede a su disolución mediante un agitador
magnético. Si el pH resultante no es de 7,9 deberá ajustarse con HC1 o NaOH 2N.
Solución de luminol en tampón de Krebs

Se introducen 4,6 mg de luminol en 100 m i de tam pón de Krebs y se deja la mezcla en
una estufa a 60 °C durante 1 h para facilitar la disolución del luminol. El pH resultante
debe estar alrededor de 7,13.
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Zimosán-A en suspensión
Se introducen 600 mg de zimosán en un matraz Erlenmeyer de 100 mi que contiene suero
fisiológico. Se hierve durante 30 min, aproximadamente, al objeto de que el zimosán no
forme grumos. Se distribuye el volumen de la mezcla semipastosa formada en varios
tubos, y se centrifugan a 2.000 r.p.m. durante 10 min. Se extrae el sobrenadante y se
añaden al sedimento que queda 20 mi de tampón Krebs. El volumen total se introduce
en un vaso de precipitado. Esta mezcla, de aspecto homogéneo, se distribuye en tubos
de plástico de 10 mi en alícuotas de 1 mi. Se sellan bien y se guardan en el congelador en
espera de la prueba de la quimioluminiscencia, cuando se deberá añadir a cada tubo tam
pón de Krebs hasta el enrase (10 mi), homogeneizando la mezcla antes de su utilización.
Método
Se basa en el procedimiento de Alien et al.
Con el equipo estabilizado a 37 °C, se introduce un tubo de plástico que contiene
100 |jl1 de solución de luminol, 5 0 |xl de agua destilada y 100 jxl de suspensión leucocítica.
Antes de que transcurran 5 min de la reacción se efectúa la prim era lectura, que corres
ponde a la cifra máxima de la prim era fase del proceso.
Seguidamente se saca el tubo del aparato y se introducen 100 (xl de zimosán (previa
mente preparado) y se vuelve a colocar en su lugar. A los 30 min se realiza otra lectura,
que corresponde a la cifra máxima de la segunda fase del proceso.
Lectura e interpretación del resultado (solución de luminol con H3BOJ

Consiste en dividir la cifra máxima con zim osán (2.a fase) p or la cifra máxima sin
zimosán (1.a fase). En esta prueba se considera como rendimiento normal a partir del
1.000%. La utilidad clínica de estas determinaciones reside en la posibilidad de identificar
trastornos hereditarios de la función granulocitaria que cursan con disminución de las
defensas, y con ello una mayor facilidad para padecer infecciones recidivantes. Con todo,
para que alguna de estas alteraciones tenga una expresividad clínica evidente, como
por ejemplo, la enfermedad granulomatosa crónica (EGC), el grado de alteración debe
comportar la práctica ausencia de actividad.
p r i n c i p a i .e s d e f e c t o s c o n g é n it o s d e l a f u n c ió n
GRANULOCITARIA
Los defectos congénitos de la función granulocitaria pueden clasificarse en tres grupos:
• Defectos de adhesión.
• Defectos de movilidad o quimiotactismo.
• Defectos de fagocitosis/actividad bactericida.
Defectos de adhesión
• D éficit de adhesión leucocitaria 1 (LAD -1). El déficit está en las cadenas de las
integrinas CD 11 y CD 18. Produce alteraciones en la adhesión, la diseminación, la
fagocitosis y en la generación de la explosión oxidativa. La consecuencia clínica son
infecciones bacterianas recurrentes.
• Déficit de adhesión leucocitaria 2 (LAD-2). Ausencia del antígeno Lewis sializado
(receptor oligosacárido para la selectina). Es menos grave que el anterior, aunque
también da lugar a infecciones bacterianas recurrentes.
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Defectos de m ovilidad o quim iotactism o

• Anomalía intrínseca del leucocito.
• Defectos de la producción de factores quimiotácticos.
• Por liberación de inhibidores del quimiotactismo en interacciones medicamentosas
como la ingesta de cloroquina o por factores liberados de tumores.
• Anomalías congénitas como el síndrom e de Chédiak-Higashi, caracterizado por
neutropenia en la que los neutrófilos muestran unos gránulos gigantes (fig. 9-4), y el
síndrome de Shwachman.
Defectos de fagocitosis/actividad bactericida

• Enfermedad granulomatosa crónica (EGC). El defecto se sitúa en los componentes de
la reacción NADPH oxidasa que genera el radical superóxido. La consecuencia es una
disminución de la actividad bactericida sobre ciertas bacterias y hongos, en general
con infecciones recurrentes por microorganismos productores de catalasa (Staphy
lococcus aureus, Serratia, Escherichia coli y Pseudomonas). Se manifiesta al comienzo
de la infancia, pero puede retrasarse hasta el comienzo de la adolescencia en algunos
pacientes. Hay dos variantes: a) forma autosómica recesiva, en la que el defecto se
halla en los componentes citoplasmáticos, y b) forma ligada al cromosoma X, en la
que el defecto se halla en los componentes de membrana plasmática. Clínicamente, se
caracteriza por lesiones granulomatosas generalizadas en la piel (dermatitis), afectación
pulm onar (neumonía) y ganglios linfáticos (adenopatías). Existen signos clínicos y
biológicos de una infección con síndrome inflamatorio crónico (rinitis crónica, dia
rreas, hipergammaglobulinemia, leucocitosis y anemia con hepatoesplenomegalia).
También puede observarse un retraso del crecimiento. El tratamiento consiste en la
administración intermitente o continua de antibióticos, y el trasplante de médula ósea.
FIGU RA 9-4. Gránulos gigantes

en el citoplasma de un polinuclear
neutrófilo en la enfermedad de
Chédiak-Higashi.
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Déficit de mieloperoxidasa (MPO). En este caso, falla la generación de C IO H - por los

neutrófilos y su consecuencia es una disminución de la actividad bactericida (sobre
todo antifungica), si bien en la mayória de los casos carece de manifestaciones clínicas.
Su diagnóstico constituye, casi siempre, un hallazgo de laboratorio cuando se utilizan
analizadores hematológicos automatizados que emplean el análisis citoquímico de
las células sanguíneas (fig. 9-5).
Déficit de gránulos específicos. Se produce un fallo de los procesos en los que inter
vienen los gránulos de los neutrófilos que contienen la lactoferrina. Se considera un
defecto muy raro que suele cursar con una disminución de la actividad bactericida,
generalmente con escasa expresividad clínica.
Déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). Un déficit de G 6 PD debido a
una mutación rara puede cursar con un síndrome hemolítico crónico acompaña
do, muchas veces, de u n defecto de la capacidad bactericida de los neutrófilos con
TECHNICON H60O0C/H601 TECHNICON H60O0C/H601

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1. 0 EO S 10
i 1 BA SO 11
27 4 L IJC cr 3 2 H
FIGURA 9-5. Imagen o histograma de la fórmula leucocitaria automática obtenida mediante un

analizador hematológico automatizado que utiliza citoquímica para diferenciar los leucocitos entre sí en
un paciente con déficit de mieloperoxidasa (MPO). En la región derecha correspondiente a los neutrófilos
prácticamente no se aprecia actividad MPO; sin embargo, el recuento muestra una cifra normal de
leucocitos.
ERRNVPHGLFRVRUJ
manifestaciones clínicas superponibles a la EGC. Un ejemplo de esta forma molecular

de G 6 PD es la variante G 6 PD Barcelona.
ANÁLISIS CITOQUÍMICO DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS

Introducción
La citoquímica constituye, en la práctica hematológica, un complemento indispensable
de la morfología óptica convencional. Su finalidad es estudiar la presencia de ciertos
com ponentes químicos (enzimas o sustancias diversas) en el interior de las células
sanguíneas, tanto hematopoyéticas como circulantes en sangre periférica.
La mayor parte de técnicas citoquímicas derivan de modificaciones de técnicas his-
toquímicas; las más útiles en hematología son la tinción del hierro (método del azul
de Prusia), para el diagnóstico de ciertas anemias y estados de sobrecarga férrica; la
tinción de la MPO, para diferenciar entre estirpe celular mieloide y linfoide, y la tinción
de las FAG, para el estudio de los síndromes mieloproliferativos. Junto a estas técnicas
citoquímicas que podríamos considerar básicas, existen otras que constituyen un com
plemento, muchas veces valioso a la morfología óptica convencional, para el diagnóstico
morfológico de las hemopatías malignas. Desde el punto de vista técnico, todas las re
acciones citoquímicas tienen en común tres etapas fundamentales (fijación, incubación y
contraste), y para su apücación a la práctica clínica deben cumplir los requisitos siguientes:
• Los reactivos empleados deben ser asequibles y estar ausentes de toxicidad.
• Las reacciones citoquímicas deben ser suficientemente sensibles y específicas para
una determinada línea celular.
• El desarrollo de las reacciones no debe influenciarse por las condiciones ambientales.
• La interpretación del resultado debe ser lo más objetiva posible.
Un grupo de expertos del Comité Internacional de Estandarización en Hematología
(ICSH) ha propuesto estudiar las leucemias agudas basándose en tres niveles secuenciales
de investigación, que son los métodos citoquímicos primarios, la inmunofenotipificación
intracelular y la inmunofenotipificación de membrana. A este respecto, recomienda la
reacción de la MPO, la de la cloro-acetato-esterasa y la de la a-naftil-acetato-esterasa.
Para los casos en que esta citoquímica básica no permita una adecuada clasificación, el
comité recomienda el análisis inmunológico del CD3, el CD22, el MPO y la TdT nuclear.
El tercer nivel de estudio (inmunofenotipificación de membrana) debería ser usado
tanto para los casos de confirmación diagnóstica y la clasificación de leucemias atípicas,
como para la subclasificación de las leucemias agudas linfoblásticas.
Fosfatasa alcalina granulocitaria

El estudio de la FAG tiene gran utilidad práctica al permitir efectuar el diagnóstico dife
rencial entre diversas hemopatías. El principal interés radica en el estudio de los síndromes
mieloproliferativos y, especialmente, para corroborar el diagnóstico de leucemia mieloide
crónica, en la que se dan valores muy bajos o nulos. También es muy útil para establecer
el diagnóstico diferencial entre leucemia mieloide crónica y reacciones leucemoides
neutrofilicas, en cuyo caso las células muestran una elevada actividad para esta enzima.
Principio
La FAG hidroliza fundamentalmente los monoésteres del ácido fosfórico, y es activa a
pH alcalino (9,1-9,6). La reacción consiste en la hidrólisis de determinados sustratos,
como por ejemplo el a-naftil-fosfato, de la que se liberan ciertos productos intermedios,
ERRNVPHGLFRVRUJ
los cuales combinados con una sal diazoica originan un precipitado coloreado, pardo
negruzco, que se localiza en el citoplasma de la célula.
Método (Leucognost®-ALPA-16300. Merck)

Reactivos
• Reactivo 1: tris-(hidroximetil)-aminometano.
• Reactivo 2: fosfato de 1-naftilo, sal sódica.
• Reactivo 3: Variamin®-Blausaltz B (sal de Variamin «azul» B).
• Solución fijadora.
• Hemalumbre de Mayer.
M étodo
1. Se fijan las preparaciones durante 30 s con metanol-formaldehído al 4% (9:1),
con 10 m i de formaldehído al 40% más 90 mi de metanol.
2. Se guarda a -2 0 °C.
3. Se desecha a las 2 semanas.
4. Se lava y se seca.
(a) Solución A: 100 mi H20 destilada más cuatro cucharadas (medida estándar)
del reactivo 1 , agitando durante unos minutos.
(b) Solución B: se mezcla un vial de reactivo 2 con 15 mi de la solución A.
(c) Solución C: se mezcla un vial de reactivo 3 con 45 mi de solución A y se
agita durante 2 min, a continuación, se añade la solución B manteniendo la
agitación hasta que todo quede bien mezclado. Por último, se filtra.
(i) Se incuban las preparaciones en esta solución durante 1 h.
(ii) Se lavan y se secan.
(iii) Se contrasta finalmente con hemalumbre de Mayer durante 5 min.
(iv) Se lavan y se secan.
(v) No se utiliza medio de montaje.
La interpretación de la técnica se hará de inmediato para evitar la pérdida de actividad
que se produce si se prolonga el período de lectura.

La actividad fosfatasa alcalina se manifiesta p o r un precipitado pardo m arrón en el
citoplasma de los polimorfonucleares neutrófilos (fig. 9-6). La valoración de la reacción
FIGURA 9-6. Reacción de la fosfatasa

alcalina granulocitaria (FAG). Apréciense
los tres grados de intensidad de izquierda
a derecha (0,1 y 2), respectivamente.
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se establece m ediante la asignación de cuatro grados de reacción a las polim orfonu-

cleares:
• Grado 0: falta de reacción (citoplasma sin color).
• Grado 1: tonalidad pardo-amarillenta en algunos puntos del citoplasma.
• Grado 2: presencia de precipitado granular en todo o prácticamente todo el cito
plasma.
• Grado 3: precipitado muy intenso que ocupa la totalidad del citoplasma y cubre el
núcleo.
El índice de FAG se establece anotando el grado de la reacción observado en cada
una de las 100 células diferentes. El índice FAG se obtiene m ultiplicando el núm ero
de células por su grado de intensidad y sum ando el resultado. En un sujeto normal,
dicho índice varía entre 10 y 100. Obsérvese un ejemplo del cálculo de este índice en
la tabla 9-2.
El interés de la determinación del índice FAG se halla limitado de m anera prácti
camente exclusiva al diagnóstico diferencial de ciertos síndromes mieloproliferativos
crónicos. Así, mientras que en la leucemia mieloide crónica (LMC) el valor suele ser
casi de cero (inferior a 1 0 ), en las reacciones leucemoides y en la mielofibrosis primaria
se halla generalmente dentro de la normalidad o es elevado (superior a 1 2 0 ), así como
en la aplasia medular, la enfermedad de Hodgkin, la policitemia vera y la crisis blástica
de LMC. O tra hemopatía en la que el índice FAG suele hallarse disminuido es la hemo
globinuria paroxística nocturna (HPN), enfermedad clínica predominantemente he
molítica, pero con afectación de todas las series por lesión primaria en el ámbito de la
célula madre pluripotente.
Existen otras situaciones no debidas a hem opatías malignas en las que tam bién
pueden observarse alteraciones significativas del índice de FAG (tabla 9-3).
TABLA 9-2. Método para calcular el índice de fosfatasas alcalinas granulocitarias (FAG)
Número de células contadas (%) Grado de intensidad de FAG Resultado

8 0 0
42 I 42
27 II 54
14 III 42
9 IV 36
Resultado del índice de FAG = 174.
TABLA 9-3. Situaciones no debidas a hemopatías malignas en las que pueden observarse
alteraciones del índice de fosfatasas alcalinas granulocitarias (FAG)
Disminución Aumento
Mononucleosis infecciosa Embarazo
Púrpura trombocitopénica idiopática Terapia con corticoides
Anemia perniciosa Anticonceptivos orales
Hipofosfatasia Benzolismo
Síndrome hipereosinofilico Infección por HIV
HIV, virus de la inmunodeficiencia hum ana.
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Mieloperoxidasa
Principio
La demostración de la existencia de esta enzima, sintetizada en el retículo endoplás-
mico rugoso, se basa en la acción oxidante de la misma sobre el sustrato, bencidina, en
presencia de peróxido de hidrógeno. La positividad de la reacción se pone de manifiesto
por la aparición de un precipitado amarillento-ocre en el citoplasma.
Método Merck (tabletas DAB-2924® de Merck)

1. Se fija durante 20-30 s con metanol, formaldehído al 40% (9:1), se lava con agua
destilada y se seca.
2. Se in tro d u ce u n a pastilla de d iam in o b en cid in a (DAB) en 10 mi de agua
destilada y se añaden 2 gotas de peróxido de hidrógeno (H 20 2) al 3%. En el
caso de que se utilice como solución perhidrol al 30% de la casa Merck, se
prepararan 9,7 m i de H 20 destilada más 0,3 mi de perhidrol. Su conservación
es de 2 meses a 4 °C.
3. Se incuban las preparaciones en esta solución durante 10 min.
4. Se lavan y se secan.
5. Se contrasta con hemalumbre de Mayer durante 15 min.
6 . Se lava, se seca y se cubre con medio de montaje.
Método Sigma (Sigma Diagnostics Kit)

Muestras
• Extensiones de sangre periférica (SP) o médula ósea (MO).
• Sangre con EDTA-K3 (frotis) ±.
Se secan las extensiones protegidas de la luz, antes de fijarlas. Las preparaciones no
fijadas conservadas en la oscuridad son estables durante 3 semanas.
Nota: La MPO leucocitaria es fotolábil.
Método
1. Se fijan las preparaciones con solución de fijación a temperatura ambiente durante
30 s.
2. Metanol: 45 mi. Formaldehído al 37%: 5 mi. (Se preparan extemporáneamente.)
3. Se lavan las preparaciones con H20 y se dejan secar al aire.
4. Se precalientan 50 m i de Trizmal 6.3, y se diluyen en un baño a 37 °C preparado
extemporáneamente. (Nota: Antes de utilizar se debe añadir un vial de peroxidasa
Indicador Reagent y 200 (jlI de H 20 2 al 3%. Se mezcla vigorosamente y se descarta
después de usar.)
(a) Tampón Trizmal 6.3 (solución de trabajo).
(b) Trizmal 6.3 buffer concentrado: u n volumen.
(c) H20 desionizada: nueve volúmenes.
5. Se colocan las preparaciones en la solución anterior y se incuban a 37 °C durante
30 m in en la oscuridad.
6 . Se lavan las extensiones y se dejan secar al aire.
7. Se tiñen las preparaciones con Acid Hematoxilin Solution durante 10 min.
8 . Se lava, se seca al aire y se examina al microscopio.
Nota: Conservar el Trizmal 6.3 Buffer y el Acid Hematoxilin Solution a temperatura
ambiente. El Peroxidasa Indicador Reagent se mantiene a 4 °C.
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La actividad peroxidasa se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado amari
llento u ocre (fig. 9-7) en el ámbito de las células de estirpe granulocítica (mieloblastos,
promielocitos, mielocitos, metamielocitos y segmentados, tanto de la línea neutrófila
como eosinófila). Las células del SMF (monocitos y precursores monocíticos) presentan
mucha m enor actividad MPO o son negativas. En una leucemia aguda, si las células
blásticas son positivas puede afirmarse su estirpe mieloide (mieloblástica), pero si la
reacción es negativa esta no puede ser descartada, al menos mediante esta única técnica.
La reacción de la MPO constituye el procedim iento de elección para diferenciar
las células inmaduras (blastos) de estirpe mieloide (MPO positivas) de las de estirpe
linfoide, que son siempre MPO negativas. Asimismo, la reacción de la peroxidasa es
empleada por ciertos autoanalizadores de base citoquímica (Sistemas Technicon de
Bayer Diagnostics) para la realización de la fórm ula leucocitaria automatizada. Ello
ha permitido la detección de individuos con déficit congénito de MPO, ya que en tales
casos se genera una imagen característica en el autoanalizador (v. fig. 9-5) que permite
su identificación. Dado el elevado núm ero de células que se analizan y la rapidez del
análisis, este procedimiento puede ser utilizado para el escrutinio del déficit congénito
de MPO. El empleo de un derivado de la bencidina en forma de tableta permite trabajar
con este reactivo sin necesidad de tenerlo que pesar, con lo cual se evita el contacto con
el mismo (peligro de carcinogénesis de la bencidina). La técnica descrita supone una
modificación de la recomendada por el ICSH.
Negro Sudán B
Principio
Es una técnica que en realidad detecta actividad peroxidásica, por lo que su utilidad es
equivalente a la de la reacción de la MPO.
Reactivos
• Reactivo de fenol: se disuelven 16 g de fenol cristalizado en 30 mi de etanol absoluto
y 100 m i de H20 destilada (en disolución se contienen 300 mg de Na 2H P 0 4).
• Solución de negro Sudán B: se disuelven 300 mg de negro Sudán B en 100 mi de
etanol absoluto. Se incuba la solución durante 48 h antes de usarla, agitando de vez
en cuando. Se filtra antes del empleo.
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Método
1. Se fija la extensión con vapores de formaldehído durante 10 min.
2. Se incuba durante 3 h a 37 °C en una mezcla incubadora formada p or 6 mi de
reactivo de fenol y 9 mi de solución de negro Sudán B. Las preparaciones se
colocarán en una cápsula de Petri, con la extensión hacia abajo y encima de un
capilar de microhematocrito, para que no roce con el cristal. Se tapa bien la cápsula
para evitar la evaporación.
3. Se lava con agua destilada.
4. Se lava con etanol al 70% durante 20 min.
5. Se lava con agua destilada.
6 . Se contrasta con colorante de Giemsa (al 10% en agua destilada) durante 20 min.

Los neutrófilos segmentados y sus precursores aparecen con unos gránulos gruesos en el
citoplasma de color gris muy oscuro (fig. 9-8). Esta reacción tiene el mismo significado
que la de la MPO. La reacción del negro Sudán B puede ser ocasionalmente útil en los
casos de leucemia aguda mieloblástica con síntesis anormal o deficiente de MPO y para
la demostración de bastones de Auer.
Esterasas
Se trata de enzimas hidrolíticas que desdoblan los ésteres (alifáticos y aromáticos) en
ácido y alcohol. Tienen capacidad para reaccionar con ésteres acílicos o cloroacílicos
del naftol acetato esterasa (ÑAS) y en ello se basa su demostración citoquímica. Existen
notables variaciones en su localización celular con relación al tipo de sustrato empleado
y también dependiendo del procedimiento técnico empleado para su determinación.
Los sustratos más comúnmente empleados son: naftol-AS-D-acetato, a-naftil-acetato,
a-naftil-butirato, naftol-AS-cloro-acetato. Estas sustancias, cuando se hidrolizan por la
acción de las esterasas en presencia de una sal diazoica, forman un colorante azoico inso
luble de tonalidad diferente, en la zona de la célula donde existe la actividad enzimática.
FIGURA 9-8. Reacción del

negro Sudán en el citoplasma
de los polinucleares neutrófilos.
Apréciense los granulos gruesos
en el citoplasma de color gris muy
oscuro y que son equiparables
a la positividad MPO.
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Naftol-AS-D-acetato-esterasa (NASDA)
Material
• Formaldehído (impregnado en un algodón que se introduce en un vaso de Coplin).
• Tampón fosfato 0,1 mol/1, pH = 6,9.
• Fosfato monopotásico (6 , 8 g en 500 mi de H 20 ) , 450 mi.
• Fosfato disódico (14,16 g en 1.000 mi de H 20 ) , 550 mi.
• Propilenglicol.
• Acetona. Fast Blue BB Salt (en polvo).
• Fluoruro sódico (NaF).
• Naftol-AS-D-acetato (sustrato).
Método
1. Se fijan las preparaciones con vapores de formaldehído durante 15 min.
2. Se incuban durante 70 min a temperatura ambiente en una mezcla incubadora
formada por las soluciones A (tampón fosfato 0,1M, pH = 6,9:50 mi más propilen
glicol, 1 ml) y B (naftol-AS-D-acetato, 8 mg, más acetona, 1,5 mi). La mezcla de las
soluciones A y B se prepara como sigue: se vierten 0,95 mi de la solución B (gota
a gota) en la solución A, agitando al mismo tiempo (a temperatura ambiente). Se
añaden a esta solución 100 mg de Fast Blue BB Salt. Se agita durante 2 min y se filtra.
4. Se contrasta durante 30 m in con hematoxilina de Harris.
5. Se lava y se seca. La inhibición de la reacción enzimática mediante el fluoruro de
sodio (NaF) se consigue al añadir 1,5 mg de este reactivo p o r cada mililitro
de solución de la mezcla incubadora.

La mayoría de las células de la hematopoyesis muestran actividad enzimática frente a este
sustrato, aunque el máximo de intensidad corresponde a los monocitos, los histiocitos y
las células reticulares, los megacariocitos y las plaquetas. La positividad en los monocitos es
tal que aparecen cubiertos (citoplasma y núcleo) de un característico precipitado verdoso
puntiforme (fig. 9-9) que, además, presenta la característica de ser inhibido específicamente
por el fluoruro sódico, mientras que las restantes células de la serie mieloide son resistentes.
FIGURA. 9-9. Células de la médula

ósea con actividad NASDA citoplasmática.
Esta enzima es característica de la serie
granulomonocítica (X 1.000).
ERRNVPHGLFRVRUJ
a-naftil-acetato esterasa ácida (ANAE)

Material
• Fijador:
• Tampón formalina-acetona, pH = 6 . Guardar a +4 °C:
- Sustrato a-naftil-acetato.
- Éter monoetílico de etilenglicol.
- Solución de pararrosanilina hidroclórica (al 4% en ácido clorhídrico 2 N).
- Solución de nitrito sódico al 4% en agua destilada. Se prepara en el momento
de usarla.
- Tampón fosfato M/15 pH = 7,6.
- Hematoxilina de Harris.
• Tampón formalina-acetona:
- Fosfato disódico: 20 mg.
- Fosfato monopotásico: 100 mg.
- H20 destilada: 30 mi.
- Formaldehído: 25 mi.
- Acetona: 45 mi.
Método
1 . Se fijan las preparaciones durante 30 s con tam pón formalina-acetona a 4 °C.
2. Se lavan y se secan.
3. Se incuban las preparaciones durante 45 m in a tem peratura ambiente en una
mezcla de las soluciones A y B:
(a) Solución A (pararrosanilina hexazotizada):
(i) 1 ,2 mi de pararrosanilina.
(ii) 1,2 mi de nitrito Na (100 mg nitrito + 2,5 mi H20 destilada).
(iii) Se mezcla durante 1 m in y se añaden:
(iv) 35 mi de tampón fosfato (80,4 mi de disódico, 19,6 mi de monopotásico,
para 1 0 0 mi).
(v) Se ajusta a pH 6,1 con NaOH 1 N.
(b) Solución B:
(i) 16 mg de sustrato a-naftil-acetato.
(ii) 2 mi de éter monoetílico de etilenglicol.
4. Se mezclan las dos soluciones A y B y se filtran. Se ajusta la mezcla a un pH de 6 ,1.
6 . Se contrasta con hematoxilina de Harris durante 30 min.

La actividad enzimática se pone de manifiesto en forma de un precipitado ocre ama-
rronado en el citoplasma de diversas células, entre las que destacan, en prim er lugar, los
monocitos (reacción muy intensa), las células plasmáticas y los eritroblastos de la anemia
perniciosa o de algún caso de eritroleucemia, en los linfocitos de origen T (disposición
centrosómica). En patología, esta reacción enzimática muestra su máxima utilidad para la
identificación de las células de estirpe monocítica, tanto de las más maduras (monocitos
e histiocitos) como de sus precursores (leucemias monocíticas y mielomonocíticas).
a-naftil-butirato-esterasa
La reacción se realiza según la técnica de Ornstein et al.
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Reactivos
• Fijador: tampón formalina-acetona, pH = 6 , (se guarda en la nevera) a 4 °C.
• a-naftil-butirato (SigmaN 8000).
• Éter monometílico de etilenglicol (Merck 859).
• Solución de pararrosanilina hidroclórica (Merck 10159) al 4% en HC12 N (Merck 317).
• Solución de nitrito sódico (Merck 6549) al 4% en agua destilada.
• Tampón fosfato M /15, pH = 7,6.
• Fosfato bisódico anhidro: 9,55 g/1.
• Fosfato monopotásico: 9,08 g/1.
• Se mezclan ambos fosfatos hasta conseguir un pH de 7,6.
• Hematoxilina de Harris (Merck 9253).
Método
1 . Se fijan las preparaciones en tam pón formalina-acetona durante 30 s a 4 °C.
2. Se lava con H 20 corriente y se deja secar.
3. Se incuba durante 60 min a temperatura ambiente en la siguiente mezcla:
(a) Solución A:
(i) Solución de pararrosanilina: 1,2 mi.
(ii) Solución de nitrito sódico: 1,2 mi.
(iii) Se mezcla durante 1 min exacto y se añaden 38 mi de tam pón fosfato.
(iv) Fosfato disódico: 80,4 mi.
(v) Fosfato monopotásico: 19,6 mi.
(vi) Ajustar a pH = 6,3.
(vii) Esta solución debe prepararse al momento.
(b) Solución B:
(i) a-naftil-butirato: 40 jjlL
(ii) Éter monometílico de etilenglicol: 2 mi.
4. Se mezclan las dos soluciones A y B, y se filtran.
5. Para determinar la fluorosensibilidad o resistencia se procede a una incubación
con fluoruro sódico añadiendo al tampón fosfato 1,5 mg de fluoruro sódico por
mililitro de tampón.
6 . Se lava con agua corriente y se deja secar.
7. Se contrasta con hematoxilina de Harris durante 30 min.
8 . Se lava con agua corriente y se deja secar.
Naftol-AS-D-cloroacetato-esterasa
Reactivos
• Naftol-AS-D-cloroacetato (sustrato).
• Pararrosanilina hidroclórica (al 4% en ácido clorhídrico HCI 2 N).
• Nitrito sódico (N aN 02) al 4% en agua destilada (preparación extemporánea).
• Dimetilformamida.
• Tampón de Michaelis: 0,1 mol/1 (pH = 7,62).
• Solución de metanol-formaldehído integrada por formaldehído al 10% en alcohol
metílico absoluto.
Método
1. Se secan las extensiones al aire.
2. Se fijan durante 30 s en metanol-formaldehído (9:1 mi).
ERRNVPHGLFRVRUJ
3. Se lavan con abundante agua destilada.

4. Se incuban las extensiones durante 30 min, y a tem peratura ambiente, en una
solución incubadora filtrada, form ada p or la mezcla de las soluciones A y B
preparadas del siguiente modo:
(a) Solución A: pararrosanilina, tres gotas; nitrito sódico al 4%, tres gotas (se
mezcla durante exactamente 60 s), y tam pón de Michaelis, 30 mi (se ajusta
el pH a 6,3 mediante HC12N).
(i) Tampón de Michaelis: 0,1 mol/1 (pH = 7,62).
(ii) Veronal sódico (un sobre), 18 g en 11 de H 20 , pH entre 8,6-9.
(iii) HC10,1 N: 11 mi.
(iv) Veronal sódico: 18 g/1,19 mi.
(v) pH final = 6,3.
(b) Solución B: naftol-AS-D-cloroacetato, 10 mg, y dimetilformamida, 1 mi.
5. Se lava con agua y se contrasta con hematoxilina de Harris durante 30 min.

Presentan positividad enzimática citoplasmática para este sustrato, en forma de una
coloración anaranjada, las células de la granulopoyesis neutrófila, sobre todo sus elemen
tos más maduros (fig. 9-10). La positividad de esta enzima puede ser observada en los
promielocitos; sin embargo, los eosinófilos son negativos. La cloroacetato esterasa no es
tan sensible como la MPO para la detección de las etapas tempranas de la diferenciación
granulocítica. Ello explica que los blastos de la leucemia aguda mieloblástica (LAM,) sean
MPO positivos y cloroacetato-esterasa negativos. Sin embargo, los blastos de leucemias
mieloides con mayor grado de diferenciación (LAM2 y LAM3) muestran ya actividad
enzimática cloroacetato-esterasa.
Reacción del ácido peryódico de Schiff (PAS)

Principio
El fundam ento de esta reacción estriba en la rotura de los enlaces C -C por el ácido
peryódico, que es un poderoso agente oxidante. Esto determina la liberación de grupos
aldehido, los cuales son capaces de combinarse con el reactivo de Schiff para dar un
color rojo púrpura intenso.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Esta reacción es positiva en presencia de num erosos carbohidratos: glucógeno,

mucopolisacáridos, mucoproteínas, glucoproteínas y glucolípidos.
Reactivos
• Solución de metanol-formaldehído (90 m i de metanol + 10 mi de formaldehído).
• Solución de ácido peryódico al 1% en agua destilada.
• Ácido clorhídrico (HC1) 2 N.
• Solución de bisulfito sódico al 40% en agua destilada.
• Pararrosanilina base.
• Metabisulfito sódico seco.
Método
1. Preparación del reactivo de Schiff: se calientan 200 m i de agua destilada
hasta la aparición de las prim eras burbujas. Se retira de la fuente de calor e
inm ediatam ente se añade 1 g de pararrosanilina y se deja enfriar hasta una
tem peratura de 50 °C. A continuación, se añade 1 mi de HC1 concentrado y
se deja enfriar hasta tem peratura ambiente, m om ento en el que se añaden 2 g
de bisulfito sódico al 40%. Se tapa bien y se guarda en la oscuridad durante
48 h. Se filtra y se coloca el reactivo, que debe ser totalm ente incoloro y trans
parente, en nevera durante 24 h, bien tapado con parafina y en frasco color
topacio. Para conseguir la transparencia adecuada, se añade carbón mineral
en polvo (unos miligramos).
2. Se fijan las extensiones en metanol-formaldehído durante 5 min.
4. Se incuba durante 7 min en una solución de ácido peryódico al 1%.
6 . Se lava durante 1 m in en una mezcla de HC12N (0,5 mi), solución de metabi
sulfito sódico al 4% (0,6 mi) y agua destilada (10 mi).
8 . Se incuba la preparación en la oscuridad y en presencia de reactivo de Schiff
(previamente filtrado) durante 45 min.
9. Se lava con agua destilada durante 10 min.
10. Se contrasta con hematoxilina de Harris durante 30 min.

Las células con material PAS positivo en su citoplasma (glucógeno, mucopolisacáridos,
mucoproteínas, glucoproteínas y glucolípidos) m uestran un precipitado de color rojo
púrpura intenso (fig. 9-11). Entre ellas destacan los polimorfonucleares neutrófilos y
otros elementos de la serie mieloide, algunos linfocitos ( 1 0 - 2 0 % de linfocitos normales),
los megacariocitos y las plaquetas, y ocasionalmente las células plasmáticas.
La presencia de material PAS positivo en forma de gruesos mazacotes en el citoplasma
de células blásticas es indicativa de celularidad de origen linfoide. La variedad L, de la
clasificación FAB es la que cursa con mayor sobrecarga de glucógeno.
Esta técnica citoquímica tiene gran interés en la patología eritroblástica, dado que en
la eritremia aguda (enfermedad de Di Guglielmo) es frecuente encontrar eritroblastos
con depósito de material PAS positivo en el citoplasma. Con todo, estas reacciones no
son constantes ni excesivamente específicas, por lo que en la actualidad la reacción del
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 9-11. Células con

positividad para la reacción del PAS
que m uestran un precipitado de color
rojo púrpura intenso (X 1.000).
PAS ha perdido gran parte de su valor al haber aparecido otros marcadores celulares
mucho más específicos basándose en anticuerpos monoclonales.
Fosfatasa ácida
Principio
La FA es una enzima hidrolítica del grupo de las fosfomonoesterasas que provoca la
hidrólisis a pH ácido del naftol-AS-bifosfato (sustrato), el cual libera productos inter
medios de la reacción que, mediante la unión con una sal diazoica, dan un precipitado
rojo-naranja en el citoplasma celular.
Reactivos
• Tampón citrato: 2,94 mg de citrato sódico en 100 mi de agua destilada. Se añade ácido
cítrico hasta conseguir un pH de 4,2.
• Solución de acetona al 60% en tam pón citrato (se conserva a 4 °C).
• Solución de pararrosanilina hidroclórica: 1 g de pararrosanilina en 20 mi de agua
destilada y se añaden 5 mi de HCI concentrado. Se agita suavemente. Se deja reposar
24 h antes de su uso. Se filtra.
• Solución de nitrito sódico (N aN 02) al 4% en agua (preparación extemporánea).
• Tampón de Michaelis 0,1 mol/1, pH de 7,62, constituido por:
• Veronal sódico (20,5 g en 1.000 mi de H 20 ): 61,5 mi.
• HCI 0,1 N: 38,5 mi.
• Dilución preparada con AT,AT-dimetilformamida (Merck).
• Naftol-AS-bifosfato (sustrato).
Método
1. Se preparan dos soluciones A y B de la siguiente forma:
(a) Solución A. Tres gotas de solución de pararrosanilina y tres gotas de solución
acuosa de nitrito sódico al 4%. Se agita la solución durante exactamente 60 s
y se añaden 30 mi de tampón de Michaelis (pH = 7,62). A continuación, se
añade HCI 2 N gota a gota hasta que el pH descienda a 5.
(b) Solución B. 15 mg de naftol-As-bifosfato en 1 mi de dimetilformamida.
2. Se fijan las preparaciones en solución tam pón acetona-citrato (seis partes de
acetona más cuatro partes de citrato) a 4 °C durante exactamente 30 s.
ERRNVPHGLFRVRUJ
3. Se incuban durante 1 h y a 37 °C en una solución constituida por la mezcla de las

soluciones A y B (mezcla incubadora).
4. Se lavan y se tiñen con hematoxilina de Harris durante 30 min.
Inhibición de la fosfatasa ácida mediante el L(+)-tartárico

Se preparan los reactivos como anteriormente, pero esta vez se añaden 225 mg de ácido
L(+)-tartárico al tampón de Michaelis antes de realizar la corrección del pH a 5, lo cual
se efectuará mediante una solución concentrada de NaOH.

Las zonas del citoplasma celular con actividad enzimática aparecen de color rojo brillante
(fig. 9-12). La positividad para esta enzima se observa normalmente en polimorfonu-
cleares neutrófilos (granulación primaria) y eosinófilos, y en monocitos, linfocitos (44%
de la población normal), células plasmáticas y células linfoides reactivas (mononucleosis
infecciosa). También son positivas otras células no presentes normalmente en la SP, tales
como las células de Gaucher y las células carcinomatosas metastásicas.
Se considera la FA un marcador citoquímico de los linfocitos T. Más del 80% de los
mismos denotan actividad de esta enzima hidrolítica; su positividad en los linfocitos T
colaboradores posee una situación centrosómica. En la llamada leucemia de células
peludas (tricoleucemia), los tricoleucocitos presentan, junto a su aspecto morfológico
peculiar (células peludas), una intensa positividad FA, que forma precipitados granulares
y es resistente a la acción del ácido L(+)-tartárico. En el linfoma linfoblástico T (sarcoma
de Sternberg), las células linfoides presentan una intensa actividad fosfatásica ácida
granular de localización centrosómica.
fS-glucuronidasa
Principio
Se trata de una enzima hidrolítica (hidrolasa ácida) que pertenece al grupo de las glu-
cosidasas o carbohidrasas. Su acción la ejerce sobre sustrato naftol-AS-bi-0-D-glucurónico,
el cual libera productos intermedios que puestos en reacción con una sal diazoica dan
lugar a un precipitado de color anaranjado intenso en el citoplasma celular.
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Reactivos
• Ácido acético: 0,2 M (11,43 ml/1).
• Bicarbonato: 0,05 mol/1 (4,2 g/1).
• Tampón de acetato sódico (pH = 5), preparado de la siguiente forma (se guarda 1 mes
a 4 °C):
• Acetato sódico: 16,4 g/1 (anhidro) o 27,2 g/1 (trihidratado), 35,2 mi.
• Ácido acético: 0,2 mol/1,14,8 mi.
• Pararrosanilina hidroclórica.
• Solución de nitrito sódico (N aN 02) al 4% en agua destilada (preparación extempo
ránea).
• Solución de sustrato (ácido naftol-AS-bi- P-D-glucurónico), formado por la mezcla
de dos soluciones preparadas de la siguiente forma:
• Solución A (sustrato).
• Solución B. La preparación de la solución B exige agitación constante durante
1 min y después de la misma se debe mezclar con la solución A. Se ha de obtener
una tonalidad ámbar.
• NaOH N (2 g/50 mi de H 20 ).
Método
1. Se secan las extensiones al aire a temperatura ambiente durante 1-6 h.
2. Se fija en solución de metanol-formaldehído (preparado extemporáneamente
en proporción 3:7) a 4 °C durante exactamente 60 s.
3. Se lava varias veces con agua destilada.
4. Se seca al aire durante 30 min a 37 °C.
5. Se congelan las preparaciones durante 60 m in en una cápsula de Petri.
6 . Se incuban durante 60 m in a 37 °C en la mezcla incubadora formada por:
(a) Solución A. Se disuelven completamente 2,8 mg de sustrato en 0,12 mi de
bicarbonato sódico 0,05 mol/1 y se añade tam pón acetato (pH = 5) hasta
10 mi.
(b) Solución B. Tres gotas de pararrosanilina hexazotizada más tres gotas de
nitrito sódico. La preparación de la solución B debe agitarse constantemente
durante 1 min, mezclándola después con la solución A.
7. Se ajusta el pH a 5,2 con NaOH N y se añade H20 hasta un volumen final de 20 mi.
Se filtra la solución, la cual debe tener un color amarillo pálido y transparente.
8 . Se lava con agua bidestilada.
9. Se contrasta con hematoxilina de Harris durante 15-30 min.
10. Se lava con agua destilada y se seca.

Se trata de una hidrolasa ácida que, al igual que la FA, tiene una localización preferente
mente lisosómica, si bien también puede hallarse 0 -glucuronidasa en otras estructuras
citoplasmáticas, tales como el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico.
Presentan intensa actividad para esta enzima los macrófagos, las células plasmáticas y
los linfocitos T (positividad granular y centrosómica) Los polimorfonucleares neutrófilos
y los monocitos presentan una positividad difusa de color rojizo (fig. 9-13).
Tinción de azul de toluidina (metacrom asia)

Las preparaciones no requieren fijación.
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FIGU RA 9-13. Células con

positividad para p-glucoronidasa.
Principio
La característica principal de los gránulos de los polimorfonucleares basófilos es su
metacromasia con los colorantes azules (azul de metileno, azul de toluidina), la cual
consiste en que estos gránulos adquieren un color rojizo en presencia de los colorantes.
La metacromasia se debe a la gran riqueza en mucopolisacáridos ácidos sulfatados que
poseen los gránulos basófilos.
Reactivos
• Solución de azul de toluidina formada por:
• Azul de toluidina: 1 g.
• Metanol: 100 mi.
Método
1. Se agita la solución de azul de toluidina durante 5-10 m in y se filtra. La solución
se conserva 6 meses a temperatura ambiente.
2. Se separa el volumen necesario y se incuban las preparaciones durante 3 h a
temperatura ambiente.
3. No se contrastan.

Es u n a tin c ió n específica p a ra los g ran u lo cito s basófilos de la sangre y de los
basófilos hísticos (células cebadas o m astocitos). Al ser el azul de to lu id in a un
colorante m etacrom ático (viraje del color en contacto con estas células), aparecen
dos colores: el fondo, de color azul verdoso, y los gránulos basófilos, de violeta
intenso (fig. 9-14).
ACTIVIDAD MURAMIDASA (LISOZIMA) EN SUERO O EN ORINA

Introducción
La lisozima o muramidasa es una proteína enzimática, de bajo peso molecular (13.900
daltons), constituida por una sola cadena de aminoácidos. Es especialmente abundante
en granulocitos, monocitos y macrófagos hísticos.
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FIGU RA 9-14. Tinción con azul

de toluidina, específica para los
granulocitos basófilos de la sangre
y los basófilos hísticos (células cebadas
o mastocitos).
Su acción consiste en catalizar la hidrólisis de ciertos enlaces glucosídicos de los

polisacáridos complejos presentes en las paredes celulares de algunas bacterias. Las
paredes bacterianas son formaciones rígidas constituidas por un entramado estructural
de cadenas de polisacáridos paralelos, unidas covalentemente por cadenas peptídicas
transversales. Este armazón que recibe el nombre de péptido glucano o mureína tiene
como m isión proteger la m em brana celular de las agresiones del medio externo. La
unidad básica que se repite en la estructura del péptido glucano es el muropéptido, un
disacárido constituido p o r N-acetil-glucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico
(NAM) con enlace 1-4.
La acción concreta de la lisozima consiste en hidrolizar estos enlaces, destruyendo
así la pared celular bacteriana.
NAGi---- 4NAM1-----4NAG,-----4NAM1
T T t
Lisozima Lisozima Lisozima
Principio
Se emplea como sustrato para la dosificación de la lisozima plasmática el Micrococcus
lysodeikticus, que es una bacteria grampositiva. La enzima hidrolítica al actuar sobre la
pared de esta bacteria, disminuye la turbidez de la suspensión bacteriana (lisis de los
gérmenes) y, por consiguiente, su densidad óptica.
Reactivos
• Sangre total mantenida incoagulable mediante EDTA-K3 y exenta de hemolisis, de la
que se separa el plasma por centrifugación. La dosificación puede diferirse 1-2 meses,
congelando el plasma a 20 °C.
• Tampón fosfato (K2H P 0 4, Na2H P 0 4) 0,06 mol/1, pH = 6,2.
• Suspensión de Micrococcus lysodeikticus: 200 mg/dl en tam pón fosfato.
• Patrón de lisozima: 10 mg/dl en tampón fosfato, pH = 6,2. A partir de esta solución
se preparan diluciones para obtener concentraciones de lisozima de 0,5,1,2,3,5,7,5
y 1 0 jig/ml.
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M étodo
1. Se diluye el plasma cinco o más veces según la intensidad de la actividad enzimática
en tam pón fosfato.
2. Se ponen en contacto 0,3 mi de cada una de las diluciones de la solución pa
trón y del plasma problema diluido, con 2,7 mi de suspensión de Micrococcus, e
inmediatamente se lee la transmisión (%) a 540 nm.
3. Se traza una recta de calibración con las soluciones patrón, calculando la concen
tración del problema sobre esta recta y teniendo en cuenta la dilución efectuada.

Los valores de referencia son de 1,7-8,2 |xg/ml. La concentración de muramidasa plas
mática aumenta en situaciones caracterizadas por un elevado recambio celular de los
macrófagos o GN. Así, puede observarse un aumento tanto en ciertos síndromes mielo
proliferativos crónicos como, por ejemplo la LMC, o en aquellas enfermedades acom
pañadas de monocitosis reactiva, tales como tuberculosis, cirrosis hepática o neoplasias,
en general. Los mayores aum entos de m uram idasa plasmática suelen observarse en
los procesos proliferativos de serie m onocítica y m uy especialmente en la leucemia
mielomonocítica crónica (LMMC), enfermedad propia de la vejez. Por mecanismo
similar pueden advertirse aumentos también significativos de muramidasa plasmática
en las leucemias agudas de estirpe monocítica, tales como la leucemia monoblástica (M5
de la clasificación FAB) o mielomonocítica (M4 de la clasificación FAB). En la aplasia
medular y en las leucemias de estirpe linfoide (agudas o crónicas), la concentración de
muramidasa plasmática suele hallarse normal o incluso disminuida.
Generales
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Capítulo 9 Funcionalism o granulocitario y m étodos de estudio citoquím ico 2 6 1 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuál de las siguientes actividades es considerada como una función granulocitaria?
(a) Fagocitosis.
(b) Activación neutrofilica.
(c) Quimiotactismo.
(d) Migración transendotelial.
Respuesta razonada: la función primordial de los granulocitos neutrófilos y de células del sistema
mononuclear fagocítico (SMF) es destruir los gérmenes y otras sustancias extrañas que puedan
entrar en el organismo. Esta función se desarrolla en cuatro etapas consecutivas: a) activación;
b) migración transendotelial; c) quimiotactismo, y d) fagocitosis.
2. La función fagocítica de los neutrófilos segmentados se realiza gracias a:
(a) Los ribosomas.
(b) Las mitocondrias.
(c) Los gránulos citoplasmáticos.
(d) El aparato de Golgi.
(e) La membrana citoplasmática.
Respuesta razonada: el granulocito neutrófilo engloba en su interior las partículas extrañas y
los agentes patógenos (gérmenes o bacterias) mediante u n fenómeno conocido con el nombre
de fagocitosis. Ello se com plem enta con la liberación en el interior de la vacuola fagocítica
recién form ada del contenido de sus gránulos, tanto prim arios (granulación azurófila) como
secundarios (granulación específica). Dicho contenido está compuesto por enzimas diversas y
sustancias que contribuyen a la destrucción de los gérmenes patógenos.
3. Para realizar su función fagocítica, los granulocitos neutrófilos requieren, en prim er lugar:
(a) Esperar a que los agentes nocivos se acerquen a ellos.
(b) Adherirse al endotelio vascular.
(c) Desplazarse por el torrente circulatorio.
(d) Desplazarse hasta donde se hala el agente nocivo m ediante quimiotactismo.
(e) Liberar actividad mieloperoxidasa al plasma sanguíneo.
4. ¿Qué significa la palabra quimiotactismo?
(a) Fagocitosis.
(b) Adhesión endotelial.
(c) Desplazamiento.
(d) Endocitosis.
(e) Citoquímica.
5. ¿Cuáles son los principales agentes de la actividad bactericida?
(a) Los agentes quimiotácticos.
(b) Los agentes bacterianos.
(c) La vacuola fagocítica.
(d) Los radicales superóxido.
(e) Las enzimas citoplasmáticas.
6. ¿Cómo se denomina a la prueba de migración granulocitaria?
(a) Quimiotactismo.
(b) Fagocitosis.
(c) Adhesión endotelial.
(d) Transmigración.
(e) Vacuolización.
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26 1. e2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
7. ¿Qué pone de manifiesto la prueba del nitroazul de tetrazolio?

(a) La capacidad quimiotáctica.
(b) La capacidad fagocítica.
(c) La capacidad bactericida.
(d) La capacidad funcional.
(e) La capacidad reductora.
8. ¿Para qué se utiliza la fosfatasa alcalina granulocitaria (FAG)?
(a) Para el diagnóstico diferencial de las leucemias.
(b) Para el diagnóstico de a leucemia linfática crónica.
(c) Para el diagnóstico de la leucemia mieloide crónica.
(d) Para el diagnostico diferencial de los linfomas malignos.
(e) Para ninguna de las anteriores.
9. La actividad peroxidasa es específica de la serie:
(a) Linfoide.
(b) Mieloide.
(c) Megacariocítica.
(d) Eritroide.
(e) Basófila.
10. ¿De qué línea celular es específica la tinción mediante azul de toluidina?
(a) Mieloide.
(b) Eritroide.
(c) Basófila.
(d) Megacariocítica.
(e) Linfoide.
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C A P Í T U L O 10
Métodos inmunológicos en hematopatología

N . V illam or
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de los procesos hematológicos clónales y neoplásicos se realiza por la
integración de los datos clínicos, morfológicos, citogenéticos e inmunológicos, tal como
se recoge en la clasificación de la Organización M undial de la Salud para tumores del
tejido hematopoyético y linfoide. El fenotipo celular se introdujo en los años ochenta con
la aparición de anticuerpos que reconocían células de estirpe linfoide B, T y mieloide,
y se ha extendido ampliamente hasta tener un papel fundamental en el diagnóstico de
los procesos hematológicos neoplásicos y otras hemopatías, y en el seguimiento de los
enfermos. Los anticuerpos siguen la nomenclatura Cluster o f Differentiation (CD) que
define cada anticuerpo por las características del antígeno celular que reconocen y por
la presencia de más de un anticuerpo capaz de reconocerlo. Cada uno de los antígenos
individuaüzados se denomina con las siglas CD seguidas de un número de identificación.
Cuando la molécula reconocida p o r el anticuerpo no está bien caracterizada o solo
existe un anticuerpo que lo reconozca, el número de identificación va precedido de la
letra w (CDw).
Se han caracterizado más de 300 CD, que perm iten detectar y caracterizar sub-
poblaciones de linfocitos (T, B y natural killer [NK]), células inm aduras, mieloides,
monocítico-histiocitarias, eosinófilas, basófilas, dendríticas, eritroides y megacariocíticas.
También existen AcMo, que reconocen moléculas de adhesión y activación, citocinas
y receptores de citocinas, interleucinas y una gran variedad de proteínas de superficie,
citoplasma y núcleo que participan en procesos fisiológicos o patológicos. Además,
existen anticuerpos que identifican células de estirpe no hematopoyética y virus. De lo
mencionado anteriormente, junto con el desarrollo de técnicas para el análisis, se deduce
que las técnicas inmunofenotípicas tienen un papel fundamental en el conocimiento
de las características de la hematopoyesis normal y patológica, y en el armamentario
diagnóstico para estos procesos.
El estudio del fenotipo celular en el diagnóstico hematológico se puede realizar
m ediante diferentes técnicas, que se basan en la emisión de fluorescencia (inm uno-
fluorescencia) o en cambios colorimétricos (inm unocitoquím ica o inm unohistoquí-
mica). Cada sistema de análisis tiene sus ventajas e inconvenientes, que se describen
som eram ente a continuación. En la actualidad, la técnica de inm unofluorescencia
es la más empleada en los laboratorios de hematología y se analiza posteriorm ente
m ediante aparatos denom inados citóm etros de flujo. La técnica inm unofluores-
cente es fácil y rápida. Se realiza sobre células viables, p or lo que el margen de tiem
po para el estudio es corto si se com para con otras técnicas de inm unofenotipo.
El proceso de tinción estándar solo detecta antígenos de m em brana celular y para
el análisis de antígenos intracelulares se requiere de un proceso previo de fijación y
permeabilización. El análisis p or citometría de flujo se realiza sin soporte morfológico

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Capítulo 10 Métodos inmunológicos en hematopatología 263
simultáneo al fenotípico, que puede ser especialmente trascendente en muestras con

una infiltración escasa p o r células malignas. No obstante, la capacidad de análisis
multiparamétrico (3 a 10 determinantes antígenos de forma simultánea en cada célula)
y los avances que se han realizado en la caracterización de la hematopoyesis norm al y
de los diversos procesos malignos perm iten minimizar la falta de base morfológica.
Recientemente, se han desarrollado citómetros de flujo que realizan, simultáneamente
al análisis fluorescente, un estudio fotográfico de las células, con lo que se puede sos
layar parcialmente la falta de soporte morfológico y apreciar la localización subcelular
del mareaje inmunofluorescente. Las técnicas colorimétricas de inm unocitoquím ica
se realizan sobre extensiones de sangre periférica, im prontas de tejido, aspirados de
médula ósea o citocentrifugados de líquidos biológicos. La interpretación se realiza
utilizando u n m icroscopio óptico estándar y la técnica es más larga y laboriosa.
A diferencia de la inmunofluorescencia, las extensiones celulares se pueden conservar
a —20 °C, y perm iten postergar el estudio fenotípico días o semanas tras la obtención
de la muestra. Con esta técnica se analizan antígenos de m em brana e intracelulares,
ya que existe un paso previo de fijación celular. Además, m ediante esta técnica se
mantiene de forma relativa la morfología de las células, lo que facilita la interpretación
del estudio en casos con poca infiltración.
Las dos técnicas se complementan, por lo que es recomendable disponer de ambas
debidamente estandarizadas en un laboratorio dedicado al diagnóstico de hemopatías
malignas. En este capítulo se exponen las pruebas inmunológicas más útiles para el
diagnóstico de las leucemias agudas y crónicas y otras hemopatías malignas, procesos
comunes de preparación y separación de las muestras, las técnicas habituales para el
análisis inmunofenotípico y el funcionamiento de un citómetro de flujo.
MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES

Los estudios inmunofenotípicos pueden realizarse en distintos tipos de muestra, como
se verá más adelante, y requerir el aislamiento celular. Se pueden obtener diversas
fracciones celulares p or métodos basados en propiedades celulares como la densidad,
la resistencia osmótica, la capacidad de adherencia a determinadas superficies o a la
afinidad antígeno-anticuerpo. En este capítulo no se describirán m étodos basados en
el empleo de anticuerpos ligados a partículas magnéticas o el fraccionamiento por
fluorescencia (fluorescent activated cell sorting), ya que precisan de equipam iento
especial.
O btención de leucocitos p o r lisis eritrocitaria

Principio
La sangre se incuba con una solución hipotónica que producirá lisis de los eritrocitos
de la muestra.
Material
• Solución de lisis eritrocitaria (NH 4CL, 0,144 M; N H 4H C 0 3, 0,1 M).
• Tubos de 50 mi con tapón.
• Tubos de 10 mi.
• Tampón fosfato salino (PBS).
• Placa de agitación.
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Método
1. Se colocan 10 m i de sangre en el tubo de 50 mi y se llena el resto con solución de
lisis. Se tapa el tubo y se mezcla por inversión.
2. Se deposita en la placa de agitación durante 10 min.
3. Se centrifuga (450 g, 10 min) y se descarta el sobrenadante.
4. Se añaden 20 mi con solución de lisis, se resuspende, se centrifuga y se decanta.
5. Se resuspende en PBS y se transfiere al tubo de 10 mi.
6 . Se centrifuga (450 g, 10 min). Se descarta el sobrenadante y se ajusta a la concen
tración celular deseada.
Nota: Existen en el mercado soluciones Usantes de hematíes comerciales.
Fraccionam iento celular m ediante sedim entación

Principio
Esta técnica emplea sustancias macromoleculares como el dextrano 500, que permiten
la sedimentación de los eritrocitos.
Material
• Dextrano al 2-3% a partir de solución de dextrano al 20% o en polvo proveniente de
Leuconostoc mesenteroides.
• Jeringas de 60 mi.
• Tapones de goma para orificios de jeringa.
• Palomita.
• Tubos de plástico de 10 mi.
• PBS.
Método
1. Se desmonta el émbolo de la jeringa y se tapa el orificio por donde se administra
la solución con un tapón. En el interior de la jeringa, se mezcla un volumen de
sangre anticoagulada y un volumen de dextrano al 2-3%. Se recoloca el émbolo
con cuidado y sin hacer presión. Se invierte la jeringa, se quita el tapón y se sube el
émbolo hasta eliminar todo el aire del interior de la jeringa. Se coloca la palomita
en la embocadura de la jeringa.
2. Se mantiene la jeringa en posición vertical durante 30 min a temperatura ambien
te, con lo cual sedimentan los eritrocitos que quedan en la parte inferior formando
una capa compacta.
3. Se presiona el émbolo de la jeringa y, a través de la palomita, se transfiere el
sobrenadante a los tubos de 1 0 mi, teniendo cuidado de no transferir la capa
eritrocitaria.
4. Se centrifuga (450 g, 10 m in) y se obtiene un botón celular que contiene los
leucocitos.
5. Se resuspende el botón celular y se lava dos veces con 10 mi de PBS (450 g, 10 m in).
6 . Se ajusta la suspensión celular a la concentración deseada.
Nota: Es recomendable: a) utilizar un papel secante cuando se quita el tapón de la
embocadura de la jeringa para evitar salpicaduras de sangre; b) cortar la aguja que está
al final de la palomita para evitar pinchazos, y c) sujetar la jeringa durante el período de
sedimentación para evitar su caída.
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Fraccionam iento celular m ediante gradiente de densidad

Principio
Esta técnica de separación según el método de Bóyum está basada en la diferente densidad
de las células. Utiliza una mezcla de Ficoll-Isopaque o productos comerciales similares.
Material
• Ficoll-Isopaque o productos comerciales similares.
• Tubos cónicos de plástico de 10 a 20 mi.
• Suero fisiológico o PBS.
Método
1. Se diluye un volumen de sangre anticoagulada (EDTA o heparina) con uno o tres
volúmenes de suero fisiológico o PBS, según el recuento leucocitario.
2. Se colocan 3 mi de la solución Ficoll-Isopaque a tem peratura ambiente en el
fondo de un tubo cónico. Mediante una pipeta Pasteur se vierten cuidadosamente
encima de la solución de Ficoll-Isopaque 7 mi de sangre diluida evitando que se
rompa la interfase Ficoll-sangre.
3. Se centrifuga (400 g, 30 m in, 20 °C) con la centrífuga sin freno. Tras la cen
trifugación se observa una interfase que contiene las células mononucleares. En
el fondo del tubo se hallan los eritrocitos y granulocitos, y en la parte superior, el
plasma diluido.
4. Se recoge la interfase, que contiene las células mononucleares con una pipeta Pas
teur y se traspasa a otro tubo. Se realizan dos lavados con 10 mi de suero fisiológico
o PBS (450 g, 10 min).
Nota: Si no se utiliza una solución comercial de Ficoll se puede preparar con
10 volúmenes de Isopaque (metrizoato sódico) de 1,2 g/ml de densidad y 24 volúmenes
de Ficoll al 9% en agua destilada. La densidad final de la solución es de 1.077. Se pueden
realizar variantes de esta técnica utilizando soluciones de diferente densidad a la del
Ficoll-Isopaque, por ejemplo con Percol®, para recoger otras fracciones celulares.
TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA PARA EL ANÁLISIS

DE ANTÍGENOS CELULARES
La técnica de inmunofluorescencia utiliza fluorocromos como indicadores de la presencia
del antígeno. Se puede aplicar a diversos tipos de muestra y analizarse por microscopía
de fluorescencia o mediante citómetros de flujo. Es esta sección se describirán ambos
tipos de técnicas. La técnica inmunofluorescente puede ser directa, cuando el anticuerpo
está ligado al fluorocromo, o indirecta, cuando el anticuerpo no está ligado y se precisa
de un anticuerpo secundario ligado a fluorocromo que reconoce de forma específica la
especie del anticuerpo primario.
Detección de antígenos citoplasm áticos y nucleares

por inm unofluorescencia en portaobjetos
Aunque la inmensa mayoría de los estudios de inmunofluorescencia en hematología
se analizan en un citómetro de flujo, en algunos casos la información diagnóstica está
en relación con la localización subcelular de la reacción o el patrón de distribución.
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El citómetro de flujo estándar no puede hacer una localización topográfica subcelular de

la señal y, por tanto, en determinadas situaciones se deberá realizar un estudio inmuno-
fluorescente sobre portaobjetos para poder apreciar de forma simultánea la morfología
y la fluorescencia. En este apartado se hablará de forma específica de la detección de la
proteína PML, tinción muy útil para la detección rápida de la fusión quimérica PML-
RARa, diagnóstica de la leucemia aguda promielocítica.
Principio
En células hematológicas normales, la proteína PML se localiza en el núcleo formando
parte de los denominados cuerpos nucleares. El número de cuerpos nucleares oscila entre
4-20, según el tipo celular, y son de un tamaño que permite contarlos tras su inmuno-
tinción con un anticuerpo específico. En la leucemia aguda promielocítica se produce la
translocación t(15;17), en la que se reordenan los genes PML-RARa. La proteína quimé
rica PML-RARa producida por la translocación altera el patrón de distribución normal
de PML, ya que se observan múltiples e incontables señales de PML al microscopio. Por lo
tanto, con una técnica simple y rápida se puede identificar la leucemia promielocítica con
el reordenamiento PML-RARa y que es sensible a la administración de ácido retinoico.
Material
• Anticuerpo específico de ratón anti-PML (clona PGM3) a la dilución adecuada en
PBS.
• Acetona pura.
• Tampón de lavado PBS.
• Anticuerpo antiinmunoglobulinas de ratón ligado a fluoresceína a la dilución ade
cuada en PBS.
• Etanol.
• Pap Pen® o Glicergel®.
• Pipetas ajustables.
• Yoduro de propidio (1 |xg/ml).
• Cubreobjetos.
• Extensiones de sangre periférica, médula ósea o citocentrífiiga de separación de células
mononucleadas de sangre periférica o médula ósea. Las extensiones deben estar secas
o, si son recientes, se deben secar con un secador de pelo durante unos minutos.
• Cámara húmeda protegida de la luz.
• Receptáculo para lavar extensiones.
Método
1. Se selecciona la zona de la extensión donde se realizará el mareaje y se marca con
un lápiz diamante.
2. Se fijan las extensiones durante 5-10 min con acetona pura.
3. Se resigue el perímetro de la zona a marcar con un producto repelente al agua
(PAP Pen® o Glicergel®) que evitará la difusión del anticuerpo.
4. Se sitúan las extensiones a marcar en una cámara húmeda protegida de la luz y
se mantienen en dicha cámara durante todo el proceso de mareaje para evitar la
evaporación del anticuerpo durante las incubaciones.
5. Se aplica la cantidad suficiente del anticuerpo prim ario diluido para cubrir la
zona a marcar (aproximadamente 1 0 0 - 2 0 0 |xl del anticuerpo primario diluido).
Se incuba durante 30 m in a temperatura ambiente.
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6. Se lava con PBS (dos baños de 2 m in).

7. Se aplica la cantidad suficiente de anticuerpo antiinmunoglobulinas de ratón
ligada a fluoresceína para cubrir la zona a marcar durante 30 m in a temperatura
ambiente.
8 . Se lava con PBS (dos baños de 2 min).
9. Se hacen pasos sucesivos en etanol a concentraciones crecientes durante 1 min
(etanol al 70 y al 90% y absoluto). Se deja secar a oscuras.
10. Se contratiñen los núcleos con la solución de yoduro de propidio, se coloca un cu
breobjetos y, con la ayuda de un papel secante, se extrae el resto de contratinción.
11. Se lee en un microscopio de fluorescencia.
Nota:
• Alternativamente al uso de repelentes al agua se puede depositar un cubreobjetos en
la zona en la que se ha depositado el anticuerpo, que se retira durante los lavados con
PBS mediante agitación del recipiente.
• La contratinción con yoduro de propidio se puede realizar en una solución comercial
que mitigue la pérdida de fluorescencia (p. ej., Vectashield®). Los núcleos se pueden
contrateñir con otras sustancias fluorescentes que puedan ser leídas por los filtros
del microscopio de fluorescencia (p. ej., DAPI).
• Los lavados tras la incubación con el anticuerpo ligado a fluoresceína deben realizarse
para evitar la tinción de fondo que interfiera con la interpretación del patrón de
proteína PML.
• Es recomendable realizar en paralelo la tinción de una m uestra norm al extraída
el m ism o día que la m uestra donde se sospecha la presencia de la translocación
PML-RARa, que sirve de control de la tinción y del patrón norm al de la proteí
na PML.

Se seleccionan los núcleos de acuerdo con la contratinción nuclear y, en ellos, se valora
el aspecto y el núm ero de señales de PML reveladas por la fluoresceína. Si las señales
son grandes y en m enor núm ero que 2 0 , corresponde con un patrón normal (o ma-
crogranular). Si por el contrario se observan incontables puntos pequeños, el patrón es
patológico (o microgranular) (fig. 10-1). Se debe valorar la presencia de señal de fondo
fluorescente para poder valorar la tinción de la proteína PML.
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Detección de antígenos de m em brana m ediante inm unofluorescencia

en células en suspensión
Introducción
Actualmente, se dispone de una extensa batería de anticuerpos que permiten identificar
antígenos de membrana presentes en células de diferentes estirpes y estadios de m adu
ración, diferenciación y activación. Los anticuerpos de uso más extendido y de mayor
interés por su especificidad para las líneas linfoides B y T y mieloide, y para el diagnós
tico de otras hemopatías se detallan en la tabla 10-1 y cuadros 10-1 y 10-2. En dichas
tablas también se incluyen otros AcMo que, aún cuando no son característicos de una
línea celular, pueden tener su interés en el diagnóstico de determinados procesos. Estos
corresponden a AcMo que reconocen marcadores de activación (CD25, CD30, CD38),
que no son específicos de línea (CD43, CD45), moléculas del complemento o antígenos
de inmadurez como el CD34, propio de la célula madre progenitora.
TABLA 10-1. Anticuerpos monoclonales para el estudio de la hemoglobinuria paroxística

nocturna
Anticuerpo Población celular afectada

CD 14 Monocitos
CD 16 Neutrófilos
CD24 Neutrófilos
CD48 Monocitos
CD55 Neutrófilos, monocitos, hematíes
CD59 Hematíes
FLAER Neutrófilos, monocitos
FLAER, aerolisina fluorescente.
CUADRO 10-1. Anticuerpos monoclonales para el estudio de las leucemias agudas

• Anticuerpos linfoides de línea B
• Panlinfoide B: CD 19, CD22 cit"; CD79a cit11
• Otrosí CD 10, CD20, IgM (citoplásmica y superficie)
• Anticuerpos linfoides de línea T/NK
• Panlinfoide T: CD7, CD3 cit“
• Otros:" CD2, CD5, CD la, CD4, CD8 , CD56, CD99
• Anticuerpos de línea mieloide
• Panmieloide: mieloperoxidasa," CD33, CD 13 cit,1"lisozima"
• Otros:'’ CD lib, CDllc, CD14, CD15, CD25, CD36, CD61, CD64, CDw65, CD6 6 ,
CD 117, CD203c, CD304
• No específicos de línea
• CD34, TdT,cHLA-DR, CD38, CD123, NG2
“ cit, citoplásmico. Indica que se deben aplicar m étodos que detecten el antígeno en el citoplasma, ya que puede estar
restringido a esta localización o aparecer precozmente en ella.
bIndica antígenos que aparecen en períodos determinados de m aduración o que representan subpoblaciones celulares
de la línea celular indicada.
‘ Indica la localización nuclear y que deben aplicarse métodos que detecten el antígeno en el núcleo.
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CUADRO 10-2. Anticuerpos monoclonales para el estudio de los síndromes

linfoproliferativos crónicos y discrasias de células plasmáticas
Anticuerpos linfoides de línea B

• Pan B: CD19, CD20, CD22, CD79b, Ig superficie, cadenas ligeras
• Otros:" FMC7, CD 10, CD23, CD 138
Anticuerpos linfoides de línea T
• Pan T: CD3, CD2, CD7, CD5
• Otros:" CD4, CD8 , RCT* a0 , RCT 7 8
Anticuerpos linfoides de línea NK
• Pan NK: CD2, CD7, CD56, CD16, CD94
• Otros: CD57, CD 158a, CD 158b, perforina, granzima
No específicos de línea
• CD1 le, CD25, CD26, CD30, CD38, CD43, CD49d, CD103, CD236, HLA-DR, bcl2c
Ig, inm unoglobulina.
“ Indica antígenos que aparecen en períodos determinados de m aduración o que representan subpoblaciones celulares
de la línea celular indicada.
bRCT, receptor de célula T.
‘ Citoplásmico. Indica que se deben aplicar m étodos que detecten el antígeno en el citoplasma, ya que puede estar
Bases de la utilización de los anticuerpos monoclonales

Los AcMo utilizados en citometría de flujo se encuentran, en general, unidos a sustancias
fluorescentes. Es muy habitual encontrar los anticuerpos, sobre todo aquellos de uso
más corriente, ligados a diferentes fluorocromos para facilitar su combinación con otros
anticuerpos. La elección del tándem AcMo-fluorocromo debe estar de acuerdo con las
características del citómetro del que se disponga, la densidad antígena de la molécula que
se debe reconocer y del resto de antígenos de la combinación, los fluorocromos utilizados
con los otros anticuerpos y el objetivo del estudio. La resolución cuántica de ficoeritrina
(PE) o aloficocianina (APC) es superior a la que se obtiene con fluoresceína (FITC) o
el complejo peridinina-clorofila-proteína (PerCP), p o r lo tanto para antígenos que se
expresan débilmente en la célula se puede escoger un fluorocromo de alta resolución
cuántica para mejorar su visualización. También debe tenerse en cuenta el espectro de
excitación y emisión de los fluorocromos para minimizar al máximo las interferencias
entre ellos. Dada la complejidad de los citómetros actuales y la gran cantidad de fluoro
cromos en el mercado, en las páginas web de diferentes compañías que comercializan
anticuerpos monoclonales existen aplicaciones que permiten visualizar las caracterís
ticas de excitación y de emisión de los fluorocromos y su grado de solapamiento según
el citómetro empleado.
La citometría de flujo facilita el mareaje múltiple, lo que permite el diseño de com
binaciones antígenas con las que se obtiene mayor precisión y que son más resolutivas
en el momento del diagnóstico o en el seguimiento de la enfermedad residual. El diseño
de las combinaciones se basará en el conocimiento de la reactividad de la celularidad
normal y patológica, y en la situación patológica que se quiera estudiar. No obstante,
es recomendable el empleo de marcadores centrales que nos sirvan para identificar con
mayor precisión las células de interés. Por ejemplo, el CD 19 es un m arcador que nos
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TABLA 10-2. Criterios para el diagnóstico de leucemia de fenotipo mixto
Línea Requisitos
Mieloide • MPO (por citometría o citoquímica)
o
Diferenciación monocíticafc
Linfoide T • CD3 citoplásmicof
o
CD3 superficie
Linfoide B • CD 19 fuerte con > 1 fuertemente expresado (CD79a cit, CD22, CD 10)
o
CD19 débil con > 2 fuertemente expresado (CD79a cit, CD22, CD10)
cit, citoplásmico; MPO, mieloperoxidasa.
“ Según la clasificación de la OMS.
h Com o m ínim o dos de los siguientes: esterasa inespecífica, CD1 le, CD14, CD64, lisozima.
c Citoplásmico: indica que se deben aplicar m étodos que detecten el antígeno en el citoplasma ya que puede estar
identifica todos los estadios de los linfocitos B, sin grandes modulaciones en su expresión,
y es muy útil en el estudio de la patología linfoide B. De igual manera, el empleo de
CD34 en las combinaciones para el estudio de casos de leucemia aguda facilitarán la des
cripción del fenotipo de los blastos. En la tabla 10-2 y cuadros 10-3 a 10-5 se describen las
características fenotípicas principales de los diversos procesos hematológicos malignos.
Material
• Sangre periférica, médula ósea anticoagulada, líquidos biológicos, células m ononu-
cleares, suspensiones celulares obtenidas de tejidos, o leucocitos obtenidos tras la
sedimentación o lisis de los hematíes (v. sección «Métodos de aislamiento de células
mononucleares»).
• Tampón de lavado PBS.
• Anticuerpos titulados y, si es preciso, inmunoglobulina antiinmunoglobulina de ratón
ligada a fíuorocromo titulada y diluida.
• Pipetas Pasteur, pipetas automáticas de volumen ajustable y puntas de pipeta.
• Tubos de plástico de 5 mi.
Nota: Según la muestra, solución lisante de eritrocitos, ya sea comercial o Tris-cloruro
de amonio (Tris X 10: se diluye 1 g de bicarbonato potásico, 8,26 g de cloruro de amonio
y 0,03 g de EDTA trisódico en 100 m i de H 20 destilada). La solución madre es estable
durante 1 mes a 4 °C; la solución de trabajo es estable 24 h.
Método
1. Se rotulan los tubos con la combinación de anticuerpo-fluorocromo deseada.
2. Se coloca en el fondo de cada tubo un volumen entre 50 y 200 (xl de la muestra, que
contenga 5 X 105 células (se diluye o se concentra la muestra inicial si es preciso).
3. Se añade la cantidad adecuada de los AcMo directamente ligados o el anticuerpo
purificado a la m uestra según está indicado en el tubo. Se cambia la p unta de
pipeta entre AcMo. Se agita para mezclar la muestra con los AcMo.
4. Se incuban 15 min a temperatura ambiente protegidos de la luz.
5. En muestras con hematíes se procede a la lisis de los eritrocitos con tampón de lisis o
bien con soluciones comerciales específicamente diseñadas para la lisis eritrocitaria.
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CUADRO 10-3. Clasificación inmunofenotípica de las leucemias agudas

Leucemia linfoblástica aguda (LLA)
• Línea B (CD 19+, CD22+, CD79a+)
• LLA no especificada"
• ProB: CD10—, IgM cit—, IgM superficie—
• Común: CD10+, IgM cit—, IgM superficie—
• Pre-B: IgM cit+, IgM superficie—
• B: IgM superficie+
• BCR-ABL+: CD38 débil, CD6 6 +, CD33+ y/o CD13+
• AF4-MLL: proB, CD24—, NG2+, CD15+
• E2A-PBX1: Pre-B, CD34-
• Hiperdiploide: común, CD45—, CD 123+
• Línea T (CD3 citoplasmático)"
• Pro-T: CD7+
• Pre-T: CD2+ o CD5+
• T cortical: CDla+
• T madura: CD la —, CD3 superficie+
Leucemia mieloide aguda (LMA) (MPO+, lisozima+, CD33+, CD13+, CD117+)b
• LMA no especificada
• Mieloide: CD 15+, MPO+
• Monocítica: CD36+, CD64+, CD14±
• Pobremente diferenciada (LMA-MO):cMPO+, antígenos mieloides positivos
• Megacariocítica: CD61+
• Dendrítica: CD303+ CD304+
• RUNX1-RUNX1T1: CD 19+ CD56±
• PML-RARa: CD34-, HLADR—, CD1 I b - , MPO++
• CBFB-MYH11: mielomonocítica+, CD2+
• RBM15-MKL1: CD45-, HLADR-, CD61+
• NPM1 mutada: CD34—, CD56±
Leucemia bifenotípica aguda''
Leucemia indiferenciada1.
“Adaptado de la propuesta del grupo EGIL.
hN o todos los m arcadores tienen que ser positivos. Hay otras LMA con translocaciones citogenéticas recurrentes poco
frecuentes con fenotipos diferenciales.
‘ Leucemia m ieloide aguda de diagnóstico exclusivo por inmunofenotipo.
Leucemia aguda con marcadores específicos de más de una línea (v. tabla 10-2).
e Leucemia aguda CD34+, HLA-DR+, sin antígenos específicos de línea.
La lisis con Tris-cloruro de amonio se realiza añadiendo 2 mi de la solución e

incubándola durante 5-7 m in a 37 °C, hasta que la solución se vuelve translúcida.
Para las soluciones Usantes comerciales se siguen las indicaciones del producto.
6 . Se centrifuga y se lava dos veces con PBS (5 mi; 5-8 min a 450 g).
7. Se resuspende la muestra en PBS y, si la técnica es directa, se lee en el citómetro
de flujo.
8 . Si la técnica es indirecta, se incuba con la cantidad adecuada del anticuerpo antiin-
munoglobulina de ratón ligado a fluorocromo. Se incuba 15 m in a temperatura
ambiente protegido de la luz. Se procede a lavados con PBS como en el paso previo.
Nota:
• Es conveniente rotular los AcMo siguiendo el orden de las fluorescencias reconocidas
por el citómetro de flujo.
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CUADRO 10-4. Marcadores inmunológicos en los síndromes linfoproliferativos crónicos

(SLPC) de línea B (CD 19+)
SLPC B CD5+
• Leucemia linfática crónica: Pan Bdébil,‘I CD23+, CD200+, CD43+, FMC7—
• Linfoma de células del manto: Pan Bnormal, CD23—, CD200—, CD43±, FMC7+
SLPC B C D 5 -
• Leucemia prolinfocítica: Pan Bnormal, CD10—, FMC7++
• Linfoma linfoplasmocítico: Pan Bnormal, CD10—, CD5—o +, CD23—o +
• Linfoma folicular: Pan Bnormal, CD10+, CD43—, bcl2+
• Linfoma de Burkitt: Pan Bnormal, CD10+, CD43—o +, bcl2—
• Tricoleucemia: FSC/SSC elevado, Pan Bnormal, CD103+, CD25+, CD1 lc+
• LELV:'’ Pan Bnormal, CD103-, CD25-, CDllc+
• Linfoma de cavidades: Pan B—, CD38+, EMA+, CD30+
• Leucemia de células plasmáticas: Pan B—, CD45—, CD19—, CD138+, CD56+
Los signos + y — indican que el antígeno es generalmente positivo o negativo en dicha entidad.
“ Pan B: CD20, CD22, CD79b, inm unoglobulinas de superficie.
bLinfoma esplénico con linfocitos vellosos.
CUADRO 10-5. Marcadores inmunológicos en los síndromes linfoproliferativos crónicos

(SLPC) de línea T (CD3+ membrana o citoplasma) y NK (CD3—)
• Leucemia prolinfocítica T:fl CD7++, CD4+, TCR g¡(3+, NK—b
• Síndrome de Sézary: CD7—, CD26—, CD4+, TCR a(3+, NK—
• Leucemia de linfocitos granulares: CD8 +, NK+, TCR afJ o TCR 7 8
• Linfoma T periférico: muy variable, incluso CD3 membrana—
• Linfoma NK: C D 3-, CD8 +, NK+
Los signos + y — indican que el antígeno es generalmente positivo 0 negativo en dicha entidad.
“Este fenotipo se observa en el 75% de los casos.
b NK: CD57, CD16, CD56, CD94.
Las técnicas en sangre total tienen la ventaja de la rapidez, al hacer innecesaria la

separación de las células, la dism inución del volum en de sangre necesario para
realizar el estudio y la reducción de la m anipulación de especímenes infectados
por virus. Además, se ha visto que los procesos de centrifugación, manipulación y
separación pueden afectar de forma diferencial a las poblaciones leucocitarias, por
lo que es preferible realizar la mínima manipulación de la muestra. Por este motivo,
recientemente se han descrito técnicas de mareaje con m enor manipulación de la
muestra como las denominadas Usado sin lavado o las que no requieren ni siquiera
lisis eritrocitaria.
Para evitar el desplazamiento de los complejos antígeno-anticuerpo sobre la m em
brana (formación de capping) y su posterior endocitosis, se puede añadir azida sódica
(inhibidor del metabolismo celular) a la suspensión celular y realizar las incubaciones
a4 °C .
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• Para obviar falsos positivos por la unión del anticuerpo con receptores Fe, se puede
añadir a la solución tam pón suero humano AB.
• El análisis de antígenos de localización citoplasmática o nuclear precisa de proce
dimientos previos al mareaje que perm itan la entrada del anticuerpo en la célula.
Existen múltiples métodos de fijación y permeabilización celular, pero en laboratorios
diagnósticos es recomendable emplear reactivos comerciales que hayan sido testados
y que aseguren la correcta tinción con los anticuerpos básicos para el diagnóstico de
las hemopatías malignas.
• Si se quiere analizar inmunoglobulinas de superficie o la distribución de cadenas lige
ras se debe utilizar células separadas o lavar con PBS (3 X 5 mi PBS, 450 g, 5-10 min)
la sangre total. Tras los lavados, se aspira el máximo de sobrenadante sin perder
celularidad, para evitar problemas en la lisis eritrocitaria, si existe un exceso de PBS
en la muestra.
• Si se quieren analizar antígenos en eritrocitos, se incuba el AcMo con 5 (jl I de sangre
total y se obvia el paso de lisis eritrocitaria.
• El núm ero de células a adquirir en el citóm etro dependerá del tipo de estudio que
se desee. Así, para el análisis de las subpoblaciones linfocitarias, la adquisición de
10.000-15.000 leucocitos (o 1.000-2.000 linfocitos) será suficiente. Para estudios
de enferm edad residual o cuantificación de células infrecuentes, p o r ejemplo
las células precu rso ras C D 34+, se n ecesitará a d q u irir u n m ayor n ú m ero de
leucocitos (50.000-1.000.000) para conseguir niveles de precisión y sensibilidad
adecuados.
• Se han desarrollado sistemas que perm iten el cálculo absoluto de células con un
determinante antigénico por microlitro, por ejemplo el valor absoluto/|jl 1 de linfocitos
CD4+. Para ello, se emplean tubos especiales que contienen un número de partículas
determ inadas p or (xl o se añaden durante el procesamiento de la m uestra y que
permiten extrapolar el núm ero absoluto utilizando un solo instrumento.

Si la lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia, la positividad se observa como
un halo fluorescente en la m embrana, cuya intensidad dependerá de los anticuerpos
utilizados. En un citómetro de flujo la reactividad o positividad de las células se apre
ciará como un desplazamiento de la señal a canales de mayor señal de fluorescencia. El
porcentaje de células positivas para cada antígeno se valorará según el control isotípico
del anticuerpo (v. más adelante).
INMUNOFENOTIPO POR CITOMETRÍA DE FLUJO

Principio de la citom etría de flujo
La medición de las características físicas y/o químicas de las células se conoce como
citometría. Esta medición puede realizarse de formas muy diversas, pero cuando se
analizan las características de las células m ediante una fuente de excitación lumínica
mientras circulan en una corriente líquida se denomina citometría de flujo. Si bien, en
sentido estricto, la citometría de flujo es una técnica que se utiliza en los analizadores
hematológicos autom atizados (v. capítulos 4 y 5), el térm ino de citom etría de flujo
multiparamétrica (CFM) suele restringirse a la lectura e interpretación de las reacciones
en las que intervienen sustancias fluorescentes. La gran difusión de la CFM en la práctica
médica tiene su base en cuatro aspectos fundamentales:
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1. El desarrollo de los AcMo y su demostrada importancia en el diagnóstico y pronós

tico de muchas enfermedades.
2. El perfeccionamiento de la tecnología basada en el empleo de luz láser.
3. La revolución de los sistemas informáticos.
4. El continuo desarrollo de nuevos fluorocromos y citómetros de flujo.
Las bases del análisis de las células sanguíneas mediante inmunofluorescencia ya se
han explicado anteriorm ente y residen, por un lado, en el empleo de los AcMo, para
identificar los antígenos de diferenciación celular, y por otro, en los sistemas de detección
de la inmunofluorescencia (visuales o automatizados).
Los citóm etros de flujo miden las diversas características celulares o parámetros
mediante los cambios observados tras la interacción entre un foco de luz y las células. Para
ello, los citómetros disponen de un sistema hidráulico para la circulación del espécimen
en un flujo monocelular continuo, un sistema lumínico que incide sobre las células, un
sistema óptico y eléctrico que recoge la luz dispersada y un sistema informático para
almacenar y procesar los datos. La interacción entre la célula y la luz láser se produce
en la cámara, punto central del citómetro, y la dispersión lumínica producida en la
interacción es recogida por los detectores de los diversos parámetros situados en la misma
dirección de la luz incidente (0,5-10°), denominada forward angle light scatter (FSC)
o dispersión frontal de luz, y de forma perpendicular a la luz incidente (90°), donde se
sitúan la denominada orthogonal scatter o side scatter (SSC) o dispersión lateral de luz y
los detectores de fluorescencia (FL). El FSC refleja, aunque no de forma precisa, el tamaño
de las células. El SSC revela la complejidad celular, entendiendo por ello la granulación,
las características de la membrana y la presencia de estructuras internas. El FSC y el SSC
detectan parámetros celulares intrínsecos, es decir, características propias de las células
detectables aunque no se hayan sometido a inmunomarcaje. El empleo de sustancias
fluorescentes perm ite analizar otras propiedades celulares, propiedades extrínsecas,
tras el adecuado proceso técnico. La mayoría de los citómetros actuales disponen de
detectores para tres o más fluorescencias, si bien existen modelos más complejos capaces
de recoger un mayor número de ellas (FLt, FL2, FL3. .. FLJ. La señal lumínica recogida
en los detectores se selecciona a determinadas longitudes de onda, de acuerdo con el
pico de emisión de los fluorocromos empleados, mediante filtros ópticos. La señal que
llega al fotomultiplicador es amplificada manteniendo la proporcionalidad de la energía
aferente y eferente. Finalmente, la señal eléctrica es convertida a lenguaje digital para
ser procesada por el sistema informático una vez incorporado el citómetro (fig. 1 0 - 2 ).
Los fluorocromos que pueden ser utilizados en un citómetro de flujo dependerán de
dos factores: que su excitación se produzca en el rango de emisión del/de los láseres que
posea el citómetro y que su espectro de emisión pueda ser recogido por los sistemas de
filtros ópticos con los que están equipados.
La mayoría de los citóm etros poseen un láser que excita a 488 nm y que perm ite
la excitación simultánea de fluorocromos como FITC (pico de emisión: 525 nm), PE
(578 nm) y PerCP (675 nm ), y un láser que excita a 633 nm y que permite la excitación
de fluorocromos como APC (660 nm) o AlexaFluor 750 (750 nm). Algunos citómetros
poseen láseres adicionales, como el violeta, que excita a 405 nm y perm ite detectar a
fluorocromos como Pacific Blue (455 nm).
C alibración del citofluoróm etro

Un paso previo imprescindible a la adquisición de los especímenes en el citómetro de flujo
es la calibración del equipo. Con la complejidad actual de los citómetros de flujo muchos
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Electrónica Recogida de señal
A / V W célula 1
Óptic célula 2
célula 3
—{ - i m A A A A
Detector I338IA A A / V V A A A A A A A A A /
FL3 A A A / W ] célula n
f e Resultados
Fluidos Láser
Ordenador
Programa análisis |
• •
F I G U R A 10-2. Esquema del funcionamiento de un citómetro. Las células de la muestra son conducidas
hacía la interacción con el láser por un sistema de enfoque hidrodinámico (A ), que mediante la presión
del líquido envolvente (flechas) centra la célula en el punto de interacción con el láser (B ). La interacción
provoca la emisión de señales lumínicas en todas las direcciones del espacio, pero solo se recogen las emitidas
en la dirección del láser (FSC) y a 90° (SSC y fluorescencias). Los filtros ópticos de diversas características
permiten dirigir la luz de cada longitud de onda a su detector específico, donde son amplificados, y la señal
para cada célula archivada. La informática es el último paso para la obtención de los resultados.
de ellos disponen de programas que ayudan en el proceso de calibración. Estos programas

utilizan partículas comerciales que emiten luz en los distintos canales de fluorescencia
leídos por el citómetro, y sirven para confirmar que el aparato está analizando de forma
correcta los diversos parámetros y para situar los fotomultiplicadores en la amplificación
óptima para obtener la mejor discriminación entre señal y ruido. Además, se debe realizar
una compensación de la señal de fluorescencia emitida para cada fluorocromo cuyo
espectro de emisión se superponga parcialmente con el de otro fluorocromo. Como se
ha mencionado anteriormente, los citómetros poseen filtros ópticos que seleccionan la
longitud de onda de los picos de emisión de los fluorocromos más empleados y que sos
layan parcialmente la superposición de espectros de emisión. A pesar de ello, hay fluoro
cromos con espectros de emisión amplios que son recogidos por los filtros ópticos para
la zona de máxima emisión de otro fluorocromo, por tanto, este dará señal en dos o más
canales de fluorescencia. El ajuste de las compensaciones se realiza con partículas ligadas
a un solo fluorocromo y, mediante programación, se sustrae la señal doble positiva que se
produce por la superposición en el espectro de emisión de los fluorocromos (fig. 10-3).
La mayoría de los citómetros poseen programas automáticos que realizan esta fimción,
ya sea previa a la adquisición o posterior a ella. Es aconsejable ajustar los parámetros
de calibración obtenidos con las partículas de calibración empleando muestras reales.
Otro aspecto muy im portante en la citometría de flujo es conocer los patrones de
positividad para los diversos anticuerpos y de las combinaciones de los mismos, que nos
permitirán detectar anomalías en el sistema o errores en el mareaje.
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FIGURA 10-3. Representación biparamétrica de la señal obtenida con partículas ligadas a un solo
fluorocromo antes de la compensación electrónica de las fluorescencias (A) y después de dicha
compensación (B). Obsérvese que antes de la compensación electrónica existía una población doble
positiva falsa.
Análisis e interpretación del resultado

Selección de poblaciones
El citómetro se utiliza para definir y cuantificar poblaciones heterogéneas, tanto desde
el punto de vista intrínseco como extrínseco. Cada célula produce una señal para cada
uno de los parámetros analizados; para cada parámetro se obtienen los valores de señal
de las células que componen la muestra distribuidas en los diversos canales de energía,
que se pueden representar en forma de histograma. No obstante, la correlación de los
datos de dos o más parámetros (estudio multiparamétrico) incrementa de forma notable
la capacidad de discriminación e identificación de la heterogeneidad celular (fig. 10-4).
La heterogeneidad intrínseca se pone de manifiesto sin necesidad de ningún mareaje con
AcMo y, así, al correlacionar FSC y SSC se pueden diferenciar, por ejemplo, los linfocitos,
monocitos y granulocitos de sangre periférica por la diferente intensidad de señal de cada
uno de los parámetros en dichas poblaciones celulares.
El program a inform ático perm ite escoger parte de la población de la m uestra
ignorando el resto, tanto en el m om ento de la adquisición como del análisis. Sobre la
parte del espécimen escogida, también denominada ventana, se puede aplicar el estudio
m ultiparamétrico. La realización de la ventana es una parte crucial del análisis de la
muestra, ya que los cálculos se realizan solo sobre la zona seleccionada. La decisión
de cómo ha de ser la ventana es relativamente subjetiva, pero debe contemplar tanto
la pureza de la población escogida como la inclusión de toda la población de interés
en la ventana. En general, la ventana se realiza en la señal de FSC y SSC, pero puede
realizarse en las fluorescencias. Si se emplean m arcadores centrales para identificar
las células de interés se facilita la inclusión de toda la población en el análisis. En el
estudio de las poblaciones linfocíticas en sangre total, la ventana de selección se realiza
de form a sistemática, incluso autom atizada en algunos equipos. La realización de
ventanas en parámetros de fluorescencia permite analizar poblaciones poco frecuentes
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FIGURA 10-4. Representación en histograma de la señal FSC (A) y SSC (B) de una sangre periférica
normal después de la lisis. La separación de las diversas poblaciones celulares no es satisfactoria.
La correlación de ambas señales (FSC en abscisas y SSC en ordenadas) permite su mejor diferenciación (C).
que, tras la selección p o r sus características específicas, sufren un proceso electrónico

de purificación que permite analizar otros parámetros de interés en un número elevado
de dichas células (fig. 10-5).
Interpretación del mareaje celular

Para saber si una población expresa o no un determinado antígeno, es necesario establecer
el límite entre lo positivo y lo negativo. Es p or ello que se emplean los denominados
controles de fluorescencia, consistentes en AcMo sin reactividad específica obtenidos en
la misma especie, del mismo subtipo de inmunoglobulina y ligados al mismo fluoro-
cromo que el anticuerpo específico a analizar. Se debe usar un control para cada uno
de los fluorocromos empleados y para cada tipo de técnica que se realice. Además,
si el espécimen ha sido som etido a algún proceso técnico especial (p. ej., fijación),
debe realizarse un control del espécimen así procesado. En determinadas situaciones
y en mareajes con muchos fluorocromos diferentes, se puede emplear como control el
denominado «control menos uno», que consiste en utilizar como control negativo un
tubo que contiene todos los antígenos de la combinación excepto el que se quiere analizar
de forma específica, ya que este tipo de aproximación controla de forma más precisa el
solapamiento de espectros.
En el citómetro calibrado, el control negativo se utiliza para delimitar la frontera entre
lo positivo y lo negativo. Para ello, el marcador de positividad-negatividad se coloca en
el límite de la distribución de la señal del control negativo, así la población queda a la
izquierda de este. Los especímenes procesados con la misma técnica y fluorocromo se
valorarán respecto al m arcador antes colocado. En la gráfica que correlaciona ambas
fluorescencias se colocan dos marcadores, de manera que la población del tubo control
negativo quede incluida en el cuadrante inferior izquierdo. En los especímenes con dos
AcMo-fluorocromo específicos, y de acuerdo con los marcadores anteriores, se pueden
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CD38:FITC-A LO G ICA L
FIGURA 10-5. En la fila superior se muestra la tinción para células plasmáticas (CD38 intenso
en color negro) y la coexpresión de CD45 y CD56 en las mismas células en un estudio con 20.000 células
sin selección electrónica previa. En lafila inferior se observa la misma muestra con selección previa
de las células con expresión intensa de CD38. Con esta aproximación, se observan dos poblaciones
según la coexpresión de CD45 y CD56, que no se distingue si no se realiza la selección electrónica.
distinguir cuatro poblaciones: la primera, situada en el cuadrante inferior izquierdo,

que es negativa para ambos anticuerpos; la segunda, situada en el cuadrante superior
izquierdo, que incluye la población positiva para el prim er anticuerpo; la tercera, situada
en el cuadrante inferior derecho, que incluye la población positiva para el segundo
anticuerpo, y la cuarta, situada en el cuadrante superior derecho, que incluye la población
positiva para ambos anticuerpos (fig. 10-6). El núm ero de poblaciones fenotípicas se
incrementa cuando se incorporan AcMo-fluorocromos de acuerdo con la fórmula 2n,
donde n representa el número de AcMo-fluorocromos empleados. Además de evaluar la
normalidad del valor porcentual de cada una de las poblaciones también se debe valorar
la intensidad de expresión de los antígenos (fig. 10-7).
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A B
FIGURA 10-6. Para valorar la positividad o negatividad de un antígeno deben colocarse primero los
separadores en los límites de la señal de fluorescencia en el tubo control (A) (anticuerpo ligado a
fluorocromo sin especificidad antihumana). En B se representan los valores de positividad para la
población CD19+, CD5- (3,1%), CD19+, CD5+ (13,3%) y CD19-, CD5+ (69,6%), según los marcadores
de positividad/negatividad del tubo control.
Aplicaciones de la citom etría de flujo m ultiparam étrica

La CFM aporta rapidez, sensibilidad y objetividad al análisis del espécimen del pa
ciente. Con ello se ha aum entado tanto la capacidad del laboratorio clínico (mayor
núm ero de especímenes procesados p or día) como la precisión y la objetividad del
CD19 PerCP C y5_5 FL3-H CD5 APC FL4-H
FIGURA 10-7. Intensidad antigénica por citometría de flujo. La citometría de flujo permite valorar
la densidad del antígeno en cada célula. En la imagen se representan la expresión de CD 19 y CD20
(izquierda) y de CD20 y CD5 (derecha) en linfocitos de sangre periférica. La expresión de CD19 es la
misma para todos los linfocitos positivos, pero existen dos intensidades para CD20. La población en negro
expresa 10 veces más CD20 que la población en gris oscuro. Además, la población con expresión débil de
CD20 coexpresa CD5 de forma patológica.
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resultado. El citóm etro de flujo perm ite analizar rápidam ente entre 5.000 y 300.000
células de un espécimen. Como se ha com entado anteriorm ente, el análisis de un
núm ero elevado de células es altamente recomendable en el estudio de poblaciones
con escasa representación en el total del espécimen, ya que increm enta la precisión
del resultado. La sensibilidad de los citóm etros de flujo llega a 1.000 moléculas por
célula y podem os conocer el núm ero de determ inantes antígenos de un espécimen
m ediante el empleo de partículas de densidad antígena conocida. La objetividad de
los citómetros de flujo viene dada p or el sistema de conversión de la señal lumínica
(v. anteriorm ente), que evita la subjetividad de la interpretación del microscopio de
fluorescencia. Los citóm etros de flujo son aparatos versátiles tanto respecto al es
pécimen como a la técnica que puede analizarse en ellos. El tipo de células que puede
analizarse mediante citom etría de flujo varía, en el campo de la hematología, desde
la plaqueta al megacariocito, y pueden realizarse estudios moleculares, funcionales o
combinaciones de ambos.
En hematología, la aplicación más usual del citómetro de flujo es el estudio de an
tígenos de superficie para el diagnóstico de procesos leucémicos agudos y crónicos,
linfoides y mieloides, la cuantificación de poblaciones linfocíticas, la determinación de
marcadores pronósticos en algunas enfermedades, el diagnóstico de la hemoglobinuria
paroxística nocturna y la cuantificación de enfermedad residual. La elección de los
AcMo en el estudio de los procesos leucémicos y de los linfocitos es fundamental para
una correcta caracterización de las poblaciones celulares y, por tanto, del diagnóstico.
Las leucemias agudas se caracterizan por la presencia de translocaciones que producen
proteínas quiméricas de fusión. Recientemente, se han desarrollado sistemas parecidos
al ELISA para analizar la presencia de la proteína quimérica BCR-ABL, que identifica
la leucemia mieloide crónica y la leucemia aguda con dicha translocación y que son
tributarias de tratamiento específico.
O tras aplicaciones habituales de la CFM son la cuantificación de reticulocitos,
el análisis del ciclo celular y el contenido de ADN. El recuento de reticulocitos se
obtiene tras la incubación con sustancias fluorescentes que se ligan al ARN y, además
de aum entar la precisión en los casos con escasos reticulocitos, perm ite diferenciar
también poblaciones de estos según el contenido de ARN. Los reticulocitos más jóvenes
poseen mayor cantidad de ARN y su fluorescencia es mayor. El estudio del ADN en
los procesos hematológicos perm ite detectar clonalidad, con la presencia de picos
no diploides, y conocer la distribución en las diversas fases del ciclo de las células del
espécimen. El estudio del ADN puede combinarse con antígenos de superficie y, de
esta manera, analizar el contenido de ADN y la distribución en el ciclo celular de la
población deseada.
M ediante CFM se puede analizar otras características celulares como la capacidad
fagocítica de los neutrófilos; realizar estudios de sensibilidad a medicamentos; buscar
autoanticuerpos plaquetarios, eritrocitarios y granulocíticos; realizar el fenotipo eri
trocitario y HLA; analizar las glucoproteínas de membrana plaquetarias para el diagnós
tico precoz de las trombopatías congénitas; cuantificar los volúmenes sanguíneos y las
enzimas eritrocitarias; realizar estudios cromosómicos y de oncogenes, y observar los
cambios de pH o calcio tras la activación celular, entre otros. El progreso de la CFM y el
desarrollo de nuevas aplicaciones estarán condicionados por el avance de la producción
de nuevos citómetros, de la aparición de nuevos reactivos y del progreso en el conoci
miento de la patología hematológica. Algunas de las aplicaciones médicas de la CMF se
resumen en el cuadro 1 0 - 6 .
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CUADRO 10-6. Principales aplicaciones de la citometría de flujo en hematología

• Hematología neoplásica y clonal*1
• Leucemias agudas
• Síndromes linfoproliferativos crónicos
• Hemoglobinuria paroxística nocturna
• Gammapatía monoclonal y mieloma múltiple
• Mastocitosis sistémica
• Mielodisplasia
• Enfermedad mínima residual
• Marcadores pronósticos*’
• Poblaciones linfocitarias y recuento de linfocitos CD4
• Recuento de células CD34
• Recuento de reticulocitos
• Cuantificación de antígenos de membrana
• Cuantificación complejos leucocito-plaqueta
• Detección de linfocitos CMV específicos
• Banco de sangre
• Transfusión fetomaterna
• Prueba de Coombs
• Fenotipificación eritrocitaria
• Detección de anticuerpos irregulares
• Contaminación leucocitaria de los concentrados de hematíes
• Patología congénita
• Enfermedad granulomatosa crónica y patologías por déficit de adhesión
• Linfohistiocitosis hemofagocítica familiar
• Inmunodeficiencias congénitas
• Trombopatías congénitas
• Ploidía y ciclo celular
• Determinación de producción de citocinas
• Determinación de HLA-B27
• Citotoxicidad a fármacos
“Aplicable a sangre periférica, médula ósea, líquidos biológicos (LCR, pleural, pericárdico, articular, vitreo,
broncoalveolar), punción aspirativa de masas, suspensión celular de tejidos.
bDependerá de la patología de base.
TÉCNICA DE INMUNOCITOQUÍMICA PARA EL ANÁLISIS

DE ANTÍGENOS CELULARES
Las técnicas inmunocitoquímicas se aplican a células fijadas sobre portaobjetos. Como
trazador de la presencia del antígeno (Ag) se emplean enzimas, como la peroxidasa
(inmunoperoxidasa) o la fosfatasa alcalina (inmunofosfatasa alcalina), que perm iten
detectar la unión antígeno-anticuerpo por un cambio de color en las células que poseen
el antígeno. Con este método se analiza, en un único proceso técnico, a antígenos de
membrana, citoplasma y núcleo ya que existe una fijación celular previa. Este hecho tiene
importancia en el diagnóstico de las leucemias agudas, pues ciertas moléculas se expresan
solo en el citoplasma en los estadios de diferenciación más tempranos, y en otros procesos
malignos en los que existe pérdida aberrante de la molécula en la superficie celular. A
continuación, se describe la técnica de fosfatasa-inmunofosfatasa alcalina (FAAFA).
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Introducción
Las dos técnicas inmunoenzimáticas principales para el estudio inmunofenotípico son
la inmunoperoxidasa y la inmunofosfatasa alcalina. La inmunoperoxidasa tiene la des
ventaja de que es necesario bloquear previamente la peroxidasa endógena presente en
determinadas células sanguíneas (fundamentalmente neutrófilos y eosinófilos), para
lo cual es preciso utilizar sustancias como el metanol, el peróxido de hidrógeno o el
cloroformo, que pueden desnaturalizar los antígenos celulares.
Por ello, la inmunofosfatasa alcalina parece ser, en el momento actual, la técnica más
ventajosa para aplicar AcMo al estudio de las enfermedades hematológicas.
Bases p ara el m anejo de los anticuerpos m onoclonales

La mayoría de los AcMo sum inistrados p o r las firmas comerciales o laboratorios de
inmunología necesitan ser diluidos antes de su empleo en técnicas inmunocitoquímicas.
Para saber cuál es la dilución más apropiada, se emplean especímenes sanguíneos que
contengan células que expresen el Ag específico del AcMo que se quiere probar. Se
realizan diluciones sucesivas (1:10,1:20; 1:50 y 1:100) del AcMo y se aplica a las mues
tras. La dilución óptim a es aquella en la que la ausencia de tinción inespecífica en las
células negativas se acompaña de una tinción adecuada de las células positivas (puede
ser preciso hacer diluciones inferiores o superiores a las indicadas anteriormente). Una
vez que se conoce la dilución óptima y teniendo en cuenta que para cada preparación se
necesitan de 100 a 200 |xl del AcMo diluido, se hacen partes alícuotas de 10 o 20 (xl del
AcMo en tubos Eppendorf y se guardan a -2 0 o -8 0 °C. De esta forma, la reactividad
de los anticuerpos se mantendrá estable durante períodos prolongados. La eficacia de los
AcMo disminuye si se congelan y descongelan de forma repetida. El AcMo diluido puede
emplearse durante 24-48 h. Conviene m antener los AcMo (diluidos o no) a 4 °C (en
nevera o baño de hielo), ya que a temperatura ambiente pierden efectividad con rapidez.
Técnica de inm unofosfatasa alcalina

La secuencia de reacciones se describe a continuación, y se muestra en la figura 10-8.
1. Se incuba el espécimen con un AcMo (AcMo primario) contra un Ag concreto.
Se efectúa un lavado que elimina el AcMo no unido al Ag.
Fosfatasa alcalina
4— intestinal
de ternera Complejos
” FAAFA
AcMo de ratón
*— antifosfatasa
alcalina
__ AcMo primario
de ratón
FIGURA 10-8. Representación

esquemática de la técnica de
inmunofosfatasa alcalina (FAAFA).
AcMo, anticuerpo monoclonal;
Ig, inmunoglobulina.
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2. Se añade un segundo AcMo (llamado AcMo puente) de otra especie animal (p. ej.,
conejo) dirigido contra inmunoglobulinas de ratón. Si el AcMo prim ario se ha
unido al Ag, el AcMo puente se unirá al primario. De no ser así, el Ac puente se
eliminará con el lavado.
3. Se añade el complejo FAAFA, formado p o r inmunoglobulinas de ratón unidas
a fosfatasa alcalina. Si el AcMo puente se ha unido a la m uestra (a través de
la unión AcMo prim ario-Ag), la fracción de unión antígena libre perm itirá el
enlace del com plejo FAAFA. El com plejo FAAFA no u n id o se elim ina con
el lavado.
4. Se añade un sustrato que reacciona con la fosfatasa alcalina. Si el complejo FAAFA
se ha unido a la m uestra (a través de la unión AcMo puente-AcMo prim ario-
Ag), la fosfatasa alcalina presente en el complejo hará que el sustrato forme un
precipitado de color rojo en el lugar donde está localizado el antígeno.
M aterial y preparación de reactivos

Fijadores
• Acetona pura.
• Tampón formol acetona (BFA).
• Se disuelven 20 mg de Na2H P 0 2 (Merck 6586R) y 100 mg de KH 2P 0 4 (Merck
4873R) en 30 m i de agua destilada.
• Se añaden 45 mi de acetona y 25 mi de formaldehído al 37% (Merck).
• Se mezclan bien antes de utilizarlo. La solución tiene un pH final de aproximada
mente 6 ,6 . Es conveniente prepararlo poco tiempo antes de su utilización.
• A cetona-form ol. A 15,6 mi de fo rm ald eh íd o al 37% se añade acetona hasta
250 mi.
Soluciones amortiguadoras
• Tris tam pón salino (TBS, 0,05 M; pH = 7,6).
• Se disuelven 60,57 g de Tris-(hidroximetil)-aminometano (Merck 8382r) en 500 mi
de agua destilada.
• Se ajusta el pH a 7,6 con aproximadamente 385 mi de HC11N. Se añade agua
destilada hasta llegar a 1 1 de solución madre.
• La solución madre se diluye 1:10 con una solución que contiene 9 g de NaCl por
litro de agua destilada.
• Es estable a 4 °C durante varias semanas.
• Tris tam pón (0,1 M; pH = 8,2).
• Se disuelven 1,21 g de Tris-(hidroximetil)-aminometano en 80 mi de agua des
tilada. Se ajusta el pH a 8,2 con aproximadamente 4,8 mi de HC11N. Se añade
agua destilada hasta llegar a 100 mi de solución. Es estable a 4°C durante varias
semanas.
Sustrato cromógeno
• Se disuelven en un vaso de precipitado de cristal 2 mg de naftol-AS-MX-fosfato libre
de ácido en 0,2 mi de AT,N-dimetilformamida. Se añaden 9,8 mi de tampón Tris 0,1 M,
pH = 8,2.
• Se disuelven 2,4 mg de levamisol y 10 mg de Fast Red TR Salt en el tampón naftol-Tris
inmediatamente antes de usarlo.
La solución se filtra antes de aplicarla sobre los portas.
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Antisueros
• Anticuerpo monoclonal de ratón específico.
• Anticuerpo de conejo antiinmunoglobulina de ratón.
• Complejo inmune fosfatasa alcalina: antifosfatasa alcalina (FAAFA).
Otros reactivos
• Hematoxilina de Harris o de Mayer.
• Glicergel® (Dakopatts) o Cristalmount® (Biomeda).
• Suero humano normal.
• Sigmacote® (Sigma) o Pap Pen® (The Binding Site).
• Micropipetas automáticas ajustables.
M étodo
Preparación de la muestra
1. Sangre periférica y aspirados de médula ósea. Se efectuarán extensiones en por
taobjetos de sangre recogida sobre heparina o EDTA o bien sin anticoagulante
(punción digital o médula ósea), realizadas de la manera habitual y evitando que
sean excesivamente gruesas.
2. Separación de células mononucleadas. Es muy práctica, ya que en un área pequeña
es posible valorar un gran número de células. Es particularmente útil cuando se
estudia la presencia de inmunoglobulinas de superficie celular, ya que se evita la
unión del AcMo con las inmunoglobulinas séricas.
3. Citocentrífuga de líquido cefalorraquídeo y otros líquidos del organismo. Se em
plean 100 (jlI de la muestra para cada preparación. Se colocan en una citocentrífuga
a 500 r.p.m. durante 5-10 min.
Nota:
• Con el fin de dism inuir el núm ero de portaobjetos, es conveniente efectuar dos
pequeñas extensiones en cada uno de ellos.
• Se dejan secar durante 4-18 h los portaobjetos con la m uestra antes utilizarlas o de
envolverlas en papel de aluminio para conservarlas a —20 °C hasta su estudio. La
conservación a 20 °C mantiene los antígenos durante períodos prolongados de tiempo.
• Se dejan temperar las preparaciones a temperatura ambiente antes de desenvolver el
papel de aluminio para evitar la degradación de la muestra.
• Antes de fijarlas, se marca un círculo con un lápiz diamante alrededor de la zona que
se va a estudiar. La parte central de la extensión es la idónea para realizar el estudio.
Fijación
• Acetona pu ra (10 m in), BFA (30 s) o form ol acetona (45 s). Las tres soluciones
fijadoras se aplican a temperatura ambiente.
• Tras la fijación se lavan las preparaciones dos veces con TBS, 0,05 M (5 m in).
A continuación, se seca con un papel suave la zona exterior al círculo donde se aplicará
el AcMo y se impregna el perímetro con un repelente al agua (Sigmacote® o Pap Pen®)
para evitar que los antisueros se desplacen y se mezclen una vez colocados.
Nota: La acetona es un buen fijador para la práctica diaria. No hace falta prepararla
y preserva óptimamente los antígenos celulares. El BFA y el formol-acetona permiten
visualizar mejor los detalles morfológicos y se obtienen unas preparaciones de excelente
calidad, aunque en ocasiones estos fijadores deterioran la antigenicidad de las moléculas.
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Antisueros
• Anticuerpo monoclonal. Es conveniente aplicarlo cuando la preparación aún está
húmeda. El período de incubación es de 30 min a temperatura ambiente. También
puede efectuarse a 37 °C durante 10 min o a 4 °C durante 12 h, pero los resultados
no son mejores que los obtenidos a temperatura ambiente.
• Inmunoglobulina de conejo antirratón a la dilución óptima. Se añade, a la misma dilu
ción, suero humano normal para evitar la reactividad cruzada de las inmunoglobulinas
de conejo con la inmunoglobulina humana. El tiempo de incubación es de 30 min.
• Complejo FAAFA a la dilución óptima. El tiempo de incubación es de 45 min.
Nota:
• Todas las incubaciones deben efectuarse a temperatura ambiente y en cámara húmeda
para evitar la concentración de los antisueros. Después de cada incubación se efectúa un
breve lavado con TBS, 0,05 M, utilizando para ello una botella de lavado, con cuidado
de no aplicar directamente el chorro sobre el círculo. Las diluciones de los antisueros
también se hacen en TBS, 0,05 M. Una vez comenzadas las incubaciones, hay que tener
especial atención en no dejar que las preparaciones se sequen en ningún momento.
• La intensidad final de la tinción puede aumentarse si se repiten nuevamente los pasos
b y c (en este caso las incubaciones repetidas son de 1 0 min), aunque ello no suele
ser necesario y, además, alarga el proceso y encarece la técnica.
• Recientemente, se han introducido sistemas de FAAFA o PAP que reconocen de
forma simultánea anticuerpos primarios de ratón y conejo, y que utilizan el sistema
biotina-avidina o biotina-estreptavidina, que permiten aumentar la sensibilidad de
la técnica y reducirla en un paso si se emplean AcMo ligados a biotina.
• Existen sistemas automáticos para la realización de la técnica de FAAFA para los
laboratorios con u n gran número de muestras diarias.
• Con la combinación de AcMo primarios de diferente especie o tipo de inmunoglo
bulina, de anticuerpos secundarios que reconozcan cada uno de ellos revelados por
sustancias cromógenas de color diferente (p. ej., FAAFA y PAP), se pueden realizar
mareajes dobles mediante esta técnica.
Sustrato cromógeno
El tiempo de incubación es de 20 min, aunque puede controlarse la intensidad de tinción
por microscopía óptica. Una vez finalizado este período, se lavan las preparaciones en
un baño de agua durante 2 min.
Nota: La preparación adecuada del sustrato es importante. Los reactivos deben guardar
se a la temperatura indicada por la casa comercial, en un ambiente poco húmedo, y deben
pesarse con exactitud y mezclarse correctamente. El pH del tampón ha de ser de 8,2. Una
vez añadido y mezclado el Fast Red, hay que filtrar el sustrato y utilizarlo inmediatamente.
Contratinción y montaje
1. Hematoxilina de Mayer o de Harris. El tiempo de contratinción varía según las
características de la hematoxilina; por ello es conveniente comprobar el tiempo
necesario para obtener tinciones óptimas.
2. Se lava en un baño de agua (2 min) y, a continuación, con agua destilada.
3. Las preparaciones, aún húm edas, se m ontan con medios de montaje acuosos
(Cristalmount®) o gelatina glicerinada (Glicergel®).
4. Se observa al microscopio óptico.
En el cuadro 10-7 se muestra la técnica esquematizada.
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CUADRO 10-7. Técnica de inmunofosfatasa alcalina (FAAFA)

1. Se fija la muestra en acetona (10 min), BFA (30 s) o formol-acetona (45 s)
2. Se lava dos veces en TBS (2 min)
3. AcMo de ratón (30 min)
4. Se lava con TBS
5. LBSA (30 min)
6. Se lava con TBS
7. LBSA (30 min)
8. Se lava con TBS
9. Sustrato cromógeno (20 min)
10. Se lava con agua (2 min)
11. Contratinción con hematoxilina
12. Se lava con aguda (2 min) seguido de agua destilada
13. Montaje

Las células positivas aparecen rodeadas p o r un anillo de color rojo brillante. La in
tensidad de la tinción depende del antígeno que se estudia y del AcMo empleado. La
intensidad varía en una misma preparación de unas células a otras y según la zona que
se observe (disminuye a medida que se va de la parte gruesa a la fina). El precipitado
rojo es estable durante períodos prolongados.
Para una interpretación correcta es conveniente examinar especímenes control en los
que el AcMo es sustituido por ascitis normal de ratón (control negativo). En este caso,
las células deben ser todas negativas, aunque las que tienen fosfatasa alcalina endógena
(p. ej., neutrófilos segmentados) pueden m ostrar una débil tinción citoplasmática.
Para los antígenos que se expresan en muestras normales de sangre o médula, estas se
pueden emplear como control positivo, asegurando así que la técnica se ha realizado
correctamente.
En la figura 10-9 se muestra un espécimen hematológico marcado con la técnica de
inmunofosfatasa alcalina.
FIGURA 10-9. Células TdT

positivas teñidas mediante la técnica
de la inmunoperoxidasa (X 1.0 0 0 ).
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www.medilibros.com
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 10 Métodos inmunológicos en hematopatología 2 8 7 .e l
Autoevaluación
1. Para la realización de la citometría de flujo:
(a) Es imprescindible realizar una separación de células mononucleadas.
(b) La técnica sin permeabilización detecta de forma simultánea antígenos de membrana,
citoplasma y núcleo.
(c) Solo se puede utilizar para el estudio de sangre periférica.
(d) Se necesita una muestra con células en suspensión.
(e) No es necesario que las células sean viables.
Respuesta razonada: para el análisis por citometría de flujo se requiere una suspensión celular que
puede obtenerse de forma directa (sangre, médula, líquidos biológicos) o por disgregación de tejidos.
No es necesario realizar una separación de células mononucleares, ya que: a) se pueden analizar otros
elementos celulares además de los linfocitos y monocitos, y b) existen técnicas para el análisis de sangre
total o posterior a la lisis de los eritrocitos. Las células han de ser viables, ya que la pérdida de la inte
gridad de membrana produce alteraciones en el mareaje y puede producir falsos positivos y negativos.
Por ello se deduce que la técnica sin permeabilización solo analiza antígenos de membrana. El análisis
de antígenos nucleares y citoplasmáticos requiere el uso de permeabilización y fijación celular.
2. Las técnicas inmunológicas con base citológica:
(a) No tienen ningún sentido en la era de la citometría de flujo.
(b) Son muy útiles cuando la anomalía es de localización subcelular.
(c) Solo analizan la membrana celular.
(d) No emplean sustancias fluorescentes.
(e) No permiten el soporte morfológico.
Respuesta razonada: es una técnica complementaria a la citometría de flujo y su principal caracte
rística es el soporte morfológico, simultáneo al fenotípico, que permite identificar la localización
subcelular del antígeno. Se puede realizar con técnicas inmunofluorescentes o inmunoenzimáticas.
El paso de fijación inicial de la técnica hace que se detecten antígenos de membrana e intracelulares.
3. El método diagnóstico de elección en la hemoglobinuria paroxística nocturna:
(a) Se basa en la sensibilidad al complemento de los eritrocitos.
(b) La prueba diagnóstica por excelencia es la de HAM.
(c) Es la citometría de flujo de determinantes antigénicos unidos a la membrana celular por
grupos glucosilfosfatidilinositol.
(d) La citometría de flujo no permite la cuantificación del tamaño de la clona.
(e) No se puede realizar en pacientes que han recibido transfusión de concentrados de hematíes.
Respuesta razonada: la citometría de flujo es la técnica de elección, ya que determina los antígenos
que regulan el complemento y otros antígenos celulares presentes en leucocitos y hematíes. Es
una técnica cuantitativa que permite calcular el tamaño del clon patológico y, como se puede
determinar en leucocitos, no se ve interferida por la transfusión de concentrados de hematíes. La
citometría de flujo ha sustituido a otras técnicas al demostrar mayor sensibilidad al complemento
de los hematíes de estos pacientes.
4. Respecto al uso de fluorocromos para citometría de flujo:
(a) La elección debe basarse en el tipo de aparato del que se disponga, la intensidad de
expresión en la célula y el tipo de estudio que se quiera realizar.
(b) La interferencia en los espectros de emisión no plantea ningún problema.
(c) Todos los fluorocromos producen una señal equivalente.
(d) No es necesario tener en cuenta la fuente de excitación del aparato.
(e) No necesitan una manejo especial, ya que son muy resistentes a la degradación lumínica.
Respuesta razonada: los fluorocromos tienen unas características de excitación y emisión es
pecíficas, por lo que solo se pueden emplear si son compatibles con el citómetro en el que se
quiere analizar. La superposición en el espectro de emisión de los fluorocromos se debe tener en
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cuenta, ya que hay combinaciones de fluorocromos que no se pueden utilizar en un citómetro

determinado. Finalmente, la resolución cuántica es diferente para cada fluorocromo, por lo
que para un mismo antígeno la intensidad de señal obtenida puede presentar diferencias según
el fluorocromo empleado. Los fluorocromos son sensibles a la luz y ciertos compuestos, es
pecialmente los tándems, son sensibles a los cambios de temperatura.
5. El estudio inmunofenotípico:
(a) No se realiza de forma rutinaria en el estudio de las leucemias agudas.
(b) No se realiza de forma rutinaria en el estudio de los síndromes linfoproliferativos.
(c) No se realiza de forma rutinaria en el estudio de la hemoglobinuria nocturna.
(d) No permite cuantificar las células CD34+.
Respuesta razonada: la citometría de flujo se aplica al estudio de la mayoría de los procesos
hematológicos malignos y de forma casi imprescindible en leucemias agudas, síndromes linfopro
liferativos crónicos y hemoglobinuria paroxística nocturna. Además, tiene muchas aplicaciones de
soporte en el manejo de los pacientes, como el recuento de los linfocitos CD4+ o la cuantificación
de las células precursoras CD34+ para la realización de autotrasplantes.
6 . El estudio inmunofenotípico para el diagnóstico de procesos hematológicos malignos:
(a) Es muy fácil, ya que un solo anticuerpo permite el diagnóstico.
(b) Requiere el uso de un panel de anticuerpos para el diagnóstico.
(c) Se puede realizar en muestras sin infiltración tumoral.
(d) Solo es útil en algunas patologías.
(e) Si se analiza el fenotipo de la membrana celular no es necesario el estudio de antígenos
intracelulares.
Respuesta razonada: el estudio inmunofenotípico constituye una herramienta fundamental
en el proceso diagnóstico de la mayoría de los procesos hematológicos malignos, junto con la
integración de datos clínicos, morfológicos, citogenéticos y moleculares. En células neoplásicas
puede ser necesario el análisis de antígenos intracelulares.
7. Respecto al análisis de enfermedad residual:
(a) No se puede realizar por citometría de flujo.
(b) Dado el estudio multiparamétrico que realizan los citómetros de flujo, se detecta con la
adquisición de pocas células de la muestra.
(c) Para conseguir sensibilidad suficiente se deben analizar unos centenares de miles de células.
(d) Se puede aplicar a todo tipo de patología.
(e) Se realiza con el uso de uno o dos anticuerpos específicos.
Respuesta razonada: la citometría de flujo junto con la biología molecular son las técnicas más
sensibles y utilizadas para la cuantificación de enfermedad residual. No existen anticuerpos es
pecíficos con sensibilidad suficiente para detectar las células malignas. El estudio multiparamé
trico es imprescindible para diferenciar la célula normal de la patológica, pero si se quiere obtener
una sensibilidad de detección de alrededor del 0 ,0 1 % se deben analizar cientos de miles de células.
Es imprescindible que la célula leucémica tenga un fenotipo claramente diferente con la combi
nación de anticuerpos que se utilicen, y esto no es posible en todas las situaciones patológicas.
8 . La citometría de flujo:
(a) Con análisis multiparamétrico es mucho más potente que con análisis monoparamétrico.
(b) Nos permite identificar las subpoblaciones celulares de una muestra heterogénea.
(c) Solo sirve para el análisis de leucocitos.
(d) Todas las anteriores.
(e) Son correctas a y b.
Respuesta razonada: la citometría de flujo permite analizar partículas en suspensión de di
versos tamaños, lo que en hematología permite el análisis desde plaquetas hasta leucocitos.
La correlación de parámetros ofrece una mayor discriminación de poblaciones que el análisis
monoparamétrico, ya que hay más características celulares que se valoran para la identificación.
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C A P Í T U L O 11
Métodos citogenéticos en hematopatología

V. Ademá*, M. Mallo*, A. Puiggros*, M. Salido, B. Espinet y F. Solé
NOMENCLATURA CITOGENÉTICA
Introducción
El estudio de las características de los cromosomas es el objetivo de la citogenética huma
na. Durante la división celular o mitosis, la cromatina (ADN + proteínas) se compacta
hasta form ar elementos independientes llamados cromosomas. Estos llegan al grado
máximo de compactación durante la metafase y, por lo tanto, el estudio citogenético se
realiza sobre los cromosomas en este momento.
Un cromosoma en metafase (fig. 11-1) consta de los siguientes elementos:
• Dos cromátidas hermanas, cada una de las cuales contiene un dúplex de ADN.
• Un centrómero, también llamado constricción primaria, que divide el cromosoma en
dos brazos, el brazo corto o «p» y el brazo largo o «q». Los centrómeros son necesarios
para la migración de las cromátidas hermanas hacia cada polo opuesto durante la
división celular. Según la posición que ocupa el centrómero en el cromosoma, los
cromosomas se clasifican en (fig. 1 1 - 2 ):
• Cromosomas metacéntricos: el centróm ero separa dos brazos de igual tamaño.
• Cromosomas submetacéntricos: el centróm ero separa dos brazos de diferente
tamaño; el brazo «p» es siempre más pequeño que el «q».
• Cromosomas acrocéntricos: el centrómero se encuentra en un extremo, p or lo
que queda un brazo «p» muy corto, a veces casi irreconocible.
• Los telómeros, o extremos del cromosoma, que garantizan la independencia e inte
gridad de cada cromosoma.
• Heterocromatina, o material genético que constituye zonas del cromosoma que
durante la interfase se mantienen condensadas. Se diferencian la heterocromatina
facultativa, que contiene genes temporalmente inactivos, y la heterocromatina cons
titutiva, que forma parte de los centrómeros y de las regiones polimórficas (variables
según los individuos).
• Eucromatina, material que constituye el resto del cromosoma no condensado en
interfase, donde se localizan los genes.
• Satélites, o formaciones redondeadas y conectadas a las cromátidas por una cons
tricción secundaria. Pueden hallarse en los cromosomas 13,14,15,21 y 22.
El estudio citogenético revela inform ación sobre la constitución genética de una
persona, porque cada cromosoma presenta un tamaño y una morfología constantes. La
morfología de cada cromosoma se puede diferenciar a partir de los siguientes paráme
tros: el tamaño, la posición del centrómero y la tinción de bandas. El patrón de bandas
obtenido después de una tinción específica perm ite la identificación precisa de cada
crom osom a y de las regiones particulares dentro de los brazos del mismo. El locus
• C ontribución equitativa.

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Capítulo 11 Métodos citogenétícos en hematopatología 289
Centrómero
Crom átide Cromátide

herm ana 1 hermana 2 FIGURA 11-1. Estructura de un
cromosoma en metafase.
FIGURA 11-2. Ejemplo de cromosomas metacéntrico (cromosoma 1), submetacéntrico (cromosoma 9)

y acrocéntrico (cromosoma 14).
cromosómico se define enum erando el núm ero de par cromosómico, brazo (p o q),
número de banda y sub-banda, por ejemplo: lq31 (fig. 11-3).
Existen diferentes tipos de bandas, cada una de las cuales proporciona un patrón
diferente. El más usado es el patrón de bandas G.
Cariotipo
El cariotipo hum ano está formado por 23 pares de cromosomas: los autosomas, del 1
al 22 en orden decreciente de longitud, y los cromosomas sexuales llamados X e Y. El
conjunto de cromosomas se clasifica en siete grupos en función de su tam año y de la
posición que ocupa el centrómero:
1. Grupo A: cromosomas 1 y 3 (metacéntricos) y 2 (submetacéntrico).
2. Grupo B: cromosomas 4 y 5 (submetacéntricos, más pequeños que el 2).
3. Grupo C: cromosomas 6-12 y X (submetacéntricos de tamaño medio).
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M * X tí 7!
K*6 tt X tí Ii K 1t
7 8 9 10 11 12
K IC K
13 14 15
X H Vi
16 17 18
H II « ti l ‘
FIGURA 11-3. Grupos
cromosómicos en función del tamaño
y la posición que ocupa el centrómero.
4. Grupo D: cromosomas 13-15 (acrocéntricos).

5. Grupo E: cromosoma 16 (metacéntrico), 17 y 18 (submetacéntricos pequeños).
6 . Grupo F: cromosomas 19-20 (metacéntricos m uy pequeños).
7. Grupo G: cromosomas 21,22 y cromosoma Y (acrocéntricos muy pequeños).
La nomenclatura utilizada para describir un cariotipo normal o patológico se ha es
tandarizado en una nomenclatura aceptada internacionalmente, gracias al International
System for H um an Cytogenetics Nomenclature (ISCN).
Fórm ula crom osóm ica

Para escribir la fórmula cromosómica de un cariotipo se realizarán los siguientes pasos:
1. Se indica el número de cromosomas, seguido de una coma.
2. Se indican los cromosomas sexuales (XX en la mujer y XY en el hombre), seguidos
de una coma en aquellos casos que se haya encontrado una alteración.
3. Se indican los cromosomas implicados en las alteraciones por orden ascendente.
En caso de estar implicado un cromosoma sexual, este se señala primero. Si un
mismo crom osom a está implicado en alteraciones numéricas y estructurales,
primero se indica la alteración numérica. Si un mismo cromosoma está implicado
en diferentes alteraciones estructurales, se señala prim ero la alteración cuya
primera letra de la abreviatura esté alfabéticamente primero. Cada alteración se
separa de la siguiente por una coma y sin espacios. Las abreviaturas más utilizadas
se describen en el cuadro 1 1 - 1 .
4. Se indica el número de metafases analizadas entre corchetes cuadrados.
5. Si existen dos clones, se separan por una barra espaciadora y se indica el número
de metafases analizadas en cada caso.
Ejemplos:
46,XX[20]
46,XY[15]
47,XX,+8,t(8; 14) (q24;q32) [20]
46,XY,del(8) (p 11) ,t( 8 ; 14) (q24;q32) [16] /46,XY [4]
Alteraciones constitucionales
Si un individuo presenta una alteración cromosómica constitucional detectada en el
estudio del cariotipo de células tumorales, esta se debe indicar con la letra «c».
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CUADRO 11-1. Abreviaturas más utilizadas en los estudios citogenéticos

+: ganancia de un cromosoma (trisomía) o de parte de este
pérdida de un cromosoma (monosomía) o de parte de este
add: material adicional de origen desconocido
ace: fragmento acéntrico
c: constitucional
cen: centrómero
chr: cromosoma
del: deleción de una banda cromosómica o segmento
der: derivativo
die: dicéntrico
dir: directo
dmin: doble diminuto (pequeño fragmento extracromosómico acéntrico)
dup: duplicación
fra: lugar frágil
g:gap
h: heterocromatina
hsr: región de tinción homogénea
i, iso: isocromosoma con dos brazos cortos o largos del mismo cromosoma
ider: isoderivativo
idic: isodicéntrico
ins: inserción
inv: inversión
mar: cromosoma marcador (cromosoma que no se puede identificar)
min: fragmento
mos: mosaico
p: brazo corto del cromosoma
q: brazo largo del cromosoma
r: cromosoma en anillo
rep: recíproca
s: satélite
see: intercambio de cromátidas hermanas
t: translocación (intercambio de material entre dos o más cromosomas)
tan: tándem
tas: asociación de telómeros
ter: terminal
tr: trirradial
Ejemplo:
48,XX,+8,+21c: el individuo presenta la alteración constitucional +21, y el clon
presenta la ganancia del cromosoma 8 .
Alteraciones en las que están implicados dos o más cromosomas

En aquellas alteraciones en las que estén implicados dos o más cromosomas, primero
se indica el cromosoma de núm ero más bajo o, en caso de estar implicado un cromo
soma sexual, este se señala prim ero y, después, el segundo cromosoma, separados por
punto y coma y entre paréntesis. Posteriorm ente, se indican los puntos de rotura de
cada uno de los cromosomas, entre paréntesis y también separados por punto y coma.
En el caso de translocaciones complejas, con más de dos cromosomas implicados,
prim ero se señala el crom osom a de núm ero más bajo o el crom osom a sexual. El
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cromosoma que se indica a continuación es el que recibe un segmento del prim er cro
mosoma, y al final se añade el crom osom a que da el material al prim er cromosoma.
Ejemplos:
46,XX,t( 1;2) (p 11 ;q21)
46,XY,t(X;l)(q27;q22)
46,XY,t(2;9;22)(p23ql2;q34;qll)
Cromosoma derivativo (der)

Cromosoma que resulta de una translocación en la que no existe u n intercambio recí
proco de material.
Ejemplo:
46,XY,der(14)t(l 1;14) (ql3;q32): se observan dos cromosomas 11 normales, un cromoso
ma 14 normal y un cromosoma 14 con material adicional procedente del cromosoma 1 1 .
Inversiones (inv)
Se indican los puntos de rotura implicados, pero sin separar por punto y coma. En caso
de estar implicados los dos brazos del cromosoma, prim ero se indican los puntos de
rotura del brazo corto.
Ejemplo:
46,XY,inv( 16) (p 13q22)
Material adicional (add)

Esta abreviatura se utiliza cuando no se conoce el origen del material adicional. Se debe
indicar el cromosoma que ha recibido dicho material y la banda cromosómica afectada.
Ejemplo:
46,XY,add(14)(q32): todos los cromosomas son normales, excepto un cromosoma
14 que presenta material adicional en la banda q32 y no podemos distinguir de qué
cromosoma proviene.
Cromosomas en anillo (r de ring) y cromosomas marcadores (mar)

Estos se indican al final de la fórmula: primero, los cromosomas en anillo, seguido de
los cromosomas marcadores. En los cromosomas en anillo, si se puede identificar el
cromosoma a partir del que se originan, este se indica entre paréntesis.
Ejemplo:
48,XX,+r(7),+mar
Clon
Al final de la fórmula se deben indicar el núm ero de metafases analizadas entre cor
chetes ([]), y el número de metafases que corresponden a cada clon. En caso de existir
una evolución clonal, se indican los clones por orden de m enor a mayor complejidad,
separados por u na barra (/). En caso de existir clones no relacionados, se señalan de
acuerdo al tam año de los clones, el de mayor tamaño primero y, en caso de existir un
clon normal, este se indica el último.
Ejemplo:
46,XX,t(8;21)(q22;q22)[3]/45,X,-X,t(8;21)(q22;q22)[8]
46,XX,inv(2) (p l lq l2 ) [10]/45,XX,-7 [7] / 46,XX [15]
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UTILIDAD DE LA CITOGENÉTICA EN EL ESTUDIO

DE LAS HEMOPATÍAS MALIGNAS
Los análisis citogenéticos, que incluyen tanto el análisis mediante citogenética convencional
como mediante técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH), han ido adquiriendo
mayor importancia en el estudio de las hemopatías malignas. El estudio del cariotipo
actualmente es esencial para el manejo clínico de los pacientes con estas neoplasias, tanto
en el momento del diagnóstico como en la progresión y seguimiento de la enfermedad, y
ha permitido identificar subgrupos clínicos asociados a cambios cromosómicos específicos.
Es importante subrayar que la interpretación de los resultados citogenéticos se debe
realizar teniendo en cuenta tanto la historia clínica del paciente como los hallazgos de
laboratorio. Por ello es necesaria una estrecha colaboración entre los citogenetistas,
hematólogos y oncólogos, la cual permitirá interpretar el significado y el valor del cambio
cromosómico hallado en un paciente determinado.
Asimismo, es importante tener en cuenta el tipo de material que debe utilizarse para
la realización de un estudio citogenético, que necesariamente corresponderá a las células
implicadas en la enfermedad. Así, en el caso de las leucemias, síndromes mielodisplásicos,
mieloma múltiple y neoplasias mieloproliferativas, la valoración se debe realizar en
la médula ósea. En los linfomas, hay que analizar los ganglios linfáticos o los tejidos
también implicados; en la leucemia linfática crónica y en algunas otras enfermedades, el
estudio del cariotipo puede efectuarse en sangre periférica al hallarse en ella una gran pro
porción de células leucémicas. No obstante, a pesar de la invasión periférica, tanto para
la leucemia mieloide crónica como para síndromes mielodisplásicos y leucemias agudas
se requiere el estudio de médula ósea para obtener la debida información citogenética.
En aquellos casos en los que debe descartarse que la alteración cromosómica hallada en
la médula ósea sea constitucional, se requerirá asimismo un estudio de sangre periférica
estimulada con fitohemaglutinina (PHA), estimulante específico de los linfocitos T, no
implicados en este tipo de hemopatías.
Por lo demás, los resultados citogenéticos, además de ser im portantes para la precisa
caracterización de las leucemias, también aportan información de valor pronóstico. Así,
por ejemplo, existen alteraciones que implican un pronóstico favorable: t( 8 ;2 1 )(q 2 2 ;q2 2 )
en la leucemia mieloide aguda (LMA) o la inv(16)(pl3q22) en la LMA con eosinofilia
medular, mientras que la monosomía del cromosoma 7 (-7) o la detección de cariotipos
complejos (con más de tres alteraciones cromosómicas distintas) se relacionan con un
pronóstico desfavorable. En estos casos concretos y en otros varios, son los cambios
cromosómicos los que por sí solos tienen valor pronóstico.
En el cuadro 11-1 se indican algunas de las abreviaturas más utilizadas en la des
cripción de un resultado citogenético con el fin de facilitar el entendimiento de varias
fórmulas cromosómicas.
Por otro lado, la caracterización y el mapeo de los genes localizados en los puntos de
rotura implicados en alteraciones cromosómicas están permitiendo conocer el mecanis
mo por el cual se origina una neoplasia.
Los avances en el campo de la genética molecular constituyen un complemento importan
te para los citogenetistas, ya que enriquecen la información que aporta el estudio citogenético.
Valor pronóstico de los hallazgos citogenéticos

A continuación, se detallan los cambios cromosómicos que tienen un valor pronóstico,
por orden de importancia:
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• Cambio cromosómico primario: se acepta que es el que está relacionado con el proceso
de transformación maligna y estrechamente asociado a mecanismos moleculares, los
cuales serían los responsables de la neoplasia.
• Cambio cromosómico secundario: cuando ocurren cambios de este tipo, la enfermedad
sigue un curso más agresivo, y se hace más resistente a la terapia por lo que es más
difícil obtener una remisión completa o de larga duración.
• Cuando existen alteraciones secundarias, el valor pronóstico parece estar relacionado
con el número de anomalías.
• Presencia o ausencia de células citogenéticamente normales en la médula ósea: los
pacientes que solo presentan células con un cariotipo anormal (AA) tienen u n peor
pronóstico que los que tienen células normales (AN o NN).
• Presencia de dobles diminutos (double minutes, DMS) o de regiones de tinción uniforme
(homogeneously staining regions, HSR): la presencia en las células leucémicas de
DMS y de HSR se asocia a un mal pronóstico, ya que están relacionados con una
amplificación génica, y esta confiere una mayor resistencia a la terapia.
• Cambios cromosómicos numéricos (sin anomalías estructurales): algunas leucemias
(particularmente la leucemia linfoblástica aguda) están relacionadas con una altera
ción cromosómica numérica. Cuando estas anomalías representan el único cambio
cromosómico, probablemente tienen el mismo valor pronóstico que los cambios
primarios, tales como translocaciones, deleciones, inserciones o inversiones.
Alteraciones citogenéticas en diversas hem opatías m alignas

En este apartado se establecerá una relación resumida de las principales alteraciones
citogenéticas observadas en distintas neoplasias hematológicas (tabla 1 1 - 1 ).
Neoplasias mieloproliferativas
Leucemia mieloide crónica
La leucemia mieloide crónica (LMC) es el clásico ejemplo del valor diagnóstico y pronós
tico de la citogenética en las hemopatías. La presencia del cromosoma Filadelfia (Ph),
TABLA 11-1. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en las hemopatías malignas
Tipos Subtipos Alteraciones

Síndromes mielodisplásicos 5q-, 7q-, trisomía 8
Leucemia mieloide crónica t(9;22) (q34;ql 1.2)
Leucemia mieloide aguda MI t(9;22)(q34;ql 1.2), inv(3)(q21q26)
M2 t(8;21) (q22;q22), t(6;9) (p22;q34)
M3 t(15;17)(q22;q21)
M4 inv(16)(pl3q22)
M5 t(9; 11) (p22;q23), t(8; 16) (p 11;p 13)
M6 trisomía 8 ,5q-, 7q-, cariotipo complejo
M7 trisomía 21, inv(3)(q21q26)
Leucemia aguda linfoblástica L1 t(9;22) (q34;ql 1.2), t (1; 19) (q21-ql 3;p 13)
t( 12;21) (p 13;q22)
L2 reord. MLL, t(4; 11) (q21;q23), 6q-
L3 t(8; 14) (q24;q32), t(8;22) (q24;ql 1 o 12)
t(2;8)(pl2;q24)
Leucemia linfática crónica del(13)(ql4),del(ll)(q22-q23), trisomía 12, del(17)(pl3)
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generalm ente resultante de la translocación entre el crom osom a 9 y el 22, t(9;22)

(q34;ql 1.2), es la principal alteración citogenética observada en esta entidad (alrededor
del 95% de los pacientes), hasta el punto de que la demostración de su existencia cons
tituye una exigencia en su diagnóstico (cuadro 1 1 - 2 ).
Los avances en genética molecular han demostrado que algunos casos que clínicamen
te parecían LMC, pero que mediante el estudio citogenético no revelaban el cromosoma
Ph, en realidad presentaban el gen BCR del cromosoma 22 reorganizado, es decir, el
cambio genético es tan pequeño que no es perceptible con estudios citogenétícos y sí
mediante estudios moleculares. Por ello, en aquellos casos con sospecha de una LMC y
estudio citogenético Ph negativo, deben realizarse técnicas de genética molecular (hi
bridación in situ o reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) y comprobar si existe el
reordenamiento del gen BCR del cromosoma 22.
M ediante estudios m oleculares se ha d em o strad o que el p ro to o n cogén ABL
localizado en el crom osom a 9, en la banda 9q34.1, se transloca al crom osom a 22,
en la b anda 2 2 q ll.2 , siempre en una área llamada breakpoint cluster region (BCR),
de aproxim adam ente 5 kilobases (kb). La yuxtaposición entre el gen BCR y el on-
cogén c-ABL dirige la producción de u n ARNm anómalo, de alrededor de 8,5 kb (el
ARNm norm al del protooncogén ABL es de 6-7 kb), que da origen a una proteína
anóm ala tam bién con actividad tirosina cinasa com o la proteína norm al, con un
peso m olecular de 210 kDa (el peso m olecular de la proteína norm al es de 150 kDa).
Parece ser que la producción de esta proteína anorm al es un paso prim ario para que
se inicie la LMC.
Por otro lado, la detección de otras alteraciones, además del cromosoma Ph, puede
darse durante la fase crónica de la enfermedad (10-15% de los casos), pero es más fre
cuente durante la fase blástica (FB) (80% de los casos). En efecto, cuando se desarrolla la
FB, en general se observan otras alteraciones cromosómicas además del cromosoma Ph,
que incluso se presentan sin la manifestación clínica de la misma. Los cambios añadidos
guardan una estrecha relación con el tipo de FB que se desarrolla.
CUADRO 11-2. Alteraciones cromosómicas de la leucemia mieloide crónica
Ph, t(9;22)(q34;qll.2)
Fase blástica (FB)
Transformación mieloide (80% de los casos)
• Transformación promielocítica: t(15;17) o i(17)(ql0)
• Transformación megacarioblástica:
• Alteraciones en 3q21 o 3q26
• Cromosoma extra Ph
• Trisomía 8
• Transformación eritroblástica:
• Hiperdiploidía (>50 cromosomas)
• Múltiples anomalías cromosómicas
• Transformación con marcada basofilia: i(17)(ql0)
Transformación linfoide (20% de los casos)
• Evolución cromosómica en el 10-50% de los casos
• Ph variante, cromosoma extra Ph, trisomía 8 , trisomía 19
• Pérdida del cromosoma Y, i(17)(ql0)
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Respecto a la LMC Ph negativa, los estudios moleculares y citogenéticos han demos

trado que cursa con alteraciones moleculares evidentes con las técnicas de genética
molecular, por lo que su prevalencia real se ha reducido al mínimo.
Neoplasias mieloproliferativas Ph negativas

Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) Ph negativas clásicas comprenden la trom -
bocitemia esencial (TE), la policitemia vera (PV) y la mielofibrosis prim aria (MFP).
A diferencia de la LMC, estas neoplasias no presentan una alteración citogenética caracterís
tica. No obstante, se ha descrito que la presencia de mutaciones adquiridas en el gen JAK2
tiene un papel relevante en el diagnóstico de estas entidades. El estudio mutacional se
centra en la detección de la mutación JAK2 V617F (exón 14), que se detecta en un 95%
de los casos de PV y en un 50-60% de casos de TE y MFP. Por otra parte, en un 3% de las
PV se detectan mutaciones en el exón 12 del gen JAK2. Otras de las mutaciones descritas
afectan a los genes MPL, TET2, ASXL1, CBL, IDH1, IDH2 e IKZF1.
Síndromes mielodisplásicos
La frecuencia de detección de alteraciones cromosómicas en los síndromes mielodis
plásicos (SMD) varía entre un 30 y un 50%, según las series presentadas. El hecho de que
se observen alteraciones cromosómicas aporta la idea de que estos síndromes representan
verdaderas neoplasias.
Las alteraciones cromosómicas más frecuentes son: deleción del brazo largo (q)
del cromosoma 5 (5 q - o del(5q)), m onosomía 7 (-7), deleción 7q (7 q - o del(7q)) y
trisomía 8 (+ 8 ), todas ellas muy frecuentes en las leucemias agudas mieloides (LMA)
(cuadro 11-3).
La alteración citogenética 5 q - es la más frecuente. Además, es remarcable por estar
asociada, en ocasiones, con una entidad clínica muy concreta, conocida como SMD
con deleción aislada de 5q (clasificación de la Organización Mundial de la Salud [OMS]
2008). Las características que presentan estos pacientes son: anemia refractaria con o
sin otras citopenias y/o trombocitosis y la deleción 5q aparece como única alteración
citogenética. El porcentaje de blastos es inferior al 5% en médula ósea e inferior al 1%
en sangre periférica y sin presencia de bastones de Auer. El térm ino «síndrome 5q—»
se restringe para un subgrupo de casos con anemia macrocítica, recuento de plaquetas
normal o elevado, así como hipoplasia eritroide en médula ósea.
Aunque no se ha demostrado el gen responsable de la patogénesis de la del(5q), varios
autores han descrito posibles genes candidatos. El más destacado es RPS14 (codifica para
una subunidad ribosómica).
El resultado citogenético, independientemente del subgrupo, tiene un valor pronós
tico. Es por ello que en 1997 se describe por prim era vez un índice pronóstico conocido
como International Prognostic Scoring System (IPSS), actualm ente vigente para la
clasificación pronostica de los SMD.
Este índice define cuatro categorías pronósticas a partir de tres variables: porcentaje
de blastos en médula ósea, núm ero de citopenias y cariotipo. Este último se subdivide
en tres grupos pronóstico:
1. Bueno: cariotipo normal, del(5q), del(20q), -Y como única alteración.
2. Malo: cariotipo complejo con tres o más alteraciones y alteraciones del cromo
soma 7.
3. Intermedio: incluye el resto de alteraciones.
En el año 2012 se publicó una nueva categorización pronostica citogenética que
incluía cinco categorías:
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CUADRO 11-3. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en los síndromes

mielodisplásicos
Alteraciones más frecuentes

• del(5q)
• -7/del(7q)
• +8
Alteraciones menos frecuentes

• del(1 2 p)
• i(17)(ql0)/del(17p)
• del(20)(qllql3)
• -Y
• -13/del(13q)
• del(9)(ql3q22)
• idic(X)(ql3)
• t( 11;16) (q23;p 13)
• t(3;21)(q26;q22)
• t(l;3)(p36;q21)
• t(2; 11) (p21;q23)
• inv(3)(q21q26)
• t(6;9)(p22;q34)
• der(l;7)(pll;pll)
• t(3;17)(q26;q22)
• t(l I;2 1 )(q2 2 ;q2 1 )
• +21
• + lq
• +11
• +13
• -18
1. Muy bueno: alteración única de del( 1lq) o -Y.

2. Bueno: cariotipo normal, alteración única de der(l;7), del(5q), del(12p), del(20q)
y alteraciones dobles con del(5q).
3. Intermedio: alteraciones únicas de del(7q), + 8 , i(17q), +19, +21, otras alteraciones
únicas y otras alteraciones dobles.
4. Malo: alteración única de der(3)(q21q26) o -7 , cariotipo complejo con tres
alteraciones y alteraciones dobles con - 7 o del(7q).
5. Muy malo: cariotipo complejo con más de tres alteraciones.
6 . Sobre la base de la nueva categorización, se ha definido el nuevo IPSS, en el que
destaca el mayor peso pronóstico del resultado citogenético.
Leucemia mieloide aguda

La clasificación inicial de la leucemia mieloide aguda (LMA) por el grupo cooperativo
de la FAB (francoam ericano-británico) estableció ocho categorías m orfológicas
(M0-M7) (tabla 11-2), basadas en características citológicas, inmunológicas o clínicas.
Posteriorm ente, se elaboró la clasificación M IC, en la que se combina la clasificación
FAB con datos citogenétícos. Actualmente, esta clasificación ha sido sustituida por la
clasificación de la OMS, que da gran im portancia a las alteraciones citogenéticas, que
son una característica indispensable para la definición de algunas entidades. El análisis
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 11-2. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en las leucemias agudas

mieloides
Subtipos Citogenética
M0-M1 5q- o -5; 7q- o -7
Ph
Deleción 3p y translocación con el 3 en 3q21 o 3q26
+21
+8
M2 t(8;21)(q22;q22)
5q- o -5; 7q- o -7
del 3p e inv(3)(q21q26)
t(6;9)(p22;q34) asociado a basofilia en médula ósea
Ph
+8
M3 t( 15; 17) (q22;q21)
i(17)(ql0)
M4 5q- o -5; 7q- o -7
inv(16)(pl3q22), 16q- o t con 16(q22), asociado a eosinofilia en médula ósea
t(6;9)(p22;q34)
t(v;ll)(v;q23)
+8
Ph
+4
M5 t(9;ll)(p22;q23) [M5a]
t(v;ll)(v;q23) [M5a]
t(8;16)(pll;pl3), asociado a eritrofagocitosis
+8
M6 5q- o -5; 7q- o 7 -
—3 y t(3;v)(q21 o q26)
dup(l)
+8
M7 inv(3)(q21q26) o del(3)
+8
+21
citogenético en el mom ento del diagnóstico de una LMA se considera el factor pronós
tico más establecido y ampliamente utilizado en la práctica clínica, siendo capaz de
estratificar a los pacientes con LMA en riesgo citogenético favorable, intermedio y alto.
De esta forma, la clasificación de la OMS establece cinco grandes categorías, una de
ellas engloba entidades con alteraciones citogenéticas recurrentes:
Leucemia mieloide aguda con translocaciones equilibradas/inversiones
• LMA con t(8;21)(q22;q22); (RU NX1/RU NX1T1).
• LMA con inv(16)(pl3q22) o t(16;16)(pl3;q22); CBFB-MYH11.
• Leucemia aguda promielocítica con t(15;17)(q22;ql2); PML-RARA.
• LMA con t(9; 11) (p22;q23); MLLT3-MLL.
• LMA con t(6;9)(p22;q34); DEK-NUP214.
• LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1.
• LMA (megacarioblástica) con t(l;2 2 )(p l3 ;q l3 ); RBM15-MKL1.
Leucemia mieloide aguda con mutaciones genéticas

Los genes afectados son principalm ente FLT3 y NPM1 y, de form a menos com ún,
CEBPA, KIT, MLL, WW T1, NRAS, KRAS, IDH1 e IDH2.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 11 Métodos citogenéticos en hematopatología 299
Respecto a los cambios cromosómicos específicos, la translocación t(8;21)(q22;q22),

que genera la fusión de los genes RUNX1-RUNX1T1, es el cambio más frecuente en la
M2. Esta anomalía se asocia a la presencia de mieloblastos grandes en la médula ósea con
signos de maduración y con bastones de Auer en el citoplasma. Es frecuente la aparición
de alteraciones adicionales a la t(8;21) como la pérdida de un cromosoma sexual (X o
Y) o la deleción de 9q. Este subgrupo se caracteriza por tener una buena respuesta a la
terapia, largas remisiones y supervivencia relativamente larga. No obstante, formas con
mutaciones en el gen K IT o expresión de CD56 se asocian a peor pronóstico.
Las LMA con inv( 16) (p 13q22) o t( 16; 16) (p 13;q22) y reordenamiento CBFB/MYH11 se
asocian a la M4 con eosinofilia medular (M4Eo). En general, la detección de este cambio cro-
mosómico se relaciona con un buen pronóstico y buena respuesta a la terapia. La presencia de
un cariotipo complejo o monosómico no parece empeorar el pronóstico de estos pacientes.
La mayoría de las LMA promielocíticas presentan la t(15;17)(q22;ql2), aunque
se ha descrito un subgrupo de casos con translocaciones variantes implicando el gen
RARA (17q22). Este tipo de leucemia es sensible al tratamiento con ácido transretinoico
(ATRA), lo que conlleva a que actualmente sea una entidad de buen pronóstico.
La t(9;l I)(p22;q23) se ha encontrado en el 30-40% de los casos con subtipo FAB M5;
la trisomía 8 es la alteración secundaria más frecuente y sin influencia en la supervivencia.
La implicación de llq 2 3 es más frecuente en niños que en adultos. Esta translocación
también se observa en una baja frecuencia en M4, y muy excepcionalmente en M2 con
componente monocítico.
Una alteración cromosómica frecuente en el grupo de las LMA es la implicación del
cromosoma 3 en las bandas 3q21 y 3q26, que en estos casos se relacionan con un número
de plaquetas superior al normal. Es una entidad con un comportamiento agresivo y de
corta supervivencia.
Los pacientes con una LMA y cariotipo normal o aquellos con alteraciones no clasi-
ficables en los grupos pronósticos constituyen lo que se conoce como grupo de riesgo
citogenético intermedio. En este subgrupo de pacientes es de utilidad el empleo de
marcadores moleculares específicos.
Leucemia linfoblástica aguda B

En la leucemia linfoblástica aguda B (LLA-B) los estudios citogenéticos se han visto frena
dos debido a la mala calidad de los cromosomas, los cuales aparecen muy condensados y
con aspecto deshilacliado. De la misma forma que las LMA, la clasificación de las LLA-B
ha evolucionado a lo largo del tiempo. Mientras que la clasificación morfológica de la
FAB identificaba tres categorías (LI, L2 y L3), la nueva clasificación de la OMS 2008 ha
definido nuevas entidades basándose en la presencia de alteraciones citogenéticas es
pecíficas. Las alteraciones más frecuentes se muestran en el cuadro 11-4.
La t(9;22), que implica los genes BCR y ABL, se relaciona con un pronóstico muy
grave. No obstante, el tratamiento con imatinib ha aumentado la supervivencia libre de
evento en estos pacientes.
Respecto a las translocaciones que afectan llq 2 3 , la más frecuente es la t( 4 ;ll)
(q21;q23) y se asocia a un mal pronóstico. Su incidencia es especialmente alta en
niños menores de 1 año, en los cuales la incidencia llega al 50%, y se relaciona a un
pronóstico m uy desfavorable. Esta translocación tam bién se ha observado en casos
con células blásticas mieloides y en la LMA.
O tra translocación frecuente en niños, es la t( 12;21) (p 13;q22), asociada a un pronós
tico m uy favorable. Más del 90% de pacientes con dicha translocación alcanzan la
remisión completa.
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 11-4. Alteraciones cromosómicas en la leucemia linfoblástica aguda B
Alteraciones características de subtipos LLA-B según la OMS 2008

• t(9;22) (q34;ql 1.2); BCR-ABL1
• Reordenamiento del gen MLL: t(v;l lq23)
• t(l2;2l)(pl3;q22);ETV6-RUNXl
• Hiperdiploidía
• Hipodiploidía
• t(5;14)(q31;q32);IL3-IGH@
• t(l;19)(q23;pl3);TCF3-PBXJ
Otras alteraciones en LLA-B
• del(6 q)
• Otras translocaciones en 14q32
• del(9p)
• del(1 2 p)
• t(17;19)(q22;pl3)
Las alteraciones en la ploidía también han sido descritas en la LLA-B, aunque con
pronóstico diferente. Mientras que las hiperdiploidías de más de 50 cromosomas tienen
una buena respuesta a la terapia y el 95% sobrevive a los 30 meses del diagnóstico, las
hipodiploidías presentan peor respuesta al tratamiento.
La translocación t(l;1 9 )(q 2 3 ;p l3 ), m uy frecuente en la LLA, se relaciona con la
presencia de blastos de inmunofenotipo pre-B. Es frecuente en niños y en adultos que
suelen presentar un núm ero de leucocitos de 20-30 X 109/1. Aunque inicialmente se
asociaba a mal pronóstico, los nuevos esquemas terapéuticos han permitido una mejora
de la respuesta en este subgrupo de pacientes.
Síndromes linfoproliferativos crónicos

Los síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC) engloban un grupo de entidades
clínicas con una evolución y respuesta al tratamiento heterogénea, así como un pronós
tico variable. Los SLPC de estirpe B representan cerca del 90% de los mismos y el resto
son de estirpe T. La mayoría de los SLPC-B y una m inoría de los T se caracterizan por
translocaciones cromosómicas recurrentes que se encuentran implicadas en el inicio
o la progresión de los mismos, como consecuencia de la yuxtaposición del receptor
de las inm unoglobulinas o el receptor T con un protooncogén de otros segmentos
crom osóm icos, lo que da como resultado la desregulación del m ism o. El estudio
de estos procesos es fundam ental para el diagnóstico, el establecimiento de factores
pronósticos y el estudio de enfermedad m ínim a residual.
Leucemia linfática crónica
En la leucemia linfática crónica (LLC) el problema principal que existe a nivel de su
estudio citogenético es que los linfocitos B leucémicos responden poco a los mitógenos
habitualmente usados. A pesar de esto, la utilización de distintas sustancias estimulantes
de la división de estas células (PHA, mitógeno de fitolaca [PWM], lipopolisacárido de
E. coli [LPS], virus de Epstein-Barr [EBV], acetato de tetraforbol éster [TPA]...) ha permiti
do observar alteraciones cromosómicas en alrededor del 50% de los casos (cuadro 11-5).
La utilización de nuevos mitógenos como el ligando de CD40 u oligonucleótidos CpG
con interleucina 2, mejora el crecimiento de las células de la LLC en cultivo, permitiendo
una tasa de detección de anomalías cromosómicas de hasta el 80% de los casos.
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 11-5. Alteraciones cromosómicas más frecuentes en la leucemia linfática crónica
• +12
• del(13)(ql4)
• del(ll)(q22q23)
• del(6)(q21q23)
• i(17)(ql0), del(17)(pl3)
• t(2; 14) (p 13;q32)
• ty del 5pl5-pl3
• 14q+oadd(14)(q32)
• t(13;14)(q22;q32)
• t(14;17)(q32;q23)
• t(14;19)(q32;ql3)
• del(14)(q22q24)
La afectación de la región 13ql4 (en forma de deleción o translocación) representa

la alteración cromosómica más frecuente, que se detecta en el 55% de los pacientes con la
técnica de hibridación in situ fluorescente en interfase (FISH). También se detectan
deleciones en Ilq22-q23 (18%) y trisomía del cromosoma 12 (+12), que representa la
alteración citogenética más característica de la LLC-B mediante estudios citogenéticos
convencionales, aunque pasa a representar solo el 15% de los enfermos si se aplican
técnicas de FISH interfásica. Las deleciones en 6q21-23 y en 17pl3 (donde se localiza el
gen TP53) se detectan en menos del 10% de los pacientes afectos de LLC.
Los estudios citogenéticos moleculares realizados en la LLC han demostrado que la
afectación de 14q32 es mucho menos frecuente de lo que se había pensado partiendo de
los estudios citogenéticos convencionales. Dicha alteración aparece en, aproximadamen
te, el 5% de las LLC, principalmente en forma de translocación t(2;14)(pl3;q32), t(14;14)
(q32;q21), t(14;17)(q32;q23), t(14;18)(q32;q21), t(14;22)(q32;ql 1) y t( 14; 19) (q32;ql3).
Respecto al valor pronóstico de las alteraciones cromosómicas en la LLC, en general
se observa que:
• Se establecen tres grupos pronósticos según la alteración citogenética detectada por
técnicas de FISH utilizando las sondas para 1lq 2 3 ,1 2 ,13ql4 y 17pl3:
• Bueno: del(13)(ql4).
• Intermedio: +12 y cariotipo norm al (sin alteraciones de las 4 sondas de FISH).
• Malo: del(ll)(q23) y del(17)(pl3), que se asocia a progresión de la enfermedad y
corta supervivencia.
• Los pacientes con un cariotipo complejo (más de tres alteraciones cromosómicas)
tienen un pronóstico más desfavorable que el resto.
Linfomas no hodgkinianos
El linfoma folicular (LF) se caracteriza citogenéticamente por la presencia de la trans
locación t(14;18)(q32;q21) en el 80-90% de los casos. Esta translocación se asocia a
una desregulación del oncogén BCL-2 en la mayoría de los casos, como consecuencia
de la yuxtaposición de una de las regiones JH del gen de la cadena pesada de las in
munoglobulinas (IGH@) en 14q32 con una región no codificadora del gen BCL-2 en
18q21. La trisomía parcial de los cromosomas 2, 3, 7,12,18 y 21 y las deleciones en los
cromosomas 6 q y 17p se asocian a formas clínicas más agresivas, y estas últimas son las
que presentan un factor pronóstico adverso independiente en los análisis multivariantes.
La transformación histológica del LF a linfoma difuso de célula grande se asocia con
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Enfermedad Alteración Gen

Linfoma folicular t(14;18)(q32;q21) IGH@/BCL2
Linfoma del manto t(ll;14)(ql3;q32) IGH@/CCND1
Linfoma de Burkitt t(8;14)(q24;q32) IG H@ /M YC
t(2;8)(pl2;q24) IGK@ /M YC
t(8;22)(q24;qll) IGL@ /MYC
Linfoma diíuso de célula grande t(3;v)(q27;v) BCL6
Linfoma marginal extranodal tipo MALT +3
t(l I;18)(q21;q21) A PI2/M ALT1
t(l;14)(p22;q32) IGH@/BCL10
t( 14; 18) (q32;q21) IGH@ /MALT1
t(3;14)(pl4;q32) FOXPl/IG H@
Linfoma esplénico de la zona marginal del(7)(q32)
+3q
Linfoma anaplásico de célula grande t(2;5)(p23;q35) N P M /A L K
amplificaciones en lp, 6 p, 8 q y 1 2 q; así como con la translocación t( l ; 2 2 )(q 2 2 ;ql 1 ),

deleciones homocigotas de 9p21 (genes CDKN2B y CDKN2A) y mutaciones de TP53
y BCL2 (tabla 11-3).
El linfoma de B urkitt (LB) se caracteriza citogenéticamente p o r la presencia de la
translocación t( 8 ; 14) (q24;q32) en el 80% de los casos. Otras dos alteraciones variantes,
la translocación t(8;22)(q24;ql 1) y t(2;8)(pll;q24), se identifican en el 15 y el 5% de
los casos, respectivamente. Estas translocaciones se asocian a una desregulación del
gen M YC (8q24), como consecuencia de la fusión de este oncogén con el gen IGH@ en
14q32, o con los genes de las cadenas ligeras k (IGK@) en 22ql 1 o X (JGL@) en 2pl 1. El
LB suele presentar otras alteraciones citogenéticas secundarias, como la duplicación de
lq, del(6 q) y del(17p). La inactivación del gen TP53 por deleción o m utación se detecta
en un 30-60% de los LB y se asocia con la progresión tumoral (v. tabla 11-3).
El linfoma del manto (LM) se caracteriza citogenéticamente por la translocación
t(ll;1 4 )(q l3 ;q 3 2 ) que se observa en el 70% de los casos mediante citogenética con
vencional y en más del 95% de los casos mediante hibridación in situ fluorescente. Esta
translocación es la causante de un aum ento de la expresión de la ciclina D 1 (más del
95% de los casos) como consecuencia de la desregulación del gen codificante para esta,
CCND1, debido a una yuxtaposición con el gen IGH@ en 14q32. Es destacable que un
5% de los LM no presentan la t( 11; 14) ni sobreexpresión del gen CCND1. El 50% de
estos casos m uestran reordenamientos del gen CCND2 (12pl3).
El empleo de técnicas de hibridación in situ e hibridación genómica com parada
ha perm itido detectar la presencia de aberraciones cromosómicas adicionales en la
m ayoría de los casos; las más frecuentes son las pérdidas de m aterial genético en
lp , 6 q, 8 p, 1lq y 13q, y ganancias en 3q, 8 q y 7p. En casos con morfología blastoide
tam bién se han observado amplificaciones de los genes: M Y C en 8 q, D M I-I en lOp,
C D K4en 12qy BCL-2 en 18q. Las deleciones délos cromosomas llq 2 3 y 13ql4 en el
LM se detectan en un porcentaje similar a la LLC y m ucho más frecuente que en otros
SLPC-B. La deleción de 17pl3 se observa generalmente en formas blásticas y se asocia
a refractariedad al tratam iento y supervivencia corta. La elevada expresión de Ki67
es un factor pronóstico adverso en la evaluación de la enfermedad, así como el grado
de complejidad del cariotipo. Se han observado deleciones en el cromosoma 8 p en el
83% de los LM leucemizados que sugieren la presencia de un gen relacionado con el
ERRNVPHGLFRVRUJ
inicio de la enfermedad. Además, se han descrito dos formas de LM leucemizado con

distinto com portam iento clínico: uno con m orfología prolinfocitoide, expresión de
CD38, deleción de TP53 y amplificación de M Y C que se com portaría de form a más
agresiva, y otro con morfología clásica, CD38 negativo, ausencia de alteraciones en
TP53 y M Y C y evolución clínica más indolente (v. tabla 11-3).
Los linfomas de la zona marginal (nodales, MALT o esplénicos) son un grupo de SLPC
con características clínicas, histológicas, inmunológicas y genéticas propias.
Las alteraciones citogenéticas más frecuentes asociadas a los linfomas nodales de la
zona marginal son las trisomías 3,7 y 18. Las translocaciones asociadas con los linfomas
de la zona marginal extranodal no se detectan.
Los linfomas M A LT (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue) extranodales presentan alte
raciones genéticas en cerca del 60% de los casos, donde la translocación t( 1 1 ; 18) (q2 1 ;q2 1 )
con la formación del gen de fusión API2/MALT1 es la alteración estructural más frecuente
(30%). La expresión de este gen de fusión conduce a un incremento en la inhibición de la
apoptosis. O tra alteración menos frecuente es la translocación t(l;14)(p22;q32) con des
regulación del gen BCL-10 también implicado en el control de la apoptosis. La presencia
concomitante de estas dos translocaciones se detecta en linfomas MALT avanzados.
Las alteraciones genéticas más frecuentes del linfoma de la zona marginal esplénico
son la trisomía 3 y las alteraciones estructurales del cromosoma 7q. Las deleciones en
7q31.3 se observan en el 40% de los casos. Se ha descrito que la ausencia de mutaciones
de los genes IGHV@ junto a deleciones en 7q confieren un pronóstico clínico adverso
en esta enfermedad (v. tabla 11-3).
El linfoma difuso de células grandes B (LDCG-B) presenta, en más de un 30% de
los casos, alteraciones de la región 3q27 que involucran el gen BCL6, que son las trans
locaciones más comunes en esta patología. No obstante, un 20-30% de casos presentan
la t( 14; 18) (q32;q21) típica de LE Además, los reordenamientos del gen M YC se observan
en más del 10% de los pacientes. Se ha descrito que la presencia de dos o más de estas
translocaciones en un paciente se asocia a un tipo de LDCG-B con características propias,
las cuales se conocen como linfomas doble o triple hit.
Conclusión
Los resultados citogenétícos son importantes porque no solo son indispensables para el
diagnóstico de algunas hematopatías, sino también por su valor pronóstico.
Aún existen muchas alteraciones cromosómicas que no se correlacionan con unas
características clínicas determinadas. Por ello, es indispensable realizar un diagnóstico
integrado con el fin de determinar la posible correlación entre el cambio cromosómico
y el curso de la enfermedad.
En los últimos años, la introducción de las técnicas de hibridación in situ ha re
presentado un complemento importante para las técnicas citogenéticas convencionales.
En aquellos casos en los que el índice mitótico de las células leucémicas es bajo (p. ej., en
la LLC), y se quiere descartar una alteración numérica (p. ej., la trisomía 12), se puede
utilizar una sonda centromérica del cromosoma que se quiere estudiar, y así se puede de
terminar, sin la necesidad de realizar un cultivo celular ni obtener células en metafase, las
copias que existen de un determinado cromosoma mediante el recuento de las señales
de hibridación en los núcleos. En otros casos, si la calidad de los cromosomas y de las
bandas no es satisfactoria, se pueden aplicar sondas de secuencia única o un conjunto de
sondas para el «pintado» de un cromosoma en concreto, y determinar la existencia de una
alteración cromosómica que mediante la citogenética convencional no se puede precisar.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Por otro lado, el desarrollo de técnicas moleculares ha introducido una nueva dimensión
en el estudio y la comprensión del papel de los cambios cromosómicos en la génesis del
tumor, por lo que los citogenetistas y los genetistas moleculares deben trabajar coordinados
para aportar una mayor información sobre el origen y desarrollo del cáncer. La colabo
ración entre la citogenética y la biología molecular es importante, ya que tiene el fin de
determinar un mayor número de regiones genómicas que puedan ser candidatas a tener
actividad oncogénica (tabla 11-4). La reciente introducción de las técnicas de secuencia-
ción masiva del genoma está permitiendo avanzar en el conocimiento de las neoplasias
hematológicas, y así definir los genes implicados en cada enfermedad y su valor pronóstico.
TABLA 11-4. Oncogenes, genes supresores de tumores y factores de crecimiento.

Localización cromosómica y neoplasia asociada
Oncogén Punto de rotura Neoplasia

RBM15 lpl3 LMAM7 t(l;22)
BCL10 lp22 LDCG-B, LLC, LNH MALT
NRAS lpl3.2 SMD, LMA
TAL1 lp32 LLA-T t(l;14)
MPL lp34 NMP
ARNT lq21 LLAt(l;12)
TPM3 lq21.2 LACG
PBX1 lq23 LLApre-B t(l;19)
BCL9 lq21 LDCG-B, LLA
AF1 lq21.3 LMA t(l;ll)
MAL 2cen-ql3 L. mediastino
IGK@ 2pl2 SLPC-B
BCLUC 2pl3 Linfomast(2;14)
REL 2pl3-12 L. mediastino
ALK 2p23 LACG t(2;5)
SF3B1 2q33.1 SMD
IDH1 2q33.3 NMP, SMD, LMA
PAX3 2q35 Rabdomiosarcoma t(2;3)
EVI1 3q26 SMD-LMA inv(3)(q21q26)
BCL6 3q27 LDCG
KIT 4 q ll-q l2 LMA
AF4 4q21 LLAt(4;ll)
TET2 4q24 NMP, SMD
NPM1 5q35.1 SMD/ LMA/LACG t(2;5)
HISTH4F 6p22.1 LACG
DEK 6p22.3 LMAbas. t(6;9)
MUM-1 6p25-p23 Linfomas, MM t(6;14)
MLLT4 6q27 LLAt(6;ll)
FGFRIOP 6q27 NMP t(6;8)
IKZF1 7pl3-pl 1.1 NMP
TCRG 7pl5-pl4 SLPC-T
BCL7B 7qll.23 LNH Burkitt
ST7 7q31 LEZM
TCRB 7q34 SLPC-T
EZH2 7q35-q36 SMD
M OZ 8pll LMA t(8;13)
FGFR-1 8p ll-p l2 t(6;8), t(8;13), t(8;9), t(7;8), t(8;22) NMP
ETO/MTG8 8q22 LMA-M21(8;21)
M YC 8q24 LB, LLA-L31(8;14)
t(8;22), t(2;8)
PAX-5 9pl3 LLP t(9; 14)
CDKN2B 9p21
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 11-4. Oncogenes, genes supresores de tumores y factores de crecimiento.

Localización cromosómica y neoplasia asociada (cont.)
Oncogén Punto de rotura Neoplasia

CDKN2A 9p21
AF9 9p22 LLA, LMA-M5 t(9;ll)
JAK2 9p24 NMP
GAS1 9q22 LMA
ABL 9q34 LMC, LLA, LMA
CAN 9q34 LMA bas t(6;9)
HOX11 10q24 LLA-T
WT llp l3 T.Wilms
CCND1 llq l3 LNH Manto
API2 llq22 LNH MALT
MLL llq23 LLA, LMA
PLZF llq23 LMA M3 t(ll;17)
BOB1 llq23 LDCG
ATM llq23 LLC-B
CBL llq23.3 NMP
KRAS 12pl2.1 LMA
ETV6 12pl3 LLAt(12;21)
BCL7A 12q24 LB
FIM 13ql2
RB 13ql4 RB, LLC
FKHR 13ql4 Rabdomiosarcoma t(2;13)
FLT3 13ql2 LMA, LLA
TCRA 14qll SLPC-T
TCRD 14qll SLPC-T
IGH@ 14q32 SLPC-B
BCL11B 14q32 LLA-T
BCL8 15qll LDCG-B
PML 15q22 LMA con t( 15; 17) (M3)
IDH2 15q26.1 NMP, SMD, LMA
TLS 16pll LMA t(16;21)
MYH11 16pl3 LMA con inv(16) (M4 Eo)
CBP 16pl3 LMA cont(8;16) (M4-M5)
CBFB 16q22 LMA con inv(16) (M4 Eo)
MAF 16q22-23 MM
TP53 17pl3
RARA 17ql2 LMA con t( 15; 17) (M3)
BCL2 18q21 LF t(14;18)
MALT1 18q21 LNH MALT
E2A 19pl3 LLA-B t(l;19)
BCL3 19ql3 LNH t( 14; 19)
CEBPA 19ql3.1 LMA
ASXL1 20qll NMP
ERG 21q22 LMA t(16;21)
IGL@ 22qll SLPC-B
RUNX1T1 22qll LMA M 2 1(8;21)
LLAt(12;21)
BCR 22qll LMC, LLA, LMA t(9;22)
EWSR1 22ql2 Tumor Ewing t(l 1;22) y t(7;22)
MKL1 22ql3 LMA con t(l;22) (M7)
TIMP1 Xpl 1.3-11.23
MCF-2 Xq27
LACG, linfoma anaplásico de célula grande; LB, linfoma de Burkitt; LDCG-B, linfoma difuso de célula grande B;
LEZM, linfoma esplénico de la zona marginal; LF, linfoma folicular; LLA, leucemia linfoblástica aguda; LLC, leucemia
linfática crónica; LLP, linfoma linfoplasmocítico; LMA, leucemia mieloide aguda; LNH, linfoma n o hodgkiniano;
RB, retinoblastoma; SLPC, síndrom e linfoproliferativo crónico; SMD, síndrome mielodisplásico.
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TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU. FUNDAMENTO

Y APLICACIONES EN NEOPLASIAS HF.MATOLÓGICAS
Introducción
La técnica de hibridación in situ (HIS) permite detectar y localizar secuencias específicas
de ácidos nucleicos (ADN o ARN) sobre preparaciones cromosómicas, extensiones
celulares, cortes de tejido y cortes ultrafinos utilizados para el estudio al microscopio. La
utilización de las técnicas de HIS ha aumentado en los últimos años como complemento
de las técnicas de citogenética convencional. La ventaja de la citogenética convencional
radica en la visualización de todos los cromosomas, pero presenta varias limitaciones:
es necesario que existan células en división y, en ocasiones, se pueden valorar pocas
metafases (menos de 20). Por otra parte, los cromosomas pueden presentar unas bandas
cromosómicas poco definidas, por lo que es imposible determinar el cariotipo debido
a una calidad m orfológica deficiente. En este caso, no será factible la detección de
alteraciones cromosómicas que afecten a regiones genéticas muy pequeñas. Para com
plem entar las técnicas citogenéticas convencionales, actualmente disponemos de las
técnicas de HIS (tabla 11-5).
La base metodológica para la realización de dichas técnicas requiere de una des
naturalización (rotura de los enlaces que unen la doble hélice del ADN) tanto del ADN
de la muestra como del ADN de la sonda utilizada (que deberá ser complementario al
fragmento de ADN que se desee estudiar). Posteriormente, se procede a hibridar los
ADN de la muestra y de la sonda, de modo que se produzca la unión entre ambos por
complementariedad de bases. El resultado de la hibridación se interpretará m icros
cópicamente y teniendo en cuenta el tipo de sonda utilizada. Las etapas generales de la
HIS se detallan en la figura 11-4.
A principios de los años noventa, se introdujeron las técnicas de HIS en el laboratorio
de hematología aplicadas en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de las neoplasias
hematológicas. Los tipos de sondas aplicadas de forma rutinaria fueron las sondas centro-
méricas (que marcan toda la región centromérica), las sondas de pintado cromosómico
(constituidas por una librería de sondas que abarcan todo el cromosoma) y las sondas de
secuencia única (locus específico), que marcan regiones cromosómicas muy concretas
(tabla 11-6). Nos referimos a ellas como sondas de HIS «convencionales» por ser de uso
TABLA 11-5. Ventajas y limitaciones de la técnica de citogenética convencional

y de hibridación in situ
Técnica Ventajas Limitaciones

Citogenética Aporta información de todos Requiere células en división del clon neoplásico
convencional los cromosomas Interpretación dificultosa en caso de obtener
Bajo coste económico cromosomas de mala calidad
Permite el análisis de pocas células
Baja sensibilidad
Hibridación Aplicable tanto sobre metafases Aporta información concreta dependiendo
in situ como sobre núcleos en interfase del tipo de sonda utilizada
Permite el análisis de un mayor Alto coste económico
número de células
Mayor sensibilidad
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FIGU RA 11-4. Etapas de la técnica

de hibridación in situ.
generalizado. Posteriormente, han aparecido nuevas tecnologías de HIS con el mismo

fundamento y la intención de resolver las carencias de las sondas «convencionales» y
aportar una mayor información en el conocimiento del cariotipo. Dichas metodologías
comprenden la técnica de hibridación genómica comparada (HGC), Multicolor-FISH
(M-FISH), Spectral Karyotyping (SKY) y Multibanding-FISH. Por otra parte, también
existen una serie de técnicas que combinan la identificación celular con la HIS, de forma
que permiten asociar una alteración cromosómica a un linaje celular concreto. Entre
ellas destacan las técnicas de morfología-anticuerpo-cromosoma e hibridación in situ
(MACHIS), May-Grünwald/Giemsa-hibridación in situ fluorescente (MGG-FISH) y
fluorescence immunophenotyping and. interphase cytogenetics as a tool fo r investigation
o f neoplasms (FICTION).
H ibridación in situ «convencional»

La HIS «convencional», de aplicación más generalizada en el estudio de las neoplasias
hematológicas, se basa en la utilización de tres tipos principales de sondas: sondas cen-
troméricas, sondas de pintado cromosómico y sondas de secuencia única o también
llamadas de locus específico.
• Las sondas centroméricas están formadas por una secuencia repetitiva de ADN que
híbrida con el ADN de la región centromérica del cromosoma. Estas permiten detectar
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TABLA 11-6. Tipos de sondas utilizadas en HIS «convencional». Visualización en metafase

e interfase
Sondas centroméricas
Sondas de pintado
cromosómico
Sondas de secuencia única

I
o de locus específico
alteraciones cromosómicas numéricas, tanto sobre metafases como sobre núcleos en

interfase (citogenética interfásica). Mediante esta técnica se puede valorar la presencia
o ausencia de alteraciones numéricas (monosomías o trisomías) sin la necesidad de
tener células en división.
• Las sondas de pintado cromosómico están formadas por una batería de sondas que
en su conjunto hibridan con todo el cromosoma. Dichas sondas permiten visualizar
alteraciones citogenéticas numéricas y estructurales sobre metafases y confirm ar
de forma inequívoca cariotipos con translocaciones complejas o con cromosomas
marcadores. El pintado cromosómico es de gran utilidad cuando los cromosomas son
de mala calidad y la citogenética convencional, sin embargo, p or sí sola, no puede
resolver el cariotipo.
• Las sondas de secuencia única o locus específico hibridan con el ADN de una región
genómica concreta, correspondiente a un gen o a una banda cromosómica. Con ellas
es posible detectar alteraciones numéricas y estructurales, tanto en metafases como
en núcleos interfásicos. Estas sondas son de gran utilidad para descartar alteraciones
cromosómicas difíciles de identificar con las técnicas de bandeo convencionales, como
translocaciones crípticas o microdeleciones.
En la tabla 11-6 se refleja la visualización sobre metafases y núcleos en interfase de
los distintos tipos de sonda aplicadas en HIS «convencional». En la tabla 11-7 se mues
tran los tipos de sondas «convencionales» más utilizados en el estudio de neoplasias
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I TABLA 11-7. Sondas de HIS «convencional» más utilizadas en el estudio de neoplasias j

hematológicas
Tipo de patología Sondas centroméricas Sondas de secuencia única

LMA t(9;22) BCR/ABL
t(8;21) AML/ETO
t(15;17) PML/RARA
16pl3/inv(16) CBPB/MYH11
llq23 MLL
SMD -7, +8 5q31,7q31,20ql2
NMP 4ql2 (PDGFRA), 5q33 (PDGFRB)
LMC t(9;22) BCR/ABL
LLA Hiperdiploidías t(9;22) BCR/ABL
llq23 MLL
t(12;21) TEL/AML
SLPC
LLC +12 llq23 ATM
13ql4D13S319
17pl3 TP53
LM t( 11; 14) IGH@/CCND1
LF t(14;18) IGH@/BCL2
LB t(8;14) IGH@/MYC
LEZM +3 7q32,3q27 (BCL6)l7pl3(TP53)
LMN y LMALT +3,+18 t(14;18) IGH@/MALT1, t(l 1;18) API2IMALT1,
lp22 (BCL10)
LACG ALK (2p23)
MM 17pl3, TP53
14q32 IGH@
t(4;14) FGFR3/IGH@
t(14;16) MAF/IGH@
Para las abreviaturas véase la tabla 11-4.
hematológicas. En la tabla 11-8 se resumen las recomendaciones respecto al número de

células a analizar, los individuos controles a realizar y los niveles de corte para las sondas
centroméricas, de locus específico y de pintado cromosómico.
O tras técnicas de hibridación in situ

Las técnicas de Multicolor-FISH (M-FISH) o Spectral Karyotyping (SKY), Multibanding-FISH
e hibridación genómica comparada (HGC) aparecieron con la intención de resolver las
carencias de la HIS «convencional» y aportar una mayor información en el conocimiento
del cariotipo.
Las técnicas M -FISH o SKY se basan en la cohibridación de 24 sondas de pintado
crom osóm ico m arcadas co m binatoriam ente con diferentes fluorocrom os sobre
metafases. El resultado de la hibridación permite visualizar simultáneamente cada par
cromosómico de un color diferente. Estas técnicas son m uy útiles para determ inar
de form a inequívoca cariotipos complejos y crom osom as no identificables con las
técnicas de bandeo (cromosomas marcadores). Esta técnica presenta una limitación en
aquellas patologías con un índice proliferativo bajo debido a la necesidad de analizar
células en división. Estas tecnologías no perm iten el reconocim iento de algunos
puntos de ro tu ra com o aquellos asociados a deleciones, inserciones, adiciones o
translocaciones de pequeño tamaño, para los cuales es necesario utilizar sondas es
pecíficas de locus.
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TABLA 11-8. R ecom endaciones respecto al núm ero de células y de c o n tro les, y respecto
a los niveles de corte para las sondas centroméricas, de locus específico y de pintado
crom osóm ico
Número de células
analizadas Controles Niveles de corte ( X * 3 DE)1'
Sondas centroméricas 200 10 Monosomías > 10%

Trisomías > 5%
Sondas de locus 200 10 Deleciones > 5-6%b
específico Ganancias > 5%
Alteraciones estructurales > 1 %
Sondas de pintado 10 No requiere Mínimo dos metafases
cromosómico con la misma alteración
0 Prom edio ± 3 desviaciones estándar. A considerar p o r cada laboratorio.
b Siempre y cuando se utilice u n control interno de la sonda.
La H G C, tam bién llam ada c o m p a r a tiv e g e n o m ic h y b r id i z a ti o n , es u n a técnica

citogenética-m olecular que perm ite detectar cambios num éricos de secuencias de
ADN (pérdidas, deleciones, ganancias y amplificaciones) en un tejido tum oral. Di
cha técnica se basa en la hibridación in s itu del ADN tum oral y de un ADN control
marcados con fluorocromos de distinto color sobre metafases normales. Después de
la hibridación, las variaciones numéricas del ADN tum oral se cuantifican mediante el
coeficiente de intensidad de fluorescencia entre el ADN tum oral y el ADN normal. La
HGC tiene particular interés en el análisis de cambios numéricos de secuencias de ADN
en tumores sólidos y en neoplasias hematológicas de índice proliferativo bajo, ya que
para la realización de la técnica no es necesaria la obtención de metafases. Asimismo, es
de gran utilidad en aquellos casos que presentan cariotipos complejos con numerosos
cromosomas marcadores, dobles dim inutos y regiones de tinción homogénea. Esta
técnica únicamente detecta cambios presentes en una proporción elevada de células
tum orales (50%). Por otra parte, no perm ite detectar translocaciones, inversiones
y otras alteraciones de tipo equilibrado que no com portan ganancias o pérdidas de
material genético.
A pesar de las ventajas que ofrece la HGC, su resolución es similar a las técnicas de
cariotipificación (3-10 Mb), por lo que ha sido reemplazada por las técnicas de m ic ro -
a rrays genómicos (tabla 11-9).
Técnicas de micro arrays

Un m ic r o a r r a y es una colección de moléculas dispuestas ortogonalm ente en filas y
columnas sobre un soporte sólido. En función del material dispuesto en dicho soporte
se pueden distinguir m ic ro a rra y s genómicos (con ADN), de expresión (con ARN), de
tejido fijado en parafina (a rra y de tejido), de proteínas o de células.
Existen dos tipos de m ic r o a rr a y s genómicos: de HGC y de sin g le n u c le o tid e p o ly
m o r p h is m (SNP).
Los m ic ro a rra y s de HGC siguen el m ismo fundamento que la HGC convencional,
cambiando el soporte sobre el que se realiza la hibridación. En lugar de hibridar sobre
un portaobjetos se hace sobre un soporte en el que se disponen millones de sondas de
secuencias de ADN correspondientes a b a cteria l a rtificia l ch ro m o so m e (BAC) u oligonu-
cleótidos, cubriendo todo el genoma o una región concreta.
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I TABLA 11-9. Ventajas e inconvenientes de las técnicas de hibridación in situ I

«convencionales» y nuevas
Ventajas Inconvenientes
HIS Centroamérica No requiere células en división Solo informa de alteraciones
numéricas
HIS de locus No requiere células en división Solo informa del locus que se estudia
específico
HIS de pintado Muy útil para descifrar cariotipos Requiere células en división
cromosómico complejos Solo aporta información del
cromosoma concreto que se analiza
Hibridación Requiere una pequeña cantidad de Solo se detectan alteraciones
genómica ADN. No requiere células en división citogenéticas que impliquen
comparada Permite estudiar material archivado ganancias y pérdidas de ADN
(congelado, en parafina) Requiere una infiltración tumoral
Permite detectar ganancias y pérdidas mínima del 50%
de ADN en todo el genoma No permite cuantificación de las
ganancias o pérdidas
No detecta ganancias de ADN
menores de 4-5 Mb ni pérdidas
menores de 10-20 Mb
Multicolor Permite obtener información de todos Requiere células en división
FISH-SKY los cromosomas No detecta alteraciones estructurales
Muy útil para descifrar cariotipos dentro de un mismo par
complejos cromosómico
No detecta alteraciones estructurales
de ADN menores de 10 Mb
Microarrays No requiere células en división Baja sensibilidad
genómicos Alta resolución. Detecta alteraciones No detecta alteraciones equilibradas
de hasta 50 kb No detecta clones individuales
Análisis global del genoma
Actualmente, también se utilizan los microarrays de SNP que, además de detectar

ganancias y pérdidas, pueden identificar pérdidas de heterocigosidad que no implican
alteraciones numéricas en el genoma.
Estas técnicas permiten un estudio global del genoma con una mayor resolución, de
hasta 50 kb. Una de las limitaciones de los microarrays genómicos es la baja sensibilidad
ya que, para identificar una alteración, se requiere que la m uestra a analizar contenga
como m ínimo un 20% de células tumorales. Además, no permite detectar alteraciones
equilibradas ni distinguir clones individuales (v. tabla 11-9).
La aplicación de esta metodología está limitada a aquellas patologías que se caracteri
zan por presentar alteraciones en el número de copias. Sin embargo, es una herramienta
destinada a la investigación porque, aunque se ha demostrado su implicación pronostica,
no está claro el valor biológico de las alteraciones detectadas.
Com binación de las técnicas de hibridación in situ con técnicas

de identificación celular
El diagnóstico y la clasificación de determinadas hemopatías malignas se basan en el es
tudio morfológico, inmunológico y citoquímico de sangre periférica, de médula ósea o
de ganglio linfático. Las alteraciones cromosómicas estudiadas tanto en sangre periférica
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como en m édula ósea por técnicas de citogenética convencional y de hibridación in

situ pueden aportar información para el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad.
La posibilidad de combinar técnicas de identificación citológica o inmunológica y de
análisis cromosómico es m uy útil para poder relacionar las alteraciones cromosómicas
directamente con las células alteradas y su linaje celular.
En 1984, Teerenhovi et al. describieron la técnica de morfología-anticuerpos-cromosomas
(MAC) basada en la conservación de la m em brana citoplasmática de las células en
metafase para su posterior identificación mediante técnicas citoquímicas y/o inmuno-
lógicas. Para poder aplicar dicha técnica es necesario realizar un cultivo de citogenética
convencional para obtener metafases. En el proceso de extracción del cultivo se utiliza una
solución hipotónica suave que expande la célula sin romper la membrana citoplasmática.
Las preparaciones se obtienen por citocentrifugación. Mediante técnicas citoquímicas o
inmunológicas se identifica el linaje celular y, posteriormente, se puede realizar la técnica
de HIS convencional, asociando la presencia o ausencia de alteraciones al tipo celular
estudiado. En este caso, la técnica se denomina morfología-anticuerpos-cromosomas-
hibridación in situ (MACHIS). La utilización de estas técnicas ha quedado restringida
por el hecho de que el núm ero de células analizables es escaso y el rendimiento ha sido
superado por otras.
Actualmente, existen principalmente dos técnicas que utilizan la citogenética inter
fásica combinada con otros métodos para la identificación celular. Dichas técnicas son
las denominadas FICTION y MGG-FISH.
La técnica de FICTION se basa en la realización de estudios inmunohistoquímicos
sobre preparaciones de sangre periférica o de m édula ósea (frotis o preparaciones
obtenidas por citocentrifugación del material). Así, permite identificar el linaje de las
células estudiadas mediante marcadores inmunológicos de superficie específicos, a la vez
que se analiza el resultado de la hibridación in situ utilizando sondas específicas para la
alteración cromosómica que deseemos estudiar. La técnica requiere que los anticuerpos
específicos y las sondas de ADN que se utilicen estén marcados directa o indirectamente
con un fluorocromo.
La técnica de MGG-FISH se basa en la identificación celular a partir de una tinción de
May-Grünwald/Giemsa. Se localiza el tipo celular que se quiere estudiar sobre extensiones
de sangre periférica o médula ósea y se procede a aplicar la técnica de FISH con las sondas
adecuadas. Posteriormente, se relocalizan las células sobre el mismo portaobjetos con
la intención de valorar el resultado de FISH y poder asociar la alteración citogenética
estudiada a un determinado linaje celular.
PROTOCOLOS DE CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

E HIBRIDACIÓN IN SITU
Citogenética convencional
Se realiza la fase previa del proceso en condiciones estériles, en la cam pana de flujo
laminar. Es conveniente que el flujo de aire esté un mínimo de 10 min en marcha antes
de empezar a trabajar.
Cultivo
Paso 1: se preparan 100 mi de medio complementado siguiendo estas proporciones:
• 80 mi de medio RPMI 1640.
• 17 mi de suero bovino fetal.
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• 2 mi de L-glutamina.
• 1 mi de penicilina/estreptomicina.
El medio preparado se congela en frascos de cultivo (10 mi), y antes de poner la
muestra a cultivar, se descongela el frasco colocándolo en el baño a 37 °C.
Paso 2: se siembran 2 X 106 células/ml de sangre periférica, médula ósea o biopsia
ganglionar en un frasco de cultivo estéril con 1 0 mi de medio complementado.
La m édula ósea, u n a vez extraídos 1-2 mi, se introduce en un tubo con 5 mi de
m edio RPMI 1640 y un 1% de heparina sódica. La m uestra debe tran sportarse a
tem peratu ra am biente y n unca debe congelarse. U na vez recibida la m uestra, se
centrifuga a 1.500 r.p.m. durante 8 min, y de la parte superior del botón celular se
recogen 1-5 gotas, en función de la celularidad y del recuento de leucocitos, para su
posterior cultivo.
La sangre periférica se recoge en un tubo con heparina sódica o heparina litio (nunca
utilizar EDTA como anticoagulante). Su transporte debe realizarse a temperatura am
biente o a 4 °C (si el transporte dura más de 6 h).
Las muestras de ganglio deben transportarse en un frasco estéril sin ningún medio
ni conservante. Una vez recibido el ganglio, se hacen cuatro improntas, de las cuales
una se tiñe para observar el tipo celular que predomina. Si en la preparación teñida se
observan células maduras, el cultivo se debe estimular con un mitógeno (TPA o PHA)
y cultivarlo 72 h; en el caso de que predominen células inmaduras se realiza un cultivo
de 24 h sin mitógenos.
Para ello, se coloca en una placa de Petri estéril, con medio de cultivo RPMI 1640.
Se trocea y se pincha para extraer el máximo de células. Se recoge el medio con la sus
pensión celular para hacer el recuento celular. Si la suspensión no está limpia, se pone en
un tubo de centrifuga para realizar un lavado previo. Se ajusta a dos millones de células
por mililitro de medio.
Paso 3: se incuba la muestra durante 24-72 h en la estufa de C 0 2 a 37 °C (tabla 11-10,
para determinar condiciones de cultivo).
TABLA 11-10. Condiciones de cultivo para el estudio citogenético en función

del diagnóstico. Tiempo de cultivo y tiempo de colcemid
Enfermedad Tejido Mitógeno Tiempo de cultivo Tiempo de colcemid

NMP MO No 24 o 48 h 30 min
SMD MO No 24 o 48 h 30 min
LMA MO No 24 o 48 h 30 min
LLA MO No 24 o 48 h 30 min
Mieloma MO No 24-72 h 2h
LCP SP Sí 72 h 2h
LLC SP Sí 72 h 2h
LPC SP Sí 72 h 2h
Tricoleucemia SP Sí 72 h 2h
LNH con expresión SP Sí 72 h 2h
periférica
LNH Ganglio Sí 72 h 2h
No 24 h 2h
MO, m édula ósea; SP, sangre periférica.
Para las abreviaturas, véase la tabla 11-4.
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Normalmente, las médulas óseas se incuban durante 24 h, la sangre de pacientes con

SLPC se incuba 24 h sin mitógenos o 72 h con mitógenos, y los ganglios se procesan
igual que la sangre periférica.
En el caso de los cultivos de sangre periférica para determ inar el cariotipo cons
titucional, al medio de cultivo se le añade el mitógeno PHA al 0,5%.
En caso de realizar el estudio citogenético de síndrom es linfoproliferativos B
(SLPC-B), se realiza un cultivo de 72 h con mitógeno de células B (el más utilizado es el
TPA, acetato de miristato de tetraforbol). En las muestras de pacientes con SLPC-T
el mitógeno más apropiado es la PHA.
En el caso del estudio de mieloma múltiple, se valora el porcentaje de células plas
máticas. Si este es superior al 20%, se realiza un cultivo de 24 h y, en función del resultado
citogenético, se valorará la posibilidad de realizar el estudio de FISH. En caso de que
dicho porcentaje sea inferior al 2 0 %, se recomienda aislar mediante técnicas inm uno-
magnéticas la población de células plasmáticas (CD 138+) para realizar el análisis de
FISH directamente de este material.
Extracción
1. En las muestras de médula ósea y cariotipo constitucional, se añaden 0,1 ml del
antimitótico colcemid, se mezcla bien y se deja actuar durante 30 min en la estufa
a 37 °C. En muestras de SLPC se añade el m ismo volumen de colcemid, pero se
deja actuar durante 2 h. A partir de este punto ya se puede trabajar en condiciones
no estériles.
2. Se transfiere el contenido del cultivo a un tubo de centrífuga y se centrifuga la
muestra a 1.800 r.p.m. durante 8 min.
3. Se retira el sobrenadante con una pipeta Pasteur o por decantación, dejando el
mismo volumen de sobrenadante y de botón para facilitar la resuspensión con la
misma pipeta.
4. Se añade una solución de hipotónico KC1 de 0,075 M con una pipeta Pasteur, hasta
unos 7 mi (el prim er mililitro gota a gota y después más rápido). Se deja actuar
30 min al baño a 37 °C.
5. Se centrifuga de nuevo, se descarta el sobrenadante y se añade el fijador Carnoy
(1 ácido acético:3 metanol), gota a gota hasta unos 8 mi.
6 . Esta operación se repite de tres a siete veces, hasta que el sobrenadante sea trans
parente y el botón celular, lo más blanco posible. En el caso de m édula ósea
y ganglio con tres lavados es suficiente, y en sangre periférica es necesario un
mínimo de cinco lavados.
Extensiones
1. Se seca un portaobjetos previamente guardado en el congelador con etanol o
metanol, se tiran dos o tres gotas (en función de su concentración) del material
fijado desde una altura aproximada de 1 m y se coloca en la placa calefactora a
45 °C para secarlo.
2. Se mira la preparación al microscopio invertido para valorar la densidad celular
y la extensión de los cromosomas. Si la densidad es alta se añaden unas gotas más
de fijador a la suspensión celular y se repite la extensión: si es baja se centrifuga la
suspensión (10 min a 3.000 r.p.m.) y se resuspende el botón con menos cantidad
de fijador. Se realizan de dos a cuatro extensiones en función de las metafases
observadas al microscopio invertido.
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El secado de las preparaciones depende de la tem peratura y hum edad ambiental.

