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Facultad de Química
Química Analítica Instrumental II
Técnicas Cromatográficas
Diciembre de 2007
Introducción a los métodos de separación
Capítulo 1.
Introducción a los métodos de separación
Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos
cromatográficos según el estado físico de la fase móvil:
Capítulo 1 1
Introducción a los métodos de separación
Cromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase
estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte
(cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única
manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna
puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase
estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo
(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puede
clasificar en los siguientes tipos:
Capítulo 1 2
Introducción a los métodos de separación
La cromatografía en papel es una técnica utilizada para análisis inorgánico cualitativo, permite llevar
a cabo la separación e identificación de iones, trabajando con cantidades mínimas de sustancia.
Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se fundamenta en que las sustancias problema,
pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno
permanece fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil
constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos
de cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de
separación de zonas y sectores.
Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas
manchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una
lámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en cromatografía sobre papel se
emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia
por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por
la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S).
𝑋
𝑅𝑓 = 𝑆
[1]
En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de
elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la que
irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los componentes
que se pretenden separar.
Capítulo 1 3
Introducción a los métodos de separación
aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso
también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un
componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que
los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos
cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El
tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el
cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea
un método adecuado para fines analíticos.
Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del
adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se
le puede añadir un adherente.
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y
probar con eluyentes cada vez menos polares.
Capítulo 1 4
Introducción a los métodos de separación
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con
los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo
con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los
componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el
tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.
Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y son
arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de “cama
de vacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque
tiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los poros que tienen
accesibles. Las moléculas de tamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la
cantidad de poros por los que puedan pasar.
Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos están
los polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “poro
controlado”. Los materiales semirígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso
ya que se limitan a una presión de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen
un tamaño usual de 5µm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son
compatibles con sistemas no acosos.
Capítulo 1 5
Introducción a los métodos de separación
Otro tipo de empacamiento hidrofílico poroso es preparado mediante una polimerización por
suspensión de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten
presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes
orgánicos polares.
Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de
muestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, puede ser
hecho fácilmente mediante el uso de una columna de exclusión aniónica. El uso de las columnas de
exclusión aniónica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separación de oligosacáridos
usando agua como eluyente a una temperatura de 90ºC, aplicando también la separación por exclusión
estérica.
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene
grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazados
permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más
común es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el grupo cargado de la
fase estacionaria.
Capítulo 1 6
Introducción a los métodos de separación
ácidos fuertes cuando está en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el
intercambio con especies aniónicas. Los más comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son
fuertemente básicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos
funcionales están totalmente disociados. Así, sus propiedades de intercambio son independientes del pH
de la fase móvil.
La cromatografía de intercambio iónico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de
empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor,
sobre una cuenta de vidrio con diámetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen
recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de sílice en el que se impregna o
enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja:
0.01- 0.1 meq/g.
El intercambiador puede también estar enlazado a macropartículas de sílice por medio de reacciones de
sililación o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso.
resina, H + K+ resina, K+ + H+
Las diferencias de retención están gobernadas esencialmente por las propiedades físicas de los iones
solvatados. La fase de resina presenta preferencia por:
Los cationes inorgánicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietéticos bajos
en sodio, y en muestras de orina.
Se pueden separar los ácidos HCN, carbónico, silícico y bórico de los ácidos fosfórico, sulfúrico y
clorhídrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.
Capítulo 1 7
Introducción a los métodos de separación
Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre
las características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido.
Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos con las de gases y líquidos. (Los datos sólo
indican el grado de magnitud).
Coeficiente de difusión (cm2/s) (1-4) * 10-1 10-3 – 10-4 (0,2 – 2)* 10-5
Viscosidad (g cm-1 s-1) (1-3)* 10-4 (1-3) * 10-4 (0,2- 3)* 10-2
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografía de gases,
líquidos y fluidos supercríticos, así como la extracción de fluidos supercríticos. Una propiedad importante
de los fluidos supercríticos, que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su
notable capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles. Por ejemplo, el dióxido de carbono
supercrítico disuelve fácilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 átomos de carbono. Una segunda
propiedad notable de los fluidos supercríticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser
fácilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la
atmósfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercríticos es que son
baratos, inocuos y no son sustancias tóxicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la
atmósfera sin efectos ambientales dañinos.