Para solventar este problema se usa una placa calefactora a 45 °C. Si el secado ha sido
correcto, las metafases observadas serán de color oscuro en el microscopio invertido.
Si por el contrario, el secado ha sido demasiado rápido o demasiado lento se verán los
núcleos con citoplasma y los cromosomas refringentes.
Tinción o técnica de bandas G
Se envejecen las preparaciones en la estufa de desecación a 65 °C durante 24 h o sobre
una placa calefactora a 100 °C durante 1 h. Dichas condiciones varían en función de las
condiciones ambientales de cada laboratorio. Una vez que transcurre este tiempo ya se
pueden teñir.
Preparación del colorante W right
1. Se prepara una solución al 0,25% de colorante de Wright en metanol (normal
mente se preparan 500 mi).
2. Se agita la mezcla 1 h en una botella preservada de la luz.
3. Se filtra con papel de filtro.
4. Se guarda a 37 °C durante 72 h.
5. Una vez preparado se conserva a 4 °C.
Preparación del tam p ó n Sórensen
• Fosfato potásico 4,539 g.
• Fosfato sódico 5,938 g.
• 1 . 0 0 0 mi de agua destilada.
• Una vez preparado se conserva a 4 °C.
Para realizar la tinción, se mezclan tres partes del tam pón Sórensen con una parte
del colorante Wright. Para cada portaobjetos se necesitan 3 mi de tam pón y 1 mi de
colorante. La mezcla se prepara en el mom ento de realizar la tinción y se deja actuar
sobre los portaobjetos durante 2-3 min. La cantidad de mezcla que sobre se desecha, ya
que el colorante W right precipita al poco rato de haberse añadido al tampón.
Análisis e interpretación del resultado

Se localizan las metafases con un objetivo X10, se añade aceite de inmersión sobre el
portaobjetos y se valoran las metafases con el objetivo X 1 0 0 .
Se realiza el recuento de cromosomas de cada metafase y se ordenan por pares (22
pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales). El recuento de
los cromosomas se debe realizar en un mínimo de 2 0 metafases y el de cariotipado en
un m ínimo de cinco metafases.
Hibridación in situ fluorescente en interfase con sondas centroméricas
y de secuencia única
O btención de la m uestra
Se realizan extensiones del material obtenido mediante la técnica de citogenética con
vencional y se dejan envejecer toda la noche a temperatura ambiente o 1 h a 100 °C.
Protocolo convencional sin placa calefactora

• Se desnaturaliza la m uestra en una solución de formam ida al 70% durante 5 min
a 74 °C.
ERRNVPHGLFRVRUJ
• Se deshidrata en una serie de etanoles al 70, 85 y 100%, cada uno durante 1 m in a

Preparación de la sonda
• Se mezclan 7 |xl de tam pón de hibridación más 1 (jlI de sonda, más 2 (xl de agua des
tilada a temperatura ambiente dentro de un tubo de microcentrífuga estéril cubierto
con papel de aluminio.
• Se centrifuga la mezcla de 1 a 3 s.
• Se desnaturaliza la sonda en un baño a 74 °C durante 5 min.
• Se vuelve a centrifugar la mezcla y se procede a la hibridación.
Reacción de hibridación
• Se colocan 10 |xl de la mezcla sobre el portaobjetos. Se tapa con un cubreobjetos de
20 X 20 m m y se sella con pegamento.
• Se coloca el portaobjetos en la cámara húm eda precalentada y se incuba a 37 °C
durante toda la noche (12-24 h).
Protocolo para la realización de la técnica de FISH con sondas

centrom éricas y de secuencia única (con placa calefactora
program able)
Preparación de la sonda y de la muestra
• Se mezclan 7 (xl de tam pón de hibridación más 1 jjlI de sonda, más 2 |xl de agua des
tilada a temperatura ambiente dentro de un tubo de microcentrífuga estéril.
• Se centrifuga la mezcla de 1 a 3 s.
• Se colocan 10 (jlI de la mezcla de la sonda sobre el portaobjetos. Se tapa con un cu
breobjetos de 20 X 20 m m y se sella con pegamento.
Desnaturalización-hibridación
• Se enciende la placa calefactora de hibridación.
• Se selecciona el programa que se quiera utilizar. Para sondas centroméricas o de locus
específico utilizaremos el programa:
• Melting: 75 °C, 1 min.
• Hybridization: 37 °C, 30 h.
• Se asegura que la placa calefactora esté húm eda para poder mantener la humedad
durante el proceso de hibridación.
• Se coloca el portaobjetos, con el cubreobjetos en la parte superior, en la superficie
caliente (vigüar que queden totalmente planos y en contacto con la placa).
• Se espera a que el proceso de desnaturalización y posterior hibridación tenga lugar,
desde 4 h a toda la noche.
A partir de este punto el proceso es el mismo para ambos protocolos.
Lavados de posthibridación
• Se elimina suavemente el pegamento de las preparaciones.
Lavados con form am id a

• Poner el baño a 45 °C y colocar las soluciones de lavado.
• 3 coplins con formamida 50%.
ERRNVPHGLFRVRUJ
• 1 coplin con 2 X SSC.

• 1 coplin con 2 X SSC/0,1% NP-40.
• Eliminar suavemente el pegamento (o parafilm) y empezar los lavados:
• Realizar 3 lavados en formamida 50% durante 10 m in a 45 °C.
• Realizar 1 lavado en 2 X SSC durante 10 min a 45 °C.
• Realizar 1 lavado en 2 X SSC/0,1% NP-40 durante 5 m in a 45 °C.
Lavados con soluciones salinas a altas tem p eratu ras

• Poner el baño a 74 °C y colocar la solución de lavado de 0,4 X SSC/0,3% NP-40 (la
temperatura de la solución debe ser 73 ± 1 °C).
• Eliminar suavemente el pegamento (o parafilm) y empezar los lavados:
• Realizar 1 lavado en 0,4 X SSC/0,3% NP-40 durante 2 m in a 74 °C (la temperatura
de la solución debe ser 73 ± 1 °C).
• Realizar 1 lavado en 2 X SSC/0,1% NP-40 durante 1 m in a tem peratura am
biente.
Contratinción
• Sobre el portaobjetos todavía húmedo se colocan 10 |xl de DAPIII (contratinción) y
un cubreobjetos encima. Se seca el exceso de DAPI II con un papel absorbente hasta
que el cubre no se mueva.
• Se guardan las preparaciones a -2 0 °C en una caja oscura y se deja reposar un mínimo
de 15 min antes de la observación.

En el caso de sondas centroméricas o de locus específico, se valoran un mínimo de 200
núcleos y se contabilizan las señales de hibridación en cada uno de ellos. Se considera
la presencia de una alteración cuando el porcentaje de células alteradas sea superior al
punto de corte fijado para cada sonda (v. tabla 11-9).
El protocolo para realizar la técnica de pintado cromosómico es m uy similar al des
crito en esta sección.
Es recomendable utilizar el protocolo proporcionado por la casa comercial al com
prar la sonda.
P r e p a r a c ió n d e s o lu c io n e s
20 x SSC
• 175,3 g de cloruro sódico.
• 88,2 g de citrato trisódico dihidratado.
• 11 de agua destilada.
• Ajustar el pH 6,2-6,3.
• Conservar a temperatura ambiente.
2 X SSC
• 50 mi de 20 X SSC.
• 450 mi de agua destilada.
• Conservar a temperatura ambiente o en nevera hasta 6 meses, siempre y cuando no
se observe contaminación de la solución.
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2 X SSC/0,1% NP-40
• 0,5 ml de NP-40 o Tween 20.
• Ajustar el pH 7-7,5 y enrasar a un volumen final de 500 mi.
• Conservar en nevera hasta 6 meses, siempre y cuando no se observe contaminación
de la solución.
0,4 X SSC/0,3% NP-40

• 1,5 mi de NP-40 o Tween 20.
• Ajustar el pH 7-7,5 y enrasar a un volumen total de 500 mi.
• Conservar en nevera hasta 6 meses, siempre y cuando no se observe contaminación
de la solución.
Formamida 70%
• 70 mi formamida.
• 20 mi H20 .
• 10 mi 20 X SSC.
• Ajustar el pH a 7,5.
• Conservar en nevera hasta 15 días.
Formamida 50%
• 125 mi formamida.
• 100 mi H20 .
• 25 mi 20 X SSC.
• Ajustar el pH a 7.
• Conservar en nevera hasta 15 días.
Etanol 70%
• 35 mi de etanol.
• Conservar durante 15 días.
Etanol 80%
• 40 mi de etanol.
• Conservar durante 15 días.
LEC TU R A S R EC O M E N D A D A S
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ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 11 Métodos citogenétícos en hematopatología 3 2 1 .e l
Autoevaluación
1. Las ventajas de la técnica de citogenética convencional aplicada al diagnóstico hematológico son:
(a) Aportar información de todos los cromosomas.
(b) Permitir la detección de mutaciones puntuales.
(c) Aportar información en aquellas células que no son capaces de entrar en división.
(d) Solo perm ite detectar alteraciones cromosómicas numéricas.
(e) Las respuestas c y d son correctas.
Respuesta razonada: la técnica de citogenética tiene la principal ventaja de que perm ite es
tudiar todos los cromosomas y, por ello, se pueden detectar tanto alteraciones numéricas como
estructurales, pero no perm ite detectar m utaciones puntuales. Su principal limitación es que
requiere de células en división.
2. ¿Cuál de las siguientes informaciones es falsa respecto a la FISH?
(a) Aporta información de la sonda que se utiliza.
(b) Permite detectar alteraciones numéricas.
(c) Permite detectar alteraciones estructurales.
(d) Su resultado tiene valor pronóstico.
(e) Las respuestas b y c son correctas.
Respuesta razonada: la técnica de FISH no tiene valor pronóstico, ya que solo detecta la alteración
que se busca con la sonda aplicada. Al dar solo información de una región m uy concreta no
perm ite conocer si otras regiones del genoma están afectadas.
3. ¿Cuál de las siguientes informaciones es falsa respecto a los arrays?
(a) Aporta información de todo el genoma.
(b) Permite detectar translocaciones.
(c) Permite detectar monosomías.
(d) Permite detectar trisomías.
(e) No necesita células en división.
Respuesta razonada: los arrays son una herramienta con una gran resolución, pero solo pueden
detectar ganancias y pérdidas de material genético, por lo que no pueden detectar alteraciones
equilibradas como las translocaciones.
4. La alteración citogenética de la leucemia mieloide crónica (LMC) es la:
(a) Translocación t(8;21).
(b) Translocación t(3;3).
(c) Translocación t(9;22).
(d) Translocación t( 11; 14).
(e) Translocación (15;17).
Respuesta razonada: la alteración característica de la LMC es la t(9;22), que da como resultado
un cromosoma 22 de m enor tamaño, denominado cromosoma Filadelfia.
5. La alteración citogenética de la leucemia promielocítica aguda M3 es la:
(a) Translocación t(8;21).
(b) Translocación t(3;3).
(c) Translocación t(9;22).
(d) Translocación t( 11; 14).
(e) Translocación (15;17).
Respuesta razonada: la alteración característica de la leucemia aguda promilelocítica o M3 es la
t(15;17), que genera la fusión de los genes PML del cromosoma 15 y RARA del cromosoma 17.
6. La citogenética estudia:
(a) Los cromosomas.
(b) La célula.
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(c) Los tejidos.

(d) Las proteínas.
(e) El ADN.
Respuesta razonada: la citogenética permite el estudio de los cromosomas y, para ello, es necesario
tener u n tejido en división para tener metafases, que es la etapa del ciclo celular en la que se
pueden visualizar los cromosomas.
7. La biología molecular estudia:
(a) Los cromosomas.
(b) La célula.
(c) Los tejidos.
(d) Las proteínas.
(e) El ADN.
Respuesta razonada: la biología molecular se basa en el estudio de los ácidos nucleicos, tanto el
ADN como el ARN, y es una técnica de gran utilidad para el estudio de los cambios genéticos
de las neoplasias.
8. ¿Qué técnica es la más sensible entre las indicadas en los siguientes apartados?
(a) PCR.
(b) Citología.
(c) Citogenética.
(d) Inmunohistoquímica.
(e) FISH.
Respuesta razonada: por orden de mayor a m enor sensibilidad: PCR > FISH > citogenéti
ca > inmunohistoquímica > citología.
9. Indica el m ejor tejido para estudiar citogenéticamente las leucemias agudas.
(a) Ganglio.
(b) Médula ósea.
(c) Sangre.
(d) Líquido amniótico.
(e) Piel.
Respuesta razonada: por orden de preferencia: m edula ósea > sangre. El resto no tienen apli
cación.
10. Indique el mejor tejido para estudiar citogenéticamente la leucemia linfática crónica.
(a) Ganglio.
(b) Médula ósea.
(c) Sangre.
(d) Líquido amniótico.
(e) Piel.
Respuesta razonada: por orden de preferencia: sangre > ganglio > m edula ósea. El resto no
tienen aplicación.
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C A P Í T U L O
Métodos de biología molecular

en hematopatología
D. Colomer
INTRODUCCIÓN
Los avances de la biología molecular han contribuido en gran manera al progreso de la
investigación en hematología. Su estudio ha ampliado los conocimientos de las bases mole
culares de determinadas enfermedades hematológicas, mejorando la capacidad diagnóstica.
La extracción de ácidos nucleicos se basa en la lisis celular, la inactivación de las nu-
cleasas celulares y el aislamiento del ácido nucleico en cuestión. Es importante tener en
cuenta que las nucleasas se hallan en la piel humana, por lo que se tiene que evitar el con
tacto directo de los ácidos nucleicos con las manos. Las ADNsas son bastante inestables,
pero las ARNsas son muy estables y pueden adsorber al vidrio y plástico y ser aún activas,
por lo que para el aislamiento de ARN se utilizan soluciones que contienen inhibidores
de estas ARNsas, como es el dietilpirocarbonato (DEPC). También es importante tener
en cuenta que los metales pesados promueven la rotura de los enlaces fosfodiéster y que el
EDTA es un excelente quelante de metales. Los métodos tradicionales de purificación de
ácidos nucleicos son combinaciones de extracciones, precipitaciones, métodos cromato-
gráficos, electroforesis y separaciones por afinidad. Muchos de estos métodos implican
la utilización de productos tóxicos (fenol, cloroformo), y son largos y laboriosos. Para
minimizar estos problemas, ya existen un gran número de productos comerciales que
simplifican notablemente los métodos de separación de ácidos nucleicos.
EXTRACCIÓN DEL ADN

Principio
De todos los métodos para trabajar en biología molecular, el más elemental es la puri
ficación de los ácidos nucleicos. En la actualidad, existe un gran núm ero de productos
comerciales para la extracción de ADN de muestras hematológicas. En este capítulo
se describe uno de los protocolos más universales y de fácil realización. Los leucocitos
obtenidos de sangre periférica o de médula ósea se rompen mediante la utilización de un
detergente, generalmente SDS, y proteinasa K. La proteinasa K libera el ADN nuclear al
medio y digiere las proteínas asociadas a él. Posteriormente, la solución que contiene
el ADN se somete a una serie de extracciones con fenol y cloroformo para la eliminación
de las proteínas y se obtiene el ADN mediante precipitación con etanol.
M aterial y reactivos
• Sangre total en EDTA.
• Suero fisiológico.

ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 12 Métodos de biología m olecular en hematopatología 323
• Tris-HCl: 2 M, pH = 8.
• Tris-HCl: 2 M, pH = 7,5.
• MgCl2 lM .
• EDTA: 0,25 M, pH = 7.
• Solución madre (X10) de lisis de leucocitos (NaCl, 3 M; EDTA, 0,1 M; Tris, 0,1 M,
ajustar a pH = 7,5 con NaOH al 32%).
• Tampón de lisis de leucocitos: 10 mi solución madre (X 10) de lisis de leucocitos y
42 g de urea en un volumen final de 100 mi.
• Tampón de lisis de eritrocitos (Tris-HCl, 0,01 M; pH = 7,5; MgCl2, 2,5 mM).
• NaCl 5 M.
• SDS-lauril sulfato al 20%, pH = 7,2.
• Urea 7 M.
• Solución de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1) saturada con Tris-HCl de 20 mM,
pH = 8,1. Se agita durante unas 6 h, se guarda en la nevera en botella oscura y se utiliza
la fase inferior.
• Solución de cloroformo-isoamílico (49:1) saturado con Tris-HCl de 20mM, pH = 8,1.
• PBS, pH = 7,2.
• NaCl, 0,15M.
• Etanol absoluto.
• Etanol al 70%.
• Tris-EDTA 1 mM (0,1 mM; pH = 8 [TE 1/0,1]).
• Acetato de sodio, 3 M; pH = 5,2 (ajustar el pH con ácido acético).
M é to d o
La extracción del ADN se puede realizar a partir de sangre total, leucocitos (separados
con dextrano T-500 o con diversas soluciones que lisan los hematíes), células mononu-
cleares (separadas mediante Ficoll) o fracciones celulares aisladas mediante purificación
magnética utilizando anticuerpos. Si se parte de sangre total será necesario lisar inicial
mente los hematíes.
1. Se lava la sangre tres veces con suero fisiológico sin eliminar la capa de leuco
citos (tubo de 50 mi graduado). Se guarda en un congelador a -8 0 °C hasta el
momento de la extracción.
2. Se añade tam pón de lisis de eritrocitos hasta 50 mi (antes de que se haya des
congelado). Se agita suavemente hasta que se descongele todo el paquete de
eritrocitos y leucocitos.
3. Se deja el tubo en hielo durante 30 min, y se agita suavemente cada 5 min.
4. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. a 4 °C durante 10 min.
5. Se elimina el sobrenadante. En el fondo del tubo quedan los leucocitos libres de
eritrocitos.
6. Se lisan las células con 0,5 mi de tam pón de lisis de leucocitos.
7. Se va añadiendo tam pón de lisis en alícuotas de 0,5 mi hasta que la suspensión
sea bastante líquida.
8. Se añade SDS al 20% (0,1 m, por cada mililitro de tam pón de lisis añadido).
9. Se incuba durante 30 m in a 37 °C.
10. Se añade un volumen igual de fenol-cloroformo-isoamílico.
11. Se mezcla agitando fuertemente. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 5 min a 4 °C.
12. Se transfiere la fase acuosa (fase superior) a otro tubo y se hace otra extracción
con fenol-cloroformo-isoamílico (volumen a volumen).
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13. Se repite la misma operación hasta que no queden proteínas en la interfase

(interfase de color blanco). Normalmente son necesarias tres extracciones.
14. Se añade un volumen de cloroformo-isoamílico, se agita fuerte y se centrifuga
(este proceso se repite dos veces).
15. Se coge nuevam ente la fase superior y se añaden dos volúmenes de etanol
absoluto. Se mezcla suavemente para que se forme el precipitado de ADN. Se
deja 30 m in a temperatura ambiente para que acabe de precipitar el ADN.
16. Se transfiere el ADN formado a un tubo Eppendorf que contiene etanol al 70%
frío para lavar el ADN.
17. Se centrifuga a 14.000 r.p.m. durante 10 min. Se decanta el sobrenadante y se
vuelve a centrifugar durante 5 min. Con una pipeta Pasteur se eliminan los restos
de etanol.
18. Se deja secar el ADN en u n a estufa a 37 °C con el tubo E ppendorf abierto
(aproximadamente 30 min).
19. Se disuelve el ADN en TE 1/0,1. La cantidad a añadir dependerá de la cantidad
de ADN formado (aproximadamente 300 |xl si se ha partido de 20 mi de sangre).
Se deja a temperatura ambiente durante 24 h hasta que se observe que todo el
ADN está disuelto.
20. Una vez disuelto el ADN se determina la concentración mediante la lectura es-
pectrofotométrica a 260/280 nm. El cociente 260/280 debe estar entre 1,7-2.
Actualmente, se tiende a la eliminación de la utilización de fenol y se realiza una
deshidratación y precipitación de las proteínas con una solución saturada de NaCl, o
se utilizan diversas resinas que purifican el ADN por métodos cromatográficos. Existen
también diversas técnicas para la extracción de ADN a partir de tejido congelado o fijado
e incluido en parafina. En tejido parafinado, el ADN que se obtiene es de menor tamaño,
y solo es útil para la realización de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa, pero
ha sido de gran utilidad en los estudios moleculares de linfomas donde solo se dispone
del tejido fijado e incluido en parafina. El ADN puede conservarse a 5 °C, pero para largas
conservaciones es mejor su congelación. Las mejores condiciones para conservar el ADN
son aquellas que contienen altas concentraciones de sales (> 1 M) y altas concentraciones
de EDTA (> 10 mM) a pH = 8,5.
PREPARACIÓN DE ARN
Para la obtención de ARN se realiza la lisis de las células con un detergente (Tritón
X-100, SDS, Nonidet P40) en presencia de compuestos que inactivan las ARNsas como
son el tiocianato de guanidina, EDTA, urea y 2-mercaptoetanol. Las ARNsas son enzi
mas muy estables, y todos los métodos de obtención de ARN se basan en inactivarlas
rápidamente. Posteriormente, existe una serie de extracciones parecidas a las utilizadas
en la extracción de ADN. Para obtener ARN de mayor calidad el extracto celular se
ultracentrífuga en u n gradiente de cloruro de cesio Solo el ARN es capaz de atravesar
tal densidad, ya que es más denso que el ADN crom osóm ico fragm entado, p or lo
que se recupera en el fondo del tubo. El ARN es inestable a tem peraturas inferiores a
-7 0 °C y conviene guardarlo en soluciones libres de ARNsas. Más del 90% del ARN
total de una célula corresponde a ARNr y solo el 5% a ARNm. Los ARNm de eucariotas
llevan en su extremo 3' una cola constituida p o r una larga secuencia poliadenílica.
Esta característica se aprovecha para su purificación m ediante cromatografía de afi
nidad, donde el soporte lleva oligo(dT) u oligo(U), que híbrida con la cola de poli(A)
de los ARNm.
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En este capítulo, se describe el método clásico de extracción de ARN, aunque en la

actualidad existen un gran núm ero de productos comerciales basados en este mismo
procedimiento.
MATERIAL Y REACTIVOS
• Solución desnaturalizante: tiocianato de guanidina, 4 M; citrato sódico, 25 mM;
pH = 7; 2-mercaptoetanol, 0,1 M; laurosilsarcosina al 0,5%.
• Preparación de solución stock: 47,264 g de tiocianato de guanidina; 3,3 mi de citrato
sódico, 0,75 M, pH = 7; 5 mi laurosilsarcosina al 10%, y hasta 100 m i H20 destilada.
• Solución de trabajo: 0,14 mi de 2-mercaptoetanol; hasta 20 mi de solución stock. Se
guarda a temperatura ambiente preservado de la luz.
• Fenol saturado con H20-D E PC al 0,2%.
• Cloroformo/isoamílico 49/1:49 volúmenes de cloroformo y un volumen de alcohol
isoamílico.
M étodo
1. Se parte de un concentrado de células.
2. Se añade 1 mi de solución desnaturalizante mediante una jeringa de 2 mi y aguja
de 20 G, se aspira varias veces hasta que la solución se vuelve viscosa.
3. Se divide en dos tubos Eppendorf, 0,5 mi en cada tubo.
4. Se añade 50 |xl de acetato de sodio 2 M pH 4.
5. Se mezcla por inversión. Se añaden 200 |xl de fenol saturado y se agita vigorosamente.
6. Se añaden 100 (xl de cloroformo-isoamílico (49:1). Se agita fuerte y se deja en
hielo 30 min.
7. Se centrifuga durante 20 min a 14.000 r.p.m.
8. Se forman dos fases. La fase acuosa, o fase superior, contiene el ARN y se pasa a
un nuevo Eppendorf.
9. Se precipita con una cantidad igual de isopropanol al 100%.
10. Se deja a -2 0 °C durante un mínimo de 30 min o más tiempo.
11. Se centrifuga durante 15 m in a +4 °C y 14.000 r.p.m. Se descarta el sobrenadante.
12. Se forma un precipitado que es el ARN. Se resuspende en 300 |xl de solución
desnaturalizante.
13. Se añade un volumen de isopropanol al 100%.
14. Se deja a -2 0 °C durante 30 min.
15. Se centrifuga durante 15 min a 4 °C.
16. Se elimina el sobrenadante.
17. Se lava el ARN con 1 mi de etanol al 75% preparado con H20-D EPC. Se deja a
temperatura ambiente durante 10 min.
18. Se centrifuga durante 10 m in a 4 °C.
19. Se deja secar el precipitado de ARN durante unos 30 min a temperatura ambiente.
20. Se resuspende en 100 jxl de H 20-D EPC. Se deja en hielo entre 30-60 min.
21. Se mide la densidad óptica (DO) a 260/280 nm. El cociente 260/280 debe estar
entre 1,7-2.
D eterm inación de la concentración de ácidos nucleicos

La concentración de ADN y ARN se determ ina p or espectrofotom etría, basándose
en la característica de que las bases púricas y pirimidínicas que componen los ácidos
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nucleicos absorben a 260 nm. Una unidad de densidad óptica a 260 nm corresponde a
una solución de ADN de doble hebra de 50 g/ml, a 40 g/ml de ARN o de ADN de una
única cadena y a 20-33 g/ml de una solución de cebadores. Para saber si hay contami
nación de proteínas se realiza la lectura de la densidad óptica a 280 nm, que es donde
absorben las proteínas. Una relación 260/280 entre 1,8 y 2 indica que el ácido nucleico
es óptim o para su utilización.
Cálculo de la concentración de ADN

Una solución de 50 |¿g/|xl de ADN da una DO de 1.
. .. D O 260nm xdiluciónX 50
ADN(w ^ ) = ------------^ ------------
Cálculo de la concentración de ARN

Una solución de 40 |xg/|xl de ARN da una DO de 1.
. .. DO 260 n m x dilución x 40
ARN (|ig/|il) = --------------— —--------------
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) permite la am
plificación in vitro de un segmento de ADN. Esta técnica fue introducida por K. Mullis
en 1985, y es probablemente la técnica más extendida y la que más ha revolucionado
la historia de la biología molecular. La técnica de PCR es un método diseñado para
producir una amplificación selectiva de una determinada secuencia de ADN a partir
de dos cebadores sintéticos llamados cebadores, de unos 18-25 nucleótidos que son
complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Los
cebadores actúan como en la síntesis in vitro de ADN. El proceso de amplificación com
prende un conjunto de tres etapas (fig. 12-1) que se repiten a lo largo de varios ciclos
que comprenden:
1. La desnaturalización de la doble hebra de ADN por calor, aplicando temperaturas
de 90 a 97 °C que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios
y, por lo tanto, la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa sepa
ración de las hebras de toda la muestra, esta temperatura debe mantenerse unos
minutos. Si el ADN se desnaturaliza parcialmente este tenderá a renaturalizarse
rápidamente, así se evita una eficiente hibridación de los cebadores y una posterior
extensión.
2. La hibridación de los dos cebadores a sus secuencias complementarias. Esta fase
se denomina también fase annealing o de emparejamiento. Una vez que el ADN
está desnaturalizado, se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido
entre los 40 y los 60 °C para que se pueda producir la unión de los cebadores a
las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. Los cebadores se
añaden en exceso al ADN que se amplifica. Estos hibridan las dos hebras opuestas
del ADN que estén orientadas con sus extremos 3', de forma que la enzima ADN
polimerasa pueda funcionar en la dirección La temperatura de fusión o
annealing (melting temperature, Tm) depende de varios factores y es relativamente
específica para cada cebador. La longitud de los cebadores y la secuencia son críticas
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5 ,rT Tm —TTTrn-nr i h it ,i n i 11 r-^ ■ Desnaturalización
G en problema
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
236 = 68 billones
de copias
22 = 4 copias 23 = 8 copias 16 copias 32 copias
FIGURA 12-1. Diagramas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A. Etapas de la PCR.

B. Amplificación de la PCR.
en la designación de los parámetros de una amplificación; una fórmula simple

para calcular la Tm es la siguiente: Tm = 4(G + C) + 2 (A + T). No obstante, cada
cebador exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura
de hibridación específica, ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de
forma inespecífica y si es m uy alta, no se producirá una unión completa.
3. La extensión o síntesis de ADN gracias a una ADN polimerasa. Como la des
naturalización se produce al calentar el ADN, y los incrementos de temperatura
eran perjudiciales para la ADN polim erasa, se recurrió a una derivada de la
bacteria termófila Thermus aquaticus, que puede sobrevivir a m uy altas tem
peraturas, de manera que es capaz de realizar su actividad polimerasa a 72 °C y
ser resistente a las temperaturas de desnaturalización, que están alrededor de los
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95 °C. La utilización de esta enzima y la automatización de este procedimiento

con aparatos que realizan automáticamente los ciclos de desnaturalización, hi
bridación y extensión han perm itido que este método se haya convertido en el
más tradicional en biología molecular. Después de un ciclo se han sintetizado
nuevas hebras de ADN que, al igual que las hebras iniciales, pueden hibridarse a
los cebadores después de un nuevo proceso de desnaturalización e hibridación.
Sin embargo, el segundo ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión da
lugar a dos productos de una única hebra que juntos originan un producto de
doble hebra que es exactamente la longitud entre los dos cebadores. Cada hebra
de este producto es complementaria a uno de los dos cebadores y puede participar
como cebador en los ciclos siguientes. La cantidad de producto se multiplica en
cada ciclo, por lo que después de 30 ciclos se han obtenido 228 copias del primer
producto amplificado (v. fig. 12-1).
A continuación, se presentan los protocolos para las aplicaciones más comunes de
las técnicas de PCR.
Amplificación enzim ática del ADN m ediante la reacción en cadena

de la polim erasa
Para la PCR en necesario mezclar el ADN que se va a amplificar, dos cebadores apropiados,
la enzima Taq ADN polimerasa, los desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) y un tampón.
Esta mezcla se cicla muchas veces, generalmente unas 30, a diferentes temperaturas que
permiten la desnaturalización, hibridación y extensión. Los productos son visualizados
posteriormente en un gel que determina el producto y la especificidad. A causa de que
la concentración de MgCl2 en el tampón es muy importante y puede variar la eficiencia
de la reacción, es necesario optimizar esta concentración para cada par de cebadores.
La reacción de PCR depende de una serie de parámetros que se detallan a continuación.
Elección de los cebadores

La elección de los cebadores específicos y eficientes continúa siendo empírica. No hay
reglas que aseguren la correcta elección y es el parámetro que más condiciona el éxito o
fracaso de la reacción. Los siguientes puntos pueden ayudar a su diseño:
• Siempre que sea posible, se escogen cebadores con una distribución de bases aleatorias
con u n contenido de GC similar al de AT.
• Se deben evitar secuencias con una estructura secundaria importante, especialmente
en el extremo 3'.
• Hay que comprobar que los cebadores no sean complementarios. En particular, se
deben eludir los cebadores en que las zonas 3' sean complementarias para evitar la
incidencia de dimerización.
Existen disponibles en la web diversos programas para el diseño de cebadores.
Solución amortiguadora
La concentración de MgCl2 puede tener un efecto im portante en la especificidad y el
rendim iento de la amplificación. Las concentraciones sobre 1,5 mM acostum bran a
ser óptimas con 200 |xM de cada dNTP. No obstante, en algunas situaciones pueden
ser necesarias otras concentraciones de MgCl2. El exceso de iones Mg++ generalmente
provocará productos de amplificación no específicos, e insuficiente M g++ reducirá el
rendimiento. Algunos protocolos incluyen el 10% de dimetilsulfoxido (DMSO) para
reducir la estructura secundaria del ADN que se va a amplificar.
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Siempre debe utilizarse la solución amortiguadora específica que acompaña la Taq-

polimerasa.
Desoxinucleótidos
Es necesario utilizar entre 50-200 (jlM de cada uno de los dNTP. Unas concentraciones
mayores provocarán malas incorporaciones de la polimerasa. Con esta concentración
se pueden obtener de 6.5 a 25 |xg de ADN respectivamente.
Enzima ADN-polimerasa (Taq-polimerasa)

La concentración óptim a viene dada por la firma comercial, aunque suele emplearse
entre 1 y 4 U para cada reacción. Incrementar esta concentración puede provocar la
formación de productos no específicos y reducir el rendimiento del fragmento deseado.
Parámetros de los ciclos

Los parámetros característicos de una típica reacción son:
• Desnaturalización: 90-97 °C.
• Hibridación: 40-60 °C.
• Extensión: 70-75 °C.
En la mayoría de los casos una temperatura de 94 °C es suficiente para desnaturalizar
las cadenas de ADN. No calentar a suficiente tem peratura puede provocar que la re
acción no funcione, ya que las dos hebras de ADN no se han separado; por el contrario,
calentar demasiado provoca que la polimerasa pierda actividad a lo largo de los ciclos. La
temperatura y el tiempo de desnaturalización inicial dependerán de cada Taq-polimerasa.
Hay algunas enzimas que se llaman hot-start, las cuales se estimulan por calor y necesitan
tiempos más largos de la etapa de desnaturalización para que se activen.
La temperatura de hibridación depende de la longitud y de la secuencia de los ceba
dores. Una tem peratura de 55 °C puede ser un buen punto de partida para cebadores
de 20 bases con un 50% de GC. Debido al exceso de concentración de los cebadores, la
hibridación ocurre casi instantáneamente, por lo que son necesarios tiempos demasiado
largos en el proceso de hibridación. Cebadores más pequeños pueden requerir una
tem peratura de hibridación más baja (40-45 °C). El tiempo de extensión a 70-75 °C
varía según la longitud del fragmento que se debe amplificar.
M ateriales y reactivos
• H20 estéril.
• 50 mM de MgCl2.
• Tampón de la reacción de PCR (X 10).
• 2 mM mezcla de los cuatro dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• 50 |xM cebadores 1 y 2.
• ADN que se va a amplificar (100 ng a 1 |xg).
• Taq ADN polimerasa.
• Aparato de PCR.
M étodo de amplificación enzim ática

La reacción estándar de PCR se realiza en un volumen de 25 a 50 jxl, que además del ADN
que se va a amplificar contiene iones K+, Tris-HCl, iones Mg+2, 200 (xM de cada dNTP
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 pmol de cada oligonucleótido y 2,5 U Taq-polimerasa.
La am plificación se realiza en u n aparato diseñado para este fin, y u n program a
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estándar podría ser el siguiente: desnaturalización a 95 °C durante 7-10 min, seguido de

30-40 ciclos consistentes en una etapa de desnaturalización de 95 °C durante 30-60 s, la
hibridación a 55 °C durante 30-60 s y la extensión a 72 °C durante 45-90 s. Por último,
un proceso de extensión final de 10 m in a 72 °C.
Estas condiciones son útiles para una gran variedad de reacciones, aunque es mejor
seguir aquellas que se especifiquen en cada reacción concreta. En la actualidad, existen
termocicladores fast que permiten realizar el proceso de amplificación de forma mucho
más rápida, con ciclos inferiores a 30 s y con volúmenes inferiores.
En la técnica de PCR, la Taq ADN polimerasa no puede utilizar ARN como molde, por
lo que es necesario sintetizar ADNc in vitro a partir de ARN mediante una transcriptasa
reversa vírica. Esta técnica se llama de retrotranscripción y PCR (RT-PCR). Mediante
esta metodología es posible detectar genes humanos cuya expresión génica es muy baja
y de u na forma m ucho más rápida que mediante N orthern blot, por lo que tiene una
gran utilidad en oncohematología.
Reacción de retrotranscripción
Existen en el mercado una gran diversidad de kits comerciales para la realización de la
técnica de la retrotranscripción. A continuación, se describe el método clásico que se
puede realizar con cualquier transcriptasa reversa.
Material y reactivos
• Preparación de ADNc mix:
• 420 (xl de H 20 DEPC.
• 428 (xl de tam pón X5 (específico de la transcriptasa reversa).
• 21,5 (x ld eD T T 0 ,l M.
• 85,5 |xl de dNTP 25 mM.
• 45 |xl de hexámeros al azar pd(N )6, 5 mg/ml.
• Se hacen alícuotas de 175 |jl1 y se congelan a -2 0 °C.
• Preparación dNTP 25 mM: se mezclan 50 |xl de dATP 100 mM; 50 (jlI de dCTP
100 mM; 50 |xl de dTTP 100 mM, y 50 |xl de dGTP 100 mM.
• Preparación pd(N)6: se preparan a 5 jxM con H20-D EPC.
• Preparación H20 DEPC: se añade el 0,1% de DEPC a H20 (1 mi en 11 de H 20 ) , se
esperan 24 h y, posteriormente, se autoclava o se compra comercialmente.
En el momento que se desee realizar una retrotranscripción, se saca una alícuota de
175 |xl del congelador y se añaden 12 (jlI de transcriptasa reversa (M-MLV), 200 U/|xl, y
6 |xl de un inhibidor de ARNsas (ARNsin), 40 U/|xl.
Método
1. Se coge de cada muestra 1 |xg de ARN en un volumen total de 19 jxl, que se com
pletará con H 20-D EPC. (Estas muestras se preparan en hielo.)
2. Estas muestras se desnaturalizan en un termociclador durante 5 m in a 65 °C y se
ponen inmediatamente en hielo.
3. Se añade a cada muestra 21 |xl de la mezcla del ADNc mix, al que le hemos añadido
M-MLV y ARNsin.
4. Se ponen las muestras en un termociclador durante 2 h a 37 °C, durante 10 min
a 65 °C para inactivar la M-MLV y el ARNsin.
5. Se guardan las muestras de ADNc a -2 0 °C o se utilizan inmediatamente para rea
lizar la PCR.
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En la actualidad, hay en el mercado transcriptasas reversas que trabajan a temperatu

ras superiores y que tienen una gran efectividad. Uno de los protocolos estandarizados
es el de utilizar 1 (xg de ARN en 9,5 |xl de H 20 y desnaturalizar durante 10 m in a 70 °C.
Se pone inmediatamente en hielo y se añaden los siguientes reactivos en un volumen
de 20 jjl I : tampón RT, 20 mM; Tris-HCl, 50 mM; KC1,5 mM, pH = 8,3; MgCl2 10 mM;
DTT, 5 |xM pd(N )6; ARNsin, 20 U; MLV, 200 U, y dNTP, 1 mM. Posteriorm ente, se
pone en un term ociclador durante 10 m in a 25 °C, 45 m in a 45 °C, 3 m in a 99 °C y
se guarda a -2 0 °C.
Detección del producto amplificado

Los métodos convencionales de detección del producto amplificado consisten en la
separación y visualización mediante electroforesis. Los soportes más utilizados son
la agarosa y la poliacrilamida: la agarosa se utiliza para la separación de fragmentos a
partir de 1 0 0 pares de bases a 2 0 kb, y la poliacrilamida está recomendada para frag
mentos más pequeños o para la separación de fragmentos de tamaños muy similares.
La agarosa es un polisacárido natural, capaz de formar geles con rigidez suficiente para
ser manipulados a partir del 0 ,2 %; se disuelve por calentamiento, ya que tiene un punto
de fusión de 80 °C y no polimeriza hasta p o r debajo de unos 45 °C. A mayor concen
tración de agarosa, mayor resistencia hay en el avance de la muestra, aunque esta relación
no es lineal, por lo que es necesario introducir patrones de tamaño conocido en cada
gel, que luego nos perm itan determ inar el tam año del ADN problema. Solo pueden
compararse movilidades de moléculas de la misma forma, y los patrones deberán ser
elegidos de acuerdo con las moléculas que se quieran analizar. Los diferentes fragmentos
de ADN o ARN pueden ser visualizados directamente en el gel mediante tinción con
brom uro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se coloca entre las
bases del ADN y ARN, y cuando forma estos complejos aum enta m ucho su fluores
cencia. En la actualidad, debido a las características mutagénicas del brom uro de etidio
se utiliza como agente intercalante el silver green. De esta manera, se pueden visualizar,
bajo luz ultravioleta, pequeñas cantidades de ADN y ARN. Los fragmentos de ADN más
pequeños migran más rápidam ente en el gel. Una característica im portante de estos
geles es su alto poder de resolución, y algunos de ellos perm iten distinguir fragmen
tos que difieren en un solo nucleótido, aun cuando su longitud total sea de varios cientos
de ellos. Recientemente, es posible la detección de los productos de amplificación en
un secuenciador automático utilizando uno de los cebadores marcados con fluores
cencia, así se obtiene una mayor resolución y se permite la separación de fragmentos
de u na base (fig. 1 2 - 2 ).
ANÁLISIS DE LOS GENES DE FUSIÓN

En la tabla 12-1 se describen las translocaciones más frecuentes en leucemias con sus
correspondientes genes de fusión. Existen múltiples protocolos para el análisis de es
tos genes de fusión, pero los más estandarizados han sido los diseñados por el grupo
BIOMED-1.
En conjunto, todos ellos se basan en la obtención de ARN a partir de las células
tumorales, la realización del proceso de retrotranscripción para obtener ADNc, seguido
de la realización de una PCR, si es una muestra al diagnóstico, o la realización de una
PCR anidada si se está analizando una enfermedad m ínima residual.
La reacción de PCR se acostumbra a realizar en un volumen final de 25 a 50 (xl, a
partir de 2-3 (xl de ADNc (10-15% del producto de la retrotranscripción), 400 nm de los
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TABLA 12-1. Genes de fusión y transcritos típicos en hemopatías malignas
Translocación Gen de fusión Transcritos

t(l;19)(q23,pl3.3) E2A-PBX1 E2A-PBX1
Variante E2A-PBX1 (+27 nucleótidos)
t(4;ll)(q21;q23) MLL-AF4 e8e7, e8e4, e9e5, e9e4, elOeó, el0e5, el0e4,
e lle 6 ,e lle 5 ,e lle 4
t(8;21)(q22;q22) R U N X-R U N X 1T 1 e5e2
(AM L1-ETO )
t(9;22)(q34;qll.2) BCR-ABL P190 ela2, ela3 (raro)
BCR-ABL P210 el3a2,el4a2
b3a3 y b2a3 (raros)
t( 12,21) (p 13;q22) ETV6-RU N X1 e5e3
(TEL-AM L1) Variante pérdida exón 2 (39pb) AML1
t(15;17)(q22;ql2) PM L-RARA BCR1
BCR2
BCR3
invl6(pl3;lq22) CBFB-M YH11 Tipo A 85%, tipo D 5%, tipo E 5%, resto
t(16;16)(pl3.1;q22) de casos aislados B, C, F, G, H, I, J
cebadores, 200 (jlM dNTP, el tam pón específico de la PCR, MgCl2 de 2 mM y 1 U de

Taq-polimerasa en un volumen de 50 (xl. Las condiciones estándar de la PCR son: 5 min
a 95 °C para la desnaturalización, y 35 ciclos que consisten en 30 s a 94 °C, 60 s a 65 °C
y 60 s a 72 °C. Si es necesario realizar una segunda ronda de la PCR se realiza a partir
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de 1 |xl del producto amplificado en la primera PCR, con el m ismo volumen, reactivos
y condiciones que en la primera PCR utilizando los cebadores específicos más internos
para cada reacción.
ANÁLISIS DE CLONALIDAD
En la mayoría de los procesos linfoproliferativos la histomorfología o citomorfología,
conjuntamente con la inmunohistoquímica o la citometría de flujo, permiten discriminar
entre un proceso linfoide reactivo o tumoral, pero hay un 5-10% de casos en los que su
diagnóstico es complicado y el análisis de clonalidad por métodos moleculares es básico.
El 90-95% de las hemopatías malignas linfoides son de estirpe B, del 5 al 7% de casos
de estirpe T y menos del 2% de origen NK (tabla 12-2). El análisis de reordenamientos
en las inmunoglobulinas (Igs) se utilizarán para detectar clonalidades de estirpe B y
los reordenamientos en los receptores de células T (TCR) se utilizarán para detectar
clonalidades de estirpe T.
En las Igs, los segmentos variables (VH) contienen tres regiones (FR) y dos regiones
determinantes de complementariedad (CDR). Las regiones FR son muy similares entre
los segmentos VH, m ientras que las regiones CDR son diferentes incluso dentro de la
misma familia. Estas regiones CDR son los lugares preferidos para las hipermutaciones
somáticas que tienen lugar durante la reacción de centro germinal. La región V-D-J
se amplifica m ediante PCR, y se puede amplificar la región FR1 (amplificación de un
fragmento de 310 a 260 pares de bases), la región FR2 (amplificación de un fragmento
de 250 a 295 pares de bases) y la región FR3 (amplificación de un fragmento de 100
a 170 pares de bases). La amplificación de la región FR3 es la más utilizada en ADN
obtenido de m aterial fijado e incluido en parafina, debido a que se amplifica un
fragm ento de m enor tam año. Los reordenam ientos V 7 -J 7 de la cadena 7 del TCR
(TCR-7 ) y los reordenam ientos V 0-J0 y D(3-J3 de la cadena (3 (TCR-pS) son los es
tudios preferidos para el análisis de clonalidad de estirpe T. La cadena 7 se reordena
en los prim eros estadios del reordenam iento T, pero tiene el inconveniente de que
nos puede dar falsos positivos debido a la baja variabilidad en reordenam ientos
com parado con la cadena (3. Las secuencias consenso se encuentran perfectamente
descritas y estandarizadas.
El estudio completo de los reordenamientos permite definir la estirpe de práctica
mente todas las hemopatías malignas linfoides.
TABLA 12-2. Leucemias y linfomas. Estirpe celular
Línea
B T NK
Leucemia aguda linfoblástica (LAL):
Niños (%) 82-96 14-18 <1
Adultos (%) 75-80 20-25 <1
Leucemia linfática crónica (LLC), % 95-97 3-5 1-2
Linfoma no hodgkiniano (LNH):
Nodal (%) 95-97 3-5 <2
Extranodal (%) 90-95 5-10 <2
Piel (%) 30-40 60-70 <2
Mieloma múltiple (%) 100 0 0
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CUANTITATIVA

O A TIEMPO REAL
En una reacción de PCR, el producto amplificado se detecta a partir de un determinado
ciclo, a partir del cual hay una producción exponencial del producto amplificado. En el
punto final de la reacción, pequeños cambios de los componentes de la reacción pueden
dar lugar a grandes cambios en el producto final detectado, por lo que se llegó a la con
clusión de que la reacción de PCR no era útil para cuantificar el producto amplificado,
sino que era solamente un proceso cualitativo. Para solucionar estos problemas se han
desarrollado técnicas de PCR cuantitativas que se basan en realizar ensayos de detección
del producto amplificado mientras se realiza la reacción de PCR. Esta metodología es la
que se denomina reacción de PCR a tiempo real. En la tecnología de PCR cuantitativa o
PCR a tiempo real, mediante un sistema de detección de fluorescencia, se considera que
hay una relación directa entre las copias del ADN problema que se debe amplificar y el
prim er ciclo donde se detecta el producto amplificado. Por lo que se acaba de comentar,
en la PCR a tiempo real surgirá el concepto de cycles threshold (Ct), que es el prim er
ciclo donde se detecta la señal procedente del proceso de amplificación y el punto que se
utiliza para la cuantificación del producto amplificado, aunque la detección se produzca
a tiempo final (fig. 12-3).
Para la detección de la señal se utilizan sondas m arcadas con fluorocrom os o el
agente intercalante fluorescente silver green. U no de los sistemas más utilizados es
el sistema Taqman, que utiliza un fragmento de 20 a 30 pares de bases marcado con dos
fluorocromos: uno es el reporter, el otro, el quencher. Cada uno de estos fluorocromos
estabiliza al otro, de manera que si no se híbrida no hay producción neta de fluorescencia.
Cuando tiene lugar la reacción de polimerización, la sonda se híbrida con el producto
que se va a amplificar y cuando la polim erización llega donde se halla la sonda, se
produce la hidrólisis de la sonda debido a la actividad 5' nucleasa de la Taq-polimerasa,
y el reporter emite la fluorescencia. Esta fluorescencia será la que perm itirá calcular la
cantidad proporcional de producto amplificado. Si se utiliza Silver Green se cuantifica
todo el ADN de doble cadena que se haya generado en la reacción. En oncohematología
Amolificación - 22 de febrero
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Ciclo
FIGU RA 12-3. Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o a tiempo real.
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la PCR cuantitativa o PCR a tiem po real tiene una gran aplicación en la detección y
cuantificación de la enfermedad residual mínima. Asimismo, es una forma mucho más
cómoda y precisa para el análisis de la expresión de genes que la técnica de Northern
blot o la RT-PCR convencional. En la actualidad, se disponen de protocolos específicos
y estandarizados para el análisis de la enfermedad mínim a residual en leucemias que
presentan los genes de fusión más frecuentes. Para ello se sigue el mismo proceso de
retrotranscripción descrito anteriormente, y la reacción de PCR cuantitativa se realiza
utilizando una mezcla de PCR universal (PCR master m ix), una concentración de
cebadores de 300 nm y una concentración de la sonda de 200 nm. Las condiciones de
la PCR cuantitativa son las universales, que consisten en un precalentamiento de 2 min
a 50 °C, la activación de la Taq-polimerasa a 95 °C durante 10 min, seguido de 40-50
ciclos de 15 s a 95 °C y 1 m a 60 °C. Se han descrito las secuencias de los cebadores y de
las sondas estandarizadas para los genes de fusión más frecuentes. Asimismo, existen
curvas estándar específicas para cada gen de fusión que permiten calcular su número de
copias. Generalmente, el resultado se expresa como u n ratio entre el número de copias
del gen problema y un gen control.
ANÁLISIS DE MICROSATF.T.ITES PARA EL ESTUDIO

DE QUIMERISMO
Los microsatélites o short tandem repeats (STR) son fragmentos de ADN presentes
en todos los individuos, pero que poseen la característica de ser altamente variables o
polimorfos entre los mismos. El análisis de un determinado número de estas secuencias
o fragmentos de ADN perm ite identificar a un individuo con una probabilidad muy
cercana al 100%. Además de ser muy polimorfo, es un ADN no codificante por lo que no
revela características fenotípicas de los individuos. Para analizar dichos polimorfismos
del ADN, se utilizan una serie de técnicas que están en continua evolución, consiguiendo
que cada vez la identificación sea más precisa y rápida. En oncohematología, el análisis
de estos polimorfismos tiene gran interés para el análisis del quimerismo en el tras
plante alógeno. Se define como quimerismo el estado inmunogenético caracterizado
por la coexistencia en un mismo organismo de poblaciones celulares originarias en
dos individuos genéticamente distintos. Inicialmente, para el análisis del quimerismo
se analizaban los antígenos séricos, las enzimas eritrocitarias y el sistema HLA. En la
actualidad, el análisis del quim erism o en el trasplante alógeno se realiza m ediante
la amplificación de diversos STR. Para ello se realiza una reacción de PCR con múltiples
cebadores marcados con fluorocromos (multiplex PCR) y los fragmentos amplificados
se analizan mediante un secuenciador automático. De esta manera podemos analizar el
tamaño y conocer la cantidad del fragmento amplificado. Se pueden separar en un mismo
pocilio diferentes fragmentos de distintos tamaños, marcados además con diferentes
fluorocromos (fig. 12-4). Al ser conveniente realizar la amplificación de diferentes STR,
es muy recomendable la utilización de kits comerciales que en una única PCR amplifican
un gran número de STR.
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1 I ' " 11" 1' I " " I ' 11 11 111 1I " " I 1 " 1I 11 1' I ' ' " 11 ' 1 1I 1" 1 I " " I 1 1
210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270
S am ple 3 3 Blue LADDER
' I " " I 11 1 1 I '

210 215 220 225 230 235 240 245 250 255
JJlJ
" I 1 11 1 I " ' I 1 1" I 11 1 1 I 1' 11 I " 11 I ' 1 1 1 I " 1 1 I " 1 1 I 1
260 265 270
Receptor
- 1.000
-5 0 0
- 1.500
- 1.000
-5 0 0
Receptor 1 mes postrasplante
-8 0 0
UdI
-6 0 0
-4 0 0
-200
Receptor 3 meses postrasplante
FIGURA 12-4. Análisis de microsatélites.
Gabert J, Beillard E, Van der Velden VH, Bi W, Grimwade D, Pallisgaard N, et al. Standardization and
quality control studies o f ’real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction
o f fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer
program. Leukemia 2003;17(12):2318-57.
Van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, et al. Standardized RT-PCR
analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection
o f m inimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of
minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13(12): 1901-28.
Van Dongen JJ, Langerak AW, Brüggemann M, Evans PA, Hummel M, Lavender FL, et al. Design
and standardization o f PCR primers and protocols for detection o f clonal immunoglobulin and
T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report o f the BIOMED-2
Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003;17(12):2257-317.
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Capítulo 12 Métodos de biología m olecular en hematopatología 3 3 6 .e l
Autoevaluación
1. El ADN debe conservarse:
(a) Siempre a tem peratura ambiente.
(b) Siempre a 4 °C.
(c) Siempre a -2 0 °C.
(d) Siempre a -8 0 °C.
(e) Puede conservarse en nevera pero es mejor congelarlo a -2 0 °C.
Respuesta razonada: para períodos largos el ADN es mejor conservarlo a -2 0 °C.
2. La longitud de onda donde absorben las bases púricas y pirimidínicas que componen los
ácidos nucleicos es:
(a) 340 nm.
(b) 280 nm.
(c) 260 nm.
(d) Luz visible.
(e) 420 nm.
Respuesta razonada: las bases púricas y pirim idínicas que com ponen los ácidos nucleicos
absorben a 260 nm.
3. La enzima que se necesita en la reacción de PCR es:
(a) Cualquier ADN polimerasa.
(b) ADN sintetasa.
(c) ADN amplicasa.
(d) ADN polimerasa termoestable.
(e) ADNsa.
Respuesta razonada: para la reacción de PCR se necesita una ADN polimerasa termoestable como
es la TAQ polimerasa que resiste los pasos de desnaturalización e hibridación.
4. La PCR es una técnica de amplificación de ADN:
(a) Cuantitativa.
(b) Cualitativa.
(c) Cuantitativa y cualitativa.
(d) Ni cualitativa ni cuantitativa.
(e) No amplifica ADN, sino ARN.
Respuesta razonada: la técnica de PCR es una técnica cualitativa; para poder realizar la técnica
de PCR cuantitativa se ha desarrollado la técnica de PCR a tiempo real.
5. En la PCR cuantitativa tenemos en cuenta:
(a) El producto amplificado a tiem po final.
(b) El prim er ciclo donde se detecta producto amplificado.
(c) El producto amplificado en el ciclo 20.
(d) La cantidad de fluorescencia a tiem po final.
(e) La cantidad de fluorescencia al ciclo 20.
Respuesta razonada: en la tecnología de PCR cuantitativa o PCR a tiem po real, mediante un sis
tema de detección de fluorescencia, se considera que hay una relación directa entre las copias del
ADN problema que se debe amplificar y el prim er ciclo donde se detecta el producto amplificado,
por lo que mediante softwares específicos se calculará este ciclo donde hay una correlación directa
con el producto amplificado.
6. El material de partida para el análisis de genes de fusión en leucemias m ediante PCR es:
(a) ARN.
(b) ADN.
(c) Proteína.
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(d) A R N o AD N .
(e) Todas son ciertas.
R espuesta correcta: a.
R espuesta razonada: los genes d e fusión deben analizarse m ed ian te A R N , ya q u e m ediante A D N
la zona genóm ica d o n d e tien e lugar la tran slo c ació n es m u y g ra n d e y es m u y difícil de analizar.
7. Los estu d io s de clonalidad son útiles para:
(a) La detección de genes de fusión.
(b) La detección de m utaciones.
(c) La detección de anom alías crom osóm icas.
(d) La detección de la estirp e celular.
(e) La detección de deleciones.
R espuesta correcta: d.
R espuesta razonada: los estudios de clonalidad son útiles para la detección de u n a célula leucé
m ica linfoide q u e sea d e estirp e celular B o T.
8. Los estu d io s de m icrosatélites en onco h e m ato lo g ía so n útiles para:
(a) La detección de m utaciones.
(b) La detección de quim eras después del trasp la n te hem atopoyético.
(c) La detección de anom alías crom osóm icas.
(d) La detección de células tum orales.
(e) La detección de genes de fusión.
R espuesta correcta: b.
R espuesta razonada: en onco h e m ato lo g ía , el análisis d e m icrosatélites tie n e g ra n interés p ara
el análisis d e q u im e ris m o en el tra s p la n te alogénico. Se defin e c o m o q u im e ris m o el estado
in m u n o g e n é tic o ca ra c te riz a d o p o r la co e x iste n cia en u n m ism o o rg a n is m o d e p o b lac io n e s
celulares originarias en d os in d iv id u o s genéticam ente distintos.
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C A P Í T U L O 13
Métodos para la clasificación

de las hemopatías malignas
J. F. N o m d e d é u
INTRODUCCIÓN
Las neoplasias hematológicas constituyen un grupo amplio y heterogéneo de procesos
tum orales que afectan a los elementos celulares de la m édula ósea y de los órganos
linfoides periféricos. Con frecuencia presentan expresión hemoperiférica, lo que cons
tituye una ventaja para estudiarlos debido a la facilidad del acceso a la sangre mediante
una simple venopunción. La clasificación actualmente en uso se estableció por un grupo
amplio de expertos internacional bajo los auspicios de la Organización M undial de la
Salud (OMS). Los criterios por los que se agrupan los diferentes procesos atienden a
datos clínicos, morfológicos, inmunofenotípicos y a la información genética obtenida
mediante estudios de citogenética y biología molecular. Esta aproximación tiene el
interés de proporcionar entidades reconocidas, a m enudo con claras implicaciones
terapéuticas y pronosticas, ser sensible a las diferentes vías histogénicas de evolución
de los procesos tumorales y, desde un punto de vista práctico, ha servido para organizar
los laboratorios de hematología en muchos de nuestros hospitales m ediante la im-
plementación de áreas metodológicas específicas centradas en cada una de las técnicas
antes mencionadas.
El diagnóstico de las neoplasias hematológicas en 2013 se basa en una correcta
identificación de los síntomas y signos del paciente, la caracterización de las células
anormales, el perfil antigénico de dichas células y el estudio extensivo con toda la meto
dología disponible (citogenética convencional, técnica de hibridación in situ fluorescente
[FISH], técnicas de reacción en cadena de la polimerasa [PCR], análisis mutacional,
secuenciación directa) de las lesiones genéticas que albergan dichas células tumorales.
Antes de pasar a describir las diferentes entidades, se harán algunas consideraciones
sobre las diferentes áreas diagnósticas.
M orfología
Constituye el elem ento central y vertebrador de los laboratorios de hematología.
El reconocimiento de elementos celulares anormales mediante microscopía óptica fue la
primera técnica empleada y no ha sido desplazada con el advenimiento de otras metodo
logías. Requiere, en primer lugar, de la experiencia de un profesional altamente cualificado
y que a la vez sepa detectar las limitaciones y utilizar de forma juiciosa las exploraciones
complementarias. Es vital contar con los frotis de sangre periférica bien realizados (valora
ción de la morfología eritrocitaria, plaquetas, granulación en la serie neutrófila, presencia
de inclusiones) y de las extensiones teñidas de los grumos celulares de la médula ósea. El
estudio medular mediante aspirado o biopsia (cuadro 13-1) es la exploración principal

ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 13-1. Clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) 2008

de procesos neoplásicos mieloides
C la s if ic a c ió n d e l a O M S d e n e o p l a s i a s m i e l o i d e s y le u c e m i a s a g u d a s
• N e o p la s ia s m ie lo p ro life ra tiv a s (N M P ): s ín d ro m e s m ie lo p ro life ra tiv o s
• N e o p la s ia s m ie lo id e s y lin fo id es a s o c ia d a s a eo sin o filia y a n o m a lía s d e P D G F R A ,
P D G F R B o F G FR 1
• S ín d ro m e s m ie lo d isp lá s ic o s /m ie lo p ro life ra tiv o s (S M D /N M P )
• S ín d ro m e s m ielo d isp lá sic o s
• L eu c em ia m ie lo id e a g u d a
• L eu c em ias a g u d a s c o n a m b ig ü e d a d d e lín ea
• L e u c e m ia /lin fo m a lin fo b lá s tic o B
• L e u c e m ia /lin fo m a lin fo b lá s tic o T
del diagnóstico hematológico. En casos de punción seca y obtención de cilindros óseos,

la realización de improntas por rodamiento y la posterior tinción pueden ser altamente
informativas. El morfólogo debe ser capaz de evaluar los grados de tinción insuficientes
o excesivos y valorar la posible aparición de artefactos que puedan entorpecer el correcto
reconocimiento de formas patológicas. Las tinciones más habitualmente empleadas son
la de May-Grünwald/Giemsa, la tinción de Perls para la identificación de los depósitos
de hierro en los precursores eritroides y en los macrófagos, y las tinciones de citoquímica
para la mieloperoxidasa, las esterasas (a-naftil-acetato-esterasa, butirato-esterasas y
cloroacetato-esterasa) con su inhibición por flúor y la técnica de PAS.
Se debe proceder con una sistemática clara, ya que el enemigo del morfólogo es la pre
cipitación y el diagnóstico irreflexivo que pueden conducir a errores de interpretaciones
de consecuencias graves para el paciente. En prim er lugar, se debe contar con los datos de
la inform ación clínica relevante (breve historia clínica, antecedentes hematológicos,
presencia de esplenomegalia, tratam ientos farmacológicos, etc.). Los procedimientos
de punción y biopsia se efectuarán con el correspondiente consentimiento informado
y estableciendo los posibles usos de los materiales obtenidos en línea con las directrices
de los comités de ética hospitalaria y las recomendaciones de la Sociedad Española de
Hematología. También conviene registrar los datos referentes al proceso de extracción
de la médula ósea (punción seca en la mielofibrosis, la tricoleucemia o en las neoplasias
solidas; consistencia disminuida en casos de mieloma o de metástasis). En la médula
se ha de valorar la celularidad total y su distribución, el número y las características de
megacariocitos, la ratio mieloeritroide, la presencia de anormales (acúmulos celulares
de células cohesivas, elementos blásticos, parásitos intracelulares) y realizar un recuento de
al menos 500 células en las extensiones de mayor calidad. A continuación, se valorarán
las tinciones de hierro valorando los niveles de este en el sistema macrofágico y la pre
sencia de sideroblastos (el tipo, si se han observado en anillo y su porcentaje). En casos
seleccionados con el diagnóstico de leucemia aguda se realizarán las técnicas citoquímicas
más arriba comentadas.
El área de morfología es un terreno de encuentro para los diferentes profesionales
del laboratorio y donde cristaliza el proceso de diagnóstico integrado de las neoplasias
hematológicas. Por este motivo representa u n lugar privilegiado para la formación de
residentes en la que captan la complejidad y riqueza de los datos que aporta la micros
copía. El morfólogo está capacitado para evaluar la presencia de elementos atípicos en
líquidos biológicos (líquido cefalorraquídeo, ascítico, pleural).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 13 Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas 339
Inm unofenotipo
Mediante el estudio inmunofenotípico entendemos el análisis del patrón antígeno de
las células anormales. Se puede dividir en: estudio inmunohistoquímico realizado sobre
biopsias y propio de los estudios de linfomas y en algunos casos de estudio de cilindros
de biopsia ósea, las técnicas de inmunocitoquímica realizadas para analizar la presencia de
algunos elementos celulares atípicos (serie megacariocítica, eritroide, células de Hodgkin,
células linfomatosas) sobre extensiones medulares o de líquidos y el inmunofenotipo
en suspensión mediante citometría de flujo. Esta última área es la que concierne más
directamente al hematólogo. El desarrollo de instrumentos de análisis (citómetros de
flujo) de alto rendimiento y sencillo manejo, la disponibilidad de multitud de anticuerpos
monoclonales conjugados con fluorocromos estables y la simplificación del software de
análisis ha permitido la generalización de estas técnicas. Las principales aplicaciones en
hematología son: el establecimiento de línea en las leucemias agudas (leucemias mieloides
agudas, linfoides, híbridas), la definición del grado de maduración de las leucemias, la
identificación de los diferentes grados de heterogeneidad celular en las leucemias agudas
y los distintos fenotipos aberrantes para realizar el estudio de la enfermedad residual
mínima, el estudio de la infiltración leucémica en líquidos (p. ej., células TdT positivas
en LCR), la detección en algunos casos de la presencia de proteínas quiméricas (p. ej.,
bcr-abl), el recuento de las poblaciones linfoides asociado al test de clonalidad B como
cribado de procesos linfoproliferativos B, el establecimiento de los patrones antígenos
característicos en los síndromes linfoproliferativos B y T, la detección de células plas
máticas con fenotipos aberrantes en casos de plasmocitosis m edular de significado
incierto y la identificación de células con morfología no clara. Debido a la potencia
de análisis (es capaz de analizar más de un millón de células en muy poco tiempo), la
citometría de flujo está especialmente capacitada para la investigación de células raras
como pueden ser las stem-cell normales y leucémicas. También se utiliza la citometría
en los análisis de los proceso de apoptosis, en la cuantificación del contenido de ácidos
nucleicos y otras aplicaciones funcionales (citocinas intracelulares, proliferación, flujos
de calcio y fosfoproteínas citoplasmáticas).
Estas técnicas dependen de un personal cualificado y meticuloso, en los procedimien
tos de mareaje, incubación, adquisición (tantos acontecimientos como sea necesario y
posible) e interpretación. La posibilidad de combinar múltiples anticuerpos gracias a
la aplicación de dos o más fuentes de láser y fluorocromos con espectros no solapados
y estables hace que nos encontrem os delante de un área todavía infrautilizada. Una
limitación importante es el coste de los reactivos.
Citogenética convencional y m olecular

La presencia de un citogenetista experto es básica en un laboratorio de hematología. La
citogenética constituye un grupo de técnicas extremadamente laboriosas y que dependen
de la experiencia en el reconocimiento de las diferentes alteraciones. El proceso tumoral
afecta a las células somáticas, por lo que las alteraciones citogenéticas no se encuentran
en todas las células analizadas. Esta consideración establece la diferencia fundamental
con la citogenética constitucional. Al mismo tiempo, exige de unos estándares de análisis
mucho más estrictos a la hora de establecer el cariotipo en las neoplasias hematológicas
(exigencias de un núm ero de metafases alto y las definiciones de clona). M uchas de
las alteraciones pueden ser m uy difíciles de identificar (formas crípticas, inversión del
cromosoma 16, microdeleciones, cromosomas marcadores), por lo que se requiere el
auxilio de las sondas fluorescentes específicas (técnicas de hibridación in si tu). Además,
ERRNVPHGLFRVRUJ
recientemente se han incorporado en estas áreas los procedimientos de análisis masivo

(hibridación genómica comparada [arrays]) que permiten analizar las zonas de pérdida
y de ganancia cromosómica. También se ha avanzado m ucho en los sistemas de captura
de metafase y de los núcleos de interfase con señales fluorescentes.
Biología m olecular
Los laboratorios de biología molecular hematológica se han beneficiado del desarrollo
de las técnicas basadas en la PCR aplicadas al diagnóstico y el seguimiento de leucemias
agudas. Las iniciativas de ámbito europeo, como las del grupo BIOMED, han permitido
estandarizar y disponer de resultados reproducibles en el estudio de la clonalidad B y
T, la detección de los genes de fusión más importantes en leucemias agudas y los sín
dromes mieloproliferativos crónicos: bcr-abl, PML-RARa, AML1 -ETO, CBFb-MYHl 1,
Tel-AM Ll, E2A-PBX, AF4-MLL. El reconocimiento de otras lesiones genéticas hace
que el análisis de las mutaciones de NPM, CEBPa, FLT3, WT1, IDH1, IDH2, DNMT3a
en leucemias mieloides agudas, el estudio de las mutaciones de abl en casos de LMC
tratados con inhibidores de tirosina cinasa, la investigación de las mutaciones de c-kit, los
reordenamientos de PDGFRa en casos con proüferaciones de eosinófilos o de mastocitosis
sistémica y el análisis del patrón mutacional de la porción variable de las cadenas de
inmunoglobulinas en casos de LLC sean considerados de rutina en la mayor parte de labo
ratorios especializados. El reconocimiento de las mutaciones de JAK2, tanto V617F como
en el exón 12, y las mutaciones de MPL en casos atípicos de trombocitopenia esencial, han
cambiado el diagnóstico de los SMPC. Sin embargo la avalancha de información genética
disponible en casos de linfomas de célula grande, leucemias linfoblásticas agudas de línea B
(deleciones de IKZF, mutaciones de JAK2, mutaciones de PAX, reordenamientos con
múltiples genes quiméricos), y T (alteraciones en la vía de NOTCH, reordenamientos
NUP-abl) y más recientemente en casos de LMMC (TET2, ASXL1, c-CBL, p53) y otros
síndromes mielodisplásicos (mutaciones en los genes que participan en el proceso de
splicing, como SF3B1) hace necesario que los instrumentos de secuenciación masiva se
incorporen de forma rápida a los laboratorios de hematología para poder establecer una
precisa información diagnóstica y pronóstica. Es de prever que, de forma relativamente
próxima, se adapte la clasificación de la OMS a la nueva información disponible, que al
mismo tiempo ha permitido identificar prometedoras dianas terapéuticas.
NEOPLASIAS LINFOIDES Y MIELOIDES AGUDAS: LEUCEMIAS

Las leucemias agudas humanas son proliferaciones tumorales adquiridas que se originan
en los precursores inm aduros linfoides, mieloides o de stem-cell (células madre) con
capacidad de diferenciación multilínea y alteración del proceso de hematopoyesis normal.
Se pueden dividir principalmente en mieloides (LMA) y linfoides (LLA). Las LMA
son más frecuentes en adultos mientras que las LLA, especialmente las de línea B, son
más comunes en la infancia (v. cuadro 13-1).
Tradicionalmente, las leucemias agudas se clasificaban siguiendo criterios exclusi
vamente morfológicos e histoquímicos, establecidos por el grupo cooperativo fran-
coam ericano-británico (FAB) (tabla 13-1). Esta clasificación ha servido de lenguaje
común hematológico durante muchos años y ha permitido sentar las bases de las nuevas
clasificaciones. La principal diferencia respecto a la clasificación de la OMS (2008) reside
en la cifra de blastos para considerar leucemia aguda (el 30% en FAB y el 20% en OMS)
y la consideración de las lesiones citogenéticas y moleculares (cuadro 13-2).
ERRNVPHGLFRVRUJ
I TABLA 13-1. Clasificación délas leucemias del grupo cooperativo

francoamericano-británico (FAB)
Tipo Definición Frecuencia Características

LMA M PO positiva
MO N o diferenciada 2-5% <3% blastos M PO +; m ieloides p o r INM
(inm unoperoxidasa+, CD 13+, C D33+) o UE (M PO
UE)
MI Sin m aduración 15-20% > 3 % blastos M P O +, en general sin granulación
M2 C on m aduración 25-30% > 3 % blastos M P O +, más del 10% con granulación.
Variedad con basofilia (M2Ba)
M3 Promielocítica 10-15% Intensa granulación, astillas citoplasmáticas.
H L A -D R -. Variedad m icrogranular o hipogranular
(M3v)
M4 M ielom onocítica 25-30% C om o M2 pero con > 20% prom onocitos, esterasas
inespecíficas+. Variedad con eosinofilia M O (M4Eo)
M5 M onocítica 10-15% M onoblastos (M 5a) o prom onocitos (M5b).
M ieloblastos < 20%. Esterasas+, CD14+, C D llb +
M6 Eritroblástica 3-4% Eritroblastos M O 50%; > 30% células no
eritroides son blastos (eritroblastos glucoforina+ o
mieloblastos)
M7 M egacarioblástica 1% Blastos con IN M (CD41+, CD61+) o UE indicativos
de estirpe plaquetaria. Mielofibrosis asociada
LLA M PO negativa
L1 Adultos 31% Células pequeñas; crom atina heterogénea, núcleo
N iños 80% irregular con nucléolos; citoplasma escaso; ligera
basofilia citoplasmática; vacuolización variable
L2 Adultos 60% Células grandes de tam año heterogéneo; crom atina
N iños 17% variable heterogénea; núcleo regular sin nucléolos;
citoplasm a variable; basofilia citoplasm ática variable;
vacuolización variable
L3 Burkitt Adultos 9% Células grandes de tam año heterogéneo; crom atina
N iños 3% hom ogénea y en punteado; núcleo regular
con nucléolos; citoplasm a abundante; basofilia
citoplasm ática intensa; vacuolización intensa
Basada en criterios morfológicos y citoquímicos. En ciertos casos son precisos estudios de inmunofenotipo (INM)
o ultraestructurales (UE) para establecer el diagnóstico. En todas las variedades, salvo en la LMA-M3 y en la LMA-M6,
se exige que la proporción de blastos en m édula ósea (M O) sea >30% .
MPO, mieloperoxidasa.
Para establecer la línea afectada en una leucemia aguda, además de la tradicional reac
ción citoquímica de la mieloperoxidasa, se deben emplear criterios inmunofenotípicos
como el establecido por el grupo EGIL (tabla 13-2) en la década de los noventa. Según
este esquema, la reactividad de más de dos puntos en una determinada línea define la
afectación diagnóstica y sirve para establecer criterios reproducibles en los casos de
leucemias agudas bifenotípicas.
En la leucemia existe una alteración de la célula progenitora que genera su prolifera
ción incontrolada y un acúmulo en el espacio medular. Ello conlleva tres complicaciones
importantes:
• Insuficiencia m edular por infiltración blástica y desaparición de la hematopoyesis
normal.
• Disminución de la inmunidad por falta de leucocitos.
• Organomegalias por aumento del tamaño del hígado, el bazo o los territorios gan-
glionares.
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 13-2. Clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS)

de las leucemias mieloides agudas (LMA) y trastornos asociados
• N e o p la s ia s m ie lo id e s re la c io n a d a s c o n el tr a ta m ie n to
• L eu c em ia m ie lo id e a g u d a c o n a lte ra c io n e s g en é tic as re c u rre n te s
• L M A c o n t(8 ;2 1 )(q 2 2 ;q 2 2 ); R U N X 1 -R U N X 1 T 1
• L M A c o n in v (1 6 )( p l3 .1 q 2 2 ) o t(1 6 ;1 6 )(p l3 .1 ;q 2 2 ) C B F B -M Y H 11
• L M A c o n t(1 5 ;1 7 )(q 2 2 ;q l2 ) P M L -R A R A
• L M A c o n t( 9 ;ll) ( p 2 2 ; q 2 3 ) M L L T 3-M L L
• L M A c o n t(6 ;9 )(q 2 3 ;q 3 4 ) D E K -N U P 2 1 4
• L M A c o n in v (3 )(q 2 1 q 2 6 .2 ) o t(3 ;3 )(q 2 1 ;q 2 6 .2 ) R P N 1 -E V I1
• L M A m e g a c a rio b lá stic a c o n t ( l ; 2 2 ) ( p l 3 ; q l 3 ) R B M 15-M K L 1
• E n tid a d p ro v is io n a l: L M A c o n m u ta c io n e s d e N P M 1
• E n tid a d p ro v isio n al: L M A c o n m u ta c io n e s d e C EBPA
• L eu c em ia m ie lo id e a g u d a c o n c a m b io s re la c io n a d o s c o n la m ie lo d isp la s ia
• L eu c em ia m ie lo id e a g u d a , n o e sp e cifica d a
• L M A c o n m ín im a d ife re n c ia c ió n
• L M A s in d ife re n c ia c ió n
• L M A c o n d ife re n c ia c ió n
• L M A m ie lo m o n o c ític a
• L M A m o n o b lá s tic a /m o n o c ític a
• L eu c em ia a g u d a e ritro id e : le u c e m ia e r itr o id e p u r a y e ritro le u c e m ia e ritr o id e /m ie lo id e
• L eu c em ia m e g a c a rio b lá stic a ag u d a
• L eu c em ia b aso filica ag u d a
• P an m ie lo s is a g u d a c o n m ielo fib ro sis
• S a rc o m a m ie lo id e
• P ro life ra c io n e s m ie lo id e s re la c io n a d a s c o n el s ín d ro m e d e D o w n
• M ie lo p o y esis a n o r m a l tra n s ito ria
• L eu c em ia m ie lo id e as o c ia d a c o n el s ín d ro m e d e D o w n
• N e o p la s ia s blá stic a s d e células d e n d rític a s p la s m o c ito id e s
Las leucemias agudas constituyen una forma grave de hemopatía maligna que deben
ser identificadas y diagnosticadas de forma rápida y precisa en el laboratorio de hema
tología. Etiológicamente, son proliferaciones de progenitores hematopoyéticos (blastos)
que infiltran la médula ósea e impiden el normal crecimiento y la diferenciación de las
células hematopoyéticas normales. La mayoría de las veces invaden también la sangre
periférica y en algunos casos otros órganos. Básicamente, en las leucemias agudas exis
te un stop madurativo con proliferación anormal. Este proceso puede tener lugar de
manera más o menos rápida, aunque en general es progresiva y requiere cierto tiempo
para que se inicien las manifestaciones clínicas. La invasión de la médula ósea por los
blastos leucémicos suele ser causa de insuficiencia medular con aparición de pancitopenia
clínicamente evidenciada por anemia, púrpura o petequias (trombocitopenia) y fiebre
(neutropenia). Junto a los síntomas anteriores, suele aparecer un síndrome tóxico con as
tenia, anorexia y pérdida de peso. Algunas veces, especialmente en las leucemias de origen
linfoide, puede observarse también un síndrome tum oral con hepatoesplenomegalia,
adenopatía y dolores óseos.
La etiología de la leucemia aguda se desconoce, pero ayudan a su desarrollo factores
genéticos (gemelos, Down, Klinefelter, Fanconi), inmunodeficiencias, factores ambien
tales (fármacos derivados del benzol, sustancias mielotóxicas, radiaciones ionizantes,
radioterapia e infecciones por virus, en especial por retrovirus).
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Puntuación Linfoide B Linfoide T Mieloide

2 CD79a-cit CD3 (m em b o cit) M PO
IgM-cit Anti-TCR
CD22-cit
CD19 CD2 CD117
CD20 CD5 CD13
CD10 CD8 CD33
CD10 CD65
0,5 TdT TdT CD 14
CD24 CD7 CD15
C D la CD64
El estudio de la leucemia aguda en el laboratorio se fundam ente en dos aspectos

básicos:
1. El hemograma con examen de la morfología celular. El signo más característico
suele ser la intensa anemia, de carácter prácticamente siempre arregenerativo y que
se acompaña de una concentración variable de leucocitos (disminuida, normal o
aumentada), células blásticas circulantes y casi siempre trombocitopenia intensa
(< 20 X 1071).
2. El examen morfológico de la m édula ósea. M uestra una sustitución variable,
aunque generalmente absoluta, de la hematopoyesis normal por células blásticas
con una práctica desaparición de los megacariocitos.
El diagnóstico diferencial de leucemia aguda debe establecerse con otras causas de
insuficiencia medular, principalmente la aplasia medular, la mielodisplasia y otros cua
dros de insuficiencia medular.
• A plasia m edular. Pancitopenia sin presencia de formas inmaduras. Ausencia de
adenopatías, esplenomegalia o hepatomegalia. Aspirado medular «blanco» y biopsia
ósea hipocelular (v. capítulo 8).
• M ielodisplasia. Considerada durante mucho tiempo como un estado preleucémico,
presenta características morfológicas y clínicas muy similares a las leucemias agudas
pero con una evolución mucho más larga (síndrome mielodisplásico).
• O tros cuadros de insuficiencia medular. Como la mielofibrosis idiopática (síndrome
mieloproliferativo crónico) o la mieloptisis (metástasis de la médula ósea por células
tumorales).
Algunas entidades reconocidas en la clasificación se exponen a continuación.
Leucemia m ieloide aguda con t(8;21)(q22;q22)/AMLl-ETO

Típicamente aparece en personas jóvenes y puede debutar en el 2,5% de los casos en
forma de sarcoma mieloide. La lesión molecular es frecuente (el 5-12% de las LMA y
hasta en la tercera parte de las LMA con maduración) y de gran importancia diagnós
tica y pronóstica. Los blastos son característicamente grandes, con citoplasma basófilo
y granulación azurófila. En algunos casos pueden presentar mazacotes granulares
(gránulos seudo-Chédiak-Higashi). Con bastante frecuencia se ven bastones de Auer
aislados (fig. 13-1). Además de los blastos grandes, pueden verse otros más pequeños
especialmente en sangre periférica (fig. 13-2). La serie blanca puede presentar diferentes
grados de displasia (seudo-Pelger-Huét y anomalías citoplasmáticas de tinción que
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 13-1. Sangre periférica

de un paciente afecto de leucemia
mieloide aguda (LMA) en la que se
aprecia un mieloblasto cuyo citoplasma
contiene un característico «bastón de
Auer». Sangre periférica (MGG X800).
confieren un peculiar color rosado a los segmentados) (fig. 13-3). Los eosinófilos pueden
ser abundantes aunque sin anomalías de tinción. A pesar de que la mayoría de los casos
presentan maduración en la serie granulopoyética, se han descrito casos sin maduración
e incluso con diferenciación monocítica. El inmunofenotipo habitual es CD 13, CD33,
MPO, CD34. Se considera una leucemia de buen pronóstico si no se asocia a cifras elevas
de leucocitos, mutaciones de c-kit o cifras persistentemente elevadas de enfermedad
residual mínima tras tratamientos de quimioterapia.
Leucemia m ieloide aguda con inv(16)(pl3q22)/CBFp-M Y H l 1

Representa aproximadamente el 10% de todas las LMA y es más frecuente en personas
jóvenes. Los blastos presentan diferenciación granulo- y monocítica. Las anomalías más
llamativas se encuentran en los eosinófilos, que están aumentados y con granulación
anormal (gránulos grandes, púrpura-violeta y en ocasiones tan densos que oscurecen la
morfología celular). Los eosinófilos m aduros pueden presentar hiposegmentación n u
clear. La reacción citoquímica de cloro-acetato-esterasa es característicamente positiva en
estos elementos. En algunos casos faltan los trastornos de la serie eosinófila y los blastos
FIGURA 13-2. Mieloblasto

de tamaño mediano, citoplasma
abundante y ligeramente basófilo cuyo
núcleo muestra cromatina laxa
y un nucléolo prominente. Sangre
periférica (MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ

de un paciente afecto de síndrome
mielodisplásico (SMD). Se aprecia
un neutrófilo con anomalía tipo
seudo-Pelger-Huét caracterizada
por presentar una morfología similar
a la de la enfermedad congénita de
Pelger-Huét y consistente en falta
de segmentación nuclear y núcleo de
aspecto bilobulado similar al del
eosinófilo. Este rasgo displásico de los
neutrófilos suele acompañarse también
de desgranulación (MGG X800).
son homogéneamente de hábito monocítico (fig. 13-4). En otras ocasiones, no se alcanza

el umbral del 2 0 % de mieloblastos sin que esta circunstancia invalide el diagnóstico de
LMA. El inmunofenotipo de los blastos muestra un porcentaje variable de blastos que
expresan CD34 y diferenciación mieloide evidenciada por positividad de CD 13, CD33,
CD117, CD 15, CD 14, CD64, CD36 y lisozima. Los eosinófilos anormales conservan las
propiedades de autofluorescencia. En algún trabajo se ha señalado la positividad carac
terística de CD2. Se debe completar el estudio citogenético convencional con las técnicas
de FISH y de RT-PCR, ya que en algunas ocasiones la inv(16) puede pasar desapercibida.
Leucemia prom ielocítica aguda (LPA) con t(15;17)(q22;ql2)/

PML-RARa
Representa el 5-8% de todas las LMA del adulto, a m enudo cursa con coagulación
intravascular diseminada (CID) y la forma m icrogranular puede evolucionar con una
marcada hiperleucocitosis. La célula característica de esta entidad es el promielocito
anóm alo. El tam año nuclear y la form a de estas células son variables aunque con
bastante frecuencia adopta una forma arriñonada o bilobulada. El citoplasma puede

mieloide aguda con inv(16)(pl3q22)/
CBF|3-MYH11. Algunos blastos
muestran un núcleo de contorno
más irregular y aspecto monocitoide.
Apréciense nucléolos prominentes
(MGG X800).
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FIGURA 13-5. Grupo de

promielocitos neutrófilos con
citoplasma repleto de bastones de Auer
formando «astillas» característicos de
la leucemia promielocítica aguda (LPA)
hipergranular. Médula ósea (MGG
X800).
encontrarse em paquetado p o r gránulos densos que oscurecen el contorno nuclear,

células características con haces de bastones de Auer (faggot cells) o «astillas» que
es la característica más com ún de la forma típica hipergranular (fig. 13-5). También
pueden verse blastos con un solo bastón de Auer. La reacción de mieloperoxidasa es
fuertemente positiva y hasta en una cuarta parte de los casos la reacción citoquímica de
la ANAE es positiva (v. capítulo 9). Las variantes micro- o hipogranular se caracterizan
por la escasez de gránulos y los núcleos bilobulados. El inmunofenotipo leucémico ca
racterístico es de células autofluorescentes CD33 homogéneamente positivo, CD 13+ con
patrón heterogéneo y negatividad de HLA-Dr y CD34. No obstante, existen casos
con positividad del antígeno CD34 o más com únm ente con subclonas minoritarias
CD34 positivas.
La reacción inmunohistoquímica efectuada sobre preparaciones con LPA utilizando
un anticuerpo monoclonal frente al antígeno PML (PG-M3) muestra que los núcleos
de los promielocitos con la t(15;17) se tiñen y adoptan un patrón finamente granular o
«arenoso» muy característico con desaparición del patrón granular nuclear normal. Este
tipo de leucemia tiene buen pronóstico y requiere un tratamiento específico con ácido
holo-trans-retinoico y quimioterapia. Algunas formas especiales que pueden entrar en el
diagnóstico diferencial son t( 11; 17) (q23;q21)/PLZF-RARa, t( 11; 17) (ql3;q21)/NuMA-
RARa y t(5;17)(q23;ql2)/NPM RARa. Estas entidades fueron inicialmente diagnos
ticadas como LPA resistentes al tratam iento con ácido transretinoico. Sin embargo
existen algunas características morfológicas particulares en la LPA con t(l I;17)(q23;q21)/
PLZF-RARa con predominio de blastos de núcleos regulares, abundantes gránulos en
ausencia de bastones de Auer y presencia en muchas ocasiones de elementos celulares
con anomalías seudo-Pelger-Huét. Los casos con t(5;17)(q23;ql2)/NPM -RARa mues
tran una población predom inante de promielocitos hipergranulares asociada a otra
de promielocitos hipogranulares. Tampoco se ven bastones de Auer. Solo esta última
variante promielocítica es sensible al ácido transretinoico.
Leucemia m ieloide aguda con anom alías del gen llq23(M L L )

Esta lesión molecular es especialmente frecuente en dos contextos: leucemias agudas
diagnosticadas en niños con edad inferior a 1 año y leucemias secundarias a tratamientos
con inhibidores de la topoisomerasa II. Los pacientes pueden presentar CID e infil
traciones extramedulares.
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FIGURA 13-6. Médula ósea

mieloide aguda con anomalías
del gen llq23(MLL). Los blastos,
mayoritariamente monoblastos,
coexisten con promonocitos
de citoplasma abundante y muchas
veces vacuolizado (MGG X800).
La morfología más habitual de este tipo de leucemia es la de monoblastos y prom o

nocitos con citoplasmas amplios, vacuolización y presencia de algún nucléolo (fig. 13-6).
Presentan con mucha frecuencia marcadores monocíticos maduros (CD 14, CD64, CD36,
lisozima, CD 11c) asociados a marcadores característicos de células inmaduras (CD34,
CD 117). Conviene señalar que la duplicación parcial del gen MLL pasa desapercibida
en el estudio citogenético convencional y se requieren estudios moleculares adicionales
para ponerla en evidencia.
De forma análoga a las LMA, las LLA también se han agrupado en categorías reco
nocidas según las lesiones citogenéticas y moleculares (cuadro 13-3):
Leucemia linfoide aguda de precursores B

Esta enfermedad se da preferentemente en niños: el 75% de los casos se diagnostican
antes de los 6 años de edad. En algunos casos, la presentación clínica es en forma pre
dominantemente poliadenopática o de tejidos (piel, hueso) con poca infiltración blás
tica medular (<25% linfoblastos medulares) y se denomina linfoma linfoblástico B. La
clínica viene dominada por la citopenia, las visceromegalias y los dolores óseos. Algunos
casos pueden estar precedidos por una fase de aplasia medular sin infiltración blástica.

de las leucemias linfoides agudas (LLA)
Clasificación de neoplasias linfoides de precursores

• Leucemia/linfoma linfoblástico de línea B, no especificado
• Leucemia/linfoma linfoblástico de línea B con anomalías genéticas recurrentes
• t(9;22)(q34;qll.2) bcr-abl
• t(v;l lq23) MLL reordenado
• t(12;21)(pl3;q22) Tel-Amll; ETV6-RUNX1
• Hiperdiploide
• Hipodiploide
• t(5; 14) (q31;q32) IL3-IGH
• t( 1; 19) (q23;p 13.3) E2A-PBX1, TCF3-PBX1
• Leucemia/linfoma linfoblástico de línea T
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La morfología de los linfoblastos va desde elementos pequeños con escaso cito

plasm a y crom atina condensada sin nucléolos, a form as grandes con m oderado
citoplasma, ocasionalmente con vacuolas, crom atina laxa y nucléolos. Las vacuolas
son características de la leucem ia/linfom a B tipo B urkitt (fig. 13-7). En un 10% se
pueden observar gránulos azurófilos gruesos o bien adoptar la m orfología de espejo
de mango.
La citoquímica muestra característicamente la negatividad de la reacción de la mielo
peroxidasa. El inmunofenotipo evidencia la positividad de la TdT y CD79a del citoplasma
con presencia de marcadores pan B: CD19, CD22, CD20, CD10 (CALLA+), cadena
de citoplasma. Con mucha frecuencia se expresan marcadores mieloides (CD 13, CD33
y CD 6 6 ). El CD45 puede ser débilmente positivo o negativo.
Las lesiones citogenéticas más im portantes en este grupo p o r su frecuencia o su
impacto pronóstico son: el cariotipo hiperdiploide (frecuente en niños y asociado a buen
pronóstico), el cariotipo hipodiploide, la t( 1 2 ;2 1 ) críptica asociada a reordenamiento
TEL/AML1 en casos de LAL CD10+ del niño (hasta el 25% de los casos) con buen
pronóstico, la t(9;22) con reordenamientos bcr-abl del tipo p210 o pl90 en LLA CD 10+
del adulto con muy mal pronóstico y reordenamientos del gen MLL en casos de LLA de
niños (CD 10—, CD 15+) y de adultos, también de mal pronóstico.
Leucemia linfoide aguda de precursores T

Representa el 15% de todas las LLA de los niños con un predom inio en varones y el
25% de las LLA del adulto. Típicamente cursan con marcadas leucocitosis y grandes
masas mediastínicas. M orfológicamente los linfoblastos son de tam año medio, alta
relación núcleo-citoplasma y contorno nuclear irregular (convoluto). Puede apreciarse
heterogeneidad del tamaño de los blastos (fig. 13-8) y son abundantes las mitosis. Los
linfoblastos T presentan positividad focal en la reacción de fosfatasa ácida. En algunas
ocasiones, existe eosinofilia o hiperplasia mieloide, y en esta última circunstancia hay
que pensar en una t(8;13)(pl 1.2;ql 1-22). El inmunofenotipo característico es CD3+ de
citoplasma, TdT+, HLA-DR y CD 123 —, con positividad para diferentes marcadores T;
CD7, el más precoz; CD5, CD2, CD4, CD 8 , CD la y CD3 de superficie en las formas más
maduras. Es común la expresión de CD34 y CD 10. También pueden expresar antígenos
mieloides CD 13, CD33 y más raramente CD 117.
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FIGURA 13-8. Sangre periférica de

un paciente afecto de leucemia linfoide
• •• aguda de precursores T. Linfoblastos

de mediano y gran tamaño, elevada
relación núcleo-citoplasma y contorno
irregular del núcleo con aspecto
«convoluto» debido a un repliegue o
invaginación peculiar de la cromatina
(MGG X800).
Las lesiones genéticas más comunes corresponden a translocaciones cromosómicas

que afectan a las secuencias reguladoras del locus de un receptor de célula T (los locus
a y 8 en 14ql 1.2; el locus (3 en 7q35 o el 7 en 7pl4-15) y a diferentes factores de trans
cripción que participan en el desarrollo de la hematopoyesis norm al (TAL1 en lp32,
RBTN1 en 1lp l5 , RBTN2 en 1lp 13, HOX11 en 10q24) o bien una tirosina cinasa (LCK
en lp34). Otras mutaciones recientemente identificadas incluyen lesiones en la vía de
NOTCH, duplicación de FLT3 y m utaciones de WT1. La patología molecular de las
LLA-T es compleja y probablemente se beneficiará de aproximaciones de análisis masivo.
SÍNDROMES MIELODISPLÁSICOS
Se engloban en esta categoría aquellos procesos que cursan con citopenias periféricas y
alteraciones dishematopoyéticas en una o más líneas. Comparten una predisposición
al desarrollo de leucemias agudas, habitualmente LMA, por lo que tradicionalmente se
las conoce como preleucemias.
En la actualidad, los pilares del diagnóstico de estas entidades son la morfología y la
citogenética. Los criterios pronósticos se establecen atendiendo al núm ero de blastos,
la edad y el cariotipo. El reconocimiento y la estandarización de las alteraciones inmuno-
fenotípicas asociadas, así como la identificación de poblaciones inmaduras anormales,
hace que cada vez se utilice más la citometría de flujo. En opinión del autor en todo
síndrome mielodisplásico (SMD) al diagnóstico se deben investigar las alteraciones de
maduración mieloide y monocítica, así como evaluar el compartimento CD34 linfoide y
mieloide. En todos los casos de SMD se deben obtener ácidos nucleicos (ARN y ADN),
ya que estamos asistiendo a u na auténtica explosión de hallazgos moleculares que a
buen seguro revolucionarán no tan solo la clasificación de estos procesos sino el tipo de
tratamiento a emplear (cuadro 13-4 y tablas 13-3 a 13-5).
SÍNDROMES MIELOPROLIFERATIVOS Y MIELOPROLIFERATIVOS /

MIELODISPLÁSICOS
Bajo este término se incluyen un conjunto de hemopatías que se originan en una célula
progenitora pluripotente o célula madre (stem-cell) de la hematopoyesis y que comparten
una serie de características hematológicas, clínicas y evolutivas comunes. Los cuadros
reconocidos están incluidos en la cuadro 13-5.
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de los síndromes mielodisplásicos (SMD)
• Citopenia refractaria con displasia unilineal

• Anemia refractaria
• Neutropenia refractaria
• Trombocitopenia refractaria
• Anemia refractaria con sideroblastos en anillo
• Citopenia refractaria con displasia multilínea (con o sin sideroblastos en anillo)
• Anemia refractaria con exceso de blastos (AREB)
• Síndrome mielodisplásico con del(5q) aislada
• Síndrome mielodisplásico no clasificable
• Síndrome mielodisplásico infantil
• Entidad provisional: citopenia refractaria infantil
TABLA 13-3. Criterios diagnósticos de los síndromes mielodisplásicos (SMD)
Hallazgos en sangre
Enfermedad periférica Hallazgos en médula ósea
Citopenia refractaria con Uni- o bicitopenia Displasia unilineal > 10% de las
displasia unilineal No blastos o <1% células en una línea mieloide
<5% blastos
<15% de los precursores eritroides
son sideroblastos en anillo
Anemia refractaria con Anemia >15% sideroblastos en anillo
sideroblastos en anillo No blastos Displasia eritroide aislada
<5% blastos
Citopenia refractaria con Citopenia(s) Displasia > 10% en > 2 series
displasia multilínea No blastos o < 1% mieloides
No bastones de Auer <5% blastos
<1 X 109/1 monocitos No bastones de Auer
±15% sideroblastos en anillo
AREB tipo 1 Citopenias Displasia unilínea o multilínea
<5% blastos 5-9% blastos
No bastones de Auer No bastones de Auer
<1 X 109/1 monocitos
AREB tipo 2 Citopenias Displasia unilínea o multilínea
5-19% blastos 10-19% blastos
Bastones de Auer± Bastones de Auer±
<1 X 109/1 monocitos
Síndrome mielodisplásico no Citopenias Displasia clara en < 10% de las
clasificable <1% blastos células de una o más series mieloides
acompañado de una lesión
citogenética típica de SMD
<5% blastos
Síndrome mielodisplásico Anemia Megacariocitos normales o altos con
asociado a del(5q) aislada Habitualmente plaquetas núcleos hipolobulados
normales o altas <5% blastos
No blastos o <1% del(5q) aislada
No bastones de Auer
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TABLA 13-4. Rasgos morfológicos definitorios de displasia
Línea Hallazgos morfológicos

Diseritropoyesis Puentes internucleares, irregularidades del contorno nuclear,
multinuclearidad, cambios megaloblásticos, cariorrexis, mitosis anormales,
Howell-Jolly, punteado basófilo, distribución anómala de la hemoglobina,
sideroblastos en anillo, PAS positividad
Disgranulopoyesis Gigantismo nuclear, hipersegmentación nuclear, hiposegmentación
(seudo-Pelger), núcleo en anillo o en espejo, alteración de la condensación
de cromatina (dumping), apéndices nucleares, bolsillos nucleares,
granulación gigante (seudo-Chédiak-Higashi), hipoagranularidad, bastones
de Auer, cuerpos de Dóhle
Dismegacariopoyesis Núcleos dispersos, núcleos bilobulados, formas monolobuladas de distintos
tamaños, micromegacariocitos
I TABLA 13-5. Lesiones moleculares en síndromes mielodisplásicos (SMD) 1

(diciembre, 2011)
Gen Frecuencia Comentarios

RUNX1 20% Mal pronóstico
MDS-EVI1 ? 5% sobreexpresión
También t(3;21)
p53 10% Mal pronóstico, cariotipo complejo y relacionado con
tratamientos
ras 15% Mal pronóstico
JAK2 5% Se observa en cuadros de AR-sideroblástica con
trombocitosis
CBL <1% No específico de SMD
TET2 11-26% No específico de SMD
Junto con mutaciones de IDH1 e IDH2 podrían
emplearse agentes hipometilantes
ASXL-1 11-18% Potencial diana de ATRA y agentes hipometilantes.
Asociado a cuadros evolucionados
EZH2 6% Posible diana de agentes modificadores de histona.
También se ha observado en neoplasias sólidas
SF3B1 y otras Depende de SMD AR-sideroblástica
proteínas de splicing Parece asociado a buen pronóstico
CUADRO 13-5. Clasificación de los síndromes mieloproliferativos
• Leucemia mieloide crónica

• Trombocitopemia esencial
• Mielofibrosis primaria
• Leucemia neutrofílica crónica
• Leucemia eosinofílica crónica
• Enfermedades de células cebadas
• Síndrome mieloproliferativo crónico no clasificable
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A diferencia de las leucemias agudas, predom inan los precursores (células más
maduras) sobre los progenitores (blastos). En general, su evolución es mucho más lenta
(crónica) y su pronóstico, generalmente más benigno.
Los síndromes mieloproliferativos comparten las siguientes características:
• Panmielopatía clonal o panmielosis: proliferación excesiva de las tres series hema-
topoyéticas que afecta a todas las células de la sangre, aunque según el tipo muestra
preferencia por una línea celular determinada:
• Progenitores o células germinales.
• Precursores, divisibles o no divisibles.
• Elementos hemáticos maduros.
• Aumento de la masa de precursores mieloides. Los más jóvenes tienen capacidad
para dividirse (mieloblastos, promielocitos, mielocitos y promonocitos; eritroblastos
y megacariocitos inmaduros), mientras que los más maduros carecen de capacidad
mitótica (metamielocitos, eritroblastos y megacariocitos).
• Posibilidad de metaplasia en bazo e hígado.
• Tendencia a u n a transform ación en leucemia aguda (transform ación blástica o
agudización terminal).
• Presencia de mielofibrosis secundaria a la proliferación mieloide y que, a excepción
de una de las formas (mielofibrosis idiopática), no tiene un origen clonal.
• Dificultad, a veces, de establecer el diagnóstico diferencial entre las cuatro formas de
síndrome mieloproliferativo (SMP), ya que no es raro observar que uno de los tras
tornos se convierta en otro de la misma familia en el curso evolutivo del proceso. Por
ejemplo, es relativamente frecuente observar una transformación de la policitemia
vera en mielofibrosis idiopática.
La leucemia mieloide crónica (LMC) se caracteriza por la presencia de abundantes
precursores mieloides y basofilia en sangre periférica, o reacción leucemoide (fig. 13-9),
esplenomegalia y la característica t(9;22), el cromosoma Philadelphia con el reorde
namiento bcr-abl. Esta entidad ha representado el paradigma del éxito de la medicina
molecular, ya que se ha conseguido un gran avance terapéutico con la introducción de
los inhibidores de las tirosina cinasas. Los otros síndromes mieloproliferativos crónicos
(SMPC) se incluyen en las tablas 13-6 y 13-9 y cuadro 13-6.
FIGU RA 13-9. Sangre periférica

mieloide crónica (LMC) caracterizada
por la presencia de abundantes
precursores mieloides y basofilia o
reacción leucemoide (MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 13-6. Síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC) bcr/abl negativos
Criterios de SMPC bcr-abl
P O L IC IT E M IA V E R A
Mayores Hemoglobina > 18,5 g/dl en hombres o 16,5 en mujeres u otra

evidencia de incremento de masa eritrocitaria
Presencia de la mutación JAK2V617F o equivalente (mutación de
exón 12 de JAK2)
Menores Biopsia medular con hiperplasia de las tres líneas para la edad
Niveles de EPO por debajo del límite de referencia
Crecimiento espontáneo de colonias eritroides in vitro
Se necesita un criterio mayor y uno menor o bien el primero de los mayores con los dos menores
T R O M B O C IT O P E N IA E S E N C IA L
Se necesitan todos los criterios Trombocitosis mantenida > 450 X 109

Hiperplasia megacariocítica característica (grandes, maduros)
No hiperplasia granulocítica o eritroide significativa ni desviación
izquierda
No criterios de otro proceso mieloide
Presencia de marcador genético clonal: JAK2V617F o mutaciones
de MPL
En ausencia de marcadores clónales se ha de descartar que no
existen causas de trombocitosis reactiva
M IE L O F IB R O S IS P R IM A R IA
Mayores Proliferación megacariocítica con atipia acompañada de fibrosis

reticulínica o colágena o bien, si no hay fibrosis, una hiperplasia
celular
No criterios de LMC, síndromes miolodisplásicos (SMD) o
policitemia vera
Marcadores clónales: JAK2V617F o mutación MPL
Si no hay marcador clonal ausencia de causas secundarias de fibrosis
Leucoeritroblastosis
Menores Incrementos de las cifras de LDH
Anemia
Esplenomegalia
Se necesitan los tres mayores y dos menores
TABLA 13-7. Diagnóstico diferencial de síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC)
LMC PV MI TE
Hemoglobina NoD A+++ D N
Leucocitos A+++ A A oD N
Plaquetas A oD A A oD A+++
Esplenomegalia + + +++ +
Cromosoma Ph +++ No No No
Mielofibrosis + /- + /- +++ + /-
FAG 0oD A No A No A
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 13-8. Indicaciones del estudio de JAK2 y MPL en el diagnóstico hematológico
Mutación Indicaciones
JAK2V617F Eritrocitosis
Trombocitosis
Fibrosis medular
Leucocitosis bcr-abl negativa
Monocitosis inexplicada
Esplenomegalia de causa no aclarada
Prurito desencadenado por el agua
Trombosis en territorio esplácnico
Analizar sp o MO (repetir)
JAK2 mutación exón 12 Eritrocitosis con EPO baja y JAK2V617F negativa
Mielofibrosis pospolicitemia JAK2V617F negativa
Mutación MPL Trombocitosis y morfología en MO equívoca de trombocitopenia esencial
Fibrosis medular y morfología en MO equívoca de mielofibrosis primaria
TABLA 13-9. Síndromes mieloproliferativos/mielodisplásicos reconocidos

en la clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS)
Categoría Criterios W T
Leucemia mielomonocítica Ph y bcr-abl negativos

crónica >1 X 109/1 monocitos
Menos del 20% de blastos más promonocitos en sangre o MO
Displasia de una o más líneas + alteración citogenética clonal o bien
monocitosis de más de 3 meses una vez que se han excluido otras causas
de monocitosis
Leucemia mieloide crónica Ph y bcr-abl negativos
atípica Leucocitos a expensas de granulocitos y sus precursores (pro- a
metamielocitos) (10% en sangre periférica)
Basófilos < 2% (sp)
Monocitos < 10% (sp)
MO hipercelular con hiperplasia y displasia de la serie blanca con o sin
displasia de las otras líneas
Menos del 20% de blastos + promonocitos en sp o MO
Leucemia mielomonocítica Ph y bcr-abl negativos
juvenil Menos del 20% de blastos + promonocitos en sp o MO
Al menos más de dos de los siguientes:
- HbF alta para la edad
- Granulocitos inmaduros en sp
- Leucocitosis > 10 X 109/1
- Anomalía cromosómica clonal (—7 u otra)
- Hipersensibilidad de precursores mieloides a GM-CSF
Síndrome mielodisplásico/ Condición que aparece de novo
mieloproliferativo Ninguno de los criterios anteriores
no clasificable Ph y bcr-abl negativos
5q—,inv(3)(q21q26) negativos
Rasgos mieloproliferativos (leucocitosis o trombocitosis)
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 13-6. Factores pronósticos adversos en mielofibrosis
• Edad > 65 años

• Síntomas constitucionales
• Hemoglobina < 10 g/dl
• Leucocitos < 25 X 109/1
• Blastos en sangre periférica >1%
SÍNDROMES LINFOPROLIFERATIVOS MADUROS

Pueden ser de dos tipos (cuadro 13-7):
1. De línea B. Incluyen los cuadros con expresión hemoperiférica, las formas nodales
(los linfomas) y el linfoma de Hodgkin.
2. De línea T y NK.
Leucemia linfática crónica

La leucemia linfática crónica (LLC) es la neoplasia B madura más frecuente. Se caracteriza
por la proliferación de linfocitos m aduros de cromatina nuclear en forma de grumos
y la presencia de típicas sombras nucleares (fig. 13-10). Los linfocitos son típicamente
CD5 y CD23 positivos. Los criterios inmunofenotípicos se han definido mediante el
uso de puntuaciones como la de la Dra. Estela Matutes (tabla 13-10). Es imprescindible
realizar un estudio de citogenética en sangre periférica para estudiar las deleciones de 17p
que definirán una mala respuesta al tratamiento convencional. También se recomienda
investigar el patró n m utacional Vh y la presencia de m utaciones de p53 m ediante
secuenciación de los exones 4 a 9. Recientemente se ha determinado la necesidad de
analizar también las mutaciones de NOTCH, SF3B1 y BIRC.
Son muy utilizadas las clasificaciones clínicas de Rai y Binet que, junto a los hallazgos
moleculares, sirven para decidir las opciones terapéuticas.
• Clasificación de Rai:
• Bajo riesgo:
- Estadio 0. Solo linfocitosis (> 1 5 .0 0 0 /m m 3 en sangre periférica, el 40% de
linfocitos en aspirado de médula ósea [MO]).
• Riesgo intermedio:
- Estadio I. Linfocitosis y adenomegalias.
- Estadio II. Linfocitosis y hepato- y/o esplenomegalias.
• Riesgo alto:
- Estadio III. Linfocitosis y anemia (Hb < 11 g %).
- Estadio IV. Linfocitosis y plaquetopenia (plaquetas < 100.000/mm3).
• Clasificación de Binet:
• Estadio A. No anemia, no plaquetopenia, menos de tres áreas linfoides comprometidas.
• Estadio B. No anemia, no plaquetopenia, tres o más áreas linfoides comprometidas.
• Estadio C. Anemia (Hb < 10 g %), plaquetas < 100.000 por m m 3.
El diagnóstico diferencial de la LLC se establece con otros SLPC B que se esquematiza
en la tabla 13-11. En el cuadro 13-8 se indican las características de la linfocitosis B
monoclonal, una situación de reconocimiento creciente.
Los procesos T y NK en sangre periférica son extremadamente raros. Interesa por su
agresividad la leucemia prolinfocítica T, que cursa con linfocitosis de núcleos convolutos
(fig. 13-11) y esplenomegalia, fenotipo T maduro y expresión característica de CD52
(cuadro 13-9).
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 13-7. Clasificación de neoplasias B maduras (incluyendo los linfomas)

• Leucemia linfática crónica/linfoma linfocítico de célula pequeña
• Leucemia prolinfocítica B
• Linfoma esplénico de la zona marginal
• Tricoleucemia (hairy cell leukemia)
• Leucemia/linfoma esplénico no clasificable (entidad provisional)
• Linfoma esplénico difuso de células pequeñas de la pulpa roja
• Tricoleucemia variante
• Linfoma linfoplasmocítico
• Enfermedades de las cadenas pesadas
• a
. y
• M'
• Plasmocitoma solitario
• Plasmocitoma extraóseo
• Linfoma de la zona marginal extranodal de regiones MALT
• Linfoma de la zona marginal nodal
• Linfoma de la zona marginal pediátrico (entidad provisional)
• Linfoma folicular
• Linfoma folicular pediátrico (entidad provisional)
• Linfoma centrofolicular primario cutáneo
• Linfoma del manto
• Linfoma difuso de célula grande B, no especificado
• Linfoma B rico en células T o en histiocitos
• Linfoma B primario del sistema nervioso central
• Linfoma primario cutáneo de células grandes tipo de las piernas
• Linfoma B de células grandes VEB+ en los ancianos (entidad provisional)
• Linfoma B de células grandes asociado a procesos inflamatorios crónicos
• Granulomatosis linfomatoide
• Linfoma B de células grandes primario del mediastino (tímico)
• Linfoma B de células grandes intravascular
• Linfoma B de células grandes ALK+
• Linfoma plasmablástico
• Linfoma B de células grandes originado en una enfermedad de Castleman
multicéntrica HHV8+
• Linfoma B de cavidades (primary effusion lymphoma)
• Linfoma de Burkitt
• Linfoma B no clasificable con características intermedias entre linfomas difusos B
de célula grande y el linfoma de Burkitt
• Linfoma B no clasificable con características intermedias entre linfomas difusos B
de célula grande y linfoma de Hodgkin clásico
Los linfomas, tanto T como B, son diagnósticos predominantemente patológicos y

requieren de un reconocimiento de la celularidad y arquitectura de las biopsias ganglio -
nares. El estudio inmunofenotípico también sirve para establecer el diagnóstico. Como
ejemplo se m uestra el algoritmo de Hans de investigación en los linfomas B difusos de
célula grande (fig. 13-12 y tabla 13-12).
ERRNVPHGLFRVRUJ

linfática crónica (LLC) caracterizada
por el predominio absoluto de
linfocitos maduros con cromatina
nuclear formando grumos
y abundantes sombras nucleares
o fragmentos de los mismos linfocitos,
especialmente lábiles en la LLC y que
aparecen en el momento de realizar
la extensión (MGG X800).
En la fase postransplante y asociados a la inmunodeficiencia inducida por el uso de

inmunosupresores pueden también aparecer linfomas inducidos por VEB y con frecuente
polimorfismo celular (cuadro 13-10).
Linfom a de H odgkin
El linfoma de Hodgkin (LH) se caracteriza por la proliferación neoplásica de un linfocito B
incapaz de generar una respuesta inmune eficiente. La célula propia del LH es la Reed-
Sternberg. El diagnóstico es histopatológico con el reconocimiento celular característico
y la inm unotinción positiva para CD 15, CD30, EM A+/— y la negatividad de CD45
(cuadro 13-11).
En los países no desarrollados, la enfermedad de Hodgkin afecta con mayor frecuencia
durante la edad infantil, mientras que en los desarrollados presenta una curva bimodal
(15-25 años y 60-65 años). Las diferencias entre el LH y otros linfomas se resumen en
el tabla 13-13.
Estadificación de los linfom as

Se establece mediante la clasificación clásica de Ann Arbor en los siguientes grupos:
• Estadio I. Compromiso de u n solo grupo ganglionar o una sola estructura linfoide
(I) o compromiso localizado de un solo órgano extralinfático (I E).
• Estadio II. Compromiso de dos o más grupos ganglionares en uno de los lados del
diafragma, o compromiso localizado de un órgano extralinfático único junto con sus
TABLA 13-10. Puntuación para el diagnóstico inmunofenotípico de la leucemia linfoide

crónica (LLC) (Matutes)
Marcador Intensidad Puntuación*

CD5 +++ 1
CD23 +++ 1
Ig de superficie + 1
FMC7 0 1
CD79b* (CD22) + /- 1
* U na puntuación igual o superior a 3 es altamente sugestiva de LLC.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 13-11. Diagnóstico inmunofenotípico de los procesos SLPC-B con expresión

hemoperiférica
Entidad Inmunofenotipo Comentarios

LLC CD5+ CD23 > CD22 En raros casos de LLC CD5—se
IgS débil mantiene CD23 > CD22
FMC7+/—
CD20+/—, CD79b+/—, CD1 lc+,
CD25+/-
CD38+/— (pronóstico)
ZAP70+/— (pronóstico)
CD10—
CD 103—
CD123+/—
Prolinfocítica B Como LLC pero FMC7++, CD20++ Gran esplenomegalia y
linfocitosis
Prolinfocitos > 60%
Linfoma del manto CD5+ CD22 > CD23 Analizar ciclina DI por
Igs no débil (con frecuencia \ ) inmunohistoquímica. Se han
FMC7+/++ descrito alteraciones de ciclina
CD20 +/++ D2yD 3 (SOX)
CD79b+/++
CD25+/—
CD38+
CD10-CD103-CD123+/—
Linfomas zona C D 5 - CD22 > CD23 Alguna vez CD5+
marginal (incluyendo FMC7++ Esplenomegalia
formas esplénicas con IgS no débil Paraproteína
linfocitos vellosos) CD20++ Virus hepatitis C+
CD llc+/++ Síndrome seco
CD25+/—
CD38+/—
CD79b+
CD10-CD103-CD123—
Linfoma Ningún fenotipo característico. Parecido Infiltración por linfocitos es
linfoplasmocítico a LLC o linfomas de zona marginal mayor en MO que sp. Puede ser
muy difícil de distinguir de los
linfomas de la zona marginal
Linfoma folicular C D 5- Muy rara vez CD5+. Si hay
CD22 = CD23 pérdida total de CD23 pensar
FMC7+ en una transformación agresiva,
CD20+ sobre todo si se asocia a
CD79+ ganancia de CD 123
CD 10+ (utilizando fluorocromos
sensibles)
Igs no débil
CD 19 puede ser débil
Tricoleucemia C D 5- En las formas variantes el CD25
CD22 > > CD23 es negativo
CD 11C++ Esplenomegalia
CD10+/— Pancitopenia
FMC7+ Punción seca
CD20++ Clona puede ser pequeña en sp
CD25+
CD 103+
CD 123+
Patrón de clonalidad característico
ERRNVPHGLFRVRUJ
I TABLA 13-11. Diagnóstico inmunofenotípico de los procesos SLPC-B con expresión j

hemoperiférica (cont.)
Entidad Inmunofenotipo Comentarios

SLPC-B biclonales Cualquier asociación de dos SLPC-B con Al menos el 5% de todos los
mismo o diferente isotipo de IgS SLPC
Formas no Fenotipos «extraños» Pensar en SLPC típicos tratados
clasificables Formas leucemizadas
de linfomas difusos de
células grandes o linfomas
linfoblásticos (TdT nuclear)
Transformaciones agresivas
(Richter y similares)
CUADRO 13-8. Características de la linfocitosis B monoclonal (MBL). Criterios

• Detección de población B-monoclonal en sp definida por:
• Ratio clonal K:L > 3:1 o < 0,3:1
• >25% sin Ig de superficie o expresión débil
• Inmunofenotipo típico de algún SLPC-B
• Población B monoclonal estable durante 3 meses
Criterios de exclusión
• Linfoadenopatía u organomegalias
• Enfermedad autoinmune o infecciosa asociada
• Recuento de linfocitos B > 5 X 109/1
• Otros rasgos clínicos de SLPC-B. No obstante puede observarse paraproteína y no
excluye MBL
Sub clasificación
• Tipo LLC: CD5+CD23+
• Tipo LLC atípica: CD5+CD23—, CD20+, CD79b+
• Tipo no LLC: CD5—

prolinfocítica T, caracterizada por la
presencia de una linfocitosis absoluta
en la que los linfocitos presentan esta
típica imagen de replegamiento de
la cromatina nuclear conocida como
«núcleos convolutos» (MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ

de las neoplasias T y NK maduras
Leucemias T maduras
• Leucemia prolinfocítica T
• Leucemia de linfocitos grandes granulares T
• Procesos linfoproliferativos crónicos NK (entidad provisional)
• Leucemia agresiva NK
• Leucemia/linfoma de célula T en el adulto
Linfomas T periféricos nodales
• Linfoma T periférico, no especificado
• Linfoma angioinmunoblástico T
• Linfoma anaplásico de célula grande ALK+
• Linfoma anaplásico de célula grande ALK—(entidad provisional)
Linfomas T extranodales
• Linfoma T/NK extranodal, tipo nasal
• Linfoma T asociado a enteropatía
• Linfoma T hepatoesplénico
• Linfoma T subcutáneo tipo paniculitis («(3)
Linfomas cutáneos T
• Micosis fungoide
• Síndrome de Sézary
• Enfermedad linfoproliferativa cutánea primaria T CD30+
• Linfoma anaplásico de célula grande primario cutáneo
• Papulosis linfomatoide
• Linfoma T primariamente cutáneo
• Linfoma T 7 8
• Linfoma CD8 + epidermotrópico agresivo
• Linfoma CD4 de células pequeñas/medianas
FIGURA 13-12. Algoritmo de Hans

FOXP1 + NCG FOXP1-CG empleado en la investigación de los
linfomas B difusos de células grandes.
ganglios regionales, con o sin compromiso de otras regiones ganglionares del mismo lado
del diafragma (IIE). Los hilios pulmonares se consideran separadamente del mediastino.
Se indica con un sufijo en números arábigos la cantidad de áreas comprometidas.
Estadio III. Compromiso de grupos ganglionares en ambos lados del diafragma, lo
cual puede estar acompañado del compromiso localizado de un órgano extralinfático
asociado (III E), o del bazo (III S) o de ambos (III ES).
Estadio III 1: con o sin compromiso del bazo, ganglios celíacos, portales o del
hilio esplénico.
Estadio I I I 2: con compromiso de ganglios paraaórticos e ilíacos.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 13-12. Lesiones moleculares en linfomas difusos de célula grande B
Tipo Lesión genética Frecuencia Consecuencia Vía funcional

Bcl2 (Transí) 30-40% Desregulación Inhibidor apoptosis
Myc (Transí) 10% Desregulación Proliferación y crecimiento
Bel (Transí) 15% Desregulación Regulador negativo respuesta
daño ADN
EZH2 (Mut) 22% Ganancia Metiltransferasa
función
CREBBP/EP300 40% Pérdida función Acetiltransferasa, regula bcló
(Mut/Del) yp53
Bcl2 (Ampl) 30% Aumento exp. Inhibidor apoptosis
Bcló (Transí) 25% Desregulación Regulador negativo respuesta
daño ADN
PRDM1 (Mut/Del) 25% Pérdida función Regulador diferenciación
terminal linfomas B
TNFAIP3 (Mut/Del) 20% Pérdida función Regulador negativo NF-kB
MYD88 (Mut) 29% Ganancia Activador NF-kB y
función JAK-STAT
CD79b (Mut) 20% Ganancia Activador NF-kB y BCR
función
CARD 11 (Mut) 9% Ganancia Activador NF-kB
función
CREBBP/EP300 15% Pérdida función Acetiltransferasa, regula bcló
(Mut/Del) yp53
JAK2 (Ampl) 50% Aumento exp. Activador JAK-STAT
PDL1, PDL2 (Ampl) 50% Aumento exp. Regulador respuesta inmune
Medi, linfoma B mediastínico.
CUADRO 13-10. Clasificación de los procesos linfoproliferativos postransplante (PTLD)
• Lesiones precoces
• Hiperplasia plasmocítica
• Proceso linfoproliferativo postransplante tipo mononucleosis infecciosa
• PTLD polimorfo
• PTLD monomorfo: B, T o NK
• PTLD tipo Hodgkin clásico
• Estadio IV. Compromiso diseminado (multifocal), de uno o más sitios extragan-

glionares, con o sin ganglios asociados comprometidos, o compromiso extralinfático
aislado con compromiso ganglionar no regional.
A: asintomático.
B: fiebre > 38 °C, sudoración nocturna o pérdida inexplicable de más del 10%
del peso corporal en los 6 meses previos al diagnóstico.
NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS

Obedecen a alteraciones de las células que participan en la producción de anticuerpos.
Se caracterizan por la síntesis y secreción de gammaglobulina homogénea (proteína M).
Las principal gammapatía monoclonal es el mieloma múltiple (MM). La etiología de
estos cuadros es desconocida, aunque se ha considerado el efecto de radiaciones, tóxicos
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 13-11. Tipos histológicos reconocidos del linfoma de Hodgkin
• Predominio nodular linfocítico

• Clásico
• Esclerosis nodular clásica
• Rico en linfocitos clásico
• Celularidad mixta clásica
• Depleción linfocitaria clásica
TABLA 13-13. Diferencias clínicas entre linfoma no hodgkiniano y Hodgkin
Característica Hodgkin No hodgkiniano

Edad de aparición Adulto joven Adulto mayor
Inicio Ganglionar Extraganglionar
Progresión Ordenada Irregular
Infiltración celular linfoide Escasa Masiva
Respuesta al tratamiento Buena Regular
Fiebre Frecuente Poco habitual
químicos o estímulos crónicos de las defensas como las infecciones y los síndromes
inflamatorios crónicos.
El componente M de la banda monoclonal característica del patrón electroforético
en estos trastornos es una proteína homogénea que se caracteriza por precipitar en frío,
formar fibrillas de amiloide, poseer una elevada viscosidad intrínseca y form ar com
plejos con otras proteínas, especialmente los factores de coagulación. En general, es
una inmunoglobulina completa (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) que posee un único tipo de
cadena ligera ( k o X ) , lo que le confiere u n carácter clonal. Otras veces pueden ser una
única cadena pesada con una cadena ligera o una cadena ligera ( k o X) libre con o sin
inmunoglobulinas completas o fragmentos de cadena pesada.
La presencia de una proteína M suele ser, prácticamente siempre, un hallazgo elec
troforético que se pone de manifiesto en la electroforesis de proteínas séricas, p or una
fracción o banda, estrecha y densa, en la zona de las inmunoglobulinas (banda m ono
clonal). Esta imagen electroforética permite establecer el diagnóstico de gammapatía
m onoclonal e iniciar los estudios necesarios para establecer la diferenciación entre
formas benignas (gammapatía m onoclonal de significado indeterminado) y malignas
(MM, macroglobulinemia de W aldenstrom, etc.). Este estudio debe iniciarse con las
determinaciones siguientes:
• Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM).
• Inmunoelectroforesis e inmunofijación de proteínas séricas. Sirve para identificar el
tipo de cadena pesada (IgG, IgA, IgM) o cadena ligera ( k o X) implicadas en cada
caso.
• Electroforesis, inmunoelectroforesis e inmunofijación en orina. De utilidad para
detectar proteinuria de Bence-Jones o identificación de cadenas ligeras ( k o X) libres.
La forma más frecuente en la práctica clínica de gammapatía monoclonal es la llamada
gammapatía monoclonal de significado indeterminado, conocida como monoclonalgam-
mopathy o f undetermined significance (MGUS), y cuya única característica es el hallazgo
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 13-14. Neoplasias de células plasmáticas
MGUS Mieloma asintomático Mieloma sintomático

Componente M en suero < 30 g/1 Componente M en suero > 30 g/1 Componente M en suero o
en orina
Plasmocitosis medular < 10% o Plasmocitosis medular Plasmocitoma o células
escasa plasmocitosis en muestra clonal > 10% plasmáticas clónales (si
histopatológica por citometría ratio IF
aberrante/reactivo > 9 /1 )
Sin lesiones orgánicas o tisulares Sin lesiones orgánicas o tisulares Lesiones orgánicas y
atribuibles a la plasmocitosis atribuibles a la plasmocitosis, tisulares, incluyendo
incluidas lesiones óseas o lesiones óseas
síntomas
MGUS, monoclonal gammopathy o f undetermined significance.
casual de una banda monoclonal al realizar la electroforesis de proteínas. La MGUS se

observa en un 3% de la población de más de 70 años y, en general, no presenta evolución
hacia la malignidad. Para establecer el diagnóstico de MGUS, la banda electroforética debe
acompañarse de una concentración de la Ig clonal en suero inferior a 20 g/1, ausencia de
proteína de Bence-Jones urinaria y un porcentaje de células plasmáticas en médula ósea
inferior al 5%. La observación casual de una banda monoclonal y el diagnóstico de MGUS
deben ir seguidos de un control periódico de la concentración de Ig sérica al objeto de
prevenir la malignización del proceso. Un dato de mal pronóstico (probable evolución
hacia MM) es la aparición de cadenas libres en orina (proteína de Bence-Jones). Por ello,
en la actualidad se preconiza incluir en el estudio inicial del análisis de cadenas Ubres en
suero y utilizar también este criterio para el control evolutivo de todo MGUS.
El MM es la enfermedad paradigmática de este grupo que obedece a una neoplasia
maligna clonal de células B m aduras (células plasm áticas), que producen grandes
cantidades de un tipo de inmunoglobulina clonal (proteína M ). Es muy im portante
conocer los criterios de laboratorio imprescindibles para establecer el diagnóstico de
MM y diferenciarlo de otras gammapatías monoclonales, en especial de la MGUS. Las
células plasmáticas se acumulan principalmente en médula ósea y hueso, y raramente en
localizaciones extraóseas. La incidencia del MM oscila en alrededor de un caso por cada
100.000 habitantes y es más frecuente en varones mayores de 60 años. La expresividad
clínica del MM viene dada p or el crecimiento celular y la producción de proteína M
(tablas 13-14 y 13-15).
TABLA 13-15. Valoración de la repercusión orgánica de las proliferaciones de células

plasmáticas
Lesión Definición
Hipercalcemia Calcemia corregida > 0,25 mmol/1 por encima del límite de normalidad o
>2,75 mmol/1
Insuficiencia renal Creatinina > 173 (xmol/1
Anemia Hemoglobina < 2 g/dl del límite inferior de la normalidad o Hb < 10 g/dl
Lesiones óseas Lesiones líticas u osteoporosis con fracturas por compresión
Otras Hiperviscosidad sintomática, amiloidosis
Infecciones bacterianas recurrentes (más de dos episodios en 12 meses)
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 13-13. Célula plasmática en

sangre periférica de un paciente afecto
de mieloma múltiple.
D iagnóstico del m ielom a m últiple

• Hemograma. Generalmente, se aprecia una anemia moderada normocítica normo-
crómica arregenerativa, con eritrocitos formando pilas de moneda y una ES elevada,
salvo cuando existen crioglobulinas, que la disminuyen. Los leucocitos suelen ser
cuantitativamente normales, aunque normalmente se observa linfopenia. Ocasio
nalmente, hay leucopenia, linfocitos inmaduros y/o células plasmáticas (fig. 13-13).
Las plaquetas están normales.
• Mielograma. Es característica la plasm ocitosis m edular con asincronía núcleo-
citoplasm a. Pueden tam b ién observarse inclusiones citoplasm áticas hialinas
llamadas cuerpos de Russell, inclusiones nucleares, gránulos eosinofílicos y reac
ción de PAS positiva p or acum ulación de gam m aglobulina en el núcleo, aparato
de Golgi y espacio inter- e intracisternas.
• Electroforesis de proteínas, inmunofijación, cuantificación de inmunoglobulinas. Las
alteraciones proteicas presentes en el mieloma son la presencia de componente M
en suero y/o proteína de Bence-Jones (PBJ) en la orina. La forma más frecuente de
MM es IgG (del 50 al 60% de los casos), seguida del MM IgA (el 20% de los casos),
IgD (del 1 al 2%). Los mielomas IgE o IgM son m y raros. En un 15% de los casos
solo se observan cadena ligeras ( k o X.) en la orina. La gammapatía puede ser también
biclonal (del 0,5 al 2,5%), y la IgG + IgA es la forma más frecuente.
• p 2-microglobulina. Es una cadena ligera que se encuentra en los antígenos de his-
tocompatibilidad clase I HLA A, B y C, y cuya síntesis está controlada por un gen del
cromosoma 2. Está presente en casi todas las células, se libera a los fluidos corporales
en pequeñas cantidades y se filtra por el riñón, se reabsorbe y cataboliza. Se eleva en
el MM, pero también en síndromes linfoproliferativos, por lo que no es útil para el
diagnóstico pero sí para el pronóstico y la evaluación de la respuesta al tratamiento.
• Estudio radiológico óseo. El examen radiológico de elección en el MM es la radiografía
ósea, especialmente la craneal. Las lesiones óseas pueden ser múltiples, localizadas
en sitios de médula ósea roja, costillas, esternón, columna, clavículas, cráneo, epífisis
proximales de huesos largos y pelvis. Las lesiones presentan características en saca
bocados, redondeadas, líticas sin halo de regeneración. Son frecuentes las fracturas
espontáneas.
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CUADRO 13-12. Clasificación de procesos neoplásicos histiocíticos y de células

dendríticas
• Sarcoma histiocítico
• Histiocitosis de células de Langerhans
• Sarcoma de células interdigitantes dendríticas
• Sarcoma de células dendríticas foliculares
• Tumor de células fibroblásticas reticulares
• Tumor de células dendríticas intermedias
• Xantogranuloma juvenil diseminado
• Estudio defunción renal.

• Citogenética. Es imprescindible estudiar las lesiones de 17p y la presencia de las trans
locaciones t(4; 14)(p 16;q32) y la t(14;16)(q32;q23) que confieren mal pronóstico.
• Inm uno fenotipo y contenido de AD N . El contenido de ADN, estudiado mediante
citometría de flujo y FISH, muestra aneuploidías en el 90% de las células; del 60 al 70%
son hiperploidías y del 10 al 25%, hipoploidías. El FISH detecta cambios numéricos
en células de interfase, como monosomías o trisomías. El inmunofenotipo de sangre
periférica o médula ósea es positivo para los antígenos CD38, CD 138, CD56+/— y
negativo para CD45 y CD 19. Puede existir positividad para cadenas ligeras k o X
citoplasmáticas.
PROLIFERACIONES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

Son entidades poco frecuentes que afectan sobre todo a niños y jóvenes. Cursan con
adenopatías, hemofagocitosis, hepatoesplenomegalia, alteraciones endocrinas y óseas.
Las reacciones inmunohistoquímicas con langerina (CD207), CD la y S I00 son muy
útiles para establecer el diagnóstico (cuadro 13-12).
Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, et al. W HO classification o f tumours
of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC; 2008.
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Capítulo 13 Métodos para la clasificació n de las hemopatías malignas 3 6 5 .e l
Autoevaluación
1. Las leucemias mieloides agudas con alteraciones genéticas recurrentes reconocidas por la
OMS son:
(a) LMA con t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1.
(b) LM Aconinv(16)(pl3.1q22) o t(16;16)(pl3.1;q22) CBFB-MYH11.
(c) LMA con t(15;17)(q22;ql2) PML-RARA.
(d) LMA con inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2) RPN1-EVI1.
(e) Todas las anteriores y algunas que no se mencionan.
Respuesta razonada: esta categoría se amplía conforme se incrementan los conocimientos de
la biología de la LMA.
2. Los marcadores de línea más frecuentemente empleados en la definición inmunofenotípica
de las leucemias agudas son los que tienen más puntuación en las escalas habituales. El de
mayor puntuación de los que se mencionan es:
(a) CD64.
(b) CD 15.
(c) CD3 citoplasmático.
(d) TdT.
(e) CD33.
Respuesta razonada: define línea T el CD3 citoplasmático.
3. La m utación V617F de JAK2 puede encontrarse en:
(a) La LMC.
(b) Es diagnóstica de policitemia vera.
(c) Excluye el diagnóstico de mielofibrosis.
(d) Es m uy rara y solo se encuentra en casos raros de trombocitemia esencial.
(e) Puede encontrarse en diferentes síndromes mieloproliferativos excepto en la LMC.
Respuesta razonada: JAK2 se encuentra m utado en diferentes tipos de SMPC.
4. El inmunofenotipo de la LLC no presenta como característica:
(a) Expresión de CD5.
(b) Positividad de CD23.
(c) Expresión débil de inmunoglobulinas.
(d) Positividad de CD 10.
(e) Puede expresar ZAP70.
5. Los linfomas NK:
(a) Son extremadamente comunes.
(b) Tienen un curso habitualmente benigno.
(c) Nunca afectan a la región de la cara.
(d) No expresan CD2.
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C A P Í T U L O 14
Métodos para la clasificación y el diagnóstico

de las anemias
J. L. Vives Corrons
CONCEPTO DE ANEMIA
La anemia se define como una disminución de la concentración de hemoglobina (Hb)
en sangre. Invariablemente, se acompaña de un descenso del hematocrito y casi siempre,
también, del número de eritrocitos. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS)
existe anemia cuando la Hb en sangre es inferior a 130 g/1 en el hombre y 120 g/1 en la
mujer. En el niño este criterio varía según la edad, de forma que, desde los 6 meses hasta los
6 años, el límite inferior de la hemoglobina es de 110 g/1, y entre los 6 y 14 años, de 120 g/1.
Al valorar una anemia, deben tenerse siempre en cuenta todas aquellas situaciones en las
que pueda existir una alteración de la distribución entre los volúmenes plasmático y globular,
ya que esta puede dar lugar a falsas disminuciones de la concentración de Hb (falsa anemia
por hemodilución); tal y como sucede, por ejemplo, durante el embarazo (anemia fisiológica).
La anemia constituye una de las causas más frecuentes de consulta general y hemato-
lógica, por lo que su diagnóstico reviste gran importancia clínica. Aunque su mecanismo
fisiopatológico común es el desequilibrio entre la formación de eritrocitos por la médula
ósea (eritropoyesis) y su eliminación por los macrófagos (hemólisis), el hecho de que la
anemia siempre se halle asociada a un trastorno o enfermedad subyacente hace que sus
causas puedan ser muy diversas. Es por ello que, en ocasiones, determinar la causa de
una anemia puede ser uno de los problemas más difíciles de la patología médica.
Con mucho, la causa más frecuente de anemia es la falta de hierro (anemia ferropé-
nica), que afecta de forma especial a mujeres y niños en edad de crecimiento.
TIPOS DE ANEMIA
Desde el punto de vista fisiopatológico, la anemia puede clasificarse en dos grandes
grupos:
1. Anemia regenerativa.
2. Anemia arregenerativa.
Anem ia regenerativa
Se caracteriza por un aumento de los precursores eritroides (eritroblastos) de la médula
ósea, o regeneración eritroblástica, por efecto del estímulo de la eritropoyetina (Epo)
cuya síntesis se halla aumentada por efecto de la hipoxia. Cuando no existe trastorno de
la médula ósea la regeneración eritroblástica constituye el mecanismo fisiológico de res
puesta del organismo para hacer frente al descenso de la concentración de hemoglobina.
Toda regeneración eritroblástica propia de una anemia regenerativa se acompaña siempre
de un aumento de reticulocitos (reticulocitosis). Existen dos causas fundamentales de

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Capítulo 14 Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias 367
anemia regenerativa: la hemorragia (extravasación de sangre con pérdida de eritrocitos) y

hemolisis (disminución de la supervivencia de los eritrocitos en la circulación). La hemo
rragia suele ser consecuencia de una lesión vascular con extravasación o pérdida de sangre.
Si es externa, es fácilmente detectable, pero si es interna a veces resulta difícil de localizar,
especialmente cuando es crónica y de pequeña intensidad (enfermedad de Rendu-Osler
o telangiectasia hemorrágica congénita). En el caso de hemorragia aguda e intensa existen
dos fases separadas por un período de pocas horas. Inmediatamente después de la hemo
rragia se produce una brusca disminución de la volemia, lo que significa una disminución
simultánea de eritrocitos y plasma. Debido a ello durante este período inicial, el descenso
de la hemoglobina es poco apreciable. Pasadas 2 o 3 h, la hemodilución con que el organis
mo intenta compensar el descenso de la volemia produce una rápida disminución de la
concentración de hemoglobina (anemia aguda), cuya intensidad dependerá del volumen
de sangre perdida. La hemorragia crónica y de pequeño volumen, como sucede en ciertas
enfermedades del aparato digestivo, produce una pérdida progresiva de hierro y con ello,
a la larga, una anemia ferropénica. La hemólisis es la disminución del período de vida
normal de los eritrocitos en la circulación. Después de salir de la médula ósea, los eritrocitos
circulan por la sangre durante aproximadamente 120 días, siendo finalmente eliminados
de la circulación por los macrófagos del sistema mononuclear fagocítico (SMF). Cuando
los eritrocitos son eliminados precozmente de la circulación (antes de los 120 días) existe
hemólisis, y si esta es suficientemente intensa aparece una anemia (anemia hemolítica). Las
causas que pueden disminuir la vida de los eritrocitos en la circulación son muy diversas y
su identificación es fundamental para establecer el diagnóstico de una anemia hemolítica.
El método más preciso para evidenciar la destrucción acelerada de eritrocitos es la
determinación de la vida media eritrocitaria, mediante un procedimiento basado en el em
pleo de eritrocitos del propio organismo marcados con un trazador isotópico (5lCr, T 1/2)
(v. capítulo 7). Las principales causas de anemia hemolítica se resumen en el cuadro 14-1.
Anem ia arregenerativa
Se caracteriza p o r la incapacidad de la médula ósea para compensar el descenso de la
concentración de hemoglobina mediante un aumento de la actividad eritropoyética.
Puede obedecer a dos mecanismos:
CUADRO 14-1. Causas de anemia hemolítica
Causas congénitas
• Defectos genéticos de la membrana eritrocitaria (o esferocitosis hereditaria y eliptocitosis
congénita)
• Hemoglobinopatías (talasemias y hemoglobinopatías estructurales)
• Eritroenzimopatías (déficit en glucosa-6-fosfafo deshidrogenasa y piruvato cinasa)
Causas adquiridas
• Presencia en el plasma de anticuerpos contra la membrana eritrocitaria (anemia
hemolítica postransfusional y autoinmune)
• Lesión mecánica de la membrana eritrocitaria con rotura de los eritrocitos
al atravesar capilares trombosados o con depósitos de fibrina (anemias hemolíticas
microangiopáticas)
• Alteraciones adquiridas de la membrana de mecanismo desconocido: hemoglobinuria
paroxística nocturna (HPN)
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1. Mecanismo cuantitativo: eritropoyesis disminuida o ausente.

2. Mecanismo cualitativo: eritropoyesis ineficaz.
La disminución o ausencia de eritropoyesis obedece generalmente a una lesión de la
célula madre pluripotente o de alguna comprometida hacia la serie mieloide. Cuando
la lesión se halla en la célula madre pluripotente, la afectación no se limita a los eritro
citos, sino que se hace extensiva a las restantes células de la sangre, leucocitos, plaquetas
y, eventualmente, linfocitos. La forma mejor conocida de anemia arregenerativa es la
aplasia de médula ósea, caracterizada por una práctica desaparición de los progenitores
y precursores hematopoyéticos, que son substituidos p o r células grasas. Aunque su
forma más frecuente es adquirida y de aparición durante la edad adulta, existe una forma
muy rara de origen congénito y que aparece durante el período perinatal (enfermedad
de Fanconi). En cualquier caso, la aplasia de m édula ósea es una enfermedad grave
que prácticamente siempre cursa con pancitopenia y requerimiento transfusional. La
causa de su aparición durante la edad adulta se desconoce, aunque existen casos en los
que se asocia a infecciones víricas, contacto con sustancias químico-orgánicas (tóxicos
industriales, medicamentos o radiaciones ionizantes) o a enfermedades autoinmunes.
La aplasia exclusiva de la serie eritropoyética se conoce como eritroblastopenia y puede
tener también un origen congénito o adquirido. La eritroblastopenia se caracteriza por la
práctica desaparición de los eritroblastos de la médula ósea con conservación de las res
tantes células de la hematopoyesis. Es por ello que su manifestación clínica fundamental
es la anemia. Cuando aparece durante la edad adulta suele asociarse a un timoma, mien
tras que cuando lo hace durante el período perinatal lo más probable es que se trate de
una enfermedad de Blackfan-Diamond que, por su rareza, se incluye dentro de la lista
de las llamadas anemias minoritarias (www.enerca.org).
La eritropoyesis ineficaz obedece a un trastorno madurativo por el cual un porcentaje
elevado de eritroblastos desaparecen de la médula ósea antes de m adurar a eritrocitos.
Según su mecanismo fisiopatológico, la eritropoyesis ineficaz puede obedecer a dos
causas:
1. Alteraciones de la maduración del núcleo (síntesis de ADN).
2. Alteraciones de la maduración del citoplasma (síntesis de hemoglobina).
Las alteraciones de la maduración nuclear obedecen a un retraso en el proceso de
maduración celular por el cual se alargan las fases intermitóticas y se prolonga el tiempo
necesario para terminar el proceso. Debido a ello, junto a la muerte precoz por apoptosis
de un elevado porcentaje de eritroblastos, los que llegan a m adurar m uestran una
im portante disminución de la supervivencia en la circulación, con lo que la suma de
aborto medular y hemólisis constituye, en este caso, el mecanismo fisiopatológico de la
anemia. La forma mejor conocida de este tipo de anemia es la megaloblástica debido a
una carencia de factores vitamínicos de maduración nuclear: cobalamina (vitamina B12)
y folato cuyas causas pueden ser diversas (cuadro 14-2). El nombre de megaloblástica
proviene de la característica morfología de los eritroblastos con disociación madurativa
núcleo-citoplasmática, por la que son conocidos como megaloblastos (v. capítulo 16).
Pueden observarse alteraciones morfológicas similares, debidas también a u n tras
torno de la maduración nuclear, en otras formas de anemia que no responden a dichos
factores vitamínicos. Tales casos suelen ser debidos a trastornos adquiridos, generalmente
de la célula madre pluripotente, por los cuales existe un defecto en los procesos de dife
renciación y maduración de las células hematopoyéticas. En este caso, aunque la anemia
sea el signo más relevante, es frecuente observar también leucopenia y plaquetopenia.
Este tipo de anemias, más frecuentes en individuos de edad avanzada (>70 años), forman
parte de los llamados síndromes mielodisplásicos (SMD), denominación actual de lo
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CUADRO 14-2. Causas de anemia megaloblástica
Déficit de vitamina B12

• Ingesta inadecuada (vegetarianismo estricto)
• Trastornos de la absorción intestinal o malabsorción (anemia perniciosa por defecto
de factor intrínseco)
Déficit de ácido fólico
• Ingesta inadecuada
• Hiperconsumo (crecimiento, gestación y anemias hemolíticas)
• Bloqueo medicamentoso de su absorción o metabolismo (terapéutica con citostáticos
antagonistas del ácido fólico)
que durante muchos años se conoció como anemias refractarias, porque no responden
a ningún tratamiento. Su diagnóstico generalmente es difícil, y exige la práctica de un
estudio morfológico y citogenético de la m édula ósea, además de otros aspectos que
son tratados ampliamente en el capítulo 13. También existen alteraciones congénitas
de la maduración nuclear que forman un grupo de anemias muy raras conocidas con el
nombre de anemias diseritropoyéticas congénitas.
Las alteraciones de la m aduración citoplasmática obedecen prácticamente siem
pre a defectos en la síntesis de hemoglobina, por lo que su característica común es la
de una hipocromía, es decir, escaso contenido hemoglobínico intraeritrocitario. En
general, esta hipocromía se acompañan también de una disminución del volumen celular
o microcitosis (VCM < 82 fl). La causa más frecuente de anemia hipocroma y microcítica
es la anemia por déficit de hierro o ferropénica, pero puede obedecer a otras causas diver
sas que se resumen en el cuadro 14-3. En el área mediterránea, otra causa relativamente
frecuente de anemia hipocroma y microcítica es el defecto congénito de la síntesis de
cadenas globina o talasemia que se estudia ampliamente en el capítulo 17. En el diag
nóstico diferencial de las anemias hipocromas y microcíticas debe tenerse siempre en
cuenta la anemia inflamatoria o asociada a procesos inflamatorios crónicos, porque sus
características hematológicas son prácticamente superponibles a la anemia ferropénica,
solo que en este caso se observa un exceso de hierro no utilizado en los macrófagos de la
médula ósea (fig. 14-1) en lugar de una ausencia. Ambas formas de anemia, ferropénica
e inflamatoria, son tratadas ampliamente en el capítulo 15.
Los trastornos congénitos o adquiridos de la síntesis del grupo hemo constituyen causas
mucho más raras de anemia microcítica y/o hipocroma. Su diagnóstico está facilitado
por la gran elevación de la sideremia y de la cantidad de hierro medular, tanto a nivel
de las células del SMF como de los eritroblastos (sideroblastos). Como consecuencia de
ello se produce un estado de sobrecarga de hierro con acumulación del mismo en el
CUADRO 14-3. Causas de alteración de la síntesis de hemoglobina
• Más frecuente: carencia de hierro (anemia ferropénica)

• Otras causas
• Bloqueo del hierro en el sistema mononuclear fagocítico (procesos inflamatorios
crónicos)
• Déficit congénito de la síntesis de globina (talasemias)
• Déficit congénito/adquirido de la síntesis del grupo hemo (anemia sideroblástica)
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FIGURA 14-1. Imagen de un

macrófago de la médula ósea obtenida
mediante la tinción de Perls.
interior de las mitocondrias, que ven alterada su morfología y propiedades funcionales

(sideroacresia). El diagnóstico de una anemia sideroblástica requiere la realización de
un examen morfológico y tinción de Perls del aspirado medular que muestra, junto a un
aumento de la serie eritropoyética (con ciertos rasgos diseritropoyéticos) y del hierro
macrofágico, la presencia de un número de sideroblastos superior al normal (>70% ) en
muchos de los cuales los precipitados de hemosiderina se disponen alrededor del núcleo,
por lo que son conocidos como sideroblastos «en anillo» (fig. 14-2). La reciente aparición
de formas hereditarias de anemia ferropénica refractarias a la administración de hierro
(IRIDA de la terminología anglosajona) ha creado un nuevo y atractivo campo en el
estudio de las anemias que, junto con todo lo que se acaba de mencionar, será objeto
de estudio en el capítulo 15.
SISTEMÁTICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE UNA ANEMIA

La anemia no es una enfermedad, sino la manifestación de una enfermedad subyacente.
Por ello, en el diagnóstico de toda anemia debe tenerse siempre presente la historia
clínica y los datos aportados por el examen físico del paciente; las exploraciones com
plementarias deben incluir, por orden cronológico, un hemograma con recuento de
reticulocitos, un estudio de la morfología eritrocitaria y todas aquellas pruebas necesarias
para investigar su origen. Tal y como se ha mencionado en el capítulo 4, un hemograma
FIGURA 14-2. Sideroblastos

«en anillo» en un paciente con
síndrome mielodisplásico tipo
anemia refractaria sideroblástica.
Apréciense los precipitados de
hemosiderina rodeando el núcleo
(MGG X 1.000).
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es el examen básico de los componentes celulares que circulan por la sangre y por ello se
le conoce también como «perfil hematológico básico» (cuadro 14-4).
Un hemograma estándar incluye las magnitudes siguientes:
• Eritrocitos
• Concentración de hemoglobina.
• Concentración de eritrocitos.
• Hematocrito.
• índices eritrocitarios (VCM, HCM y CCM H).
• Amplitud de la curva de distribución eritrocitaria (ADE o RDW).
• Leucocitos
• Concentración de leucocitos.
• Recuento diferencial leucocitario (RDL).
• Plaquetas
• Concentración de plaquetas.
• Tamaño plaquetario (VPM).
• Amplitud de la curva de distribución de plaquetas (ADP o PDW).
En caso de anemia deben añadirse siempre otras dos magnitudes:
• Reticulocitos.
• Examen morfológico del frotis de sangre teñido.
Concentración de hem oglobina

La existencia de anemia viene definida exclusivamente por la concentración de hemo
globina. Por ello, dada la gran trascendencia clínica que esta m edida com porta, el
Comité Internacional para la Estandarización de Hematología (ICSH) y la OMS han
estandarizado su procedimiento para reducir al m ínim o las posibles causas de error
metodológico (v. capítulo 6). La utilización de analizadores automatizados ha permitido
una determinación rápida y fiable de la concentración de hemoglobina, y también de
las restantes magnitudes del hemograma, entre las que destacan los recuentos de células
(eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y los índices eritrocitarios (volumen corpuscular
m edio [VCM], hem oglobina corpuscular media [HCM] y concentración media de
hemoglobina corpuscular [CCMH]).
Volumen corpuscular m edio y otros índices eritrocitarios

Independientemente de su grado de automatización, todos los analizadores automatizados
suministran, de forma sistemática, el VCM. Por ello, hoy en día, cualquier laboratorio clínico
puede diferenciar entre anemia microcítica (VCM < 83 fl), macrocítica (VCM > 98 fl)
y normocítica (VCM entre 83 y 98 fl), lo que perm ite establecer de forma inmediata
CUADRO 14-4. Perfil hematológico básico
• Hemograma
• Concentración de hemoglobina
• Valor hematocrito
• Recuentos celulares (eritrocitos, leucocitos y plaquetas)
• índices eritrocitarios: a) volumen corpuscular medio; b) hemoglobina corpuscular
media, y c) concentración corpuscular media de hemoglobina
• Fórmula leucocitaria y morfología de los eritrocitos
• Recuento de reticulocitos
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una prim era orientación diagnóstica. Así, una anemia microcítica es probablemente
ferropénica y una anemia macrocítica, probablemente megaloblástica. Cuando la anemia
se acompaña de un VCM normal (anemia normocítica), el diagnóstico es más difícil ya
que puede obedecer a causas muy diversas, muchas de ellas no debidas a una enfermedad
de la sangre sino de otros órganos o sistemas. Por ello ante una anemia normocítica, el
valor de la concentración de reticulocitos puede contribuir decisivamente a establecer
la orientación diagnóstica hacia u n a anemia de carácter regenerativo (reticulocitos
aumentados) o arregenerativo (reticulocitos normales o disminuidos).
El VCM, com binado con otras magnitudes eritrocitarias, se ha utilizado durante
m ucho tiem po como m étodo sim ple para el escrutinio de rasgo talasém ico m e
diante el cálculo de un factor discriminante que facilite el diagnóstico diferencial con la
ferropenia. Uno de los factores discriminantes más empleados es el de England y Fraser
(FD), obtenido por cálculo matemático a partir de los propios parámetros suministrados
por el analizador:
FD = VCM - Cifra de eritrocitos - (5 x Hb) -3 ,4
Valores de VCM superiores a 98 fl son indicativos de macrocitosis, es decir, un pre

dom inio de eritrocitos con tam año superior al norm al. La causa más frecuente de
macrocitosis es la anemia megaloblástica por carencia de ácido fólico o vitamina B12. La
medida sistemática del VCM ha permitido observar tam bién frecuentes macrocitosis
sin anemia que obedecen a situaciones diversas no necesariamente relacionadas con un
déficit de factores madurativos o la presencia de megaloblastosis. Un ejemplo de ello es
la macrocitosis asociada a ciertas hepatopatías crónicas, alcoholismo o tabaquismo. La
relación entre macrocitosis y alcoholismo es tan constante que la determinación del VCM
se ha utilizado junto a otras pruebas biológicas, como índice de ingesta crónica de alcohol.
La HCM y la CMHC son los índices eritrocitarios relacionados con la concentración
de hemoglobina. De ellos, el de mayor valor práctico es la HCM, ya que la CMHC que,
teóricamente debería ser el índice más preciso del contenido hemoglobínico eritrocitario,
presenta casi siempre un valor normal, aun en presencia de disminuciones importantes
de la concentración de hemoglobina debido a que, se obtiene por cálculo matemático
a partir de la hemoglobina y del hematocrito. El empleo de analizadores que miden de
forma independiente el VCM y la HCM permite, gracias a la aplicación del llamado
«principio de Mié», ofrecer un valor real de la CMHC que resulta útil para el diagnóstico
de ciertas anemias minoritarias de origen congénito y caracterizadas por un aumento de
la HCM (hipercromía); ejemplo de ello son la esferocitosis hereditaria y la xerocitosis
congénita, dos causas raras de hemolisis corpuscular e intensa anemia.
Recuento de reticulocitos
Junto al hemograma, el recuento de reticulocitos es la m agnitud de mayor valor para
el estudio de una anemia, ya que permite diferenciar entre mecanismo central (anemia
arregenerativa) y periférico (anemia regenerativa).
El resultado del recuento de reticulocitos puede expresarse en tanto por ciento, con
respecto a la cifra global de eritrocitos, o en valor absoluto. En el prim er caso, es obligado
realizar una corrección debido a que el porcentaje se refiere siempre a una cifra normal de
eritrocitos, lo cual no se cumple prácticamente nunca en la anemia, en donde en la mayoría
de los casos existe un descenso del número de eritrocitos. Sin la corrección, el porcentaje de
reticulocitos queda referido a una población eritrocitaria numéricamente normal y, por
tanto, su valor cuando esta se halla disminuida es siempre superior al real (v. capítulo 4).
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Exam en m orfológico de la sangre

El examen morfológico de los eritrocitos en una extensión de sangre bien realizada y
teñida constituye una exploración imprescindible en el diagnóstico etiológico de toda
anemia. Ello es así ya que en ciertas anemias, la observación de la morfología eritroci
taria constituye el único procedimiento diagnóstico de valor (esferocitosis hereditaria,
eliptocitosis congénita y anemia hemolítica microangiopática o mecánica). Asimismo,
ante cualquier anemia de origen desconocido, resulta útil valorar la intensidad de la
policromasia (índice de reticulocitosis), anisopoiquilocitosis con dacriocitosis y presencia
de algún eritroblasto (metaplasia mieloide), punteado basófilo (saturnismo, talasemia)
y anillos de Cabot o cuerpos de Howell-Jolly (diseritropoyesis, esplenectomía).
Para interpretar las alteraciones morfológicas eritrocitarias, se puede hacer una
clasificación en cuatro grandes grupos:
1. Alteraciones del tamaño.
2. Alteraciones de la forma.
3. Alteraciones del color.
4. Presencia de inclusiones.
Alteraciones del tamaño

Actualmente, las alteraciones del tamaño eritrocitario se basan en los datos cuantitativos
aportados por el VCM, por lo que no se requiere la observación de la extensión de sangre
La medida electrónica del tamaño eritrocitario tiene el grado de exactitud y precisión que
requiere el diagnóstico clínico. En caso de rasgo talasémico, el examen de la morfología
eritrocitaria suele m ostrar una población de eritrocitos microcíticos que, debido a su
uniformidad, podría pasar fácilmente desapercibida mediante el examen óptico conven
cional de la extensión. Si bien es cierto que una hipocromía muy intensa como la que
puede observarse en algún caso de anemia ferropénica, no suele pasar nunca inadvertida
a los ojos de un observador experto, la microcitosis del rasgo talasémico, especialmente
cuando es muy uniforme y afecta a casi la totalidad de la población eritrocitaria, puede
resultar difícil de apreciar. En este caso, la ventaja de los analizadores automatizados
sobre el ojo humano es que, al valorar individualmente el tamaño de gran número de
eritrocitos, la microcitosis, cuando existe, no pasa nunca inadvertida.
En ocasiones, pueden coexistir simultáneamente varias alteraciones de tamaño, lo
que se denomina anisocitosis. La macrocitosis, un signo morfológico característico de la
anemia megaloblástica, consiste en la presencia de macrocitos (o megalocitos), que son
eritrocitos de gran tamaño y a veces ligeramente ovalados; este rasgo lo define como de
origen megaloblástico (fig. 14-3). Se observan, por tanto, en la anemia megaloblástica
por déficit de vitamina B12 o ácido fólico, aunque ocasionalmente pueden observarse
tam bién en ciertas anem ias diseritropoyéticas acom pañando a una mielodisplasia
adquirida o a un trastorno congénito. No siempre que se aprecia macrocitosis debe
pensarse en megaloblastosis, ya que existen causas de macrocitosis no megaloblástica.
Tal sucede en las hepatopatías crónicas y en grandes fumadores. En todos estos casos,
los macrocitos son redondos, no ovales, y no suelen aparecer signos de eritropoyesis
ineficaz como, por ejemplo cuerpos de Hovell-Jolly o anillos de Cabot característicos
de la anemia perniciosa.
Alteraciones de la forma
La alteración de la forma eritrocitaria puede obedecer a defectos hereditarios o adquiridos
de la eritropoyesis (diseritropoyesis) o del eritrocito (eritropatías).
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FIGU RA 14-3. Frotis de sangre de un paciente con anemia macrocítica debida a déficit de vitamina B12
(anemia perniciosa). Muchos eritrocitos muestran un tamaño superior al normal (macrocitos) y
algunos contienen inclusiones llamadas «cuerpos de Howell Jolly». Los macrocitos de mayor tamaño
muestran también cierto grado de ovalocitosis, lo que es una consecuencia más del trastorno madurativo.
Apréciese también un polinuclear hipersegmentado (pleocariocito) característico de las anemias carenciales
de curso avanzado, muy especialmente de las secundarias a déficit de folato y vitamina B12, aunque pueden
observarse también en la anemia ferropénica (MGG X800).
En la diseritropoyesis, lo que suele observarse es la coexistencia de eritrocitos con

diversas formas (poiquilocitosis). Igualmente sucede con las alteraciones morfológicas
adquiridas por acción de diferentes causas extraeritrocitarias (anisopoiquilocitosis).
En los defectos eritrocitarios congénitos o de origen hereditario, predomina un tipo
de alteración morfológica sobre cualquier otra, lo que facilita el diagnóstico. Entre estas,
las más frecuentes son las siguientes:
• Esferocitos. Son eritrocitos que tienen forma esférica, es decir, un diámetro inferior
al norm al. No obstante, conservan el m ism o VCM que los eritrocitos norm ales
(fig. 14-4). La causa más frecuente de esferocitos es la hereditaria o enfermedad de
Minkowski-Chauffard, en la que existe un pequeño porcentaje de eritrocitos esféricos
debido a un defecto congénito de la membrana eritrocitaria (alteración estructural de

de un paciente con esferocitosis
hereditaria. Los esferocitos se identifican
por su menor diámetro y su mayor
densidad hemoglobínica. Apréciese
que los esferocitos carecen de la palidez
central característica de los eritrocitos
maduros (MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 14-5. Frotis de sangre

de un paciente doble heterocigoto
con hemoglobinopatía C/p-talasemia
(Hb 7,5 g/1 y VCM 67 fl). Junto
a eritrocitos prácticamente desprovistos
de hemoglobina (hipocromía),
se observan otros cuya palidez
central forma una imagen densa
con una disposición que recuerda
a la de una diana. A estos eritrocitos
se les conoce como dianocitos
o codocitos (MGG X800).
la anquirina, la banda 3 o de la proteína 4,2). La esferocitosis puede tener también un

origen adquirido, como, por ejemplo, en los casos en que la membrana eritrocitaria
se altera por factores extraeritrocitarios diversos tales como anticuerpos (anemia
hemolítica autoinmune), toxinas bacterianas (lecitinasa del Clostridium welchii) o
efectos mecánicos (anemia microangiopática) (v. capítulo 18).
Codocitos. Son eritrocitos que poseen un exceso de superficie, por lo que aparece
en su región central un área con mayor contenido hemoglobínico (zona densa),
que se sitúa en el centro del área clara norm al. Esto explica el que se les conozca
clásicamente con el nombre de eritrocitos en diana o dianocitos, y frecuentemente
son observados en ciertas hemoglobinopatías, tales como la talasemia y HbC, o en
la anemia ferropénica y en ciertas hepatopatías crónicas con aumento del contenido
en colesterol y fosfolípidos de la m embrana eritrocitaria (fig. 14-5).
Drepanocitos. Se denominan también eritrocitos falciformes por su forma caracterís
tica, ya que, debido a un proceso de polimerización hemoglobínica, se alargan y
adquieren forma de hoz o media luna. Su aparición es propia del estado homocigoto
de hemoglobinopatía S y su núm ero aumenta si la sangre se expone a condiciones
anaerobias o a agentes reductores (fig. 14-6).

de un paciente de raza negra
afecto de una anemia falciforme
por hemoglobinopatía S homocigota
(HbS). Los eritrocitos falciformes
se identifican fácilmente por su forma
alargada (rígida), en semiluna o de hoz
(MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 14-7. Frotis de sangre

de un paciente afecto de eliptocitosis
congénita (EC), en el que los eliptocitos
se identifican por su forma alargada
y ovalada (MGG X800).
Eliptocitos. En esta alteración morfológica, los eritrocitos son alargados u ovales

(ovalocitos) y presentan un diámetro longitudinal superior al transversal, por lo
que adquieren la forma de «puro habano» u ovoide (fig. 14-7). Su presencia puede
ser debida a una alteración congénita de la m em brana eritrocitaria (eliptocitosis
congénita), aunque también se observa de forma adquirida en el curso de la anemia
megaloblástica, ferropénica o arregenerativa (mielofibrosis medular) (v. capítulo 18).
Equinocitos. Son eritrocitos cuya superficie se halla repleta de prominencias cortas,
tienen una base de implantación ancha y están distribuidos regularmente (eritrocitos
espiculados o crenados) (fig. 14-8). La equinocitosis es un fenómeno que aparece es
pontáneamente en sangre conservada debido a un descenso del ATP intraeritrocitario,
aunque puede observarse en el curso de ciertas eritroenzimopatías de la glucólisis
(déficit de piruvato cinasa) o de ciertas enfermedades no hematológicas (insuficiencia
renal).
Acantocitos. Son eritrocitos esferoidales que presentan prominencias superficiales
alargadas y que casi siempre están distribuidas de manera irregular; su base de im
plantación es estrecha (fig. 14-9). Característicamente, esta alteración eritrocitaria
aparece en un tipo de enfermedad congénita denominada acantocitosis, en la que
FIGURA 14-8. Sangre periférica de

un paciente afecto de déficit congénito
de piruvato cinasa (PK) eritrocitaria.
Se observan numerosos equinocitos
o eritrocitos con prominencias cortas,
distribuidas regularmente, y cuya base
de implantación es relativamente ancha
(MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 14 Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias

de un paciente con abetalipoproteinemia
y acantocitosis. Los acantocitos,
a diferencia de los equinocitos, son
esferoidales con prominencias alargadas
con base de implantación estrecha y, casi
siempre, distribuidas irregularmente
(MGG X800).
existe ausencia de lipoproteínas plasmáticas. Asimismo, puede observarse también

en el curso de la insuficiencia hepatocelular grave (spur-cells).
Dacriocitos. Reciben esta denominación los eritrocitos con forma de lágrima o de
raqueta (fig. 14-10) y suelen observarse en los trastornos de la eritropoyesis (anemia
megaloblástica, anemia ferropénica, talasemia) y, fundamentalmente, en la fibrosis
medular o mielofibrosis.
Esquistocitos. Corresponden a eritrocitos rotos o fragmentados. En general, pue
den presentar formas muy diversas, aunque predom inan las triangulares o las que
adquieren el aspecto de un casco de guerrero (fig. 14-11). Los esquistocitos suelen
observarse en el curso de anemias hemolíticas de origen mecánico, anemias hemo-
líticas microangiopáticas o debidas a la colocación de prótesis valvulares.
Estomatocitos. Son eritrocitos que en su región central clara poseen una hendidura
en forma de boca (fig. 14-12). Aparecen de forma característica en una enfermedad
conocida con el nombre de estomatocitosis congénita, que cursa con aumento de la
permeabilidad pasiva de la membrana eritrocitaria al sodio y aumento del contenido
acuoso intraeritrocitario (estomatocitosis hidratada). No obstante, pueden observarse
tam bién en la esferocitosis hereditaria, en el alcoholismo y en el curso de alguna
eritroenzimopatía.

de un paciente con anemia
arregenerativa debida a síndrome
mieloproliferativo tipo mielofibrosis
idiopática (MI) con intensa
esplenomegalia. Se observan numerosos
dacriocitos (eritrocitos en forma
de lágrima) sugestivos de MI
(MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ

de un paciente con anemia hemolítica,
acompañada de intensa plaquetopenia,
e insuficiencia renal, en la que se observan
numerosos eritrocitos fragmentados
o esquistocitos, característicos
de una hemólisis microangiopática
debida a síndrome hemolítico urémico
(SHU) (MGG X800).

de un paciente afecto de estomatocitosis
congénita y anemia hemolítica
moderada. Los estomatocitos
son eritrocitos en los que su zona
clara se presenta como una hendidura
en forma de boca. En realidad,
los estomatocitos son eritrocitos que
han perdido una de sus concavidades
(unicóncavos) y que, al ser deformados
por efecto de la extensión, adquieren
esta forma peculiar, útil
para el diagnóstico de la enfermedad
(MGG X800).
El empleo del microscopio electrónico de barrido (MEB) ha permitido estudiar mejor

los aspectos morfológicos de estas y otras alteraciones eritrocitarias, contribuyendo
de manera fundamental al conocimiento de su fisiopatología.
Excentrocitos. Son eritrocitos con distribución irregular de la hemoglobina, de forma
que esta aparece como despegada de la parte interna de la m embrana y concentrada
en uno de sus extremos (fig. 14-13). Morfológicamente, se caracterizan por poseer
contornos parcialm ente arrugados y, en general, un tam año inferior al normal.
Suelen aparecer de manera especial en el curso de ciertas anemias hemolíticas indu
cidas por agentes oxidantes (medicamentos o sustancias químicas) y en el déficit de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa después de la ingesta de habas (favismo), caso en
el que los eritrocitos son pequeños.
Eritrocitos pinzados. Son eritrocitos con un estrangulamiento o pinzamiento que les
confiere la forma de una «seta». Se observan de forma casi exclusiva en la esferocitosis
hereditaria, donde coexisten con los esferocitos en aquellas formas debidas al déficit
de banda 3 (fig. 14-14). Su presencia constituye un criterio importante para establecer
el diagnóstico de EH.
Eritrocitos con tendencia a formar «pilas de moneda» (fig. 14-15). Se observan
cuando existe una tendencia a la aglutinación eritrocitaria, debida a la presencia de
una inmunoglobulina que la favorece, como por ejemplo, un gran aumento de IgM.
ERRNVPHGLFRVRUJ

de un paciente con crisis de
anemia hemolítica aguda después
de la ingesta de habas (favismo)
debido a un déficit congénito de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PD). Obsérvense varios
excentrocitos con la hemoglobina
desplazada hacia uno de los extremos
del eritrocito, dejando el citoplasma
desprovisto de la misma (MGG X800).
a P d
lo t s z . O O .® 1
p í/ j FIG U RA 14-14. Sangre periférica
de un paciente con esferocitosis
ÍVi írL I hereditaria (EH). Se aprecian
pocos esferocitos, pero en el centro
de la imagen hay un eritrocito
en forma de seta o como si estuviera
- 9 OP pinzado. La observación de este tipo
de alteración morfológica es altamente
sugestiva de EH por déficit de banda 3
(MGG X800).
FIGU RA 14-15. Cuando

en el plasma existe un aumento
importante de inmunoglobulinas,
especialmente de IgM (como sucede
en la macroglobulinemia
de Waldenstrom), los eritrocitos
tienden a agregarse dando una imagen
parecida a las «pilas de monedas».
Esto es lo que sucede en esta extensión
de sangre perteneciente a un paciente
con gammapatía monoclonal
(MGG X800).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Manual de técnicas de laboratorio en hematología
FIGU RA 14-16. Intensa

anisopoiquilocitosis en una extensión
de sangre periférica de un niño
con piropoiquilocitosis congénita
(PPC), una forma grave de eliptocitosis
congénita (EC) (MGG X800).
Es p or ello que se observa en las gammapatías monoclonales, especialmente en el

mieloma múltiple y la macroglobulinemia de Waldenstrom.
• A nisopoiquilocitosis. Se refiere a la presencia de eritrocitos de diferentes formas
y tamaños. A bundan los dacriocitos y los equinocitos, a la vez que se observa una
alteración del color con presencia de doble población eritrocitaria (fig. 14-16). Se
observa en la piropoiquilocitosis congénita (PPC), una forma grave de eliptocitosis
congénita (EC) de presentación neonatal con un cuadro clínico de anem ia muy
intensa
Alteraciones del color

Su aparición refleja alteraciones en el contenido hemoglobínico. Existe hipocromía
cuando los eritrocitos se tiñen débilmente con el m étodo convencional (eritrocitos
pálidos). La hipocromía es siempre la consecuencia de una disminución del contenido
hemoglobínico eritrocitario, por lo que, si no existe una enfermedad que la explique,
debe descartarse, en prim er lugar, la ferropenia (defecto de la síntesis del hemo) o la
talasemia (defecto de la síntesis de globina) (fig. 14-17).
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La policromasia es la presencia de eritrocitos con tonalidad gris azulada. Su aparición

es signo de inmadurez celular, por lo que suele observarse en casos de anemia regenerativa
(reticulocitosis) o en ciertas anemias arregenerativas acompañadas de salida prematura
de reticulocitos a sangre periférica (desviación reticulocitaria). Los eritrocitos policromá
ticos se caracterizan por un relativo gran tamaño (macrocitos) y su coloración azulada,
en comparación con el resto de eritrocitos, debido a su elevado contenido en ARN.
La doble población o anisocromasia se refiere a la coexistencia de eritrocitos hipo-
cromos y norm ocrom os, fenóm eno que puede observarse en la anem ia ferropénica
tratada, después de que se practique una transfusión sanguínea, y en el curso evolutivo
de ciertas anemias debidas a trastornos de la eritropoyesis o de maduración (v. fig. 14-16).
Presencia de inclusiones intraeritrocitarias

En ocasiones, los eritrocitos pueden presentar inclusiones de naturaleza diversa de
acuerdo con el origen de las mismas:
• El punteado basófilo tiene el mismo significado que la policromasia y corresponde
a gránulos ribosóm icos, que al form ar agregados de color azul intenso, pueden
apreciarse fácilmente mediante el microscopio óptico convencional (fig. 14-18). Un
eritrocito con punteado basófilo es, por tanto, u n eritrocito con elevado contenido
en ARN y puede tratarse de un reticulocito. La observación de punteado basófilo se
relaciona con el tiempo de secado de la preparación previa a su tinción y se debe a
que el eritrocito tiene un defecto congénito o adquirido para la degradación del ARN
(déficit de pirimidina-5'-nucleotidasa eritrocitaria). En el saturnismo o intoxicación
por el plomo existe un déficit adquirido de esta enzima, que puede ser la causa del
punteado basófilo.
• La granulación azurófila corresponde a pequeñas granulaciones eritrocitarias de color
violeta púrpura, que corresponden a restos de núcleo eritroblástico, producto de la
cariorrexis (polvillo nuclear). En general, se observan en el curso de ciertos síndromes
diseritropoyéticos congénitos y/o adquiridos.
• Los anillos de Cabot corresponden probablem ente a restos de m icrotúbulos que
quedan después de una mitosis anormal (fig. 14-19). Su presencia pone de manifiesto
una afectación importante de la eritropoyesis.
• Los cuerpos de Howell-Jolly son restos de cromatina que persisten en el interior de los
eritrocitos m aduros (fig. 14-20). Generalmente, suelen observarse después de una
esplenectomía o en el curso de una anemia megaloblástica, donde constituyen un
signo periférico de diseritropoyesis.
- □ V J P f l w w ;
n O O o a O jOg
h f io & g FIGU RA 14-18. Imagen
característica de punteado basófilo
eritrocitario en sangre periférica de
" ,, -
un paciente con déficit congénito
de pirimidina-5’-nucleotidasa (P5’N).
Esta imagen es prácticamente
superponible a la que se observa
en el saturnismo o intoxicación
por plomo (MGG X800).
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FIGURA 14-20. Cuerpos de
Howell-Jolly en el interior
de los eritrocitos de un paciente
esplenectomizado. Constituyen restos
de ADN que persisten en los eritrocitos
maduros debido a una alteración de
la eritropoyesis, primaria o secundaria.
Los eritrocitos nucleados son eritroblastos circulantes (fig. 14-21) y su presencia cons
tituye un signo de intensa regeneración eritroblástica (anemia hemolítica intensa
y esplenectomía) o de infiltración m edular por células malignas del propio tejido
hematopoyético (leucemias) o procedentes de otros tejidos neoplásicos (metástasis
medular o mieloptisis). O tra causa de eritroblastosis es la existencia de focos eritro-
poyéticos extramedulares (metaplasia mieloide). A veces, la presencia de eritroblastos
ERRNVPHGLFRVRUJ
circulantes se puede acompañar de la salida simultánea a sangre periférica de células

inmaduras de la serie granulopoyética (síndrome leucoeritroblástico).
• Los parásitos. La forma más característica de parasitosis intraeritrocitaria es el paludis
mo o malaria, en la que, durante los accesos febriles pueden observarse los parásitos
de esta enfermedad con su característica forma anillada que contiene un pequeño
núcleo central. Cuando el número de formas parasitarias es reducido, se facilita su
localización practicando la técnica de la gota gruesa teñida con el método de Giemsa
(v. capítulo 24).
El examen morfológico de los eritrocitos debe com plem entarse con el del resto
de las células sanguíneas, es decir, u n examen completo de la extensión de sangre, ya
que, en ocasiones, puede aportar im portante inform ación sobre el posible origen de
una anemia. El examen morfológico de los leucocitos (fórmula leucocitaria) informa
sobre la existencia de alteraciones cualitativas de los leucocitos, eventualmente aso
ciadas a la anemia. Ejemplo de ello es la observación de leucocitos neutrófilos des
granulados que puede orientar el diagnóstico hacia determinadas formas de anemia
refractaria o mielodisplasia, o la de pleocariocitos o granulocitos hipersegmentados
que es un indicador de anemia carencial p o r déficit de factores madurativos (ácido
fólico, vitam ina B12 o hierro). También ciertas alteraciones linfocitarias como, por
ejemplo, la presencia de linfocitos reactivos o virocitos sugieren la coexistencia de
una enferm edad vírica o síndrom e linfoproliferativo com o posibles causas de la
anemia. Igualmente, la observación de células inm aduras o de eritroblastos orienta
hacia una infiltración m edular por blastos leucémicos (leucemia aguda), tejido fibroso
(mielofibrosis) o células neoplásicas de diverso origen (síndrome leucoeritroblástico
paraneoplásico). Sim ultáneam ente, la observación m orfológica del frotis perm ite
efectuar una estimación aproximada del núm ero y las características morfológicas
de las plaquetas. La im portancia diagnóstica del examen m orfológico de la sangre se
ha tratado en el capítulo 4.
Estudio etiológico de la anem ia

En el estudio etiológico de toda anemia es fundamental disponer de la información
aportada por el estudio clínico del paciente. Solo conociendo la historia clínica y los
datos de exploración física del paciente se podrá seleccionar adecuadamente la batería
ERRNVPHGLFRVRUJ
de exámenes complementarios necesarios para diseñar el protocolo diagnóstico que

ha de conducir al conocimiento de la causa de la anemia. A veces esto es un proceso
relativamente fácil, pero otras resulta extremadamente difícil, especialmente cuando
se trata de diagnosticar la causa de anem ias poco conocidas y de baja prevalencia
en nuestra población (anem ias m in o ritarias). Las anem ias m inoritarias form an
parte de las enfermedades raras cuya prevalencia en Europa es inferior a 5 p or cada
10.000 habitantes. La mayoría son de origen congénito, e incluso después de realizar
num erosos estudios no se llega a conocer su origen (anemias de diagnóstico difícil).
A lgunas veces la dificultad diagnóstica obedece a que la anem ia tiene un origen
m ultifactorial, que hace m uy difícil delim itar con precisión cuál es el mecanism o
prim ario o las posibles interferencias com o posibles causas. A fortunadam ente la
Com isión Europea, dentro de su Program a de Salud Pública dedicado a enferm e
dades raras, ha cofinanciado con el Hospital Clinic de la Universidad de Barcelona
un proyecto para crear una Red Europea de Referencia en Anemias M inoritarias o
Raras llamada ENERCA (European Network for Rare and Congenital Anemias), cuya
web de consulta es www.enerca.org. Esta página ofrece un sistema de ayuda para la
orientación de una anem ia (flowchart), de form a que introduciendo el sexo y tres
m agnitudes biológicas (concentración de hem oglobina, VCM y reticulocitos) se
puede conocer si se padece, o no, una anemia, y en el prim er caso ofrece un diagrama
de flujo que indica las pruebas que se deben realizar para conseguir u n a p rim e
ra orientación diagnóstica. Actualmente, para iniciar el diagnóstico de toda anem ia
basta con analizar con precisión los datos aportados p o r el hem ogram a estándar
autom atizado, en especial la concentración de hem oglobina y el VCM. Tal y como
se ha m encionado con an terioridad, la posibilidad de obtener el VCM m ediante
procedim ientos autom atizados supuso, hace ya bastantes años, un hito en la his
toria de la hematología, ya que constituye un criterio de valor extraordinario para
realizar una prim era orientación etiológica de la anemia. Así, si el VCM está alterado,
el diagnóstico etiológico de la anem ia puede confirm arse realizando u n a conjunto
de pruebas dependiendo de si este tiene un valor inferior a 82 fl (o microcitosis)
(fig. 14-22) o superior a 98 fl (o macrocitosis) (fig. 14-23).
En caso de que el VCM sea normal (82 a 98 fl), se trata de una anemia normocítica
y su orientación requiere la práctica de un recuento de reticulocitos para saber si es
regenerativa o arregenerativa (fig. 14-24).
Anemia regenerativa
Una vez descartada la hemorragia oculta, debe pensarse en un origen hemolítico. Para
ello deben practicarse un conjunto de determinaciones que permitirán confirmar dicho
origen (cuadro 14-5):
• El aumento de la bilirrubina con predominio de la forma no conjugada, prehepática
o indirecta obedece al hipercatabolismo hemoglobínico. La bilirrubina deriva de la
degradación del grupo hemo y, en el plasma, es transportada por la albúmina hacia
el hígado, donde se conjuga al ácido glucurónico. En la anemia hemolítica, debido
al exceso de bilirrubina plasmática liberada por las células del SMF se sobrepasa la
capacidad de conjugación, y aumenta su fracción no conjugada o libre (bilirrubina
indirecta).
• El aumento de la lactato deshidrogenasa (LDH) se debe a la hemólisis con liberación
de la LDH intraeritrocitaria hacia el plasma. El origen eritrocitario de la LDH puede
ponerse de manifiesto m ediante el estudio de sus isoenzimas (predominio de las
fracciones LD1 y LD2).
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 14-22. Diagrama de flujo o algoritmo diagnóstico de la anemia microcítica (VCM < 82 fl).
La dism inución de la haptoglobina plasm ática se debe a su u n ió n a la hem o

globina cuando esta aparece librem ente en el plasm a. La haptoglobina es una
a-glucoproteína sintetizada en el hígado y cuya estructura se halla determ inada
genéticamente en tres fenotipos con diferente capacidad para fijar la hemoglobina.
La hemoglobina forma con la haptoglobina un complejo hemoglobina-haptoglobina,
que es elim inado y degradado p o r el hígado. D ebido a ello, cuando existe gran
cantidad de hemoglobina libre en el plasma (>1,5 g/1), se produce la práctica desa
parición de la haptoglobina, ya que el hígado no puede compensar p o r neosíntesis
toda la que se elimina con la formación del complejo hemoglobina-haptoglobina.
La haptoglobina solo se fija a la hemoglobina y no lo hace a grupos hemo libres ni
a la mioglobina.
El aumento de estercobilinógeno fecal es u n índice m uy preciso de hemólisis y está
directamente relacionado con el aumento de la excreción biliar de bilirrubina. Así,
cuando existe hemólisis, el estercobilinógeno, al ser un derivado intestinal de la bili
rrubina, se elimina abundantemente por las heces.
La determinación de la vida media eritrocitaria (51CrTl/2) es el método más directo y
específico para demostrar la existencia de hemólisis, pero debido al carácter engorroso
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 14-23. Diagrama de flujo o algoritmo diagnóstico de la anemia macrocítica (VCM > 98 fl).
de su realización, resulta difícil su aplicación sistemática. El procedim iento más

empleado consiste en el mareaje de eritrocitos del paciente con cromo radioactivo
(Na5IC r0 4) y seguir posteriormente la desaparición de la radiactividad mediante el
análisis de muestras sanguíneas extraídas sucesivamente en el transcurso de varios
días. Mediante este procedimiento se obtienen valores de vida media eritrocitaria
(51CrTl/2) norm al que varían entre 25 y 35 días (v. capítulo 9). La hemólisis cursa
siempre con una disminución más o menos intensa de la vida media eritrocitaria.
La determinación de la vida media eritrocitaria mediante 5lCr suele acompañarse del
estudio de la captación del trazador en los tejidos que intervienen en la destrucción
eritrocitaria (detecciones externas). C on ello puede valorarse el grado con que cada
uno de ellos (bazo y/o hígado) contribuye a la eliminación de los eritrocitos de la
circulación y, por tanto, su influencia en el mecanismo fisiopatológico de la hemólisis
(hipercaptación esplénica y/o hepática) (v. capítulo 8).
ERRNVPHGLFRVRUJ
RETICULOCITOS
Normales/disminuidos
Sangre en las heces Mielograma
Negativa
Estudio de hemodiálisis: Celularidad Celularidad normal
LDH disminuida o aumentada
Bilirrubina
Haptoglobina
Hemorragia
digestiva
Investigar Biopsia medular No evidencia
la causa
de hemorragia
Prueba de Coombs
maligna
Factores
madurativos
Aplasia
Función tiroidea
Negativa Displasia
Búsqueda de
metástasis
Anemia O tras causas

hemolítica de hem ólisis
autoinm une
Estudio inmunohematológico completo Estudio morfológico,

Estudio de enzim as eritrocitarias (G6PD, PK, otras) inm u nofen otípico,
Investigación de HPN (CD55, CD59) m olecular y citogenético
Estudio de hemoglobinas de la médula ósea
Prueba de la resistencia osmótica eritrocitaria (ROE)
Mielograma con tinción de Perls
Factores madurativos (vitamina B 12 y ácido fólico)
Investigación de tóxicos (cobre, plomo, entre otros)
FIGU RA 14-24. Diagrama de flujo o algoritmo diagnóstico de la anemia normocítica (VCM: 82-98 fl).
CUADRO 14-5. Alteraciones biológicas características de hemólisis
• H iperbilirrubinem ia con predom inio de la fracción indirecta (no conjugada)

• A um ento de la lactato deshidrogenasa sérica con predom inio de las isoenzimas
LD, y LD2
• D ism inución de la h aptoglobina plasm ática o ausencia total de la m ism a
• A cortam iento de la vida m edia eritrocitaria (51C rT 1/2)
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U na vez confirm ado el origen hem olítico de la anem ia deberá establecerse una
pauta diagnóstica para esclarecer su origen (v. fig. 14-7). En el cuadro 14-6, se resumen
los principales procedimientos que se utilizan en la práctica clínica para una prim era
orientación diagnóstica.
Anemia arregenerativa
C uando la exploración clínica del enfermo y los exámenes generales de laboratorio
no son suficientes p ara establecer u n a o rientación etiológica de la m ism a, debe
procederse a la práctica de un aspirado m edular e incluso, si es necesario, a la de
una biopsia ósea.
• El aspirado m edular m ostrará los aspectos cuantitativos y cualitativos de la serie
eritropoyética (aum ento o dism inución de la misma o presencia de alteraciones
morfológicas de los eritroblastos) y permitirá descartar la presencia de un síndrome
mieloproliferativo o linfoproliferativo, o de una metástasis neoplásica como causas
de anemia. Ante la sospecha de aplasia o mielofibrosis es obligada la práctica de una
biopsia ósea mediante aguja de Jamshidi o un trocar similar. En muchas ocasiones, la
imagen de la biopsia ósea resulta espectacularmente distinta a la que se aprecia con el
simple aspirado medular. Ello se debe a que, mientras este analiza un área muy limi
tada de la médula ósea (a veces un foco eritroblástico o linfoide), la biopsia informa
sobre una parcela amplia del hueso y permite valorar sus características anatómicas
y la disposición del tejido hematopoyético entre ellas (v. capítulo 8, tabla 8-3).
• El examen de la m édula ósea debe acompañarse siempre de la tinción de Perls del
aspirado (azul de Prusia), ya que con ello se valora de forma muy precisa el estado
de las reservas férricas del organismo (hemosiderina de los histiocitos medulares) y
el hierro no hemínico de los eritroblastos (sideroblastos). La muestra obtenida del
CUADRO 14-6. Métodos para el diagnóstico etiológico de una anemia hemolítica
• Análisis m inucioso de la m orfología eritrocitaria

• Interés diagnóstico: esferocitosis hereditaria y eliptocitosis congénita, anem ia
falciforme
• Análisis m inucioso de los eritrocitos som etidos a tin ció n vital (tinción de reticulocitos)
al objeto de descubrir precipitados espontáneos de hem oglobina
• Interés diagnóstico: hem oglobinopatías inestables, a-talasem ia (H bH )
• Prueba d e C oom bs (directa e indirecta)
• Interés diagnóstico: anem ia hem olítica auto in m u n e
• Resistencia osm ótica eritrocitaria (con sangre fresca e incubada 24 h a 37 °C)
• Interés diagnóstico: esferocitosis hereditaria
• Estudio de hem oglobinas
• Interés diagnóstico: hem oglobinopatías estructurales (HbS y H b C ), p-talasem ia
• Pruebas de estabilidad m olecular de la hem oglobina
• Interés diagnóstico: hem oglobinopatías inestables
• D eterm inación de las enzim as eritrocitarias (G6PD y PK)
• Interés diagnóstico: favismo y hem ólisis m edicam entosa, anem ia hem olítica crónica
• Prueba de hem ólisis en m edio ácido (Ham -D acie) y de la sacarosa*
• Interés diagnóstico: hem oglobinuria paroxística n o ctu rn a
' Actualmente en desuso y sustituida p o r la determinación de los marcadores antigénicos CD55 y CD59 en hematíes
y leucocitos m ediante citofluorometría.
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aspirado medular puede también utilizarse para otros exámenes complementarios

(citogenéticos, bacteriológicos, citoquímicos y ultraestructurales).
Como se ha mencionado anteriormente, utilizando la información contenida en la
web de ENERCA puede obtenerse de forma rápida y precisa la orientación etiológica
de una anemia, aunque para ello sea siempre indispensable conocer tres magnitudes
fundamentales: hemoglobina, VCM y reticulocitos.
ENERCA facilita tam bién inform ación sobre las anemias en general, y ayuda al
diagnóstico de aquellas en las que averiguar su origen resulta más difícil. La posibilidad
de realizar consultas online y solicitudes de «segunda opinión» resulta tam bién ex
traordinariamente útil para los pacientes, pero también para los médicos, que muchas
veces desconocen este tipo de enfermedades raras.
Bunn HF. Approach to the anemias. En: Goldman L, Schafer AI editors. Cecil Medicine. 24.a ed.
Philadelphia: Saunders Elsevier; 2011. Chapter 161.
Hoffman R, Benz EJ, Silberstein LE, Heslop K, Weitz J, Anastasi J. Haematology. Basic Principles and
Practice. Approach to Anemia in the Adult and Child. 6.a ed. Edinburgh: Churchill Livingstone;
2013.
Vives Corrons JL. Introducción al estudio de la anemia. Aspectos generales del diagnóstico. En: Sans
Sabrafen J, Besses Raebel C, Vives Corrons JL editors. Hematología clínica. 5.a ed. Barcelona:
Elsevier; 2006.
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Capítulo 14 Métodos para la clasificació n y e l diagnóstico de las anem ias 3 8 9 .e l
Autoevaluación
1. ¿Qué es una anemia?
(a) Una enfermedad grave.
(b) La consecuencia de comer poco.
(c) Un descenso del núm ero de hematíes.
(d) Un descenso de la concentración de hemoglobina.
Respuesta razonada: la anemia se define como una disminución de la concentración de hem o
globina (Hb) en sangre.
2. Una anemia regenerativa se caracteriza por:
(a) Un aum ento del núm ero de reticulocitos.
(b) Un descenso del volumen corpuscular medio.
(c) Una regeneración del tejido óseo.
(d) Una aumento del núm ero de eritroblastos.
(e) Un aum ento de esferocitos circulantes.
Respuesta razonada: la anemia regenerativa, al contrario que la arregenerativa, se caracteriza por
un aum ento de eritroblastos y, por tanto, de reticulocitos.
3. En una hemorragia, la cifra de reticulocitos:
(a) Disminuye.
(b) Aumenta.
(c) Novaría.
(d) Sufre variaciones intermitentes.
Respuesta razonada: una hemorragia produce anemia y, como consecuencia, una regeneración
de la serie eritroblástica y un aumento del núm ero de reticulocitos.
4. El procedimiento más preciso para saber si existe hemólisis es:
(a) La cifra de reticulocitos.
(b) La concentración de hemoglobina.
(c) El volumen corpuscular medio.
(d) El valor de la vida m edia eritrocitaria.
(e) La morfología eritrocitaria.
Respuesta razonada: todas las pruebas que se utilizan en el laboratorio clínico para diagnosticar
la existencia de hemólisis son indirectas, excepto la m edida de la vida media eritrocitaria, que
es la única que permite confirmarla m ediante un método directo.
5. La eritropoyesis ineficaz puede ser causa de:
(a) Policitemia.
(b) Poliglobulia.
(c) Anemia.
(d) Hemólisis.
(e) Síndrome leucoeritroblástico.
Respuesta razonada: la diseritropoyesis es una causa de anemia porque consiste en una muerte
prem atura de los eritroblastos antes de m adurar a hematíes.
6. El dato clínico de laboratorio más característico del déficit de ácido fólico es:
(a) La intensa anemia.
(b) Los trastornos neurológicos.
(c) La macrocitosis.
(d) La policromasia.
(e) La reticulocitosis.
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Respuesta razonada: el déficit de ácido fólico es causa de anemia megaloblástica y, por tanto, su
signo clínico de laboratorio más característico es la macrocitosis o aumento del VCM.
7. Los defectos hereditarios o adquiridos de incorporación del hierro al grupo hem o suelen
cursar con:
(a) Anisopoiquilocitosis.
(b) Hipercromía.
(c) Sideroblastos en anillo.
(d) Reticulocitosis.
(e) Porfiria.
Respuesta razonada: los defectos de incorporación del hierro al grupo hem o producen una
acumulación de hierro en el citoplasma de los eritroblastos bajo la form a de hemosiderina;
son unos precipitados que rodean al núcleo como si fuera un anillo. A estos eritroblastos se les
denomina «en anillo» y pueden ponerse de manifiesto mediante la tinción de Perls. La presencia
de sideroblastos «en anillo» se conoce como sideroacresia.
8. En una anemia, el examen morfológico de los hematíes es fundamental para el diagnóstico de:
(a) Policitemia vera.
(b) Reticulocitosis.
(c) Esferocitosis.
(d) Mielofibrosis.
(e) Aplasia medular.
Respuesta razonada: el examen morfológico de los hematíes es siempre un complemento indis
pensable en el estudio de toda anemia, pero resulta imprescindible para el diagnóstico de ciertas
enfermedades eritrocitarias como, por ejemplo, la esferocitosis hereditaria (EH), para la que la
observación de esferocitos circulantes constituye la prueba diagnóstica m ás fehaciente.
9. Existe una situación clínica en la que es característica la observación de abundantes hematíes
fragmentados (esquistocitos).
(a) Después del trasplante de m édula ósea.
(b) En la microangiopatía con hemólisis mecánica.
(c) En la hemólisis de origen autoinmune.
(d) En la anemia regenerativa.
(e) En la aplasia medular.
Respuesta razonada: la fragm entación eritrocitaria puede observarse en m uchas situaciones
clínicas diversas, pero suele ser de escasa relevancia. Existe una situación clínica en la que es
característica la observación de abundantes hematíes fragmentados o esquistocitos, debido a
la existencia de m icroangiopatía con hemólisis mecánica: se denom ina púrpura trom bótica
trombocitopénica (PTT).
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C A P Í T U L O 15
Métodos para el diagnóstico de la ferropenia

y el exceso de hierro
M. Sánchez y J. L. Vives C orrons
HIERRO EN EL ORGANISMO HUMANO

El hierro (Fe) es un metal fundamental en el metabolismo celular, ya que su concentra
ción es de 45 a 55 mg por kg de peso; entre un 60-70% forma parte de la hemoglobina y
un 10% de otras hemoproteínas de gran importancia funcional: mioglobina, citocromos
y ciertas enzimas como la catalasa y las peroxidasas. Del 20 al 30% restante se halla en los
depósitos formando parte de la ferritina. Solo un 1% (unos 3 mg) se encuentra unido a
la transferrina (TF), que es la proteína plasmática que lo transporta. Diariamente, la TF
transporta unos 30 mg de hierro desde los depósitos hacia la médula ósea (eritroblas
tos) para la síntesis de hemoglobina, cantidad idéntica a la que diariamente liberan los
eritrocitos en las células del sistema mononuclear fagocítico (SMF) como consecuencia
de su muerte fisiológica. Este equilibrio es fundamental para el mantenimiento de la
concentración de hemoglobina en el organismo. La distribución del hierro en el organis
mo está esquematizada en la tabla 15-1.
El hierro de los alimentos se halla prácticamente siempre formando complejos con
otros compuestos y es liberado en el proceso de la digestión. Su absorción tiene lugar
preferentemente en el duodeno, para lo cual es imprescindible que se halle en estado
reducido o ferroso. A esta reducción contribuyen otras sustancias también presentes
en los alimentos como, por ejemplo, el ácido ascórbico (vitamina C), entre otros. Nor
malmente, el intestino absorbe entre un 5 y un 10% del hierro ingerido, y el resto es
eliminado por las heces.
La absorción del hierro (Fe) no hemínico comporta tres etapas: 1) paso del Fe a través
de la m embrana apical del enterocito; 2) paso del Fe al plasma a través de la m embrana
basolateral, y 3) regulación global de estos procesos.
En la prim era etapa interviene una proteína transportadora de metales divalentes
(DMT1), también conocida como proteína de resistencia natural asociada a macrófagos
(Nramp2), y una oxidorreductasa férrica o citocromo b duodenal (Cytb D) que reduce
el hierro de la forma férrica u oxidada a su forma ferrosa o reducida. Así, en la misma
superficie del enterocito, el hierro es reducido por la Cytb D e inmediatamente inter
nalizado por la proteína transportadora DMT1. Una vez en el interior del enterocito, el
hierro puede ser almacenado bajo la forma de ferritina o transportado hacia el plasma
previo paso a través de la membrana basolateral. Las proteínas transportadoras DMT1
forman parte integral de la membrana apical del enterocito y realizan el transporte activo
de otros cationes metálicos bivalentes además del Fe++ (Zn, M n, Co, Cd, Cu, Ni y Pb).
La DMT1 posee una región IRE en posición 3' de su ARNm, por lo que es regulada a
través de la concentración del hierro celular mediante el sistema regulador IRP/IRE. Así,
su concentración aumenta en el estado de ferropenia y disminuye en el de sobrecarga.