Capítulo 1 8
Introducción a los métodos de separación
compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las técnicas espectroscópicas o
electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos.
Los equipos instrumentales para la cromatografía de fluidos supercríticos son bastante parecidos
en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos
diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y
además proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase móvil; (2) un restrictor o un
dispositivo de contrapresión, que se utiliza para mantener la presión en la columna en el nivel deseado y
para convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector.
Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque
las primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de sílice fundida
con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas
tienen una longitud de 10 a 20 m y un diámetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la película varía
entre 0.05 1 micrómetro.
Fases móviles. La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de
moléculas orgánicas no polares. Además, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no
tóxica, fácilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases móviles cromatográficas.
La temperatura crítica del CO2 ES 31° C y su presión crítica 72,9 atmósferas, lo cual permite jugar con una
banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operación de un equipo de
HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, óxido nitroso, diclorodifluorometano, éter dietílico,
amoníaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases móviles de cromatografía de fluidos
supercríticos.
Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la
cromatografía de gases, detectores de ionización de llama. Este detector es de respuesta universal a
compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad. Los espectrómetros de masas también se pueden
Capítulo 1 9
Introducción a los métodos de separación
adaptar como detectores más fácilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de
absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de
llama.
Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beige
unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero.
Capítulo 1 10
Introducción a los métodos de separación
1.10 Electroforesis
Los orígenes de ésta técnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logró separar
mezclas de proteínas (micelas cargadas eléctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso
al que se aplicaba un campo eléctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separación de cualquier
especie cargada o alrededor de una doble capa eléctrica.
Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que
son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente
escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han
utilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice, etc.
Capítulo 1 11
Introducción a los métodos de separación
Electroforesis capilar
La sección transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drástica al realizar
la electroforesis en el interior de un tubo capilar de diámetro interno menor a 0.1mm y una longitud de
50cm a 1m. Es efectivo llevar de ésta forma la técnica porque la resistencia eléctrica de la disolución es
tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes más altos sin
calentamiento excesivo. La técnica tiene gran poder de resolución y se han desarrollado métodos para
llevar a cabo la electroforesis incluso en moléculas neutras no iónicas.
Además, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual
modo que en una cromatografía en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de
muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y después de la separación, cada uno de los
analitos está en volúmenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños, muy pocos
métodos de detección se pueden usar eficazmente.
چ Braithwaite, A. Métodos cromatográficos, 4ª ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Páginas 216-
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چ Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jesús Hernández Méndez, Química Analítica
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چ Lehninger, Albert. L. Principios de Bioquímica. Segunda Edición. Ediciones Omega. Barcelona, 1995,
pp 137
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Introducción a los métodos de separación
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Español. Editorial McGraw Hill S.A. España
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Editorial McGraw Hill. México
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2001, págs.: 785- 791 y 831- 836.
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m
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چ http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel
http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml
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Parámetros cromatográficos
Capítulo 2
Parámetros cromatográficos
2.1 Glosario
Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un
separador de banda.
Banda: Es una situación ideal, es una distribución gausiana. La cantidad de compuesto que sale de
cromatografico o de una columna electroforética.
Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribución de un soluto entre dos fases,
para definir el coeficiente de partición solo se utiliza una forma de un soluto (kD).
Cola: prolongación final de un pico cromatográfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy
activos en la fase estacionaria.
Constante de disociación: constante de equilibrio de una reacción en la que un complejo metal- ligando
se disocia para formar un ión metálico libre y un ligando (kD).
Constante de equilibrio: K’ Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor
numérico de K’ depende de la fuerza iónica del medio.
Cromatografía: separación en la que los solutos se distribuyen entre fase móvil y estacionaria.
Cromatograma: registro de la señal de detección en función del tiempo de elusión o del volumen.
Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatográfico, se suele
expresar en términos de la altura H, de los platos o del número N de platos teóricos. En la medida en que
la distribución del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos está dada por la varianza
dividida entre la longitud de la columna del empacado.
Capítulo 2 14
Parámetros cromatográficos
Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k’).
Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad
de la columna para uno de ellos (α).
Factor de separación: medida de la eficacia de una separación en lo que se refiere a la separación entre
el analito y el interferente.
Número de platos teóricos: característica de una columna cromatográfica que se emplea para medir su
eficiencia.
Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una
columna, como si estuviera compuesta de pequeñas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto
entre las fases móvil y estacionaria
Relación de distribución: cociente que expresa la concentración total de soluto en una fase en relación
con una segunda fase; en su definición participan todas las zonas del soluto (D).
Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a través de la columna.
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Parámetros cromatográficos
Un parámetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso,
una operación o un resultado. La parametrización de datos en cromatografía, como en otros métodos
facilita la tabulación y la comunicación de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posición y la
resolución de las bandas de una cromatografía. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con
descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separación.
Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un
fenómeno de distribución, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases.
De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La
constante asociada es la llamada constante de distribución, que se define para un soluto A como:
𝐴 1
𝐷𝐴 =
𝐴 2
La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia
de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas
según su coeficiente de distribución. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con
polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribución distintos, la retención será diferente para
cada uno.
El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retención
ajustado o corregido, t’R.
t'R = tR – to
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Parámetros cromatográficos
Una medida conveniente y útil de la retención del soluto está dada por el factor de capacidad (o
factor de retención), k’
𝑡´𝑟
𝑘´ =
𝑡0
FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retención diferentes, así como el tiempo muerto.
En los modos de retención de cromatografía se tiene: k’ > 0, que significa que no hay bandas
eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es útil expresar el tiempo de retención o el volumen en
términos del factor de capacidad, k’.
tR = to (1+ k’)
VR = Vm (1 + k’)
La retención del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan
afectar a la misma. El fenómeno de adsorción depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea ésta
se fomentará la desorción, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del análisis.
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Parámetros cromatográficos
α = k2 / k1
3) La temperatura.
FIG. 2. Separación de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografía de líquidos .
Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una de las
cuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas
zonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una
columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El
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Parámetros cromatográficos
valor numérico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La
altura del plato está relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de
la columna, X:
σ2
𝐻=
X
donde σ es un estándar de desviación de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simétricos la
anchura de la base es igual a 4σ y la anchura del pico al punto de inflexión, ωi es igual a 2σ. Por lo tanto
el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.
𝐿 𝐿∗𝑋
𝑁= = 2
𝐻 σ
Si consideramos la posición del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ω,
obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con más pendiente del pico, es igual a 4σ, la
ecuación anterior se convierte en
16 ∗ 𝐿2
𝑁=
W2
𝑡𝑅 2
𝑁 = 16
𝑊
La medición del ancho del pico es más confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico,
con lo cual se puede utilizar
2
𝑡𝑅
𝑁 = 5.545
𝑊1/2
2
𝑡𝑅
𝑁 = 2𝜋
á𝑟𝑒𝑎
𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎
Es importante que tanto 𝑡𝑅 , W ó W1/2 ó á𝑟𝑒𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 se expresen en las mismas unidades ya
que N es adimensional.
Capítulo 2 19
Parámetros cromatográficos
Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de película delgados y
columnas de poco diámetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la
fase móvil también afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad óptima para obtener el
máximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de éste para no perder demasiado
tiempo en análisis.
𝐴+𝐵
𝐻=
𝑣+𝐶∗𝑣
B representa la difusión axial, la cual depende de la movilidad de las moléculas en las fases. El
soluto se difunde desde la zona central que es la más concentrada hacia las regiones más diluidas. En
esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el término
A. Para encontrar la velocidad óptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en función
de v.
Por último, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario éste término porque en
realidad los fenómenos que ocurren están fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase
móvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las moléculas de
analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la
transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.
2.7 Resolución
La separación relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolución, Rs. La resolución se define
como
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Parámetros cromatográficos
𝑡2 − 𝑡1
𝑅𝑠 =
1
(𝑤 + 𝑤2 )
2 1
Fig 3. Separación de dos bandas como una función de la resolución (Rs) y el tamaño relativo de banda.
Una resolución pobre puede deberse a que el método utilizado no es apropiado, pues no
discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporción a la columna cromatográfica.
Capítulo 2 21
Parámetros cromatográficos
Para llevar a cabo un análisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables,
tanto para la construcción de la curva de calibración como para el tratamiento del analito mismo.