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Capítulo 15 Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro 391
TABLA 15-1. Distribución del hierro en el organismo
Tipos Distribución del hierro en el organismo

Hierro hemínico
Hemoglobina Aprox. 3 g
Mioglobina 0,15 g \ Aprox. 3,2 g
Enzimas hemínicas 0,01 g |
Hierro no hemínico
Hierro sérico 0,003 g I Aprox. 1,05 g
Hierro de reserva Aprox. 1 g f
Total de hierro del organismo Aprox. 4,25 g |
En el paso del Fe a través de la membrana basal hacia el plasma intervienen también

dos proteínas: la transportadora, ferroportina 1, y la cuproproteína con actividad oxidasa,
hefaestina. La ferroportina 1 (Iregl, SLC40A1 o MTP1) es una proteína integral de la
m em brana basal del enterocito. La hefaestina (HEPH) es una ferroxidasa análoga a
la ceruloplasmina de localización exclusivamente intestinal; su función es transformar el
hierro desde su estado reducido (Fe2+) al oxidado (Fe3+), imprescindible para que pueda
ser incorporado en la TF plasmática (fig. 15-1).
Luz
intestinal
Transferrina
n FIGU RA 15-1. Mecanismos reguladores

de la absorción de hierro.
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F IG U R A 15 -2 . Acciones de la hepcidina.
Un acontecimiento clave en el metabolismo del hierro fue el descubrimiento de un

pequeño péptido constituido por solo 25 aminoácidos que ejerce un papel fundamental
en la regulación de los procesos que intervienen en la homeostasis del hierro. Este pép
tido, conocido con el nombre de hepcidina (acrónimo que proviene de los términos en
inglés hepatic bactericidal protein) fue descubierto en la orina humana, posee actividad
bactericida/fungicida y es sintetizado por el hígado como respuesta a estímulos inflama
torios, hipoxia (anemia) y concentración de hierro unido a la transferrina (fig. 15-2). La
hepcidina ejerce un efecto regulador negativo sobre la absorción intestinal de hierro y
también sobre su liberación desde los macrófagos, la placenta y otras células, al degradar
la proteína transportadora ferroportina 1. Por ello, su función se ha relacionado con la
regulación de los procesos de absorción y reutilización del hierro por el organismo. De
este modo, un exceso de hierro aumentaría la síntesis de hepcidina, lo que disminuiría
tanto la absorción intestinal como la salida de hierro de los macrófagos. Por el contrario,
la ferropenia disminuiría la síntesis de hepcidina, aumentando la absorción de hierro
intestinal y su liberación desde los macrófagos para poder ser utilizado en la síntesis
de hemoglobina. La hepcidina constituiría, en realidad, un factor plasmático exclusivo
que, de m anera simultánea, regularía tanto la absorción del hierro intestinal como
su reutilización a partir de los depósitos. Por el mismo mecanismo, en los procesos
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FIGU RA 15-3. Esquema que

muestra la saturación normal de la
transferrina.
inflamatorios crónicos donde se ha demostrado un importante aumento de la síntesis

de hepcidina, este péptido no solo sería el regulador fisiológico de la cinética del hierro,
sino que contribuiría al mecanismo fisiopatológico de la llamada anemia asociada a
procesos inflamatorios crónicos o anemia inflamatoria.
En el plasma, el hierro circulante no se halla nunca en forma libre (sería muy tóxico)
sino siempre unido a la TF, que es una glucoproteína transportadora de 83.000 daltons,
capaz de fijar un máximo de dos átomos de hierro. La TF solo fija hierro oxidado (ión
férrico) y, en condiciones fisiológicas, únicamente un 30-35% de ella se halla saturada
(fig. 15-3). Mediante la TF, el hierro alcanza la médula ósea, penetra en los eritroblastos
y es utilizado para la síntesis de hemoglobina. Para penetrar en los eritroblastos, la TF
se une a un receptor específico o receptor de la TF (RTF1) presente en la superficie de
los mismos formando un complejo TF-RTF1, de manera que su afinidad por esta unión
guarda relación directa con su estado de saturación por el hierro. Una vez formado el
complejo TF-RTF1, se forma una vesícula llamada siderosoma, donde los cambios de
pH producen una liberación progresiva de hierro hacia el citoplasma, en el que es incor
porado a la apoferritina para formar ferritina. Una vez liberado el hierro del complejo
TF-RTF1, la vesícula se recicla hacia la superficie celular y la TF, desprovista ya de hierro,
se libera hacia el plasma (fig. 15-4). Una porción del RTF1 presente en la m em brana
plasmática experimenta una escisión de su región extracitoplasmáticay bajo una forma
truncada pasa al plasma, dando lugar al llamado receptor soluble de la transferrina (RST).
El RST puede medirse mediante técnicas basadas en la reacción antígeno-anticuerpo y
constituye una m agnitud útil en el diagnóstico de la anemia ferropénica.
Además de la médula ósea, gracias a la TF el hierro alcanza otros tejidos del organis
mo como, por ejemplo, el músculo, el hígado y los macrófagos del SMF. Allí y por el
mecanismo citado, penetra en el citoplasma celular y se deposita en forma de ferritina.
En el músculo, el hierro entra a formar parte de la mioglobina y el hígado, y las células
del SMF se acum ulan bajo la form a de ferritina, lo que origina el llamado hierro de
los depósitos o hierro de reserva. Diariamente unos 30 mg de hierro son liberados de los
depósitos hacia el plasma (donde se unen a la TF) para la síntesis de hemoglobina, y
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Fe
FIGU RA 15-4. Entrada de hierro

en el eritroblasto. RTF, receptor
de la transferrina; TF, transferrina.
son los mismos que se depositan diariamente en los depósitos como consecuencia de la
eliminación de los eritrocitos envejecidos y el catabolismo de la hemoglobina (fig. 15-5).
Debido a que la cantidad de hierro que diariamente se absorbe por el intestino (1,5 mg)
es prácticamente la misma que la que se pierde, también diariamente, de forma fisiológica
por la descamación epitelial, las secreciones externas, las faneras y otros medios, el
organismo reutiliza permanentemente el hierro de reserva (unos 30 mg) para mantener
constante la concentración de hemoglobina. Por ello si disminuye la absorción de hierro,
aumentan las necesidades fisiológicas (crecimiento o embarazo, principalmente) o se
produce una pérdida crónica del mismo (hemorragia o hemoglobinuria), y las reservas
de hierro del organismo van disminuyendo paulatinamente. Tanto en un caso como
en otro, una vez agotadas las reservas de hierro, se inicia un descenso progresivo de la
síntesis de hemoglobina, que conduce a la anemia y a otras alteraciones generales propias
de la carencia de hierro. Las causas más frecuentes de anemia ferropénica se resumen
en la tabla 15-2.
La anemia ferropénica es la causa más frecuente de consulta hematológica, y su expre
sividad más característica es la disminución del tamaño y contenido hemoglobínico de los
1.5 mg/día
Ingesta
Eritrocitos
Macrófagos
(SM F)
>
< ©
Pérdidas FIGU RA 15-5. Esquema del
(descam ación epitelial, sudor) mecanismo de reutilización del hierro
1,5 mg/día por el organismo. SMF, sistema
mononuclear fagocítico.
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TABLA 15-2. Causas de ferropenia
Tipo Causas Mecanismos

Fisiológicas Embarazo Hiperconsumo
Crecimiento Hiperconsumo
Menstruación Pérdida
Patológicas Hernia de hiato y varices esofágicas Pérdida crónica
Ingesta de aspirinas por microsangrado digestivo
Neoplasia digestiva
Hemólisis intravascular crónica Pérdida crónica por la orina
(hemoglobinuria paroxística nocturna)
eritrocitos (microcitosis hipocroma). Estas alteraciones morfológicas pueden apreciarse

fácilmente mediante la observación microscópica de una extensión de sangre (fig. 15-6),
aunque deben ser corroboradas mediante la práctica de u n hemograma (disminución
del VCM y de la HCM). Existen otras formas de anemia que también pueden cursar
con microcitosis e hipocromía y que no deben confundirse con la ferropenia. Las más
frecuentes son los síndromes inflamatorios crónicos y neoplasias (anemia inflamatoria),
la disminución congénita de la síntesis de hemoglobina (talasemia) y los defectos de la
síntesis del grupo hemo (anemia sideroblástica) (cuadro 15-1).
La anemia inflamatoria obedece a una retención del hierro en los depósitos debido a
la existencia de una dificultad en su liberación desde los macrófagos. Puede confundirse
fácilmente con la anemia ferropénica porque la microcitosis hipocroma suele acompa
ñarse de una disminución de la concentración de hierro en plasma (sideremia) y de la
ferritina. La práctica de otras determinaciones, como la capacidad de saturación de la TF
(CST) o del índice de saturación de la TF (1ST), es aquí de extraordinaria importancia
para establecer el diagnóstico diferencial.
La talasemia, relativamente frecuente en nuestro medio bajo la forma de «rasgo tala
sémico», rara vez se confunde con una ferropenia si se presta atención a la información
que sum inistra el hemograma. En prim er lugar, destaca una microcitosis superior a
la que se observa en la ferropenia; una escasa hipocromía, inferior a la que se observa
FIGU RA 15-6. Disminución

del tamaño y contenido hemoglobínico
de los eritrocitos (microcitosis
hipocroma) en la anemia ferropénica.
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CUADRO 15-1. Anemias no ferropénicas que pueden cursar con hipocromía

y microcitosis
• Síndromes inflamatorios crónicos (polimialgia reumática) y neoplasias:
• Anemia «inflamatoria» por defecto de utilización del hierro (bloqueo férrico a nivel
de los depósitos)
• Disminución congénita de la síntesis de cadenas de globina:
• Anemia microcítica de la talasemia
• Trastornos en el mecanismo de síntesis del grupo hemo:
• Anemia sideroblástica congénita o adquirida
CUADRO 15-2. Tipos de anemia microcítica sideroblástica

Congénitas
• Anemia sideroblástica congénita ligada al sexo (gen ALAS2)
• Anemia sideroblástica congénita ligada al sexo con ataxia (gen ABCB7)
• Anemia sideroblástica congénita no sindrómica y recesiva (gen SLC25A38)
• Anemia sideroblástica con sobrecarga de hierro hepática (gen GLRX5)
Adquiridas
• Anemia sideroblástica secundaria
• Por alcohol
• Por medicamentos (isoniazidas, cloranfenicol)
• Por tóxicos (plomo)
• Anemia sideroblástica idiopática
en la ferropenia, y una concentración de eritrocitos prácticamente siempre superior a la

normal (falsa poliglobulia) debido al aumento de la regeneración eritroblástica. Asimis
mo, en el rasgo talasémico la concentración de hierro en plasma (sideremia) ha de ser
normal o aumentada, excepto en el caso de que coexista con una ferropenia.
Finalmente, la anemia sideroblástica es una form a de anemia m inoritaria debido a
un defecto en la utilización del hierro p or los eritroblastos, y puede tener un origen
congénito o adquirido (cuadro 15-2). La form a congénita se observa en la edad
infantil o juvenil, y la adquirida, en individuos adultos de más de 60 años. C onfundir
una anem ia sideroblástica con una ferropénica es prácticam ente imposible porque,
adem ás del hecho de que la m icrocitosis es m enos frecuente que la norm ocitosis
o macrocitosis, la ferritina (hierro de depósitos) suele hallarse aum entada, a veces
considerablem ente. La anem ia sideroblástica adquirida constituye u n a form a de
m ielodisplasia (anem ia refractaria sideroblástica) que se caracteriza p or un gran
aumento de eritroblastos con abundante hierro intracitoplásmico o sideroblastos. Estos
eritroblastos pueden ponerse fácilmente de manifiesto m ediante la tinción del azul de
Prusia o tinción de Perls, que transform a la ferritina en gránulos de hemosiderina muy
visibles por su destacado color verde azulado. En la anemia sideroblástica (congénita
o adquirida) los gránulos de hemosiderina son tan abundantes que rodean el núcleo
de los eritroblastos, dando lugar a los llamados sideroblastos en anillo (fig. 15-7).
D istinguir una ferropenia de un trastorno en la utilización del hierro es de gran
im portancia en la práctica clínica. En la tabla 15-3 se esquem atizan las pruebas de
laboratorio que pueden facilitar el diagnóstico diferencial.
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FIGU RA 15-7. Imagen

microscópica de un sideroblasto
en anillo (X 1.000).
■
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE HIERRO EN SUERO
Introducción
La concentración de hierro sérico, conocida como sideremia, puede determ inarse
m ediante m étodos colorim étricos y de absorción atóm ica. Los prim eros se basan
en la form ación de u n a sustancia coloreada cuando el hierro, en su form a reducida,
reacciona con un derivado de la fenantrolina. Pueden emplearse indistintam ente
dos derivados de la fenantrolina: batofenantrolina y o-fenantrolina. Actualmente es
tos sistemas de medida, en especial los colorimétricos, han sido estandarizados por
diferentes firmas comerciales para poder ser utilizados en analizadores autom atiza
dos. De esta form a puede realizarse un elevado núm ero de determ inaciones, junto
a muchas otras, de form a sim ultánea y en m uy poco tiem po. Entre estos sistemas
comerciales de m edida de la concentración de hierro en plasm a (o suero) destacan
los siguientes:
• ADVIA 1650 (Bayer).
• Alcyon 300 (Chema Diagnóstica).
• Dimension (Dade Behring).
• Ilab 600 (Instrumentation Laboratory).
• Hitachi (Roche Diagnostics).
• Cobas Integra (Roche Diagnostics).
TABLA 15-3. Diagnóstico diferencial de la anemia ferropénica
Prueba diagnóstica Falta de hierro Defectos en la utilización

(ferropenia) del hierro
Sideremia Disminuida Normal
Aumentada
Disminuida
Ferritina sérica Disminuida Normal o aumentada
Capacidad de saturación Aumentada Normal o disminuida
de la transferrina (CST)
Indice de saturación de la transferrina (1ST) Disminuido Normal o aumentado
Tinción de Perls del aspirado medular Hierro ausente Hierro normal o aumentado
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El Comité Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH) recomienda el

método colorimétrico con batofenantrolina, que, con ligeras modificaciones, es el que
se describe aquí.
Principio
Debido a que, en el plasma, el hierro (TF-Fe+++) se halla unido en su totalidad a la TF,
puede ser cuantificado fácilmente a partir de un extracto desproteinizado del mismo.
La adición de una sustancia precipitante y reductora produce la liberación de hierro a
partir de la TF y su reducción a Fe++, al cual se une posteriormente el derivado de la
fenantrolina (sulfonato de batofenantrolina) o compuesto cromógeno, y con ello se
produce un cambio de color.
T F -Fe"^ Precipitación
Reducción
donde C = cromógeno y CC = compuesto coloreado.

La densidad óptica o absorbancia (A) del compuesto coloreado es finalmente ana
lizada mediante un fotocolorímetro (filtro verde) o un espectrofotómetro a 535 nm.
M a te ria l
• Material de vidrio volumétrico de pureza garantizada (Pyrex®) y totalmente desprovis
to de contaminación con hierro. Para ello, antes de toda determinación, el material de
vidrio debe lavarse con detergentes o mezcla crómica y permanecer a continuación
durante 24 h en solución de HC1 concentrado, diluido al 50%. Antes de su empleo, el
material debe aclararse con abundante agua desionizada o doblemente destilada.
• Fotómetro o colorímetro capaz de leer a 535 nm.
• Cubetas específicas para esta determinación.
• Tubos de hemólisis de 12 X 100 mm.
• Pipetas graduadas de 2 y 5 mi.
• Centrífuga.
R eactivos
• Solución precipitante. Esta solución debe conservarse en botella. Mantenida a 4 °C,
tiene una estabilidad de 3-4 meses y a temperatura ambiente unas 2 semanas.
• Ácido tricloroacético, 49 g.
• Ácido tioglicólico, 14 mi.
• H C11 mol/1 hasta 500 mi.
• Solución cromógena.
• Solución de acetato sódico de 1,5 mol/1 que contiene 0,25 g/1 de ferrocina
(3 -[2-piridil]-5,6-bis-[ácido fenilsulfónico]-l,2,4-triacina). Se deja m adurar
en frasco topacio envuelto en hoja de papel de aluminio durante 2 semanas. Se
completa hasta 500 mi con agua destilada o desionizada.
• Patrón de hierro:
- Solución madre (reserva) de hierro puro (20 mmol/1) en una dilución al 50%
de HC1 concentrado.
- Solución patrón, 40 (xmol de hierro p or litro (2,24 |JLg/l) preparada extem
poráneamente mediante dilución de 2 mi de la solución madre en 11 de agua
destilada o desionizada.
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• Espécimen de suero que se va a analizar.

• El hierro sérico debe medirse siempre a partir de suero totalmente libre de hemó
lisis, ya que el hierro hemoglobínico constituiría un factor de error decisivo en la
determinación.
• Si se requiere plasma, este debe obtenerse a partir de sangre heparinizada.
M étodo
Para cada suero se realizará siempre una triple determinación de acuerdo con la siguiente
sistemática:
1. En una gradilla se colocan tres tubos de hemólisis que se enumeran del 1 al 3.
2. A cada uno de ellos se añade:
(a) Tubo A: 1 mi de suero problema.
(b) Tubo B: 1 mi de solución estándar de hierro.
(c) Tubo C: 1 mi de agua bidestilada (totalmente exenta de hierro).
3. A los tres tubos se añade 1 mi de la solución precipitante y se procede a realizar
una agitación vigorosa seguida de un reposo de 5 min.
(a) Se centrifuga el tubo A hasta obtener un sobrenadante transparente.
(b) Se preparan otros tres tubos de hemólisis y en cada uno de ellos se coloca:
(i) Tubo D: 1 ml del sobrenadante obtenido con la centrifugación del tubo A.
(ii) Tubo E: 1 ml del líquido contenido en el tubo B.
(iii) Tubo F: 1 ml del líquido contenido en el tubo C.
(iv) A continuación, se añade a todos ellos 1 mi de solución cromógena y
después de realizar u n a buena homogeneización se dejan en reposo
durante 10 min.
(c) Finalmente, mediante un espectrofotómetro bien calibrado se lee el valor de
la absorbancia (A) de cada tubo a 535 nm frente a un blanco de agua bides
tilada. Si se utiliza un colorímetro, debe emplearse el filtro verde.

A535suero (tuboD )-A 535blanco (tuboF)x40
Sideremia (|im ol/l) =-
A535 estándar (tuboE)-A 535blanco (tuboF)

Para una población sana, la concentración plasmática de hierro (sideremia) expresada
como concentración de sustancia (Pla-Hierro; c.sust) o de masa (Pla-Hierro; c.masa)
varía ampliamente según la edad y el sexo (tabla 15-4). El descenso de la sideremia
es característico de la anem ia ferropénica, pero puede observarse tam bién en todas
aquellas situaciones que se acompañan de un bloqueo del hierro en las células del SMF,
tales como los síndromes inflamatorios crónicos y los procesos neoplásicos avanzados
(anemia inflamatoria).
Un aumento de la sideremia suele observarse en los llamados estados de sobrecarga
férrica, es decir, en todas aquellas situaciones en las que el organismo acumula hierro
en exceso debido a un aumento de la absorción (hemocromatosis) o no puede utilizarlo
de forma apropiada (anemia sideroblástica y talasemias). En tales casos, el hierro en
exceso tiende a depositarse abundantemente en los tejidos de reserva e incluso en otras
células como los hepatocitos, el tejido glandular o las células musculares, lo que da lugar
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TABLA 15-4. Valores normales de la concentración de hierro en plasma (Pla-hierro)
Edad (años) Hombres Mujeres

(|Xg/l) ((xmol/1) (M-g/1) ((x m o l/ I)
Recién nacido 1.600 28,6 1.600 28,6
1-20 140-1.200 2,5-21,5 140-1.200 2,5-21,5
20-29 450-1.740 8-31 340-1.620 6-29
30-39 450-1.570 8-28 170-1.680 3-30
40-49 450-1.570 8-28 280-1.620 5-29
50-59 390-1.620 7-29 390-1.450 7-26
60-70 340-1.620 6-29 390-1.450 7-26
Más de 70 340-1.620 6-29 340-1.450 6-26
a trastornos funcionales, generalmente graves (insuficiencia cardíaca, diabetes mellitus,

cirrosis hepática y otros). También puede observarse aumento de la concentración plas
mática de hierro en anemias hemolíticas o diseritropoyéticas, generalmente intensas
y de larga evolución, ya que todas estas situaciones se acom pañan de un aum ento
de la absorción intestinal de hierro. Igualmente, en la hepatitis aguda o crónica con
hepatólisis y en el alcoholismo agudo o crónico, suele observarse un aum ento de la
concentración de hierro plasmático (sideremia) con aumento del hierro de depósito,
lo que, en individuos predispuestos genéticamente, puede ser un factor desencadenante
de hemocromatosis.
Cuando no existe un motivo clínico que justifique el aumento aislado de la concen
tración del hierro en plasma, debe pensarse siempre en causas metodológicas como,
por ejemplo, contaminación del material empleado para el análisis (tubos de recogida,
principalmente, por los tapones de goma), hemólisis en caso de extracción dificultosa,
conservación defectuosa de la muestra u otras causas muchas veces difíciles de determi
nar (interferencias, errores técnicos, envejecimiento de la muestra, entre otros).
C A PA C ID A D E ÍN D IC E D E S ATU R AC IÓ N D E L A TR A N S FE R R IN A
P rin c ip io
La CST es la cantidad de TF del plasma que puede ser saturada por el hierro y constituye
una medida indirecta de la concentración plasmática (o sérica) de TF.
Debido a que prácticamente todo el hierro circulante se halla unido a la TF, la CST
se determina añadiendo al plasma (o suero) un exceso de hierro, suficiente para saturar
completamente la TF. Después de que se haya eliminado todo el excedente de hierro libre
mediante carbonato de magnesio (quelante o fijador del hierro), se realiza una nueva
determinación de la sideremia.
M é to d o m a n u a l
A 2 mi de suero se añaden 4 mi de una solución clorhídrica de cloruro férrico (FeCl36H20 )
que contenga 5 mg de hierro por cada mililitro de HCI, 0,005 N. Transcurridos 5 min,
se añaden a la mezcla 0,4 g de carbonato magnésico (M g C 0 3) y, después de agitar
intensam ente la mezcla, se deja en reposo durante 30 min. Después de centrifugar
durante 15 m in a 1.500 g, se determina el hierro a partir de 2 mi de sobrenadante, según
el método descrito anteriormente.
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Capítulo 15 Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro 40 1
M étodos autom atizados

Actualmente, existen diversos procedimientos que permiten, además de medir automáti
camente la concentración de hierro en plasma, determinar también la CST. En este caso, la
CST se calcula a partir de la medida de la TF como proteína mediante un método basado
en una reacción antígeno-anticuerpo y de la sideremia. Esta metodología, que es la que
se usa cada vez más, tiene un coste superior al procedimiento manual y posee mayores
desviaciones en los valores extremos en caso de ferropenia o de acúmulo de hierro.

Cada miligramo de TF fija alrededor de 1,4 (xg de hierro, por lo que la CST puede variar
entre 2,5 y 4 g/1 (45 y 70 (xmol/1), así el tanto por ciento de TF normalmente saturada
por el hierro, o 1ST, es de aproximadamente u n 33%. Los valores de referencia para la
concentración de TF en plasma determ inada mediante procedimientos automáticos
son algo inferiores a los obtenidos con el m étodo manual, y sus valores, expresados
en concentración de sustancia (Pla-TF; c.sust) oscilan entre 20 y 50 jxmol/1, y en con
centración de masa (Pla-TF; c.masa) entre 1,7 y 4 g/1. Mientras que la CST depende
de la cantidad de TF, el 1ST depende de la cantidad de hierro plasmático (sideremia), de
manera que a mayor valor de sideremia, mayor 1ST y viceversa.
En el organism o hum ano norm al existe u n a relación inversa entre la cantidad
de hierro de depósito y la síntesis de TF, de manera que, cuando disminuye el hierro de
los depósitos, aumenta la síntesis de TF y viceversa. Debido a ello, en la ferropenia se
observa prácticamente siempre un aumento paralelo de la concentración de TF plas
mática. El análisis de la relación entre concentración de hierro en plasma (sideremia),
CST e 1ST es determinante para establecer el diagnóstico diferencial entre ferropenia
por falta real de hierro (ferropenia verdadera) o por bloqueo del hierro en los depósitos
(seudoferropenia). Así, mientras que en una ferropenia verdadera la disminución de la
sideremia y ferritina se acompaña, prácticamente siempre, de un aumento de la CST y
de una marcada disminución del 1ST (<15% ), en los trastornos debidos a bloqueo del
hierro con disminución similar de la sideremia y ferritina, nunca se observan grandes
aumentos de la CST y el 1ST, aunque pueden hallarse ligeramente disminuidos, y nunca
alcanzan valores inferiores al 15% (fig. 15-8).
MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE FERRITINA EN SUERO

Principio
La m edida de la ferritina sérica, conocida tam bién como ferritinem ia, ha sido am
pliamente introducida como un método reproducible para cuantificar el estado de las
reservas férricas del organismo. Diversos autores han demostrado una buena correlación
entre los valores de ferritina sérica y la cantidad de hierro medular determinado a partir
de aspirados de m édula ósea teñidos con la coloración de Perls. En consecuencia, la
determinación de la ferritina puede suplir, en algún caso, la práctica de una punción
medular e incluso otras determinaciones tales como la sideremia o la CST. Asimismo, la
determinación de la ferritina es muy útil en el seguimiento o control del estado férrico
de los pacientes con insuficiencia renal crónica bajo tratamiento de diálisis o para evaluar
los efectos de la flebotomía en el tratamiento de la hemocromatosis idiopática o de los
quelantes de hierro en pacientes con talasemia mayor.
Actualmente, existen en el mercado diversos procedimientos automatizados para
la medida de la concentración de ferritina basados en reacciones ferritina-anticuerpos
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Normal 1ST = 30%
Ferropenia 1ST < 10%
Procesos
inflamatorios
1ST = 30%
crónicos
y neoplasias
100 300 500

itg/dl
Transferrina
FIGU RA 15-8. Relación entre sideremia e índice de saturación de la transferrina (1ST) y su utilidad
en el diagnóstico diferencial entre ferropenia verdadera y seudoferropenia.
antiferritina, pero que pueden emplear metodologías muy diversas que van desde la
quimioluminiscencia hasta la nefelometría. Se puede decir que casi cada proveedor de
metodologías automatizadas ha implementado una nueva metodología para la determi
nación de la concentración sérica de ferritina: AxSYM (Abbott), Chem 1 (Bayer), Access
(Beckman Coulter), Dimension (Dade Boehring), Immulite (DPC), ELISA (IBL), entre
otros. Todos estos métodos perm iten realizar un gran núm ero de determinaciones en
muy poco tiempo, lo que ha supuesto una indudable mejora en el diagnóstico diferencial
entre estados ferropénicos y sobrecargas de hierro.
La determinación más precisa de la ferritina es la que utiliza técnicas radioinmuno-
lógicas (RIA) o inm unorradiométricas (IRMA). Puesto que la técnica RIA precisa del
empleo de ferritina altamente purificada, con riesgo de ser dañada durante el mareaje,
en la actualidad existe cierta tendencia al uso de las técnicas IRMA. En estas técnicas,
la m uestra problem a reacciona simultáneamente con antiferritina hum ana marcada
con un isótopo radiactivo y con antiferritina hum ana unida a u n soporte sólido (fase
sólida), generalmente una bolita de cristal. Tras un período específico de incubación,
la fase sólida es lavada para extraer el anticuerpo marcado no unido. La radiactividad
unida será directamente proporcional a la concentración de ferritina de la muestra. Este
sistema de medida isotópico es el que se describe aquí.
M aterial
• Contador de centelleo para emisiones de radiación 7 . Baño maría a 37 °C.
• Tubos de plástico de 12 X 75 m m de fondo esférico.
M uestra de sangre problem a

No se requiere ninguna preparación especial del paciente antes de la toma de muestra.
La determinación se realiza en suero, el cual puede conservarse a 2-8 °C durante varios
días o a -2 0 °C para períodos de tiempo más prolongados.
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Reactivos (cantidad suficiente para 100 m uestras)

• Antiferritina humana 1251:20 ml de IgG monoclonal de ratón que contiene seroalbú-
mina bovina y 0,1% de azida de sodio. Actividad: 37 kBq de 125I/ml.
• Antiferritina hum ana en fase sólida: 100 bolitas recubiertas de IgG monoclonal de
ratón.
• Calibradores: un vial con 4 mi de calibrador 0 (diluyente libre de ferritina y seis viales
con 1 mi de solución, que contienen 4,10,20,50,200 y 500 ng/ml de ferritina hepática
humana). Cada vial contiene 0,1% de azida de sodio y seroalbúmina humana.
• Solución de lavado: 500 mi de tampón, que contiene un 0,3% de azida de sodio.
M étodo
1. Se llevan todos los reactivos a temperatura ambiente.
2. Se marca el suficiente número de tubos para identificar los calibradores, las mues
tras problema y los controles por duplicado.
3. Se dispensa una bola recubierta de anticuerpo en cada tubo.
4. Se añaden 25 |xl por duplicado de cada calibrador, muestra problema o control
en el tubo apropiado.
5. Se añaden 200 |xl de antiferritina hum ana 125I a cada tubo. Se mezcla el contenido
agitando suavemente.
6. Se incuban los tubos durante 2 h al baño maría a 37 °C.
7. Se añaden 2 mi de solución de lavado a cada uno de los tubos y se aspira o decanta
la solución.
8. Se repite el paso 7.
9. Se colocan los tubos en el contador y se determ inan las cuentas por m inuto
(c.p.m.) de cada tubo.

La curva de calibración se construye con los puntos obtenidos representando en el eje de
ordenadas (y) las c.p.m. y en el eje de abscisas (x) las concentraciones de los calibradores.
La concentración de ferritina de una muestra problema se obtendrá interpolando en la
curva de calibración la medida de las c.p.m. obtenidas en el par de tubos (fig. 15-9).

Los valores de referencia de la concentración de ferritina sérica (Pía-Ferritina; c.sust o
Pla-Ferritina; c.masa) varían con el sexo, pero también según el procedimiento empleado
para su m edida (manual o automatizado). Con todo, estas variaciones son escasas y
puede considerarse que en nuestra población el valor de ferritina en suero varía entre
7 y 340 |ig/l (mujeres) y 11 y 400 |ig/l (hombres). En general, tom ando como límites
de confianza un 95% (mujeres y hombres), los valores de concentración de ferritina
oscilan entre 12 y 300 |xg/l.
La ferritina sérica (FS) disminuye en la anemia ferropénica y aumenta en los estados
de sobrecarga férrica independientemente de su origen. Aunque en la ferropenia, la FS
se halla siempre disminuida, no sucede lo m ismo con su aumento, ya que en ocasiones
este es proporcionado en relación a la cantidad de hierro de reserva. Así, es frecuente
observar grandes aumentos de la FS en ciertos procesos inflamatorios agudos y crónicos,
como por ejemplo en la enfermedad de Still del adulto. Asimismo, se han observado
también grandes aumentos de FS en el hipertiroidismo y en ciertas neoplasias en las que
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Media Ferritina Media Ferritina

Espécim en c.p.m. (ng/ml) Espécim en c.p .m . (ng/ml)
A 27.909 150 A 3.612 13
B 8.447 40
Ferritina (ng/ml) Ferritina lng/ml)
FIG U RA 15-9. Curva de calibración para el cálculo de la ferritina sérica.
podría existir síntesis de ferritina por las propias células proliferantes. Es de señalar que la
ferritina constituye una proteína reactante de fase aguda, lo que explica tales aumentos así
como los que ocasionalmente pueden observarse también en el curso de una hepatopatía
(aguda o crónica) o en procesos neoplásicos diversos. Para ayudar en el correcto diagnós
tico y tratamiento de la hiperferritinemia existen herramientas en internet a disposición
de los profesionales médicos (http://highferritin.imppc.org).
RECEPTOR SOLUBLE DE LA TRANSFERRINA

El receptor soluble de la transferrina (RST) es una magnitud que va adquiriendo cada día
más relevancia en el estudio de la ferropenia. Deriva de una proteína llamada receptor de
la transferrina (RTf) que, en forma dimérica, se encuentra en la superficie de la mayoría de
las células, y es muy abundante en los eritroblastos y la placenta. Algunas moléculas de RTf,
por un mecanismo aún no del todo bien conocido, sufren un proceso de proteólisis y pasan
a la circulación bajo la forma del llamado receptor soluble de la TF (RST). La concentración
del RST depende de la del RTf y, al igual que la concentración de ferritina, viene regulada
por la concentración de hierro intracelular. Así, cuando esta disminuye (ferropenia), aumenta
la concentración de RST a la vez que disminuye la de ferritina y viceversa. La concentración
de RST también aumenta cuando lo hace el número de células que poseen RTf, como, por
ejemplo, los eritroblastos (hiperplasia eritroide) o los linfocitos (leucemia linfática crónica). A di
ferencia de la ferritina sérica (FS), que es un reactante de fase aguda, el RST apenas se afecta
con la presencia de inflamación, lo que le atribuye un interés especial para el diagnóstico
diferencial de la anemia ferropénica y la inflamatoria. Así, mientras en la ferropenia se aprecia
un aumento de la concentración de RST, en la anemia inflamatoria esta permanece inalterada.
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Sistema de medida nmol/1 mg/1

ELISA (Rameo Laboratories) 34,1-97,6 2,9-8,3
ELISA (Orion Diagnostics) 15,3-38,8 1,3-3,3
ELISA (R&D Systems) 8,7-28,1 0,7-2,4
University of Iowa (2002):
- Mujeres 21,2-54,1 1,8-4,6
- Hombres 25,9-52,9 2,2-4,5
ELISA, análisis de inm unoabsorción ligado a enzimas.
La medida de la concentración plasmática de RST también es de gran utilidad para

valorar la masa eritroblástica (aumenta en las anemias regenerativas y disminuye en las
arregenerativas) y la respuesta eritropoyética (p. ej., al tratam iento con eritropoyetina
recombinante o rHuEpo,), junto a la concentración de eritropoyetina plasmática (Epo)
y de reticulocitos.
M étodo
Existen diferentes metodologías para m edir la concentración plasmática de RST. La
mayoría de ellas se basan en el principio de la reacción antígeno-anticuerpo mediante
el empleo de anticuerpos monoclonales o policlonales. Aunque en el mercado existen
técnicas RIA, los más empleados son los basados en la técnica del enzimoinmunoanálisis
(ELISA), para los que existen diversos sistemas de m edida comercializados: Rameo
Laboratories, O rion Diagnóstica, R&D Systems, principalmente, o DAMCO, IDEA,
entre otros, o adaptados al empleo de analizadores autom áticos (Roche y Behring,
principalm ente). Actualmente, tam bién existen m étodos inm unoturbidim étricos y
nefelométricos.
El inconveniente es que no existe un estándar internacional y que las unidades varían
según el fabricante. A pesar de ello, no obstante, pueden usarse cualquiera de estos proce
dimientos comerciales siempre que se atiendan las recomendaciones de cada fabricante.
Usando métodos ELISA con anticuerpos policlonales, los valores de referencia (media ±
1SD) de concentración de RST expresado en unidades internacionales [Pla-Receptor de TF
(fragmento); c.sust] o convencionales [receptor de TF (fragmento); c.sust] varían según
el procedimiento de análisis empleado (tabla 15-5), con unos valores medios de alrededor
de 5 ± 1,1 mg/1. El problema es que hay que seguir siempre las recomendaciones del
fabricante, ya que al no existir un patrón de referencia internacional pueden observarse
valores muy dispares.
TINCIÓN DE PERLS DEL ASPIRADO DE MÉDULA ÓSEA

Principio
La tinción de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma de
cualquier tipo de célula, que puede ser aplicada a las células presentes en una extensión
de sangre o m édula ósea. La hem osiderina es un derivado insoluble de la ferritina
(apoferritina + Fe++), considerada como el resultado de la precipitación y unión de
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varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. Normalmente, constituye el hierro

no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células ma-
crofágicas del SMF (macrófagos hísticos o depósitos fisiológicos de hierro).
M aterial
• Extensión de médula ósea (aspirado medular) en portaobjetos totalmente libre de
hierro.
• Microscopio.
• Solución clorhídrica de hexacianoferrato (II) de potasio trihidrato. Debe prepararse
extemporáneamente, mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de
ferrocianuro potásico al 2% en agua destilada (20 g/1) y otra de HCI de 0,2 mol/1
(preparada disolviendo con sumo cuidado 2 ml de HCI concentrado en 98 mi de agua
destilada fría y bajo agitación). La mezcla no se completa hasta después de 10 min de
agitación constante a temperatura ambiente.
• Solución de contraste: hematoxilina de Harris.
M étodo
1. Se fija la extensión en alcohol metílico durante 30 min.
2. Se introduce la extensión fijada en la solución clorhídrica de ferrocianuro potásico
a temperatura ambiente durante 10 min.
3. Se lava la extensión colocándola en agua del grifo durante 20 min.
4. Se contratiñe en solución de contraste durante 5 min.
5. Se lava con abundante agua del grifo y se coloca la extensión durante 2 m in en
alcohol etílico absoluto. Finalmente, se vuelve a lavar con agua del grifo. Una vez
secas, las extensiones están listas para ser observadas.
Valoración e interpretación del resultado

La hemosiderina teñida mediante la tinción de Perls aparece bajo la forma de gránulos
de intenso color azul-verdoso (azul de Prusia) que se observan norm alm ente a la
altura de las zonas abundantes en macrófagos, tales como el grum o medular aplas
tado (fig. 15-10). De hecho, el estudio del hierro m edular constituye el medio más
fidedigno para conocer el estado de las reservas férricas del organismo, a la vez que es
el más práctico por la relativa facilidad de su realización.
fjfl FIGU RA 15-10. Imagen de hierro

medular obtenida mediante la tinción
de Perls.
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Además del hierro macrofágico, la tinción de Perls del aspirado medular permite valorar
también el hierro no hemínico, presente en el citoplasma de los eritroblastos, y determinar
el número de los que presenten uno o más gránulos de hemosiderina (sideroblastos).
La cuantificación del hierro macrofágico medular puede realizarse de varias maneras,
aunque las más empleadas son la valoración de la intensidad del color azul o la del
núm ero de precipitados hemosiderínicos presentes en las zonas de grum o aplastado.
Según ello, el hierro medular puede presentarse bajo cuatro grados diferentes: grado 0
(ausente), grado I (disminuido), grado II (normal) y grado III (aumentado).
La importancia diagnóstica de la apreciación del hierro macrófago, también llamado
hierro medular, reside en que en la ferropenia se halla siempre disminuido (grado I) o
ausente (grado 0), mientras que en la anemia de los procesos crónicos o en los estados
de sobrecarga férrica se halla en cantidad normal (grado II) o aumentado (grado III). La
determinación del hierro medular tiene también gran interés en el diagnóstico precoz de
la ferropenia, ya que en el curso evolutivo de la misma existe siempre una primera etapa
en la que este se halla disminuido o ausente sin anemia (fase de ferropenia latente).
La valoración del número de sideroblastos tiene interés para conocer si el hierro llega a
los eritroblastos. En condiciones normales, entre un 30-60% de eritroblastos son sidero
blastos, pero, en la anemia ferropénica la ausencia de hierro macrofágico se acompaña
siempre de una disminución del núm ero de sideroblastos (<5% ). Por el contrario, en
los estados de sobrecarga férrica, el número de sideroblastos se halla siempre aumentado
(60-90%) y, a veces, muy aum entado (anemia sideroblástica), excepto cuando existe
bloqueo del hierro en el interior de los macrófagos (procesos inflamatorios crónicos y
neoplasias). En este caso, es característica la disociación entre el aumento del hierro ma
crofágico (grado III) y la disminución de los sideroblastos (5-10%), y su observación es de
gran utilidad clínica para establecer el diagnóstico diferencial entre la anemia ferropénica
verdadera y la que acompaña los procesos inflamatorios crónicos y ciertas neoplasias.
DETECCIÓN DE PÉRDIDAS DE HIERRO

En un individuo adulto (varones y mujeres posmenopáusicas), la anemia ferropénica
obedece prácticamente siempre a un sangrado por vía digestiva. En general, se trata de
microhemorragias de carácter crónico que producen una pérdida progresiva de hierro
y que pueden obedecer a causas m uy diversas (v. tabla 15-2). O tra posible causa de
anemia ferropénica por pérdidas de hierro es la eliminación de hemosiderina por la orina
(hemosiderinuria). Esta causa es m ucho menos frecuente que la anterior y obedece a
hemólisis intravascular crónica de escasa intensidad, pero con pérdida de hierro por la
orina mediante las células descamadas del túbulo renal.
Detección de pérdida de hierro p o r vía digestiva (hem orragias ocultas)

Ciertas situaciones patológicas del aparato digestivo, como por ejemplo una hernia hiatal,
varices esofágicas, úlcera péptica y tumores del tubo digestivo, pueden acompañarse de
pérdidas crónicas de sangre por el tubo digestivo que, según su extensión y duración,
pueden ser causa de anem ia ferropénica. Aunque existen diversos procedim ientos
basados en reacciones químicas para detectar la presencia de hemoglobina en las heces,
la escasa sensibilidad de algunos (prueba del Guayaco) o el potencial peligro carcinógeno
de otros (prueba de la bencidina) hacen que, hoy en día, el procedimiento más práctico
y fiable para detectar la existencia de hemorragias digestivas ocultas sea la cuantificación
de radiactividad en heces después de la administración de los propios hematíes marcados
con cromo radiactivo (método del cromo radiactivo).
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Este método tiene la ventaja, sobre los convencionales basados en reacciones quí
micas, de que, además de ser mucho más sensible (y específico), permite cuantificar la
intensidad de la hemorragia mediante el cálculo de la cantidad de sangre (en mi) perdida
por día. De esta forma pueden cuantificarse pérdidas de hasta 1 mi de sangre por día, lo
cual es muy im portante si se tiene en cuenta que pérdidas de alrededor de 3 m l/día
son suficientes para ocasionar, en un período relativamente corto (varios meses), una
anemia ferropénica.
Material
• Los reactivos son los mismos que los utilizados para la determinación del volumen
eritrocitario con 5lCr.
• Formalina: formaldehído al 40%.
• Ácido fórmico.
• Contador de centelleo para emisores de radiación y de gran volumen.
Método
1. Se marcan los eritrocitos del propio paciente con 51Cr de la forma descrita para
la determinación del volumen eritrocitario, utilizando una dosis de 37 kBq de
Na2 51Cr20 4/kg de peso corporal.
2. Se inyectan los eritrocitos marcados y, transcurridas 24 h, se inicia la recogida de
heces totales durante un período de 4 días.
3. Se efectúan tres extracciones de sangre con heparina, al segundo día (inicio de la
recogida de heces), al cuarto día y al sexto día (final de la recogida).
4. Se homogeneizan las heces con formalina, colocándolas en el recipiente adecuado
del contador de gran volumen y se procede al recuento de la radiactividad fecal total.
5. Se disuelve una cantidad determinada de sangre (p. ej., 2 mi) de cada una de las
tres extracciones, en un volumen de agua equivalente al de las heces, y se procede
a la medida de la actividad sanguínea.

Una vez restada la radiación de fondo, la pérdida de sangre (mi) p or día se calcula
aplicando la siguiente fórmula:
Actividad del 51Crenheces (c.p.m./día)

Actividad del 5lCrensangre (c.p.m./ml)

En sujetos norm ales, la pérdida sanguínea digestiva es siem pre inferior a 2 m l/día.
Factores tales com o u n a incom pleta colección de heces, el retraso entre el san
grado y la excreción o la falta de hom ogeneización pueden dism inuir la precisión
del ensayo.
Detección de pérdidas de hierro p o r vía u rin aria (hem osiderinuria)

Cuando existe una pérdida de sangre por la orina, esta puede ser debida a una hematuria o
a una hemoglobinuria. La hem aturia es fácilmente distinguida de la hemoglobinuria
por la presencia de abundantes eritrocitos intactos en el sedimento urinario. Su origen
reside en el sistema urogenital.
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La hemoglobinuria obedece al paso de hemoglobina libre en el plasma a través del

glomérulo renal; cuando es intensa se reconoce fácilmente por el fuerte color pardo u
oscuro (color «coca-cola») de la orina («orinas oscuras»). En la hemoglobinuria no se
observan eritrocitos intactos en el sedimento urinario y obedece siempre a una hemólisis
con im portante destrucción de eritrocitos en el sistema vascular (hemólisis intravas-
cular). Es de señalar que, macroscópicamente, la hemoglobinuria no se distingue de la
mioglobinuria, por lo que cuando existen dudas debe procederse a medir la concen
tración de mioglobina en orina.
Al contrario de lo que sucede en caso de hemoglobinuria por hemólisis intravascular
intensa (visible macroscópicamente), cuando esta es poco intensa, la pérdida crónica de
cantidades muy pequeñas de hierro por la orina no puede apreciarse visualmente y debe
recurrirse a la tinción del hierro en las células tubulares descamadas (tinción de Perls)
del sedimento urinario o detección de hemosiderinuria.
Principio
Cuando la hemólisis intravascular es poco intensa, las pequeñas cantidades de hemo
globina libre plasmática que atraviesan el glomérulo renal son reabsorbidas por las
células del túbulo renal, que proceden a su catabolismo y depósito del hierro hemínico
en forma de hemosiderina. Esta queda depositada en mayor o m enor cantidad en el
citoplasma de las células del túbulo, de forma que cuando se descaman permiten una
fácil apreciación del hierro que contienen mediante la tinción de Perls del sedimento
urinario. La hemosiderinuria es la observación microscópica de hierro en el interior de
las células descamadas del túbulo renal cuando se practica el sedimento urinario.
Material
• Solución de hexacianoferrato (II) de potasio trihidrato al 2%.
• Solución de HCI al 2% en agua destilada.
• Centrífuga o citocentrífuga.
• Orina fresca.
Método
1. Se centrifuga la orina durante 5-10 min a 6.000 r.p.m.
2. Se desecha el sobrenadante y al sedimento se añaden:
(a) 1 ml de HCI al 2%.
(b) 1 mi de ferrocianuro potásico al 2%.
3. Se deja reposar, una vez agitado, durante 20 min.
4. Se centrifuga de nuevo 5-10 min a 6.000 r.p.m.
5. Se desecha el sobrenadante y se recoge una gota de precipitado que se observa al
microscopio entre porta y cubre.

Cuando las células de descamación de las vías urinarias contienen cúmulos de hemosi
derina, (gránulos azul-verdosos) existe hemosiderinuria (fig. 15-11). La hemosiderinuria
pone de manifiesto un estado de hemólisis intravascular poco intenso, pero crónico, con
filtración constante de hemoglobina en el glomérulo renal, pero que es totalmente re
absorbida en el túbulo. La hemosiderinuria es un signo característico de una enfermedad
llamada hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). La enfermedad de Marchiafava-
Micheli o HPN es un síndrom e hemolítico secundario a un defecto adquirido de la
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de la tinción de Perls del sedimento
urinario (hemosiderinuria).
membrana eritrocitaria, por el que los eritrocitos presentan un aumento de la sensibilidad

a la acción lítica del complemento (C3b). Ello afecta también a leucocitos y trombocitos,
lo que pone de relieve el carácter clonal de la enfermedad (lesión de la CFU-GEMM). El
estudio de la HPN se incluye dentro de las anemias, porque el síndrome hemolítico es
la principal manifestación clínica de la enfermedad. Sin embargo, no debe olvidarse que la
gravedad del cuadro clínico no depende exclusivamente de la intensidad de la hemólisis,
sino también del grado de afectación de las restantes series (leucopenia o trombocitopenia)
y de la frecuencia e intensidad de los fenómenos trombóticos venosos, también relacionados
con la alteración adquirida de membrana, característica de esta enfermedad.
Aunque la denominación de HPN tiene su origen en las primeras descripciones de
la enfermedad (hemólisis aguda de carácter paroxístico y de aparición nocturna), la
experiencia demuestra que tal comportamiento clínico no alcanza el 50% de los casos.
En realidad, la mayoría de las veces, la HPN cursa con un síndrome hemolítico crónico
de carácter larvado e inicio insidioso, en el que lo más destacado suele ser la coexis
tencia de alteraciones en las otras series (ligera leucopenia y/o plaquetopenia), así como
el carácter escasamente regenerativo de la médula ósea, puesto de manifiesto por un
recuento de reticulocitos escasamente elevado. En caso de pancitopenia, lo más probable
es que coexista un cuadro de aplasia medular. La existencia de trombosis vasculares no es
constante, pero es frecuente observar una tendencia a la hiper- o hipocoagulabilidad.
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DEL EXCESO DE HIERRO

Y HEMOCROMATOSIS
A pesar de que el hierro es un elemento esencial en la dieta, su exceso puede ser perjudicial
e incluso puede matar. Ello puede tener un origen genético o bien puede ser un trastorno
adquirido, que aparece generalmente en personas con anemia crónica y que precisan
de transfusiones periódicas como tratamiento. Ambas situaciones pueden preverse y
corregirse mediante un tratamiento eficaz.
La hem ocrom atosis hereditaria (H H , OM IM 235200) es un trastorno genético
causado por una excesiva absorción de hierro. Las características clínicas de la hemocro
matosis incluyen cirrosis hepática, hepatocarcinoma, arritmias, insuficiencia cardíaca,
diabetes, artritis, hiperpigm entación e hipogonadismo. Al menos cuatro trastornos
de sobrecarga de hierro se han identificado sobre la base de características genéticas
(tabla 15-6). La HH clásica, HFE-HH o HH tipo 1 (OMIM 235200) es una enfermedad
genética autosóm ica recesiva y se debe a m utaciones en el gen HFE (sobre todo la
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TABLA 15-6. Tipos de hemocromatosis hereditarias
Hemocromatosis hereditaria Gen (proteína) Herencia OMIM Orpha

Tipo 1 (hemocromatosis clásica) HFE AR 235200 139498
Tipo 2a (hemocromatosis juvenil) HFE2 (HJV) AR 602390 225123
Tipo 2b (hemocromatosis juvenil) HAMP (hepcidina) AR 602390 79230
Tipo 3 TFR2 AR 604250 139498
Tipo 4 SLC40A1 (ferroportina) AD 606069 139491
AD, autosómico dom inante; AR, autosómico recesivo.
m utación C282Y) y afecta cinco veces más frecuentemente a los hom bres que a las
mujeres. La mutación C282Y del gen HFE es muy común en la población caucásica, con
una prevalencia de 1:1.000 a 1:200. La presencia de la mutación C282Y en homocigosis
predispone a desarrollar H H tipo 1, pero no todos los individuos con esta mutación
desarrollaran síntomas clínicos (penetrancia incompleta). Las otras H H (tipo 2, 3 y 4)
o H H no-H FE son enferm edades genéticas raras. D ebido a que la m ayoría de los
datos disponibles de HH no-HFE se basan en informes de pocos casos, la prevalencia
y distribución étnica en la población son difíciles de estimar. La HH-juvenil (OMIM
602390) es una forma más grave de H H y está causada p o r mutaciones en el gen de la
hepcidina (HAMP) o en el gen de la hemojuvelina (HJV). La HH-juvenil se presenta
generalmente antes de los 30 años y, a diferencia de la HFE-HH, afecta a ambos sexos
por igual. La miocardiopatía y el hipogonadismo son las características más prominentes
de la HH juvenil. Los pacientes no tratados mueren a edad temprana como resultado de
la insuficiencia cardíaca, debida a la rápida acumulación de hierro en el corazón. La
inversión de complicaciones cardíacas se ha descrito en pacientes tratados con una
combinación de dos quelantes de hierro, deferiprona y deferoxamina. Un trastorno
clínico similar a la HFE-HH está causado por mutaciones en el receptor de TF 2 (TFR2)
(OMIM 604250). La TFR2-HH o HH tipo 3 es una enfermedad genética poco frecuente
y tiene u n fenotipo más grave que la HFE-HH.
Una enfermedad relacionada con la HH, pero con una herencia dominante (todas
las demás formas de H H son recesivas) está causada por mutaciones en el exportador
de hierro ferroportina (FPN) (OMIM 606069). Las diferencias mutacionales en este
gen derivan en dos variaciones fenotípicas: un prim er tipo se asemeja al fenotipo de la
HFE-HH con una saturación de TF alta y la acumulación de hierro en hepatocitos (HH
tipo 4b), y el segundo fenotipo presenta una saturación de TF normal y la acumulación
de hierro en las células de Kupffer del hígado (HH tipo 4a).
El principal tratam iento para los pacientes de H H es la flebotomía terapéutica o
la eritrocitaféresis para eliminar el exceso de hierro. Algunos pacientes no toleran la
extracción de sangre, ya que desarrollan anemia, y pueden ser tratados con quelantes
de hierro. Es im portante destacar que los pacientes con H H diagnosticados y tratados
precozmente tienen una esperanza de vida normal. Se ha descrito un amplio espectro
de mutaciones en todos los genes que causan HH.
Existen varios métodos para medir la sobrecarga de hierro en el organismo, cada uno
de los cuales tiene limitaciones. Debido a que el 90% del exceso de hierro se deposita
en el hígado, el enfoque de la mayoría de las técnicas es medir el nivel de hierro en el
hígado. El exceso de hierro en el cuerpo se diagnóstica m ediante las pruebas que se
desarrollan a continuación.
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Pruebas bioquím icas: ferritina sérica y saturación de transferrina

Todos los tipos de hemocromatosis hereditaria presentan una sideremia elevada y además
los tipos 1 ,2a, 2b, 3 y 4b se caracterizan por unos niveles de ferritina sérica y un índice
de saturación de TF (1ST) elevados. Ambos parámetros bioquímicos (ferritina e 1ST)
deben ser medidos para un correcto diagnóstico.
Ferritina sérica (v. el apartado «Medida de la concentración de ferritina

en suero»)
Esta es una prueba relativamente fácil, ya que se realiza con una muestra de sangre y
no es un método invasivo ni m uy costoso. Para llevar un estudio de la evolución de la
sobrecarga de hierro se deben realizar medidas de la ferritina sérica a intervalos regulares
(cada 6 meses-1 año). También se utiliza en la valoración de la respuesta a la terapia con
quelantes de hierro o a las flebotomías.
La m edida de la ferritina sérica es un marcador que estima de forma indirecta los
depósitos de hierro. Como principal desventaja cabe destacar que los niveles de ferritina
se ven influenciados por factores como inflamación, deficiencia de vitamina C o hepatitis,
por lo que se requiere de la utilización de otros métodos de medición para determinar
la causa de su elevación. Para ayudar en el correcto diagnóstico y tratam iento de la
hiperferritinemia existen herramientas en internet a disposición de los profesionales
médicos (http://highferritin.imppc.org).
índice de saturación de transferrina (v. el apartado «Capacidad e índice

de saturación de la transferrina»)
Consiste en medir la saturación en hierro que presenta la proteína transportadora de
hierro en suero, la transferrina. Unos valores superiores a un 55% en dos ocasiones son
sugestivos de hemocromatosis hereditaria. Se trata de una prueba barata, aunque no
específica, apta para el cribado de la población.
Pruebas de cuantificación de hierro

Biopsia hepática
Este método de cuantificación de hierro ha sido considerado históricamente como el
método de referencia para la determinación de hierro corporal, aunque actualmente
existen métodos no invasivos (v. resonancia magnética nuclear y SQUID) que están sus
tituyendo a esta prueba diagnóstica. La medición del contenido de hierro en el hígado
(LIC) por biopsia hepática es un método preciso y directo para estimar la sobrecarga de
hierro; además permite evaluar la naturaleza y severidad de la enfermedad hepática por
medio del análisis patológico e histológico del hígado, lo cual mejora la información
sobre la situación clínica del paciente. Como principales desventajas se destaca que
es un método invasivo y no exento de morbilidad, requiere médicos experimentados
y técnicas de laboratorio estandarizadas, además de que el tam año de la m uestra es
pequeño (<1 mg/g peso seco) y la distribución del hierro, despareja, particularmente
en presencia de cirrosis, lo que puede dar resultados erróneos.
Resonancia magnética
Este es un método técnico por imagen basado en el principio de la resonancia magnética
(RM). A diferencia de la biopsia hepática, se trata del método no invasivo de detección
de hierro, por lo tanto, puede repetirse cuantas veces sea necesario. Además permite la
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visualización de todo el órgano (hígado o corazón) y paralelamente se puede evaluar

el estado patológico. En general, este método precisa de una calibración previa con un
grupo de pacientes con concentraciones hepáticas de hierro ya conocidas y de un software
específico para la cuantificación precisa de la concentración de hierro. Este método se
está utilizando cada vez mas como método diagnóstico en hemocromatosis primarias
y/o secundarias, y para monitorizar la efectividad del tratamiento de estos pacientes.
Susceptom etría m agnética

Este método está basado en la respuesta paramagnética del hierro de la ferritina y hemo
siderina, que es detectada por el dispositivo de interferencia cuántica superconductora
(SQUID). Este método no invasivo ha demostrado una gran fiabilidad y precisión en
la cuantificación del hierro corporal, dem ostrando su utilidad en el diagnóstico de
pacientes con hemocromatosis primaria y secundaria. La medición del hierro hepático
por susceptom etría magnética tiene correlación lineal con la LIC determ inada por
biopsia y las mediciones pueden repetirse en forma frecuente. Sin embargo, el altísimo
coste de compra y mantenimiento y su baja versatilidad (se necesita de un técnico muy
especializado para el procesamiento de los datos) han hecho que solo unos pocos centros
en el m undo hayan adquirido aparatos de este tipo (cuatro equipos en el m undo). No
existe ninguno en España ni en Latinoamérica.
Flebotom ía c u a n tita tiv a

En aquellos tipos de hemocromatosis (primarias) en las que el tratamiento de elección
son las flebotomías, puede recurrirse a la cuantificación de las mismas para evaluar el
contenido en hierro del organismo. Cada flebotomía de 450 mi corresponde aproxima
damente a 0,2 g de hierro extraído. Al sumar flebotomías se puede deducir la cantidad
total de hierro que el paciente tenía atesorado. Suele considerarse una cifra netamente
patológica el poder extraer más de 5 g de hierro almacenado en hombres y más de 4 g
en mujeres. La superación de estos valores se considera como una confirm ación de
diagnóstico en la hemocromatosis hereditaria.
Pruebas genéticas en la hem ocrom atosis hereditaria

En el caso de sospecha de hemocromatosis hereditaria, las pruebas genéticas pueden
aportar un diagnóstico definitivo sobre la etiología de la enfermedad.
D iagnóstico m olecular de la hem ocrom atosis hereditaria

M utaciones del gen HFE. Detección de la m utación C282Y del gen HFE
p o r PCR-RFLP
Un 70-80% de los pacientes con hemocromatosis hereditaria presentan mutaciones de
un gen denom inado HFE. La mutación más prevalente es la denom inada C282Y en
forma homocigota (heredada por partida doble, de padre y madre). La mutación C282Y
consiste en un cambio de guanina (G) por adenina (A) en el nucleótido 845 (exón 4)
que resulta en un cambio de aminoácido de cisterna (Cys) por tirosina (Tyr). Menos
frecuentemente puede hallarse una combinación de esta misma mutación en forma he-
terocigota con otras variaciones comunes (H63D, S65C) en heterocigosis (heterocigotos
dobles). Actualmente, se considera que solo el genotipo C282Y/C282Y es un genotipo
de riesgo para la hemocromatosis hereditaria. Las variaciones genéticas H63D y S65C se
han implicado como causa de HH solamente en combinación con la m utación C282Y
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y junto con otros factores de comorbilidad como la hepatitis vírica o el alcoholismo.

Así pues, los pacientes con sobrecarga bioquímica o clínica de hierro (elevación del 1ST
y/o de la ferritina sérica y/o evidencia de sobrecarga de hierro hepática) y la mutación
C282Y en homocigosis pueden ser directamente diagnosticados de hemocromatosis
hereditaria tipo 1.
Se han descrito múltiples metodologías para la detección de la mutación C282Y del
gen HFE entre ellas: reacción en cadena de la poümerasa (PCR) seguida de digestión con
enzima de restricción (PCR-RFLP), PCR con cebadores alelo específicos (PCR-ASO),
hibridación con oligonucleótidos alelo específicos (ASOH), hibridación reversa, método
single-strand conformational polymorphism (SSCP), análisis de heterodúplex, ensayo
de ligación de oligonucleótidos (OLA), método first nucleotide change method (FNC),
análisis por single nucleotide prim er extension (SNuPE), método de prim er extension
y transferencia de energía de resonancia fluorescente, PCR múltiple seguida de una
detección por cromatografía desnaturalizante líquida o DHPLC, tecnología del chip de
ADN, PCR en tiem po real y secuenciación directa Sanger. Algunos de estos métodos
requieren de una considerable manipulación post-PCR, aunque son m uy específicos y
rápidos, proporcionan un genotipo múltiple, con consumo mínimo de reactivo debido
a la miniaturización, y facilitan la manipulación de múltiples muestras.
Estas técnicas requieren de la extracción del ADN (v. capítulo 13), determinación de
la concentración de ácidos nucleicos (v. capítulo 13), reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) (v. capítulo 13) y de otros pasos específicos.
La detección de la m utación C282Y p o r PCR-RFLP es un método m uy utilizado
en los laboratorios para el diagnóstico de H H tipo 1, aunque el abaratamiento de la
secuenciación Sanger y otras tecnologías (secuenciación por next-generation sequencing)
cambiarán el método diagnóstico en un futuro próximo. A continuación, se describe la
detección de la m utación C282Y del gen HFE mediante PCR-RFLP por ser un método
que no requiere de una extensa manipulación post-PCR ni de un aparataje m uy es
pecífico.
La técnica PCR-RFLP se basa en el corte con endonucleasas de restricción de los
productos amplificados por PCR. Si la mutación causa una variación de la secuencia
nucleótida de los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción, se generarán
distintos patrones de fragmentos.
La mutación C282Y crea una diana de restricción Rsal, por lo que los alelos normales
y m utados pueden ser fácilmente reconocidos a p artir del tam año de los fragmentos
una vez digeridos con esta enzima de restricción y sometidos a electroforesis en u n gel
de agarosa. M uchos laboratorios utilizan los cebadores descritos por Feder et al. en el
artículo que describe el descubrimiento del gen HFE (Feder et al., 1996). Sin embargo, es
importante la selección de los cebadores y la enzima de restricción para que el producto
de PCR contenga un sitio de restricción adicional al creado o destruido por la mutación,
para usarlo de control interno. Además, debido a la polémica sobre la utilización del
cebador reverso descrito por Feder et al., en esta técnica se ha recomendado no utilizar
cebadores que comprendan polimorfismos conocidos, por lo que muchos laboratorios
han rediseñado este cebador (más abajo se proporcionan cebadores optimizados para
la detección de la mutación C282Y).
M aterial
• Microtubos de ensayo de 0,2 m i estériles.
• Micropipetas ajustables de 10,20,200 y 1.000 (xl.
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• Puntas de micropipetas de 10,200 y 1.000 jjlL

• Microcentrífuga.
• Agitador vórtex.
• Termociclador.
• Baño maría.
• Equipo de electroforesis en gel de agarosa y fuente de alimentación.
• Solución tampón de electroforesis: TBE (Tris-borato-EDTA, pH = 8,2-8,6) preparado
de la siguiente forma: 10 X TBE buffer, 11: Tris base, 108 g; ácido bórico, 55 g; 40 mi de
EDTA 0,5 M, pH = 8, agua hasta 11. Se diluye el buffer a 1X para ser usado.
Reactivos
• ADN genómico 0,05 |xg/|xl.
• Enzima Pfu Taq-polimerasa 5 U / jjlL
• Tampón 10X de la PCR: 200 mM de Tris-HCl (pH = 8,8 a 25 °C), 100 mM. (NH4)2S 0 4,
100 mM de KC1, un 1% (v/v) Tritón X-100.
• dNTP, 10 mM.
• Taq-polimerasa, 5 U/|xl.
• ADN, 50 ng/ |xl.
• Cebadores a 10 pmol/(xl:
• Forward: 5_ TGG CAA GGG TAA ACA GAT CC 3_.
• Reverse: 5_ TAC CTC CTC AGG CAC TCC TC 3_.
• Enzima de restricción Rsa I (10.000 unidades/ml) de NEB y tam pón de digestión
10X (NEBuffer 4).
• Agua desionizada.
Preparación de la mezcla de reacción de la PCR (M aster-Mix PCR) (tabla 15-7)

Se reparten 19 |xl de la mezcla de reacción (Master-Mix) en cada tubo de PCR y se añade
a la mezcla 1 (xl de ADN del paciente.
Condiciones de la PCR
• Primera desnaturalización: 94 °C-5 min.
• 30 ciclos con el siguiente programa:
• Desnaturalización: 94 °C-1 min.
• Hibridación: 58 °C-30 s.
• Elongación: 72 °C-1 min.
• Ültima elongación: 72 °C-10 min.
TABLA 15-7. Mezcla de reactivos para la amplificación de parte del gen HFE. Detección
de la mutación C282Y
Reactivos Master Mix PCR

Tampón (X10) 2 |xl
dNTP 10 mM 1 |il
Taq-polimerasa 5 U / |xl 0,5 |xl
Primerforward (10 pmol/(il) 1 |xl
Primer reverse (10 pmol/|xl) 1 |xl
Agua bidestilada estéril 13,5 |xl
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Reactivos Master Mix de digestión

Tampón de digestión NEB4 (X 10) 3 |xl
Enzima de restricción Rsa 1 10 U/|xl 0,5 fil
Agua bidestilada estéril 6,5 |jl1
Digestión enzimática con enzima Rsal

Se prepara la siguiente reacción de Master-Mix para la digestión (tabla 15-8). Se mezcla
de reactivos para la digestión de la amplificación de parte del gen HFE. Se procede a la
detección de la m utación C282Y.
Se reparten 10 fxl de la mezcla de reacción (Master-Mix para la digestión) en tubos
de 1,5 mi y se añaden a la mezcla 20 jjlI de producto de PCR. Se incuban los tubos a
37 °C durante 2 h.
Electroforesis en gel de agarosa al 2% y detección mediante tinción con bromuro

de etidio
• Se procede a la electroforesis (migración de las muestras amplificadas y digeridas)
tras añadirle un buffer de carga a la muestra (p. ej., 10X ADN Gel Loading Buffer: un
0,21% de azul de bromofenol, un 0,21% de Xilen Cianol FF, EDTA 0,2 M, pH = 8, el
50% de glicerol). Se carga también u n marcador de peso molecular.
• Las bandas se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio en un transilumi
nador.
• Fragmentos:
• Banda de 248 y 149 pb (gen normal).
• Banda de 248,149 y 110 pb (gen con la m utación C282Y en heterocigosis).
• Banda de 248 y 110 pb (gen con la m utación C282Y en homocigosis).

La aparición de una banda de ADN de 110 pb indica la presencia de la mutación C282Y,
pues esta crea una nueva diana Rsal que hace que el fragmento de 149 pb sea de m enor
tamaño (fig. 15-12). Si únicamente se detecta la banda de 110 pb, y no la de 149 pb, el
paciente es homocigoto para la mutación C282Y; si presenta ambas bandas el paciente es
heterocigoto para la mutación C282Y y su otro alelo es normal. Ünicamente las personas
con un genotipo C282Y en homocigosis son susceptibles de padecer hemocromatosis
hereditaria tipo 1.
M utaciones en o tro s genes (TFR2, HFE2, HAMP, SLC40A1)

Se han descrito casos de hemocromatosis hereditarias debidas a mutaciones en otros
genes distintos al gen HFE, lo que ha dem ostrado la heterogeneidad genética de la
hemocromatosis hereditaria y a supuesto la clasificación de la misma en cuatro tipos
(v. tabla 15-6). Las hem ocrom atosis hereditarias de tipo 2, 3 y 4 son enfermedades
minoritarias; se han descrito diversas mutaciones en estos genes que normalmente están
restringidas a determinadas familias, sin que haya u na m utación más predominante.
Este hecho hace que el diagnóstico m olecular sea complicado y que se opte p or la
secuenciación de todo el gen mediante el método de secuenciación directa Sanger, para
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Mutante 110 pb
C282Y
FIGU RA 15-12. Diagnóstico genético de hemocromatosis hereditaria tipo 1 (HFE), mutación C282Y
por PCR-RFLP.
que inequívocamente se detecte, si existe, alguna m utación causante de la enfermedad.

Existen centros especializados en la detección de mutaciones en estos genes (v. http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/ o http://www.orpha.net).
Método de secuenciación directa

Las técnicas de secuenciación de ADN se desarrollaron a finales de los años setenta y
revolucionaron de forma significativa el m undo de la genética molecular. Originalmente,
se describieron dos métodos de secuenciación de ADN: el método de Maxam y Gilbert
(Maxam AM, Gilbert W. PNAS 1977) y el método de Sanger (Sanger et al. PNAS 1977).
M ientras que el método de Maxam y G ilbert está basado en la degradación química
de la cadena original de ADN, el método de Sanger se basa en la síntesis de una nueva
cadena de ADN m ediante la actividad enzimática de una ADN polimerasa. Aunque
ambos métodos producen poblaciones de fragmentos marcados (originalmente con
radiactividad) de distinta longitud, los cuales son separados por electroforesis en un gel
de poliacrilamida, en la práctica el método enzimático de Sanger es el más popular y el
más utilizado para secuenciar ADN de forma rutinaria. En los últimos años, el método
original de Sanger se ha modificado y m ejorado sustancialmente, y los cambios más
im portantes son la sustitución de la radiactividad p or marcadores fluorescentes y la
aplicación de la PCR. A continuación, se describen a grandes rasgos las principales
características del método de Sanger.
M étodo de Sanger
El m étodo enzimático de Sanger está basado en la incorporación de term inadores
didesoxinucleótidos (ddNTP) a una nueva cadena de ADN m ediante la actividad de
una ADN polimerasa. Aunque los ddNTP se incorporan a la nueva cadena de la misma
forma que se incorporan los desoxinucleótidos convencionales (dNTP), difieren de
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estos porque carecen del grupo 3'-O H necesario para la elongación de la cadena. Por es
ta razón, cuando se incorpora un ddN TP a la nueva cadena creciente de ADN, la
ausencia del grupo hidroxilo evita la formación del puente fosfodiéster con el siguiente
dNTP y la elongación de la cadena se term ina en ese punto. En la práctica, cada uno
de los cuatro ddNTP se combina con una mezcla de los cuatro dNTP convencionales
en presencia de la ADN polimerasa y de un cebador (primer) específico. En el método
original, cada uno de los cuatro ddNTP se empleaba en cuatro reacciones distintas en
presencia de un dNTP marcado radiactivamente, de forma que se obtenían poblaciones
de ADN de distinta longitud de nucleótidos. Los fragmentos radiactivos obtenidos se
separaban en un gel de poliacrilamida y la secuencia de ADN completa se determinaba
mediante autorradiografía.
C om o ya se h a co m en tad o a n te rio rm e n te , el m éto d o enzim ático de Sanger
es el m étodo de secuenciación más u tilizado en la actualidad, pero con im p o r
tantes m odificaciones. En este sentido, la in co rp o ració n de la PCR ha dado lu
gar a lo que se denom ina secuenciación cíclica. En la secuenciación cíclica, y al
igual que en el m éto d o original de Sanger, se copia la cadena original de ADN
a p a rtir del cebador hasta el lugar de incorporación del ddN TP p o r la ADN p o
lim erasa. La diferencia radica en que en la secuenciación cíclica, esta reacción
tiene lugar unas 20-30 veces en un term o ciclad o r, que da com o resultado una
generación de m últiples copias de los fragm entos, lo que amplifica enorm em en
te la señal y facilita su detección. O tras m odificaciones im portantes del m étodo
original de secuenciación son la su stitu ció n de la rad iactiv id ad p o r flu o ro cro
mos y la autom atización de su detección y análisis m ediante secuenciadores auto
m áticos de ADN. Así, en el m étodo actual la fluorescencia suele estar asociada
a los term inadores ddN TP (cada term inador está asociado a un fluorocrom o dis
tinto), los cuales se incorporan a la nueva cadena de ADN m ediante la amplificación
cíclica usando la actividad de la Taq-polimerasa. Los nuevos fragm entos de ADN se
separan en u n gel de poliacrilamida y la señal emitida p o r cada uno de los fluorocro
mos al ser excitados p or un láser es captada p or unos detectores y analizada mediante
ADN para secuenciar
Polim erasa
l
dNTP
Term inadores ddNTP: ddG -^ . d d a - * d d T - * ddC-
G¥
A A T -*
AA“* £ G GTGAATG G G TG GG TA
:g- ¥
G -*
Tiem po
Gel de
Electroferograma
poliacrilamida
FIGU RA 15-13. Secuenciación de Sanger con fluorocromos y detección automática por láser.
ERRNVPHGLFRVRUJ
soporte inform ático (fig. 15-13). Las principales ventajas de la secuenciación auto
mática son la gran flexibilidad en la utilización de cualquier cebador (norm alm ente
es u no de los dos usados para am plificar el ADN p o r PCR) y que los errores de
lectura causados p o r falsas paradas de la ADN polim erasa no se detectan, ya que no
incorporan fluorescencia. Además, y puesto que cada term inador lleva asociado un
fluorocrom o distinto, el núm ero de tubos a m anejar se divide p o r cuatro mientras
que el núm ero de m uestras a secuenciar en un m ism o gel se m ultiplica p or cuatro.
En la actualidad, existen muchas compañías y servicios de secuenciación que rea
lizan análisis de secuenciación directa Sanger (MACROGEN, GATC y otras). A estas
compañías o servicios se les ha de proporcionar sim plem ente el producto de PCR
purificado y el cebador para obtener la secuencia completa de este fragmento de ADN
amplificado (tamaño de hasta 800-1.000 pb como máximo). También existen múltiples
programas que ayudan en el análisis de los resultados de forma más automatizada (p. ej.,
M utation Surveyor de Softgenetics), com parando la secuencia del paciente con una
secuencia de referencia obtenida de las bases de datos (NCBI, ENSEMBL u otra base de
datos de ADN) y reportando las variaciones encontradas.
M aterial
• Micropipetas ajustables de 10,20,200 y 1.000 (xl.
• Puntas de micropipetas de 10,200 y 1.000 |xl.
• Termociclador.
Reactivos
• ADN genómico 0,05 |xg/|xl.
• Enzima Pfu Taq-polimerasa, 5 U / |il.
• Tampón 10X de la PCR: 200 mM de Tris-HCl (pH = 8,8 a 25 °C), 100 mM (NH4)2S 0 4,
100 mM de KC1, un 1% (v/v) de Tritón X-100.
• dNTP 10 mM.
• Taq-polimerasa 5 U/|xl.
• ADN 50ng/jxl.
• Cebadores a 10 pmol/(xl (tablas 15-9 y 15-10).
• Agua desionizada.
M étodo
Para obtener una secuencia de un fragmento de ADN se deben realizar los siguientes
pasos:
1. Se extrae y cuantifica ADN genómico del paciente (v. capítulo 13).
2. Se diseñan cebadores específicos para la amplificación del fragmento deseado,
generalmente de un tam año inferior a 700-800 pb. En la tabla 15-9 se describen
los cebadores usados para la amplificación de los genes HFE, TFR2, HFE2,
H A M P y SLC40A1 causantes de hemocromatosis hereditaria. En la tabla 15-10
se describen los cebadores usados para la amplificación de los genes TF, CP,
SLC11A2 y TM PRSS6 causantes de anem ias microcíticas no sideroblásticas
y del exón 1 del gen FTL causante del síndrom e de hiperferritinem ia con
cataratas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 15-9. Listado de cebadores usados en la secuenciación Sanger de los genes responsables de la hemocromatosis hereditaria: HFE, TFR2,
HFE2, H AMP y SLC40A1
Amplifi- Cebador F Cebador F secuencia 5 -3 ' Cebador R Cebador R secuencia 5’-3’ Tamaño Pro-
cación de (pb) grama
HFE promotor HFE_9F CATCCCTTAGGGTGGCATTA HFE_9R CCTGGTGAAAAGCAACAGGT 600 64
HFE exón 1 HFE_1F GCTACTTTCCCCAATCAACAA HFE_1R AGGTCCTCCAAAGTTAGCAAA 440 64
HFE exón 2 HFE_2F ACATGGTTAAGGCCTGTTGC HFE_2R CAGACTTCCAGCTGTTTCCT 520 64
HFE exón 3 HFE_3F GCAGGGAAGAGGGAAGGAAT HFE_3R GCCACTAGAGTATAGGGGCA 420 64
HFE exón 4 HFE_4.1F AGTCCAATCTTAGGACACAAA HFE_4R TGCCATAATTACCTCCTCAG 500 64
HFE exón 5 HFE_5.1F GCAGAGATATACGTGCCAGGT HFE_5R CTGGGGCAGAGGTACTAAGA 380 64
HFE exón 6 HFE_6F AAGATGGTGCCTAGGTTTGT HFE_6R TCCCCCAAATTTAAGGAGTC 440 62
parte 1
HFE exón 6 HFE_7F AACCTCAAGCTGCATCTAGA HFE_7R GATGAGTTACTGGGTAACACAG 250 62
parte 2
HFE exón 6 HFE_10F TTTTCTTCTTCACTTT- HFE_10R TGTAATTGTCTGCTTTT- 700 64
parte 3 CACTTTCC CAGAGTTC
TFR2 promotor TFR2_16F CTGTGCCCCTCCTTCTCC TFR2_16R AGGGCCCCTTATCAGTCCT 600 62
TFR2 exón 1 TFR2_1F CTTGGGGGTGGTGAGGAGC TFR2_1R TGGGAAGAAGCGAGGTCAGG 285 66

TFR2 exón 2 TFR2_2.1F ATTGCCAGATGCCTCCCCAC TFR2_2.1R GCTCATAGTTGACATCCTCACT- 400 64
GAC
TFR2 exón 3 TFR2_3F CTCCCCAGAAGTGAAGGGCT TFR2_3.1R CCCAGTCTGAGCGGATGA 400 64
TFR2 exón 4 y 5 TFR2_4.2F CCCCACGTCTCTGGCATC TFR2_4.1R GCCGATGGCGCTGTAGG 470 66
TFR2 exón 5 y 6 TFR2_5F GGCTCACCCCAACACCCTGC TFR2_5R CAGTCCGACCCTCCGGTTCC 380 70
TFR2 exón 7 y 8 TFR2_6F CATTTCCTGGTTTCTCCTGCC TFR2_6R CTTCCTCTCTCTGCTTCCTCC 515 62
TFR2 exón 9 TFR2_7F CTACCCAGGCAGCGTCCAGA TFR2_7R GGCACCACTCCTGTCCCCTC 415 70
TFR2 exón 10 TFR2_8F GCAGTGTCAGAAGTGGGTCC TFR2_8R TGTGGATGCCGAGGTCCAAG 285 70
TFR2 exón 11 TFR2_9F GGGGACCAGGACAGAAGAAG TFR2_9R GGGTGACCAGTGTGGAGTGG 245 66
TFR2 exón 12,13 TFR2_10.2F GTTAGGCATTGGGGAGAGGT TFR2_10.2R CAAAGGCCGTGAAGGAATAG 590 62
y 14
TFR2 exón 15 TFR2_11F GAGCCTGAACCCACAGATCG TFR2_11R CTCCTTTGTGTGCAGGAATGG 245 64
en he m atología
TFR2 exón 16 TFR2_12.2F CGCTAGTCCTTCAGCCTGTC TFR2_12.2 CCAGGGAATGCAGAGAGAAG 370 64
TFR2 exón 17 TFR2_13F GGTCCTTGTCCCCATGCTAG TFR2_13R CAGAGGACCGGGACTGTGTA 340 70
TFR2 exón 18 TFR2_14F AGCCCCCAACCCTGACCTGA TFR2_14R AGCCACCTCCCTGACCCTGA 400 66
parte 1
Capítulo
TFR2 exón 18 TFR2_15.1F CCAGTCAAGAGCTCCTCTGC TFR2_15.1 ATGAGGGTGAGGAAGAAGCA 465 62
parte 2
HFE2 exón 1 HFE2_1.1F GGATATCCAACTTGTCTGTCA HFE2_1R GAGAGACATCCAAGTAGGTG 470 62
15
HFE2 exón 2 HFE2_2F ATCTCCCCAAATTCCAGTCTG HFE2_2R ACATAGCAGCCTACCCTCTAG 360 64
HFE2 exón 3 HFE2_3F CCCTGATGAGATTTGGAAGAG HFE2_3R TGTGAAAGTGATGGTGGAAGC 550 62
Métodos para el diagnóstico

parte 1
HFE2 exón 3 HFE2_4F CCGGACCCTTGTGACTATGA HFE2_4R GAGAGGTTGAGGAAGAAAAGG 345 62
parte 2
HFE2 exón 4 HFE2_5F TAGTCCTGCATCTCTACTTGG HFE2_5R TGCAGGTCCTGTTCAGCTG 400 62
parte 1
HFE2 exón 4 HFE2_6F ATGGAGGTGACCGACCTGG HFE2_6R AGCTGCCAGGTAAAGTTGG 375 68
parte 2
HFE2 exón 4 HFE2_8.1F TGGTGATCCCAACTTTACCG HFE2_8.1R TGCTTTCAGCTCTTGCCTCT 500 62
parte 3
HFE2
de la ferropenia y el exceso de hierro

exón 4 HFE2_9.1F CAAGGTTACTGCATTCCGGAT HFE2_9R GCCCTCTTTCAGTGGAGTG 500 62
parte 4
HAMP promotor HAMP_1F GGCTAGAATCTCAGCTCTGC HAMP1_R CACACATCTGTAGTCCCAGC 470 64
parte 1
HAMP promotor HAMP_2.1F TGCAGTCACACAATCATAGCTCA HAMP_2.1R CACGTGCATAGGTTCTGGCA 450 64
parte 2
HAMP promotor HAMP_3.1F ACCAGAGCCACATCTCAAGG HAMP_3.1R GTCTGGGACCGAGTGACAGT 470 66
parte 3
HAMP exón 1 HAMP_4.1F CGCTCTGTTCCCGCTTATCT HAMP_4.1R CTGGTTCCTGTTCAGCTGCC 410 64
HAMP exón 2 HAMP_5.1F GGCCCCTCCTAAGAGTCCAT HAMP_5.1R CGGCAGAGAGAAAGGACAAC 510 70
SLC40A1 promotor SLC40A1_10F TCGCGCAGAATCTCCCTAC SLC40A1_10R GCACCTCTAAAAACACAACAGC 589 64
SLC40A1 exón 1 SLC40A1_1F CGTCGTTGTAGTCTTTTTGC SLC40A1_1R TTCACAGCAGAGCCACATTC 290 64
SLC40A1 exón 2 SLC40A1_2F CATTAAGTGACTACCATCGC SLC40A1_2R GCTTAATACAACTGGCTAGAA 200 58
SLC40A1 exón 3 SLC40A1_3.1F CCATTGTGCTGGGATGAAC SLC40A1_3.1R AGGCATTGGTCCCATGAATA 389 66
SLC40A1 exón 4 SLC40A1_4.1F GCAGGACTGACTTCAGAAAGG SLC40A1_4.1R AAGGTCACACTGGCCAAAAA 370 58
SLC40A1 exón 5 SLC40A1_5.1F TTTTTATCATTCCACCAAA- SLC40A1_5.1R CCACCGATTTAAAGTGAATCC 291 58
GACTA
SLC40A1 exón 6 SLC40A1_6F GTCTCTCTTTGATGGGTTTGC SLC40A1_6R AGCCTGCTCTTGCCTCGTCT 450 66
SLC40A1 exón 7 SLC40A1_7F GGAAGGGGAATAGAAGGAAA SLC40A1_7R ACCTGTCCGAACCAAACCAC 450 58
1
(Continúa) hP^-
to
TABLA 15-9. Listado de cebadores usados en la secuenciación Sanger de los genes responsables de la hemocromatosis hereditaria: HFE, TFR2,
HFE2, H AMP y SLC40A1 (cont.)
Gen Amplifi Cebador F Cebador F secuencia 5'-3' Cebador R Cebador R secuencia 5’-3’ Tamaño Pro
SLC40A1 exón 7 SLC40A1 8F GGAATAATGGGAACTGTAGCT SLC40A1 8R TTTCGTAAGAGTGGATTTTGCT 475 58
parte 2
SLC40A1 exón 8 SLC40A1 9.1F TGTGATTTGAAATGTATGC- SLC40A1 9. IR ACACCCAGCCATTTATTGGA 466 58
parte 1 CTGTA
SLC40A1 exón 8 SLC40A1_11F TTAACTGTTGCTATCCTGTTAC- SLC40A1_1 IR AGTTAAGTGTTTTGTTTTTC- 535 58
parte 2 TAGA CACA
SLC40A1 exón 8 SLC40A1_12F TTTCTGCAAAACT- SLC40A1_12R TTCTACCTGAGTGTGTTAAAT- 560 58
parte 3 CACTCTTGTTC CAAGTG
SLC40A1 exón 8 SLC40A1_13F CCTTCAGCCTGGCAAGTTAC SLC40A1_13R GATGTTCTGTAA- 500 58
parte 4 CAAAAGCCTTG

en he m atología
Capítulo
TABLA 15-10. Listado de cebadores usados en la secuenciación Sanger de los genes responsables de la hiperferritinemia con cataratas (FTL)
y las anemias microcíticas no sideroblásticas (TF, CP, SLC11A2, TMPRSS6)
15
Gen Amplifi Cebador F Cebador 1 secuencia 5'-3' Cebador R Cebador 2 secuencia 5'-3' Tamaño Pro

FTL exón 1 FTL_2F GGGCTGAGACTCCTATGTGC FTL_2R GCAGCTGGAGGAAATTAGGG 500 62
TF promotor TF_29F GACCTTTGAGAGCCCAGGAG TF_29R CTTTGACCTCCCGTGTTTGT 483 64
TF exón 1 TF_7 + 8.1F GTGCTGGACTCCTTCCACTC TF_7 + 8. IR GCGTAGAGAGGCAATGGAAA 299 62
TF exón 2 TF_9F GACAGGACTGAGGGGATGTG TF_9R GCCCCATATATCAGCCTCCT 491 64
TF exón 3 TF_10F GCTGTGCGTGGTCTAGTCAAG TF_19R AAGGATGACAACTCCTTCCTG 428 64
TF exón 4 TF_11F CCTTATCGCCCAGTCCAGTA TF_11R GTCTAGTGCAGCCTGTGTGG 384 64
TF exón 5 TF_12F GCATGTGCTGGTTTGGTTTT TF_12R GAGGACATTTGGCACTTTGG 282 64
TF exón 6 TF_13F GGTGTTGCTTCAGCTACGG TF_13R AAAAAGAACACCCAC- 376 64

TACTTGGA
TF exón 7 TF_14F GTCATTCTCCCGCATGTTCT TF_14R ATCCAAGCAGGGAGCACTAA 300 62
TF exón 8 TF_15F CCTCTCTCCTGGCATCTTGA TF_15R TGCAGGTCCCTGAAAAGACT 246 62
TF exón 9 TF_16F CCTTGAATGGGGTCTGTTTG TF_16R GCATCATTCCCAGGAACACT 373 62
TF exón 10 TF_17F TCTGCTATCTCCCTGGCATT TF_25R TCAGAGAGGGAAAGCTT- 394 62
TATGG
TF exón 11 TF_18F GGACTTGTTGGGAATTGATGA TF_18R CCCCAAAACAATGGGAATTT 377 64
TF exón 12 TF_19.1F TGGAAGCAGACACTCTGGAA TF_19R CTAGAACCAGAGCCCACAGC 289 62
TF exón 13 TF_20F GTGGTGGCTGGTCACAGAAT TF_20R GCCGCACTAATGGAATAGGA 392 64
TF exón 14 TF_21F TGGAAGTTA- TF_21R AAGTGAATACCAGTGACCAG- 370 64
CAGTTGCTGTTTTC GA
TF exón 15 TF_27F AGGCCCAGGTTCTCTACACA TF_27R AAGAAAGTGCTGGAGTCATGG 245 64
TF exón 16 TF_23F GGTGGAAAATTCCCAAGACA TF_23R ACCATGTTTGGTTGCCACTT 384 62
TF exón 17 TF_28F GCCCAGTTCACAGAAGAGGA TF_28R TTAGGCAGAATGCATAAA- 387 62
GAAAT
CP exón 1 CP_1F CAGAGGAACAAAGGGAGCAT CP_1R GCCCACATTTTGCAGTTTCT 599 64
CP exón 2 CP_2F GCATCCCTACAACAGGCAAA CP_2R GAGCTGAATGGCAGTTA- 497 64
TATGTC
CP exón 3 CP_3F AACACATCCCCAAGGATCAC CP_3R CCACCTCTCTACCTTACCTGCT 460 64
CP exón 4 CP_4F GGAGTGACTGGTCCAGACTTG CP_4R GGCTTTACCTGGCTTA- 499 64
GAGTTTT
CP exón 5 CP_5F ACCAGCATGTGTGCCAGATA CP_5R GGGATAAAACTAAGATGC- 493 64
CAGTTC
(Continúa)
y las anemias microcíticas no sideroblásticas (TF, CP, SLC11A2, TMPRSS6) (cont.)
CP exón 6 CP_6F TGCTATCTGTCTATTC- CP_6R TCTCAAGCTCAGACTCTTA- 452 64
CTTCAATTTC CATCAA
CP exón 7 CP_7F GCACTGGTCA- CP_7R TGTTTTATCTTCCACACGCCTA 369 64
GAATTTTTCTCTT
CP exón 8 CP_8F CAAGCTTTCCATTCACCACA CP_8R TCCGTAAACCAATTGGAGGT 471 64
CP exón 9 CP_9F TGCAATCACATCGGTCTGTTA CP_9R GGTGTGATAATTGTGGGCATT 541 64
CP exón 10 CP_10F TGTGGGCAGGAAGGTAGAGT CP_10R TTCACATTTTGTTTAGT- 495 64
TAAAAGCA
CP exón 11 CP_11F CACATAAAGCGTGGGCAAG CP_11R GGCCTAGACTTGCTCTTTCAA 494 64
CP exón 12 CP_12F GAGCAGAAGGTGTGGAAAGC CP_12R TCCTAG- 488 64
GAAGTGTTTTGTTGTTG
CP exón 13 CP_13F TCAGATGGCTGCACTCAGAT CP_13R CGGGACAATACATAGTTTCCAA 577 64
CP exón 14 CP_14F TGGTCTCCATTTTTATTTCCAG CP_14R TCTGATTCACGCTTGAGGATT 559 64
CP exón 15 CP_15F ATCAAGGCTGTGTGTGTGTG CP_15R CGTAGAATTGGACCACAGGAA 298 64

CP exón 16 CP_16F CCACATTGGGCAAAGTCTGT CP_16R CAAAGTGAGGCAGAAGTGGTT 467 64
CP exón 17 CP_17F AAGGCTTTTGGTGCAAAGTG CP_17R ATGAAGCACCGGCTGTACTC 386 64
CP exón 18 CP_18F TCCCTGAGCTGAACATTAA- CP_18R TGCATCATATTGGGGGAAGT 336 64
CAA
CP exón 19 CP_19F AAAAATTGGAATACATTTAAA- CP_19R GGGAAGGCAATGATTGAAAA 483 64
parte 1 GAACCA
CP exón 19 CP_20F TTGCAAATGGAAAGATCAACA CP_20R GCCACAGGTCTATTTTGAAGC 472 64
parte 2
CP exón 19 CP_21F GAACTGGAGAAAAGCA- CP_21R TTTTTGAGAAAGATGT- 500 64
parte 3 GAGTTGA TAATGTTTTG
CP exón 19 CP_22F TCATTTGATTCAGAGAAA- CP_22R TTCACTTCTTAATTTATGAC- 386 64
parte 4 CAGAGC CTCAATC
en he m atología
SLC11A2 exón 1A SLC11A2_1F AGCTGTGTTGCTTAGAG- SLC11A2_1R CTGGAGCAGGTTGGTTTT- 401 64
CACCC CATAC
SLC11A2 exón IB SLC11A2_2F CAATAGGGATGTGCGGCTG SLC11A2_2R TCCATCAGTCCTGGACTCTGG 322 64
SLC11A2 exón 2 SLC11A2_3F CAAACTGCTGGTTCT- SLC11A2_3R CATTTTCATTTACAGC- 304 64
GAACTTGTT CTAAGTCACC
Capítulo
SLC11A2 exón 3 SLC11A2_4F ATAAATTGAGCTAGAGT- SLC11A2_4R AACTTGAGCCATCCAGCA- 363 64
CAGGTTGGTCT GATC
SLC11A2 exón 4 SLC11A2_5F TGCTTCATATGTGATAA- SLC11A2_5R GCCCCTGAGGCTACTATCCAA 302 64
15
CAGACCAATT

SLC11A2 exón 5 SLC11A2_6F AGTATTTACCACTCATGTTGC- SLC11A2_6R CACTATAGAATGAGGC- 302 64
CAAAC CAGCACA
SLC11A2 exón 6 SLC11A2_7F AGTCTGGAGGCTTATAAAG- SLC11A2_7R AATTGGGTTTTTGTTTT- 302 64
GACTGTT TATCTCTGC
SLC11A2 exón 7 y 8 SLC11A2_8F TTTATCTGGAGAGCTGTTGG- SLC11A2_8R TTGATACACCCACTATAAGT- 452 66
GAA GAATCATACTAG
SLC11A2 exón 9 SLC11A2_9F GATAAAGGATGC- SLC11A2_9R AATTGAAGGAAAAGATC- 304 64
TAACTGTTCCCTG CCATGAA
SLC11A2 exón 10 SLC11A2_10F CAGCTGACTCCAAACTC- SLC11A2_10R CCATTGCAGTCTTCACTT- 304 64
CTGAAA TACCCT

SLC11A2 exón 11 SLC11A2_11F GTGTTTTCCCTCCAGCCTACC SLC11A2_11R GACACTCCAGAGGAGA- 312 64
TATGCTCAT
SLC11A2 exón 12 SLC11A2_12F TGCTGTTTTGGATATTGTCT- SLC11A2_12R TTACACTCCAACTTGGGCGAC 301 64
GAGC
SLC11A2 exón 13 SLC11A2_13F CCATTCTTCT- SLC11A2_13R TCTGACTGGCCTACTG- 907 64
y 14 GAGGTCTCTCCTG CATGAA
SLC11A2 exón 15 SLC11A2_14F GTTTCCTTTTCTGTCTGTGGCC SLC11A2_14R GCCTGGGTCTGTTCATTTCTG 356 64
SLC11A2 exón 16 SLC11A2_15F CTTGTGCAACCCTTGGTGGTA SLC11A2_15R TTAGTAAGCACCACCTAGC- 926 66
GATGT
SLC11A2 exón 17 SLC11A2_16F TTCAATAAATACGTGAAAAT- SLC11A2_16R TTGACCAGTTCATTGT- 350 64
CAGTCTAACC GAAAAAGAG
TMPRSS6 exón 1 1F CTGAGACCTCCGTCTGTCCTC IR TGGAAACAGCCTCGCATTTG 271 64
TMPRSS6 exón 2 2F TGCCGCCTGATGTTGTTACTC 2R GCCTGCTACAGTCACCCCAAG 395 64
TMPRSS6 exón 3 3F GCAGGAGAAGGCATGGAA- 3R TCCCTGTGAATGCTCCAGATG 323 64
GAG
TMPRSS6 exón 4 4F AGTAGGAGCAAAGGGCACCTC 4R GACATGCAGGAAGCCAAGTTC 301 64
TMPRSS6 exón 5 5F CTTCTGCGTGAAGACGGACAG 5R GGCCACACCACAGCTTGTTTC 378 64
TMPRSS6 exón 6 6F AGACAAGGCTGGCTCCAAGG 6R CCCTGCACACACAACAGAAGC 255 64
TMPRSS6 exón 7 7F AGGCGTGAAGCTCAGTGTGTG 7R CTAGCCGTCCTGTCTCCCAGA 584 64

TMPRSS6 exón 8 8F GATGTCCAGACTCCCGTCCAC 8R GAATCTTCCCTCTCCCCATCC 364 64
TMPRSS6 exón 9 9F ATTTGCTGGCAGAGGTGGTAG 9R GGAAACACAGAATCCCAGGTG 458 64
(Continúa,
y las anemias microcíticas no sideroblásticas (TF, CP, SLC11A2, TMPRSS6) (cont.)
TMPRSS6 exón 10 10F TGTTGTTAGGGAGGTGGGTT- 10R GAGATTGGGGACTTGGGCTTC 287 64
CAC
TMPRSS6 exón 11 11F AGGGAGAAATCAGGGCAGAGG 11R CCTTGGTGGTTCCAGGGATG 356 64
TMPRSS6 exón 12 12F GCCACAAGGGTTTGCAGGAAT 12R GAGGCTGCATTGCTGGTCTGT 523 64
TMPRSS6 exón 13 13F GTGATTGGTAACGTGCAA- 13R TGAAGCATGTAGCAGGC- 285 64
TACAGC CTAGA
TMPRSS6 exón 14 14F CTCTTCTGGCTCCATCGTTCC 14R TGAGATTTCCCTCCAGCTTCC 295 64
TMPRSS6 exón 15 15F TCTCCCCCTCCATCATTCTCC 15R CCACCACCCTTCCCTCTATCTG 399 64
TMPRSS6 exón 16 16F ACCACCAGCTAGGCGACCTTC 16R GCCCAATTTGAATCCCAGCAC 571 64
TMPRSS6 exón 17 17F GTGGGCAGAGCAGGAGAGAAG 17R GATGTGAGCAAAGGGCCAGAC 337 64
TMPRSS6 exón 18 18F CCCAGTCAATTCCCAACAGTC 18R GAATACTTGTCCCCCTGCTTG 344 64

en he m atología
3. Se amplifica el ADN por PCR, tal y como se explica en el apartado «Detección

de la m utación C282Y del gen HFE por PCR-RFLP», pero usando los cebadores
específicos (v. tablas 15-9 y 15-10) y una tem peratura de hibridación de los
cebadores adecuada (tabla 15-11 para las condiciones de la PCR).
4. Se purifica el producto de PCR mediante, por ejemplo, el uso de columnas con
membranas de gel de sílice que atrapan el ADN (QIAquick PCR purification kit
u otros similares).
5. Se envía el producto de PCR y del cebador al servicio de secuenciación.
6. Se analizan los resultados comparando la secuencia obtenida con una secuencia
de referencia manualmente o con la ayuda de programas especializados.
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE OTROS TRASTORNOS

HEREDITARIOS DEL METABOLISMO DEL HIERRO
A parte de la hemocromatosis hereditaria, un trastorno genético de sobrecarga del hie
rro, existen otras enfermedades hereditarias en las que los parámetros bioquímicos del
hierro tales como sideremia, ferritina sérica o índice de saturación de TF están alterados.
Síndrom e de hiperferritinem ia con cataratas (HHCS)

El síndrome de hiperferritinemia con cataratas (Hereditary Hyperferritinemia Cataracts
Syndrome, HHCS) fue descrito por primera vez en 1995 (Bonneau et al., 1995) como una
patología hereditaria autosómica dominante caracterizada por niveles de ferritina sérica
marcadamente elevados (>1.000 ng/ml) sin sobrecarga de hierro y catarata congénita
bilateral de aparición temprana. La ausencia de sobrecarga de hierro en pacientes con
HHCS sugería que la elevación de ferritina sérica era debida a una desregulación de la
expresión de la L-ferritina. El análisis del locus genético de la L-ferritina en pacientes con
HHCS condujo a la identificación de las mutaciones heterocigotas en la región reguladora
llamada iron responsive element (IRE) en el gen de la L-ferritina.
Estas mutaciones impiden que las iron regulatory protein (proteína IRP) se unan
a la región 5 ' UTR de ARNm de la ferritina L y se bloquee su síntesis en condiciones
de deficiencia de hierro. Así pues, la síntesis no se reprime y se genera constantemente
L-ferritina; en los análisis sanguíneos se detectan unos niveles muy elevados de ferritina
sérica. Los síntomas clínicos de esta enfermedad son solamente la presencia de cataratas
bilaterales a edad muy temprana. Aunque no se conoce el mecanismo exacto de forma
ción de cataratas, el depósito de exceso de L-ferritina en la lente parece ser determinante.
Desde 1995, numerosas m utaciones que afectan al 5 ' IRE de la L-ferritina se han
descrito, incluidas deleciones y mutaciones puntuales. Una revisión actualizada de las
mutaciones descritas en pacientes con HHCS ha sido publicada recientemente y también
se muestra en la figura 15-14. La mayoría de las mutaciones descritas se encuentran en el
tallo superior y el bucle apical de la estructura IRE. Históricamente, las mutaciones del
IRE de la L-ferritina se han descrito con el nombre de la ciudad en la que se identificó
la m utación seguida por la posición del nucleótido afectado y el tipo de cambio (p. ej.,
un Verona +41 G > C). Hasta la fecha, unas 90 familias han sido diagnosticadas con la
enfermedad en todo el mundo. La prevalencia de esta enfermedad aún no se ha deter
minado con precisión, pero se estima que es de al menos una de cada 200.000 personas
de acuerdo con la base de datos de Orphanet.
Debido a los altos niveles de ferritina sérica, algunos pacientes con HHCS han sido mal
diagnosticados de hemocromatosis hereditaria, una enfermedad genética de sobrecarga
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 15-11. Condiciones de la PCR para secuenciación Sanger de los genes descritos
en las
Programa Temperatura Tiempo

70 Primera desnaturalización: 94 °C 5 min
• 3 ciclos con el programa:
- Desnaturalización 94 °C 30 s
- Hibridación 70 °C 30 s
- Elongación 72 °C 30 s
Elongación final 72 °C 5 min
Primera desnaturalización: 94 °C 5 min
*
- Elongació: 72 °C 30 s
Primera desnaturalización: 94 °C 5 min
ERRNVPHGLFRVRUJ
I TABLA 15-11. Condiciones de la PCR para secuenciación Sanger de los genes descritos j
en las tablas 15-9 y 15-10 (cont.)
Programa Condiciones Temperatura Tiempo

- Desnaturalización: 94 °C 30 s
ERRNVPHGLFRVRUJ
G-C
C
U
U
G-U
A-U
G-C
(+115'-G-CAG-3' (+77)
HUMANO
5'IRE
FTL
FIGU RA 15-14. Alguna de las mutaciones detectadas en el IRE de la L-ferritina en pacientes

con síndrome de hiperferritinemia con cataratas (HHCS). Para una revisión completa, véase Luscieti
et al., 2013.
de hierro (v. apartado «Métodos diagnósticos del exceso de hierro y hemocromatosis»).

Esto ha llevado incluso a realizar pruebas y terapias innecesarias como la cuantificación
de hierro por biopsia hepática y tratam ientos p or flebotomías que han producido la
anemización de estos pacientes con HHCS. Por lo tanto, es muy importante un correcto
diagnóstico genético en pacientes con HHCS, para evitar pruebas clínicas innecesarias
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 15-12. Principales diferencias biológicas y clínicas de las anemias microcíticas

hereditarias no sideroblásticas
Enfermedad Atrans- Aceruloplas- Deficiencia IRIDA

ferrinemia minemia de DMT1
Gen TF CP SLC11A2 TMPRSS6
Proteína TF CP DMT1 Matriptasa 2
Edad de Infancia Adulto Infancia Infancia, adolescencia
diagnóstico
Sobrecarga Sí Sí Sí No (o sí debido a
hepática tratamiento por
de hierro transfusión sanguínea)
Daño cerebral No Sí No No
Hierro sérico Bajo Bajo Alto Bajo
Ferritina sérica Alta Alta Baja o normal Normal
Saturación de Alta Baja Alta Baja
transferrina
Hepcidina Baja Baja Muy baja Normal/Alta para
valores bajos de hierro
Otros Niveles de TF Niveles de CP
sérica muy sérica muy bajos
bajos
CP, ceruloplasmina; TF, transferrina.
y la aplicación de tratamientos inadecuados. Los pacientes diagnosticados con HHCS

deben ser asesorados sobre la inocuidad relativa de esta enfermedad genética, que debe
tratarse con la cirugía de las cataratas.
Debido a la gran variedad de mutaciones que causan esta enfermedad (v. fig. 15-14) el
diagnóstico genético de la HHCS se realiza normalmente mediante secuenciación directa
Sanger del exón 1 de la L-ferritina que contiene el elemento IRE. Véase el protocolo de
secuenciación directa en el apartado «Método de Sanger»; la tabla 15-10, para la secuen
cia de los cebadores y el tamaño de la amplificación y la tabla 15-11 para las condiciones
de la PCR. Existen centros especializados en la detección de mutaciones en estos genes
(v. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/ o http://www.orpha.net).
Anem ias m icrocíticas no sideroblásticas

Existen una serie de enfermedades hereditarias minoritarias caracterizadas por una
anemia hipocrómica y microcítica no sideroblástica que presentan paradójicamente
una sobrecarga de hierro. Las características bioquímicas y clínicas de estas enfermedades
se presentan en la tabla 15-12 y pueden ser usadas para un diagnóstico diferencial. Para
diagnosticar genéticamente estas enfermedades existen centros especializados (v. http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/ o http://www.orpha.net).
Atransferrinemia o hipotransferrinemia
La hipotransferrinemia o atransferrinemia es una enfermedad extremadamente rara,
caracterizada por una anemia microcítica severa desde el nacimiento y una sobrecarga
de hierro tisular (hígado, páncreas, corazón). Esta enfermedad presenta una heren
cia autosómica recesiva (OMIM 209300) y se debida a mutaciones en el gen de la TF, la
proteína plasmática que transporta el hierro a la médula ósea y a otros órganos. La falta
de TF provoca pues una deficiencia de hierro en las células eritroideas y una reducción
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de la síntesis de hemoglobina. El hierro presente en el plasma, como no está asociado

a la TF, provoca la sobreacumulación de este elemento en el hígado, el páncreas y el
corazón. Esta sobrecarga de hierro se ve exacerbada por un incremento en la absorción
intestinal de hierro.
Los pacientes con atransferrinemia pueden ser tratados con infusiones de plasma o
con apo-TF recombinante. Solo se han descrito en todo el m undo 13 pacientes de 11
familias con esta enfermedad y únicamente en cinco pacientes se ha realizado un estudio
genético molecular.
El diagnóstico genético molecular de esta enfermedad se puede realizar mediante
secuenciación directa Sanger del gen de la TF. Véase el protocolo de secuenciación directa
en el apartado «Método de Sanger»; la tabla 15-10, para la secuencia de los cebadores, y
el tamaño de la amplificación, y la tabla 15-11, para las condiciones de la PCR.
Aceruloplasminemia
La aceruloplasm inem ia es una enfermedad genética rara recesiva (OMIM 604290)
caracterizada por anemia moderada, sobrecarga de hierro y neurodegeneración pro
gresiva, causada por la ausencia de ceruloplasmina (CP), una enzima ferroxidasa que
contiene cobre y que cataliza la oxidación del hierro ferroso (Fe2+) a férrico (Fe3+) para
la incorporación de este últim o a la TF en el plasma. La ausencia de ceruloplasmina
causa depósitos de hierro en diversos órganos (hígado, páncreas, cerebro y retina). Estos
pacientes desarrollan diabetes mellitus, degeneración retinal, ataxia y demencia a edades
avanzadas. Un tratam iento agresivo con deferoxamina, un agente quelante de hierro,
puede detener la progresión de estas complicaciones. La aceruloplasminemia se ha des
crito principalmente en personas japonesas y en muy pocos casos de personas caucásicas.
El diagnóstico genético molecular de esta enfermedad se puede realizar mediante
secuenciación directa Sanger del gen de la ceruloplasmina. Véase el protocolo de se
cuenciación directa en el apartado «Método de Sanger»; la tabla 15-10, para la secuencia
de los cebadores y el tamaño de la amplificación, y la tabla 15-11, para las condiciones de
la PCR.
Anemia microcítica e hipocrómica con sobrecarga de hierro por defectos

en el gen SLC11A2 (proteína DMT1)
Recientemente se han descrito unos pocos casos de personas afectadas desde la infancia
de una anemia microcítica e hipocrómica severa, sobrecarga de hierro hepático y que
presentan diferentes mutaciones en el gen SLC11A2 que codifica para la proteína trans
portadora de hierro DMT1 (del inglés divalent metal transporter 1) (OMIM 206100).
La proteína DMT1 es un mediador clave de la absorción de hierro y la transferencia
de hierro de los endosomas al citosol de las células eritroides en desarrollo. Este tipo de
anemia microcítica con sobrecarga de hierro es una enfermedad genética rara con una
herencia autosómica recesiva. La prevalencia exacta de esta enfermedad no se conoce,
pero se estima en <1/1.000.000. Todos los pacientes descritos han sido tratados con
transfusiones de eritrocitos, aunque estos pacientes no requirieron unas transfusiones
tan continuadas como en el caso de pacientes con (3-talasemia. En un caso, se administró
eritropoyetina (EPO), lo que permitió la independencia de las transfusiones.
La transfusión de eritrocitos contribuye a la sobrecarga de hierro, sin embargo, hasta el
momento no hay datos en estos pacientes respecto al empleo de una terapia de quelación
de hierro. La suplementación con hierro por vía oral continuada aumenta los valores de
hemoglobina y mejora la calidad de vida del paciente.
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El diagnóstico genético molecular de esta enfermedad se puede realizar m ediante

secuenciación directa Sanger del gen SLC11A2. Véase el protocolo de secuenciación
directa en el apartado «M étodo de Sanger»; la tabla 15-10, para la secuencia de los
cebadores y el tamaño de la amplificación, y la tabla 15-11, para las condiciones de la PCR.
Anemia refractaria a hierro y con deficiencia de hierro

Aquellos pacientes con anemia refractaria a hierro y con deficiencia de hierro (iron-
refractory iron-deficiency A nem ia, IRIDA [OMIM 206200]) presentan una anemia
hipocrómica y microcítica, valores m uy bajos de hierro sérico y de saturación de trans
ferrina, así como valores normales o elevados de hepcidina. Esta enfermedad está causada
por mutaciones en el gen TMPRSS6, que codifica para la proteasa de serina m atripta-
sa 2. Las mutaciones conducen a una reducción de la actividad de la matriptasa 2 en
los hepatocitos y, por lo tanto, a un aumento en la cantidad de la horm ona hepcidina
que inhibe la absorción intestinal de hierro. La anemia que presentan los pacientes con
IRIDA normalmente no responde a la terapia oral con hierro, pero sí parcialmente a la
administración de hierro intravenoso que debe ser administrado sobre todo en época
de crecimiento.
El diagnóstico de IRIDA se puede realizar mediante la m edida de la hepcidina y/o
un diagnóstico genético molecular por secuenciación directa Sanger del gen TMPRSS6.
Véase el protocolo de secuenciación directa en el apartado «M étodo de Sanger»,
la tabla 15-10, para la secuencia de los cebadores y el tamaño de la amplificación, y la
tabla 15-11 para las condiciones de la PCR.
Bonneau D, Winter-Fuseau I, Loiseau MN, Amati P, Berthier M, O riot D, et al. Bilateral cataract and
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Capítulo 15 Métodos para el diagnóstico de la ferropenia y e l exceso de hierro 4 3 3 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuál es el posible diagnóstico de una persona con ferritina sérica de 1.600 ng/ml y con varios
familiares que presentan valores de ferritina de >900 ng/ml?
(a) Hemocromatosis hereditaria.
(b) Estos valores están dentro de los rangos normales.
(c) Síndrome de hiperferritinemia y cataratas.
(d) Respuestas a o c.
(e) Respuestas a o c, o deficiencia de DM T1.
Respuesta razonada: la H H y la HHCS se caracterizan por niveles altos de ferritina sérica. La
deficiencia de D M Tl presenta valores bajos o normales de ferritina sérica.
2. ¿Qué parámetros bioquímicos son necesarios para diagnosticar hemocromatosis hereditaria?
(a) Hierro y ferritina sérica solamente.
(b) Ferritina sérica y hemoglobina.
(c) Hierro, ferritina sérica y VCM.
(d) Hierro, ferritina sérica y hematocrito.
(e) Hierro, ferritina sérica y saturación de transferrina.
Respuesta razonada: para el diagnóstico de la H H es necesario saber los niveles de ferritina y
hierro sérico y, además, es m uy im portante la saturación de transferrina.
3. ¿Qué gen/es está/n implicado/s en la hemocromatosis hereditaria adulta?
(a) HFEyTF.
(b) HFE, TFR2 y SLC40A1.
(c) HFE2, TFR2 y SLC40A1.
(d) HFE2, TFR2ySLCllA2.
(e) HFEy TFR2.
Respuesta razonada: los genes causantes de H H son: en la forma adulta HFE, TFR2 y SLC40A1,
y en la forma juvenil HAMP y HFE2.
4. ¿Qué m utación es más frecuente en la hemocromatosis hereditaria clásica?
(a) C282Y en homocigosis.
(b) C282Y y D65Y en heterocigosis compuesta.
(c) C282Y en heterocigosis.
(d) C282Y y H63D en heterocigosis compuesta.
(e) Las respuestas a y b son correctas.
Respuesta razonada: más de un 80% de los pacientes con H H clásica (debida a m utaciones del
gen HFE) presentan la mutación C282Y en homocigosis.
5. ¿Qué tipo de herencia genética presenta la atransferrinemia?
(a) Autosómica dominante.
(b) Es una enfermedad rara y no se sabe qué herencia presenta.
(c) Autosómica recesiva.
(d) Ligada al cromosoma X.
(e) Defectos del ADN mitocondrial.
Respuesta razonada: la atransferrinem ia es una enferm edad genética rara con una herencia
genética autosómica recesiva. El gen de la transferrina está en el crom osoma 3; por tanto, la
herencia no es ni ligada al X ni mitocondrial.
6. ¿Qué posible terapia existe para tratar la atransferrinemia?
(a) No existe tratam iento para la atransferrinemia.
(b) Transfusiones sanguíneas.
(c) Infusiones de plasma.
(d) Transferrina recombinante.
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4 3 3 .e2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
Respuesta razonada: los pacientes con atransferrinemia pueden ser tratados con infusiones de
plasma o con transferrina recombinante.
7. ¿Cuál es el posible diagnóstico de un niño con anemia microcítica e hipocróm ica severa,
sobrecarga de hierro hepática, saturación de transferrina y hierro sérico elevado?
(a) Deficiencia de DMT1 o atransferrinemia.
(b) Deficiencia de DMT1.
(c) Deficiencia de DMT1, aceruloplasminemia o atransferrinemia.
(d) IRIDA.
Respuesta razonada: la deficiencia de DMT1 presenta niveles de hierro sérico elevados, mientras
que la atransferrinemia, la aceruloplasminemia y la IRIDA presentan niveles de hierro sérico
bajos.
8. ¿Qué gen está implicado en la IRIDA?
(a) DMT1.
(b) TF.
(c) CP.
(d) TMPRSS6.
Respuesta razonada: la iron-refractory iron-deficiency anemia (IRIDA) se debe a m utaciones
en el gen TMPRSS6.
9. ¿Cuál/es es/son la/s principal/es característica/s bioquímica/s que presentan los pacientes
con IRIDA?
(a) Niveles anorm alm ente elevados de hepcidina para personas con anemia.
(b) Niveles anorm alm ente elevados de hierro sérico para personas con anemia.
(c) Niveles anormalmente elevados de saturación de transferrina para personas con anemia.
(d) Las respuestas a y c son correctas.
(e) Las respuestas a y b son correctas.
Respuesta razonada: los pacientes con IRIDA presentan unos valores anorm alm ente elevados
(normales o altos) de hepcidina en condiciones de anemia. La hepcidina es un marcador diferen
cial de la anemia IRIDA respecto a otros tipos de anemias hereditarias (fi-talasemias, deficiencia
de DMT 1...) y anemias no hereditarias (enfermedad celíaca, deficiencia nutricional de hierro...).
10. La aceruloplasminemia es una enfermedad causada por la deficiencia de ceruloplasmina,
que es:
(a) Una proteína involucrada en el m etabolismo del manganeso.
(b) Una enzima ferroxidasa que contiene cobre y que cataliza la oxidación del hierro ferroso
(Fe+2) a férrico (Fe+3).
(c) Una enzima ferrorreductasa que contiene cobre y que cataliza la reducción de hierro
férrico (Fe++3) a ferroso (Fe+2).
(d) Una enzima ferroxidasa que contiene manganeso y que cataliza la oxidación del hierro
ferroso (Fe+2) a férrico (Fe+3).
(e) Una enzima ferrorreductasa que contiene m anganeso y que cataliza la reducción de
hierro férrico (Fe+3) a ferroso (Fe+2).
Respuesta razonada: la aceruloplasminemia es una enfermedad causada por la deficiencia de
ceruloplasmina, que es una enzima ferroxidasa que contiene cobre y que cataliza la oxidación
del hierro ferroso (Fe+2) a férrico (Fe+3).
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C A P Í T U L O 16
Métodos para el diagnóstico de la anemia

megaloblástica
A. Remacha y J. L. Vives Corrons
CONCEPTO
La anemia megaloblástica se debe a una falta de cobalamina (vitamina B12) o de folato.
Se denom ina megaloblástica porque se acom paña de unas alteraciones morfológicas
características de los eritroblastos, consistentes en gigantism o celular y asincronía
madurativa núcleo-citoplasma. La causa es un trastorno de la síntesis del ADN que
afecta no solo la serie hematopoyética, sino a todos los tejidos con intenso recambio
celular, como p or ejemplo el epitelio de la piel, la cavidad bucal y el intestino. Asimis
mo, en la m édula ósea pueden afectarse p or el mismo trastorno, además de la serie
eritropoyética, la granulopoyética (leucopenia) y la megacariocítica (plaquetopenia).
La megaloblastosis se acom paña de un acortamiento de la vida de los eritoblastos que
desaparecen en la propia médula antes de madurar a eritrocitos (eritropoyesis ineficaz).
Esta es la causa del escaso aum ento de los reticulocitos y del aum ento del volumen
corpuscular m edio (VCM) (macrocitosis), características de esta enfermedad. Las
causas de anemia megaloblástica se resum en en la cuadro 16-1. No hay que olvidar
que numerosas sustancias químicas, p o r mecanismo competitivo debido a analogía
estructural con la cobalamina o el folato, pueden ser tam bién causa de megaloblas
tosis (cuadro 16-2).
Fisiopatología de la m egaloblastosis
La megaloblastosis es un térm ino morfológico que se refiere a un aumento del tamaño
celular producido p or la perturbación de la síntesis del ADN, durante la fase S del
ciclo celular (fig. 16-1). En esta fase, la célula duplica su contenido norm al de ADN
(diploide-2N-tetraploide-4N), para lo cual requiere de las vitaminas que intervienen en
la síntesis de timina, base pirimidínica que forma parte del ADN (fig. 16-2). La trans
formación del desoxiuridilato (dUMP) en timidilato (dTTP), es una etapa fundamental
para la síntesis del ADN. En esta reacción, el 5,10-metilén-THF es oxidado a ácido
dihidrofólico o dihidrofolato (DHF), que para ser regenerado a ácido tetrahidrofólico
(THF, forma activa del ácido fólico) necesita la intervención de la enzima dihidrofolato-
reductasa. Vemos, pues, que la síntesis del ADN puede estar com prom etida por una
carencia de ácido fólico o p o r sustancias que im pidan su regeneración, gracias a la
enzima mencionada.
El papel de la vitam ina B12 tiene lugar en el aprovisionam iento celular en fola-
tos activos: N5-m etil-TH F, N 5,10-m etilén-TH F y THF, y en la reacción de tra n s
form ación del N 5-m etil-TH F en TH F p o r la cual la hom ocisteína se convierte en
metionina.

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Capítulo 16 Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica 435
CUADRO 16-1. Causas más importantes de anemia megaloblástica por déficit de folatos
y/o vitamina B12
• Malnutrición
• Vitamina B12: vegetarianismo estricto y kwashiorkor. Es un mecanismo excepcional
de déficit de vitamina BJ2
• Ácido fólico: desnutrición acusada o ingesta de alimentos muy cocidos y alcoholismo
crónico acompañado de desnutrición. Es un mecanismo común en el déficit de folatos
• Malabsorción
• Anemia perniciosa o de Biermer: se trata de una malabsorción exclusiva de vitamina B12
debida a una falta de factor intrínseco gástrico de probable origen autoinmune.
Es relativamente frecuente en mujeres menopáusicas, en las que suele asociarse
a diabetes, vitÍligo y afecciones tiroideas (hipotiroidismo)
• Gastrectomía total
• Afecciones intestinales (grandes resecciones del intestino, infestación por el botriocéfalo,
esteatorrea idiopática)
• Hiperconsumo
• Mecanismo prácticamente exclusivo del déficit de folatos. Las causas que pueden
aumentar el consumo son: embarazo, anemias hemolíticas y neoplasias o hemopatías
malignas.
• Todas estas situaciones conducen a una disminución e incluso a un agotamiento
de las reservas de factores madurativos, debido al aumento del recambio celular
en la médula ósea
• Trastornos de la utilización. Las causas más frecuentes en el adulto de déficit de ácido
fólico por trastorno de la utilización (exceptuando el consumo de medicamentos)
son el alcoholismo crónico y la cirrosis hepática, que en muchos casos se dan
simultáneamente.
CUADRO 16-2. Anemias megaloblásticas de causa medicamentosa

• M edicam entos citostáticos (antineoplásicos). Se trata de sustancias que, p o r m ecanism os
distintos (análogos de las p irim idinas o de las p urinas, análogos del ácido fólico, etc.),
conducen a u n enlentecim iento en la síntesis del ADN:
• 5-fluouracilo
• 6-m ercaptopurina
• Arabinósido de citosina
• M etotrexato
• Antiepilépticos. Las hidantoínas conducen a este tip o de trasto rn o , al parecer debido
a que p roducen alteraciones de la absorción intestinal
• Tuberculostáticos:
• Isoniacidas
• PAS, que p uede inducir u n a avitam inosis B12p o r m alabsorción intestinal
• Contraceptivos orales
• A ntidiabéticos orales
• M etform ina
Ácido fólico o folato

El ácido fólico o pteroilglutámico, aislado en 1941 de la hoja de espinaca y a la que debe
su nombre, está formado por la condensación de un núcleo de pteridina con dos ácidos:
paraaminobenzoico y glutámico (fig. 16-3).
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G, ¡ S M ; G, ; S G2 M i FIGURA 16-1. Esquema del ciclo

celular. En el déficit de vitamina B|2 o
1'2 24 36 48 60 Í2 de ácido fólico se perturba la fase S
o de síntesis de ADN. G l, reposo
H o ra s
posmitótico; S, síntesis de ADN.
Las formas activas de este ácido son los derivados reducidos: DHF y THF. Los folatos
se encuentran en gran núm ero de alimentos, especialmente en los vegetales (verduras).
Las necesidades diarias de folato son unos 100 (xg, y están cubiertas por una dieta
equilibrada. El lugar de absorción del folato es el yeyuno proximal, donde las células epi
teliales hidrolizan los poliglutamatos (forma del ácido fólico en los alimentos) mediante
la enzima pteroilpoliglutamato-hidrolasa. El hígado es el órgano de reserva fundamental
del ácido fólico y contiene alrededor de 10 mg de folato que constituyen las reservas
globales del organismo.
Vitam ina B12o cobalam ina

La vitamina B12 fue descubierta en 1877, si bien no se obtuvo en forma cristalina hasta
1948. Químicamente es bastante compleja y, en esquema, consta de una estructura anular
(el anillo de la corrina), que está constituida p o r cuatro anillos pirrólicos dispuestos
ADN-polimerasa ^ | a q n
■THF —► N5,10-metilén-THF N5-metil-THF
t ___ I
Homocisteína
FIGURA 16-2. Nivel bioquímico en el que se bloquea la síntesis de ADN por efecto del déficit
de vitamina B12o de ácido fólico.
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Folato
__ I__
N N
COOH
I
NH— C H — CH2— CH2— COO-
Ácido
paraam inobenzoico
(PABA) Ácido-L glutámico
Ácido pteroico
FIGU RA 16-3. Estructura química del ácido fólico.
de forma similar a los de la protoporfirina IX del grupo hemo, aunque se diferencian

de este en que dos de ellos se unen directamente entre sí sin puentes meténicos. Este
anillo encierra en su interior un átomo de cobalto, el cual se une a los nitrógenos de los
cuatro pirróles por valencias de coordinación. Mediante la quinta valencia se une a un
ribonucleótido (el 5-6-dimetilbencimidazol), constituyendo la molécula cobalamina, y
a través de la sexta puede unirse a uno de los radicales siguientes: cianuro (cianocobala-
mina), hidroxilo (hidroxicobalamina), metilo (metilcobalamina) o 5'-desoxiadenosina
(5'-desoxiadenosil-cobalamina, tam bién llamada coenzima B12) (fig. 16-4). Los dos
últimos derivados son las formas naturales y activas de la vitamina en el organismo.
Las principales fuentes de esta vitamina son los alimentos de origen animal (hígado,
huevos, leche y pescado). De todas formas, interesa saber que esta molécula solo es
sintetizada por determinados microorganismos que son ingeridos por los mamíferos.
Las necesidades diarias de vitamina B12son escasas (2 (ig); el aporte propio de una
dieta corriente es suficiente. Las reservas del organismo son más de 150 veces superiores
a las de folato, lo que explica que, en caso de carencia, la vitamina B12tarda m ucho más
tiempo en desaparecer del organismo que el ácido fólico.
La vitamina B12se absorbe en el íleon distal, previa unión a una proteína segregada por
las células parietales del estómago, llamada factor intrínseco (Fl). La vitamina absorbida
en el intestino es transportada al hígado, unida a una proteína plasmática (transcobalami-
na II), donde se acumula formando la reserva de vitamina B12del organismo. El hígado
posee más de 1.500 mg de vitamina, la cual sale del mismo y es nuevamente transportada
por la sangre unida a otra proteína (transcobalamina I) sintetizada por los granulocitos.
Semiología de la anem ia m egaloblástica

La anemia megaloblástica, tanto por carencia de folatos como de vitamina B12, cursa con
clínica y signos biológicos prácticamente superponibles (cuadro 16-3).
Cuando se sospecha un trastorno de la absorción intestinal de vitamina B12, la llamada
prueba de Schilling permite confirmar el diagnóstico (fig. 16-5). Esta prueba consiste en
hacer ingerir al sujeto una dosis mínima de vitamina B12, marcada con un radioisótopo,
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FIGU RA 16-4. Estructura química de la vitamina B12.
e inyectarle, por vía intramuscular, una dosis de la misma vitamina no marcada con el fin
de saturar el transportador (transcobalamina II). En situación normal, la dosis ingerida
es absorbida y eliminada por la orina, donde se detecta mediante un contador de cente
lleo líquido. En caso de no detectarse radiactividad en la orina, significa que no ha sido
absorbida y que se ha eliminado directamente por las heces (prueba de Schilling positiva).
Si existe anemia perniciosa (déficit de Fl), la prueba de Schilling es positiva y se corrige
con la administración de Fl, siempre que no exista un trastorno de la propia mucosa intes
tinal secundario al déficit vitamínico. La prueba de Schilling tiene la ventaja de que puede
realizarse aun después de haber iniciado el tratamiento del enfermo con vitamina B12.
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CUADRO 16-3. Semiología de la anemia megaloblástica
Signos clínicos
• Signos generales de anemia (palidez, astenia, disnea de esfuerzo, palpitaciones)
• Glositis atrófica
• Trastornos digestivos diversos
• Síndrome neuroanémico (propio de la anemia perniciosa): parestesias, dolores, trastornos
de la marcha, hiperreflexia tendinosa, trastornos psíquicos. No se da en el déficit de folatos
Signos biológicos
• Sangre periférica:
• Macrocitosis (VCM > 120 fl) con eventuales inclusiones (cuerpos de Howell-Jolly y/o
anillos de Cabot)
• Cifra normal de reticulocitos
• Eventualmente leucopenia y/o plaquetopenia
• Presencia de pleocariocitos o neutrófilos hipersegmentados gigantes
• Médula ósea:
• Megaloblastos (asincronía madurativa núcleo-citoplasma de los eritroblastos: núcleos
inmaduros y citoplasma con abundante hemoglobina)
• Mielocitos y/o metamielocitos gigantes
• Megacariocitos hipersegmentados
Anemia
perniciosa
FIGU RA 16-5. Esquema general de la prueba de Schilling.
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MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE FACTORES MADURATIVOS

La medida de la concentración de cobalamina en suero, así como la de folato (séricos o in
traeritrocitarios), puede realizarse mediante métodos microbiológicos o radioisotópicos.
M étodos m icrobiológicos
Consisten en estudiar el crecimiento de un microorganismo, dependiendo del factor
cuya concentración hay que medir. El crecimiento es apreciado por la m edida de la
opacificación del medio o de la disminución del pH, debido a la producción de ácido
láctico. El resultado obtenido con una muestra de suero control o del paciente se compara
con un patrón obtenido a partir de diluciones conocidas de cobalamina sérica o de ácido
fólico. Los gérmenes más utilizados son: a) para la determinación de cobalamina sérica
la Euglena gracilis, el Lactobacillus leichmannii o la Escherichia coli, y b) para la del ácido
fólico, el Lactobacillus casei.
M étodos isotópicos
Están basados en el principio de unión competitiva p or los lugares de fijación de una
sustancia aceptora o ligante (generalmente una proteína) específica de la sustancia que
se desea medir. Para la determinación de cobalamina se utiliza como ligante Fl porcino
purificado, que elimina las posibles interferencias de las proteínas R, y se puede calificar
de específico para la cobalam ina biológicam ente activa. Para el folato se utiliza la
(3-lactoglobulina como proteína de unión. La competición por un número limitado de
lugares de fijación del ligante se establece entre el folato o cobalamina presentes en el
espécimen a analizar (analito), y una cantidad fija de folato o cobalamina (o análogos
de los mismos), marcados con un isótopo radiactivo. Los isótopos más utilizados para
la determinación de cobalamina han sido el 57Co y 58Co y para el folato el 3H y 125I. La
utilización conjunta de ácido fólico-125I y cobalamina-57Co permite la determinación
simultánea de ambas sustancias en la misma muestra, debido a las diferentes energías
de radiación, perfectamente separables y sin interferencias.
C uando en la m uestra problem a existe una pequeña concentración de analito, el
ligante fijará mayor concentración de sustancia radiomarcada que cuando el analito
se encuentre en elevada concentración. Existirá, por lo tanto, mayor radiactividad en
el complejo analito ligante para bajas concentraciones de analito y m enor para altas
concentraciones del mismo, una vez separado de la fracción unida a la fracción libre.
Sim ultáneamente a los especímenes de suero problem a se procesan una serie de
muestras control (patrones) con concentración conocida de cobalamina y de folato que
permitirán obtener las concentraciones de ambas sustancias en el espécimen problema,
al poder construir las curvas de radiactividad/concentración.
M étodos autom áticos

Usando el mismo método de unión a un transportador (en este caso el Fl gástrico), se
han construido numerosas metodologías automatizadas basadas en aquellas que ponen
de relieve la concentración de vitamina B12unida a su transportador. Esta varía de una
casa comercial a otra. Lo importante es que usen Fl como ligando, ya que esta proteína
es específica de la cobalamina; otros transportadores, como las cobalofilinas o trans-
cobalamina I, no lo son.
En los métodos inmunológicos automatizados se han descrito interferencias que
pueden dar resultados falsos, tanto falsos positivos como falsos negativos. Sin embargo,
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 16 Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica 44 1
han permitido una generalización de la determinación de los factores de maduración. Ac

tualmente, son los métodos más usados de forma rutinaria; tanto los métodos isotópicos
como, sobre todo, los microbiológicos solo los realizan laboratorios muy especializados
y, en muchos casos, con fines científicos.
M É TO DO S M IC R O B IO L Ó G IC O S
Concentración de cobalam ina sérica

Material de vidrio
Se lava cuidadosamente con mezcla sulfocrómica todo el material de vidrio y después
se aclara abundantem ente con agua destilada. A continuación, se esteriliza durante
30 min a 180 °C.
Espécimen de sangre
Se extraen 10 mi de sangre en un tubo sin anticoagulante y se separa el suero al cabo
de unas 2 h (el suero puede conservarse a —20 °C si no va a efectuarse la dosificación
el mismo día). La presencia de hemólisis tiene poca importancia, ya que el contenido
eritrocitario en cobalamina es muy pequeño.
Medios de cultivo
Pueden emplearse indistintamente medios de cultivo comerciales: BBL o DIFCO.
La preparación y el modo de empleo de ambos están indicados en los frascos corres
pondientes. Además se precisa:
• B12Culture Agar (para el mantenimiento de la cepa).
• B12Inoculum Broth (para la preparación del inóculo).
• B12Assay Medium (para la dosificación propiamente dicha).
Microorganismo
El microorganismo utilizado es el Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, que se mantiene
por reincubación cada 10-15 días en agar-agar (incubación durante 24 h a 37 °C) y se
conserva a 4 °C.
El día anterior a la dosificación, el germen se transfiere a un caldo de cultivo (Inocu
lum Broth) y se incuba 24 h a 37 °C. Este cultivo de 24 h será centrifugado en condiciones
estériles en tubos de tapón de rosca, lavado cuatro veces en solución salina fisiológica es
téril y resuspendido en 10 mi de suero fisiológico. El inóculo estará constituido por una
dilución al 1/100 en suero fisiológico de esta última suspensión.
Reactivos
• Tampón acetoacético, 0,4 mol/1, pH = 4,6:54,4 g de acetato sódico-trihidrato en
900 mi de agua destilada. Se ajusta el pH a 4,6 con ácido acético glacial y se completa
el volumen hasta 11 con agua destilada.
• Solución de cianuro potásico (KCN), 400 mg/1.
• Monodihidrogenofosfato de potasio 0,2 mol/1 (34,84 g/1 de K2H P 0 4).
Método
Paso 1. Se extrae la vitamina B12de las proteínas séricas. Para ello, se prepara en primer
lugar la siguiente mezcla:
ERRNVPHGLFRVRUJ
• Suero, 1 mi.
• Tampón acetoacético, 1 mi.
• Solución de KCN, 0,25 mi.
• Agua destilada, 6,45 mi.
Paso 2. Se introduce la mezcla en un autoclave durante 10 m in (120 °C) y se deja
enfriar a 0 °C. Se añaden 1,5 mi de KH 2P 0 4 y se centrifuga a 5.000 r.p.m. A partir del so
brenadante se practican cuatro diluciones, a una de las cuales se añade el medio de cultivo.
1 2 3 4
Sobrenadante (mi) 0,2 0,5 1 2
Agua destilada (mi) 4,8 4,5 4 3
M edio de cultivo (mi) 5
Paso 3. Se elabora un patrón de soluciones de cianocobalamina. Para ello se emplea

una solución madre de cianocobalamina de 20 mg/1 en agua destilada. La cianocobala
mina debe guardarse a 4 °C durante un máximo de 15 días.
A p artir de la solución madre, se practican dos soluciones sucesivas de 1/1.000, es
decir, se obtiene una solución de 20 pg/ml (20 X 10 -12 g/ml); después se preparan ocho
diluciones de acuerdo con la sistemática indicada a continuación:
1 2 3 4 5 6 7 8
Concentración (pg/ml) 5 10 20 30 40 60 80 100
Solución de 20 pg/m l (mi) 0,25 0,5 1 1,25 2 3 4 5
Agua destilada (mi) 4,75 4,5 4 3,5 3 2 1 —
M edio de cultivo (mi) 5
1. Todas las soluciones que hay que estudiar deben ser esterilizadas durante 10 min
a 120 °C y, después de un enfriamiento inmediato, se siembran mediante una gota
de inóculo. Finalmente, se colocan en la estufa a 37 °C. Hay que preparar también
dos tubos testigo (5 mi de agua ± 5 mi de medio) para el control de esterilidad
y dos tubos testigo (5 mi de agua destilada ± 5 mi de Assay m edium-inóculo)
para el control de la dependencia del germen frente a la vitamina B12. Los tubos
testigo deben ser esterilizados e incubados a 37 °C en idénticas condiciones que
el patrón y las soluciones problema.
2. La lectura del resultado se efectúa valorando fotom étricam ente a 550 nm la
turbidez originada por el crecimiento del germen después de 2 0 h de incuba
ción.
Las dosificaciones serán calculadas a partir de la curva del patrón, procurando que
las tomas sean variadas y teniendo en cuenta la dilución a 1 / 1 0 del suero.
Otro método de apreciación del crecimiento del germen consiste en dosificar el ácido
láctico liberado p o r el Lactobacillus, mediante titulación con NaOH 0,1N. El patrón
se establece sobre papel semilogarítmico, indicando en abscisas la concentración y en
ordenadas los volúmenes de NaOH consumidos.
C oncentración de folato sérico e in traeritrocitario

Material de vidrio
Se lava cuidadosamente con mezcla sulfocrómica o con detergentes enérgicos el material
de vidrio, aclarando con abundante agua destilada. Se esteriliza a continuación durante
30 min a 180 °C.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Espécimen de sangre
Para la m edida de la concentración de folato en suero, la extracción de sangre debe
efectuarse en un tubo sin anticoagulante. El suero se obtiene por centrifugación trans
curridas 2-3 h de la extracción, y se puede guardar congelado ( —20 °C), si la determina
ción no puede realizarse el mismo día, ya que los folatos reducidos son lábiles. Una vez
preparado el suero, se le añaden 5 mg/ml de ácido ascórbico al objeto de proteger el es
tado reducido de los folatos y evitar la pérdida de su actividad. La adición de un producto
reductor es imprescindible si el suero no va a ser conservado a —20 °C. Además, es muy
im portante evitar en lo posible el más m ínimo grado de hemólisis, ya que el contenido
de folatos eritrocitarios es entre 50 y 100 veces superior al del suero.
Los folatos eritrocitarios se determinan mediante una extracción sanguínea realizada
con anticoagulante seco (heparina o EDTA). Se determ ina el valor hem atocrito y se
provoca la hemólisis eritrocitaria (0,5 mi de sangre total + 4,5 mi de agua destilada
enriquecida con ácido ascórbico a la concentración de 1 g/dl). Este hemolizado puede
conservarse a —20 °C hasta el momento de la dosificación.
Microorganismos
El microorganismo utilizado es el Lactobacillus casei ATCC 7469, el cual se mantiene por
reinoculación en agar 10 días (incubación durante 24 h a 37 °C) y se conserva a 4 °C. El
día anterior a la dosificación, el germen es transferido a un caldo (Inoculum Broth) y se
incuba 24 h a 37 °C. Este último cultivo sirve para preparar el inóculo, de acuerdo con
la sistemática siguiente: se centrifuga en condiciones de esterilidad en tubos de tapón
de rosca, se lava cuatro veces con 1 0 mi de suero fisiológico, y la dilución al 1 / 1 . 0 0 0 de
esta última suspensión constituye el inóculo.
Medios
Los medios pueden ser BBL, Difeo o Daño. Además, se precisa:
• Lactobacillus culture agar (mantenimiento de la cepa).
• Folic acid assay medium (dosificación propiamente dicha).
Las indicaciones para la preparación y utilización de cada uno de estos medios son
proporcionadas por los proveedores.
Reactivos
• Tampón fosfato (KH 2P 0 4-NaH 2P 0 4), 0,06 mol/1 (pH = 6,2).
• Tampón fosfato + ácido ascórbico (100 mg/dl).
Método
Paso 1. Se extraen los folatos de las proteínas preparando la mezcla siguiente:
• 1 mi de suero (para folatos séricos) o 1 mi de hemolizado (para folatos eritrocitarios).
• 9 m i de tam pón fosfato-ácido ascórbico.
Se esteriliza la mezcla en autoclave durante 10 m in a 120 °C y se deja enfriar a 0 °C.
A continuación, se centrifuga a 5.000 r.p.m. y se separa el sobrenadante.
Paso 2. Se preparan las soluciones siguientes:
• Determinación de folatos séricos:
Sobrenadante sérico (mi) 0,75 1 1,25 1,5

Agua destilada (mi) 1,75 1,5 1,25 1
M edio (mi) 2,5 2,5 2,5 2,5
ERRNVPHGLFRVRUJ
• D eterm inación de folatos totales:
Sobrenadante de hem olizado (mi) 0,1 0,25 0,5 1

Agua destilada (mi) 2,4 2,25 2 1,5
M edio (mi) 2,5 2,5 2,5 2,5
Paso 3. Se prepara un patrón a partir de una solución madre de ácido fólico (ácido
pteroilmonoglutámico) de 2 0 mg/dl de la mezcla agua/alcohol absoluto (80 volúmenes
por 20 volúmenes). La disolución del ácido fólico puede facilitarse añadiendo NaOH y el
pH se ajusta finalmente a 7 mediante HC11N. A partir de la solución puede prepararse
una solución estándar de 1 ng/ml en agua bidestilada.
Solución patrón o estándar (mi) 0,1 0,3 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2
Agua destilada (mi) 2,4 2,2 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5
M edio (mi) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Tanto las soluciones como los patrones deben esterilizarse durante 10 m in a 120 °C,
enfriándose inmediatamente y efectuando la siembra con una gota de inóculo. A conti
nuación, se colocan en una estufa a 37 °C.
Paso 4. Se preparan dos tubos testigo, uno con 2,5 mi de agua destilada y 2,5 mi de
medio para el control de esterilización, y otro con 2,5 mi de medio más una gota de inó
culo para el control de la dependencia del germen frente a los folatos.
Los testigos de esterilización se incubarán a 37 °C en las mismas condiciones que los
patrones y que las soluciones problema.
Paso 5. La lectura se efectúa valorando la turbidez originada por el crecimiento del
germen, y se puede apreciar transcurridas las 24 h de incubación, midiendo la densidad
óptica en un colorímetro a 550 nm.
De manera similar que para la vitamina B12, otro método de apreciación del creci
miento bacteriano consiste en titular m ediante N aOH 0,1N el ácido láctico liberado
por el germen.
Los niveles de folato sérico se calculan a partir de la curva del patrón, procurando que
las tomas sean variadas y teniendo en cuenta la dilución al 1 / 2 0 del suero.
Los folatos eritrocitarios se calculan a partir de la tasa de folatos totales, de los folatos
séricos y del hematocrito (Hto), según la fórmula:
„ . . . . Folatos totales-Folatos séricos (1-100) Hto
Folatos entrocitanos = ------------------------- ==----------------------------
Hto
100
MÉTODO ISOTÓPICO
Principio
El método isotópico permite la medida simultánea de la concentración de cobalamina
y folato (sérico y eritrocitario). El proceso consiste en tres secuencias:
1. Desnaturalización alcalina de las proteínas endógenas a p H = 12-13, en presencia
de ditiotreitol y cianuro potásico. De esta forma se inactivan los anticuerpos anti-
FI (presentes en más de la mitad de las anemias perniciosas) y los niveles elevados
de proteínas transportadoras de vitamina B12.
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2. Competición por el Fl y (3-lactoglobulina purificados (inmovilizados en partículas

de celulosa), utilizados como ligantes, a pH = 9,3.
3. Separación del complejo analito-ligante, unido a la fase sólida de partículas de
celulosa, p o r centrifugación y decantación.
M aterial
• Contador de centelleo para emisores de radiación 7 .
• Centrífuga capaz de alcanzar los 2.000 g.
• Baño maría a 37 °C.
• Vórtex.
• Agitador magnético.
• Tubos de plástico de 12 X 75 mm.
Especímenes de sangre
La dosificación de folatos y vitamina B 12 se realiza en suero. La recogida y el almacena
miento de muestras sanguíneas se efectúan de igual forma a la descrita para la determina
ción por el método microbiológico. Para la dosificación de folatos eritrocitarios se utiliza
sangre recogida en EDTA, diluyéndola en ácido ascórbico al 1%, en proporción 1:21.
Reactivos (cantidad suficiente para 100 tubos)

• Solución trazadora: vial con 110 mi, que contenga 74 kBq de vitamina B 12 marcada
con 57Co y 259 kBq de ácido fólico marcado con 125I.
• Solución ligante: vial con 120 m i, que c o n ten g a so lu ció n de Fl porcin o y
(3-lactoglobulina purificada e inmovilizada en partículas de celulosa microcristalina,
disueltas en tampón fosfatoglicina con proteína y azida de sodio.
• Calibradores: siete viales, que contengan 0; 50; 100; 300; 600; 1.200 y 2.400 pg/ml de
vitamina B 12 y 0; 0,5; 1; 3; 6 ; 12 y 24 ng/ml de ácido fólico, respectivamente.
• NaOH/KCN.
• Ditiotreitol (vial de 6 m i de solución al 8 %).
• Ácido ascórbico, solución al 1 % preparada extemporáneamente.
M étodo
1. Se marca el suficiente número de tubos, por duplicado, para identificar la actividad
total (AT), enlace no específico (ENE), máximo enlace (ME), calibradores, pro
blemas y controles.
2. Se dispensan 200 |xl del calibrador 0 en los tubos de ENE y ME, y 200 |xl de los res
tantes calibradores, muestras problema y controles en los tubos correspondientes.
3. Se prepara la solución de trabajo, añadiendo a cada mililitro de solución trazadora
50 |xl de ditiotreitol. Esta solución se prepara inmediatamente antes del uso.
4. Se añade 1 mi de solución de trabajo a todos los tubos y se agita al vórtex.
5. Se incuba 30 m in a temperatura ambiente.
6 . Se añaden 50 |xl de NaOH/KCN a todos los tubos y se agita al vórtex.
7. Se incuba 30 m in a 37 °C.
8 . Se añade 1 mi de solución ligante a todos los tubos, excepto a los identificados
como ENE, y se agita vigorosamente al vórtex. A los tubos ENE se adiciona 1 mi
de agua bidestilada.
9. Se incuba durante 60 min a temperatura ambiente.
10. Se centrifuga durante 15 min a 2.000 g.
ERRNVPHGLFRVRUJ
11. Se decanta y desecha el sobrenadante.

12. Se cuenta el precipitado durante 1 min en el contador de centelleo en las condi
ciones de 125I y 57Co.

1. Se determina la media de las actividades del 125I y 57Co de cada par de tubos.
2. Se obtienen los recuentos netos, restando al recuento medio de cada par de tubos
los recuentos correspondientes al ENE.
3. Se determ ina el porcentaje de unión, tom ando los recuentos del ME como
100%.
TT •, v Recuentos netos de la muestra , _

Unión (%) = --------------------------------------- x 100
Recuentos netos del ME
Se representan los porcentajes de unión de los calibradores en papel Logit-Log y se

obtiene la gráfica que une todos los puntos (línea recta). La concentración de folatos y
vitamina B 12 de los problemas y controles se obtendrá interpolando en la gráfica corres
pondiente el porcentaje de unión de cada muestra (fig. 16-6).
VALORES DE REFERENCIA E INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO

Concentración de cobalam ina sérica
La medida de la concentración de cobalamina (Pla-Cobalamina; c.sust o Pla-Cobalamina;
c.masa) está indicada en caso de anemia macrocítica con o sin megaloblastosis. No
F IG U R A 1 6 -6 . Porcentaje de unión de ácido fólico y vitam ina B12.
ERRNVPHGLFRVRUJ
obstante, debe recordarse que esta determinación no tiene valor si el enfermo ha tomado
recientemente medicamentos con vitamina B12.
Los valores de referencia de cobalamina sérica varían entre 200 y 1.000 pm ol/m l.
En caso de déficit se puede llegar a valores inferiores a 100 pmol/1 (anemia perniciosa
y otras carencias de vitamina B 12 no tratadas). Por el contrario, se pueden alcanzar va
lores que sobrepasan incluso los 1.500 pmol/1 en ciertos síndromes mieloproliferativos
(especialmente leucemia mieloide crónica) o en las hepatopatías crónicas evolutivas.
Concentración de folato sérico y eritrocitario

Los valores de referencia no presentan diferencias significativas entre los dos métodos
(microbiológicos e isotópicos) aquí descritos. Así, los valores medios de concentración
de folato en plasma (Pla-Folatos; c.sust o Pla-Folatos; c.masa) varían entre 2 y 17 (xg/1
(concentración de masa) o entre 2,5 y 46 nmol/1 (concentración de sustancia). Los
valores de concentración de folato en sangre total (folato eritrocitario) varían entre
250 y 1.100 (xg/ml, aproximadamente. Valores inferiores a los indicados son altamente
indicativos de carencia de folato, independientemente de su causa. En ciertos pacientes
con déficit de vitam ina B 12 puede observarse una concentración norm al o incluso
elevada de folato sérico acompañada de u n descenso de la concentración de folato eri
trocitario. Esta disociación se debe a la interrelación existente entre el metabolismo de
la vitamina B12 y el del folato, y al defecto en la entrada del folato dentro de las células
como consecuencia de la falta de vitamina B12.
El folato sérico y el folato eritrocitario no son intercambiables. El sérico evalúa
el balance fólico (equilibrio entre absorción y pérdidas/utilización) en un mom ento
determinado. En cambio, el eritrocitario tarda más tiempo en variar, pues refleja los
depósitos de folato en el organismo. Por lo tanto, el folato eritrocitario es más específico
que el sérico para evaluar el déficit de folato. En el déficit de folato, existe una excelente
correlación entre el folato eritrocitario y la elevación de homocisteína, que es peor en
el caso del folato sérico.
El folato sérico es una técnica sensible, pero menos específica que el folato eritrocita
rio; sobre todo, en el ambiente hospitalario donde hay una ingesta inadecuada de folato
de forma pasajera (postoperatorio, enfermos de cuidados intensivos, etc.).
CAPACIDAD DE CAPTACIÓN DE VITAMINA B12LIBRE

POR EL PLASMA
Principio
El análisis de la capacidad de captación (CC) de vitamina B12 por el plasma constituye un
método indirecto de cuantificación de todas aquellas proteínas del plasma capaces de fi
jar de manera específica cobalamina o transcobalaminas. En situación normal el plasma
contiene tres formas de transcobalaminas: I, II y III. De ellas, solo la transcobalamina II
(T C II) es transportadora; las otras dos (T C I y T C III) solo fijan la cobalamina, pero
no la transportan y p or ello se las conoce también como cobalofilinas. No obstante, la
medida de la capacidad que tiene el plasma para fijar la cobalamina, al igual que la que
tiene para fijar el hierro a la transferrina (capacidad de saturación de la transferrina), es
un reflejo de la cantidad de transcobalamina libre de vitamina B12 presente en el plasma.
Esta determinación se efectúa m ediante una técnica isotópica de saturación, aña
diendo al plasma vitamina B12 radiactiva en exceso y midiendo la actividad fijada a las
transcobalaminas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
M aterial
• Contador de centelleo para muestras emisoras de radiación.
• Centrífuga capaz de alcanzar los 2.000 g.
• Vórtex.
• Tubos de cristal de 10 mi.
• Sangre. La dosificación se efectúa en suero obtenido del paciente en ayunas. Puede
conservarse a 2-8 °C durante 48 h o a -2 0 °C para almacenamientos prolongados.
Reactivos
• Charcoal recubierto de albúmina: en un vaso de precipitado de 250 mi se pesan 2,6 g
de Charcoal (Norit A, grado farmacéutico) y 0,5 g de albúmina (BSA, fracción V). Se
añaden 100 mi de H20 bidestilada y se mantiene en agitación durante 1 h antes de
su utilización. Puede usarse durante 1 mes conservado a 4 °C.
• Solución trazadora: se toma una cantidad determinada de solución madre de ciano-
cobalamina 57Co de actividad específica, 555 kBq/|xg, y se diluye con suero fisiológico
salino para obtener una solución de concentración conocida (p. ej., 4.000 pg/ml).
Puede utilizarse durante 1 mes a 4 °C.
M étodo
1. Se llevan todos los reactivos y los sueros de los pacientes a temperatura ambiente.
2. Se numera una serie de tubos y se identifica (por duplicado) la AT, el trazador no
arrastrado (NA) y los sueros de los pacientes.
3. Siguiendo el mismo esquema que en la determinación de la vitamina B12, se dis
pensan en cada tubo las cantidades expresadas de solución salina, sueros problemas
y solución trazadora.
4. Se mezcla con vórtex durante unos segundos, se añade el Charcoal y se centrifuga
a 2 . 0 0 0 g durante 1 0 min.
5. Se cuenta el sobrenadante durante 1 min en el contador de centelleo en las con
diciones del 57Co.

Paso 1. Se determina la media de las actividades de cada pareja de tubos. Se obtienen las
actividades netas restando al recuento medio de los problemas la actividad NA.
_ c.p.m. (1 -N A [c.p.m.])
c.p.m. netas = -
AT (c.p.m.)
Paso 2. Se determina la capacidad de captación (CC) de la vitamina B 12 mediante la

expresión:
nn d _ Activ. problema (c.p.m. netas) x(A T)(pg/m l) x 2

vvVv oe Dp
AT (c.p.m.)

La vitamina B 12 fijada a las transcobalaminas del plasma, o CC de vitamina B12 por el
plasma, oscila, en sujetos sanos, entre 800-1.600 (xg/1. Su aumento es un reflejo de un
aumento de transcobalaminas circulantes, en especial de la transcobalamina I (TC I),
ERRNVPHGLFRVRUJ
sintetizada por los granulocitos neutrófilos y sus precursores de la médula ósea. Por ello la
CC de vitamina B12 por el plasma aumenta en los síndromes mieloproliferativos crónicos
(SMPC), especialmente cuando el recambio celular es m uy elevado como sucede, por
ejemplo, en la leucemia mieloide crónica (LMC) y la policitemia vera (PV) donde cons
tituye, además, un criterio diagnóstico de la enfermedad. En ambos casos, el trastorno
obedece a la liberación de TC I a p artir de los leucocitos en exceso. La captación de
vitamina B 12 libre por el plasma puede hallarse también aumentada en otras situaciones
como, por ejemplo, en la anemia megaloblástica y especialmente en la congénita (déficit
congénito de TC II), donde existe un aumento compensador de TC I y TC III.
ABSORCIÓN INTESTINAL DE VITAMINA B12 (PRUEBA

DE SCHILLING)
Principio
Tras la adm inistración oral de vitam ina B 12 se observa un pico de máxima actividad
sanguínea entre las 8 y 1 2 h, debido a que la absorción ocurre solo en el íleon y existe un
retraso en la transferencia mucosa-sangre. La vitamina B12 no absorbida es eliminada
en heces en un período de 3 a 6 días. Desde la sangre, la vitamina B 12 es captada pos
teriormente por el hígado.
La medida de la actividad sanguínea, la vitamina B12 excretada en heces o la detección
de la actividad hepática podrían proporcionar datos útiles para la cuantificación de la
absorción de vitamina B12, pero todas estas pruebas tienen grandes limitaciones, desde el
punto de vista práctico. Sin embargo, cuando se administra vitamina B 12 intramuscular
mente en cantidad suficiente para saturar los lugares de fijación (TC II y cobalofilinas)
y, a continuación, se administra una dosis de vitamina B12 marcada radiactivamente por
vía oral, a las 2 h se observa como 1/3 de la misma es excretada por el riñón. Esta es la
base de la prueba de absorción intestinal de vitamina B|2.
M aterial
• Una cápsula de cianocobalamina-57Co (E; 122 keV; T 1/2: 270 días): 0,25 g, 18,5 Hbq
unida a jugo gástrico hum ano (Fl).
• Una cápsula de cianocobalamina-58Co (E: 475 keV; T 1/2: 71 días): 0,25 g, 29,6 Hbq.
• Una ampolla de cianocobalamina fría: 1 mg, 1 mi.
• Dos soluciones estándar de 57Co y 58Co: 1 m í de cada una de estas soluciones contiene
el 2 % de la radiactividad contenida en cada una de las cápsulas.
• Contador de centelleo para emisores de radiación -y.

El paciente debe permanecer en ayunas durante las 10-12 h previas al inicio de la prueba
y no recibir ningún laxante durante la misma.
M étodo
1. Se administran las dos cápsulas de cianocobalamina-57Co (Fl) y 58Co.
2. Se inyecta por vía intramuscular 1 mg de cianocobalamina fría, 1,5-2 h después
de la ingestión de las cápsulas.
3. Se inicia la recogida de orina total durante las 24 h siguientes a la administración
de las cápsulas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
4. Se anota el volumen de orina excretado y se dispensan partes alícuotas (p. ej.,

5 mi) por triplicado, en tubos de recuento.
5. Se preparan los estándares dispensando una parte alícuota (p. ej., 1 mi) de ambas
soluciones estándar, por triplicado, en tubos de recuento.
6 . Se mide la actividad en un contador de centelleo para emisores de radiación 7 en
las ventanas prefijadas para ambos isótopos.

Paso 1. Se determina la media de los triplicados de cada muestra y se resta la radiación
de fondo de cada isótopo.
Paso 2. Se calcula el porcentaje de inclusión del 58Co en la ventana del 57Co:
t 1 •, /f\/\ Actividad estándar del 58Co en ventana del 57Co (c.p.m.)

Inclusion (%) = ----------------------------- ----------------------------------------
Actividad estándar del Co en ventana del Co (c.p.m.)
Paso 3. Se resta a la actividad de la orina en la ventana del 57Co la debida a la con

tribución del 58Co:
Actividad neta de orina e n 57Co (c.p.m./ml)= Actividad de orina en ventana d e l57Co

(c.p.m ./m l)-% de inclusiónx Actividad de orinaenventanadel58Co (c.p.m./ml).
Paso 4. La actividad administrada vendrá dada multiplicando por 50 los recuentos

obtenidos por cada isótopo en su ventana correspondiente:
Actividad administrada del 57Co (c.p.m.) = Actividad estándar d e l57Co (c.p.m.) x 50

Actividad administrada del 58Co (c.p.m.) = Actividad estándar del 58Co (c.p.m.) x 50
Paso 5. Se determina la actividad eliminada multiplicando el volumen excretado por

la actividad neta de la orina en su canal correspondiente:
Actividad eliminada d e l57Co (c.p.m.) = Actividadnetadeorinaen 57Co (c.p.m./ml) x
Volumen de orina (mi)
Actividad eliminada del 58Co (c.p.m.) = Actividadnetadeorinaen 58Co (c.p.m./ml) x
Volumende orina (mi)
Paso 6 . Se calcula el porcentaje de eliminación de cada isótopo.

Eliminación de
• r. 57/- Actividad eliminada en 57Co (c.p.m.)

vitaminaB 12 en 57Co(FI)(%) = ---------------------------------- F— — xlOO
Actividad administrada en Co (c.p.m.)
Eliminación de
• r» 58^ Actividad eliminada en 58Co (c.p.m.)

vitaminaB 12 en 58C o(FI)(% )=---------------------------------- F— — xlOO
Actividad administrada en Co (c.p.m.)

Los valores de referencia en sujetos sanos, así como los obtenidos en sujetos con mala
absorción (con o sin déficit de Fl), están expresados en la tabla 16-1. Además del déficit
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 16 Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica 45 1
TABLA 16-1. Prueba de Schilling: eliminación urinaria porcentual (%) de vitamina B12
en 57Co y en 58Co
57Co + Fl (%) 57Co (%)

Normal:
20 21
- X
- Límites 1 1 -2 8 12 -30
Anemia perniciosa y ciertas lesiones
gástricas:
2 10
- X
- Límites 0 ,5-5 5 - 14
Malabsorción no causada por déficit de Fl <4 <4
Fl, factor intrínseco.
de Fl p or gastritis atrófica (anem ia perniciosa), la insuficiencia pancreática, el so-

brecrecimiento bacteriano en el intestino delgado y la disfunción de la mucosa ileal,
pueden ser tam bién causa de malabsorción de vitamina B12 y de anemia megaloblás
tica (no perniciosa). Por ello es im portante establecer claramente el mecanismo de la
malabsorción de vitamina B12, repitiendo la prueba después de la administración de Fl,
durante el tratamiento antibiótico o administrando enzimas pancreáticas.
Jim énez V. Técnicas d e la b o ra to rio en hem atología. M adrid: M arb an ; 1980. p. 3 7 ^ .,
M eyhell M Q , C ooke W T, C ox FG, G addie R. S eru m cyano-cobalam ins level in ch ro n ic intestinal
disorders. L ancet 1957; 1:1901.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 16 Métodos para el diagnóstico de la anem ia m egaloblástica 4 5 1 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuál d e las siguientes es la causa m ás prevalente de déficit de vitam in a B]2?
(a) V egetarianism o.
(b) G astrectom ía.
(c) A nem ia perniciosa.
(d) A lcoholism o crónico.
(e) D esnutrición.
R espuesta correcta: c.
R espuesta razonada: la an e m ia perniciosa es la m ás frecuente. T iene u n origen au to in m u n e y se
o bserva m ás en m ujeres. Se debe a u n a atrofia gástrica y, adem ás del déficit de p ro d u c ció n de
fa cto r intrínseco, se ac o m p añ a d e u n a aquilia resistente a pentagastrina.
2. ¿C uál d e las siguientes es la causa m ás frecuente de déficit de folato?
(a) V egetarianism o.
(b) M alabsorción.
(c) H em ólisis crónica.
(d) A lcoholism o.
(e) C eliaquía.
R espuesta correcta: d.
R espuesta razonada: la causa m ás frecuente es el alcoholism o crónico. G eneralm ente, se ac o m
p a ñ a de tra s to rn o s dietéticos y d e u n a interferencia del alcohol co n el m etabolism o fólico.
3. ¿Q u é fá rm a c o s p u e d e n p ro v o c a r u n a a n e m ia m eg a lo b lá stic a p o r d éfic it d e fa cto re s d e
m ad uración?
(a) Insulina.
(b) M etotrexato.
(c) D ifenilhidantoína.
(d) Todos.
(e) Los dos últim os.
R espuesta correcta: e.
R espuesta razo n ad a: ta n to el m eto trex a to c o m o la d ifen ilh id an to ín a p u e d e n pro v o c ar déficit
d e folato. Los an tid iab ético s orales (m etfo rm in a ) p u e d e n pro v o c ar déficit d e vitam in a B ]2, n o
la insulina.
4. ¿Cuál d e las m anifestaciones clínicas siguientes n o es típica d e la an e m ia m egaloblástica?
(a) A nem ia.
(b) L eucopenia.
(c) A nem ia m icrocítica.
(d) N europatía.
(e) M etam ielocitos gigantes.
R espuesta ra zonada: la a n e m ia m ac ro cítica, c o n VC M elevado, es la típ ic a d e los fa cto re s de
m ad u ra ció n . La anem ia m icrocítica, au n q u e n o excluye la presencia d e su déficit, es m ás rara.
5. ¿Q ué alim entos so n m ás ricos en ácido fólico?
(a) Las carnes rojas.
(b) Los vegetales verdes.
(c) Los lácteos.
(d) Los huevos.
(e) Los azúcares sintéticos.
R espuesta razonada: el ácido fólico es m u y a b u n d a n te en los vegetales verdes y crudos. La cocción
pro lo n g ad a hace q u e se d escom ponga el ácido fólico.
6. La m olécula d e vitam ina B ]2 es com pleja y se asem eja a la de:
(a) H em oglobina.
(b) V itam in a C.
(c) Á cido fólico.
ERRNVPHGLFRVRUJ
45 1.e2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
(d) M etionina.
(e) N inguna.
R espuesta correcta: a.
R espuesta razonada: al igual q u e en la h em o g lo b in a, p osee cu a tro anillos p irró lico s d e fo rm a
s im ilar a la p ro to p o rfirin a IX del g ru p o hem o. El h ierro en la v itam in a B ]2 es su stitu id o p o r el
cobalto.
7. En el caso d e u n a resección ileal, el estu d io del te s t de Schilling dem ostrará:
(a) U n a m alabsorción d e vitam in a B]2 q u e se corrige al a ñ a d ir factor intrínseco gástrico.
(b) U n a m alabsorción de v itam in a B]2 q u e n o se corrige al a ñ a d ir factor intrínseco gástrico.
(c) U n a m alabsorción d e vitam ina B]2 q u e se corrige al a ñ a d ir cobalofilinas.
(d) U n a m alabsorción de ácido fólico q u e se corrige al a ñ a d ir fa cto r intrínseco gástrico.
(e) U n a m alab so rció n de ácido fólico que n o se corrige al añ a d ir fa cto r intrínseco gástrico.
R espuesta razonada: en la patología ileal n o hay o n o fu n c io n a co rrec tam en te el re cep to r ileal
del fa cto r intrínseco gástrico, con lo q u e n o se absorbe vitam ina B ]2; adem ás, n o se corregirá al
a ñ a d ir este factor.
8. ¿Cuál es la m eto d o lo g ía m ás u sada p a ra valorar los factores d e m aduración?
(a) La hom ocisteína.
(b) Los m éto d o s m icrobiológicos.
(c) Los m éto d o s au to m atiza d o s inm unológicos.
(d) Los m éto d o s isotópicos.
(e) N in g u n o d e los anteriores.
R esp u esta ra z o n a d a : a u n q u e n o e s tá n e x e n to s d e p ro b le m a s , los m é to d o s in m u n o ló g ic o s
au to m atiza d o s son los usados con m ás frecuencia en la ru tin a analítica.
9. En el estu d io del déficit de folato:
(a) El folato eritrocitario suele estar dism inuido.
(b) La vitam in a B ]2 sérica p u e d e estar dism inuida.
(c) El folato sérico p u ed e estar dism inuido.
(d) La h om ocisteína está elevada.
(e) Todas son correctas.
R espuesta correcta: e.
R espuesta razonada: en el déficit de folato están d ism in u id o s ta n to el folato sérico com o el eri
trocitario. La h o m o cisteín a se eleva y p u ed e estar dism in u id a la vitam in a B]2.
ERRNVPHGLFRVRUJ
C A P Í T U L O 17

de las hemoglobinopatías y talasemias
M . M . M a ñ ú Pereira y J. L. Vives C o rro n s
HEMOGLOBINOPATÍAS Y TALASEMIAS. INTRODUCCIÓN

Las hemoglobinopatías son alteraciones cualitativas o cuantitativas de la síntesis de la
globina secundarias a mutaciones genéticas, cuya consecuencia puede ser una modifi
cación estructural (hemoglobinopatías estructurales) o una disminución variable de la
síntesis de una cadena de globina, sin alteración estructural (talasemias). Ambos tras
tornos tienen un origen hereditario y su estudio va íntimamente asociado a la historia
clínica del paciente, antecedentes personales o familiares, origen étnico y otros exámenes
hematológicos de carácter general como, por ejemplo, el hemograma; o más dirigido,
como el estudio del hierro.
Las hemoglobinopatías suelen clasificarse en dos grandes grupos.
H em oglobinopatías estructurales
Son el resultado de mutaciones genéticas puntuales que afectan a la estructura (sus
titución de un aminoácido por otro) de alguna de las cadenas de globina (a , 3 , 8 y 7 ),
mayoritariamente a y (3. En un elevado número de casos, la sustitución de un aminoácido
por otro diferente com porta un cambio en la carga en la superficie de la molécula, lo
que permite diferenciar esta hemoglobina m utada de la norm al (HbA) mediante una
simple electroforesis. Si la mutación ha tenido lugar en una zona de la molécula alejada
de su superficie, posiblemente no podrá ser identificada mediante electroforesis, pero
es muy probable que se produzcan alteraciones de otras propiedades moleculares que
también permiten su identificación (inestabilidad molecular, polimerización en medios
hipoxémicos, alteración de la afinidad por el oxígeno, etc.). O tras veces, la mutación
no produce ningún cambio de las propiedades moleculares de la Hb y, por tanto, no se
acompañará de sintomatología clínica (mutaciones silentes).
Las hemoglobinopatías estructurales se transm iten hereditariamente con carácter
autosóm ico codominante. El estado homocigoto se caracteriza p o r la presencia ex
clusiva de la hemoglobina m utada (ausencia de HbA). En el estado heterocigoto, si
la mutación afecta a la cadena 0, se observa un 50% de Hb norm al y un 50% de Hb
patológica, m ientras que si la m utación afecta a la cadena a se observa un 75% de
Hb normal y un 25% de Hb patológica. Esto es debido a que la cadena a , a diferencia de la
P, está codificada por dos genes a. En caso de mutación con repercusión funcional, tanto
las manifestaciones clínicas como la expresividad biológica de la hemoglobinopatía de
penderán del tipo de m utación. Así, la expresividad clínica de una hemoglobinopatía
estructural está íntim am ente relacionada con el tipo y lugar de la m utación. En este
sentido, las m utaciones pueden clasificarse en los tipos que vienen esquematizados
en la tabla 17-1.

ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 17 Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias 453
TABLA 17-1. Hemoglobinopatías estructurales. Mutaciones y expresividad clínica
Localización Consecuencia Expresividad Estabilidad Expresividad

de la mutación electroforética molecular clínica
Superficie Cambio de carga Sí Normal Asintomática
o anemia
hemolítica aguda
Unión Metahemoglobina Sí Disminuida Normal/cianosis
Fe++-globina
Cavidad del Pérdida del hemo Ocasional Disminuida Anemia
hemo hemolítica
crónica
Interacciones Equilibrio oxi-Hb/ No Variable Normal/
entre cadenas desoxi-Hb eritrocitosis
de globina
La hemoglobinopatía estructural m ejor conocida es la HbS, resultante de la sus

titución del am inoácido ácido glutámico (Glu) p o r la valina (Val) a nivel del sexto
residuo de la cadena 0. Esta hemoglobina es funcionalmente normal, pero cuando se
desoxigena, polim erizay da lugar a la aparición de estructuras fibrilares, que deforman
intensamente el eritrocito, haciendo que este adquiera forma de hoz o semiluna (eri
trocito falciforme o drepanocito) (fig. 17-1). La falciformación, cuando es acusada, se
acompaña de anemia hemolítica aguda por rotura de los eritrocitos en la microcircu-
lación y de crisis vasooclusivas por el cúmulo de eritrocitos falciformes y rígidos en los
territorios capilares periféricos.
La hem oglobinopatía S da lugar a la enfermedad de células falciformes cuando
se encuentra en estado hom ocigoto (p s/(3s), o com puesto doble heterocigoto con:
a) otras hemoglobinopatías estructurales como la HbC, H bD o H bO árabe, siendo
la asociación más com ún con la H bC (0 S/ 0 C), o b) con genes talasémicos del locus
(3-globina (0 s/0°-tal). La enferm edad de células falciformes presenta un patrón de
herencia autosóm ico recesivo. La form a de presentación más com ún es la form a
hom ocigota, en la que los pacientes padecen el síndrom e falciforme, de m odo que,

característica de un drepanocito
irreversible en un paciente con
hemoglobinopatía S homocigoto.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 17-2. Genotipos asociados a la enfermedad de células falciformes y gravedad

clínica asociada
Enfermedad de células falciformes Gravedad clínica

HbSS Alta
HbSC Moderada-alta
HbS/ P°-talasemia Alta
HbSDPun>ab Alta
H bSO ^ Alta
HbSE Leve-moderada
HbS/ P+/8 p +-talasemia Moderada-alta
HbS/Hb Lepore Moderada
HbS/HPFH Asintomática-leve
adem ás de la anem ia, pueden presentar graves crisis vasooclusivas con intensos
dolores óseos de carácter general. En las formas de presentación compuestas dobles
heterocigotas la in ten sid ad del síndrom e es variable depen d ien d o del genotipo
asociado (tabla 17-2). La interacción entre las form as dobles com puestas de las
alteraciones más frecuentes que afectan al gen de la 0 -globina, clasificadas según el
riesgo de la descendencia de padecer una hem oglobinopatía grave, se representan
en la figura 17-2.
Debido al efecto protector de la H b fetal durante el período neonatal, el inicio de
la enfermedad de células falciformes es siempre después de los prim eros 4-6 meses
M ADRE
Portador/a HbS (J-Tal Sp-Tal Hb Lep HbE HbO HbC HbD HPPF NP
PADRE HbS
0-Tal
8p-Tal
Hb Lepore
HbE
H b O *30
HbC
HbD
HPPF
NP
Riesgo alto □ R iesgo m oderado □ Sin riesgo
FIGU RA 17-2. Interacción de diferentes mutaciones de los genes de globina cuando coexisten en un
mismo individuo y que condicionan la gravedad del cuadro clínico.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 17-3. Algunos ejemplos de hemoglobinopatías estructurales
Nombre Sustitución aminoacídica Anomalías funcionales

Hemoglobina S (36 (A3/Glu) —»Val No
Hemoglobina C (36 (A3/Glu) -» Lys No
Hemoglobina D Punjab (3121 (GH4) Glu —» Gln No
Hemoglobina Kóln (398 (FG5) Val Met Inestable
Hemoglobina Fannin-Lubbock (3119 (GH2) Gly —» Asp Inestable
Hemoglobina Barcelona (394 (FG1) Asp His Afinidad aumentada por el 0 2
Hemoglobina G Filadelfia a68 (El7) Asn —> Lys —
Hemoglobina Chesapeake a92 (FG4) Arg —» Leu Afinidad aumentada por el 0 2
Hemoglobina J París o¡2 (A10) Ala —» Asp No
Hemoglobina M Boston a58 (E7) His -» Tyr Metahemoglobinemia
Hemoglobina M Iwate a87 (F8) His —» Tyr Metahemoglobinemia
de vida. La m ortalidad en niños con enfermedad de células falciformes es máxima

entre los 1 y 3 años de vida, y generalmente es debida a infecciones p or Streptococcus
pneum oniae. El diagnóstico precoz y la tom a de m edidas preventivas d urante el
período perinatal, la profilaxis an tibiótica y la vacunación antineum ocócica dis
m inuyen significativamente la m orbilidad y m ortalidad asociadas a la enfermedad.
De ahí la im portancia de establecer programas de cribado neonatal de la enfermedad
de células falciformes en regiones donde el nivel de prevalencia lo exige, como, por
ejemplo, en Cataluña y Madrid.
Además de la HbS, hasta la actualidad se han descrito más de 500 hemoglobinopatías
diferentes; las más frecuentes se han recogido en la tabla 17-3. Su importancia clínica
es m ucho m enor que la HbS porque no cursan con manifestaciones tan graves, excepto
cuando coexisten con un gen po rtad o r de HbS. La hem oglobinopatía C (H bC) se
caracteriza p or la sustitución del ácido glutámico de la posición 6 de la cadena 3 de
la globina por lisina. Es una hemoglobinopatía propia del África occidental, pero no
infrecuente en España (existen focos de familias en algunas zonas del sur de España, es
pecialmente en Extremadura). El estado heterocigoto (0 /0 °) es asintomático mientras
que el homocigoto ( 0 C/ 0 C) se acompaña de una moderada anemia hemolítica de carácter
crónico y esplenomegalia. La hemoglobinopatía J (HbJ) es una Hb de migración rápida.
Endémica en Europa, puede encontrarse en España. La hemoglobinopatía D (HbD) asin-
tomática en estado heterocigoto se caracteriza por una leve anemia hemolítica en estado
homocigoto, muy infrecuente en España. La hemoglobinopatía E (HbE) es relativamente
frecuente en el sudeste asiático y en estado homocigoto cursa con un síndrome anémico
leve de características similares a la (3-talasemia heterocigota. En estado heterocigoto
m uestra microcitosis m oderada sin anem ia que puede pasar desapercibida desde el
punto de vista clínico; se caracteriza por la aparición de hematíes «en diana» (fig. 17-3).
Las hemoglobinas inestables obedecen a un cambio de am inoácidos cerca de la
cavidad del hemo, y las cadenas de globina pueden precipitar, produciendo hemólisis,
con anemia y esplenomegalia. Se han descrito más de 100 formas diferentes de hem o
globina inestable y sus manifestaciones clínicas pueden variar desde crisis de hemólisis
neonatal hasta una ausencia de las mismas, pasando por cuadros de anemia hemolítica
crónica.
Las hem oglobinopatías con alteración de la afinidad p or el oxígeno obedecen a
mutaciones que se traducen en una mayor o m enor afinidad de la hemoglobina por el
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 17-3. Presencia de

dianocitos en sangre periférica de un
paciente afecto de p-talasemia mayor.
oxígeno, alterando, con ello, el grado de liberación del oxígeno a los tejidos (oxigenación).
El defecto más frecuente es un aum ento de afinidad que disminuye la liberación de
oxígeno a los tejidos dando lugar a hipoxia y aumento de la síntesis de Epo, con aparición
de eritrocitosis secundaria que se debe tener en cuenta en el diagnóstico diferencial de
la poliglobulia.
Finalmente, la metahemoglobinemia hereditaria obedece a mutaciones que alteran
el estado del hierro hemínico favoreciendo su estado oxidado, es decir, incapaz de trans
portar oxígeno. Normalmente, el hierro de la molécula de hemoglobina se encuentra en
estado ferroso (Fe2+) y, en condiciones normales, menos del 1% está oxidado (Fe3+)
gracias a la existencia de un sistema metabólico específico (sistema diaforasa-citocromo
b5) que mantiene permanentemente reducido el Fe3+.
Talasemias
Son disminuciones hereditarias de la síntesis de alguna de las cadenas de globina y,
según la naturaleza de esta, se clasifican en: a-talasem ia (disminución de cadenas a ),
0 -talasemia (disminución de cadenas 0 ) o 80-talasemia (disminución simultánea de
cadenas 8 y 0). Existen talasemias en las que coexiste la disminución de síntesis con
una alteración estructural (hemoglobinopatías talasémicas). Un ejemplo de ello son
las hemoglobinopatías producidas por un intercambio anómalo de material genético
durante la meiosis. En este caso se producen cadenas de globina híbridas, constituidas
por residuos aminoacídicos normales de dos cadenas diferentes de globina como, por
ejemplo, en el caso de la Hb Lepore, formada por residuos aminoacídicos de las cadenas
8 y 0 , y que constituye una forma de talasemia porque cursa clínicamente con seudopoli-
globulia microcítica.
El mecanism o m olecular de las talasemias es m uy variable, aunque destacan la
mutación delecional en las a talasemias y las mutaciones puntuales en las 0 talasemias.
La deleción de 3,7 kb del gen a-globina (del a -3,7) constituye la forma molecular de
rasgo talasémico más frecuente en nuestro medio, seguida de las mutaciones del gen /3
( 0 -talasemia heterocigota). En ambos casos existe un exceso de síntesis de las res
tantes cadenas de globina, de form a que en el caso de la 0 -talasem ia se observan
precipitados intraeritroblásticos de cadenas a , y en el caso de a-talasemia, precipitados
de cadenas 0. Estos precipitados de exceso de cadenas dificultan la m aduración norm al
ERRNVPHGLFRVRUJ
de los eritroblastos, con su consiguiente desaparición en la propia médula ósea antes de

madurar a eritrocitos (eritropoyesis ineficaz). La eritropoyesis ineficaz constituye,
por tanto, el mecanism o fisiopatológico fundam ental de la anemia en la talasemia.
Igualm ente, la dism in u ció n de cadenas p da lugar a un au m en to com pensador
de cadenas 8 (HbA2) o 7 (H bF), p o r lo que u n a m utación del gen ¡3 con síntesis
parcial de cadenas 0 ( 0 +-talasemia) suele acom pañarse de un m oderado aum ento
de la fracción H bA 2 (3 ,5-4, 8 % ); y cuando existe u n a ausencia to ta l de síntesis
(P°-talasemia), junto al aum ento de HbA^, suele observarse tam bién un aum ento de
la hemoglobina fetal (HbF).
jS-talasem ia
En nuestro medio, la (3-talasemia m enor o rasgo talasémico es la forma más conocida, ya
que su detección, especialmente de formas asintomáticas, viene facilitada por el empleo
de analizadores automatizados que suministran sistemáticamente el VCM. El diagnóstico
definitivo de 0 -talasemia requiere la separación y cuantificación de las fracciones de la
Hb, en los que debe existir un aumento de la fracción HbA 2 (>3,5% ), y ocasionalmente
también de HbF (>1,5% ).
La expresividad clínica de la 0 -talasemia depende de la intensidad del déficit de
síntesis de cadena 0 , que varía según la naturaleza de la mutación y su presencia en estado
homocigoto o heterocigoto (tabla 17-4). Dentro de los síndromes 0-talasémicos también
podem os encontrar asociaciones entre genes 0 -talasémicos y genes 8(3-talasémicos,
como la Hb Lepore.
La forma más grave de 0 -talasemia se produce cuando la síntesis de cadenas 0 es
mínim a o inexistente. Esta forma de talasemia se conoce con el nom bre de talasemia
mayor y cursa con una anem ia hem olítica crónica grave con requerim iento trans-
fusional de por vida. La forma más leve de 0 -talasemia es el estado heterocigoto, en el
que la anemia es de poca intensidad o prácticamente ausente. Esta forma de talasemia
se conoce como 0 -talasemia m enor o rasgo talasémico, y su expresividad hematológica
más característica es la seudopoliglobulia microcítica. La talasemia intermedia se debe
a genotipos intermedios, homocigotos o compuestos dobles heterocigotos de diferentes
TABLA 17-4. Genotipos asociados a las diferentes categorías clínicas presentes

en los síndromes 0-talasémicos
Fenotipo Genotipo
Talasemia mínima pSiknüyp
Talasemia menor P Silentej^Silente
P+/P 0 p " /p
P ° /p
Talasemia intermedia P " /P * o P * 7 P ~
m
PV8(J" 0 (J"/S3Ü
Talasemia mayor p*/p*

p*/p"
P"/P"
f>[íl'l',"/fl(íl‘T'"
ERRNVPHGLFRVRUJ
mutaciones 0 -talasémicas, y es la que presenta mayor variabilidad clínica dependiendo de

las mutaciones implicadas. En general, estas formas de talasemia no requieren transfusión.
a -ta la se m ia
Aunque tradicionalmente se ha considerado algo menos frecuente que la anterior, por
existir un mayor número/porcentaje de casos asintomáticos, diversos estudios han demos
trado que su incidencia es, al menos en nuestro medio, superior a la de 0 -talasemia hete-
rocigota. En este sentido, hay que señalar que con la introducción de la biología molecular,
muchas de las microcitosis familiares no diagnosticadas electroforéticamente han resul
tado ser formas heterocigotas de a-talasemia (del a -3,7). A diferencia de la 0-talasemia,
en la que predominan las mutaciones puntuales del gen /3 en zonas relacionadas con la
maduración del ARNm, en la a-talasemia predominan las deleciones de uno o dos de
los genes a . Con todo, la aplicación sistemática de los métodos de biología molecular
ha perm itido describir un núm ero cada vez más elevado de variantes moleculares
de a-talasem ia debidas a m utaciones del gen a 2 que, al igual que en la 0 -talasemia,
alteran el proceso madurativo del ARN. El déficit de cadenas a se acom paña de un
exceso de cadenas 0, que al unirse entre sí form an hom otetrám eros 0 4 (H bH ). D u
rante el período fetal (en el que, en lugar de cadenas 0 , existen cadenas 7 ), se forman
homotetrámetros 7 4 que reciben el nombre de hemoglobina Bart. La H bH (y también
la H b Bart en sangre de cordón) puede identificarse m ediante electroforesis en ace
tato de celulosa a pH alcalino por una fracción de migración más rápida que la HbA
(fig. 17-4) o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (fig. 17-5). Al igual que la
0 -talasemia, la a-talasemia presenta diversas formas clínicas según el carácter heterocigo
to u homocigoto del defecto molecular. La forma más grave de a talasemia es la llamada
anasarca fetoplacentaria o hydrops fetalis, en la que existe una ausencia total de cadenas a .
Debido a que en la composición de todas las hemoglobinas interviene la cadena a y las
HbH y Hb Bart carecen de capacidad para transportar oxígeno, esta forma de talasemia es
incompatible con la vida. Las otras formas de a talasemia se caracterizan por anemia de
Hb Lepore
HbH
ü
II HbS/C
A C ------► ^ HbA/F
HbA2 — ►
HbA
FIGU RA 17-4. Electroforesis de
II HbA/D hemoglobinas en acetato de celulosa
con pH 8,6. La fracción de HbH,
Hb Fannin-Lubbock y también la Hb Bart (presente en
sangre de cordón umbilical), pueden
Hb Barcelona identificarse mediante electroforesis
en acetato de celulosa a pH alcalino,
Origen ya que muestran una migración más
rápida que la fracción HbA normal.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Fenotipo FA Fenotipo FAS Fenotipo FS

(normal) {rasgo falciforme) Idrepanocitosis)
Time Area
0,11 122377 0.11 102473 Unknown 1 4.8 0.12 110688

0,19 202951 0.19 101000 FAST 14,2 0.18 331967
0,4 747876 0.37 395122 Unknown 216,8 0.53 307835
0,72 2433335 0.72 1670603 0.77 1406121
0,95 558320 0.95 217866 0.86 15936
area 4064859 1.26 154226 0.95 10168
S 0% area 2641379 1.28 88415
S 5.8% rea 2330131
Fenotipo FAC Fenotipo FS C

Irasgo HbC) Idrepanocitosis)
Unknown 1 2.9 0,11 172643 Unknown 1 6 0,11 172643

FAST 3,6 0,19 122254 FAST 18,2 0,18 525179
Unknown 213.3 0,41 445739 Unknown 2 13,8 0,55 397968
0,72 2212932 I- b4./ 0,73 1579026
9.6 309245 Unknown 3 0,5 0,85 15558
Unknown 3 0.2 1.56 6456 0,95 31164
1.81 165799 1,26 86951
rea 3359475 Unknown 4 0,2 1,55 5300
S 0% 1,79 73850
rea 2330131
S 3%
FIGU RA 17-5. Perfiles cromatográficos obtenidos mediante el programa para cribado neonatal
de la anemia de células falciformes utilizado por el equipo Variant System de Bio-Rad®.
intensidad variable y la presencia de mayor o m enor cantidad de H bH , que puede

ponerse fácilmente de manifiesto mediante la electroforesis convencional o la tinción
vital de los eritrocitos con azul de cresilo brillante; este, al producir la precipitación de
la HbH, dará lugar a una imagen de inclusiones eritrocitarias en forma de mórula muy
características (fig. 17-6). La forma más leve de a-talasemia es totalmente asintomática
y solo puede diagnosticarse mediante análisis del ADN y, ocasionalmente, el estudio in
vitro de la síntesis de cadenas de globina.
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 17-6. Cuerpos de Heinz

espontáneos en un caso de a-talasemia.
Obsérvese su aspecto característico en
forma de mórula (ACB X 1.000).
8(3-talasemia
Se caracteriza por un defecto en la síntesis de las cadenas 8 y (3. Genéticamente se debe
a amplias deleciones en el locus 0 del cromosoma 11. En el estado homocigoto, solo se
sintetiza HbF, y en el heterocigoto se aprecia un valor elevado de HbF (entre 7 y 16%)
con presencia de las restantes fracciones hemoglobínicas normales. Las manifestaciones
clínicas solo se observan en el estado homocigoto y suelen ser parecidas a una 0-talasemia
intermedia de baja intensidad. La 80-talasemia heterocigota es relativamente frecuente
en la zona mediterránea de España, aunque menos que la 0-talasemia. La 80-talasemia
debe distinguirse de la Hb Lepore, debida a un entrecruzamiento (crossing-over) entre
los genes 8 y 0. Las manifestaciones clínicas son muy similares, si bien la 80-talasemia
se caracteriza por un mayor grado de anemia microcítica e hipocromía.
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS GENERAI.F.S

Las técnicas empleadas en el estudio de las hemoglobinas son muy diversas, desde la
simple electroforesis sobre acetato de celulosa hasta el análisis de los genes de globina
mediante técnicas de biología molecular. En la práctica clínica, las técnicas más empleadas
son las que permiten detectar fácilmente la presencia de hemoglobinopatía, dejando para
laboratorios especializados todos aquellos procedimientos encaminados a identificar la
mutación genética. Estas técnicas son esencialmente las siguientes:
1. Electroforesis convencional de hemoglobinas e isoelectrofocalización
2. Cuantificación de la fracción hemoglobínica HbA2
3. Cuantificación de la hemoglobina fetal (HbF)
4. Análisis de la estabilidad molecular de la hemoglobina
5. Detección y cuantificación de la hemoglobina M (HbM)
Electroforesis convencional de hem oglobinas e isoelectrofocalización

Principio
La hemoglobina, p o r ser una molécula de naturaleza proteica, está constituida por
aminoácidos los cuales se unen entre sí mediante enlaces peptídicos formando cadenas
secuenciales (globinas) que poseen radicales ácidos C00“ y básicos N H 3+. La carga eléc
trica de estos grupos depende del pH del medio en que están disueltos. En su punto
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 17 Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias 46 1
isoeléctrico (igual cantidad de C00~ y N H 3+), la proteína es eléctricamente neutra.

A medida que se eleva el pH, los radicales N H 3+van siendo neutralizados por la base del
regulador del medio (tampón o buffer) y predominan los radicales C00-, lo que confiere
a la proteína una carga negativa. Si el pH es ácido, obviamente ocurre lo contrario. En
el prim er caso, la proteína cargada negativamente será atraída por el polo positivo del
campo eléctrico (ánodo), y en el segundo, lo será por el polo negativo (cátodo).
Las diferentes hemoglobinas normales (HbA, HbA, y HbF), al igual que las proteínas
del plasma, cuando se colocan en un medio a un determinado pH, presentan diferente
carga eléctrica, por lo que pueden ser separadas debido a su distinta movilidad al aplicar
un campo eléctrico.
Existen distintas modalidades de electroforesis y cada una de ellas con sus aplica
ciones específicas. En el caso concreto de las hemoglobinas, la electroforesis de zona
es, ampliamente, la más utilizada, habiendo quedado la electroforesis libre (en la que
las proteínas que hay que separar migran disueltas en un sistema am ortiguador a un
determinado pH, en un tubo en U) completamente relegada. En la electroforesis de zona,
el sistema amortiguador impregna u n soporte (papel, gel de agar, almidón, acetato de
celulosa, gel de poliacrilamida, etc.), sobre el que se coloca una muestra de la solución
de hemoglobinas que hay que analizar. Las fracciones separadas se pueden visualizar
después del revelado con colorantes adecuados.
De los distintos soportes disponibles, los más utilizados en el estudio de las hemoglobinas
son el acetato de celulosa, el gel de agar y el gel de poliacrilamida. En la práctica diaria, el
soporte más empleado es el acetato de celulosa a pH 8,6. El acetato de celulosa es el soporte
ideal, tanto por su carácter homogéneo y no absorbente como por su elevada resistencia
mecánica que le confiere una fácil manipulación. Tiene la ventaja de ser completamente
soluble en ácido etanoico concentrado, lo que permite eluir las fracciones separadas y
analizarlas cuantitativamente por colorimetría. Cualitativamente, esta técnica permite la
separación de las hemoglobinas normales de un hemolizado (A, A2, F), así como determi
nados imitantes estructurales (HbS, HbE, HbJ, etc.). Determinados tipos de hemoglobinas,
debido a que poseen una intensidad de carga similar, migran prácticamente al mismo nivel
cuando se separan en soporte de acetato de celulosa a pH 8,6. Un ejemplo de ello lo cons
tituyen las hemoglobinas HbA2, HbC y HbE, y las HbS y HbD. En estos casos, para conseguir
una mejor separación entre dichas fracciones se recomienda el empleo de otro valor de
pH, generalmente pH 6, y casi siempre otro soporte (el más empleado es el gel de agar).
A diferencia del acetato de celulosa, en que el factor fundamental de separación es la intensidad
de la carga eléctrica molecular, en el gel de agar intervienen, además, otros factores, tales
como ciertas interacciones fisicoquímicas entre el agar y las moléculas de hemoglobina que
dependen de la localización superficial de la mutación. Debido a ello, el gel de agar permite
en muchos casos separar dos fracciones de hemoglobinas, que en acetato de celulosa migran
casi al mismo nivel. Así, el agar a pH ácido es especialmente útil para separar la HbS de la
HbD y la HbC de la HbE, y además es muy manejable, ya que forma geles rígidos aun a
concentraciones del 1%. El gel de agar con el que se obtiene una mejor resolución de las
fracciones de hemoglobina es la poliacrilamida, resultado de la polimerización a partir de una
mezcla de acrilamida y N, N ’ metilenbisacrilamida. Es preciso añadir a la misma un agente
activador de la polimerización, que generalmente es el TEMED, junto al persulfato amónico.
La N, N’-metilenbisacrilamida facilita el entrecruzamiento de las cadenas de acrilamida, y
su concentración en el gel condiciona el tamaño del poro obtenido. Los geles obtenidos son
en general transparentes y elásticos, y las distintas fracciones separadas se pueden visualizar
sin necesidad de tinción específica, aprovechando el color que posee la hemoglobina y
precipitándolas sobre el gel con una solución diluida de ácido tricloroacético (TCA).
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Electroforesis a p H alcalino (8,6)

Material
• Espécimen de sangre total. Puede emplearse cualquier anticoagulante aunque se
recomienda la heparina.
• Cubetas de electroforesis con fuente de alimentación.
• Solución tampón: TEB (Tris EDTA borato, pH 8,2-8,6) preparado de la siguiente forma:
• Tris-(hidroximetil-aminometano), 10,2 g.
• EDTA, 0,6 g.
• Ácido bórico, 3,2 g.
• H20 destilada, hasta 1.000 mi.
• Solución colorante: negro amido B-10 (0,5 g en una solución constituida por 50 mi de
metanol, 40 mi de agua destilada y 10 m i de ácido acético glacial). Puede emplearse,
alternativamente, el verde de lisamina o el rojo de Ponceau.
• Solución decolorante (475 mi de agua destilada, 475 mi de metanol y 50 mi de ácido
acético glacial).
• Soporte de acetato de celulosa.
• Solución transparentadora (83 mi de metanol absoluto, 17 mi de ácido acético glacial
y 1 mi de glicerina).
Método
1. Lavar los eritrocitos tres veces en NaCl 0,15 mol/1 y obtener el hemolizado aña
diendo un volumen de eritrocitos lavados a dos volúmenes de agua destilada
mediante congelación descongelación tres veces consecutivas.
2. Centrifugar el hemolizado, obteniendo en el sobrenadante una solución de hemo
globina que se ajusta mediante agua destilada a una concentración de 8-10 g/dl.
3. Sumergir el soporte de acetato de celulosa en tam pón como m ínim o durante
20 min y colocarlo en el puente de la cubeta electroforética, una vez eliminado el
exceso de tampón mediante papel de filtro WHATMAN®.
4. A 2 cm aproximadamente del lado catódico (polo negativo) del soporte se de
positan linealmente (o m ediante un aplicador adecuado) 2 |xl de solución de
hemoglobina y la electroforesis se lleva a cabo durante 15 min a 350 V.
5. Después de la electroforesis, los soportes se colorean colocándolos durante 5 min
en solución colorante y a continuación en la decolorante hasta que desaparezca el
color de fondo. Una vez decolorado, el soporte puede transparentarse sumergién
dolo durante 30 s en metanol absoluto y 3 min en la solución transparentadora.
Finalmente, la placa debe colocarse en una estufa de cultivo a 37 °C hasta que esté
completamente seca.

En la electroforesis de u n hem olizado destacan tres fracciones bien diferenciadas
(v. fig. 17-4). La fracción más rápida y más intensamente coloreada corresponde a la
hemoglobina A (HbA), la segunda fracción corresponde a la HbA^ y la tercera, cerca del
origen, no es hemoglobina y corresponde a la anhidrasa carbónica (AC), muy abundante
en el eritrocito. Si se parte de eritrocitos de cordón umbilical o de sangre de recién nacido,
se observa inmediatamente detrás de la hemoglobina A una fracción correspondiente
a la hemoglobina fetal (HbF).
Las alteraciones cuantitativas que se observan con mayor frecuencia son el aumento
de la fracción HbA2 (0 -talasemia m enor y anemia megaloblástica) y el incremento de la
ERRNVPHGLFRVRUJ
CUADRO 17-1. Causas de aumento de la hemoglobina fetal

• Anemia intensa
• Aplasia medular (congénita o adquirida)
• Anemia perniciosa
• Esferocitosis hereditaria (EH)
• Eliptocitosis congénita
• Hemoglobinuria paroxística nocturna
• Eritropoyesis exagerada o de estrés
• Mielofibrosis
• Neoplasias
• Tumores metastásicos
• Leucemia (particularmente, la mielomonocítica infantil)
• Histiocitosis
• Hemoglobinopatías
• Talasemia mayor y menor
• Hemoglobina Lepore
• Hemoglobinas S, C, D y E en las formas homocigotas
• Persistencia hereditaria de la HbF
HbF (80-talasemia, persistencia hereditaria de la HbF y ciertos trastornos adquiridos de

la eritropoyesis) (cuadro 17-1). La presencia de fracciones hemoglobínicas anómalas es
característica de las hemoglobinopatías estructurales que modifican la carga superficial.
Es rara, por el contrario, en las hemoglobinopatías inestables (excepto en la Hb Kóln)
y en las hemoglobinopatías con aumento de la afinidad por el oxígeno, ya que en estos
casos las hemoglobinas mutadas suelen presentar la misma carga que la HbA y, por tanto,
su misma velocidad de migración electroforética.
Electroforesis a p H ácido (6)

Material
• Espécimen de sangre total. Puede emplearse cualquier anticoagulante, aunque se
• Soporte de gel de agar.
• Bacto agar (Difeo®).
• Cubetas de electroforesis adaptadas al empleo de placas Helena® (Helena Biosciences
Europe) y fuente alimentadora adecuada.
• Soluciones de tam pón citrato sódico.
Solución A madre o de reserva (citrato sódico 0,5 mol/l)

• Citrato sódico (Na3C2H50 7 2H20 ) , 147 g.
• H20 bidestilada, 500 mi.
• Mediante ácido cítrico (300 g/1) ajustar el pH a 6.
• Añadir agua bidestilada, c.s.p. 1.000 mi.
Solución B de trabajo (citrato sódico 0,05 mol/l)

• Diluir a 1/10 la solución A (citrato sódico 0,5 mol/1) y equilibrar a pH 6 con ácido
cítrico (300 g/1).
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Reactivo de tolidina (preparación extemporánea)

• O-tolidina-dihidroclorohidrato, 1 g.
• Ácido acético glacial, 25 mi.
• Agua destilada c.s.p. 100 mi.
Método
1. Lavar los eritrocitos tres veces en NaCl 0,15 mol/1 y obtener el hemolizado aña
diendo un volumen de eritrocitos lavados a dos volúmenes de agua destilada
mediante congelación descongelación tres veces consecutivas. Centrifugar el
hemolizado, obteniendo en el sobrenadante una solución de hemoglobina que
se ajusta mediante agua destilada a una concentración de 1-3 g/dl.
2. Disolver 1 g de Bacto agar (Difeo®) en 100 mi de solución B de trabajo (citrato
sódico 0,05 mol/1), añadir dos gotas de cianuro potásico (KCN) al 5%. Calentar
al baño maría a ebullición hasta que el agar se haya disuelto completamente.
3. Mediante una pipeta cubrir un soporte de plástico con una capa de agar (general
mente son necesarios 5 mi de la solución) y dejar enfriar hasta que el agar tome
cuerpo y se solidifique.
4. Guardar las placas preparadas a 4 °C en cámara húmeda hasta su uso, para lo cual
deben haber transcurrido como mínimo 2 h desde su preparación.
5. Preparar la cámara de electroforesis para la colocación de los soportes con el agar.
6. Depositar la muestra en el centro de la placa.
7. Colocar la placa con el gel de agar sobre el puente de la cubeta electroforética,
asegurando el contacto con el tam pón mediante sendas bandas de papel de filtro.
8. La electroforesis se lleva a cabo durante 45 min a 40 V.
9. Una vez term inada la electroforesis, verter sobre la placa 5 mi de reactivo de
O-tolidina, a los que se han añadido 3 o 4 gotas de ácido acético glacial.
10. Después de 2-3 min, eliminar el exceso de líquido de la placa mediante decantación
y sumergirla en una solución de peróxido de hidrógeno (H 20 2) (1 mi de H20 2 en
200 mi de agua destilada) y dejar en reposo hasta que aparezca el revelado (bandas
o fracciones de color azul).
11. Sumergir la placa en agua destilada durante 30 min.
12. Finalmente, eliminar el exceso de agua, transferir la placa a u n soporte de papel
de filtro y dejarlo secar en la estufa (37 °C) durante 24 h.

La electroforesis en gel de agar (citrato de agar, pH 6) permite diferenciar perfectamente
la HbA de la HbF, lo cual resulta difícil mediante la electroforesis sobre acetato de celulosa
a pH 8,6. Asimismo, resulta útil para diferenciar perfectamente ciertas hemoglobinas
patológicas, como la HbS de la HbD.
Isoelectrofocalización
Principio
La electrofocalización, llamada también técnica del isoelectroenfoque, permite la sepa
ración de moléculas proteicas en función de su punto isoeléctrico. Dado que las hemo
globinas forman parte de este grupo de moléculas, en presencia de un campo eléctrico
y de un gradiente de pH, se desplazan hasta llegar a una línea de valor de pH en la que
su carga eléctrica global es nula (punto isoeléctrico), y en ese m omento la hemoglobina
deja de m igrar al no poder ser atraída por los polos del campo.
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Material
• Espécimen de sangre total. Puede emplearse cualquier anticoagulante, aunque se
• Dos placas de vidrio de 260 X 125 X 1 mm y pinzas de presión.
• Banda de caucho de 1 m m de espesor.
• Jeringa y aguja con calibre de 0,5 mm.
• Matraz Kitasato de 100 mi.
• Solución madre de acrilamida bisacrilamida preparada de la siguiente forma:
• Acrilamida, 9,7 g.
• Bisacrilamida, 0,3 g.
• Agua destilada, 50 mi.
• A nfolinas (Anpholine® [Amersham Pharmacia-Biotech] de gradientes pH 6-8
Y 7 -9 ).
• Temed®.
• Persulfato amónico al 30%.
Método
1. Preparación del gel
(a) Lavar las placas de vidrio escrupulosamente, aclarándolas con agua destilada
y rociando una de ellas con etanol para facilitar la adherencia del gel a una de
ellas. Colocar la banda de caucho entre ambas placas, dejando un pequeño
espacio para introducir la acrilamida. A continuación, se unen fuertemente
mediante las pinzas de presión. Colocar las placas así dispuestas, los reactivos,
el matraz Kitasato, la jeringa y la aguja en nevera a 4 °C.
(b) Verter en el matraz Kitasato:
(i) Solución madre de acrilamida bisacrilamida, 7,5 mi.
(ii) Anpholine® (pH 6-8), 6 mi.
(iii) Anpholine® (pH 7-9), 1,6 mi.
(iv) Agua destilada, 20 mi.
(c) Tapar y eliminar el aire retenido mediante una bomba de vacío durante 5 min
y a continuación añadir 20 |xl de Temed® y 100 (xl de persulfato amónico.
Remover suavemente la mezcla, e inm ediatam ente verter la solución en
la jeringa e inyectarla entre las placas de vidrio, evitando la formación de
burbujas. Dejar que la gelificación tenga lugar durante 1 h a tem peratura
ambiente. Colocar la placa en nevera 24 h antes de usarla.
(d) Se retira con cuidado la junta de caucho y con la punta de una espátula se
procede a la separación de las placas de vidrio. El gel quedará adherido a una
de ellas, que casi siempre será la que ha sido rociada con alcohol. Se tendrá la
precaución de eliminar el exceso de líquido de las tiras secándolas entre dos
hojas de papel de filtro.
2. Migración. Preelectroforesis (antes de colocar las muestras): 15 m in a potencia
constante (0,9 W /m l de gel).
3. Obtención de la muestra: lavar los eritrocitos tres veces en NaCl 0,15 mol/1
y obtener el hemolizado añadiendo un volum en de eritrocitos lavados a dos
volúmenes de agua destilada m ediante congelación-descongelación tres veces
consecutivas. Diluir el hemolizado a 1:5 con agua destilada y centrifugar.
4. Depósito de la muestra: depositar 5 |xl de la muestra obtenida sobre cuadritos
de papel de filtro WATHMAN 3, y colocarlos con una pinza sobre el gel a 1 cm
del cátodo y dejando un espacio de 2 m m entre ellas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Hb Lepore
m
HbH
m
~n
mm
HbS/C
HbA/F
HbA
HbA/D
tt Hb Fannin-Lubbock

SI Hb Barcelona característica de un fraccionamiento
de hemoglobinas mediante la
▼ Origen técnica del isoelectroenfoque (IEE) o
electrofocalización.
5. Migración electroforética: se realiza durante 1-1,5 h al mismo voltaje de la pre-

electroforesis.
6. Secado: finalizada la migración, la placa se sumerge en solución de ácido tri-
cloroacético al 12% durante 10 min; luego se transfiere el gel a un papel de filtro
y se seca a 60 °C durante 2 h, o a 37 °C durante 24 h.

La imagen obtenida tras la electroforesis está constituida por los diferentes componentes
hemoglobínicos del hemolizado en forma de bandas focalizadas en diferentes líneas
según sus puntos isoeléctricos (fig. 17-7).
Cuantificación de la fracción HbA2de la hem oglobina

Principio
La apreciación subjetiva de la fracción HbA2 mediante la inspección visual de la elec
troforesis sobre acetato de celulosa permite, en la mayoría de los casos, dem ostrar la
presencia de un aumento del mismo. Esta apreciación, no obstante, es puramente cua
litativa y en ocasiones puede ser incluso errónea, especialmente cuando la electroforesis
se ha realizado a partir de una solución excesivamente concentrada de hemoglobina. El
diagnóstico de 0 -talasemia exige, por tanto, la cuantificación de esta fracción normal
de hemoglobina. La cuantificación de la HbA2 se realiza tradicionalm ente mediante
dos técnicas manuales: a) elución de la fracción electroforética, y b) microcolumna de
DEAE-celulosa.
La elución de la fracción electroforética consiste en separar físicamente la banda co
rrespondiente a la HbA2. Para ello, se parte de la tira electroforética de acetato de celulosa
sin transparentar y la elución se consigue sumergiendo la fracción separada en amoníaco
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diluido. Una vez eluida la tira, se cuantifica analizando mediante un fotocolorímetro la

absorbancia de la solución obtenida con relación a la del total de hemoglobina.
La dosificación de la HbA2 por microcolumna de DEAE celulosa se basa en la ad
sorción relativa de la misma en un lecho o soporte de DEAE celulosa, que es una resina
intercambiadora de iones. Debido a que la adsorción de la HbA2 en la resina difiere de
la de la HbA, puede eluirse y obtenerse separadamente de esta, haciendo pasar a través
de la columna un tampón de pH adecuado. La DEAE celulosa puede utilizarse no solo
para separar hemoglobinas normales, sino también diferentes hemoglobinas patológicas.
A ctualmente, existe un m étodo autom atizado para realizar la cuantificación de
las fracciones hemoglobínicas HbF y HbA2 que presenta mayor reproducibilidad y
sensibilidad que los métodos manuales.
Elución de la fracción electroforética

Se describe aquí un método rápido para la cuantificación de la fracción HbA2 de la
hemoglobina que presenta muy pocas variaciones respecto al recomendado por el ICSH.
Material
El mismo que el empleado en la electroforesis de hemoglobinas sobre soporte de acetato
de celulosa a pH 8,6.
Método
1. Realizar los pasos 1,2 y 3 del apartado «Método» de la electroforesis de hem o
globinas sobre soporte de acetato de celulosa a pH 8,6.
2. Sin teñir la tira electroforética, y mediante unas tijeras, se cortan las fracciones
HbA y HbA2y se introducen en 15 y 1,5 mi, respectivamente, de NH4OH diluido
(2:100), durante 30 min. A continuación se lee la absorbancia mediante un es-
pectrofotómetro a 415 nm de las soluciones obtenidas.
3. La proporción de HbA2 se calcula del siguiente modo:
HbA2(%) = ------ AHbA, X100------

10 X (AHbA - A H bA ,)
(A = absorbancia o densidad óptica)

Como blanco para esta lectura se emplea un fragmento de tira de acetato de celulosa
sin Hb y eluida de la misma forma que las fracciones que hay que analizar.
Interpretación de los resultados y valores de referencia

Mediante este método, en un sujeto adulto normal, el porcentaje de HbA2 oscila entre el
2,5 y 3,5%. Esta cifra aumenta sensiblemente en la 0-talasemia menor, en la que puede
llegar a alcanzar valores comprendidos entre el 3,8 y el 7%. Valores situados entre 3,5 y
3,8% deben ser considerados con especial atención, ya que podrían tratarse de rasgos
talasémicos con baja expresividad de HbA2o, lo más probable, podrían reflejar la coexis
tencia de una ferropenia. En tales casos es m uy conveniente repetir la determinación a
partir de un nuevo espécimen y descartar las causas citadas. La 8 0-talasemia y la hemo
globina Lepore cursan con valores normales de HbA2.
Aunque el interés diagnóstico de la dosificación de HbA2se centra casi exclusivamen
te en la 0-talasemia menor, existen otras situaciones patológicas en las que esta fracción
hemoglobínica puede observarse alterada. Así, puede hallarse aum entada en ciertas
ERRNVPHGLFRVRUJ
hemoglobinopatías inestables por m utación de la cadena 0, en la anemia megaloblás

tica y en la eritroleucemia; y disminuida en la ferropenia, la anemia sideroblástica, el
rasgo a-talasémico asociado a HbS y ciertas hemoglobinopatías por mutación de las
cadenas a y 8 de globina.
Elución en microcolumna de DEAE-celulosa

Resultados similares al m étodo de la elución de la fracción electroforética pueden
obtenerse m ediante la técnica de la elución en microcolumna de DEAE-celulosa. El
m étodo descrito aquí corresponde al de un kit comercial basado en el de Efremov,
también recomendado por el ICSH. No obstante, en la actualidad esta técnica solo se
utiliza excepcionalmente, porque en los laboratorios donde puede realizarse ha sido
sustituida por la HPLC (v. más adelante).
M aterial
• Sangre total heparinizada.
• Microcolumna de DEAE-celulosa.
M étodo
A 250 |xl de reactivo hemolizante, añadir 50 |xl de sangre total. Dejar en reposo 10 min.
Extracción crom atográfica

1. Destapar la columna en la parte superior, mezclar la resina de la columna mediante
pipeta de Pasteur, retirar el tapón inferior y dejar eluir el exceso de tampón.
2. Añadir 100 |jl1del hemolizado, el cual queda adsorbido en la parte superior de la resina.
3. Una vez que la columna está así dispuesta, colocar sobre un tubo colector con señal
de enrase y añadir por su extremo superior 2,5 ml del tampón (HbA2 Developer),
recogiendo a continuación todo el eluido que contiene la fracción hemoglobínica A,.
4. En otro tubo colector con señal de enrase a 15 mi se colocan 100 (xl del hemolizado
y se añade agua destilada hasta dicho enrase (agitar suavemente).
5. El tubo colector que contiene la fracción hemoglobínica A2 recogida se completa
hasta el enrase de 3 mi con agua destilada (agitar suavemente).
6. Finalmente se realiza la lectura espectrofotométrica de ambas muestras a 415 nm
contra un blanco de agua destilada y se aplica el siguiente cálculo:
_ , /n/x A415 x H b A 2 xlOO

HbA 2(%) = ... ------ - 2 - ------------
A de hemolizado total x 5
Interpretación de los resultados y valores de referencia

Los individuos normales presentan unos valores de HbA, que oscilan entre 2,8 y 3,6%.
La interpretación de la técnica es superponible a lo dicho en el método anterior.
Cuantificación de la hem oglobina fetal (HbF)

Existen dos métodos tradicionales para determinar la HbF: a) método cuantitativo de la
desnaturalización alcalina, y b) método cualitativo de la resistencia a la elución ácida sobre
porta. Actualmente, existe un método automatizado para realizar la cuantificación de las
fracciones hemoglobínicas HbF y HbA2que presenta mayor reproducibilidad y sensibilidad
que los métodos manuales (v. «Cromatografía líquida de alta resolución»).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Método de la desnaturalización alcalina según Betke (ICSH)

Principio
La HbF es más resistente a la desnaturalización alcalina que las otras hemoglobinas,
apareciendo en el filtrado después de neutralizar el pH con una solución saturada de
sulfato amónico. Para el diagnóstico clínico, este método ha sido totalmente desplazado
por la HPLC (v. «Cromatografía líquida de alta resolución»), pero se describe aquí porque
aún puede ser utilizado cuando no se dispone de la tecnología actual.
Reactivos
1. Solución de Drabkin preparada del siguiente modo:
(a) Ferricianuro de potasio Fe (CN)6 K3, 200 mg.
(b) Cianuro de potasio (KCN), 200 mg.
(c) Agua destilada, c.s.p. 1.000 mi.
2. Sulfato amónico ([N H J2 S 0 4) a saturación.
3. Solución de NaOH, 1,2 N.
4. Hemolizado con una concentración de hemoglobina aproximada de 8 g/dl.
Método
La técnica debe realizarse siempre a temperatura ambiente (18-20 °C):
1. A 0,6 m i de hemolizado se añaden 10 mi de solución de Drabkin.
2. De la solución de cianometahemoglobina así obtenida (paso 1) se toman 2,8 mi
y se colocan en un tubo de hemólisis, al que se añaden a continuación 0,2 mi de
NaOH 1,2 N (tubo 1).
3. Agitar durante 2 m in y añadir 2 mi de sulfato amónico saturado. Agitar fuerte
mente, dejar en reposo durante 5 min y filtrar.
4. Leer la absorbancia (A) del filtrado a 540 nm.
5. Para obtener la densidad óptica de la hemoglobina total se diluyen 2,8 mi de
la solución de cianometahemoglobina con agua destilada hasta completar un
volumen final de 25 mi (tubo II).
6. El blanco se obtiene mezclando 2,8 mi de D rabkin con 0,2 mi de NaOH y 2 mi
de (NH4)2S 0 4.
7. El cálculo del resultado se realiza aplicando la fórmula siguiente:
H b P (% )= D 0deltub0lX 100
DO del tubo 11x5
Método de la resistencia a la elución ácida según Kleihauer-Betke

Principio
Se trata de un método citoquímico empleado para cuantificar la intensidad de la hemo
rragia fetomaterna mediante observación microscópica de la HbF presente en los eri
trocitos. La reacción se basa en la mayor resistencia de la HbF a la elución cuando los
eritrocitos puestos sobre una extensión se someten a valores de pH ácidos, lo cual se
pone de manifiesto por su intensa coloración roja.
Material
• Sangre total mantenida en EDTA.
• Tampón cítrico fosfato, pH 3,7.
• Ácido cítrico, 0,715 mol/1.
• Difosfato sódico, 0,57 mol/1.
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• Solución de hematoxilina ácida (1 g/1), pH 3,3.

• Solución de eosina al 0,1 %.
Método
1. Realizar una extensión muy fina y dejar a temperatura ambiente hasta que esté
completamente seca.
2. Preparar un baño maría a 37 °C y colocar en el mismo un vaso de Coplin con
una dilución 1/10 del tam pón cítrico-fosfato en agua destilada. Dejar estabilizar
durante 30 min.
3. Sumergir la preparación en metanol al 80% durante 5 m in y lavar con abundante
agua corriente.
4. Sumergir la preparación en la solución tam pón durante 5 min, agitando después
del prim er y el tercer minuto.
5. Lavar con agua destilada y dejar secar a temperatura ambiente durante 1 h.
6. Teñir la preparación sumergiéndola 3 min en la solución de hematoxilina.
(a) Transcurrido este tiempo, se extrae y se lava con agua destilada.
7. Contrastar la preparación con eosina durante 4 m in, lavar con agua destilada y
dejar secar, m om ento en el que ya está lista para su observación.
En condiciones normales, prácticamente no existen eritrocitos que contengan HbF (< 1 %),
por lo que la mayoría carecen de hemoglobina teñida (ácido sensible) en su interior; por
el contrario, puede hallarse aumentado su núm ero en el caso de una mujer embarazada
con eritrocitos fetales en su torrente circulatorio (hemorragia transplacentaria). Asimismo,
son mayoría cuando se observa una muestra de sangre de cordón umbilical e incluso de
un recién nacido. Los eritrocitos que contienen HbF se caracterizan por su intenso color
rojo, que difiere notablemente del de los eritrocitos adultos (fig. 17-8).
Análisis de la estabilidad m olecular de la hem oglobina

Introducción
Existe un grupo de hemoglobinas patológicas que se caracterizan por poseer una molécula
inestable capaz de desnaturalizarse en presencia de ciertas condiciones físicas (temperatura o
agentes químicos), que son perfectamente toleradas por la HbA. Las hemoglobinas inestables
generalmente son el resultado de una mutación de carácter neutro y, por tanto, no se acompa
ñan de variación en la carga de la molécula de hemoglobina. Al migrar electroforéticamente,
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igual que la HbA, no pueden ser detectadas mediante este procedimiento. En este ti
po de hemoglobinopatías la m utación suele estar localizada en la cavidad del grupo
hemo, por lo que su desnaturalización va precedida de una desheminización o pérdida
espontánea del grupo hemo. La desnaturalización in vivo de la hemoglobina condiciona
la aparición de precipitados de hemoglobina en el interior del eritrocito o cuerpos de
inclusión (cuerpos Heinz), que son la causa de la hemólisis. En la práctica se utilizan dos
procedimientos para poner a prueba la estabilidad molecular de la hemoglobina:
1. Método de la estabilidad frente al calor (estabilidad térmica).
2. Método de la estabilidad frente al isopropanol (estabilidad química).
Tanto el estudio de la estabilidad térmica como la influencia del isopropanol son
igualmente sensibles en la detección de hemoglobinas inestables. No obstante, pueden
observarse en ocasiones falsas positividades, especialmente cuando existe metahemo
globina o un aumento de la HbF.
Prueba de estabilidad de la hemoglobina al calor

Principio
Esta prueba debe ser practicada siempre a p artir de sangre fresca y con un control
simultáneo normal. Consiste en incubar una solución de hemoglobina durante 2 h a
50 °C y observar la eventual aparición de precipitado evidente.
Material
• Sangre total heparinizada (del paciente y un control norm al).
• Tampón Tris-HCI 0,15 mol/1, pH 7,4.
• Tris, 5,05 g.
• Agua destilada c.s.p. 1.000 mi.
• Ajustar el pH con H C 11 N hasta conseguir un valor de 7,4.
Método
1. Lavar los eritrocitos tres veces con solución salina fisiológica.
2. Realizar el hemolizado mezclando 100 |xl de eritrocitos lavados y 200 (jlI de agua
destilada.
3. Eliminar los estromas mediante centrífuga Eppendorf®.
4. En dos tubos, uno para el paciente y otro para el control, colocar 1,8 mi de solución
tam pón Tris HC1, pH 7,4, y añadir 200 (xl de los hemolizados correspondientes.
5. Incubar 2 h a 50 °C y observar la eventual aparición de un precipitado.

Cada hora debe observarse el contenido del tubo para ver la posible aparición del
precipitado, el cual debe caracterizarse por una floculación blanquecina o la desaparición
de la transparencia. La prueba se considera positiva solamente cuando dicho precipitado
aparece en el hemolizado problema y no en el tubo control.
Prueba de estabilidad de la hemoglobina al isopropanol

Principio
El isopropanol, debido a su carácter intensam ente polar, produce un efecto deses
tabilizador sobre la molécula de hemoglobina. Este efecto, a la concentración en que
se utiliza en la prueba, es bien resistido por una hemoglobina normal, mientras que en
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una hemoglobinopatía inestable produce una precipitación de características similares

a las descritas en la prueba térmica.
Reactivos
1. Sangre heparinizada (paciente y control).
2. Solución de isopropanol al 17% en Tris-HCl 0,1 mol/1, pH 7,4.
Método
1. Lavar los eritrocitos del paciente y los eritrocitos control.
2. Preparar el hemolizado a partir de los eritrocitos lavados, de la misma forma que
en el método de la desnaturalización por el calor.
3. Si la concentración de hem oglobina del hemolizado es m uy alta, ajustarla a
10 g/dl.
4. En dos tubos situados en un baño maría a 37 °C, introducir, respectivamente,
2 mi de tam pón isopropanol y dejarlo equilibrar durante 5 min. A uno de los
tubos se le añaden 0,2 mi de hemolizado problema y al otro, 0,2 mi de hemolizado
control.
5. Los tubos, una vez tapados, se agitan suavemente por inversión y se colocan de
nuevo en el baño maría a 37 °C. Observar si existe precipitado a los 5 m in y, si no,
esperar otros 15 y ver si existe un floculado blanquecino.

Si no existe hem oglobina inestable, la solución del hemolizado permanecerá trans
parente durante más de 30-40 min. Por el contrario, si existe hemoglobina inestable,
aparecerá un precipitado o flóculo blanco dentro de los primeros 10 min tras iniciarse
la incubación o bien desaparecerá la transparencia (fig. 17-9). Como se ha comentado
anteriormente, debe tenerse siempre presente que un aumento de HbF o la presencia
de metahemoglobina pueden dar lugar a falsos positivos.
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FIGURA 17-10. Cuerpos de

Heinz espontáneos en un caso
de hemoglobinopatía inestable.
Obsérvese su aspecto único
y de localización excéntrica
(ACB X 1.000).
Prueba de la formación de cuerpos de Heinz espontáneos

Ciertas hemoglobinopatías inestables en presencia de azul de cresilo brillante (ACB)
precipitan y originan cuerpos de inclusión intraeritrocitarios, o cuerpos de Heinz. Estos
pueden adoptar dos morfologías bien distintas:
1. La presencia de un único cuerpo de inclusión adherido a la membrana eritrocitaria
(cuerpo de Heinz), que aparece en la mayoría de las hemoglobinas inestables des
pués de la esplenectomía (Hb Kóln, Hb Zurich, H b Hammersmith) (fig. 17-10).
2. La presencia de inclusiones múltiples redondas y pequeñas, azules verdosas y
distribuidas por la totalidad del citoplasma eritrocitario, que aparecen de forma
casi exclusiva en la a-talasemia (HbH) (v. fig. 17-6).
Método
La técnica empleada para poner de manifiesto estos cuerpos de inclusión es la misma
que se emplea en la tinción de reticulocitos. A un volumen de sangre total se añade un
volumen de una solución de ACB en solución salina citratada (10 g/1). Después de una
incubación de 5 m in a 37 °C se practica una extensión de la suspensión de eritrocitos y
se deja secar. No hace falta contratinción para observar esta preparación al microscopio
óptico.
Detección y cuantificación de la hem oglobina M (HbM)

Introducción
Las hem oglobinas M son resultado de mutaciones de la cadena de globina que es
tabilizan el hierro (Fe) de dos grupos hemo en su forma férrica u oxidada. Esto hace
que de cada molécula de hem oglobina M solo la m itad pueda tran sp o rtar oxígeno
(metahemoglobina), hecho por el cual existe un déficit de oxigenación de los tejidos
periféricos con cianosis o coloración violácea de piel y mucosas. La hemoglobina M se
hereda con carácter autosómico dominante y la única manifestación clínica es la cianosis
permanente. Esta cianosis, a diferencia de la secundaria a un déficit de metahemoglobina
reductasa (diaforasa), no desaparece con la administración de ácido ascórbico (vitamina C)
o azul de metileno.
Se conocen varios tipos de hemoglobinas M que pueden ser diferenciados de la
metahemoglobina normal (HiA) mediante métodos espectroscópicos (debido al espectro
de absorción visible característico de las hemoglobinas M; fig. 17-11) y electroforéticos.
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FIGURA 17-11. Espectro de

absorción de una hemoglobinopatía M
(línea discontinua) frente a patrón
normal de metahemoglobina (línea
continua) (absorbancia 450-650 |xm).
Fraccionamiento electroforético de las hemoglobinas M

Debido a que en la mayoría de casos la mutación de la cadena globínica neutraliza la carga
positiva creada por la oxidación del hierro, las hemoglobinas M presentan una movilidad
electroforética idéntica a la de la HbA. Por ello, para poder evidenciar su presencia hay
que transform ar previamente la HbA en metahemoglobina, que presenta una mayor
carga positiva. Esto se consigue añadiendo ferricianuro potásico (15 mg/1) al hemolizado
(normal y patológico) y se procede a realizar una electroforesis convencional (pH 8,9)
sobre acetato de celulosa. La migración simultánea del hemolizado normal (con toda la
HbA transformada en HiA) y el hemolizado patológico, permitirá apreciar, en caso de
hemoglobina M, una fracción de migración más lenta que la HbA.
Escrutinio de la anem ia falciform e (HbS)

Prueba de la reducción de HbS
A diferencia de la HbA, en presencia de un agente reductor, la HbS gelifica y se vuelve
insoluble. Por ello, esta prueba es prácticamente específica de esta hemoglobinopatía.
Reactivos
1. Sulfato amónico ([NH 4]2S 0 4).
2. Fosfato dipotásico (K2H P 0 4 3H20 ).
3. Saponina.
4. Ditionito sódico (Na2S20 4).
5. Hidróxido potásico (KOH).
Preparación del tampón pH 7,5

• En un vaso de precipitados de 100 mi se disuelven 30 g de sulfato am ónico en
80-90 m i de agua destilada.
• Se añaden 1,2 g de fosfato dipotásico, calentando m oderadam ente para disolver
a continuación 1 g de saponina. Debe agitarse lentam ente la mezcla, ya que la
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saponina en solución form a espum a con rapidez. La agitación debe m antenerse

hasta que la disolución se complete.
• Finalmente, el volumen se ajusta a 100 mi mediante un m atraz aforado, y el pH a
7,5 con solución de KOH 1 N. El tam pón así preparado es estable en frasco oscuro
durante meses.
M étodo
1. En dos tubos de 5 mi (paciente y control) se colocan:
(a) Tampón a pH 7,5,2 mi.
(b) Ditionito sódico, 20 mg.
2. La mezcla se agita y se añaden 0,1 mi de sangre total o 0,5 |xl de eritrocitos lavados.
La solución se ajusta dejándola en reposo durante 5-10 min y, finalmente, se cen
trifuga durante 2 m in a 3.000 r.p.m.

Se pueden presentar tres situaciones:
1. Presencia de un sobrenadante rojo con precipitado blanquecino en el fondo:
solubilidad normal.
2. Presencia de un sobrenadante rosado con precipitado hemoglobínico: solu
bilidad parcialm ente dism inuida que indica un p ortador heterocigoto HbA/
HbS.
3. Presencia de un sobrenadante pálido con precipitado rojo: insolubilidad total,
indicativa de un paciente con hemoglobinopatía S homocigoto (fig. 17-12).
II ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGURA 17-12. Aspecto de la prueba de la
solubilidad de la hemoglobina en un paciente con
drepanocitosis (HbSS). En el tubo de la izquierda
existe insolubilidad total de la hemoglobina. El
tubo de la derecha corresponde a un control
normal.
Prueba de la falciformación (Prueba deltano)

Principio
Consiste en provocar la falciformación de los eritrocitos a partir de sangre total, cuando
esta es expuesta a un medio pobre en oxígeno. Como es sabido, la HbS, cuando se halla
en estado desoxigenado, presenta unas características de solubilidad distintas a las de
la HbA, consistentes en una im portante pérdida de la misma y la tendencia a formar
polímeros de desoxi-HbS, que deforman intensamente el eritrocito (falciformación).
Como consecuencia de ello, los eritrocitos adquieren una forma alargada e incurvada
que recuerda a una hoz (sickle-cell). Este fenómeno se observa en los portadores del
rasgo falciforme (Hb A/S) y en los afectos de drepanocitosis o enfermedad de células
falciformes (Hb S/S, Hb S/C y H b S/0-tal).
Método
Después de practicar una dilución de sangre en NaCl 0,15 mol/1 al 50%, se coloca
una gota sobre un portaobjetos y se tapa con un cubreobjetos, cuyos bordes son pos
teriormente sellados con parafina líquida. Esta preparación se observa al microscopio
antes y después de incubarla 1 h (como mínimo) a 37 °C.

En caso de HbS hom ocigota (HbSS), la falciformación es inmediata (sin necesidad
de incubación) y consiste en la aparición de num erosos drepanocitos o eritrocitos
falciformes (fig. 17-13). En caso de HbS heterocigota (HbAS), solo aparecerán algunos
drepanocitos después de la incubación.
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ESPECIAI.F.S

Los m étodos diagnósticos de las hem oglobinopatías d enom inados «especiales»
son tod o s aquellos que, fu era de los clásicam ente em pleados y d escritos en el
apartado anterior, profundizan en los aspectos proteicos, moleculares y genéticos
de la hem oglobina para conseguir un diagnóstico preciso de la m utación o m uta
ciones im plicadas en cada caso. Esto resulta actualm ente im prescindible porque
el im pacto inm igratorio observado en u n elevado núm ero de países de la U nión
FIGU RA 17-13. Prueba de la

falciformación en un portador de
anemia drepanocítica. Obsérvese la
presencia de numerosos drepanocitos
(hematíes falciformes) inducidos por
la desoxigenación.
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CUADRO 17-2. Métodos diagnósticos de las hemoglobinopatías
1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

2. Electroforesis capilar (EC-Capillarys)
3. Electroforesis ácida/alcalina
4. Síntesis de cadenas de globina
5. Técnicas de biología molecular
(a) A R M S-PCR (escrutinio de m utaciones HbS, H bC , H b D y HbE)
(b) Secuenciación del gen ^-globina (hem oglobinopatías estructurales y (3-tal)
(c) Secuenciación del gen a-globina (hem oglobinopatías estructurales y a -ta l)
(d) GA P-PCR (escrutinio de m utaciones a-talasem ia)
(e) STR IP ASSAY K IT (escrutinio de m utaciones fJ-talasemia)
(f) GA P-PCR y secuenciación (escrutinio y análisis genético de la hem oglobina
Lepore)
(g) GA P-PCR (escrutinio de la persistencia hereditaria de la hem oglobina fetal
[PH H F])
(h) GA P-PCR (escrutinio de la 8(3-talasemia)
Europea (especialmente p or poblaciones africanas, asiáticas y de América central

o del sur) ha condicionado un cam bio en el com portam iento clínico de m uchas
hem oglobinopatías, especialmente de sus formas más graves (síndrom e falciforme
y talasem ia m ayor) que ha obligado al la im plem entación del m ayor núm ero de
procedim ientos para po d er identificar las causas m oleculares de la variabilidad
clínica. Estas técnicas diagnósticas especiales (cuadro 17-2) son las que se utilizan
para confirm ar las alteraciones detectadas mediante las pruebas generales aplicadas
al diagnóstico clínico, o las que se utilizan en el escrutinio neonatal de hem oglobi
nopatías (prueba del talón).
Crom atografía líquida de alta resolución (HPLC)

Introducción
Los métodos convencionales para el estudio de hemoglobinas basados en procedimientos
electroforéticos y cromatográficos han sido y continúan siendo de utilidad para el es
crutinio de hemoglobinopatías y talasemias en áreas geográficas donde estas causas de
anemia presentan cierto grado de prevalencia. La región m editerránea es una de las
áreas donde este tipo de estudios epidemiológicos revisten interés sanitario y social. Por
ello, la posibilidad de automatizar la determinación de las hemoglobinas HbA2 y HbF,
así como la posibilidad del escrutinio, también automatizado, de hemoglobinopatías es
prácticamente una necesidad en todos aquellos centros que realizan estudios sistemáticos
de estas enfermedades congénitas.
A principios de los años ochenta se introdujo la cromatografía líquida de alta resolu
ción (HPLC) para la separación y cuantificación automatizada de las fracciones hemo-
globínicas normales (HbA, HbA2y HbF), así como de posibles hemoglobinopatías (HbS,
HbC, HbD, etc.) y de derivados glicados de la hemoglobina (HbAt, principalmente), de
utilidad clínica en el seguimiento terapéutico de la diabetes mellitus.
Actualmente, existe un equipo especialmente diseñado para el análisis de muestras
de sangre de adulto y de recién nacido impregnada en papel y que permite la detección de
talasemias (HbA2 y HbF) y hemoglobinopatías estructurales de manera estandarizada,
rápida y precisa (Variant Hemoglobin Testing System® de Bio-Rad).
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La base del procedimiento empleado es una columna de intercambio catiónico con

gradientes preprogram ados que van increm entando la fuerza iónica del tam pón de
elución, siendo las hemoglobinas más fuertem ente unidas a la colum na las últimas
en eluir. La elución de la colum na es m onitorizada m ediante un espectofotóm etro
que detecta cambios en la absorbancia a dos longitudes de onda 415/690 nm. La re
presentación de estos cambios en relación al tiem po genera un crom atogram a para
cada una de las m uestras problem a. Cada variante de hem oglobina tiene asociado
un tiem po de retención; este tiem po de retención se m ide desde el m om ento en
que la m uestra es inyectada hasta el máximo punto de cada pico representado en el
cromatograma.
Dispone de dos programas básicos para la detección de:
1. Talasemia en adultos: 0-thalassemia Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA).
2. Cribado neonatal de la enfermedad de células falciformes a partir de sangre seca:
Sickle Cell Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA).
Ambos program as perm iten la separación e identificación de las hemoglobinas
norm ales (HbA, HbF y H bA 2), así como las hem oglobinopatías estructurales más
comunes (HbS, HbC, HbD y HbE). El programa para la identificación de talasemias,
además, permite la cuantificación de HbA2y HbF mediante una cromatografía de 6 min.
Aunque con la fracción HbA2 existe coelución de la hemoglobinopatía E (HbE), ello
carece de importancia en la práctica, ya que valores de HbA2de alrededor del 30% deben
hacer sospechar la existencia de HbE o alguna otra hemoglobina anormal y proceder a
la correspondiente investigación.
El program a de cribado de la anemia falciforme, m ediante una cromatografía de
3 m in de duración, tiene como objetivo la identificación y cuantificación relativa de la
HbS y permite la identificación de la enfermedad de células falciformes, tanto en estado
homocigoto de la HbS como en estado doble compuesto heterocigoto con otras hem o
globinopatías estructurales y talasémicas. Además, también permite la identificación
del carácter portador de la HbS y otras hemoglobinopatías estructurales presentes en
la población.
Procedimiento para la detección de talasemia en adultos

Muestra
Sangre total con EDTA como anticoagulante.
Las muestras son estables durante 7 días si se mantienen a 2-8 °C.
Material
• Columnas cromatográficas.
• Viales de 1,5 mi.
• Punta Azul Daslab®.
Reactivos
Programa 0-thalassemia Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA):
1. Tampón de elución 1.
3. Solución de lavado.
4. Cebador sangre total.
5. Reactivo de hemólisis.
6. Calibrador HbA2/F y diluyente.
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Equipos
• Pipeta automática regulable de 0-20 |xl MicroOne®.
• Pipeta automática regulable de 100-1.000 |xl MicroOne®.
• Bio-Rad VARIANT Hemoglobin Testing System.
Preparación de reactivos
Cebador de sangre
Preparar el cebador añadiendo 1 mi de H20 destilada, agitar ligeramente y dejar reposar
durante 10 min a temperatura ambiente.
El cebador, una vez reconstituido, es estable durante 24 h a una temperatura de 2-8 °C.
Calibrador HbAJF
Preparar el calibrador añadiendo 10 mi de diluyente, agitar ligeramente y dejar reposar
durante 10 m in a temperatura ambiente.
El calibrador, una vez reconstituido, es estable durante 7 días a una temperatura de 2-8 °C.
1. Pipetear 5 |xl de sangre total en un vial de 1,5 mi.
2. Añadir 1 mi de reactivo de lisis en cada vial.
3. Homogeneizar por inversión.
Procesado de las muestras

1. Colocar las muestras en la bandeja del Bio-Rad. VARIANT Hemoglobin Testing
System.
2. El cebador de sangre total debe usarse al principio de cada montaje para acondi
cionar la columna para el análisis.
3. El calibrador deberá procesarse de m anera paralela a cada grupo de muestras
problema.
4. Programar el equipo con la lista de trabajo.

El programa para la detección de 0-talasemia permite separar y determinar los porcen
tajes de las áreas para la hemoglobina A2 y la hemoglobina F. Este programa también
permite la identificación de las variantes de la hemoglobina más comunes (hemoglobinas
S, D, C y E; v. fig. 17-5). El área total de cada análisis debería estar entre 1.000.000 y
3.000.000 (xvolt por segundo. La interpretación de los resultados según los valores de
HbA 2 y HbF se representa en la tabla 17-5.
TABLA 17-5. Interpretación de los resultados según los valores de HbA2/F
Genotipo Nivel HbA2 Nivel HbF

(3-talasemia heterocigota 3,8-9% 1-5%
(3-talasemia homocigota Normal o elevada 80-100%
8(3°-talasemia heterocigota 2,3-3,2% 5-15%
8 (3o-talasemia homocigota 0,65-0,92% 95-100%
HPFH heterocigota <1,5% 10-20%
HPFH homocigota Ausente 100%
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Procedimiento para la detección de hemoglobinopatías en recién nacidos

Cribado de la enfermedad de células falciformes e identificación y semicuantificación
de las hemoglobinas A, F, S, C, D y E en la población neonatal.
Muestra
Sangre total recogida sobre papel cromatográfico SS903.
En el caso de no realizarse la determinación inmediatamente deberá conservarse la
muestra a 4 °C.
Material
• Columnas cromatográficas.
• Viales de 1,5 mi.
• Punta Azul Daslab®.
Reactivos
Programa Sickle Cell Short Program (Bio-Rad, Hercules. CA):
3. Solución de lavado.
4. Cebador sangre total.
5. Calibrador FAES de tiempo de retención.
6. Calibrador FADC de tiempo de retención.
Equipos
1. Pipeta automática regulable de 100-1.000 |xl MicroOne®.
2. Bio-Rad VARIANT Hemoglobin Testing System.
Preparación de reactivos
Cebador de sangre total
Preparar el cebador añadiendo 1 mi de H20 destilada, agitar ligeramente y dejar reposar
durante 10 min a temperatura ambiente.
El cebador, una vez reconstituido, es estable durante 21 días a una temperatura de 2-8 °C.
Controles de tiempo de retención

Se dispone de dos juegos de controles: control 1 (FAES) y control 2 (FADC). Son usados
para la identificación presuntiva de los tiempos de retención individuales de las mues
tras problema.
Preparar el calibrador 1 y el calibrador 2 añadiendo 10 mi de H20 destilada, agitar
ligeramente y dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente.
Los controles, una vez reconstituidos, son estables durante 21 días a una temperatura
de 2-8 °C.
1. En un vial colocar un círculo taladrado con el puncher y añadir 600 |xl de H20
destilada.
2. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Retirar el círculo de sangre.
4. Homogeneizar por inversión.
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Procesado de las muestras

1. Colocar las muestras en la bandeja del Bio-Rad. VARIANT Hemoglobin Testing
System.
2. El cebador de sangre total debe usarse al principio de cada montaje para acondi
cionar la columna para el análisis.
3. Los controles 1 (FAES) y 2 (FADC) deberán procesarse de manera paralela a cada
grupo de muestras problema.
4. Programar el equipo con la lista de trabajo.

Los tiempos de retención de los controles 1 y 2 se ajustarán cada vez que se realice un
cambio de columna. Para ello se procesará por duplicado cada uno de los controles y se
calculará la media de cada uno de los tiempos de retención específicos de cada variante.
El orden de aparición de las diferentes variantes de la hemoglobina es: HbF,, HbF (fetal),
HbA, HbA2/E, HbD, HbS y HbC (v. fig. 17-5). El área total de cada análisis debería estar
entre 1.000.000 y 3.000.000 jxvolt/s. Los fenotipos asociados a la enfermedad de células
falciformes se representan en la tabla 17-6.
Electroforesis capilar
Introducción
La electroforesis capilar (EC) (CAPILLARYS 2 - SEBIA) perm ite realizar todas las
etapas de la electroforesis hasta la obtención del perfil de las hemoglobinas para el
análisis cualitativo o cuantitativo. El análisis puede realizarse usando el hemolizado de
glóbulos rojos sedimentados, centrifugados o lavados; el lavado de los glóbulos rojos
no es indispensable. Las hemoglobinas, separadas en capilares de sílice fundido, son
detectadas directamente en una burbuja existente en el capilar mediante espectrofotome-
tría de absorbancia a 415 nm , que es la longitud de onda de absorción específica de las
hemoglobinas. Los perfiles electroforéticos son analizados visualmente para detectar
las anomalías. La detección directa proporciona automáticamente una cuantificación
relativa precisa de cada fracción individual de las hemoglobinas que presenta un interés
particular, como la hemoglobina A2 en el diagnóstico de las 0 -talasemias. Además, la
buena separación de las diferentes fracciones perm ite confirm ar la identificación de
las variantes de la hem oglobina y, en particular, diferenciar la hem oglobina S de la
TABLA 17-6. Fenotipos más frecuentes
Fenotipo Descripción
Hb FA Patrón normal
Hb FS Anemia falciforme o drepanocitosis
Hb FAS Portador rasgo falciforme
Hb FC Enfermedad hemoglobina C
HbFAC Portador hemoglobina C
Hb FD Enfermedad hemoglobina D
HbFAD Portador hemoglobina D
Hb FE Enfermedad hemoglobina E
HbFAE Portador hemoglobina E
Hb FSC Enfermedad hemoglobina SC
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hem oglobina D, y la hem oglobina E de de la hem oglobina C. La cuantificación de

la hemoglobina A2 también se puede realizar en presencia de hemoglobina E.
Presenta dos programas, uno para el análisis a partir de muestras de adultos o niños,
no recién nacidos (CAPILLARYS HEMOGLOBIN[E]), y un programa específico para el
cribado neonatal de la enfermedad de células falciformes (CAPILLARYS NEONAT Hb).
Procedimiento para la detección de hemoglobinopatías en adultos

La electroforesis de las hemoglobinas de la sangre hum ana es un análisis m uy útil en el
laboratorio de análisis clínicos para investigar las anomalías cualitativas y cuantitativas
de la hemoglobina. Paralelamente a las técnicas de electroforesis en diferentes soportes,
entre los que está el gel de agarosa, se ha desarrollado la técnica de electroforesis capilar,
que ofrece las ventajas de una automatización competa del análisis, separaciones rápidas
y una excelente resolución. Se define como una técnica de separación electrocinética rea
lizada en un tubo de diámetro interno inferior a 1 0 0 |xm lleno de un tampón compuesto
por electrólitos. Se considera una tecnología intermedia entre la electroforesis de zona
en soporte y la cromatografía líquida.
El sistema CAPILLARYS 2 usa el principio de la electroforesis capilar en solución
libre, que representa la forma más corriente de electroforesis capilar.
Permite la separación de moléculas cargadas en función de su movilidad electro
forética propia en un tam pón de pH dado y, según el pH del electrólito, de un flujo
electroendosmótico más o menos importante. El sistema CAPILLARYS 2 posee una
serie de capilares en paralelo, que perm ite realizar siete análisis simultáneos. En este
sistema, la inyección en los capilares de las muestras diluidas con solución hemolizante
se realiza en el ánodo por aspiración. La separación se realiza a continuación aplicando
una diferencia de potencial de varios miles de voltios en los extremos de cada capilar.
La detección directa de las hemoglobinas se efectúa a 415 nm en el lado catódico. Los
capilares se lavan antes de cada análisis con una solución de lavado, y luego con el
tam pón de análisis. Con el tam pón de pH alcalino usado, el orden de migración de las
principales hemoglobinas normales (fig. 17-14) y anormales es el siguiente, del cátodo
al ánodo: 8A’2 (variante de A2), C, A2/0-A rab, E, S, D, G-Filadelfia, F, A, Hope, Bart, J,
N-Baltimore y H. Hay que tener en cuenta que la anhidrasa carbónica no se detecta en
el perfil electroforético de las hemoglobinas en la electroforesis capilar, lo que permite
identificar algunas variantes de la hemoglobina A2 en su zona de migración.
Procedimiento para el cribado neonatal de la enfermedad

de células falciformes
El kit CAPILLARYS NEONAT Hb permite la separación en medio alcalino (pH 9,4) de
las hemoglobinas normales de la sangre de recién nacidos humanos (F y A) y la detección
de las principales hemoglobinas anormales (S, C, E, D y Bart), mediante electroforesis
capilar en el sistema automático CAPILLARYS 2.
El sistema CAPILLARYS 2 permite realizar todas las etapas de la electroforesis hasta la
obtención del perfil de las hemoglobinas para el análisis cualitativo. El análisis se realiza
en el hemolisado de sangre total recogida en papel de filtro, que es cortado en forma de
disco con un perforador. Los perfiles electroforéticos son analizados automáticamente
para detectar las anomalías, con identificación de los perfiles normales (fig. 17-15) y
patológicos. El diagnóstico de la drepanocitosis se ve así facilitado por la buena separación
de las diferentes fracciones, que permite distinguir la fracción S de otras variantes de la
hemoglobina. Además, la estimación de los cocientes HbA/HbF y HbA/HbX (X = S, C,
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FIGU RA 17-14. Perfil electroforético normal en un adulto.
rww.medilibros.com
FIGU RA 17-15. Perfil electroforético normal en un recién nacido.
ERRNVPHGLFRVRUJ
D, E u O-Arab) ayuda al diagnóstico de las 0-talasemias y permite detectar una eventual

transfusión sanguínea previa del recién nacido.
C on el tam p ó n usado de pH alcalino, el orden de m igración de las principales
hemoglobinas normales y anormales es el siguiente, del cátodo al ánodo: C, A 2/0-A rab,
F-Ouled Rabah, E, S, D, G-Filadelfia, Korle-Bu, F, F degradada, A, A degradada y Bart.
Las variantes resultantes de la m utación de la cadena 7 pueden aparecer en algunas
zonas del perfil. Hay que tener en cuenta que la anhidrasa carbónica no se detecta en
el perfil electroforético de las hemoglobinas en la electroforesis capilar. Las sangres de
recién nacidos con varios días de edad y no transfusionados no presentan hemoglobina
A2 ni variantes de esta hemoglobina, ni tampoco hemoglobina H (en caso contrario,
están presentes en una cantidad muy baja). Estas sangres contienen mayoritariamen-
te fracciones asociadas a la cadena 7 , lo que implica que principalm ente contienen
hemoglobina F, eventualmente variantes de esta cadena y hemoglobinas resultantes
de modificaciones postraduccionales como la hemoglobina F, (o HbF acetilada con
acetilación de u n aminoácido de la cadena 7 ), que migra en la misma posición que la
hemoglobina F degradada.
Síntesis in vitro de cadenas de globina

Introducción
Aunque, en general, el diagnóstico de (3-talasemia se establece p or el aum ento de la
fracción HbA 2 y eventualmente también de la HbF, existen casos en que la dosificación
de las hemoglobinas A2 y F puede resultar normal, aun existiendo el cuadro de seudo
poliglobulia microcítica no ferropénica con incidencia familiar. En estos casos, una vez
descartado el rasgo a-talasémico mediante análisis del ADN, está indicado realizar la
biosíntesis de cadenas de globina in vitro con el fin de objetivar un desequilibrio en
la relación a / 0 de cadenas de globina.
Principio
Consiste en efectuar la síntesis de cadenas de globina in vitro a partir de una población de
eritrocitos con abundantes reticulocitos (también pueden emplearse células de médula
ósea) que se incuban en un medio que contiene los aminoácidos necesarios para la sín
tesis de globinas y entre los que uno de ellos (la leucina) presenta un marcador isotópico.
Los reticulocitos conservan aun una elevada capacidad para sintetizar hemoglobina, ya
que poseen una elevada cantidad del ARN mensajero (ARNm) globínico y ribosomas,
imprescindibles para la traducción del mismo. La lista de aminoácidos empleados y su
correspondiente cantidad se representa en la tabla 17-7.
Material
• 1 0 mi de sangre recogida con heparina.
• Mezcla de aminoácidos sin leucina.
• Leucina tritiada ( 3HLeu) (9,25 MBq) (AMERSHAM).
• Sulfato de hierro amoniacal.
• Glucosa.
Método
1 . Centrifugar la sangre a 3.000 r.p.m. durante 15 min a 4 °C.
2. Separar el plasma, guardándolo en hielo.
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A m inoácidos (mg)
Ácido aspártico 95
Ácido glutámico 73.5
Alanina 45
Arginina 21
Asparragina 75
Cisteína 12.5
Fenilalanina 65
Glicocola 100
Glutamina 70
Histidina 90
Isoleucina 10
Lisina 65
Metionina 12.5
Prolina 40
Serina 45
Tirosina 37.5
Treonina 50
Triptófano 15
Valina 90
3. Pasar los eritrocitos a u n tubo (de pared gruesa) de 1 cm de diámetro y 10 cm

de longitud para centrifugación a 13.000 r.p.m. durante 45 m in en centrífuga
refrigerada de rotor oblicuo.
4. Recoger unos 0,25 mi de la porción de eritrocitos situada en el extremo superior
de la superficie libre, enriquecida unas cinco veces en reticulocitos.
5. Resuspender los reticulocitos en plasma, restableciendo un hematocrito de apro
ximadamente 0,45.
6. Para 1 mi de esta suspensión, añadir (disueltos en 5 10 |xl de NaCl 0,15 M) 0,15 mg
de mezcla de aminoácidos sin leucina, 1 mg de glucosa y 0,01 mg de sulfato de
hierro amoniacal.
7. Hacer una preincubación de 10-15 m in en baño maría a 37 °C con sistema de
agitación lenta.
8. Añadir 40 (jlI de solución de 3HLeu, continuando la incubación durante 2 h.
9. Lavar los eritrocitos tres veces con solución de NaCl 0,15 M, hemolizándolos a
continuación con agua destilada fría, procurando obtener una concentración
hemoglobínica a 1-1,5% (relación agua/botón globular, aproximadamente 20:1).
10. Separar el grupo hemo de la globina por precipitación de la misma en medio
acetona/ácido clorhídrico (100 mi de acetona + 50 (jlI de HC1 fumante), el cual
se m antiene en una mezcla frigorífica a -2 0 °C (esta mezcla se consigue con
hielo machacado y sal) bajo agitación continua. La solución hemoglobínica se va
incorporando gota a gota al medio acetónico acidificado.
11. Transcurridos unos 30 m in se centrifuga a -2 0 °C y el precipitado blanco de
globina se lava tres veces con acetona a -2 0 °C.
12. Una vez evaporada la acetona, se disuelve la globina en agua destilada y se liofiliza.
13. La separación de las cadenas globínicas se lleva a cabo mediante cromatografía
en columna de CM-celulosa en urea 8 M.
14. Aproximadamente, 10 mg de la globina se disuelven en 1 mi de tampón de fosfato
disódico 7,5 mM a pH 6,9, 0-mercaptoetanol 0,05 M y urea 8 M.
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15. Esta solución se dializa tres veces (45 m in 1 h cada vez) co n tra el m ism o
tam pón.
16. Se deposita la solución proteica sobre una colum na (de 8 X 0,5 cm) de CM
celulosa (CM 52-WATHMAN) equilibrada con el tampón.
17. Las cadenas de globina se separan por elución mediante un gradiente lineal de
concentración en fosfato 7,5 mM/35 mM (35 ml/35 ml) a pH constante (6,9).
18. El perfil de elución se sigue por lectura continua de la absorción a 280 nm.
19. El recuento de la radioactividad de la muestra se efectúa sobre una parte alícuota
de cada fracción recolectada, según la fórmula:
(a) Fracción proteica, 1 mi.
(b) Agua destilada, 1,5 mi.
(c) Líquido de centelleo aceptor de agua (PCS®), 10 ml.

La globina 0 es la que eluye en prim er lugar, seguida de la globina a . Los valores de
absorción obtenidos para cada fracción se trasladan a una hoja de papel milimetrado
con el fin de obtener un gráfico ampliado. Sobre el mismo se transcriben los valores de
las desintegraciones por minuto (DPM) de cada fracción obtenida, debiéndose obtener
un gráfico que se halle en fase con el primero.
La suma de los valores de las DPM de la cadena 0 y los de la cadena a nos permitirá
establecer una relación a /0 , que en el caso de una (3-talasemia será > 1 y en el de una
a-talasemia, por el contrario, < 1.
D iagnóstico m olecular de las hem oglobinopatías

Extracción de ADN
Material
• Sangre total con EDTA.
• Tubos Falcon de 50 mi.
• Eppendorf de 1,5 mi.
• Pipetas de 5 y 10 mi.
• Baño de agua.
• Centrífuga.
• Espectrofotómetro.
• Cubetas de cuarzo.
• Agitador.
• Baño seco.
Nota: Utilizar todo el material estéril.
Reactivos
1. Tampón BLB.
2. Cloroformo.
3. H20 bidestilada estéril.
4. CTAB al 5%.
5. NaCl 1,2 M.
6. Etanol absoluto.
7. Etanol al 70%.
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Soluciones amortiguadoras
1. CTAB 5%
(a) CTAB, 2,5 g.
(b) NaCl 5 M, 4 mi.
(c) H20 bidestilada, c.s.p. 50 mi.
(d) Filtrar y guardar a 4 °C.
2. Tampón BLB
(a) DTAB, 8g.
(b) NaCl 5 M, 30 mi.
(c) Tris-HCl 1 M, 10 mi.
(d) H20 bidestilada, c.s.p. 100 mi.
(e) Filtrar.
Método
Lisis y desnaturalización
1. En un tubo Falcon de 50 mi introducir la sangre total con EDTA (de 1 a 2,5 mi).
2. Añadir 2 mi de tampón BLB por mi de sangre y mezclar suavemente.
3. Incubar en el baño a 68 °C durante 5 min.
4. Añadir 3 mi de cloroformo por mililitro de sangre, mezclar suavemente y cen
trifugar a 3.000 r.p.m. durante 15 min. Traspasar la fase superior a otro tubo Falcon
y desechar las dos fases restantes.
Precipitación y resuspensión del ADN

1. Añadir 3 mi de H20 bidestilada estéril por mililitro de sangre y mezclar suavemente.
2. Agregar 0,35 mi de tampón CTAB 5% por mililitro de sangre, agitar suavemente
hasta que aparezca el ADN.
3. Centrifugar 5 m in a 3.000 r.p.m., decantar el sobrenadante y dejar secar boca
abajo sobre un papel de filtro para eliminar todo el líquido restante.
4. Añadir 1 mi de NaCl 1,2 M por mililitro de sangre y dejar el tubo en agitación
hasta que se haya disuelto completamente el ADN (mínimo 30 min).
5. Agregar 2,5 mi de etanol absoluto por mi de sangre, agitar suavemente hasta que
aparezca otra vez el ADN. Preparar un tubo Eppendorf con 1 mi de etanol al 70%.
6. Coger el ADN con una varilla de vidrio y pasarlo al tubo Eppendorf.
7. Centrifugar a 14.000 r.p.m. durante 10 min.
8. Extraer el sobrenadante y dejar secar el ADN a 37 °C, mínimo 1 h.
9. A continuación resuspender en 100 (jlI de H 20 bidestilada. Se puede incubar a
temperatura ambiente toda la noche para una mejor resuspensión.
Cálculo de la concentración de ADN
1. Preparación de blanco y muestras:
(a) Blanco: 400 |xl H20 bidestilada.
(b) Muestras: 395 |xl H20 bidestilada + 5 |xl ADN.
2. Medir la concentración en el espectrofotómetro a 260 nm en cubeta de cuarzo.
3. Cálculo del resultado:
DO x 50x 80 = DO260x 4 = [ADN] |Xg/jil 1.000
1 unidad de DO260 = 50 |JLg/ml
Factor de dilución de la m uestra = 1/80.
Con este método de extracción se obtienen valores de concentración de 0,5 a 1 (ig/(xl.
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Análisis genético de la mutación /3s CD6 GAG > GTG responsable

de la hemoglobinopatía S (HbS)
Introducción
Para la confirmación de la hemoglobinopatía S (HbS) se utiliza el sistema ARMS (Am
plification Refractory M utation System). Este sistema se basa en la amplificación de
manera específica del alelo normal y del alelo mutado. Para ello se diseñan dos cebadores
que presentan el nucleótido portador de la mutación que se quiere estudiar en el extremo 3’.
Uno de los cebadores es com plem entario al alelo norm al y el otro al alelo mutado.
Además, en ambos cebadores se introduce una mutación en posición 3 desde el extremo 3’.
De esta manera, la reacción será alelo-específica.
Como control interno se amplifica una región del gen de la 0-globina de 890 bp con
los siguientes cebadores:
Nombre Secuencia
CIF 5’ GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA 3’
CIR 5’ CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC 3’
Los cebadores utilizados para la detección del alelo norm al y el alelo portador de la
mutación (3Sson los siguientes:
Nombre Secuencia
HbSC 5’ ACCTCACCCTGTGGAGCCAC3’
HbSN 5’ CACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTGCT 3’
HbSM 5’AGGGCAGTAACGGCAGACTTCTGC 3’
Se llevan a cabo dos reacciones de PCR, una con el cebador com ún (HbSC) y el
cebador específico para el alelo normal (HbSN), y otra con el cebador común (HbSC)
y el cebador específico para el alelo mutado (HbSM).
Mezcla de reacción
Las reacciones de PCR se llevan a cabo en un volumen final de 2 5 (jlI, consistente en
10 -15 |xl de la extracción de ADN, 0,6 5 prnol/jil de cada uno de los cebadores alelo-es-
pecíficos para la mutación (3\ 1,12 prnol/jil de cada uno de los cebadores CIF y CIR,
Ecotaq® tampón 10% (Ecogen, Barcelona), 1,5 mM de MgCl, 0,2 5 mM de dNTP y 2,5 U
de Ecotaq® (Ecogen, Barcelona).
Condiciones de amplificación
• Desnaturalización inicial: 5 m in a 93 °C.
• Programa 35 ciclos:
• Desnaturalización: 93 °C durante 48 s.
• Hibridación: 61 °C durante 48 s.
• Elongación: 72 °C durante 60 s.
• Elongación final 72 °C durante 10 min.
Separación y visualización de los productos de PCR mediante un gel de agarosa 1,2%.
Interpretación de los resultados:
Resultado 1 Resultado 2 Resultado 3
Reacción N M N M N M
C.1.890 bp — — — — — _
(3 o ps 200 bp — — — —
ERRNVPHGLFRVRUJ
El resultado 1 corresponde al genotipo homocigoto para el alelo normal (0/0).

El resultado 2 corresponde al genotipo heterocigoto para el alelo p ortador de la
mutación ( 0 / 0 s).
El resultado 3 corresponde al genotipo hom ocigoto para el alelo p ortador de la
mutación ( 0 S/ 0 S).
Diagnóstico molecular de la (3-talasemia

Introducción
Debido a la elevada heterogeneidad genética asociada a la 0-talasemia, la técnica de
elección para su caracterización genética es la secuenciación del gen de la 0 -globina:
región promotora, exónica e intrónica flanqueante, ya que es la única que nos permite
detectar el 1 0 0 % de las m utaciones independientem ente del origen geográfico del
paciente. Esto es básico para poder realizar un adecuado consejo genético y diagnóstico
prenatal, si procede.
Se lleva a cabo la secuenciación del gen de la 0-globina desde la posición -384 hasta
el nucleótido 42 del segundo intrón (IVS2:42), y desde el nucleótido 776 del segundo
intrón (IVS2:776) hasta 194 bp después del codón de terminación.
Cebadores
Gen F R
P-globina
Promotor 5’ GCTGAATTATGGTAGACAAAACTC 3’ 5’ CCAGGGCCTCACCACCAACT 3’
Exón 1 5’ CATCTATTGCTTACATTTGCTTCT 3’ 5’ GTCTCCACATGCCCAGTTTCTAT 3’
Exón 2 5’ CTCTTGGGTTCTGATAGGCACTG 3’ 5’ AAGAAGGGGAAAGAAAACATCAAG 3’
Exón 3 5’ AAGGCTGGATTATTCTGA 3’ 5’ TGCACTGACCTCCCACAT 3’
Mezcla de reacción
La mezcla de reacción para cada exón se realiza en un volumen final de 25 (jlI usando
2 unidades de Taq polimerasa, Ecotaq® (Ecogen, Barcelona), 2,5 |xl de tam pón 10X
comercial (Ecogen, Barcelona), 0,64 pmol/|xl de cada cebador, 0,2 mmol/1 de cada nu
cleótido y 1,5 mmol/1 de Cl2Mg. A la mezcla de reacción se le añade 1 (jlI de la extracción
de ADN (500 ng/|xl).
Condiciones de amplificación
• Desnaturalización inicial: 10 m in a 93 °C.
• Programa 35 ciclos:
• Desnaturalización: 93 °C durante 48 s.
• Hibridación: 56 °C durante 48 s.
• Elongación 72 °C durante 60 s.
• Elongación final: 72 °C durante 10 min.
El producto de amplificación se visuaüza en un gel de agarosa al 1,2%.
Región p-globina Tamaño fragmento

Promotor 568 bp
Exón 1 215 bp
Exón 2 324 bp
Exón 3 397 bp
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Orden de frecuencia de mutaciones Tipo de mutación Consecuencia de la mutación

CD39 (C-T) ARNm no funcional
2 IVS1:110 (G-A) Procesamiento de ARNm
3 IVS1:6 (T-C) Procesamiento de ARNm
5 IVS2: 745 (C-G) Procesamiento de ARNm
7 -87 (C-G) Transcripción
8 CD6-A ARNm no funcional
El volumen total de producto amplificado es purificado con QIAquick® PCR Purifi

cation Kit (QUIAGEN) mediante un sistema de purificación por columna de la banda
obtenida. Una vez purificados los productos de amplificación, se lleva a cabo la reacción
de secuenciación. Para ello se utiliza un secuenciador automático ABI Prism® 3130 XL
Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster city CA, USA) y el kit comercial BigDye
Terminator v3.1. Una vez finalizada la PCR de secuenciación, se realiza la eliminación
de los term inadores sobrantes m ediante colum na AutoSeq™ G-50 Dye Term inator
Removal Kit (GE Healthcare, UK).
En la tabla 17-8 se representan las mutaciones más frecuentemente encontradas en
el área mediterránea.
Diagnóstico molecular de la (f38)°-talasemia

La 80-talasem ia consiste en una dism inución o desaparición de la síntesis de cade
nas 8 y 0. Se divide en 8 0 +- y 8 0 o-talasemia, según el grado de síntesis de las cadenas
8 y 0 por parte del crom osom a afectado. La 8 0 -talasem ia obedece norm alm ente
a largas dilecciones que im plican al clúster 0 -globina y elim inan los dos genes 8 y
0, dejando intacto uno o los dos genes 7 . Esta form a de talasem ia se caracteriza
por el aum ento, a veces exclusivo, de la HbF, que en las form as heterocigotas oscila
entre un 7 y 15% y en las hom ocigotas se halla cercana al 100%. D ebido a ello se
la conoce tam bién con el nom bre de talasemia F y en España obedece prácticamente
siempre a un m ismo tipo de deleción que se conoce con el nom bre de 80°-talasemia
spanish.
Material
• Tampón 80Tal 10X: KC1, 500 mM; Tris HC1, 100 mM; pH 8,3; Cl2Mg, 15 mM;
albúmina 1 0 0 jxg/ml.
• dNTP 2 mM.
• Taq polimerasa, 5 U / (ii.
• ADN, 5 |xg/|xl.
• Primers Nj, N 2 y 80del a 10 pmol/ jjl I :
• N j: 5’ATG GGT ATT TCA CTT GTT AT 3’
• N 2 : 5’ACT TTG TCT GTT AAT TCC AA 3’
• 80del 5’ACT GTG GGA GCC CCT TTC TG3’
- Nj-N 2 amplifica el gen normal.
- Nj-SfSdel amplifica el gen que contiene la mutación.
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TABLA 17-9. Preparación de la mezcla de reacción de la PCR de 80-talasemia
N.° muestras Vol (|xl) XI
H 20 36,75
TPO 10X 5
dNTP 2 mM 5
Taq-polimerasa 0,25
N, 1
N2 1
Spdel 1
Preparación de la mezcla de reacción de la PCR (Master-Mix) (tabla 17-9)

Añadir a la mezcla de reacción (Master Mix) 1 (xl de ADN del paciente.
Condiciones de la PCR
• Primera desnaturalización: 94 °C durante 7 min.
• 30 ciclos con el siguiente programa:
• Desnaturalización: 94 °C durante 1 min.
• Hibridación: 55 °C durante 1 min.
• Elongación: 72 °C durante 1 min.
• Última elongación: 72 °C durante 7 min.
Electroforesis en gel de agarosa al 2%

Migración de las muestras amplificadas con un marcador de peso molecular.
Fragmentos:
• N j-N2, 685bp (gen normal).
• Nj-Spdel 299 bp (gen con la mutación).
Diagnóstico molecular de a-talasemia

La a-talasemia constituye la alteración genética más frecuente en la población mundial
y está ampliamente extendida en los países mediterráneos. La patología molecular de
la a-talasem ia está determ inada p or u na serie heterogénea de deleciones de diversa
extensión que:
• En el caso de la a°-talasemia implican todo el complejo de genes a-globina, o la región
que controla su expresión.
• La a +-talasemia es el resultado de deleciones de menor tamaño que eliminan uno de
los dos genes a-globina o de mutaciones puntuales (a-talasemia no delecional) que,
a pesar de dejar los genes intactos, pueden causar su inactivación parcial o completa.
La forma más frecuente de a-talasemia es la que se asocia a anemias microcíticas e
hipocromas no ferropénicas sin expresividad electroforética (microcitosis familiares
atípicas) y las más graves son la H bH y la hidropesía fetal, que vienen determinadas por
la presencia de H bH y Hb Bart respectivamente.
Detección de las deleciones 3,7 kb y 4,2 kb

Material
• ADN genómico 0,5 (xg/|xl.
• Taq polimerasa 2,5 U/|xl.
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• T am pón u n iv ersal 10X: (N H 4) 2 S 0 4, 166 m M ; T ris-H C l 670 mM con pH

8,8; Na2EDTA, 670 |xM; BSA, 160 |xg/ml; 0-m ercaptoetanol, 100 mM ; M gCl2,
25 mM.
• dNTP 2 mM.
• Mezcla de oligonucleótidos o cebadores (C 10/C3y C 10/C 9c) a una concentración final
de 25 pmol/|xl.
Secuencia de los cebadores:
• C 10: 5’ GAT GCA CCC ACT GGA CTC CT 3’
• C3: 5’ CCA TTG TTG GCA CAT TCC GG 3’
• C9C: 5’ CCA TGC CTG GCA CGT TTG CTG AGG 3’
C 10amplifica el extremo 5’ tanto para el gen como para a 2.
C 10 + C3amplifican la zona a 2 en la que se ha producido el entrecruzamiento.
C 10 + C2 amplifican la zona correspondiente al gen a r
Método
1. Preparar dos reacciones de PCR en dos tubos E p p en d o rf con u n volum en
final de 50 |xl cada uno. Estos volúmenes corresponden a u n a sola m uestra
(tabla 17-10).
2. Añadir 1 |xl de ADN 0,5 |xg/|xl en cada tubo.
3. Condiciones de PCR:
(a) Primera desnaturalización: -9 4 °C durante 10 min.
(b) 30 ciclos con el siguiente programa:
(i) Desnaturalización: -9 4 °C, 45 s.
(ii) Hibridación: -5 6 °C durante 1 min.
(iii) Extensión: -7 2 °C durante 1 min.
(c) Última elongación: -7 2 °C durante 10 min.
4. Migrar el producto de la PCR en un gel de agarosa al 1,2%.
5. Visualización del resultado de la amplificación.
Interpretación de los resultados

La utilización de las dos reacciones paralelas de PCR por cada m uestra (tabla 17-11)
permite diferenciar:
• La condición de homocigoto y heterocigoto de la deleción de 3,7 kb.
• La triplicación del gen a.
• La condición de doble heterocigoto 3,7 kb y 4,2 kb.
• La condición de homocigoto de la deleción 4,2.
TABLA 17-10. Preparación de la mezcla de la reacción de la PCR en la a-talasemia
Tubo 1 (jjlI) Tubo 2 (|xl)

Agua bidestilada estéril 32,5 32,5
Tampón universal 10 X 5 5
dNTP 2 mM 5 5
DMSO al 10% 5 5
Taq-polimerasa 0,5 0,5
C10 25 pm/p,l 1 1
C3 25 pm/|xl 1 —
25 pm/|xl — 1
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TABLA 17-11. Reacciones paralelas de PCR para los diferentes tipos de a-talasem ia
C,o-C3 fragmento CI0-C9Cfragmento

(kb) (kb)
o ta/aa 1,9 2,1 Patrón normal
-a 3'7/ a a 1,9 1 ,9/2,1 Heterocigoto para la deleción
de 3,7 kb
-a 3’7/-a 3’7 1,9 Homocigoto para la deleción
de 3,7 kb
a a a ” ti3’7/ a a 1,9/2,1 2,1 Heterocigoto para el triple
gen a
a a a anti3’7/-a 3,7 1,9/2,1 1 ,9/2,1 Doble heterocigoto para
el triple gen a y la deleción
de 3,7 kb
-a 4,2/-a 4,2 2,1 Homocigoto para la deleción
4,2
-a 3,7/-a 4,2 1 ,9/2,1 Doble heterocigoto para las
deleciones 3,7 y 4,2
a a a anti4’2/-a 3,7 1,9 1,9 Doble heterocigoto triple
a anü4,2/deledón 3,7
Detección de las deleciones__ MED,__ SEA y _ a 20,5

Secuencia de los cebadores
1. D eleción__ MED
(a) 5’MED: 5’ACA GTC ACT CCT GAG GCC AGT C 3’
(b) 5’MED N: 5’TAC AGC AGA GTG AGT GCT GCA T 3’
(c) 3’ MED: 5’GGA GAA GTA GGT CTT CGT GGC 3’
2. D eleción__ SEA
(a) 5'SEA: 5’CTC TGT GTT CTC AGT ATT GGA G 3’
(b) 3'SEA N: 5’TGA AGA GCC TGC AGG ACC AGT CA 3’
(c) 3'SEA: 5’ATA TAT GGG TCT GGA AGT GTA TC 3’
3. Deleción _ a 20>5
(a) 5’- a 20,5: 5’ GGC AAG CTG GTG GTG TTA CAC A 3’
(b) 5’ TGG AGG GTG GAG ACG TCC TG 3’
(c) 3’a,: 5’ CCA TGC TGG CAC GTT TCT GAG G 3’
Método
Las deleciones__ M ED ,__ SEA, y __ a 20,5 pertenecen a un grupo de deleciones de 18-
30 kb. Para detectar la presencia de una de estas deleciones se realizan dos reacciones de
PCR. Una contiene un par de cebadores designados para detectar la deleción, y la otra
un par para detectar la secuencia normal (tablas 17-12 a 17-14).
1. Preparar las siguientes reacciones de PCR en dos tubos Eppendorf con un volumen
final de 50 jjlI cada uno.
2. Añadir 1 |xl de ADN de concentración de 0,5 |xg/(jlI en cada tubo.
3. Condiciones de PCR:
(a) Desnaturalización inicial: 94 °C, 10 min.
(b) 30 ciclos con el siguiente programa:
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TABLA 17-12. Detección de la deleción__ MED
Tubo 1 (|xl) Tubo 2 (jxl)

Tampón universal 10X 5 5
dNTP 2 mM 5 5
DMSO 5 5
5’-MED 25 pm/(xl 1 —
3’-MED 25 pm/pd 1 1
5’-MED N 25 pm/|xl — 1
TABLA 17-13. Detección de la deleción _ _SEA
Tubo 1 (|xl) Tubo 2 (jil)

dNTP 2 mM 5 5
DMSO 5 5
5’-SEA 25 pm/|xl 1 —
3’-SEA 25 pm/|xl 1 1
5’-SEA N 25 pm/|xl — 1
TABLA 17-14. Detección de la deleción _ _ a 20-5
Tubo 1 (|xl) Tubo 2 (|jJ)

dNTP 2 mM 5 5
DMSO 5 5
5’-(a 20,5) 25 pm/(xl 1 —
3’-a, 25 pm/|xl 1 1
C, 25 pm/|xl — 1
(i) Desnaturalización: 94 °C durante 45 s.

(ii) Hibridación: 56 °C durante 1 min.
(iii) Extensión: 72 °C durante 1 min.
(c) Extensión final: 72 °C durante 10 min.
Interpretación de los resultados

La interpretación de los resultados para las deleciones MED, SEA y a 20,5 se resume en la
tabla 17-15.
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I TABLA 17-15. Interpretación de los resultados para las deleciones de a-talasemia MED, 1
SEAy5’-a20-5- 3-aj
5’MED - 3’MED fragmento 5’MED N - 3’MED fragmento

mutado (kb) normal (kb)
a a /a a ___ 1
a a / - MED 0,65 1
j
_MED _MED 0,65 —
5’SEA - 3’SEA fragm ento m utado (kb) 5’SEA - 3’SEA N fragm ento norm al (kb)
a a /a a — 0,98
a a / —SEA 0,66 0,98
_SEAj _SEA 0,66 —
5’- a 20'5- 3 - a 1fragm ento m utado (kb) 0 ,-3 - a , fragm ento norm al (kb)
a a /a a — 1,07
a a / — a 20'5 1,18 1,07
—a 20,5/ — a 20,5 1,18 —
LECTURAS RECO M ENDADAS

Bain B, Bates I, Laffan M, Lewis M editors. Dacie and Lewis Practical Haematology. 11.a ed.
Philadelphia: Churchill Livingstone/Elsevier; 2012.
Betke K, M arti HR, Scilicet I. Estimation o f small percentages o f fetal hemoglobin. Nature
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Carrell RW, Kay R. A simple m ethod for the detection o f unstable haemoglobins. Br J Haematol
1972;23:615.
Clegg JB. Haemoglobin Synthesis. En: Wheatherall DJ editor. M ethods in Haematology.
Edinburgh: Churchill Livingstone; 1983. p. 54-73.
Efremov GD, Huisman THJ. The laboratory diagnosis o f the haemoglobinopathies. Clin
Haematol 1974;3:542.
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differentiate the sickle-cell trait from sickle-cell anemia. J Clin Pathol 1970;23:781.
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Fetal Hemoglobin Reference Preparations and Fetal Hemoglobin determination by the Alkali
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hemoglobinopatías y déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) en Cataluña. Estudio
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Capítulo 17 Métodos para el diagnóstico de las hemoglobinopatías y talasem ias 4 9 5 .e l
Autoevaluación
1. ¿Qué se conoce con el térm ino de hemoglobinopatía?
(a) Una disminución parcial en la síntesis de una cadena globínica.
(b) Un cambio estructural en la síntesis de una cadena globínica.
(c) Una disminución total en la síntesis de una cadena globínica.
(d) Las respuestas a y b son correctas.
(e) Ninguna es correcta.
Respueta razonada: las hemoglobinopatías son alteraciones cualitativas o cuantitativas de la
hemoglobina, cuya consecuencia puede ser una modificación estructural de la hemoglobina o
una disminución variable de la síntesis de una cadena de globina.
2. ¿Qué se conoce con el térm ino de talasemia?
(a) La disminución total en la síntesis de la cadena (3-globina.
(b) La disminución total en la síntesis de la cadena a-globina.
(c) Una variante estructuralmente anómala de la hemoglobina.
(d) La disminución total o parcial de una de las cadenas de globina.
Respuesta razonada: conocemos como talasemia la dism inución parcial o total de una de las
cadenas que forman parte de la hemoglobina: cadena a , (3 o 8.
3. ¿Cómo se produce una hemoglobinopatía estructural?
(a) Es el resultado de mutaciones genéticas que afectan a la estructura de la hemoglobina.
(b) Es consecuencia de m utaciones genéticas que afectan a la capacidad de síntesis de una
cadena de globina.
(c) Es consecuencia de m utaciones genéticas, generalmente grandes deleciones.
(d) Es consecuencia de la exposición a ciertos medicamentos.
(e) Las respuestas a y c son correctas.
Respuesta razonada: las hemoglobinopatías estructurales son el resultado de mutaciones genéticas
que afectan a la estructura de una de las cadenas de la globina; generalmente afecta a u n o o
pocos aminoácidos.
4. ¿Qué es la hemoglobinopatía S?
(a) Un tipo de talasemia de cadena (¡J-globina.
(b) Una variante estructural de cadena p-globina.
(c) Una variante estructural de cadena a-globina.
(d) Una de las hemoglobinas normales en la infancia.
Respuesta razonada: la hem oglobinopatía S es una variante estructural de la hemoglobina,
consecuencia de una m utación que afecta al codón 6 de la cadena (3-globina.
5. ¿En qué porcentaje se expresará una hemoglobinopatía estructural en estado heterocigoto
debida a una m utación en la cadena a-globina?
(a) En un 50%.
(b) En un 100%.
(c) En un 25%.
(d) Entre un 50 y un 100%.
(e) Depende de si se hereda de la m adre o del padre.
Respuesta razonada: la cadena a-g lo b in a está sintetizada p o r dos genes, el a2 y el a,. Por
consiguiente, una m utación que afecte a un gen a representará u n 25% de cadena m utada
c u ando se encuentre en estado hetero cig o to y u n 50% c u an d o se en cu en tre en estado
hom ocigoto.
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4 9 5 .e2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
6. ¿En qué porcentaje se expresará una hemoglobinopatía estructural en estado heterocigoto

debida a una m utación en la cadena (¡J-globina?
(a) En u n 50%.
(b) En u n 100%.
(c) En u n 25%.
(d) Entre un 50 y un 100%.
(e) Depende de si se hereda de la m adre o del padre.
Respuesta razonada: la cadena p-globina está sintetizada por un único gen. Por consiguiente,
una m utación que afecte al gen (3-globina representará u n 50% de cadena m utada cuando se
encuentre en estado heterocigoto y un 100% cuando se encuentre en estado homocigoto.
7. ¿Qué nos indica una cuantificación de la HbA2 de 5,6%?
(a) Presencia de una a-talasemia.
(b) Presencia de una ^-talasemia.
(c) Presencia de una 8 /(3-talasemia.
(d) Presencia de una H b estructural de cadena a.
(e) Presencia de una anemia ferropénica.
Respuesta razonada: los valores de HbA2 superiores al 3,5% nos indican la presencia de una
P-talasemia. En la a - y la 8/(3-talasemia, así como en la anemia ferropénica, los valores de HbA2
son siempre normales.
8. ¿Qué nos indica la presencia de H bH en un individuo?
(a) Que el individuo padece anemia falciforme.
(b) Es un indicador de fJ-talasemia.
(c) Que el individuo padece a-talasemia.
(d) Que el individuo padece talasemia sin poder diferenciar entre a o (3.
Respuesta razonada: la presencia de H bH nos indica que el individuo padece una a-talasemia
causada por la deleción de tres alelos a-globina. Las cadenas (3-globina que se encuentran en
exceso se unen entre sí dando lugar a hom otetrám eros que conocemos como HbH.
9. ¿Cuál es el soporte más empleado para realizar la electroforesis de hemoglobinas?
(a) Acetato de celulosa a pH 5,6.
(b) Acetato de celulosa a pH 8,6.
(c) Poliacrilamida a pH 5,6.
(d) Poliacrilamida a pH 8,6.
Respuesta razonada: en la práctica diaria, el soporte más empleado es el acetato de celulosa a pH
8,6. El a c e ta to d e c e lu lo sa es el soporte ideal, tanto por su carácter homogéneo y no absorbente
como por su elevada resistencia mecánica, que le confiere una fácil manipulación.
10. ¿Qué ventajas confiere la cromatografía líquida de alta resolución sobre la electroforesis
convencional?
(a) Permite la cuantificación relativa de las fracciones de la hemoglobina.
(b) Facilita realizar programas de cribado de hemoglobinopatías.
(c) Mayor sensibilidad.
(d) Ninguna.
(e) Las respuestas a, b y c son correctas.
Respuesta razonada: la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) perm ite de manera es
tandarizada, rápida y sencilla la separación y cuantificación automatizada de las fracciones hemo-
globínicas normales (HbA, HbA2y HbF), así como la detección de posibles hemoglobinopatías
(HbS, HbC, HbD, HbE entre otras).
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C A P Í T U L O 18

de las membranopatías eritrocitarias
M. L. Ribeiro, I. Besson y J. L. Vives Corrons
ESTRUCTURA D E L A M E M B R A N A D E L E R ITR O C IT O
El eritrocito es una célula discoide, muy deformable, que circula libremente por la sangre
periférica, sobreviviendo a la turbulencia de la microcirculación durante 120 días apro
ximadamente, hasta que es fagocitado por las células del sistema mononuclear fagocítico
(SMF). Su elevada elasticidad y resistencia, que le permiten atravesar territorios capilares de
diámetro muy inferior al suyo, dependen de la composición y estructura de una membrana
capaz de responder prontamente al estrés y soportar grandes tensiones sin fragmentarse.
Esta m embrana, al mismo tiempo, permite mantener el equilibrio iónico y acuoso
del eritrocito, protege a la hemoglobina y a otras proteínas celulares de la oxidación y
retiene selectivamente a los componentes vitales mientras se libera de los nocivos. El
fallo de cualquiera de estas funciones conlleva una disminución de la supervivencia de
los eritrocitos en la circulación.
La disminución de la vida media eritrocitaria, o hemólisis, puede ser debida a factores
extracorpusculares, extrínsecos al propio eritrocito (en general de origen plasmático o vas
cular), o a factores intracorpusculares que alteran algunos de los componentes estructurales:
membrana, hemoglobina o enzimas del metabolismo. A diferencia de los factores ex
tracorpusculares, la mayoría de los defectos intracorpusculares tienen un origen congénito.
En la fisiopatología de las anemias hemolíticas en general, la membrana eritrocitaria
tiene gran importancia porque cualquier alteración de los componentes estructurales
de los eritrocitos, resultante de factores extrínsecos o intrínsecos, en últim a instancia
repercute sobre la membrana, dando lugar a una alteración de la forma y de la capacidad
de deformación eritrocitaria.
La membrana del eritrocito está compuesta por tres estructuras que interaccionan:
una bicapa lipídica (formada esencialmente por fosfolípidos y colesterol no esterificado),
las proteínas integrales o transmembrana (que atraviesan la bicapa lipídica) y el citoes-
queleto (una red de proteínas que confieren integridad estructural a la célula) (fig. 18-1).
Las proteínas de la m embrana eritrocitaria pueden ser identificadas mediante elec
troforesis en poliacrilamida. Esta técnica permite separar las proteínas según su peso
molecular (PM), teñirlas con un colorante de proteínas y cuantificarlas por densitometría.
Cada banda en la electroforesis se identifica mediante la asignación de un núm ero de
acuerdo a la nomenclatura internacional (fig. 18-2).
E s tru c tu ra lip íd ic a
La bicapa lipídica de la membrana del eritrocito está compuesta por colesterol y fosfolí
pidos distribuidos asimétricamente. La fosfatidilcolina y la esfingomielina se concentran
en la capa externa, mientras que la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina predominan

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Capítulo 18 Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias 497
FIGURA 18-1. Esquema de la estructura de la membrana eritrocitaria.
240 Espectrina a
220 Espectrína
Isoformas anquirina
Proteina 4.1a y b
Proteina 4.2/palidina
Banda 5/actina
Banda 6/G3PDH
Banda 7/estomatina
FIGURA 18-2. Esquema
de las fracciones correspondientes
Hemoglobina a las proteínas de la membrana
eritrocitaria separadas mediante
electroforesis (coloración con Azur
de Coomassie).
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en la capa interna. Esta asimetría es im portante para m antener las propiedades de la

mem brana y resulta de un sistema dinámico de transform ación constante (flip-flop)
entre las dos capas. El colesterol se halla en proporciones similares en ambos lados de la
bicapa lipídica y se mueve con mucha rapidez entre ellos, lo que evita las diferencias de
presión cuando el eritrocito sufre una compresión. Los glucolípidos están concentrados
en la capa externa y transportan determinantes antígenos de los grupos sanguíneos,
principalmente de los grupos A, B, H, Lea, Leb y P.
En condiciones fisiológicas, la bicapa lípídica se encuentra en estado líquido, y permite
que las proteínas transmembranosas, los antígenos y otras moléculas que están en la
superficie se muevan en el plano de la membrana. En algunas situaciones patológicas
se ha demostrado disminución de la fluidez de la m embrana por exceso de colesterol,
con formación de acantocitos o spur cells en la terminología anglosajona (abetalipo-
proteinemiay enfermedades hepatocelulares graves). La incorporación excesiva de lípidos
en la bicapa causa un aumento de superficie de la membrana, con formación de células
diana (dianocitos o target cells) o codocitos, como acontece en las enfermedades hepáticas
obstructivas, en el déficit familiar de lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT), en la
hipocromía muy intensa (talasemia y ferropenia) y en la hemoglobinopatía C homocigota.
E s tru c tu ra p ro te ic a
La capa interna de la membrana del eritrocito está revestida por una red de proteínas que
se entrelazan formando un esqueleto flexible, el cual da forma y estabilidad mecánica a
la célula. Es una estructura densa que puede distenderse de manera uniforme y adquirir
una superficie 7-8 veces mayor que la del eritrocito norm al, perm itiéndole soportar
grandes deformaciones sin llegar a fragmentarse.
Esta red está formada por largos filamentos de a - y (3-espectrina, asociados en heterodí-
meros, que, a la vez, se asocian en tetrámeros y forman una red densa en la superficie interna
de la bicapa lipídica. La estructura es predominantemente hexagonal, con complejos de
interconexión en el centro y en los vértices, formados por seis tetrámeros de espectrina (de
media) entrelazados a pequeños filamentos de actina, estabilizada por la tropomodulina.
La interacción actina-espectrina está reforzada p or las proteínas 4.1 y aducina. El
esqueleto tiene dos lugares de unión a la bicapa lipídica: uno de alta afinidad entre
la p-espectrina y la anquirina, con interacción de la proteína banda 3 reforzada por la
proteína 4.2, y otro entre la proteína 4.1 (del complejo funcional) y la glucoforina C,
con interacción de la proteína p55.
Proteínas integrales
Las principales proteínas integrales de la membrana del eritrocito son la banda 3 y las
glucoforinas A, B, C y D. Estas son, en general, proteínas con tres dominios específicos:
a) dominio extracelular, o receptor glucosilado que contiene los determinantes antígenos de
los grupos sanguíneos; b) dominio intramembranoso, muy hidrófobo, que se integra con los
fosfolípidos, y c) dominio citoplásmico, lugar de unión de las proteínas del citoesqueleto.
Existen muchas otras proteínas integrales que penetran o atraviesan la membrana del
eritrocito y que se conocen como proteínas del sistema Rh, Kell y Dufíy; proteínas del com
plemento (C3b y C4b) y proteínas que sirven de transportadores y receptores.
B anda 3 (AE1)
La banda 3 o AE1 (del inglés anion exchanger, «intercambiador amónico») forma parte de
una familia multigénica de proteínas AE con dominios intramembranosos implicados en
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el transporte iónico. Es la mayor y más abundante proteína integral de la membrana, con

cerca de 1,2 millones de copias por eritrocito; representa el 20-30% de las proteínas de
la membrana. Tiene tres dominios estructurales: a) citoplásmico (residuos 1-403), lugar
de unión a las enzimas glucolíticas, hemoglobina, hemicromos y proteínas del citoes-
queleto; b) membranoso (residuos 404-882), compuesto por 14 regiones helicoidales que
atraviesan la membrana y forman un canal para el intercambio iónico, y c) otro dominio
citoplásmico (residuos 883-911), de función desconocida. La anquirina, la proteína 4.1
y la proteína 4.2 se unen al dominio citoplásmico, probablemente en más de un lugar.
En la esferocitosis hereditaria (EH) se han descrito mutaciones del gen EPB3 que
producen una disminución de la síntesis, la estabilidad y la inserción de la banda 3 en la
membrana, o la alteración de las regiones de unión a la proteína 4.2. La deleción de ocho
residuos aminoacídicos (400 a 408) se ha asociado a una forma especial de ovalocitosis
conocida como ovalocitosis SAO (sudeste asiático). En formas raras de acantocitosis
hereditaria se han descrito variantes de la banda 3 con aumento del transporte aniónico.
También, en la anemia diseritropoyética congénita (CDA) tipo II se observa una altera
ción cualitativa de la banda 3 en la electroforesis, más compacta y rápida.
La banda 3 también se expresa en las células intersticiales de los túbulos distales del
riñón, donde contribuye a mantener el equilibrio acidobásico de la sangre. Para la síntesis
de la proteína AE1 renal, el gen EPB3 utiliza un prom otor localizado en el intrón 3,
pero debido a que carece de los 65 primeros aminoácidos no se une a los componentes
citoplásmicos.
Glucoforinas
Con base en las propiedades y en la estructura génica, las glucoforinas pueden ser
subdivididas en dos grupos. El primero está constituido por las glucoforinas A (GPA),
B (GPB) y E (GPE), estructuralm ente homologas y asociadas a los antígenos de los
grupos sanguíneos MNS. Las GPA y GPB transportan más del 90% de los residuos del
ácido siálico que confieren carga negativa a la superficie de los eritrocitos. La GPA ya es
detectable en los proeritroblastos y constituye un marcador específico de la línea eritroide.
La ausencia de GPA y/o GPB no se acompaña de alteraciones morfológicas o funcionales
de los eritrocitos. Las glucoforinas C (GPC) y D (GPD) constituyen un segundo grupo
que contiene los antígenos de los grupos sanguíneos Gerbich (Ge). Ambas proteínas
son sintetizadas por un único gen, utilizando diferentes códigos de iniciación: GPD es
una forma modificada de GPC a la que le faltan los primeros 21 aminoácidos del grupo
terminal NH2. Las GPC y GPD se expresan en tejidos eritroides y no eritroides y pueden
actuar de receptores para el Plasmodium falciparum. La ausencia completa de estas
glucoproteínas se asocia a eliptocitosis. La GPC se halla unida a la proteína 4.1 y forma
un importante lugar de anclaje del citoesqueleto a la membrana.
Proteínas del citoesqueleto

Espectrina
La espectrina es la proteína más abundante y larga de la m em brana del eritrocito.
Es un heterodímero form ado por dos subunidades, a y 0, enrolladas entre sí en una
orientación antiparalela. Los heterodímeros se asocian en tetrámeros a 2$2 a través de
su terminal proximal (cabeza), que está formado por el terminal NH2 de la cadena a y
el terminal C OOH de la cadena (3. La interconversión dímero-tetrámero está regulada
por un equilibrio termodinámico que, en condiciones fisiológicas, favorece fuertemente
los tetrámeros de espectrina.
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En el terminal distal o caudal, los heterodímeros, con ayuda de la proteína 4.1, se unen
a pequeños filamentos de actina, y forman un complejo funcional con la tropomiosina
y la aducina.
El principal lugar de unión del esqueleto de la m em brana a la bicapa lipídica se
establece por la interacción (3-espectrina-anquirina que, a su vez, se une al dominio
citoplásmico de la banda 3. La interrupción de esta unión vertical causa EH por deses
tabilización y vesiculación del citoesqueleto y de la capa lipídica. Una segunda unión
vertical está mediada p or la asociación (3-espectrina-actina-proteína 4.1, unida a su
vez a la glucoforina C. Las alteraciones en esta interacción no parecen ser causa de EH.
Anquirina (proteína 2.1)

La anquirina tiene tres dominios funcionales: a) dominio con carga positiva, compuesto
por 23 segmentos de 33 AA, con lugares de unión para la banda 3 y para otras proteínas
integrales; b) dominio neutral donde la anquirina se une por afinidad a la 0 -espectrina,
y c) dominio regulador que modula la interacción de la anquirina con la espectrina y
con la banda 3. Este segmento tiene varias isoformas que resultan del reordenamiento
(splicing) alternativo del ARNm y cuya función se desconoce. La fosforilación de la
anquirina también funciona como mecanismo regulador: la anquirina no fosforilada
se une preferentemente a los tetrámeros y oligómeros de espectrina en detrim ento de
los dímeros. La fosforilación disminuye esta unión preferente y reduce la capacidad
de la anquirina para unirse a la banda 3. La anquirina eritroide también se expresa en
las células de Purkinje del cerebelo, por lo que los individuos con déficit de anquirina
pueden presentar una disfunción neurológica grave.
Proteína 4.1
La proteína 4.1 interacciona con varias proteínas transmembranosas y del citoesqueleto,
contribuyendo a la estabilidad de la red de espectrina-actina. Está constituida por cuatro
dominios comprendidos por los aminoácidos 1 a 300,301 a 404,405 a 471 y 472 a 662. El
prim er dominio está implicado en una interacción con la GPC, reforzada por la unión a
la proteína p55, pero no está claro si in vivo interacciona también con la GPA y la banda 3.
El tercer dominio está relacionado con la unión a la 0-espectrina, que se establece junto
al lugar de unión espectrina-actina, contribuyendo a reforzarla. Al parecer, la proteína
4.1 también se une directamente a la actina formando un complejo espectrina-actina-
proteína 4.1. La ausencia de proteína 4.1 se asocia a eliptocitosis hereditaria, con un
cuadro clínico de anemia hemolítica crónica, debido a inestabilidad de la membrana.
Mediante electroforesis (SDS-PAGE) la proteína 4,1 puede ser separada en proteína
4. la y 4. Ib. La 4. Ib predomina en los reticulocitos y da origen a la 4. la por desanimación
gradual del Asn 502. La proteína 4.1 tiene una variedad de isoformas con especificidad
tisular y del estado de maduración celular y que resultan de diferentes splicings en el
gen EPB41.
Proteína 4.2
La proteína 4.2 está unida a varias proteínas, en particular la banda 3 y la anquirina. La
deficiencia completa de proteína 4.2 se asocia a la esferovalocitosis con anemia hem o
lítica, lo que sugiere el desempeño de un papel importante en la integridad de la mem
brana. Existen cuatro isoformas resultantes del splicing alternativo en el gen EPB42 en
la región correspondiente al terminal N H 2 de la proteína. La proteína 4.2 tiene una gran
analogía con las proteínas de la familia de las transglutaminasas, como el factor XIII de
la coagulación, pero no posee actividad enzimática.
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Proteína p55
La proteína p55 se une a la proteína 4.1 y a la región citoplásmica de la GPC estableciendo
un puente de unión entre ambas. Los eritrocitos sin proteína 4.1 o sin GPC tampoco
tienen p55.
Actina y otras proteínas asociadas

La actina forma parte del complejo funcional y está organizada en pequeños filamentos
en doble hélice, que parecen estabilizarse por las interacciones con la espectrina, adu-
cina, proteína 4.1, tropomiosina y tropomodulina. La unión a espectrina es ineficaz en
ausencia de la proteína 4.1. La aducina es un heterodímero, formado por dos cadenas,
a y (3, estructuralmente parecidas, que se une a la espectrina y la actina para promover
la asociación de las dos proteínas. La desm antina (proteína 4.9) une los filamentos
de actina agrupándolos. La tropom iosina se une con la actina, y en concentraciones
saturadas de tropom iosina inhibe la unión espectrina-actina. La tropom odulina está
asociada a actina e interacciona con la tropomiosina en los respectivos terminales N H 2.
La miosina está formada por dos cadenas ligeras y una pesada, tiene actividad ATPasa y
se une a la actina y posiblemente también a la proteína 4.1. En los eritrocitos del recién
nacido existen cerca de 2,5 veces más copias de miosina que en los adultos.
TRASTORNOS CONGÉNITOS DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO

Las proteínas que forman el esqueleto de la m embrana del eritrocito establecen entre sí
interacciones verticales (entre el esqueleto y la bicapa lipídica) y horizontales (entre las
proteínas que form an la red del citoesqueleto). La interrupción de estas interacciones,
por defectos de alguna de las proteínas, altera la integridad estructural y funcional de la
membrana y puede reducir la supervivencia del eritrocito (tabla 18-1). La interrupción
de las interacciones verticales, que implican a la espectrina o a las proteínas que unen
la espectrina a la m em brana (como la anquirina, la proteína 4.2 y la banda 3), es causa
de EH. La interrupción de las interacciones horizontales (entre las espectrinas a y 0,
la (3-espectrina y la proteína 4.1; o la pro teína 4.1 y la actina) es causa de eliptocitosis
(ElipH) o piropoiquilocitosis hereditaria (PPH). La ovalocitosis del sudeste asiático
(SAO) es una forma de ElipH que resulta de una alteración específica en la banda 3.
I TABLA 18-1. Anem ias hem olíticas asociadas a alteraciones en las proteínas
de la m em brana eritrocitaria
Proteína EH ElipH PPH SAO EstH CDA-II

a-espectrina X X X
^-espectrina X X X
Anquirina X
Banda 3 X X X
Proteína 4.1 X
Proteína 4.2 X
Estomatina X
Glucoforina A X
Glucoforina C X
CDA-II, anemia diseritropoyética congénita tipo II; EH, esferocitosis hereditaria; ElipH, eliptocitosis H;
EstH, estomatocitosis hereditaria; PPH, piropoiquilocitosis hereditaria; SAO, ovalocitosis del sudeste asiático.
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Los trastornos en la perm eabilidad de la m em brana de los eritrocitos alteran la

concentración intracelular de los cationes monovalentes, causando un conjunto de
enfermedades hereditarias conocidas como estomatocitosis hereditaria.
Esferocitosis hereditaria (EH)

Es la anemia hemolítica crónica más frecuente en Europa. Se encuentra en todos los
grupos étnicos, y se caracteriza p or la presencia de eritrocitos con form a esférica y
osmóticamente más frágiles (fig. 18-3). El cuadro clínico, de intensidad muy variable,
se caracteriza clásicamente por ictericia, anemia con reticulocitosis y esplenomegalia.
La variabilidad clínica depende fundamentalmente de la proteína afectada y del tipo
y localización de la alteración, pero también está influenciada p o r múltiples factores
intra- y extragénicos.
En aproxim adam ente el 75% de los casos de EH, la transm isión es autosóm ica
dom inante y en el 25% restante es esporádica. Se estima que los casos esporádicos,
aunque pueden ser autosómicos recesivos, están causados en su mayoría por mutaciones
de novo en el gen de la anquirina o de la 0-espectrina. El estado homocigoto para las
formas dominantes de EH es raro, probablemente debido a que es incompatible con la
vida. La gravedad de los cuadros clínicos descritos en la literatura médica justifica que
en el caso del diagnóstico de una EH autosómica dominante en uno de los miembros
de una pareja, se estudie al otro miembro para consejo genético y, si estuviera indicado,
ofrecer el diagnóstico prenatal.
La causa más frecuente de EH en la población europea y americana es un déficit de
anquirina/espectrina (35-65%), seguido del déficit de banda 3/proteína 4.2 (15-30%). El
déficit aislado de proteína 4.2 es raro en la población europea, pero tiene una elevada preva
lencia en Japón. Como resultado de la estrecha interacción entre estas proteínas, la reducción
primaria de una proteína origina reducciones secundarias de las que le están asociadas.
La alteración de las interacciones verticales entre el esqueleto y la bicapa lipídica
conlleva la formación de microvesículas membranosas que, al ser eliminadas por los
macrófagos, producen una reducción progresiva de la superficie de la membrana eri
trocitaria, lo que constituye la causa de esferocitosis.
Los principales defectos proteicos primarios en la EH son los déficits de anquirina,
banda 3, espectrina y proteína 4.2.
• Déficit de anquirina: el déficit primario de anquirina es la causa más frecuente de EH
y, en la mayoría de los casos, se acompaña de un déficit secundario de espectrina, que
F IG U R A 18 -3 .Frotis de sangre periférica de una muestra con esferocitosis hereditaria. Se identifican

numerosos eritrocitos con forma esférica (esferocitos). La flecha muestra un eritrocito «en champiñón»,
frecuente en las EH por déficit de banda 3.
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se degrada por falta de anquirina para unirse a la membrana. El fenotipo resulta de

mutaciones en el gen ANK1. En las formas de transmisión dominante las mutaciones,
en estado heterocigoto, originan casi siempre codones de paro (stop) de la traducción
(frameshift). Las formas de transmisión recesiva están asociadas, más frecuentemente,
a mutaciones en la región promotora del gen. No siempre existe correlación genotipo-
fenotipo debido a la asociación con otros factores que modifican la expresión del
defecto primario.
• Déficit de banda 3: se considera responsable de un 15-30% de los casos de EH dominante
y resulta de mutaciones en el gen EPB3 asociadas a alteraciones que disminuyen la esta
bilidad o la capacidad de inserción de la banda 3 en la membrana. El cuadro clínico suele
ser una anemia hemolítica leve o moderada, con disminución (20-30%) de banda 3
y déficit proporcional de proteína 4.2. Las mutaciones en la secuencia que codifica el
dominio citoplásmico de la banda 3 pueden alterar el locus de unión de la proteína
4.2, que en estos casos se presenta más reducida que la banda 3. Aparentemente, estas
alteraciones solo se manifiestan en estados homocigotos o asociados a otras mutaciones
esferocíticas. Algunas mutaciones en el gen EPB3 alteran la banda 3, que se expresa en
las células tubulares distales del riñón, dando lugar a acidosis tubular distal.
• Déficit de espectrina: es la tercera causa más frecuente de EH y el grado de deficiencia
de espectrina se correlaciona con el grado de hemólisis. En general, las mutaciones
en el gen de 0 -espectrina (SPTB) se asocian a EH dom inante con fenotipo leve a
moderado, mientras que las mutaciones en el gen de a-espectrina (SPTA1) se asocian
a EH recesiva y hemólisis muy intensa en homocigotos. Más del 50% de los pacientes
con formas recesivas y graves de EH presentan una mutación en el gen SPTA1.
• Déficit de proteína 4.2: la EH por déficit de proteína 4.2 tiene un fenotipo de trans
misión autosómica recesiva que puede resultar de mutaciones en el gen EPB42 o en
el EPB3, en la secuencia que codifica el local de unión de la proteína 4.2 al dominio
citoplásmico de la banda 3.
Eliptocitosis (ElipH) y piropoiquilocitosis hereditarias (PPH)

La ElipH es frecuente en las poblaciones del Mediterráneo y África y se caracteriza por
la presencia de eritrocitos ovalados o elípticos (fig. 18-4). Su expresividad clínica es muy
variable y predominan las formas asintomáticas, por lo que existen muchos casos que no
se detectan. La mayoría de las ElipH presentan una transmisión autosómica dominante:
FIGURA 18-4. Frotis de sangre periférica de una muestra con eliptocitosis hereditaria. A. Forma ligera.
B. Forma severa. C. Piropoiquilocitosis hereditaria.
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los heterocigotos son asintomáticos, sin signos de hemólisis; los homocigotos, o hetero-
cigotos compuestos, suelen tener anemia hemolítica de m oderada a severa.
La PPH es una form a rara de ElipH, que se presenta en el período neonatal con
anemia hemolítica intensa, marcada anisopoiquilocitosis, formas bizarras, esferocitos y
algunos eliptocitos. La transmisión es autosómica recesiva, los padres son heterocigotos
para una mutación que afecta el lugar de unión de los heterodímeros a|3-espectrina,
o uno es heterocigoto para una m utación en el mismo sitio y el otro tiene un alelo de
baja expresión ( a LELYo spectrinstLoms). En la mayoría de los casos la anemia disminuye
de intensidad en los primeros 6 meses de vida y se queda con un cuadro típico de ElipH
con anemia leve o moderada.
La ElipH y la PPH resultan de una pérdida de estabilidad del citoesqueleto de la
membrana, como consecuencia de defectos de interacción horizontal de las proteínas
a-espectrina, (¡J-espectrina y proteína 4.1.
• Déficit de a-espectrina o -espectrina: la mayoría de los casos de ElipH por déficit de es
pectrina son consecuencia de mutaciones en los genes de la a-espectrina (SPTA1) o de
la 0-espectrina (SPTB), que modifican los lugares de unión entre los heterodímeros
de espectrina. La intensidad del cuadro clínico está directamente relacionada con
la cantidad de espectrina en la m embrana y con el porcentaje de heterodímeros. El
porcentaje de dímeros de espectrina depende principalmente de dos factores: la dis
función de la espectrina m utada (las mutaciones próximas al lugar de unión de las
cadenas producen un fenotipo más grave) y la cantidad de espectrina mutada que se
incorpora en la membrana (depende de si existen uno o dos alelos mutados y de la
presencia de alelos de baja expresión). En general, las mutaciones en el gen SPTB cau
san fenotipos de transmisión dominante con expresividad variable, mientras que los
heterocigotos para mutaciones en el gen SPTA1 son asintomáticos y los homocigotos
suelen presentar anemia m oderada o intensa. Una misma m utación puede hallarse
asociada a cuadros clínicos de intensidad variable debido a la herencia conjunta
de alelos de baja expresión. El más frecuente es el polimorfismo a LELY (mutaciones
SPTA1 CD1857 C—>G y nt-12 C —>T en el intrón 45, con skipping parcial del exón
46), con una frecuencia génica estimada del 20 al 30% en algunos grupos étnicos.
Este alelo es silente en estado homocigoto, debido a que las cadenas de a-espectrina
son sintetizadas en exceso y el skipping del exón 46 acontece en apenas el 50% del
ARN. Si se asocia a una mutación estructural del gen a-espectrina, el a LELYmejora
el fenotipo cuando ocurre en cis, pero lo empeora si ocurre en trans, lo que produce
un fenotipo de PPH.
• Déficit de proteína 4.1: produce una marcada inestabilidad del esqueleto de la m em
brana eritrocitaria. En este defecto proteico, los heterocigotos para mutaciones en
el gen EPB41 presentan eliptocitosis intensa, pero sin hemólisis ni aum ento de la
fragilidad osmótica (FO) de la membrana. Los homocigotos presentan una ElipH
moderada a intensa y hemólisis crónica. El déficit de proteína 4.1 es frecuente en
las poblaciones europeas y árabes, pero no se encuentra en poblaciones de origen
africano.
• Déficit de glucoproteína C (GPC): al igual que en el déficit de proteína 4.1, en el de
GPC existe una marcada inestabilidad del esqueleto de la membrana eritrocitaria. El
déficit de GPC se transmite con carácter autosómico recesivo y los pacientes homo-
cigotos o compuestos heterocigotos para mutaciones en el gen GYPC, con déficit
completo de GPC (fenotipo Leach), carecen de antígeno Gerbich. Clínicamente,
el déficit de GPC cursa con ElipH esferocítica y anemia hemolítica moderada con
transmisión recesiva.
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Ovalocitosis del sudeste asiático

También conocida como eliptocitosis estomatocítica, la ovalocitosis del sudeste asiático
(SAO) es una forma de ElipH de elevada prevalencia (del 5 al 25%) en Malasia, Indonesia,
Papúa Nueva Guinea y Filipinas, zonas endémicas de malaria. Su transmisión es auto
sómica dominante y los portadores son asintomáticos o afectos de hemólisis moderada.
No están descritas formas homocigotas, lo que hace suponer que son incompatibles con
la vida (letal in útero). Muchos de los eritrocitos son ovales y presentan una o dos estrías
transversales que dividen el halo claro central (fig. 18-5). Al contrario de otras formas
de eliptocitosis, en la SAO los eritrocitos tienen una m em brana más rígida y menos
deformable, lo que les hace más resistentes al calor y a la crenación. El defecto molecular
se sitúa en el gen EPB3, que presenta dos mutaciones en cis: la deleción de nueve codones
que codifican los aminoácidos 400 a 408, situados en la transición entre los dominios
citoplásmicos y transmembranosos, o la sustitución Lys56Glu (banda 3 Memphis).
Estom atocitosis hereditaria

La hidratación de los eritrocitos depende de la concentración intracelular de los cationes
monovalentes: un aumento intracelular de Na+y K+ hace entrar agua, lo que da origen
a estomatocitos, y la pérdida de Na+ y K+ deshidrata la célula, originando los xerocitos.
La estomatocitosis o hidrocitosis hereditaria (EstH) y la xerocitosis hereditaria (XH)
representan los extremos de las alteraciones de permeabilidad y existen casos clínicos
con características interm edias que pueden ser agrupados en tres subtipos: criohi-
drocitosis, seudohiperpotasemia y xerocitosis estomatocítica. Todas estas patologías,
no bien definidas ni clínica ni molecularmente, presentan una transmisión hereditaria
aparentem ente autosóm ica dom inante y cursan con hemólisis crónica m oderada y
reticulocitosis importante.
• Estomatocitosis o hidrocitosis hereditaria (EstH): la EstH, así llamada por presentar eri
trocitos con palidez central alargada o en forma de «boca» (fig. 18-6), se halla asociada
a una ausencia de estomatina o banda 7.2b (proteína integral de membrana), cuya
función no está aún bien definida. En los estomatocitos, el transporte pasivo de Na+
al interior es mayor que la pérdida de K+, por lo que la célula retiene agua, aumenta
de volumen y se vuelve osmóticamente más frágil. Estos eritrocitos son relativamente
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FIGURA 18-6. Frotis de sangre periférica de muestras con estomatocitosis hereditaria que presentan
numerosos estomatocitos. A. Eritrocitos con palidez central alargada, o en forma de boca, y cup cells.
B y C. Eritrocitos con hemoglobina desplazada lateralmente.
rígidos y necesitan de una elevada cantidad de ATP para bombear el Na+y el K+, con el
fin de mantener la homeostasis. Los estomatocitos son un artefacto frecuente al realizar
la extensión de sangre. Pueden observarse también en la intoxicación alcohólica aguda
con hemólisis leve y después de la administración terapéutica de alcaloides de la vinca.
El cuadro típico de la EstH es el de anemia hemolítica crónica con estomatocitos en
sangre periférica (5-50%), macrocitosis (110-150 fl), disminución de la concentración
de hemoglobina corpuscular media (CMHC) (24-30 g/dl) y aumento de la FO. La es-
plenectomía disminuye el proceso hemolítico, pero está contraindicada porque favorece
un estado de hipercoagulabilidad, con mayor riesgo de padecer trombosis venosas.
Xerocitosis hereditaria (XH): es una anemia hemolítica crónica, en la que los eri
trocitos se deshidratan debido a un aumento de la permeabilidad de la membrana
al K+. Está asociada a un aumento de la fosfatidilcolina, y se desconoce su alteración
molecular. Los eritrocitos tienen un exceso de membrana; son relativamente rígidos,
frágiles y muy sensibles a sustancias oxidantes. La CMHC y el VCM se hallan aumen
tados, la FO disminuida y se observa un aumento de la autohemólisis que se corrige
con la adición de glucosa. La cuantificación de las proteínas de membrana es normal y
la concentración de 2,3-DPG está ligeramente disminuida. En la mayoría de los casos
se observan eritrocitos en diana (codocitos), algunos acantocitos y estomatocitos y,
en los casos más graves, pueden observarse equinocitos (eritrocitos contraídos
y espiculados) y algunos eritrocitos hiperdensos con hemoglobina desplazada late
ralmente (excentrocitos). La esplenectomía no mejora el proceso hemolítico y está igual
mente contraindicada por su asociación a fenómenos tromboembólicos (trombofilia).
La criohidrocitosis, la seudohiperpotasemia y la xerocitosis estomatocítica son tras
tornos de probable transmisión autosómica dominante mal definidos desde el punto
de vista clínico y molecular. Generalmente cursan con hemólisis crónica de intensidad
variable. La criohidrocitosis se caracteriza por estomatocitos, FO normal, sin incuba
ción y autohemólisis aumentada, más intensa a 4 que a 37 °C. La seudohiperpotasemia
es similar a la criohidrocitosis, pero los eritrocitos presentan un mayor grado de
deshidratación y la pérdida de K+ es más acentuada en frío. La cuantificación de K+
plasmático de una muestra de estos pacientes, conservada algunas horas a temperatura
ambiente o refrigerada, muestra valores elevados. En la xerocitosis estomatocítica
predominan los estomatocitos, pero la FO está disminuida (al contrario de lo que
ocurre en la EstH).
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En los síndromes Rh-nulo (Rhnull), en que hay ausencia o disminución de antígenos

Rh, los pacientes tienen una anemia hemolítica que varía de moderada a intensa, carac
terizada por presentar esferocitos y estomatocitos, y FO ligeramente aumentada.
TRASTORNOS ADQUIRIDOS DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO

Las alteraciones estructurales de la membrana de los eritrocitos alteran su conformación,
lo que permite sospechar el diagnóstico con una sencilla observación microscópica de la
morfología de la sangre periférica. Todavía hay otras patologías adquiridas que pueden
causar alteraciones morfológicas semejantes y confundir el diagnóstico.
1. Esferocitos: además de la EH, pueden hallarse esferocitos en algunas enfermedades
como la anemia hemolítica autoinmune, la incompatibilidad ABO en el recién
nacido, las reacciones transfusionales con hemólisis inm une, en las primeras
24-48 h después de quem adura extensa, las sepsis p o r Clostridium welchii o
Clostridium perfringens y las anemias hemolíticas microangiopáticas (microes-
ferocitos). El veneno de algunos reptiles y arañas, así como una picadura masiva
de abejas o de avispas, pueden desencadenar anemia hemolítica esferocítica.
2. Codocitos: los codocitos o hematíes en diana resultan de un aumento de la relación
superficie/volumen de la m em brana del eritrocito. Se asocian a trastornos que
aumentan la bicapa lipídica (como la colestasis hepática, la hipobetalipoprotei-
nemia y el déficit familiar de LCAT), o que disminuyen el volumen eritrocitario
(por disminución de cationes y agua) o de la hemoglobina (ferropenia, talasemia
o algunas otras hemoglobinopatías). El déficit familiar de LCAT es una enfer
medad autosóm ica recesiva, caracterizada p or anemia, opacidad de la córnea,
hiperlipidemia, proteinuria, nefritis crónica y arteriosclerosis precoz. Cursa con
anemia normocrómica ligera o moderada y abundantes codocitos circulantes. La
enfermedad del ojo de pez, un déficit parcial de LCAT, se caracteriza por opacidad
de la córnea, hipertrigliceridemia y niveles muy bajos de HDL.
3. Equinodtos: los equinocitos son eritrocitos que presentan pequeñas prolongaciones
de la membrana regularmente distribuidas en toda la superficie y constituyen un
trastorno relativamente frecuente en la práctica del laboratorio. En la mayoría de
los casos es un artefacto en extensiones mal preparadas o por empleo de sangre
envejecida, por lo que es aconsejable exam inar siempre extensiones de buena
caüdad, realizadas poco después de la recogida de la sangre. Los equinocitos pueden
ser inducidos por factores diversos, intra- o extraeritrocitarios. Entre los factores
intraeritrocitarios destacan los trastornos congénitos del metabolismo que afectan
fundamentalmente a la función normal de la glucólisis anaerobia: déficit congénito
de piruvato cinasa (PK) o de cualquier otra enzima capaz de bloquear la producción
normal de ATP por el eritrocito. Generalmente, solo son observados después de es-
plenectomía. Entre las causas extraeritrocitarias cabe mencionar la hipofosfatemia,
la uremia y la hemólisis mecánica producida por ejercicio muscular extenuante
(atletas). Los equinocitos se observan también en algunos enfermos con anemia
hemolítica microangiopática y en los recién nacidos, en especial en los prematuros.
4. Acantocitos: los acantocitos son eritrocitos con prolongaciones de la membrana de
base amplia, diferentes tamaños y distribución irregular. Pueden observarse en el
hipotiroidismo, las enfermedades hepatocelulares graves (spur cells), el síndrome
de Zieve, la picnocitosis infantil, la anorexia nerviosa grave, el ayuno prolongado
o la m alnutrición, la abetalipoproteinem ia, la corea amiotrófica, el síndrome
McLeod (ausencia del precursor Kx del antígeno Kell) y el fenotipo Lutheran nulo
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Lua-b_. Los enfermos con hipotiroidismo tienen con mucha frecuencia acantocitos
«en dedo de guante», y es aconsejable practicar las pruebas de la función tiroidea
en todos aquellos enfermos que muestren acantocitosis.
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES

DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO
El diagnóstico de las enfermedades más frecuentes de la m embrana del eritrocito como,
por ejemplo, la EH y la ElipH, se basa en los datos aportados p or la historia clínica del
paciente y su familia, el hemograma (incluido el recuento de reticulocitos) y la observa
ción morfológica de la sangre periférica, que se complementan con las siguientes pruebas
de laboratorio denominadas «de hemólisis no inmune»:
1. La FO de los eritrocitos (o resistencia osmótica eritrocitaria), dependiente de la
relación superficie/volumen, que incluye la prueba de la lisis en glicerol acidificado
(AGLT) y la prueba de pink.
2. La susceptibilidad de los eritrocitos a la criofragmentación, o criotest.
3. La cuantificación de la banda 3 en la membrana de los eritrocitos mediante medida
de la fluorescencia con eosina-5’-maleimida (EMA), para el empleo de un equipo de
citometría de flujo.
La elección de las pruebas de laboratorio más apropiadas para el diagnóstico de EH
se basa en su sensibilidad y especificidad, pero también en la complejidad y coste de los
procedimientos. Las pruebas más sensibles y específicas para el diagnóstico de EH son la
AGLT, el criotest y la EMA, y emplearlas conjuntamente mejora la capacidad diagnóstica,
incluso en formas poco expresivas de EH. Empleadas por separado, no permiten sacar
conclusiones en un número significativo de casos.
El empleo de analizadores hematológicos autom atizados de últim a generación,
utilizando diferentes principios para el análisis celular, perm ite obtener u na elevada
variabilidad de mediciones celulares, algunas de las cuales (referidas exclusivamente a los
eritrocitos) son de gran utilidad en el diagnóstico de las anemias. Así, en la EH se detecta
un elevado porcentaje de hematíes hipercrómicos (aumento de la HCM y CMHC), y el
gráfico de dispersión de la concentración de hemoglobina corpuscular (CHC) frente al
volumen celular (VC) (fig. 18-7, A), así como el histograma de distribución de la CHC
(fig. 18-7, B) m uestran configuraciones muy características que indican la presencia de
esferocitos. De esta forma, estos instrumentos constituyen, hoy en día, un procedimiento
al alcance de muchos laboratorios para el cribado de la EH (v. capítulo 5).
La medida de la deformabilidad eritrocitaria, mediante viscosimetría o ectacitometría
de gradiente osmótico, es una tecnología muy sofisticada que permite hacer el diagnóstico
diferencial de muchas de las enfermedades de la membrana eritrocitaria. Los eritrocitos
son incubados en soluciones con un amplio intervalo osmótico (de concentraciones muy
hipotónicas a hipertónicas) y sujetos a condiciones de estrés mecánico (shear-stress), lo
que permite establecer una curva de deformabilidad, que varía en función de la relación
superficie-volumen del eritrocito, de su estado de hidratación y del contenido hemo
globínico. La curva es comparada con los perfiles de deformabilidad establecidos para
las diferentes alteraciones del eritrocito. Desgraciadamente, esta tecnología solo está al
alcance de unos pocos laboratorios altamente especializados o de investigación.
C uando se detecta alguna alteración que hace sospechar un defecto de proteínas
de m embrana eritrocitaria, resulta im portante identificar cuál es la proteína afectada
mediante electroforesis en poliacrilamida (PAGE) y dodecilsufato sódico (SDS), lo que
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FIGURA 18-7. A. Gráfico de

dispersión de la concentración
de hemoglobina corpuscular (CHC)
(g/dl) frente al volumen globular (fl)
en una muestra normal (1) y una
muestra con EH (2). Los eritrocitos
hipercrómicos se encuentran a la
derecha del eje que indica CHC 41 g/dl.
B . Histograma de distribución de la
concentración de hemoglobina
corpuscular (CHC): 1, muestra
normal; 2 y 3, muestras con EH;
4, muestra con anemia hemolítica
autoinmune (AHAI). En la EH
y en la AHAI se observa un claro
desplazamiento de la curva en relación
al eje X, en el punto de intersección
con el eje derecho, que está en
relación con el número de esferocitos
presentes en la muestra. (Adaptado de
Cell-Dyn Sapphire, Abbott Diagnostics,
California.)
se conoce como SDS-PAGE. Mediante este procedimiento se puede realizar el análisis

cuantitativo y cualitativo de las principales proteínas estructurales que forman la mem
brana de los eritrocitos.
Un paso más es la identificación de mutaciones de los genes que codifican las pro
teínas de la membrana, pero solo está justificada en casos m uy concretos o de elevada
complejidad, o bien cuando se desea realizar un diagnóstico prenatal. Estos estudios
permiten elucidar la base genética de la variabilidad fenotípica en diferentes pacientes de
una misma familia, confirmar mutaciones recesivas o de novo cuando los progenitores
son aparentemente normales, y hacer el diagnóstico prenatal cuando hay riesgo de que
nazca un niño con una forma muy grave de EH.
Debido a su complejidad y precio, los estudios de las proteínas de la membrana eri
trocitaria y los estudios moleculares de los genes que codifican estas proteínas se efectúan
solamente en centros especializados o de referencia.
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Fragilidad osm ótica eritrocitaria (FO)

La prueba de la FO evalúa la capacidad de resistencia de los eritrocitos al efecto de diferentes
grados de hipotonía del medio; depende de la relación existente entre superficie y volumen
eritrocitario, y de la CMHC. Los eritrocitos normales pueden aceptar, sin hemolizar, una
entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta en un 70%, mientras que los es-
ferocitos, con una relación superficie/volumen disminuida, tienen una capacidad mucho
m enor y hemolizan en soluciones salinas de m enor hipotonía, es decir, más próximas
al suero fisiológico. El aumento de la FO de los esferocitos condiciona su forma esférica
(menor relación superficie/volumen), independientemente de la causa de la esferocitosis.
Para realizar la prueba de FO se incuban pequeños volúmenes de sangre en soluciones
salinas con un gradiente de concentración de isotónico a hipotónico, y la hemólisis en
cada uno de los tubos se determina mediante espectrofotometría. La prueba se realiza
a tem peratura ambiente (prueba inmediata) y después de 24 h de incubación a 37 °C
(prueba incubada), y los resultados se representan mediante una gráfica que tiene forma
sigmoide (fig. 18-8). Los eritrocitos con alteraciones de la membrana muestran una FO
más aumentada después de la incubación durante 24 h a 37 °C, lo que incrementa la
sensibilidad de la prueba. Ello obedece al aumento del volumen de la célula producido
por un exceso de entrada de sodio que supera la pérdida de potasio, ya que con la
incubación se produce un fallo del transporte iónico secundario a la disminución de
glucosa del medio, imprescindible para el mantenimiento del ATP, o energía celular.
Muestra de sangre total

Se utiliza sangre heparinizada. No deben utilizarse anticoagulantes como oxalato, el
EDTA o citrato, debido a su efecto sobre la concentración salina del medio hipotónico.
La prueba de FO inmediata (determinación mediante sangre recién extraída) debe
realizarse dentro de las 2 h de practicada la extracción, o dentro de las primeras 6 h si la
1 2 3 3,5 4 4 ,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 10 NaCl (g %o)
FIGURA 18-8. Representación gráfica de la curva de la fragilidad osmótica eritrocitaria a temperatura

ambiente inmediata (líneas continuas) y tras 24 h de incubación (líneas de puntos). La curva continua y la
curva de puntos a la izquierda corresponden a una muestra normal; la curva continua y la curva de puntos
a la derecha corresponden a una muestra con esferocitosis hereditaria.
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sangre se ha conservado a 4 °C. La muestra del paciente debe ser procesada siempre en
paralelo con un control normal recogido en las mismas condiciones.
Reactivos
Solución madre: cloruro de sodio (NaCl) a 100 g/1
Se prepara como sigue:
• NaCl, 100 g.
• H20 bidestilada, c.s.p. 1.000 mi.
Bien tapada y a 4 °C esta solución se conserva durante varios meses. Pueden formarse
cristales de sal que deben ser cuidadosamente disueltos antes de usar la solución.
Soluciones de trabajo
Se preparan a p a rtir de la solución m adre m ediante diluciones graduales en agua
bidestilada:
• Concentración 1:100.
• 1 g/1 solución madre, 1 mi.
• H 20 bidestilada, c.s.p. 100 mi.
Se hace un gradiente de diluciones en los otros tubos:
2:100; 3:100; 3,5:100; 4:100; 4,5:100; 5:100; 5,5:100; 6:100; 6,5:100; 7:100; 7,5:100;
8:100; 8,5:100; 9:100; 10:100.
Las concentraciones finales de NaCl (g/1) son: 1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5;
8; 8,5; 9 y 10.
Estas soluciones, una vez preparadas, pueden mantenerse durante varias semanas a
4 °C, aunque se debe prestar especial atención a la formación de hongos, ya que, en ese
caso, la solución debe ser descartada.
Método
Sangre heparinizada, 2 mi.
La determinación de la FO se realiza a partir de sangre recién extraída (FO inmediata)
y después de su incubación durante 24 h a 37 °C (FO incubada).
Una vez preparadas las soluciones hipotónicas, se procede según la siguiente meto
dología:
1. Se colocan 5 mi de cada una de las soluciones hipotónicas en una batería de tubos
de centrífuga, dispuestos en una gradilla (1; 2; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8;
8,5; 9 y 10 [g/1]), y a continuación se añaden a cada uno 0,05 mi (50 |xl) de sangre
total. Después de agitar suavemente todos los tubos p o r inversión (el mismo
núm ero de veces cada uno de ellos), se dejan a la tem peratura del laboratorio
(25 °C) durante 30 min.
2. Transcurrido este el tiempo, los tubos se centrifugan a 2.500 r.p.m. durante 5 min
y, a continuación, se separa el sobrenadante.
3. El grado de hemólisis presente en cada sobrenadante se determina mediante la lectura
de DO en un espectrofotómetro (540 nm), considerando como el 100% de hemólisis
el tubo con 1 g/1 de NaCl y el 0% (blanco) el tubo con 10 g/1 de NaCl (tubo 1).
La prueba de FO incubada debe hacerse con 1-2 mi de sangre heparinizada incubada
a 37 °C durante 24 h. La metodología es exactamente la misma que la descrita para la
prueba inmediata.
En el cuadro 18-1 se presentan las diferentes causas de error que pueden alterar el
resultado de la FO.
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CUADRO 18-1. Causas de error en la determinación de la fragilidad osmótica
Empleo de otros anticoagulantes distintos a la heparina.

Defecto en la preparación de las soluciones hipotónicas.
• Variaciones en la temperatura ambiente.
Diferentes cantidades de sangre en cada tubo.
Diferentes volúmenes de salino en cada tubo.
• Variaciones del pH de las soluciones hipotónicas.
La relación entre el volumen de la sangre y el volumen de la solución salina entre los
diferentes tubos. La proporción de 1 (volumen de sangre) por 100 (volumen de salino) es la
ideal para que la cantidad de plasma no interfiera en la concentración final de la solución.

En m uestra con eritrocitos normales, la form a sigmoidea de la curva indica que las
células normales varían en su resistencia en soluciones hipotónicas en función de su
juventud, de forma que los hematíes más viejos son los menos resistentes, porque tienen
un contenido de sodio más elevado. Los reticulocitos, de tamaño más elevado y menor
contenido hemoglobínico que los hematíes maduros, son más resistentes a la hemólisis
hipotónica, por lo que una intensa reticulocitosis puede llegar a enmascarar un aumento
de la FO y hacer que esta tenga valores normales.
Los valores de referencia de la FO (antes y después de la incubación) están representa
dos en la tabla 18-2. La forma de la curva sigmoidea ofrece una información importante,
porque pone de relieve la heterogeneidad de la FO de la población de eritrocitos analizada
y contribuye al diagnóstico diferencial con otras enfermedades que pueden acompañarse
de alteraciones en la FO (cuadro 18-2). Sin incubación, la FO suele ser norm al en un
10-20% de los casos de EH, mientras que tras incubación de la sangre durante 24 h a
37 °C aum enta la sensibilidad y disminuye el porcentaje de resultados normales. Con
todo, aún persiste un porcentaje relativamente importante de «falsos negativos».
TABLA 18-2. Valores de referencia de la fragilidad osm ótica (%) a diferentes

concentraciones de NaCl (en g/1)
NaCl H em ólisis inmediata Hem ólisis incubada

(sin incubar) (%) (24 h a 37 °C) (%)
2 95-100 97-100
3 97-100 83-100
3,5 88-100 88-99
4 50-85 84-98
4,5 5,55 77-97
5 0-5 47-85
5,5 0 15-55
6 0 0-32
6,5 0 0-10
7 0 0-6
7,5 0 0-5
8 0 0-3
8,5 0 0
9 0 0
Hemólisis al 50% (H ) 3,6-4,2 4,5-5,2
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CUADRO 18-2. Enferm edades q u e c u rsa n con alteraciones d e la fragilidad osm ó tica
A u m e n to d e la F O
• Esferocitosis hereditaria
• Eliptocitosis hereditaria (FO norm al en las E lipH sin hemólisis)
• Estom atocitosis hereditaria o hidrocitosis (C M H C baja)
• A nem ia hem olítica autoinm u n e
D is m in u c ió n d e la F O
• Talasemias
• Anem ia ferropénica
• Xerocitosis hereditaria (C M H C elevada)
En la EH toda la curva suele hallarse desplazada hacia la derecha, pero a veces está muy
poco desplazada y solo se observa una pequeña «cola» de células con FO muy aumentada que
corresponde a una población muy frágil de esferocitos. Esta imagen, frecuente en pacientes
con EH no esplenectomizados, suele desaparecer con la esplenectomía, porque la población de
células se hace más homogénea y la curva muestra una imagen de mayor continuidad desde
los más frágiles a los de menor FO normales. Los hematíes de pacientes esplenectomizados
muestran un aumento de superficie, lo que los hace más resistentes a hemólisis hipotónica.
Una FO disminuida indica la presencia de eritrocitos con relación superficie/volumen
aumentada, tal como sucede en la ferropenia o la talasemia. Cuando la EH se asocia a
hipocromía (ferropenia o talasemia), el valor de la FO puede resultar falsamente normal,
debido a que la hipocromía disminuye la FO.
En la interpretación de FO debe recordarse que, además de la esferocitosis, existen
otras situaciones que pueden acompañarse de FO anormal, lo que invariablemente indica
la presencia de eritrocitos anormales; una FO en el rango de la normalidad no significa
que los eritrocitos sean normales. Las principales situaciones patológicas que suelen
acompañarse de una FO alterada se resumen en el cuadro 18-2.
En la anem ia hem olítica autoinm une gran parte de la curva puede ser norm al,
pero con una «cola» de células más frágiles que corresponden a los esferocitos. En las
anemias hemolíticas por déficits enzimáticos de la vía glucolítica la curva de FO puede
ser anormal, en especial en los casos más graves, debido a la presencia de reticulocitos
(«cola» de células más resistentes) y de células más frágiles.
Prueba de lisis en glicerol acidificado

La AGLT es una forma de m edir la fragilidad eritrocitaria, y en ella se registra el tiempo
(en segundos) que tarda en producirse el 50% de la hemólisis de los eritrocitos cuando
se incuban en un medio hipotónico acidificado salino-glicerol (AGLT50). El glicerol dis
minuye la entrada de agua en los eritrocitos, lo que permite un registro continuo de la
hemólisis mediante u n espectrofotómetro (fig. 18-9).
El principio es el mismo que en la FO: los eritrocitos con disminución de la relación super
ficie/volumen (esferocitos) resisten menos a la entrada de moléculas de agua que los eritrocitos
normales y, por tanto, sucede siempre que existan esferocitos circulantes, independientemente
de su causa. Un valor normal de AGLT50 es siempre superior a 1.800 s y en la EH disminuye.

Se tom an 2 mi de sangre total en EDTA. La prueba debe hacerse siempre frente a un
espécimen de sangre control.
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Tiempo
FIGU RA 18-9. Representación gráfica del test de hemólisis en glicerol acidificado, ctr, muestra control
normal; EH, muestra con esferocitosis hereditaria.
Reactivos
• Tampón de fosfato salino pH 6,9 (solución A):
• Fosfato dihidrógeno potásico (KH2P 0 4) 0,1 M, 0,63 g.
• Fosfato disódico (Na2H P 0 4) 0,1 M, 1,3 g.
• Cloruro sódico (NaCl) 0,15 M, 8,1 g.
• Solución de glicerol (solución B):
• Glicerol, 2,2 mi.
• Tampón de fosfato salino pH 6,9,30 mi.
• H20 bidestilada, c.s.p. 67,8 mi.
Método
Los reactivos deben estar a temperatura ambiente y el espectrofotómetro equilibrado a
625 nm, mediante un blanco (1 mi de solución A + 2 mi de solución B), en modo cinético
(absorbancia/tiempo). La sistemática que se debe seguir es la siguiente:
1. En un tubo se introducen 5 mi de solución A, pH 6,9 (el pH de la solución es muy
importante para la fidelidad de los resultados).
2. Se añaden 20 (xl de sangre total y se mezcla con cuidado.
3. Se pipetea 1 mi de la suspensión y se introduce en la cubeta de lectura de un es
pectrofotómetro equipado con registro lineal-logarítmico.
4. Se coloca en la largura de onda 625 nm, se ajusta el cero de DO mediante el blanco
de referencia.
5. Se añaden 2 mi de la solución de glicerol.
6. Se mezcla con cuidado y se lee inmediatamente la DO.
7. Se anotan los valores de DO hasta los 6 min y se mide el tiempo necesario para
alcanzar la mitad de la absorbancia inicial.
La hemólisis es cuantificada por la turbidez de la solución. Los resultados son ex
presados en el tiempo necesario para que la densidad óptica disminuya a la m itad del
valor inicial (AGLT50).
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Una solución con eritrocitos normales tarda más de 30 min (1.800 s) en alcanzar el 50%
de la hemólisis (AGLT50). Este valor es similar en la sangre de un adulto normal, de un
recién nacido o en la sangre de cordón umbilical.
En la EH el AGLT50 varía entre 25 y 150 s. El AGLT50 disminuido también se puede
encontrar en pacientes con insuficiencia renal crónica, leucemias crónicas, anemias
hemolíticas autoinmunes y en algunas mujeres embarazadas.
El AGLT es un buen test de cribado: es sencillo, no es caro y utiliza una pequeña
cantidad de sangre, que puede ser procesada hasta 24 h después de recogida, con resul
tados fiables.
Prueba de p in k (pink test)

Es una prueba complementaria de la AGLT. Se considera más sensible, pero algo menos
específica. Según algunos autores, es más reproducible que la AGLT, por lo que se con
sidera más recomendable su uso en el laboratorio clínico general. La principal diferencia
con respecto a la AGLT es que se emplea el tam pón Bis-Tris en lugar de tam pón fosfato,
y el pH ha de ajustarse exactamente a 6,6.

Se mezclan 3 mi de sangre total con heparina o EDTA. La prueba debe hacerse siempre
frente a un espécimen de sangre control.
Reactivos
• Solución amortiguadora (esta solución se conserva a 4 °C indefinidamente):
• Bis-Tris 70 mM /1,14,6 g.
• NaCl 25 mM /1,1,46 g.
• Azida sódica 1,5 mM /1,0,1 g.
• Glicerol 135 mM /1,12,43 g.
• Agua bidestilada, c.s.p. 1.000 mi.
• Se ajusta el pH a 6,6 con HC1 concentrado y la osmolaridad a 290 ± 5 Osm/1 con
NaCl al 30%.
• Solución hemolizante:
• Tritón X-100 al 2% en agua destilada.
Método
Los reactivos deben estar a temperatura ambiente:
1. Se introducen en un tubo de centrífuga 3 mi de solución tampón.
2. Se añaden 10 (xl de sangre total.
3. Se mezcla cuidadosamente y se incuba a tem peratura ambiente durante 40 o
45 min.
4. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 10 min.
5. Se lee la densidad óptica del sobrenadante a 540 nm y se devuelve al tubo
correspondiente.
6. Se añaden al tubo dos gotas de solución hemolizante.
7. Se agita hasta conseguir la hemólisis completa de los eritrocitos.
8. Después de 5 m in se lee la DO a 540 nm (DO del hemolizado).
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9. Se calcula el resultado aplicando la fórmula siguiente:
Hemólisis (%) = DO del sobrenadante x ÍOO/DO del hemolizado

En los sujetos normales, el porcentaje de la hemólisis es siempre inferior al 25%. En la
EH y otras enfermedades que cursan con esferocitos circulantes, este valor puede ser
superior al 60%. La prueba de pink suele aumentar en el fallo renal, la anemia hemolítica
autoinmune y en mujeres embarazadas.
En esta prueba el pH de la solución no es tan im portante como en la AGLT; por eso
se considera más reproducible. Dada su gran asequibilidad, se considera u na prueba
muy recomendable para detectar la existencia de EH.
P rueba de la criohem ólisis (criotest)

La prueba de la criohem ólisis se basa en la m ayor susceptibilidad a la ro tu ra por
efecto del frío que tienen los eritrocitos con alteraciones proteicas de m em brana.
Al contrario de las pruebas de FO, cuyo resultado aum enta independientem ente
de la causa de la esferocitosis, el criotest es independiente de la relación superficie/
volumen eritrocitario, lo que aum enta su especificidad para el diagnóstico de la EH.
Su sensibilidad se ha descrito inicialmente como del 100% y su especificidad del 90%,
aunque todavía no existen resultados concluyentes. En la anem ia diseritropoyética
congénita tipo II (CDA-II), en la SAO y en la EstH, el criotest suele ser positivo.
Teniendo en cuenta que estas son enferm edades raras y que el procedim iento es
sencillo y económ ico, el c rio test se considera u n a b u en a p ru e b a de lab o ratorio
general para el cribado de la EH.

La prueba puede realizarse en una muestra de sangre en EDTA hasta 1 día después de
recogida. Se debe usar siempre un control norm al y, si es posible, un control positivo
con EH, procesado en las mismas condiciones.
Reactivos
• Tampón fosfato 50 mmol/1, pH 7,4:
• Na2H P 0 4, 0,72 g.
• H20 destilada, 60 mi.
• Se ajusta el pH a 7,4 con un fosfato ácido (NaH2P 0 4. H20 50 mmol/1).
• H20 destilada, c.s.p. 100 mi.
• Tampón 0,7 mol/1 de sacarosa:
• Sacarosa, 23,96 g.
• Tampón fosfato 50 mmol/1 pH 7,4,100 mi.
Esta solución puede ser congelada en alícuotas de 2 mi preparados para usar.
Método
1. Se lavan los eritrocitos tres veces con salino frío (NaCl 9 g/1 a 4 °C, 2.500
r.p.m./5 min). Se hace una suspensión de células del 50% en la solución salina y
se m antiene en hielo hasta el análisis.
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2. Se preparan dos tubos con 2 m i de la solución tampón (0,7 mol/1 de sacarosa) y

se colocan 10 min a 37 °C para equilibrar la temperatura.
3. Se pipetean 50 |xl de la suspensión celular en cada uno de los dos tubos con la
solución caliente (Al y A2), se agita de inmediato unos segundos en el vórtex y
luego se calienta durante exactamente 10 m in a 37 °C.
4. De inmediato se trasfieren los tubos para un baño de hielo (0 °C) durante 10 min
exactos. Se agitan en el vórtex durante unos segundos y luego se centrifugan (2.500
r.p.m./5 min) para sedimentar las células restantes.
5. Se prepara una solución con un 100% de hemólisis pipeteando 50 (xl de la muestra
original para 2 mi de agua. Se centrifuga y se diluyen 200 |xl del sobrenadante en
4 mi de agua (A3).
6. Se lee la absorbancia a 540 nm de las dos pruebas (Al y A2) y de la muestra con
el 100% de lisis (A3).
, ... . Media de las 2 absorbancias Al yA 2
Calculo de lisis: % cnohemólisis = ------------------------------------------- -------- x 21
Absorbancias con 100% de hemólisis A3

Son considerados valores normales de lisis entre el 3 y el 15%; en la EH la lisis es >20%.
Considerando las características de la técnica, se recomienda que cada laboratorio
encuentre sus valores de referencia.
Las causas de error pueden ser una deficiente preparación de la solución madre de
tam pón fosfato-sacarosa o la falta de precisión en el tiempo de incubación.
C itom etría de flujo con eosina-S’-m aleim ida (EMA)

La evaluación m ediante citom etría de flujo de la fluorescencia de la EMA en los
eritrocitos es u na prueba muy sensible (92,7%) y específica (99,1%) para el diagnós
tico de EH.
En presencia de EMA, alrededor de un 80% de esta substancia se une, m ediante
enlaces covalentes, al g rupo e -N H 2 de la Lys-430, localizada en la p rim era ansa
extracelular de la proteína banda 3, y el 20% restante a proteínas del complejo Rh
y CD47. En la EH la fluorescencia media está dism inuida respecto a los controles
norm ales, independientem ente de la p ro teín a de la m em brana que esté afectada
(fig. 18-10).
La elevada especificidad de esta prueba obedece a que en la EH la unión de la EMA a
las proteínas integrales de la membrana interacciona directamente con el citoesqueleto
eritrocitario, mientras que en otras enfermedades con esferocitosis pero sin alteración
proteica del citoesqueleto (p. ej., anemia hemolítica autoinm une) no sucede así y el
resultado de la prueba es normal. No obstante, en algunas enfermedades raras, como
la PPH, la CDA-II, la criohidrocitosis y la SAO, puede observarse una moderada dis
minución del valor medio de fluorescencia. Por el contrario, en ciertas EH con hemólisis
compensada (sin anemia) o acompañadas de macrocitosis, la prueba de EMA suele ser
normal.
Muestras
Muestras de sangre periférica en EDTA-K3, máximo 48 h después de haber sido recogida,
conservadas a 4 °C.
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A B
FIGU RA 18-10. A. Histograma de fluorescencia de eritrocitos marcados con eosina-5-maleimida (EMA)

en una muestra normal y en otra con esferocitosis hereditaria (EH). La intensidad media de fluorescencia
(MFI) es menor en la EH que en la muestra normal. B. Muestra de un paciente de EH con ausencia de banda 3
en régimen hipertransfusional. La doble población corresponde a los eritrocitos del paciente (1), con MFI
muy baja, y a los eritrocitos trasfundidos (2). (Adaptado de Cytomics FC500, da Beckman-Coulter.)
En cada ensayo se deben usar seis muestras control con parámetros hematológicos
normales y, si es posible, un control con EH recogido en las mismas condiciones. Hay
que tener en cuenta si ha habido transfusiones previas.
Reactivos
1. EMA
(a) Preparación de la solución madre: Concentración final (Cf) = 1 mg/ml EMA
en tampón PBS.
(b) Se almacena congelado a —80 °C en alícuotas de 2 mi en la oscuridad, porque
el colorante es sensible a luz y la temperatura. Estabilidad de, aproximada
mente, 4 meses.
(c) Solución de trabajo: C f = 0,5 mg/ml EMA en tampón PBS.
(d) Esta solución debe ser preparada solo en el m om ento de su utilización
Ci X Vi = C f X V f (concentración inicial X volumen inicial = concentración
final X volumen final).
2. Solución de albúmina (BSA) al 30%:
(a) Disponible comercialmente. Diluir a 0,5% en PBS.
3. Tampón fosfato (PBS):
(a) Pastillas disponibles comercialmente para disolver en agua. Alternativamente
se puede preparar, en partes iguales, tampón fosfato isoosmótico y NaCl 9 g/1.
(b) Tampón fosfato isoosmótico, pH 7,2:
(i) NaH2P 0 4.2 H 20 (150 mmol/1), 23,4 g/1.
(ii) NaH2P 0 4 (150 mmol/1), 21,3 g/1.
(c) Se añaden 24 mi de reactivo A a 76 m i de reactivo B.
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Equipamiento
• Citómetro de flujo.
• Centrífuga.
• Agitador mecánico.
• Pipetas.
• Tubos de citometría de flujo.
Método
1. Se pipetean 50 |xl de sangre en EDTA para un tubo.
2. Se lavan las células tres veces con PBS (3 m in a 2.500 r.p.m.).
3. En un tubo de citometría de flujo se pipetean 25 |xl de la solución de trabajo EMA
(0,5 mg/ml), previamente descongelada en oscuridad y preparada, y 5 (xl de las
células previamente lavadas.
4. Se homogeniza bien.
5. Se incuba en oscuridad, a temperatura ambiente. Media hora después, se hom o
geniza de nuevo la mezcla y se incuba durante media hora más.
6. Se centrifugan los tubos 20 s a 5.000 r.p.m.
7. Se retira con cuidado el exceso de sobrenadante que contiene el colorante no ligado.
8. Se lava tres veces con PBS/BSA el pellet de células marcadas. En la últim a cen
trifugación el sobrenadante debe quedar incoloro. Si la lectura en el citómetro es
inmediata, se pueden lavar las células solamente con PBS, sin BSA.
9. Se resuspenden las células marcadas en 1,5 mi de PBS/BSA (o solo PBS, si la lectura
es inmediata).
10. Se leen en el citómetro de flujo las muestras y controles, con adquisición de 15.000
eventos. Se hace un gate para los eritrocitos en log forward scatter (FS)/log side
scatter (SS).
11. Se determina la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las muestras y con
troles en FL1 (fluorescencia verde).
Cálculo del resultado:
Los resultados deben expresarse como la razón de las MFI obtenidas en las muestras
y los controles normales:
_ . MFI de la muestra
Razón= -------------------------------------
MFI media de los 6 controles

En general, el punto de corte para el diagnóstico de EH es de 0,8. Sin embargo, cada
laboratorio debe establecer sus propios valores de referencia para cada citómetro de
flujo utilizado, así como su punto de corte para el diagnóstico de la EH y la respectiva
sensibilidad y especificidad de la técnica.
Las causas de error más frecuentes son el deterioro de las muestras y/o del EMA, por
conservación inadecuada, y la demora entre la preparación de las muestras y la lectura
en el citómetro de flujo.
Electroforesis de proteínas de m em brana eritrocitaria

El estudio de las proteínas de la membrana por electroforesis en en gel de poliacrilamida
y dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), con cuantificación por densitometría, permite un
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FIGURA 18-11. Electroforesis de proteínas de la membrana eritrocitaria (SDS-PAGE): método Laemmli

(electroforesis de gradiente lineal) y método Fairbanks (electroforesis de gradiente exponencial). (Por
cortesía de Helena Almeida, Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra.)
análisis cuantitativo y/o cualitativo de las principales proteínas estructurales: a y 0-espec-

trinas, anquirina, banda 3, proteína 4.1, proteína 4.2, actina, estomatina y glucoforinas.
Es una técnica muy sensible, que requiere un procedimiento muy estricto y que solo
está al alcance de laboratorios especializados. En la inmensa mayoría de los casos, este
estudio no es necesario para el diagnóstico, pero es muy útil para elucidar casos más
complejos de EH, ElipH o EstH. En la CDA tipo II la banda 3 es más estrecha y tiene una
migración más rápida de la normal en SDS-PAGE, debido a una m enor glucosilación.
En los raros casos en que son necesarios estudios moleculares (p. ej., si estuviera
indicado el diagnóstico prenatal, o en el estudio de proteínas de m embrana por SDS-
PAGE) es imprescindible la identificación de la proteína afectada.
Son dos los métodos comúnmente empleados: la electroforesis de gradiente lineal
(5-15%), según Laemmli, y la electroforesis de gradiente exponencial (3,5-17%), según
Fairbanks (fig. 18-11).

Se toma una muestra de 2-5 mi de sangre en EDTA. Se conserva a 4 °C y se hace la extrac
ción de las membranas de los eritrocitos en las 48 h posteriores a la recogida de la muestra.
Para cada electroforesis se deben analizar cuatro m uestras control además de la
muestra del paciente.
Método
Los métodos de Laemmli y de Fairbanks comparten el procedimiento, aunque difieren
en los reactivos y las concentraciones utilizadas. Se describen a continuación, indicando
las variantes correspondientes para cada uno de los métodos.
Los procedimientos comprenden:
1. Extracción de las proteínas de m embrana por lisis hipotónica.
2. Cuantificación de las proteínas por el método de Lowry.
3. Solubilización de las proteínas.
4. Electroforesis en SDS-PAGE de gradiente lineal y exponencial (según Laemmli y
Fairbanks).
5. Coloración, fijación y tinción de la placa de electroforesis con azul de Coomassie.
6. Cuantificación de las fracciones proteicas mediante densitometría.
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Preparación del tampón P 0 4 500 mM a pH 8 necesario a extracción, cuantificación

y solubilización de las proteínas de la membrana:
• Tampón P 0 4 (500 mM, pH 8):
• Na2H P 0 4 500 mM, 71 g.
• H20 destilada, 900 mi.
• Ajustar el pH 8 con un fosfato ácido NaH2P 0 4. H20 , 500 mM/1:
• H20 destilada, c.s.p. 1.000 mi.
Extracción de las proteínas de membrana por lisis hipotónica

Reactivos
Se preparan 30 m in antes y se guardan en hielo.
• Tampón A: tampón de lavado (PBS):
• Tampón P 0 4 500 mM, pH 8,2 mi.
• NaCl 1,5 M, 20 mi.
• Tampón B: tam pón de lisis:
• Tampón P 0 4 500 mM, pH 8,1 mi.
• PMSF 200 mM, 150 |xl.
• Solución de PMSF (fenilmetano sulfonil fluoruro) 200 mM:
• PMSF (PM 174,2), 0,871 g/25 m i de etanol absoluto.
• Se guarda en alícuotas a -2 0 °C.
• Tampón C: tampón de lavado de m embranas (P 0 4Na 5 mM pH 8):
• Tampón P 0 4 500 mM, pH 8,2 mi.
Procedimiento
1. Lavado de los eritrocitos. Se lavan los eritrocitos tres veces con el tam pón A
(10 min/10.000 r.p.m. a 4 °C).
2. Preparación del hemolizado:
(a) Se toma 1 ml del concentrado de eritrocitos (previamente lavado y agitado
en vórtex) y se añade a 20 mi de tam pón de lisis (tampón B) a 4 °C para que
se produzca una lisis hipotónica (proporción exacta).
(b) Se agita en el vórtex. Se deja durante 10 min a 4 °C (hielo).
(c) Se centrifuga a 15.000 r.p.m. a 4 °C durante 10 min.
(d) Se retira suavemente el sobrenadante procurando no alterar la capa de mem
branas que se ha formado.
3. Lavado de las membranas. Se lavan las membranas tres veces consecutivas me
diante tam pón fosfato (P 0 4) 5 mM (tampón C). En la última centrifugación las
membranas deben quedar como una pastilla blanca de precipitación en el fondo
del tubo. En el último lavado se debe aspirar muy bien el tampón. Se guardan las
membranas en alícuotas a —80 °C.
Cuantificación de las proteínas por el método de Lowry

La concentración proteica de las membranas se determina mediante el método colorimé-
trico de Lowry utilizando seroalbúmina bovina (BSA) como estándar. En presencia de
iones de cobre (Cu2+) y reactivo de Folin las proteínas adquieren color con una intensidad
proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra. Los reactivos se encuentran
estandarizados comercialmente en el Protein Assay Lowry membranes Kit.
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TABLA 18-3. Elaboración de la curva de calibración para la medida de la concentración

de proteínas
Tubos 0 1 2 3 4
H 20 bidestilada 50 (xl 40 |xl 30 |xl 20 m-1 10 |xl
BSA mg/ml 0 |xl 10 |xl 20 |xl 30 n,l 40 |xl
Solución A + S 250 (xl 250 |xl 250 |jl1 250 jjlI 250 |jl1
Solución B (reactivo de Folin) 2 mi 2 mi 2 mi 2 mi 2 mi
Proteínas (concentración final mg/ml) 0 10 20 30 40
Reactivos
• Solución de trabajo (A + S): p or cada mililitro de solución alcalina de tartrato de
cobre (solución A) se añaden 10 (jlI de solución surfactante (solución S).
• Solución de trabajo B: reagente de Folin.
• Seroalbúmina bovina (BSA).
Procedimiento
1. Se hace u n a curva de calibración con diferentes concentraciones de BSA
(tabla 18-3).
2. Cada muestra se prepara por duplicado (tabla 18-4).
3. Se agitan los tubos suavemente.
4. Se incuba a tem peratura ambiente durante un m ínim o de 15 min. El color es
estable hasta 2 h.
5. Se lee la absorbancia a 730 nm.
6. Se extrapolan los valores de absorbancia obtenidos en la curva de calibración para
obtener las concentraciones proteicas de las muestras.
Solubilización de las proteínas

Todas las muestras cuantificadas se equiparan a una misma concentración proteica de
1 mg/ml. Para cada 100 |xg de proteína se añadirán 21 jjlI de medio de solubilización (MS).
El volumen de tam pón P 0 4 5 mM que se debe añadir será igual a:
Q(cantidad de proteínas)-(volum en de la muestra+ volumen MS)
Reactivos
• Medio de solubilización (MS):
• Dodecil sulfato sódico (SDS) al 20% EDTA 10 mM, 4.000 |xl.
• Azul de bromofenol al 1%, 400 |xl.
TABLA 18-4. Preparación de las muestras
Membranas Blanco
H 20 bidestilada 40 |jl1 50 |xl
Membranas (agitadas suavemente) 10 |xl —
Solución A + S 250 |xl 250 |¿1
Solución B (reactivo de Folin) 2 mi 2 mi
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• Glicerol (87-99%), 4.000 \ú.

• Ditiotreitol (DTT), 520 mg.
• Se mezcla bien y se distribuye en alícuotas de 500 |xl. Se congela a -20 °C.
Ejemplo:
Para 112 |xg de proteína se pondrán 23,5 |xl de MS y un volumen de 70 |xl de muestra.
El volumen de tam pón se calcula del siguiente modo:
Volumen de tampón P 0 4(5 mM) = 112 - (70 + 23,5) = 18,5 (il
Procedimiento
Para los Eppendorf con las membranas extraídas (muestras y controles) se pipetean los
volúmenes tam pón P 0 4 5 mM y de MS calculados.
Se homogeniza, se llevan las muestras a ebullición durante 3 m in para realizar la
desnaturalización proteica y se colocan de inmediato en hielo para evitar la desnatu
ralización.
Se reparten en alícuotas y se guardan a —80 °C hasta el mom ento de realizar la elec
troforesis.
Electroforesis en gel de poliacrilam ida (SDS-PAGE) de gradiente lineal

y exponencial (según Laemmli y Fairbanks)
Reactivos
• Acrilamida-bisacrilamida, 30:0,8 (Laemmli):
• Acrilamida, 60 g.
Bisacrilamida, 1,6 g.
• H20 , c.s.p. 200 mi.
• Se filtra y se conserva a 4 °C en botella oscura.
• Solución tampón Tris 1,5 M pH 8,8 (gel separating de Laemmli):
• Tris, 18,16 g.
• H20 , 80 mi.
• Se ajusta el pH a 8,8 con HC1 concentrado.
• SDS, 0,4 g.
• H20 , c.s.p. 100 mi.
• Se disuelve en baño maría con agitación.
• Solución tampón Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (gel staking de Laemmli):
• Tris, 6,05 g.
• H20 , 60 mi.
• Se ajusta el pH a 6,8 con HC1 concentrado.
• SDS, 0,4 g.
• H20 , c.s.p. 100 mi.
• Se disuelve en baño maría con agitación.
• Sacarosa (Fairbanks):
• Sacarosa, 500 mg.
• Acrilamida-bisacrilamida (40:1,5) (Fairbanks):
• Acrilamida, 40 g.
• Bisacrilamida, 1,5 g.
• H20 bidestilada, c.s.p. 100 mi.
• Se filtra y se conserva a 4 °C en botella oscura.
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• Peroxodisulfato de amonio (PSA) 10%:

• PSA, 0,1 g.
• H20 , c.s.p. 1 mi.
• Se guarda en un Eppendorf durante un máximo de 5 días.
• Solución A (solución tamponada de migración 10X, según Fairbanks):
• Tris 40 mM, 48,456 g.
• CH3COONA 20 mM, 16,406 g.
• EDTANa2 2 mM, 7,445 g.
• H20 , c.s.p. 900 mi.
• Se ajusta el pH a 7,4 con C 0 3C 0 0 H .
• Se guarda en la nevera a 4 °C.
• Solución B (solución A + SDS) (preparación extemporánea):
• Solución A, 80 mi.
- SDS, 2 g.
- Se agita y se deja en el microondas 2 min hasta su disolución completa.
- Tampón, c.s.p. 100 mi.
• Solución tamponada de migración 10 X, según Laemmli:
• Tris 0,177 M, 21,4 g.
• Glicina 1,92 M, 144 g.
• H20 , 1.000 mi.
• Se disuelve la glicina en 600 mi de H20 en baño maría durante 30 min.
• Se disuelve el Tris en 400 mi de H 20 .
• Se mezcla un mismo volumen de ambas soluciones (Tris-glicina) y se añaden 10 g
de SDS. Este tampón de migración se diluye hasta 1X en el momento de hacer la
electroforesis.
• Solución tamponada de migración IX , según Fairbanks:
• Solución B, 80 mi.
• H20 , c.s.p. 800 mi.
• Se conserva a temperatura ambiente.
Procedimiento
• Se lavan m uy bien las placas de cristal pequeñas.
• Se pasan por alcohol a 70 °C, se secan y luego se limpian con agua destilada. Se ubican
las placas de cristal en sus soportes, de manera que entre las mismas quede un espacio
para la fabricación del gel.
• Se introducen en las dos columnas del Gradient Former las mezclas de acrilamida (del
5 y el 15% para la electroforesis de Laemmli y del 3,5 y el 17% para la electroforesis
de Fairbanks), que se prepararán como se muestra en las tablas 18-5 y 18-6.
TABLA 18-5. Gel de gradiente lineal, según Laemmli
Reactivos Sol. 5% (mi) Sol. 15% (mi)
H 20 2,4 1
Acrilamida-bisacrilamida 30:0,8 0,6 2
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 1 1
Total 4 4
PSA 10% 10 |xl 10 (xl
Temed 4,5 |jl1 4,5 |xl
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TABLA 18-6. Gel de gradiente exponencial (4,5-17%), según Fairbanks
Reactivos Sol. A 3,5% (mi) Sol. B 17% (mi)

H20 4,65 1,3
Acrilamida-bisacrilamida 40:1,5 675 |xl 1,4 mi
Tampón 10 X SDS 2% 600 |il 330 |xl
(solución B)
Sacarosa — 500 mg
Total 6 1,05
PSA 10% 100 |xl 15 |xl
Temed 3,5 |xl 1 |xl
• En el fondo de cada una de las dos columnas del Gradient Former se colocará un imán
pequeño para poder agitar las acrilamidas.
• Se coloca en cada columna el PSA y el Temed (tetrametiletilenodiamina) y rápida
mente se monta la placa regulando el volumen al abrir el grifo que pone en contacto
las dos columnas. Una vez colocada la acrilamida dentro de la placa se pone H20 y
se espera a que polimerice antes de poner el gel stacking.
• Se elimina el H20 y se seca la parte de arriba de la placa con papel de filtro 1 MM.
• Se añade el gel stacking (cuadro 18-3) con una pipeta Pasteur encima del gel de
separación e inmediatamente se pone el peine. Esperar a que polimerice.
• Se retira el peine. Se monta el gel en el sistema para electroforesis.
• Se dispensa el tampón de migración, que es distinto para cada tipo de electroforesis.
• Se realiza una premigración, sin muestras, durante 15 m in a 100 V para la elec
troforesis de Laemmli.
• Se aplican 8 |xl de cada m uestra y un marcador de migración para proteínas (low
range: 102-20 kDa) en los diferentes pocilios. Se deja migrar 30 min a 100 V, período
en el cual las muestras pasarán del gel stacking al de separación. Una vez finalizada
esta etapa, se realiza la separación de las proteínas a 200 V durante 140 m in (solo en
la electroforesis Laemmli).
CUADRO 18-3. Preparación del gel stacking
Según Laemmli
• HzO, 1,58 mi
• Acrilamida-bisacrilamida (30:0,8): 275 |xl
• Tris-HCl 0,5 M: 650 |xl
• Total: 2,5 mi
• PSA 10%: 12,5 p.1
• Temed: 4,5 |xl
Según Fairbanks
• Gel stacking al 3,6%
• H20 bidestilada: 1.975 mi
• Acrilamida-bisacrilamida (40:1,5): 225 mi
• Tampón Fairbanks 10X + SDS al 2%: 250 mi
• PSA al 10%: 18,5 m-1
• Temed: 6 |xl
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• En la electroforesis según Fairbanks, la migración es siempre a 90 V durante 120 min.

• Finalizada la electroforesis, se para la fuente de alimentación y se retira el gel de los
dos cristales eliminando el stacking gel.
Coloración, fijación y tinción de la placa de electroforesis con azul de Coomassie

Reactivos
• Azul de Coomassie:
• Azul de Coomassie, 0,125 g.
• Ácido acético, 25 mi.
• Isopropanol, 62,5 mi.
• H20 , c.s.p. 250 mi.
• Se agita hasta una completa disolución.
• Se filtra y se guarda en botella oscura.
• Solución de descoloración I:
• Alcohol isopropílico, 125 mi.
• Solución de descoloración II:
• Alcohol isopropílico, 50 mi.
• Solución de descoloración III:
Procedimiento
• Coloración y fijación del gel: se coloca la placa de acrilamida en la solución fijadora y
colorante durante 10-24 h en agitación a temperatura ambiente.
• Decoloración del gel: se coloca el gel durante 45 min en cada una de las soluciones
de descoloración (solución I, II y III), a tem peratura ambiente y en agitación, para
producir su decoloración total.
• Después de la decoloración, los geles se reposan en agua hasta su cuantificación
mediante densitometría.
Cuantificación de las fracciones proteicas mediante densitometría

Se procede a la lectura de los geles a 570 nm con un densitómetro, en función de la
densidad óptica de las diferentes bandas. La intensidad de la tinción es proporcional a
la cantidad de proteína presente en la muestra. La integración del área de cada pico o
banda se utiliza para calcular la cantidad de proteína, expresada como porcentaje relativo.

Los porcentajes relativos de cada una de las proteínas de m em brana eritrocitaria del
paciente se comparan con los intervalos de normalidad (X ± 2DE) determinados a partir
de los cuatro controles que se hacen m igrar paralelamente en cada gel.
La cuantificación de las proteínas de la membrana eritrocitaria constituye un com
plemento de gran importancia en el estudio de las membranopatías hereditarias. Gracias
a ello, puede identificarse la proteína m utada e iniciarse el estudio molecular del gen
implicado.
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Prueba de estabilidad térm ica eritrocitaria

La m embrana del eritrocito resiste a aumentos de temperatura que pueden llegar a los
49 °C. Si se sobrepasa este límite se inicia un proceso de desestructuración y fragmenta
ción que origina microesferocitos y eritrocitos fragmentados (poiquilocitos).
La PPH es una anemia hemolítica congénita rara que se caracteriza por presentar
numerosos microesferocitos y piropoiquilocitos en el frotis de sangre periférica. Es debida
a alteraciones que causan una disrupción grave en la red de espectrina de la membrana
eritrocitaria. Estos eritrocitos tienen una sensibilidad aumentada al calor, la cual puede
comprobarse con la prueba de estabilidad térmica eritrocitaria. Este es un método sencillo
que puede ser realizado en cualquier laboratorio medianamente dotado.
Muestras, equipamiento y reactivos

• Sangre total reciente (paciente y control) tratada con EDTA-K3.
• Baño maría de precisión (para pequeñas variaciones de temperatura).
• Microscopio óptico.
• Solución am ortiguadora o tam pón I (cacodilato 0,15 mol/1): se disuelven 3,21 g
de sodio-cacodilato hasta 100 mi de agua, ajustando la solución a un pH de 7,4
mediante HCI 2N. La osmolaridad final debe estar entre 265-300 mOsm (se ajusta
cuidadosamente con solución de sacarosa).
• Solución amortiguadora o tampón II (cacodilato 0,05 mol/1): se disuelven 1,07 g de sodio-
cacodilato hasta 100 mi de agua ajustando la solución a un pH de 7,55 mediante HCI 2N.
• Solución de glutaraldehído: extemporáneamente se diluyen 9,2 mi de tam pón II en
0.8.mi de solución madre de glutaraldehído.
Método
1. Se incuba una suspensión de 400 |xl de sangre total (paciente y control) en 2 mi
de tampón I a 46,47,48 y 49 °C durante 15,30 y 60 min.
2. Para cada temperatura analizada se preparan tres tubos que contengan 0,5 m i de
solución de glutaraldehído.
3. A cada tubo se añaden 100 |xl de la suspensión de sangre total incubada, una vez
transcurrido el tiempo correspondiente (15, 30,60 min).
4. Una vez finalizada la incubación, se coloca una gota de cada una de las suspensio
nes de sangre total incubada, y de la correspondiente al tiempo 0, en portaobjetos
y se cubren con lamelas.
5. Se observan al microscopio óptico para valorar la morfología de los eritrocitos
(torocitos, torocitos espiculados y eritrocitos fragmentados). Los valores obtenidos
se expresan según el esquema indicado en la tabla 18-7.
TABLA 18-7. Prueba de la fragmentación térmica en una muestra normal
Torocitos Eritrocitos
Temperatura Tiempo (min) Torocitos (%) espiculados (%) fragmentados (%)
46 °C 15 63,5±0,2 _ _
30 67,5±9,2 — —
60 68,2±9,5 — —
49 °C 30 49,4±13,6 26±14,3 21,1+10,3
60 26,0±7,5 19,9±9,3 59,4111,3
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FIGU RA 18-12. Imagen de

eritrocitos fragmentados a 46 °C
(en un caso de piropoiquilocitosis
hereditaria).

En la PPH es característica la disminución de la estabilidad térmica de la m embrana
eritrocitaria y, p o r tanto, se observan eritrocitos fragm entados a la tem peratura de
incubación de 46 °C (fig. 18-12).
La estabilidad térmica de los eritrocitos se halla sensiblemente aumentada en la XH,
una anem ia hemolítica rara debida a un trastorno de la perm eabilidad iónica de la
membrana de los eritrocitos, cuya consecuencia es un gran aumento de la permeabilidad
pasiva al sodio y potasio con deshidratación de los eritrocitos.
Evaluación de la perm eabilidad de la m em brana eritrocitaria al sodio

(Na+) y potasio (K+)
La membrana eritrocitaria desempeña una función crucial en la regulación del volumen
de la célula. Muchas de las proteínas están implicadas en la homeostasis de los cationes
y, consecuentemente, en la cantidad de agua en la célula. La pérdida de capacidad de
regular su volumen compromete el desempeño del eritrocito y reduce su vida media.
Un aumento intracelular de Na+ y K+, que se acompaña de un aumento de la cantidad
de agua, lleva a un aumento de volumen de la célula, en cuanto que la pérdida de Na+
y K+deshidrata la célula, con la consecuente diminución del volumen del eritrocito.
Las enfermedades congénitas de la m em brana eritrocitaria con trastornos en el
transporte iónico transmembranoso presentan dos fenotipos distintos: estomatocitosis
hereditaria deshidratada (xerocitosis) y estom atocitosis hereditaria hiperhidratada
(hidrocitosis). Algunos fenotipos de características intermedias pueden ser agrupados
en tres subtipos: criohidrocitosis, seudohiperpotasemia y xerocitosis estomatocítica.
La cuantificación de Na+ y K+ intraeritrocitarios y la medida de la permeabilidad de
la membrana eritrocitaria al Na+ y K+suelen ayudar al diagnóstico de las enfermedades
de permeabilidad de la membrana eritrocitaria.
Concentración desodio (Na+) y potasio (K+) intraeritrocitarios

Equipam iento
• Tubos Greiner de 50 mi estériles.
• Tubos Greiner de 10 ml estériles.
• Capilares de hematocrito.
• Fotómetro de llama Eppendorf® ELEX 6361.
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• Centrífuga refrigerada.
• Pipetas automáticas: P-1000, P-100 y P-20.
• Centrífuga de hematocrito.
• Baño maría.
• Agitador de tubos vórtex.
Reactivos
• Sacarosa.
• Cloruro de magnesio (MgCl,).
• Cloruro de litio (LiCl).
• Cloruro de potasio (KC1).
• MOPS-Tris.
• Ouabaína.
• Bumetanida.
Recogida y procesamiento de la muestra

1. Se extraen 10 mi de sangre venosa en un tubo heparinizado y se centrifuga a 1.750 rpm
durante 15 min, a 4 °C, con el fin de eliminar el plasma y la capa leucocitaria.
2. Se efectúan tres lavados de 10 min cada uno a 4 °C y 1.750 rpm con una solución
de MgCl2 110 mM.
3. Se resuspende el paquete de eritrocitos en u n a solución am ortiguadora de
Mg2+-sacarosa a pH 7,4 y osmolaridad 295 ± 5 mOsm que contenga (mM): 75
MgCl2, 85 sacarosa, 10 MOPS-Tris y 10 glucosa hasta conseguir un hematocrito
del 20 al 25%.
Método
1. Se añaden 4 mi de agua bidestilada a 100 (jlI de la suspensión de eritrocitos
explicada en el apartado anterior.
2. Se lee el contenido catiónico del lisado en el fotómetro de llama.
3. Se multiplica el resultado obtenido por el siguiente factor corrector (Fe):
Hto inicial
donde el hematocrito (Hto) es de la suspensión de eritrocitos.

4. Se expresa el resultado en mmol/1.
Medida de la permeabilidad de la membrana eritrocitaria al sodio (Na+)

y al potasio (K+)
Principio
La determinación de los sistemas de transporte a través de la membrana eritrocitaria se
realiza mediante la técnica de Garay et al. modificada (I. Besson), siguiendo el esquema
representado en la figura 18-13.
Método
1. Se preparan cuatro soluciones de Mg2+-sacarosa de 25 mi cada una que contengan
(mM): 2 KC1 (solución 1), 0,1 ouabaína (solución 2), 0,1 ouabaína y 0,02 bum e
tanida (solución 3); y 0,1 ouabaína, 0,02 bumetanida y 10 LiCl (solución 4).
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[ H a s s
1 1-2 2-3 3 3-4

Flujo total Flujo activo Cotransporte Flujo pasivo Contratransporte
FIGU RA 18-13. Esquema del método para determinar los sistemas de transporte transmembranoso de
Na+y K+.
2. Se prepara una batería de 16 tubos de 10 mi, de tal m anera que haya cuatro para
cada solución: dos para el tiempo 0 m in (t0) (soluciones 1 ,2 ,3 y 4), dos para el
tiem po 30 m in (t30) (solución 1) y dos para el tiempo 60 m in (t60) (soluciones
2, 3 y 4).
3. Se coloca la batería de tubos en una bandeja con hielo picado y agua y se añade a
cada uno de ellos 1 mi de la solución correspondiente y 250 |xl de la suspensión
de eritrocitos. Es importante m antener siempre cubiertos los tubos abiertos con
papel de filtro, así como los tapones, para evitar la posible contaminación de Na+
del ambiente.
4. Se agitan rápidamente los tubos en el vórtex y se depositan los t30y t60 para incubar
en el baño maría a 37 °C.
5. Se centrifugan rápidamente los ocho tubos t0 a 1.750 g durante 5 min, a 4 °C; se
recoge el sobrenadante y se guarda a 4 °C.
6. Pasado el tiempo de incubación (30 m in para los dos tubos de la solución 1, y
60 min para los seis de las soluciones 2,3 y 4), se depositan los tubos durante 2 min
en la bandeja de hielo picado y agua para detener la actividad de los sistemas de
transporte, y se procede igual que para los tubos 4 y 5.
7. Los sobrenadantes de los 16 tubos se leen inmediatamente o se conservan durante
1 semana a 4 °C. La lectura se realiza a temperatura ambiente.

Para calcular la intensidad de los flujos catiónicos (FC) debe aplicarse la siguiente
fórmula:
„ D cat x (1 - Hto final)

F C = ---------------------------
Hto final
donde D cat es la diferencia entre la concentración catiónica después de incubar a
37 °C y a tiempo cero. El hematocrito final se calcula del siguiente modo:
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TT . . l-(H toinicial/100)
H to final = -
(Hto inicial/100)
De esta forma:
La actividad de la ATPasa Na+, K+ se calcula restando el flujo de Na+ en presencia
(solución 2) y ausencia (solución 1) de ouabaína.
La actividad del cotransporte Na+, K+se obtiene mediante la diferencia entre el flujo de
Na+obtenido en presencia de ouabaína con (solución 3) y sin (solución 2) bumetanida.
La actividad del contratransporte Na+, Li+ se obtiene mediante la diferencia entre el
flujo de Na+ de la solución 4 del obtenido en la 3.
Los flujos pasivos de Na+y K+ son los que se obtienen directamente de la solución 3. Los
resultados se expresan en |xmol/l.cel.
En la figura 18-13 se resume un esquema de esta técnica.
Pruebas de hem ólisis para el diagnóstico de hem oglobinuria

paroxística nocturna
La hem oglobinuria paroxística nocturna (HPN) es un síndrom e hemolítico secun
dario a un defecto adquirido de la m em brana eritrocitaria, p o r el que los eritrocitos
presentan un aum ento de la sensibilidad a la acción lítica del complemento (C3b).
Es u na enfermedad rara de la célula m adre pluripotente o stem cell, que afecta todas
las líneas celulares y presenta tres características clínicas que varían de paciente a
paciente y en el curso de la enfermedad:
1. Hemólisis intravascular m ediada p or complemento, con hemoglobinuria noc
turna (25% de los pacientes) y hemosiderinuria.
2. Trombofilia o hipercoagulabilidad.
3. Insuficiencia de la médula ósea.
La H PN resulta de una mutación somática en el gen PIGA, localizado en el brazo
corto del cromosoma X, que causa déficit parcial o total de las proteínas normalmente
ancladas a la m embrana celular vía glicofosfatidilinositol (GPI). Aunque más de 20 de
estas proteínas se expresen en las células hematopoyéticas, el déficit de CD55 (factor
acelerador de la degradación [DAF]) y de CD59 (inhibidor de la lisis de mem brana
[MIRL]) son los responsables de la anemia hemolítica. Los eritrocitos desprovistos de
CD55 y CD59 sufren hemólisis intravascular espontánea por la activación descontrolada
de la vía alternativa del complemento.
La forma clásica de HPN presenta anemia hemolítica con hemoglobinuria nocturna,
ictericia y hemosiderinuria, y frecuentemente trombosis venosas. La gravedad del cuadro
clínico depende de la intensidad de la hemólisis, del fallo m edular y de la frecuencia e
intensidad de los fenómenos trombóticos venosos. La HPN puede surgir como fenómeno
asociado a otros síndromes de insuficiencia medular.
En el desarrollo de la HPN se ha demostrado que existen eritrocitos con gran sensi
bilidad a la lisis por acción del complemento (HPN tipo III, 10-15 veces la normal), con
sensibilidad mediana (HPN tipo II, 3-5 veces la normal) y con sensibilidad normal (HPN
tipo I). La intensidad de la anemia hemolítica de un paciente está directamente relacionada
con el porcentaje de eritrocitos más susceptibles a la lisis que posee en cada momento.
La elevada sensibilidad de los eritrocitos HPN al complemento puede ponerse de ma
nifiesto mediante la activación de la vía alternativa del C3 por diferentes procedimientos
in vitro, tales como la prueba de la hemólisis en medio ácido, o prueba de Ham-Dacie,
y la prueba de la sacarosa.
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La cuantificación de la expresión de las proteínas unidas a grupos fosfatidil inositol

(GPI), utilizando anticuerpos monoclonales y citometría de flujo, se considera la mejor
metodología para diagnosticar y realizar la monitorización o seguimiento de la HPN.
La citometría de flujo tiene la ventaja, sobre los métodos clásicos, de perm itir no solo
identificar, sino cuantificar el número de células HPN, lo que facilita el seguimiento de la
enfermedad mediante determinaciones periódicas de las proteínas CD55 y CD59. Además,
permite realizar el estudio en leucocitos (monocitos y neutrófilos), que puede ser más
informativo que el análisis de los eritrocitos, porque estos sufren una hemólisis selectiva;
por otro lado, evita los inconvenientes de analizar a pacientes sometidos a transfusiones.
Las bases técnicas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo se explican en
el capítulo 10.
Prueba de lisis en el suero acidificado (prueba de Ham)

El complemento, al unirse al complejo antígeno anticuerpo en la superficie de los eritrocitos,
favorece la lisis celular. Esta acción lítica del complemento resulta favorecida por un descenso
del pH del medio (6,5-7) o de la fuerza iónica. En los eritrocitos normales la acción lítica del
complemento no se desarrolla, ni aun en presencia de suero acidificado, pero en los eritrocitos
HPN basta una pequeña disminución del pH del medio para que sobrevenga la hemólisis.
En una form a rara de anem ia hereditaria (CDA-II HEMPAS [m ultinuclearidad
eritroblástica hereditaria con positividad en suero acidificado]), los eritrocitos solo
hemolizan cuando son incubados en algunos sueros normales acidificados, pero no en
presencia del suero propio. El mecanismo de la hemólisis en medio ácido difiere del de
la HPN, ya que es debido a la presencia, en un porcentaje de sueros normales (~30% ),
de un anticuerpo IgM (anti-HEMPAS) que reacciona con un antígeno presente en la
m embrana eritrocitaria de los pacientes con CDA tipo II. En presencia de HEMPAS,
la prueba de la sacarosa es negativa, y la expresión de las proteínas unidas a GPI normal.
M uestras
• Eritrocitos del paciente obtenidos de sangre desfibrinada, heparinizada, oxalatada o
con EDTA. Si la sangre se ha mantenido estéril a 4 °C en ACD, la prueba puede rea
lizarse incluso después de algunos días de la extracción. Los reticulocitos son mucho
más sensibles que los eritrocitos maduros a la lisis en medio ácido, por lo que algunos
autores han sugerido aum entar la sensibilidad del método empleando solamente la
capa eritrocitaria correspondiente a la parte superior del paquete eritrocitario cen
trifugado, debido a su mayor contenido en reticulocitos.
• Suero o plasma del paciente y de un sujeto control isogrupo. Los sueros deben ser
obtenidos por desfibrinación, para que no haya lisis, aunque el suero control también
puede ser obtenido de sangre que haya coagulado espontáneamente a temperatura
ambiente o a 37 °C. Los sueros deben ser recientes, aunque pueden conservarse a
-70 °C sin que pierdan su poder lítico en el curso de varios meses.
Si es posible, se debe procesar en paralelo una muestra de células conocidas de HPN,
como control positivo.
M étodo
Para realizar la prueba de Ham-Dacie se necesitan seis tubos de hemólisis que se enu
meran del 1 al 6.
1. Se depositan 0,5 mi de suero fresco normal, del grupo AB o ABO compatible con
la sangre del paciente en los 6 tubos.
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2. Los tubos 1 ,2 ,4 y 5 se mantienen a temperatura ambiente.

3. Los tubos 3 y 6 se introducen en un baño maría a 56 °C durante 30 min con el fin
de inactivar el complemento.
4. Se añade a los tubos 2 ,3 ,5 y 6 0,05 m l de HCI, 0,2 mol/1.
5. Se colocan todos los tubos a 37 °C.
6. A los tubos 1, 2 y 3 se añaden 0,05 mi de una suspensión al 50% (en solución
salina) de eritrocitos lavados del propio paciente. Se mezcla cuidadosamente y se
coloca a 37 °C durante 1 h.
7. A los tubos 4, 5 y 6 se añaden 0,05 mi de una suspensión al 50% (en solución
salina) de eritrocitos normales de control lavados. Se mezcla cuidadosamente y
se coloca a 37 °C durante 1 h.
8. Se centrifuga y se observa si hay hemólisis.
Interpretación del resultado (tabla 18-8)

La muestra de células normales de control no presentará üsis en ninguno de los tres tubos
(4,5 y 6). En un paciente con HPN se observará lisis bien definida, aunque incompleta,
en el suero acidificado (tubo 2). Una lisis mucho menor, o incluso inexistente, se podrá
observar en el suero no acidificado (tubo 1). No deberá haber ninguna lisis en el suero
acidificado inactivo (tubo 3); si se observa alguna lisis el test no puede ser considerado
positivo. Si la prueba es positiva utilizando suero norm al, es im portante testar con
suero del paciente para excluir la CDA tipo II o HEMPAS. En esta patología, la prueba
de Ham-Dacie es positiva solo cuando los eritrocitos del paciente se enfrentan con un
determinado núm ero (aproximadamente 30%) de sueros isogrupo acidificados, pero
nunca con el propio suero.
No todos los eritrocitos del paciente tienen igual susceptibilidad a la lisis por com
plemento, ni siquiera en las mejores condiciones del test. La variación en el grado de
hemólisis se debe al carácter heterogéneo de la población eritrocitaria, con diferentes
porcentajes de eritrocitos más sensibles o menos sensibles a la hemólisis en medio ácido.
El predominio de una u otra población puede variar de forma importante en el curso
de la enfermedad, por lo que la intensidad de la hemólisis puede ser diferente según
su m om ento evolutivo. Incluso puede existir la negativización de la prueba si, en el
momento en que se practica, el núm ero de eritrocitos HPN es muy escaso.
Prueba de la sacarosa
La prueba de la sacarosa es menos sensible y menos específica para el diagnóstico de
HPN que la hemólisis en medio ácido. La lisis eritrocitaria en presencia de sacarosa se
TABLA 18-8. Prueba de la lisis en suero acidificado
Reactivos Prueba (mi) Controles (mi)

Tubos 1 2 3 4 5 6
Suero normal fresco 0,5 0,5 0,5 0,5
Suero normal inactivado (56 °C) — 0,5 — — 0,5
HCI, 0,2 mol/1 — 0,05 0,05 — 0,05 0,05
Hematíes del paciente (50%) 0,05 0,05 0,05 — — —
Hematíes normales (50%) — — — 0,05 0,05 0,05
HPN-lisis 0-+ +++ 0 0 0 0
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basa en el principio de que los eritrocitos fijan el complemento sérico en presencia de

solutos de baja fuerza iónica (sacarosa), p or lo que, si se trata de eritrocitos HPN, se
facilitará la hemólisis.
Muestras y método
1. Sangre total del paciente mantenida incoagulable en oxalato cálcico o ACD.
2. Sangre control (no necesariamente isogrupo) recientemente extraída.
3. Solución isotónica de sacarosa (92,4 g/1).
4. En dos tubos (paciente y control) de hemólisis se introducen 1,8 mi de la solución
de sacarosa.
5. En el tubo del paciente se añaden 0,2 mi de sangre total y en el tubo control 0,2 mi
de una sangre control recientemente extraída.
6. Se agitan suavemente ambos tubos y se dejan en reposo a temperatura ambiente
durante 30 min.
7. Se centrifugan los tubos y se observa la aparición de hemólisis.

La prueba es positiva cuando se observa aparición de hemólisis en el tubo del paciente.
Es casi siempre positiva en la H PN , especialmente cuando existe positividad de la
prueba de Ham-Dacie. El grado de positividad puede variar ampliamente (entre 10 y
80% de hemólisis) e incluso, en ocasiones, ser negativo, aun en presencia de HPN. En
el HEMPAS, por el contrario, esta prueba es siempre negativa. En ciertas hemopatías
puede observarse una ligera positividad de la prueba de la sacarosa, con negatividad de
la prueba de Ham-Dacie. No obstante, en estos casos no puede hablarse de HPN, excepto
en el caso en que la prueba de Ham-Dacie se haga finalmente positiva.
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Capítulo 18 Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias 5 3 5 .e l
Autoevaluación
1. La interrupción de las interacciones verticales entre las proteínas del citoesqueleto y la bicapa
lipídica es causa de:
(a) Esferocitosis hereditaria.
(b) Eliptocitosis hereditaria.
(c) Ovalocitosis del sudeste asiático.
(d) Estomatocitosis hereditaria.
Respuesta razonada: la interrupción de las interacciones verticales, que implican la espectrina
o las proteínas que unen la espectrina a la m em brana, com o la anquirina, la p roteína 4.2 y
la banda 3, es causa de esferocitosis hereditaria. Estas alteraciones conllevan la form ación
de m icrovesículas m em branosas, que al ser rem ovidas en el sistem a reticu lo en d o telial
producen una reducción progresiva de la superficie de la m em brana eritrocitaria originando
los esferocitos.
2. En la esferocitosis hereditaria ¿cuál es el déficit de proteína más frecuente?
(a) Déficit de espectrina.
(b) Déficit de anquirina/espectrina.
(c) Déficit de banda 3/proteína 4.2.
(d) Déficit de proteína 4.2.
(e) Déficit de proteína 4.1.
Respuesta razonada: la causa más frecuente de EH en la población europea y americana es
un déficit de anquirina/espectrina (35-65% ), seguido del déficit de banda 3/proteína 4.2
(15-30%). El déficit aislado de proteína 4.2 es raro en la población europea, pero tiene una
elevada prevalencia en Japón. Com o resultado de la estrecha interacción entre estas proteínas,
la reducción prim aria de una proteína origina reducciones secundarias de las que le están
asociadas.
3. ¿Cuáles son los parámetros esenciales del diagnóstico de esferocitosis hereditaria?
(a) Parámetros hematológicos.
(b) Recuento de reticulocitos.
(c) Observación morfológica de la sangre periférica.
(d) Historia clínica del paciente y su familia.
Respuesta razonada: el diagnóstico de esferocitosis hereditaria se hace con base en los datos de
la historia clínica del paciente y su familia, los parámetros hematológicos (incluido el recuento
de reticulocitos) y la observación morfológica de la sangre periférica, complementado con una
o dos pruebas de laboratorio.
4. ¿Cuáles son los test de laboratorio que en asociación presentan m ejor sensibilidad en el
diagnóstico de esferocitosis hereditaria?
(a) AGLT y criotest.
(b) Criotest y EMA.
(c) AGLT y EMA.
(d) Fragilidad osmótica y AGLT.
(e) Fragilidad osmótica y EMA.
Respuesta razonada: los test que presentan mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de
esferocitosis hereditaria son el AGLT, el criotest y el EMA. Sin embargo, algunos autores demos
traron que cada uno de estos test por separado no perm ite diagnosticar un núm ero significativo
de casos. El AGLT en asociación con el EMA demuestra la mejor sensibilidad en el diagnóstico de
EH, incluso en las formas ligeras.
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5. ¿Cuáles son las enfermedades que cursan con alteraciones de la fragilidad osmótica?
(a) Esferocitosis hereditaria.
(b) Anemia hemolítica autoinmune.
(c) Anemia ferropénica.
(d) Talasemia.
Respuesta razonada: enfermedades que cursan con alteraciones de la fragilidad osmótica (FO):
1. AUMENTO DE LA FO:
Esferocitosis hereditaria
Eliptocitosis hereditaria (FO norm al en las ElipH sin hemólisis)
Estomatocitosis hereditaria o hidrocitosis (CMFIC baja)
Anemia hemolítica autoinm une
Anemia hemolítica microangiopática
2. DISMINUCIÓN DE LA FO:
Talasemias
Anemia ferropénica
Hemoglobinopatía S
Hemoglobinopatía C
Xerocitosis hereditaria (CMHC elevada)
6. El test de hemólisis en glicerol acidificado (AGLT) es una prueba que evalúa:
(a) La susceptibilidad de los eritrocitos a la rotura por frío.
(b) La fragilidad osmótica eritrocitaria.
(c) La cantidad de banda 3 en la m em brana de los eritrocitos.
Respuesta razonada: el test de hemólisis en glicerol acidificado es otra prueba de fragilidad
eritrocitaria, en que se registra el tiem po (en segundos) que tarda en verificarse el 50% de
la hemólisis de los eritrocitos (AGLT50) cuando estos se incuban en una m istura hipotónica
acidificada salino-glicerol. El glicerol retrasa el ritm o de entrada de las moléculas de agua en
los eritrocitos, lo que perm ite un registro continuo de la hemólisis en el espectrofotómetro. El
principio es el m ismo que en el test de fragilidad osmótica: los eritrocitos con disminución de
la relación superficie/volumen (esferocitos) resisten menos a la entrada de moléculas de agua
que los eritrocitos normales. Esto se aplica a todos los esferocitos, independientemente de que
se trate de una EH u otra patología que curse con esferocitos en circulación.
7. El test de EMA suele estar disminuido ¿en qué enfermedades?
(a) Anemia diseritropoyética congénita tipo II.
(b) Esferocitosis hereditaria.
(c) Anemia hemolítica autoinmune.
(e) a y b .
Respuesta razonada: la evaluación p or citometría de flujo de la fluorescencia de la eosina-5’-
maleimida (EMA) en los eritrocitos es una prueba con gran sensibilidad (92,7%) y excelente
especificidad (99,1%) para el diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH).
La unión de la EMA a las proteínas integrales de la m em brana, que se unen directamente
con el citoesqueleto eritrocitario, contribuye a la elevada especificad de esta prueba. En otras
patologías que cursan con esferocitos en sangre periférica y que no resultan de alteraciones estruc
turales en la m em brana como la anemia hemolítica autoinm une, la prueba de EMA es normal.
Sin embargo, se observa una disminución de la fluorescencia media en algunas enfermedades
raras, como la piropoiquilocitosis hereditaria (PPH), la anemia diseritropoyética congénita tipo
II, la criohidrocitosis y la ovalocitosis del sudeste asiático (SAO).
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Capítulo 18 Métodos para el diagnóstico de las m embranopatías eritrocitarias 5 3 5 .e 3
8. En las enfermedades de la membrana eritrocitaria ¿cuál es la técnica utilizada para identificar

la proteína que tiene alteraciones?
(a) Fragilidad osmótica eritrocitaria.
(b) Test de lisis en glicerol acidificado.
(c) Electroforesis de proteínas de m embrana eritrocitaria.
(d) Prueba de citometría de flujo con eosina-5’-maleimida (EMA).
(e) Prueba de la autohemólisis.
Respuesta razonada: las proteínas de la membrana eritrocitaria pueden ser identificadas mediante
electroforesis en poliacrilamida (SDS-PAGE). Esta técnica perm ite separar las proteínas según
su peso molecular, teñirlas con un colorante de proteínas y cuantificarlas por densitometría.
Cada banda en la electroforesis se identifica mediante la asignación de un núm ero de acuerdo
la nomenclatura internacional.
9. En las enfermedades de la m embrana eritrocitaria ¿cuándo está indicado hacer el estudio de
las proteínas de m embrana, m ediante electroforesis SDS-PAGE, y estudios moleculares?
(a) Casos clínicos complejos.
(b) Si hay una gran variabilidad fenotípica en diferentes pacientes de una misma familia.
(c) Para confirmar mutaciones recesivas o de novo.
(d) Para hacer el diagnóstico prenatal.
Respuesta razonada: en los casos más complejos de enfermedades de la m em brana eritrocitaria
es importante identificar cuál es la proteína que está afectada. Mediante electroforesis SDS-PAGE
se puede hacer el análisis cuantitativo y cualitativo de las principales proteínas estructurales de
la m em brana de los eritrocitos.
Los estudios moleculares para identificación de m utaciones en los genes que codifican las
proteínas de la membrana solamente se justifican en casos muy raros y complejos, o si estuviera
indicado el diagnóstico prenatal. Estos estudios perm iten elucidar la base genética de la variabi
lidad fenotípica en diferentes pacientes de una misma familia, confirmar mutaciones recesivas
o de novo cuando los progenitores son aparentemente normales, y hacer el diagnóstico prenatal
cuando hay riesgo de nacimiento de u n niño con una forma muy severa de HS.
10. ¿Cuál es la m ejor m etodología de diagnóstico de hem oglobinuria paroxística nocturna
(HPN)?
(a) Prueba de lisis en el suero acidificado (prueba de HAM).
(b) Prueba de la sacarosa.
(c) Cuantificación, por citometría de flujo, de la expresión de las proteínas ancladas a GPI.
Respuesta razonada: la cuantificación de la expresión de las proteínas ancladas a GPI, utilizando
anticuerpos monoclonales m ediante citom etría de flujo, se considera la m ejor metodología
para diagnosticar y m onitorizar hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). La citometría de
flujo tiene la ventaja, sobre los m étodos clásicos, de perm itir no solo identificar, sino tam bién
cuantificar el núm ero de células HPN, lo que facilita seguir la evolución de la enfermedad a partir
de la cuantificación periódica. Además posibilita realizar el estudio en leucocitos (monocitos y
neutrófilos), que puede ser más informativa que el análisis de los eritrocitos, porque estos sufren
una hemólisis selectiva; y, asimismo, evita los inconvenientes de analizar pacientes sometidos
a transfusiones.
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C A P Í T U L O 19
Diagnóstico de las eritroenzimopatías

M. A. Pujades y J. L. Vives Corrons
INTRODUCCIÓN
El eritrocito cumple tres funciones principales encaminadas, todas ellas, a m antener la
función y el transporte de la hemoglobina desde los pulmones a los tejidos y viceversa:
1. Conservar la integridad de sus componentes para sobrevivir en la circulación
sanguínea aproximadamente 120 días.
2. M antener el hierro hemoglobínico en estado reducido o funcional para que la
hemoglobina pueda fijar reversiblemente el oxígeno molecular.
3. Contribuir a la función de la hemoglobina, facilitando la liberación del oxígeno a
los tejidos.
Estas funciones las realiza gracias a su reducida, pero suficiente, dotación enzimática, he
redada de sus precursores, los eritroblastos, y que le permite obtener energía en forma de ATP
(metabolismo energético), proteger la hemoglobina de los agentes oxidantes (metabolismo
oxidorreductor y diaforásico) y contribuir a la función respiratoria de la hemoglobina (síntesis
de 2,3-bisfosfoglicerato). La ausencia de síntesis proteica en el eritrocito maduro imposibilita
el recambio molecular de estas enzimas, por lo que su déficit congénito tiene, casi siempre,
una repercusión fisiopatológica mucho mayor que en cualquier otra célula del organismo.
Las enzimopatías cuyo estudio clínico reviste mayor interés son las que se acompañan
de un síndrome hemolítico solo o asociado a otro trastorno no hematológico como, por
ejemplo, neuropatía, miopatía o retraso mental. Se ha atribuido también importancia
a determinadas eritroenzimopatías sin anemia pero asociadas a eritrocitosis como, por
ejemplo, el déficit hereditario de bisfosfoglicerato sintasa y la hiperactividad piruvato
cinasa. Desde el punto de vista fisiopatológico, las eritroenzimopatías se clasifican en
cuatro grupos según la vía metabólica afectada:
• Enzimopatías de la glucólisis anaerobia (metabolismo energético).
• Enzimopatías de la vía de pentosas y metabolismo del glutatión (metabolismo oxido
rreductor).
• Enzimopatías del metabolismo nucleotídico.
• Enzimopatías del sistema reductor de la hemoglobina (diaforasa).
En la figura 19-1 se representan las enzimas pertenecientes a las tres vías metabólicas impres
cindibles para mantener la viabilidad del eritrocito maduro; glucólisis anaerobia (producción
de ATP), vía de pentosas y glutatión (sistema antioxidante). El estudio de las enzimas del me
tabolismo eritrocitario ha representado un gran avance en el diagnóstico de ciertas formas de
hemólisis congénita no esferocítica. Aunque, en nuestro medio, el déficit de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (G6PD) es la enzimopatía más frecuente, la presencia de otras eritroenzimo
patías no constituye un hecho excepcional. Así, se han descrito déficits de piruvato cinasa (PK),
fosfoglucosa isomerasa (PGI), triosa fosfato isomerasa (TPI), pirimidina-5'-nucleotidasa
(P5'N), fosfofructocinasa (PFK) y diaforasa. Las características de las eritroenzimopatías
más importantes desde el punto de vista clínico y genético se representan en la tabla 19-1.

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Capítulo 19 Diagnóstico de las erítroenzim opatías 537
1 ,3 -D P G
M utasa ^ PGK
I 2 ,3 -D P G I ÂDP
Fosfatasa S |atp!
3-P G
ATP | ADP NADH NAD
M utasa 2-P G 4--------- ► PEP . — ►Pinivatn — >I
Enolasa | PK [ Lactato deshidrogenasa
FIGU RA 19-1. Esquema de la glucólisis anaerobia y metabolismo oxidorreductor.
TABLA 19-1. Manifestaciones clínicas de las erítroenzimopatías
Enzimopatía Hemólisis Otras manifestaciones

Hexocinasa Crónica No
Glucosa fosfato isomerasa Crónica Sí (neuropatía)
Fosfofructocinasa Crónica Sí (miopatía, glucogenosis)
Triosa fosfato isomerasa Crónica Sí (neuropatía muy grave)
Gliceraldehído-3-fosfato Crónica No
deshidrogenasa
Fosfoglicerato cinasa Crónica Sí (neuropatía)
Piruvato cinasa Crónica No
Fosfoglicerato mutasa No Poliglobulia
Diaforasa No Cianosis
Enolasa ND
Glucosa-6-fosfato Aguda (favismo) No
deshidrogenasa
6-fosfogluconato Crónica No
deshidrogenasa
Glutatión reductasa Aguda (favismo) Cataratas
Glutatión peroxidasa ND
Glutatión sintetasa Crónica Oxoprolinuria
y-glutamil-cisteína sintetasa Neuropatía
crónica
Lactato deshidrogenasa ND
ND, no demostrada.
ERRNVPHGLFRVRUJ
El déficit de G6PD constituye una causa de anemia hemolítica aguda y su existencia debe
sospecharse siempre que se trate de un individuo con crisis hemolíticas poco después
de la ingesta de habas o de alguno de los llamados medicamentos «oxidantes», algunos de
los cuales se m encionan en el cuadro 19-1.
La determinación de las actividades enzimáticas del eritrocito no es compleja, aunque
sí delicada, por cuanto cualquier contaminación por pequeña que sea o ligeras variacio
nes de la temperatura pueden modificar los resultados. Así, el análisis cuantitativo de las
actividades enzimáticas eritrocitarias debe efectuarse siempre a partir de hemolizados
desprovistos de contaminación leucocitaria. Ello es especialmente importante en la de
terminación de la actividad de PK, ya que esta enzimopatía eritrocitaria se acompaña de
una actividad leucocitaria normal; debido a ello, la contaminación del hemolizado por
leucocitos puede dificultar la detección del déficit.
CUADRO 19-1. Sustancias con potencial de acción hemolítica en el déficit de G6PD
• Analgésico/antipiréticos
• Acetanilida
• Acetofenetidina (fenacetina)
• Amidopirina (aminopirina)
• Antipirina
• Ácido acetilsalicílico
• Fenacetina
• Probenecida
• Piramidón
• Antipalúdicos
• Cloroquina
• Hidroxicloroquina
• Mepacrina (quinacrina)
• Pamaquina
• Pentaquina
• Primaquina
• Quinina
• Quinocida
• Agentes cardiovasculares
• Procainamida
• Quinidina
• Sulfonamidas/sulfonas
• Dapsona
• Sulfacetamida
• Sulfametoxipirimidina
• Sulfanilamida
• Sulfapiridina
• Sulfasalacina
• Sulfisoxazol
• Miscelánea
• a-metildopa
• Ácido ascórbico (vitamina C)
• Dimercaprol (BAL)
• Hidracina
• Mestranol
• Azul de metileno
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CUADRO 19-1. Sustancias con potencial de acción hemolítica en el déficit de G6PD (cont.)
• Naftaleno
• Niridazol
• Fenilhidracina
• Piridio
• Quinina
• Azul de toluidina
• Trinitrotolueno
• Uratoxidasa
• Vitamina K soluble
• Citotóxicos/antibacterianos
• Cloranfenicol
• Cotrimoxazol
• Furazolidona
• Neoarsfenamina
• Nitrofiirantoína
• Nitrofiirazona
• PAS
• Habas (favismo)
Al objeto de sistematizar la metodología aplicada al análisis de las actividades enzi

máticas eritrocitarias en la práctica clínica, el Comité Internacional de Estandarización
en Hematología (ICSH) ha unificado la preparación del hemolizado y estandarizado
los diferentes métodos de análisis correspondientes a cada una de las enzimas que hay
que determinar. Ello ha constituido en gran m anera a disminuir la variabilidad entre
laboratorios y a garantizar la calidad de los resultados, especialmente de aquellos con
menos experiencia en este tipo de determinaciones.
Finalmente, al interpretar los resultados de un estudio enzimático eritrocitario,
debe tenerse en cuenta la edad del paciente y el número de reticulocitos presentes en el
momento de realizar el estudio. En los recién nacidos y niños menores de 1 año, ciertas
enzimas presentan actividades inferiores a las del estado adulto, lo que puede hacer creer
un falso déficit enzimático si no se tiene en cuenta la edad (tabla 19-2). Asimismo, el
grado de reticulocitosis es también muy importante, por cuanto los eritrocitos jóvenes
poseen actividades enzimáticas generalmente muy superiores a las del eritrocito adulto
normal. En tales casos, si la reticulocitosis es lo suficientemente alta, puede enmascarar
un déficit enzimático, al observarse una falsa «actividad normal» debida al efecto de los
reticulocitos (fig. 19-2).
TIPOS DE ERÍTROENZIMOPATÍAS
Enzim opatías de la glucólisis anaerobia
El eritrocito carece de mitocondrias, por lo que su única fuente de energía (ATP) es la
glucólisis anaerobia u oxidación de la glucosa a piruvato (v. fig. 19-1). Esta oxidación
se realiza en dos etapas: 1) transformación de una molécula de glucosa en dos triosa
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TABLA 19-2. Valores de referencia de las actividades enzimáticas en adultos sanos,

adultos con reticulocitosis (> 1 0 0 X 109/1) y recién nacidos a término
Reticulocitosis
Adultos Recién nacidos > 100.000 X 109/1
1. GLUCÓLISIS ANAEROBIA
Hexocinasa (HK) 0,62-1,26 1,3-2,1 1,37-2,86

Enolasa (ENOL) 3,93-5,67 9-13 5,6-8
Aldolasa (ALD) 1,46-3,46 1,83-4,3 2,1-4,9
Glucosa fosfato isomerasa (GPI) 45-66 73-107 56-81
Fosfofructocinasa (PFK) 6,2-13,9 5,8-8,25 10,8-16,1
Gliceraldehído-3-fosfato 168-300 206-367 265-473
deshidrogenasa (GA3PDH)
Fosfoglicerato cinasa (PGK) 197-343 254-442 250-437
Piruvato cinasa (PK) 8,4-15,2 8,85-16 10,4-18,9
3-fosfoglicerato mutasa (3-PGM) 10,7-20,63 10,8-21 12,1-23,4
2,3-difosfoglicerato sintasa 2,86-7,7 3,41-9,1 3,41-9,1
(2,3-DPGS)
Triosa fosfato isomerasa (TPI) 1.361-2.759 1.442-2.820 2.075-3.449
2. VÍA DE PENTOSAS-FOSFATO
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 5,7-9,9 8,4-14,6 8,6-14,9
(G6PDH)
6-fosfogluconato deshidrogenasa 6,12-10,2 6,7-9,85 8,8-14,9
(6-PGDH)
3. METABOLISMO DEL GLUTATIÓN
Glutatión reductasa (GS-SG RED) 5,3-11,9 7,6-17 6,5-14,6
Glutatión peroxidasa (GPX) 9,1-25 5,5-12,9 12-31
Glutatión reducido (GSH) 58-84 — 54-78
GSH + AFH 47-71 43-62
4. METABOLISMO NUCLEOTÍDICO
Adenilato cinasa (AK) 180-310 64 109 186-315
La actividad enzimática viene expresada en unidades/gramo de Hb.
El GSH viene expresado en mg/100 mi de hematíes.
AFH, acetilfenilhidracina.
Reticulocitos (%)
FIGU RA 19-2. Relación entre actividad enzimática y porcentaje de reticulocitos (R. Van Wijk, 2011).
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fosfatos (gliceraldehído 3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato), con consum o de dos

moléculas de ATP, y 2) transformación de las triosa fosfatos en piruvato con producción
de dos moléculas de ATP. El rendimiento energético de esta vía metabólica es favorable,
debido a que en el eritrocito existe una conversión total de la dihidroxiacetona fosfato en
gliceraldehído-3-fosfato, con lo que la oxidación de una molécula de glucosa a piruvato
supone siempre un rendimiento neto de dos moléculas de ATP. Aunque la cantidad de
ATP, que se obtiene a través de la glucólisis anaerobia, es muy inferior a la que podría
obtenerse por oxidación mitocondrial del piruvato, resulta suficiente para las escasas
necesidades energéticas del eritrocito. La enzima más importante de esta vía es la PK,
cuyo déficit congénito constituye la causa más frecuente de anemia hemolítica crónica
no esferocítica (AHCNE). Junto a las enzimas de la glucólisis, el eritrocito posee otras
que contribuyen tam bién al m antenim iento de ATP. Entre ellas destacan como más
importantes la adenilato cinasa (AK), la pirimidina 5’-nucleotidasa (P5’N) y la adenosina
desaminasa (ADA).
La im portancia de la glucólisis anaerobia en el eritrocito se pone de manifiesto
cuando por algún mecanismo disminuye su actividad fisiológica. Así, el descenso del pH
intraeritrocitario disminuye la actividad de enzimas situadas en la prim era etapa de la
glucólisis y aumenta la formación de piruvato a expensas del 2,3-difosfoglicerato (2,3-
DPG). El 2,3-DPG es un metabolito muy abundante en el eritrocito y fundamental para
la regulación de la función hemoglobínica. Se origina a partir del 1,3-difosfoglicerato
(glicerato-l,3-P2) mediante u na reacción enzimática catalizada por la enzima 2,3-bis-
fosfoglicerato sintasa (BPGS), que posee tam bién actividad m utasa o fosfoglicerato
mutasa (MPGM). Cuando desciende el pH eritrocitario, se activa la función fosfatásica
de la BPGS y el 2,3-DPG se transform a en 3-fosfoglicerato (3-PG); con ello se cierra
el llamado «ciclo del 2,3-DPG». Finalmente, el 3-PG se transform a en lactato a través
de varias reacciones enzimáticas, en una de las cuales se produce una molécula de ATP.
D ebido a ello, cuando se produce un bloqueo metabólico de la prim era etapa de la
glucólisis, el eritrocito puede m antener durante cierto tiem po su contenido en ATP
gracias al consumo de 2,3-DPG (fig. 19-3).
GI ¡ce ra Ideh ído-3-fosfato
1 ,3 - b ¡ s f 0 s f 0 g l¡ c e r a t 0 , B isfosfo glicerato
bisfosfo glice rato

fosfatasa
P.
* Piruvato
FIGU RA 19-3. Ciclo del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-DPG).
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Enzim opatías de la vía de las pentosas-fosfato

La protección de las proteínas eritrocitarias y en especial de la hemoglobina frente a
la acción de los llamados agentes oxidantes, norm alm ente presentes en el interior del
eritrocito, se realiza mediante los sistemas antioxidantes, cuya finalidad es m antener el
glutatión eritrocitario en estado reducido (GSH) y, a la vez, reducir el hierro hemínico
(Fe++), para evitar la transformación de la hemoglobina en metahemoglobina.
El glutatión es un tripéptido sintetizado en el propio eritrocito, que actúa eliminando
el exceso de peróxido de hidrógeno (H20 2) mediante una reacción enzimática catalizada
por la glutatión peroxidasa (fig. 19-4). La catalasa, que es tam bién una enzima es
pecífica para la desintoxicación del H 20 2, solo actúa cuando su concentración es muy
elevada. Cuando disminuye la concentración eritrocitaria de GSH el exceso de H 20 2 no
eliminado facilita la desnaturalización de la hemoglobina, dando lugar a la formación de
precipitados intraeritrocitarios llamados cuerpos de Heinz (v. fig. 17-10). La presencia
de cuerpos de Heinz dificulta el paso de los eritrocitos a través del bazo y facilita su
eliminación o hemólisis. Asimismo, el H20 2 y otros peróxidos pueden actuar también
sobre las proteínas de membrana, dando lugar a la formación de agregados de espectrina
que disminuyen también la deformabilidad eritrocitaria y, por tanto, la vida media de
los eritrocitos en la circulación.
La causa más frecuente y mejor conocida de descenso del poder reductor eritrocitario
es el déficit congénito de la G6PD. Esta enzimopatía es muy frecuente en nuestro medio
y constituye la base molecular de la anem ia hemolítica aguda, desencadenada p or la
ingesta de habas o favismo.
Enzim opatías del m etabolism o nucleotídico

Como el eritrocito carece de síntesis de nucleótidos adenílicos (AMP, ADP y ATP),
todas aquellas enzimas que de alguna form a eviten su degradación o intervengan en
su síntesis adquieren gran im portancia funcional. Entre las enzimas im portantes de
esta vía, y cuyo déficit se acom paña de anemia hemolítica, destacan la P5'N, la ADA
y la AK. El déficit de P5'N produce u n acúm ulo intraeritrocitario de nucleótidos
adenílicos con dism inución de la degradación del exceso de ARN, que es la causa del
6-fosfogluconato
FIGU RA 19-4. Sistema antioxidante eritrocitario.
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Capítulo 19 Diagnóstico de las eritroenzim opatías 543
punteado basófilo. El defecto hereditario de ADA que produce hemólisis consiste un

aum ento de la actividad o hiperactividad de la enzima p or m utación del gen regu
lador. El déficit de AK es excepcional y existen casos en los que la anemia hemolítica
crónica se acom paña de neuropatía.
Enzim opatías del sistem a reductor de la hem oglobina

El mantenimiento del hierro hemínico en estado reducido (Fe++) es fundamental para
que este pueda fijar reversiblemente el oxígeno molecular y, por tanto, para el transporte
de oxígeno a los tejidos. Ello depende de la actividad de la enzima m etahemoglobina
reductasa o NADH-diaforasa que se ha identificado con la fracción soluble de la cito-
cromo b5reductasa presente en numerosas células del organismo. El déficit hereditario
de NADH-diaforasa es causa de metahemoglobinemia, que en algunos pacientes puede
ir asociada a un trastorno neurológico grave. Junto a la NADH-diaforasa, el eritrocito
posee u n sistema diaforásico secundario (NADPH-diaforasa) que no funciona en
condiciones fisiológicas porque le falta el aceptor de electrones (citocrom o b5). No
obstante este sistema secundario (NADPH-diaforasa) puede actuar si se administra un
receptor apropiado, como por ejemplo, el azul de metileno. Por ello, en caso de déficit
de NADH-diaforasa, la administración de azul de metileno produce la reducción de la
hemoglobina y la desaparición de la cianosis.
MÉTODOS APLICADOS AL DIAGNÓSTICO

DE LAS ERITROENZIMOPATIAS
En la actualidad, existen diferentes procedimientos que informan acerca de la simple
existencia de un déficit de actividad enzimática hasta las características y mecanismos
moleculares de una enzimopatía determinada. La detección de una eritroenzimopatía
puede realizarse mediante métodos cualitativos o cuantitativos.
Los métodos cualitativos y de cribado se han aplicado principalm ente al es
crutinio del déficit de G6PD en poblaciones y, con m ucho m enor éxito, al de otras
enzimopatías de la glucólisis eritrocitaria. Debido a la elevada frecuencia del déficit
de G6PD en determ inadas razas o poblaciones (negra, asiática o m editerránea), el
ICSH recomienda emplear la prueba de la m ancha fluorescente para el escrutinio de
portadores asintomáticos de esta enzimopatía. Asimismo, la presencia de mosaicis-
mo en mujeres heterocigotas puede ponerse de manifiesto fácilmente m ediante un
método citoquímico basado en la incapacidad de los eritrocitos con déficit de G6PD
para reducir la metahemoglobina. Los métodos cualitativos aplicados a la detección
del déficit de PK se basan también en el principio de la m ancha fluorescente, aunque
han dem ostrado ser menos reproducibles que los empleados para la detección del
déficit de G6PD.
Los métodos cuantitativos son los únicos válidos para confirm ar la existencia
de una eritroenzim opatía. En general, aunque con ligeras diferencias, todos ellos
se basan en el em pleo de una mezcla de sustrato-coenzim as e iones en un m edio
tam ponado, donde la enzima que hay que estudiar constituye la etapa limitante. A la
reacción catalizada p or la enzim a se le acopla la transform ación de un nucleótido
nicotinam ídico (NAD o NADP) desde su form a oxidada a reducida o viceversa.
Debido a que el NADH y el NADPH presentan una absorbancia específica a 340 nm, la
medida espectrofotométrica de su velocidad de formación o desaparición determinará
la actividad enzimática.
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M étodos cualitativos y de cribado

P rueba de la m a n ch a fluorescente
Principio
Esta prueba, recomendada por el ICSH para el escrutinio del déficit de G6PD, consiste
en incubar sangre total en presencia de una solución tamponada que contenga los sus
tratos de la enzima G6PD (G6P y NADP) y después de impregnar una gota de la misma
sobre u n filtro, observarlo mediante luz ultravioleta (emisión de 340 nm) y apreciar la
aparición o no de fluorescencia (formación de NADPH2).
Si existe suficiente actividad de G6PD en la sangre, la mancha será fluorescente. Por
el contrario, en caso de déficit de G6PD (escasa o nula formación de NADPH2) no exis
tirá fluorescencia.
• Sangre total heparinizada o mantenida incoagulable con EDTA o ACD (paciente y
control).
• Lámpara ultravioleta.
• Papel de filtro (W hatman n.° 1).
• Solución de glucosa-6-fosfato (G6P) de 10 mmol/1 (305 mg de sal disódica en 100 mi
de agua destilada).
• Solución de NADP, 7,5 mmol/1 (600 mg de sal disódica en 100 mi de agua destilada).
• Saponina al 1% (10 g/1).
• Tris-HCl 750 mmol/1, pH = 7,8.
• Tris (hidroximetil-aminometano), 90,86 g/1,250 mi.
• HCI 1N , 33 mi.
• Agua destilada, c.s.p.* 1.000 mi.
• Glutatión oxidado (GSSG), 8 mmol/1.
Método
1. Se prepara de forma extemporánea la solución-reactivo. En la actualidad, existen
kits comerciales en los que deben seguirse las instrucciones correspondientes en
el mom ento de preparar la solución-reactivo:
(a) G6P 10 mmol/1,200 |xl.
(b) NADP 7,5 m mol/1,100 |xl.
(c) Saponina al 1%, 200 |xl.
(d) Tris-HCL 750 mmol/1, 300 |xl.
(e) GSSG 8 m mol/1,100 (jlI.
(f) H20 , 100 |xl.
2. En un tubo de ensayo se colocan 100 |xl de solución-reactivo y se añaden 10 jxl
de sangre total. Se agita suavemente.
3. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 5-10 min.
4. Se tom an 10 (xl de la mezcla y se impregna con ella el papel de filtro.
5. Se visualiza la mancha mediante una lámpara de luz ultravioleta.
Junto al estudio del espécimen de sangre problema deben procesarse simultáneamente
uno o varios controles normales.
c.s.p.: cantidad suficiente para.
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En muestras de sangre normales (controles), las manchas son intensamente fluores
centes debido a la formación de NADPH2. Cuando existe déficit de G 6 PD (<20% de la
actividad normal), no se observa fluorescencia.
En el caso de déficit de G 6 PD heterocigoto (mujeres portadoras) o hemicigoto (va
rones) con reticulocitosis, en los que la actividad es superior al 2 0 % de lo normal, puede
apreciarse fluorescencia, m uy difícil de distinguir de la que se observa en las muestras
normales. Es recomendable procesar cuanto antes la muestra de sangre recién extraída,
pero si ha de demorarse la determinación es preferible usar ACD como anticoagulante,
ya que la actividad puede conservarse hasta 3 semanas, si la muestra se mantiene a 4 °C.
Glutatión reducido eritrocitario (GSH)
Principio
El glutatión reducido (GSH) es un tripéptido (glutamil-cisteinil-glicina) que, al mantener
un estado reducido intraeritrocitario, preserva contra la acción directa de los diversos
agentes oxidantes (H 20 2 principalmente) sobre la hemoglobina y otros componentes
del eritrocito. La concentración normal de GSH se mantiene gracias a la acción de una
enzima llamada glutatión reductasa (GR) y del metabolito NADPH2. La enzima G 6 PD
es la responsable de que exista suficiente NADPH 2 para el norm al ftincionamiento de
la enzima GR (v. fig. 19-4).
A unque existen varios procedim ientos para la determ inación del GSH eritroci
tario, aquí solo se describe el más empleado y que se basa en la reducción del ácido
55'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) en ausencia y presencia de acetil-fenilhidracina
(APH) que es una sustancia oxidante. La adición de APH tiene como objeto demostrar
la capacidad del eritrocito para mantener su concentración de GSH.
• Sangre total heparinizada.
• Metanol absoluto.
• AT-acetil-AT-fenilhidracina (APH).
• Solución precipitante formada por:
• Ácido metafosfórico glacial, 1,67 g.
• EDTA sódico, 0,2 g.
• NaCl, 30 g.
• Agua bidestilada, c.s.p., 100 mi.
• Solución de fosfato disódico (P 0 4H Na2), 0,3 mol/1.
• Reactivo de 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB), preparado de la siguiente manera:
• DTNB, 30 mg.
• Citrato sódico al 1%, c.s.p., 100 mi.
Método
1. Se prepara la solución de APH (se disuelve 1 g de APH en 10 mi de metanol).
2. Se colocan 10 fil de la solución de APH en diversos tubos, de form a que, al
evaporarse el metanol, quedará 1 mg de APH en polvo en cada uno de ellos.
3. Se añaden a un tubo que contiene 1 mg de APH y a otro sin APH 0,2 mi de sangre
total, respectivamente, y se incuba la mezcla 2 h a 37 °C.
4. Terminada la incubación, se procede con los dos tubos de la siguiente forma:
(a) Se añaden 1,8 mi de agua bidestilada a cada tubo y se hemoliza la sangre
mediante agitación vigorosa.
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(b) Se añaden 3 mi de solución precipitante, se remueve mediante agitador de

tubos y se espera 5 min antes de filtrar.
5. Se recoge el filtrado y se procede del siguiente modo:
Pro b lem a (mi) 151anco (mi)
Filtrado 1
Sol. P 0 4HNa2 4 4
Reactivo DTNB 0,5 0,5
Solución precipitante (diluida 1
al 3/2 en agua destilada)
6 . Mediante un colorímetro o espectrofotómetro (412 nm ), se lee la absorbancia

(A) del problema frente al blanco.
, A 412 X310,4x100
GSH(mg/dl eritrocitos) = ----------------------
Hto

Pueden considerarse como valores de referencia para nuestra población:
• GSH: 54,75-82,7 mg/dl de eritrocitos.
• GSH después de la incubación en presencia de APH: 42-71,1 mg/dl de eritrocitos.
El contenido eritrocitario en GSH y su estabilidad frente a la acetilfenilhidracina
(APH) se hallan notablemente disminuidos en el déficit de glucosa-6 -fosfato deshidroge
nasa (G 6 PD) y en todas aquellas situaciones que comprometen el buen funcionamiento
de la vía de pentosas fosfato como, p or ejemplo, el déficit de 6 -fosfogluconato des
hidrogenasa (6 -PGD), el de GR o el de glutatión sintetasa (GS). Asimismo, se observa
un patrón similar en algunas hemoglobinopatías inestables. Por el contrario, tanto el
GSH como su estabilidad se hallan aumentados de manera característica en el déficit de
P5’N y en un elevado número de hemopatías malignas (síndromes mieloproliferativos
agudos y crónicos, principalmente). El valor del GSH se considera como procedimiento
de cribado imprescindible para la detección de enzimopatías de la vía de síntesis del
glutatión (v. fig. 19-4). Ello obedece a que la medida de las actividades 7 -glutamilcisteína
sintetasa (GGCS) y GS, debido a su dificultad metodológica, no forma parte de la batería
habitual para el estudio de las eritroenzimopatías, pero el hallazgo de una concentración
de GSH muy disminuida o prácticamente de cero, no atribuible a otra causa, es altamente
sugestiva de déficit de alguna de estas dos enzimas, por lo que deberán ser investigadas
convenientemente.
Análisis citoquímico de la G6PD sobre porta

Principio
Esta prueba tiene como única finalidad la detección de mujeres portadoras heterocigotas
del déficit de G 6 PD; permite visualizar la presencia de G 6 PD (mediante la precipitación
de formazán) en los eritrocitos de forma individual. No debe olvidarse que la prueba no
es específica para el déficit de G6 PD, sino que pueden mostrar el mismo patrón cualquie
ra de las causas citadas en el apartado anterior y comprometer el buen funcionamiento
de la vía de pentosas-fosfato.
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La reacción analizada es la siguiente:
Hb Meta:Hb C,6I>D >Oxi-Hb

Oxi-Hb — M11 ) Formazán
• Sangre heparinizada o en ACD.
• Nitrito sódico, 0,18 mol/1.
• Solución incubadora (preparación extemporánea).
• NaCl 0,15 mol/1,4 mi.
• Glucosa al 5%, 1 mi.
• Tampón fosfato potásico (0,3 mol/1, pH = 7), 2 mi.
• Sulfato de azul de Nilo (11 mg/100 ml), 1 mi.
• H20 bidestilada, 2 mi.
• Solución de metiltiotiazol (MTT):
• 5 mg/ml de NaCl 0,15 M (preparación extemporánea).
• NaCl al 0,6% en agua destilada.
Método
1. Se centrifuga la sangre a +4 °C durante 5 min a 3.000 r.p.m. y se elimina el plasma.
2. Se mezclan 0,5 m i de eritrocitos con 9 mi de NaCl 0,15 mol/1 y 0,5 m i de nitrito
sódico 0,18 mol/ 1.
3. Se incuba la mezcla a 37 °C durante 20 min.
4. Se centrifuga a +4 °C durante 15 m in (3.000 r.p.m.).
5. Se elimina el sobrenadante sin eliminar la capa de leucocitos. Se añaden 9 mi de
NaCl 0,15 mol/1, y se centrifuga eliminando el sobrenadante. Se repite la misma
operación dos veces más. Al final del último lavado se elimina la capa de leucocitos.
6 . Se mezcla bien el paquete eritrocitario y se añaden 50 |jil del mismo a 1 mi de
líquido incubador.
7. Se incuba la suspensión a 37 °C durante 30 m in sin agitar y después de este
tiempo se añaden 0,2 mi de solución MTT. Se agita y se continúa la incubación
durante 1 h más.
8 . Se mezcla una gota de la suspensión con una gota de NaCl al 0,6%, se coloca la
mezcla encima de un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos.
9. Se m ira al microscopio ( X40).
10. Se analiza la presencia de gránulos de formazán en un mínimo de 500 eritrocitos
de acuerdo con el criterio siguiente:
(a) Puntuación 0: inexistencia de granulación.
(b) Puntuación 1+: de uno a tres gránulos.
(c) Puntuación 2+: cuatro o más gránulos.

Esta prueba, utilizada hace años para detectar portadoras heterocigotas de déficit
G 6 PD, es muy engorrosa, y en la actualidad ha sido totalmente sustituida por el estudio
genético de la G 6 PD, mediante PCR o secuenciación. Debido al fenómeno de Lyon, o
inactivación cromosómica durante el desarrollo, el número de eritrocitos con capacidad
para reducir el M TT a form azán es generalmente superior al de los que carecen de
ella. En tales casos, la actividad G 6 PD obtenida a partir del hemolizado puede hallarse
normal o muy poco disminuía, por lo que la prueba citoquímica permitirá demostrar la
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presencia de una población eritrocitaria desprovista de G6PD y establecer así el carácter

portador del déficit.
En condiciones normales, la mayoría de eritrocitos analizados contienen cuatro
o más gránulos de formazán en su interior. Ello se debe a que poseen una capacidad
normal para reducir el MTT a formazán debido a la actividad G6PD. En caso de déficit,
aumenta sensiblemente el núm ero de eritrocitos sin granulación, con lo que se observa
un predom inio de los mismos con puntuación 0. C uando el déficit de G6PD es de
prácticamente 0 (sujetos hemicigotos con variantes de tipo mediterráneo), la puntuación
0 es de prácticamente el 100%. Cuando la actividad es de aproximadamente el 50%
(mujeres heterocigotas), se aprecia un 50% de la población eritrocitaria desprovista de
granulación (puntuación 0) y un 50% con granulación normal.
M étodos cuantitativos
El análisis cuantitativo de las actividades enzimáticas eritrocitarias, excepto la pirimidi-
na-5'-nucleotidasa (P5'N), se basa en la preparación, para cada una de ellas, de una mez
cla reactiva, en la que la enzima que hay que analizar constituye la etapa limitante y en el
curso de la reacción enzimática existe una transformación de derivados nicotinamídicos
desde sus formas oxidadas a reducidas o viceversa. Debido a que tanto el NADH2 como
el NADPH2presentan una absorción específica a 340 nm, la medida espectrofotométrica
de la velocidad vendrá dada por la velocidad observada en la formación o desaparición de
estos compuestos (variación de absorbancia por m inuto o A/min). Como el principio
utilizado para determ inar todas las actividades enzimáticas es el mismo, el ICSH ha
estandarizado la metódica a emplear en la clínica para que los resultados obtenidos en
diferentes laboratorios sean comparables.
Las actividades enzimáticas pueden expresarse en U/100 m i de eritrocitos, U/109 de
eritrocitos o U l/g Hb. La forma recomendada por el ICSH es la de U l/g Hb a 37 °C, para
lo cual una vez realizada la lectura espectrofotométrica se aplica la siguiente fórmula
común:
TTT/ TT, AA340 1 100C _
U I/s H b = --------------- x — x ------- x D
eNAD(P)H Vh Hb
AA340 = variación de la absorbancia por minuto.

8 = coeficiente de extinción molar del NADH o NADPH (6,22 X 103).
H b = hemoglobina del hemolizado.
Vh = volumen de hemolizado en la cubeta.
C = paso de luz de la cubeta (1 cm).
D = dilución del hemolizado empleado.
Aspectos generales que se deben tener en cuenta

Las actividades enzimáticas, aunque pueden medirse aisladamente, en general se determi
nan bajo forma de perfil completo o batería de 18 enzimas que explora, de una vez, todas
las vías metabólicas más importantes del eritrocito. Este listado, con sus correspondientes
valores de referencia se representa en la tabla 19-2. Los valores de referencia de las acti
vidades enzimáticas listadas en esta tabla corresponden a individuos adultos, los cuales
difieren de los correspondientes al período neonatal (recién nacidos a término). Cada
una de las enzimas incluidas en esta tabla se analiza de manera individual, pero de forma
conjunta con todas las demás. Debido a ello se requiere tener preparados todos los reactivos
imprescindibles para realizar estas determinaciones de forma conjunta (cuadro 19-1).
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Cabe señalar otros tres aspectos importantes:

1. La inclusión del cociente PK/HK resulta muy im portante en pacientes con in
tensa reticulocitosis, ya que la actividad PK es muy dependiente de la juventud
eritrocitaria y, por tanto, en casos de elevada reticulocitosis, puede m ostrar una
actividad aparentemente normal (dentro de los límites de referencia). Para poder
desenmascarar esta falsa apariencia de normalidad, se utiliza el cociente PK/HK
que compara su actividad con la de la HK, otra enzima aún más dependiente de
la reticulocitosis (v. fig. 19-2). Así, mientras en condiciones normales, es decir, en
ausencia de déficit de PK, el cociente PK/HK oscila entre 7,2 y 15,6, en caso de
déficit con intensa reticulocitosis este valor es generalmente inferior a 7,2. Este
hallazgo perm ite sospechar la existencia de un déficit de PK enmascarado por
la reticulocitosis. Aunque más rara, también puede darse la situación inversa, es
decir, la existencia de un déficit de HK, en cuyo caso el cociente PK/HK mostrará
un valor próximo a 15,6 o superior.
2. El contenido en glutatión reducido eritrocitario es un sustrato que se mide en
mg/dl de eritrocitos. Tiene valor como m étodo de cribado de déficit de GR o de
alguna de las enzimas que interviene en la síntesis del glutatión (GGCS y GS).
3. Preparación del hemolizado: la sangre puede ser recogida mediante los anticoa
gulantes heparina o ACD. Es esencial que los eritrocitos estén libres de leucocitos
y plaquetas; para ello, la sangre total debe filtrarse a través de una columna de
celulosa microcristalina a-celulosa preparada del siguiente modo:
(a) Se mezcla una parte de celulosa microcristalina con dos partes de a-celulosa,
disueltas en suero fisiológico. De esta mezcla se ponen 2 mi en una jeringa
de 5 ml, a la que previamente se ha colocado un pequeño papel de filtro en
el fondo. La columna es equilibrada con suero salino fisiológico.
(b) Se hace pasar por la columna 1 mi de sangre total que tenga un hematocrito
de aproximadamente el 50%, y se recoge el eluido formado por eritrocitos
libres de leucocitos y plaquetas en un tubo.
(c) Se vuelve a pasar suero fisiológico para que la columna quede lo más limpia
posible de eritrocitos. Los eritrocitos así obtenidos se lavan dos o tres veces con
suero fisiológico y el paquete final es resuspendido al 50% en suero fisiológico.
Para preparar el hemolizado, se mezcla un volumen de la suspensión de eritrocitos
lavados (al 50% en suero fisiológico) con nueve volúmenes de la solución estabiliza-
dora y se procede a su congelación-descongelación tres veces consecutivas. Con ello se
obtiene un hemolizado que corresponde a una dilución 1/20 del paquete eritrocitario
inicial. A partir del hemolizado 1/20 (que es el que se empleará para la mayoría de las
determinaciones enzimáticas) se procede a preparar dos nuevas diluciones en solución
estabilizadora: una de 1/200 y otra de 1/2.000, necesarias para la dosificación de algunas
actividades enzimáticas.
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y 6-fosfogluconato deshidrogenasa

(6-PGD)
Principio
La G6PD (EC 1.1.1.49) es una enzima presente en todos los seres vivos. En los mamíferos
cataliza la primera reacción en la vía de la pentosa fosfato, la ruta metabólica que aprovi
siona a la célula de NADPH y de pentosas para la síntesis de ácidos nucleicos. La reacción
catalizada por la G6PD es la reducción de la NADP+a expensas de la deshidrogenación de
la glucosa-6-fosfato en 6-fosfogluconato.
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G 6P+ NADP+ fí6l>D >6-PG + NADPH+ H +

6-PG+ NADP+ 6'PGU ) Ribulosa-5-fosfato+ NADPH++ H++ C 0 2
Método
En cuatro cubetas se coloca el volumen (jxl) de reactivos indicados a continuación:
Cubetas
1 2 3 4
Blanco (|jl 1) G6PD (|xl) 6-PGD (|xl) G6PD + 6-PGD (|xl)
Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8 — 100 100 100
MgCl2, 0,1 mol/1 — 100 100 100
NADP, 2 mmol/1 — 100 100 100
Hemolizado (1/20) — 20 20 20
Agua bidestilada 1.000 580 580 480
Se incuba a 37 °C durante 10 min.
G6P, 6 mmol/1 100 100
6-PG, 6 mmol/1 100 100
Se mide la variación de absorbancia (A) por minuto a 340 nm (a 37 °C).
AAM7m in 1 100 ADO/min „ „

UI/gH b = --------------- x — x ----- = --------------- x0,8
6,22 20 Hb Hb(g/dl)
La actividad de G6PD se obtiene a partir de la diferencia entre la actividad observada

en la cubeta n.° 4 y la observada en la n.° 3.

Los valores de referencia ( X ± 2DE a 37 °C) para la actividad G6PD son de 5,7 a 9,9 Ul/g
Hb. Junto a esta actividad se determina sistemáticamente la de la enzima 6-PGD cuyos
valores de referencia son 6,18 a 10,22 U/g Hb.
El déficit de G6PD es la eritroenzim opatía más frecuente y la m ejor conocida.
Se ha estudiado am pliam ente tanto clínica com o m olecularm ente, en un elevado
núm ero de grupos étnicos. Su frecuencia es mayor en determ inadas razas (negra,
caucásica del área m editerránea y asiática), y nuestro país es uno de los afectados,
aunque en m enor intensidad que otras áreas del litoral m editerráneo. Su transm isión
hereditaria se halla ligada al sexo, y p or ello la expresividad clínica es propia de los
individuos hemicigotos (varones) y hom ocigotos (mujeres). Esta enzim opatía suele
presentarse bajo la form a de un síndrom e aném ico agudo, generalm ente intenso,
con cefalea, fiebre, ictericia y hem oglobinuria, pocas horas después (a veces 1 o 2
días) de la ingesta de ciertos m edicam entos (cuadro 19-2) o alimentos, como por
ejemplo, habas. O tros factores desencadenantes de hemólisis aguda en el déficit de
G6PD son las infecciones, en especial la neum onía bacteriana, la hepatitis aguda
y tam bién tra sto rn o s m etabólicos diversos en tre los que destaca la cetoacidosis
diabética. Con m ucha m enor frecuencia, el déficit de G6PD puede cursar con un
síndrom e hemolítico crónico.
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CUADRO 19-2. Reactivos imprescindibles para la medida de las actividades enzimáticas
Reactivos generales
• Ácido clorhídrico (HC1)
• Fosfato disódico (Na2H P04)
• (3-mercaptoetanol
• Hidroximetil-amino-metano (Tris)
• Ácido etilenodiaminotetraacético, sal disódica (EDTA)
• Cloruro sódico (NaCl)
• Fosfato potásico (KH2P 0 4)
• Cloruro magnésico (MgCl2)
• Cloruro potásico (KC1)
• Ácido tricloroacético al 30%
• Ácido molíbdico
• Solución de Fiske Subbarow (Sigma®)
• Fosfato dipotásico (K2H P04)
• Bicarbonato sódico (NaHC03)
• Enzimas purificadas
• Lactato deshidrogenasa (LDH), 60 U/ml
• Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), 10 U/ml
• Piruvato cinasa (PK), 50 U/ml
• Glutatión reductasa (GR), 10 U/ml
• Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GA3PD), 40 y 50 U/ml
• Glicerín-3-fosfato deshidrogenasa (G3PD), 2 U/ml
• Enolasa (ENOL), 10 U/ml
• 3-fosfoglicerato cinasa (3-PGK), 50 U/ml
• Triosa fosfato isomerasa (TPI), 60 U/ml
• Aldolasa (ALD), 5 U/ml
• Malato deshidrogenasa (MDH), 1 U/ml
Sustratos
• Nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH)
• Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP)
• Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH)
• 6-fosfogluconato (6-PG)
• Glucosa-6-fosfato (G6P)
• Adenosín-5-difosfato (ADP)
• Fosfoenol-piruvato (PEP)
• Fructosa-1,6-bisfosfato (F1,6BP)
• Fructosa-6-fosfato (F6P)
• Glucosa
• Adenosa-5-trifosfato (ATP)
• Glucosa-1-fosfato (G1P)
• Glucosa-1,6-bisfosfato (G1,6BP)
• Adenosín-monofosfato (AMP)
• Glutatión oxidado (GSSG)
• Flavina adenina dinucleótido (FAD)
• Glutatión reducido (GSH)
• 3-fosfoglicerato (3-PG)
• 2-fosfoglicerato (2-PG)
• Citidina monofosfato (CMP)
• Uridina monofosfato (UMP)
(Continúa)
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CUADRO 19-2. Reactivos imprescindibles para la medida de las actividades enzimáticas (cont.)
• Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD)

• 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG)
• Piruvato sódico
• Adenosina
Soluciones
• Solución salina fisiológica (NaCl, 0,15 mol/1)
• Solución estabilizadora formada por EDTA, 2,7 mmol/, y mercaptoetanol, 0,7 mmol
por litro, pH = 7
• Solución tampón de Tris-HCl 1 mol/1 (EDTA, 5 mmol/1), pH = 8
• Solución tampón de fosfato sódico potásico, 0,2 mol/1, pH = 7
• Solución de cloruro magnésico (MgClj), 0,1 mol/1
• Solución de cloruro potásico (KC1), 1 mol/1
• Solución tampón de Tris-HCl, 10 mmol/1 (+ EDTA, 2,7 mmol/1) + mercaptoetanol,
0,7 mmol/1, pH = 6,5
• Solución tampón Tris, 30 mmol/1 (+ MgCl2, 30 mmol/1), pH = 8
• Solución tampón de diálisis (P5 N) Tris 10 mmol/1 + NaCl, 150 mmol/1 + MgCl2,
10 mmol/1 + EDTA, 0,02 mmol/1, pH = 8
• Solución bicarbonato sódico al 1% (NaHC03)
En el curso de la reticulocitosis es frecuente observar un aumento variable de la G6PD.

No obstante, esta es una enzima relativamente lábil y muy sensible al envejecimiento eri
trocitario, por lo que, si su determinación se demora mucho tiempo (>48 h) después de
extraída la sangre, pueden apreciarse importantes disminuciones de la actividad que in
cluso pueden simular un déficit. Dada la frecuencia en nuestro medio de la variante G6PD
deficiente mediterránea, cuya actividad es prácticamente 0 en hemicigotos, la detección del dé
ficit de G6PD, siguiendo la metódica descrita, resulta relativamente sencilla. Por ello, la
existencia de una actividad de G6PD solo ligeramente disminuida en un varón en el que exis
te sospecha de déficit G6PD debe hacer replantear el diagnóstico o en todo caso repetir
de nuevo la determinación enzimática a partir de una nueva muestra de sangre. Si después de
ello la actividad de G6PD continúa aún por debajo de los límites normales (< 2 DE), es
recomendable, antes de afirmar la existencia de déficit, repetir la determinación después
de renovar las soluciones tampón y los reactivos empleados para la misma.
En mujeres, la detección del déficit de G6PD es algo más delicada, aunque es rela
tivamente simple en portadoras con un 50% de actividad. Si la actividad es superior al
60% de la normal, en este caso la confirmación del carácter de portador debe hacerse
m ediante el estudio genético de la G6PD utilizando PCR (m utación conocida en la
familia) o secuenciación del gen G6PD.
El déficit de G6PD en su fase de hemólisis aguda (crisis de hemólisis) puede manifestarse
también por una alteración morfológica muy característica, que es la retracción del conte
nido hemoglobínico de los eritrocitos y la observación de espacios vacíos (desplazamiento
de la hemoglobina hacia uno de los extremos de la célula). A esta alteración se la conoce
con el nombre de excentrocitosis (fig. 19-5), y permite realizar el diagnóstico de déficit de
G6PD incluso antes de su confirmación mediante el estudio de la actividad en el hemolizado.
El déficit de 6-PGD es extremadamente raro, y se han descrito muy pocos casos.
Clínicamente es parecido al déficit de G6PD (crisis hemolíticas agudas generalmente
medicamentosas), pero dado que se hereda con carácter autosómico recesivo, puede
afectar a ambos sexos por igual.
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Fosfoglucom utasa (PGM1)

Principio
La fosfoglucomutasa (PGM1; EC 5A.2.2) es una enzima que cataliza la transferencia
del grupo fosfato desde el carbono 1 de la glucosa-1-fosfato (G1P) al carbono 6 de la
glucosa-5-fosfato.
Glucosa-lP< >Glucosa-6-P
G-6-P+N A D P+ C,6PD >6-PG+ NADPH+ H +
6-PG+NADP+ 6 PC,U >Ribulosa-5-P+ NADPH+ H +
La reducción de NADP se realiza a 340 nm.
Método
Blanco ((xl) Problema (|xl)

Tris-HCl, M, EDTA, 5 mM, pH = 8 — 100
Cl2M g,0,lM — 50
NADP, 2 mM — 100
Hemolizado al 1/20 — 50
G6PD, 10 U/ml — 20
Gl,6-difosfato, 0,7 mM — 200
H20 1.000 430
G1,6-difosfato, 0,05 M — 50
Se lee la variación de absorbancia (A) por m inuto.a 340 nm (a 37 °C).
TTT/ ADO340nm/min
UI/gH b = --------------------- x0,16
Hb(g/dl)
9*0^ .
• - •[ 1
s • *
a» • •co
*
FIGURA 19-5. Excentrocitos en un paciente con crisis hemolítica aguda debida a un déficit de G6PD.
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Los valores de referencia ( X ± 2D E a 37 °C) de la PGM varían entre 1,41 y 2,69 UI/g Hb.
El interés clínico de esta enzimopatía es m uy limitado porque no se han descrito defi
ciencias de la misma que hayan podido atribuirse a anemia u otra manifestación clínica.
Piruvato cinasa (PK)
Principio
La PK (EC 2.7.1.40) es una enzima de la glucólisis que cataliza la transferencia de un
grupo fosfato del fosfoenolpiruvato (PEP) a la adenosina difosfato (ADP), produciendo
una molécula de piruvato y otra de adenosina trifosfato (ATP).
Fosfoenol piruvato+ ADP —- ^ +-~>Piruvato+ ATP

Piruvato+ NADH —LUH >Lactato+ NAD+
La enzima posee un PM de 60 kDa, y está constituida p or tres m onóm eros. En
humanos, dos genes codifican para esta proteína: PKLR y PKM. El gen PKLR codifica la
secuencia de la enzima eritrocitaria (PKR) y hepática (PKL), mientras que el gen PKM
codifica dos isoenzimas (PKM1, que se expresa en el tejido muscular y embrionario, y
PKM2, que lo hace en otros tejidos, leucocitos y plaquetas). Todas estas isoenzimas se
originan mediante un mecanismo de splicing alternativo.
Método
Se preparan dos cubetas: blanco (H20 ) y problema, que contiene el sustrato (PEP) a saturación.
Blanco HzO (pl) Problema (pl)

Tampón TRIS-HCL, mol/1, pH = 8 r V*® ■ 100
MgCl2, 0,1 mol/1 — 100
NADH, 2 mmol/1 — 100
ADP, 30 mmol/1 (neutralizado) — 50
LDH, 60 U/ml — 100
Agua bidestilada 1.000 330
Hemolizado 1/20 — 20
Se incuba a 37 °C (durante 10 min).
PEP, 100 mmol/1 — 100
Se lee la variación de absorbancia (A) por minuto a 340 nm (a 37 °C).
Con lo expuesto se pretende medir la actividad de la PK a concentración saturante de sustrato PEP
(reacción enzimática convencional).

A D O ^/m in 1 100 AAJ4l7m in X 0 ,8
UI/gH b = ----------------- X— X------------- = ----------------------
6 ,2 2 20 Hb(g/dl) H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ± 2 DE a 37 °C) de la actividad PK varían entre 8,4 y 15,2 UI/g Hb.
El déficit congénito de PK es m ucho m enos frecuente que el de G6PD, pero puede
observarse en nuestro m edio con una incidencia sim ilar a la del resto de Europa
en general (1 p or cada 50.000 habitantes). Cursa con u n cuadro clínico similar al
de la esferocitosis hereditaria (anemia de intensidad variable, reticulocitosis y es
plenomegalia), pero sin esferocitos y una fragilidad osm ótica eritrocitaria norm al.
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TABLA 19-3. Variaciones de las actividades enzimáticas eritrocitarias en sangre fetal

(recién nacidos) y en caso de reticulocitosis (>100 X 109/1)
Aumento de actividad Disminución de actividad

Reticulocitosis y eritrocitos fetales Eritrocitos fetales
• Hexocinasa • Fosfofructocinasa
• Enolasa • Glutatión peroxidasa
• Aldolasa • Adenilato cinasa
• Triosa fosfato isomerasa • Acetilcolinesterasa
• Fosfoglucosa isomerasa • Diaforasa
• Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD)
• Pirimidina-5-nucleotidasa
• 2,3-difosfoglicerato sintasa
• Glutatión reductasa
• Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Reticulocitosis (exclusivamente) Diseritropoyesis adquirida
• Piruvato cinasa • Piruvato cinasa
• 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6-PGD) • Adenilato cinasa
• Fosfofructocinasa
• Glutatión peroxidasa
• 3-fosfoglicerato mutasa
Ocasionalm ente, se observan algunos equinocitos (eritrocitos con espículas) que

pueden co n trib u ir al diagnóstico (fig. 19-6). La presencia de equinocitosis en un
déficit enzimático se atribuye a la falta de ATP, ya que no es exclusiva del déficit de
PK sino que puede observarse en cualquier enzimopatía de la glucólisis anaerobia. La
transm isión hereditaria del déficit de PK es autosóm ica recesiva, por lo que los porta
dores heterocigotos del déficit suelen carecer de expresividad clínica o hematológica,
aunque se han descrito algunos casos en que puede observarse hemólisis neonatal o la
aparición de un síndrome hemolítico en el curso de situaciones de estrés. Finalmente,
en ciertas hem opatías, especialmente en los llamados síndrom es mielodisplásicos,
pueden verse disminuciones adquiridas de la enzima de hasta un 50% de su actividad
norm al (tabla 19-3).
En la determinación de la PK existen tres posibles causas de error:
1. Reticulocitosis.
2. Contaminación leucocitaria.
3. Variantes moleculares con comportamiento cinético peculiar:
(a) La PK es una enzima m uy influenciable p or la reticulocitosis debido a que
los reticulocitos tienen actividad PK varias veces superior a la de los hema
tíes maduros. Debido a ello, al analizar la actividad enzimática a partir del
hemolizado debe tenerse siempre muy en cuenta la cifra de reticulocitosis.
Por ello, cuando esta es muy elevada puede llegar a enmascarar un déficit
de PK.
(b) O tro aspecto a tener en cuenta en el análisis de la PK es que el hemolizado
esté totalmente desprovisto de leucocitos. Ello es así porque el déficit de PK
eritrocitaria (PKLR) se acompaña de una actividad normal de PK leucocitaria
(PKM2). En consecuencia, la presencia de contaminación leucocitaria puede
dificultar el diagnóstico de un déficit de PK.
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F IG U R A 19 -6 . Equinocitos en un paciente con déficit de piruvato cinasa e intensa anemia.
(c) Finalmente, existen variantes deficientes de PK en las que el déficit solo

se po n e de m anifiesto en presencia de co ncentraciones m uy bajas de
sustrato. Por ello, si solo se emplea una concentración saturante de sustrato,
como sucede con cualquier determ inación enzimática, la detección de la
enzimopatía resulta imposible, ya que la actividad que se obtiene en estas
condiciones es normal.
Glucosa fosfatoisomerasa (GPI)

Principio
La glucosa-6-fosfatoisomerasa (EC 5.3.1.9) es una enzima, presente en gran parte de
los seres vivos; cataliza la reacción reversible de G6P a fructosa-6-fosfato (F6P). En el
citoplasma, forma parte de las rutas metabólicas de la glucólisis y la gluconeogénesis, y
en la matriz extracelular funciona como factor neurotrófico.
G6P- <?PI- >F6P
Método
Blanco (|jl1) Problema (|xl)
Tampón Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8 — 100
MgCl2, 0,1 mol/1 — 100
NADP, 2 mmol/1 10
F6P, 20 mmol/1 100
Se incuba durante 10 min a 37 °C.
Hemolizado 1/20 5
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AA347min 1 100 AA340/min x 3,21

6,22 5 Hb Hb (g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) para la actividad GPI oscilan entre 45 y
66 U l/g Hb. Después del déficit de PK, el de GPI es la enzimopatía más frecuente que
cursa con un síndrome hemolítico crónico. Dada su posición estratégica entre la glucó
lisis anaerobia y la vía de pentosas fosfato, puede acompañarse de hemólisis aguda con
formación de cuerpos de Heinz. La enzima GPI eritrocitaria es un dímero con actividad
exclusivamente enzimática, mientras que en su forma monomérica, presente en diversos
tejidos (especialmente el nervioso), posee una actividad neurotrófica (neuroquina), por
lo que, excepcionalmente, el déficit congénito de GPI puede asociarse también a tras
tornos neurológicos (retraso mental).
Hexocinasa (HK)
Principio
La hexocinasa (HK; EC 2.7.1.1) es una enzima que transfiere un grupo fosfato desde una
molécula de «alta energía» (ATP) a otra que actuará como aceptora de este fosfato (p. ej.,
glucosa) llamada sustrato. Esta transferencia se denomina fosforilación.
ATP+ Glucosa — ^ - ^ G 6 P + ADP

Mg
G 6P+NADP G6PD >6-PG+ NADPH+ H+
Método
Blanco (|xl) Problema (|xl)
Tampón Tris-HCl, pH = 8 — 100
MgCl2, 0,1 mol/1 — 100
Glucosa, 20 mmol/1 — 100
ATP, 20 mmol/1 (en bicarbonato al 1%) — 500
NADP, 2 mmol/1 — 100
G6PD, 10 U/ml — 10
Se lee la variación de absorbancia (A) por minuto a 340 nm durante 20 min (a 37 °C).
AA /m in 1 100 A D O /m inx 0,321

UI/gHb = --------------- x — x ------------- = ------------------------
6,22 50 Hb(g/dl) Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la HK oscilan entre 0,62 y 1,26 U l/g Hb.
La actividad de esta enzima depende mucho de la concentración de reticulocitos, por
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lo que una actividad norm al o ligeramente dism inuida en presencia de una intensa
reticulocitosis debe hacer sospechar la existencia de u n déficit.
El déficit de HK es una enzimopatía rara. Clínicam ente, presenta características
superponibles al déficit de PK, pero con un cuadro anémico de mayor intensidad. Ello
obedece a que, a diferencia del déficit de PK, que se caracteriza p or un aum ento del
2,3-DPG, en el déficit de HK existe una marcada disminución de este metabolito, con
lo que disminuye la eficacia funcional de la hemoglobina y la liberación de oxígeno a
los tejidos es menor.
Fosfofructocinasa (PFK)
Principio
La PFK (EC 2.7.1.11) es la principal enzima reguladora de la glucólisis y está formada
por cuatro subunidades cuya actividad alostérica es regulada por varios activadores e
inhibidores. La PFK cataliza la fosforilación de la F6F con gasto de una molécula de ATP
para formar fructosa- 1,6-bisfosfato (F1,6BP) y ADP.
F6P+ATP -PF¿ —»F1,6BP+ADP

Mg
F1,6BP ALD >GA3P+DHAP GA3P—^¡->DHAP
DHAP+ N A D H + H + fí3PD >a-glicerofosfato+NAD+
Método
Blanco (pl) Problema (|xl)

Tampón Tris-HCl, pH = 8 — 100
MgCl2, 0,1 mol/1 — 200
F6P, 20 mmol/1 — 100
Solución de enzimas* — 100
Se incuba 10 min a 37 °C.
ATP, 20 mmol/1 en HNaC03 — 100
al 1%
^Solución de enzimas:
Aldolasa (50 U/ml), 0,55 mi
TPI sol. 1 (1 mi de [N H J2S04 + 0,01 mi de TPI), 0,05 mi
G3PD (50 U/ml), 0,125 mi
(NH4)2S 04, 3,2 mol/1,0,275 mi
Dilución al 1/15 = 0,1 mi de la solución de enzimas + 1,4 mi de solución estabilizadora.

AD0M0/m in x 0,8
UI/gH b = -
Hb(g/dl)
ERRNVPHGLFRVRUJ

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la PFK oscilan entre 6,2 y 13,9 UI/g Hb.
El déficit congénito de PFK es raro, aunque no excepcional. La enzima PFK hum ana es
codificada p or tres genes diferentes (PFK M, PFK L y PFK P) y en los tejidos se halla
bajo diferentes isoenzimas que resultan de la unión de las diferentes subunidades (M,
L y P). Así, mientras en el músculo solo existe un isoenzima (M4), en los eritrocitos
existen cinco isoenzimas diferentes (M4, M3L1, M2L2 ML3 y L4). Dado que en la
gran mayoría de los casos la enzimopatía obedece a mutaciones en el gen M, el m ús
culo y los eritrocitos se hallan siem pre afectados de form a sim ultánea aunque en
diferente intensidad. Por ello, el déficit de PFK suele cursar con un síndrome hemolítico
de escasa intensidad (la mayoría de las veces, hemólisis compensada), y m iopatía de
características clínicas superponibles a la glucogenosis tipo VII o enfermedad de Tarui
(debilidad muscular con intolerancia al esfuerzo, calambres y movimientos rítmicos
incontrolables, insuficiencia m uscular a pequeños esfuerzos y orinas oscuras debido
a la mioglobinuria). La coexistencia de anemia hemolítica, miopatía y orinas oscuras
es altamente sugestiva de déficit de PFK. En esta enzimopatía es también caracterís
tica la hiperuricemia.
Triosa fosfato isomerasa (TPI)

Principio
La TPI (EC 5.3.1.1) es una enzima que cataliza la interconversión entre gliceraldehído-3-
fosfato (DL-GA3P) y dihidroxiacetona fosfato (DHAP). Esta es una enzima implicada
en la glucólisis, y estructuralmente es un homodímero donde cada subunidad posee un
cilindro 3 paralelo con hélices a en los nexos de unión. Su sitio activo se encuentra en la
parte superior del cilindro y posee un residuo de glutamato (Glu 165) y otro de histidina
(His 95) que son esenciales para la catálisis.
DL-GA3P <-—pl-™ »DHAP

M á n T -T _ L T -T + i n U A D / G3PD
(;3PU
NADH+H+ +D H A P< awD >NAD+ +a-glicerofosfato
Método
Blanco (|xl) Problema (jj_1)

Tampón Tris-HCl, 1 mmol/1, 100
pH = 8
NADH, 20 mmol/1 100
Hemolizado 1/2.000 10
G3PD (2 U/ml) 50
Se incuba 10 min a 37 °C.
DL-GA3P, 30 mmol/1 — 100
Ajuste de la concentración de GA3P comercial (Sigma®) 50 mg/ml.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Se diluye la DL-GA3P comercial al 1/10 en agua bidestilada y se prepara la mezcla

reactiva siguiente:
DL-GA3P (1/10) — 5
Agua bidestilada 5 —
Tam pón Tris-HCI, 1 mmol/1, 100 100
pH = 8
NAD H, 2 mmol/1 100 100
TPI (no diluido, comercial) 5 5
G3PD H (2 U/m l) 50 50
Agua bidestilada 740 740
Se lee la línea de base.
Se lee a 340 nm hasta que no haya variación de DO.
DL-GA3P = A A x2-Q00= c mmol/1

6,22
Para obtener una concentración de 30 mmol/1, se toman 0,3 mi de DL-gliceraldehído

comercial y se ajusta a un volumen igual de 0,01 X «C» en agua bidestilada.

ADO3" / min X 161
U I/gH b =
Hb(g/dl1)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la TPI son 1.362 a 2.769 U l/g Hb. El
déficit de TPI es una enzimopatía rara, pero no excepcional. Afecta principalmente a
niños y junto a las manifestaciones hematológicas (hemólisis crónica de intensidad leve o
moderada), se acompaña de importantes trastornos neuromusculares (espasticidad gene
ralizada e hiperreflexia, signos piramidales) de aparición neonatal que suelen conducir a
la muerte del paciente por paro cardiorrespiratorio durante el período infantil o antes de
alcanzar los 15 años de edad. Además, esta enzimopatía suele cursar con una importante
disminución de la capacidad bactericida de los polinucleares neutrófilos, lo que facilita la
aparición de frecuentes infecciones interrecurrentes que pueden complicarse y provocar
cuadros clínicos de extrema gravedad, tales como una septicemia fulminante.
Fosfoglicerato cinasa (PGK)

Principio
La fosfoglicerato cinasa (PGK; EC 2.7.2.3) es una enzima transferasa que cataliza la
conversión reversible de 1,3-difosfoglicerato (1,3-BPG) a 3-PG con la generación de
una molécula de ATP. Mediante esta reacción se transfiere un grupo fosfato desde el
1,3-difosfoglicerato al ADP.
1,3-BPG+ ADP ( rGK >3-PGA+ATP

GA3P+ NAD++ Pi *J¿IL=*N A D H + H ++1,3-BPG
ERRNVPHGLFRVRUJ
M éto d o
Blanco (|j,l) Problema (|xl)

Tam pón Tris-HCl, 1 mol/1, p H = 8 — 100
M gCl2, 0,1 mol/1 — 100
ATP, 20 mmol/1 (bicarbonato al 1%) — 400
NAD H, 2 mmol/1 — 100
GA3PD (40 U /m l) — 100
3-PGA, 100 mmol/1 — 100
Se lee la variación de absorbancia (A) p o r m inuto a 340 nm (a 37 °C).
ttt/ ttu ADOmin x 16

UI/gHb = -------------------
Hb (g/1)

Los valores de referencia (X ± 2D E a 37 °C) de PGK varían entre 197 y 343 UI/g Hb.
El déficit de PGK, al igual que el déficit de PFK, es u na enzimopatía m uy rara y, junto
a anemia hemolítica crónica, cursa con un cuadro neurológico de intensidad variable
y retraso mental.
Bisfosfoglicerato mutasa (BPGM)

Principio
La bisfosfoglicerato mutasa (BPGM) cataliza la síntesis del 2,3-DPG desde el 1,3-difos-
foglicerato (1,3-DPG). Se la conoce también con el nom bre de 2,3-bisfosfoglicerato
sintetasa. La BPGM y la fosfoglicerato mutasa (PGM) son enzimas relacionadas es
tructuralmente que catalizan reacciones de transferencia de grupos fosfato entre los tres
átomos de carbono del fosfoglicerato.
F-1,6-BP Aldolasa >GAP+DHAP

gap^ U d hap
NAD+ GAP< GAPD >1,3-DPG+ NADH
1,3-DPG >2,3-DPG
Método
Blanco ( j x l ) Problema ( j j lI )
Tam pón Tris-HCl, 1 mol/1, p H = 8 — 100
NAD, 20 mmol/1 — 100
F-1,6-DP, 0,1 mol/1 — 50
3-PGA, 10 mmol/1 — 100
KH2P 0 4, 0,1 mol/1 — 20
ERRNVPHGLFRVRUJ

GA-3-PD (50 U/m l) — 20
Aldolasa (5 U/m l) — 20
TPI (60 U /m l) — 20
Hem olizado 1/20 — 20
Se lee la variación de la absorbancia (A) p o r m inuto a 340 nm (a 37 °C).
ADOM7 m in x 0,8
U I/gH b = -
Hb (g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la actividad 2,3-BPGM oscilan entre
2,68 y 7,7 U l/g Hb.
El interés de esta enzima es m uy escaso en la práctica clínica y eventualmente su
determ inación podría ser de utilidad en aquellos casos de poliglobulia familiar (en
general no asociada a hemólisis), en la que se hubieran descartado todas sus posibles
causas más habituales (hemoglobinopatías, principalmente).
Fosfoglicerato mutasa (PGAM)

Principio
La PGAM (EC 5.4.2.1) es una enzima que cataliza la transferencia interna de un grupo
fosfato desde el carbono C-3 al carbono C-2 que da como resultado la conversión
de 3-PG a 2-fosfoglicerato a través del com puesto interm edio 2,3-bisfosfoglicerato
(2,3-DPG). La reacción implica a dos grupos fosfato diferentes, es decir, el grupo fosfato
final del 2-fosfoglicerato no es el mismo que el grupo fosfato inicial del 3-PG.
3“PG < 2^3-bpg >2' PG Enolasa >PEP

PEP+ ADP —^-»P iruvato+ ATP
H ++ Piruvato+ NADH LDH ) Lactato+ NAD+
Método
Tris-H Cl, 1 mol/1, p H = 8 — 100
M gCl2, 0,1 mol/1 — 100
KC1,1 mol/1 — 100
NAD H, 2 mmol/1 — 100
ADP, 30 mmol/1 (neutralizado — 50
con bicarbonato al 1%)
2,3-BPG 1 mmol/1 — 20
LDH (60 U/m l) — 20
PK (50 U/m l) — 20
ERRNVPHGLFRVRUJ
Blanco ( p l ) Problema (|jl1 )

Enolasa (10 U/ml) — 20
3-PG, 10 mmol/1 — 100
Se mide la variación de absorbancia (A) por minuto a 340 nm (a 37 °C).
A D O ^/m in x 0,8
U I/H b = -
Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X ± 2 DE a 37 °C) de la PGM oscilan entre 10,7 y 20,6 Ul/g Hb.
Esta enzima se presenta bajo dos isoenzimas, la propia del tejido nervioso o isoenzima B
(común al eritrocito) y la muscular o isoenzima M. Existen descritos muy pocos casos
de déficit de la isoenzima M con miopatía. Recientemente, nuestro grupo ha descrito el
prim er caso m undial de déficit de isoenzima B en una paciente portadora heterocigota
de la enzimopatía y afecta de anemia moderada. El hallazgo fue casual al realizarle un
estudio completo de las enzimas eritrocitarias con motivo de la anemia.
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GA3PD)

Principio
La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GA3PD; EC 1.2.1.12) es una enzima impli
cada en una de las reacciones más importantes de la glucólisis de la ruta de Embden-Me-
yerhof, puesto que cataliza un paso en el cual se genera el primer intermediario de elevada
energía y, además, genera un par de equivalentes de reducción (en forma de NADH).
La enzima requiere la coenzima NAD+ a fin de rescatar los electrones producto de la
oxidación del sustrato.
->1,3-BPG+ NA D H + H
3-PGA+ATP< PGK >1,3-BPG+ADP
Método
Blanco (p,l) Problema (|xl)
Tris-HCl, 1 mol/1 + EDTA, 5 mmol/1,
pH = 8 — 100
MgCl2, 0,1 mol/1 — 100
ATP, 20 mmol/1 (en bicarbonato al 1%) — 400
PGK, 50 U/ml — 100
3-PGA, 100 mmol/1 — 100
Se lee la variación de absorbancia por minuto a 340 nm (a 37 °C).
ERRNVPHGLFRVRUJ
A D 0 347 m in X l6
UI/Hb = -
H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ± 2 DE a 37 °C) de la GA3PDH varían entre 168 y 300 Ul/g
Hb. Esta enzimopatía es tan rara que solo se han descrito tres casos en la literatura
médica, sin que se haya podido dem ostrar claramente una relación causa-efecto con
la anemia.
Aldolasa
Principio
La aldolasa (ALD; EC 4.1.2.13) es una enzima que participa en la glucólisis. Cataliza la
escisión de la fructosa-1,6-bisfosfato en dos triosas, dihidroxiacetona-fosfato y gliceral-
dehído-3-fosfato.
También cataliza la rotura reversible de la fructosa-1-fosfato en gliceraldehído y
dihidroxiacetona fosfato.
En el ser hum ano se conocen tres isoenzimas de la ALD (ALD A, ALD B y ALD C)
codificadas por tres genes diferentes y que se expresan de distinta m anera durante el
desarrollo. Pequeñas diferencias en la estructura de las isoenzimas dan lugar a diferentes
actividades sobre los dos sustratos: fructosa-1,6-bisfosfato y fructosa-1-fosfato. La ALD
B no exhibe preferencia sobre los sustratos y, por tanto, cataliza ambas reacciones. En
cambio, las ALD A y C prefieren la fructosa-1,6-bisfosfato.
F1,6-DP< ALD >GAP+DHAP

DHAP+ NADH+ H +< C,3PU >a-glicerofosfato+ NAD+
Método
Blanco (|xl) Problema ( jjlI)
Tampón Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8 100 100
NADH, 2 mmol/1 100 100
Solución de enzimas* 100 100
Agua destilada 600 590
F1,6-DP, 10 mmol/1 100 100
^Solución de enzimas:
TPI (100 U/ml), 1 (jlI
G3PD (100 U/ml), 250 p,l
(NH4)2 S04 3,2 mol/1,750 |jl1
Se diluye la solución a 1/15, mezclando 0,1 mi de la misma con 1,4 mi de solución estabilizadora.
ERRNVPHGLFRVRUJ
A D O ^/m in x 0,8
UI/gHb = -
Hb (g/dl)

Los valores de referencia (X ± 2 DE a 37 °C) de la ALD oscilan entre 1,46 y 3,46 UI/g Hb.
Se trata de otra enzimopatía extremadamente rara de la que existen unos cinco casos
descritos. En uno de ellos el paciente padecía anemia hemolítica y afectación neurológica,
aunque no puede afirmarse que exista una clara relación causa-efecto.
Lactato deshidrogenasa (LDH)

Principio
La lactato deshidrogenasa (LDH; EC 1.1.1.27) es una enzima que corresponde a la catego
ría de las oxidorreductasas, dado que cataliza una reacción redox, en la que el piruvato es
reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+. Participa en el metabolismo
energético anaerobio, reduciendo el piruvato (procedente de la glucólisis) para regenerar
el NAD+, que en presencia de glucosa es el sustrato limitante de la vía glucolítica.
H ++ Piruvato+ NADH< -LDS-> Lactato+ NAD+
Método
Piruvato sódico, 10 mmol/1 — 100
A D 0 347m in x 8,03
UI/gHb = -
Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X ± 2D E a 37 °C) de la LDH varían entre 135 y 233 UI/g Hb.
El déficit congénito de esta enzimopatía es excepcional y no se ha descrito asociado a
anemia hemolítica.
Enolasa
Principio
La enolasa o fosfopiruvato hidratasa (EC 4.2.1.11) es una metaloenzima que cataliza la
transformación de 2-fosfoglicerato a PEP durante la glucólisis. La enzima puede también
ERRNVPHGLFRVRUJ
catalizar la reacción inversa, según la concentración de los sustratos en el medio. El pH

óptimo de la enzima es 6,5. La enolasa se encuentra en todos los tejidos y organismos
capaces de efectuar fermentación o glucólisis. Fue descubierta por Lohmann y Meyerhof
en 1934 y se ha purificado de gran variedad de fuentes biológicas, incluyendo el músculo
humano y los eritrocitos.
2-PG Eno!asa—>PEP
PEP+ ADP — »Piruvato+ ATP
Piruvato+NADH++ H +< LUH )Lactato+ NAD+
Método
Blanco ((xl) Problema (|il)
MgCl2, 0,1 mol/1 — 100
KC1,1 mol/1 — 100
ADP, 30 mmol/1 (en bicarbonato al 1%) — 50
LDH (60 U/ml) — 10
PK (50 U/ml) — 10
H 20 1.000 410
2-PG, 10 mmol/1 — 100
ADO/min x 0,8
UI/gHb = -
Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la ENOL oscilan entre 3,58 y 8,22 Ul/g
Hb. Es otra de las eritroenzimas eritrocitarias de las que no se sabe bien si su déficit
puede ser causa de hemólisis o no.
Adenilato cinasa (AK)

Principio
La AK (EC 2.7.4.3) es una enzima que cataliza la interconversión de nucleótidos de
adenina, un proceso implicado en la homeostasis.
El ATP transfiere un grupo fosfato al AMP para formar ADP. El trifosfato inorgánico
también puede actuar como donante de fosfato.
A M P + A T P r^ -> 2 -A D P ADP + PEP - ^ P i r u v a t o + ATP

Mg"^ Piruvato+H ++NADH —LUH >Lactato+ NAD+
ERRNVPHGLFRVRUJ
M éto d o

ATP, 20 mmol/1 neutralizado — 50
PEP, 50 mmol/1 — 50
KC1,1 mol/1 — 20
LDH (60 U/ml) — 50
MgCl2, 0,1 mol/1 — 50
PK (50 U/ml) — 20
AMP, 20 mmol/1 (en Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8) — 50
Se lee la variación de absorbancia por minuto a 340 nm (a 37 °C).

ADO/min x l6
U l/g Hb = -------------------
Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X+2DE a 37 °C) de la AK oscilan entre 180 y 310 U l/g Hb. El
déficit de AK es excepcional y no se han descrito más de 10 casos en toda la literatura médica
mundial. En todos los casos descritos, se ha observado anemia hemolítica crónica y en tres
de ellos esta se ha asociado a una neuropatía grave.
P irim id in a -5 '-nucleotidasa (P5’N )

Principio
La P5'N es una enzima del metabolismo nucleotídico que degrada los nucleótidos pirimi-
dínicos que se forman en el interior del eritrocito como resultado del catabolismo del ARN
durante su período de maduración reticulocitaria. En 1974, Valentine et al. describieron
el prim er caso de anemia hemolítica producida por un déficit de P5'N. El mecanismo
fisiopatológico del déficit de P5'N se atribuye al acumulo de nucleótidos pirimidínicos y
ARN como consecuencia de su deficiente degradación.
El principio de la reacción para la dosificación de la P5'N a partir del hemolizado es
colorimétrico, y se basa en la cuantificación del fosfato (Pi) liberado por la enzima en
un medio de incubación adecuado.
UMP o CMP P5<N >Nucleósidos+ Pi
Reactivos
• Tampón Tris-HCl, 10 mmol/1 + EDTA, 2,7 mmol/1 + mercaptoetanol, 0,7 mmol/1,
pH = 6,5.
• Tampón de incubación: Tris-HCl, 30 mmol/1 + MgCl2, 30 mmol/1, pH = 8.
• Tampón de diálisis, pH = 8.
• Cloruro sódico (NaCl), 150 mmol/1.
• Tris-HCl, 10 mmol/1, pH = 8.
ERRNVPHGLFRVRUJ
• MgCl2, 10 mmol/1.
• EDTA, 0,02 mmol/1.
• Ácido tricloroacético al 30%.
• Citidina monofosfato (CMP), 60 mmol/1.
• Uridina monofosfato (UMP), 60 mmol/1.
• Ácido molíbdico.
• Solución de Fiske Subbarow (Sigma®).
Método
1. Se centrifugan y separan plasma, leucocitos y plaquetas.
2. Se lavan los eritrocitos tres veces con solución salina fisiológica (NaCl, 0,15 mol/1).
3. Se diluye el paquete de eritrocitos al 1/4 en (Tris-H Cl, 10 mmol/1; EDTA,
2,7 mmol/1, y mercaptoetanol, 0,7 mmol/1, pH = 6,5).
4. Se hemoliza mediante congelación-descongelación.
5. Se centrifuga el hemolizado para eliminar los estromas.
6. Se dializa el sobrenadante durante un m ínim o de 12 h contra el tam pón de
diálisis.
7. Se preparan las siguientes soluciones reactivas y se sigue el esquema señalado.
Blanco Problemas
CMP UMP
Tampón Tris-HCl, pH = 6,5 2,3 2,3 2,3
CMP 0,1 0,1
UMP 0,1 ¡-J L * 0,1
Hemolizado dializado [ 1 -1 i ] 0,1 0,1
Ácido tricloroacético 0,5 0,5 0,5
Hemolizado dializado 0,1 —
Se centrifuga y se separa el sobrenadante.
Blanco (mi) Problemas (mi)

CMP IM P
Sobrenadante 2 2 2
Ácido molíbdico 0,5 0,5 0,5
Solución de Fiske Subbarow 0,125 0,125 0,125
Se incuba durante 2 h a 37 °C.
Se lee la absorbancia a 660 nm en contra de un blanco de H20.

1. Se resta el blanco al problema.
2. Se lee en la gráfica de calibración del Pi la concentración del fosfato (Pi) liberado
en función de la absorbancia. La concentración se prepara determinando mediante
el método de Fiske Subbarow la absorbancia de diferentes soluciones patrón de
fosfato de concentración conocida.
U I/gH b = ^ gPÍ(gráfiCa)X24,2
H b(g/dl)
U = (xmol de Pi liberado por hora.

Hb = g/dl del hemolizado al 1/4.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Valores de referencia e in terp retació n del resultado

Los valores de referencia (X ±2D E a 25 °C) para la P5'N son:
• Frente al CMP: 8,9-20,9 U l/g Hb.
• Frente al UMP: 9,8-22,2 U l/g Hb.
El déficit congénito de P5'N, aunque se considera relativamente frecuente en ciertas
poblaciones, es raro en nuestro medio. Por el contrario, es mucho más frecuente obtener
una disminución de la P5'N como consecuencia de la intoxicación por el plomo, situación
en la que la actividad P5'N puede disminuir por debajo del 50% de su actividad normal.
Debido a ello y a la gran sensibilidad de la enzima a la presencia de mínimas cantidades de
plomo en el organismo, la dosificación de la P5'N puede ser útil en clínica, tanto para el
diagnóstico de la intoxicación saturnina como para seguir la evolución de la enfermedad
después del tratamiento con quelantes. Tanto en el déficit congénito de P5’N como en el
saturnismo, es frecuente observar «punteado basófilo» eritrocitario, atribuido al acúmulo
de nucleótidos pirimidínicos como consecuencia de la deficiente degradación del ARN.
Acetilcolinesterasa eritrocitaria (AChE)

Principio
La acetilcolinesterasa, o coünesterasa en glóbulos rojos (AChE), es una enzima humana
de la familia de colinesterasas que se encuentra en los hematíes pero también en el tejido
nervioso, donde su función principal es hidrolizar al neurotransmisor acetilcolina.
La AChE existe bajo varias isoformas moleculares, cada una con propiedades ca
talíticas similares, aunque difieren en la forma como se adhieren a la superficie de la
membrana celular.
La colinesterasa verdadera, AChE eritrocitaria, específica o de tipo E, se encuentra
unida a la parte externa de la membrana eritrocitaria, pero también a la membrana de
las neuronas a la altura de las sinapsis ganglionares de las estructuras neuromusculares.
La seudocolinesterasa o colinesterasa inespecífica, también denominada butirilcolines-
terasa, colinesterasa plasmática o de tipo S, está presente generalmente en forma soluble
en casi todos los tejidos (colinesterasa sérica).
El complejo enzimático es codificado por un solo gen en el cromosoma 7 y las formas
diferentes de unión a la m embrana celular aparecen tras modificaciones después de la
traducción genética, así como por el uso de diferentes promotores del ADN.
El principio de la reacción es la hidrólisis de la acetilcolina a colina y acetato, proceso
que se realiza en dos fases:
• Fase 1: reacción de la AChE con la acetilcolina; genera un intermedio acetilenzima y
la liberación de la colina.
Acetilcolina —AChE >Colina+ Acetilenzima (AChE acetilada)
• Fase 2: hidrólisis de la acetilenzima; la AChE se regenera y el ácido acético se libera

en forma de acetato.
AChE acetilada+H20 —>AChE+ Ácido acético

M étodo
Blanco (|xl) Problema (( jlI)

Tris-HCl, 1 mol/1 y EDTA, 4 mmol/1, pH = 8 100 100
DTNB, 0,5 mM (en citrato de sodio al 1%) 50 50
H O bidestilada 800 790
ERRNVPHGLFRVRUJ
Blanco ((xl) Problema (|xl)

Hemolizado 1/20 (diluido al 1/10 en H20 — 10
bidestilada)
Yoduro de AChE, 10 mm/1 50 50
Se lee a 412 nm a 37 °C durante 10-15 min.
ADQ412/m ín 100
13,6 Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2DE) de la AChE varían entre 25,8 y 42,7 U l/g Hb. La
AChE es una enzima situada en la mem brana eritrocitaria y, aunque su función en el
eritrocito adulto se desconoce, su determinación posee un indudable interés diagnóstico.
Así, la AChE se halla disminuida de manera prácticamente constante en la hemoglobinu
ria paroxística nocturna (HPN), y constituye una prueba diagnóstica de valor clínico en
esta enfermedad. Asimismo, suele hallarse también disminuida en la anemia hemolítica
autoinmune (AHAI) y en otras enfermedades en las que exista una alteración adquirida
de la m embrana eritrocitaria como, por ejemplo, en la esferocitosis hereditaria (EH).
G lu tatión reductasa (GR)

Principio
La GR es una enzima que cataliza la reducción del glutatión oxidado a glutatión reducido,
el cual será utilizado por la glutatión peroxidasa para la reducción de peróxido y de
lipoperóxidos, los cuales son especies reactivas del oxígeno (v. fig. 19-4). Esta enzima
juega un im portante papel en la defensa antioxidante y debido a su presencia en los
diferentes tejidos y órganos está involucrada en la fisiopatología de varias enfermedades.
H ++N ADPH+GSSG—^ N A D P ++2GSH
Método
Esta enzima se determina en dos reacciones diferentes, una en presencia del activador
FAD (flavina adenina dinucleótido), que es el precursor de la vitam ina B2, y otra en
ausencia del mismo. En general, la actividad de la enzima se halla normalmente saturada
por el FAD, por lo que la activación in vitro es mínima. No obstante, existen situaciones
patológicas en las que se observa una intensa activación in vitro de la enzima por el FAD.
En tales casos, la determ inación de la GR es útil para valorar el nivel de este factor
vitamínico en el organismo.
Sin FAD Con FAD

Blanco (|i,l) Problema (|xl) Blanco (|xl) Problema (|xl)
Tampón Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8 50 50 50 50
Agua bidestilada 800 790 700 690
Hemolizado 1/20 — 10 — 10
ERRNVPHGLFRVRUJ
Sin FAD Con FAD

Blanco (p.1) Problema (|jl1) Blanco (|xl) Problema (|xl)
FAD, 10 |xmol/l — 100 100
GSSG, 33 mmol/1 (en tampón 100 100 100 100
Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8)
NADPH, 2 mmol/1 50 50 50 0

ADO/min X 1,6
U I/H b = -
H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la GR son:
• Sin FAD: 5,3-11,9 U I/gH b.
• Con FAD: 6,9-15,5 U l/g Hb.
El déficit congénito de GR es una enzimopatía muy rara de la que solo existen descritos
seis casos en todo el m undo y sus manifestaciones clínicas son superponibles al déficit
de G6PD: hemólisis aguda desencadenada por la ingesta de medicamentos o habas, que
presenta como rasgo adicional la asociación a cataratas.
Dada su dependencia del factor vitamínico riboflavina (vitamina B2), el análisis
cuantitativo de esta enzima constituye una m edida indirecta del contenido de esta
vitamina en el organismo. En caso de avitaminosis B2 se observa una disminución de la
actividad GR que se normaliza con la adición de FAD a la reacción.
Glutatión peroxidasa (GPX)

Principio
La enzima glutatión peroxidasa (GPX), o glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.9), cataliza
la reacción de oxidación del glutatión al glutatión disulfuro; para ello utiliza peróxido
de hidrógeno. Esta enzima usa como cofactor el selenio (Se), por lo que su actividad
viene muy influenciada por la concentración de este oligoelemento en los alimentos. Su
función principal es proteger al organismo del efecto degradante de los hidroperóxidos
formados de forma endógena; en el hematíe contribuye a proteger la hemoglobina de
los eritrocitos de la oxidación. Se constituye como homotetrámero y su localización es
citoplasmática.
2GSH+ R-O-OH GPX >GSSG+ H 20 + R-OH

GSSG+ NADPH+ H+—™->GSH+ NADP+
Método
Blanco ( (jlI ) Problema (|xl)
Tampón Tris-HCl, 1 mol/1, pH = 8 100 100
GSH, 0,1 mol/1 20 20
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Blanco ( | x l ) Problema (|xl)

GR, 10 U/ml 100 100
NADPH, 2 mmol/1 100 100
Agua bidestilada 670 660
t-butil-hidroperóxido, 7 mmol/1 10 10
diluido a 1/1.000
ADO340/m in xl,61
U I/gH b = -
Hb(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la GPX oscilan entre 9,1 y 25 UI/g
Hb. El déficit de GPX es excepcional y solo tiene interés clínico como una m edida
indirecta (al igual que sucede con la actividad GR y la vitam ina B2) de u n a carencia
de selenio en el organismo, ya que esta actividad enzimática es muy dependiente del
nivel de este oligoelemento. Asimismo, esta enzima se caracteriza p o r u n a relativa
mente im portante variabilidad étnica y entre individuos de una mism a población,
lo que dificulta a veces la in terp retació n de ciertas dism inuciones de actividad
observadas.
En el déficit de GPX eritrocitaria, aunque se ha asociado a hemólisis, la relación
causa-efecto ha sido puesta en duda por algunos autores.
Transcetolasa (TK)
Principio
La transcetolasa (TK) es una enzima que se halla normalmente en el interior del hematíe
catalizada por el pirofosfato de tiamina (TPP) o vitamina Br La carencia de vitamina
B( es frecuente en el alcoholismo crónico, que constituye la principal causa de déficit de
TK en los países industrializados.
Ribosa-5P — >Sedoheptulosa TK >F6P

EFECTO TPP = TK saturada - TK no saturada x 100 = % TK saturada
• Tampón Tris-HCl, M + EDTA 5 mM, pH = 8.
• R5P 150 mM, 0,0205 g, 0,5 m i de tampón.
• TPP 10 mM, 0,046 g, 1 mi de tampón.
• NADH 2,5 mM, 0,0035 g, 2 mi de tampón.
• TPI + G3PDH (2 mg/ml).
• Solución estabilizadora, 0,2 mi.
• TPI, 0,025 mi.
• G3PDH, 0,025 mi.
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Preparación del hemolizado

1. Para la eliminación de leucocitos y plaquetas se filtrará 1 mi de sangre total a
través de una columna de a-celulosa y celulosa microcristalina; las proporciones
dependerán del tipo de anticoagulante empleado.
2. Los eritrocitos libres de leucocitos y plaquetas se lavarán tres veces con suero
fisiológico.
3. Del culote de hematíes se procederá a hacer un hemolizado al 1/5 con digitonina
saturada.
(a) Digitonina saturada, 0,8 mi.
(b) Culote de hematíes, 0,2 mi.
4. Se agita intensamente para que hemolicen todos los hematíes.
5. Se centrifuga a 14.000 r.p.m. y se trabaja con el sobrenadante. M irar la H b del
hemolizado.
Método
Sin TPP Con TPP
Blanco (|xl) Problema (jxl) Blanco (jjlI) Problema (|j_l)
Tris-HCl, 1 M, EDTA, 5 mM, 50 50 50 50
pH = 8
R-P, 0,15 M (en tampón) 50 50 50 50
H20 bidestilada 880 850 850 820
Hemolizado al 1/5 "l" ■ ■ 20 — 20
digitonina
TPI + G3PDH (2 mg/ml) 4 1 10u ! 10
TPP, 0,01 M (en tampón) — 30 30
NADH, 2,5 mM (en tampón) 20 20 20 20
ADO/min 5
6,22 H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E a 37 °C) de la TK son:
• Sin TPP: 0,3-0,8 U l/g Hb.
• Con TPP: 0,6-0,9 U l/g Hb.
La activación por el pirofosfato de tiamina (TPP) varía entre el 3,7 y el 19,1%.
La carencia de v itam in a Bj da lugar a un sín d ro m e clínico conocido con el
nom bre de beriberi, u n trastorno grave cuya prevalencia fue m uy elevada en Asia
(donde el alimento básico es el arroz). El beriberi, que se presenta de diversas formas
clínicas, se debe sobre todo a la carencia de tiam ina. En la actualidad, casos clásicos
de beriberi se registran esporádicamente. La carencia de tiam ina, que ocasiona una
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variedad de signos clínicos, a veces asociada con carencias de otras vitaminas, no es

rara, aunque no hay m ucha inform ación al respecto. Al igual que sucede con la GR
con respecto a la riboflavina (vitam ina B2), la TK es una enzima cuya actividad se
determ ina no para descartar la causa de un síndrom e hemolítico, sino para conocer,
de form a indirecta, el nivel de vitam ina JSl del organism o que resulta generalmente
bajo en el curso de ciertos trastornos neurológicos secundarios a u n a intoxicación
alcohólica.
Glutámico oxaloacético transaminasa (GOT)

Principio
La aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1), antes conocida como glutámico oxaloacético
transaminasa (GOT) o aspartato transaminasa (AST), es una enzima presente en ciertos
tejidos del organismo, especialmente corazón, hígado y tejido muscular. La reacción
de transferencia de un grupo amino desde el L-aspartato al 2-oxoglutarato donde se
forma L-glutamato y oxaloacetato utiliza el fosfato de piridoxal (piridoxal-5'-fosfato) o
la vitamina B6 como cofactor.
L-aspartato+ a-cetoglutarato 007 >Oxaloacetato+ L-glutamato

Oxaloacetato+ H ++ NADH MDH' >M alato+ NAD+
M étodo
Sin vitamina B6 Con vitamina B(

BKjxl) Prob (|xl) Bl(jJ) Prob (|xl)
Tris-HCl, 1 M, EDTA, 100 100 100 100
5 mM, pH = 8
NADH, 2 mM 100 100 100 100
L-aspartato, pH = 8 100 100 100 100
Mélico DH, 1 U/ml 10 10 10 10
Piridoxal 5 'P 0 4, 0,4 mM 50 50
H20 670 570 620 520
Hemolizado al 1/20 20 20 20 20
a-cetoglutarato de Na, — 100 100
0,1 M
Se lee la variación de absorbancia (A) a 340 nm (a 37 °C) en contra de cada blanco.

Los valores de referencia (X ± l DE) para la GOT eritrocitaria son:
• Sin fosfato de piridoxal: P 0 4 = (3,02 ± 0,67 U de GOT/g Hb).
• Con fosfato de piridoxal: P 0 4 = (5,04 ± 0,9 U de GOT/g Hb).
En el plasma sanguíneo su actividad aumenta en caso de infarto agudo de miocardio,
hepatopatía aguda, miopatías o ingesta de fármacos o en cualquier otra enfermedad o
trastorno en los que resulten seriamente dañadas las células de los tejidos citados. Fuera
de estas situaciones, la aspartato am inotransferasa es una enzima cuya actividad se
determina con la finalidad de conocer de forma indirecta el nivel de fosfato de piridoxal
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(vitamina B6) del organismo. Por ello, tiene especial interés cuando se sospecha un déficit
de esta vitamina en ciertos casos de anemia hipocroma por alteración de la síntesis del
hemo debida a un déficit de vitamina B6.
NADH-diaforasa (citocromo b5 reductasa)

Principio
La NADH-diaforasa, NADH-metahemoglobina reductasa o citocromo b 5 reductasa,
pertenece al grupo de las deshidrogenasas, enzimas capaces de eliminar hidrógeno de
los sustratos y transferirlo a otra sustancia aceptora. Se conocen también con el nombre
de diaforasas y catalizan la deshidrogenación del NADH o del NADPH.
H b3* + H ++NADH NA1)Hdiaforasa >H b2++NAD+
• EDTA neutralizado, 0,27 mol/1.
• Tampón citrato de sodio, 0,05 mol/1, pH = 4,7.
• Ferrocianuro de potasio, 0,5 mmol/1.
• NADH, 2 mmol/1.
• Sustrato de hemoglobina: se trata de una solución de hemoglobina sin actividad
diaforásica intrínseca que se prepara del siguiente modo:
• Se centrifuga una muestra de sangre normal y se elimina el plasma.
• Se lavan tres veces los eritrocitos con suero fisiológico.
Por cada 10 mi de paquete eritrocitario, se añaden 60 mi de agua y 1,6 g de DEAE-
celulosa.
• (W hatman, DE 23).
• Se agita la suspensión durante 10 m in a +4 °C. Se filtra recogiendo el filtrado. Se
repite dos veces la operación anterior, y se añade DEAE-celulosa por cada 10 mi
de paquete celular.
• Se determina la H b del sobrenadante claro en solución de Drabkin y se ajusta a
una concentración final de 1,224 g/dl.
• Se verifica la ausencia de actividad N ADH-diaforasa (A < 0,003/min) en un
blanco, en el cual la cantidad de hemoglobina es de 1,05 mi, en lugar de 1 mi, sin
añadir sangre.
Si la actividad diaforásica es elevada (A > 0,003/min), se repite el tratamiento con
DEAE-celulosa del hemolizado.
El sustrato así preparado es estable durante 2 semanas a +4 °C o bien durante meses
en alícuotas a -7 0 °C.
M étodo
1. En un tubo de 5 mi se colocan:
(a) EDTA 0,27 mol/1,0,01 mi.
(b) Citrato sódico 0,05 mol/1, pH = 4,7,0,05 mi.
(c) Ferrocianuro potásico 0,5 m mol/1,1,5 mi.
(d) Sustrato de Hb, 1 mi.
(e) H20 bidestilada, 1,74 mi.
(f) Sangre total, 0,005 mi.
2. Se espera 10 min. Con ello se obtiene la mezcla reactiva.
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3. A continuación, en dos cubetas de 1 mi (blanco y problema) se añade:

Blanco Problema
Mezcla reactiva (mi) 0,95 0,95
H 20 (mi) 0,05 —
NADH 2 mmol/1 (mi) — 0,05
4. Se lee la variación de absorbancia (A por m inuto) a 575 nm y a 25 °C.

Al realizar esta determinación debe elaborarse un blanco adicional para verificar si el
sustrato de hemoglobina está exento de contaminación con NADH-diaforasa. Para ello,
se prepara una mezcla de composición idéntica a la anterior, exceptuando el volumen
de sustrato de hemoglobina, que será de 1,05 mi y solución de 1,69 mi de H 20 . No se
añadirá sangre total a esta mezcla y el ensayo se reaüzará de igual manera. El AA a 575 nm
no debe ser superior a 0,003/min.
Diaforasa (en |xmol de Hb reducida/ml):
u ttl j -j / i AA575nmproblem a-A A 575 blanco

Limolde Hb reducida/ml = ---------- -------------------------------
420
Expresada en unidades internacionales (UI) corresponde a:
= MmQlH breducida/ml X 0,238
H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ±2D E ) de la diaforasa oscilan entre 2,26 y -3,42 U/g Hb a
25 °C. La diaforasa es una enzima que contribuye al mantenimiento de la hemoglobina
en su estado reducido, protegiéndola contra la transformación en metahemoglobina.
El déficit congénito de diaforasa es causa de metahem oglobinem ia y cianosis, pero
ocasionalmente puede asociarse también a trastornos neurológicos graves. El déficit de
diaforasa, que cursa solamente con cianosis, se denomina forma benigna y se trata con
azul de metileno u otros agentes reductores. La forma grave presenta junto a la cianosis
diversos trastornos neurológicos, que al carecer de tratamiento eficaz, conllevan la muerte
del paciente durante la prim era infancia.
La transmisión hereditaria del déficit congénito de diaforasa es autosómica recesiva.
Cuando se analiza la actividad diaforásica en niños de corta edad (antes de los 6 meses),
no debe olvidarse que su valor es normalmente muy inferior al que se observa durante la
edad adulta, por lo que, en tales casos, la determinación de dicha enzima con fines diag
nósticos tendrá más valor en ambos padres (que en caso de déficit congénito presentarán
una disminución de actividad de aproximadamente el 50%) que en el mismo propositus.
Adenosina desaminasa (ADA-1)
Principio
La ADA-1 es una enzima que se encuentra en los hematíes, pero también en muchos
otros tejidos del organismo donde se encuentra bajo tres isoformas diferentes: ADA-1,
ADA-2 y ecto-ADA. La ADA-1, eritrocitaria, es una proteína monomérica de 40 kDa, con
una actividad óptima a un pH entre 7 y 7,5 que cataliza la desaminación de adenosina
para producir inosina y liberar amonio (fig. 19-7).
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FIGU RA 19-7. Vía metabólica del metabolismo nucleotídico.
Adenosina+ H 20 —^DA' —>Inosina+ N H 3
Método
Blanco (/ jlI ) Problema (fil)
Tampón P 0 4KNa, 0,2 mol/1, 980 960
pH = 7
Hemolizado 1/20 1 20
Adenosina, 4 mmol/1 20 20
ttt/ ADO265/m in
U I/g H b = ------------------x
H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ± 2 DE a 37 °C) de la ADA oscilan entre 0,54 y 1,4 U l/g Hb.
Un exceso de actividad ADA-1 puede ser una causa de anemia hemolítica crónica, pero
es excepcional. Por causas que se desconocen puede hallarse aumentada en la anemia de
Fanconi, una forma m uy rara de aplasia de la médula ósea de inicio neonatal y origen
congénito. Desde el punto de vista clínico, su mayor interés tiene que ver con otra
enfermedad muy grave conocida como inmunodeficiencia combinada severa (SCID)
donde se halla significativamente disminuida y por debajo del 50% de la normalidad
en todas las células sanguíneas.
Purina nucleósido fosforilasa (PNP)

Principio
La purina nucleósido fosforilasa (PNP; EC 2.4.2.1) es una enzima de la degradación
de purinas que cataliza la rotura de distintos nucleósidos (inosina y guanosina) en sus
respectivas bases púricas (hipoxantina y guanina) (v. fig. 19-7).
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Inosina —P-NP- >Hipoxantina

Guanosina Guanina
Método
Blanco ( p l) M u estra (|jl1 )
Tampón P 0 4Na, 0,5 M, 945 925

pH = 7,4
Hemolizado al 1/200 — 20
Xantina oxidasa 20 20
Inosina, 6 mM 35 35
Se lee la variación de absorbancia (A) por minuto a 293 nm (a 37 °C) en cubeta de cuarzo.
ADQX50
12,15

Los valores de referencia de la PNP ( X ± 2 D E ) oscilan entre 44,9 UI/g Hb-64,5 UI/g Hb.
El déficit de PNP se hereda de forma autosómica recesiva y se manifiesta generalmente
en los prim eros años de vida con problemas inmunológicos, neurológicos (retraso
m ental y espasticidad muscular) y alteraciones del desarrollo. Hay tam bién mayor
riesgo de enfermedades autoinmunes. Esta enzimopatía se asocia con disminución en
el núm ero de células T (inm unidad celular) con escasa incidencia sobre los linfocitos B
(inm unidad hum oral). Los niveles de inmunoglobulinas séricas son normales o casi
normales. La terapia de reemplazamiento no ha sido útil en esta deficiencia y en general,
en los casos muy graves se opta por el trasplante de médula ósea que, si bien aum enta la
supervivencia, no corrige los trastornos neurológicos. Existe la posibilidad de diagnós
tico prenatal.
ANÁLISIS DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

DE LOS ERITROCITOS
Catalasa
Principio
La catalasa (EC 1.11.1.6) es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de
hidrógeno (H20 2) en oxígeno y agua de acuerdo con la siguiente reacción:
2H20 2 Catalasa >2H20 + 0 2
El grado de descomposición del H20 2por la catalasa se mide en el espectrofotómetro

a 230 nm , ya que el H 20 2 absorbe luz a esta longitud de onda.
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Método
Blanco (p l) Pro b lem a (|xl)
Tris-HCl, M, EDTA, 5 mM, pH = 8 50 50
H20 2, 10 mM* — 900
H20 900 —
Hemolizado al 1/2.000 con etanol** 20 20
*Se mide la DO de 0,9 mi de una dilución al 1/10 de tampón fosfato 1 M a 230 nm (DO,).
Se añaden 0,1 mi de una dilución al 1/100 del H20 2al 30% y se lee la DOz.
El coeficiente de extinción molar del H20 2 a 230 nm es de 0,071, la concentración de H20 2de la
solución diluida al 1/100 es 141 (D 02-D 0,). Para diluir el H20 2 a 10 mM, se diluye 1 mi de la solución
1/100 a C/10 mi con H20.
**E1 hemolizado 1/20 diluido en solución estabilizadora se diluye 1/100, se añaden 20 (jlI de etanol
absoluto por cada mililitro de hemolizado al 1/2.000 para romper cualquier «complejo II» que pueda
estar presente.
La disminución de la DO se mide leyendo en contra el blanco durante 10 min.
La reacción es lineal, durante 3-4 min. La reacción enzimática debería empezar inmediatamente
después de la adición del hemolizado.
A D o 230nm/m in 100 1 _ ADO/min x 7,042

-------------------- x ----- x — x l0 0 = ------------------------
0,071 Hb 20 H b(g/dl)

Los valores de referencia (X ± l DE a 37 °C) de la catalasa son 153.117 + 23.904 Ul/g Hb.
El déficit congénito de catalasa se denomina acatalasemia (o acatalasia) o enfermedad
de Takahara, y se manifiesta por la ausencia de actividad de la catalasa en los glóbulos
rojos acompañada de infecciones gangrenosas bucales muy graves que pueden producir
pérdida de dientes y graves destrucciones de los maxilares y regiones blandas adyacentes.
Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para muchas sustancias orgánicas, es
pecialmente para el etanol que actúa como donante de hidrógeno.
M alonildialdehído
Principio
Los niveles de malonildialdehído (MDA) son un indicador de la peroxidación que se
produce en el interior de los hematíes; el interés de su medida radica en que un exceso
de peroxidación constituye una causa de alteraciones estructurales de la hemoglobina, las
proteínas de membrana y las enzimas. El MDA induce cambios en la actividad de algunas
enzimas eritrocitarias consistentes en aumentos o disminuciones cuando los hematíes son
incubados en presencia de diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (H20 2).
Preparación de soluciones amortiguadoras

Solución m adre
• Fosfato, 0,005 M, pH = 7,5.
• Osmolaridad, 290 mOsm.
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• KC1,0,008 M +N aC l, 0,14 M.
• Solución A
• Na2P 0 4H 12H20 , 1,79 g c.s.p. = 1.000 mi de H20 .
• Solución B
• N aP 04H2 2H20 , 0,39 g c.s.p. = 500 mi de H 20 .
• Se mezclan para obtener un pH de 7,5, aproximadamente:
• Sol. A, 809,5 mi.
• Sol. B, 190,5 mi.
• Total, 1.000 mi.
• Se añade:
• NaCl 0,14 M, 8,18 g.
• KC10,008 M, 0,598 g.
• Se ajusta el pH a 7,5 con NaOH 1 M.
• Se comprueba la osmolaridad: 290 mOsm.
Solución de trabajo
• Se prepara extemporáneamente:
• N3Na 0,002 M, 0,013 g.
• Glucosa 0,004 M, 0,072 g.
• Solución madre c.s.p. = 100 mi.
Ácido tricloroacético al 28% en arseniato sódico 0,1 M

• Arseniato sódico 0,1 M, 1,56 g.
• H20 , c.s.p. = 50 mi.
• Ácido tricloroacético, 14 g.
• Arseniato sódico 0,1 M, c.s.p. = 50 mi.
• TBA al 1% en NaOH 0,05 M:
• TBA, 0,25 g.
• NaOH 0,05 M c.s.p. = 25 mi.
Dilución del H2Oz en solución de trabajo

• Solución madre
• H20 2, 0,25 mi.
• Solución de trabajo, 24,75 mi.
• Solución 20 mM de H20 2:
• Solución madre de H20 2, 5,66 mi.
• Solución de trabajo, c.s.p. = 25 mi.
M étodo
Se parte de sangre con heparina libre de conservantes.
1. Se pasa la sangre por columna.
2. Se lavan los hematíes tres veces con suero fisiológico.
3. Culote de hematíes. Se ajusta a un hematocrito del 5% con solución de trabajo:
(a) Solución de trabajo: 4 mi.
(b) Hematíes: 0,25 mí.
(c) Se comprueba el hematocrito.
(d) Se determina la hemoglobina de la dilución.
4. Preparación:
(a) Solución al 5%, 2 mi.
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(b) H20 2 20 mM, 2 mi.

(c) Se agita suavemente y rápidamente se coge:
0,5 mi y se centrifuga: 0% de hemólisis.
0,5 mi y se congela: 100% de hemólisis.
(d) El resto se incuba 1 h a 37 °C bajo agitación suave.
5. Se cogen:
(a) 0,5 m i y se centrifugan. Hemólisis a los 60 min.
(b) A 1 mi de la solución anterior se añaden 0,5 mi de ácido tricloroacético al 28%.
(c) Se agita y se centrifuga a 14.000 r.p.m.
(d) Sobrenadante, 1 mi.
(e) TBA al 1% en arseniato 0,1 M, 0,25 mi.
(f) Baño maría a ebullición durante 15 min.
(g) Se pone rápidamente en hielo.
(h) Se lee la DO a 600 y 532 nm.
DO532- D O 600x 1,2

--------------------------= nm /gH b
Hb (solución al 5%)

El efecto del peróxido de hidrógeno sobre una suspensión de hematíes puede medirse a
través de la actividad MDA, lo que permite clasificar a las enzimas en tres grupos:
1. G rupo I: enzimas con sensibilidad a bajas concentraciones de H 20 2.
(a) Inactivación: P5’N.
(b) Activación: ALD, PGK, PGM y piruvato cinasa.
2. G rupo II: enzimas con sensibilidad a elevadas concentraciones de H20 2.
(a) Inactivación: G6PD y PFK.
(b) Activación: GPX, LDH, triosa fosfato isomerasa, fosfohexosa isomerasa, fos-
foglucomutasa y bisfosfoglicerato-sintasa.
3. G rupo III: enzimas insensibles al H 20 2.
(a) HK, enolasa, adenosina desaminasa y glutatión reductasa.
Estos cambios en las actividades enzimáticas a diferentes concentraciones de H20 2se
correlacionan con la cantidad de MDA liberado por los hematíes cuando son incubados
con H20 2
Es especialmente im portante la disminución de la P5 'N y la G6PD.
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ERRNVPHGLFRVRUJ
A nexo
P re p a ra c ió n de s o luciones em p le a d as e n el an á lisis d e las e n z im a s e ritro c ita ria s .

Soluciones empleadas en el análisis cuantitativo de las actividades enzimáticas eritrocitarias.
EDTA 0,27 M pH = 7
• EDTA, 10,05 g
H 20 bidestilada, 80 mi
• NaOH al 32%, pH = 7
H 20 bidestilada, c.s.p. = 100 mi
Se comprueba el pH
Solución estábilizadora
EDTA, 2,7 mM, pH = 7, P-mercaptoetanol, 0,7 mM
• EDTA, 0,27 M, pH = 7 ,10 mi
(3-mercaptoetanol, 0,05 mi
H 20 bidestilada, c.s.p. = 1.000 mi
Solución amortiguadora Tris-HCl 1 M/EDTA 0,005 M, pH = 8
• Tris, 12,114 g
• EDTA, 0,186 g
C1H concentrado, pH = 8
H 20 bidestilada c.s.p. = 100 mi
Solución amortiguadora P 0 4KNa 0,2 M, pH = 7 (ADA)
• (A )P04KH2, 2,72 g
• (B )P04Na2H 12H20 , 7,16 g
Para obtener un pH = 7
Tampón (A), 38,9 mi
Tampón (B), 61,1 mi
Cloruro magnésico 0,1 M
• Cl2Mg, 2,03 g
Cloruro potásico 1 M
• C1K, 7,455 g
• H 20 bidestilada c.s.p. = 100 mi
Bicarbonato sódico al 1%
• C 0 3HNa, 1 g
• H 20 bidestilada, 100 mi
Fosfato monopotásico 0,1 M
• P 0 4H 2K, 0,6804 g
Sulfato amónico 3,2 M
• S 0 4(NH4), 21,14 g
• H20 bidestilada c.s.p. = 50 mi
Solución amortiguadora P 0 4Na 0,05 M, pH = 7,4 (PNP)
• (Sol. A) N aH2P 0 4 1H20 , 0,689 g
• (Sol. B) Na2H PQ 4 2H20 , 0,889 g
ERRNVPHGLFRVRUJ
H20 bidestilada c.s.p. = 100 mi

Para obtener el pH = 7,4
Solución A, 19,2 mi
Solución B, 80,8 mi
Solución Tris 0,1 M, EDTA 0,027 M, pH = 6,5. Solución madre (P5 'N)
• Tris, 6,06 g
• EDTA, 5 g
• H20 , c.s.p. = 480 mi
C1H concentrado hasta pH = 6,5
• H 20 c.s.p. = 500 mi
Solución amortiguadora A (P5'ND)
Solución m adre, 50 mi
(3-mercaptoetanol, 0,025 mi
• H20 c.s.p. = 500 mi
Solución de diálisis (P5 'ND)
• NaCl 0,15 M, 9 g
• Tris 0,001,1,21 g
• Cl2Mg 0,01 M, 2,03 g
H20 bidestilada, c.s.p. = 800 mi
HC1 concentrado a pH = 8
H 20 bidestilada c.s.p. = 1.000 mi
Nota: Se prepara extemporáneamente.
Solución de incubación (P5 'ND)
• Tris 0,03 M , 1,82 g
• Cl2Mg, 3,05 g
HC1 concentrado a pH = 8
Ácido tricloroacético al 30% (P5'ND)
• Ácido tricloroacético, 30 g
Ácido molíbdico (P5'ND)
Preparado comercialmente
Solución de Fiske Subbarow (P5 'ND)
Polvo preparado comercialmente
H20 bidestilada, 6,3 mi
Se agita, se filtra y se guarda a 4 °C en botella ámbar
Citrato sódico al 1%
• Citrato sódico, 1 g
Ácido cítrico 1 M
• Ácido cítrico, 10,51 g
Citrato de sodio 0,5 mM pH = 4,7
• Citrato de sodio, 1,05 g
• H20 c.s.p. = 80 mi
• Ácido cítrico 1 M a pH = 4,7
H 20 c.s.p. = 100 mi
ERRNVPHGLFRVRUJ
Ferrocianuro potásico 5 X 10~4M

• K3Fe (CN6), 0,0164 g
Se guarda en botella de 100 mi, color ámbar.
DNTB (2,2'-dinitro-5,5'-ditiobenzoico) (GSH)
• DNTB, 0,04 g
Citrato sódico al 1% c.s.p. = 100 mi
Bicarbonato al 2% + EDTA 1 mM
• C 0 3HNa, 10 g
• EDTA, 0,1861 g
Solución precipitante (GSH)
• Ácido metafosfórico glacial, 1,67 g
• EDTA, 0,2 g
• Cloruro sódico, 30 g
• Se disuelve cada reactivo por separado en 30 mi de H 20 bidestilada
Se mezclan en un solo recipiente
• H 20 c.s.p. = 100 mi
Fosfato disódico dodecahidrato 0,3 M (GSH)
• P 0 4HNa2 12H20 , 53,72 g
• H20 bidestilada c.s.p. = 500 mi
Soluciones amortiguadoras de fosfato de Sorensen
Soluciones madre 66 mmol/1 100 mmol/1 150 mmol/1
(A) KH2P 0 4 9,1 g/1 13,8 g/1 20,7 g/1
(B) Na2HPQ4 9,5 g/1 14,4 g/1 21,6 g/1
oN a2P 0 4.2H20 11,9 g/1 18 g/1 27,1 g/1
Nota: Para obtener una solución a un pH determinado, se añaden A y B en las proporciones
indicadas.
PH A B
5,4 97 3
5,6 95 5
5,8 92,2 7,8
6 88 12
6,2 81 19
6,4 73 27
6,6 63 37
6,8 50,8 49,2
7 38,9 61,1
7,2 28 72
7,4 19,2 80,8
7,6 13 87
7,8 8,5 91,5
8 5,5 94,5
Solución amortiguadora de fosfato sódico 0,1 M a 25 °C

pH Na2H P 0 4 (mi) NaH2P 0 4(ml)
5,8 7,9 92,1
6 12 88
6,2 17,8 82,2
6,4 25,5 74,5
6,6 35,2 64,8
6,8 46,3 53,7
ERRNVPHGLFRVRUJ
PH Na2H P 0 4 (mi) NaH2P 0 4 (mi)

7 57,7 42,3
7,2 68,4 31,6
7,4 77,4 22,6
7,6 84,5 15,5
7,8 89,6 10,4
8 93,2 6,8
Solución amortiguadora de fosfato potásico 0,1 M A 25 °C

PH K2H P 0 4 (mi) KH2P 0 4(ml)
5,8 8,5 91,5
6 13,2 86,8
6,2 19,2 80,8
6,4 27,8 72,2
6,6 38,1 61,9
6,8 49,7 50,3
7 61,5 38,5
7,2 71,7 28,3
7,4 80,2 19,8
7,6 86,6 13,4
7,8 90,8 9,2
8 94 6
Solución amortiguadora Tris a varios valores de pH

PH a 25 °C Vol. de HCI 0,1 N (mi)
7.1 45,7
7.2 44,7
7.3 43,4
7.4 42
7.5 40,3
7.6 38,5
7.7 36,6
7.8 34,5
7.9 32
8 29,2
8,1 26,2
8.2 22,9
8.3 19,9
8.4 17,2
8.5 14,7
8.6 12,4
8.7 10,3
8.8 8,5
8.9 7
Nota: Los tam pones Tris 0,05 M a un pH deseado se deben hacer mezclando Tris base 0,1 M
con un volumen indicado de HCI 0,1 M y ajustando luego la mezcla a 100 mi de H20 bidestilada.
Formas de expresar las actividades enzimáticas. Factores de conversión

Actividades
• U I/1010de hematíes
• U I/100 mi de hematíes
• U l/g de hemoglobina
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Cálculos
• UI/100 mi Hes —> U/10'° Hes
• N = n.° de hematíes
1.000 mi de sangre total corresponden a N X 1012Htes
100 mi de sangre total corresponden a N X 10" Htes
u u N x i0 0 x l0 " H e s
100 mi de H es= -----------------------
Hto
Pasar U /100 m i de Htes —> U/g Hb
U /100 mi de Htes TTT. TT,

----------------------- = Ul/g Hb
CCMH
Pasar U/100 m i de hematíes a U/1010Htes
UI/1010Htes = Hto Act/100 mi Htes

H tesxlO 3
Pasar U/g H b a U/100 mi de Htes
UI/100 mi de Htes = U/g Hb x CCMH
Efecto de la temperatura en la dosificación enzimática

Factores de conversión
Enzimas Actividad a 30° Actividad a 25°
Actividad a 37° Actividad a 37°
Acetilcolinesterasa 0,822 ± 0,035 0,73 ± 0,053
Adenosina desaminasa 0,75 ± 0,022 0,489 ± 0,021
Adenilato cinasa 0,77 ± 0,061 0,553 ± 0,052
Aldolasa 0,628 ±0,051 0,548 ± 0,089
Catalasa 0,861 ± 0,015 0,762 ± 0,017
Difosfoglicerato mutasa 0,71 ± 0,033 0,504 ± 0,038
Enolasa 0,7 ±0,018 0,445 ± 0,01
Glucosa fosfato isomerasa 0,76 ± 0,019 0,590 ± 0,014
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,815 ±0,031 0,559 ± 0,034
Glutatión peroxidasa 0,867 ± 0,013 0,818 ± 0,014
Glutatión reductasa sin FAD 0,714 ± 0,005 0,543 ± 0,047
Glutatión reductasa con FAD 0,735 ± 0,009 0,562 ± 0,02
Gliceraldehído-3-fosfato DH 0,699 ± 0,044 0,52 ±0,013
GOT sin fosfato de piridoxal 0,867 ± 0,043 0,601 ± 0,019
GOT con fosfato de piridoxal 0,789 ± 0,058 0,561 ± 0,015
Hexocinasa 0,709 ± 0,037 0,477 ± 0,022
Lactato deshidrogenasa 0,670 ± 0,019 0,44 ± 0,009
Monofosfoglicerato mutasa 0,696 ± 0,015 0,399 ± 0,02
NADH metahemoglobina reductasa 0,870 ± 0,021 0,733 ± 0,02
Fosfofructocinasa 0,750 ± 0,045 0,58 ± 0,014
Fosfoglucomutasa 0,643 ±0,011 0,416 ± 0,008
Fosfoglicerato cinasa 0,735 ± 0,047 0,604 ± 0,056
Piruvato cinasa 0,689 ± 0,037 0,432 ± 0,026
6-fosfogluconato deshidrogenasa 0,668 ± 0,013 0,486 ± 0,025
Triosa fosfato isomerasa 0,656 ±0,051 0,475 ± 0,047
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Capítulo 19 Diagnóstico de las erítroenzim opatías 5 8 6 .e l
Autoevaluación
1. ¿Por qué un defecto enzimático tiene m ayor impacto clínico sobre los hematíes que sobre
otros tejidos del organismo?
(a) Por la limitada vida media de los eritrocitos.
(b) Por la incapacidad del hematíe para adaptarse a situaciones metabólicas más precarias.
(c) Por el descenso del pH que producen los defectos enzimáticos en el interior de los hematíes.
(d) Por la a ausencia de síntesis proteica en el eritrocito m aduro.
(e) Por el efecto de la enzimopatía sobre la deformabilidad eritrocitaria.
Respuesta razonada: el eritrocito cumple tres funciones principales encaminadas, todas ellas, a
m antener el transporte de la hemoglobina: a) conservar la integridad de sus componentes para
sobrevivir en la circulación sanguínea aproximadamente 120 días; b) mantener el hierro hemoglobí-
nico en estado reducido para que la hemoglobina pueda fijar reversiblemente el oxígeno molecular,
y c) contribuir a la función hemoglobínica, facilitando la liberación del oxígeno en los tejidos.
Estas funciones las realiza gracias a su reducida, pero suficiente, dotación enzimática, heredada
de sus precursores, los eritroblastos, que le permite obtener energía en forma de ATP (metabolis
mo energético), proteger la hemoglobina de los agentes oxidantes (sistema oxidorreductor) y
contribuir a la función respiratoria de la hemoglobina (síntesis de 2,3-bisfosfoglicerato). La
ausencia de síntesis proteica en el eritrocito m aduro imposibilita el recambio molecular de estas
enzimas, p or lo que su déficit congénito tiene, casi siempre, una repercusión fisiopatológica
mucho mayor que en cualquier otra célula del organismo.
2. ¿Cuál es la eritroenzimopatía más frecuente que causa anemia hemolítica crónica?
(a) El déficit de G6PD.
(b) El déficit de aldolasa.
(c) El déficit de piruvato cinasa.
(d) El déficit de hexocinasa.
(e) Todas muestran una frecuencia similar.
Respuesta razonada: aunque, en nuestro medio, el déficit de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
(G6PD) es la enzimopatía más frecuente, la presencia de otras erítroenzimopatías no constituye
un hecho excepcional. Así, se han descrito déficits de piruvato cinasa (PK), fosfoglucosa isomerasa
(PGI), triosa-fosfato isomerasa (TPI), p irim idina 5’-nucleotidasa (P5’N ), fosfofructocina-
sa (PFK) y diaforasa.
3. ¿Cuál es la enzima eritrocitaria para la cual la m edida de actividad exige evitar la contam i
nación leucocitaria del hemolizado?
(a) El déficit de piruvato cinasa.
(b) El déficit de G6PD.
(c) El déficit de triosa-fosfato isomerasa.
(d) El déficit de hexocinasa.
Respuesta razonada: la determinación sistemática de las actividades enzimáticas del eritrocito
no es compleja, aunque sí delicada, por cuanto cualquier contam inación, p o r pequeña que
sea, o ligeras variaciones de la tem peratura pueden modificar los resultados. Así, el análisis
cuantitativo de las actividades enzimáticas eritrocitarias debe efectuarse siempre a partir de
hemolizados desprovistos de contaminación leucocitaria. Ello es especialmente importante en la
determinación de la actividad de PK, ya que esta enzimopatía eritrocitaria se acompaña de una
actividad leucocitaria normal; debido a ello, la contaminación del hemolizado por leucocitos
puede dificultar la detección del déficit.
4. ¿Cuál es el factor que debe tenerse m uy en cuenta cuando se interpreta el resultado de la
medida de las actividades enzimáticas?
(a) La calidad de los reactivos.
(b) La edad del paciente.
(c) El núm ero de reticulocitos circulantes.
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(d) La concentración de hemoglobina.

(e) Son correctas b y c.
Respuesta razonada: para interpretar los resultados de un estudio enzimático eritrocitario debe
tenerse en cuenta la edad del paciente y el núm ero de reticulocitos presentes en el m omento de
realizar el estudio. En los recién nacidos y niños menores de 1 año, ciertas enzimas presentan
actividades inferiores a las del estado adulto, pudiendo hacer creer en un falso déficit enzimático
si no se tiene en cuenta la edad. Asimismo, el grado de reticulocitosis es también muy importante,
por cuanto los eritrocitos jóvenes poseen actividades enzimáticas generalmente m uy superiores
a las del eritrocito adulto normal. En tales casos, si la reticulocitosis es lo suficientemente alta,
puede enmascararse u n déficit enzimático, al observarse una falsa «actividad normal» debida
al efecto de los reticulocitos.
5. ¿Cómo influye la glucólisis eritrocitaria sobre la función de la hemoglobina?
(a) Mediante variaciones de la actividad piruvato cinasa.
(b) Gracias a la vía de pentosas fosfato.
(c) Mediante un descenso del pH intraeritrocitario.
(d) Regulando la concentración de 2,3-DPG.
(e) La glucólisis no tiene nada que ver con la función de la hemoglobina.
Respuesta razonada: el 2,3-DPG es un metabolito muy abundante en el eritrocito y fundamental
para la regulación de la función hemoglobínica. Se origina a p artir del 1,3-difosfoglicerato
(glicerato-l,3-P2) mediante una reacción enzimática catalizada por la enzima 2,3-bisfosfogli-
cerato-sintasa (BPGS), que posee también actividad mutasa o fosfogliceratomutasa (MPGM).
Cuando desciende el pH eritrocitario, se activa la función fosfatásica de la BPGS y el 2,3-DPG
se transform a en 3-fosfoglicerato (3PG), cerrándose con ello el llamado «ciclo del 2,3 DPG».
Finalmente, el 3PG se transform a en lactato a través de varias reacciones enzimáticas, en una
de las cuales se produce una molécula de ATP. Debido a ello, cuando se produce un bloqueo
metabólico de la prim era etapa de la glucólisis, el eritrocito puede m antener durante cierto
tiem po su contenido en ATP gracias al consumo de 2,3-DPG.
6. ¿Cuál es el metabolito fundamental en la eliminación del exceso de peróxido de hidrógeno
intraeritrocitario?
(a) El 2,3-difosfoglicerato.
(b) El lactato.
(c) El glutatión reducido (GSH).
(d) El glutatión oxidado (GSSG).
(e) El ATP.
Respuesta razonada: la protección de las proteínas eritrocitarias y en especial de la hemoglobina
frente a la acción de los llamados agentes oxidantes, normalmente presentes en el interior del
eritrocito, se realiza m ediante los sistemas de oxidorreducción, cuya finalidad es m antener el
glutatión eritrocitario en estado reducido (GSH) y reducir el hierro hemínico (Fe++), evitando la
transformación de la hemoglobina en metahemoglobina. El GSH es un tripéptido sintetizado en
el propio eritrocito, que actúa eliminando el exceso de peróxido de hidrógeno (H20 2) mediante
una reacción enzimática catalizada por la glutatión peroxidasa.
7. ¿Cuál es causa más frecuente y mejor conocida de descenso del poder reductor eritrocitario?
(a) El déficit de glutatión sintetasa.
(b) El déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
(c) El déficit de glutatión reductasa.
(d) El déficit de glutatión peroxidasa.
(e) El déficit de catalasa.
Respuesta razonda: la causa más frecuente y mejor conocida de descenso del poder reductor eri
trocitario es el déficit congénito de la glucosa 6-fosfato-deshidrogenasa (G6PD). Esta enzimopatía
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Capítulo 19 Diagnóstico de las erítroenzim opatías 5 8 6 .e 3
es m uy frecuente en nuestro medio y constituye la base molecular de la anemia hemolítica aguda,

desencadenada por la ingesta de habas o favismo.
8. ¿Cuál es la eritroenzimopatía cuyo déficit es causa de punteado basófilo eritrocitario?
(a) El déficit de adenilato cinasa (AK).
(b) El déficit de pirimidina 5’-nucleotidasa (P5’N).
(c) El déficit de glutatión reducido (GSH).
(d) El déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
Respuesta razonada: como el eritrocito carece de síntesis de nucleótidos adenílicos (AMP, ADP
y ATP), todas aquellas enzimas que de alguna forma eviten su degradación o intervengan en
su síntesis adquieren gran importancia funcional. Entre las enzimas importantes de esta vía y
cuyo déficit se acompaña de anemia hemolítica, destacan la pirimidina 5’-nucleotidasa (P5N), la
adenosina desaminasa (ADA) y la adenilato cinasa (AK). El déficit de P5N provoca un acúmulo
intraeritrocitario de nucleótidos adenílicos con dism inución de la degradación del exceso de
ARN, lo que produce punteado basófilo.
9. El déficit hereditario de diaforasa cursa con cianosis debido a u n aumento de m etahem o
globina. ¿Qué substancia puede administrarse a los pacientes para reducir la concentración
de metahemoglobina?
(a) Hierro en cápsulas.
(b) Vitamina C.
(c) Ácido acetilsalicílico.
(d) Azul de metileno.
(e) Azul de cresilo brillante.
Respuesta razonada: el déficit hereditario de NADH-diaforasa es causa de m etahemoglobine
mia, que en algunos pacientes puede ir asociada a un trastorno neurológico grave. Junto a la
NADH-diaforasa, el eritrocito posee un sistema diaforásico secundario (NADPH-diaforasa)
que n o funciona en condiciones fisiológicas porque le falta el aceptor de electrones (citocro
mo b5). N o obstante, este sistema secundario (NADHP-diaforasa) puede actuar si se administra
un receptor apropiado, como, p or ejemplo, el azul de metileno. Por ello, en caso de déficit de
NADH-diaforasa, la administración de azul de metileno produce la reducción de la hemoglobina
y la desaparición de la cianosis.
10. El diagnóstico de una eritroenzimopatía exige realizar:
(a) Un estudio genético.
(b) La m edida de su actividad.
(c) Un recuento de reticulocitos.
(d) La m edida de la concentración de hemoglobina.
(e) La prueba de la mancha fluorescente.
Respuesta razonada: la detección de una eritroenzimopatía puede realizarse mediante métodos
cualitativos o cuantitativos. Los métodos cuantitativos son los únicos válidos para confirmar la
existencia de una eritroenzimopatía. En general, aunque con ligeras diferencias, todos ellos se
basan en el empleo de una mezcla de substrato-coenzimas e iones en un medio amortiguado,
donde la enzima que se debe analizar constituye la etapa limitante.
ERRNVPHGLFRVRUJ
C A P Í T U L O 20
Una visión práctica de los grupos sanguíneos

eritrocitarios
E. Muñiz-Díaz, N. Nogués, R. M ontero y C. Canals
INTRODUCCIÓN
Los grupos sanguíneos son caracteres heredados, localizados en estructuras polimorfas
de la membrana del eritrocito, y reconocidos por anticuerpos específicos. Hablamos de
polimorfismo cuando en una determinada población existen, como mínimo, dos variantes
alélicas de un mismo gen. Los alelos, por tanto, no son más que versiones alternativas de
un gen que difieren entre sí en su secuencia nucleotídica. Los cambios en la secuencia
nucleotídica original se producen como consecuencia de mutaciones. Estas diferencias es
tructurales de los alelos van a comportar también diferencias estructurales en los productos
que codifican. Un gen constituido por múltiples alelos es un gen polimorfo o alelomorfo.
A ctualm ente, se han definido 33 sistemas de grupos sanguíneos eritrocitarios
(tabla 20-1). Cada sistema está integrado por un conjunto de antígenos que son producto
de los alelos pertenecientes a un mismo locus genético (representado por un solo gen o
por un «clúster» de dos o más genes estrechamente ligados), independiente de los locus
genéticos que codifican para los otros sistemas de grupo sanguíneo y, por tanto, trans
mitidos de forma independiente. La posibilidad de un entrecruzamiento entre estos genes
es imposible o muy remota, dada su proximidad. Además, se han definido siete «colec
ciones» de antígenos relacionados entre sí por sus características genéticas, bioquímicas
o serológicas (tabla 20-2). Y, finalmente, dos series de antígenos, una de baja frecuencia
(serie 700) y otra de alta frecuencia (serie 900) que no han podido adscribirse a ningún
sistema o colección (tablas 20-3 y 20-4). Para conseguir una nomenclatura unificada,
la Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea ha establecido que cada antígeno
está representado por seis dígitos. Los tres primeros corresponden al sistema (001-030)
(p. ej., 006 para Kell), a la colección (205-210), o a las series 700 o 900. Los otros tres
números identifican al antígeno (p. ej., 006003 para Kpa). Cada sistema tiene además
un símbolo alfabético. Esta terminología ha resultado muy útil para unificar criterios
y para el almacenamiento electrónico de la información, sin embargo resulta compleja
para la comunicación verbal, por lo que se sigue aceptando en este entorno el uso del
nombre clásico de los antígenos.
La importancia clínica de los grupos sanguíneos en hematología se debe a la posibi
lidad de que los aloanticuerpos (dirigidos contra antígenos no presentes en el individuo
que los produce) pueden ocasionar la destrucción de los hematíes transfundidos, o
atravesar la placenta e inducir una hemólisis en el feto y en el recién nacido. Esto va a
depender de lo siguiente: la frecuencia con la que cada aloanticuerpo se produce, las
características funcionales del mismo (amplitud térmica, clase de inmunoglobulina,
capacidad de fijar el complemento) y la frecuencia con la que el aloantígeno está presente
en la población.

ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-1. Sistemas de grupos sanguíneos eritrocitarios
N.° Nombre del sistema Símbolo Nombre del gen Localización cromosómica
001 ABO ABO ABO 9q34.2
002 MNS MNS GYPA, GYPB, 4q31.21
GYPE
003 P1PK P1PK A4GALT 22qll.2-qter
004 Rh RH RHD, RHCE lp36.11
005 Lutheran LU LU 19ql3.32
006 Kell KEL KEL 7q34
007 Lewis LE FUT3 19pl3.3
008 Duffy FY DARC lq23.2
009 Kidd JK SLC14A1 18ql2.3
010 Diego DI SLC4A1 17q21.31
011 Yt YT ACHE 7q22.1
012 Xg XG XG, MIC2 Kp22.33
013 Scianna SC ERMAP lp34.2
014 Dombrock DO ART4 12pl2.3
015 Colton CO AQP1 7pl4.3
016 Landsteiner-Weiner LW ICAM4 19pl3.2
017 Chido/Rodgers CH/RG C4A, C4B 6p21.3
018 H H FUTI 19ql3.33
019 XK XK XK Xp21.1
020 Gerbich GE GYPC 2ql4.3
021 Cromer CROM CD55 lq32.2
022 Knops KN CR1 lq32.2
023 Indian IN CD44 llp l3
024 Ok OK BSG y^9pl3.3
025 Raph RAPH CD151 1lp 15.5
026 John Milton Hagen JMH SEMA7A 1 15q24.1
027 I I GCNT2 6p24.2
028 Globoside GLOB B3GALT3 3q26.1
029 Gill GIL AQP3 9pl3.3
030 Rh-associated RHAG RHAG 6
glycoprotein
031 Forsman FORS GBGT1 9q34.13
032 Junior JR ABCG2 4q22
033 Langereis LAN ABCB6 2q36
CONCEPTOS BÁSICOS EN LA GENÉTICA DE GRUPOS SANGUÍNEOS

El térm ino genotipo se refiere al conjunto de alelos heredados provenientes de un de
term inado gen (p. ej., AA, A O ) mientras que el fenotipo se refiere, exclusivamente, al
producto reconocible de estos alelos. Los antígenos producidos por diferentes alelos de
un determinado locus se denominan antitéticos.
Todos los cromosomas están dispuestos en parejas y, por ello, son diploides en el n ú
cleo celular. Cuando un par de alelos perteneciente al mismo gen de ambos cromosomas
son idénticos decimos que el individuo es homocigoto. Por el contrario, cuando este par
de alelos difiere decimos que el individuo es heterocigoto.
Un alelo puede ser dominante respecto a su pareja. Esto implica que solo se expresará
la versión de la proteína codificada por este alelo. El alelo suprimido se conoce como alelo
recesivo. Solo cuando el alelo recesivo esté presente en ambos cromosomas (el individuo
será homocigoto para este alelo recesivo) será posible reconocer a la correspondiente
versión de la proteína. También puede suceder que ambos alelos sean codominantes.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 20 Una visión práctica de los grupos sanguíneos eritrocitarios 589
TABLA 20-2. Colecciones de grupos sanguíneos
Colección Antígeno
N.° Nombre Símbolo N.° Símbolo Incidencia (%)

205 Cost COST 205001 Csa 95
205002 Csb 34
207 li 1 207002 i *
208 Er ER 208001 Era >99
208002 Erb <1
208002 Er3 >99
209 GLOB 209002 Pk >99*
209003 LKE 98
210 210001 Lec 1
210002 Led 6
212 Vel VEL 212001 Vel >99
212002 ABTI >99
213 MN 213001 Hu
CHO 213002 MI
213003 Tm
213004 Can
213005 Sext
213006 Sj
*Con test serológicos estándar, suele ser de baja incidencia.
TABLA 20-3. Antígenos de baja incidencia (serie 700)
N.° Nombre Símbolo

700002 Batty By
700003 Christiansen Chra
700005 Biles Bi
700006 Box Bxa
700017 Torkildsen Toa
700018 Peters Pta
700019 Reid Rea
700021 Jensen Jea
700028 Livesay Lia
700039 Milne
700040 Rasmussen RASM
700043 Oldeide 01a
700044 JFV
700045 Katagiri Kg
700047 Jones JONES
700049 HJK
700050 HOFM
700052 SARA
700054 REIT
Esta es la situación que concierne a la mayoría de alelos que codifican para los diferentes
productos polimorfos responsables de los grupos sanguíneos. Algunos genes tienen alelos
que no codifican ningún producto, son los alelos silentes.
Los alelos de genes muy próximos se heredan conjuntamente constituyendo lo que
conocemos por haplotipo.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-4. A ntígenos de a lta inciden cia (serie 901)
N.° Nom bre Sím bolo
901003 August Af
901008 Emm
901009 Anton AnWj
901011 Sid Sda
901014 PEL
901016 MAM
ANTÍGENOS ERITROCITARIOS
Pueden expresarse exclusivamente en los hematíes (antígenos Rh), o adicionalmente
en otras células sanguíneas (el antígeno P l), en otros tejidos (antígenos MNS), o en
las células sanguíneas y en los tejidos (antígenos ABO). La mayoría de los antígenos
eritrocitarios son producto directo del gen que los codifica y se ubican en proteínas,
glucoproteínas y glucolípidos de la mem brana eritrocitaria. Los antígenos de los sis
temas ABO, Lewis y P constituyen una excepción, porque los genes correspondientes
codifican para u n enzima (transferasa) responsable de catalizar la reacción por la que
un determinado monosacárido o azúcar se une a un sustrato (oligosacárido) para cons
tituir una determ inada estructura antigénica. Las proteínas que expresan antígenos
eritrocitarios se insertan en la m em brana a través de las siguientes opciones: como
proteínas de un solo paso, como proteínas de múltiples pasos, o bien como proteínas
ancladas a la membrana a través de enlaces glucosilfosfatidilinositol (GPI) (fig. 20-1).
La distribución y frecuencia de los diversos fenotipos eritrocitarios varía según las po
blaciones y los grupos étnicos (tabla 20-5).
MNs Kell Rh Kidd Vt Cromer.

Lutheran Duffy Diego Dom brockv
KX Colton
V n H¡
m m? n n n n
. . .
C O O H —'
P aso ú n ic o /
N H - ''
. mm u u u u
FIGU RA 20-1. Representación esquemática de la membrana eritrocitaria y del modo de inserción

de las proteínas donde se localizan los diferentes grupos sanguíneos eritrocitarios.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-5. Principales sistemas de grupo sanguíneo, fenotipos y frecuencias

en población caucásica y de raza negra
Sistema Frecuencia en raza Frecuencia en raza

(símbolo ISBT) Fenotipo caucásica (%) negra (%)
ABO (ABO) 0 44 49
A 42 26
B 11 20
AB 4 5
MNS (MNS) S —s+ 45 68
S + s+ 44 24
S + s— 11 6
S —s— Raro 1,5
Rh (RH) Dce 2 47
DCcEe 13 4
dce 15 6
Dce 19 2
Dcce 35 21
DcE 2 0,2
DcE 12 19
Kell (KEL) K—k+ 91 98
K+k+ 9 2
Duffy (FY) Fy(a-b+) 34 22
Fy(a+b+) 49 1
Fy(a+b-) 17 9
F y (a -b -) Raro 68
Kidd (JK) Jk (a-b + ) 23 9
Jk (a+b+) 49
Jk (a+ b -) 27 50
ANTICUERPOS ERITROCITARIOS
Casi todos los anticuerpos dirigidos contra los antígenos eritrocitarios son inm uno-
globulinas de clase IgG, o bien IgM, y una m inoría m uestran especificidad IgA. Las in
munoglobulinas de clase IgM tienen mayor capacidad para activar el complemento (C)
que las de clase IgG, ya que se requieren dos dominios Fe para activar la porción C lq de
la fracción C l. La estructura de las moléculas IgM permite que una sola molécula sea
capaz de unirse a la porción C lq; en el caso de las IgG se requieren como mínimo dos
moléculas adyacentes para que se produzca una correcta unión.
Las subclases IgGl e IgG3 activan fuertemente el complemento, IgG2 lo hace débil
mente e IgG4 no es capaz, en general, de activarlo. Los anticuerpos que son activos a
37 °C son capaces de destruir o de secuestrar a los hematíes alogénicos transfundidos.
Los anticuerpos de clase IgG también son capaces de atravesar la placenta y, en teoría,
de producir enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN).
A nticuerpos «naturales»
Los llamados anticuerpos «naturales» son habitualmente de clase IgM, pero también
pueden ser de clase IgG, y se detectan en personas que no han sido nunca transfundidas
con hematíes, y que carecen de antecedentes de gestación, en el caso de las mujeres.
Se supone que su aparición ha tenido lugar como respuesta a la exposición a ciertas
sustancias que están presentes en el medio ambiente o en la dieta y que muestran una
estructura similar al antígeno eritrocitario en cuestión. Algunos anticuerpos naturales
ERRNVPHGLFRVRUJ
de especificidad anti-A, anti-B y anti-A,B son reactivos a 37 °C, pero la mayoría de

anticuerpos «naturales» no lo son, y se considera que carecen de importancia clínica.
Anticuerpos adquiridos o inm unes

Son predominantemente de clase IgG, aunque pueden contener un componente IgM
y/o IgA. Se producen tras la exposición a un antígeno extraño en el curso de una trans
fusión o del embarazo. La incidencia viene dada por la frecuencia del antígeno en la
población y por su inmunogenicidad. La relativa inmunogenicidad de un antígeno se
ha deducido de los estudios efectuados en pacientes transfundidos y en gestantes. Entre
los antígenos que no inducen anticuerpos «naturales», el antígeno D es de lejos el más
inmunogénico, seguido de los antígenos K y c. La capacidad de respuesta varía de unos
individuos a otros, y parece estar sujeta a diferentes factores, genéticos y ambientales.
Los pacientes con enferm edades autoinm unes son más proclives a desarrollar
aloanticuerpos, por ejemplo en más de un 32% de los pacientes con anemia hemolí
tica autoinm une se detectan aloanticuerpos. Igualmente sucede con los pacientes con
hemoglobinopatía S. Por el contrario, son poco habituales en los pacientes afectos de
hipogammaglobulinemia (leucemia linfocítica crónica [LLC], niños en los primeros
meses de vida).
La actividad de los anticuerpos tiende a reducirse con el tiempo, si el paciente no se
expone nuevamente al antígeno. La concentración de los anticuerpos dirigidos frente al
sistema Kidd disminuye m uy rápidamente.
En las tablas 20-6 y 20-7 se reflejan algunas de las principales características de los
anticuerpos específicos relacionados con los antígenos eritrocitarios pertenecientes a
los diferentes sistemas, colecciones y series.
SISTEMA ABO
Descubierto por Landsteiner en 1900, continúa siendo el sistema más importante en la
transfusión sanguínea, debido a la presencia sistemática de anticuerpos regulares reacti
vos a 37 °C, fijadores de complemento y dirigidos contra los antígenos de los que carece
el portador de los mismos. Estos anticuerpos pueden producir reacciones hemolíticas
muy graves de tipo intravascular cuando se transfunden hematíes ABO incompatibles.
TABLA 20-6. Significado clínico de algunos anticuerpos antieritrocitarios
Clínicamente Clínicamente No significativos Generalmente sin

significativos siempre significativos a veces por debajo de 37 °C significación clínica
Ay B Ata Al Bg
Diego Colton H Chido-Rogers
Dufiy Cromer Lea Cost
H en Oh Dombrock Lutheran JMH
Kell Gerbich M ,N Knops
Kidd Indian Pl Leb
P, PPIPk Jra Sda xgr
Rh Lan
S, s,U LW
Vel Scianna
Yt
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-7. Datos complementarios de algunos anticuerpos antieritrocitarios distintos

de los sistemas ABO y Rh
Ag Proteína Temperatura óptima Medio reacción Fijación complemento

Lewis IgM 20-37 °C Variable Sí
I IgM 4°C Salino Algunos
P IgM 4-20 °C Salino Solo Tja
MNSs IgM 4-20 °C Salino Algún Ss
Lutheran IgM-IgA Variable Salino
Kell IgG 37 °C AGH No
Duffy IgG 37 °C AGH No
Kidd IgG 37 °C AGH Todos
Genes y antígenos
Como ya se ha comentado, a diferencia de otros sistemas de grupo sanguíneo, en que
los genes codifican directamente para los correspondientes antígenos, en este sistema, los
genes A y B codifican para unas enzimas que van a catalizar la reacción que permite la
unión de determinados carbohidratos a precursores glucoproteicos o glucolipídicos
para configurar la estructura antigénica propia de lo que conocemos como antígenos
A y B (fig.20-2).
Los antígenos ABH se encuentran ampliamente distribuidos en nuestro organismo
y, además de los hematíes, podemos encontrarlos en linfocitos, plaquetas (adsorbidos
del plasma), en la mayoría de tejidos endoteliales y epiteliales, y en algunos órganos
FIGU RA 20-2. La adición de N-acetilgalactosamina a la cadena precursora H por acción de una

transferasa A implica la aparición del antígeno A. La adicción de galactosa por acción de la transferasa B
implica la aparición del antígeno B.
ERRNVPHGLFRVRUJ
como es el caso de los riñones. Por este motivo, en el trasplante de órganos sólidos ABO
incompatibles, puede producirse una grave reacción hiperaguda del injerto. Asimismo,
en el caso del trasplante de progenitores hematopoyéticos con incompatibilidad ABO
mayor (p. ej., receptor O, donante A), puede ocurrir una hemólisis aguda, a menos que
los hematíes incompatibles sean separados de las células progenitoras. Los antígenos
ABH también pueden encontrarse en forma soluble, y se localizan en las secreciones
y en todos los fluidos con excepción del líquido cefalorraquídeo. En la m embrana del
hematíe están presentes como moléculas glucolipídicas o glucoproteicas, y en la forma
soluble se hallan fundamentalmente como glucoproteínas. A las 5 o 6 semanas de vida
intrauterina ya pueden ser detectados, pero no alcanzan su máxima expresión hasta los
2-4 años de vida, por lo que pueden reaccionar débilmente en las muestras de cordón y
durante los primeros años de vida.
Existen cuatro posibles fenotipos ABO, y en la práctica cotidiana se dice que un
individuo pertenece al grupo A, B, AB u O. En los grupos A y B pueden diferenciarse
diversos subgrupos, pero raras veces tienen significado clínico. En la tabla 20-8 se mues
tra la relación de fenotipos y posibles genotipos en el sistema ABO, y en la tabla 20-9
la distribución de los m ism os en un g rupo de 215 donantes de sangre españoles.
Globalmente, en la raza caucásica los grupos O y A son los más frecuentes (45 y 40%,
respectivamente), seguidos del grupo B (11%) y del grupo AB (4%). La frecuencia del
grupo B en las razas negra y asiática es claramente superior (20 y 27%, respectivamente)
a las de la raza blanca (11%).
El gen del antígeno A está constituido por 1.062 pb que codifican un total de 353
aminoácidos (AA). La proteína resultante es una enzima (transferasa A) encargada de
facilitar la unión del azúcar N-acetilgalactosamina a las cadenas activas H (v. fig. 20-2).
El gen del antígeno B es idéntico en un 99% al gen A, y contiene cuatro nucleótidos dis
tintos que comportan un cambio de AA en los residuos 176,235,266 y 268. La proteína
resultante es también una enzima (transferasa B) que añade galactosa a las cadenas H
activas (v. fig. 20-2). El gen O es amorfo y codifica para una proteína funcionalmente
inactiva de solo 116 AA, como consecuencia de la deleción de una base (G) cerca del
TABLA 20-8. Relación de fenotipos y posibles genotipos en el sistema ABO
Fenotipo Antígenos Anticuerpos Gen Genotipos

O Ninguno Anti-A O O'O1
Anti-A, (yo2
Anti-B O'O2
Anti-A,B
A, A+A, Anti-B A1 A1A1
A'A2
A'O'
A'O2
A2 A Anti-B A2 A2A2
Anti-A, (a veces) A20'
A2^
B B Anti-A B BB
BO1
BO2
AiB A+A,+B Ninguno A'B A’B
a 2b A+B A menudo A2B A2B
anti-A
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-9. Distribución de los fenotipos y posibles genotipos del sistema ABO
en una serie de 212 donantes de sangre españoles
Fenotipo n Genotipos n
A, 56 A'A1 8
A'A2 2
A10 1 42
A'O2 4
A2 15 A2A2 3
A20' 10
A2(y 2
B 21 BB 1
BO' 19
BO2 1
A,B 4 A'B 4
A 2B 2 A2B 2
O 117 O'O1 111
0 20 2 5
O'O2 1
extremo 5' terminal de la secuencia codificante, en la posición 261; este cambio comporta
la aparición anticipada de un triplete de finalización que interrumpe el proceso de trans
cripción (fig. 20-3).
Los subgrupos de A y B (tablas 20-10 y 20-11) tam bién se producen como con
secuencia de m utaciones similares que com portan cambios en los AA. Por ejemplo,
A2 se produce como consecuencia del cambio de leucina p o r prolina en el residuo
156 de la proteína. Serológicamente, esto se traduce en la aparición de una transferasa
N'-acetilgalactosamina que posee un pH óptimo alterado, pero que todavía es capaz de
A1 A2 B o1 o2
FIGU RA 20-3. Representación esquemática de la estructura de los productos de los alelos ABO.
En la figura se indica la localización de las mutaciones responsables de las diferencias estructurales
entre los alelos ABO. Cuatro mutaciones puntuales diferencian el alelo B de A1y dos solamente a A2de A1.
El producto O1se debe a la deleción de una base (G) en la posición 261 de la secuencia, lo que ocasiona
la aparición de un triplete de finalización precoz (stop codón). La estructura del alelo O2es muy similar
a la de los productos del gen B, pero entre ambos existen diferencias como resultado de dos mutaciones
puntuales en el gen O2.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-10. Fenotipos débiles de A
Subgrupo Reactividad* frente a: Sustancias Suero Frecuencia

de A ensaliva1 Anti-A1 (%)
Anti-A Anti-A,B Anti-Al Anti-H
AI ++++ ++++ ++++ 0 A, H No ND

A, ++++ ++++ 0 ++++ A, H A veces ND
Amt ++++ ++++ ++(+) +++ A, H No ND
A™ ++(+)“* + +(+ r 0 ++++ A, H A veces 0,01
AX 0/+ ++(+) 0 ++++ H A 0,03
menudo
A„d + + 0 ++++ H A veces 0,003
A'" 0/+ 0/+ 0 ++++ A, H No 0,0007
aL + + 0 ++++ H Sí ND
\a n tu +(+) +(+) 0 ++++ H Sí ND
A,ae 0* 0 +++** ++++ H Sí*** ND
A ae 0* 0 0 ++++ A, H No ND
0* 0 0 ++++ H A veces ND
mf, aglutinación en campo mixto; ND, n o determ inada (m uy infrecuente).
* U na reacción negativa se denota p o r 0. Las reacciones positivas se indican como desde + (aglutinación débil) a + + + +
(aglutinación máxima).
** Dolichos biflorus solamente.
*** Reactividad del suero contra A ( y A2 RBC.
TSustancias de grupos sanguíneos ABO en la saliva y otros fluidos corporales del secretor.
5A pesar de la falta de aglutinación, anti-A puede ser adsorbido y eluido por células en este subgrupo.
generar la suficiente sustancia A para configurar el antígeno A. Los hematíes poseerán,

en este caso, menos lugares antigénicos A que en los individuos de grupo A . Igualmente,
otros cambios de AA son responsables de la producción de glucosiltransferasas alteradas
que dan lugar a otros subgrupos de A y B, como A3, Axy By
El estudio molecular de los genes ABH ha permitido el descubrimiento de nuevos
alelos, como O2, en el que no existe el cambio de base presente en los alelos O «normales».
Este alelo es idéntico al alelo A 1, pero con dos AA distintos: Arg—>Gli en el residuo 176
y Gli—>Arg en el residuo 268 de la proteína, lo que resulta determinante para abolir la
actividad biológica de la enzima resultante (v. fig. 20-3).
TABLA 20-11. Fenotipos débiles de B
Tipificación en placa Sustancias Frecuencia

en saliva
Prueba globular (Beth-Vincent) Prueba sérica (Simonin)
Anti-B Anti-A Anti-AB Anti-H A l A2 B B H
B3 ++ - ++ +++ +++ ++ + + Poco frecuente
Bx (+) - (+) +++ +++ ++ (+) ay ++ Raro
B^ - - - +++ +++ ++ +++ (+) Raro
Bd - - - +++ +++ ++ + o- +++ Muy raro
Esta clasificación es aproximativa, solo para definir de una m anera práctica los fenotipos débiles de B, dado el gran
polimorfismo de estos (mutaciones familiares).
+ + o +, doble población; (+), aglutinación débil; (Bx), sustancia B detectada en la saliva de los individuos Bs p o r inhibición
con sus propios eritrocitos.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Relación entre los genes ABO, FUT1(H) y FUT2(Se) y la expresión

de los antígenos ABO
La expresión de los antígenos ABO está controlada desde tres locus genéticos distintos: el gen
ABO localizado en el cromosoma 9, el gen FUTI (H) y el gen FUT2(Se), ambos localizados en el
cromosoma 19. Cada uno de estos genes codifica para diferentes enzimas (glucosiltransferasas)
encargadas de la unión de monosacáridos específicos a cadenas precursoras de disacáridos.
Como ya se ha mencionado, los antígenos A y B se originan cuando las correspon
dientes transferasas producidas por los genes A y B facilitan la unión de un nuevo mono-
sacárido a su oligosacárido precursor, que no es otro que la estructura que corresponde
al antígeno H (v. fig. 20-2). A su vez, el antígeno H se origina a partir de un disacárido
previo cuando la enzima fucosiltransferasa producida por el gen FUTI (Ft) permite la
unión de un nuevo monosacárido (fucosa) a un oligosacárido precursor (v. fig. 20-2). Este
mismo oligosacárido precursor es el sustrato sobre el que se van a producir los antígenos
de los sistemas Lewis, I y P. En la tabla 20-12 se muestra la relación de glucosiltransferasas
TABLA 20-12. Glucosiltransferasas producidas por los genes que codifican para los antígenos
pertenecientes a los sistemas ABO, H y Lewis, azúcares incorporados y especificidad
serológica
Producto del gen Azúcar incorporado Estructura Especificidad

Genes por la enzima del oligosacárido terminal serológica
H(Se) a-L-fucosiltransferasa (1) Fue Gal0(l-3) LNT
GlcNAc-R
Gaip(l-3) f H 1
GlcNAc-R
1
2
a-Fuc
Le a-L-fucosiltransferasa (2) Fue Gal0(l-3) Lea
GlcNAc-R
1
4
a-Fuc
H(Se) a-L-fucosiltransferasa Fue GalpJ(l-3) Leb
YLe (1 y 2) GlcNAc-R
2 4
a-Fuc a-Fuc
A a-N-acetil-D-galactosaminil GalNAc aGalNAc(l-3) A
transferasa GalpJ(l-3)
GlcNAc-R
1
2
a-Fuc
B a-D - galactosiltransferasa Gal a-Gal(l-3) B
Gal|3(l-3)
GlcNAc-R
1
2
a-Fuc
Fue, fucosa; Gal, D-galactosa; GalNAc, N-acetil-D-galactosamina; GlcNAc, N-acetil-D-glucosamina; LNT, lacto-N-tetrosa;
R, cadena restante de oligosacárido.
Tomado de Morgan y Watkins, 1969.
ERRNVPHGLFRVRUJ
producidas por los genes que codifican para los antígenos pertenecientes a los sistemas
ABO, H y Lewis, los azúcares incorporados y la especificidad serológica final.
Los individuos portadores del raro fenotipo Bombay son hom ocigotos para el
alelo h del gen FU TI, de m anera que no pueden producir antígeno H y, en definitiva,
tam poco producen antígeno A ni B. Sus hematíes suelen tipificarse como O, pero un
meticuloso estudio de su suero m uestra la presencia de anti-H , además de anti-A,
anti-B y anti-A,B. En el resto de individuos, a partir del gen H aparecen los antígenos
correspondientes A, B o AB en función de su estructura genómica ABO. No obstante,
el antígeno H se conserva en u na cierta proporción en los individuos de grupo A y B,
y siempre en una proporción m ucho m enor de la que está presente en los individuos
de grupo O.
El gen FUT2 (Se) es responsable de la expresión del antígeno soluble H en las estruc
turas glucoproteicas de las secreciones como sucede en el caso de la saliva. Los individuos
de genotipo (SeSe o Sese) se denominan secretores, lo que ocurre en, aproximadamente,
un 80% de la población. El 20% restante de individuos (genotipo sese) son no secretores.
El alelo se es amorfo.
En la tabla 20-13 se m uestran ejemplos de la interacción entre los genes ABO,
FUTI (H) y FUT2(Se) y la expresión de los antígenos del sistema ABO en los hematíes
y en la saliva.
A nticuerpos
Los anticuerpos ABO aparecen en los prim eros meses de vida tras el contacto con
diversas sustancias presentes en la dieta o en el medio ambiente (bacterias, plantas, polen)
que presentan una estructura similar a los antígenos ABH. Aunque su aparición está
relacionada con una exposición antigénica, su carácter precoz hace que se les considere
como anticuerpos «naturales». Habitualmente son una combinación de moléculas IgM
e IgG y, a menudo, fijan complemento.
Una nueva inmunización puede producirse como resultado de una transfusión de
hematíes incompatible, de plasma que contiene antígenos solubles A o B incom pati
bles, de un embarazo de un feto ABO incompatible con la madre, o p or inoculación
de vacunas que contienen antígenos A o B. Esta reinmunización va a incrementar el
contenido del componente IgG y su capacidad para reaccionar a 37 °C.
TABLA 20-13. Relación entre los genes ABO, FUTI (H) y FUT2(Se) y la expresión
de los antígenos del sistema ABO
Antígenos expresados
Genes heredados
Hematíes Saliva
Ejemplo 1
ABHHSeSe A, B, H A, B, H
ABHHsese A, B, H N inguno
Ejemplo 2
OOHHSese H H
OOHHsese H N inguno
ERRNVPHGLFRVRUJ
El título de anticuerpos ABO decrece en las personas de edad avanzada y pueden

producirse discordancias entre los resultados de la prueba hemática y la prueba sérica
que dificultan la correcta catalogación del grupo sanguíneo ABO. Una situación similar
puede producirse con los pacientes afectos de diferentes patologías que cursan con inmu-
nodepresión: leucemia linfática crónica, mieloma múltiple, hipogammaglobulinemia y
agammaglobulinemia congénita o adquirida, pacientes en tratamiento inmunosupresor
o trasplantados con progenitores hematopoyéticos.
El anti-A producido por los individuos de grupo O y B puede separarse con técnicas
de adsorción y elución en dos componentes: anti-A y anti-A(. Anti-A( es específico para
el antígeno Aj y no aglutina a los hematíes A2. Su temperatura óptima de reacción suele
ser por debajo de los 37 °C, po r lo que no es considerado clínicamente significativo.
Sin embargo, puede ocasionar discordancias hemático-séricas en la tipificación ABO.
El anticuerpo anti-A2 no existe, porque los individuos de fenotipo A2 poseen el mismo
antígeno A que las personas de fenotipo A,, aunque en m enor proporción. Esto ex
plica por qué los individuos de fenotipo At no responden inmunológicamente tras la
exposición a hematíes de fenotipo A2.
El anti-H producido por los individuos de fenotipo Bombay es muy potente y puede
producir reacciones transfiisionales hemolíticas inmediatas muy graves. Solamente los
hematíes de otro individuo de fenotipo Bombay resultan compatibles. Los individuos
secretores que carecen de antígeno H en sus hematíes presentan antígeno H soluble en
las secreciones, motivo por el que cuando se sensibilizan no producen anti-H sino un
anticuerpo similar de especificidad anti-IH que no acostumbra a reaccionar a 37 °C, por
lo que no es considerado clínicamente significativo. Esta misma especificidad anti-IH
también puede detectarse en los individuos de grupo A por ser los que poseen menor
cantidad de antígeno H.
Sistema ABO y enferm edades

Los individuos de grupo A pueden, excepcionalmente, adquirir u n grupo B y trans
formarse en un grupo AB, aunque la expresión de este nuevo antígeno es más débil, al
igual que la del antígeno A que también se ve debilitada. En la mayoría de los casos se
trata de pacientes afectos de procesos del aparato digestivo, mayoritariamente carcinoma
de colon (cinco de los siete pacientes descritos en el artículo original presentaban
esta patología). La explicación a este fenómeno reside en que ciertas enzimas bacte
rianas (enzima diacetilasa) tienen la capacidad de convertir N-acetilgalactosamina en
a-galactosamina que es similar a la galactosa, el azúcar inmunodominante del grupo B.
El riesgo que conlleva esta situación es que el paciente sea incorrectamente transfundido
con hematíes de grupo AB y que sufra una reacción hemolítica fatal por la intervención
de un anti-B hiperinmune.
El debilitamiento del antígeno A es característico de los pacientes de grupo A afectos
de leucemia mieloide aguda. En algunos pacientes, lo que se observa es una doble po
blación de hematíes A y O. Los cambios en los antígenos B y H en los pacientes afectos
de leucemia no son tan comunes. En algunas ocasiones, la disminución en la expresión de
estos antígenos precede al diagnóstico de la leucemia y actúa como indicador de un es
tado preleucémico.
La herencia de los antígenos ABH parece estar débilmente asociada a la predisposición
de ciertas enfermedades:
• Carcinoma gástrico: los individuos de grupo A tienen un riesgo 1,2 veces superior al
de los de grupo B u O. También es superior el riesgo para el carcinoma de colon.
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• Ülcera péptica: los de grupo O tienen 1,4 veces mayor riesgo que los de los restantes
grupos.
• Ülcera duodenal: los individuos no secretores tienen 1,5 veces mayor riesgo que los
secretores.
• Los individuos de grupo B tiene mayor riesgo de sufrir infecciones por Streptococcus
pneumoniae y Escherichia coli.
No se conoce apenas nada de la función de los antígenos ABH presentes sobre los
hematíes y otras células y tejidos de nuestro organismo. No obstante, sabemos que con
tribuyen con su presencia a lo que conocemos como glucocálix, la matriz extracelular
compuesta de carbohidratos que protege a los hematíes de una posible lesión mecánica
y del ataque de los diversos microorganismos.
SISTEMA Rh
En 1930, Levine identificó por primera vez un anticuerpo en el suero de una mujer que
acababa de dar a luz a su segundo hijo, que aglutinaba el 85% de las sangres humanas
ABO compatibles. Se trataba de un anticuerpo propio de su especie. Sin embargo,
en 1940, Landsteiner y Wiener, inyectando eritrocitos del Macacus rhesus a conejos y
cobayas, aislaron un anticuerpo que también aglutinaba el 85% de los hematíes humanos.
Los sujetos cuyos eritrocitos aglutinaban con el suero anti-Rhesus se catalogaron como
Rh positivo, y el 15% restante, como Rh negativo. Hasta 1961, no quedó completamente
aclarada la confusión entre el anticuerpo de origen humano y el anticuerpo anti-Rhesus
de origen animal. Sin embargo, en aquel momento, ya se había generalizado tanto el
térm ino Rh en la práctica transfusional que resultaba imposible modificarlo. Levine
sugirió entonces dar el nom bre de anti-LW al anticuerpo anti-Rhesus de conejo, en
honor a sus descubridores.
Hoy en día, se sabe que se trata de dos sistemas genéticamente independientes, cuyos
antígenos pueden ser reconocidos por anticuerpos diferentes.
El sistema Rh es muy complejo y, hasta el momento, se han descrito un total de 50
antígenos y unos 170 alelos han sido definidos a nivel molecular, de m anera que su
estructura genómica es muy polimorfa. Además del antígeno D, otros cuatro antíge
nos (C, c, E y e) destacan por su importancia en la práctica transfusional relacionada
con su capacidad de inducir la producción de aloanticuerpos cuando no se respeta la
compatibilidad donante-receptor para cada uno de ellos. Estos cuatro antígenos cons
tituyen dos pares de antígenos antitéticos (C/c y E/e), estrechamente relacionados entre
sí y a la vez con el antígeno D, lo que condujo a Fisher a postular que en el sistema Rh
estos cinco antígenos más el inexistente antígeno d, antitético de D, se transmitirían en
forma de tres pares de alelos D/d, C/c y E/e ligados entre sí en forma de haplotipo, y
que las diferentes combinaciones posibles entre estos antígenos serían responsables de
los diferentes fenotipos.
A lo largo de la historia se han venido empleando diferentes nomenclaturas para
definir los genotipos y fenotipos de este sistema en función de la concepción de la
estructura genómica y el patrón de herencia aceptado en cada momento. La nom en
clatura de Fisher-Race denomina los antígenos por separado y los haplotipos resultantes
se expresan por la conjunción de tres letras. Es la nomenclatura D C c E e. W iener asignó
un nom bre a cada haplotipo, empleando la letra R mayúscula para los haplotipos D
positivo y la r minúscula para los D negativo. La letra se acompaña de un número (0,1,2)
o de un carácter ( '," ) para definir la presencia o ausencia de los otros cuatro antígenos
mayores. La nom enclatura de Rosenfield no tiene en cuenta la estructura genética y
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trata de construir un sistema práctico que facilite la clasificación de los antígenos que
se determinan. Cada antígeno se expresa por un núm ero determinado (1,2, 3, etc.), y
su ausencia, por el mismo número, pero precedido del signo menos (—1, —2, —3, etc.).
Actualmente, sigue siendo habitual el uso de la nomenclatura de Fisher en la escritura
ordinaria, y la nomenclatura de W iener en el lenguaje oral. En 1986, Tippett propuso
otro modelo genético para el sistema Rh, según el cual existirían dos locus estrechamente
ligados, D y CcEe, con dos alelos en el primero: D y n o D , y cuatro alelos en el segundo,
CcEe, que incluyen ce, Ce, cE y CE.
Poco después, C olin et al. d em ostraron que el locus Rh de los individuos Rh
positivo está compuesto p o r dos genes diferentes. En los individuos D negativo uno
de estos genes se halla ausente. Se apunta a que uno de estos genes R H codifica el
polipéptido D y el otro gen codificaría los polipéptidos C /c y E/e. Estos hallazgos
confirmarían el modelo de Tippett, si exceptuamos que ahora sabemos que el alelo d
(no D) no existe.
En la tabla 20-14 se exponen las diferentes nomenclaturas empleadas, a falta de un
acuerdo internacional para utilizar una nomenclatura única y en la tabla 20-15 los geno
tipos más probables del sistema Rh deducidos a partir de los fenotipos más frecuentes.
TABLA 20-14. Antígenos del sistema Rh. Nomenclaturas de Rosenfield, Fisher-Race

y Wiener
Otros Otros
Rosenfield Fisher-Race Wiener nombres Rosenfield Fisher-Race Wiener nombres
Rhl D Rh Rh31 ( J b i hr8 V Bastiaan
Rh2 C rh'° — Rh32 — RN —
Rh3 E rh" — Rh33 — — DHar
Rh4 c hr' — Rh34 — HrB Bas
Rh5 e hr" — Rh35 — — III4
Rh6 f, ce Hr — Rh36 — — Bea
Rh7 Ce rh. — Rh37 — — Evans
Rh8 Cw rhw Willis Rh39 C-like — —
Rh9 Cx rhx — Rh40 — — Tar
RhlO V,ces hrv — Rh41 Ce-like — —
R hll Ew rhw2 — Rh42 Ces rh.s Cces
Rhl2 G rhG — Rh43 — — - Crawford
Rhl3 * RhA — Rh44 — — Nou
Rhl4 * RhB — Rh45 — — Riv
Rhl5 * RhC — Rh46 — — See
Rhl6 * RhO — Rh47 — — Dav
Rhl7 ** Hr0 — Rh48 — — Jal
Rhl8 — Hr — Rh49 — — STEM
Rhl9 — hrs — Rh50 — — FPTT
Rh20 VS, es — — Rh51 — — MAR
Rh21 CG — — Rh52 — — BARC
Rh22 CE — Jarvis Rh53 — — JAHK
Rh23 Dw — Wiel Rh54 — — DAK
Rh26 c-like — Deal Rh55 — — LOCR
Rh27 cE — — Rh56 — — CENR
Rh28 — hrH Hernández Rh57 — — CEST
Rh29 — — Total Rh Rh58 — — CELO
Rh30 De°r Goa Rh59 CEAG
— — —
*Corresponde a algunos anti-D parciales formados por sujetos D positivos.
*■*Corresponde a u n anticuerpo D form ado por sujetos D— /D— .
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I TABLA 20-15. Genotipos más probables del sistema Rh deducibles a partir de los fenotipos 1
más frecuentes
Fenotipo Rh Genotipo probable Frecuencia genotípica

DCcee DCeldce(Rlr) 34,39
DCCee DCe/DCe(R}R}) 19,94
DccEe DcE/dce(R2r) 12,24
DccEE DcE/DcE(R2R2) 0,95
DCcEe DCe/DcE(R‘R2) 12,87
ddccee dce/dce(rr) 15,4
Genes y antígenos
El locus Rh está constituido por dos genes homólogos, RHD y RHCE, de 10 exones cada
uno, con una extensión cercana a 60 kb de ADN genómico. Están ubicados en el cromo
soma 1, en la posición lp34-36, y distribuidos en forma de tándem (uno a continuación
del otro), pero con orientaciones opuestas (5'R H D 3 '-3 'RH C E5'). El gen RHD está
flanqueado por dos regiones de 9 kb y un 98,6% de homología denominadas cajas Rhesus,
que tienen un papel primordial en la formación del haplotipo RHD negativo en la raza
caucásica (fig. 20-4). La deleción del gen RHD responsable del fenotipo negativo se produjo,
probablemente, por el entrecruzamiento desigual de las cajas Rhesus de dos haplotipos RH
mal alineados en trans, dando lugar a una caja Rhesus híbrida (fig. 20-5). Los individuos
de fenotipo D positivo pueden ser homocigotos para el gen RHD o bien, hemicigotos (una
sola copia del gen). Algunos individuos de fenotipo Rh(D) negativo, mayoritariamente
Genom a RhD-positivo
■i H 2 H 3 H * H s Hb H? 7 Hs H 5 H4 H3 H 2 H1 I
Caja Rhesus Caja Rhesus
Genom a RhD-negativo (raza caucásica)
Caja Rhesus híbrida
G enom a RhD-negativo (raza negra)
R H D <|i
M uta cio nes M utació n
puntuales ■ ---- «nonsense»
5' [[i l y y 5'
A
D u plica ción 37 pb
FIGU RA 20-4. Organización genómica del locus Rh humano.
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Gen RHD Gen RHCE

5' 3' 3' 5'
*H><>wooDaooniF
H aplotipo RHD negativo
Gen RHCE
P N SM P1 3' 5-
--------- Ü £ O 0 « J S E J 0 O O E -
Cajo Rhesus híbrida
FIGU RA 20-5. Recombinación genética en trans.
de poblaciones no caucásicas, conservan secuencias propias del gen RHD en el locus Rh,
lo que suele comportar discordancias entre fenotipo y genotipo. En la población de raza
negra, la variante alélica RHD *¥, o seudogén RHD, está presente hasta en un 66% de los
individuos Rh(D) negativo. Esta variante corresponde a un gen RHD inactivo que no es
capaz de dar lugar a la proteína RhD, ni al antígeno Rh(D) correspondiente.
En cuanto al gen RHCE, existen cuatro formas alélicas de este gen: RHce, RHCe RHcE
y RHCE. Los alelos que codifican para el antígeno C se diferencian en seis nucleótidos
(cuatro AA) de los alelos que codifican para el antígeno c, aunque parece ser que es la
posición aminoacídica 103 la que determina la especificidad. Los alelos RHE y RHe, en
cambio, se diferencian en un único nucleótido que comporta u n cambio de AA en la
posición 226.
Las proteínas resultantes, RhD y RhCE, son proteínas transmembrana no glucosiladas
de múltiples pasos, compuestas, cada una de ellas, p or 417 AA que difieren entre sí en
un total de 32 a 35 AA. A lo largo de las proteínas se distinguen 6 bucles extracelulares,
12 segmentos transmembrana y 7 segmentos intracelulares. Cada uno de los exones del
gen codifica para un segmento de la proteína, de manera que los 10 exones dan lugar a
una proteína completa (fig. 20-6). Las proteínas Rh forman complejo en la membrana
con una glucoproteína denominada RHAG (Rh-associated glycoprotein).
Tras el descubrimiento de la base molecular del locus Rh se han ido sucediendo en
cascada numerosos hallazgos relacionados con las bases moleculares de los diferentes
fenotipos Rh(D), incluyendo los correspondientes a los fenotipos D parcial y D débil.
Precisamente, las similitudes moleculares subyacentes en ambos fenotipos son las que
han propiciado el cambio hacia una visión unitaria de los mismos y a su inclusión dentro
de lo que actualmente conocemos como variantes RHD.
D parcial
Hasta que fueron definidas las bases moleculares del fenotipo D parcial, se suponía
que los individuos portadores de este fenotipo carecían de un fragmento de proteína lo
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In tra c e lu la r
FIGU RA 20-6. Modelo de las proteínas Rhesus (RhD y RhCE) en la membrana del hematíe.
suficientemente im portante como para sensibilizarse tras la exposición a u n antígeno

Rh(D) completo y desarrollar el correspondiente anticuerpo. Las bases moleculares que
explican este fenotipo pueden ser de tres tipos: alelos híbridos RHD/RHCE, mutaciones
puntuales en los segmentos extracelulares de la proteína y, finalmente, mutaciones pun
tuales dispersas (fig. 20-7).
Los alelos híbridos son responsables de la mayoría de fenotipos D parcial (fig. 20-8).
La estructura en tándem y la orientación en direcciones opuestas de los genes RHD y
RHCE facilitan las recombinaciones genéticas entre ellos dando lugar a alelos híbridos
de tipo RHD-CE-D o RHCE-D-CE (v. fig. 20-7). La proteína híbrida resultante puede
SM P1
5' y 3' 5'
RHD-CE (4-7)-D SM P1 G e n RHCE
FIGU RA 20-7. Recombinación genética en cis.
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d"-E C D S H tlX iH ^ M E - t¡p”N- 0 Q S H tI } S O f § S -

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ÍR h
FIGU RA 20-8. Bases moleculares de diferentes variantes RHD que determinan un fenotipo D parcial.
no expresar el antígeno Rh(D) o ver reducida su expresión, dependiendo de los exones

comprometidos en la recombinación y de cómo esta afecte a la configuración que resulta
necesaria para la correcta expresión del antígeno Rh(D). Los AA que caracterizan al
antígeno Rh(D) forman parte de la región extracelular de la proteína y están ubicados en
los bucles externos 3,4 y 6. Asimismo, las diferencias externas entre las proteínas Rh(D)
y Rh(CE) residen en estos bucles que están codificados, respectivamente, por los exones
4, 5 y 7 del gen RHD. Por tanto, si un gen RHD, a través de una recombinación en cis,
cambia sus exones 4, 5 y 7 por los exones correspondientes al gen RHCE, el producto
resultante de este gen híbrido será una proteína con los bucles 3, 4 y 6 propios de la
proteína Rh(CE) y, por ello, con una expresión alterada del antígeno Rh(D).
Considerando que los exones 4, 5 y 7 son críticos para la construcción de los frag
mentos de proteína más comprometidos con la expresión del antígeno Rh(D), existen
seis posibles combinaciones de estos exones que dan lugar a seis alelos híbridos, los
que corresponden a las categorías DIVb, DVa, DVI, DFR, DBT y DHAR, que expresan,
respectivamente, los antígenos inmunogénicos de baja frecuencia Rh37 (Evans), Rh23
(Dw), Rh52 (BARC), RH50 (FPTT), Rh32 y Rh33. La expresión del antígeno Rh(D)
puede variar entre alelos pertenecientes a una misma categoría, al igual que la reactividad
frente a diferentes anticuerpos anti-Rh(D) dependiendo de la densidad antigénica de
las proteínas resultantes.
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Las mutaciones puntuales y las mutaciones puntuales dispersas [múltiples mutaciones

ubicadas en diferentes regiones de la proteína Rh(D)] son responsables del resto de
fenotipos D parcial. Las variantes DII, DVII y DNB son algunos ejemplos de fenotipos
debidos a mutaciones puntuales, y las variantes DUIa, DIII tipo IV, DIVa y DAR lo son
de los fenotipos debidos a mutaciones puntuales dispersas.
D débil
La información actualmente disponible sobre las bases moleculares del fenotipo D débil
ha puesto de manifiesto su gran heterogeneidad, confirmando que bajo el térm ino D
débil se ha ido incluyendo a lo largo del tiem po a u n a am plia variedad de fen oti
pos D de expresión débil, como si todos ellos correspondieran a una sola entidad seroló-
gica. Esto explica también por qué los intentos de establecer un protocolo de actuación
uniforme frente a los diversos fenotipos D débil han resultado insatisfactorios. Todos
los ejemplos publicados hasta el m om ento obedecen a mutaciones puntuales del gen
RH D en la región transmembrana o intracelular (fig. 20-9). Aunque esta localización,
en general, no resulta inmunogénica, puede suponer una dificultad en la inserción de
la proteína en la m embrana del hematíe y afectar a su interacción con la glucoproteína
Rh50 (RhAG), que produce un fenotipo D débil. Más de 70 alelos distintos han sido
descritos y, entre todos ellos, el D débil tipo 1 es el más frecuente en población europea.
La forma más débil corresponde al fenotipo DEL, anteriormente D el, en el que la ex
presión del antígeno es tan extremadamente débil que solo puede demostrarse con una
técnica de adsorción-elución. En Europa, el fenotipo DEL es el menos frecuente en el
conjunto de fenotipos D débil, pero en el este asiático más de u n 30% de los donantes
son portadores de un fenotipo DEL ligado a la variante RH D (K409K).
Los fenotipos D débil de los tipos 1 al 4 representan aproximadamente el 95% de
los fenotipos D débil detectados en europeos. El D débil tipo 4 se ha dividido a su
vez en varios subtipos. En la raza negra africana, el D débil tipo 4.2, también conocido
como DAR, se detecta con una frecuencia muy superior a la encontrada en raza caucásica
europea.
FIGURA 20-9. Localización de los AA sustituidos en algunas de las variantes RHD que determinan
un fenotipo D débil.
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D parcial y D débil: más similitudes que diferencias

La definición de las bases moleculares de los fenotipos D parcial y D débil, y algunas
observaciones clínicas publicadas en los últim os años de individuos portadores de
estos fenotipos, han cuestionado los criterios clásicos empleados para la clasificación
de los mismos y han dem ostrado que las fronteras que los separan son en realidad
virtuales. Por ejemplo, algunos fenotipos D parcial son debidos, tal como sucede con
los fenotipos D débil, a mutaciones puntuales y no solo a fenómenos de recombina
ción genética. Y, lo que es más im portante, aunque en la mayoría de los fenotipos D
débil descritos no se ha detectado aloinm unización anti-D, esta ya no se considera
patrim onio exclusivo de los fenotipos D parcial, y algunos ejemplos de individuos
de fenotipo D débil portadores de anti-D también han sido publicados. De la misma
forma, existen numerosos fenotipos D parcial en los que nunca se ha documentado
aloinmunización anti-D, probablemente porque los epítopos de los que carecen son
poco o nada inmunogénicos.
Hasta el mom ento no se ha detectado aloinmunización anti-D en ninguno de los
pacientes transfundidos portadores de los fenotipos D débil tipos 1, 2, 3, 4.1 y 5. Por
tanto, los individuos portadores de las variantes más prevalentes en la población europea
no parecen presentar riesgo de inmunización cuando son transfundidos con hematíes
Rh(D) positivo. Por el contrario, los fenotipos D débil tipo 4.2,11 y 15 parecen asociarse a
un riesgo probado o posible de inmunización. Respecto a otros fenotipos D débil menos
comunes, no existe por el momento una información definitiva. Probablemente, algunos
individuos portadores de estos fenotipos son catalogados como Rh(D) negativo, ya que
la densidad antigénica es muy escasa, por lo que difícilmente podremos documentar el
riesgo de aloinmunización subyacente. No obstante, de conocerse la presencia de esta
variante en el paciente, es preferible que este sea transfundido con componentes Rh(D)
negativo.
O tros antígenos Rh
Antígenos compuestos: ce, Ce, cE, CE y G
Estos antígenos se han definido con anticuerpos que reaccionan con hematíes en los que
los antígenos C/c y E/e están codificados por el mismo gen. Por ejemplo, anti-ce (también
conocido como anti-f) solo reconoce los hematíes que poseen un haplotipo dce o Dce,
es decir, cuando c y e se encuentran en posición cis. Por tanto, los hematíes de fenotipo
D+ C+ C+ E+ e+ reaccionarán con anti-ce, pero no anti-Ce si el genotipo es DCE/dce
y, por el contrario, reaccionarán con anti-Ce y no con anti-ce si el genotipo es DCe/DcE.
Anti-ce es un componente frecuente en mezclas de anticuerpos que contienen anti-c
y anti-e y, ocasionalmente, puede detectarse como especificidad aislada. La mayoría de
sueros con anti-C y anti-C + D contienen una porción de anti-Ce. Las especificidades
anti-CE y anti-cE son m uy poco frecuentes.
Anti-G reacciona con los hematíes que expresan D o C, es decir, D+ C+, D+ C — y
D — C+ . El AA primario que define al antígeno C es serina 103 en la proteína RhCcEe.
La proteína RhD también presenta una serina en la misma posición. Por esta razón, el
anti-G reconoce la presencia de serina 103, ya sea en el contexto de la proteína D o de la
proteína CcEe, en contraste con anti-C que es más conformacional y solo reconoce
la presencia de serina 103 en el contexto de una proteína CcEe. A nti-G se detecta a
menudo en sueros que contiene anti-D más anti-C, y puede ser motivo de confusión
en las investigaciones de anticuerpos irregulares que se realizan en las gestantes dentro
del protocolo de prevención de la EHRN.
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Cw, Cx, MAR

Cw es un antígeno de relativa baja frecuencia en todas las poblaciones, aunque su
incidencia es variable. En España, la frecuencia estimada es de un 1,9% muy similar al
de otras poblaciones estudiadas en Europa. Cx es un antígeno raro con una incidencia
del 0,1 y el 0,3% en población caucásica. Cw y Cx suelen estar presentes en haplotipos
DCe en los que C se expresa débilmente. Cw está asociado al cambio de glutámico por
arginina en el residuo 41 de la proteína, y Cx con el de alanina por treonina en el residuo
36 de la proteína CcEe, lo que implica en ambos casos cambios conformacionales que
afectan a la expresión, más débil del antígeno C.
El antígeno MAR es un antígeno de alta incidencia. La prevalencia de individuos MAR
negativo en finlandeses es del 0,2%. Los hematíes MAR negativo pueden expresar Cw
y Cx. Su localización está comprendida entre los residuos 36-41 de la proteína RhCe.
v s,v
El antígeno VS tiene una frecuencia del 30-40% en la población africana de raza negra,
pero es muy raro en otros grupos étnicos. VS resulta del cambio leucina 245 valina en la
proteína CcEe y se asocia con un antígeno e débil. Los hematíes VS+ son habitualmente
V+, aunque hasta un 20% de ellos carecen del antígeno V, y además del cambio de AA
mencionado tiene añadido el cambio glicina 336 cisteína. El haplotipo del gen alterado
que con frecuencia se asocia con un fenotipo VS+ V - no contiene RHD, pero posee un
gen híbrido RHD-CE-D que no produce D pero sí un C anormal.
Fenotipos Rh-deficitarios. RhnuUy Rhmod

Los hematíes de los individuos de fenotipo Rhnu]1 son excepcionales y se caracterizan
por la ausencia de antígenos Rh en su membrana. Estas personas cuando se inm uni
zan producen un anticuerpo anti-Rh29 que reacciona con todos los hematíes, excepto con
los del mismo fenotipo. Este se explica a través de dos posibles modelos de herencia:
1) homocigosidad para haplotipos Rh inactivos, donde estos individuos carecen de gen
RHD (como la mayoría de individuos D negativo y son homocigotos para un RHCE
que contiene mutaciones inactivas, por lo que ninguna de las dos proteínas Rh puede ser
producida), y 2) los genes RHD y RH C son activos, pero los individuos portadores de
un fenotipo nulo son homocigotos para mutaciones inactivadoras en el gen RHAG. La
proteína RhAG no expresa antígenos Rh, pero está íntimamente asociada a la proteína
Rh en la m em brana, y su presencia es necesaria p ara que los antígenos Rh puedan
expresarse con normalidad. En algunos casos el gen RHAG es capaz de producir una
m ínim a cantidad de proteína RhAH, lo que explica la presencia de antígenos Rh de
expresión muy débil, como sucede con el fenotipo Rhmod.
Las células Rhnu]1son anómalas, tanto morfológica como funcionalmente. La mayoría
de los individuos de fenotipo Rhnull y Rhmodpresentan un cierto grado de anemia hemo
lítica que, en algunos casos, puede ser subsidiaria de una esplenectomía.
A n tic u e rp o s
Los anticuerpos Rh son habitualmente de clase IgG (IgGl y/o IgG3) y la mayoría de ellos
no fijadores de complemento. El anti-D suele acompañarse de anti-C en un 30% de casos
y de anti-e en un 2%. La inmunización primaria de una persona RhD negativo, después
de una transfusión RhD positivo, suele conllevar la aparición de un aloanticuerpo de
especificidad anti-D a las 20 semanas aproximadamente de la transfusión en aproxima
damente un 20% de individuos. En ocasiones, la exposición a una pequeña cantidad de
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hematíes D positivo no permite que el anticuerpo sea detectable, como puede suceder
durante la gestación o en el posparto inmediato; sin embargo, una nueva exposición a
hematíes D incompatibles provocará una rápida e intensa respuesta anamnésica.
Anti-D puede causar reacciones transfusionales hemolíticas, en algunas ocasiones de
carácter grave, y EHRN. Las gestantes portadoras de una variante de D que se sensibilizan
pueden producir EHRN cuando el feto es portador de un antígeno D completo. Si se co
noce que la gestante es portadora de una de estas variantes, y da a luz a un recién nacido D
positivo, la gestante es candidata a recibir la dosis preceptiva de gammaglobulina anti-D.
De los restantes anticuerpos Rh, anti-c se ha considerado el segundo más frecuente,
seguido de anti-E; sin embargo, en los últimos años y coincidiendo con la utilización de
técnicas más sensibles de detección de anticuerpos irregulares, los anticuerpos anti-E
parecen detectarse con mayor frecuencia que los de especificidad anti-c, aunque muchos
de ellos suelen ser de origen «natural». La presencia aislada de la especificidad anti-C
es muy rara en ausencia de anti-D. Clínicamente, anti-c es el más importante, ya que es
capaz de producir EHRN grave, por el contrario anti-C, anti-E y anti-e raram ente la
producen, y cuando lo hacen, los recién nacidos presentan una clínica moderada.
Función putativa de las proteínas Rh y RhAG

Las proteínas Rh y RhAG son estructuras homologas con idéntica conformación en la
membrana y un 33% de identidad en la secuencia de AA. Su conformación caracterís
tica de proteínas de múltiples pasos de entrada y salida en la membrana es propia de
las moléculas transportadoras. Además, la secuencia proteica de ambas tam bién es
homóloga con la de los transportadores de amonio en animales inferiores y plantas. Las
células de levadura, que carecen de transportadores de amonio, no son capaces de desa
rrollarse en un medio bajo en amonio, pero la situación cambia cuando se efectúa una
transfección de la célula con RHAG. De confirmarse la hipótesis de que ambas proteínas
actúan como transportadoras de amonio, cabe imaginar que los hematíes transportan
este desde el cerebro hasta el hígado o el riñón para su metabolización o excreción.
Una hipótesis alternativa es que las proteínas Rh y RhAG, junto a la proteína banda 3,
podrían actuar como proteínas de intercambio entre el oxígeno y el dióxido de carbono.
Esta hipótesis estaría alineada con la función primordial del hematíe, la de transporte
de oxígeno y la conversión del dióxido de carbono a bicarbonato mediante la acción de
la anhidrasa carbónica en el citoplasma del propio hematíe.
SISTEMAS KELL Y Kx
Genes y antígenos
El sistema Kell está constituido por 27 antígenos numerados del 1 al 27, de los que tres
han sido considerados obsoletos, y que se agrupan en cinco sets de antígenos antitéticos
(K y k; Kpa, Kpb y Kp°; Jsay Jsb; K11 y K17; K14 y K24), cuatro antígenos de baja frecuencia
(Ula, K23 y VLAN, VONG) y ocho antígenos más de alta frecuencia (Ku, K12, K13,
k-like, K18, K19, Km, K22, TOU, RAZ, KALT y KTIM). Todos estos antígenos se localizan
en una proteína integral de mem brana eritrocitaria de Pm 93000. Las características
estructurales y la secuencia de la proteína Kell es homóloga a la de las endopeptidasas
cinc-dependientes que intervienen en el procesamiento de diversas hormonas peptídicas.
La función de esta proteína no se conoce plenamente, pero parece comportarse como
una enzima activa encargada de catalizar la reacción que convierte al péptido inactivo
endotelina 3 en un vasoconstrictor activo.
ERRNVPHGLFRVRUJ
El gen KEL se localiza en el cromosoma 7q32-q36, y se extiende a lo largo de una secuen

cia de 21,5 kb de ADN organizada en 19 exones codificantes. La producción de los diferentes
antígenos está también ligada a genes pertenecientes al locus XK del cromosoma X.
El antígeno K se detecta con una frecuencia del 9% en norteuropeos, un 2% en
individuos de origen africano y, muy raramente, en los de origen asiático; por el contrario,
el antígeno k es de alta frecuencia en todas las poblaciones (tabla 20-16). El antígeno
Kpa se detecta en un 2% de individuos de raza blanca, y está ausente en raza negra y en
japoneses, y el antígeno Kpb es de alta frecuencia en todas las poblaciones examinadas.
El antígeno Jsa parece exclusivo de la raza negra. Su frecuencia en negros americanos de
origen africano es de un 16%. El antígeno Jsbes de alta incidencia en todas las poblaciones.
Los antígenos K y k resultan de una cambio de base (C—»T) en el exón 6 que comporta
un cambio de AA en el residuo 193 de la proteína (metionina, en los individuos K —>
treonina, en los k).
Las bases moleculares del fenotipo Kell nulo (K0) son muy diversas, y se atribuyen
a diferentes tipos de mutaciones (m utaciones puntuales, m utaciones sin sentido y
mutaciones en lugares de splicing), en individuos en los que la mutación está presente
en forma homocigota.
Los antígenos Kpa, Kpb y Kp° surgen de un cam bio de base en el exón 8: Kpa
TGG—>Trp281; Kpb CGG—>Arg281; Kp° CAG—>Gln281. Actualmente, también se han
definido las bases moleculares de los antígenos Jsa/Jsb (KEL 6 y KEL 7), K11/K17 y del
antígeno Ula (KEL 10).
Al igual que sucede con los sistemas ABO y RH, existen individuos en los que la
expresión del sistema Kell aparece deprimida por diferentes causas:
• Existe una relación, cuyo mecanismo íntimo se desconoce, entre ciertos fenotipos
Gerbich y la depresión de los antígenos Kell.
• El alelo codificante de Kpa induce en ocasiones una expresión débil del resto de
antígenos; es posible que la presencia de Trp281 produzca un cambio de conformación
en la molécula que afecte la expresión de los demás antígenos.
• Los fenotipos Kmod no son más que un cajón de sastre que engloba a una variedad de
fenotipos Kell débiles.
• El síndrome de McLeod, en el que todos los antígenos Kell están deprimidos, y Km
ausente, cursa con ausencia de la proteína XK en la que reside el sistema Kx y su único
antígeno (Kx). La relación entre las proteínas Kell y XK se establece a través de un
único puente disulfuro. El gen XK, responsable de la proteína XK, es u n gen ligado
al cromosoma X, motivo p or el que este síndrome habitualmente solo se presenta
en varones. Se debe a la aparición de mutaciones en el gen X K que pueden afectar al
proceso de transcripción del ARNm, o bien a una deleción parcial del cromosoma X
TABLA 20-16. Relación de fenotipos y frecuencia en el sistema Kell
Reacciones con anti- Frecuencia (%)

K k Fenotipo Raza blanca Raza negra
+ 0 K+k- 0,2 Raro
+ + K+k+ 8,8 2
0 + K—k+ 91 98
0 0 Ko Muy raro
ERRNVPHGLFRVRUJ
que incluye o afecta al gen X K Los pacientes afectos de este síndrome presentan
acantocitosis y una amplia variedad de defectos musculares y neurológicos.
• El síndrome de granulomatosis crónica ligado al cromosoma X también se debe a
una deleción del cromosoma X que incluye a los genes X K y al gen responsable de
esta patología.
A nticuerpos
El aloanticuerpo anti-K es el más com ún tras las especificidades pertenecientes a los
sistema ABO y Rh. Generalmente es de clase IgGl y, ocasionalmente, fijador de com
plemento. Los restantes aloanticuerpos son menos habituales, y la presencia de anticuer
pos anti-k, anti-Kpb y anti-Jsb suele plantear problemas cuando se requieren hematíes
carentes de estos antígenos para la transfusión, ya que se ha demostrado su capacidad
para producir reacciones transfusionales y EHRN. La proteína Kell se expresa en fases
muy precoces del proceso de maduración eritroide, y ello permite que los anticuerpos
anti-K puedan inhibir la eritropoyesis y provocar una anemia aplásica que puede superar
al componente hemolítico de la anemia fetal.
Los individuos de fenotipo K0 pueden producir un anticuerpo de especificidad
anti-Ku cuando se sensibilizan que aglutina a todos los hematíes, excepto a los de otros
individuos de fenotipo idéntico.
Los individuos afectos de síndrome de McLeod y de enfermedad granulomatosa
crónica cuando se sensibilizan producen un anticuerpo anti-Kx más anti-Km que hace
prácticamente inviable el encontrar hematíes de idéntico fenotipo para la transfusión.
Por esta razón, la transfusión de los niños afectos de estas patologías debe ser evitada
siempre que sea posible.
SISTEMA DUFFY (Fy)

Genes y antígenos
El sistema Fy está constituido en los individuos de raza caucásica por dos antígenos, Fy3y Fy1’
que se combinan dando lugar a tres posibles fenotipos; y en los individuos de origen africano
existe un alelo adicional, Fy, que origina un cuarto fenotipo, Fy(a-b-) (tabla 20-17).
Los antígenos de este sistema se localizan en una glucoproteína codificada por el gen
Dujfy o DARC en el cromosoma 1. Tiene un Pm de 35-45 kD y está constituida por un
total de 338 AA.
El polimorfismo Fya/Fyb, que se encuentra tanto en individuos de raza blanca como
de raza negra, resulta de un cambio de base que da lugar a la presencia del AA glicina en
el residuo 44 de la proteína Fy3y de aspártico en la proteína Fy1’.
TABLA 20-17. Polimorfismos del sistema Duffy y frecuencia de los diferentes genotipos
en la población africana y europea
Europeos Africanos
Fenotipo Genotipo Frecuencia (%) Genotipo Frecuencia%
Fy (a+b+) Fy/Fy 20 Fy/Fy o Fy/Fy 10
Fy (a+b+) Ff/Fyb 48 Fy/Fy 3
Fy (a—b+) F//Fyb 32 Fy/Fy o Fy/Fy 20
Fy ( a - b - ) Fy/Fy Muy raro Fy/Fy 67
ERRNVPHGLFRVRUJ
La región codificante del alelo Fy es idéntica a la del alelo Fyb, pero en cambio los indi
viduos con fenotipo Fy(a-b-) carecen de este antígeno en sus hematíes. Tournaville et al.
encontraron una mutación en el gen Duffy de las personas con este fenotipo, situada en la
región promotora del gen, a una distancia de 41 nucleótidos del inicio de la transcripción.
Esta mutación afecta a una secuencia consensus para la unión de los factores de trans
cripción GATA, de tal manera que impide la unión del factor de transcripción específico
eritroide GATA-1 y, en definitiva, no resulta posible la expresión del producto génico en
los hematíes, aunque sí en otros tejidos. Esto explica por qué cuando estos individuos se
sensibilizan lo hacen desarrollando un anti-Fy3y no un anti-Fyb. El fenotipo Fy(a-b-) en
la raza negra oscila entre el 70% en americanos de origen africano y el 100% en Gambia.
Aunque infrecuente, este fenotipo también se ha descrito en individuos de raza caucásica.
En este caso la mutación responsable difiere de la propia de la raza negra, y el resultado
es la ausencia de la proteína Duffy en los hematíes y en todos los tejidos del organismo.
En un estudio realizado en España se verificó que u n 2,4% de los donantes de sangre
analizados presentaban la mutación responsable del fenotipo Fy(a-b-).
El alelo F f , responsable de un antígeno Fyb débil, se debe a una mutación adicional
sobre la secuencia del alelo Fyb (265C > T). La incidencia de este fenotipo Fyb débil en
población de raza blanca oscila entre un 2-3%.
La glucoproteína Duffy actúa como receptor de múltiples quimiocinas, incluyendo la
interleucina 8, por lo que se le atribuye un papel en el curso de la cascada inflamatoria.
Además, en los hematíes actúa como receptor para Plasmodium vivax y knowlesi, res
ponsables de la malaria, una infección ampliamente difundida en el continente africano.
Los hematíes de fenotipo Fy(a-b-) y, por tanto, carentes de la glucoproteína Duffy, son
resistentes a la invasión de este tipo de Plasmodium. La ausencia de esta glucoproteína
no solo no es esencial para la vida, sino que la mutación detectada en esta raza representa
una ventaja selectiva en las áreas donde la malaria terciaria es endémica.
A nticuerpos
Anti-Fya es mucho más común que anti-Fyb. El resto de posibles aloanticuerpos son
muy poco comunes. Son predominantemente IgGl y, ocasionalmente, fijadores de C.
Ambos anticuerpos pueden producir reacciones transfusionales hemolíticas inmediatas
y retardadas, en general de carácter moderado, y EHRN que puede oscilar entre formas
clínicas moderadas y graves.
Anti-Fy3 es uno de los anticuerpos desarrollados por los individuos de fenotipo
Fy(a-b-) y, a diferencia de anti-Fya y anti-Fyb, es resistente a la acción de proteasas.
Anti-Fy5 también puede ser producido por los individuos de fenotipo Fy(a-b-) y, más
concretamente, por los de raza negra repetidamente transfundidos. A diferencia de anti-
Fy3 no reacciona con las células Rhnu]|. No se conoce la causa de esta asociación entre
las proteínas Rh y Duffy. Anti-Fy3 ha producido reacciones transfusionales inmediatas
y retardadas, y anti-Fy5 reacciones retardadas.
SISTEMA KIDD (Jk)

Genes y antígenos
El sistema Kidd surge del conjunto de alelos producidos p o r el gen HUT11 (JK) lo
calizado en el cromosoma 18, que da lugar a una proteína de varios pasos en la que se
localizan los diversos antígenos Jky el transportador eritrocitario de urea. Los antígenos
codominantes Jka y Jkb resultan de un polimorfismo del gen HUT11 consistente en un
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cambio de base en la secuencia de ADN que determina un cambio de AA en la posición

280 (Asp/Asn) de la proteína.
El fenotipo Jk (a-b-) es muy raro y se debe a la presencia en estado homocigoto de
un alelo silente, Jk, en el locus JK, o bien a la herencia de un gen dominante inhibidor In
(Jk), independiente del locus JK. Los hematíes Jk(a-b-) son resistentes a la lisis inducida
por la urea y muestran un defecto selectivo en el transporte de esta (tabla 20-18). En la
Polinesia, el fenotipo nulo puede llegar a detectarse en uno cada 400 individuos.
A nticuerpos
Anti-Jka es más com ún que anti-Jkb. Suelen ser de clase IgG, o bien IgG más IgM y,
ambos, fijadores de complemento por su componente IgG3. La detección de estas es
pecificidades resulta, en ocasiones, complicada debido a su efecto de dosis que hace
que los anticuerpos reaccionen exclusivamente con las células en las que el antígeno se
encuentra en estado homocigoto, o bien a su presencia en una concentración práctica
mente indetectable. Pueden producir reacciones hemolíticas inmediatas muy graves y
reacciones retardadas. Por el contrario, raramente producen EHRN.
Los individuos con fenotipo nulo, Jk (a -b -), desarrollan un anti-Jk3 cuando se
inmunizan, y también puede producir reacciones hemolíticas inmediatas y retardadas.
SISTEMA MNSs
Genes y antígenos
Los genes GYPA y GYPB están íntimamente relacionados en el cromosoma 4 y codifican
para las glucoforinas respectivas GPA y GPB. Ambas son sialoglucoproteínas de un solo
paso y en ellas se expresan los antígenos M y N (GPA) y Ss (GPB), respectivamente
(tabla 20-19). Las bases moleculares de este sistema son muy complejas. El gen GYPA, tiene
varias posiciones polimorfas que según la secuencia nucleotídica determinan la expresión
del antígeno M o N. Concretamente, el alelo que codifica para el antígeno N presenta los
siguientes cambios respecto al alelo M: 59C > T; 71G > A; 72T > G. En cuanto al gen
GYPB, presenta una única posición polimorfa que distingue los alelos S y s (143C > T).
La complejidad de este sistema radica en que los genes que codifican para estas dos
proteínas son altamente homólogos, lo que favorece los fenómenos de recombinación
entre ellos y la form ación de numerosos alelos híbridos. Algunos antígenos de baja
incidencia, pero clínicamente significativos, son precisamente fruto de estas recombi
naciones, como el antígeno Mur, cuya frecuencia en algunas poblaciones orientales llega
a ser de un 10%.
TABLA 20-18. Distribución de los diferentes fenotipos del sistema Kidd en población
caucásica y en un grupo de 197 donantes de sangre españoles

Jka Jkb Fenotipo Genotipo Caucásicos en general Españoles
+ 0 Jk (a+b—) JkaJka 26 26
+ + Jk (a+b+) JkaJkb 51 50
0 - Jk (a—b+) JkbJkb 23 24
0 0 Jk ( a - b - ) Jk nulo Muy raro
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TABLA 20-19. Fenotipos y frecuencias en el sistema MNS
M N s s Fenotipo Raza blanca Raza negra

+ 0 M +N- 28 26
+ + M+N+ 50 44
0 + M -N + 22 30
+ 0 S+s— 11 3
+ + S+s+ 44 28
0 + S—s+ 45 69
El antígeno U se encuentra en los hematíes de todos los individuos de raza caucásica

y en el 99% de los de raza negra. Los individuos U negativo son, con pocas excepciones,
S -s- y carecen de la GPB, o poseen una GPB alterada.
A nticuerpos
Anti-M es un aloanticuerpo relativamente frecuente que puede ser de clase IgM o IgG.
En algunos casos puede resultar reactivo a 37 °C y, potencialmente, podría ocasionar una
reacción transfusional hemolítica. Excepcionalmente, puede ocasionar EHRN.
Anti-N es muy poco común y carece de trascendencia clínica.
Anti-S y anti-s son habitualmente de clase IgG y, ambos, pueden ocasionar reacciones
hemolíticas y EHRN.
Anti-U es muy poco común y, habitualmente, contiene la fracción IgGl. Se han des
crito casos de reacciones transfusionales hemolíticas fatales y de EHRN grave debidos
a este anticuerpo.
SISTEMA LEWIS
Está constituido por los antígenos Leay Leb. Como en el caso de los antígenos ABH, estos
tampoco son productos alélicos. El gen FUT3 produce una enzima fucosiltransferasa que
cataliza la unión de fucosa a un disacárido precursor que puede coincidir con el precursor
del que también deriva el antígeno H (precursor tipo 1H), dando lugar al antígeno Lea, o
bien al precursor que representa el propio antígeno H (tipo 1H) dando lugar al antígeno
Leb (fig. 20-10). Existen cuatro posibles fenotipos (tabla 20-20):
1. Le(a+b). Solo presente en los individuos ABH no secretores. El gen FUT2 es
inactivo, por lo que solo existe precursor tipo 1H y solo el antígeno Lea acabará
incorporándose a la membrana del hematíe.
2. Le(a-b+). Solo en individuos ABH secretores. La mayor parte de la estructura
correspondiente al precursor tipo 1H se convierte en el tipo 1H en las secreciones
mediante la enzima fucosiltransferasa codificada por el gen FUT2, p o r lo que
predom inantem ente detectaremos Leb y m uy poco Lea, y solo Leb se detectará
sobre los hematíes.
3. Le(a+b+). Solo detectable en individuos ABH secretores con un gen FUT2
débil. La cantidad de precursor tipo 1H convertido a tipo 1H es m enor que en
el caso anterior, por lo que la presencia de ambos antígenos en las secreciones es
abundante y pueden detectarse sobre los hematíes.
4. L e(a-b -). Independientem ente del tipo ABH secretor, los hematíes L e(a-b-)
carecen de antígenos Lewis debido a la hom ocigosidad de las m utaciones
ERRNVPHGLFRVRUJ
T ip o 1H
G al: galactosa
GIcN ac: W-acetilglucosamina
Fue: f ucosa
G alN A c: /V-acetilgalactosamina
FIGU RA 20-10. Representación del antígeno Le3y su precursor tipo 1H, y de Leby su precursor, tipo 1H.
TABLA 20-20. Fenotipos y genotipos del sistema Lewis
Fenotipo Genotipo Frecuencias aproximadas (%)

Lewis (FUT3) Secretor (FUT2) Caucásicos Afroamericanos Chinos
Le(a+b—) Le/Le Le/le se/se 22 20 0
Le(a—b+) Le/Le Le/le Se/Se 72 55 62
Se/se
Le(a+b+) Le/Le Le/le Sew/Sew 0 0 27
Sew/se
Le(a—b —) le/le Ninguno 6 25 11
responsables de la inactivación del gen FUT3 que com porta la no producción

de transferasas.
Los anticuerpos anti-Lewis solo son producidos p or los individuos de fenotipo
Le(a-b-), y no suelen ser clínicamente significativos porque raram ente reaccionan a
37 °C.
OTROS GRUPOS SANGUÍNEOS

Sistema L utheran
Originalmente fue descrito como un sistema con un locus y dos alelos Luay Luh, el cual
daría lugar a las combinaciones fenotípicas habituales (tabla 20-21). La base molecular
de estos dos antígenos antitéticos es un cambio nucleotídico (230G—>A) en la secuencia
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 20-21. Relación de fenotipos y frecuencia en los sistemas Lutheran (Lu),

Cartwright (Yt), Colton (Co) y Dombrock (Do)
Sistemas Reacciones con anti- Fenotipo Frecuencia (%)

Lu Lua Lub Raza blanca
+ 0 Lu (a+b—) 0,15
+ + Lu (a+b+) 7,5
0 + Lu (a—b+) 92,35
0 0 Lu (a—b —) Muy raro
Yt Yta Ytb
+ 0 Yt (a+b—) 91,9
+ + Yt (a+b+) 7,9
0 + Yt (a—b+) 0,2
Co Coa Cob
+ + Co (a+b—) 89,3
+ + Co (a+b+) 10,4
0 + Co (a—b+) 0,3
0 0 Co (a—b —) Muy raro
Do Doa Dob
+ 0 Do (a+b—) 17,2
+ + Do (a+b+) 49,5
0 + Do (a—b+) 33,3
del gen LU, que comporta a su vez un cambio de aminoácido (Arg77His). La frecuencia
génica del alelo que codifica para el antígeno Lua es de 0,035, y la del alelo que codifica
para Lu1’, de 0,96, por lo que este último se considera un antígeno de alta frecuencia.
El mayor interés del sistema Lutheran radica en el fenotipo L u (a-b -), tam bién
conocido como In(Lu). Este fenotipo, heredado con carácter dominante, se ha asociado
durante mucho tiempo a un gen inhibidor (In) que inhibía al mismo tiempo el sistema
P, el antígeno i y el sistema Auberger. Hoy en día, se conoce que la causa del fenotipo
L u(a-b-) son mutaciones en el gen que codifica para el erythroid Krüppel-like factor
(factor EKLF), un factor de transcripción que resulta crítico para la expresión de diversos
genes en los eritrocitos.
Los antígenos del sistema Lutheran no están bien desarrollados en el mom ento de
nacer.
El anti-Lua es poco común y, m uy raramente, clínicamente significativo. Por el con
trario, anti-Lub puede ocasionar hemólisis intravascular.
Sistema C artw right

Los antígenos Yta y Ytb (His353Asn) se expresan en una enzima acetilcolinesterasa que
se une a la membrana eritrocitaria a través de una molécula GPI (v. tabla 20-21). Se han
descrito algunos ejemplos de anti-Yta con capacidad para producir reacción hemolítica,
pero en general no son clínicamente significativos.
Sistema Colton
El antígeno Coa (Ala45) es un antígeno de alta incidencia, y Cob (Vall45) es su antitético
con una frecuencia en caucásicos del 8%, y algo inferior en otras etnias (v. tabla 20-21).
Se expresan en una proteína transportadora de agua (acuaporina 1 o CHIP-1). Los
anticuerpos de especificidad anti-Coa y, el más raro, anti-Cob han estado implicados en
ERRNVPHGLFRVRUJ
reacciones hemolíticas graves y EHRN. Anti-Co3 es el anticuerpo producido por los

individuos de fenotipo Colton nulo.
Sistema D om brock
Este sistema incluye a los antígenos Doa y Dob (Asn265Asp), así como los antígenos de
alta incidencia Gy% Hy y Joa (v. tabla 20-21). Anti-Gy3 es el anticuerpo característico
producido por los individuos de fenotipo Dombrock nulo. Los anticuerpos anti-D oa
y anti-Dob han ocasionado reacciones transfusionales hemolíticas. La estructura de la
proteína Dombrock es propia de una ADP-ribosiltransferasa.
Sistema GLOB y sistem a P lP k

El antígeno P (GLOB1), que originalmente formaba parte de la colección globósido
ju n to con los antígenos Pk y LKE, pasó a c o n stitu ir el sistem a GLOB cuando, en
2002, se establecieron sus bases m oleculares. R ecientem ente, tam b ién se han
descrito las bases moleculares del antígeno P l que han puesto de manifiesto su es
trecha relación con el antígeno Pk. Esta observación ha hecho que el antígeno Pk haya
pasado a form ar parte del m ism o sistema que el antígeno P l, ahora denom inado
sistema P lP k (anteriorm ente, sistema P). Por su parte, el antígeno LKE permanece
en la colección globósido. En la figura 20-11 se resume la relación entre los sistemas
GLOB, P lP ky ABH.
El antígeno P está considerado de alta incidencia en todas las poblaciones es
tudiadas. El significado clínico de los anticuerpos anti-P es incierto, aunque se ha
relacionado con algunos casos de reacciones transfusionales, algunas graves, y EHRN
Lactosilceramida (LacCer)
3-|3-/V-acet¡lglucosam¡n¡ltransferasa 4-a-gal actosi Itransfe rasa
3-p-A/-acet¡lgalactosamin¡ltransferasa
4-a-galactos¡ltransferasa H,A,B
transferasa
FIGURA 20-11. Relación entre los sistemas GLOB, PlPkyABH.
ERRNVPHGLFRVRUJ
de perfil moderado. Por su parte, el antígeno P1 está presente en aproximadamente un

80% de individuos de raza caucásica. La mayoría de anticuerpos anti-P l no aglutinan
a los hem atíes p o r encim a de los 25 °C, p or lo que no se consideran clínicam ente
significativos.
Relacionado con estos sistemas se encuentra el fenotipo p, que resulta de la ausencia
de los antígenos P, P1 y Pk. Estos individuos cuando se inmunizan desarrollan un potente
anticuerpo conocido como anti-P PlPk, anteriormente anti-Tja.
Sistema Diego
Los 21 antígenos del sistema Diego se localizan en la proteína banda 3, o AE1, término
empleado para denominar a la proteína que actúa como intercambiador de aniones en
los hematíes. Está considerada una de las glucoproteínas mayores de la membrana, con un
número de copias por hematíe muy elevado, del orden de 106. Tiene, como mínimo, dos
funciones, la del intercambio de aniones y el transporte de C 0 2y como elemento de sostén,
fundamental en la estructura de membrana anclándola al citoesqueleto. Probablemente,
algunos tetrámeros de la banda 3 forman parte del macrocomplejo Rh de proteínas de
membrana.
El antígeno Dia (Leu854) es muy poco frecuente en europeos y africanos, pero alcanza
una frecuencia de un 5% en chinos y japoneses, y una incidencia alta en nativos del norte
y sur de América, del orden de un 54% en indios brasileños. Dib (Pro854) es un antígeno
de alta incidencia en prácticamente todas las poblaciones.
Anti-Dia y anti-Dib son habitualmente de clase IgGl más IgG3. Anti-Dia puede ocasio
nalmente fijar complemento. En pacientes politransfimdidos de Brasil se detecta hasta en un
3,6%, y puede ocasionar EHRN grave. Anti-Dib también puede, ocasionalmente, producir
EHRN.
Wra (Lys658) es un antígeno de baja frecuencia, antitético de Wrb (Glu658) que es de
alta incidencia. Los anticuerpos anti-W r1son relativamente frecuentes, mayoritariamente
de clase IgGl, pero en ocasiones pueden ser de clase IgM, o IgM más IgG. Puede producir
EHRN grave y reacciones transfusionales hemolíticas. Anti-Wr1’es raro, y su significado
clínico no se conoce bien, sin embargo como autoanticuerpo es relativamente común y
puede estar implicado en la anemia hemolítica autoinmune.
Los 17 antígenos restantes son todos de baja frecuencia.
Sistema Xg
El antígeno Xga está codificado p or XG, un gen ligado al cromosoma X que tiene una
frecuencia del 66% en hom bres y del 89% en mujeres. Anti-Xga no es clínicamente
significativo.
Sistema Scianna
Está constituido por siete antígenos localizados en una proteína de adhesión de la mem
brana eritrocitaria (ERMAP), y todos ellos son de muy alta o de muy baja frecuencia.
Los anticuerpos anti-Scianna no se han relacionado, hasta el momento, con reacciones
transfusionales ni EHRN.
Sistema Landsteiner-W iener

LW* y LWb (Gln70arg) son un par de antígenos antitéticos, de alta y baja frecuencia, res
pectivamente. Anti-LWab reacciona con todos los hematíes, excepto con los de fenotipo
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LW nulo y Rhnull que también son LW (a-b-). Los anticuerpos anti-LW no son habi
tualmente clínicamente significativos. La glucoproteína LW, también llamada molécula
de adhesión intercelular 4 (ICAM-4) es una molécula de adhesión perteneciente a la
superfamilia de inmunoglobulinas.
Sistema Chido/Rodgers
Los nueve antígenos Chido/Rodgers no son verdaderos antígenos eritrocitarios porque
no son producidos por las células eritroides. Se localizan en el cuarto componente del
complemento (C4), presente originalmente en el plasma, pero que se acaba uniendo a
los hematíes.
Sistema Gerbich
Está constituido por tres antígenos de muy alta incidencia y cinco de muy baja incidencia
que residen en sialoglucoproteínas de las glucoforinas C (GPC) y D (GPD), o en ambas.
Anti-Ge3 ha producido EHRN.
Sistema Crom er
Está constituido por 11 antígenos de alta incidencia y tres de baja frecuencia, y residen
en una glucoproteína reguladora del complemento (DAF o CD55). Los anticuerpos
anti-Cromer no son habitualmente clínicamente significativos.
Sistema Knops
Los siete antígenos Knops se localizan en una glucoproteína reguladora de comple
mento, el receptor-1 (CR1 o CD35). Los anticuerpos anti-Knops no son clínicamente
significativos.
Sistema Indian
Está formado por un antígeno de baja frecuencia, Ina (Arg46), y su antitético Inb (Pro46),
más dos antígenos de alta incidencia. Estos antígenos se localizan en la proteína CD44,
una proteína capaz de desempeñar múltiples funciones y que se une al ácido hialurónico
de la matriz extracelular. Los anticuerpos anti-Indian no se consideran, habitualmente,
clínicamente significativos.
Sistema I
El antígeno I es el único incluido en este sistema. El producto del gen I (GCNT2) es una
enzima (P 1,6-AT-acetilglucosamina-transferasa) que cataliza la unión de N-acetilactosamina
formando cadenas de polilactosaminas. Las cadenas lineales no ramificadas expresan
antígeno i. Los hematíes de los recién nacidos son I negativo y expresan intensamen
te antígeno i. La unión de las nuevas cadenas comporta el debilitamiento del antígeno i y
un incremento de la expresión de I que alcanza su máxima expresión entre los 6 y los
18 meses de vida. Algunos individuos, m uy poco comunes, homocigotos para diversas
mutaciones inactivadoras del gen GCNT2 nunca convierten i en I y muestran un fenotipo i
que suele conducir a la producción de un aloanti-I. Estos anticuerpos suelen ser de
clase IgM y no acostumbran a reaccionar a 37 °C. En el este asiático el fenotipo i suele
asociarse a cataratas congénitas, pero no es el caso de los caucásicos. Esto se debe a que las
mutaciones de GCNT2 en los individuos de fenotipo i se producen en transcritos de
ARNm que expresan los tejidos hematopoyéticos y epiteliales responsables del correcto
ERRNVPHGLFRVRUJ
funcionamiento del cristalino, mientras que en los caucásicos las mutaciones solo se dan
en los transcritos del tejido hematopoyético.
Algunos autoanticuerpos anti-I m uy potentes pueden resultar hemolíticos y causar
el síndrome de aglutininas frías. Los anticuerpos con especificidad anti-i acostumbran
a ser autoanticuerpos que a m enudo se detectan en pacientes con m ononucleosis
infecciosa.
Anti-i es el único antígeno de una de las colecciones de grupos sanguíneos (colección
207). No es parte del sistema I porque su biosíntesis no está regulada por el gen GCNT2
y no ha sido definido por un aloanticuerpo.
ANTÍGENOS NO PERTENECIENTES A NINGÚN SISTEMA DE GRUPO

SANGUÍNEO
Se trata de un grupo de antígenos de alta o baja incidencia que no han podido adscri
birse a n ingu n o de los 33 sistem as de g ru p o sanguíneo bien definidos (v. tablas
20-2 a 20-4).
Entre los anticuerpos dirigidos contra antígenos de alta incidencia cabe señalar a anti-
Vel, anti-Lan y anti-Wj, por haber causado EHRN grave. Anti-Vel resulta especialmente
peligroso al tratarse de anticuerpos de clase IgM, fijadores de complemento, que pueden
ocasionar reacciones transfusionales hemolíticas inmediatas de carácter muy grave.
Anti-MAM puede producir también EHRN grave.
La mayoría de anticuerpos dirigidos contra antígenos de baja frecuencia no suelen
ser clínicamente significativos, con la excepción de anti-JFV, -Kg, - JONES, -HJK y -REIT
que han producido EHRN.
El térm ino Bg se emplea para referirnos a los antígenos HLA de clase I expresados
en los hematíes. Bga corresponde a HLA-B7, Bgb a HLA-B17 y Bg0a HLA-A28 (con reac
ción cruzada con A2). No obstante, algunos individuos no expresan antígenos Bg en
sus hematíes aunque expresen sobre linfocitos los correspondientes antígenos HLA. Su
papel en las reacciones hemolíticas transfusionales, a pesar de algunas publicaciones que
lo apoyan, continúa siendo incierto. El mayor problema reside en que su presencia en las
muestras a estudio puede confundir en la interpretación de los resultados al obtenerse
reacciones inesperadas en los paneles de identificación de anticuerpos.
FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS

Cuando hablamos de la función biológica de los grupos sanguíneos, en realidad nos
referimos a la función desempeñada por las estructuras de membrana donde se localizan
los diferentes grupos sanguíneos eritrocitarios. Los grupos sanguíneos, en realidad,
no son más que polimorfismos de estas estructuras y, por el momento, la presencia de
uno u otro antígeno no parecer incidir directamente, salvo excepciones, en la función
desarrollada por la proteína que lo alberga. Cada función no es patrim onio de una sola
proteína y estas pueden desempeñar múltiples funciones. Entre las funciones atribuidas
se encuentran: 1) transportadores de moléculas biológicamente importantes a través de
la membrana; 2) receptores de estímulos externos y de células de adhesión; 3) reguladores
autólogos del complemento para evitar la destrucción de los hematíes; 4) enzimas;
5) anclaje de la membrana con el citoesqueleto, y 6) contribuyentes a la m atriz extrace-
lular de carbohidratos que protegen al hematíe de las lesiones mecánicas y del ataque de
microorganismos. En la tabla 20-22 se muestra una relación de algunas de las funciones
mencionadas por diversas proteínas eritrocitarias.
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TABLA 20-22. Funciones putativas asignadas a algunas de las proteínas de membrana

donde se expresan los grupos sanguíneos eritrocitarios
Tipo de función Grupo sanguíneo Estructura Función concreta

(producto génico)
Transporte/canal Kidd Proteína múltiples Transporte urea
pasos (PM P)
Colton PM P (CHIP-1) Transporte agua
Drego PM P (banda 3) Intercam bio aniones
Receptores Duffy PM P (DARC) Receptor
quim iocinas/P. vivax
Indian Proteína paso único (CD44) Receptor ác.
(PUP) hialurónico
C om plem ento Chido/Rodgers C4 C om ponente del C
Crom er GPI (DAF) Regulador del C
Knops PU P (CD35 o CR1) Regulador del C
Adhesión LW PUP, superfam ilia de Se liga a las integrinas,
las Igs CD11/CD18
Lutheran PUP, superfam ilia de Puede unirse
las Igs a la lam inina
Enzimas Yt GPI Desconocida
(acetilcolinesterasa) en los hematíes
Kell PU P (endopeptidasa) ¿Metaloproteinasa?
Estructurales Gerbich PU P (glucoforinas Anclaje al
C yD ) citoesqueleto
A pesar del gran avance en nuestros conocimientos en torno a la función biológica

de los grupos sanguíneos, todavía nos queda por conocer la razón de la aparición de los
diferentes polimorfismos eritrocitarios en el curso de la evolución y la posible relación
de los mismos con diversas enfermedades.
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Capítulo 20 Una visión práctica de los grupos sanguíneos eritrocitarios 6 2 2 .e l
Autoevaluación
1. Los grupos sanguíneos se clasifican en:
(a) Sistemas.
(b) Colecciones.
(c) Series de antígenos de alta frecuencia.
(d) Series de antígenos de baja frecuencia.
(e) Las cuatro anteriores son ciertas.
Respuesta razonada: los sistemas están integrados por un conjunto de antígenos que son p ro
ducto de los alelos pertenecientes a un m ism o locus genético. Además, se han definido siete
«colecciones» de antígenos relacionados entre sí p or sus características genéticas, bioquímicas
o serológicas. Y, finalmente, dos series de antígenos, una de baja frecuencia (serie 700) y otra de
alta frecuencia (serie 900), que no han podido adscribirse a ningún sistema o colección.
2. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es cierta?
(a) El térm ino genotipo se refiere al conjunto de alelos heredados provenientes de un
determinado gen (p. ej., AA, AO).
(b) El fenotipo se refiere exclusivamente al producto reconocible de estos alelos.
(c) Los antígenos producidos por diferentes alelos de un determinado locus se denominan
antitéticos.
(d) Cuando un par de alelos perteneciente al mismo gen de ambos cromosomas son idénticos
decimos que el individuo es homocigoto. Por el contrario, cuando este par de alelos
difiere decimos que el individuo es heterocigoto.
(e) Todas las afirmaciones son ciertas.
Respuesta razonada: tal como se explica en el apartado «Conceptos básicos en la genética de los
grupos sanguíneos», todas las afirmaciones anteriores son correctas.
3. Los antígenos eritrocitarios:
(a) Tal como su nom bre indica, son exclusivos de los eritrocitos o hematíes.
(b) Algunos antígenos eritrocitarios pueden estar presentes en otras células sanguíneas y en
otros tejidos.
(c) Son siempre un producto directo del gen que los codifica y se ubican en proteínas,
glucoproteínas y glucolípidos de la m em brana eritrocitaria.
(d) Las proteínas que expresan antígenos eritrocitarios se insertan en la m em brana como
proteínas de múltiples pasos.
(e) La distribución y frecuencia de los diversos fenotipos eritrocitarios es constante entre
las diferentes poblaciones y grupos étnicos.
Respuesta razonada: pueden expresarse exclusivamente en los hematíes (antígenos Rh), o adicio
nalmente en otras células sanguíneas (el antígeno P l), en otros tejidos (antígenos MNS) o en las
células sanguíneas y en los tejidos (antígenos ABO). La mayoría de los antígenos eritrocitarios son
producto directo del gen que los codifica y se ubican en proteínas, glucoproteínas y glucolípidos
de la m em brana eritrocitaria. Los antígenos de los sistemas ABO, Lewis y P constituyen una
excepción, porque los genes correspondientes codifican para un enzima (transferasa) responsable
de catalizar la reacción por la que un determinado monosacárido o azúcar se une a un sustrato
(oligosacárido) para constituir una determinada estructura antigénica. Las proteínas que expresan
antígenos eritrocitarios se insertan en la m em brana a través de las siguientes opciones: como
proteínas de un solo paso, como proteínas de múltiples pasos, o bien como proteínas ancladas a
la membrana a través de enlaces glucosilfosfatidilinositol (GPI). La distribución y frecuencia de
los diversos fenotipos eritrocitarios varía según las poblaciones y grupos étnicos.
4. Los anticuerpos eritrocitarios:
(a) Casi todos los anticuerpos dirigidos contra los antígenos eritrocitarios son inm uno-
globulinas de clase IgG.
(b) Las subclases IgGl e IgG2 activan fuertemente el complemento.
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(c) Los llamados anticuerpos «naturales» son habitualm ente de clase IgM, pero tam bién
pueden ser de clase IgG.
(d) La actividad de los anticuerpos tiende a m antenerse estable con el tiempo.
(e) Los anticuerpos naturales de especificidad anti-A, anti-B y anti-A,B nunca son reactivos
a 37 °C.
Respuesta razonada: casi todos los anticuerpos dirigidos contra los antígenos eritrocitarios son
inmunoglobulinas de clase IgG, o bien IgM, y una minoría muestran especificidad IgA. Las sub
clases IgGl e IgG3 activan fuertemente el complemento, IgG2 lo hace débilmente e IgG4 no es
capaz, en general, de activarlo. Los llamados anticuerpos «naturales» son habitualmente de clase
IgM, pero también pueden ser de clase IgG. La actividad de los anticuerpos tiende a reducirse con
el tiempo, si el paciente no se expone nuevamente al antígeno. Algunos anticuerpos naturales de
especificidad anti-A, anti-B y anti-A,B son reactivos a 37 °C, pero la mayoría de los anticuerpos
naturales no lo son, y se considera que carecen de importancia clínica.
5. Una de las siguientes afirmaciones es falsa:
(a) Los genes A y B codifican para unas enzimas que van a catalizar la reacción que permite la
unión de determinados carbohidratos a precursores glucoproteicos o glucolipídicos para
configurar la estructura antigénica propia de lo que conocemos como antígenos A y B.
(b) Los antígenos ABH son específicos de los hematíes.
(c) Existen cuatro posibles fenotipos ABO, y en la práctica cotidiana se dice que un individuo
pertenece al grupo A, B, AB u O.
(d) La expresión de los antígenos ABO está controlada desde tres locus genéticos distintos:
el gen ABO localizado en el cromosoma 9, el gen FU TI (H) y el gen FUT2(Se), ambos
localizados en el cromosoma 19.
(e) Los individuos portadores del raro fenotipo Bombay son homocigotos para el alelo h
del gen FUTI, de m anera que no pueden producir antígeno H y, en definitiva, tampoco
producen antígeno A ni B.
Respuesta razonada: los antígenos ABH se encuentran ampliam ente distribuidos en nuestro
organism o y, además de en los hematíes, podem os encontrarlos en linfocitos, en plaquetas
(adsorbidos del plasm a), en la mayoría de los tejidos endoteliales y epiteliales, y en algunos
órganos, como es el caso de los riñones. Por este motivo, en el trasplante de órganos sólidos ABO
incompatibles, puede producirse una grave reacción hiperaguda del injerto.
6. En relación con los anticuerpos del sistema ABO, ¿cuál de las siguientes afirmaciones es
correcta?
(a) El título de anticuerpos ABO decrece en las personas de edad avanzada y pueden
producirse discordancias entre los resultados de la prueba flemática y la prueba sérica
que dificultan la correcta catalogación del grupo sanguíneo ABO.
(b) Una situación similar puede producirse con los pacientes afectos de diferentes patologías
que cursan con inmunodepresión.
(c) El anticuerpo anti-A2 no existe, porque los individuos de fenotipo A2 poseen el mismo
antígeno A que las personas de fenotipo A l, aunque en m enor proporción.
(d) El anti-H producido p o r los individuos de fenotipo Bombay es m uy potente y puede
producir reacciones transfusionales hemolíticas inmediatas m uy graves.
(e) Todas las afirmaciones anteriores son ciertas.
Respuesta razonada: el título de anticuerpos ABO decrece en las personas de edad avanzada
y pueden producirse discordancias entre los resultados de la prueba hem ática y la prueba
sérica que dificultan la correcta catalogación del grupo sanguíneo ABO. Una situación si
m ilar puede producirse con los pacientes afectos de diferentes patologías que cursan con
inm unodepresión: leucosis linfática crónica, m ielom a m últiple, hipogam m aglobulinem ia
y agam m aglobulinem ia congénita o adquirida, pacientes en tratam iento inm unosupresor
o trasplantados con progenitores hematopoyéticos. El anticuerpo anti-A2 no existe, porque
los individuos de fenotipo A2 poseen el mismo antígeno A que las personas de fenotipo A l,
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Capítulo 20 Una visión práctica de los grupos sanguíneos eritrocitarios 6 2 2 .e 3
aunque en m enor proporción. Esto explica por qué los individuos de fenotipo Al no responden
inmunológicamente tras la exposición a hematíes de fenotipo A2. El anti-H producido p o r los
individuos de fenotipo Bombay es m uy potente y puede producir reacciones transfusionales
hemolíticas inm ediatas m uy graves. Solamente los hematíes de otro individuo de fenotipo
Bombay resultan compatibles.
7. En relación con el sistema Rh, una de las siguientes afirmaciones es falsa:
(a) Se han descrito un total de 50 antígenos, y unos 170 alelos han sido definidos a nivel
molecular.
(b) Además del antígeno D, otros cuatro antígenos (C, c, E, e) destacan por su importancia
en la práctica transfusional.
(c) El locus RH está constituido por dos genes homólogos, RHD y RHCE, de 10 exones
cada uno.
(d) Los individuos de fenotipo D positivo son siempre homocigotos para el gen RHD.
(e) En la población de raza negra, la variante alélica RHD'F, o seudogén RHD, está presente
hasta en u n 66% de los individuos Rh(D) negativo.
Respuesta razonada: el locus RH está constituido por dos genes homólogos, RHD y RHCE, de
10 exones cada uno. Están ubicados en el cromosoma 1, en la posición lp34-36, y distribuidos
en forma de tándem, pero con orientaciones opuestas (5’RHD3’-3’RHCE5’). El gen RHD está
flanqueado por dos regiones de 9 kb y un 98,6% de homología denominadas «cajas Rhesus». La
deleción del gen RHD responsable del fenotipo negativo se produjo, probablemente, por el en-
trecruzamiento desigual de las cajas Rhesus de dos haplotipos RH mal alineados en tra n s, dando
lugar a una caja Rhesus híbrida. Los individuos de fenotipo D positivo pueden ser homocigotos
para el gen RHD, o bien hemicigotos (una sola copia del gen).
8. Respecto a los anticuerpos contra los antígenos del sistema Rh, una de las siguientes afirma
ciones no es cierta:
(a) Los anticuerpos Rh son habitualm ente de clase IgG (IgGl y/o IgG3) y la mayoría no
fijadores de complemento.
(b) El anti-D suele acompañarse de anti-C en un 30% de los casos y de anti-e en un 2%.
(c) Anti-D puede causar reacciones transfusionales hemolíticas, en algunas ocasiones de
carácter grave, y enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN).
(d) Después de anti-D, anti-E es el siguiente anticuerpo en importancia clínica.
(e) La m ayoría de los individuos de fen o tip o R hnull y R hm od p resen tan u n cierto
grado de anemia hemolítica que, en algunos casos, puede ser subsidiaria de una es-
plenectomía.
Respuesta razonada: anti-c es considerado el segundo anticuerpo en importancia clínica, ya que es
capaz de producir EHRN graves. Por el contrario, anti-C, anti-E y anti-e raramente la producen,
y cuando lo hacen, los recién nacidos presentan una clínica moderada.
9. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre otros grupos sanguíneos no es cierta?
(a) El aloanticuerpo anti-K es el más com ún tras las especificidades pertenecientes a los
sistema ABO y Rh.
(b) El aloanticuerpo anti-K puede inducir reacciones transfusionales, pero no es capaz de
producir EHRN.
(c) Anti-Fya es m ucho más común que anti-Fyb.
(d) Los individuos con fenotipo nulo, Jk (a-b -), desarrollan un anti-Jk3 cuando se inm u
nizan.
(e) El antígeno U se encuentra en los hematíes de todos los individuos de raza caucásica y
en el 99% de los de raza negra.
Respuesta razonada: los anticuerpos anti-K sí que pueden producir EHRN. La proteína Kell
se expresa en fases m uy precoces del proceso de m aduración eritroide, y ello perm ite que los
anticuerpos anti-K puedan inhibir la eritropoyesis y provocar una anemia aplásica que puede
superar al componente hemolítico de la anemia fetal.
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62 2.e4 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
10. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre otros grupos sanguíneos no es cierta?
(a) Los antígenos del sistema Lutheran no están bien desarrollados en el m omento de nacer.
(b) El antígeno Colton (a) es un antígeno de alta incidencia.
(c) El antígeno Diego (a) es muy poco frecuente en europeos y africanos, pero tiene una
frecuencia elevada en nativos del norte y sur de América.
(d) Los anticuerpos contra los antígenos Crom er se caracterizan por producir reacciones
hemolíticas graves.
(e) Anti-Vel resulta especialmente peligroso al tratarse de anticuerpos de clase IgM, fija
dores de complemento, que pueden ocasionar reacciones transfusionales hemolíticas
inmediatas de carácter m uy grave.
Respuesta razonada: el sistema Cromer está constituido p or 11 antígenos de alta incidencia y 3
de baja frecuencia, y residen en una glucoproteína reguladora del complemento (DAF o CD55).
Los anticuerpos anti-Cromer no suelen ser clínicamente significativos.
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C A P Í T U L O 21
Métodos para el diagnóstico de las citopenias

inmunes
E. M u ñ iz-D íaz, C. C anals, R. M o n te ro , E. M a rtín ez y C. M artín-V ega
MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LOS PRINCIPAI.F.S

GRUPOS SANGUINEOS
D ebido a la presencia en el plasm a norm al de anticuerpos contra grupos sanguí
neos (aglutininas naturales) y en los eritrocitos de antígenos de grupo, es posible
determ inar el grupo sanguíneo a p artir de eritrocitos (prueba directa o globular)
y de aglutininas plasm áticas (prueba inversa o sérica). Para la d eterm inación de
los grupos sanguíneos pueden emplearse dos procedim ientos manuales: en placa o
portaobjetos y en tubo.
Actualmente, también pueden emplearse técnicas en gel y en columna de microes-
feras de vidrio. Estas técnicas perm iten la determ inación de los antígenos de grupo
sanguíneo, la detección e investigación de anticuerpos irregulares, la realización de las
pruebas de antiglobulina directa e indirecta y las pruebas cruzadas pretransfusionales.
Dependiendo del uso que se desee dar, los reactivos contenidos en las cámaras de las
columnas serán diferentes. Esta es la técnica de elección cuando el laboratorio está
automatizado.
Estudio básico del grupo ABO

La determ inación del grupo ABO ha de incluir una prueba globular y una prueba
sérica. La prueba globular puede realizarse en placa, porque los antisueros son capaces
de producir aglutinación sin necesidad de centrifugación, sin embargo, el grupo inverso
es más seguro cuando se realiza en tubo. Se efectúa preferentemente con una muestra
de sangre total sin coagular previamente centrifugada para separar los hematíes del
plasma. Los reactivos deben ser usados siguiendo el método sugerido por el fabricante,
pero de forma general se pueden seguir el protocolo y las técnicas que a continuación
se exponen.
Prueba globular
Material
• Tubos de hemólisis (12 X 75).
• Reactivos: anti-A, anti-B, anti-AB.
• Solución salina isotónica (NaCl, 0,15 mol/1).
• Pipetas Pasteur desechables.
• Placa tipo Nacryl o portaobjetos.
• Centrífuga para tubos.

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M étod o en placa
1. Se diluyen los hematíes a estudiar al 10% en su propio plasma o en solución salina
isotónica.
2. Se coloca en la placa u n a gota de anti-A , u n a gota de anti-B y u n a gota de
anti-AB.
3. Se coloca una gota de hematíes diluidos al lado de cada reactivo.
4. Se mezclan los hematíes con el antisuero correspondiente formando un círculo
de 2-2,5 cm de diámetro.
5. Se mueve la placa con movimientos circulares durante 2 min.
6. Se observa si hay aglutinación (prueba positiva [+]) o ausencia (prueba negati
va [-]).
M étod o en tubo
1. Se prepara una suspensión de los hematíes a estudiar al 3-5% en su propio plasma
o en solución salina isotónica.
2. Se rotulan tres tubos: uno con anti-A, otro con anti-B y otro con anti-AB y se
coloca en cada uno de ellos una gota del antisuero correspondiente.
3. A continuación, se añade a cada uno de ellos una gota de los eritrocitos a estudiar
previamente diluidos, y se mezcla.
4. Se centrifuga durante 15-30 s a 1.000 X g y se lee la presencia de aglutinación
(prueba positiva [+]) o la ausencia de ella (prueba negativa [-]).
Prueba sérica
M aterial
• Hematíes reactivos A ( y B lavados y resuspendidos al 3 y al 10% en solución salina
isotónica.
• Placa tipo Nacryl.
M étod o en placa
1. Se colocan en una placa una gota de hematíes y otra de hematíes B diluidos
al 10%.
2. Se añade a cada una de ellas dos gotas del plasma a estudiar.
3. Se mezcla bien y se mueve la placa con movimientos circulares durante 2 min
observando la presencia de aglutinación (prueba positiva [+]) o la ausencia de
ella (prueba negativa [-]).
M étod o en tu bo
1. Se rotulan dos tubos: uno con A y otro con B.
2. Se añade al tubo A una gota de hematíes A, al 3% y al tubo B, una gota de hematíes
B al 3%.
3. Se añaden a cada tubo dos gotas del plasma a estudiar.
4. Se mezcla y se centrifuga durante 15-30 s a 1.000 X g y se lee la presencia de
aglutinación (prueba positiva [+]) o la ausencia de ella (prueba negativa [—]).
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Capítulo 21 Métodos para el diagnóstico de las citopen ias inmunes 625

Prueba globular Prueba sérica
Grupo ABO Anti-AAnti-B Anti-AB Hematíes-Aj Hematíes-B
A + - + - +
B - + + + -
AB + + + - -
O - - - + +
Si los resultados de la prueba inversa no coinciden con los obtenidos en la prueba

directa, debe descartarse ante todo el error metodológico, el cual puede obedecer a alguna
de las siguientes causas:
• Empleo de tubos no suficientemente limpios.
• Empleo de una concentración inadecuada de células.
• Contaminación o inactivación de los reactivos. La calidad de los reactivos debe con
trastarse periódicamente enfrentándolos con testigos de grupo sanguíneo conocido.
D eterm inación del sistem a Rh

Determinación del antígeno D (Rh estándar)
Es muy importante en la determinación del antígeno D seguir las instrucciones del fa
bricante, que pueden variar significativamente dependiendo del origen y tipo de reactivo.
La determinación se realiza a partir de sangre extraída con EDTA y, para ello, puede
emplearse, igualmente, un portaobjetos o un tubo.
M aterial
• Anti-D.
• Albúmina bovina al 22-30% (control).
• Porta objetos.
• Resuscopio.
M étod o sobre portaob jetos

1. En un portaobjetos de vidrio, limpio y seco se coloca una gota de suero anti-D.
2. En otro portaobjetos se coloca una gota de albúmina bovina.
3. Se añaden a cada una de las gotas anteriores dos gotas de eritrocitos problema
diluidos al 40-50% en su propio plasma o suero.
4. Se colocan los objetos en un resuscopio a 40 °C y se mezclan los eritrocitos con
el suero moviéndolo lentam ente durante 2 m in, hasta observar la aparición
de aglutinación (prueba positiva). La aparición de positividad en el testigo de
albúmina anula el resultado de la prueba.
M étod o en tu b o
1. Se coloca una gota de suero anti-D en tubo rotulado.
2. Se coloca una gota de albúmina en otro tubo rotulado.
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3. Se añade a cada tubo una gota de eritrocitos problema suspendidos al 2-5% en

su propio plasma o solución salina.
4. Se mezcla suavemente y se centrifuga durante 15-30 s a 1.000 X g.
5. Una vez que los tubos se han agitado suavemente para resuspender los eritrocitos,
se observa la aparición de aglutinados. La aparición de positividad en el tubo de
albúmina anula la positividad de la prueba.
Los reactivos Rh más recientes son los que contienen una mezcla de un anticuerpo
IgM m onoclonal y un anticuerpo IgG policlonal. El anti-D m onoclonal perm ite la
determinación del D en una centrifugación inmediata, mientras que el anti-D policlonal
permite la prueba de detección del D débil.

La presencia de aglutinación con el suero anti-D definirá a una persona como Rh positivo.
El testigo de albúmina deberá ser siempre negativo. No obstante, si al emplear ambas
técnicas (portaobjetos y tubo) el testigo de albúmina es positivo, debe repetirse la prueba
pero esta vez utilizando eritrocitos lavados tres veces consecutivas en suero fisiológico.
Si persiste la positividad, se efectuará una prueba de Coombs (antiglobulina directa) con
los eritrocitos problema para descartar la existencia de una anemia hemolítica autoinmune.
Determinación del antígeno D débil

Los eritrocitos Rh(D) positivo poseen el antígeno D, pero en ocasiones este no es lo
suficientemente intenso como para producir aglutinación en presencia de cualquier
suero anti-D. Por ello, en tales casos debe recurrirse al empleo de una prueba de Coombs
indirecto para demostrar su presencia.
M aterial
• Suero anti-D.
• Suero de conejo, antiglobulina humana (suero de Coombs).
• Tubos de hemólisis.
• Centrífuga.
M étodo
1. En un tubo de hemólisis se coloca una gota de suero anti-D y en otro una gota
de albúmina.
2. Se añade a ambos tubos una gota de una suspensión de eritrocitos problema,
previamente lavados y suspendidos en suero fisiológico al 3-5%.
3. Se mezcla bien y se incuba a 37 °C durante 45-60 min.
4. Se lavan los eritrocitos tres veces consecutivas en abundante solución salina, la
cual debe decantarse completamente después del último lavado.
5. Se añade una gota de suero antiglobulina y se mezcla suavemente.
6. Se centrifuga la mezcla durante 30-45 s a 1.000 X g y se observa la aparición o no
de aglutinación.

Si se observa aglutinación positiva, indicará la presencia de la variante D débil en la
membrana eritrocitaria, por lo que se clasificará al sujeto como Rh positivo débil.
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El testigo de albúmina deberá ser siempre negativo. En caso de ser positivo, se prac
ticará una prueba directa de antiglobulina con los eritrocitos problema.
Determinación del fenotipo Rh

Siempre se han de seguir las instrucciones del fabricante. La siguiente técnica puede ser
un ejemplo de lo que, en general, se realiza.
Material
• Antisueros anti-C, anti-c, anti-D, anti-E y anti-e.
• Hematíes control: eritrocitos conocidos hemicigotos y negativos para los antígenos
C, c, E, D y e.
Método
1. Se lavan tres veces en suero fisiológico los eritrocitos que hay que estudiar y se
resuspenden en solución salina al 3-5%.
2. Se colocan en 6 tubos los reactivos indicados en la tabla 21-1.
3. Se añade una gota de los eritrocitos diluidos y se mezcla suavemente.
4. Se incuba a temperatura ambiente durante 10-15 min.
5. Se centrifuga durante 15-30 s a l .000 X g y se observa la presencia o no de aglu
tinados.

Hay que comprobar siempre la calidad de los reactivos utilizados realizando paralela
mente la técnica con hematíes control (+) y control (-) para cada antisuero.
Detección de anticuerpos irregulares antieritrocitarios

Para la detección de anticuerpos irregulares se precisa suero problema y también entre
dos y cuatro muestras de hematíes seleccionados por su fenotipo eritrocitario y por tener
representados en su conjunto a los antígenos considerados clínicamente significativos.
Pueden emplearse diversos métodos, pero las técnicas tradicionales para la detección
TABLA 21-1. Determinación del fenotipo Rh
Suero Tubos
1 2 3 4 5 6
Anti-C 1 gota
Anti-c 1 gota
Anti-D 1 gota
Anti-E 1 gota
Anti-e 1 gota
Albúmina 1 gota
Eritrocitos 5% 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota
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de los anticuerpos irregulares están basadas en la observación macroscópica de la

aglutinación de los eritrocitos, que se produce al unirse el anticuerpo presente en el suero
o plasma al antígeno específico situado en la membrana del eritrocito y que da lugar a
puentes entre los eritrocitos que producirán la aglutinación.
Generalmente, la búsqueda y observación de la aglutinación se realiza con técnicas en
tubo y, más recientemente, con técnicas de columnas que contienen gel o microesferas de
vidrio. Estas técnicas son necesarias, entre otras cosas, para determinar la compatibilidad
entre el donante y el receptor de una transfusión.
Técnicas de estudio
Las técnicas en tubo son las técnicas de referencia. En tubo pueden realizarse varias
técnicas (salinas, enzimas, con aditivos que favorecen la aglutinación, AGH, etc.). Es
tas técnicas en tubo permiten la manipulación y hacen visible la hemólisis, pero tienen
como inconvenientes una aglutinación inestable y que requieren una manipulación y
lectura m uy cuidadosa.
T écnica en so lu ció n salin a iso tó n ica a 22 °C

1. En un tubo de Kahn o hemólisis se dispensan 2-3 gotas de suero problema y una
gota de eritrocitos control resuspendidos en solución salina isotónica.
2. La suspensión se incuba durante 1 h a 22 °C.
3. Se centrifuga durante 30-45 s a 1.000 X g y se deshace el botón de hematíes
cuidadosamente, observando la presencia o no de aglutinación.
Em pleo de eritrocitos tratados con enzim as

Las enzimas proteolíticas reducen la carga negativa de la superficie de los hematíes dis
minuyendo la distancia entre ellos y favoreciendo la aglutinación. Para este uso son aptas
las enzimas bromelina, ficina y papaína.
Hay dos maneras de usar estas enzimas:
1. Se añade a la mezcla formada por una gota de eritrocitos lavados y diluidos al 3-5%
en solución salina más dos gotas del suero problema y 1-2 gotas de la enzima, y
se deja incubar todo junto a 37 °C. Posteriormente, se observa la presencia o no
de aglutinación por decantación del tubo o por centrifugación durante 30-45 s a
1.000 X g.
2. Se tratan los eritrocitos previamente con la enzima escogida, se lavan tres veces
con abundante solución salina y se diluyen al 3-5% en salina. Posteriormente, se
incuban una gota de los eritrocitos pretratados y dos gotas del suero que se va a
estudiar, durante 15-30 min a 37 °C. Después se observa la presencia o no de agluti
nación por decantación del tubo o por centrifugación durante 30-45 s a 1.000 X g.
P rueba de la antiglobulina o técnica de Coom bs

La prueba de la antiglobulina o técnica de Coombs es un procedimiento que permite
detectar la presencia de anticuerpos fijados a la mem brana de los hematíes. Fue des
crito en 1945 por Coombs, M ourant y Race para detectar los anticuerpos anti-Rh no
aglutinantes o incompletos. Posteriormente, se usó para demostrar la sensibilización de
los hematíes in vivo en pacientes con anemia hemolítica autoinmune (AHAI). Entre las
técnicas serológicas se considera la más importante en inmunohematología.
Se realiza cuando se quiere saber si existe algún anticuerpo antieritrocitario fijado en
los hematíes y, por ello, resulta esencial en el diagnóstico de:
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• LaAHAI.
• La enfermedad hemolítica del recién nacido.
• La hemólisis inducida por fármacos.
• La reacción hemolítica postransfusional.
El principio de la técnica se basa en que los hematíes recubiertos por anticuerpos
de tipo IgG no son capaces de aglutinar por sí solos, pero si se añade una antiglobulina
dirigida contra las inmunoglobulinas humanas (AGH) se forman unos puentes que
conectan los hematíes sensibilizados con IgG que realizan la aglutinación. Esta técnica
permite detectar hematíes recubiertos con anticuerpos de tipo IgG y/o complemento.
A estos anticuerpos antiglobulina humana (suero) se les denomina reactivo antiglobu
lina o suero de Coombs, que se obtiene mediante inoculación a animales (generalmente,
conejos) con suero humano total o con inmunoglobulinas purificadas, así se consiguen
antiproteínas que reconocen a las inmunoglobulinas humanas, a las que se unen a través
del fragmento Fe.
Existen dos tipos de reactivos: antiglobulina hum ana poliespecífica, que contiene
anti-IgG (detecta anticuerpos no aglutinantes) y anticomplemento (detecta anticuerpos
IgM que fijan com plem ento), y antiglobulina hum ana monoespecífica, que incluye
únicamente anti-IgG o anticomplemento.
Existen también dos tipos de prueba de la antiglobulina: la directa, o Coombs directo,
y la indirecta, o Coombs indirecto.
Prueba directa de la antiglobulina o de Coombs directa

Esta prueba se realiza para saber si los hematíes están recubiertos in vivo de anticuerpos
antieritrocitarios. Se usa para estudios de:
• Autoanticuerpos contra los propios hematíes (AHAI).
• Anticuerpos de la madre contra hematíes del recién nacido (enfermedad hemolítica
del recién nacido).
• Hemólisis por fármacos.
• Reacción hemolítica postransfusional por aloanticuerpos contra los hematíes trans
fundidos.
Consiste en añadir antiglobulina antihumana a los hematíes del individuo. Si estos
están recubiertos con IgG o complemento la prueba será positiva. De entrada, la prueba se
realiza añadiendo una AGH poliespecífica (anti-IgG y anticomplemento). Si el resultado
es positivo, los hematíes son examinados nuevamente empleando por separado anti-IgG
y anticomplemento.
La aglutinación de los hematíes indica un resultado positivo y puede advertirnos de
una posible destrucción de los hematíes por los macrófagos (fig. 21-1).
Método en tubo
1. Se lavan los hematíes a examinar de cuatro a seis veces con abundante solución
salina fisiológica (SSF).
2. Se diluyen los hematíes al 3-5% en SSF.
3. En un tubo de hemólisis se añade una gota de hematíes diluidos y 1-2 gotas de
AGH poliespecífica.
4. Se centrifuga durante 15-30 s a 1.000 X g.
5. Se observa la presencia o no de aglutinación. Si el resultado es positivo (pre
sencia de aglutinados) se repite el punto 3, pero esta vez con las AGH m onoes-
pecíficas.
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S uero
fisiológico
v_y
Eritrocitos y Eritrocitos
Q ^ lavados
g o ^5 O Q Cf
Suero de Coombs
eritrocitos
x
O E ritrocitos
y-( Inm un og lobu lina de conejo
A n tlin m u n o g lo b u lin a hum ana
FIGU RA 21-1. Esquema de la prueba de Coombs directa.
Prueba indirecta de la a n tig lo b u lin a o de C oom bs indirecta

Esta prueba se usa para detectar anticuerpos libres en el suero que están dirigidos
contra antígenos de los hematíes. La prueba se realiza con el suero o plasma a estudiar
sensibilizando in vitro hematíes de sujetos normales (hematíes de una unidad de sangre
o hematíes con fenotipo conocido). Se puede potenciar la reacción añadiendo aditivos
(PEG, albúmina, LISS). Después se añade el suero AGH. Si se produce aglutinación
significa que la prueba es positiva y que en el suero de la m uestra hay anticuerpos
dirigidos contra la unidad de sangre (prueba cruzada) o contra los hematíes de fenotipo
conocido (cribado o identificación de anticuerpos).
Esta técnica está indicada en los siguientes casos:
• Detección e identificación de anticuerpos antieritrocitarios (pruebas de compatibi
lidad pretransfusional, control de gestación, control de donantes, etc.).
• Tipificación de antígenos eritrocitarios que no son visualizados por aglutinación directa.
• Como complemento al estudio de una prueba de Coombs directa.
Método
La técnica tiene varias fases:
1. Fase de sensibilización: se incuba el suero o plasma junto con los hematíes co
nocidos. Si hay anticuerpos libres dirigidos contra los antígenos presentes en los
hematíes, estos anticuerpos se fijarán a los hematíes sensibilizándolos. En esta fase
se pueden añadir potenciadores de la reacción.
2. Fase de lavado: se realiza para elim inar los anticuerpos que no se han fijado.
Si no se realiza adecuadamente, los anticuerpos libres pueden neutralizar pos
teriormente el reactivo AGH.
3. Fase de la AGH: en esta fase se añade el reactivo AGH que permitirá observar la
aglutinación fijándose a los posibles anticuerpos que se hayan podido unir a los
hematíes en la fase de sensibilización. La aglutinación de los hematíes indica un
resultado positivo (fig. 21-2).
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Método en tubo
1. Se lavan los hematíes conocidos tres veces con abundante SSF y se diluyen al 3-5%
en SSF.
2. En un tubo de hemólisis se coloca una gota de los hematíes lavados y diluidos,
más tres gotas del suero o plasma a testar.
3. Se incuba a 37 °C durante 45-60 min (si se añaden potenciadores de la reacción
el tiempo puede reducirse).
4. Se lava tres veces con abundante SSF eliminándola completamente después del
último lavado.
5. Se añaden 1-2 gotas del suero AGH.
6. Se centrifuga durante 15-30 s a 1.000 X g y se observa la presencia o no de aglu
tinación.
Además del método en tubo, estas técnicas también se pueden realizar con técnicas
en columna, lo que permite la estandarización y la automatización de las mismas.
Finalmente, no debe olvidarse la posibilidad de errores capaces de ocultar el resultado
de la prueba de Coombs. Así, en la práctica pueden observarse falsos positivos y falsos
negativos cuyas causas se resumen en el cuadro 21-1.
ESTUDIO GLOBAL DE LA ANEMIA HEMOLÍTICA AUTOINMUNE

Definición
La AHAI es una anemia hemolítica adquirida, en la que los hematíes son destruidos por
autoanticuerpos dirigidos frente a antígenos presentes en la membrana de los hematíes.
La confirmación del diagnóstico de AHAI nos la dará un resultado positivo en la prueba
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CUADRO 21-1. Causas de error en la prueba de Coombs
Falsos positivos
• Sensibilización eritrocitaria in vitro por efecto de anticuerpos naturales o del
complemento cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4 °C antes de su
análisis
• Lavado insuficiente de los eritrocitos
• Fijación inadecuada de suero antiglobulínico que contiene anticuerpos capaces de unirse
a eritrocitos no sensibilizados
• Reacción con la sílice coloidal de los tubos de cristal
• Elevada reticulocitosis en la muestra de sangre analizada
Falsos negativos
• Tiempo insuficiente de la prueba que no permite alcanzar la aglutinación eritrocitaria
• Dilución incorrecta del suero antiglobulina
• Suero antiglobulina de mala calidad
• Cuando el anticuerpo es de naturaleza IgA. Esto obedece a que los sueros antiglobulina
normalmente empleados carecen de anti-IgA
• Alteración del suero antiglobulina debido a la mala conservación o contaminación
bacteriana
• Lavado inadecuado de los eritrocitos, que facilita la neutralización de los anticuerpos
fijados sobre ellos por las inmunoglobulinas plasmáticas o el complemento
• Eliminación de los autoanticuerpos fijados sobre la superficie eritrocitaria mediante el
lavado
• Empleo de sangre caducada
• Empleo de placas o portaobjetos sucios, húmedos o con residuos de jabón en la prueba
de Coombs
de Coombs directa (CD) o prueba directa de la antiglobulina (PDATG), que evidenciará

la presencia de anticuerpos fijados a la m embrana de los hematíes del paciente.
Clasificación
Las anemias hemolíticas pueden clasificarse según diferentes criterios.
1. En función de la temperatura óptima de reactividad del autoanticuerpo, las AHAI
se clasifican en:
(a) AHAI por Ac calientes: cuando la temperatura óptima de reacción es cercana
a 37 °C. Las AHAI por Ac calientes son las más frecuentes, constituyen entre
un 75-80% de los pacientes diagnosticados de AHAI. En un 50% de casos,
los pacientes que se diagnostican de AHAI por Ac calientes presentan alguna
enfermedad asociada.
(b) AHAI por Ac fríos: en los casos en que los Ac son reactivos a temperaturas
bajas y preferentemente a 4 °C. Las AHAI por Ac fríos representan alrededor
de un 15% de los casos. Las AHAI por Ac fríos suelen ser idiopáticas, aunque
también pueden estar asociadas a infecciones o procesos linfoproliferativos.
(c) AHAI mixtas, que combinan Ac fríos y calientes. Las AHAI mixtas son mucho
más infrecuentes.
2. En función de la etiología, si las AHAI se presentan o no asociadas a alguna
patología, se clasifican en:
(a) AHAI idiopática o primaria: no asociada a ninguna patología.
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(b) AHAI secundaria o asociada a procesos infecciosos, autoinm unes o neo-

plásicos (neoplasias sólidas y hematológicas).
3. En algunos casos la administración de determinados fármacos puede inducir una
AH por mecanismos inmunes. Existen diversos tipos de anemia hemolítica in
mune inducida por fármacos (AHIIF), en función del mecanismo fisiopatológico
implicado en cada caso.
Anem ia hem olítica autoinm une p o r anticuerpos calientes

La AHAI por anticuerpos calientes se denomina así debido a que la temperatura óptima
de reactividad del autoanticuerpo es de 37 °C. En general, los hematíes del paciente están
recubiertos por autoanticuerpos de clase IgG, lo que conduce fundamentalmente a una
hemólisis extravascular por fagocitosis de los hematíes en el sistema reticuloendotelial.
Es el tipo más común de AHAI, pues constituye un 75-80% de los casos diagnosticados.
Su patogenia no es bien conocida; en alrededor del 50% de los pacientes diagnostica
dos se presenta asociada a alguna patología de base, y es catalogada de «idiopática» en el
resto de casos. Generalmente se presenta en adultos, aunque puede ocurrir también en
niños; en este caso se asocia a inmunodeficiencias o procesos infecciosos virales. No se
ha demostrado ninguna predisposición genética a padecer una AHAI. Se habla de AHAI
secundaria cuando se presenta asociada a una patología en la que se ha demostrado una
mayor incidencia de AHAI, el tratamiento de la enfermedad de base mejora la AHAI o
cuando existe evidencia de que están relacionadas por una disfunción inmunológica, en
el contexto de autoinmunidad. Las enfermedades a las que se asocia con mayor frecuencia
son la leucemia linfática crónica, los linfomas y algunas enfermedades autoinmunes, entre
las que es más frecuente el lupus eritematoso sistémico (LES). Mucho más raramente
puede presentarse asociada a quistes de ovario u otros procesos. Se han descrito casos ais
lados de AHAI en niños después de la administración de diferentes vacunas, sin embargo
esta relación no ha sido demostrada en estudios epidemiológicos a nivel poblacional.
En algunos pacientes la presentación es insidiosa, con una aparición gradual de
síntomas de anemia, con frecuencia asociados a fiebre e ictericia. En otros pacientes,
el inicio es brusco, con dolor lumbar y síntomas de anemia rápida. La presentación de
orinas oscuras, por hemoglobinuria o pigmentos biliares en orina, es frecuente. En la
AHAI idiopática un 50-60% de casos presentan esplenomegalia, un 30% hepatomegalia
y un 25% adenopatías. En un pequeño porcentaje de casos los pacientes presentan
una trombocitopenia autoinmune, que aparece de forma simultánea a la AHAI o a lo
largo de la evolución; a esta asociación se la denomina síndrome de Evans. Un 50% de
estos enfermos tienen una enfermedad de base asociada, frecuentemente un LES, sín
dromes linfoproliferativos o una inmunodeficiencia común variable. En niños puede
presentarse en el contexto de un síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA).
La anemia suele ser importante, normalmente con cifras de Hb < 7 g/dl al diagnóstico,
que progresa hasta que el tratamiento empieza a ser efectivo. En general, los recuentos
de leucocitos y plaquetas son normales, y en algunos casos existe una desviación a la
izquierda en la fórm ula leucocitaria. Típicamente, aparece una reticulocitosis, y en
la extensión de sangre periférica se observa una esferocitosis y policromatofilia. Si se
realiza un estudio medular, se observa una hiperplasia eritroide.
De forma característica, estos pacientes presentan una prueba de CD positiva. Alre
dedor de un 70% de los casos tiene un estudio positivo por IgG y por C3; cerca del 20%,
positivo únicamente por IgG, y aproximadamente un 10%, positivo únicamente por C3.
En la AHAI por Ac calientes los hematíes del paciente están recubiertos por autoanti
cuerpos generalmente de clase IgG, que pueden ser eluidos de los hematíes del paciente
ERRNVPHGLFRVRUJ
y reaccionan inespecíficamente con todos los hematíes normales. En ocasiones, estos

autoanticuerpos presentan cierta especificidad relativa para algunos antígenos presentes
en el propio paciente, con frecuencia del sistema Rh. En la AHAI por Ac calientes, suele
existir también autoanticuerpo libre en el suero del paciente, que reaccionará frente a
todos los hematíes normales, dando una positividad con todas las células utilizadas en
el escrutinio y la identificación de Ac irregulares, y en las pruebas de compatibilidad. La
actitud a seguir en el caso de que el paciente requiriera ser transfundido se explica en el
último apartado de esta unidad.
En un pequeño porcentaje de casos, de alrededor de un 3% de las AHAI, el CD
puede resultar negativo. En los casos en que el CD es negativo y la sospecha clínica es
claramente de AHAI, puede ser útil realizar el estudio del eluido así como estudiar si la Ig
implicada es de tipo IgA o IgM. En algunos casos, a pesar de ser el CD negativo, el eluido
es positivo y permite demostrar la presencia de autoanticuerpos fijados a los hematíes del
paciente. Una AHAI por anticuerpos calientes de tipo IgM sin anticuerpos de tipo IgG
ocurre en muy raras ocasiones. También es muy excepcional que la inmunoglobulina
implicada sea únicamente de tipo IgA, sin que estén presentes otras Ig o componentes
del complemento.
Anem ia hem olítica autoinm une p o r anticuerpos fríos

Hablamos de AHAI p or anticuerpos fríos en aquellos casos de AHAI en los que los
autoanticuerpos son reactivos a temperaturas bajas y, preferentemente, a 4 °C. Dentro
de este grupo, según las características de los Ac, podemos diferenciar las dos situaciones
que se exponen a continuación.
Anemia hemolítica autoinmune mediada por aglutininas frías

El síndrome por aglutininas frías (cold aglutinin síndrome, CAS) supone cerca de un
15% de todas las AHAI diagnosticadas. O curre con mayor frecuencia en pacientes
entre 50-60 años de edad, y es excepcional en niños. Está m ediado generalmente por
autoanticuerpos de tipo IgM. Suele presentarse de forma idiopática, pero puede estar
asociado a infecciones, en particular por Mycoplasma pneumoniae, y a mononucleosis
infecciosa. Algunos pacientes desarrollan este cuadro asociado a leucemia linfática
crónica y a otros procesos linfoproliferativos.
Los síntomas varían mucho de un paciente a otro, dependiendo del rango térmico del
anticuerpo, pero son frecuentes los de una anemia crónica. Algunos pacientes pueden
experimentar hemoglobinuria, particularmente cuando el clima es frío, y se quejan de
acrocianosis cuando se exponen a bajas temperaturas. La exploración física suele revelar
palidez e ictericia y puede evidenciarse una hepatoesplenomegalia leve o moderada. La
mayor parte de la hemólisis en este caso ocurre a nivel hepático.
En los casos más típicos, el grado de anem ia depende del grado de exposición al
frío. En general, suele encontrarse una anemia leve o moderada, de forma crónica. Con
frecuencia las muestras de sangre presentan autoaglutinación a temperatura ambiente,
lo que dificulta la realización de la extensión de sangre y de los recuentos celulares. La
autoaglutinación se intensifica a 4 °C y revierte al calentar la m uestra a 37 °C. La m or
fología de los hematíes no suele estar tan alterada como en la AHAI por Ac calientes, y
existe reticulocitosis y policromatofilia. Si se realiza un estudio medular, se observa una
hiperplasia eritroide y un cierto grado de proliferación linfoide.
La autoaglutinación de la m uestra, cuando ocurre, puede hacer sospechar ya el
diagnóstico de CAS o crioaglutininas. Puede ser necesario m antener la m uestra de
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EDTA a 37 °C y lavar los hematíes con solución salina precalentada a 37 °C para dis
persar las crioaglutininas antes de realizar la tipificación ABO y Rh, y la prueba de
CD. El diagnóstico debe ser considerado en aquellos pacientes con una prueba de CD
positiva por anti-C3 y negativa por anti-IgG. En la mayoría de los pacientes con CAS
los anticuerpos son de tipo IgM, que inducen a la fijación de complemento sobre los
hematíes. Los autoanticuerpos libres en el suero del paciente causan la aglutinación de
los hematíes normales fundamentalmente a bajas temperaturas, con un título elevado
a 4 °C, y reaccionando con una intensidad mucho m enor a temperaturas de 30 °C. El
anticuerpo suele tener una especificidad frente al sistema Ii. En los casos asociados a
infecciones por Mycoplasma pneumoniae, la especificidad suele ser anti-I, mientras que
en la mononucleosis infecciosa, anti-i.
El pronóstico en pacientes con CAS es significativamente mejor que en los casos de
AHAI por Ac calientes. Los casos secundarios a procesos infecciosos suelen tener una
presentación clínica más aguda y se resuelven espontáneamente en el curso de varias
semanas. En los casos idiopáticos el curso normalmente es crónico y bien tolerado. Debe
aconsejarse a los pacientes que eviten la exposición al frío. Algunos de ellos pueden
requerir tratamiento inmunosupresor.
Anemia hemolítica autoinmune mediada por hemolisinas frías

En este subgrupo se incluyen también casos de AHAI primaria o idiopática y casos secun
darios, generalmente a infecciones. La hemoglobinuria paroxística afrigore (paroxysmal
cold hemoglobinuria, PCH) es un trastorno muy infrecuente, que supone menos del 1%
de los casos de AHAI. Antiguamente se observaba después de la exposición al frío en
pacientes con sífilis terciaria. En la actualidad, es más habitual verla en niños con una
infección viral reciente. Los pacientes generalmente presentan un episodio agudo de
hemólisis transitorio, y muchas veces no relacionado con exposición al frío.
La hemólisis es de inicio agudo, y provoca una anem ia rápidam ente progresiva.
El paciente puede presentar escalofríos, fiebre, dolor abdominal y lumbar, náuseas y
malestar general. Con frecuencia existe hemoglobinemia y hemoglobinuria, y anomalías
en la morfología de serie roja características de hemólisis (esferocitosis, poiquilocitosis,
reticulocitosis, etc.).
Los autoanticuerpos son de tipo IgG, pero reaccionan con los hematíes en las zonas
más frías del organismo (partes acras de las extremidades) provocando la fijación irre
versible del C3, disociándose a temperaturas más elevadas. Una prueba de CD estándar
resulta positiva únicamente por C3. En el suero de estos pacientes se puede demostrar la
existencia de una hemolisina bifásica, mediante la prueba diagnóstica de Donath-Lands-
teiner. Los autoanticuerpos se fijan a hematíes normales a bajas temperaturas (4 °C) y
conducen a hemólisis cuando los hematíes son calentados a 37 °C en presencia de com
plemento. El autoanticuerpo suele tener especificidad anti-P, reaccionando con todos
los hematíes normales excepto con aquellos de fenotipo excepcional p o Pk.
La enferm edad se autolim ita espontáneam ente en el curso de pocas semanas y
generalmente no recidiva.
Técnicas y estrategia de trabajo en los pacientes afectos de anem ia

hem olítica autoinm une candidatos a transfusión
Para proporcionar una transfusión segura y eficaz al paciente afecto de AHAI que
inevitablemente ha de ser transfundido, deben tomarse una serie de precauciones tanto
en el ámbito del laboratorio como de la clínica. Las pruebas de compatibilidad exigen
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una serie de técnicas adicionales que tienen como objetivo prim ordial descartar la
presencia de un aloanticuerpo oculto por el autoanticuerpo. Las pruebas y técnicas que
a continuación se exponen están diseñadas para los casos de pacientes afectos de AHAI
por autoanticuerpos de clase IgG.
Información clínica
Es im portante disponer de toda la inform ación posible en torno a antecedentes del
paciente y a su estado clínico. Interesa saber si ha estado transfundido previamente, el
número de gestaciones, los antecedentes patológicos, los fármacos, etc. Por otra parte,
el estado del paciente nos orientará en torno al tiempo que disponemos para preparar
las unidades de hematíes más óptimas.
Determinación del grupo ABO y Rh

La tipificación del grupo ABO no suele resultar problemática: para la determinación del
grupo hemático, además de los sueros anti-A, anti-B (opcionalmente, también anti-AB
y anti-Aj), debe emplearse un control negativo (albúmina bovina al 5% o, si se dispone
de ello, la solución en la que va suspendido el anticuerpo monoclonal empleado), para
el grupo sérico, además de los hematíes A, y B (opcionalmente, también hematíes A^ AB
y O), deben emplearse los hematíes del propio paciente en suspensión salina al 3-5%.
Respecto al sistema Rh, es im portante realizar una tipificación lo más completa
posible, siempre que no existan transfusiones en los últimos 3 meses de los antígenos
D, C, c, E y e.
Los reactivos monoclonales actualmente utilizados no suelen producir falsos resulta
dos positivos, pero es recomendable un control de la albúmina al 5%, o bien el diluyente
en el que están suspendidos los anticuerpos.
Estudio completo de la prueba directa de la antiglobulina (Coombs directo)

El diagnóstico de AHAI se habrá establecido sobre la base de la concurrencia de anemia,
los signos biológicos de hemólisis y la PDATG positiva. Una vez obtenido el resultado
positivo con la antiglobulina polivalente habrá que caracterizar la inmunoglobulina
implicada con la ayuda de las antiglobulinas monovalentes, habitualm ente anti-IgG
y anti-C3b,d. En caso de que fuera necesario cabe el empleo de otras antiglobulinas
monovalentes anti-IgM o anti-IgA.
Los autoanticuerpos calientes son mayoritariamente de clase IgG, aunque estudios
recientes realizados con técnicas muy sensibles dem uestran que hasta en un 37% de
casos suelen detectarse simultáneamente inmunoglobulinas de clase IgM o IgA, o ambas.
No obstante, el perfil más com ún esperado en una AHAI caliente será el de anti-IgG
positivo solo o acompañado de C3b,d. Una buena antiglobulina IgG debe comenzar a dar
resultados positivos en presencia de un mínimo de 150 moléculas de IgG por hematíe.
Estudio del eluido

La realización de un eluido y el estudio posterior del mismo nos permiten confirmar la
naturaleza autoinmune de las inmunoglobulinas IgG fijadas a la membrana del hematíe.
Cuando el eluido contiene exclusivamente un autoanticuerpo, este es reactivo con
todas las células del panel, m ostrando, en ocasiones, una especificidad relativa.
Una PDATG positiva pero que cursa con un eluido no reactivo puede sugerir la
intervención de un fármaco. También es sugestivo de un proceso que com porta en
el paciente la presencia de inmunocomplejos, de paraproteína o de una proporción
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superior a la habitual de inmunoglobulinas que de forma inespecífica se han fijado a

los hematíes del paciente.
La presencia de un aloanticuerpo en el eluido es sugestiva de una reacción trans-
fusional retardada, de una enfermedad hemolítica del recién nacido o, más raramente,
de u n autoanticuerpo mimicking o de un fenómeno de Matuhasi-Ogata.
Existen múltiples métodos de elución y cada uno de ellos posee ventajas e inconve
nientes, si bien en los últimos años se han impuesto los reactivos comerciales de elución
a pH ácido.
Autoanticuerpos con especificidad Rh o especificidad relativa

En ocasiones, algunos autoanticuerpos reaccionan con todos los hematíes del panel,
pero m uestran una reactividad superior (aglutinación de intensidad superior o título
superior) frente a hematíes de un determinado fenotipo Rh y, más concretamente, frente
al antígeno e.
La actitud a adoptar en caso de que el paciente deba ser transfundido es controvertida.
Algunos expertos abogan por no emplear aquellos hematíes que contengan el antígeno e,
excepto en el caso de que respetar esta regla implique transfiindir sangre Rh(D)+ a un
individuo R h(D )-, especialmente si se trata de una m ujer en edad fértil. Igualmente,
si un paciente posee u n autoanti-E más un aloanticuerpo (anti-E), debe respetarse
esta incom patibilidad prioritariam ente y prescindir de la especificidad relativa del
autoanticuerpo.
Otros expertos, por el contrario, recomiendan ignorar las especificidades relativas
apoyándose en las siguientes consideraciones. Primero, los estudios de supervivencia de
los hematíes compatibles frente a los incompatibles no son concluyentes y, en muchos
de ellos, el beneficio de respetar la especificidad relativa es mínimo. Y, en segundo lugar,
contemplar la especificidad relativa puede implicar el uso de hematíes en los que pueden
estar presentes antígenos ausentes del fenotipo del paciente, con el consiguiente riesgo
de inmunización.
Estudio del suero

En más de un 80% de los pacientes con AHAI IgG, el autoanticuerpo se encuentra libre
en el suero, lo que determina que tanto el escrutinio como la identificación de anticuer
pos irregulares y las pruebas de compatibilidad resulten positivos. En esta situación, si
el paciente tiene antecedentes transfusionales y/o de gestación, no es posible asegurar
que la reactividad observada se deba únicamente a la presencia de un autoanticuerpo.
El objetivo fundamental al abordar el estudio del suero es el de detectar la presencia de
aloanticuerpos que pudieran quedar ocultos por el autoanticuerpo libre.
Las técnicas de elección para investigar la presencia de aloanticuerpos ocultos por el
autoanticuerpo son las de adsorción: autoadsorción y adsorción alogénica o diferencial.
No obstante, existen otras estrategias que pueden resultar orientativas, pero nunca sus-
titutivas de los dos procedimientos de elección:
1. C om parar la intensidad de la aglutinación en la PDATG con la de la prueba
indirecta (PIATG). Si no existe aloanticuerpo, la intensidad de la aglutinación en
la PDATG > PLATG, ya que la mayoría del autoanticuerpo suele estar fijado a los
hematíes. Por el contrario, en presencia de un aloanticuerpo, la aglutinación en la
PITG > PATGD. Sin embargo, puede resultar peligroso ignorar en el prim er caso
la posibilidad de que además del autoanticuerpo pueda existir un aloanticuerpo
de m enor título.
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2. Aglutinaciones de diferente intensidad con el panel de hematíes. Esta condición

solo se cumple cuando el aloanticuerpo acompañante posee un título notablemen
te superior al del autoanticuerpo. En este caso la realización de diluciones seriadas
del suero del paciente puede ayudar a clarificar la especificidad del aloanticuerpo.
Autoadsorción
Actualmente, la m ejor técnica disponible para detectar un aloanticuerpo en presencia
de un autoanticuerpo es la autoadsorción del suero del paciente a 37 °C frente a sus
propios hematíes, después de haber realizado la elución de al menos una fracción del
autoanticuerpo.
Tras las adsorciones, el suero es nuevam ente enfrentado al panel de hematíes, de
manera que una vez eliminada la interferencia creada por el autoanticuerpo, podremos
determinar claramente la presencia de un aloanticuerpo y su especificidad.
La mayoría de autoanticuerpos poseen un título inferior a 16 en la PIATG, de for
ma que 2-3 autoadsorciones resultan suficientes en la mayoría de casos. Si el título es
superior pueden tratarse los hematíes con enzimas para increm entar la cantidad de
autoanticuerpo adsorbido. Por el contrario, si la PDATG es muy débil puede realizarse
la autoadsorción sin elución previa de los hematíes.
El principal inconveniente técnico de este método es la hemólisis que, en ocasiones,
implica la elución de los hematíes del paciente y que impide la reutilización de los
mismos.
La técnica de autoadsorción es tan útil que merece la pena conservar hematíes del
paciente obtenidos con ocasión de la prim era transfusión, para poder realizar autoad
sorciones en el caso de que en el futuro este requiera más sangre. Los hematíes pueden
conservarse en ACD, CPD o congelados, si se dispone de los medios para efectuarlo.
El fenómeno de Matuhasi-Ogata puede teóricamente limitar la utilidad de esta técnica,
al igual que la de adsorción diferencial. Matuhasi-Ogata sugirieron que algunos anti
cuerpos de una determ inada especificidad pueden adherirse a complejos antígeno-
anticuerpo de una especificidad distinta. Y así, potencialmente es factible que el aloan
ticuerpo pueda adherirse al complejo constituido por el autoanticuerpo y los hematíes
del paciente empleados para la autoadsorción. No obstante, la experiencia acumulada
indica que este fenómeno, en caso de producirse, no conlleva la total desaparición del
aloanticuerpo que todavía permanece a título suficiente como para poder detectarlo.
Adsorción diferencial
Esta técnica constituye la alternativa ideal a la autoadsorción cuando el paciente ha sido
transfundido recientemente. Consiste en la adsorción del autoanticuerpo empleando
hematíes alogénicos de diferente fenotipo. Por ejemplo, la adsorción de un suero que
contenga u n autoanticuerpo más un aloanticuerpo de especificidad Jka con unos he
matíes de fenotipo Jk(a-), resultará en la adsorción del autoanticuerpo y no en la del
aloanticuerpo, que podrá ser fácilmente detectado con el panel de hematíes.
Al igual que con la autoadsorción, el tratamiento enzimático de los hematíes mejora
el rendimiento de cada adsorción, aunque no es absolutamente necesario.
Como la mayoría de las reacciones transfusionales hemolíticas están causadas por
un núm ero limitado de anticuerpos (ABO, Rh, Kell, Kiddy Duffy), la complejidad de
disponer de hematíes de diferente fenotipo se simplifica, especialmente si se conoce el
fenotipo Rh del paciente.
• Los anticuerpos del sistema ABO no representan ningún problema si la tipificación
se ha realizado correctamente.
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• El antígeno Kell puede omitirse en la selección de los hematíes a utilizar para la

adsorción, ya que solo un 7-8% de los hematíes son Kell(+), por lo que no planteará
mayores problemas al transfundir.
• El tratam iento con enzimas de los hematíes implicará la desnaturalización de los
antígenos M, N, S, Fya y Fy1’, de m anera que los anticuerpos dirigidos contra es
tos antígenos no podrán adsorberse y permanecerán en el suero del paciente.
• En definitiva, la mayoría de los anticuerpos potencialm ente hemolíticos podrán
detectarse realizando las adsorciones con dos células que de forma complementaria
resulten Jka(-) y Jkb(-).
Si no se detecta ningún aloanticuerpo en el suero adsorbido, bastará con seleccionar
hematíes del mismo fenotipo Rh que el paciente y Kell(-) para poder transfundirlo.
Aunque con esta estrategia se ignoran algunos aloanticuerpos con capacidad hemolítica,
la probabilidad de que produzcan una reacción transfusional es mínima.
Cuando no se conoce el fenotipo Rh del paciente y existe una transfusión reciente
que no perm ite determ inarlo de u n a m anera objetiva, la selección de los hematíes
para las adsorciones conlleva mayor complejidad. En esta situación se debe investigar
escrupulosamente la posibilidad de que algún anticuerpo de especificidad Rh pueda
quedar oculto por el autoanticuerpo y, p or ello, se requieren tres células de fenotipo
R1R1, R2R2 y rr, respectivamente. Las tres células serán Kell(-), una de ellas Jka(-), otra
Jkb(-). Si se utilizan hematíes tratados con enzimas podemos ignorar el sistema Duffy, o
de lo contrario una célula deberá ser Fy^-) y otra, como mínimo, S(-).
Fenotipo de los hematíes Permanecen en el suero

R1R1 kk ss Jk(a+b-) Fy(a+b-) c, E, K, S, Jk*5, Fyb
R2R2 kk SS Jk(a+b-) Fy(a+b-) C, e, K, s, Jkb, Ff
rr kk ss Jk(a-b+) Fy(a-b+) C, D, E, S, Jka, Fy1
La desventaja potencial de la adsorción diferencial obedece a la posibilidad de que un

anticuerpo dirigido contra un antígeno de alta frecuencia pueda ser también adsorbido
por las células empleadas, pero en la práctica estos anticuerpos son poco frecuentes.
Si los hematíes empleados en la adsorción son tratados enzimáticamente y el título del
anticuerpo es inferior a 16 en la PIATG, dos o tres adsorciones pueden resultar suficientes
para eliminar el autoanticuerpo.
Para disponer de los hematíes necesarios, cuando se plantee la necesidad de realizar
adsorciones diferenciales, puede resultar muy útil conservar estos hematíes en una
solución de conservación a 4 °C.
La autoadsorción o la adsorción diferencial del eluido también puede resultar útil para
diferenciar si la reactividad observada obedece a la presencia de un autoanticuerpo o a
la suma de este más un aloanticuerpo, como podría suceder en el caso de una PDATG
positiva como resultado de una reacción transfusional hemolítica.
A dsorciones diferenciales con polietilenglicol

El polietilenglicol (PEG) es un polímero soluble en agua que actúa como potenciador
de la reacción antígeno-anticuerpo y que, además, resulta muy útil para acortar los pro
cedimientos de adsorción. La incorporación de PEG a la mezcla de suero y de hematíes
nos ahorra el tratamiento enzimático de los hematíes y nos permite reducir el tiempo
de incubación de cada adsorción a un máximo de 15 min. Para minimizar el riesgo de
dilución de la muestra problema se aconseja emplear una proporción volumen a volumen
de cada uno de los tres elementos.
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Al realizar la prueba cruzada, se empleará una mayor proporción del suero adsorbido
del orden de 2-3 veces para compensar el efecto de dilución del PEG, y la lectura se
efectuará con antiglobulina anti-IgG.
D escripción detallada de algunas técnicas útiles en el estudio

de las anem ias hem olíticas autoinm unes
Técnicas de elución
Existen técnicas muy diversas y todas tienen como objeto interferir en las fuerzas de
ligadura no covalente que fijan los complejos antígeno-anticuerpo a la superficie de los
glóbulos rojos. La base de la elución puede consistir en la aplicación de calor, ultrasonido,
congelación-descongelación o empleando detergentes o solventes orgánicos. El método
de la elución ácida en frío es la base de la mayoría de los reactivos de elución comerciales.
En muy importante efectuar lavados muy completos de los glóbulos rojos antes de
la elución para asegurarse de que los anticuerpos se encuentran exclusivamente fijados
a la membrana, y no en forma libre en el suero o plasma, lo que podría inducir un falso
resultado positivo. Un control para dem ostrar que se han eliminado los anticuerpos
libres consiste en guardar el sobrenadante salino del último lavado que se examinará en
paralelo con el eluido.
Elución ácida en frío

Se requieren eritrocitos del paciente que tendrán un Coombs directo positivo, lavados
seis veces en solución salina. Se debe guardar el sobrenadante del último lavado.
Reactivos
• Glicina-HCl (0,1 M, pH = 3). Se conserva a 4 °C.
• Amortiguador fosfato (0,8 M, pH = 8,2). Se conserva a 4 °C.
• ClNa al 9%, a 4 °C.
• Sobrenadante salino del último lavado de los hematíes.
Método
1. Se dispensan los eritrocitos en un tubo de hemólisis y este se enfría en un baño
de hielo durante 5 min.
2. Se agrega inmediatamente 1 mi de solución salina fría y 2 mi de glicina-ClH fría
a los eritrocitos.
3. Se mezcla y se incuba durante 1 m in en un baño con hielo (0 °C).
4. Se centrifuga durante 2-3 min a 900-1.000 X g.
5. Se transfiere el eluido sobrenadante a un tubo limpio y se añade 0,1 mi de amor
tiguador fosfato a pH = 8,2 por cada mililitro de eluido.
6. Se mezcla y se centrifuga durante 2-3 m in a 900-1.000 X g.
7. Se transfiere el eluido sobrenadante a un tubo limpio y se evalúa en paralelo con
el sobrenadante salino final.
Nota: La acidez no neutralizada con el amortiguador puede producir hemólisis. El
añadir albúmina bovina al 22% puede reducir la hemólisis.
Elución por calor

Es el método de elección para la investigación de la enfermedad hemolítica del recién
nacido por incompatibilidad ABO y la elución de anticuerpos IgM de los eritrocitos. No
debe emplearse en el estudio de auto- o aloanticuerpos IgG.
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Capítulo 21 Métodos para el diagnóstico de las citopen ias inmunes 64 1
Se requieren los eritrocitos portadores de un Coombs directo positivo, lavados seis

veces en solución salina. Se debe guardar el sobrenadante del último lavado.
Reactivos
• Albúmina bovina al 6%.
• Sobrenadante salino del último lavado de los hematíes en estudio.
M étodo
1. Se mezclan volúmenes iguales de eritrocitos concentrados lavados y albúmina
bovina al 6% en un tubo de hemólisis.
2. Se incuba durante 10 min a 56 °C, agitando periódicamente.
3. Se centrifuga durante 2-3 min a 900-1.000 X g, dentro de lo posible en una cen
trífuga termostatizada.
4. Se transfiere de inmediato el eluido sobrenadante a un tubo limpio y se valora en
paralelo con el sobrenadante del último lavado de los hematíes.
Nota: Para recuperar m ejor los anticuerpos fríos, es conveniente lavar los hematíes
en solución salina helada a fin de prevenir la disociación de los anticuerpos fijados antes
de la elución.
Eluido de Lui
Se utiliza principalmente en la investigación de la enfermedad hemolítica del recién
nacido por incompatibilidad ABO. Se requieren los eritrocitos portadores de un Coombs
directo positivo lavados seis veces en solución salina.
M étodo
1. Se mezclan 0,5 mi de eritrocitos con tres gotas de solución salina en un tubo de
hemólisis.
2. Se tapa el tubo y se rota de tal forma que las paredes queden recubiertas de hematíes.
3. Se coloca el tubo en posición horizontal en el congelador durante 10 min a una
temperatura entre - 6 y -7 0 °C.
4. Se retira del congelador y se calienta con agua.
5. Se centrifuga durante 2 min a 900-1.000 X g.
6. Se transfiere el sobrenadante a un tubo lim pio y se valora en paralelo con el
sobrenadante del último lavado de los hematíes.
Prueba de D o n a th -L a n d stein er
Los anticuerpos que causan PCH actúan como hem olisinas bifásicas in vitro. Los
autoanticuerpos IgG se fijan a los hematíes a tem peraturas bajas y, posteriorm ente,
cuando se calienta la muestra a 37 °C se activa el complemento y se produce la hemólisis.
Para el estudio se requiere de una muestra de sangre fresca mantenida a 37 °C.
Reactivos
• Mezcla de suero norm al fresco que carezca de anticuerpos irregulares como fuente
de complemento.
• Hematíes lavados de grupo O y fenotipo P positivo en suspensión al 50%.
Método
1. Se etiquetan tres grupos de tres tubos: A l, A2, A3; Bl, B2, B3; C l, C2, C3.
2. En los tubos 1 y 2 de cada grupo se dispensan 10 gotas de suero del paciente.
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3. En los tubos 2 y 3 de cada grupo se dispensan 10 gotas de suero fresco normal.

4. En todos los tubos se dispensa un volumen de la suspensión de hematíes de
fenotipo P positivo, lavados y al 50%, y se mezcla bien.
5. Se incuban los tubos «A» durante 30 min en un baño con hielo y luego durante
1 h a 37 °C.
6. Se incuban los tubos «B» durante 90 m in en un baño con hielo.
7. Se incuban los tubos «C» durante 90 m in a 37 °C.
8. Se centrifugan todos los tubos y se examina el sobrenadante para detectar la
presencia de hemólisis.

• La prueba se considera positiva cuando el suero del paciente, con o sin complemento,
produce hemólisis en los tubos «A» incubados primero con hielo y luego a 37 °C (Al
y A2), pero no en los mantenidos a 37 °C (C l y C2), o en hielo (B1 y B2).
• Los tubos A3, B3 y C3 actúan como controles de la actividad del complemento y no
deben presentar hemólisis.
Nota: El complemento activo es esencial para la prueba. Para demostrar la especifici
dad P de la hemolisina debe realizarse una segunda tanda de tubos empleando hematíes p,
con los que no se producirá hemólisis si existe una verdadera especificidad anti-P.
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTILEUCOCITARIOS

En clínica existen diversas enfermedades de índole autoinm une que afectan directa o
indirectamente a los leucocitos, especialmente a los granulocitos neutrófilos. En el curso
de estas enfermedades se producen autoanticuerpos que pueden dirigirse contra la mem
brana de los granulocitos neutrófilos (anticuerpos antigranulocitarios), el citoplasma
(anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos) o el núcleo (anticuerpos antinucleares). De
todos ellos, solo los AGA suelen dar lugar a u n síndrome hematológico caracterizado
por una neutropenia de intensidad variable (granulopenia o neutropenia autoinmune).
Los restantes autoanticuerpos, anticitoplasma de neutrófilo (antineutrophil cytoplasmic
antibodies, ANCA) y antinucleares (antinuclear antibodies, ANA) carecen de manifes
tación clínica hematológica propiamente dicha, pero su presencia suele emplearse en
el diagnóstico de ciertas enfermedades autoinmunes de carácter sistémico como, por
ejemplo, el LES (ANA) o, las vasculitis y la enfermedad de Wegener (ANCA).
Anticuerpos antinucleares
En 1971, la Asociación Americana de Reumatología (ARA) emitió unos criterios revisa
dos en 1982 en los que se incluyeron los ANA como criterio diagnóstico de LES.
El LES es una enfermedad reumática de base autoinmune y de origen desconocido,
en la que existe una afectación más o menos generalizada del tejido conjuntivo cuyas
manifestaciones clínicas aparecen en diversos órganos y tejidos, que p o r orden de
creciente de frecuencia son: articulaciones, piel, sistema nervioso, riñones, corazón,
pulmones, sangre, hígado, bazo y ojos. Su nombre (etimológicamente: lobo rojo) hace
referencia a que una de sus primeras manifestaciones es una erupción cutánea en forma
de alas de mariposa que cubre la nariz y las mejillas (eritema malar) y da al paciente un
aspecto de lobo.
El LES es una enfermedad que, a pesar de su carácter reumático, suele tener sus
primeras manifestaciones en las células sanguíneas. Así, es frecuente la anemia (50% de
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los casos), la leucopenia (60% de los casos), la trombocitopenia (5% de los casos) y la
aparición de anticoagulante lúpico (25% de los casos). Los anticoagulantes lúpicos (lupus
anticoagulant [LA]) son anticuerpos IgG dirigidos contra la fracción fosfolipídica del
complejo activador de la trombina. Interfieren con las pruebas de coagulación depen
dientes de fosfolípidos sin inhibir la actividad de factores de coagulación específicos. La
totalidad de los LA circulantes en el LES alargan el tiempo parcial de tromboplastina
(TTP) y algunos de ellos también el tiempo de protrom bina (TP). Puede decirse, por
tanto, que descartando el déficit de factor de la coagulación ante un TP y TTP alargados,
lo más probable es que exista u n LA circulante. El nom bre de LA es en cierto modo
engañoso, ya que no es específico del LES y, paradójicamente se asocia clínicamente a
trombosis arterial y venosa.
En el LES existe una producción de autoanticuerpos, especialmente contra las es
tructuras del núcleo celular (ANA) y formación y depósito de inmunocomplejos. Al
igual que cualquier otra enfermedad reumática, los principales autoanticuerpos son
inmunoglobulinas de tipo IgG e IgM.
El diagnóstico del LES se basa en datos clínicos y de laboratorio. Una de las pruebas
de laboratorio clásicamente em pleadas en el diagnóstico de la enferm edad fue la
determ inación de células LE, descrita en prim er lugar p or Hargraves et al. en el año
1948. Esta prueba es positiva en aproximadamente un 80% de los pacientes con LES
activo, pero puede serlo también en otras condiciones patológicas diferentes al mis
mo, como por ejemplo diversas colagenosis. Con todo, la prueba de las células LE ha
m antenido su valor clínico hasta la llegada de las pruebas inmunológicas mucho más
sensibles y específicas.
Método indirecto (células LE)

Principio
Las células LE o células de Hargraves son polimorfonucleares que han fagocitado material
nuclear previamente alterado y procedente de la destrucción del núcleo de otros leuco
citos por el llamado factor LE o factor nuclear (FN). El factor LE es una IgG anti-ADN
que se fija a la superficie del núcleo y determina alteraciones de la cromatina. El material
nuclear alterado (cuerpo hematoxilínico) de aspecto hialino recubierto de anticuerpos
y com plem ento es fagocitado rápidam ente p or los polim orfonucleares neutrófilos
funcionalmente activos (fig. 21-3).
le a r
FIGU RA 21-3. Esquema que

ilustra el principio de formación
de la célula LE.
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Método
1. Se extraen 10 mi de sangre y se dejan coagular en un tubo de ensayo durante 2 h
a 37 °C.
2. Se centrifugan 10 m in a 3.500 r.p.m.
3. Se elimina el suero y se deposita el coágulo sobre un tamiz de malla fina.
4. Se aplasta el coágulo contra el tamiz, y se recoge el producto resultante en un vaso
de precipitados.
5. Se llena con una pipeta Pasteur un tubo de Wintrobe, con el hemolizado obtenido
de la destrucción del coágulo.
6. Se centrifuga durante 20 m in a 5.000 r.p.m.
7. Se elimina el sobrenadante y se recogen los leucocitos situados en la interfase
suero/eritrocitos con una pipeta Pasteur.
8. Se efectúan dos extensiones con este material.
9. Se tiñe con el método de May-Grünwald/Giemsa y se observa mediante el objetivo
de inmersión.

La positividad de la prueba se pone de manifiesto por la aparición de leucocitos neu
trófilos, en cuyo citoplasma se halla material nuclear fagocitado y alterado por el proceso
de la propia fagocitosis (fig. 21-4).
Clásicamente, la determinación de las células LE ha sido el m étodo más empleado
para el diagnóstico biológico de LES. Esta prueba, aunque de gran especificidad (ya que
prácticamente solo se observan células LE en el LES), carece de suficiente sensibilidad,
por cuanto es negativa en, aproximadamente, un 30% de los pacientes con la enfermedad.
Asimismo, la corticoterapia, que a m enudo se aplica prontam ente a estos enfermos,
inhibe la formación de las células LE.
Las células LE no deben confundirse con otro fenómeno celular de aspecto similar, en
el que el fagocito es un monocito que a consecuencia de las condiciones impuestas por la
técnica han englobado en su citoplasma algún núcleo o una célula entera (casi siempre un
polimorfonuclear neutrófilo). Este fenómeno se conoce con el nombre de célula en tarta
o tart-cell y, a diferencia de las células LE, el núcleo o célula fagocitada mantiene intactas
sus características morfológicas ya que no ha existido el proceso previo de hialinización.
Finalmente, a pesar de su gran especificidad, las células LE pueden observarse también
en otras enfermedades autoinmunes, muchas veces difíciles de distinguir clínicamente
FIGU RA 21-4. Células LE.

Obsérvese el material nuclear alterado,
fagocitado por los polimorfonucleares
neutrófilos (MGG, X 1.000).
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del LES, como p or ejemplo, las colagenopatías mixtas y la artritis reum atoide. Por
ello, en la actualidad, esta técnica va siendo sustituida por otras pruebas cada vez más
sensibles y específicas, entre las que destacan los ANA. Con todo, en laboratorios con
escasas posibilidades técnicas, la determinación de las células LE constituye todavía un
procedimiento de valor diagnóstico que no debería abandonarse, excepto que se dis
ponga de otro mejor.
Método directo (anticuerpos antinucleares)

Aunque la determinación de ANA se basa en un análisis serológico, la diversidad de
antígenos nucleares frente a los que pueden reaccionar los ANA explica la escasa es
pecificidad de esta prueba, que puede resultar también positiva en otras enfermedades
autoinmunes diferentes al LES. No obstante, es mucho más sensible que la aparición de
las células LE ya que es positiva en prácticamente todos los casos (>95% ) de LES, lo que
justifica el que cuando resulta negativa, prácticamente puede descartarse este diagnós
tico. Los ANA pueden ser de varios tipos de acuerdo con el determinante antígeno que
reconocen (tabla 21-2).
TABLA 21-2. Tipos de anticuerpos antinucleares
Antígenos Enfermedad en que aparecen ANA

ADN
ADN ss (monocatenario) Enfermedades reumáticas y autoinmunes
ADN ss-ds (mono- y bicatenario) Lupus eritematoso sistémico (LES) (inespecífico)
ADNa (nativo) LES (específico)
Antígenos nucleolares
ARN 4-6G nucleolar Síndrome de Raynaud y esclerodermia
Antígenos extraíbles (ENA)
PNP Conectivopatía
Sm LES (específico)
SSAySSB Síndrome de Sjógren (SS)
Scl-70 Esclerodermia
Pm-1 Dermatomiositis-polimiositis
Ma LES grave
RANA Artritis reumatoide y SS
Antígenos citoplásmicos
Mitocondriales Cirrosis biliar primaria (CBP)
Microsomales Hepatitis crónica activa (HCA)
Roy La LES con ANA negativos
Microsomas de tejidos
- Células parietales Anemia perniciosa
- Células epiteliales tiroideas Enfermedad de Hashimoto
- Células de la corteza suprarrenal Enfermedad de Addison
Factor perinucleolar Artritis reumatoide
Músculo liso Hepatitis crónica activa (HCA)
ARN:
- Monocatenario LES (inespecífico)
- Bicatenario LES (inespecífico)
Otros antígenos nucleares
Centrómero Síndrome de Crest
Granulocitos Artritis reumatoide y síndrome de Felty
PcNa LES (inespecífico)
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FIGU RA 21-5. ANA

(inmunofluorescencia) en un enfermo
con LES (X400).
■
Principio
En el LES, pero también en otras enfermedades autoinmunes, es posible detectar en
el suero de los enfermos anticuerpos contra componentes nucleares de las células. La
técnica más simple y empleada en la práctica para la determ inación de los ANA es
la inmunofluorescencia indirecta (IFI), que consiste en enfrentar el suero del enfermo
con una m uestra de triple tejido de rata (estóm ago/hígado/riñón) y/o células. En la
actualidad, el sustrato más empleado para la caracterización del patrón de ANA es el
de las células Hep-2, línea celular hum ana derivada de un carcinoma laríngeo epitelial.
Estas células presentan la ventaja de poseer un amplio núcleo y organelas más fáciles
de ver. Además, estas células se dividen rápido, y se puede observar en u n mismo
pocilio células en diferentes fases de división celular lo que facilita la determinación
del patrón antinuclear. Tras un paso de lavados (para eliminar las proteínas séricas
no fijadas al antígeno) se procede a la incubación del sustrato con anticuerpos anti-
IgG hum ana marcados con fluoresceína. Una vez finalizada la incubación, se pasa a
observar las células del tejido-sustrato m ediante un microscopio de fluorescencia al
objeto de analizar la eventual presencia o no de fluorescencia nuclear y determinar el
patrón de ANA (fig. 21-5).
Material
• Microscopio de fluorescencia con condensador de fondo neutro.
• Anticuerpos anti-IgG humana marcados con fluoresceína. Diferentes preparaciones
comerciales cumplen estas características.
• Portaobjetos con los sustratos antígenos (triple tejido de rata (TTR)/línea celular
Hep-2).
• Suero problema.
Método
1. Se diluye el suero problem a en solución salina fisiológica (NaCl, 0,15 mol/1).
En general, se realiza una dilución inicial de 1/40 para analizar los anticuerpos
antitisulares y de 1/80 para analizar los ANA sobre Hep-2, aunque no existen
acuerdos a nivel internacional sobre la dilución de inicio.
2. En cada determinación, además del suero problema, se emplean dos testigos: uno
con suero positivo y título de ANA conocido, y otro con suero negativo.
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3. A cada portaobjetos se añaden 50-100 (xl de una dilución del suero problema (ytes-
tigo) y se colocan durante 30 min en posición bien horizontal en el interior de una
cámara húmeda a 25 °C (temperatura de laboratorio).
4. Se lava dos veces el portaobjetos con solución salina tam ponada y se secan las
zonas de la extensión sobre las cuales no se realizará la reacción.
5. Se recubre la zona de la extensión elegida para la reacción con la solución de
antiinmunoglobulinas fluorescentes (previamente diluidas, si es necesario) y se
incuba durante 30 min.
6. Se lava el portaobjetos con abundante solución salina fisiológica.
7. Se seca la extensión en torno al área de reacción, la cual se recubre con una gota
de aceite mineral y finalmente con un cubreobjetos.
8. Se observa la zona de la extensión elegida para la reacción con el microscopio de
fluorescencia.

Se considera positivo todo suero que origina fluorescencia nuclear a u na dilución de
1/40 o superior sobre sustrato de TTR y de 1/80 o superior sobre Hep-2. Los sueros
positivos deben titularse, es decir, ser ensayados a diluciones progresivamente mayores
hasta que den resultado negativo. Se define el título como la mayor dilución que aún da
resultado positivo (fig. 21-6).
Se pueden diferenciar numeroso patrones de ANA. Algunos de los más frecuentes
detectados en el LES son:
• P atró n periférico. Consiste en la apreciación de un ribete fluorescente que rodea
completamente el núcleo. En general, corresponde a la presencia de anticuerpos anti-
ADN, lo que es muy específico de LES, pero requiere una posterior confirmación por
otras técnicas.
• P atró n hom ogéneo. En este caso, la fluorescencia ocupa la totalidad de la superficie
nuclear, al presentar una distribución difusa sobre la superficie del mismo. Corres
ponde a la presencia de anticuerpos antinucleohistonas (nucleoproteínas) y, por tanto,
es también sugerente de LES, aunque no como el patrón anterior, por cuanto puede
E s p e c ific id a d
Im a g e n P a tr ó n A n tic u e r p o LE S CPM AR
Periférico Anti-A D N nativo +++ + /- +/-

O
D ifuso A ntinucleohistonas * + ++
0
Granular A nti-EN A +/- ++ +/- FIGU RA 21-6. Esquema de

© los diferentes patrones nucleares
de inmunofluorescencia en
enfermedades autoinmunes.
N ucleolar Anti-AR N +h + +/- AR, artritis reumatoide;
CPM, conectivopatía mixta;
0 LES, lupus eritematoso sistémico.
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observarse también en pacientes con artritis reumatoide o neoplasias diversas, o en

sujetos de edad avanzada.
• P a tró n m oteado. Se caracteriza p o r el carácter no hom ogéneo o parcelar de la
fluorescencia nuclear. La fluorescencia se presenta bajo forma de pequeños puntos
fluorescentes. Se asocia a la presencia de anticuerpos del grupo ENA (extractable
nuclear antigen), es decir, anticuerpos contra determinados antígenos presentes en
el núcleo y que pueden ser extraídos con solución salina (Sm, RNP y SS-B). Este tipo
de patrón se observa con mayor frecuencia en la esclerodermia y otras colagenosis
sistémicas, y es menos frecuente en el LES. Asimismo, puede aparecer en el curso de
ciertas neoplasias.
• P atrón nucleolar. Corresponde a la presencia de fluorescencia exclusivamente en la
región nucleolar. Se identifica por la aparición de uno a cinco puntos fluorescentes en
el interior de los nucléolos e indica la presencia de anticuerpos anti-ARN nucleolar.
Es un patrón muy raro y casi nunca se observa en pacientes con LES; es más frecuente
en otras patologías como la esclerosis sistémica progresiva.
En definitiva, la prueba de los ANA es útil como método de escrutinio, ya que, ante
una clínica compatible, su positividad es prácticamente diagnóstica de LES. No obstante,
dada su positividad en otras enfermedades autoinmunes y la dificultad existente m u
chas veces en la correcta interpretación de los patrones de inmunofluorescencia, lo más
adecuado, ante un paciente con positividad de estos anticuerpos y sospecha de LES u otra
colagenopatía, es la ampliación del estudio a especificidades anti-ADN de doble cadena
y ENA mediante otros procedimientos como la IFI utilizando como sustrato Chrithidia
luciliae para la determ inación de anticuerpos anti-ADN de doble cadena, altamente
específicos de LES o pruebas de ELISA o inm unoblot para confirmar y cuantificar las
diferentes especificidades de ENA.
Anticuerpos anticitoplasm a de neutrófilo

La descripción de autoanticuerpos que reconocen antígenos citoplásmicos aparece
en la literatura médica en 1982, pero es en 1985 cuando van der Woude describe por
prim era vez la asociación de anticuerpos anticitoplasma y la enfermedad de Wegener.
Pocos años después, Falk y Jenette extienden esta asociación a otros tipos de vasculitis
como la poliarteritis microscópica y la glomerulonefritis necrotizante con proliferación
extracapilar, hoy en día considerada como una forma de vasculitis con expresión ex
clusivamente renal.
Las vasculitis de pequeño vaso son consideradas como enfermedades autoinmunes
y, como tales y debido a su carácter inflamatorio, suelen acompañarse de un aumento
en la concentración plasmática de diversas proteínas plasmáticas que en conjunto se
denomina reacción de fase aguda (RFA). Las proteínas de la RFA son sintetizadas en el
hígado bajo el estímulo de la interleucina (IL), producida en grandes cantidades por los
fagocitos activados p or el proceso inflamatorio. Entre las RFA destacan la proteína C
reactiva (CRP) y el factor reumatoide (FR). La CRP es útil en el diagnóstico diferencial
entre el LES y la artritis reum atoide (AR), ya que m ientras en esta últim a se halla
prácticamente siempre aumentada, en el LES suele ser normal. El FR está constituido
por un conjunto de anticuerpos dirigidos contra determinantes antígenos del fragmento
Fe de la IgG desnaturalizada (animal o humana). En general, solo se detecta el FR tipo
IgM. En la práctica esta detección se realiza mediante dos métodos: látex y Waaler Rose.
La prueba del látex es ligeramente más sensible pero menos específica que la de Waaler
Rose y en ella se utilizan partículas de látex, mientras que en esta últim a se emplean
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eritrocitos de carnero sensibilizados con inm unoglobulina de conejo. El suero debe

ser previamente calentado para destruir sustancias que pudieran causar aglutinaciones
diferentes a las debidas al FR y en la prueba de Waaler Rose debe ser previam ente
absorbido para eliminar los anticuerpos heterófilos.
Principio
La técnica más comúnmente empleada para la identificación de los ANCA es la de la
IFI, donde se describe el llamado patrón citoplásmico (c-ANCA) y el llamado patrón
perinuclear (p-ANCA). Ambos identifican antígenos localizados en los gránulos prima
rios de los polimorfonucleares. En el caso del patrón c-ANCA, el antígeno reconocido
corresponde a la enzima lisosómica llamado proteinasa 3 (PR3) y en el caso del p-ANCA
el antígeno reconocido corresponde en la mayoría de los casos a la mieloperoxidasa
(M PO), si bien en ocasiones se ha descrito el patrón perinuclear cuando el antígeno
reconocido corresponde a la elastasa, la lactoferrina BPI o catepsina G (especificidades
menos frecuentes). Algunos autores denominan al patrón de IFI correspondiente a estas
especificidades menos frecuentes como patrón X-ANCA o ANCA atípico.
Todos estos antígenos son enzimas lisosómicas y, por tanto, de localización citoplas
mática, sin embargo, cuando se utiliza el alcohol como medio de fijación del sustrato
con el que se analizan los ANCA (polimorfonucleares), aparecen unos poros en la
pared lisosómica que permiten la salida y el desplazamiento de las enzimas con carga
eléctrica más positiva hacia el núcleo que está cargado negativamente. Ello explica el
patrón perinuclear en la IFI que identifica antígenos que normalmente están localizados
en el citoplasma, como MPO. Sin embargo, el PR3 permanece en el citoplasma. Así, la
fijación con etanol perm ite hacer un prim er escrutinio de las especificidades ANCA
más frecuentes (MPO y PR3), que deberá confirmarse p o r técnicas más específicas
como el ELISA.
Este fenóm eno artefactual en la fijación de los polimorfonucleares no aparece si
utilizamos formalina en lugar de alcohol en el proceso de fijación celular de los por
taobjetos. En este caso, la inmunofluorescencia daría siempre un patrón citoplásmico. El
método de la IFI es cualitativo o semicuantitativo, y es necesaria cierta experiencia para
la interpretación correcta de los resultados. Las técnicas cuantitativas incluyen el enzi-
moinmunoensayo (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) utilizando extractos crudos
celulares o antígenos purificados en la sensibilización de las placas. No existe una total
concordancia entre el IFI y las técnicas de ELISA, por lo que se acepta internacionalmente
que la determinación de ANCA en un suero problema debe incluir ambas técnicas ya que
de este modo se obtiene la máxima especificidad y sensibilidad.
Purificación de neutrófilos
M aterial
• Portaobjetos esmerilados de base mate.
• Tubos cónicos de poliestireno (20 mi).
• Centrífuga.
• Citocentrífuga Shandon.
Reactivos
• Dextrano T-2000. Pharmacia Biotech.
• Albúmina humana, fracción V, HSA, Sigma, Cod. A -1653.
• Solución búfer fosfato (PBS). Biomerieux, Cod. 75511.
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• Heparina sódica al 1%. Rovi.

• Etanol absoluto. Panreac.
Métodos
Preparación de los reactivos
• 60 mi de dextrano.
• 3 g de dextrano T-2000 + 60 m i de PBS.
• Agitación magnética.
• 100 mi de PBS-HSA al 1%.
• 1 g de albúmina humana.
• Se enrasa a 100 mi con PBS.
• Se conserva a 4 °C, preservado de la luz.
Técnica
1. Se preparan 5 mi de heparina en un tubo de perfusión.
2. Se añaden 10 mi de sangre.
3. Se mezcla la sangre con la heparina por inversión.
4. Se prepara un tubo de perfusión con 2 mi de dextrano.
5. Se mezclan 10 mi de sangre con el dextrano. Muy suavemente se deja que la
sangre resbale sobre la pared del tubo hasta llegar a la solución de dextrano.
6. Se pasa este volumen a un nuevo tubo cónico, y se deja resbalar sobre la superficie
del tubo para evitar que pasen o se hagan burbujas de aire.
7. Se incuba en posición vertical durante 45 min.
8. Con pipeta Pasteur se recoge el sobrenadante. Se hace muy despacio, girando la
pipeta por las paredes de los tubos. Se reparte el volumen entre dos tubos.
9. Se centrifuga a 200 g,1durante 10 m in a temperatura ambiente.
10. Se descarta el sobrenadante. Se lava el pellet tres veces con 10 mi de PBS-HSA al
1% (centrífuga a 200 g, 10 min, temperatura ambiente y resuspensión con pipeta
Pasteur). La última resuspensión se pasa a un solo tubo.
11. Se resuspende el pellet en PBS-HSA al 1% hasta obtener una suspensión celular
de 106 cél/cm3 (aprox. 10 mi).
12. Se prepara la citocentrífuga y los cubres.
13. Se marcan los portaobjetos con un punto en la parte superior derecha.
14. Se coloca el filtro sobre el portaobjetos con la cara lisa mirando hacia arriba.
15. Se m ontan los portas en la citocentrífuga.
16. Se citocentrifugan 150 (xl (aprox. dos gotas) de suspensión, 3 min a 300 r.p.m.
(LOAD 1).
17. Se dejan secar a temperatura ambiente.
18. Se fijan las preparaciones en EtOH frío (4 °C) durante 5 min.
19. Se dejan secar a temperatura ambiente
20. Se conservan las preparaciones a -2 0 °C.
Nota: Como puede observarse del protocolo anterior, la realización de los portaob
jetos es compleja y requiere de personal muy experimentado. Además, una fijación no
completa puede dar lugar a problemas artefactuales y errores en la interpretación de los
resultados. En los últimos años se han comercializado portaobjetos por diversas casas
comerciales con gran calidad técnica, por lo que, si es posible, se recomienda utilizarlos.
200 g equivalen a 1.500 r.p.m. en la centrífuga IEC-CENTRA 7R.
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Determinación de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilo

por inmunofluorescencia indirecta
1. En el proceso de la IFI deben incluirse tantas preparaciones como sueros problema
queramos investigar, y siempre se añaden dos preparaciones extras para el control
positivo y el control negativo (suero hum ano normal). Los sueros problema y
los controles se emplearán diluidos 1/20 en PBS, pH = 7,4, y se aplicará una gota
de las correspondientes diluciones sobre los botones celulares señalados con un
círculo.
2. Se dejan incubar las preparaciones durante 30 min a tem peratura ambiente en
cámara húmeda procurando que nunca se lleguen a secar.
3. Se colocan todas las preparaciones en cámaras de lavados, las cuales se habrán
llenado previamente con PBS. Se espera 10 m in para que el suero que no se haya
pegado a las células de modo específico se diluya en el líquido de lavado.
4. Se repite el proceso durante otros 10 m in en PBS fresco.
5. Después de este segundo lavado, se procede a secar el PBS de las preparaciones
respetando la zona marcada con el círculo y se deja una pequeña cantidad de PBS
en él para que las células no se sequen.
6. Se añade a cada preparación una gota de anticuerpo de conejo (fracción IgG)
antig-IgG hum ana marcada con isotiocianato de fluoresceína, a una dilución
previamente establecida según el reactivo comercial que se utilice, en PBS.
7. Se dejan incubar las preparaciones 30 min a tem peratura ambiente en cámara
húmeda procurando que nunca se lleguen a secar.
8. Se repiten los lavados.
9. Se aplica una gota de una mezcla 2/1 de glicerol/PBS a cada botón celular y se
cubre la preparación con u n cubreobjetos.
10. Las preparaciones deben leerse inmediatamente en un microscopio de fluores
cencia o conservarse a 4 °C fuera del alcance de la luz a la espera de ser leídas.
Soluciones de trabajo
• Dextrano/metrizoato.
• 24,7 mi de agua destilada.
• 89,4 mi de dextrano T-500 al 6% (Pharmacia, Uppsala, Suecia).
• 20 m i de metrizoato sódico 75% w/v (Nycomed, Oslo, Noruega).
• PBS, pH = 7,4.
• 8 g de NaCl.
• 200 mg de KC1.
• l,44deNa2H P 04:H20.
• 200 mg de KH2P 0 4.
• H 20 destilada hasta 1.000 mi.
• PBS/albúmina 1% w/v. Se añade albúmina humana a u n determinado volumen de
PBS en la proporción de un 1%.
• Etanol al 99%.
• Mezcla de glicerol/PBS. Se añade glicerol a una cantidad determinada de PBS para
conseguir una mezcla final del 66%.

Los botones celulares que se emplean contienen abundantes leucocitos polimorfonu-
cleares, eritrocitos, eosinófilos y linfocitos, células que deben ser claramente distinguibles.
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FIGU RA 21-7. Patrón citoplásmico

de anticuerpos anticitoplasma de
neutrófilo (c-ANCA).
Patrón citoplásmico: c-ANCA

El patrón citoplásmico o c-ANCA se describe como una fluorescencia granular fina
distribuida por todo el citoplasma celular, algo más intensa cerca del núcleo que en la
periferia (fig. 21-7). Los monocitos pueden ser positivos pero m ostrando un patrón
menos granular. Los eosinófilos y los linfocitos deben ser negativos. Los eosinófilos
pueden presentar una autofluorescencia amarronada, pero en caso de m ostrar fluores
cencia verde se debe a la fijación inespecífica de la inmunoglobulina conjugada a las
proteínas catiónicas de los gránulos eosinófilos.
En caso de observarse una fijación citoplasmática de granulo grueso, ello puede ser
debido a la fijación de agregados de inmunoglobulina fluoresceinada a través del receptor
GFc del neutrófilo. En tal caso la utilización de una fracción Fab fluoresceinada evita esta
fijación inespecífica. También puede observarse una fijación citoplasmática/perinuclear
de poca intensidad en caso de que el suero problema sea portador de complejos inmunes
circulantes, los cuales también se fijarán al receptor Fe del neutrófilo.
Patrón perinuclear: p-ANCA

El patrón perinuclear o p-ANCA se describe como una fluorescencia localizada alrededor
del núcleo celular del neutrófilo o, en ocasiones, tiñendo la superficie nuclear con un
refuerzo perinuclear (fig. 21-8). Algunos monocitos pueden m ostrar este patrón, pero
FIGU RA 21-8. Patrón perinuclear

de anticuerpos anticitoplasma de
neutrófilo (p-ANCA).
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la mayoría de eosinófilos y linfocitos deberían ser negativos. Este patrón es un artefacto

producto del proceso de fijación celular con etanol. Esta sustancia elimina la mayoría de
los lípidos de las membranas, de modo que las moléculas que estaban en el interior de los
lisosomas pueden desplazarse libremente por el interior de la célula o incluso ponerse
en contacto con estructuras celulares vecinas. Las moléculas catiónicas lisosómicas tales
como MPO, lisozima, elastasa, catepsina G y lactoferrina se desplazan hacia el núcleo
celular que posee una carga m uy electronegativa.
Las preparaciones obtenidas con el m étodo descrito, así como en la mayoría de
preparaciones comerciales son muy útiles para descartar la presencia de ANA, ya que en
tal caso la fluorescencia nuclear no se limitará a los polimorfonucleares sino que también
estará presente en neutrófilos y linfocitos.
Clínicamente, los ANCA parecen identificar a diversos trastornos según la especifi
cidad antigénica que presenten, resultando por lo tanto elementos útiles desde el punto
de vista diagnóstico.
El c-ANCA, que corresponde a un anticuerpo que identifica a la PR3, es caracterís
tico de la enfermedad de Wegener. Si el Wegener es difuso, es decir, se caracteriza por la
tríada de inflamación granulomatosa del tracto respiratorio alto, vasculitis sistémica y
glomerulonefritis necrotizante con proliferación epitelial, el c-ANCA está presente en
más del 90% de los pacientes. En pacientes afectos del llamado Wegener limitado, es
decir, aquellos que cursan sin afectación renal, el c-ANCA está presente en el 67-86%
de los casos. En c-ANCA puede estar presente en algunos casos de glomerulonefritis
necrotizante con proliferación epitelial e inmunofluorescencia negativa (pauci inmune)
en combinación o no con vasculitis de vaso pequeño y en ausencia de lesión granulo-
matosa. Esos casos etiquetados hasta ahora de poliarteritis microscópica pueden ser
considerados probablemente como pacientes afectos de enfermedad de Wegener con
expresión exclusivamente renal. El p-ANCA corresponde mayoritariamente al anticuerpo
que identifica la MPO y está asociado en un 94-99% a la poliangeítis microscópica. Este
es un térm ino internacionalmente aceptado que engloba a la poliarteritis microscópica
con afectación de las arterias de tam año pequeño, la glomerulonefritis rápidamente
progresiva inmunonegativa tipo III con necrosis glomerular y proliferación extracapilar
considerada hoy en día como una forma de vasculitis con expresión exclusivamente
renal y la capilaritis pulm onar hemorrágica, la cual puede presentarse asociada a la
glomerulonefritis rápidamente progresiva tipo III y formar el denominado síndrome
renopulmonar o en forma de capilaritis pulm onar hemorrágica aislada.
El p-ANCA con especificidad para la M PO puede estar presente en hasta un 30%
de los casos de enfermedad por anticuerpos antim em brana basal glomerular o en el
síndrom e de G oodpasture si existe hem orragia pulmonar. También se han descrito
p-ANCA con especificidad para la MPO y la lactoferrina en casos de LES y p-ANCA con
especificidad para la lactoferrina en un porcentaje importante de artritis reumatoide que
cursan con fenómenos de vasculitis sistémica (VS). Por último, se han descrito p-ANCA
con especificidad antigénica poco definida en la enfermedad inflamatoria intestinal tipo
colitis ulcerosa y en la enfermedad hepática autoinmune.
La poliarteritis nudosa clásica es una patología de grandes vasos que cursa con mi-
croaneurismas arteriales y con ausencia de afectación renal en el capilar glomerular, si bien
es frecuente la afectación de otros territorios como el sistema musculoesquelético, la piel
o los nervios periféricos entre otros. En estos casos, los ANCA acostumbran a ser negativos
así como en otras patologías de grandes vasos como son la arteritis de Horton o la arteritis
de Takayasu. En la arteritis asociada a asma y eosinofilia denominada de Churg-Strauss,
la incidencia de ANCA positivo es variable, y oscila entre el 30 y el 70% según los autores.
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Anticuerpos antigranulocitarios (AGA)

La neutropenia autoinm une (NAI) ocurre p o r la presencia de autoanticuerpos diri
gidos contra la m em brana de los granulocitos neutrófilos. Es la causa más com ún de
neutropenia crónica en niños, aunque también se observa en adultos. La destrucción
de los granulocitos puede tener lugar en la circulación periférica, así como interferir
en la granulopoyesis situada en la m édula ósea. El hem ogram a m uestra una neu
tropenia absoluta, que oscila desde cero neutrófilos hasta cifras casi en el rango de la
normalidad.
La técnica básica para el estudio de autoanticuerpos antigranulocitarios es el test de
inmunofluorescencia de granulocitos (GIFT), que permite la detección de anticuerpos
de diferentes clases y con distintas propiedades. Se investiga la presencia de inm uno-
globulinas fijadas a los granulocitos, utilizando antiglobulina humana (ATG) marcada
con un fluorocromo (prueba directa), así como la presencia de autoanticuerpos libres
en el suero del paciente (prueba indirecta). La técnica de GIFT es un método cualitativo
o semicuantitativo, en el que se valora la intensidad de la fluorescencia observada en
la superficie de los granulocitos, ya sea m ediante lectura en microscopio de fluores
cencia o mediante citometría de flujo. Hay que subrayar que los granulocitos presentan
receptores para el fragmento Fe de las inmunoglobulinas. Por este motivo, para evitar
la unión inespecífica de la ATG a su membrana, es preciso tratar los granulocitos con
paraform aldehído al 1%, que disminuye la afinidad de los receptores Fe, y utilizar
fragmentos F(ab')2de la ATG.
A diferencia de los eritrocitos, los granulocitos son células muy «frágiles», lo que
dificulta la investigación de AGA en el laboratorio. Tienen una vida media m uy corta,
se activan con facilidad y tienden a form ar agregados in vitro de forma espontánea.
Conviene realizar los estudios lo antes posible después de la extracción de la muestra,
que debe m antenerse preferiblemente a tem peratura ambiente (TA), y extremar las
precauciones al máximo en su manipulación en el laboratorio.
Técnica de inmunofluorescencia de granulocitos

Material
• Tubos.
• Pipetas Pasteur de vidrio.
• Pipetas automáticas y puntas.
• Centrífugas (tubos/microplacas).
• Baño de agua de temperatura controlada.
• Microplacas de fondo en U.
• Tapas de microplaca de un solo uso.
• Papel secante (celulosa).
• Portaobjetos de vidrio (26 X 76 mm) y cubreobjetos (24 X 40 mm).
• Microscopio de fluorescencia.
• Hielo picado.
Reactivos
• PBS.
• Albúmina al 22%.
• PBS-BSA al 0,2% BSA.
• PBS-BSA al 1% BSA.
• Ficoll-Paque o Lymphoprep.
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• Solución de N H 4C1 (pH = 7,3) (en 500 m i de agua destilada):

• N H 4C1,4,15 g.
• K H C 03, 0,5 g.
• Solución de paraformaldehído (PFA) al 1%.
• Solución madre al 4%: 4 g de PFA en 100 m i de PBS.
- Se calienta a 75 °C durante 5-10 min y se mezcla bien.
- Se añade OHNa 1 M (1-5 gotas), hasta que quede transparente.
- Se deja 1 h a 4 °C.
- Se deja 1 h a temperatura ambiente y se ajusta el pH a 7,3 (HC11 N).
- Se filtra con filtro Milipore.
- Se guarda en botella estéril, protegida de la luz, a 4 °C.
• Solución de trabajo al 1%: 1 vol. de PFA 4% más 3 vol. de PBS.
• Suero normal: suero de grupo AB de varón no transfundido.
• Antiglobulina marcada con FITC (polivalente, anti-IgG y anti-IgM ). Fragmentos
F(ab')2. Existen diferentes preparaciones comerciales con estas características.
• Glicerol-PBS: 3 vol. de glicerol por 1 vol. de PBS.
Preparación de la suspensión de granulocitos

1. Se extrae sangre en tubos de EDTA-K3de 10 mi. El volumen de sangre extraída
dependerá del grado de neutropenia del paciente. Habitualmente, se aconseja
extraer entre 40 y 60 mi.
2. Se centrifugan los tubos de EDTA a 300 g durante 7 min, a una temperatura de
22 °C.
3. Se aspira y se desecha el plasma rico en plaquetas, dejando la capa leucocitaria
y los hematíes.
4. Se sustituye el volumen de plasma desechado por PBS-BSA al 0,2% y se mezcla
bien.
5. En tubos cónicos de 50 mi, se flota cuidadosamente sobre Ficoll o Lymphoprep,
a una proporción de 2 vol. de m uestra por 1 vol. de Ficoll.
6. Se centrifuga a 400 g durante 20 min, a una temperatura de 22 °C, sin freno. Por
su tamaño y densidad, los granulocitos (GR) se separarán, encontrándose en la
capa inferior, junto a los hematíes.
7. Tras la centrifugación, se aspira el plasma, el anillo intermedio (capa de linfocitos/
células mononucleadas) y el Ficoll.
8. Se trata con cloruro amónico (NH4C1) con la finalidad de lisar los hematíes.
(a) Se añade solución de NH4C1 hasta un volumen total de 50 mi.
(b) Se incuba 5 min a 0 °C (hielo picado). Pasado este tiempo, se agita y, si los
hematíes no están lisados, se incuba 5 min más a 0 °C.
(c) Se centrifuga, para obtener el botón de GR, a 150 g durante 5 min, a 22 °C.
(d) Se decanta para eliminar el sobrenadante.
9. Se repite de nuevo el tratamiento con cloruro amónico, juntando todos los GR
en un único tubo de 50 mi.
10. Se pasa el botón de GR a un tubo de cristal de 10 m i y se hacen dos lavados con
PBS-BSA al 0,2%. Para cada lavado:
(a) Se añade 1 mi de PBS-BSA al 0,2%, se desagrega el botón de GR con una
pipeta Pasteur de vidrio y se acaba de llenar hasta 10 mi de PBS-BSA al 0,2%.
(b) Se centrifuga para obtener el botón de GR.
(c) Se decanta el sobrenadante.
11. Se procede al tratamiento de los GR con paraformaldehído al 1%.
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Tratamiento de los granulocitos con paraformaldehído

1. Se resuspende el b o tó n de GR con 1 mi de PFA al 1% (puede añadirse más
volumen, en función de la cantidad de granulocitos obtenida) y se incuba durante
6 min a TA.
2. Una vez acabada la incubación, se llena el tubo con PBS-BSA al 0,2%.
3. Se centrifuga para obtener el botón de GR.
4. Se decanta el sobrenadante.
5. Se realiza un nuevo lavado con PBS-BSA al 0,2%.
6. Se prepara la suspensión de trabajo añadiendo al botón de GR pequeños volú
menes de PBS-BSA al 0,2%, hasta conseguir una concentración aproximada de
10.000 células/mm3.
Desarrollo de la técnica del test de inmunofluorescencia de granulocitos

en microplaca
Prueba directa
Se enfrentarán los GR a las distintas antiglobulinas (ATG) que se desee testar. Se utilizarán
siempre preparados del tipo F(ab')2, para evitar la unión inespecífica de la ATG a los
receptores Fe de los granulocitos. Habitualmente, se utilizan tres tipos de ATG humana,
un reactivo polivalente y reactivos monoespecíficos anti-IgG y anti-IgM, todas ellas conju
gadas con FITC. Se utilizarán, en cada caso, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Los pasos de la prueba directa en microplaca serán:
1. La microplaca de fondo en U debe preincubarse un mínimo de 3 h con PBS-BSA
al 1%. Para ello, se dispensan en los pocilios necesarios 200 |xl de PBS-BSA al 1%,
se tapan y se mantiene a TA hasta su utilización. Se utilizarán en todo el proceso
tapas de un solo uso.
2. Se decanta la microplaca y se ponen 20 |xl de la suspensión de trabajo de GR del
paciente por pocilio. Se tapa y se centrifuga la placa a 100 g durante 5 min, a 22 °C.
Se decanta y se resuspende el botón de GR agitando con suavidad la placa.
3. Se añaden 20 |xl de los diferentes reactivos ATG a los correspondientes pocilios,
a la dilución recomendada por el fabricante.
4. Se tapa la placa y se incuba 30 min a TA, a oscuras.
5. Se lava dos veces con PBS-BSA al 0,2%.
(a) Se añaden 180 |xl de PBS-BSA al 0,2% a cada pocilio.
(b) Se tapa y se centrifuga la placa a 100 g durante 5 min, a 22 °C.
(c) Se decanta y se seca la placa (sobre papel de celulosa).
(d) Se resuspende el botón de GR agitando con suavidad la placa. No se utiliza
Mixer.
6. Si la lectura se realiza por microscopía:
(a) Se añaden a cada pocilio 20 |xl de glicerol-PBS (3:1) y se resuspende el botón
de GR agitando con suavidad la placa.
(b) Se trasvasa la suspensión celular a portaobjetos, previamente rotulados, se cubren
y se guardan a 4 °C, a oscuras, hasta el momento de la lectura (mínimo 1 h).
(c) La lectura se hace con un microscopio de fluorescencia, con un objetivo ( X60)
de inmersión en agua destilada.
7. Si la lectura se realiza por citometría: se añaden a cada pocilio 200 |xl de PBS-BSA
0,2%, se resuspende agitando suavemente con la pipeta y se trasvasa el contenido a
tubos de citometría, previamente rotulados. Se adquieren las muestras y se procede
al análisis según las condiciones de cada citómetro.
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Prueba indirecta
El objetivo de la prueba indirecta es la detección de anticuerpos libres en el suero de los
pacientes. Los pasos finales serán los mismos que en la prueba directa, pero con una
incubación inicial del suero problema frente a GR de un donante sano. Procesaremos,
en paralelo, un control positivo (C + ) y un control negativo (C -). Como C+ se utiliza
un suero con Acs anti-HLA pluriespecíficos (pool de sueros) y como C - u n suero
AB de donante varón no transfundido. Una vez incubados los sueros con los GR del
donante, y después de lavar, se realizará la segunda incubación utilizando los mismos
reactivos ATG que en la prueba directa (polivalente, anti-IgG y anti-IgM). Es preciso
también, como control, m ontar una prueba directa de los GR del donante utilizado.
Los pasos de la prueba indirecta en microplaca serán:
1. La microplaca de fondo en U se debe preincubar un mínimo de 3 h con PBS-BSA
al 1%. Para ello, se dispensan en los pocilios necesarios 200 |xl de PBS-BSA al 1%,
se tapa y se mantiene a TA hasta su utilización.
2. Se decanta la microplaca y se ponen 20 |xl de la suspensión de trabajo de GR
control por pocilio.
3. Se añaden 20 |xl de los sueros (sueros problema, C+ y C -) a los correspondientes
pocilios, agitando suavemente con la pipeta.
4. Se tapa la placa y se incuba 30 m in a TA. Se utilizaran en todo el proceso tapas de
un solo uso.
5. Se realizan tres lavados con PBS-BSA al 0,2%, según se indica en el punto 5 de la
prueba directa.
6. Después del tercer lavado, se continúa el protocolo con la incubación de los
reactivos ATG, siguiendo los mismos pasos que en la prueba directa. Se sigue el
protocolo descrito, a partir del punto 3.
Si se realizan conjuntamente la prueba directa y la indirecta, puede utilizarse una única
microplaca, empezando primero con las incubaciones de la prueba indirecta, y se añaden
las muestras de la prueba directa antes de la centrifugación que sigue al tercer lavado. En
la figura 21-9 se propone como ejemplo un esquema de trabajo para el desarrollo de la
técnica de GIFT en microplaca.

El resultado será concluyente cuando se observe positivo en el C+ y negativo en el C —.
Asimismo, la prueba directa del donante usado para la prueba indirecta debe ser negativa.
Un resultado positivo, invalidaría resultados positivos en los sueros problema.
Se valora por la presencia o no de un halo de fluorescencia en la membrana de los
granulocitos. La intensidad del resultado es muy variable. En la lectura por microscopía, el
grado de positividad observada se califica como positivo débil (+), +, ++, ++ + y ++++.
La lectura de un resultado positivo intenso se realiza sin dificultad. La interpretación
de resultados positivos débiles requiere más experiencia. La lectura mediante citome
tría se basa en analizar la intensidad de la fluorescencia de los granulocitos, posibilita
el cálculo de la ratio respecto al C - y perm ite analizar simultáneamente la viabilidad
celular. El análisis debe realizarse sobre una población celular bien definida, teniendo
en consideración el tam año y la complejidad celular de los granulocitos (FSC/SSC) y
su viabilidad. La interpretación del resultado requiere que cada laboratorio establezca
sus niveles de referencia.
En los pacientes afectos de NAI, niños o adultos, se observa una prueba directa
positiva, ya sea por IgG, por IgM o por ambas clases de Ig, indicativa de la presencia de
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P ru eba in directa
| GR donante sano]
i % i Isa.
S § § s s g
9 10 11 12
G R paciente / / Su ero ...
G R paciente .
/ / Suero ...
/ / / / / / / /
G R de donante o H LA (C+)
sano (utilizado er / /
la prueba indirec o A B (C-)
/ / / / /
/ / / /
FIGU RA 21-9. Esquema de trabajo en la investigación de anticuerpos antigranulocitarios.
autoanticuerpos fijados a los granulocitos. Pueden detectarse también, en cerca de un

10% de estos pacientes, autoanticuerpos libres en el suero, ya sea de tipo IgG, IgM o
ambos (prueba indirecta positiva). Un resultado positivo en la prueba indirecta junto con
una prueba directa negativa excluye que se trate de autoanticuerpos, y es muy sugestivo
de la presencia de Acs anti-HLA de clase I en el suero problema.
Existen otras situaciones clínicas, como la neutropenia neonatal aloinmune (NNA)
o algunas reacciones transfusionales, producidas por aloanticuerpos dirigidos frente a
antígenos presentes en los granulocitos (human neutrophil antigens, HNA). Se han des
crito cinco sistemas HNA. Como consecuencia de un estímulo antigénico, ya sea por una
gestación o por transfusiones sanguíneas, pueden desarrollarse anticuerpos anti-HNA de
diferentes especificidades. La técnica de GIFT, mediante la prueba indirecta, permite la
investigación de aloanticuerpos anti-HNA en pacientes afectos de algún proceso aloin
mune de granulocitos. Para ello, se requiere un panel de donantes tipificados, de los que se
ha estudiado el fenotipo/genotipo granulocitario. Los resultados obtenidos al enfrentar el
suero problema a un panel de granulocitos de distinto fenotipo permitirá la identificación
de la especificidad presente en el suero. Los aloanticuerpos más comúnmente descritos en
casos de NNA son los de especificidad HNA-la. En las reacciones transfusionales de tipo
lesión pulm onar aguda asociada a la transfusión (LPA-AT) los anticuerpos anti-HNA
que se han descrito con más frecuencia son los de especificidad HNA-3a. La investigación
de aloanticuerpos anti-HNA requiere la aplicación de otras técnicas complementarias al
GIFT, como la granuloaglutinación (GAT) y la técnica monoclonal antibody immobili
zation o f granulocyte antigens (MAIGA). Estas técnicas son realizadas por laboratorios
de inmunohematología especializados en serología granulocitaria.
DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTIPLAQUETARIOS

Esta determ inación se solicita principalm ente ante la sospecha de autoanticuerpos
antiplaquetarios, en pacientes con trombocitopenia. Asimismo, se investigan también
anticuerpos antiplaquetarios en el contexto de procesos aloinmunes de plaquetas. En
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estos casos, se investiga la presencia en el suero del paciente de aloanticuerpos específicos

frente a antígenos plaquetarios {human platelet antigens, HPA).
La púrpura trombocitopénica autoinmune (PTAI) ocurre por la presencia de autoan
ticuerpos dirigidos contra la m embrana plaquetaria. Los síntomas y signos dependen
de la gravedad de la trom bocitopenia, que es variable, aunque lo más frecuente es
la diátesis mucocutánea. La PTAI puede ser secundaria, cuando aparece asociada a
patologías autoinmunes (lupus eritematoso, síndrome antifosfolípido, etc.), síndromes
linfoproliferativos, infecciones o ciertos medicamentos, o ser idiopática o primaria. Los
pacientes desarrollan autoanticuerpos, en general IgG, que se unen a las plaquetas, lo que
conlleva su fagocitosis por los macrófagos, predominantemente en el bazo y el hígado.
Estos autoanticuerpos van dirigidos frente a una o múltiples glicoproteínas plaquetarias,
presentes también en la superficie de los megacariocitos, por lo que pueden afectar tam
bién la producción de plaquetas en médula ósea. Ante un paciente con trombocitopenia
aislada, sin otros problemas hematológicos, el estudio de anticuerpos antiplaquetarios
puede confirmar la sospecha de la posible etiología autoinmune.
La técnica básica para el estudio de autoanticuerpos antiplaquetarios es la inmuno-
fluorescencia (IF), fundamentada en la utilización de reactivos ATG marcados con fluo
rescencia. La IF permite investigar la clase de inmunoglobulina implicada en la PTAI
(IgG, IgM y/o IgA). Para evitar resultados inespecíficos, por la presencia en la membrana
plaquetaria de receptores Fe, deben tratarse las plaquetas con PFA. El PFA bloquea estos
receptores, lo que impide la unión inespecífica de inmunoglobulinas IgG, agregados o
complejos inmunes, inhibe la agregación de las plaquetas y produce un aumento de su
tamaño, lo que facilita su visión en el microscopio. La técnica de IF es un método semi-
cuantitativo, en el que se valora la intensidad de la fluorescencia observada en la superficie
de las plaquetas, ya sea mediante lectura en microscopio de fluorescencia o mediante
citometría de flujo. Se investiga la presencia de inmunoglobulinas fijadas a las plaquetas
(prueba directa), así como la presencia de anticuerpos antiplaquetarios libres en el
suero del paciente (prueba indirecta). Cuando se observa una prueba directa positiva,
se completa el estudio examinando el eluido obtenido de las plaquetas del paciente. Un
resultado positivo en el estudio del eluido permite confirmar que las inmunoglobulinas
detectadas en la prueba directa corresponden a verdaderos autoanticuerpos.
La técnica de IF de plaquetas, mediante la prueba indirecta, se emplea también en
la investigación de aloanticuerpos antiplaquetarios específicos (anti-HPA) en pacientes
afectos de algún proceso aloinmune, como la trombocitopenia fetal-neonatal aloinmune
(TFNA), la púrpura postransfusional o la refractariedad a las transfusiones de plaquetas.
Para ello, se requiere un panel de donantes tipificados, de los que se ha estudiado el
fenotipo/genotipo plaquetario. Los resultados obtenidos al enfrentar el suero problema
al panel de plaquetas permitirán la identificación de la especificidad presente en el suero.
Los aloanticuerpos más com únm ente descritos en la TFNA son los de especificidad
anti-H PA -la. En la investigación de aloanticuerpos anti-HPA se emplean, de forma
complementaria a la IF, otras técnicas. Las más utilizadas son ensayos de tipo ELISA, de
los que existen varios productos comerciales, y la técnica de monoclonal antibody im
mobilization o f platelet antigens (MAIPA). Estas técnicas son realizadas por laboratorios
de inmunohematología especializados en serología plaquetaria.
Técnica de inm unofluorescencia de plaquetas
Material
• Tubos.
• Pipetas Pasteur de vidrio.
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• Pipetas automáticas y puntas.

• Centrífugas (tubos/microplacas).
• Baño de agua de temperatura controlada.
• Microplacas de fondo en U.
• Tapas de microplaca de un solo uso.
• Papel secante (celulosa).
• Portaobjetos de vidrio y cubreobjetos.
• Microscopio de fluorescencia.
• Hielo picado.
Reactivos
• PBS.
• PBS-EDTA: EDTA-Na2: 3,35 g/1.000 mi de PBS.
• Albúmina al 22%.
• PBS-EDTA-BSA al 0,2%.
• Solución de N H 4C1 (pH = 7,3) (en 500 m i de agua destilada):
• N H 4C1,4,15 g.
• K H C 03, 0,5 g.
• 0,5 mi de EDTA-Na2 al 0,1 M.
• Solución de PFA al 1%.
• Solución madre al 4%: 4 g de PFA en 100 mi de PBS.
- Se calienta a 75 °C durante 5-10 min y se mezcla bien.
- Se añade OHNa 1 M (1-5 gotas), hasta que quede transparente.
- Se deja 1 h a 4 °C.
- Se deja 1 h a temperatura ambiente y se ajusta el pH a 7,3 (HCI 1 N).
- Se filtra con filtro Milipore.
- Se guarda en botella estéril, protegida de la luz, a 4 °C.
• Solución de trabajo al 1% (1 vol. PFA 4% + 3 vol. PBS).
• Solución cloroformo-tricloroetileno vol./vol.
• Suero normal: suero AB de varón no transfundido.
• Antiglobulina marcada con FITC (polivalente, IgG, IgM, IgA). Se prepara y se con
serva según las instrucciones del fabricante.
• Glicerol-PBS: 3 vol. de glicerol por 1 vol. de PBS.
Preparación de la suspensión de plaquetas

Paso 1. Se procede a la extracción de sangre en tubos de 10 m i de EDTA-K3. El volumen
de sangre extraída dependerá del grado de trom bocitopenia del paciente. A m odo
orientativo, se recomienda:
P laquetas x 109/1 V olum en de sangre necesario

<10-20 60 mi
21-50 50 mi
51-100 40 mi
En pacientes pediátricos, se extrae el volumen de EDTA que sea posible en función de

la edad. En niños pequeños, con trombocitopenia muy severa, es difícil obtener plaquetas
suficientes para realizar la prueba directa.
Paso 2. Se obtiene del plasma rico en plaquetas (PRP): se centrifugan los tubos de
EDTA a 300 g durante 7 min, a 22 °C, sin freno.
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Paso 3. Se obtiene el botón de plaquetas (PLQ): se centrifuga el PRP a 1.600 g, 7 min,

a 22 °C, con freno, y se aspira el plasma sobrenadante.
Paso 4. Se realizan tres lavados con la solución PBS-EDTA-BSA al 0,2%. Para cada
lavado:
1. Se añade 1 mi de solución, se desagrega el botón de PLQ con una pipeta Pasteur
de vidrio, y se llena después el tubo con la solución de lavado.
2. Se centrifuga para obtener el botón de PLQ (como en el punto 3)
3. Se decanta el sobrenadante.
Paso 5. Se separan las plaquetas en dos fracciones, una destinada a la prueba directa
que deberá de tratarse con PFA y otra, para efectuar un eluido. Cuando se obtienen muy
pocas plaquetas, no será posible realizar el eluido y se procesarán todas para realizar la
prueba directa.
Paso 6. Tratamiento con PFA:
1. Se añaden al botón de PLQ 2 mi de la solución de PFA al 1%, se resuspende el
botón y se deja reposar durante 6 m in a temperatura ambiente.
2. Se lava dos veces con la solución PBS-EDTA-BSA al 0,2%.
Paso 7. Después del segundo lavado, se aspira el sobrenadante y se prepara la sus
pensión de trabajo de PLQ.
Paso 8. Se prepara la suspensión de trabajo de PLAQ: se desagrega el botón añadiendo
poco a poco PBS-EDTA-BSA al 0,2%, hasta una concentración de plaquetas aproximada
de 500.000/mm3.
Preparación del eluido

Existen diversos métodos para eluir anticuerpos antiplaquetarios, pero el más habitual
por su sencillez y sensibilidad es el realizado tratando las plaquetas con cloroformo-tri-
cloroetileno. Se procederá a obtener el eluido en aquellos casos en que se haya observado
un resultado positivo en la prueba directa.
Elución por cloroformo-tricloroetileno

1. Se p rep ara u n a susp en sió n de PLQ a u n a c o n cen tració n aproxim ada de
2.000 X 1071.
2. Se añade el mismo volumen de cloroformo-tricloroetileno (vol./vol.), se tapa el
tubo y se agita vigorosamente 2 min.
3. Se incuba durante 10 min a 37 °C, agitando regularmente.
4. Se centrifuga a 1.800 g, 10 min, a 22 °C, con freno. Se forman tres capas, de las
que la capa superior corresponde al eluido.
5. Se recoge el eluido y se traspasa a un tubo de vidrio.
Desarrollo de la técnica de inmunofluorescencia de plaquetas en microplaca

P rueba directa
Se enfrentarán las plaquetas del paciente, tratadas con PFA, a las distintas ATG que se
desee testar. Habitualmente, se utilizan tres tipos de ATG humana, un reactivo polivalente
y reactivos monoespecíficos anti-IgG y anti-IgM, todas ellas conjugadas con FITC. Se
utilizarán, en cada caso, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Los pasos de la prueba directa en microplaca serán los siguientes:
1. Se dispensan 20 (jlI de la suspensión de trabajo de PLQ del paciente por pocilio.
2. Se centrifuga la microplaca a 200 g, 5 min. Se decanta el sobrenadante y se resus
pende el botón de PLQ (puede utilizarse un Mixer).
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3. Se añaden 20 |xl de cada una de las ATG (polivalente y monoespecífica) a sus

pocilios correspondientes.
4. Se tapa la placa y se incuba 30 min a temperatura ambiente, a oscuras.
5. Se realizan tres lavados con la solución de lavado PBS-EDTA-BSA al 0,2%. Para
ello:
(a) Se añaden 150 fxl de PBS-EDTA-BSA al 0,2% a cada pocilio.
(b) Se tapa y se centrifuga la placa a 200 g durante 5 min, a 22 °C.
(c) Se decanta y se seca la placa (sobre papel secante).
(d) Se resuspende el botón de PLQ (Mixer).
6. Si la lectura se realiza por microscopia:
(a) Se añaden a cada pocilio 20 |xl de glicerol-PBS (3:1) y se resuspende.
(b) Se trasvasa el contenido de cada pocilio a portaobjetos, previamente rotulados,
se cubren y se guardan a 4 °C, a oscuras, hasta el m om ento de la lectura
(mínimo 1 h).
(c) La lectura se hace con un microscopio de fluorescencia, con un objetivo ( X60)
de inmersión en agua destilada.
7. Si la lectura se realiza por citometría: se añaden a cada pocilio 200 |xl de PBS-
EDTA-BSA al 0,2%, se resuspenden agitando suavemente con la pipeta y se tras
vasa el contenido a tubos de citometría, previamente rotulados. Se adquieren las
muestras y se procede al análisis según las condiciones de cada citómetro.
Prueba indirecta
El objetivo de la prueba indirecta es la detección de autoanticuerpos libres en el suero de
los pacientes y en eluido. Los pasos finales serán los mismos que en la prueba directa, pero
con una incubación inicial de la muestra (eluido o suero) frente a plaquetas (PLQ) de un
donante sano, de grupo O para soslayar la incompatibilidad de grupo. Procesaremos, en
paralelo, un control negativo (C-) y un control positivo (C+). Como C —se utiliza un suero
AB de donante varón no transfundido, como C+ se utiliza un suero que contenga an
ticuerpos capaces de reaccionar con cualquier plaqueta, p o r ejemplo, anticuerpos
anti-HLA pluriespecíficos (pool de sueros) o anticuerpos anti-H PA -la, reactivos con
más del 97% de los donantes escogidos al azar. Una vez incubadas las muestras con las
PLQ del donante, y después de lavar, se realizará la segunda incubación utilizando los
mismos reactivos ATG que en la prueba directa (polivalente, anti-IgG y anti-IgM). Es
preciso también, como control, m ontar una prueba directa de las PLQ del donante que
se utilicen en la prueba indirecta.
Los pasos de la prueba indirecta en microplaca serán los siguientes:
1. Se dispensan 20 |xl de la suspensión de trabajo de PLAQ del donante por pocilio.
2. Se añaden 20 |xl de las muestras (eluidos y/o sueros problema) y de los controles
(C+ y C—) a los correspondientes pocilios, agitando suavemente con la pipeta.
3. Se tapa la placa y se incuba 30 min a TA.
4. Se realizan tres lavados con PBS-EDTA-BSA al 0,2%, según se indica en el punto
5 del apartado de la prueba directa.
5. Después del tercer lavado, se procederá a incubar con los diferentes reactivos
antiglobulina, siguiendo el mismo protocolo descrito en la prueba directa. Se
sigue el protocolo descrito a partir del punto 3.
Si se realizan conjuntam ente la prueba directa y la indirecta, puede utilizarse una
única microplaca: prim ero se empieza con las incubaciones de la prueba indirecta, y
después se añaden las muestras de la prueba directa, antes de la centrifugación que sigue
al tercer lavado.
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Prueba directa Prueba indirecta

PLQ donante sano
10 11 12
PLQ paciente............ A /
/ E lu id o ...
/ / Suero ...
/ /
PLQ de donante C / / / / /
san o (utilizado en
la prueba indirecta) D / / / / / Suero H LA (C+)
/ Suero A B (C-)
/ / / /
FIGU RA 21-10. Esquema de trabajo en la investigación de anticuerpos antiplaquetarios.
En la figura 21-10 se propone como ejemplo u n posible esquema de trabajo para el

desarrollo de la técnica de IF de plaquetas en microplaca en estudios de PTAI.

El resultado se valora por la presencia o no de un halo de fluorescencia en la membrana
de las plaquetas del paciente (prueba directa) o del donante sano (prueba indirecta).
La intensidad del resultado es m uy variable. En la lectura p o r microscopía, el grado
de positividad observada se califica como positivo débil (+), +, ++, + + + y ++ ++. La
lectura de un resultado positivo intenso se realiza sin dificultad. La interpretación de
resultados positivos débiles requiere más experiencia. La lectura mediante citometría se
basa en analizar la intensidad de la fluorescencia de las plaquetas, y permite el cálculo
de la ratio respecto al C -. El análisis debe realizarse sobre una población celular bien
definida, teniendo en consideración el tamaño y la complejidad celular de las plaquetas
(FSC/SSC). La interpretación del resultado requiere que cada laboratorio establezca sus
niveles de referencia.
Los resultados serán concluyentes cuando se observe un resultado positivo en el C+
y un resultado negativo en el C -. Asimismo, debe obtenerse u n resultado negativo en
la prueba directa del donante usado para la prueba indirecta. Un resultado positivo,
invalidaría resultados positivos en las muestras problema. Entre las causas que pueden
determinar u n falso negativo, destaca la inactivación de la antiglobulina. La inclusión
sistemática de un suero control positivo permite detectar esta anomalía. Un exceso de
plaquetas en relación con la cantidad de anticuerpos utilizados también puede causar
un falso negativo, por esta razón es m uy importante ajustar la suspensión de plaquetas
a la concentración de trabajo adecuada. Si no se respeta la compatibilidad ABO entre
el paciente y el donante utilizado, pueden obtenerse falsos positivos por la presencia de
las isohemaglutininas anti-A y/o anti-B del suero del paciente. Por ello, se aconseja usar
siempre un donante de grupo O.
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La investigación de autoanticuerpos plaquetarios se valora como positiva cuando la

prueba directa y el eluido son positivos. La presencia de un autoanticuerpo libre en el
suero es un dato complementario. Una prueba directa positiva con un eluido negativo
puede deberse a varias posibilidades: presencia de inmunoglobulinas inespecíficas o de
complejos inmune en la membrana plaquetaria del paciente (trombocitopenia inducida
por fármacos), o a autoanticuerpos de baja afinidad que se pierden durante el proceso
de elución.
Si se observa un resultado positivo en el suero (prueba indirecta) junto con una
prueba directa negativa, es esencial valorar el contexto clínico y la historia del paciente
para interpretar adecuadamente los resultados. En pacientes que han sido inmunizados
como resultado de transfusiones anteriores o de embarazos, en el caso de las mujeres, un
resultado positivo en el suero puede ser indicativo de la presencia de anticuerpos anti-
HLA de clase I (HLA-A y B) o bien de aloanticuerpos antiplaquetarios. En esta circuns
tancia, es aconsejable realizar los estudios complementarios que se precisen, según el caso.
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Capítulo 21 Métodos para el diagnóstico de las citopen ias inmunes 6 6 4 .e l
Autoevaluación
1. En la determinación del grupo sanguíneo ABO:
(a) Hay que incluir una prueba globular y una prueba sérica.
(b) La prueba globular puede realizarse en placa porque los antisueros son capaces de
producir aglutinación sin necesidad de centrifugación.
(c) El grupo inverso es más seguro cuando se realiza en tubo.
(d) Se efectúa preferentemente con una muestra de sangre total sin coagular previamente
centrifugada, para separar los hematíes del plasma.
(e) Todo lo anterior es cierto.
Respuesta razonada: efectivamente, todas las afirmaciones son ciertas, tal como se explica en el
apartado «Estudio básico del grupo ABO» del capítulo 21.
2. Una de las siguientes afirmaciones es falsa:
(a) Si los resultados de la prueba inversa no coinciden con los obtenidos con la prueba
directa, debe descartarse, ante todo, el error metodológico.
(b) Para la detección de anticuerpos irregulares se precisa suero problema y una sola muestra
de hematíes.
(c) Las enzimas proteolíticas reducen la carga negativa de la superficie de los hematíes dis
minuyendo la distancia entre ellos y favoreciendo la aglutinación.
(d) El test de Coombs fue descrito en 1945 por Coombs, M ourant y Race para detectar los
anticuerpos anti-Rh no aglutinantes o incompletos.
(e) La prueba directa de la antiglobulina o test de Coombs directo se realiza para saber si
los hematíes están recubiertos in vivo de anticuerpos antieritrocitarios.
Respuesta razonada: para la detección de anticuerpos irregulares se precisa suero problema y
entre dos y cuatro muestras de hematíes, seleccionados por su fenotipo eritrocitario y por tener
representados en su conjunto a los antígenos considerados clínicamente significativos.
3. Una de las siguientes aplicaciones del test de Coombs indirecto no es cierta:
(a) Se emplea para la detección e identificación de anticuerpos en las pruebas de compati
bilidad pretransfusional.
(b) Se emplea para la detección e identificación de anticuerpos en las mujeres gestantes.
(c) Se emplea para la investigación de anticuerpos de la madre contra hematíes del recién
nacido.
(d) Se emplea para la tipificación de antígenos eritrocitarios que no son visualizados por
aglutinación directa.
(e) Se emplea para la detección e identificación de anticuerpos en los donantes de sangre.
Respuesta razonada: para demostrar la presencia de anticuerpos maternos fijados a los hematíes
del recién nacido debe emplearse la técnica de Coombs directo sobre los hematíes del niño.
4. Una de las siguientes afirmaciones sobre las anemias hemolíticas autoinm unes (AHAI) por
anticuerpos calientes es falsa:
(a) La AHAI por anticuerpos calientes se denomina así porque la tem peratura óptim a de
reactividad del autoanticuerpo es de 37 °C.
(b) Es el tipo más com ún de AHAI, y constituye un 75-80% de los casos diagnosticados de
AHAI.
(c) La presentación de orinas oscuras, por hemoglobinuria o pigmentos biliares en orina,
es frecuente.
(d) En un pequeño porcentaje de casos (alrededor de un 3%) de las AHAI, el test de Coombs
directo puede resultar negativo.
(e) Se habla de AHAI secundaria cuando no supone u n problema grave para el paciente.
Respuesta razonada: se habla de AHAI secundaria cuando se presenta asociada a una patología en
la que se ha demostrado una mayor incidencia de AHAI, cuando el tratamiento de la enfermedad
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de base mejora la AHAI o cuando existe evidencia de que están relacionadas por una disfunción
inmunológica, en el contexto de autoinmunidad.
5. Una de las siguientes afirmaciones sobre las anemias hemolíticas autoinm unes (AHAI) por
anticuerpos fríos es falsa:
(a) Los autoanticuerpos son reactivos a tem peraturas bajas y, preferentemente, a 4 °C.
(b) El síndrome por aglutininas frías ocurre con mayor frecuencia en pacientes de 50 a 60
años de edad, siendo m uy excepcional en niños.
(c) Suele presentarse de form a idiopática, pero puede estar asociado a infecciones, en
particular por M ycoplasm a p neum oniae, y a mononucleosis infecciosa.
(d) Algunos pacientes desarrollan este cuadro asociado a LLC y a otros procesos linfo-
proliferativos.
(e) En los casos más típicos, el grado de anemia es independiente del grado de exposición
al frío.
Respuesta razonada: en los casos más típicos, el grado de anemia depende del grado de exposi
ción al frío. En general suele encontrarse una anemia leve o moderada, de forma crónica. Con
frecuencia, las muestras de sangre presentan autoaglutinación a tem peratura ambiente, lo que
dificulta la realización de la extensión de sangre y de los recuentos celulares. La autoaglutinación
se intensifica a 4 °C y revierte al calentar la m uestra a 37 °C.
6. En relación con las pruebas de compatibilidad y la transfusión en el paciente con AHAI, una
de las siguientes afirmaciones no es cierta:
(a) Es muy importante conocer si el paciente ha estado transfundido previamente, el número
de gestaciones, los antecedentes patológicos, los fármacos, etc.
(b) La tipificación del grupo ABO no suele resultar problemática.
(c) En más de un 80% de los pacientes con AHAI IgG, el autoanticuerpo se encuentra
libre en el suero, lo que determ ina que tanto el escrutinio como la identificación de
anticuerpos irregulares y las pruebas de compatibilidad resulten positivas.
(d) La técnica de elección para investigar la presencia de aloanticuerpos ocultos p o r el
autoanticuerpo es la dilución del suero del paciente (1:5).
(e) Respecto al sistema Rh, es importante realizar una tipificación lo más completa posible,
siempre que no existan transfusiones en los últimos 3 meses, de los antígenos D, C, c, E, y e.
Respuesta razonada: las técnicas de elección para investigar la presencia de aloanticuerpos ocultos
por el autoanticuerpo son las de adsorción: autoadsorción y adsorción alogénica o diferencial.
7. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre las técnicas de adsorción es correcta?
(a) La mejor técnica disponible para detectar un aloanticuerpo en presencia de un autoan
ticuerpo es la autoadsorción del suero del paciente a 37 °C frente a sus propios hematíes.
(b) La mayoría de autoanticuerpos poseen un título inferior a 16 en la técnica indirecta de
antiglobulina, de form a que 2-3 autoadsorciones resultan suficientes en la mayoría
de casos.
(c) La técnica de adsorción diferencial constituye la alternativa ideal a la autoadsorción
cuando el paciente ha sido transfundido recientemente.
(d) La desventaja potencial de la adsorción diferencial obedece a la posibilidad de que un
anticuerpo dirigido contra un antígeno de alta frecuencia pueda ser tam bién adsorbido.
(e) Todas las afirmaciones son correctas.
Respuesta razonada: todas las afirmaciones son correctas, tal como se expone en el capítulo 21.
8. En relación con la investigación de anticuerpos antineutrófilo una de las siguientes afirma
ciones no es correcta:
(a) La técnica básica para el estudio de autoanticuerpos antigranulocitarios es el test de
inmunofluorescencia de granulocitos (GIFT).
(b) La técnica de GIFT es un m étodo cualitativo o semicuantitativo, en el que se valora
la intensidad de la fluorescencia observada en la superficie de los granulocitos, ya sea
mediante lectura en microscopio de fluorescencia o mediante citometría de flujo.
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Capítulo 21 Métodos para el diagnóstico de las citopen ias inmunes 6 6 4 . e3
(c) Se investiga la presencia de inm unoglobulinas fijadas a los granulocitos, utilizando

antiglobulina hum ana (ATG) marcada con un fluorocromo (prueba directa), así como
la presencia de autoanticuerpos libres en el suero del paciente (prueba indirecta).
(d) Los receptores Fe para las inmunoglobulinas IgG no interfieren en la técnica.
(e) A diferencia de los eritrocitos, los granulocitos son células m uy frágiles, que tienen una
vida media muy corta, se activan con facilidad y tienden a form ar agregados in vitro de
forma espontánea.
Respuesta razonada: los granulocitos presentan receptores para el fragmento Fe de las inmuno-
globulinas. Por este motivo, para evitar la unión inespecífica de la ATG a su membrana, es preciso
tratar los granulocitos con paraformaldehído al 1%, que disminuye la afinidad de los receptores
Fe, y utilizar fragmentos F(ab’)2 de la ATG.
9. En relación con la investigación de anticuerpos antiplaquetarios una de las siguientes
afirmaciones no es correcta:
(a) Esta determ inación se solicita principalm ente ante la sospecha de autoanticuerpos
antiplaquetarios, en pacientes con trombopenia.
(b) La técnica básica para el estudio de anticuerpos antiplaquetarios es la inmunofluores
cencia (IF), fundam entada en la utilización de reactivos antiglobulina (ATG) marcados
con fluorescencia.
(c) Con esta técnica se investigan también anticuerpos antiplaquetarios en el contexto de
procesos aloinmunes de plaquetas.
(d) Cuando se observa una prueba directa positiva, se completa el estudio examinando el
eluido obtenido de las plaquetas del paciente.
(e) La presencia de autoanticuerpo libre en el suero es un dato fundamental para el diagnós
tico.
Respuesta razonada: la investigación de autoanticuerpos plaquetarios se valora como positiva
cuando la prueba directa y el eluido son positivos. La presencia de autoanticuerpo libre en el suero
es un dato complementario. Una prueba directa positiva con un eluido negativo puede deberse a
varias posibilidades: presencia de inmunoglobulinas inespecíficas o de complejos inmunes en la
membrana plaquetaria del paciente (trombopenia inducida por fármacos), o a autoanticuerpos
de baja afinidad que se pierden durante el proceso de elución.
10. Es falso que el test de Coombs directo nos permite realizar el diagnóstico en:
(a) La anemia hemolítica autoinm une (AHAI).
(b) La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN).
(c) Detección e identificación de anticuerpos antieritrocitarios en el suero/plasma de los
pacientes.
(d) La anemia hemolítica inducida por fármacos.
(e) La reacción hemolítica postransfusional.
Respuesta razonada: para la detección e identificación de anticuerpos antieritrocitarios se emplea
la técnica de Coombs indirecto.
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C A P Í T U L O 22
Hemostasia y trombosis. Conceptos básicos

J. F o n tcu b erta y M . Borrell
INTR O D U C C IÓ N
La hemostasia es el conjunto de reacciones que conducen a la formación de fibrina,
proteína insoluble que evita la pérdida de sangre cuando se lesiona u n vaso. En este
proceso intervienen la activación de las plaquetas, la formación del trom bo plaquetario,
la activación de la coagulación y el sistema fibrinolítico.
Asimismo, la hem ostasia tiene como principal objetivo m antener que la sangre
sea u n fluido. En ocasiones, se requiere que la sangre pase de un fluido a un sólido
y de nuevo a un fluido, pero solo en el sitio de rotura de u n vaso y en el m om ento
adecuado.
Según su función, las reacciones que se producen para que esto suceda se pueden
clasificar de la siguiente manera:
• Activación de las plaquetas y formación del trom bo plaquetario.
• Procoagulantes. Son las que conducen a la formación de la fibrina y así evitan la
pérdida de sangre.
• Anticoagulantes. Regulan o controlan la coagulación. También im piden que la
generación de factores activados, que se producen en un punto y que son necesarios
para evitar una hemorragia, se extienda y provoque una coagulación generalizada.
• Fibrinolíticas. Son las encargadas de eliminar la fibrina cuando ya no es necesaria
para evitar la pérdida de sangre, restableciendo el flujo sanguíneo.
Todas estas reacciones requieren una superficie fosfolípida cargada negativamente para
que la cascada de la coagulación se desarrolle y contribuya a la regulación del crecimiento
del trombo en el punto necesario donde se ha roto un vaso. Estas superficies fosfolípidas
cargadas negativamente se exponen en el lugar de rotura del vaso.
Uno de los mayores avances en la patogénesis de la trom bosis es el concepto de
que la hemostasia y la trom bosis son procesos localizados. La activación de la coa
gulación y el desarrollo del trom bo se producen en una zona endotelial deteriorada,
donde se expone el colágeno de la m atriz subendotelial y se expresa un receptor, el
factor tisular (FT), que inicia la activación de la coagulación al unirse al factor VII
activado.
La exposición del colágeno subendotelial implica que las plaquetas se unan a esta
m atriz subendotelial, se activen, se desgranulen y se agreguen form ando el prim er
tapón hemostático. Simultáneamente, la coagulación se activa en el punto de la lesión
endotelial, por exposición del FT, y el resultado de ello es la form ación de la fibrina
en este punto de lesión vascular y la estabilización del trom bo plaquetario inicial.
El antiguo concepto de la activación de la coagulación en forma de cascada por in
cremento de la concentración de distintas enzimas, con dos vías de iniciación (extrínseca
e intrínseca), en la actualidad está desechado. El mayor conocimiento del papel de cada

ERRNVPHGLFRVRUJ
factor de la coagulación y de las células implicadas en este proceso ha conducido al

concepto de coagulación basada en la interacción celular.
Este modelo representa más acertadamente la interacción de las distintas enzimas de la
coagulación con las membranas de determinadas células (plaquetas, células endoteliales,
monocitos, etc.) para generar trom bina y formar un trombo.
ACTIVACIÓN DE LAS PLAQUETAS Y FORMACIÓN DEL TAPÓN

PLAQUETARIO
E structura plaquetaria
Las plaquetas son fragmentos del citoplasma de los megacariocitos, de forma discoide
y con un tam año de 2-4 |xm. Son anucleadas y desempeñan un papel esencial en la
hemostasia y la fisiopatología de la aterotrombosis.
La m em brana de la plaqueta está form ada p o r u n a doble capa de fosfolípidos
que se extiende hacia el interior del citoplasma a través del sistema canalicular, donde
se conecta con el citosol. Después de su activación, las plaquetas cam bian su forma
discoide a u na form a esférica y emiten seudópodos para incrementar la superficie de
contacto.
La m embrana de la plaqueta está compuesta por una gran variedad de receptores de
transmembrana. Estos receptores pueden ser:
• Integrinas: a in>03 a 2Bj, a 5Bj, a 6Bj, a yP 3.
• Glucoproteínas (con dominios ricos en leucina): GPIb/IX/V y receptores Toll-like.
• Receptores de proteína G (GPCR): receptores de trom bina PAR-1 y PAR-4, P2Y1 y
P2Y12 receptores de ADP, T P a y TP3 receptores del tromboxano A2.
• Proteínas que provienen de la superfamilia de inmunoglobulinas: GPVI, FC7 RIIA.
• Receptores de lecitina tipo C: P-selectina.
• Receptores de tiroxina cinasa (receptor de trombopoyetina, GAS-6 ).
• Una miscelánea de otros tipos de receptores: CD63, CD36, ligando 1 de P-selectina,
receptor tipo TNF.
Muchos de estos receptores se encuentran en distintos tipos de células, pero otros son
específicos de las plaquetas y juegan un papel esencial en la hemostasia y la trombosis,
al establecer interacciones con otras plaquetas y con la célula endotelial.
En el citoesqueleto de la plaqueta se encuentra el sistema canalicular denso, algunas
m itocondrias, los gránulos de glucógeno, los gránulos densos ( 8 ) y los gránulos a .
Los gránulos a contienen abundantes proteínas, entre ellas: factor von W illebrand,
fibrinógeno, P-selectina, PECAM-1, CD4, factor 4 plaquetario, P-trom boglobulina,
trombospondina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor V y
glucoproteína GPIIb/IIIa. Los gránulos densos son ricos en nucleótidos (ADP, ATP),
serotonina y Ca++.
Después de la activación plaquetaria, el contenido de los gránulos se libera para
promover la adhesión de las plaquetas y su agregación en la zona alterada del endotelio
vascular (fig. 2 2 - 1 ).
Form ación del tapón hem ostático o trom bo plaquetario

La formación del tapón hemostático en el lugar de alteración del endotelio vascular
depende de la acción coordinada de los siguientes acontecimientos: 1 ) fijación de las
plaquetas en el endotelio alterado (fase de iniciación); 2 ) almacenamiento y activación de
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Capítulo 22 Hemostasia y trom bosis. Conceptos básicos 667
Corte longitudinal
FIGURA 22-1. Estructura general

de las plaquetas. GA, gránulos a;
GC, glucocálix; GD, gránulos densos;
GLU, glucógeno; Mit, mitocondrias;
MT, microtúbulos; SC, sistema
canicular abierto; STD, sistema
tubular denso.
las plaquetas (fase de extensión), y 3) estabilización del tapón plaquetario y prevención

de la desagregación (fase de estabilización) (fig. 2 2 - 2 ).
Fase de iniciación
La formación del trom bo inicial plaquetario está determinada por la interacción de las
plaquetas con los componentes de la matriz extracelular alterada del endotelio vascular,
fundam entalm ente p o r la exposición del factor von W illebrand (FvW), el colágeno,
la fibronectina, la trom bospondina y la laminina. Estas interacciones adhesivas están
muy influenciadas por las condiciones reológicas, ya que cuando se altera el endotelio,
rápidamente ocurre una vasoconstricción. A baja fuerza de cizallamiento, como la que
ocurre en las venas y grandes arterias, la adhesión de las plaquetas al endotelio vas
cular alterado se lleva a cabo p or el colágeno fibrilar, la fibronectina y la laminina.
A altas fuerzas de cizallamiento, como las que se producen en las pequeñas arterias, la
adhesión plaquetaria es dependiente de la unión al FvW. Es bien conocido que el com
plejo GPIb/IX/V es el receptor más importante de las plaquetas para su unión al FvW.
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FIGURA 22-2. Receptores y agonistas plaquetarios más relevantes. Puntos de acción de los principales
agentes antiagregantes plaquetarios.
Este complejo GPIb/IX/V también es capaz de unirse a otras proteínas adhesivas, como
la a-trom bina, y a los factores de la coagulación: quininógeno de alto peso molecular,
factor XI y factor XII.
La deficiencia congénita de este receptor (GPIb/IX/V) o su disfunción está asociada
al síndrom e de Bernard-Soulier (SBS), que se caracteriza p o r diátesis hemorrágica
moderada por mucosas y plaquetas gigantes.
Se ha demostrado que la unión de la G PIba al FvW inmovilizado da lugar a un in
cremento del Ca++ citoplásmico, fosforilación de proteínas, liberación de ADP, síntesis
de tromboxano A2 (TxA2) y agregación plaquetaria.
La adhesión de las plaquetas al endotelio vascular alterado tam bién requiere la
unión de las plaquetas al colágeno. La unión de las plaquetas al colágeno y al FvW
es fundamental para la formación del tapón plaquetario, ya que el FvW contribuye a
captar más plaquetas hacia la zona endotelial alterada y el colágeno, a la producción de
uniones más estables de las plaquetas, iniciando la activación plaquetaria. En la unión
del colágeno a las plaquetas juegan u n papel importante la glucoproteína VI (GPVI) y
la integrina a 2Br
La GPVI es un receptor plaquetario de baja afinidad para el colágeno, pero que tiene una
gran potencia en el inicio de la señal de generación. La región citoplásmica de GPVI se une
con la cadena a del dímero del receptor Fc7 RIIa después de la participación de varias vías
de señalización que provocan la liberación de 1,2-diacilglicerol e inositol-1,4,5-trifosfato,
que son los segundos mensajeros que promueven la completa activación de las plaquetas.
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Fase de extensión
Después de la adhesión de las plaquetas al FvW y al colágeno, expuestos en el suben-
dotelio vascular, el siguiente paso en la formación del trom bo plaquetario es la capta
ción de más plaquetas y la activación de estas en un proceso conocido como agregación
plaquetaria. Esto se lleva a térm ino p or la local acum ulación de agonistas solubles
liberados de las plaquetas adheridas y activadas. Estos agonistas solubles son: ADP, TxA2,
epinefrina y trombina.
La intervención del complejo glucoproteico GPIIb/IIIa es esencial para la agregación
de unas plaquetas con otras: el complejo GPIIb/IIIa se une al fibrinógeno y al FvW y se
forman puentes estables con las plaquetas adyacentes.
Muchos de los agonistas implicados en la extensión del trom bo plaquetario actúan
a través de GPCR.
Papel de los agonistas solubles liberados de las plaquetas

Adenosina difosfato
Liberada de los gránulos densos de las plaquetas y tam bién de los hematíes, lleva a
cabo los fenómenos de agregación plaquetaria a través de la elevación del Ca++ intra-
plaquetaria, la promoción de la síntesis de TxA2 y la fosforilación de proteínas. Dichos
acontecimientos se realizan a través de la interacción de la adenosina difosfato (ADP)
con P2Yj y P2Y12, dos quimiorreceptores para la ADP purinérgicos del grupo GPCR que
se unen a proteínas G aq y Gai. Estas proteínas G son subunidades de una proteína G
heterotrimérica intermediarias vitales entre la activación del receptor de la membrana
y las acciones de la célula, en este caso concreto la agregación plaquetaria.
El receptor purinérgico P2Y[2 es la diana donde actúan las tienopiridinas: clopidogrel,
prasugrel y otros. La deficiencia congénita de P2Y 12 da lugar a una diátesis hemorrágica
moderada.
Tromboxano A2
Es un prostanoide muy lábil que se sintetiza en las plaquetas activadas a través de una
serie de reacciones de la ciclooxigenasa y la trom boxano sintetasa A2. Se considera un
potente vasoconstrictor y uno de los agentes proagregantes más potentes.
La sobreproducción de TxA2 se ha implicado en la patogénesis de fenómenos trom
bóticos. El bloqueo de la síntesis de TxA2, m ediante el bloqueo de la ciclooxigenasa
por el ácido acetilsalicílico, es una de las dianas de tratam iento antiagregante mejor
estudiadas (fig. 22-3).
Las plaquetas humanas expresan un receptor p or el TxA2, que es el T P a. Algunos
pacientes con cambios genéticos en este receptor (TPa) o en la vía metabólica del TxA2
pueden presentar clínica de diátesis hemorrágica por mucosas.
Trombina
La trom bina se genera en el punto de lesión del endotelio vascular por activación de la
coagulación in situ y juega un papel esencial en la estabilización del trom bo plaquetario
por la formación de mallas de fibrina. La trom bina es el más efectivo activador de las
plaquetas, ya que induce cambios de forma de las mismas, síntesis y secreción de TxA2,
movilización de la Ca++, fosforilación de proteínas y agregaciónplaquetaria.
La trom bina induce todas estas actividades de las plaquetas por la vía de los receptores
de proteasas activadas (PAR), fundamentalmente por el PAR-1 y el PAR-4.
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FIGU RA 22-3. Metabolismo de las prostaglandinas (equilibrio trombótico).
Epinefrina (adrenalina)
La epinefrina secretada localmente desde las plaquetas activadas o la epinefrina circulante
contribuyen al crecimiento del trom bo plaquetario. Por sí sola es un débil agonista de las
plaquetas humanas, que actúa sinérgicamente con otros agonistas a bajas concentraciones
y produce un significativo incremento de la activación plaquetaria.
Se inhibe mediante la formación de AMPc, a través de la unión al receptor a 2-adrenérgico
de la plaqueta y a la proteína G aZ. Una reducción del número de receptores de epinefrina
da lugar a moderadas complicaciones hemorrágicas.
En diferentes modelos animales, con deficiencias del receptor a 2-adrenérgico, se
increm enta la form ación de émbolos p or inestabilidad del trom bo form ado. Estos
experimentos sugieren una alta participación de las vías de señalización de los receptores
a 2-adrenérgicos en la formación de trombosis.
Fase de estabilización
Esta fase es la últim a en la formación del trom bo plaquetario; en ella se le da consis
tencia en el p u n to donde se ha producido la lesión del endotelio vascular y se for
man puentes entre las plaquetas adyacentes, lo que perm ite la acción de moléculas
ERRNVPHGLFRVRUJ
liberadas p o r las plaquetas que a su vez facilitan la transferencia de inform ación a

otras plaquetas.
La integrina, que juega un papel muy relevante en esta fase de contacto entre plaque
tas, es la cd lb p 3 (GP Ilb/IIIa). Esta se une al fibrinógeno, que hace de puente al unirse a
otra plaqueta por esta misma integrina.
Las señales transmitidas en esta fase son esenciales para la reorganización del citoes
queleto, la formación y estabilización de grandes agregados de plaquetas y el desa
rrollo de una actividad procoagulante en la mem brana de la plaqueta que perm ite la
formación de mallas de fibrina y la estabilización y retracción del trom bo plaquetario.
En este proceso de unión plaqueta-plaqueta intervienen dos interacciones ligando/
receptor importantes: la semaforina 4D y el Gas-6 . La semaforina 4D es una glucopro
teína de membrana tipo I que se une al receptor CD72 y la plexina-Bl; juega un papel
im portante en la unión plaqueta-plaqueta. El Gas - 6 es el producto del growth arrest-
specific gen 6 , proteína de la vitamina K dependiente implicada en el crecimiento, la
adhesión y la migración celulares. El Gas- 6 se encuentra en los gránulos a de las plaquetas
y se libera cuando se activan las plaquetas. Se ha observado que el Gas- 6 contribuye con
la integrina a llb 3 3 a la transmisión de señales para la unión de plaqueta-plaqueta y la
retracción del coágulo.
Para la estabilización del trombo, la formación de una red de fibrina es fundamental.
Este proceso requiere FT y activación de la coagulación; aunque existe controversia sobre
la procedencia del FT, ya que para unos autores procede de los monocitos y es trans
portado a la zona lesionada por las micropartículas (MP) procedentes de monocitos y
con contenido de FT, y para otros parece ser que la mayor parte procede del subendotelio
lesionado. Independientemente de dónde proceda el FT, este es fundamental para iniciar
la activación de la coagulación y para formar una malla de fibrina que da estabilidad al
trom bo plaquetario.
En resumen, cabe concluir que las plaquetas juegan un papel decisivo en la dinámica
de la formación del trom bo plaquetario. Los receptores plaquetarios, los acontecimien
tos de señalización y las reacciones de liberación de proteínas plaquetarias junto con
sustancias inflamatorias actúan de una m anera orquestada con el endotelio vascular,
otras células de la sangre y factores de la coagulación para la formación del trom bo
plaquetario.
FACTORES DE COAGULACIÓN
La mayoría de los factores de coagulación son proteínas que se encuentran en la sangre
como cimógenos inactivos que pueden ser activados y transform ados en enzimas
con actividad serina proteasa mediante proteólisis limitada. Estas activaciones se realizan
en una serie de reacciones encadenadas en las que el producto de la prim era reacción
funciona como enzima para la segunda, y el producto de la segunda funciona como
enzima para la tercera, y así sucesivamente (fig. 22-4).
La mayoría de los factores de coagulación se sintetizan en el hígado. Entre ellos, los
factores II, VII, IX, X, proteína C, proteína S y proteína Z necesitan la vitamina K para
su síntesis completa. Estos factores llamados vitamina K dependientes, después de su
traducción a proteína sufren una carboxilación de los residuos de ácido glutámico
(Gla) en una reacción en la que actúa como cofactor la vitamina K. Esta transform a
ción les confiere una gran afinidad por los fosfolípidos. De esta manera, las reacciones
entre factores que en fase fluida serían muy poco eficientes se realizan sobre superficies
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Inflamación
Lesión tisular
]F
Factor IXa + Factor Villa
Endotoxinas
Factor tisular + Factor Vila tor X ------ ► Factor X a + Factor Va

M embrana celular
I
Protrombina —► Trombina -------
^ I ^
Coágulo ▼ Activación
Activación células
plaquetas endoteliales
FIGU RA 22-4. Cascada de activación de la coagulación.
fosfolípidas (membranas celulares) form ando complejos enzimáticos que aumentan

considerablemente la eficiencia de la reacción (tabla 22-1).
A parte de los precursores de serina proteasa, hay otras proteínas que no tienen
actividad p or sí mismas pero que actúan como cofactores en los complejos enzimáti
cos aumentando la eficiencia de la reacción. Por una parte tenemos los factores plasmáticos
V y VIII, que una vez han sufrido una pequeña proteólisis por la trom bina forman parte
de los complejos protrombinasa (Va-Xa-II) y tenasa (VIIIa-IXa-X); por otra, están las
proteínas de membrana FT y trombomodulina (TM), que actúan en los complejos Vlla-
FT-X, y trombina-TM -proteína C.
Actualmente, se acepta que el mecanismo hemostático fisiológicamente relevante está
asociado fundamentalmente a tres complejos enzimáticos procoagulantes, formados
por proteínas con actividad serina proteasa y vitamina K dependientes, reunidas sobre
una superficie fosfolípida y asociadas con cofactores que tam bién están unidos a la
membrana.
En cada caso el complejo enzimático conduce a u n incremento significativo (105-
106 veces) de la velocidad de reacción en la activación del sustrato. La formación de
estos complejos catalíticos sobre la mem brana celular sitúa la actividad proteolítica en
el punto en que las células dañadas del vaso, o las células activadas de sangre periférica,
aportan el sitio requerido para la formación del complejo. El requerim iento de com
plejos enzimáticos para desarrollar la actividad catalítica atenúa la propagación de las
reacciones de coagulación lejos del sitio donde se ha iniciado (fig. 22-5).
Inicio de la coagulación
El FT es una proteína que atraviesa la m em brana celular y form a parte de la familia
de receptores de citocinas. En condiciones normales no se expresa en la mem brana de
la célula endotelial indemne. Para que el sistema de la coagulación se active es preciso
que se lesione el endotelio vascular; esta lesión endotelial induce a la expresión del
FT a la luz vascular. Recientes estudios han dem ostrado que el FT que se expresa
ya está unido al factor VII (FVII), es decir, la lesión endotelial implica la expresión
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Capítulo
TABLA 22-1. Principales características de los factores de la coagulación
22
Masa
Hemostasia y trombosis. Conceptos básicos

molecular
(kDa) y n.° N.° residuos Gen: locus,
aminoácidos Concentración Vida Vitamina K y-carboxiglutámicos tamaño
Nombre (aa) (p-g/ml) media dependiente en dom inio Gla Dom inios y n.° de exones Síntesis Función
Factor I 340 kDa 3.000 3-5 días No — 2D 4q28; 24 kb; Hepática Form ación
(fibrinógeno) 222 aa 1E 24 exones de fibrina
Factor II 75 kDa 200 2-3 días Sí 10 Gla; 2 KR; CA 1l p l l-q l2 ; Hepática Activa a
579 aa 20,3 kb; 14 i,v,vm,
exones XI, XIII
plaquetas
Factor tisular 48 kDa No Extracelular, lp21.3; Subendot. Cofactor
263 aa transm em brana, 12,4 kb; 6 vascular de V ila
citoplásmico exones
Factor V 330 kDa 7 14 h No — 6 dom inios lq23; 73,2 kg; Hepática Cofactor
2196 aa funcionales 8-9 exones de Xa
Factor VII 50 kDa 0,5 4-6 h Sí 10 Gla; 2 EGF; CA 13q34; Hepática Inicia vía
406 aa 14,2 kb; 8-9 extrínseca
exones
Factor VIII 170 kDa 0,1 12 h No 6 dom inios Xq28; Hepática Cofactor
funcionales 140,4 kb; 26 d elX a
exones
Factor IX 56 kDa 5 1 día Sí 12 Gla; 2 EGF; CA Xq26.3-q27.1; Hepática Activa al X
415 aa 32,7 kb; 8
exones
(Continúa)
Os
Ov
TABLA 22-1. Principales características de los factores de la coagulación (cont.)
Masa
molecular
(kDa) y n.° N.° residuos Gen: locus,
aminoácidos Concentración Vida Vitamina K •v-carboxiglutámicos tamaño
Nombre (aa) (^g/m l) media dependiente en dom inio Gla Dom inios y n.° de exones Síntesis Función
Factor X 60 kDa 10 1-2 días Sí 10 Gla; 2 EGF; CA 13q34; Hepática Activa al II

26,7 kb; 8
exones
Factor XI 160 kDa 4 2-4 días No — 4 apple; 4q35; 22,7 kb; Hepática Activa al
607 aa tripsina; CA 14 exones IX
Factor XII 78 kDa 30 2-3 días No — 2 EGF; 1 FN; 5q35.1; 7,4 kb; Hepática Activa al
596 aa FN2; 1 KR; CA 14 exones XI
Precalicreína 88 kDa 30 No 4 apple; CA 4q34-q35; Hepática Cofactor
619 aa 30,9 kb; 15 XII y XI
exones
Cininógeno
HMW
120 kDa
626 aa
80 No 1 3 cistatina 3q27; 26,6 kb;
11 exones
Hepática Cofactor
XII y XI

Factor XIII 320 kDa 15 4-8 días No 10 sushi A: 6p24.2-p24.3; Hepática Estabiliza
(2 subunidades: B: Iq31-q32.14 la fibrina
A,B)
en hematología
:r r r r r tr■:tv:’■"'11"’■r r r:'::: ’ :
F T + Vila
Fase d e in ic io
FIGURA 22-5. Activación de la
coagulación sobre las mem branas
celulares. Fase de inicio: generación
de pequeñas cantidades de trom bina
(Ha) a partir de la acción directa del
complejo FT + V ila sobre el factor X.
F as e d e p ro p a g a c ió n
Fase de propagación: gran producción
de trom bina por activación del FIX
p o r el complejo FT + V ila en la
Trombo Tapón hemostático superficie de la m em brana plaquetaria.
FT, factor tisular.
FIGURA 22-6. E structura del

factor tisular: porción am inoterm inal
(N H2) expresada en la luz del vaso
cuando se activa la coagulación;
porción carboxiterm inal (C O O H )
en la p arte citoplásmica de la
célula endotelial, y una porción
transm em branosa.
del complejo FT-FVII, el cual se activa e inicia todo el proceso de la coagulación

(fig. 2 2 - 6 ).
En animales de experimentación, la deficiencia congénita de FT, o su inhibición,
implica graves hemorragias en órganos vitales tales como el cerebro y el corazón, y es
incompatible con la vida. Esto explica que la vía de generación de trom bina es funda
mental para mantener la hemostasia en órganos vitales.
Desde el descubrim iento del FT y su posterior caracterización se ha pensado que
existe una «forma circulante de pequeñas trazas de FT». Hace algunos años se demostró
ERRNVPHGLFRVRUJ
T r o m b in a |
FIGURA 22-7. Form ación del

com plejo «tenasa» y del com plejo
«protrom binasa» en la superficie de
las m em branas celulares (plaquetas
y células endoteliales) y formación
de mallas insolubles de fibrina
que dan consistencia al trom bo
plaquetario. FT, factor tisular.
que el FT formaba parte de las MP, que son fragmentos de células, generalmente de
membrana, derivados de una gran variedad de células activadas y/o apoptósicas. En el
caso de las MP que contienen FT, se cree que la mayor parte provienen de los monocitos
y de células endoteliales activadas. Las MP que contienen FT circulantes probablemente
juegan un papel importante en trombosis venosas en estados de hipercoagulabilidad y
en trombosis relacionadas con cáncer y otras situaciones clínicas. Cuando el FT entra en
contacto con la sangre, el factor V ila circulante se une rápidamente a él y se inicia la
coagulación, lo que activa los factores X y IX. El factor Xa también activa el factor IX
acelerando el proceso de formación de IXa. El factor IXa forma un segundo complejo con
el factor V illa y el factor X (complejo tenasa), y constituyen el factor Xa de una forma
50 veces más eficientemente que el que se forma en el complejo FT-factor Vlla-factor X.
El factor Xa form ado p o r cualquiera de las dos fuentes com pone un complejo con
el factor Va y el factor II o protrombina (complejo protrombinasa) para transformarlo
en trom bina (fig. 22-7).
El factor Xa, producido mediante el complejo FT-VII-X, puede generar una pequeña
cantidad de trombina, pero es una reacción extremadamente ineficiente. Sin embargo,
una vez producida, la trom bina y el factor Xa formados activan pequeñas cantidades de
factor V y de factor VIII. La activación de estos dos cofactores es esencial para que los
complejos catalíticos IXa-VIIIa-X y Xa-Va-II sean eficientes para convertir el factor X
inactivo a Xa y el factor II a lia respectivamente.
El inicio de la coagulación está regulado por el inhibidor de la vía del factor tisular
(TFPI), una proteína que inhibe el complejo Xa-FT- Vila y limita la producción de Xa
y IXa por esta vía. Una vez que esto ocurre, el factor Xa solo puede producirse p or el
complejo IXa-VIIIa-X. De ahí la importancia de los factores VIII y IX en la hemostasia
y la diátesis hemorrágica que acompañan a su déficit.
Vía intrínseca
La vía intrínseca de la coagulación no parece tener m ucha importancia en el inicio de
esta, pero juega un papel fundamental en el crecimiento y el mantenimiento del coágulo.
La activación de esta vía se inicia cuando el factor XI se acciona, ya sea por trazas de
trom bina o bien p or la activación de lo que se conoce como fase de contacto, que se
inicia cuando el plasma entra en contacto con una superficie cargada negativamente,
como fibras de colágeno o superficies externas, cristal, caolín, etc. El factor XII se activa
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y el X lla activa a la precalicreína. La calicreína, formada junto con el quininógeno de

alto peso molecular, amplifica la activación del factor XII que a su vez activa al factor XI.
El factor Xla, formado por la vía que sea, activa al factor IX a IXa en presencia de
calcio, e hidroliza el mismo enlace peptídico que rompe el complejo FT-factor Vila.
Después, el proceso continúa como se ha descrito anteriormente.
El descubrimiento de la activación del factor XI de forma independiente del factor
XII, la precalicreína y del quininógeno de alto peso molecular ayuda a clarificar el papel
del factor XI en la vía intrínseca y explica p o r qué pacientes con déficits severos de
factor XI sufren diátesis hemorrágica, mientras que esto no ocurre en individuos con
deficiencias de factor XII, precalicreína o quininógeno de alto peso molecular. Estas
tres últimas proteínas están implicadas en la activación del factor XI cuando el plasma
entra en contacto in vitro con superficies cargadas negativamente, como el cristal o el
caolín, pero podrían ser importantes cuando la sangre entra en contacto con superficies
artificiales como válvulas cardíacas o durante la diálisis de la sangre.
Factor von Willebrand

El FvW es u n a proteína m ultim érica de elevado peso m olecular que circula en el
plasma unida al factor VIII coagulante. Se sintetiza tanto en el endotelio como en los
megacariocitos, y se transporta p o r las plaquetas. De ellas se libera p or diferentes es
tímulos (estrés, ejercicio, horm onas, etc.) pasando a la sangre donde se une al factor
VIII. Su actividad contribuye al fenóm eno de la adhesión plaquetaria, actuando
probablem ente com o puente entre la plaqueta y el subendotelio. En una prim era
reacción el FvW se une al colágeno del subendotelio vascular y, a continuación, sufre
algunos cambios críticos que le perm iten unirse al receptor plaquetario glucoproteína
Ib. Las glucoproteínas Ilb y Illa plaquetarias también unen al FvW cuando han sido
estimuladas.
ADAMTS-13
El ADAMTS-13 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-l-like do
mains) es una metaloproteasa que regula el FvW produciendo una proteólisis parcial
de los multímeros de alto peso molecular. Convencionalmente a esta proteína se la ha
llamado ADAMTS-13 y es el producto del gen AD AM TS-13 situado en el cromosoma
9q34 que contiene 37 kb y 29 exones.
El ADAMTS-13 se sintetiza en el hígado y en las células endoteliales, se libera a la
circulación general en forma activa, su concentración plasmática es aproximadamente
de 1 (xg/ml y su vida media es de 2-3 días. Las plaquetas expresan ADAMTS-13 cuando
se activan por acción de la trombina.
En 2001 diferentes grupos identificaron el sustrato natural de ADAMTS-13 en los
multímeros de alto peso molecular del FvW con actividad procoagulante.
Como es sabido, cuando se altera el endotelio vascular se expone FvW y colágeno.
Los multímeros de alto peso molecular del FvW tienen capacidad para unirse al com
plejo glucoproteico plaquetario GP Ib-IX-V, que implica la adhesión de las plaquetas al
endotelio vascular alterado, la posterior activación y agregación, y así se inicia el llamado
trom bo plaquetario y la trombosis.
En condiciones norm ales, el FvW y el ADAMTS-13 circulan p o r el plasm a y es
probable que la inactivación de los multímeros de alto peso molecular de ambos sea
mínima. Dicha inactivación es 1.000 veces más rápida y eficiente cuando el FvW se
expresa en el endotelio vascular alterado. Hay un equilibrio in vivo constante entre la
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cantidad de multímeros de alto peso molecular de FvW y la liberación de ADAMTS-13

por las células endoteliales.
En resumen, el ADAMTS-13 en condiciones fisiológicas es activo tanto en condiciones
de baja fuerza de cizallamiento (p. ej., la que se observa en las venas), como en altas
fuerzas de cizallamiento de la circulación arterial. En estas condiciones, el ADAMTS-13 es
capaz de romper los multímeros de alto peso molecular del FvW y regular la interacción
de las plaquetas con el endotelio vascular. De esta manera, el ADMTS-13 previene la
formación de trom bos en el endotelio activado tanto de capilares venosos como de
arteriolas.
La púrpura trombótica trombocitopénica (PTT) es un síndrome caracterizado por
la aparición de microtrom bos, de forma diseminada, en las arteriolas y los capilares
terminales de múltiples órganos. Son m uy frecuentes en cerebro, riñón, hígado y otros
órganos. Este síndrom e está causado p o r la deficiencia de ADAMTS-13, que puede
ser congénita, causada por más de 50 mutaciones detectadas en el gen AD A M TS-13 o
adquirida por autoanticuerpos contra el ADAMTS-13 (la más frecuente).
Niveles bajos de ADAMTS-13 también se han detectado en síndromes microangiopá-
ticos trombóticos secundarios al trasplante de médula ósea y órganos sólidos, en tumores
malignos diseminados, en infecciones (HIV, E. coli enterohemorrágica), en enfermedades
autoinmunes (LES, Crohn, tiroiditis, ac. antifosfolípidos), fármacos (quinina, mitomi-
cina, ticlopidina, clopidogrel) y durante el embarazo (síndrome HELLP).
En otras situaciones como sepsis, coagulación intramuscular diseminada (CID) y
en enfermedad cardiovascular (infarto agudo de miocardio e ictus), también se han
detectado niveles moderadamente bajos de ADAMTS-13.
Trom bina
La trom bina se origina a partir de la protrombina, ambas miembros de la familia de fac
tores de vitamina K dependientes cuya característica principal es poseer un dominio Gla
en su porción aminoterminal, el cual posee diferentes cantidades de residuos del ácido
7 -carboxiglutámico (la protrombina posee 1 0 residuos de ácido 7 -carboxiglutámico).
También la trom bina y la protrom bina pertenecen a la extensa familia de serina
proteasas, donde están incluidos la mayoría de factores de la coagulación, la quimo-
tripsina, el quimotripsinógeno, la tripsina y otros componentes de la fibrinólisis. La
mayoría de estas serina proteasas pueden ser inhibidas por el grupo de las serpinas (su
nom bre deriva de serin protease inhibitors), entre ellas se encuentran: antitrombina,
antitripsina, antiplasmina, etc.
Los dominios Gla de la molécula de protrom bina son esenciales para la unión de
iones calcio a la molécula, que sufre cambios conformacionales que permiten que la
molécula de protrom bina se pueda unir a las membranas celulares que contienen fos-
folípidos ácidos.
La protrom bina se activa a a-tro m b in a en la mem brana de las células (plaquetas,
células endoteliales, etc.) en un proceso que incluye la acción de las serina proteasas
factor Xa, el cofactor factor Va e iones divalentes de calcio, y forman el llamado com
plejo protrombinasa.
La protrombina también puede activarse a a-trom bina de forma muy lenta con solo
el efecto del factor X activo (FXa). En presencia de FXa y calcio se produce una escisión
en la molécula de protrombina, en la arginina 271, dando lugar al fragmento 1 + 2 de la
protrom bina y a la pretrom bina 2; posteriormente, el FXa más el calcio fragmentan
la pretrombina 2 en la arginina 320, y dan lugar al fragmento de la protrombina 1 + 2 y
a la a-trom bina. Esta a-trom bina formada puede fragmentar por sí misma una pequeña
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s ------------- s
FIGURA 22-8. Transform ación de la protrom bina en a-trom bina. Arg, arginina; Frag 1 + 2: fragm entos
de la protrom bina 1 + 2 ; S-S, puentes disulfuro.
cadena de 13 aminoácidos de la región aminoterminal de la trom bina y dar lugar a la

forma estable de la a-trom bina (fig. 2 2 - 8 ).
La activación de la protrom bina por el complejo protrombinasa se produce en dos
tiempos: el primero, donde tiene lugar una escisión de la molécula de protrom bina en
arginina 320, y se origina la meizotrombina, y el segundo, en el que la meizotrombina,
una enzima con algunas actividades parecidas a la a-trom bina, se escinde en arginina
271 y origina el fragmento 1 + 2 de la protrom bina y la a-trom bina.
La velocidad de transform ación de protrom bina en a-tro m b in a p or el complejo
protrom binasa es 300.000 veces más rápida y eficiente que la producida por el FXa
solo. Fisiológicamente la vía de la protrombinasa es la más relevante en la generación
de a-trom bina.
La trom bina es la enzima final de la activación de la coagulación y parece lógico que
sea una de las dianas predilectas de los nuevos anticoagulantes orales. La estructura cris
talina de la trom bina tiene una alta homología con las serina proteinasas. En la superficie
de la molécula y cerca de su centro activo, la molécula expone bucles y zonas cargadas
aniónicamente (dominios) que contribuyen a su especificidad p or los sustratos.
La trom bina tiene dos zonas cargadas aniónicamente, dominios I y II (exositios I y
II) que tienen una alta funcionalidad en la interacción con sus respectivos sustratos. El
dominio I (exositio I) está constituido por una estructura hidrófoba y numerosas zonas
aniónicas que establecen uniones electroestáticas con las cadenas a y 0 del fibrinógeno
al acercar la molécula de fibrinógeno al centro activo de la trom bina para transformarlo
en monómeros de fibrina.
En el dominio I también se une la hirudina para poder inhibir el centro activo de
la trombina. En este dominio también se unen los receptores activadores de proteasas
(PAR) la TM y la proteína C.
El dom inio II (exositio II) de la trom bina está especializado en la interacción con
ligandos polianiónicos tipo heparina y glucosaminoglucanos. Como es sabido, la unión
de la heparina no fraccionada (HNF) o el heparán sulfato a la antitrombina precisa de
una unión a la trom bina para catalizar la inhibición de esta y otros sustratos.
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También en el dominio II se unen los glucosaminoglucanos capaces de acelerar la

reacción de inhibición entre el cofactor II de la heparina y la trombina. Es en este dominio
donde está el punto de unión de la trom bina con el receptor de las plaquetas, la gluco
proteína Ib y también con la m itad ácida de la cadena 7 del fibrinógeno.
O tra im portante zona de la estructura de la trom bina es el bucle que contiene el
lugar de unión al ión Na+. La unión del sodio en este bucle modula las actividades alos-
téricas de la trombina. Una vez el Na+ se une a la trombina, esta pasa de una baja y lenta
actividad a tener una alta y rápida actividad de interacción con sus respectivos sustratos.
En estas condiciones la trom bina transforma el fibrinógeno en monómeros de fibrina,
activa los factores V, VIII y XI, activa las PAR-1 y PAR-4 responsables de la activación
de las plaquetas y da lugar a una explosiva generación de trom bina en la cascada de la
coagulación. Cuando el Na+ no está presente en la molécula de trombina, esta se trans
forma en lenta y en estas condiciones activa a la proteína C, en colaboración con la
TM y el receptor de la proteína C (RPC), por lo que se convierte en un potente agente
anticoagulante.
En condiciones normales, la concentración de Na+ en sangre es ligeramente mayor que
la afinidad del Na+ por el lugar de unión a la trombina, con lo que el 60% de las moléculas
de trom bina contienen Na+ y determinan la forma rápida de la trom bina y el 40% no
tiene Na+ y representan la forma lenta de la trombina. Así pues, la presencia de Na+ en
la molécula de trom bina es crítica para que esta desarrolle propiedades procoagulantes
o propiedades anticoagulantes.
Las propiedades procoagulantes de la trombina son la transformación del fibrinógeno
en m onóm eros de fibrina, la activación de los cofactores de la coagulación V y VIII,
la activación del factor XIII que estabiliza a la fibrina, la activación del factor XI, la
activación de las plaquetas por la vía de las PAR-1 y PAR-4 y por la vía del complejo de
glucoproteínas Ib-IX-V. Todas estas funciones están desarrolladas por la forma rápida
de trom bina con presencia del ión Na+ en el bucle de unión al Na+.
Las propiedades anticoagulantes de la trom bina se llevan a cabo cuando no está
presente el ión Na+ en la molécula y esta tiene una form a de activar lenta. En estas
condiciones, la forma lenta de trom bina en el endotelio vascular se une al cimógeno
proteína C, en colaboración con la TM, y el RPC transform a el cimógeno proteína C
en proteína C activada, que es capaz de degradar a los factores V activado y VIII activado
actuando como cofactor la proteína S.
O tra acción im portante de la trom bina está relacionada con la regulación de la
fibrinólisis. Así pues el complejo trom bina-TM en el endotelio vascular activa una
carboxipeptidasa B llamada inhibidor de la fibrinólisis activable por la trom bina (TAFI),
que da lugar a una estabilización del trom bo de fibrina al producir una proteólisis de los
residuos lisina de la fibrina y del plasminógeno.
Form ación de fibrina

El fibrinógeno es una glucoproteína de 340 kD sintetizada en el hígado. Tiene una vida
media de unos 3-4,5 días y en plasma se encuentra en una concentración de 2 a 4 g/1.
La molécula está compuesta p or dos mitades simétricas, cada una formada por tres
tipos de cadenas polipeptídicas: A a , B(3 y 7 , que difieren entre ellas por la secuencia
de aminoácidos y su tamaño. Las tres cadenas se unen entre ellas por puentes disul
furo. Las dos mitades de cada molécula están unidas p or el dominio aminoterminal
m ediante tres puentes disulfuro, dos de los cuales están entre las cadenas 7 y otro
entre las cadenas a . La zona aminoterminal o central de la molécula se conoce como
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dom inio E y las dos zonas que com prenden las partes carboxiterminales se conocen
como dominios D.
La conversión del fibrinógeno en fibrina se realiza en tres etapas:
1. La trombina rompe el enlace Arg 16-Gly 17 de la cadena a y libera el fibrinopéptido
A (Ala 1-Gly 16). A continuación, la trombina rompe el enlace Arg 14-Gly 15 de la
cadena (3 liberando el fibrinopéptido B (Gly 1-Arg 14), así se forma el monómero
de fibrina.
2. Tras la liberación de los fibrinopéptidos, la molécula expone unos sitios de po
limerización en la zona aminoterminal de las cadenas a y 0 que reaccionan con
estructuras complementarias en la zona carboxiterminal de la cadena 7 . De esta
manera, los dominios D de una molécula interaccionan con la zona E de otra
molécula, y se forma una fibra de dos hebras en la que los m onóm eros están
medio solapados. A continuación, se produce una asociación lateral de las fibras
aumentando su grosor.
3. En presencia de factor XHIa, la fibrina que inicialmente estaba unida por inte
racciones no covalentes, sufre una serie de uniones intermoleculares mediante la
formación de enlaces entre residuos de lisina de una cadena 7 y glutamina de otra.
Posteriormente se realizan otros enlaces entre las cadenas a y entre cadenas a
y 7 . La incorporación de estos enlaces covalentes entre las fibras de fibrina aporta
una mayor resistencia a la degradación p o r la plasmina, así como una mayor
resistencia y elasticidad del coágulo.
M ecanism os reguladores
Los mecanismos que regulan la hemostasia son fundamentalmente de dos tipos:
1. Los inhibidores de serina proteasa, que inhiben los factores activados: anti-
trom bina, cofactor II de la heparina, TFPI, a 2-macroglobulina, inhibidor de la
proteína C activada, inhibidor del Cl-esterasa y a,-antitripsina.
2. Los reguladores de los cofactores activados: vía de la proteína C, proteína C,
proteína S, TM (fig. 22-9).
— FT + Vila
F IG U R A 2 2 -9 . Líneas grises: vías de inhibición de los reguladores fisiológicos de la coagulación.

AT, antitrom bina; PCA, proteína C activada; TFPI, inhibidor de la vía del factor tisular.
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Centro
reactivo
Láminas B
(zona posterior
de la molécula)
F IG U R A 2 2 -1 0 . Estructura
Sitio
tridim ensional de la form a nativa
de unión
a heparina circulante de la antitrom bina hum ana.
Shutter, cerrojo.
Antitrombina
La antitrombina (AT) es un inhibidor de serina proteasa sintetizado en el hígado que
se encuentra en plasma a una concentración de 2 ,4 (jlM . E s el principal inhibidor de la
trom bina y del factor Xa, pero también inactiva los factores IXa, Xla, Xlla, calicreína y
plasmina. También inhibe al factor Vila unido al FT (fig. 2 2 -1 0 ). La actividad inhibidora
se incrementa unas 1.000 veces en presencia de heparina que in vivo tiene su equivalente
en el proteoglucano sulfato de heparán presente en el endotelio vascular.
La molécula de AT se une a la molécula de heparina a través de una secuencia dis
continua de residuos básicos (Lys, Arg) en la zona aminoterminal. La trom bina se une
también a la cadena de heparina de una m anera no específica m ediante cargas elec
trostáticas. De esta manera, se forman complejos ternarios heparina-AT-trombina en
los que el sitio activo de la trom bina se acerca al sitio reactivo de la AT. Inicialmente, la
trom bina rompe el enlace Arg 393-Ser 394 en el sitio reactivo de la AT, lo que produce
un cambio conformacional de la AT que atrapa de forma irreversible a la trom bina.
Una vez formado el complejo AT-trombina se libera a la circulación y forma complejos
ternarios con la vitronectina. Se cree que estos complejos ternarios se eliminan de la
circulación por unión a los proteoglucanos de sulfato de heparán que son posteriormente
internalizados (fig. 22-11).
El factor Xa y otros factores activados de la coagulación se unen solo débilmente a la
heparina y son inhibidos por el complejo heparina-AT gracias al cambio conformacional
que induce la heparina en la AT.
Cofactor II de la heparina
Es un inhibidor de serina proteasa con una homología de un 25% con la ATIII. Se sinte
tiza en el hígado, y se encuentra a una concentración de 1,2 jiM en sangre. A diferencia
de la AT, solo inhibe la trom bina y no los demás factores activados. Su acción inhibidora
se incrementa extraordinariamente en presencia de glucosaminoglucanos, pero el es
tímulo más potente es el sulfato de dermatán que difiere del sulfato de heparán por la
composición del disacárido (D-galactosamina en lugar de D-glucosamina).
Inhibidor de la vía del factor tisular

El inhibidor de la vía del factor tisular {tissue factor pathway inhibitor, TFPI) tiene es
pecial importancia en la regulación del inicio de la coagulación. A diferencia de otros
inhibidores de factores activados, no pertenece a la familia de serina proteasas. Posee
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FIGURA 22-11. Representación esquemática de la unión de la heparina no fraccionada y de bajo peso

molecular a la molécula de antitrombina. AT, antitrombina; CR, centro reactivo; Ha, trombina; Xa, factor X
activado.
tres dominios inhibidores de tipo Kunitz. En condiciones normales, el TFPI circula en

plasma mayoritariamente unido a lipoproteínas y entre un 5-10% en forma libre. Des
pués de la administración de heparina, los niveles plasmáticos de TFPI se incrementan
entre dos y ocho veces. Este TFPI que se libera del endotelio no parece estar asociado
a las lipoproteínas. Una pequeña parte de TFPI está asociado a las plaquetas y se libera
cuando se activan por la trombina.
La actividad anticoagulante del TFPI se desarrolla en dos etapas: en la primera, se
forma un complejo reversible estequiométrico 1:1 con el factor Xa, lo que produce una
pérdida de actividad catalítica del factor Xa; en la segunda etapa, este complejo binario
se une al factor VIIa-FT unido a la membrana en una reacción que necesita calcio, por
lo que se forma el complejo cuaternario Xa-TFPI-VIIa-FT y da lugar a la pérdida de
actividad catalítica del factor VIIa-FT (fig. 22-12).
Vía anticoagulante de proteína C

La proteína C (PC) es una glucoproteína de la vitamina K dependiente sintetizada en el
hígado que circula en el plasma a una concentración de 50-80 nm. Es la precursora de
una serina proteasa y contiene residuos 7 carboxilados que le confieren la capacidad
de unirse a los fosfolípidos mediante el calcio.
Una vez activada la PC (PCA) se une a los fosfolípidos de m embrana o al receptor
endotelial y actúa como un potente anticoagulante degradando los factores Va y Villa.
En esta actividad proteolítica actúan como cofactores la proteína S y el factor V.
La TM es una proteína integral de m embrana que consta de una zona aminotermi
nal parecida a la lectina (lectin-like), seguida de seis dominios parecidos al factor de
crecimiento epitelial (EGF), un dominio rico en los aminoácidos serina y treonina, un
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Kunitz 3
TFPI
FIGURA 22-12. Esquema de la inhibición del complejo factor tisular-factor VII activado por el inhibidor
del factor de la vía tisular (TFPI). COOH, región carboxiterminal; FT, factor tisular; Kunitz 1,2,3, dominios
inhibidores de la molécula de TFPI; NH2, región aminoterminal; Vila, factor VII activado; Xa, factor X
activado.
dominio transmembrana y una cola citoplásmica. El quinto y sexto EGF son esenciales
para la unión a la trom bina, mientras que la unión calcio a la proteína C dependiente
requiere la región que une el tercer y el cuarto EGF. En el residuo Ser 474, la TM contiene
una cadena de sulfato de condroitina.
Se ha identificado TM hum ana en diferentes tejidos como vasos linfáticos, placenta,
plaquetas, megacariocitos, macrófagos, neutrófilos y células musculares. En la vasculatura
se localiza principalmente en los capilares y en m enor cantidad en las arterias y venas.
La actividad anticoagulante de la TM consiste en la inactivación de la actividad
procoagulante de la trom bina y la activación de la proteína C.
La trom bina se une con gran afinidad a la TM. U na vez unida, la trom bina pierde
su actividad procoagulante, es decir, no transforma el fibrinógeno en fibrina, no activa
el factor V, el VIII ni el XIII y tampoco activa las plaquetas ni las células endoteliales.
Además, la TM ejerce una actividad parecida a la heparina al acelerar la neutralización
de la trom bina por diferentes inhibidores de proteasas como la AT, el cofactor II de la
heparina, etc.
La TM induce un cambio conformacional en la trom bina que resulta en un eficiente
reconocimiento y activación de la proteína C. La expresión de TM en la superficie endo
telial es susceptible a diversas condiciones patológicas: disminuye por diversos agentes
inflamatorios como el factor de necrosis tum oral, la interleucina 1 , las endotoxinas
bacterianas, los microorganismos bacterianos, la hipoxia, etc. (fig. 22-13).
La proteína S (PS) es una glucoproteína de la vitamina K dependiente. Se sintetiza
en el hígado, pero también en las células endoteliales y los megacariocitos. Se encuentra
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FIGURA 22-13. Representación

esquemática de la activación de la
proteína C en la membrana de la
célula endotelial. EPCR, receptor
endotelial de la proteína C;
Ha, trombina; PC, proteína C;
PCA, proteína C activada;
TM, trombomodulina.
en plasm a a u n a concentración de 250-350 nm y está form ada p o r u n dom inio

C -term inal hom ólogo a la proteína que une a los andrógenos (androgen binding
protein), 4 EGF, un dominio sensible a la trom bina, y un dominio Gla aminoterminal
que le facilita su unión al calcio y a la m em brana celular. La unión al calcio protege a
la PS de la degradación por la trom bina y además induce un cambio de conformación que
es necesario para que actúe como cofactor de la PCA. Se piensa que la interacción
con la PCA se realiza m ediante el dom inio sensible a la trom bina y el EGF. La zona
parecida al trasportador de andrógenos está relacionada con la unión al C4b binding
protein (C4bBP), que es una glucoproteína de alto peso m olecular reguladora del
complemento y un reactante de fase aguda formado por siete subunidades idénticas
a y una subunidad 0. Las subunidades a se unen al C4b y la subunidad 0 se une a
la proteína S. En plasma, un 40% de PS circula libre y posee actividad cofactor para la
PCA; el 60% restante está unido al C4bBP y en esta form a no estimula la actividad
anticoagulante de la PCA.
El mecanism o anticoagulante de la PC se inicia cuando se genera una pequeña
cantidad de trombina. Esta se une a la TM y el complejo trom bina-TM activa a la PC
unida a sus fosfolípidos de membrana o al receptor endotelial. La PC activada junto con
la proteína S y el factor V, que actúan como cofactores, tiene como principal sustrato al
factor Va, al que degrada rompiendo dos enlaces: el primero en la Arg 506, que produce
una rápida pero incompleta pérdida de actividad, y el segundo en la Arg 306, con lo que
la inactivación del factor Va es completa (fig. 22-14).
Una alteración en la molécula del factor V relativamente frecuente y asociada a
trombofilia es el factor V Leiden, que consiste en un factor V en el que el aminoácido
Arg 506 ha sido sustituido p o r una Gln y p or ello la molécula es más resistente a la
degradación por la PCA.
El factor V illa es también un sustrato para la PCA, pero debido a la inestabilidad del
factor V illa no parece ser muy relevante a nivel fisiológico. La PS y el factor V actúan de
forma sinérgica como cofactores en la degradación del factor Va. Después de su activa
ción, la PCA es lentamente neutralizada por al m enos tres inhibidores de proteinasas:
el inhibidor de la PCA (PCI), la a 2 macroglobulina (a 2M) y la a t-antitripsina ( a tAT).
En la figura 22-15 se representa de forma esquemática el endotelio vascular, la activa
ción de la coagulación, su regulación por las serina proteasas y la activación del sistema
fibrinolítico. Asimismo, se expresan los cambios que sufre el endotelio protrombótico
en comparación con el endotelio antitrombótico o fisiológico.
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Citosol
FIGURA 22-14. Mecanismo anticoagulante de la proteína C. APC, proteína C activada; II, protrombina;
PS, proteína S; V, factor V; Va., factor V activado, inhibido; Villa., factor VIII activado, inhibido; IXa, factor
IX activado; Xa, factor X activado.
FIGURA 22-15. Activación y regulación de la coagulación y la fibrinólisis a nivel endotelial. En la parte

superior, el endotelio protrombótico y en la inferior, el endotelio antitrombótico o fisiológico. AT, antitrombina;
Fgno, fibrinógeno; FT, factor tisular; FVa, factor V activado; FVIIa, factor VII activado; FVIIIa, factor VIII
activado; FvW, factor von Willebrand; HS, sulfato de heparán; NO, óxido nítrico; PAF, factor agregante
plaquetario; PAI, inhibidor de la activación del plasminógeno; PC, proteína C; PCa, proteína C activada;
PGI2, prostaciclina; PS, proteína S; TFPI, inhibidor de la vía del factor tisular; TM, trombomodulina;
t-PA, activador tisular del plasminógeno; Tr, trombina; Tr-AT, complejo trombina-antitrombina.
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SISTEMA FIBRINOLÍTICO
El sistema fibrinolítico tiene como objetivo la lisis de la fibrina depositada en el árbol
vascular, es decir, es un sistema reactivo a la activación de la coagulación y a la generación
final de trombina. La plasmina, una serina proteasa de 85 kDa, es la enzima central de este
sistema. En condiciones normales circula por el plasma humano en forma de proenzima,
el plasminógeno. La transformación del plasminógeno en plasmina se lleva a cabo por
los denominados activadores del plasminógeno: el activador tisular del plasminógeno
(t-PA) y el activador tipo urocinasa (U-PA). El t-PA juega u n papel fundamental en la
fibrinólisis fisiológica, mientras que el U-PA es un activador de la proteólisis extracelular.
El sistema plasminógeno/plasmina juega un papel esencial en la lisis de la fibrina, pero
también tiene otras importantes funciones como incrementar los estados de inflamación
crónicos (artritis), las infecciones y la arterosclerosis.
La plasmina juega u n papel im portante en la invasión celular y en el remodelado,
también es esencial en distintos procesos donde se requiere la degradación de la matriz
extracelular (ME). La plasmina directamente puede degradar a diversos componentes
de la ME como la laminina y la fibronectina y a la vez puede activar a metaloproteina-
sas de la matriz extracelular (MMP).
Activación del plasm inógeno

El plasminógeno es un cimógeno sintetizado en el hígado en forma de una sola cadena
glucoproteica que contiene unos 791 aminoácidos y un peso molecular próximo a los
92 kDa.
En la molécula de plasm inógeno se pueden distinguir diferentes dominios: a) el
péptido de preactivación; b) la zona de cinco «kringles», que contienen los lugares de
afinidad para la lisina y son esenciales para la unión del plasminógeno a la fibrina y para
la unión del plasminógeno a su principal inhibidor, es decir, la a 2-antiplasmina, y c) la
región del centro catalítico, constituida por HIS 603, Asp 646 y Seri 741 que identifica a
la molécula como una serina proteasa.
La activación del plasminógeno a plasmina, constituida p or dos cadenas, implica
la rotura de la simple cadena de plasminógeno por Arg 561/Val 562. La plasmina es
tá regulada p o r los activadores del plasm inógeno (AP) y p or los inhibidores de los
activadores del plasminógeno (PAI-1 y PAI-2) pero su principal inhibidor endógeno
es la a 2-antiplasmina ( a 2AP). La cinética de inhibición de la plasmina por la a 2AP es
una de las más rápidas que se conocen de todos los sistemas enzimáticos del organismo
hum ano (fig. 22-16).
In hibidor de la fibrinólisis activado p o r trom bina

Existe una íntima conexión entre la activación de la coagulación y la regulación del sis
tema fibrinolítico. Hace más de 20 años que se descubrió el inhibidor de la fibrinólisis
activado por trombina (thrombin-activable fibrinolysis inhibitor, TAFI), también llamado
carboxipeptidasa R, carboxipeptidasa U o procarboxipeptidasa B. Este es un inhibidor
de la lisis del coágulo con capacidad para unirse al plasminógeno y alterar los radicales
lisina que son imprescindibles para su unión a la fibrina y la posterior transformación
en plasmina.
El TAFI se sintetiza en el hígado, circula en forma de cimógeno y, mediante su unión
al complejo trom bina-TM (T-TM), se transforma en forma activa (actividad carboxi
peptidasa). Esta activación p or el complejo T-TM es 1.000 veces más eficiente que la
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FIGURA 22-16. Representación esquemática de la activación de la fibrinólisis y su regulación fisiológica.

PAI-1, inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1; PAI-2, inhibidor del activador del plasminógeno
tipo 2; PAI-3, inhibidor del activador del plasminógeno tipo 3.
activación sola por trom bina. El TAFI activado (TAFIa) provoca una proteólisis de
las lisinas de la cadena carboxiterminal de la fibrina, y también de las lisinas del plas
minógeno. La proteólisis de estas lisinas de la fibrina implica una m enor incorporación
de plasminógeno y de t-PA en el coágulo y, por tanto, una inhibición de la fibrinólisis.
Como se ha dicho anteriormente, el TAFI actúa sobre el plasminógeno impidiendo la
transformación de Glu-plasminógeno en Lis-plasminógeno. Como es sabido, la forma
Lis-plasminógeno tiene mayor afinidad por la fibrina y por el t-PA, de esta manera el t-PA
unido a la fibrina transforma el Lis-plasminógeno, también unido a la fibrina, en plasmina;
esta plasmina, unida a la fibrina, está protegida de su inhibición por la a 2 antiplasmina.
Globalmente, p o r acción del TAFIa, hay una m enor generación de plasmina y una
disminución de la fibrinólisis.
En este contexto, la generación de trom bina en el endotelio vascular y su unión a
la TM implica la formación de complejo T-TM, que por un lado activa la PC y regula la
activación de la coagulación y, por otro, activa el TAFI, que da lugar a una inhibición de
la fibrinólisis y a una protección del coágulo de su lisis por la plasmina. De esta manera,
el complejo T-TM juega un papel complementario en el m antenimiento del equilibrio
de la balanza de la hemostasia (fig. 22-17).
El TAFIa, además de ser un inhibidor de la fibrinólisis, es capaz de inactivar y au
mentar la excreción renal de un número importante de mediadores de la proinflamación
como la bradicinina, los com ponentes del com plem ento C3a y C5a, la osteopontina
activada por la trom bina y la chemerina activada por la plasmina.
En modelos animales de fibrinólisis la inhibición del TAFI por un inhibidor específico
(procedente de la patata), implica un incremento de la fibrinólisis inducida por el t-PA.
En humanos, los niveles circulantes de TAFI implican un riesgo moderado de trombosis
venosa.
O tro componente im portante de la fibrinólisis es el receptor de la U-PA (U-PAR),
que no solo facilita la proteólisis celular por la U-PA sino que también inicia importantes
señales intracelulares.
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FIGURA 22-17. Representación esquemática clee:ómo el complejo trombina-trombomodulina (T-TM)

mantiene en equilibrio la activación de la coagulación por la proteína C y la regulación de la fibrinólisis
por el TAFI. FVa, factor V activado; FVIIIa, factor VIII activado; PCA, proteína C activada; PDF, productos
de degradación de la fibrina; TAFI, inhibidor de la fibrinólisis activable por la trombina; TAFIa, inhibidor de
la fibrinólisis activable por la trombina activo; signo +, activación; signo —, inhibición.
Al igual que la activación de la coagulación, la activación del plasminógeno tiene lugar

en las superficies celulares, en las membranas de las células endoteliales y en los lugares en
donde se ha generado fibrina. De hecho el t-PA se halla unido a la fibrina cuando esta
se forma, y es el que transform a al plasminógeno unido a la fibrina en plasmina. La
plasmina degrada selectivamente a la fibrina en productos de degradación de la fibrina
(PDF); una vez ha degradado a la fibrina rápidamente es inhibida por la a 2-antiplasmina.
La presencia de fibrina increm enta en dos órdenes de m agnitud este proceso de
activación del plasm inógeno a plasm ina p or el t-PA y p o r la U-PA. Los activadores
del plasminógeno (t-PA y U-PA) tienen capacidad de unirse a células e incrementar la
producción de plasmina. Dicha producción está controlada por los inhibidores de los
activadores del plasminógeno (PAI-1 y PAI-2).
Como se ha mencionado anteriormente, la activación del plasminógeno puede estar
implicada en la inflamación crónica, la inflamación como respuesta a una infección
(Yersinia pestis), la aterosclerosis y la activación de determ inadas células como las
plaquetas, las células endoteliales y los monocitos.
Los activadores fisiológicos del plasminógeno t-PA y U-PA están siendo utilizados
en la actualidad como agentes trom bolíticos en el tratam iento del infarto agudo de
miocardio, el embolismo pulmonar, en ictus recientes, en trombosis arteriales periféricas
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y en otras situaciones críticas. Asimismo, la estreptocinasa (SK) y la urocinasa (UK), la

primera purificada del cultivo de estreptococos y la segunda purificada de orina humana,
también son agentes trombolíticos que en la actualidad todavía se utilizan en un amplio
espectro de indicaciones.
AGRADECIMIENTOS
• Al Dr. F. España del Centro de Investigación del Hospital Universitario La Fe, Valencia,
por la cesión de algunas tablas y figuras de gran valor para este texto.
• Agencia de Gestió d ’Ajuts Universitaris i de Recerca (AGAUR) 2009SGR1147
Generalitat de Catalunya.
• RECAVA RD 06/0014/0016 Instituto de Salud Carlos III.
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Capítulo 22 Hemostasia y trom bosis. Conceptos básicos 6 9 0 .e l
Autoevaluación
1. ¿Cuál es el receptor plaquetario más im portante para establecer una unión con el factor von
Willebrand?
(a) PAR-1 y PAR-4.
(b) GPIb/IX/V.
(c) GPIIb/IIIa.
(d) P2Y,.
(e) P2Y12.
Respuesta razonada: el complejo glucoproteico GPIb/IX/V es el receptor más im portante de las
plaquetas para su unión con el factor von Willebrand, tanto con altas como con bajas fuerzas
de cizallamiento (com o las que se encuentran en las arteriolas pequeñas o en las venas). La
deficiencia congénita de este receptor (GPIb/IX/V) o su disfunción está asociada al síndrome de
Bernard-Soulier, que se caracteriza por diátesis hemorrágica p or mucosas y plaquetas gigantes.
2. ¿Cuál de los siguientes factores inicia la activación de la coagulación?
(a) El sistema contacto (FcXII, precalicreína, cininógeno de alto peso molecular).
(b) Trombina.
(c) El complejo factor tisular-FcVIIa.
(d) Factor IX activado.
(e) Factor X activado.
Respuesta razonada: el complejo FT-FcVIIa inicia la activación de la coagulación provocando de
forma directa la activación del factor X y el factor IX. A partir de estas activaciones se producen
dos complejos: el complejo protrombinasa formado por el FcXa, el FcVa, el FcIIa; y el complejo
«tenasa» formado por el FcIXa, el FcVIIIa y el FcXa, que generan una gran cantidad de trombina.
Como es sabido, la trom bina transform a el fibrinógeno en fibrina soluble y tam bién actúa sobre
una gran cantidad de sustratos de la coagulación: activa el FcXIII, las plaquetas, los cofactores
V y VIII, el sistema de la proteína C y el TAFI.
3. ¿Qué anomalía molecular se encuentra en el síndrom e de Bernard-Soulier?
(a) Los receptores PAR-1 y PAR-4.
(b) Los receptores P2Y]2.
(c) El complejo GPIb/IX/V.
(d) El receptor T Pa.
(e) El complejo GPIIb/IIIa.
Respuesta razonada: la deficiencia o disfunción del complejo GPIb/IX/V da lugar al síndrome
de Bernard-Soulier, caracterizado p o r un tam año de las plaquetas gigantesco y p o r diátesis
hemorrágica m oderada, básicamente, p o r mucosas. La falta de este complejo implica la no
fijación del factor von Willebrand en el endotelio alterado (impidiendo el incremento de Ca++
citoplasmático), la no fosforilación de proteínas, la falta de liberación de ADP, la falta de síntesis
de trom boxano \ y la alteración de la agregación plaquetaria.
4. ¿Cuál es la función fundamental del ADAMTS-13?
(a) Activar el factor von Willebrand.
(b) Activar la trombina.
(c) Activar la proteína C.
(d) Degradar los m ultímeros de alto peso molecular del factor von Willebrand.
(e) Todas las respuestas son correctas.
Respuesta razonada: la función fundamental de la metaloproteasa ADAMTS-13 es la de degradar
los m ultímeros de alto peso molecular del factor von Willebrand. Si no se produce esta degra
dación, los m ultímeros de alto peso molecular del factor von Willebrand tienen capacidad para
unirse al complejo glucoproteico plaquetario GPIb/IX/V, provocar la adhesión de las plaquetas
al endotelio, agregar a las plaquetas y formar el llamado trom bo plaquetario. Estos trom bos de la
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microcirculación arterial y venosa se encuentran en los llamados síndromes microangiopáticos

y en la púrpura trombocitopénica trombótica.
5. ¿Cuál es el inhibidor fisiológico m ás im portante del com plejo factor tisular-factor VII
activado?
(a) Antitrombina.
(b) El cofactor II de la heparina.
(c) El complejo trom bomodulina-trom bina-receptor endotelial de la proteína C.
(d) El TAFI.
(e) El TFPI.
Respuesta razonada: el TFPI, el inhibidor de la vía de activación de la coagulación por el factor
tisular, es el principal inhibidor del com plejo factor tisular-factor VII activado. Posee tres
dominios Kunitz; en un prim er paso se une al factor X activado por el Kunitz 2. Una vez unido al
factor Xa, la molécula de TFPI sufre un cambio conformacional, haciendo que su Kunitz 1 pueda
bloquear al complejo factor tisular-factor VII activado. Se form a así un complejo cuaternario
donde se pierde la capacidad catalítica del complejo factor tisular-factor VII activado.
6. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones no es cierta?
(a) La proteína C es una glucoproteína dependiente de vitamina K.
(b) El complejo trom bom odulina-trom bina activa la proteína C.
(c) La proteína C se sintetiza en el hígado de form a inactiva.
(d) La proteína C activada precisa de los cofactores factor V y la proteína S para degradar a
los factores Va y VIII activados.
(e) Todas las respuestas anteriores son falsas.
Respuesta razonada: todas las respuestas anteriores caracterizan las funciones y actividades de la
proteína C activada, que es esencial en la regulación de la coagulación. La proteólisis parcial de
los factores V y VIII de la coagulación es la actividad fundamental de la proteína C. Su deficiencia
congénita en forma heterocigota está ligada a trombosis venosas de repetición. La deficiencia ho-
mocigota de proteína C cursa con una púrpura fulminans neonatal extraordinariamente grave,
asociada frecuentemente a ceguera por trombosis intracraneales.
7. La a 2-macroglobulina es un inhibidor de:
(a) Plasminógeno.
(b) t-PA.
(c) u-PA.
(d) Fibrina.
(e) Es el segundo inhibidor en importancia de la plasmina.
Respuesta razonada: la a 2-macroglobulina es el segundo inhibidor en importancia de la plasmina.
El inhibidor principal de la plasmina es la a 2-antiplasmina. La a 2-antiplasmina unida a la fibrina
inhibe la plasmina que se libera después de que esta haya degradado la fibrina en productos de
degradación de la fibrina (PDF). Cuando se ha agotado la a 2-antiplasmina, como, por ejemplo,
durante los tratam ientos fibrinolíticos, la a 2-macroglobulina es el principal inhibidor de las
plasmina.
8. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es falsa en relación al TAFI?
(a) Se sintetiza en el hígado y circula de forma activa.
(b) Es un inhibidor de la lisis del coágulo.
(c) Es capaz de degradar los radicales lisina del plasminógeno.
(d) Es activable por el complejo trom bina-trom bomodulina.
(e) Aumenta la excreción renal de mediadores de la proinflamación.
Respuesta razonada: el TAFI, o inhibidor de la fibrinólisis activable por trom bina, se sintetiza
en el hígado y circula en forma de cimógeno inactivo. El complejo trom bina-trom bomodulina
activa al TAFI de una forma muy eficiente, 1.000 veces más eficiente que la trom bina sola. Una
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Capítulo 22 Hemostasia y trom bosis. Conceptos básicos 6 9 0 .e 3
vez activado el TAFI, produce una proteólisis parcial de las lisinas del plasminógeno, impidiendo
su unión a la fibrina y su posterior transformación en plasmina p or acción del t-PA. Así pues,
por acción del TAFI hay una menor generación de plasmina y una disminución de la fibrinólisis.
9. ¿En la molécula de trom bina, qué funciones tiene el bucle que contiene el ión Na+?
(a) La presencia de Na+confiere a la trom bina actividad procoagulante y la ausencia de N a+
propiedades anticoagulantes.
(b) La presencia de Na+ en la molécula no le confiere actividades especiales.
(c) Está relacionado con la u nión de la trom bina a la heparina o a otros glucosam ino-
glucanos.
(d) Está relacionado con la unión a las cadenas a y p del fibrinógeno.
(e) Tiene relación con su unión a la hirudina.
Respuesta razonada: la zona de la trom bina que contiene el bucle de unión al ión Na+ regula las
propiedades alostéricas de la trombina. Cuando está presente el Na+en la molécula de trombina,
esta lleva a cabo las funciones procoagulantes: transform a el fibrinógeno en fibrina, activa los
factores V, VIII, XI, XIII y activa las plaquetas. Cuando no está presente el ión Na+en la molécula
de trom bina, las reacciones anteriorm ente citadas no se llevan a cabo o lo hacen de una manera
extraordinariamente lenta. La no presencia de Na+ en la molécula de trom bina confiere a es
ta propiedades anticoagulantes; en estas condiciones se activa la proteína C, en colaboración
con la trom bomodulina y el receptor endotelial de la proteína C. La proteína C activada degrada
parcialmente los factores Va y V illa, actuando como cofactores el propio factor V y la proteína S.
10. ¿Cuál es la principal función del cofactor II de la heparina?
(a) Inhibe el FcXa.
(b) Inhibe el complejo factor tisular-FcVIIa.
(c) Es un inhibidor de la proteina C.
(d) Es un inhibidor del sistema fibrinolítico, pues bloquea el activador tisular del plas
minógeno.
(e) El cofactor II de la heparina inhibe exclusivamente la trom bina de forma relativamente
lenta y en presencia de sulfato de derm atán incrementa m ucho esta reacción.
Respuesta razonada: el cofactor II de la heparina se sintetiza en el hígado. Tiene una alta ho
mología con la antitrom bina III pero, a diferencia de esta, solo inhibe la trom bina de forma
relativam ente lenta. En presencia de glucosam inoglucanos, y concretam ente de sulfato de
dermatán, incrementa extraordinariamente la reacción de inhibición de la trombina.
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C A P Í T U L O 23
Métodos para el diagnóstico de los trastornos

hemorrágicos y trombofilia
M. Borrell, I. Tirado y J. Fontcuberta
INTRODUCCIÓN
El estudio de la hemostasia tiene dos grandes objetivos. Por un lado, buscar alteraciones
que expliquen una tendencia o riesgo hemorrágico que presente un enfermo y, por otro,
buscar alteraciones que supongan un riesgo trombótico: trombofilia.
Los métodos que se utilizan para estudiar la hemostasia son de tres tipos:
1. Los que estudian la hemostasia primaria.
2. Los que estudian la actividad o concentración de las proteínas de la coagulación
y la fibrinólisis.
3. Los que estudian variantes genéticas asociadas a trombofilia.
Como se ha dicho en el capítulo anterior, el esquema clásico de la coagulación que
comprende las vías intrínseca, extrínseca y común es una simplificación y no responde
exactamente a la fisiología de la hemostasia. Sin embargo, esta visión sigue siendo útil
para el diagnóstico del síndrome hemorrágico.
El estudio del riesgo hemorrágico se inicia a partir de unas pruebas globales básicas
que exploran las vías extrínseca (tiem po de protrom bina) e intrínseca (tiem po de
trom boplastina parcial activada). Si alguna de ellas está alterada el estudio continúa
hacia los factores que intervienen en estas pruebas.
Hay que tener en cuenta sin embargo, que el estudio básico de la hemostasia suele
ser normal en determinados síndromes hemorrágicos, algunos raros (p. ej., las trom -
bocitopatías congénitas o el déficit de factor XIII), pero otros muy frecuentes (p. ej., las
formas moderadas de la enfermedad de von Willebrand).
En el estudio de la trombofilia los análisis se dirigen especialmente a las proteínas
reguladoras de la hemostasia (en especial antitrombina y vía de la proteína C) y a algunas
variantes genéticas que se asocian con el riesgo trombótico.
En los casos en que se detecta una alteración hereditaria, se recomienda realizar el
estudio familiar para detectar a aquellos miembros afectos de la misma alteración y así
poder valorar el posible riesgo y aplicar una medicina preventiva adecuada en cada caso.
Expresión de los valores de las proteínas de la hem ostasia

La actividad de los factores e inhibidores fisiológicos de la coagulación se expresa en
unidades. Por convenio internacional, una unidad equivale a la actividad contenida
en 1 mi de una mezcla de plasmas normales. La expresión en tanto por ciento de actividad
es incorrecta (para cualquier resultado analítico), pero está fuertemente establecida por la
costumbre. Aunque no totalmente correcta, es frecuente la expresión en unidades por di,
que conserva el mismo valor numérico del tanto por ciento.

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La interpretación de los resultados analíticos requiere un suficiente conocimiento

de la fisiopatología de la hemostasia y una correcta valoración clínica del paciente. Es
la clínica la que orientará la búsqueda de una alteración congénita o adquirida, y la que
hará sospechar un defecto de la hemostasia primaria o bien de la coagulación, en función
del tipo de manifestaciones hemorrágicas.
EXPLORACIÓN DE LA HF.MOSTASIA PRIMARIA

Tiem po de sangría (Ivy)
Esta prueba valora la capacidad hemostática global in vivo y consiste en medir el tiempo
que tarda en cesar la hemorragia después de realizar un pequeño corte. Sin embargo,
esta determinación in vivo se considera una prueba imprecisa e invasiva por lo que se ha
ido sustituyendo por el analizador de la función plaquetaria (platelet function analyzer
o PFA-100®).
A nalizador de la función plaquetaria o PFA-100®

Este analizador aporta una inform ación similar al tiem po de sangría con resultados
más reproducibles. Se basa en pasar una m uestra de sangre citratada fluyendo con altas
fuerzas de cizallamiento (5.000-6.000 s“‘), a través de una abertura en una membrana
recubierta de colágeno y un inductor: epinefrina o adenosina 5 '-difosfato (ADP). La
sangre es impulsada por una bomba a través de la membrana, las plaquetas se unen al
colágeno, se activan y empieza la agregación plaquetaria. Al agregarse se va ocluyendo
la abertura de la membrana hasta que no permite el flujo de sangre. El tiempo que tarda
en ocluirse se llama tiempo de obturación (TO) y se mide en segundos.
Material
• PFA-100®.
• Cartucho de colágeno-epinefrina.
• Cartucho de colágeno-ADP.
• Los cartuchos se conservan en nevera y se deberán sacar de ella y mantener a tempe
ratura ambiente un mínimo de 15 min antes de ser utilizados.
Muestra
• Se utilizarán muestras de sangre extraída sobre citrato sódico (aceptable entre 0,1 y
0.129.mol/1, pero siempre tamponado) en proporción 1/10 sobre el volumen final,
en tubos de vidrio siliconado.
• Las muestras de sangre se utilizan sin centrifugar y en un plazo máximo de 4 h a partir
de su extracción mantenidas a temperatura ambiente.
Método
1. Se efectúan los procedimientos diarios de puesta en marcha y autoverificación, de
acuerdo a las instrucciones del fabricante, hasta que la pantalla principal indique
«sistema preparado».
2. Se coloca un cartucho de colágeno-epinefrina en la posición A del soporte para
cartuchos y se pone en el carrusel.
3. Se mezcla suavemente la m uestra de sangre total, evitando la form ación de
burbujas, y se pipetean 800 |xl de ella en el orificio anterior del cartucho, con
suavidad para no formar burbujas.
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Capítulo 23 Métodos para el diagnóstico de los trastornos hemorrágicos y trom bofilia 693
4. Se selecciona «Run» en la pantalla mediante el botón correspondiente del teclado.

Transcurrido el tiempo de aspiración aparece el resultado del TO en la pantalla
y por impresora. Los resultados fuera del margen de referencia están marcados
con un asterisco.
El cartucho colágeno-ADP se valorará, con iguales pasos.

Cada laboratorio deberá establecer el margen de referencia para sus resultados (la concen
tración de la solución de citrato puede influir en ellos).
El TO aporta información sobre el funcionalismo plaquetario de la muestra, y se en
cuentra alargado en patología plaquetaria y enfermedad de von Willebrand (tabla 23-1).
Limitaciones del método

• La existencia de microtrombos o de impurezas p or partículas extrañas puede inte
rrum pir el flujo dando resultados falsamente cortos.
• Un hem atocrito < 3 5 % o un núm ero de plaquetas < 150.000/(jl1 puede dar TO
elevados.
• Hay que revisar los medicamentos que tom a el paciente, ya que m uchos de ellos
afectan al funcionalismo plaquetario.
Interferencias al ensayo
Hemólisis, debido a la disminución del hematocrito y liberación de ADP.
Estudio de la agregación plaquetaria

La agregometría es el método general para el estudio in vitro de la función plaquetaria.
Principio
Se deposita plasma rico en plaquetas (PRP), obtenido a partir de sangre citratada, en
una cubeta transparente, a una tem peratura de 37 °C y con agitación continua por
medio de una barrita de hierro sometida a un campo magnético giratorio. La cubeta está
atravesada por un haz de luz y cuando, tras introducir un agente inductor, se produce
la agregación, aum enta la transmisión de luz a través de la cubeta, y su intensidad es
recogida gráficamente.
Material
• Agregómetro con registrador gráfico. Existen diversos modelos en el mercado.
• Cubetas siliconadas y barritas de agitación magnética.
• Micropipeta de 5 0 |xl.
TABLA 23-1. Tiempos de obturación en distintos individuos
Cartucho Normal Ácido Enfermedad de Tromboastenia

acetilsalicílico von Willebrand de Glanzmann
Colágeno/epinefrina Normal Anormal Anormal Anormal
Colágeno/ADP Normal Normal Anormal Anormal
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• Agentes agregantes:
• Adenosina difosfato (ADP).
• Colágeno.
• Ácido araquidónico.
• Ristocetina.
Pueden ser útiles otros agentes como la epinefrina, la trom bina o U46619 (análogo
del tromboxano), en determinados estudios.
Existen diversas presentaciones en el mercado.
Método
1. Preparación de la muestra:
(a) Se extrae la sangre sobre citrato sódico en proporción 1/10, en los tubos
habitualmente utilizados para pruebas de coagulación.
(b) Se centrifuga la sangre a 160 g durante 10 m in, a tem peratura ambiente
y sin freno para ob ten er el PRP. Se separa este en un tu b o de plástico
mediante una pipeta Pasteur de plástico o con pipeta automática con punta
de plástico.
(c) Se centrifuga de nuevo el remanente de los tubos de sangre total a 1.500 g
durante 20 min para obtener el plasma pobre en plaquetas (PPP).
2. Preparación de los reactivos. Los reactivos se disuelven de acuerdo con las ins
trucciones del fabricante y luego se ajustan a las siguientes concentraciones:
(a) ADP: se preparan dos diluciones con concentraciones de 20 y 50 (xmol/l que
corresponden a concentraciones finales (c.f.) en la cubeta: 2 y 5 (xmol/1.
(b) Colágeno: se preparan dos diluciones con concentraciones de 20 y 50 mg/1
(c.f.: 2 y 5 mg/1).
(c) Ácido araquidónico: se prepara a 15 mmol/1 (c.f.: 1,5 mmol/1). Puede venir
ya diluido.
3. Realización de la prueba. Se prepara el equipo y se siguen las instrucciones del
fabricante.
(a) En general, se empieza introduciendo 450 |xl de PPP del paciente en una
cubeta y se introduce en la cámara de detección para ajustar el 100% de
transmisión de luz.
(b) En o tra cubeta se dispensan 450 |xl de PRP con u n a barrita agitadora y
se introducen en la cám ara de detección. Con el PRP se ajusta el 0% de
transm isión de luz. Se incuba 1-2 m in para estabilizarse y se alcanzan los
37 °C.
(c) En la cubeta con PRP, se dispensan 50 |xl del inductor poniendo en marcha
el registro durante 5 min.

Si no hay respuesta al ácido araquidónico se recomienda estudiar la agregación con
un análogo del trom boxano (U46619), para distinguir un defecto en el receptor del
tromboxano (falta de agregación con U46619) o un defecto en vía de la ciclooxigenasa
(agregación norm al al U46619) (tabla 23-2).
Valoración del factor von W illebrand

El estudio para descartar un defecto del factor von Willebrand (FvW) incluye habitual
mente las pruebas desarrolladas a continuación.
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TABLA 23-2. Respuesta a distintos inductores en algunos defectos del funcionalismo

plaquetario
Ác. araquidónico ADP Colágeno U4669 Ristocetina

Defecto de la No agrega Disminuida Disminuida Normal Normal
ciclooxigenasa
Defecto No agrega Disminuida No agrega No agrega Normal
tromboxano
Defectos de Normal Disminuida Disminuida Normal Normal
almacenamiento
(storage pool
disease)
Bernard-Soulier Normal o Normal o Normal Normal No agrega
disminuida disminuida
Tromboastenia No agrega No agrega No agrega Normal
de Glanzmann
Valoración inmunológica (FvW:Ag)

Esta determinación nos informa de la cantidad de FvW presente en el plasma, indepen
dientemente de su funcionalidad.
El método más usado es el de ELISA con anticuerpos dirigidos contra el FvW, que se
puede automatizar en analizadores para técnicas de ELISA.
Otros sistemas utilizan métodos inmunoturbidimétricos con partículas de látex a las
que se ha unido un anticuerpo anti-FvW. El FvW del plasma aglutina estas partículas y
la turbidez que se produce es proporcional al FvW presente en la muestra. Este método
es automatizable en algunos coagulómetros.
En ambos casos se necesita un plasma calibrado frente al estándar internacional para
realizar la curva estándar y uno o dos controles de calidad internos.
Los dos métodos tienen un límite de sensibilidad de alrededor de 5 U/dl (5%), por
lo que su precisión es escasa por debajo de estos valores.
Se consideran valores normales los comprendidos entre 50 y 150 U/dl (50-150%),
aunque, como para otros parámetros, cada laboratorio deberá establecer su margen de
referencia.
Valoración funcional
Este grupo de pruebas valoran las distintas propiedades que tiene el FvW.
D eterm inación del cofactor de la ristocetina (FvW:RCO)

Es el método estándar para estudiar la funcionalidad del FvW.
Principio
Valora la interacción del FvW con el receptor GPIb-V-IX de las plaquetas. El antibiótico
ristocetina produce un cambio estructural en la molécula del FvW que favorece la unión
al receptor de la glucoproteína Ib (GPIb) de las plaquetas produciendo su agregación.
Esta agregación será tanto más intensa cuanto más elevada sea la concentración de FvW.
Determinación manual o semicuantitativa
Esta técnica es muy delicada en su realización y su reproducibilidad escasa.
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MATERIAL. Para llevar a cabo este método se requiere:

• Reactivo: contiene una suspensión de plaquetas humanas estabilizadas, ristocetina y
EDTA.
• Placa de vidrio transparente con seis campos.
• Suero fisiológico.
MUESTRA. Se hacen diluciones del plasma del enfermo con suero fisiológico, desde
1/1 a 1/200.
MÉTODO
1 . En cada campo se mezclan 50 |xl de la dilución del plasma o un blanco (suero
fisiológico) y 50 |jl1 del reactivo.
2. Se agita lentamente durante 1 m in y se deja en reposo 1 min.
3. Se lee la aglutinación comparándola con el blanco (no aglutinación).
El resultado se obtiene multiplicando el título de la muestra (última dilución en la
que se observa una aglutinación clara) por el límite de detección del reactivo que está
definido en el vial y depende del lote.
Determinación por agregometría

PRINCIPIO. La velocidad de agregación de las plaquetas inducida por la ristocetina es
proporcional a la concentración de FvW.
• Suspensión de plaquetas normales fijadas en formol.
• Ristocetina.
• Calibrador de plasma control calibrado para el FvW. La concentración dependerá de
cada lote.
• Controles de calidad calibrados para el FvW.
• Solución salina tam ponada con Tris (NaCl, 0,15 M; Tris, 0,05 M).
• Agregómetro con registrador gráfico, cubetas y barritas de agitación magnética y
micropipeta de 50 |xl.
MUESTRA. Plasma pobre en plaquetas.
MÉTODO. Existen diversos m étodos de trabajo, dependiendo del agregómetro de que
se disponga.
• Se preparan los reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
• Curva estándar: se preparan un m ínim o de tres diluciones del calibrador con la
solución salina tamponada.
• Muestra del paciente diluida 1/2 y 1/4 con solución salina tamponada.
• Blanco de agregación: se pipetean en una cubeta 2 5 0 jjlI de suspensión de plaquetas
y 2 5 0 (xl de solución salina con una barrita de agitación.
Procedimiento:
1. Se establece el blanco en cada canal con la muestra anterior.
2. Se depositan 400 |xl de la suspensión de plaquetas en una cubeta de agregómetro
para cada muestra estudiada. Se añade una barrita de agitación.
3. Se coloca la cubeta en el agregómetro y se añaden 50 |xl de ristocetina (a 10 mg/ml)
a la cubeta.
4. Se incuba durante 3 min a 37 °C.
5. Se añaden 50 |xl de dilución del plasma estándar, de los controles o de los pacientes.
6. Se deja agregar durante 5 min.
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7. Se traza la tangente a la pendiente máxima de cada curva.

8. Utilizando papel bilogarítm ico se representan los valores de las unidades (o
porcentajes) correspondientes a las diluciones del plasma control en el eje de las
abscisas y la pendiente de la agregación en el eje de las ordenadas. Con ello se
construye la recta de calibración. Sobre ella se interpolan las pendientes de las
muestras problema y se transforman en unidades (o tantos por ciento).
9. Algunos agregómetros tienen incorporado un programa para calcular las pen
dientes, realizar la curva de calibración e interpolar los resultados de los pacientes.
INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO. Se consideran valores normales los comprendidos
entre 50 y 150 U /dl (50-150%), aunque, como para otros parámetros, cada laboratorio
deberá establecer su margen de referencia.
El límite de sensibilidad es relativamente alto, alrededor de 15-20 U /dl (15-20%).
A ctividad d el factor vo n W illebrand (receptor de la glu cop roteín a Ib)

Principio
Es un método inmunoturbidimétrico amplificado con partículas de látex. Las partículas
de látex están cubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-FvW dirigido específicamen
te al sitio de unión del FvW a las plaquetas (receptor de la GPIb). Este anticuerpo une
el FvW presente en el plasma y aglutina las partículas de látex. El grado de aglutinación
es proporcional al FvW de la muestra y se determina midiendo el descenso de luz trans
mitida que se produce al agregarse las partículas de látex.
Las diluciones de un plasma con una concentración conocida de FvW permiten que
se realice la curva de calibración, a la que se interpola luego la aglutinación que produce
cada muestra.
Material
• Partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo anti-FvW (receptor GPIb).
• Plasma calibrado con el que se realizará la curva.
• Controles de calidad.
• Coagulómetro con capacidad para leer la aglutinación de partículas de látex.
Capacidad de u n ión al colágeno

Principio
Este ensayo valora la capacidad que posee el FvW de unirse a los com ponentes del
subendotelio, concretamente al colágeno.
Para valorar esta función se utilizan placas recubiertas de colágeno tipo I/III, so
bre las que se incuba la m uestra problema. El FvW del plasma se une al colágeno y la
cantidad que se ha unido se valora mediante una técnica de ELISA con u n anticuerpo
anti-FvW marcado con una enzima y un sustrato sensible a esta enzima.
El límite de sensibilidad es parecido a la determ inación antigénica: alrededor de
5 U /dl (5%). El principal problema de esta técnica es la falta de estandarización, ya que
diferentes reactivos comerciales utilizan distintas proporciones de colágeno de tipo I o III.
Capacidad de u n ión al factor VIII

Si el FvW no se une correctamente al factor VIII, este se degrada más rápidamente y en
el plasma encontramos niveles de factor VIII bajos que pueden confundirse con una
hemofilia leve.
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TABLA 23-3. Resultados de las pruebas de laboratorio en la enfermedad de von W illebrand
Actividad, cofactor
Antígeno ristocetina, unión Unión al RIPA1,5 RIPA0,5
Tipo FvW:Ag al colágeno Fe VIII mg/ml mg/ml Multímeros
1 i i Concuerda con Normal i No agrega Normal
FvW:Ag
2A Normal ■l Respecto al FvW:Ag Normal i No agrega Faltan los
o -l de alto PM
2B Normal vi Respecto al FvW:Ag Normal Normal Sí agrega Faltan los
oi de alto PM
2M Normal vi Respecto al FvW:Ag Normal i No agrega Normal
oi
2N Normal Normal u Normal No agrega Normal
3 <5% <5% —
4- indica disminución.
Principio
Se utiliza una técnica de ELISA en la que el FvW del paciente se une a una placa que está
recubierta con un anticuerpo anti-FvW. Se elimina el factor VIII endógeno y se añade
una cantidad fija de factor VIII (en general recombinante) que se unirá al FvW a menos
que el paciente tenga un defecto de unión al factor VIII. La cantidad de factor VIII que
se fija a la placa se detecta con un anticuerpo antifactor VIII marcado con una enzima
(en general peroxidasa) y un sustrato sensible a la enzima.
Un defecto en la unión al factor VIII es sugestivo de enfermedad de von Willebrand
tipo 2 N.
Agregación plaquetaria inducida p o r la ristocetina (RIPA)

Esta prueba se suele hacer como parte de un estudio de la función plaquetaria. El funda
mento es el mismo que la determinación de la actividad del cofactor de la ristocetina con
el test de agregometría, pero las plaquetas son del mismo paciente. Se utilizan concen
traciones de ristocetina de 0,5 y 1,5 mg/ml.
Una respuesta baja a 1,5 mg/ml no discrimina entre una enfermedad de von Wi
llebrand o un defecto plaquetario como el síndrome de Bernard-Soulier (ausencia del
receptor plaquetario GPIb).
Una respuesta mayor del 30% a una concentración de 0,5 mg/ml indica hiperrespuesta
característica de la variante de vW tipo 2B.
Análisis de los m ultím eros del factor von W illebrand

Se trata de estudiar la estructura multim érica del FvW, identificando la distribución
de las formas de sus diferentes pesos moleculares. Se basa en una separación de los
multímeros en función de su tamaño mediante electroforesis en agarosa-SDS y posterior
transferencia a un filtro de nitrocelulosa. Este se revela con una IgG anti-FvW humano
y un segundo anticuerpo anti-IgG marcado con una enzima. Al añadirle su sustrato se
produce un precipitado insoluble de color que nos m ostrará la presencia o ausencia de
los multímeros de diferente peso molecular.
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Los niveles de FvW son más bajos en los individuos del grupo sanguíneo O comparado
con los otros grupos.
Por otro lado, las situaciones de estrés como cirugía, inflamación sistémica, ejercicio,
embarazo, anovulatorios, etc. dan lugar a un incremento en los valores del FvW que
pueden enmascarar niveles basales bajos de esta proteína (tabla 23-3).
ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS DE LA HEMOSTASIA

Preanalítica y m étodos
Obtención y preparación de las muestras
Las condiciones preanalíticas son de gran importancia para las pruebas de hemostasia
y los problemas en esta fase son responsables de la mayoría de los errores analíticos.
• La extracción de sangre ha de ser por punción venosa limpia y no precedida por una
estasis prolongada por torniquete. (Hay que evitar que se libere tromboplastina.)
• La sangre se recoge en tubos de plástico o vidrio siliconado sobre citrato sódico a 105
o 129 mol/1, en una proporción de nueve partes de sangre sobre una de citrato.
• Se debe mezclar inmediatamente y con suavidad la sangre con el citrato, invirtiendo
2-3 veces el tubo.
• Los tubos se transportan a temperatura ambiente (15-25 °C).
• Al llegar al laboratorio hay que comprobar que el tubo en que se ha recogido la sangre
sea el correcto (citrato), que el volumen de sangre y citrato sea el correcto y que la
sangre no esté coagulada.
• Preparación del plasma pobre en plaquetas (excepto en las pruebas que se realizan en
sangre total o en plasma rico en plaquetas). Los tubos se centrifugan a 1.500 g durante
20 min a una temperatura entre 15-25 °C.
• El plasma se procesa en un plazo de 4 h o se congela a —20 °C para su posterior
análisis. Una vez descongelado el plasma no se puede volver a congelar.
La conservación prolongada a temperatura ambiente conlleva una inactivación parcial
de los factores V y VIII, mientras que la refrigeración prolongada activa el factor VII.
Tipos de métodos
Métodos coagulativos
Se basan en la inducción de la coagulación con un activador y la medida del tiempo que
tarda en formarse fibrina.
La detección de la fibrina se puede realizar mediante dos sistemas:
1. Sistemas mecánicos, que miden los cambios físicos que produce la aparición de
fibrina: aumento de la viscosidad que influye en el arrastre de una bola, cambios
en la conductividad, etc.
2. Sistemas ópticos, que miden los cambios en la turbidez de la m uestra que se
producen al formarse la fibrina.
Métodos que utilizan sustratos cromogénicos

Se utilizan para evaluar la actividad de enzimas, proenzimas o inhibidores de enzimas.
Los sustratos cromogénicos son pequeños péptidos sensibles específicamente a la
acción de la enzima que se estudia, a los que se les ha unido una molécula (cromóforo)
que al liberarse genera color. La enzima rompe el sustrato liberando el cromóforo y el
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color que se produce se mide en un espectrofotómetro y es proporcional a la actividad

de la enzima presente en la muestra.
Si se realiza una técnica manual se detiene la última reacción (enzima sobre el sus
trato), en general con un ácido, y se mide la densidad óptica (DO).
En los instrumentos automáticos no se para la reacción y se mide el incremento de
DO/min.
La actividad se refiere a una curva de calibración preparada con un plasm a que
contiene cantidades conocidas de la proteína que se estudia: calibrador. Se construye la
curva de calibración con las absorbancias (o incremento de absorbancia/min) frente a
la concentración de cada punto de la curva. En ella se extrapolan las absorbancias de las
muestras problema y se obtiene la concentración.
Asimismo, hay que incluir controles de calidad internos, que son plasmas con una
cantidad conocida de la proteína que se estudia. Una vez aceptada la curva y comprobado
que el valor del control entra en el rango estipulado por el fabricante, se valoran los
pacientes.
Si lo que se valora es una proenzima, prim ero se tiene que pasar a enzima activa
mediante un activador y luego valorar su actividad sobre el sustrato.
En el caso de un inhibidor se estudia su capacidad para inhibir una enzima. Para ello
se incubará el plasma con una cantidad fija de la enzima y se evaluará la enzima residual
sobre el sustrato.
M étodos inm unológicos

Con ellos se mide la cantidad de proteína presente en el plasma, independientemente
de si es o no funcional.
Determinaciones por ELISA (enzimoinmunoensayo)

Son las que se utilizan con mayor frecuencia.
Se usan placas de plástico con diversos pocilios (en general 96) en los que se ha
insolubilizado un anticuerpo específico contra la proteína que se quiere determinar. Se
introduce en los diferentes pocilios la curva de calibración (muestras con concentraciones
conocidas de la proteína), los controles y los plasmas problema. La proteína específica
se unirá al anticuerpo quedando retenida en la placa. Tras varios lavados se añade un
segundo anticuerpo contra la proteína, marcado con una enzima. El anticuerpo con la
enzima se unirá a la proteína unida a la placa. Se añade luego un sustrato cromogénico
sensible a esta enzima que lo va a romper. El color que se produce al romperse el sustrato
es proporcional a la proteína que se está determinando. Se lee en un espectrofotómetro
especial para placas de ELISA.
Con el calibrador se construye la gráfica de la absorbancia de cada punto frente a su
concentración y en ella se extrapola la concentración de la muestra en función de su
absorbancia.
Determinaciones por aglutinación de partículas de látex

Se utilizan partículas de látex a las que se ha unido un anticuerpo contra la proteína que
se quiere valorar.
Se incuba el plasma problem a con estas partículas y la aglutinación producida es
proporcional a la concentración de la proteína.
La valoración de la aglutinación puede ser:
• Semicuantitativa: cuando se hace una lectura a simple vista y con diluciones crecientes
del plasma.
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• Cuantitativa: con métodos inmunoturbidimétricos. Se mide la turbidez de las par

tículas de látex al aglutinarse. Se utilizan en aparatos automáticos que puedan leer
la aglutinación. Las determinaciones se realizan junto a una curva de calibración y
controles de calidad internos.
Con el calibrador se construye la gráfica de la turbidez de cada punto de la curva
frente a su concentración y en ella se extrapola la concentración de la muestra en función
de su turbidez.
Inmunodifusión radial
Se utilizan placas de agarosa que contienen un anticuerpo contra la proteína que se
quiere dosificar. Se deposita el plasma en pequeños pozos y se deja difundir. El antígeno
se combina con el anticuerpo formando complejos solubles hasta que alcanza el punto
de equivalencia, entonces precipita formando un círculo insoluble alrededor del pozo.
El diámetro del precipitado es proporcional a la concentración del antígeno en la mues
tra. Con diluciones de un calibrador se prepara la curva de calibración que se trata de
la mism a m anera que las m uestras. En papel milim etrado se dibuja la gráfica de las
concentraciones del calibrador frente a los diámetros (o producto de dos diámetros)
de los círculos obtenidos, y sobre ellos se extrapolan los resultados de los diámetros de
las muestras.
Exploración de la coagulación
Introducción
Actualmente, la casi totalidad de las pruebas de coagulación se realiza mediante coagu-
lómetros automáticos, no obstante se describirán unas indicaciones generales para su
realización semiautomática de forma que se pueda aplicar a cualquier instrumento de
medida.
Estudio básico de la coagulación

La exploración de la coagulación sanguínea se basa en la realización de dos pruebas
globales, el tiempo de protrom bina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPA), que se complementan con una valoración de la formación de fibrina mediante la
determinación del tiempo de trom bina y la realización funcional del fibrinógeno. Sobre
la base de los resultados de estas pruebas se puede realizar una aproximación diagnóstica
cuya confirmación puede requerir la determinación específica de factores.
Valoración global de la vía extrínseca: tiempo de protrombina

Principio
El plasma citratado, en presencia de tromboplastina (factor tisular y una mezcla de fos-
folípidos) y cloruro cálcico se coagula a una velocidad dependiente de las actividades de
la protrom bina (factor II), los factores V, VII, X y el fibrinógeno, siempre que no existan
inhibidores de la reacción.
M aterial
• Tromboplastina cálcica.
• Plasma citratado del paciente.
• Plasma citratado control, preparado en el laboratorio (mezcla de 40-50 plasmas de
donantes sanos) o bien comercial.
• Coagulómetro.
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M étodo
1. Se dispensa un volumen (habitualmente 100 jjlI) de plasma en las cubetas de
reacción del aparato utilizado y se deja calentar a 37 °C durante 2 min.
2. Se añaden dos volúmenes (200 jjlI) de tromboplastina cálcica, previamente incu
bada a 37 °C, y se mide el tiempo de coagulación.
3. Es imprescindible que se realice simultáneamente la valoración de un plasma
control (control interno).
E xpresión del resultado

Los resultados del paciente, en segundos, se expresan como razón del tiempo del paciente/
tiempo de la media de unos 50 controles, ya que los tiempos dependen del reactivo y
del instrumento utilizado.
El tiem po de los controles se obtendrá m idiendo el TP en segundos de unos 50
individuos sanos sin patología coagulativa. Se eliminan aquellos resultados que se hallen
fuera de ±2 DE, se establece de nuevo la media y se calcula el valor p or el que deben
dividirse los segundos de los pacientes, mientras se utilice el mismo lote de reactivo y
el mismo aparato.
La mayoría de coagulómetros disponen de programas en los que se puede introducir
este valor y muestran directamente la razón segundos paciente/segundos control.
Control del tratamiento anticoagulante oral (TAO)

Los resultados se expresan en forma de «razón normalizada internacional (INR)», que
representa la razón que se habría obtenido si se hubiera realizado la prueba con la primera
tromboplastina de referencia humana de la OMS.
El cálculo de la INR requiere que se conozca la sensibilidad de la trom boplas
tina para el aparato (dato aportado p o r el fabricante), expresada como «índice de
sensibilidad internacional (ISI)». C onocida esta, el cálculo se realiza m ediante la
fórmula:
INR = (P /C )ISI
en donde P/C es la razón del tiempo del paciente dividido por el del control.
Ejemplo:
Si el TP del paciente es de 27 s y el del control de 12 s, la razón P/C será 27/12 = 2,25.
Sea 1,15 el ISI de nuestra tromboplastina, entonces:
INR = 2,25U5= 2,54
Esta forma de expresión permite comparar resultados para el control del tratamiento
anticoagulante oral realizados en diferentes laboratorios con reactivos de distinta sensi
bilidad. La mayor parte de los coagulómetros calculan de forma automática el valor de
INR una vez introducido el ISI del lote de tromboplastina en uso.
Interpretación d el resultado
El TP es sensible al déficit de los factores de la vía extrínseca: II, V, VII, X. La prueba es
muy sensible a la hipo- o disfibrinogenemia y a cualquier trastorno en la polimerización
de la fibrina.
Se consideran valores normales las razones de 1,2 o menores aunque, como para otros
parámetros, cada laboratorio deberá establecer su margen de referencia.
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Valoración global de la vía intrínseca: tiempo de tromboplastina parcial

activada o tiempo de cefalina
Principio
El reactivo de tromboplastina activada (o cefalina) contiene una mezcla de fosfolípidos
y un activador de la fase de contacto (caolín, celite, sílice, etc.) con elevada carga eléc
trica negativa.
El activador inicia la coagulación activando los factores de la fase del contacto:
(precalicreína, quininógeno de alto peso molecular, factor XII). Al añadir calcio, el
plasma coagula a una velocidad que depende de la concentración de los factores de la
vía intrínseca: precalicreína, quininógeno de alto peso molecular y factores XII, XI, IX
y VIII, siempre que no existan inhibidores de la reacción.
M aterial
• Tromboplastina activada.
• Solución de cloruro cálcico de 25 mmol/1.
• Plasma citratado control preparado en el laboratorio o comercial.
• Coagulómetro.
M étodo
1. Se dispensa un volumen (habitualmente 100 |xl) de plasma en las cubetas de
reacción del aparato utilizado y se deja calentar a 37 °C durante 2 min.
2. Se añade un volumen (100 |jd) de trom boplastina, que se habrá m antenido a
temperatura ambiente, y se pone en marcha un prim er cronómetro.
3. Al cabo de 3-5 min de incubación (según las instrucciones del reactivo) se añade
un volumen (100 |xl) de cloruro cálcico, previamente incubado a 37 °C, y se mide
el tiempo de coagulación que, para la mayoría de los reactivos comerciales, es de 25
a 35 s para el plasma normal.
4. Es imprescindible que se realice simultáneamente la valoración de un plasma
normal como control interno.
E xpresión del resultado

El resultado se suelen expresar como la razón del tiem po en segundos de paciente/
tiempo de la media de unos 50 controles, ya que los tiempos dependen del reactivo y
del instrumento utilizado.
Como en el caso del TP, el tiempo de control se obtiene midiendo el TTPA en segun
dos de unos 50 individuos sanos sin patología coagulativa, se eliminan aquellos resultados
que se hallen fuera de ±2 DE, se establece de nuevo la media y se calcula el valor por
el que deben dividirse los segundos de los pacientes Este valor será válido mientras se
utilice el mismo lote de reactivo y el mismo aparato.
El TTPA es sensible al déficit de los factores de la vía intrínseca, factores VIII, IX, XI y
XII y a los del contacto. Es también sensible, aunque en m enor grado, a los déficits de
factores de la vía común: X, V, II y fibrinógeno.
La prueba es especialmente dependiente de la concentración de factor VIII, de manera
que elevaciones reactivas del mismo pueden enm ascarar deficiencias moderadas de
otros factores.
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Habitualmente, se consideran valores normales las razones de 1,3 o menores.

Es m uy sensible a la presencia de heparina no fraccionada, que es la prueba más
utilizada para el control del tratamiento con este anticoagulante.
Tiempo de trombina
Principio
La adición de bajas concentraciones de trom bina al plasma da lugar a la coagulación
del fibrinógeno en un tiempo que dependerá no solo de la concentración de este, sino
también de la funcionalidad de la molécula y de la presencia de inhibidores de la for
mación de fibrina.
M aterial
• Trombina humana o bovina concentrada (50 U NIH/ml) como solución madre que
se conservará congelada en pequeñas alícuotas. Para realizar la prueba se diluye hasta
que el tiempo de la prueba sea de 15 a 20 s para el plasma normal, lo que se obtiene
a concentraciones de 5 a 7 U NIH/ml.
• Plasma citratado de paciente y control (preparado en el laboratorio o comercial).
• Coagulómetro.
M étodo
1. Se dispensan dos volúmenes (200 |xl) de plasma problema en u n tubo o cubeta
de coagulómetro y se deja incubar durante 2 min a 37 °C.
2. Se añade un volumen (100 |xl) de trom bina diluida y se mide el tiempo de coa
gulación.
3. Se realiza la prueba con el plasma control normal, cuyo resultado acompañará al
del paciente.

Cada laboratorio tiene que establecer sus márgenes de normalidad. Una prolongación
de más de 5 s con respecto al valor norm al indica una anomalía. La prueba se pro
longa por reducción en la concentración de fibrinógeno, pero también p o r marcada
elevación del m ism o (más de 6 g/1) y p or alteraciones funcionales de su molécula
(disfibrinogenemia), frecuentes en las hepatopatías. Es m uy sensible a la presencia de
heparina y se prolonga también por interferencias en la polimerización de la fibrina,
como la concertación elevada de productos de degradación de la fibrina (dímero D)
o del fibrinógeno (PDF).
Tiempo de reptilasa
Puede considerarse una variante del anterior. El veneno de las víboras del género Both-
rops contiene una enzima que coagula el fibrinógeno y cuya actividad no es interferida
por la presencia de heparina.
M aterial
• Solución que contiene la enzim a coagulante (existen varias preparaciones en el
mercado) diluida de forma que el plasma control coagule en unos 15 a 20 s.
• Plasma citratado de paciente y control (preparado en el laboratorio o comercial).
• Coagulómetro.
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M étodo
1. Se dispensan dos volúmenes (200 (xl) de plasma problema en la cubeta del coa-
gulómetro y se deja incubar durante 2 min a 37 °C.
2. Se añade un volumen (100 (jlI) de la solución de reptilasa y se mide el tiempo de
coagulación.
3. Se realiza la prueba con el plasma control normal, cuyo resultado acompañará al
del paciente.
Cada laboratorio tiene que establecer sus márgenes de normalidad. Una prolongación de
más de 5 s con respecto al valor normal indica una anomalía. Se trata de una prueba com
plementaria del tiempo de trombina, ya que se prolonga por las mismas causas que este
excepto por la presencia de heparina o de inhibidores directos de la trombina. Su normalidad
en presencia de un tiempo de trombina prolongado señala la presencia de heparina (por
administración terapéutica o por contaminación durante su extracción) o de inhibidores de
la trombina (dabigatrán, etc.). Por otra parte permite detectar otras causas de prolongación
del tiempo de polimerización de la fibrina en pacientes tratados con heparina.
Determinación del fibrinógeno en plasma

El método más informativo es el coagulativo de Clauss, que valora el fibrinógeno funcional.
Principio
Con una concentración elevada de trom bina (70-100 U/ml) el tiempo de coagulación
de un plasma es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.
M aterial
• Trombina concentrada: 100 U NIH/ml.
• Tampón de Owren o veronal (dietil barbiturato sódico, 0,587%; NaCl, 0,125 M con
pH = 7,35.
• Calibrador: plasma citratado comercial de referencia con un nivel de fibrinógeno
funcional conocido.
• Controles de calidad: plasmas comerciales con una concentración conocida de fi
brinógeno.
• Coagulómetro.
Existen en el mercado diversas preparaciones comerciales que contienen todos los
reactivos necesarios para la realización de la prueba.
M étodo
Elaboración de la recta de calibración:
1. Se preparan diluciones al 1/5,1/10,1/20,1/40 del plasma calibrador con tampón
de Owren (tabla 23-4).
2. Se incuban dos volúmenes de plasma diluido (habitualmente 200 (xl) a 37 °C
durante 2 min.
3. Se añade un volumen de trom bina concentrada, conservada a temperatura am
biente, y se mide el tiempo de coagulación.
4. Sobre papel bilogarítmico se traza la recta de calibración, enfrentando los tiempos
de coagulación en segundos en las ordenadas con las concentraciones de fibrinó
geno en las abscisas.
ERRNVPHGLFRVRUJ
TABLA 23-4. Preparación de la curva de calibración del fibrinógeno
Concentración (g/1) (valor

Dilución Tampón (mi) Calibrador (mi) Factor del calibrador x factor)
1/5 0,4 0,1 2 Valor calibrador X 2
1/10 0,9 0,1 1 Valor calibrador X 1
1/20 0,4 0,4 de la dilución 1/10 0,5 Valor calibrador X 0,5
1/40 0,4 0,4 de la dilución 1/20 0,25 Valor calibrador X 0,25
Muestras
1. Se diluyen las muestras de plasma y los controles con tampón de Owren a 1/10.
2. Se incuban dos volúmenes de plasma diluido (habitualmente 200 jxl).
3. Se añade un volumen de trom bina concentrada (habitualmente 100 |il), conser
vada a temperatura ambiente y se mide el tiempo de coagulación.
4. Se lleva el tiempo sobre la curva de calibración y se extrapola la concentración a
la que corresponde.
5. En caso de concentraciones de fibrinógeno muy bajas, la coagulación puede no
ser detectable. En este caso se repite con m enor dilución (1/5,1/2,1/1) y se aplica
al resultado la corrección aritmética correspondiente.
La mayor parte de los coagulómetros permiten una lectura automática de la prueba
mediante los datos de calibración conservados en su mem oria. Los coagulómetros
automáticos realizan las diluciones del calibrador, la curva de calibración y extrapolan
los resultados de las muestras problema.
Se consideran valores normales los comprendidos entre 2 y 4 g/1.
Determinación inmunológica por inmunodifusión radial

Esta prueba valora la presencia de fibrinógeno independientemente de su funciona
lidad.
Principio
La m uestra se deposita en pozos preparados en un gel de agarosa que contiene un
anticuerpo antifibrinógeno. Se deja difundir durante 2-3 días y se lee el diámetro de los
círculos de precipitado que se han formado. El diámetro del círculo es proporcional a la
concentración de fibrinógeno en la muestra.
Método
Hay disponibles métodos comerciales que constan de una placa de agarosa, que contiene
un anticuerpo antifibrinógeno, con una serie de pocilios en los que se deposita el plasma
que se debe valorar.
1. Con un plasma calibrador (plasma con una cantidad conocida de fibrinógeno) se
prepara una curva con diluciones a 1/1,1/2,1/4,1/8 en suero fisiológico (NaCl,
0,9%).
2. Se introduce en los pocilios la cantidad indicada por el fabricante del plasma que
se va a valorar y de cada dilución del calibrador.
3. Se deja difundir el tiempo indicado por el fabricante.
4. Se miden dos diámetros de los círculos de difusión.
ERRNVPHGLFRVRUJ
En un papel milimetrado se representa la curva de calibración con las concentraciones

en las abscisas y los productos de dos diámetros en las ordenadas. Sobre ella se extrapolan
los productos de los diámetros de las muestras.
Fibrinógeno derivado
Es una valoración turbidimétrica que ofrecen algunos coagulómetros a partir del coágulo
obtenido en el TP. Esta determinación no es aconsejable, ya que da resultados incorrectos
fuera de los valores normales, en plasmas heparinizados, con niveles altos de PDF y en
disfibrinogenemias.
Determinación de los factores de la coagulación

La determinación de los factores de coagulación suele realizarse p or m étodos coagu-
lativos. Se utilizan mezclas del plasma del paciente diluido a 1/10 con plasmas comer
ciales carentes del factor que se va a valorar y que contiene el resto de los factores de la
coagulación en exceso.
La dosificación se basa en modificaciones de las dos pruebas globales principales, TP
y TTPA, y los tiempos con que coagulan son inversamente proporcionales a la concen
tración del factor que se valora.
V aloración de los factores de la vía extrín seca m ed ian te el tiem po

de protrom bina: factores II, V, VII y X
Principio
La determinación del TP de una mezcla de plasma carente en un factor y del plasma
problema diluido da lugar a un tiempo de coagulación inversamente proporcional a la
concentración de dicho factor en la muestra problema.
M aterial
• Tromboplastina cálcica.
• Plasma citratado calibrador (preparación comercial calibrada frente al estándar
internacional del factor que se va a valorar).
• Plasma control: preparación comercial con una cantidad conocida del factor es
pecífico.
• Plasma carente en el factor (existen diversas presentaciones comerciales para todos
los factores).
• Tampón de Owren con un pH de 7,35.
• Coagulómetro.
M étodo
ELABORACIÓN DE LA RECTA DE CALIBRACIÓN. Se preparan diluciones del calibrador
con tam pón veronal a 1/5,1/10,1/20,1/40 y 1/80. En el caso de niveles bajos de factor
se preparan diluciones a 1/160,1/320 y 1/640.
1. Se dispensa en las cubetas del coagulómetro un volumen (100 (jlI) de plasma
carente en el factor que se quiere determinar y un volumen (100 |xl) de cada una
de las diluciones de plasma calibrador.
2. Después de que se incube 2 min a 37 °C, se añaden dos volúmenes (200 |xl) de
trom boplastina cálcica y se mide el tiem po de coagulación de cada una de las
diluciones.
ERRNVPHGLFRVRUJ
3. En papel doble logarítmico se llevan los tiempos en segundos sobre las ordenadas
y las concentraciones en unidades sobre las abscisas. La dilución a 1/10 corres
ponderá a un valor cercano a 100 U/dl (100%), dependiendo del valor del plasma
calibrador, la de 1/20 a 50 U /dl (50%), la de 1/40 a 25 U /dl (25%), etc.
Se traza la recta que pase sobre los puntos.
VALORACIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA
1. Se prepara una dilución a 1/10 del plasma problema y del plasma control interno.
2. Se procesa como se ha indicado para las muestras del calibrador.
3. Se lleva el tiempo obtenido sobre la recta de calibración para obtener la concen
tración del factor a que corresponde.
Tanto la calibración como la valoración del plasma problema se realizan de forma
automática en los coagulómetros actuales.
Expresión del resultado

Los límites del margen de referencia normalmente admitidos para los factores II, VII y
X son de 80 a 120 U/dl; los del factor V son algo más amplios, de 70 a 130 U/dl, aunque,
como para otros parámetros, cada laboratorio deberá establecer su margen de referencia.
D eterm in a ción de lo s factores de la vía in trínseca (VIII, IX, XI, XII)
m ed ian te el tiem p o de trom b op lastin a parcial activada
Principio
La determinación del TTPA de una mezcla de plasma carente en un factor y del plasma
problema diluido, da lugar a un tiempo de coagulación inversamente proporcional a la
concentración de dicho factor en la m uestra problema.
Material
• Tromboplastina parcial activada.
• Solución de cloruro cálcico, 25 mmol/1.
• Plasma citratado calibrador (preparación comercial calibrada frente al estándar
internacional del factor que se quiere valorar).
• Plasma control: preparación comercial con una cantidad conocida del factor que se
quiere determinar.
• Plasma carente en el factor (existen diversas presentaciones comerciales para todos
los factores).
• Tampón de Owren, pH = 7,35.
• Coagulómetro.
Método
ELABORACIÓN DE LA RECTA DE CALIBRACIÓN. Se preparan diluciones del calibrador
con tam pón de Owren a 1/5,1/10,1/20,1/40 y 1/80. En el caso de niveles muy bajos de
factor se preparan diluciones a 1/160,1/320 y 1/640.
1. Se dispensa en las cubetas del coagulómetro un volumen (100 (xl) de plasma des
provisto del factor que se quiere determinar y un volumen (100 |xl) de cada una
de las diluciones del plasma calibrador.
2. Tras una incubación durante 2 m in a 37 °C, se añade un volumen (100 |xl) de
tromboplastina parcial activada a cada uno de los tubos y se incuba 2 o 3 m in a
la misma temperatura.
ERRNVPHGLFRVRUJ
3. Se añade un volumen de CaCl2 de 25 mmol/1 (100 (xl) y se mide el tiempo de

coagulación de cada una de las diluciones.
4. En papel doble logarítmico se llevan los tiempos en segundos sobre las ordenadas
y las concentraciones en unidades sobre las abscisas. La dilución a 1/10 corres
ponderá a un valor cercano a 100 U/dl (100%), dependiendo del valor del cali
brador, la de 1/20 a 50 U/dl (50%), la de 1/40 a 25 U/dl, etc. Se traza la recta que
pase sobre los puntos.
En general, se recomienda realizar una recta para valores de 25 a 100 U/dl y otra para
valores de 25 a 1 U/dl en el caso de realizar el m étodo semiautomático y dibujando a
mano la recta de calibración.
Los coagulómetros automáticos realizan las diluciones del calibrador, la curva de
calibración y extrapolan los resultados de las muestras problema.
VALORACIÓN DE LA MUESTRA PROBLEMA. Se llevará a cabo aplicando los pasos

siguientes:
1. Se prepara la dilución de la muestra y del control interno a 1/10 con el tampón
de Owren.
2. Se procesa como se ha indicado para las muestras del calibrador.
3. Se lleva el tiempo obtenido sobre la recta de calibración para obtener la concen
tración del factor a que corresponde.
Expresión del resultado

Los valores normales para el factor VIII oscilan entre 50 y 150 U/dl; para los restantes
factores el margen es más estrecho, aproximadamente de 80 a 120 U /dl para el factor IX
y de 70 a 130 U/dl para los factores XI y XII, aunque, como para otros parámetros, cada
laboratorio deberá establecer su margen de referencia.
Factor VIII por métodos cromogénicos: para algunos grupos este es el método de
elección para el control de los hemofílicos tratados con concentrados de factor VIII. Se
basa en mezclar el plasma del paciente que aporta el factor VIII con factor IX activado,
fosfolípidos, factor X y calcio. Se genera factor X activado que se mide sobre un sustrato
cromogénico sensible al factor X activado.
Valoración del factor XIII

Valoración cualitativa
PRINCIPIO. El factor XIII es el cimógeno de una transglutaminasa que, una vez acti
vada por la trombina, establece uniones entre los monómeros de fibrina, previamente
polimerizados de forma espontánea. Este proceso da lugar a la formación de fibrina
estabilizada, que es insoluble en soluciones de urea o ácido cloroacético, a diferencia de
la fibrina inicial o no estabilizada.
En caso de ausencia o de concentraciones m uy bajas de factor XIII, el coágulo de
fibrina será soluble en dichas soluciones.
MATERIAL. Para llevar a cabo esta valoración se requiere:

• Plasma citratado problema.
• Solución de CaCl2, 0,1 mol/1.
• Solución de ácido cloroacético al 1% (volumen/volumen) o bien de urea, 5 mol/1.
MÉTODO. Consiste en la aplicación de los pasos siguientes:
ERRNVPHGLFRVRUJ
1. Se depositan 400 |xl de plasma problema en un tubo de hemólisis y se añaden

100 fjul de CaCl2 de 0,1 mol/1. Se mezcla y se incuba a 37 °C durante 30 min, así
se produce la coagulación.
2. Se añaden 3 mi de la solución de ácido cloroacético o de urea, se mezcla para des
pegar el coágulo y se observa periódicamente la posible disolución del coágulo
durante 24 h.
INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO. El coágulo norm al permanece insoluble a las
24 h. En caso de ausencia total de factor XIII el coágulo se disuelve totalmente en unos
10 min. Una disolución precoz indicará, en cualquier caso, un déficit im portante menor
de 2 U /dl (< 2% de actividad).
Valoración semicuantitativa
Se basa en la adición de diluciones progresivas del plasma problema a una solución de
fibrinógeno carente de factor XIII, y su coagulación mediante trombina y cloruro cálcico.
Se determina la dilución mayor de plasma para la cual el coágulo permanece insoluble
en ácido cloroacético, tras 5 m in de incubación. Los resultados se comparan con los
obtenidos mediante las diluciones de una mezcla de plasmas normales:
Factor XIII (U /d lo % )= ^ r s a de la mayor dilución del problema x lQQ

Inversa de la mayor dilución del control
Determinación cuantitativa (fotométrica)

PRINCIPIO. El factor XIII del plasma es activado por la trom bina en presencia de un
péptido que inhibe la polimerización de la fibrina. El factor XIII activado une un sustrato
específico al éster glicinoetílico liberando N H y
La cantidad de N H 3 liberado es proporcional a la concentración de factor XIII y se
mide en una reacción enzimática en paralelo que calcula el decrecimiento de NADH.
FXIII + trombina —>FXIIIa

Éster glicinoetílico + sustrato peptídico + FXIIIa —» conjugado + N H 3
N H 3 + NADH + a-cetoglutarato + GLDH —>NAD + glutamato
MATERIAL. Se utilizan kits comerciales que contienen todos los reactivos necesarios:
• Activador que contiene trombina, inhibidor de la polimerización de la fibrina y CaC^.
• Reactivo NADH.
• Se diluye el activador con el reactivo NADH.
• Reactivo de detección: glutamato deshidrogenasa (GLDH), péptido como sustrato del
factor XHIa, ADP, éster glicinoetílico, a-cetoglutarato, albúmina y tampón HEPES.
• Calibrador con concentraciones conocidas de factor XIII.
• Controles con concentraciones conocidas de factor XIII.
• Lector óptico para leer la absorbancia a 340 nm.
MÉTODO
1. Se preparan los reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Se prepara la curva de calibración con diluciones entre 100 y 5 U/dl.
3. Se mezclan a partes iguales el reactivo activador y el de detección.
4. Para una determinación manual, en una cubeta de reacción a 37 °C se mezclan
100 |xl de plasma con 100 |xl de la mezcla de reactivos. Se lee la absorbancia a
ERRNVPHGLFRVRUJ
340 nm a los 5 m in y a los 10 min. Con la variación de la absorbancia/min de

cada punto de la curva, se dibuja la curva de calibración. Sobre ella se extrapolan
los resultados de cada muestra.
Se puede estandarizar en diferentes instrumentos que calcularán la curva y los resul
tados de las muestras.
Investigación de anticoagulantes circulantes (inhibidores adquiridos

de la coagulación)
Introducción
Se trata de anticuerpos que interfieren en el proceso coagulativo, y que dan lugar a una
prolongación de las pruebas básicas de coagulación. Esta prolongación no se corrige por
la mezcla a partes iguales con plasma normal, a diferencia de lo que ocurre en los déficits
de factores. Pueden ser de dos tipos:
1. Los anticoagulantes lúpicos. Son muy frecuentes; en realidad se trata de anti
cuerpos dirigidos contra complejos de proteínas unidas a fosfolípidos. No tienen
acción anticoagulante in vivo y, p or el contrario, se asocian a complicaciones
trombóticas y abortos de repetición. Se presentan en pacientes con lupus erite-
matoso sistémico (de ahí su nombre), colagenosis, neoplasias o en individuos sin
otra enfermedad evidenciable (anticuerpo antifosfolípido primario).
2. Los anticuerpos dirigidos co n tra u n d eterm inado factor de la coagulación.
Son más raros. El más frecuente es el que va dirigido contra el factor VIII, y
puede aparecer como respuesta al tratamiento sustitutivo en los hemofilicos, pero
también de forma espontánea.
Investigación del anticoagulante lúpico

Su presencia es demostrable por la prolongación de cualquier prueba de coagulación en
la que se utilice una concentración baja de fosfolípidos. Casi siempre alargan el TTPA,
pero solo los más potentes prolongan el TP.
Se recomienda realizar, al menos, dos pruebas para su diagnóstico, que pueden ser la
realización de un TTPA utilizando cefalina diluida, el tiempo de veneno de víbora Russell,
etc. Estas pruebas no se pueden realizar en presencia de heparina ni de anticoagulantes
orales, ya que dan resultados falsamente positivos.
Tiempo de veneno de víbora Russell diluido

El veneno de la víbora Russell inicia la coagulación activando el factor X en presencia de
fosfolípidos. Para ello, se utilizan dos reactivos con concentraciones diferentes de fos
folípidos: el primero (reactivo de cribado), contiene una concentración baja de fosfolípidos
y da resultados prolongados en presencia del anticoagulante lúpico, y el segundo (reactivo
de confirmación), contiene una concentración mayor de fosfolípidos y corrige el alarga
miento neutralizando el anticuerpo en caso de que la causa sea un anticoagulante lúpico.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Y PROCEDIMIENTO. Se preparan siguiendo
las instrucciones del fabricante: en una cubeta del coagulómetro se mezclan partes
iguales del plasma (200 |xl) y del reactivo (200 |xl) a 37 °C. Después se mide el tiempo
de coagulación.
OBTENCIÓN DE LOS VALORES NORMALES. Se m iden los tiem pos de coagulación
con los dos reactivos de unos 50 plasmas de individuos sanos sin alteraciones de la
coagulación. Se calcula la media y la desviación estándar.
ERRNVPHGLFRVRUJ
INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO. Se empieza utilizando el reactivo de cribado. Si

el tiempo de coagulación de la muestra es superior al del rango normal, se utilizará el
reactivo de confirmación.
El resultado se expresa como el cociente del tiempo de coagulación con el reactivo de
cribado entre el tiempo de coagulación con el reactivo de confirmación.
El rango de normalidad para este cociente se calculará con el plasma de los individuos
normales.
Tiempo de coagulación con silica

Esta técnica se basa en la activación de la coagulación por la vía intrínseca con dos con
centraciones de fosfolípidos: una diluida (LA screen) y otra concentrada (LA confirm).
MÉTODO. Se realiza el test de TTPA con los reactivos LA screen y con LA confirm.
OBTENCIÓN DE LOS VALORES NORMALES. Se m iden los tiem pos de coagulación
con los dos reactivos de unos 50 plasmas de individuos sanos sin alteraciones de la
coagulación. Se calcula la media y la desviación estándar.
PACIENTES. Se miden los tiempos de coagulación obtenidos con el reactivo LA screen
y se dividen por el valor medio obtenido con los controles, así se obtiene el ratio screen.
Se m iden los tiem pos de coagulación obtenidos con el reactivo LA confirm y se
dividen por el valor medio obtenido con los controles. Se obtiene el ratio confirm.
EXPRESIÓN DEL RESULTADO. El resultado se expresa como:
Ratio normalizado = Ratio screen /Ratio confirm

El rango de normalidad para este cociente se calculará con los ratios obtenidos con
el plasma de los individuos normales.
Determinación de anticuerpos antifosfolípidos

Son anticuerpos cuya presencia se asocia a trombofilia; algunos de ellos son los res
ponsables del anticoagulante tipo lupus.
PRINCIPIO. Se determinan mediante métodos de ELISA. Se utilizan placas recubier
tas de cardiolipina en presencia de P 2-glucoproteína I (anticuerpos anticardiolipina) o de
02-glucoproteína I (anticuerpos anti-02-glucoproteína I). Al añadir el plasma del enfermo,
los antígenos capturan los anticuerpos fijándolos a la placa. Estos se detectan mediante
un segundo anticuerpo anti-IgG o anti-IgM hum ana m arcado con una enzima y se
añade luego un sustrato. El color que se genera al romperse el sustrato es proporcional
a la concentración de anticuerpos en el plasma. Los resultados se expresan en U GPL/ml
(anticuerpos de tipo IgG) o U MPL/ml (anticuerpos de tipo IgM) y se calculan frente a
una curva de calibración valorada en la misma placa.
Investigación de u n in h ib id o r específico c o n tra u n factor de la coagulación

Prueba de cribado (test de Ewingy Kasper)
Esta prueba sirve para detectar inhibidores (anticuerpos neutralizantes) contra factores
de la vía intrínseca de la coagulación: VIII, IX, XI y XII.
No se interfiere por los anticoagulantes lúpicos.
PRINCIPIO. Se mide el tiempo de TTPA de una mezcla de plasma del paciente, plasma
control y tromboplastina que se ha incubado a 37 °C durante 2 h.
ERRNVPHGLFRVRUJ
O
P control 1
P problema 4 P problema 1 i P control 1
Cefalina caolín 5 Cefalina caolín 1 i Cefalina caolín 1
W :
Incubar 2 h a 37 °C Incubar 2 h a 37 °C ^ Incubar 2 h a 37 °C
4 partes de 2A B js s i 1 parte de 2B
Recalclficar y Recalciflcar y
tiem po de coagulación tiempo de coagulación
FIGU RA 23-1. Test de Ewing y Kasper. Esquema de la determinación de un inhibidor contra un factor de
la vía intrínseca. Los números indican la proporción de plasma problema, plasma control y cefalina caolín
en cada tubo.
Los tiempos de TTPA de esta mezcla se comparan con la misma proporción de plasma
del paciente y plasma control que se han incubado por separado con tromboplastina, y
se mezclan justo antes de recalcificarse.
Si en el plasma del enfermo hay anticuerpos contra algún factor de la vía intrínseca, el
tiempo de coagulación de la mezcla en que se han incubado juntos el plasma del paciente
y el plasma control será más largo que el del tubo en que se han incubado por separado.
Los anticuerpos del plasma del paciente habrán degradado el factor del plasma control
contra el que van dirigidos.
La incubación del plasma durante 2 h con la tromboplastina (fosfolípidos) neutraliza
un posible anticoagulante tipo lupus.
MÉTODO
1. Se preparan tres tubos con las proporciones de plasma control, plasma problema
y cefalina caolín que se indican:
(a) Tubo n.° 1: una parte de plasma control más cuatro partes de plasma problema
más cinco partes de cefalina caolín.
(b) Tubo n.° 2A: partes iguales de plasma problema y cefalina caolín.
(c) Tubo n.° 2B: partes iguales de plasma control y cefalina caolín.
2. A continuación, se incuban durante 2 h a 37 °C. Una vez que el tiempo ha termina
do, se mezclan cuatro partes del tubo 2A con una parte del tubo 2B y se recalcifica
midiendo inmediatamente el tiempo de coagulación. De la misma manera, se
recalcifica y se mide el tiempo de coagulación del tubo n.° 1 (fig. 23-1).
De forma orientativa, una diferencia de más de 12 s indica la presencia de un inhibidor,
aunque siempre hay que determ inar la norm alidad con los reactivos e instrum entos
utilizados.
Estudio de un inhibidor específico contra un factor de la coagulación
PRINCIPIO. Al incubar una mezcla de plasma de un paciente con inhibidor mediante un
plasma control, el anticuerpo del paciente degradará el factor contra el que va dirigido
el plasma control.
ERRNVPHGLFRVRUJ
MÉTODO
1. Se deposita en un tubo plasma del paciente, en un segundo tubo plasma control
y en un tercer tubo partes iguales de plasma del paciente y plasma control.
2. Se incuban los tres tubos a 37 °C durante 1 h.
3. Se valora la concentración de factor contra el que se sospecha que va dirigido el
inhibidor. Se suele empezar por el factor VIII, que es el más frecuente. Véase el
apartado «Determinación de los factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI, XII)
mediante el TTPA».
INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO. Si no hay inhibidor, los niveles de factor que se
encuentran en la mezcla serán próximos a la media del que se encuentra en los tubos de
plasma del paciente y de plasma control.
Si hay inhibidor, el nivel de factor en la mezcla será inferior a la media de los obtenidos
en los tubos con plasma del paciente y con plasma control.
Cuantificación del inhibidor del factor VIH. Unidades Bethesda

PRINCIPIO. El ensayo se basa en medir la cantidad de factor VIII residual de un plasma
control que se ha incubado con el plasma del paciente durante 2 h a 37 °C. La fuente
de factor VIII es un pool de plasmas normales que contiene aproximadamente 1 U/ml de
factor VIII.
Se incuban partes iguales de plasma del paciente y plasma control. Pasadas las 2 h se
mide el factor VIII residual.
Una unidad Bethesda (UB) se define como la cantidad de inhibidor que neutraliza
la m itad del factor VIII de la mezcla en estas condiciones.

• Calibrador: plasma con una cantidad conocida de inhibidor (si es comercial varía
para cada lote y viene indicada en la etiqueta).
• Tampón imidazol, 3,4 g/1 a pH = 7,5, con un 4% de albúmina bovina.
• Plasma control: pool de un mínimo de 40 plasmas normales, con niveles de factor
VIII próximos a 1 U/ml, o bien comercial.
• Reactivos e instrumentos para la determinación del factor VIII.
MÉTODO. En prim er lugar se obtiene la curva de inhibidor: se ajusta el calibrador

(plasma con inhibidor) a 2 U/ml, 1 U/ml, 0,5 U/m l y 0 U/ml con el tam pón imidazol.
El último punto (solo tampón) se utiliza como control. Y posteriormente se preparan
las muestras: con el plasma del enfermo se preparan diluciones dobles desde la 1/1 hasta
la 1/128 con el tam pón imidazol (si el inhibidor es muy potente hay que aum entar el
número de diluciones).
En distintos tubos de plástico se introducen 0,3 mi de cada punto de la curva del
inhibidor: 2 U/ml, 1 U/ml, 0,5 U /m l y 0 U/ml (tampón), y de cada una de las diluciones
del plasma del enfermo. Se les añade a todos 0,3 mi de plasma control y se incuban los
tubos 2 h a 37 °C. Pasado este tiempo se determina el factor VIII de cada mezcla.
CÁLCULO DEL RESULTADO. De los tres puntos de la curva del inhibidor y de cada
dilución del plasma del enfermo se calcula el tanto por ciento de factor VIII residual
respecto al tubo control (contiene 0,3 m i de plasma control + 0,3 mi de tampón):
, 7TTT . , , % Factor VIII de cada tubo

% Factor VIII residual= --------------------------------------- x 100
% Factor VIII del tubo control
ERRNVPHGLFRVRUJ
En un papel semilogarítmico se dibuja la curva de calibración con las unidades de

inhibidor en las abscisas (escala aritmética) y el porcentaje de actividad residual en las
ordenadas (escala logarítmica) (fig. 23-2).
Se calculan las unidades de inhibidor a partir de la actividad residual de cada dilución
del plasma del paciente. Se consideran solamente los valores de las diluciones del plas
ma del paciente que tienen una actividad residual entre un 25 y un 75%. Después se
multiplica por el factor de dilución.
Se hace la media con los resultados de las diluciones cuyo valor residual estaba entre
el 25 el y 75%.
En la figura 23-2 y en la tabla 23-5 se muestra un ejemplo.
Los resultados se expresan como UB/ml.
% F VIII
100
80
70
60
50
40
30
FIGU RA 23-2. Cálculo de las

unidades de inhibidor.
TABLA 23-5. Ejemplo del cálculo de las unidades Bethesda de inhibidor del factor VIII
Plasma
control % F. % F. VIII
ml (ml) VIII residual U/ml X dilución UB/ml
CALIBRADOR
2 UB/ml 0,3 0,3 16 25
1 UB/ml 0,3 0,3 32 51
0,5 UB/ml 0,3 0,3 45 71
0 U/ml (control) 0,3 0,3 B 63 100
g
PL PACIENTE DILUIDO
1/1 0,3 0,3 0 —
1/2 0,3 0,3 0 —
1/4 0,3 0,3 Zj 16 25 2 X4 8
1/8 0,3 0,3 31 49 1,1 X8 8,8
1/16 0,3 0,3 0 46 73 0,47 X 16 7,52
1/32 0,3 0,3 61 97 —
1/64 0,3 0,3
1/128 0,3 0,3
ERRNVPHGLFRVRUJ
Interpretación de las pruebas de coagulación

Un estudio básico de la hemostasia comprende las siguientes pruebas:
• Recuento de plaquetas.
• Tiempo de protrom bina (TP).
• Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA).
• Tiempo de trom bina (TT) y/o nivel de fibrinógeno (Fg).
Hay que tener en cuenta que no todas las alteraciones de la hemostasia que cursan
con tendencia hemorrágica quedan reflejadas en el estudio básico, así enfermos con
alteraciones funcionales de las plaquetas, enfermedad de von Willebrand o déficits de
factor XIII tendrán un estudio básico de hemostasia normal.
Tiempo de tromboplastina parcial activada prolongado con tiempo

de protrombina normal o poco alterado
Ante una alteración del TTPA lo prim ero que hay que descartar es la presencia de
heparina no fraccionada en el plasma, ya sea porque el paciente esté en tratam iento
o por contam inación en la extracción (m uestra extraída de u n catéter heparinizado,
etc.).
En el caso de contaminación por heparina, el TT estará alargado, por lo que se debe
realizar el tiempo de reptilasa (TR) que será normal.
Una vez descartada la presencia de heparina, se estudia, por su elevada frecuencia, la
posible existencia de un anticoagulante lúpico.
Si este no se detecta, se valoran los factores de la vía intrínseca. Si uno de ellos aparece
reducido, esta será la causa del TTPA anómalo, pero se debe diferenciar si el déficit es
por falta de síntesis o secundario a la presencia de un inhibidor adquirido, específico
para este factor.
Si los factores VIII, IX, XI y XII son normales puede haber una reducción de algún
componente del sistema del contacto que, en general, no se valora ya que su déficit no
supone un riesgo hemorrágico.
Tiempo de protrombina prolongado con tiempo de tromboplastina parcial

activada normal o poco alterado
Un TP prolongado puede deberse a una hepatopatía, un déficit de vitam ina K o al
tratamiento con antivitamínicos K. Cuando no se conoce la causa de la prolongación,
hay que valorar cada uno de los factores medidos en el TP (factores II, V, VII, X), y se
puede obtener uno de los siguientes patrones:
• D éficit más o menos marcado de los cuatro factores: la causa más frecuente es la
existencia de u n a hepatopatía. Se suele acom pañar, en m ayor o m en o r grado,
de prolongación de los tiem pos de trom bina y reptilasa y, en fases avanzadas de
la insuficiencia hepática, de niveles bajos de fibrinógeno. También se observa
un déficit m últiple de factores tras hem orragia severa y en situaciones de coa
gulación intravascular disem inada (CID) o fibrinólisis sistémica (terapéutica o
patológica).
• Déficit exclusivo de factores vitamina K dependientes (II, VII, X): déficit de vitamina K
o bien tratam iento o intoxicación con cumarínicos. En este caso el TT, factor V y
fibrinógeno serán normales, a diferencia del caso de una hepatopatía.
• Déficit aislado de un factor: probablemente congénito (estudio familiar). Hay que
descartar la existencia de un inhibidor específico contra dicho factor (muy raro).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Prolongación del tiempo de tromboplastina parcial activada y del tiempo

de protrombina
La alteración de las dos vías se observa en pacientes con tratamiento de antivitaminas K o
con déficits severos de vitamina K, ya que el factor IX es también vitamina K dependiente
y su déficit alargará el TTPA.
También se observa en déficits de factores de la vía común como II, V, X o fibrinógeno.
Prolongación del tiempo de trombina

La causa más frecuente es una contaminación por heparina o el tratam iento con los
nuevos inhibidores directos de la trombina. Se tiene que realizar el tiempo de reptilasa
(TR), que será normal.
Si el TT y el TR están alargados, se puede tratar de una hepatopatía o de una hipo- o
disfibrinogenemia. Se recomienda realizar la determinación del fibrinógeno.
Niveles bajos de fibrinógeno

Se encuentran en hepatopatías, tras hemorragias severas, coagulopatías de consumo,
tratamientos fibrinolíticos e hipo- o disfibrinogenemias. En ausencia de una causa que
lo justifique, se recomienda realizar la determinación del fibrinógeno por un método
inmunológico. En la tabla 23-6 se muestra una orientación para la interpretación de un
estudio básico de coagulación.
TABLA 23-6. Interpretación del estudio básico de la coagulación
TP TTPA TI TR Orientación diagnóstica Se recomienda estudia9

N N N N Coagulación conservada
Si existe historia hemorrágica: Factor XIII, antiplasmina
Funcionalismo plaquetario
Factor von Willebrand
N/P P P N La muestra contiene heparina
P N N N Déficit aislado de algún factor Factores II, V, VII y X
de la vía extrínseca o inhibidor
específico
N P N N Posible anticoagulante lúpico Anticoagulante lúpico
Déficit de factor(es) exclusivo(s) Factores VIII, IX, XI, XII,
de vía intrínseca precalicreína y quininógeno
Enfermedad de von Willebrand Factor von Willebrand y Factor VIII
Inhibidor específico Descartar inhibidor específico
P P N N Descartar cumarínicos Factores II,V II,IX ,X yV
Déficit aislado de factor II, V o X Investigar toma de cumarínicos
(o inhibidor específico) Déficit marcado de factores o
síndromes de mala absorción
dependientes de vitamina K
Síndrome hemorrágico recién
nacido
Hepatopatía parenquimatosa Factores II,V II,X yV
Coagulopatía de consumo PDF, dímero D
Fibrinólisis sistémica PDF, dímero D
Hipofibrinogenemia marcada o Determinación funcional e
disfibrinogenemia inmunológica del fibrinógeno
N , norm al; P, prolongado; TP, tiem po de protrombina; TR, tiempo de reptilasa; TT, tiempo de trom bina; TTPA, tiem po de
tromboplastina parcial activada.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Investigación de la tendencia trom bótica o trom bofilia

El térm ino trombofilia se refiere a una tendencia trom bótica aumentada, y puede ser
adquirida o congénita. Dentro de la primera, la principal causa es el síndrome del an-
tifosfolípido, cuyo estudio incluye la investigación del anticoagulante lúpico y de los
anticuerpos anticardiolipina y anti-(32-glucoproteína I valorados por método inmuno-
lógico (ELISA). La trombofilia congénita o familiar incluye déficits de los principales
inhibidores de la coagulación, que son la antitrombina, la proteína C y la proteína S, así
como elevación de factores como el factor VIII, IX, XI o fibrinógeno o las mutaciones
en determinados factores, como el V (Leiden, Cambridge o Hong Kong), II (mutación
G20210A), XII (F12 C46T) y grupo sanguíneo no O.
Existen otras alteraciones, como la hiperhomocisteinemia, que pueden deberse a
causas congénitas o adquiridas. La asociación de otras anomalías (como el déficit de
cofactor II de la heparina, las hipo- y displasminogenemias o el aumento de PAI-1) con
un aumento del riesgo trombótico no está claramente demostrada.
Valoración de la antitrombina
Principio
La determinación debe ser funcional, mediante sustratos cromogénicos.
Al añadir un exceso de heparina al plasma problema diluido se forma el complejo anti-
trombina-heparina; después se añade un exceso de factor X activado (FXa) o trom bina
que será neutralizada, en parte, por dicho complejo, por lo que queda cierta cantidad de
FXa o trom bina residual que, actuando sobre el sustrato cromogénico, generará color
que puede medirse en un espectrofotómetro. Cuanto m enor sea el nivel de antitrombina
(AT) mayor será el FXa o la trom bina residual y el color generado.
Existen diversos equipos comerciales para su realización automática.
Material
Los kits comerciales contienen:
• Un sustrato cromogénico sensible al factor Xa o a la trombina.
• Solución de factor Xa o trombina.
• Tampón con heparina.
Se necesita también:
• Calibrador: plasma con una concentración conocida de AT.
• Controles de calidad: plasmas con una concentración conocida de AT.
• Lector manual o automático de color con filtros adecuados al sustrato usado.
Método
1. El test se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Se prepara la curva de calibración con diluciones del calibrador y se analiza cada
punto. Con los datos del plasma calibrador se representa la curva de calibración:
la concentración de AT en las abscisas y las DO o incremento de D O /m in en las
ordenadas.
3. Con las lecturas de los plasmas problema se extrapolan las concentraciones de AT
en esta curva.

Los valores normales oscilan entre 80 y 120 U /dl (aunque cada laboratorio deberá es
tablecer su margen de referencia). Los déficits congénitos presentan alrededor de 40 a
ERRNVPHGLFRVRUJ
60 U /dl de actividad. En las hepatopatías el nivel de AT es un marcador de la función

hepática. Se encuentran, también niveles reducidos en la CID y en el síndrome nefrótico.
Valoración de la proteína C
La determinación debe ser funcional, de preferencia mediante sustratos cromogénicos,
ya que el método coagulativo está más expuesto a interferencias.
Principio
La proteína C (PC) de la muestra es activada por una enzima específica, contenida en
el veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix. La cantidad de PC activada (PCa) es
determinada por su acción sobre un sustrato cromogénico que al romperse genera un
color que se puede medir en un espectrofotómetro. El color es proporcional a la PC del
plasma.
M aterial
Existen diversos productos comerciales que pueden realizarse en instrum entos auto
máticos.
Los kits comerciales contienen:
• Un sustrato cromogénico sensible a la PCa.
• Activador de la PC, procedente de veneno de serpiente.
• Calibrador: plasma con una concentración conocida de PC.
• Controles de calidad: plasmas con una concentración conocida de PC.
M étodo
Se deben seguir las instrucciones del fabricante: se prepara la curva de calibración con
diluciones del calibrador y se analiza cada punto. Con los datos del calibrador, se re
presenta la curva de calibración con la concentración de PC en las abscisas y las DO o
incremento de D O /m in en las ordenadas.
Con las lecturas de los plasmas problema se extrapolan las concentraciones de PC
en esta curva.

El margen de referencia se halla, aproximadamente, entre 70 y 140 U/dl (aunque cada labo
ratorio deberá establecer el suyo propio). Los déficits congénitos heterocigotos presentan
actividades alrededor de 40 a 50 U/dl. Se encuentran también niveles reducidos de PC en
las hepatopatías, en la CID y durante el tratamiento anticoagulante con antivitaminas K.
Valoración de la proteína S
La proteína S (PS) es un cofactor no enzimático de la PC activada. Se presenta en forma
libre (40%) funcionalm ente activa, o unida a la fracción del com plem ento C4bBP
(60%) en cuyo caso pierde su función de cofactor. La valoración más importante es la
de la forma S libre, si bien es útil realizar también la de la proteína S total, con objeto de
establecer el tipo de defecto.
Esta proteína es vitamina K dependiente, por lo que está disminuida en pacientes bajo
tratamiento con antivitamínicos K y es una de las que tarda más tiempo en recuperarse
después de dejar el tratamiento. Se recomienda esperar unos 15 días antes de su valoración.
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Determinación funcional
Es un m étodo coagulativo que se basa en el efecto que tiene la PS sobre la actividad
anticoagulante de la PC activada (PCa).
Material
Los métodos comerciales varían según el fabricante, pero en general utilizan:
• Plasma humano desprovisto de PS.
• PCa o un activador de la PC endógena.
• Algunos aportan factor V bovino.
Además se necesita:
• Calibrador: plasma con una concentración conocida de PS.
• Controles de calidad: plasmas con concentraciones conocidas de PS.
Método
1. Se prepara la curva de calibración con diluciones del calibrador que contengan
desde 150 U /dl a 2,5 U/dl.
2. Se mezclan diluciones del calibrador o del paciente con el plasma deficiente
en PS.
3. Se añade PCa y factor V o el activador de la PC.
4. Se incuba un tiempo a 37 °C y se mide el tiempo de coagulación después de añadir
tromboplastina cálcica o CaCl2 25 mM.
5. Se mide el tiempo de coagulación, que será más largo cuanta más PS haya en el
plasma. En la curva de calibración se extrapolan los tiempos de coagulación de
los pacientes.
Limitaciones
Esta técnica es muy sensible a las condiciones preanalíticas y se ve alterada por múltiples fac
tores: resistencia a la PCa, factor V Leiden, anticoagulantes tipo lupus o presencia de heparina.
Valoración inmunológica
El método clásico es la determinación por ELISA. Se valoran mediante anticuerpos es
pecíficos la PS total y la PS libre. Los anticuerpos monoclonales específicos contra la PS
libre permiten su determinación directa sin previo fraccionamiento del plasma.
También se han desarrollado m étodos basados en la utilización de anticuerpos
monoclonales fijados a micropartículas de látex que permiten una rápida determinación
de la proteína S libre sobre algunos coagulómetros, con resultados superponibles a los
obtenidos por ELISA.

El margen de referencia es algo inferior en la mujer (aproximadamente 55 a 110 U/dl)
que en el hombre (70 y 125 U/dl), y es aún m enor en las gestantes, lo que debe ser tenido
en cuenta para evitar falsos diagnósticos de déficits congénitos. Como para otros paráme
tros, cada laboratorio deberá establecer su margen de referencia. Aparte de la deficiencia
congénita, se encuentran también niveles reducidos de PS en las hepatopatías, en la CID
y durante el tratamiento anticoagulante oral.
Resistencia a la proteína C activada

Con esta prueba se estudia la respuesta del plasma del paciente al añadirle PCa.
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Principio
Mide el alargamiento del TTPA del plasma del paciente después de añadir PCa y se
expresa como la razón de tiempo de TTPA con PCa/tiempo de TTPA sin PCa.
Se utilizan kits comerciales que contienen la PCa y reactivos para la determinación
del TTPA. Cada laboratorio tiene que establecer sus valores de normalidad.
La mayor parte de plasmas con resistencia a la PCa son debidos a la presencia de
una m utación en el gen del factor V que hace que la proteína sea más resistente a la
degradación por la PCa: factor V Leiden (FVL).
Sin embargo, alrededor de un 20% de pacientes con resistencia a la PCA no tienen
la m utación FVL, y es la resistencia en sí un factor de riesgo trombótico. Unos niveles
elevados de factor VIII, la presencia de anticoagulante lúpico y el tratam iento con
anticonceptivos orales pueden dar lugar a resistencia a la PCa.
Una hepatopatía o el tratamiento con antivitamínicos K o con heparina pueden dar
lugar a resultados falsamente normales.
Exploración de la fibrinólisis
El elemento del sistema fibrinolítico cuya medición tiene mayor interés práctico es la
antiplasmina, cuyo déficit funcional congénito es muy raro, pero se puede asociar a una
diátesis hemorrágica. Se halla reducida, además, siempre que exista una hiperfibrinólisis
sistémica.
La valoración de otros componentes del sistema, como el plasminógeno, el activador
tisular del plasminógeno (t-PA) y su principal inhibidor (PAI-1), es utilizada especial
mente en estudios de investigación clínica, ya que su valor asistencial es escaso al no estar
establecido su papel en la trombofilia.
Por el contrario, la determ inación de los productos de degradación de la fibrina
(dímero D) por acción de la plasmina tiene u n creciente interés clínico, antes limitado
al estudio de la CID y ahora ampliamente utilizada en el diagnóstico de la trombosis
venosa y de la embolia pulmonar, por su elevado valor predictivo negativo.
Plasminógeno
Principio
El plasma se incuba con un exceso de estreptocinasa para form ar el complejo plas-
minógeno-estreptocinasa. Este complejo es capaz de romper un sustrato cromogénico
generando color que será proporcional a la concentración del plasminógeno.
Material
• Estreptocinasa.
• Un sustrato específico para el complejo plasminógeno-estreptocinasa.
• Calibrador: plasma con una concentración conocida de plasminógeno.
• Controles de calidad: plasmas con una concentración conocida de plasminógeno.
Método
1. El test se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante: con los datos del
plasma calibrador, se representa la curva de calibración con la concentración
de plasm inógeno en las abscisas y las DO o increm ento de D O /m in en las
ordenadas.
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2. Con las lecturas de los plasmas problema se extrapolan las concentraciones de

plasminógeno en esta curva.
3. Se acepta que el margen de referencia está alrededor de 80 a 140 U /dl aunque,
como para otros parámetros, cada laboratorio deberá establecer su propio margen.
Dosificación del inhibidor de la plasmina (antiplasmina)

Principio
El plasma estudiado se incuba con un exceso de plasmina. La antiplasmina inhibe parte de la
plasmina añadida y la plasmina residual rompe un sustrato cromogénico produciendo color.
Este color será inversamente proporcional a la cantidad de antiplasmina presente en el plasma.
Existen diversos equipos comerciales para su realización automática.
M aterial
• Un sustrato cromogénico sensible a la plasmina.
• Solución de plasmina.
• Tampón.
• Calibrador: plasma con una concentración conocida de antiplasmina.
• Controles de calidad: plasmas con una concentración conocida de antiplasmina.
M étodo
El test se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante: con los datos del plasma
calibrador, se representa la curva de calibración con la concentración de antiplasmina
en las abscisas y las DO o incremento de D O /m in en las ordenadas.
Con las lecturas de los plasmas problema se extrapolan las concentraciones de anti
plasmina en esta curva.

El margen de referencia se acepta que está alrededor de 80 a 120 U /dl aunque, como
para otros parámetros, cada laboratorio deberá establecer su propio margen. Se observan
niveles reducidos de antiplasmina en las hepatopatías graves y en situaciones de hiperfi-
brinólisis, sean patológicas o terapéuticas. Los déficits congénitos son muy raros.
Medida de los productos de degradación de la fibrina (dímero D)

Principio
Para su determinación se utilizan anticuerpos monoclonales específicos que reconocen
el dímero D, producto de degradación de la fibrina, sin interferencia por la presencia de
fibrinógeno ni de sus productos de degradación.
M étodo de aglutinación en placa

Este método es semicuantitativo. Consiste en mezclar diluciones del plasma en estudio
con partículas de látex a las que se ha unido un anticuerpo contra el dímero D. La aglu
tinación se lee en placas de vidrio y se compara con un control positivo y uno negativo.
La concentración se obtiene de multiplicar la sensibilidad del test (viene indicada por el
fabricante) por la mayor dilución del plasma con la que el látex aglutina.
Este m étodo no se puede utilizar para descartar una trombosis o una embolia pul
monar.
ERRNVPHGLFRVRUJ
ELISA
Es el método clásico para la determinación cuantitativa, pero tiene el inconveniente de
que el tiempo que se necesita para su realización lo hace inviable para una determinación
de urgencia.
Existen en el mercado otros métodos de ELISA más rápidos con una muy buena co
rrelación con los ELISA clásicos, y unos valores predictivos negativos para la trombosis
y la embolia pulm onar superponibles al ELISA clásico.
Método inmunoturbidimétrico
Consiste en mezclar el plasma del enfermo con partículas de látex recubiertas de un
anticuerpo monoclonal antidímero D. En presencia del dímero D, las partículas de látex
se aglutinan y el grado de aglutinación es proporcional a la concentración de dímero
D en el plasma. Se determina midiendo el descenso de luz transmitida causado por los
agregados.
Con un calibrador se construye la curva y sobre ella se extrapolan los resultados de
los pacientes.
Este método es también equiparable al ELISA en cuanto a su valor predictivo negativo
para descartar trombosis o embolias pulmonares.

El dímero D está elevado en la CID. En las sospechas de trom bosis venosas o em bo
lia pulm onar esta determ inación sirve para descartar su presencia si el dím ero D es
<500 (xg/1. En el caso de ser >500 fxg/1 no indica nada, ya que puede estar aumentado
por otras muchas causas.
O tras pruebas de interés clínico

Valoración de la concentración de heparina no fraccionada en plasma
El TTPA es la prueba recomendada para el control del tratamiento anticoagulante con
heparina no fraccionada, pero sus resultados varían de una a otra preparación comercial
del reactivo. Para establecer el margen terapéutico del TTPA en un reactivo determinado,
se determina el TTPA de plasmas normales con concentraciones de heparina entre 0 y
1 Ul/ml. Se construye una gráfica con los valores de heparina y los TTPA obtenidos y se
utilizan los valores de TTPA que corresponden a la concentración de heparina deseada.
Determinación de heparina de bajo peso molecular

Principio
La heparina de bajo peso m olecular (HBPM) se analiza como un complejo con la
antitrombina presente en la muestra de plasma. Se mezcla el plasma que aporta HBPM
con una cantidad fija de factor Xa y de un sustrato sensible al factor Xa. Se producen
dos reacciones en competencia. Una es la inhibición del FXa por el complejo heparina-
antitrombina y la otra es la rotura del sustrato por el FXa que genera color. La DO final
o el incremento de D O /m in son inversamente proporcionales a la concentración de
heparina presente en el plasma.
Material
• Un sustrato cromogénico sensible al FXa.
• FXa bovino.
ERRNVPHGLFRVRUJ
• Calibrador: plasma con una concentración conocida de HBPM.
• Controles de calidad: plasmas con una concentración conocida de HBPM.
Utilidad clínica
El control de estas HBPM solo es necesario en casos especiales como insuficiencia renal
grave, peso muy alejado de los valores promedio de la población o gestación.
Determinación de anticuerpos anti-PF4-heparina

La trom bocitopenia inducida p or la heparina es una complicación del tratam iento
con heparina provocada p o r la presencia de anticuerpos dirigidos contra el factor 4
plaquetario cuando está unido a la heparina. Estos anticuerpos activan las plaquetas y
pueden provocar trombosis arteriales o venosas.
Determinación por ELISA

Es el método clásico, aunque tiene el inconveniente del tiempo necesario para la rea
lización que lo hace inviable para urgencias.
Determinación por un método inmunoturbidimétrico

El reactivo consiste en partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales
que reconocen al complejo PF4-polivinilsulfato (PVS). Al mezclar el látex con la muestra
del paciente, en presencia de PF4, si hay anticuerpos se produce una reacción competitiva
y el grado de aglutinación es inversamente proporcional a la concentración de anticuer
pos. Se mide el descenso de la luz transmitida causado por los agregados.
Filtración en gel de partículas aglutinadas

El reactivo consiste en una suspensión de partículas de un polímero de color rojo que es
tán sensibilizadas con el complejo F4P-heparina. Al mezclarlo con el plasma del paciente,
los anticuerpos del paciente aglutinan estas partículas. Se separan luego las partículas
aglutinadas de las que no se han aglutinado mediante el filtrado de la mezcla a través
de un gel por centrifugación. Las partículas aglutinadas quedan en la parte superior o
distribuidas dentro del gel (reacción positiva, presencia de anticuerpos) y las que no se
han aglutinado forman un botón en el fondo de la microcolumna de filtración (reacción
negativa o ausencia de anticuerpos).
Determinación de ADAMTS-13
Los métodos para la detección de ADAMTS-13 se basan en la mezcla de plasma como
fuente de este y de factor von Willebrand o una parte de él (un pequeño péptido que
contenga el enlace Tyr 1605-Met 1606) como sustrato, y la medida del sustrato residual
que queda después de la acción del ADAMTS-13.
Entre los métodos actuales, uno de los más sencillos y comerciales es descrito por
Kato et al., que utiliza como sustrato un pequeño péptido sensible al ADAMTS-13 y un
anticuerpo dirigido contra el aminoácido Tyr 1605 que queda expuesto al romperse el
sustrato por acción del ADAMTS-13. El procedimiento consiste en u nir el sustrato a la
placa y añadir el plasma que aporta el ADAMTS-13, que romperá el sustrato y expondrá
el aminoácido Tyr 1605. Se añade luego un anticuerpo dirigido contra este aminoácido,
marcado con peroxidasa y se revela con un sustrato para la peroxidasa. El color generado
es proporcional al ADAMTS-13 presente en la muestra.
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Detección del inhibidor contra el ADAMTS-13

Principio
Se mide el ADAMTS-13 residual que queda después de una incubación de 1 h a 37 °C
de partes iguales de la fracción de inmunoglobulinas (Ig) del paciente más plasma con
trol. Se compara con la mezcla de Ig de un pool de plasmas control más plasma control
incubada también 1 h a 37 °C.
Método
1. Elim inación del ADAMTS-13 endógeno: se incuba un plasm a control y las
m uestras problem a a 56 °C durante 30 m in. Se centrifuga y se recoge el so
brenadante (Ig).
2. Se mezclan partes iguales de las Ig de cada paciente con plasma control y partes
iguales de las Ig del plasma control con plasma control.
3. Se incuba 1 h a 37 °C.
4. Se valora el ADAMTS residual de cada mezcla.

Se considera que hay inhibidor si el ADAMTS-13 del tubo que contiene la mezcla de
Ig paciente más plasma control es <70% del ADAMTS-13 del tubo con Ig control más
plasma control.
ESTUDIO MOLECULAR DE LA TROMBOFILIA

Introducción y conceptos generales
Hasta el m om ento se han descrito mutaciones y polimorfismos puntuales (single nu-
cletotide polymorphism [SNP]) como factores de riesgo en la enfermedad trom boem-
bólica. La manera de expresar dichas alteraciones en la bibliografía puede ser en forma
de nombre convencional aceptado internacionalmente, como puede ser el caso de la m u
tación del FVL, y en otros casos mediante el sistema de nomenclatura aceptado en el
análisis genético (Human Genome Organization [HUGO], www.hugo-international.org)
donde la misma mutación se expresaría como F5G1090A (F5 es el gen que codifica para
el factor V de la coagulación, G representa el alelo salvaje más frecuente y A es el alelo
mutado menos frecuente).
Para realizar el estudio m olecular de la trom bofilia existen diversas m etodologías
que se pueden realizar en función de la alteración que se analice y del núm ero de
m uestras. De m anera esquem ática se m uestran las diferentes posibilidades en la
figura 23-3.
O btención de la m uestra de ADN

Fase preanalítica
La fase preanalítica es de gran importancia, ya que los problemas en esta fase son res
ponsables de la mayoría de los errores en todo el proceso global.
La muestra para extraer ADN es sangre periférica que se recoge de m anera general
en tubos de EDTA. También se pueden obtener muestras en tubo de citrato sódico.
Los tubos se transportan a tem peratura ambiente (15-25 °C) hasta un máximo de
24 a 48 h. Una vez recibida la muestra, se puede conservar en nevera de 24 a 48 h hasta
realizar la extracción del ADN. Si fuera necesario conservarla más tiem po antes de
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 23-3. Diferentes metodologías para el estudio molecular de la trombofilia.
proceder a la extracción se puede guardar en el congelador a una temperatura de - 2 0 °C

hasta su procesamiento.
Al llegar al laboratorio hay que comprobar que el tubo en que se ha recogido la sangre
sea el correcto y que la sangre no esté coagulada.
Fase de extracción del ADN

Para extraer ADN se han desarrollado diversos procedimientos, que se pueden llevar
a cabo usando tanto sistemas automáticos como manuales. Los leucocitos de sangre
periférica son una de las fuentes más asequibles para la obtención de ADN genómico en
los estudios de rutina. A partir de 1 a 10 mi de sangre recogidos sobre anticoagulante, se
obtiene una cantidad suficiente de ADN para realizar los estudios necesarios.
Los métodos de extracción de ADN genómico pueden ser diversos. Uno de los as
pectos a tener en cuenta en la elección del método de extracción es el número de muestras
a procesar y la cantidad de ADN que se quiere obtener.
Métodos de extracción del ADN

1. M étodo convencional. Descrito por Miller et al., cuenta con dos ventajas funda
mentales: se obtiene bastante cantidad de ADN con una buena pureza y se puede
conservar de manera indefinida a 4 °C. El inconveniente es que al ser una técnica
totalmente manual se pueden procesar pocas muestras al mismo tiempo.
2. M étodos a u to m a tiz ad o s. Desarrollados m ediante extractores autom áticos
con diferentes sistemas en función del fabricante. Con estos métodos se puede
procesar un mayor número de muestras; la cantidad de ADN y la pureza obtenida
están en función del fabricante. La elección de un m étodo va en función del
ERRNVPHGLFRVRUJ
número de muestras que se han de procesar y la cantidad de ADN que se quiere

obtener.
Una vez extraído el ADN se calcula la concentración mediante la lectura de DO a
260 nm (DO260) y el coeficiente de extinción molar para el ADN bicatenario:1
jxg/ml de ADN = DO260 x 501
Para com probar la pureza de la muestra de ADN obtenido se realiza la lectura de
DO280 (lectura de DO de las proteínas). La razón óptima entre DO260/D O 280ha de ser:
D O 260/D O 280(1,6-2)
De manera que si es inferior a 1,6 significa que la muestra contiene exceso de proteínas
y si es superior a dos, que contiene exceso de sales. En los dos casos podría influir en
alguna técnica del laboratorio.
Una vez obtenido el ADN genómico, y en función del método de extracción del mismo,
se podrá conservar a una temperatura de 4 °C o en un congelador de —20 °C de manera
indefinida. En cada caso, el método utilizado presenta unas recomendaciones al respecto.
Técnica de la reacción en cadena de la polim erasa (PCR) y digestión

con enzim as de restricción
Principio
El método se basa en la amplificación mediante el método de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), seguido de una digestión con una enzima de restricción de tipo II es
pecífico y un posterior análisis de los fragmentos de restricción. El análisis del producto am
plificado por PCR y de la digestión se realiza mediante electroforesis convencional en geles
de agarosa o mediante métodos automáticos en electroforesis capilar de alta resolución.
Una de las desventajas de esta metodología es que es un proceso lento que puede
requerir de 12 a 48 h para realizar cada una de las etapas necesarias.
Técnica de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa
Principio
La PCR (en inglés Polymerase Chain Reaction) es una técnica capaz de generar in vitro
grandes cantidades de un determinado fragmento de ADN, a partir de cantidades ínfimas
del mismo. Es un método que produce una amplificación selectiva (magnitud = 106) de
una determinada secuencia de ADN (ADN diana), lo que facilita de modo espectacular las
manipulaciones posteriores. Se basa en la amplificación de regiones específicas de ADN in
vitro y consiste en sucesivos ciclos programados en un termociclador de PCR que incluyen
de manera resumida diferentes fases:
1. Fase de desnaturalización de la doble hebra de ADN molde por calor.
2. Fase de hibridación a la temperatura específica de los dos oligonucleótidos com
plementarios (cebadores o primers) a las secuencias situadas en los extremos del
fragmento que se va a amplificar.
3. Fase de extensión de la cadena de ADN mediante la reacción de la ADN polimerasa.
Las ADN polimerasas necesitan, para llevar a cabo la reacción de amplificación, una
mezcla de reacción que ha de incluir: los cebadores (directo y reverso) para iniciar
la síntesis de la hebra complementaria de ADN, la polimerasa, el tam pón de la
polimerasa, cloruro de magnesio y desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
Factor derivado del coeficiente de extinción m olar para el ADN bicatenario.
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Las tres fases (desnaturalización, hibridación y extensión) constituyen un ciclo

durante el trascurso del cual la cantidad de ADN diana se ha duplicado. El proceso de
la PCR incluye varios ciclos de manera repetitiva y normalmente en un experimento el
número de ciclos se sitúa entre 20 a 50, dependiendo de la cantidad de ADN de partida
y de las necesidades finales. Al final del experimento se obtienen grandes cantidades del
fragmento de ADN amplificado (amplicón).
Material
Para la realización de la PCR se necesita:
• M uestras de ADN de los pacientes y de los controles internos (controles con los
diferentes patrones: normal, portador heterocigoto y homocigoto m utado).
• Control negativo de la PCR: H20 estéril libre de nucleasas.
• Termociclador de PCR y software para programar los ciclos específicos.
• Reactivos de la mezcla de la reacción:
• Primers o cebadores específicos del fragmento que se va a amplificar.
• Taq polimerasa con su tampón de reacción.
• Desoxinucleótidos (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
• Cloruro de magnesio (MgCl2).
• H20 estéril libre de nucleasas.
• Material de auxiliar de laboratorio de genética debidamente esterilizado: puntas, tubo,
placas, tapones, etc.
Método
1. Primero se atemperan las muestras de ADN de los pacientes y de los controles a
2. Se descongelan los reactivos y se preparan las mezclas de reacción de la PCR.
3. Se preparan las tiras de tubos o placas para la PCR. Se añade la mezcla de reacción
de PCR a cada tubo. Se añaden las muestras de ADN de cada paciente y control.
En el caso del control negativo se añade H20 .
4. Se carga en la PCR y se pone en marcha el programa de amplificación específico.
5. Al finalizar la PCR se conserva a 4 °C.
6. Control de amplificación mediante electroforesis. Se comprueba que la amplifi
cación haya sido correcta en los pacientes y controles positivos, y también que el
control negativo (H20 ) no se ha amplificado.

1. Se realiza una electroforesis del producto amplificado junto con un m arca
dor de peso m olecular para com probar el tam año del fragm ento obtenido
(fig. 23-4).
2. Se com prueba que el control negativo (H 20 ) no haya amplificado. En el con
trol negativo se introducen todos los reactivos necesarios para la reacción y en
lugar de m uestra de ADN se añade H 20 . Si en el control negativo se observara
amplificación significa que probablem ente algún reactivo está contam inado
con ADN o que existe una contam inación ambiental. Si el control negativo
(H20 ) ha amplificado el ensayo no es válido y se ha de repetir de nuevo, ya que
indica que ha habido en algún m om ento del proceso una contam inación con
ADN.
3. Se comprueba que los controles internos sean correctos.
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FIGURA 23-4. Electroforesis en un gel de agarosa marcado con bromuro de etidio. M, marcador de
peso molecular. Carriles 1 y 2: producto amplificado de PCR para el F12C46T (fragmento de 369 pares
de bases). Carriles 3 ,4 y 5: fragmentos obtenidos de la digestión con la enzima de restricción Sfna I
que corta en presencia del alelo T. Carril 3: portador heterocigoto (C/T) para F12C6T que presenta los
fragmentos de 369 bp, 232 bp y 137 bp. Carril 4: paciente homocigoto mutado (T/T) para F12C46T que
presenta los fragmentos de 232 bp y 137 pb. Carril 5: paciente con el alelo normal (C/C) para F12C46T.
Se observa el fragmento sin digerir de 369 bp.
Digestión con enzimas de restricción de tipo II

Principio
Las enzimas de restricción fraccionan el ADN en lugares específicos, produciendo unos
fragmentos que se pueden separar electroforéticamente.
Los enzimas de restricción se caracterizan por su capacidad de reconocimiento de una
secuencia específica de ADN. Una vez reconocida la secuencia, la enzima se une y corta
la secuencia por un lugar de corte específico. Cuando una mutación o un polimorfismo
puntual pueden generar o eliminar una secuencia de reconocimiento para la enzima, esta
será capaz de unirse y cortar el fragmento o no podrá unirse y no cortará, de manera que
al analizar los resultados, estos m ostrarán un patrón diferente en función de la presencia
del alelo normal o el alelo mutado. El material de partida será el producto amplificado
por la PCR del fragmento que se analiza.
Material
• Reactivos para preparar la mezcla de reacción: enzima de restricción específica en
cada caso en función de la secuencia diana y del polimorfismo o m utación que se va
a analizar, tampón de reacción específico recomendado por el fabricante y H20 estéril
libre de nucleasas.
• Incubador de laboratorio con agitación.
• Material de auxiliar de laboratorio de genética debidamente esterilizado: puntas,
tubos, placas, tapones, etc.
Método
1. Se descongelan los reactivos y se preparan las mezclas de reacción de la digestión.
2. Se preparan las tiras de tubos o placas de reacción. Se añade la mezcla de reacción
de digestión a cada tubo. Se añaden las muestras de PCR de cada paciente y cada
control.
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3. La reacción de digestión se deja incubar durante el tiem po y la tem peratura

adecuados, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
4. Al finalizar se para la reacción a 4 °C.
5. Control de reacción mediante electroforesis. Se comprueba el patrón de bandas
específico con el marcador de peso molecular (v. fig. 23-4).
Análisis mediante electroforesis

El análisis de los fragmentos obtenidos en la PCR o en el proceso de la digestión se realiza
mediante electroforesis a partir de dos procedimientos:
1. Electroforesis en geles de agarosa: las moléculas de ADN se pueden separar en
geles de agarosa de diversa concentración. Este tipo de geles se someten a elec
troforesis horizontales en un campo eléctrico de dirección constante. Se prepara
un gel a una concentración de agarosa apropiada en función del tam año del
fragmento de ADN que se desee separar. El gel de agarosa se prepara con bromuro
de etidio, agente intercalante en la doble cadena de ADN, y de esta m anera las
bandas que contienen el ADN se ven directamente bajo la iluminación con luz
ultravioleta (v. fig. 23-4).
2. Electroforesis capilar de alta resolución: método automático donde los geles de
agarosa viene prefabricados y llevan incorporado el bromuro de etidio. Con este
proceso automático se pueden llegar a procesar un mayor número de muestras y
requiere m uy poco volumen de reacción (fig. 23-5).
M aterial
• Agarosa en función del tamaño del fragmento de ADN que se quiere separar.
• Marcador de peso molecular en función del peso molecular de los fragmentos que
hay que analizar.
• Equipo de electroforesis convencional: fuente de alimentación, cubetas, portageles,
peines, tampón de electroforesis y material auxiliar necesario.
• Equipo automático de electroforesis capilar de alta resolución: equipo automático para
procesar la electroforesis, software para realizar y analizar las carreras electroforéticas,
FIGURA 23-5. Electroforesis en

252 bp un gel de agarosa de alta resolución
marcado con bromuro de etidio. Se
muestra en la columna de la izquierda
___ el marcador de peso molecular y el
164 bp i i i - • i
marcador de alineamiento, y en la
columna de la derecha los tamaños de
87 bp los fragmentos de restricción con la
enzima de restricción Msp I de 252 bp,
164 bp y 87 bp del estudio del exón 6
del gen del ABO.
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calibradores de intensidad, marcadores de alineamiento, marcadores de peso mole

cular específicos.
• Material de auxiliar de laboratorio de genética debidamente esterilizado: puntas,
tubos, placas, tapones, etc.

En el análisis de los fragmentos de digestión se ha de tener en cuenta el patrón de bandas
característico de la m utación o polimorfismo de los pacientes comparado con los con
troles y el marcador de peso molecular (v. figs. 23-4 y 23-5).
Técnica de PCR en tiem po real m ediante el sistem a de detección

con sondas tipo FRET
Principio
La metodología de la PCR en tiem po real se basa en que desde el m om ento en que
se inicia la PCR, y a lo largo de todo el proceso, se puede detectar la amplificación
mediante la fluorescencia emitida p or unas sondas específicas. Una de las aplicaciones
de esta m etodología es la discrim inación alélica de m utaciones y polim orfism os
puntuales (SNP).
De entre todos los métodos que existen en el mercado, uno de los sistemas actuales
es la técnica de PCR en tiempo real mediante el sistema de detección con sondas tipo
FRET. Las sondas FRET (trasferencia energética de fluorescencia por resonancia) son
oligonucleótidos marcados con fluorescencia y con una secuencia complementaria a la
zona del ADN que incluye la variante genética que se quiere determinar.
En prim er lugar, hay que tener en cuenta el concepto teórico de la temperatura de
fusión o disociación Tm (melting). La Tm es la tem peratura a la cual el 50% de las
moléculas de ADN complementarias se encuentran desnaturalizadas. Esta Tm depende
de la secuencia, de la proporción de CG y AT y de la longitud del fragmento de ADN.
El sistema de detección por sondas FRET se basa en este concepto. Para ello se diseñan
unas sondas complementarias al alelo normal o al alelo mutado del amplicón analizado,
de m anera que la presencia de un simple cambio de una base nucleotídica debida a
una m utación o a un polimorfismo puntual mostrará una Tm diferente. Así, el método
permite realizar una discriminación alélica al analizar las curvas de fusión de las sondas
en cada muestra analizada. Cada alelo (mutado y normal) presenta su patrón, con su
curva de fusión o Tm característica (fig. 23-6).
Una de las ventajas de esta metodología es que todo el proceso, desde la amplificación
hasta la detección, se lleva a cabo en el mismo tubo de reacción, y de esta m anera se
evitan posibles contaminaciones ambientales. Además, es una metodología rápida, ya
que todo el proceso puede tardar como máximo 1-2 h.
Material
diferentes patrones: normal, portador heterocigoto y homocigoto mutado).
• Control negativo de la PCR: H20 libre de nucleasas.
• Equipo de PCR en tiempo real: un equipo especializado que incluye un sistema de
termociclador de PCR, un sistema de detección de fluorescencia y un software para
la fase de análisis de los resultados.
• Reactivos para preparar la mezcla de la reacción:
• Primers o cebadores específicos del fragmento que se va a amplificar.
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Tem peratura °C
FIGURA 23-6. Curvas de disociación o fusión (curvas melting del inglés) para el estudio del polimorfismo
F12C46T. La temperatura de fusión o melting (Tm) para el alelo C es de 72 °C, y para el alelo T es de 62 °C.
En el caso del heterocigoto se observan las dos temperaturas de fusión, la de 62 °C y la de 72 °C.
• Sondas marcadas con fluorescencia específicas de la mutación o polimorfismo

puntual que se quiere detectar.
Método
1. Primero se atemperan las muestras de ADN de los pacientes y de los controles
internos a temperatura ambiente.
2. Se descongelan los reactivos y se preparan las mezclas de reacción. Las sondas
marcadas con fluorescencia se han de proteger de la luz.
3. Se preparan las tiras de tubos o placas para la PCR, se añaden los reactivos para la mezcla
de la reacción. La mezcla de reacción se incorpora a cada tubo. Se agregan las muestras
de ADN de cada paciente y control. En caso de control negativo se añade H20.
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4. Se programa en el software específico el programa que incluye dos procesos:

(a) La PCR con el número de ciclos adecuados (puede ser de 30 a 50) donde cada
ciclo incluye las fases siguientes:
(i) Fase de desnaturalización de la molécula de ADN molde.
(ii) Fase de hibridación a oligonucleótidos específicos complementarios
(primers o cebadores) que definirán la zona a amplificar.
(iii) Fase de extensión de la cadena de ADN.
(iv) Fase de enfriamiento para parar la reacción.
(b) Programa de hibridación de sondas en u n solo ciclo:
(i) Fase de desnaturalización del producto amplificado.
(ii) Fase de hibridación a una temperatura específica de la sonda.
(iii) Fase de disociación de la sonda al increm entar la tem peratura lenta
mente.
(iv) Fase de enfriamiento.
5. Análisis de los resultados mediante el software específico del fabricante:
(a) Análisis de la curva de amplificación.
(b) Análisis de las curvas de fusión y obtención de las Tm específicas para cada
alelo (normal y mutado).
(c) Análisis de genotipación.

1. Se deben seguir las instrucciones del fabricante con el software específico.
2. Se com prueba que la amplificación ha sido correcta y que el control negativo
(H20 ) no se ha amplificado.
3. Se analiza que las tem peraturas de las curvas de fusión (Tm) de los controles
internos (individuos normales, heterocigotos y homocigotos mutados) son las
correctas (v. fig. 23-6).
4. Se analizan las temperaturas de fusión de los pacientes para asignar el genotipo
en cada caso.
Técnica de PCR en tiem po real m ediante sistem a de sondas Taqman

Principio
Se trata tam bién de una PCR en tiem po real, donde a lo largo de todo el proceso se
puede detectar la amplificación m ediante la fluorescencia em itida p or unas sondas
específicas de alelo. La diferencia es que en esta m etodología to d o sucede en el
m ism o proceso de am plificación, donde conform e se va am plificando el sistema
ya es capaz de detectar la presencia de las m utaciones o polim orfism os puntuales
analizados.
En este caso, el sistema de amplificación de PCR en tiempo real incluye la detección
con sondas específicas de alelo (sondas tipo Taqman). El método se basa en la actividad
exonucleasa de la Taq polimerasa y la diferente eficiencia de hibridación de un par de
sondas marcadas con un fluorocromo específico de cada alelo. Se diseñan dos sondas
específicas para cada alelo (alelo norm al y alelo mutado) y marcados con fluorocromos
diferentes (VIC o FAM) para poder realizar la discriminación alélica.
Una de las ventajas de esta metodología es que todo el proceso, desde la amplificación
hasta la detección, se lleva a cabo en el mismo tubo de reacción, evitando así posibles
contaminaciones ambientales. Además, es una metodología rápida, ya que todo el proceso
puede tardar como máximo 1-3 h.
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Material
diferentes patrones: normal, portador heterocigoto y homocigoto m utado).
• Control negativo de la PCR: H20 libre de nucleasas.
• Equipo de PCR en tiempo real: un equipo especializado que incluye un sistema de
termociclador de PCR, un sistema de detección de fluorescencia y un software específico.
• Reactivos para preparar la mezcla de la reacción:
• Primers o cebadores específicos del fragmento que se quiere amplificar.
• Sondas marcadas con fluorescencia (VIC o FAM) específicas de la mutación o
polimorfismo puntual.
Método
2. Se descongelan los reactivos y se preparan las mezclas de reacción de la PCR.
3. Se preparan las tiras de tubos o placas para la PCR. Se añade la mezcla de reacción
de PCR a cada tubo. Se agregan las muestras de ADN de cada paciente y control.
En el caso del control negativo se añade H 20 .
4. Se programa en el software específico el programa que incluye:
(a) Descripción de los alelos del SNP en función del mareaje (VIC o FAM) de
cada sonda específica para cada alelo.
(b) El programa incluye las condiciones de la PCR y detección en el punto final
de la reacción:
(i) Fase de desnaturalización de la molécula de ADN molde.
(ii) Fase de extensión de la cadena de ADN mediante la reacción de la Taq
polimerasa.
(iii) Fase de detección en el punto final de la fluorescencia emitida.
(iv) Análisis de amplificación y discriminación alélica.

2. Se comprueba que la amplificación ha sido correcta y que el control negativo no
se ha amplificado.
3. Se analizan los resultados de los pacientes para asignar el genotipo en cada caso
según las indicaciones del fabricante y el software específico (fig. 23-7).
Secuenciación autom ática p o r el m étodo de Sanger

Principio
La técnica utilizada está basada en la metodología descrita por Sanger, a la que se de
nomina secuenciación enzimática o método de los didesoxinucleótidos utilizando un
secuenciador automático. El método de los didesoxinucleótidos implica la síntesis de
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 23-7. Diagrama de

discriminación alélica por sondas
Taqman para el polimorfismo
F12C46T. La bola gris oscuro indica
individuo normal C /C , la bola gris
0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 claro individuo homocigoto mutado
Alelo 1 C T/T y la bola negra individuo portador
heterocigoto C/T.
una cadena de ADN p o r una ADN polimerasa in vitro a partir de un molde de ADN
en una reacción de secuencia.
Para llevar a cabo la reacción de secuencia de un ADN molde (fragmento amplificado
por PCR previamente) a secuenciar se necesita u n cebador o primer (oligonucleótido
iniciador) complementario a una región del ADN molde, donde se iniciará la secuencia
y la ADN polimerasa que copia la cadena molde al añadir los desoxinucleótidos corres
pondientes (dNTP: dATP, dGTp, dCTP, dTTP). En la mezcla de la reacción además
de los desoxinucleótidos se incluye un pequeño porcentaje de didesoxinucleótidos
marcados con fluorescencia (ddNTP: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). Los ddNTP son
terminadores de secuencia, ya que estos no tienen el grupo hidroxilo en el extremo 3’
necesario para la elongación de la cadena en el proceso de copia de la ADN polimerasa,
de m anera que cuando la ADN polimerasa vaya haciendo la copia de la cadena molde,
se irán introduciendo en la cadena de ADN que nace los dNTP y de manera aleatoria
los ddNTP marcados. La técnica se basa en que cada vez que un ddNTP se introduzca
en la nueva secuencia, se parará en ese m om ento la extensión de la nueva cadena. Al
final del proceso se obtiene una gran cantidad de copias de los fragmentos de todos los
tamaños posibles con una diferencia de una sola base. De esta m anera los productos
de la reacción de secuencia se pueden separar mediante electroforesis capilar en un
secuenciador automático. D urante la electroforesis todos los fragmentos van pasando
por un detector tipo láser que excita a los fluoróforos (ddN TP) y perm ite detectar
la fluorescencia emitida en cada caso. Finalmente, el secuenciador autom ático lleva
incorporado un software específico para realizar el análisis de la secuencia del fragmento
de ADN analizado.
Esta metodología es muy útil, ya que siempre se puede utilizar para analizar cualquier
mutación o polimorfismo puntual.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Material
1. Muestras de ADN de los pacientes y de los controles internos (controles con los
diferentes patrones: normal, portador heterocigoto y homocigoto mutado).
2. Control negativo de la PCR: H20 libre de nucleasas.
3. Equipo de PCR para amplificar el fragmento de ADN que se quiere secuenciar.
4. Equipo de secuenciación automática: secuenciador automático y software específico.
5. Primers o cebadores específicos para la PCR inicial y para la reacción de secuencia.
6. Mezcla de reacción que incluye todos los reactivos: Taq modificada, tam pón de
reacción, MgCl2 y desoxinucleótidos (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), didesoxinu-
cleótidos (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP marcados con fluoróforos específicos).
7. Reactivos necesarios para la reacción de purificación del producto de reacción de
secuencia.
8. Material de auxiliar de laboratorio de genética debidamente esterilizado: puntas,
tubo, placas, tapones, etc.
Método
2. Se descongelan los reactivos y se preparan las mezclas de reacción de la PCR para
amplificar el fragmento que interesa secuenciar. Se preparan las tiras de tubos o
placas para la PCR. Se añade la mezcla de reacción de PCR a cada tubo. Se agregan
las muestras de ADN de cada paciente y control. En el caso del control negativo
se añade H 20 .
3. Fase de eliminación de primers y dNTP que sobran de la PCR y que podrían
interferir en la reacción de secuencia.
4. Fase de reacción de secuencia en un termociclador de PCR. Se descongelan los
reactivos que incluyen la ADN polimerasa, los dNTP y los ddNTP, así como el
tampón de reacción recomendado por el fabricante.
5. Precipitación del producto de secuencia para eliminar los reactivos que sobran y que
no interfieran en la electroforesis capilar en el secuenciador. Conservación y recons
titución del producto de secuencia para procesar en el secuenciador automático.

2. Se comprueba que la secuencia de los controles negativos y los controles internos
sea correcta.
3. Se analizan los resultados de los pacientes para asignar el genotipo en cada caso
(fig-23-8).
M u ta c ió n fa c to r V de Leiden
La mutación más frecuente responsable de la resistencia a la proteína C activada es una
mutación puntual en el exón 10 del gen del factor V denominada factor V Leiden (FVL),
que consiste en una sustitución en el nucleótido G1690A (rs6025) e implica un cambio
del aminoácido Arg 506 por Gln, uno de los lugares de actuación de la proteína C activada
en la degradación catalítica del factor Va. Como consecuencia, la molécula del factor V
activado m utada no será debidamente inactivada por la PCa. La mutación FVL se puede
determinar por cualquiera de las técnicas explicadas: PCR y enzima de restricción, PCR
en tiempo real por sondas FRET o sondas Taqman y secuenciación automática.
ERRNVPHGLFRVRUJ
00, , 248C
A C G G A T G C C A T G
200
1 0
¡\
F I G U R A 2 3 - 8 . Resultados de la secuenciación automática para el polimorfismo F12C46T. Se muestran
los resultados de un individuo normal donde la flecha indica C / C para el individuo normal, C / T para el
individuo heterocigoto mutado y T /T para el individuo homocigoto mutado.
M u ta c ió n G20210A d e l gen de la p ro tro m b in a

La mutación G20210A se localiza en la región 3’ no traducible del gen de la protrombina
(F2G20210A; rs 1799963). El mecanismo por el cual incrementa el riesgo de trombosis
no es bien conocido, pero se ha demostrado una asociación entre la presencia del alelo
mutado 20210A y el incremento de los niveles de protrombina en plasma. La hipótesis
más aceptada es que el incremento de los niveles de protrom bina es debido a un posible
incremento de la eficiencia de la poliadenilación del ARN mensajero transcrito.
La mutación G20210A se puede determinar por cualquiera de las técnicas explicadas:
PCR y enzima de restricción, PCR en tiempo real por sondas FRET o sondas Taqman
y secuenciación automática.
Se ha descrito en la literatura médica un polimorfismo neutro en el nucleótido 20209
que podría interferir en la detección de los homocigotos mutados para F2G20210A y
por ello se recomienda confirmar los resultados obtenidos por PCR en tiempo real con
secuenciación automática.
E stu d io d e l p o lim o rfis m o F12C46T

El polimorfismo F12C46T (rsl801020) se encuentra cerca de la señal de inicio de la
traducción de la proteína (metionina inicial) del factor XII, Produce un inicio alternativo
y da lugar a un codón stop muy precoz y a la traducción de una proteína de solo tres
aminoácidos, lo que genera una proteína truncada no funcional.
El polimorfismo F12C46T se puede determ inar por cualquiera de las técnicas ex
plicadas: PCR y enzima de restricción, PCR en tiempo real por sondas FRET (Tirado
et al.) o sondas Taqman y secuenciación automática.
E stu d io de la m u ta c ió n C677T de l gen de la m e tile n o te tra h id ro fo la to

reductasa
El incremento de los niveles de homocisteína plasmática es un riesgo independiente
de trombosis. Los niveles de homocisteína vienen determinados por la interacción de
ERRNVPHGLFRVRUJ
factores genéticos y ambientales. Actualmente, el polimorfismo más aceptado que influye

en la variabilidad de la homocisteína es C677T (rsl801133) del gen de la metilenote-
trahidrofolato reductasa (MTHFR).
La mutación C677T se puede determinar por cualquiera de las técnicas explicadas:
PCR y enzima de restricción, PCR en tiempo real p or sondas FRET o sondas Taqman
y secuenciación automática.
E stu d io de las m u ta cio n e s fa c to r V C a m b rid g e (p .A rg 3 0 6 T h r)

y fa c to r V H o n g K o n g (p .A rg30 6G ly)
Algunos pacientes muestran el fenotipo de la resistencia a la proteína C activada en ausen
cia de la mutación factor V Leiden. Se ha descrito como, en un pequeño porcentaje, estos
casos presentan una mutación en el exón 7 del gen del factor V que implica otros lugares
donde la PC rompe el factor V activado. En ambos casos, el resultado es una sustitución
del aminoácido Arg 306: en uno el cambio es de Arg306Thr (F5G1091C), y se denomina
factor V Cambridge, y en el otro es de Arg306Gly (F5A1090G) o factor V Hong Kong.
Las mutaciones factor V Cambridge y factor V Hong Kong se pueden determinar por
las técnicas PCR y enzima de restricción y secuenciación automática.
En este caso la PCR en tiempo real por sondas FRET o sondas Taqman no se puede
utilizar, ya que las dos mutaciones se localizan a solo un nucleótido una de otra y la
técnica no podría discriminar a esta distancia si se trata de una u otra mutación.
E stu d io de la a n titr o m b in a C a m b rid g e tip o I ( SERPINC1 G13802C;

A la 384 P ro) y tip o I I ( SERPINC1 G13802T; Ala384Ser)
Se han descrito dos mutaciones puntuales en el gen de la antitrom bina (SERPINC1)
que provocan una mutación tipo missense en el aminoácido 384 de la proteína y una
deficiencia de antitrombina de tipo II con defecto en el centro reactivo. El residuo alanina
384 corresponde al residuo PIO del centro reactivo, que forma parte de su región bisagra,
y por tanto, con una potencial relevancia en el movimiento del centro reactivo durante
el proceso de inhibición.
Una de las mutaciones descritas produce un cambio de guanina por citosina en el
gen SERPINC1 en la posición 13802 (g.13802 G > C) que da lugar a la sustitución del
aminoácido alanina por prolina (Ala384Pro) denom inada antitrom bina Cambridge
tipo I. El efecto de la fisiopatología de esta mutación en pacientes con trombofilia se
desconoce debido a la baja prevalencia de la misma.
La segunda m utación que se ha descrito produce un cambio de guanina por timi-
na (g. 13802 G > T) que da lugar a la sustitución del aminoácido alanina por serina
(Ala384Ser) denom inada antitrom bina Cambridge tipo II. Se ha descrito en varios
estudios que la antitrom bina Cambridge tipo II es un factor de riesgo trom bótico en
pacientes con trombofilia.
Las mutaciones antitrombina Cambridge tipos I y II se pueden determinar por las
técnicas de PCR y enzima de restricción y secuenciación automática. En este caso, la
PCR en tiempo real por sondas FRET o sondas Taqman no se puede utilizar, ya que las
dos mutaciones se localizan en el mismo nucleótido y la técnica no podría discriminar
a esta distancia si se trata de una u otra mutación.
E stu d io de l g e n o tip o de l g ru p o A B O
Se ha dem ostrado la implicación genética directa entre el grupo sanguíneo ABO y
el riesgo a sufrir episodios trombóticos, que es más elevado en los individuos con la
ERRNVPHGLFRVRUJ
presencia de grupo no O frente a los que presentan grupo O. En población española se

ha mostrado que en concreto el alelo A l presenta un elevado riesgo en pacientes con
trombosis venosa, por lo cual requiere el estudio a nivel genético.
El estudio del genotipo del grupo ABO se pueden determinar por las técnicas PCR y
enzima de restricción y secuenciación automática. En este caso, la PCR en tiempo real
por sondas FRET o sondas Taqman no se puede utilizar ya que no discriminaría los
diferentes polimorfismos posibles.
E stu d io d e l p o lim o rfis m o fa c to r X I I I V al34Leu (c. 103G > T )

El polimorfismo Val34Leu del gen del factor XIII (c. 103G > T ; rs5985) se encuen
tra situado en la zona que traduce para el péptido de activación del factor XIII de la
coagulación (Arg37 y la Gly38). La activación del factor XIII en los portadores del alelo
Leu34 mediante trom bina presenta una cinética más rápida que la variante Val34. El
mecanismo p o r el cual se acelera esta activación por trom bina no se conoce del todo,
sin embargo, varios estudios han sugerido que los posibles cambios conformacionales
podrían desempeñar un papel importante. Los coágulos de fibrina formados en presencia
de Leu34 m uestran fibras más finas en presencia de niveles elevados de fibrinógeno y
con características de permeabilidad alteradas cuando se comparan con la estructura
en presencia de Val34.
El polimorfismo factor XIIIVal34Leu se puede determ inar p o r cualquiera de las
técnicas explicadas: PCR y enzima de restricción, PCR en tiempo real por sondas FRET
o sondas Taqman y secuenciación automática.
A G R A D E C IM IE N TO S
Agéncia de Gestió d’Ajuts Universitaris i de Recerca (AGAUR): 2009SGR1147. Gene
ralitat de Catalunya.
RECAVA RD 06/0014/0016. Instituto de Salud Carlos III.
REFERENCIAS B IB LIO G R Á F IC A S
Kato S, M atsum oto M , M atsuyam a T, Isonishi A , H iura H , Fugim ura Y. N ovel m onoclonal
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X II gene, a novel genetic risk factor for throm bosis, b y m elting peak analysis using fluorescence
hybridization probes. G enetic Testing 2 0 0 3 ;7 ( 4 ):2 9 5 -3 0 1.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 23 Métodos para el diagnóstico de los trastornos hemorrágicos y trom bofilia 7 3 9 .e l
Autoevaluación
1. U n tiem po de protrom bina prolongado puede indicar:
(a) Déficit de factor V III.
(b) Déficit de factor IX .
(c) Déficit de factor II.
(d) Incremento de fibrinógeno.
(e) Déficit de factor XI.
Respuesta razonada: el tiem po de protrom bina es sensible a los factores de la vía extrínseca:
II, V, V II, X , y fibrinógeno.
2. ¿Q ué otras determinaciones se tendrían que realizar ante el siguiente estudio: T T P A prolon
gado; T P N orm al; T T N orm al?
(a) Factor II.
(b) Antitrom bina.
(c) Anticoagulante lúpico.
(d) Fibrinógeno.
(e) Factor V II.
Respuesta razonada: al tener un T T n orm al se d escarta la presencia de heparina. U n a vez
descartada, la causa m ás frecuente de un T T P A prolongado es un anticoagulante tipo lupus.
3. ¿Q ué sugiere el siguiente estudio? Dism inución de los factores: II, V II, IX , X con factor V y
fibrinógeno normales.
(a) Hepatopatía.
(b) Déficit de vitam ina K.
(c) Inhibidor contra el factor V II.
(d) Déficit de factor II.
(e) Presencia de heparina.
Respuesta razo n a d a : so lam en te se o b serv a un a d ism in u ció n d e los facto res v ita m in a K
dependientes. E n un a hepatopatía se en con trarían d ism inu idos tam bién el facto r V y el fi
brinógeno.
4. Niveles bajos de factor V III pueden indicar:
(a) Hem ofilia A.
(b) Anticoagulante lúpico.
(c) Enferm edad de von Willebrand.
(d) Inhibidor adquirido contra el factor V III.
Respuesta razonada: en presencia de un anticoagulante lúpico los resultados de laboratorio
del factor V III están disminuidos de form a artefactual. En la enferm edad de von W illebrand el
nivel de factor V III disminuye, por no estar protegido po r el factor von W illebrand.
5. U n dímero D > 500 (xg/ml indica:
(a) Trom bosis venosa.
(b) Trom boem bolism o pulmonar.
(c) Presencia de heparina.
(d) Antivitam ínicos K.
(e) N ingun a de las anteriores.
Respuesta razonada: el dím ero D solo tiene valo r para descartar un a trom bosis venosa o un
trom boem bolism o pulm onar cuando es negativo < 500 (J ig /m l. Puede ser positivo por muchas
otras causas y no es informativo.
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6. El siguiente estudio de trombofilia ( T T P A N orm al; T P prolongado; T T N orm al; proteína C

5 0 % ; proteína S 4 0 % ; antitrom bina 9 5 % ) sugiere:
(a) Déficit de proteína C .
(b) Déficit de proteína S.
(c) Presencia de anticoagulante tipo lupus.
(d) Presencia de antivitam ínicos K.
(e) Presencia de heparina.
R espuesta razonada: tan to la proteína C com o la proteína S son vitam ina K dependientes.
El alargamiento del tiem po de protrom bina tam bién indica que probablemente el enferm o ha
recibido antivitam ínicos K.
7. El tipo de variantes genéticas descritas com o factores de riesgo trom boem bólico son:
(a) M utaciones puntuales.
(b) Polimorfismos puntuales.
(c) a y b son correctas.
(d) G randes deleciones.
Respuesta razonada: hasta el m om ento se han descrito m utaciones y polim orfism os puntuales
com o factores de riesgo trom boem bólico.
8. La técnica adecuada para el estudio molecular de la trombofilia es:
(a) T écnica de la P C R y digestión con enzimas de restricción.
(b) Secuenciación automática.
(c) P C R en tiem po real con sondas FR ET .
(d) P C R en tiem po real con sondas Taqman.
(e) Todas son correctas en función de la variante genética estudiada.
Respuesta razo nada: p ara realizar el estud io m o lecu lar de la tro m b o filia existen diversas
metodologías que se pueden realizar, en función de la alteración que se analice y el núm ero de
muestras.
9. En la técnica de P C R el control negativo:
(a) E s el H 20 .
(b) Es un control que no presenta la mutación.
(c) Es un control que presenta la mutación solo en heterocigosis.
(d) N o ha de m ostrar producto amplificado.
(e) a y d son correctas.
R espuesta razonada: en la técn ica d e la P C R el con tro l negativo es el H 20 . A l preparar la
mezcla de reacción se introducen todos los reactivos necesarios y en lugar de añadir A D N se
añade H 20 . D e m anera que n o ha de presentar ningún producto de amplificación.
10 . La ventaja de la P C R en tiem po real es:
(a) U n m étodo rápido.
(b) U n m étodo lento.
(c) Todo el proceso se lleva a cabo en el m ism o tubo de reacción.
(d) a y c son correctas.
(e) N ingun a es correcta.
R espuesta razo n ada: la ven taja d e la m eto d o lo gía d e P C R en tiem p o real es q u e to d o el
proceso, desde la am plificación hasta la detección, se lleva a cabo en el m ism o tubo de reacción,
evitando de esta m anera posibles contam inaciones ambientales. A dem ás es un m étodo rápido,
ya que todo el proceso tarda com o m áxim o de 1 a 3 h.
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C A P Í T U L O
Identificación de hemoparásitos
en sangre periférica
R. Navarro García
IN T R O D U C C IÓ N
Las hemoparasitosis constituyen enfermedades ampliamente distribuidas en toda la zona
tropical, al igual que sus vectores; causan efectos negativos en la salud de las personas y
los animales, y también sobre la producción y rentabilidad de los sistemas de producción
establecidos en las diferentes regiones.
Actualmente, están en aumento los movimientos migratorios en todas las zonas del
planeta: viajeros, inmigrantes, emigrantes, cooperantes, etc. Esto conlleva que en las
consultas médicas aparezcan pacientes de otras zonas del mundo, que presentan o pueden
presentar patologías de sus zonas de origen tanto asintomáticas como sintomáticas. Otras
personas viajan por las zonas tropicales y están expuestas, o transportan en su organismo,
a patologías que son estrictas de un ecosistema determinado.
Sea como sea, nuestra obligación es saber identificar el parásito y conocer la zona
geográfica de la que procede el paciente o el tránsito realizado. En el m om ento del
diagnóstico se deben tener en cuenta los siguientes parámetros: 1) sospecha clínica;
2) antecedentes epidemiológicos, y 3) conocer cuándo se debe tomar la muestra, teniendo
en cuenta el período prepotente del parásito, la periodicidad, la clínica, dónde se puede
localizar el parásito y cómo escoger la técnica adecuada. En la tabla 24-1 se muestra la
clasificación de las histo- y hemoparasitosis más frecuentes.
TIPO S D E PARÁSITOS QUE PU ED EN AFECTAR A L A SANGRE
M alaria o paludism o
Es una antropozoonosis parasitaria causada por esporozoarios del género Plasmodium y
transmitida al hombre por el mosquito Anopheles hembra. Según datos de la Organiza
ción Mundial de la Salud (OMS), en 2010 el paludismo infectó a 216 millones de personas
y causó cerca de 655.000 muertes, la mayoría en niños africanos. Es una enfermedad
prevenible y curable, con medidas de prevención y control.
Los viajeros no inmunes procedentes de zonas sin paludismo que contraen la in
fección son muy vulnerables a la enfermedad. El hom bre puede estar parasitado por
las cinco especies: Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae,
Plasmodium ovale y Plasmodium knowlesi. Este último es considerado como la quinta
especie, ya que en los últimos años se han dado casos en humanos debidos a este parásito;
deriva del mono, y aparece en zonas boscosas de Asia sudoriental.
El parásito presenta en su ciclo dos formas de reproducción (fig. 24-1):

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Capítulo 2 4 Identificación de hemoparásitos en sangre periférica 741
TABLA 24-1. H isto- y hem oparasitosis m ás frecuentes
Parasitosis Agentes Formas infectantes

para el hombre
PROTOZOOS
Malaria Plasmodium spp. Esporozoito
Leishmaniosis Leishmania spp. Promastigote
Enfermedad de Chagas Trypanosoma cruzi Tripomastigote
Enfermedad del sueño Trypanosoma brucei Tripomastigote
Toxoplasmosis Toxoplasma gondii Ooquistes, quistes, zoitos
Babesiosis Babesia spp. Merozoitos
NEMATODOS
Filariosis Wuchereria bancrofti
Brugia malayi Larva filariforme
Loa loa mansonella Metaciclicas
M icrogam etos |
Ciclo de la malaria
Ex flagelación |
M icrogametocitos
Qocineto
L^ E s p o ro ¿oitos |
O oguisiesl
¡díñelos]
| M a c ro g a m e to c ito s f
|E sp o ro zo iIo s|i
jorozoito s
Iero7oftos|
F I G U R A 2 4 - 1 . Ciclo de la malaria. A . Ciclo esporogónico, reproducción sexual que se realiza en el

mosquito, huésped definitivo. B . Ciclo esquizogónico, reproducción asexual que se realiza en el hombre,
huésped intermediario.
1. Ciclo esporogónico, reproducción sexual que se realiza en el mosquito (huésped

definitivo).
2. Ciclo esquizogónico, reproducción asexual que se realiza en el hombre (huésped
intermediario).
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Ciclo esporogónico
Solo aparece en las hembras de los mosquitos de género Anopheles, las cuales se infectan
cuando ingieren sangre de una persona afectada de malaria que por su evolución del
ciclo ya tenga el parásito en forma de gametocitos, sexualmente diferenciados en ma
chos (microgametocitos) y hembras (macrogametocitos). Estos gametos entran en el
estómago del mosquito, donde continúan su ciclo; en allí donde los microgametocitos
se desarrollan e inician la exflagelación, que consiste en la división de la cromatina en
varios fragmentos, dispuestos en la periferia del parásito y transform ados en formas
flageladas móviles, los llamados microgametos. Al liberarse buscan las células femeninas
para fecundarlas. Los macrogametocitos m aduran también y se transform an en ma-
crogametos; en cada uno de ellos se forman uno o dos cuerpos polares, que se desplazan
hasta la superficie del parásito para recibir un microgameto que lo fecunde. La fusión de
sus cromatinas da origen a un huevo (cigoto). El cigoto se desarrolla y se transforma en
una célula alargada y móvil llamada oocineto, la cual se desplaza hasta llegar a las capas
epitelial y muscular, donde crece y se transform a en ooquistes que van m adurando y
adquiriendo una forma redondeada. En su interior, el núcleo y el citoplasma se dividen
y van creando elementos filamentosos en gran cantidad llamados esporozoítos. Al
madurar, el ooquiste estalla liberando los esporozoítos por todo el cuerpo del mosquito,
pero se instalan preferentemente en sus glándulas salivales, donde se mantienen a la espe
ra de ser inoculados al hombre en una nueva picadura.
Ciclo esquizogónico
Cuando el mosquito pica, inyecta en la sangre esporozoítos, de forma alargada y móviles.
Durante 30 min permanecen en la sangre, pero después pasan a invadir los hepatocitos
(células hepáticas). Hay dos etapas de reproducción esquizogónica: preeritrocitaria y
eritrocitaria.
Etapa preeritrocitaria
Empieza cuando los esporozoítos invaden los hepatocitos. Dentro de cada hepatocito
parasitado se desarrolla un esquizonte tisular, que desarrolla muchos núcleos con sus
citoplasmas, llamados merozoítos. El esquizonte madura deformando la célula hepática
y la rompe liberando miles de merozoítos tisulares, que salen al torrente circulatorio y
pasan a invadir a los eritrocitos. En el caso de P. vivaxyP. ovale, algunas formas pueden
desarrollarse m uy lentamente y quedar latentes durante meses o años; estas reciben el
nom bre de hipnozoítos y son las causantes de las recaídas. Esto no ocurre nunca en
P. falciparum, P. malariae y P. knowlesi.
Etapa eritrocitaria
Los merozoítos procedentes de los esquizontes tisulares entran en el torrente sanguíneo e
invaden los eritrocitos. Al penetrar en un eritrocito toman forma anillada y se denominan
trofozoítos; estos van madurando, se desarrollan irregularmente y se nutren de la hemo
globina. Al dividir su cromatina se constituye un esquizonte que tom a forma de rosetas
con varios núcleos y sus citoplasmas. El número de divisiones depende de la especie del
Plasmodium. En el caso de P. falciparum, los esquizontes en sangre periférica son muy
raros de ver, ya que se desarrollan en los eritrocitos adheridos a las paredes viscerales.
El esquizonte maduro, al romper el eritrocito libera los merozoítos que invaden a otro
eritrocito y empieza un nuevo ciclo eritrocitario. Algunos de estos merozoítos tienen
una determinación genética para desarrollarse en gametocitos masculinos y femeninos.
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Los gametocitos circulan como formas infectantes para los mosquitos, pero no afectan
al hombre; si el m osquito no los ingiere, desaparecen espontáneamente de la sangre.
En el caso de P. falciparum los gametocitos aparecen en la sangre y pueden permanecer
en ella de 1 a 6 semanas; en las otras especies desaparecen más rápidamente. El diagnós
tico se realiza por el hallazgo del parásito en la sangre, demostrado directamente o a
través de pruebas indirectas. Los métodos más sencillos de diagnóstico son el frotis y la
gota gruesa, tomados preferentemente en el m omento del acceso febril.
En el frotis sanguíneo se debe investigar la morfología del parásito dentro del mismo
eritrocito o localizar formas más maduras, como esquizontes o gametocitos, para poder
identificar la especie.
En la gota gruesa se pueden apreciar los parásitos más concentrados para su rápida
localización, lo que servirá para contar la parasitemia. Esta nos será útü para saber el
grado de gravedad inicial y en caso de resistencia al tratamiento.
Hay otros métodos más rápidos para su diagnóstico, como la utilización de la técnica
del QBC®, que consiste en un procedimiento de fluorescencia con naranja de acridina
que tiñe los núcleos para su detección con la ayuda de un microscopio especial, y métodos
más sencillos de diagnóstico rápido o en kits específicos que detectan los anticuerpos
monoclonales contra fracciones antigénicas del P. falciparum.
Una mención aparte merece el P. knowlesi. Este es un protozoo parásito que se dis
tribuye principalmente en el sudeste asiático y se transmite por picadura de mosquitos
del grupo de Anopheles leucosphyrus e infecta preferentemente a los macacos de cola
larga (Macaca fascicularis), en los cuales la parasitemia es baja y la infección es crónica.
Se trata de una infección emergente, que apareció por prim era vez en humanos en 1965,
y potencialm ente m uy grave, ya que es bastante invasiva y de ciclos m uy rápidos. La
morfología es similar a la del P. malariae, aunque actualmente gracias a las pruebas del
detección molecular o PCR se puede identificar el P. knowlesi. Desde 2004 ha habido un
número creciente de esta infección entre los humanos de las zonas del sudoeste asiático,
como Malasia, Tailandia, Singapur, Filipinas, Vietnam, Myanmar e Indonesia.
Leishm aniosis
La leishmaniosis es una histoparasitosis producida por protozoos del género Leish-
mania, intracelular en los macrófagos. Son parasitosis comunes del hom bre y ciertos
animales debido a protozoos flagelados y transmitidos por la picadura de insectos de los
géneros Phlehotomus y Lutzomyia; por este motivo se pueden considerar también una
zoonosis, ya que existen reservorios domésticos y silvestres. Su clasificación es clínica,
geográfica y epidemiológica. Las especies de Leishmania que infectan al hom bre se
manifiestan en tres formas clínicas diferentes: cutánea, mucocutánea y visceral.
La leishmaniosis visceral (LV), denominada también Kala-Azar, está causada por tres
agentes clasificados según su localización geográfica: L. donovani (India, China, África,
Irak), L. infantum (costa del Mediterráneo europeo y africano) y L. chagasi (América).
El diagnóstico parasitológico se puede realizar a través de varios procedimientos para
demostrar su existencia:
• Examen morfológico de la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo y el hígado. De
todos ellos, el menos agresivo es el aspirado de médula ósea con extensión y tinción
mediante el método de Giemsa. Los amastigotes de Leishmania se encuentran en el
interior de los macrófagos o histiocitos (fig. 24-2).
• Cultivos in vitro o inoculaciones en animales de laboratorio.
• Pruebas serológicas muy útiles en LV: la aglutinación directa, la inmunofluorescencia
indirecta y la prueba de ELISA.
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FIGU RA 24-2. Leishmania.
La leishmaniosis mucocutánea se encuentra localizada desde el sur de EE. UU.

hasta el norte de Argentina. Todas las leishmanias de im portancia médica producen
lesiones cutáneas y algunas de ellas, además, lesiones mucosas. La más importante es la
L. braziliensis.
El diagnóstico parasitológico requiere la demostración de los amastigotes en el frotis
de la lesión o en las improntas de la biopsia. En el frotis de la lesión se debe examinar
una lesión reciente y limpia. Se realiza un raspado con bisturí o espátula del borde,
intentando que no sangre. La mejor m uestra es la que contenga más linfa rica en his-
tiocitos y menos hematíes, mucus o gérmenes que puedan impedir la observación. Se
tiñe con Giemsa y se observa con el objetivo de X 100 y aceite de inmersión en búsqueda
de parásitos dentro o fuera de los histiocitos. En lesiones tratadas o crónicas no son
frecuentes los hallazgos.
La leishmaniosis cutánea se encuentra en el viejo m undo y es conocida como botón
de oriente. El botón de oriente de tipo seco y zona urbana es causado por L. tropica, y
el de tipo húmedo y en zona rural, por L. major, y se considera una zoonosis por ser los
roedores sus reservorios. La L. aethiopica es la más agresiva, ya que ocasiona lesiones
mucosas y se diagnostica mediante examen morfológico del frotis de la lesión.
Tripanosom iasis
La tripanosomiasis es una enfermedad producida por protozoos flagelados, denominados
tripanosomas.
Se distinguen dos infecciones principales producidas por los tripanosomas, que se
diferencian geográficamente como tripanosomiasis africana, o enfermedad del sueño,
y tripanosomiasis americana, o enfermedad de Chagas.
Tripanosomiasis o enfermedad del sueño

Se encuentra localizada solamente en las regiones ecuatoriales de África. Es la infección
del hombre y de la mosca tse-tsé por el Trypanosoma brucei. Hay dos agentes causales:
T. gambiensey T. rhodesiense, que presentan similitud en su morfología y biología por
lo que actualmente se les denomina T. brucei del subgénero Trypanozoon. Puede infectar
tanto a animales como al hombre y se transmite por la mosca del género Glossina (tse-
tsé). El ciclo del T. brucei (fig. 24-3) se inicia cuando una mosca no infectada pica a una
persona o animal infectado. En sus glándulas salivales y aparato digestivo se realiza el
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desarrollo del parásito: epimastigotes, metamorfosis, multiplicación, remetamorfosis

y tripomastigotes metacíclicos. Al picar a otro individuo le inyecta los tripanosomas a
través de las glándulas salivales.
En el hombre se distinguen tres fases: 1) multiplicación de tripanosomas en la sangre
inyectados por la mosca en el lugar de la infección que invaden el torrente sanguíneo;
2) invasión de espacios en diferentes órganos, y 3) invasión del sistema nervioso central,
que ocasiona síntomas cerebrales y coma.
Tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas

Se encuentra situada en zonas selváticas de EE. UU., América central y la mayor parte
de América del sur. Es la infección de mamíferos y triatom inos p or el Trypanosoma
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FIGU RA 24-4. Ciclo del Trypanosoma cruzi (tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas).
cruzi. En el hombre puede ser una enfermedad adquirida o congénita y afecta a diversos
órganos y sistemas, principalmente los aparatos circulatorio (corazón) y digestivo. El
ciclo del T. cruzi (fig. 24-4) se inicia cuando la chinche redúvida, de diferentes especies
y géneros según los países y nichos ecológicos, pica a un mamífero infectado e ingiere
los tripomastigotes. En el intestino medio los parásitos se multiplican por fisión binaria
y se desarrollan los tripomastigotes que quedan depositados en el intestino posterior
del insecto. Después de picar a u n mamífero defeca y deposita las heces infectadas de
tripomastigotes metacíclicos en la piel del mamífero no infectado, lo que produce prurito
y abrasión en la zona. El mamífero, al frotarse la piel, se introduce los tripanosomas que
llegarán al torrente circulatorio y de allí a todos los órganos.
Esta enfermedad puede presentase de forma aguda o crónica. La fase aguda suele
presentarse en lactantes. La crónica es más leve, incluso asintomática.
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TABLA 24-2. Técnicas más adecuadas para el diagnóstico de tripanosomiasis
Tripanosomiasis africana Tripanosomiasis americana

Examen en fresco No adecuado Adecuado en fase aguda
Frotis sanguíneo No adecuado No adecuado
Gota gruesa Adecuado Adecuado en fase aguda o en casos
de trastornos congénitos
Buffy coatt Muy adecuado Muy adecuado en fase aguda o
en trastornos congénitos
Punción ganglionar Muy adecuado Muy adecuado en fase aguda o
en trastornos congénitos
LCR Adecuado Adecuado
Xenodiagnóstico No procede Utilizar ninfas de triatomas de laboratorio
Pueden darse tres períodos: 1) agudo (chagoma de inoculación, afectación visceral);

2) latente o indeterminado, y 3) crónico (cardiopatía chagásica crónica, afectaciones diges
tivas y de otros sistemas). En el vídeo 1, se observa el T. cruzi en fresco mediante gota gruesa.
Para el diagnóstico parasitológico pueden utilizarse varias técnicas, pero lo más
im portante es saber que la presencia de parásitos en sangre varía mucho de un período
a otro. Las más adecuadas se resumen en la tabla 24-2. Cuando circula por la sangre, el
T. cruzi puede observarse en fresco, o mediante tinción de Giemsa (fig. 24-5). También
se dispone de técnicas de diagnóstico parasitológico indirecto, como reacciones de
ELISA, inm unofluorescencia indirecta (IFI), hem oaglutinación (HAI), fijación del
complemento (FC) y otras.
Filariasis
Las filariasis son un grupo de enfermedades diferentes que tienen en común que todas
ellas están producidas por nem atodos (gusanos redondos) de la misma familia y se
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transmiten de persona a persona por diferentes insectos dípteros hematófagos. Se dis

tinguen tres tipos de enfermedades importantes.
Tipos
Filariasis linfática
Producida por dos especies de filarías: Wuchereria bancrofti y Brugia malayi. Estas se
sitúan en los canales linfáticos y obstruyen de m anera perm anente el flujo de la linfa
(elefantiasis). W. bancrofti es la más extendida de las filarías; se da en toda la costa
atlántica de América Central y Sudamérica; oeste, centro y este de África; centro-sur,
sureste y este de Asia e islas del Pacífico. B. malayi aparece de form a salpicada por el
centro-sur, este y sureste de Asia.
Loasis
Producida po r Loa loa, origina inflamaciones de la piel transitorias y p ruritos que
se pueden observar cruzando la córnea del ojo. Se localiza p o r las selvas húmedas de
África central y oeste. En los vídeos 2 y 3 se muestra la Loa loa a X40 y X 10 aumentos,
respectivamente.
Existen otras filariasis de dudosa patogenicidad como la Mansonella ozzardi (Caribe
y América del sur), Dipetalonema perstans (África tropical y América del sur) y Dipeta-
lonema streptocerca (África continental).
En los vídeos 4 y 5, se m uestra la Mansonella ozzardi a X40 y X 10 aumentos, res
pectivamente.
Oncocercosis
Producida por Onchocerca volvulus, forma nodulos en la piel donde el gusano vive m u
chos años, este expulsa larvas frecuentemente por otras zonas, e incluso puede alcanzar
los ojos hasta producir ceguera. Se localiza por América central, Colombia y Venezuela,
oeste, centro y este de África y Yemen, en el suroeste de Asia. En el vídeo 6 se muestra
otra filaría que puede aparecer en la sangre, aunque su diagnóstico se realiza a través de
un pellizco de piel (oncocerca).
Ciclo
Las larvas de las diferentes filarías se encuentran en la sangre de un infectado, son
ingeridas por insectos hematófagos y, después de sufrir parte del ciclo en ellos, son trans
mitidas a personas sanas durante la nueva ingesta. Después de varios meses alcanzan
la madurez sexual (gusanos adultos) en los tejidos, por los que tienen una preferencia
específica. En ellos son depositadas las larvas (microfilarias), las cuales pasan a la
circulación sanguínea, donde quedan dispuestas nuevam ente para la transm isión.
En este m om ento es cuando se pueden diagnosticar, ya que están circulando en el
torrente circulatorio. La prueba de diagnóstico más adecuada es la concentración de
microfilarias, donde se localizan vivas. Hay que tener en cuenta la periodicidad de la
infección, ya que el diagnóstico puede resultar falso si no realizamos la extracción en
el m omento adecuado
Clasificación
La clasificación de las filarías y sus características diferenciales se resumen en la tabla 24-3.
De ellas destacan cuatro tipos:
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TABLA 24-3. Características diferenciales de las microfilarias
Tamaño Localización Núcleos Extremo

microfilaria Vaina parásito del cuerpo de la cola
Adulto Microf.
Wuchereria 200-300 |xm Sí Vasos y Sangre Gruesos y bien Sin núcleos
bancrofti ganglios separados Extremo
linfáticos puntiagudo
Brugia 220-250 |xm Sí Vasos y Sangre Gruesos, tienden a Dos núcleos
malayi ganglios superponerse muy
linfáticos espaciados
Punta roma
Loa loa 250-300 |xm Sí Tejido Sangre Gruesos, tienden a Núcleos
subcutáneo superponerse presentes
Punta
redondeada
Onchocerca 250-300 |xm No Nódulos Piel Gruesos y Sin núcleos
volvulus subcutáneos separados Extremo
puntiagudo
Mansonella 150-200 |xm No Cavidades Sangre Medianos y Núcleos
perstans serosas superpuestos Punta
redondeada
Mansonella 180-240 |xm No Tejido Piel Finos, en su Núcleos
streptocerca subcutáneo mayoría separados Punta curva
Mansonella 150-200 |xm No Cavidades Sangre Finos, en su Sin núcleos
ozzardi serosas mayoría separados Extremo
puntiagudo
1. Wuchereria bancrofti, transmitida durante la noche por las hembras de mosquitos

Anopheles, Mansonia y Culex. Se debe realizar la extracción de sangre en horario
nocturno (24 h).
2. Brugia malayi, contagiada por mosquitos hembras de actividad nocturna como
Anopheles, Mansonia y Aedes. La extracción de sangre se realizará en horario
nocturno (24 h).
3. Loa loa, transmitida durante el día por machos y hembras de tábanos Chrysops.
La investigación se realiza con la extracción en horario diurno (12 h).
4. Onchocerca volvulus, contagiada por dípteros machos y hembras del género Simu-
lium, de hábitos diurnos. Esta filaría no la podremos clasificar como hemoparásito,
ya que se diagnostica con la técnica del pellizco de piel.
Babesiosis
Es una enfermedad animal que puede infectar al hombre ocasionalmente y producir la
muerte principalmente en personas esplenectomizadas. Se trata de un protozoo apicom-
plexo de la familia Babesiidae que comprende más de 20 especies que atacan a los anima
les de Europa, Rusia, América del norte, sur y central. Es un parásito intraeritrocitario
esporozoico de los animales que se transmite por picadura de garrapatas infectadas.
Las especies de babesia se presentan dentro de los hematíes en forma redondeada, oval,
piriforme o de anillo, y se dividen en dos o cuatro merozoítos que tienden a unirse en
el centro. Parasitan además los linfocitos, histiocitos y eritroblastos. Se puede confundir
con u n P. falciparum.
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El diagnóstico parasitológico se basa en la demostración del parásito en sangre, en

la fase aguda, con gota gruesa y frotis de sangre. Hay otras pruebas serológicas que
pueden utilizarse para las formas agudas o crónicas: ELISA, fijación del complemento,
aglutinación con látex, anticuerpos para fluorescencia, etc.
Toxoplasmosis
Es una infección intracelular parasitaria del hombre, de diversos mamíferos y de aves,
producida por el parásito protozoario intracelular Toxoplasma gondii. Se encuentra en
los seres hum anos a nivel mundial. Los gatos son el huésped final del parásito, el ciclo
solo se realiza en ellos.
La infección se produce al ingerir accidentalmente quistes de T. gondii de tierra
contaminada, o al manipular heces del gato. También se da con la ingesta de carne cruda o
poco cocida de cordero, cerdo, res, o por transmisión placentaria (infección congénita)
o transfusión de sangre o trasplante de órganos.
El diagnóstico se realiza por examen de tejidos y extensiones. En los cortes histológicos
teñidos con hematoxilina o eosina se puede hallar fácilmente el microorganismo. Para la
extensión se tiñe con Giemsa, donde se visualiza su forma fusiforme u oval caracterís
tica (los quistes tienen forma esférica). El reconocimiento de trofozoítos (taquizoítos) o
quistes (bradizoítos) no se realiza fácilmente. Actualmente, también se realizan técnicas
como serología para toxoplasma, IRM de cráneo, TC craneal o biopsia del cerebro. Es
muy im portante el estudio de la retina con lámpara de hendidura, para localizar las
lesiones características de la enfermedad.
TÉCNICAS PARA LA INVESTIGACIÓN DE HF.MOPARÁSITOS

EN SANGRE
Exam en en fresco
Principio
Se trata de investigar una pequeña m uestra de sangre, inmediatamente después de la
extracción para la búsqueda de los hemoparásitos en movimiento.
Material
• Portaobjetos.
• Cubreobjetos.
• Cloruro sódico.
Método
1. Se extraen dos o más gotas de sangre capilar o venosa sin anticoagulante y se
depositan en un portaobjetos.
2. Se añade una gota de cloruro sódico y se remueve uniformemente.
3. Se coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio con un objetivo de X5,
X40 y X 100, según el hemoparásito que se investigue.
Lectura
Se observa toda la muestra buscando formas móviles entre los hematíes o leucocitos que
deben estar dispuestos uniformemente sin aglutinaciones ni zonas desecadas.
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Se localizan con el objetivo de X10: especies de microfilarias sanguíneas, especies de
tripanosomas, otros (especies de borrelias).
Observaciones: la observación de sangre en fresco es muy rentable cuando se intentan
localizar parásitos móviles. Se utiliza el objetivo de X 10 para su localización y se aumenta
para su identificación.
Para el diagnóstico es necesario fijar el parásito y teñir sus estructuras para la dife
renciación (tinción de Giemsa, tinción de hematoxilina).
Exam en en gota gruesa

Es la técnica más utilizada para el diagnóstico del paludism o y requiere una buena
formación en citología sanguínea, ya que su identificación no siempre es fácil. Se utilizará
para identificar la presencia de especies de plasmodio.
Principio
Se trata de aglutinar en una pequeña m uestra de sangre capilar o venosa la mayor
cantidad posible de hematíes. Una vez concentrados se rompen los hematíes por osmosis
y se tiñen las estructuras restantes, para así poder observar los parásitos.
Material
• Portaobjetos.
• Giemsa al 2%.
• Agua tamponada.
Método
1. Se extraen dos o más gotas de sangre capilar o venosa y se depositan en el centro
de un portaobjetos.
2. Con el extremo de otro portaobjetos se remueve uniformemente toda la sangre
depositada, haciendo círculos de 1 cm de diámetro, aproximadamente durante
1 min, con la finalidad de desfibrinar la muestra.
3. Se deja secar completamente con una fuente de calor.
4. Se sumerge dentro del agua unos m inutos con la finalidad de deshemoglobinizar
los hematíes por osmosis, y se espera a que la hemoglobina se visualice en el fondo
del recipiente.
Tinción
Hay diversas técnicas para colorear la gota gruesa; dentro de las mismas se pueden hacer
concentraciones diferentes de colorantes y adaptar el tiempo de fijación.
1. Se prepara la tinción Giemsa al 2% y se cubre completamente durante 20 min. Se
deja secar y se observa al microscopio con aceite de inmersión.
2. Tinción de Field:
(a) Tinción A y B de Field (solución).
(b) Agua destilada o corriente.
Método
Se sumerge la gota:
• 1.°: en la solución Field A durante 5-10 s.
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• 2.°: en agua limpia durante 3-5 s.

• 3.°: en la solución Field B durante 3-5 s.
• 4.°: en agua, donde se retiran los restos de colorante.
• 5.°: se seca al aire y se observa al microscopio con un objetivo de X 100.
Observación al microscopio
En la gota gruesa se quedan depositados los leucocitos, las plaquetas y los parásitos en
mayor concentración que si se tratase de un frotis. Gracias a la tinción se pueden observar
la morfología de los siguientes parásitos:
• Especies de plasmodio.
• Especies de tripanosomas.
• Especies de microfilarias.
• Babesias.
• Otros: especies de borrelias.

En la gota gruesa se debe calcular la parasitemia: n.° de plasmodios/milímetro cúbico. Se
calcula el número de plasmodios encontrados, por 100 leucocitos contados, y después se
hace una regla de tres con el n.° de leucocitos por m m 3. En el caso de no conocerse la nu
meración de glóbulos blancos, se realiza el cálculo estándar en 8.000 leucocitos por m m 3.
Se pueden identificar con el objetivo de X 10 las especies de microfilarias sanguíneas,
y con el objetivo de X100: las especies de plasm odio, tripanosom as, leishmanias y
otros (borrelias).
Observaciones: la gota gruesa es la prueba más rentable para la investigación del
paludismo. Con poca cantidad de sangre concentrada, se pueden hallar fácilmente las
estructuras a investigar como, por ejemplo, el gametocito del P. falciparum (fig. 24-6).
Exam en en frotis sanguíneo

Principio
Se trata de observar la estructura de los elementos sanguíneos para investigar la situación
de los parásitos en relación a los hematíes. Se localizan los hematíes parasitados y se
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TABLA 24-4. Características diferenciales de las especies de plasmodio
Hematíe Plasmodium Plasmodium Plasmodium Plasmodium Plasmodium

parasitado falciparum vivax malariae ovale knowlesi
Tamaño Normal Aumentado Normal Aumentado Normal
Tendencia
oval y
desflecado
Granulación No Granulaciones No Granulaciones No
del citoplasma Presencia azuladas de azuladas de
de manchas Schüñner Schüffner
de Maurer
(ocasional)
N.° de 1-2-3-4 1 (2 muy raro) 1 1 1
plasmodios
dentro del
mismo
hematíe
Puntos de 1-2 1 (2 muy raro) 1 1 1
cromatina
del trofozoíto
Trofozoíto Anillo delgado Anillo Anillo Anillo Anillo
joven y pequeño pequeño o pequeño pequeño o pequeño o
grande o grande grande grande
Grueso Deforme Grueso
Trofozoíto No frecuente Anillo grande Anillo Anillo grande Anillo
maduro en sangre e irregular compacto redondo compacto
periférica y redondo Compacto y redondo
Compacto Forma en Forma de
banda banda
observa la disposición del parásito dentro del hematíe o la morfología del mismo para
su diagnóstico según las características de identificación (tabla 24-4).
Material
• Portaobjetos.
• Metanol al 75%.
• Giemsa al 2%.
Método
1. Con una pequeña cantidad de sangre capilar o venosa, con o sin anticoagulante,
se realiza un frotis o extensión sanguínea, y se deja secar al aire.
2. Se cubre con alcohol metílico durante 3 min.
3. Se cubre el portaobjetos con la solución de Giemsa al 2% durante 20 min.
4. Se deja secar y se observa al microscopio con el objetivo de X 100 y aceite de
inmersión.
Observación al microscopio XlOO

Se observa toda la muestra en la zona de las barbas, donde los hematíes quedan mejor
dispuestos para su observación. Se localizan los hematíes parasitados y se estudia la
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FIGU RA 24-7. Trofozoíto de

P. falciparum.
disposición del parásito dentro de estos. También se investiga la localización de formas

más desarrolladas para así poder diferenciar la especie o las posibles apariciones de las
diferentes especies que se puedan encontrar en un mismo paciente.

Se puede identificar con el objetivo de X 100 el P. falciparum u otros (figs. 24-7 y 24-8;
v. fig. 24-6).
Observaciones: para el diagnóstico directo del paludismo, es estrictamente necesario
el frotis sanguíneo, ya que la gota gruesa sirve para identificar la presencia del parásito,
pero nunca se puede identificar la especie, pues no hay presencia de hematíes. Los as
pectos que hay que tener en cuenta para identificar la especie de plasmodio a partir de
un frotis de sangre son los siguientes:
• Tamaño del hematíe parasitado.
• Granulación del citoplasma del hematíe parasitado.
• N úmero de plasmodios por hematíe.
• Puntos de cromatina de los trofozoítos.
• Forma de trofozoíto joven y maduro.
• Formas intermedias o esquizontes.
• Estructura del gametocito.
FIGU RA 24-8. Esquizonte de

P. Vivax.
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Concentración de m icrofilarias
Principio
Se trata de realizar u na concentración de sangre venosa y hemolizarla. Se añade una
solución de saponina al 2% para mantener vivas las microfilarias y se observa todo el
sedimento en el microscopio con el objetivo de X 10. Una vez localizadas las filarias, se
deja secar todo el sedimento y se fija con la tinción de hematoxilina.
Material
• Tubo de 10 mi para centrífuga.
• Solución de cloruro sódico al 5%.
• Anticoagulante EDTA.
• Solución de saponina al 2%.
• Hematoxilina de Mayer.
• Centrífuga.
• Portaobjetos.
Método
1. Se añaden dos gotas de anticoagulante EDTA en un tubo de centrífuga.
2. Se extraen 3 mi de sangre venosa y se introducen en el tubo.
3. Se añaden 7 mi de cloruro sódico al 5% y se mezclan suavemente.
4. Se añaden unas gotas de solución de saponina al 2% y se mezclan bien hasta que
la sangre queda hemolizada.
5. Se centrifuga 10 m in a 1.500 r.p.m.
6. Se desecha el sobrenadante.
7. Se deposita el sedimento en un porta y se observa con el objetivo de X 10.
Observación al microscopio X10

Se observa todo el sedimento buscando formas móviles. Para ello se deben utilizar varios
portaobjetos si es preciso, pero hay que investigar todo el sedimento de la concentración.

Se cuentan todas las microfilarias encontradas y se da el resultado del total dividido por
los mililitros de sangre extraídos:
Número de microfilarias /mililitros de sangre venosa
Para el diagnóstico se observa la tinción de las microfilarias con hematoxilina, para

identificar la estructura de los extremos del parásito.
Tinción con hematoxilina

1. Se deja secar el sedimento con las microfilarias.
2. Se fija con metanol durante 3 min.
3. Se decantan.
4. Se cubre con hematoxilina de Mayer durante 10 min, calentando el colorante
hasta la emisión de vapores.
5. Se sumerge la preparación en un recipiente con agua alcalinizada (bicarbonatada)
durante unos segundos.
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M 0 f j c r
w JV T í a
A B
FIGU RA 24-9. A. Especies de Borrelia. B. Microfilaria Loa loa.
6. Se sumerge la preparación en un recipiente con agua normal y se deja al aire.

7. Se observa con el objetivo de X 10, X40 o X 100 para identificar la especie (figs. 24-9
y 24-10).
Observaciones: Cuando se investigan las microfilarias, hay que tener en cuenta la
periodicidad de la filaria sospechada. La extracción sanguínea debe realizarse según
la filaria sea diurna (extracción de sangre entre las 11-16 h) o nocturna (extracción de
sangre entre las 23-1 h).
Técnica capilar del QBC® (Q uantitative Buffy Coat)

Esta técnica se utiliza para el diagnóstico de hemoparásitos, y es muy rentable para la
identificación de paludismo.
Principio
El colorante de naranja de acridina tiene la propiedad de fijarse al material nuclear de
la célula (ADN, ARN).
Con la ayuda de un flotador (cilindro de cristal), de densidad parecida a la capa de
plaquetas y leucocitos, se separan los hematíes parasitados al centrifugar a 12.000 r.p.m.
.if** •
FIGU RA 24-10. Microfilarias:

Loa loa y Mansonella perstans.
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FIGU RA 24-11. Plasmodium

falciparum (método QBC).
Con la ayuda de una luz ultravioleta, la fijación nuclear aparece de color verde fluores
cente. En la observación, identificaremos los leucocitos y en esta misma zona localizare
mos los núcleos de los parásitos (fig. 24-11).
Material
• Kit especial QBC.
• Capilares con el reactivo y el anticoagulante en su interior.
• Accesorios para el montaje de la técnica: flotador, tapón soporte.
• Centrífuga especial para capilares a 12.000 r.p.m.
• Fibra óptica de la fuente de luz ultravioleta que se acopla a un objetivo de X60.
Método
1. Se llena el capilar de sangre por el extremo del anticoagulante, hasta la medida
señalada.
2. Se homogeneiza bien la sangre con el reactivo (naranja de acridina).
3. Se coloca el tapón del kit en un extremo y p or el otro se introduce el flotador
(cilindro de cristal).
4. Se centrifuga a 12.000 r.p.m. durante 5 min.
5. Los hematíes parasitados se situarán muy cerca de la capa de los leucocitos, de
esta manera se pueden localizar.
Ventajas: rapidez. En 10 min se puede localizar el parásito.
Inconvenientes: coste de diagnóstico elevado y accesorios específicos para la técnica
(microscopio, sonda de ultravioleta, centrífuga, etc.).
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Capítulo 2 4 Identificación de hemoparásitos en sangre periférica 7 5 7 .e l
Autoevaluación
1. ¿Qué afirmación no es correcta respecto a la enfermedad de loiasis?
(a) Se denomina también hinchazón de Calabar.
(b) La filaria adulta se puede visualizar en el ojo humano, cuando se desplaza.
(c) Se puede visualizar en gota gruesa.
(d) Tiene vaina.
(e) Es de periodicidad nocturna.
Respuesta razonada: la microfilaria Loa loa aparece en la sangre periférica cuando se realiza la
extracción cerca del mediodía. Esto se atribuye al ciclo vital de su vector, la mosca Chrysops, que
es diurna y se alimenta a las horas de sol.
2. ¿Qué diferencia importante hay entre Tripanosoma cruzi y Tripanosoma brucei7 .
(a) Solo T. brucei se encuentra en el LCR.
(b) La procedencia del paciente.
(c) La estructura del parásito.
(d) Solo T. cruzi se puede teñir con Giemsa.
(e) Solo T. cruzi se puede localizar en la sangre periférica.
Respuesta razonada: Tripanosoma brucei solo se puede localizar en África. Tripanosoma cruzi
solo se puede encontrar en América Central. Morfológicamente son casi iguales. Es importante
saber de dónde procede el paciente.
3. Cuando en la gota gruesa vemos gametocitos después del tratamiento, ¿qué pensamos?
(a) Es normal. No debemos hacer nada.
(b) Pensamos en resistencia al tratamiento.
(c) No puede ser normal.
(d) Nunca se pueden ver gametos después de un tratamiento.
(e) C y D son ciertas.
Respuesta razonada: los gametocitos circulan por la sangre, pero no son infectivos para el hombre.
Pueden permanecer hasta 6 semanas. Durante este período sí que son infectivos para el mosquito.
Si no los ingiere, desaparecen espontáneamente de la sangre.
4. ¿Por qué se utiliza la saponina en la técnica de investigación de microfilarias en sangre?
(a) Porque es un reactivo m uy económico.
(b) Porque mata a las microfilarias y podemos realizar el contaje.
(c) Porque las mantiene en m ovimiento y se puede realizar el contaje.
(d) No es aconsejable su utilización en esta técnica.
(e) Nunca se debe utilizar la saponina en la investigación de microfilarias.
Respuesta razonada: la saponina al 2% es un jabón, que se añade a la cantidad de sangre extraída
(3 cm3). Tiene dos funciones: a) hemolizar los hematíes conservando solo los leucocitos y m i
crofilarias, y b) m antener vivas y en completo m ovimiento las microfilarias. Por este m otivo es
m ucho más fácil su contaje total.
5. ¿Qué quiere decir «hemoparásito»?
(a) Parásito que circula y se desarrolla en la sangre.
(b) Parásito que se alimenta de sangre mediante una picadura.
(c) Parásito que nunca puede ser transm itido por la sangre.
(d) Parásito saprófito en anemias ferropénicas.
(e) Parásito que puede aparecer en personas inmunodeficientes.
Respuesta razonada: los hemoparásitos solo pueden reproducirse y realizar su ciclo cuando
se encuentran dentro de la circulación sanguínea. No son vectores ni saprófitos. Necesitan la
sangre para su ciclo vital.
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6. Cuando en una extensión sanguínea encontramos un trofozoíto de Plasmodium con dos

núcleos de cromatina, ¿qué diagnóstico nos confirma?
(a) Todos los plasmodios tienen dos núcleos de cromatina.
(b) No nos confirma ningún diagnóstico.
(c) Confirmamos que es un trofozoíto de Plasmodiumfalciparum.
(d) Confirmamos que es un trofozoíto de Plasmodium malariae.
(e) Las respuesta a y b son ciertas.
Respuesta razonada: cuando vemos plasmodios con dos núcleos de crom atina podemos con
firmar que se trata de Plasmodiumfalciparum, ya que las otras especies de plasmodio no tienen
nunca (o m uy raramente, en el caso de P. vivax) dos núcleos de cromatina.
7. ¿Qué dos sustancias utilizamos para teñir los parásitos de malaria en una gota gruesa?
(a) Alcohol y Giemsa.
(b) Agua y eosina.
(c) Formol y Giemsa.
(d) Agua y Giemsa.
(e) Eosina y Giemsa.
Respuesta razonada: para teñir los parásitos en una GG solo hemos de diluir la Giemsa al 2%.
Así podem os provocar la hemólisis de los hematíes. Es esta la razón de que solo se vean los
leucocitos y los parásitos teñidos.
8. Cuando sospechamos una malaria, ¿cuál es el momento idóneo para tomar una muestra de sangre?
(a) Al tercer día de la fiebre.
(b) Cuando la fiebre descienda.
(c) En el m omento de la aguja de fiebre.
(d) Siempre que tenga clínica y que reúna todos los requisitos.
(e) Las respuestas c y d son ciertas.
Respuesta razonada: cuando hay una aguja de fiebre es cuando se encuentran más parásitos en
la circulación sanguínea. Pero si hay sospecha de malaria y se cumplen los requisitos (tiempo de
incubación, zona geográfica, clínica, etc.) debe realizarse siempre. Aunque hemos de saber que un
resultado de GG negativa no quiere decir que en otro momento no tenga más parásitos circulando.
9. ¿Podemos encontrar una microfilaria de Loa loa en un pellizco de piel, cuando estamos bus
cando Onchocerca?
(a) No, nunca pueden aparecer estas dos especies juntas.
(b) Es norm al que cuando se realice este pellizco de piel, siempre puede aparecer Loa loa.
(c) Depende de la procedencia del paciente.
(d) Depende de cómo realizamos el pellizco.
(e) Las respuestas c y d son ciertas.
Respuesta razonada: pueden aparecer cuando se cum plen dos requisitos: a) que el paciente
proceda de una zona endémica de las dos especies y esté infectado de las dos, y b) que el pellizco
se contamine con sangre en el m omento de su realización. Para que esto no pase, el pellizco debe
ser específicamente subcutáneo.
10. Cuando en una extensión sanguínea encontramos un trofozoíto de plasmodio con un núcleo
de crom atina plano y un anillo en form a de banda que ocupa casi todo el hematíe, ¿qué
diagnóstico nos confirma?
(a) No podemos confirmar ningún diagnóstico.
(b) Confirmamos que es un trofozoíto de Plasmodiumfalciparum.
(c) Confirmamos que es un trofozoíto de Plasmodium vivax.
(d) Confirmamos que es un trofozoíto de Plasmodium malariae.
(e) Confirmamos que es un trofozoíto de Plasmodium ovale.
Respuesta razonada: la forma de un trofozoíto amplio parecido a una banda que atraviesa todo
el hematíe es característico del Plasmodium malariae.
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C A P Í T U L O 25
La calidad en el laboratorio de hematología

J. M iró y J. L. Vives Corrons
INTRODUCCIÓN
El laboratorio de hematología tiene como objetivo principal realizar observaciones
y mediciones (cualitativas, cuantitativas o estructurales) de componentes o sistemas
relacionados con la sangre y órganos hematopoyéticos con finalidad diagnóstica, pre
ventiva o terapéutica. Las enfermedades de la sangre, debidas a alteraciones del sistema
hematopoyético o de la hemostasia, son comparativamente m ucho menos frecuentes
que las alteraciones que pueden observarse en un elevado núm ero de situaciones
patológicas del organismo. Así, por ejemplo, las anemias, tan frecuentes en la práctica
clínica, son la mayoría de las veces expresión de enfermedades diversas, generalmente no
hematológicas, e igual sucede con muchas de las alteraciones cuantitativas o cualitativas
de leucocitos y plaquetas circulantes. El estudio de estas alteraciones sanguíneas cons
tituye una fuente inagotable de conocimientos para el hematólogo ya que, sobre la base
de su formación clínica, puede profundizar en la fisiopatología de las mismas y con
tribuir a su prevención, diagnóstico y tratamiento. Por ello, la práctica del laboratorio
de hematología exige, además de conocimientos clínicos y de gestión, conocimientos
morfológicos y muchos otros comunes a las ciencias básicas y de laboratorio clínico
en general.
Desde un punto de vista funcional o de conjunto, el laboratorio de hematología
constituye una unidad asistencial, muchas veces estrechamente unida al laboratorio
general, que presta un servicio fundamental a pacientes, médicos en general, instituciones
sanitarias y empresas aseguradoras. Por ello, es esencial que se cumplan tres requisitos:
1. Calidad en la realización de los procedimientos.
2. Credibilidad (o fiabilidad) de los resultados.
3. Claridad en la presentación de los informes.
Uno de los aspectos que más ha cambiado la sistemática de trabajo del laboratorio
clínico en general, y el de hematología, en particular, ha sido la automatización que,
para algunas técnicas o procedimientos, es prácticamente total. Ello ha comportado
un im portante cambio en la gestión de los recursos prom ovido por un significativo
aumento en la rapidez y fiabilidad de los resultados y una m enor dotación de recursos
humanos. Este aum ento de eficiencia, inherente a la automatización, ha comportado
una disminución de los costes pero, en contrapartida y como consecuencia de la unifi
cación de los recursos, el laboratorio de hematología ha perdido parte de su actividad
en aquellos exámenes más corrientes, como, p or ejemplo, la hem atim etría (o sea, el
estudio básico de las células sanguíneas), que en m uchos centros se ha integrado en
el laboratorio general. No obstante, buscando siempre el lado positivo del problema,
la autom atización ha obligado tam bién a la im plantación de rigurosos sistemas de
control que garantizan el correcto funcionamiento de todas las fases que constituyen
la actividad del laboratorio clínico: preanalítica, analítica y postanalítica. Los sistemas

ERRNVPHGLFRVRUJ
Capítulo 25 La calidad en e l laboratorio de hematología 759
cualitológicos* requieren además la form ación continuada del personal técnico y

facultativo para asegurar una perm anente actualización de los conocim ientos que
permitan una correcta interpretación de los resultados y un adecuado asesoramiento
a usuarios y clientes.
La mejora continuada de la calidad va dirigida a alcanzar la idoneidad del resultado
analítico a través de una revisión continua de los procedimientos, la corrección de los
problemas cuando se detectan (acciones correctivas) así como la prevención de posi
bles problemas (acciones preventivas). Los sistemas cualitológicos se implantan a partir de
unas norm as cualitológicas, y la apuesta por la calidad implica una organización es
tructurada y sensibilizada respecto a esta, con una secuencia de decisiones y acciones
basadas en una política cualitológica definida por el laboratorio y en la documentación
de todas las actividades del laboratorio, para así poder demostrar las acciones realizadas.
Dada la complejidad, el coste y la sobrecarga de trabajo que supone la implantación de
un sistema cualitológico, es conveniente una implantación gradual, para que todos los
trabajadores estén sensibilizados y puedan adquirir un adecuado conocimiento del nuevo
sistema. Para ello se considera adecuado seguir el ciclo de Deming: planificar, ejecutar,
verificar y corregir. El responsable de la garantía de la calidad debe ser un profesional con
una formación adecuada para gestionar, establecer e implantar el sistema de gestión de
la calidad. Por ello es necesario que: 1) conozca todos los aspectos técnicos y de gestión
de un laboratorio clínico; 2) contribuya a elaborar la documentación necesaria, y 3) es
tablezca una sistemática de registro adecuada. Cuando estos documentos, diseñados
con un formato normalizado y fácil de interpretar, son seguidos punto por punto por
el personal técnico, permiten que se implante un control continuado de la calidad con
acciones correctoras y preventivas que den lugar a una revisión y actualización constante
de los documentos, y el laboratorio estará en condiciones de ser auditado y conseguir
un reconocimiento formal a través de una certificación o una acreditación de que su
actividad se realiza cumpliendo los requisitos de la norma.
Las actividades de un laboratorio pueden clasificarse en dos bloques: actividades
técnicas, que incluyen tres fases (preanalítica, analítica y postanalítica) y actividades de
gestión. Hoy en día, se observa que es en la etapa analítica donde se producen menos
errores. La m ayor proporción se produce en la fase preanalítica. Las causas de es
tos errores surgen fundamentalmente en la toma de los datos personales de los pacientes
y en la obtención de muestras (v. capítulo 1). Los errores postanalíticos se deben a la
entrada errónea de datos y a la demora en la entrega de resultados, entre otros. La falta
de comunicación entre analistas y clínicos suele originar errores de interpretación que
representan uno de los motivos más notables de deficiencias en la calidad. Es importante
que la fase analítica experimente una mejora continua, adaptando los procedimientos a
los nuevos métodos e instrumental, pero es necesario reducir los de las fases preanalítica
y postanalítica.
Desde hace años, los laboratorios clínicos están realizando un esfuerzo notable para
mejorar la instrumentación y la utilización de métodos validados y controlados. En la
actualidad, la atención sanitaria se lleva a cabo de modo que los pacientes son tratados
en diferentes centros sanitarios. Esta situación trae consigo la intervención de muchos
profesionales. El «corazón de la gestión» lo constituyen el diagnóstico y la terapia, donde
los laboratorios clínicos juegan un papel muy importante. Es preciso lograr un adecuado
nivel de calidad para que los ciudadanos perciban que la atención sanitaria ofrecida en
* El adjetivo cualitológico/a puede utilizarse p ara indicar la p ertinencia al área d e conocim iento que tra ta d e aspectos
relacionados con la gestión de la calidad.
ERRNVPHGLFRVRUJ
su país es similar a la de otros. La política en común ha dado lugar a la Confederación

de Química Clínica de la Unión Europea (EC4) que está formada por un conjunto de
sociedades de química clínica y de laboratorios clínicos de países miembros de la UE.
Sus actividades se centran en el reconocimiento de la equivalencia entre los laboratorios,
intentando armonizar la formación de especialistas, las normas de gestión de la calidad y
la calibración instrumental. Finalmente, en los últimos 20 años se ha observado también
un creciente interés por obtener un reconocimiento externo que avale la calidad del
servicio ofrecido mediante una certificación o una acreditación que estandarice la forma
de trabajar de los laboratorios.
GESTIÓN DE LA CALIDAD
Reseña histórica
La necesidad de m ejorar las prestaciones de los laboratorios clínicos se ha ido cons
tatando al compás de los avances tecnológicos y de la evolución del concepto de calidad
en los países desarrollados. El laboratorio clínico ha ido sustituyendo métodos manuales,
generalmente complejos y laboriosos, por otros total o parcialmente automatizados e
incluso robotizados. En la mayoría de los casos, equipos conectados a redes informáticas
permiten concentrar todos los datos obtenidos de los análisis en el sistema informático
del laboratorio y agilizar el trabajo más rutinario.
Por otro lado, el término calidad ha adquirido nuevas acepciones. Se puede considerar
como calidad todas aquellas actividades que se realizan con el objetivo de asegurar unas
técnicas de laboratorio correctas, tanto en lo que se refiere a calibración como estabilidad
de procedimientos y reactivos, y unos resultados fiables. El concepto calidad también se
emplea para todos aquellos sistemas que garantizan una correcta prestación de servicios
y satisfacción del cliente (sistemas de gestión de la calidad).
El control interno de la calidad (CIC) es una práctica habitual en el laboratorio que
se realiza desde hace m uchos años. Los métodos utilizados se han ido depurando y
mejorando; de entre todos ellos destaca la utilización de las gráficas de control de Levy-
Jennings, introducidas en 1950 (www.qualityamerica.com). Estas gráficas permiten
evaluar y realizar el seguimiento diario y perm anente de fiabilidad de los resultados.
Otros métodos empleados para el CIC son las reglas de Shewhart (www.asq.org) y el
m étodo CUSUM (ca.wikipedia.org/wiki/CUSUM ). No obstante, la utilización ex
clusiva del CIC no es suficiente para garantizar la calidad total, p or lo que es necesaria
también la comparación de resultados entre laboratorios diferentes. Fue en EE. UU.
donde, conscientes de las graves repercusiones que puede tener un diagnóstico erróneo,
se inició el diseño de los primeros programas para la evaluación externa de la calidad
(EEC). Tales programas demostraron que existían diferencias, a veces muy significativas,
entre los resultados obtenidos en distintos laboratorios pese a utilizar correctamente
sistemas de CIC.
Un programa para la evaluación externa de la calidad (PEEC) consiste esencialmente
en comparar, mediante técnicas estadísticas, los resultados obtenidos por un grupo de
laboratorios que analizan diversos componentes de un material de control.
Para poder garantizar que los análisis realizados por un laboratorio tienen una es
tabilidad a lo largo del tiempo, junto al empleo de equipos bien calibrados y reactivos
garantizados es necesaria la descripción de los procesos efectuados con el importante
detalle de la sistemática a seguir para realizar las técnicas o procedimientos. La des
cripción debe ser lo suficientemente clara y sistemática como para que el protocolo
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pueda ser utilizado p o r diferentes profesionales sin dificultades y debe existir uno para
cada una de las actividades que se realizan en el laboratorio clínico.
En los últimos 10 o 15 años, junto al CIC y los PEEC, se ha hecho necesaria la intro
ducción de otros indicadores cualitológicos, ya que se comprueba que los requerimientos
de los usuarios van más allá del simple control de la fase analítica. Así, de acuerdo con la
Organización Internacional de Normalización (ISO), un sistema cualitológico permite
definir la «aptitud de un producto, proceso, sistema, servicio o persona para satisfacer las
necesidades explícitas o implícitas de un paciente». Las normas ISO obligan, por tanto, a
que cada laboratorio elabore un catálogo de prestaciones o servicios donde se indiquen
las propiedades que analiza, los métodos y las unidades que emplea para ello y el plazo
de entrega de los resultados. Esto significa que el laboratorio clínico debe asegurar la
calidad de cada una de las etapas o fases que conforman su actividad:
1. Preanalítica (recepción y datos del paciente, obtención de muestras, preparación
para la realización de pruebas, transporte de muestras).
2. Analítica (realización de los análisis).
3. Postanalítica (validación de los resultados y entrega del informe).
En este contexto, un laboratorio de hematología, como unidad asistencial inde
pendiente o formando parte de un servicio integrado de laboratorio clínico (conocido
actualmente como laboratorio «Core»), es el único responsable de garantizar el co
rrecto funcionamiento de su cadena de producción y suministros. Ello quiere decir que
todos los procesos incluidos en esta cadena han de ser gestionados de forma integrada
teniendo siempre presente sus interacciones. Por todo ello, un sistema cualitológico en
el laboratorio de hematología no solo ha de procurar la obtención de resultados fiables,
sino también que todos los procesos que se inician en la preparación del paciente para
la extracción de sangre y terminan en la entrega del resultado se realicen correctamente,
en el m enor tiempo posible y a un coste razonable. Así, un laboratorio de hematología
moderno ha de poder «obtener resultados fiables en el tiempo adecuado, a partir de la
muestra correcta (que pertenezca al paciente cuya analítica se solicita) y a u n precio
razonable». Debido a esto, la implantación de un sistema cualitológico en el laboratorio
de hematología supone muchas ventajas, entre las que destacan las siguientes:
• Proporcionar una respuesta satisfactoria a las necesidades de la clínica.
• Dar cobertura legal a la actividad que se realiza.
• Infundir seguridad al personal que trabaja en el laboratorio y disminuir las posibili
dades de error humano.
• Optimizar los recursos existentes.
• Reducir los costes debidos a posibles errores.
• Avanzar en el conocimiento de los procedimientos de normalización para una mayor
transferibilidad de los resultados y el empleo de las mejores metodologías.
Principios generales
La calidad en el laboratorio clínico no ha dejado nunca de ser un objetivo importante,
pero en la actualidad goza de un interés inusitado, muy probablemente debido a una
mayor exigencia de calidad p o r parte de los usuarios y a la necesidad de equiparar e
igualar el trabajo realizado por los laboratorios pertenecientes a los estados miembros de
la Unión Europea (UE) que facilite la libre circulación y el intercambio de profesionales
entre ellos.
Los sistemas cualitológicos son el medio para garantizar que tanto el proceso pro
ductivo (fase analítica) como el de servicio (fases preanalítica y postanalítica) cumplan
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con el objetivo fundamental de obtener resultados fiables y dar satisfacción a los clientes.
Por tanto, todo laboratorio clínico debe tener como objetivo fundamental ofrecer un
servicio de calidad al cliente a precios competitivos y con los mínimos costes. Teniendo
en cuenta los requisitos legales y formativos aplicables al laboratorio clínico, el desarrollo
y la implantación de un sistema cualitológico exige que cada laboratorio clínico defina
y aporte los recursos necesarios para su gestión, considerando como tal los principios
básicos de la gestión cualitológica:
• O rie n ta c ió n al cliente. El laboratorio clínico depende de sus clientes (médicos
solicitantes, pacientes, otros laboratorios, mutuas, etc.) y, por lo tanto, debe conocer las
necesidades actuales y futuras de estos, y tener la capacidad de satisfacer sus requisitos
y expectativas.
• Liderazgo. Según el tamaño del laboratorio, habrá una o más personas con la res
ponsabilidad de liderazgo, las cuales habrán de crear y mantener un ambiente interno
adecuado y saber implicar al personal para alcanzar los objetivos del laboratorio
clínico.
• Participación del personal. El personal constituye la esencia del laboratorio clínico,
por lo que el uso y la aplicación de sus conocimientos y habilidades al trabajo del
laboratorio harán posible alcanzar los objetivos de la organización.
• Enfoque en los procesos. Un proceso es cualquier actividad que transform a una
entrada (actividad, material o información) en un producto (otra actividad, otro
material o información). La orientación hacia los procesos significa considerar las
actividades y los recursos relacionados como procesos.
• G estión b asada en procesos. El laboratorio clínico ha de identificar los procesos
que están interrelacionados y considerarlos como un sistema que funciona de forma
global.
• M ejora continua. La mejora continua es un proceso que tiene el objetivo principal
de mejorar la calidad de los productos de laboratorio clínico; se basa en el incremento
de la eficacia y la eficiencia.
• Toma de decisiones basada en datos. Las decisiones que se tomen en el laboratorio
clínico han de basarse previamente en el análisis de datos y la información.
• Relaciones de beneficio m u tu o con los proveedores. Las relaciones con los provee
dores de los laboratorios (laboratorios subcontratistas, etc.) han de ser beneficiosas
para ambos.
GARANTÍA DE LA CALIDAD
Conceptos básicos
La garantía de la calidad es el conjunto de procesos implantados por una organización
para alcanzar los objetivos cualitológicos. En el laboratorio clínico tiene como objetivo
final garantizar la fiabilidad (exactitud y precisión) de las medidas que se realizan en
el laboratorio e incide sobre todos y cada uno de los procesos que se desarrollan en el
mismo, de forma que la relevancia clínica del resultado, es decir, su contribución al
diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad quede siempre garantizada.
Para ello debe disponerse de todos los medios adecuados para reconocer posibles errores
y aplicar, en su caso, las medidas correctoras necesarias. La garantía de la calidad abarca
las tres fases del laboratorio clínico: preanalítica, analítica y postanalítica, que incluyen
todos los procesos desde antes de la extracción de sangre hasta después de la entrega del
resultado (cuadro 25-1).
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CUADRO 25-1. Procesos q ue se incluyen en u n p ro g ra m a d e g a ra n tía d e calidad

del lab o ra to rio hem atológico
P ro c eso s p re a n a lític o s
• Solicitud de los exám enes analíticos
• Extracción y recogida de los especímenes
• Registro e identificación
• T ransporte de los especímenes
• Preparación preanalítica de los especímenes
P ro c eso s a n a lític o s
• M antenim iento preventivo de in stru m en to s y equipos
• Em pleo de sum inistros de buena calidad
• M antenim iento de la fiabilidad (exactitud y precisión de los m étodos analíticos)
• C ontrol interno de calidad
• Participación en program as de evaluación externa de la calidad
• Em pleo de sistemas de detección de errores
• Aplicación de m edidas correctoras
• Desarrollo de p rogram as de form ación continuada del personal de laboratorio
• M antenim iento estricto de los p rotocolos norm alizados de trabajo
• Elaboración y actualización del m anual de procedim ientos
P ro c eso s p o s ta n a lític o s
• Validación de los resultados
• Transcripción de los datos analíticos
• Elaboración y em isión de los inform es
• Archivo de los resultados e inform es
• C ontrol del proceso inform ático
La fase preanalítica se refiere a todos los procesos previos a la medición. Esta fase in
cluye la solicitud de las pruebas, la preparación del paciente, la obtención de las muestras,
la identificación de los especímenes y el transporte al laboratorio. El tiempo de llegada
de la muestra al laboratorio es de gran importancia, ya que de este depende el tiempo
de entrega de los resultados. Por ello, debe controlarse de forma estricta indicando en el
tubo, en caso necesario, la rapidez con que debe llegar al laboratorio.
La fase analítica se refiere al proceso de observación o medición. Para la realización
de un examen hematológico básico mediante analizador automatizado, esta fase incluye
la calibración y el control diario del equipo, así como la realización de la medición
propiamente dicha. La garantía de la calidad implica siempre el empleo de materiales
de control apropiados, propios o comerciales (calibradores y controles), la vigilancia de
los reactivos y el m antenimiento de materiales e instrumentos.
La fase postanalítica se refiere a los procesos que tienen lugar una vez obtenidos los
resultados e incluye, básicamente, una correcta revisión y distribución de los mismos. Los
procesos propios de esta fase son la validación de los resultados, la emisión del informe, su
entrega y el archivo de la copia correspondiente. La validación de los resultados consiste
en comprobar si estos son conformes entre sí o con la clínica del paciente, y de ella pueden
derivarse comprobaciones o repeticiones de pruebas y sugerencias para la realización de
nuevos análisis que contribuyan a completar el diagnóstico. La revisión de los resultados
incluye la validación del informe, comprobando que no existan errores de trascripción
y procurando que la forma de expresarlos sea clara e inteligible.
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Estos procesos varían según las características de cada laboratorio: tamaño, nivel de
especialización, grado de automatización, características de los métodos que emplean
y el volumen asistencial, entre otras. Su control supone, necesariamente, la puesta en
marcha de sistemas que permitan verificar la bondad o rectitud con que se realizan todas
y cada una de las etapas que constituyen la actividad del laboratorio clínico.
La medición de los resultados de las magnitudes bioquímicas está sujeta a dos fuentes
de error: error sistemático y error aleatorio. El error sistemático es el que depende de la
inexactitud del procedimiento y puede estar ocasionado por defectos en la calibración,
en el pipeteo de los reactivos o las muestras, en los tiempos de incubación y en la lectura
de las señales medidas (absorbancia, impedancia, etc.), entre otras causas. Si se conoce
la cuantía de este error puede aplicarse una corrección a los resultados de manera que
quede anulado.
El error aleatorio está originado por las fluctuaciones que tienen su origen en la ines
tabilidad de los dispositivos de lectura de las mediciones, la conservación de los reactivos,
las contaminaciones, la estabilidad de la temperatura, etc. Debido a su naturaleza, este
tipo de error no puede corregirse y solo pueden adoptarse medidas preventivas para
intentar disminuirlo.
C ontrol interno de la calidad

El control de la calidad se basa principalmente en el análisis repetido de materiales de
control que mimetizan a los especímenes biológicos, pero con una estabilidad mucho
mayor. De los resultados obtenidos con estos materiales dependerá la aceptación o
no de los resultados que se obtengan con los sueros de los pacientes. También existen
procedimientos para el control de reactivos, materiales de control, material volumétrico,
equipos e instrumentos de uso general que determinan su validez.
Control de reactivos y materiales analíticos

Los reactivos son uno de los suministros de laboratorio más importantes, ya que pueden
afectar directamente la calidad de los análisis. Su selección, modo de empleo y mante
nimiento (caducidad, conservación y sistema de almacenamiento) son, por tanto, una
parte vital de un buen programa de control de la calidad interno.
En el análisis de las células sanguíneas tiene especial importancia controlar la caduci
dad de las soluciones amortiguadoras y de los reactivos empleados en la determinación
de la concentración de hemoglobina mediante el método de referencia (cianometahemo
globina). Asimismo, deberían controlarse periódicamente la calidad y las características
de los reactivos empleados en el funcionamiento de los analizadores automatizados,
especialmente en lo que se refiere a la medida de la concentración de células sanguíneas
(recuentos celulares) y el volumen celular (pH y osmolaridad de líquidos diluyentes,
principalmente).
O tro aspecto que hay que tener en cuenta es el control de los materiales empleados
para la calibración de los analizadores o los materiales usados para el control de la calidad
interna de diversos procedimientos analíticos. Para su uso en hematología existen patro
nes primarios para diferentes componentes de la sangre cuya producción es muy limitada
y que, en general, solo se suministran a centros acreditados (individuos u organizaciones
relacionadas con la estandarización y el control de la calidad). El patrón prim ario (de
referencia internacional) por excelencia en hematología es la solución certificada de
cianometahemoglobina (HiCN) calibrada a una concentración entre 550 y 850 mg/1
de hemoglobina. Los patrones secundarios elaborados a partir del patrón prim ario se
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utilizan para verificar la exactitud de la medida de la concentración de hemoglobina en

sangre y, eventualmente, también para calibrar los instrumentos de medida basados en
la espectrometría de absorción molecular (fotometría).
Control del material volumétrico

Todo el instrum ental dedicado a la transferencia de líquidos debe estar calibrado en
función de la exactitud y precisión requeridas. Aunque actualm ente la mayoría de
procesos están automatizados, ocasionalmente puede ser conveniente efectuar algún pro
ceso de dilución. Normalmente se utilizan pipetas automáticas con puntas de material
desechable. El laboratorio debe tener constancia docum ental de su m antenim iento
periódico y de la verificación del cum plim iento de sus características metrológicas.
El material de vidrio debe estar provisto del correspondiente certificado por parte del
fabricante. Además, debe disponerse de los procedim ientos docum entados sobre la
correcta limpieza del mismo.
Control de los instrumentos y equipos

Los instrumentos existentes en un laboratorio son los de tipo auxiliar o complementario
(neveras, congeladores, baños de agua, centrífugas, medidores del pH y microscopios,
entre otros) y los analizadores automatizados, que se emplean para medir las magnitudes
de la sangre. Las neveras y los congeladores deben tener un sistema de alarma que ponga
de manifiesto cualquier desviación del margen de temperaturas permitido. Cuando la
nevera o congelador tiene como función el almacenamiento de derivados sanguíneos para
ser transfundidos, debe disponer de un sistema de registro continuo de las temperaturas.
Los termómetros que miden la temperatura de estos instrumentos deben estar calibrados
respecto a un termómetro de referencia.
Cada día debe limpiarse cuidadosamente el interior de las centrífugas y, periódica
mente, controlar la velocidad rotacional y la exactitud del temporizados Si la centrífuga es
refrigerada, debe controlarse también que la temperatura no varíe de los valores exigidos.
Los m icroscopios, p o r tratarse de in stru m en to s dotados de num erosas lentes
en contacto directo con el exterior, deben estar sometidos a un m antenim iento ex
trem adam ente cuidadoso y por una persona experta. Los oculares, objetivos y otros
elementos ópticos deben limpiarse diariam ente después de su uso, mediante papel
m uy fino o tela de algodón m uy lim pia y seca. Resulta m uy recomendable hacer la
limpieza de los restos de aceite en los objetivos de inmersión mediante un papel m uy
fino humedecido con una mezcla de alcohol y éter etílico en la proporción 2/1. Cuando
el microscopio no se utiliza, debe cubrirse convenientemente para evitar el depósito de
polvo (especialmente en sus sistemas mecánicos), el cual al mezclarse con la grasa que
lubrican los engranajes del estativo, la platina y el carro puede entorpecer el manejo
de estos componentes.
En la actualidad, la medición de las magnitudes hematológicas de sangre total, rela
cionadas de forma prácticamente exclusiva con las células sanguíneas, se realiza mediante
analizadores automáticos o semiautomáticos. Dichos instrumentos de medición tienen
que cumplir con los requisitos especificados por el fabricante y deben adaptarse a las
necesidades de cada laboratorio. Además, se les debe aplicar un riguroso protocolo
de mantenimiento preventivo convenientemente registrado. La calibración de dichos
sistemas debe ser revisada periódicamente según las especificaciones del fabricante,
adaptadas en cada laboratorio y revisadas cuando los controles internos se desvíen del
rango de tolerancia (v. capítulo 5).
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Control de los resultados

El control de los resultados se efectúa incluyendo en cada serie analítica uno o más
m ateriales de control. El resultado del análisis de estas m uestras de control sirve
para adoptar la decisión de aceptar o no los resultados en función de unos criterios
previamente establecidos p o r el laboratorio. Debe tenerse en cuenta que dichos m a
teriales pueden comportarse de m anera distinta a los especímenes de los pacientes, y,
asimismo, que su coste suele ser elevado. Un m étodo alternativo consiste en el análisis
repetido de una o más muestras de sangre procedentes de pacientes, analizada en la
serie anterior y conservada a 2-6 °C. La diferencia entre los resultados de las dos series
debe mantenerse dentro de unos límites fijados anteriorm ente para asumir que el sis
tem a está bajo control.
Para valorar el error sistemático, especialmente de los índices eritrocitarios, puede
utilizarse la media de resultados de pacientes. Así, la valoración de los resultados diarios
obtenidos mediante materiales de control puede realizarse de acuerdo con dos proce
dimientos diferentes: a) elaboración de una gráfica control, y b) método de las sumas
acumulativas (CUSUM).
Gráfica de Levy-Jennings
Este procedimiento exige, en prim er lugar, el establecimiento de los intervalos. Para ello,
el material debe analizarse en un m ínimo de 20 series consecutivas, determinándose el
valor de x y DE para cada magnitud. Con estos valores se elabora una gráfica control en
la que en el eje de ordenadas figuran los valores obtenidos y en el de abscisas, la crono
grafía de serie en que se han analizado. El valor de x es la línea de base alrededor de
la cual deben distribuirse los distintos puntos. Cuando un valor se sale del intervalo
definido por x ± 3 DE o dos valores, seguidos o simultáneos dentro de la misma serie, del
intervalo x ± 2 D E , los resultados de esta serie deberían revisarse ya que podrían darse
desajustes considerables (fig. 25-1).
Línea
“ de base
Tiempo
FIGU RA 25-1. Gráfica control que ilustra las variaciones que puede sufrir la medida de una determinada
magnitud en función del tiempo. A. Situación correcta. B. Un valor se halla por fuera de las 2 DE (error
aleatorio). C. Se observa una tendencia al aumento del valor (error sistemático).
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Los problemas que pueden ser detectados mediante este m étodo son:
• Valores esporádicos situados por fuera de ± 2 DE (error en el muestreo y saltos de
corriente, principalmente).
• Valores consecutivos con variación progresiva, situados a uno de los lados de la línea
de base (calibración deficiente y alteración del reactivo, principalmente).
Método CUSUM
Este procedimiento es especialmente útil para controlar la deriva de los instrumentos en
el transcurso del tiempo. Para su realización debe partirse, al igual que en la elaboración
de la gráfica control, del análisis del material de control un mínimo de 20 veces con
secutivas para obtener los valores de x y DE. En una gráfica se representa la diferencia
entre cada resultado y x. El resultado de esta diferencia se suma a la obtenida en la serie
anterior. Así, la observación de la gráfica de control que se aleja de la línea de base pone
de manifiesto de manera muy visible la existencia de derivas. Si no las hay, los puntos se
distribuyen alrededor de la línea de base (fig. 25-2).
Algoritmo de Bull
El procedimiento basado en los resultados obtenidos en las muestras de los pacientes
es el llamado algoritmo de Bull. En 1974, Brian Bull diseñó un modelo matemático que
permitía determinar un conjunto de medias compensadas a partir de grupos de 20,25
o 30 muestras (XB¡) que en cada caso se calculaban a partir de la media de cada grupo
anterior (XB¡_,). Este procedimiento se basa en la constatación de que el valor medio de
los índices eritrocitarios (VCM, HCM y CCMH), suministrados sistemáticamente por
los analizadores automáticos, apenas varía para una población determinada en el curso
del tiempo y que presentan una distribución normal o gaussiana. Para ello, se calcula
inicialmente la media aritmética de las magnitudes citadas, obtenida a partir de 800 a
1.000 muestras analizadas mediante el instrumento que hay que controlar, previamente
calibrado (media de referencia). La media de Bull (XB) se calcula a partir de grupos cons
tituidos por un mínimo de 20 muestras, al objeto de facilitar el control permanente del
analizador automático, evitando que en caso de error el núm ero de muestras que haya
que repetir sea excesivo. A partir de la media de referencia en el primer grupo y de cada
Lín ea
d e b ase
-1 d e -
- 2 DE
T ie m p o
FIGU RA 25-2. Gráfica control para el método CUSUM. A. Situación correcta. Fluctuaciones muy
próximas a la línea de base. B. Error sistemático que da lugar a una desviación de los valores CUSUM
en el sentido de la disminución.
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media previa (xB._,), se obtiene la llamada media compensada de cada uno de los grupos
que se analizan a lo largo del día (xB.) mediante la fórmula siguiente:
donde n = número de muestras y x.. = valor de cada una de las muestras que componen
el grupo.
Esta fórmula sería aplicable siempre que todos los valores de la magnitud analizada
(Xj) fueran iguales o superiores al valor de la media anterior (x¡ > xB¡_,), lo que nunca
se cumple en condiciones normales. Debido a esto, debe recurrirse a un algoritmo más
complejo, que consiste en realizar el sumatorio de las raíces cuadradas del valor absoluto
de las diferencias de cada uno de los valores del grupo que se analiza menos la media
previa, conservando el signo de esta diferencia, dividido por el número de casos, elevado
al cuadrado y sumado o restado (según el signo) a la media previa.
Debido a que en el cálculo se consideran los valores del grupo que se analiza y todos
los del grupo anterior o los de toda la población, modula de forma muy precisa la posible
existencia de valores dispares o aberrantes debidos a un defecto en el funcionamiento
o en la calibración del analizador. Este cálculo puede realizarse mediante un programa
informático con el cual, rápidamente, el valor de la media compensada de cada grupo
perm itirá m antener un control constante y sensible del analizador. Para obtener un
registro visible del proceso es necesario representar en una gráfica (Levy-Jennings) los
valores que se vayan obteniendo, donde el valor de la media de referencia corresponde
al 0% y la máxima desviación aceptable es de ±3% (fig. 25-3).
Evaluación externa de la calidad

La evaluación externa de la calidad constituye un complemento imprescindible del
CIC. Ello es así ya que aunque se tomen las debidas medidas para evitar la inexactitud
e imprecisión, existen ciertos errores que pueden quedar enmascarados debido a la
diferencia de matriz, o sea composición real, entre las muestras biológicas y los materiales
FIGU RA 25-3. Gráfica de control de los índices eritrocitarios en grupos de 20 muestras.
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ORGANIZADOR PARTICIPANTES
P re p a ra c ió n ■ ^ R ec ep c ió n
(m a te r ia l d e c o n tro l) (m a te r ia l d e c o n tro l)
D e te r m in a c ió n
A n á lisis e stad ístico - ^ i
1
In fo rm e h
FIGURA 25-4. Esquema general de un programa para la evaluación externa de laboratorios clínicos (PEECLC).
de control. La evaluación externa de la calidad puede estructurarse en diferentes ámbitos

geográficos (local, regional, nacional o internacional) y se basa en que el mayor número
posible de laboratorios participe en un mismo programa especialmente diseñado según
las magnitudes que se deseen evaluar. El esquema general de un programa de evaluación
externa de la calidad (PEEC) es el siguiente (fig. 25-4):
1. Existe un centro organizador de reconocida solvencia que contribuye al diseño del
programa, la distribución de los materiales y, eventualmente, la preparación de los
mismos. Asimismo, el centro organizador es el que se encarga de la puesta en marcha
del programa, la evaluación de los resultados y el establecimiento de un contacto
directo con los laboratorios participantes en el programa. La Comisión de las Comu
nidades Europeas, a través del programa M&T, recomienda que los responsables de
los aspectos científicos y profesionales de un PEEC sean especialistas en laboratorio
clínico y no tengan vinculaciones económicas con la industria del diagnóstico in vitro.
2. Cada laboratorio que participa en un PEEC recibe periódicamente especímenes o
muestras control (sangre total, plasma liofilizado o extensiones de sangre teñidas)
con objeto de que sean analizadas al igual que los especímenes de los pacientes.
Los resultados de los análisis son remitidos al centro organizador del programa
que realiza su evaluación estadística.
3. Finalmente, los resultados de la evaluación son enviados a los participantes, que
de esta forma pueden apreciar la situación de su laboratorio dentro del conjunto
de laboratorios que participan en el mismo programa.
La complejidad de un PEEC depende de la multiplicidad de técnicas e instrum en
tos que pueden emplearse en la determinación de una m isma m agnitud y el número
de magnitudes o constituyentes sometidos a evaluación. Aunque existen programas de
evaluación externa de la calidad para muchas técnicas diferentes, los más usuales son los
que se refieren a hematimetría automatizada (hemograma y fórmula leucocitaria) y las
pruebas básicas de coagulación (tiempo de protrombina, tiempo parcial de tromboplas
tina y concentración de fibrinógeno). Otros programas incluyen la evaluación externa
de la calidad de técnicas diagnósticas especiales como, por ejemplo, el recuento visual o
automático de reticulocitos, la concentración (sérica y eritrocitaria) de folato, la concen
tración sérica de cobalamina (vitamina B12), hemoglobinas HbA2y HbF y hemoglobinas
patológicas y actividad glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa.
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La valoración estadística de los resultados se realiza sobre la base de la obtención para

cada m agnitud evaluada del valor diana o media de consenso de los resultados de todos
los grupos y de cada grupo en particular. Ambos datos informan sobre la situación de
cada laboratorio individual respecto a los demás laboratorios que analizan la misma
magnitud, independientemente del método empleado para ello (todos los grupos) y
respecto al grupo que utiliza la misma metodología (cada grupo). La media de consenso
x se obtiene eliminando los valores que se hallan p o r fuera de ±3 DE y recalculando
nuevamente el valor medio hasta eliminar de este m odo todos los valores que se alejan
excesivamente de la media de consenso (valores dispares o aberrantes).
Para cada magnitud evaluada, los resultados de cada participante se suministran con
la siguiente información:
1. Coeficiente de variación (CV) de la media de consenso para cada grupo de
métodos y para el total de grupos. Este valor se calcula del siguiente modo:
DE
CV% = — X100
x
donde DE = desviación estándar de su grupo y x = media de consenso de su grupo.
2. índice de desviación (ID) obtenido a partir de los valores del valor propio (x.), la
media de cada método, grupo de métodos o global (xm) y la desviación estándar (DE):
De acuerdo con los valores de ID obtenidos respecto a su mismo grupo o a todos los
grupos, los resultados se clasifican en cuatro categorías:
Excelentes: 0 < ID <0,5
Buenos: 0,5 < ID < 1
Satisfactorios: 1 < ID < 2
Fuera de límites aceptables: ID > 2
En este últim o caso es m uy im portante identificar la causa del error mediante la
revisión del método empleado o cualquier otro procedimiento.
3. Diagrama de Youden o representaciones gráficas de los índices de desviación
(ID), calculados a p artir del análisis de dos especímenes control. Para ello se
remite a cada laboratorio participante dos muestras control (muestras A y B) y el
diagrama de Youden se obtiene representando en un sistema de coordenadas los
valores de la media x y de las tres desviaciones estándar (3 DE) de cada una de
las muestras, de forma que en el eje de ordenadas se representan las desviaciones
estándar correspondientes de una muestra y en el eje de abscisas los de la otra
(fig. 25-5). Esta gráfica suministra información visual de la exactitud de las medias
obtenidas por cada laboratorio. Así, los valores próximos al centro de la misma
indican exactitud (el resultado del propio laboratorio viene indicado con una x);
los situados lejos del mismo, pero cerca de la bisectriz, la existencia de un error
sistemático, y cuando los valores se hallan lejos del centro del diagrama y de la
bisectriz indica la presencia de un error aleatorio. El error sistemático señala la
necesidad de recalibrar los instrumentos, mientras que el error aleatorio obliga
a una revisión general de toda la metódica empleada. Con ello, cada laboratorio
participante conoce sus posibilidades o limitaciones en relación con los restantes
que intervienen en el mismo programa y pueden comprobar su nivel m etodoló
gico en comparación con el conjunto de laboratorios participantes.
ERRNVPHGLFRVRUJ
5,6 91,1 93,7 96,8 98,8 101

Nivel 1
FIGURA 25-5. Representación gráfica de un diagrama de Youden.
Recientemente, se han desarrollado program as para la evaluación externa de la

calidad (PEEC) en los que el flujo de los datos se realiza a través de Internet. Para ello,
cada participante tiene una clave de usuario y una contraseña que le permiten acceder a
la base de datos introduciendo las magnitudes en las que quiere participar, los métodos
y las unidades de trabajo. A través de este acceso introduce los resultados obtenidos en
cada período. Al final de cada período, los organizadores proceden al cierre y tratamiento
estadístico de los resultados. Entonces, cada participante puede consultar su posición
respecto al conjunto de valores (fig. 25-6). Esto permite una agilidad mucho mayor cara
a la adopción de las medidas correctoras que procediera adoptar.
Ejemplo del funcionamiento de un PEEC de cinco laboratorios

para la medida de la concentración de hemoglobina
Valores de los controles (datos elaborados por el centro de evaluación):
Control 1 Control 2
x = 130g/l x = 60g/l
x ± 2 D E = 120-140 x + 2 D E = 50-65
Valores obtenidos por cada uno de los laboratorios participantes:

Control 1 Control 2
Lab. 1 130 60
Lab. 2 120 50
Lab. 3 135 65
Lab. 4 120 70
Lab. 5 150 40
La representación gráfica de estos valores se halla en la figura 25-5.
Lab. 1 = resultado correcto.
Lab. 2 = resultado aceptable, pero con desviación hacia valores más bajos (error sistemático).
Lab. 3 = resultado aceptable, pero con desviación hacia valores altos (error sistemático).
Lab. 4 = resultado inaceptable, que indica error aleatorio.
Lab. 5 = resultado inaceptable, que indica error aleatorio.
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QC SY STEM • INTRODUCCIÓN D E R E SU LT A D O S
RESULTADOS NUMÉRICOS (2 NIVELES) PERIODO 2005/11
Control Control
1 2
CHCM II 19/m
HCM II |w
Hematíes |l0e12fl
Hematocrito II I*
Hemoglobina II lüM
Leucocitos 110e9/l
Plaquetas 110e9/l
VCM II lo
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FIGU RA 25-6. Imagen en PDF de un informe correspondiente a la EEC de la hemoglobina obtenido por
conexión al servidor de un PEEC para laboratorios clínicos.
NORMAS CUALITOLÓGICAS
Certificación y acreditación
El reconocimiento externo de la implantación de un sistema cualitológico y de las activi
dades que se desarrollan en un laboratorio clínico se realiza a dos niveles: la certificación
y la acreditación. Los requisitos necesarios para conseguir una u otra son distintos:
• Certificación significa «evaluar y declarar públicamente que el laboratorio cumple
con los requisitos de una norm a de gestión de la calidad». La certificación es, por
tanto, una garantía por escrito de que un producto, proceso o servicio cumple unos
requisitos especificados. La norm a de certificación, ISO 9001:2008, en ocho capítulos
describe los requisitos para establecer un sistema de gestión de la calidad capaz de
adaptarse a cualquier tipo de empresa.
• Acreditación significa «reconocer formalmente que el laboratorio tiene capacidad téc
nica para las tareas que realiza». La acreditación es, por tanto, el reconocimiento formal
y escrito de que una organización o individuo es competente para llevar a término unas
tareas específicas. La norm a de acreditación EN17025 y más recientemente la norma
ISO 15189:2012 se hallan enfocadas a los requisitos específicos que debe cumplir un
laboratorio, incluidos los de gestión de la calidad para demostrar su competencia técnica.
Las diferencias entre certificación y acreditación se refieren también al equipo auditor.
Tanto la certificación como la acreditación son otorgadas por organismos competentes,
independientes y externos al laboratorio. En la certificación, el equipo auditor está
formado por personas con experiencia en la evaluación de sistemas de gestión de la
calidad y en la aplicación de los requisitos genéricos de la normativa al funcionamiento
del laboratorio clínico, con objeto de verificar el cumplimiento de dichos requisitos. En
la acreditación, los auditores tienen como misión fundamental verificar la competencia
técnica del personal y la disponibilidad de todos los recursos técnicos necesarios para
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producir datos y resultados fidedignos con los métodos especificados. La certificación

puede ser otorgada por diversos organismos de certificación acreditados. Por el contrario, la
acreditación es competencia estatal (en España es otorgada por la agencia estatal ENAC).
Certificación: no rm a UNE-EN ISO 9001:2008

La ISO es una entidad internacional que ha desarrollado las llamadas normas ISO 9000.
De ellas, la que define los requisitos para establecer un sistema de gestión de la calidad,
independientem ente del tipo de organización o entidad es la norma de certifica
ción UNE-EN ISO 9001:2008. La UNE-EN ISO 9001:2008 es una norm a de certificación
genérica para los sistemas de gestión de la calidad aplicable a cualquier organización,
independientem ente del tipo, tam año o producto que suministre. Debido a ello, en
principio, es aplicable a los laboratorios clínicos. La norm a ISO 9001:2008 exige estable
cer, documentar, implantar y mantener un sistema de gestión de la calidad en el que se
incluya la mejora continua; para esto es necesario identificar los procesos del laboratorio
clínico implicados en la calidad del servicio prestado. Una entidad independiente al
laboratorio clínico certificará la implantación de la norma, la capacidad de suministrar
productos y servicios que satisfagan los requisitos y especificaciones definidas, así como
las reglamentaciones técnicas y legales que sean aplicables al laboratorio.
La norm a se desarrolla en ocho capítulos, donde se definen los requisitos necesarios
para establecer un sistema de gestión de la calidad que perm ita al laboratorio clínico
demostrar su habilidad para ofrecer un servicio de calidad, que cumpla con los requisitos
de sus clientes y con otros requisitos legales y formativos aplicables, con el objetivo de
incrementar la satisfacción del cliente, la mejora continua y la garantía de la conformidad
de los productos. Los principales requisitos del sistema cualitológico de acuerdo con la
norm a ISO 9001:2008 son los siguientes:
• Disponer de toda la documentación relacionada con el sistema de gestión de la calidad
claramente redactada, mantenida, actualizada y controlada. Como documentación
destacan los siguientes apartados: 1) la política cualitológica; 2) los objetivos cuali
tológicos; 3) el manual de la calidad; 4) los procedimientos o documentos necesarios
para asegurar la planificación y el control de los procesos (instrucciones de trabajo,
procedimientos de trabajo y otros), y 5) los registros.
• Identificación, mantenimiento y calibración de todos los aspectos técnicos y forma
apropiada al trabajo que se realiza en el laboratorio: infraestructuras, equipos y
productos.
• Dinamización de los recursos humanos promoviendo la motivación y participación
del personal, la atribución de responsabilidades de acuerdo con la formación del
mismo y la implantación de un sistema de formación continuada.
• Mejora de la gestión de los recursos y de la calidad del servicio prestado (plazos de
entrega, garantía, fiabilidad, etc.), lo que redunda en una mayor satisfacción de los
clientes.
• Capacidad de avalar las acciones a través del registro de las actividades que se realizan
en el laboratorio.
Una vez se han implantado los requisitos de la norm a ISO 9001:2008, un organis
mo certificador audita el sistema para evaluar su implantación y, si la implantación
se ha realizado de forma satisfactoria, el laboratorio clínico recibe la certificación. La
certificación tiene un período de vigencia de 3 años, durante los cuales y de forma anual,
el organismo certificador externo revisa la implantación del sistema para asegurar su
correcto funcionamiento.
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Acreditación: n o rm a ISO 15189:2012

Posteriormente, la ISO elaboró una norma de acreditación ISO 15189, específica de labora
torios clínicos. Ello obedece a que estos tienen peculiaridades (aspectos de seguridad, éticos y
de relación con el paciente) que no se hallan contempladas en la norma EN-17025, aplicable
a los llamados «laboratorios de ensayo». Entre las más importantes destacan las siguientes:
• El reconocimiento de la capacidad técnica no es suficiente, también es necesario
considerar la capacidad profesional con todas sus aplicaciones.
• Los aspectos de bioseguridad son claves en un laboratorio que recibe pacientes y
muestras potencialmente infecciosas.
• Es habitual que un laboratorio clínico disponga de centros periféricos de toma de
muestras y que realice la subcontratación de algunas determinaciones, pues su res
ponsabilidad es gestionar la calidad de estas actividades.
• La solicitud analítica se puede formular como un perfil específico para diagnosticar
una determinada patología.
• Es muy im portante considerar la fase preanalítica, que incluye la preparación del
paciente, la toma de m uestra y el transporte y la conservación de la misma.
• Es necesaria una continua actualización de las técnicas instrum entales y de los
métodos analíticos, debido a que constantemente surgen nuevos indicadores para el
diagnóstico, seguimiento o tratamiento de las enfermedades.
• Los sistemas informáticos, la automatización instrumental y la robotización son as
pectos muy singulares en el laboratorio clínico.
• Los resultados deben satisfacer no solo los requisitos de calidad analítica, sino también
los de utilidad para el diagnóstico y la terapéutica.
• Los informes de resultados analíticos procedentes del laboratorio clínico tienen
particularidades concretas. Se valora mucho la interpretación por personal cualificado
para dicha actividad.
• La ética, la confidencialidad, el consentimiento, la privacidad, la confortabilidad y la
beneficencia son conceptos de vital importancia en los servicios que se elaboran en
los laboratorios clínicos.
Esta normativa está asentada en las normas ISO 9001 e ISO/IEC 17025 y ha sido desa
rrollada para aquellos laboratorios clínicos que desean acreditar su competencia técnica
(incluidos los de bioquímica clínica, hematología, microbiología y anatomía patológica).
Esencialmente establece los requisitos relativos a la competencia y la calidad que son
propios de los laboratorios clínicos. La norm a ISO 15189 consta de cinco capítulos que
tienen una doble orientación: por una parte contiene requisitos relacionados con la ges
tión de la calidad, similares a los exigidos por la ISO 9001:2008 y, por otra, los requisitos
relacionados con la competencia técnica similares a los exigidos por la ISO/IEC 17025.
Además, la norm a hace referencia a consideraciones de seguridad y ética en el trabajo
del laboratorio clínico, y énfasis en la necesidad de que cada laboratorio proporcione
la necesaria educación y formación científica al personal técnico y licenciado superior.
Aunque existe una im portante correlación entre las norm as ISO 9001:2008 e ISO
15189:2012, la principal diferencia entre ambas, incluyendo que la norma ISO 9001:2008
se usa para certificar, y la norm a ISO 15189:2012 para acreditar, es que esta última contie
ne requisitos técnicos para el personal del laboratorio clínico y para su funcionamiento.
Cuando el laboratorio clínico considera que cumple con los requisitos estipulados
en la norm a UNE-EN ISO 15189, un equipo auditor evaluará su competencia técnica
y verificará dicho cumplimiento. Asimismo, todo laboratorio clínico acreditado según
la UNE-EN ISO 15189 habrá demostrado la implantación de un sistema de gestión de
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la calidad según la norm a ISO 9001:2008 (aspectos de organización y documentación,

definición de necesidades y expectativas de sus clientes, mejora continua) y la ejecución
de las actividades propias del laboratorio clínico.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS EN HEMATOLOGÍA

Propiedades y m agnitudes hem atológicas
Los análisis que se efectúan en el laboratorio de hematología tienen como objetivo
llegar a conocer la composición de los distintos componentes celulares de la sangre, así
como de determinadas sustancias relacionadas con su funcionalidad. En el ámbito de la
metrología se denomina propiedad a toda característica susceptible de ser observada o
medida. Si puede ser cuantificada se denomina magnitud.
Las propiedades y magnitudes hematológicas constan de u n sistema en el que están
insertas, un componente que es observado o medido y un tipo de propiedad que define
la naturaleza de la medición u observación. Un ejemplo de propiedad cuantitativa o
magnitud hematológica es la concentración numérica de leucocitos en sangre. En este
caso el sistema es la sangre, el componente son los leucocitos y el tipo de m agnitud es
la concentración numérica. Una propiedad no cuantificable sería la poiquilocitosis de
los eritrocitos sanguíneos, en la que el sistema serían los eritrocitos, el componente la
poiquilocitosis y el tipo de propiedad la concentración arbitraria (c.arb).
N om enclatura y unidades
La conveniencia de normalizar la forma de expresar los exámenes de propiedades bio
lógicas efectuados en el laboratorio clínico, así como las unidades en las cuales son ex
presadas ha dado lugar a diversas recomendaciones internacionales. La nomenclatura
recomendada internacionalmente parte de unos conceptos metrológicos básicos, incluido
el concepto de propiedad, y unas reglas sintácticas simples. La nomenclatura sistemática de
cualquier propiedad biológica requiere la descripción del sistema en estudio (p. ej., plasma,
sangre, médula ósea), del componente considerado (p. ej., fibrinógeno, hemoglobina,
mielocitos) y del tipo de propiedad (p. ej., concentración de sustancia, fracción de número)
y, cuando es necesario, alguna especificación de cada uno de estos tres elementos. Fijando
la ordenación de estos elementos junto con el resultado del examen de laboratorio, se
forma un sintagma que describe la propiedad biológica y el resultado obtenido.
La sintaxis recomendada internacionalmente incluye los siguientes elementos, dis
puestos de izquierda a derecha:
1. Nombre o símbolo del sistema y, si es necesario, se añade, entre paréntesis y sin
dejar ningún espacio, una especificación [p. ej., Cls (MOs) que significa «células
de la médula ósea»] (tabla 25-1).
2. Sin dejar ningún espacio, se escribe un guión largo o dos guiones cortos (- -). Se
escribe siguiendo la nomenclatura internacional y utilizando mayúsculas para la
primera letra, el nombre completo del componente; cuando es necesario se añade
una especificación entre paréntesis y sin dejar ningún espacio [p. ej., mielocitos
(neutrófilos)].
3. Sin dejar ningún espacio, se escribe un punto y coma.
4. Después del punto y coma, dejando un espacio, se escribe el nombre o la abrevia
tura del tipo de propiedad añadiendo, entre paréntesis y sin dejar ningún espacio,
las especificaciones necesarias, como el procedimiento de medición [p. ej., tiempo
rel.(INR; IRP 67/40)], el material de referencia respecto al cual el resultado es
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TABLA 25-1. Sistemas biológicos con sus símbolos internacionales
Elemento Abreviatura Elemento Abreviatura

Bazo Spl Líquido cefalorraquídeo LCR
Cálculo urinario CUr Líquido pericárdico LPe
Células Cls Líquido peritoneal LPt
Células de vellosidades coriónicas CVC Líquido pleural LP1
Contenido duodenal CDu Líquido sinovial LSi
Contenido gástrico CGa Meconio Mee
Eritrocitos Ers Médula ósea MOs
Espermatozoides Spz Moco cervical MCe
Esputo Spu Músculo (esquelético) Mus
Estómago Gst Orina Uri
Exudado ótico EOt Ovarios Ova
Exudado uretral EUr Paciente Pac
Heces Fae Páncreas Pan
Hígado, hepatocitos Hep Pelo Pil
Fibroblastos de piel cultivados FPC Piel Cut
Filtrado glomerular FG1 Plaquetas Pqs
Ganglio Gan Plasma Pía
Glándula tiroides Thy Plasma seminal PSe
Glándulas paratiroides Pth Pro teína Prt
Glándulas suprarrenales Adr Riñón Ren
Glomérulos Glo Saliva Slv
Hemoglobina Hb Sangre San
Hipófisis Hph Secreción lacrimal SLa
Intestino Int Secreción vaginal SVa
Leucocitos Lks Semen Sem
Linfocitos Lfs Sudor Sud
Líquido amniótico LAm Suero Srm
Líquido ascítico LAs Testículos Tes
OTROS SÍMBOLOS QUE SE PUEDEN UTILIZAR EN LA DESCRIPCIÓN
DE UNA MAGNITUD BIOLÓGICA
Arterial a Por vía oral p.o.
Capilar c Subcutáneo s.c.
Intramuscular i.m. Venoso(a) v
Intravenoso i.v.
trazable [p. ej., c.subst.arb.(IS 83/505) ], o la escala de valores posibles, que siempre
debe acompañar el tipo de propiedad de concentración arbitraria [p. ej., c.arb.(0 1),
c.arb. (microscopía; 0 12), c.arb. (microscopía; ausentes, escasos, abundantes)].
5. A continuación, se dejan uno o más espacios y se escribe el operador relacional
correspondiente.
6. Finalmente, se dejan uno o más espacios y se escribe el resultado del examen de
laboratorio. Cuando el tipo de propiedad así lo requiera, se añade la unidad del
sistema internacional de unidades, o la unidad arbitraria, correspondiente; el
signo decimal debe de ser siempre una coma.
Esta sintaxis permite denom inar según un mismo principio todas las propiedades
biológicas examinadas en el laboratorio clínico. Los resultados de los exámenes de
laboratorio clínico pueden pertenecer a una escala nominal (p. ej., el nombre de un grupo
sanguíneo), a una escala ordinal (p. ej., cualquier valor ordinal o semicuantitativo) y a
una escala de razón o de diferencias (números racionales).
El resultado de medición de una propiedad cuantitativa (magnitud) particular se
expresa mediante un valor numérico que multiplica una unidad de medición. La descrip
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ción de este valor numérico debe seguir las normas internacionales para la escritura de
los números. Las unidades recomendadas son las del sistema internacional de unidades
(tablas 25-2 y 25-3), aunque en algunos casos, debido a la falta del total conocimiento
de las entidades moleculares en estudio se ha de recurrir a unidades arbitrarias.
TABLA 25-2. Magnitudes biológicas y unidades según el sistema internacional (SI)
Magnitud básica Unidad (SI) Símbolo

Cantidad de sustancia Mol mol
Corriente eléctrica Amperio A
Intensidad lumínica Candela cd
Longitud Metro m
Masa Kilogramo kg
Temperatura Kelvin K
Tiempo Segundo s
Magnitudes biológicas derivadas (abreviatura)
Actividad catalítica (act.cat.) Katal kat
Concentración arbitraria c.arb arb.u./l, int.u./l
Concentración catalítica (c.cat.)
Concentración de masa (c.masa) Katal por litro kat/1
Concentración de número (c.núm.) Kilogramo por litro kg/1
Concentración de sustancia (c.sust.) Entidades por litro 1/1
Fracción de masa (fr.masa) Mol por litro mol/1
Fracción de número (fr.núm.) Uno 1
Fracción de sustancia (fr.sust.) Uno 1
Fracción de volumen (ir.vol.) Uno
Osmolalidad Uno I 1
pH Mol por kilogramo mol/kg
Presión parcial Uno 1
Radiactividad Pascal Pa
Volumen (vol.) Becquerel Bq
Volumen entítico (vol. entítico) Litro 1
TABLA 25-3. Múltiplos y submúltiplos de las unidades del sistema internacional
Factor Prefijo Símbolo

1024 yotta- Y
1021 zetta- Z
1018 exa- E
1015 peta- P
1012 tera- T
109 giga- G
106 mega- M
103 kilo- k
10' deca- da
10-3 mili- m
10* micro- H-
10* nano- n
10-'2 pico- P
10-'5 femto- f
10-'8 atto- a
10-21 zepto- z
10-24 yocto- y
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La interpretación del resultado de la medición de una m agnitud hematológica debe
basarse en unos valores de referencia con los que tiene que compararse. Así, un «valor
de referencia» es el valor de una magnitud biológica particular correspondiente a un
individuo de referencia. Habitualmente se consideran individuos de referencia aque
llos que no presentan ninguna patología conocida. Por ello, en hematología, como en
cualquier otra disciplina del laboratorio clínico, es de gran importancia establecer, para
cada magnitud analizada, el intervalo de valores de referencia, o sea, el margen dentro
del cual un valor observado puede corresponder a un individuo sano.
El organismo humano está sujeto a numerosas variaciones, debidas tanto a su propia
fisiología como a diferencias genéticas, a la presencia de enfermedades o de los llamados
factores ambientales (variabilidad biológica individual y colectiva). La interpretación
de los valores atribuidos a las magnitudes hematológicas requiere, por tanto, conocer la
influencia de estas variaciones, tanto desde el punto de vista individual como colectivo, y
sobre la base de ello disponer de datos fiables con los que poder comparar los obtenidos
tanto en condiciones de salud como de enfermedad.
Fuentes de variabilidad de los resultados

Los resultados de la medición de las magnitudes hematológicas están sometidos a dos
tipos de variabilidad: metrológica y biológica. La primera se ha tratado en el apartado de
control de la calidad. La variabilidad biológica tiene orígenes muy diversos que van desde
la edad, el sexo, la raza, el embarazo, etc., que dan lugar a la diferencia entre los individuos,
y otros como los ritmos biológicos, la alimentación, el estrés, la masa corporal, a parte de
la presencia de enfermedades, que generan la fluctuación de los valores de cada magnitud
en un individuo a lo largo del tiempo. Así pues, pueden distinguirse dos componentes
de la variabilidad biológica: la intraindividual y la interindividual.
En función del objetivo de la realización de los análisis pueden interesar las compa
raciones longitudinales o las transversales. En el prim er caso, se hace el seguimiento de
una m agnitud en un individuo a lo largo del tiempo, es decir, cómo sería la observación
de la evolución de la concentración de hemoglobina en sangre. Para ello, la fuente de va
riabilidad biológica que deberá tenerse en cuenta es la intraindividual. Cuando se quiere
establecer el diagnóstico de una enfermedad no se suele disponer de datos suficientes
del propio individuo, por lo que debe recurrirse a comparaciones transversales con una
colectividad. Como los valores de las magnitudes dependen en mayor o m enor grado
del grupo biológico al que pertenece el individuo (edad, sexo, raza, etc.) es necesario en
algunas magnitudes limitar las comparaciones al propio grupo biológico.
O btención de los lím ites de referencia

La definición de los términos corrientemente empleados en el estudio de los valores de
referencia y su interrelación se resumen a continuación (cuadro 25-2):
• Un individuo de referencia se selecciona sobre la base de criterios claramente definidos,
entre los que es fundamental su estado de salud. La definición de salud para un individuo
de referencia (y población de referencia) conlleva ciertas dificultades, ya que ha variado
no solo a lo largo de la historia sino también entre diferentes países o grupos étnicos.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la salud se define como el estado de
completo bienestar físico, mental y social y no simplemente como la ausencia de enfer
medad o dolencias físicas. Con todo, no debe olvidarse que también pueden constituir
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CUADRO 25-2. Generación de los valores de referencia
1. Individuos de referencia
constituyen una
2. Población de referencia
de la que se selecciona
3. Una muestra de referencia
en la que se determinan
4. Los valores de referencia
de los que se obtiene una
5. Distribución de referencia
de la que se calculan
6. Los límites de referencia
que permiten definir
7. El intervalo de referencia
que puede ser comparado con
8. Valores observados en un individuo
individuos de referencia pacientes afectos de determinadas dolencias, con enfermedades

en determinado estado evolutivo o pertenecientes a ciertos grupos de riesgo.
• Una población de referencia está constituida por un número variable, generalmente
elevado, de individuos de referencia. En general, la población de referencia con la que
normalmente se comparan los valores de las magnitudes analíticas está constituida
por sujetos aparentemente sanos o en estado fisiológico normal.
• Una m u estra de referencia está formada por un número estadísticamente adecuado
de individuos pertenecientes a la población de referencia y seleccionados al azar a
partir de la misma. Una muestra de referencia puede ser también un subconjunto de
la población de referencia.
• Un valor de referencia es aquel que se obtiene mediante la medida de una magnitud
particular (concentración de hemoglobina, recuento de leucocitos, etc.) en individuos
de una muestra de referencia.
• Una d istrib u ció n de referencia es la que corresponde a los valores de referencia.
Dichas distribuciones pueden ser paramétricas o no paramétricas, según se ajusten
o no a la forma de la campana de Gauss.
• Un lím ite de referencia es un valor perteneciente a la distribución de referencia.
Generalmente se adopta el percentil 2,5 como límite inferior y el percentil 97,5 como
límite superior.
• Un in terv alo de referencia es el existente entre dos límites de referencia, ambos
incluidos.
• Un valor observado es el obtenido por medición de una magnitud particular y debe
poder ser comparado con los valores de referencia, la distribución de referencia, los
límites de referencia o los intervalos de referencia.
Los m étodos para obtener los valores de referencia dependen de las m agnitudes
(o componentes) consideradas, pero en cualquier caso deben ser los mismos que los
empleados para estudiar a los pacientes. La obtención de los límites de referencia
requiere métodos de análisis estadístico, los cuales deben considerarse siempre como un
instrumento; su empleo debe hacerse siempre de forma correcta y con un preciso cono
cimiento de su significado. Por ejemplo, la creencia generalizada de que las magnitudes
biológicas cumplen siempre una distribución gaussiana es inexacta. Existen muchas de
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CUADRO 25-3. Criterios de exclusión en la elaboración de una población de referencia.

Abuso de preparados polivitamínicos
• Alcoholismo
• Alteraciones de la presión arterial
• Drogodependencia
• Ejercicio intenso
• Embarazo
• Enfermedad reciente:
• Hospitalización
• Intervención quirúrgica
• Transfusión
• Estado tensional (estrés psicológico)
• Factores ambientales
• Factores genéticos
• Factores profesionales
• Ingesta de anticonceptivos orales
• Menopausia
• Menstruación reciente
• Obesidad
• Tabaquismo
ellas que presentan una distribución asimétrica y que, por ello, requieren un tratamiento
estadístico diferente al de una distribución gaussiana.
Los valores de referencia obtenidos a partir de un individuo o un grupo de individuos
solo tienen significado si existe una definición previa de los mismos y de los métodos
empleados para su medición. Por ello, en la obtención de los valores de referencia deben
tenerse muy en cuenta los factores siguientes:
• La correcta definición de la población de referencia en relación con la edad, el sexo,
el grupo étnico, los factores genéticos, fisiológicos, socioeconómicos y ambientales,
y los criterios de exclusión (cuadro 25-3).
• Las variables preanalíticas dependientes del procedimiento empleado para la recogi
da de los especímenes, que incluyen la preparación del individuo (factores biológicos)
y los aspectos metodológicos relacionados con la técnica de la extracción (punción
venosa o capilar), el transporte y la manipulación de la muestra (cuadro 25-4).
CUADRO 25-4. Variables preanalíticas que se deben considerar en la elaboración

de los valores de referencia
B iológicas
• H em odinám icas
• Inducción enzim ática
• Lesión celular
• M etabólicas
M e to d o ló g ic a s
• Extracción de la m uestra
• M anipulación de la m uestra
• T ransporte de la m uestra
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• Las variables analíticas dependientes del método analítico empleado. Estas incluyen
detalles sobre su precisión, sensibilidad y exactitud, y hacen énfasis en las variaciones
a largo plazo en el caso de que la población o los individuos sean estudiados durante
un largo período de tiempo.
Como los intervalos de los valores de referencia dependen de los factores citados, cada
laboratorio deberá informarlos junto con los resultados para posibilitar u na correcta
interpretación de los mismos.
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Capítulo 25 La calidad en e l laboratorio de hematología 7 8 1 .e l
Autoevaluación
1. La mayoría de los errores que se producen en la realización de los análisis hematológicos
ocurren:
(a) En la fase preanalítica.
(b) A causa de errores instrumentales.
(c) Por mal estado de los reactivos.
(d) Por fallos en el sistema informático.
(e) En el turno de noche.
Respuesta razonada: en la actualidad, gracias a los avances en la instrumentación y la informática,
la fase preanalítica es la que origina m ás de un 60% de los errores.
2. El control interno de la calidad implica que los materiales de control se analicen:
(a) Cada mes.
(b) Cada semana.
(c) En días alternos.
(d) En cada serie analítica.
(e) Cada hora.
Respuesta razonada: para poder dar validez a los resultados de las mediciones, cada serie requiere
el análisis de los controles internos establecidos en el procedimiento.
3. La medición de los resultados de las magnitudes bioquímicas está sujeta a dos fuentes de
error:
(a) Sistemático y aleatorio.
(b) Directo e indirecto.
(c) Instrumental y manual.
(d) Positivo y negativo.
(e) Real y virtual.
Respuesta razonada: se reconocen dos fuentes de error. El error sistemático se reproduce en cada
medición y, en caso de ser conocido, puede compensarse aplicando un cálculo al resultado. El
error aleatorio, en cambio, es imprevisible.
4. Los valores de una serie de análisis no pueden ser, en principio, aceptados cuando el resultado
de la medición un material de control es:
(a) > 2x.
(b) < x - 2 D S .
(c) <5/2.
(d) > x + 3DS.
(e) > x + 2DS.
Respuesta razonada: cuando el resultado del control excede la media más tres desviaciones
estándar o no llega a la media menos tres desviaciones estándar, se vulnera la prim era regla de
control y la serie debe ser rechazada.
5. El algoritmo de Bull:
(a) Sirve para calcular la media y la desviación estándar de los resultados de medición de
los controles.
(b) Pone de manifiesto el error aleatorio de u n sistema de medida.
(c) Permite el control interno de la calidad utilizando los valores de los propios pacientes.
(d) Se utiliza preferentemente para el control de calidad de los análisis de plaquetas.
(e) Se utiliza preferentemente para el control de calidad de los análisis de leucocitos.
Respuesta razonada: la media de una serie de análisis en 20 o más pacientes se considera estable
para los índices eritrocíticos, y una desviación superior al 2% de la media ponderada de Bull
implica una desviación de la estabilidad del sistema analítico.
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78 1 .e2 Manual de técnicas de laboratorio en hematología
6. La participación en programas de evaluación externa de la calidad:

(a) Se efectúa una vez cada año.
(b) Se efectúa diariamente.
(c) Se basa en laboratorios de referencia.
(d) Se basa en la comparación de los resultados de los análisis de múltiples laboratorios en
materiales de control.
(e) No debe ser superior a 20 laboratorios.
Respuesta razonada: los programas de evaluación externa de la calidad se basan en la comparación
entre laboratorios.
7. La acreditación de un laboratorio de análisis hematológicos por la norm a ISO 15189:2007
implica que:
(a) Cumple las normas medioambientales.
(b) Tiene documentados todos los procesos.
(c) Se reconoce formalmente que es competente para llevar a cabo su función.
(d) Participa en programas de evaluación externa de la calidad.
(e) Todas las opciones.
Respuesta razonada: la norm a ISO 15189 es específica para la acreditación de laboratorios
clínicos, y junto con los requisitos de gestión, equivalentes a los que incluyen las norm as de la
serie 9000, tiene requisitos técnicos que perm iten garantizar la competencia de los laboratorios
acreditados para ejercer su función.
8. La concentración de hemoglobina en sangre es:
(a) Una prueba.
(b) Un parámetro.
(c) Una m agnitud hematológica.
(d) Una propiedad cualitativa.
(e) Ninguna de ellas.
Respuesta razonada: una propiedad susceptible de ser medida en una escala de números reales se
conoce como magnitud, que en el caso de la hemoglobina puede calificarse como hematológica,
ya que se estudia en esta disciplina. Cuando el valor de una propiedad no puede expresarse en
térm inos numéricos, esta se denomina cualitativa, como, por ejemplo, el color, el olor, la forma,
etc., que corresponderían a una escala nominal. El térm ino prueba es ambiguo y no es aplicable
a este concepto, a pesar de la amplia difusión de su uso en el lenguaje común. Parámetro es un
térm ino que se aplica en la estadística, la informática y las matemáticas con un significado muy
distinto al de magnitud.
9. La variabilidad biológica intraindividual puede ser debida a diferencias de:
(a) Sexo.
(b) Raza.
(c) Ritmos biológicos.
(d) Grupo sanguíneo.
(e) Entorno social.
Respuesta razonada: la variabilidad biológica puede desglosarse en dos componentes: intraindi
vidual e interindividual. La intraindividual se debe a los cambios que pueden darse en el propio
individuo, como alimentación, estrés, masa corporal, ritm os biológicos, etc. Los factores que
permanecen estables a lo largo de la vida (como sexo, raza y grupo sanguíneo) o durante períodos
prolongados (como el entorno social) solo pueden influir en la variabilidad interindividual.
10. Una población de referencia está constituida por:
(a) Individuos en los que se cumplen unas condiciones biológicas bien definidas.
(b) Individuos que poseen unas condiciones biológicas excelentes.
(c) Todos los pacientes a lo que se les practica análisis en un centro sanitario.
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Capítulo 25 La calidad en e l laboratorio de hematología 7 8 1 .e 3
(d) Individuos cuya edad está comprendida entre los 20 y los 30 años.
(e) Todos los pacientes a los que se les practica análisis en un centro de medicina preventiva.
Respuesta razonada: una población de referencia está constituida p o r individuos con unas
características bien definidas, como puede ser la de aquellos en los que no se manifiesta ninguna
enfermedad que tenga influencia en los valores de las magnitudes estudiadas. En este caso, se
trataría de una población de referencia cuyo intervalo de valores de referencia sería el fisiológico.
No obstante, tam bién podría tratarse de pacientes que están en una determinada fase de una
enfermedad.
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Indice alfabético
A Alteración(es) macrocítica, 386

Abbott, 127 del color, 380 megaloblástica, 369,434
Aberración cromática, 92 cromosómicas causa(s), 435
Abetalipoproteinemia, 377,498, hemopatías malignas, 294 medicamentosa, 435
507 leucemia(s) semiología, 437,439
ABO agudas mieloides, 298 microcítica(s), 385
grupo, 623 linfática crónica, 301 no sideroblásticas, 431
sistema, 592 linfoblástica aguda B, 300 hereditarias, 431
y enfermedades, 599 mieloide crónica, 298 sideroblástica, 396
fenotipos/genotipos, 594 linfomas, 302 normocítica, 387
Aborto medular, 368 síndromes mielodisplásicos, perniciosa, 374
Absorbancia por minuto, 548 297 refractaria(s), 368
Acantocitos, 376,507 de la forma eritrocitaria, 373 a hierro y con deficiencia
AccuCount, 135 del tamaño eritrocitario, 373 de hierro, 433
Aceite de cedro, 97 Amplificación enzimática, 329 sideroblástica, 370
Aceruloplasminemia, 431,432 ANA, patrones, 647 regenerativa, 366,384
Acetato de celulosa, 461 Análisis sideroblástica, 396
Acetilcolinesterasa eritrocitaria citoquímico de las células tipos, 366
(AChE), 569 sanguíneas, 244 Anisocromasia, 381
Ácido de regresión lineal, 149 Anisopoiquilocitosis, 380
cítrico-(citrato)-dextrosa, 18 Analizador(es) Anopheles, mosquito, 740
etilenodiaminotetraacético, 16 de la función plaquetaria, 692 Anquirina, 500
fólico, 435 hematológicos automatizados, déficit, 502
déficit, 369 129,133,134 Anticoagulantes, 13
estructura química, 437 calibración, 141 circulantes, 711
Actina, 501 características peculiares, tópicos, 642,711
Activación del plasminógeno, 687 135 Anticuerpos, 608
Actividad muramidasa, 258 control de calidad, 142 ABO, 598
ADAMTS-13,677 Anasarca fetoplacentaria, 458 adquiridos, 592
Adenilato cinasa (AK), 566 Anemia(s), 366 anti-PF4-heparina, 724
Adenosina arregenerativa, 367,388 anticitoplasma de neutrófilo,
desaminasa (ADA-1), 576 diagnóstico, 370 648,651,652
difosfato, 669 diseritropoyéticas congénitas, antieritrocitarios, significado
Adler, reacción, 171 368 clínico, 592
ADN, 729 drepanocítica, 476 antifosfolípidos, 712
extracción, 322 estudio etiológico, 383 antigranulocitarios (AGA),
secuenciación, 417 falciforme, 375,474 654,658
Adrenalina. Véase también ferropénica, 380,393,403,407 antileucocitarios, 642
Epinefrina diagnóstico diferencial, 397 antinucleares, 642
Adsorción diferencial, 638 hemólisis como causa, 366 tipos, 645
con polietilenglicol, 639 hemolítica, 367,378,388 antiplaquetarios, 658,663
ADVIA, sistema, 126,138,151 autoinmune, 631 eritrocitarios, 591
Aglutininas frías, 634 por anticuerpos irregulares antieritrocitarios, 627
síndrome, 634 calientes, 633 monoclonales, 282
Agregometría, 693 fríos, 634 «naturales», 591
Aldolasa, 564 pacientes candidatos a Antígeno (s)
Alelo(s) transfusión, 635 ABH, 593
dominante, 588 técnicas útiles, 640 ABO, 597
recesivo, 588 hemorragia como causa, 366 compuestos, 607
silentes, 588 inflamatoria, 395 incidencia
D 2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos 783

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784 ín dice alfabético
Antígeno (s) (cont.) 2,3-bisfosfoglicerato, 541 Chagas, enfermedad, 745

alta, 590 Bohr, efecto, 177 Chédiak-Higashi
baja, 589 Borrelia, 756 anomalía, 119
eritrocitarios, 590 Boyum, método, 235 síndrome, 89
no pertenecientes a ningún Brugia malayi, 748 Cianometahemoglobina, 160,
sistema de grupo Bull, algoritmo, 143,767 163
sanguíneo, 620 Bürker, cámara, 109 Cilindro óseo por punción
del sistema Rh, 601 Burkitt, linfoma, 302 con trocar, 216
Antígeno D débil, 626 Bursa de Fabricius, 43 Citocinas, 34
Antiplasmina, 722 Busulfano, 83 que regulan la hematopoyesis, 35
Antitrombina, 682,683 Citofluorómetro, calibración, 274
humana, 682 c Citogenética convencional
Aplasia medular, 343 C282Y, mutación, 415,416 y molecular, 339
Apoptosis, 15 Cabot, anillos, 381,382 Citogramas, 134
Armazón de reticulina, 221 Cámara Citometría de flujo
ARMS (Amplification Refractory cuentaglóbulos, 107,108 aplicaciones, 279
Mutation System), 488 líquidos diluyentes, 110 con eosina-5’-maleimida, 517
ARN, preparación, 324 de flujo, 132 inmunofenotipo, 273
Arneth, hemograma, 105,106 Cambio cromosómico, 294 intensidad antigénica, 279
Artefactos, 69,145 Capacidad de captación de principales aplicaciones, 281
Asociación Americana vitamina B|2 libre principio, 273
de Reumatología, 642 por el plasma, 447 técnicas inmunocitoquímicas,
Aspirado CAPILLARYS 2,482 281
blanco, 221 CAPILLARYS NEONAT Hb, 482 Citómetro, esquema del
medular, 204 Capping, 272 funcionamiento, 275
extensión, 206 Carboxihemoglobina, 173 Citopenias inmunes, 623
zonas de elección, 205 Carcinoma gástrico, 599 Citoquímica, 244
Atransferrinemia, 431 Cariotipo humano, 289 Citrato sódico, 18
Auer, bastones, 344-346 Cartwright, sistema, 616 Clasmatosis, 42
Auramina 0 , 151 Cascada de activación de la Clon, 292
Autoadsorción, 638 coagulación, 672 Clonalidad, 332
AutoPrep®, sistema, 64 Cebadores, 326,328 Clorotiazida®, 83
Azul de toluidina, 257 CELL-DYN, sistemas, 137 Clorpromacina, 83
CellaVision DM 200,126 Cluster o f Differentiation, 262
B Célula(s) CO-Oximeter 282®, 174
Babesiosis, 749 blásticas, 86 Coagulación, 701
Bactolátex, 238 dendríticas, 365 estudio básico, 717
Barbitúricos, 78 inmaduras, 86 Cobalamina sérica, 441
Basofilia, 79 madre Codocitos, 375,507
Basofilopenia, 85 germinal, 1 Cofactor II de la heparina, 682
Basófilos/neutrófilos, canal no pluripotente, 30,37 Coloración
segmentado, 140 natural killer, 42,45 excesivamente azul, 69
Bayer, 127 plasmática, 51 excesivamente rosada, 69
Bazo, 33 precursoras, 36 Colton, sistema, 616
BD Microtainer®, tubos, 13 progenitoras, 36 Comité Internacional de
Bethesda, unidades, 714,715 sanguíneas, 30 Estandarización en
Betke, método de la características Hematología (ICSH), 76,
desnaturalización alcalina, morfológicas, 45 116,128,159,398,539
469 recuento manual, 105 Comité Nacional para Patrones
Bilirrubina conjugada, 158 en tarta, 644 de Laboratorio Clínico
Billroth, cordones, 33 Células B memoria, 43 (NCCLS),76,159
Biología molecular, 340 Células LE, 643,644 Comparative genomic
métodos, 322 Centrifugación, 20,63 hybridization, 310
BIOMED, grupo, 340 Centrifugadora de Complejo trombina-
Bisfosfoglicerato mutasa (BPGM), microhematocrito, 21 trombomodulina, 689
561 Centrómero, 288 Compromiso madurativo, 34
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ín dice alfabético 785
Concentración Digitalización de imágenes, 72 del sistema reductor de la

de cobalamina sérica, 446 Discrasias de células plasmáticas, hemoglobina, 543
de eritropoyetina plasmática, 199 269 de la vía de pentosas, 542
de folato sérico, 447 Dismorfia plaquetaria, 94 Eosinofilia, 78
media de hemoglobina Dispersión medicamentos asociados, 79
corpuscular, 29 diferencial, 138 pulmonar, 78
Condensador, 96 lumínica, 131,132 Eosinofilopenia, 85
Confederación de Química Displasia, 351 Epinefrina, 670
Clínica de la Unión Europea hallazgos morfológicos, 351 Epstein-Barr, síndrome, 119
(EC4), 759 Distribución de referencia, 779 Equinocitos, 376,507,556
Contaminación leucocitaria, 555 Dobles diminutos, 294 Equinocitosis, 15
Control menos uno, 277 Dóhle, cuerpo, 89 Eritroblastopenia, 368
Coombs, técnica, 628 Dombrock, sistema, 617 Eritroblastos, 86
Corpúsculos del timo, 32 Drabkin, reactivo, 161,163 basófilos, 40
Coulter Drepanocito(s), 375,453 circulantes, 112
principio, 26 Drepanocitosis, 475,476 Eritrocito (s), 1,54,55
sistema, 126,127,135 Dry-tap, 221 capacidad antioxidante, 578
Coulter, Wallace, 125 Dufly falciformes, 375
Crenación, 15 glucoproteína, 612 marcados
Crioaglutininas, 186 sistema, 611 con cromo 51,191
Criohidrocitosis, 506 polimorfismos, 611 con tecnecio 99 metaestable,
Criterios para evaluar un analizador 193
de fórmula leucocitaria, 149 E nucleados, 382,383
Cromátidas, 288 EDTA, 14,17,60 pinzados, 378
Cromatina EGIL, grupo, 341 policromático, 41
«peinada», 53 Electrofocalización, 466 Erítroenzimopatías, 536,539
sexual, 47 Electroforesis, 497,729 diagnóstico, 543
Cromatografía líquida de alta capilar, 481 manifestaciones clínicas, 537
resolución (HPLC), 477 de alta resolución, 730 Eritropoyesis
Cromosoma(s), 288 convencional de hemoglobinas, ausencia, 368
en anillo, 292 460 ineficaz, 368
derivativo, 292 en geles de agarosa, 730 Eritropoyetina recombinante, 228
en metafase, 289 Eliptocitos, 376 Eritrosedimentación, 15,179,185
Cuerpo cromatínico. Eliptocitosis, 503 fases, 180
Véase Cuerpo Y congénita, 376 método semiautomático, 184
Cuerpo Y, 57 ELISA, 700,723 Error en la extracción sanguínea, 13
Cultivos de progenitores Elución mediante punción venosa, 14
hematopoyéticos, 225 ácida en frío, 640 Escherichia coli, 440,600
Curvas de disociación, 732 por calor, 640 Esferocitos, 374,507
CUSUM, método, 760,767 Emisores láser, 132 Esferocitosis hereditaria, 199,374,
Cycles threshold, 334 ENERCA, 383,389 379,501,502
Enfermedad Espectrina, 499
D de células falciformes, 454 déficit, 503
Dacriocitos, 377 cribado neonatal, 478 Esquistocitos, 377,378
Déficit granulomatosa crónica, 242 Esterasas, 249
de adhesión leucocitaria, 241 del sueño. Véase Estomatina, 501
congénito de piruvato cinasa Tripanosomiasis Estomatocitos, 377
(PK) eritrocitaria, 376 Enfoque hidrodinámico (EH), Estomatocitosis
Delta-check, 135,145 130,135 congénita, 378
Deming, ciclo, 759 Enolasa, 565 hereditaria, 505
Desviación reticulocitaria, 122 Enzimas de restricción de tipo II, Estudio(s)
Dianocitos, 456 729 de la agregación plaquetaria, 693
Diapédesis, 232 Enzimopatías citogenétícos, 291
Dicumarol, 83 de la glucólisis anaerobia, 539 inmunofenotípico, 339
Diego, sistema, 618 del metabolismo nucleotídico, Eucromatina, 288
2 ,3-difosfoglicerato, 157 542 Euglena gracilis, 440
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Ewing y Kasper, test, 712,713 Filariasis, 747 Genes

Examen morfológico de la sangre, Flebotomía, 8 de fusión, 331,332
373 cuantitativa, 413 supresores de tumores, 304
periférica, 59 Fluorescent activated cell sorting, 263 Genotipo, concepto, 588
Excentrocitos, 378,553 Fluorocromos, 99 Giemsa
Exceso de hierro, 390,410 Folato sérico, 442 colorante, 67
Explosión oxidativa, 233 Folículos linfáticos, 34 tinción, 66
Extensor mecanizado de sangre Fonio, método, 114 Gliceraldehído-3-fosfato
sobre portaobjetos, 63 Formaz, 239 deshidrogenasa (GA3PD),
External Quality Assurance Fórmula 563
Programmes in Laboratory cromosómica, 290 GLOB, sistema, 617
Medicine (EQALM), 67 leucocitaria, 72,105 Globina, 154
Extravasación de los leucocitos, 233 visual, 74 Glóbulos rojos. Véase Eritrocitos
F orw ard angle lig h t scatter, 274 Glucoforinas, 499
Fosfatasa Glucólisis anaerobia, 537,540
F12C 46T , polimorfismo, 737 ácida, 255 (3-glucoronidasa, 256,258
Factor(es) alcalina granulocitaria, 244, Glucosa fosfatoisomerasa (GPI), 556
de coagulación, 671 245 Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
principales características, 673 método para calcular, 246 (G6PD), 549
de corrección por elución del Fosfofructocinasa (PFK), 558 déficit, 243
51Cr de los eritrocitos, 198 Fosfoglicerato Glucosiltransferasas, 597
de crecimiento, 304 cinasa (PGK), 560 Glutámico oxaloacético
Fagocitosis, 234 mutasa (PGAM), 562 transaminasa (GOT), 574
degradación, 235 Fosfoglucomutasa (PGM1), 553 Glutatión
desgranulación, 234 6-fosfogluconato deshidrogenasa peroxidasa (GPX), 571
etapas, 234 (6PGD), 549 reducido eritrocitario, 545
Fairbanks, método, 520 Fotomultiplicador, 101,132 reductasa (GR), 570
Fanconi, enfermedad, 368 Fracción de reticulocitos Gordon-Sweet, reticulina, 219
Favismo, 379 inmaduros, 150 Gráfica recta de calibración, 163
FDA Guidance, 147 Fraccionamiento celular Grandes fumadores, 174
Fenotipo(s) gradiente de densidad, 265 Granulación azurófila, 381
concepto, 588 sedimentación, 264 Granuloaglutinación (GAT), 658
Rh-deficitarios, 608 Fragilidad osmótica eritrocitaria, Granulocitos, 46,66
Fenotipo D 510 basófilos, 49
débil, 606 causas de error en la eosinófilos, 48
parcial, 603 determinación, 512 función primordial, 232
Ferritina valores de referencia, 512 Grupo(s)
plasmática, 158 Frotis de sangre, 60 cromosómicos, 290
sérica, 401 grosor de la extensión, 73 hemo, 155
curva de calibración, 404 observación, 71 sanguíneos
método preciso de realización manual, 60 colecciones, 589
determinación, 402 teñido con MGG, 122 eritrocitarios, 587
y saturación de transferrina, Funcionalismo granulocitario, 232 sistemas, 588
412 defectos congénitos, 241 función biológica, 620
L-ferritina, 427 Funciones de la sangre, 2 genética, 588
Ferropenia, 390
causas, 395 G H
Ferroportina 1,391 G20210A, mutación, 737 H aem oglobin C olour Scale,160,168
Fibrina, 680 G6PD, 546 Ham, prueba, 532
Fibrinógeno, 680,706 déficit, 550 Hans, algoritmo, 360
derivado, 707 crisis hemolítica aguda, 553 Haplotipo, 589
Fibrinólisis, 721 Gaisbóck, síndrome, 116 Haptoglobina
activación, 688 Gammapatía monoclonal, 379 curva de calibración, 175,176
inhibidor, activado Ganglios linfáticos, 33 plasmática, 174
por trombina, 687 Gaucher, células, 211 reactivos, 175
FICTION, técnica, 312 Gel stacking, 525 Hargraves, células. Véase Células LE
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Harkness, viscosímetro, 188 inestable, 124 Hipocromía, 380

Hefaestina, 391 métodos diagnósticos, 477 Hipotransferrinemia. Véase
Heinz, cuerpos, 124,460,473 Hemoglobinopatía S homocigota, Atransferrinemia
Hemaglutinación, 180 453 Histogramas, 134
Hemalog-D, autoanalizador, 126 Hemoglobinuria paroxística de distribución de tamaño, 128
Hematíes. Véase Eritrocitos afrigore, 635 celular, 129
Hematimetría, 8 nocturna, 268,531 Hodgkin
Hematocrito, 19 Hemograma, 105 enfermedad, 81,85
por centrifugación, 20 automatizado, 127 linfoma, 357
error en la determinación del interferencia electrónica, 144 tipos histológicos, 362
hematocrito, 24 Hemolisinas frías, 635 Homocigoto, concepto, 588
por centrifugación, 25 Hemólisis, 387 Homogeneizador rotatorio, 61
obtenido electrónicamente, 26 mediante ácido clorhídrico, 166 Hospital Clinic de la Universidad
interpretación del resultado, 24 Hemoparásitos de Barcelona, 383
regla graduada, 23 en sangre periférica, 740 Howell Jolly, cuerpos, 374,381,382
valores de referencia, 26 técnicas para la investigación, 750 Human Genome Organization,
Hematopoyesis, 37 Hemopatías malignas, 293 725
mieloide, 31 métodos de clasificación, 337 Hydropsfetalis, 458
regulación, 34 Hemorragias digestivas, 407
Hematrak®, 26 prueba del cromo radiactivo, I
Hematuria, 170 408 Idoneidad de las muestras, 144
Hemocitómetro, 105 Hemosiderinuria, 408,410 Impedancia, 128
Hemocromatosis hereditaria, Hemostasia, 665 Impregnación argéntica, 219
410,422 primaria, exploración, 692 Inclusiones intraeritrocitarias, 381
pruebas genéticas, 413 Hemox-Analyzer®, 177 Indices eritrocitarios, 19,26,768
tipo 1,417 Heparina, 17 Inhibidor de la vía del factor
tipos, 411 de bajo peso molecular, 723 tisular, 682
HemoCue Hepcidina, 392 Inmunodifusión radial, 701,706
hemoglobinómetro, 167 Heterocigoto, concepto, 588 Inmunofenotipo, 339
sistema, 160 Heterocromatina, 288 Inmunofluorescencia (IF), 265,659
Hemodonación, 10 Hexocinasa (HK), 557 indirecta, 651
Hemoglobina, 154 Hibridación de plaquetas en microplaca, 661
análisis de la estabilidad genómica comparada, 339 Inmunofosfatasa alcalina, técnica,
molecular, 470 in situ, 306 282,286
catabolismo, 158 combinación con técnicas Insuficiencia medular, 343
concentración, 159 de identificación Intercambiador aniónico, 498
causas de error, 165 celular, 311 Interleucinas, 35
valores de referencia, 164 etapas, 307 Interleucina 3 recombinante, 228
corpuscular media, 28 protocolos, 312 Interleucina 4,34
esquema de la molécula, 155 tipos de sondas, 308 International Committee
fetal (HbF), 463,468 ventajas y limitaciones, 306 for Standardization in
fracción HbA2, 466 Hierro, 390 Haematology, 16
función, 156 detección de pérdidas, 407 International Federation of
en orina, 170 distribución en el organismo, 391 Clinical Chemistry, 3
Hemoglobina M (HbM), 473,474 entrada en el eritroblasto, 394 International Prognostic Scoring
fraccionamiento exceso, 390,410 System, 296
electroforético, 474 medular, 406 International Union of Pure and
Hemoglobinómetro pérdida por vía Applied Biochemistry, 3
de escala de color, 168 digestiva, 407 Intervalo de referencia, 779
HemoCue, 167 urinaria, 408 IRMA, técnicas, 402
Hemoglobinopatía(s), 452,473 pruebas de cuantificación, 412 Islote eritroblástico, 41
detección en recién nacidos, 480 de reserva, 393 ISO, normas, 761
estructurales, 452 valores normales, 400 Isoelectrofocalización, 460,464
ejemplos, 455 Hiperferritinemia, 412 Isoniacida, 79,83
mutaciones y expresividad con cataratas, 423 Isopropanol, 471
clínica, 453 Hiperplasia eritroblástica, 209 Itano, prueba, 476
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J del grupo cooperativo Loa-loa, 756

JAK2,354 francoamericano-británico, Loasis, 748
Jamshidi, trocar, 215 clasificación, 341 Luí, eluido, 641
indiferenciada, 271 Lupus eritematoso sistémico
K linfática, 224 (LES), 646
Katayama, prueba, 174 crónica, 80,300,355,357 Lutheran, sistema, 615
K EL, gen, 610 Binet, clasificación, 355
Kell, sistema, 609 Rai, clasificación, 355 M
Kidd, sistema, 612 linfoblástica M acacus rhesus, 600
distribución de los diferentes aguda (LLA), 271 Macrocitosis, 373
fenotipos, 613 aguda B, 299 Macrófago(s), 39,53
Kleihauer tipo Burkitt, 348 de la médula ósea, 370
método de la resistencia a la linfoides agudas (LLA) Maduración nuclear, 368
elución ácida, 469 clasificación de la OMS, 347 Malaria, 740
tinción, 470 de precursores B, 347 ciclo, 741
Kupffer, células, 39 de precursores T, 348,349 hemoparasitosis, 741
Kx, sistema, 609 mieloide Malonildialdehído, 579
aguda (LMA) b0020,297,344 M ansonella perstans, 757
L clasificación de la OMS, 342 Marchiafava-Micheli,
Laboratorio de hematología, 758 crónica, 24,294,352 enfermedad, 409
acreditación de calidad, 759, prolinfocítica T, 359 Masson, tricrómico, 220
772 promielocítica aguda (LPA) Matuhasi-Ogata, fenómeno, 638
norma ISO 15189:2007,774 hipergranular, 346 May-Grünwald, colorante, 67
certificación de calidad, 759, Leucocitos, 1,45 May-Grünwald/Giemsa
772 neutrófilos desgranulados, 383 colorante, 126
norma UNE-EN ISO valores de referencia, 76 tinción, 67
9001:2008,773 Leucocitosis, 117 causas de error, 68
control interno de la calidad, 760 Leucopenia, principales causas, 118 Medida de la concentración
garantía de la calidad, 762 Levy-Jennings, gráfica, 766 de factores
procesos, 763 de control, 143 madurativos, 440
gestión de la calidad, 760 Lewis, sistema, 614 Médula ósea, 202
principios básicos, 761 Límite(s) de referencia, 778,779 aplasia, 222
sistemas, 760 Línea(s) biopsia, 213
Lactato deshidrogenasa (LDH), 565 linfoide, 42 marcadores, 212
Lactobacillus casei, 440,443 madurativa(s) normal, 220
Lactobacillus leich m a n n ii, 440,441 eritroblástica, 40 estructura general, 203
Laemmli, método, 520 de la hematopoyesis, 36 examen
Large u nstained cells, 139 mieloide, 37 citológico, 207
Lector de microhematocrito, 22,23 Linfoblasto, 42 morfológico, 202
L eish m a n ia , 744 Linfocito(s), 51,91 metástasis de células
Leishmaniosis, 743 grande granulado, 85 carcinomatosas, 211
cutánea, 744 Linfocitosis, 80 normal, 208
mucocutánea, 744 medular, 210 punción aspirativa. Véase
visceral, 743 Linfocitosis B monoclonal, 359 Aspirado medular
LES. Véase Lupus eritematoso Linfoma(s), 333 tipos de células, 204
sistémico (LES) clasificación clásica de Ann Megacarioblasto, 42
Leucemia(s), 333,340 Arbor, 357 Megacariocito, 42,208
aguda(s),211,268 difusos de célula grande B, 361 Megaloblastosis, 434
clasificación estadificación, 357 Membrana eritrocitaria, 496
inmunofenotípica, 271 folicular, 224 electroforesis de proteínas, 519
de la OMS, 338 leucemizado, 87 estructura, 497
criterios de clasificación MALT, 303 permeabilidad al sodio, 528
EGIL de línea, 343 no hodgkiniano, 301,362 pruebas de diagnóstico, 508
de neutrófilos, 77 Linfopenia, 85 trastornos
bifenotípica aguda, 271 Lisosomas, 56 adquiridos, 507
de fenotipo mixto, 270 Litio, 78 congénitos, 501
ERRNVPHGLFRVRUJ
Membranopatías eritrocitarias, 496 Mieloperoxidasa, 247 Neutropenia, 82

2-mercaptoetanol, 227 déficit, 243 crónica idiopática, 84
Metabolismo nucleotídico, 577 Migración transendotelial, 232 medicamentos asociados, 83
Metacromasia, 49 MIGRATEST®, 238 Nomarski, óptica, 55
Metahemoglobina, 171,172 Miller, ocular, 120 Nomenclatura, resultados en
Metamielocito, 38 Minkowski-Chauffard, hematología, 775
MethoCult®, 229 enfermedad, 374 Normas
Método(s) MMSS, sistema, 613 cualitológicas, 772
de aglutinación en placa, 722 Molécula(s) ISO, 761
citogenéticos, 288 de adhesión celular, 232 Núcleos convolutos, 359
para la extracción de sangre, 8 de heparina, 18
agujas, 10 Monoblasto, 38 O
de la impedancia, 129 Monocitos, 53,91 O nchocerca v olvulus, 748
inmunoturbidimétrico, 723 Monocitosis, 80 Oncocercosis, 748
M icroarrays, 310 fisiológica del recién Oncogenes, 304
Microcirculación sanguínea, 2 nacido, 81 Ontogenia del sistema
Microcitosis, 373 M o noclonal a ntibody hematopoyético, 31
hipocroma, 395 im m o b iliza tio n o f Organización genómica del locus
Microfilarias, 749,755 granulocyte antigens Rh humano, 602
Microhematocrito, 20 (MAIGA), 658 Organización Internacional de
Microlanceta estéril desechable, Muestra de referencia, 779 Normalización (ISO), 761
12,13 Multicolor-FISH (M-FISH), 309 Organización Mundial de la Salud
Microperoxisomas, 56 Mutación factor V de Leiden, 736 (OMS), 262
Microsatélites, 335 M ycoplasm a p n e u m o n ia e , 81,634 Osciloscopio, 134
anáfisis, 336 Ovalocitosis, 499
Microscopía N del sudeste asiático, 505
de campo oscuro, 98 N-acetilgalactosamina, 593 Oxalato sódico, 19
electrónica de barrido, 54 NADH-diaforasa (citocromo b. Oxihemoglobina, 157,165
de fluorescencia, 99 reductasa), 575 curva de disociación, 176
Microscopio, 92 a-naftil-acetato esterasa ácida
binocular, 94 (ANAE), 251 P
confocal, 100 a-naftil-butirato-esterasa, 251 Pacientes
cuántico, 103 Naftol-AS-D-acetato-esterasa diabéticos, 10
digital, 103 (NASDA), 250 HIV positivos, 211,214
electrónico, 101,102 Naftol-AS-D-cloroacetato- Paludismo, 383. Véase tam bién
de barrido, 103 esterasa, 252 Malaria
de transmisión, 102 Naranja de tiazol, 151 Parásitos, 740
óptico, 93 National Committee for Clinical Parasitosis intraeritrocitaria, 383
partes, 94 Laboratory Standards, 8 P arvovirus B19,119
objetivo, 94 Negro Sudán, 249 Pasteur, pipeta, 22
ocular, 94 Negro Sudán B, 248 Patrón
platina, 94 Neoplasias citoplásmico (c-ANCA), 649,652
propiedades, 96 de células plasmáticas, perinuclear (p-ANCA), 649,652
Mié 361,363 PCR Purification Kit (QULAGEN),
principio, 372 mieloides, clasificación de la 490
teoría, 138 OMS, 338 Pelger-Huét
Mielemia, 86 mieloproliferativas enfermedad congénita, 345
Mieloblasto, 38 Ph negativas, 296 signo, 89
Mielocito, 38 Neoplasias B maduras, 356 Perfil
Mielodisplasia, 343 Neoplasias T/NK maduras, electroforético normal
Mielofibrosis, 94,355 clasificación de la OMS, en un adulto, 483
idiopática, 223 360 en un recién nacido, 483
Mielograma según Wintrobe, 209 Neubauer, cámara, 109 hematológico, 371
Mieloma, 363 Neutrofilia, 77 Perls, tinción, del aspirado de
múltiple, 361,364 medicamentos asociados, 78 médula ósea, 405
diagnóstico, 364 Neutrófilo segmentado, 38 PHAGOBURST®, 240
ERRNVPHGLFRVRUJ
P hlebotom us, 743 Promegacariocito, 42

Pilas de moneda, 378,379 Prometacina, 83 Radiofrecuencia, 130,131
P in k test, 515 Promielocito, 38 Reacción
Pirimidina-5’-nucleotidasa Promonocito, 38 en cadena de la polimerasa
(P5’N), 567 Propiedades y magnitudes (PCR), 326,727
Piropoiquilocitosis, 503 hematológicas, 775 cuantitativa o a tiempo
congénita (PPC), 380 Prostaglandinas, 670 real, 334
hereditaria, 528 P rotein A ssay L o w ry m em branes etapas, 327
Piruvato cinasa (PK), 554 K it, 521 seguida de digestión con
déficit, 556 Proteína C (PC), 683,719 enzima de restricción
congénito, 554 activación, 685 (PCR-RFLP), 414
Plaquetas, 2,56,92,112 activada, 720 peroxidásica, 139
activación, 666 mecanismo anticoagulante, 686 de retrotranscripción, 330
agentes antiagregantes, 668 vía anticoagulante, 683 Reactivos imprescindibles para la
agonistas solubles liberados, Proteína p55,501 medida de las actividades
669 Proteína PML, 267 enzimáticas, 551
estructura, 666,667 Proteína Rh, 609 Recambio metabólico, 158
reticuladas, 137 Proteína RhAG, 609 Receptor soluble de la transferrina
Plasma, 1,2 Proteína S (PS), 683,719 (RST), 393
componentes, 3,4 Prueba(s) Recién nacidos, 10-12,26
Plasminógeno, 687 con álcali, 174 Recombinación genética
Plasmodio, características de la criohemólisis, 516 en cis, 604
diferenciales de las especies, diagnósticas cerca del paciente, en trans, 603
753 152 Recta de calibración, 164
P la sm o d iu m fa lc ip a ru m , 499,740, directa de la antiglobulina, 629 Recuento(s)
752,757 de estabilidad de la hemoglobina automáticos, límites de
trofozoíto, 754 al calor, 471 tolerancia, 146
P la sm o d iu m knowlesi, 743 al isopropanol, 471 automatizado, causas de error, 147
Pleocariocito, 374 de la fragmentación térmica, 527 celular mediante luz halógena,
Población de referencia, 779 indirecta de la antiglobulina, 630 125
P o in t o f care testing (PCT). Véase de lisis diferencial
Pruebas diagnósticas cerca en glicerol acidificado, 513 de leucocitos. Véase
del paciente de p in k . Véase P in k test Fórmula leucocitaria
Policromasia, 41,381 de la mancha fluorescente, 544 óptico, 76
Polietilenglicol, 639 de la migración leucocitaria, 237 electrónico de plaquetas, error,
Poliglobulia, 116 del nitrato de tetrazolio, 238 148
diferencia con policitemia, 24 del nitroazul de tetrazolio, 235 de reticulocitos, 372
Polimorfonuclear, 38 de la sacarosa, 533 automatizado, 149
eosinófilo, 49 de la t de Student, 149 citograma, 151
neutrófilo, 46,47,88 Pulpejo del dedo, 12 manual, 116,120
Portaobjetos, 60,62 Punción visual, 123
Potencial zeta, 180 capilar, 10 Reed-Sternberg, 357
Preparados polivitamínicos, venosa, 8,9,11 Regla del tres, 145
abuso, 780 sistemática, 10 Reticulocito, 41,540
Price-Jones, curva, 27 Punteado basófilo, 381 recuento. Véase Recuento(s) de
Procesos linfoproliferativos Purina nucleósido fosforilasa reticulocitos
postransplante, 361 (PNP), 577 en sangre, valores de referencia
Productos de degradación de la Púrpura trombocitopénica y variaciones patológicas,
fibrina, 722 autoinmune, 659 123
Proeritroblasto, 40,208 Reticulocitosis, 123,555
Programa(s) Q Reticuloplaquetas. Véase
de control interno de la calidad Quantitative Bufty Coat, 756 Plaquetas reticuladas
(CIC), 142 Queratinocitos, 45 R h-associated glycoprotein, 603
para la evaluación externa de Quimerismo, 335 RIA, técnica, 402
la calidad (PEEC), 72, Quimioluminiscencia, 235,240 Ristocetina, 695
760,768 Quimiotactismo, 233,242 agregación plaquetaria, 698
ERRNVPHGLFRVRUJ
Romanowsky, tinción, 65,70 crónicos, 79,353 S|3-talasemia, 460
panóptica, 46 tipo mielofibrosis idiopática, Tapón
377 hemostático, 666
s mieloproliferativos/ plaquetario, 666
Sahli, método, 166 mielodisplásicos T a qm an
Sanger clasificación de la OMS, 354 sistema, 334
método, 417,734 p-talasémicos, 457 sondas, 733,735
secuenciación, 414,418,428 Síntesis Technicon, 126
cebadores usados, 422,423 de hemoglobina, 369 Tecnología VCS, 136
Schiff, ácido peryódico (PAS), 253 in vitro de cadenas de globina, 484 Tejido
Schilling, prueba, 437,439,451 aminoácidos empleados, 485 hematopoyético, 30
Secuestro Sistema evolución con la edad, 31
de los eritrocitos marcados antioxidante eritrocitario, 542 linfoide, 32
con 5lCr, 199 fibrinolítico, 687 relacionado con mucosas, 34
esplénico, 198 hematopoyético, 32,33 Telómeros, 288
Sediplast®, 183 informático del laboratorio Test
Serie (SIL), 143 de hemólisis en glicerol
eritropoyética, 40 internacional (SI), 777 acidificado, 514
linfoide B, 43 linfoide, 32 de inmunofluorescencia de
linfoide T, 44 monocular fagocítico, 158 granulocitos (GIFT), 654
megacariocítica, 42 mononuclear fagocítico, 394 T h erm u s aquaticus, 327
monocítica, 38 Rh, 625 Thoma, retículo, 107
Seudo-Pelger-Huet, anomalía, 346 vascular, 1 Tiempo
Seudohiperpotasemia, 506 SLC1 i A2, gen, 432 máximo de conservación de la
Seudoplaquetopenia, 144 Sobrecarga férrica, 399,403 sangre total, 15
Sézary, enfermedad, 87 Sociedad Española de de obturación (TO), 692,693
Shewhart, reglas, 760 Hematología, 338 de protrombina, 701
S h o rt ta n d e m repeats. Véase Sociedad Internacional de de reptilasa, 704
Microsatélites Laboratorio de Hematología de sangría, 692
S ide scatter,274 (ISLH), 59 de trombina, 704
Sideremia, 397 Solución de luminol en ácido de tromboplastina parcial
Sideroblastos, 40 bórico, 240 activada, 703,708
en anillo, 370,396,397 Sondas Timo, 32
Sigma Diagnostics Kit, 247 centroméricas, 307 Timocitos, 44
Silver green, 334 de secuencia única, 308 Tinción, 65
Símbolos internacionales de tipo FRET, 731 con azul de toluidina, 49
los sistemas biológicos, 776 Sórensen, tampón, 315 Tornillo macrométrico, 95
Síndrome(s) Stem -cell, 30 Torniquete, 9,10
hipereosinofílico, 78 Stokes, ley, 179 Toxoplasm a gondii, 750
de hiperferritinemia Streptococcus pneum oniae, 454,600 Toxoplasmosis, 750
con cataratas (HHCS), Sulfohemoglobina, 173 Transcetolasa (TK), 572
427 Supervivencia eritrocitaria, 195,198 Transferrina, 391,393
de inmunodeficiencia Susceptometría magnética, 413 capacidad e índice de
adquirida, 85 Sustratos cromogénicos, 699 saturación, 400
linfoproliferativos Sysmex, 127 índice de saturación, 412
crónicos (SLPC), 269,272, sistemas, 136 receptor soluble, 404
300 Translocaciones complejas, 291
de línea T, 272 T Transporte transmembranoso de
maduros, 355 Talasemia(s), 395,452,456 Na+ y K+, 530
mielodisplásicos (SMD), 296, detección en adultos, 478 Trasplante de progenitores
345,349 a-talasemia, 458,460,492 hematopoyéticos
clasificación de la OMS, 350 deleciones, 495 con incompatibilidad ABO
criterios diagnósticos, 350 reacciones paralelas de PCR, 493 mayor, 593
lesiones moleculares, 351 (3-talasemia, 457,490 Trastornos hemorrágicos, 691
mieloproliferativo(s), 349 diagnóstico molecular, 489 Tricoleucemia, 87
clasificación, 351 mayor, 456 Triosa fosfato isomerasa (TPI), 559
ERRNVPHGLFRVRUJ
Tripanosomiasis, 744 Unidad formadora de colonias estructura química, 438

diagnóstico, 747 eritroides, 230 necesidades diarias, 437
Tritón X-100®, 161 granulomonocíticas, 37,231 Volemia, 190
Trombina, 669,678 Unidades, resultados expresión, 195
propiedades en hematología, 775 Volumen
anticoagulantes, 680 Unión Europea (UE), 761 corpuscular medio, 28,371
procoagulantes, 680 sanguíneo, 190
a-trombina, 679 V von Willebrand
Trombo plaquetario, 666 Vacuolas eritrocitarias, 56 enfermedad, 698
Trombocitopenia, principales Vacuolización, 15 factor, 677,694
causas, 119 Valor(es)
Trombocitos. Véase Plaquetas observado, 779 W
Trombocitosis, principales causas, de referencia, 778,779 Waldenstrom,
118 Variabilidad de los resultados, 778 macroglobulinemia, 187
Trombofilia, 691,718,725,726 Variant System de Bio-Rad®, 459 Westergren, pipeta, 182
Trombosis, 665 Velocidad de sedimentación Wintrobe
Tromboxano A2, 669 globular, 179 mezcla, 18
Trypanosoma brucei, 745 analizadores automatizados, mielograma, 209
Trypanosoma cruzi, 746,747 183 tubo, 24
Tubo(s) Westergren, método, 181 Wright
capilares, 20 Wintrobe, método, 182 colorante, 68,315
sellados al vacío, 16 Vena cefálica, 9 tinción, 68
de tapón color Venopuntura, 8 Wuchereria bancrofti, 748
amarillo, 18 Vida media, eritrocitros, 195
azul, 18 Viscosidad plasmática, 186
verde, 17 X
medida, 187 Xerocitosis
violeta, 16 valores de referencia, 190
tipo BD Microtainer®, 13 estomatocítica, 506
Viscosímetro(s) hereditaria, 506
al vacío, 8,9,14 capilar, 187
Türk, líquido, 110 de ejes coaxiales, 188,189
con sistema cono-plato, 188, Y
U 189 Youden, diagrama, 770
Úlcera Vitamina B|2, 434,436
duodenal, 600 absorción intestinal, 449 Z
péptica, 600 déficit, 369 Zimosán-A en suspensión, 241
ERRNVPHGLFRVRUJ
Atlas de citología básica para el laboratorio
clínico
F IG U R A 1. Sangre periférica
norm al con presencia de un
polinuclear neutrófilo, un linfocito,
hem atíes y plaquetas.
F IG U R A 2. Polinuclear neutrófilo.
§>2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos el

ERRNVPHGLFRVRUJ
e2 Atlas de citología básica para el laboratorio clínico
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FIGU RA 3. Polinucleares neutrófilos con apéndices nucleares (“en palillo de tambor”).
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F IG U R A 4. Polinucleares neutrófilos no segm entados (en “banda” o “cayado”).
ERRNVPHGLFRVRUJ
Atlas de citología básica para el laboratorio clínico
F IG U R A 6. Polinucleares eosinófilos.
ERRNVPHGLFRVRUJ
FIGU RA 7. Polinuclear basófilo.
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FIGU RA 8. Linfocito.
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FIGU RA 10. Linfocitos estimulados o virocitos (mononucleosis infecciosa).
F IG U R A 11. Linfocitos atípicos.

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FIGU RA 12. Linfocitos atípicos.
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FIGURA 13. Artefactos.

Atlas de citología básica para el laboratorio clínico e7
FIGURA 15. Alteraciones de los polinucleares en los síndrom es mielodisplásicos.

FIGURA 16. Polinucleares

hipersegmentados (pleocariocitos) en la
megaloblastosis.
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FIGURA 17. Anom alías plaquetarias. Plaquetas gigantes y alteraciones de la granulación.

FIGU RA 19. Eritrocito normal observado mediante microscopio electrónico de barrido y eritrocitos
deshidratados en un caso de xerocitosis hereditaria (“en silla de montar”).
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FIGU RA 20. Reticulocitos teñidos con azul de cresilo brillante (arriba) y macrocitos policromáticos tal
como se observan mediante la coloración de May Grunwad Giemsa (abajo).
FIGU RA 21. Hipocromía en un paciente con anemia ferropenia intensa.

Atlas de o to lo g ía básica para el laboratorio clínico e ll
FIGU RA 22. Macrocitosis y pleocariocitosis en un paciente con anemia megaloblástica.
F IG U R A 2 3 . Esferocitosis hereditaria.
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FIGU RA 24. Microesferocitosis con policromasia y punteado basófilo en un paciente con anemia
hemolítica intensa de origen autoinmune (AHAI).
FIGU RA 25. Esquistocitos (hematíes fragmentados) en un paciente con síndrome hemolítico urémico
(SHU).
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FIGURA 26. Anillos de Cabot (signo de diseritropoyesis o de trastorno de la maduración eritropoyética).
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FIGURA 2 7 . Anisopoiquilocitosis intensa.

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FIGU RA 29. Hematíes falciformes en un paciente afecto de drepanocitosis (hemoglobinopatía S). En la

imagen inferior derecha se observa la falciformación inducida por hipoxia (prueba de Itano).
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FIGU RA 30. Eliptocitos en un paciente con eliptocitosis herteditaría.
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r a FIGU RA 31. Dacriocitos (eritrocitos en forma
r de lágrima o raqueta). En la imagen inferior

derecha, los hematíes se observan en suspensión
con glutaraldehído.
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FIGURA 32. Eritrocitos observados en suspensión a n glutaraldehído y filtro interferencial para apreciar las
vacuolas superficiales (“pits”), cuya presencia indica un mala calidad de la función esplénica o una esplenectomía.
FIGU RA 33. Hematíes en diana o dianocitos (target cells) en un paciente con hemoglobinopatía C
homocigota, intensa esplenomegalia y síndrome hemolítico moderado.
Atlas de citoloqia básica para el laboratorio clínico e !7
__________________
FIGU RA 34. Formas asexuadas del parásito Plasmodiumfalciparum.
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f» « 4
F IG U R A 3 5 . Leucemia mieloide crónica (LMC): leucocitosis, m ielem ia, eosinofilia y basofilia.

e l8 Atlas de citología básica para el laboratorio clínico
FIGU RA 36. Trombocitemia esencial (TE) con intensa trombocitosis.
wqgJ r Jo s.co r
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• :4
FIGU RA 37. Leucemia linfática crónica (LLC). Predominio de linfocitos de aspecto maduro y presencia
de sombras nucleares de Gumprecht.
Atlas de o to lo g ía básica para el laboratorio clínico e !9
• •
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4> • •
* m
5 *. . FIGU RA 38. Leucemia prolinfocítica (LPL).

Predominio de linfocitos con aspecto más inmaduro
que en la leucemia linfática crónica. Algunos muestran
uno o dos nucléolos bien visibles.
I A»
FIGU RA 39. Linfoma leucemizado. Se observan linfocitos en diferentes estadios de diferenciación y

abundantes células hendidas (cleaved cells).
e20 Atlas de d to lo g ia básica para el laboratorio clínico
FIGU RA 40. Células plasmáticas en sangre periférica de un paciente afecto de gammapatía monoclonal
de tipo mieloma múltiple (MM).
FIGU RA 41. Mieloma múltiple. Imagen característica de los hematíes con tendencia a agregarse “en pilas
de monedas”.
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•
FIGU RA 42. Células linfoides características del Síndrome de Sezary en las que se aprecia un plegamiento
especial de la cromatina nuclear que le confiere un aspecto cerebriforme (I).
FIGU RA 43. Células linfoides características del Síndrome de Sezary en las que se aprecia un plegamiento
especial de la cromatina nuclear que le confiere un aspecto cerebriforme (II).
FIGU RA 44. Células linfoides características de la leucemia de linfocitos peludos (tricoleucemia).
FIGU RA 45. Leucemia aguda linfoblástica (LAL).

Atlas de citología básica para el laboratorio clínico e 23
FIGU RA 46. Leucemia aguda linfoblástica de tipo Burkitt (LAL-B).
FIGURA 47. Leucemia aguda mieloblástica (LAM).

Algunas de las células (líneas inferiores) muestra un
“bastón de Auer” (marcador mieloide) (I).
FIG U RA 48. Leucemia aguda mieloblástica (LAM). Algunas de las células (líneas inferiores) muestra un
“bastón de Auer” (marcador mieloide) (II).
FIGU RA 49. Leucemia aguda promielocítica (LAP). La mayoría de las células muestran abundantes
bastones de Auer formando haces de astillas.
Atlas de citología básica para el laboratorio clínico e 25
FIGU RA 50. Leucemia aguda mono I

d iti
m
m
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FIGU RA 51. Leucemia aguda monoblástica

(LAM5) (II).
J É L C
FIGURA 52. Eritroeleucemia (LAM6). Medula ósea e imagen de sangre periférica (imagen inferior derecha).
í , '
iPf.' É
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FIGU RA 53. Eritroleucemia (LAM6). Intensa

positividad de la tinción del ácido peryódico de
Shiff (PAS) en los eritroblastos de médula ósea.
*
* 4#
? FIGU RA 54. Médula ósea normal. Precursores
FIGU RA 55. Médula ósea normal.

Precursores eritroides (eritroblastos
rodeando un macrófago o islote
eritroblástico).
FIGU RA 56. Eritroblastos circulantes (síndrome leucoeritroblástico) e imagen de metástasis neoplásica

de la médula ósea (imágenes inferiores).
Indice de vídeos
Loa loa 40x

Loa loa lOx (1)
Loa loa lOx (2)
Mansonella perstans 40x (1)
Mansonella perstans lOx (1)
Oncocerca (1)
Oncocerca (2)
Oncocerca (3)
Trypanosoma cruzi (1)
2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos

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M anual de técnicas de laboratorio

Joan Lluís Vives Corrons

Josep Lluís Aguilar i Bascompte

ELSEVIER A m sterd a m B arcelona B eijing B o sto n Filadelfia L ondres

Fotocopiar es un delito (Art. 270 C.P.)

ISBN (versión impresa): 978-84-458-2147-3

Depósito legal (versión impresa): B.2.475 - 2014

Coordinación y producción editorial: G ea C o n s u l t o r ía E d it o r ia l , s . l .

Josep Lluís Agu ilar i Bascom pte Josep E Nomdedéu

Eduard M uñiz D íaz

V era Adem á Rosa M ontero

Isabel Besson M aspla Roser Navarro García

Montserrat Borrell N ú ria Nogués

Me enorgullezco de pertenecer a una generación de personas que hemos sido capaces de

En resumen, como ya m encionábamos en ediciones anteriores, seguimos creyendo

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20 Una visión práctica de los grupos sanguíneos eritrocitarios 587

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2014. Elsevier España, S.L. Reservados todos los derechos 1

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M étodo del m icrohem atocrito

contienen heparina a la concentración de 2 UI y una franja roja en uno de sus ex