Primero es necesario llevar a cabo un análisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones
óptimas. Para evaluar esto, se calculan los parámetros cromatográficos de cada ensayo que sirven como
referencia. De ésta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones
posibles, acercándose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo más exactos que ésta técnica
nos permite.
Si no se obtiene una buena resolución, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de
muestre, sino puede probarse utilizando una fase móvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra
fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo,
y analizar la naturaleza química de las distintas fases así como solutos, para probar con otra fase sea
estacionaria o móvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operación mejor, y que una vez
encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse.
Para realizar la curva de calibración puede usarse el método de estándar externo o interno,
siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operación.
2.9 Resumen
Los parámetros cromatográficos son claves para el diseño de un análisis, pues son herramientas
que ayudan a evaluar las condiciones en las que se está llevando a cabo.
Cada soluto tendrá asociado un tiempo de retención distinto que se puede expresar como el
factor de capacidad, y la relación de los tiempos de retención o factores de capacidad de los solutos nos
indicará si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolución se podrá evaluar si la separación
entre los tiempos de retención se los solutos es suficiente o excesiva. El cálculo de los platos teóricos nos
indicará la eficiencia del sistema.
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Parámetros cromatográficos
2.10 Bibliografía
Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Química UNAM,
México 2002
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-
14/skoog/26d.html
Capítulo 2 23
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Capítulo 3
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Fig 1. Representación esquemática de una separación cromatográfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad
que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna más tiempo.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena
con partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de las
columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil.
Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase
estacionaria cubriendo las paredes interiores.
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial,
inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varían,
entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (más empleado en CG), alúminas, resinas de
intercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo, éste debe de someterse a un
tratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es característico que
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Cromatografía en fase líquida a columna abierta
el tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo más uniforme posible. El procedimiento del
empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos:
2. Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del
cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia.
Para el caso específico de cromatografía de adsorción, existe una ordenación de los disolventes de
acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie
eluotrópica. La fuerza eluyente es una medida de energía de adsorción del disolvente, supuesto valor
cero para el sistema pentano/sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
respecto a la sílice en cromatografía de adsorción.
Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la
columna.
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Cromatografía en fase líquida a columna abierta
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un
disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una
elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,
produciendo un gradiente continúo.
Fig 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción con los puntos activos
de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más fácilmente se desplaza el soluto.
Estas son dos técnicas de análisis cromatográfico, la diferencia entre ellas es que la retención del analito
en la columna depende de la naturaleza de su interacción con la fase estacionaria.
En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito,
con la fase estacionaria, en la de absorción, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de
partición de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.
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Cromatografía en fase líquida a columna abierta
La absorción es un fenómeno de superficie, por lo tanto físico, en el cual diversas sustancias son
atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie
interfacial, formándose una película del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea
sólido o líquido, aunque este proceso implica una interacción de diferentes fuerzas, sean estas físicas o
químicas, por ello se habla de fisisorción, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es
solo física, y quimisorción, cuando la retención implica enlaces con el adsorbente. Así pues, en la
cromatografía de adsorción, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si
es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el
analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen.
Durante la separación, se filtra una solución a través de una columna de adsorbente, que es la
fase móvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria sólida, formando una “cama” de
partículas que se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, o sea, se distribuyen a lo largo
del sólido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorción.
El equilibrio entre la fase estacionaria y móvil permite la separación del analito. Si vemos la
ilustración de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la
fase sólida, los huecos en ella son los sitios de absorción, donde el analito interacciona con la fase
estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque
generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de
magnesio.
Capítulo 3 Página 27
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Aplicaciones. Esta es una de las técnicas cromatográficas mas antiguas, su uso depende del
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en particular se usa para la
separación de compuestos isoméricos, especies no polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestos
con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes, por ello es utilizada para
separar azúcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas así como oligosacáridos, y también
se ha usado para obtener proteínas biliares.
Esta técnica se basa en la retención del analito en una columna sólida como granos de fibra o
cualquier otro material inerte químicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente
afín al analito; y una fase móvil liquida o gaseosa; cuando la fase móvil pasa a través de la columna, el
equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al
final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase
móvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los círculos, alrededor de los cuales hay una
capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,
donde este se disuelve.
Las moléculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la móvil, a esto se le llama
partición puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoquímica del sistema, entre
las dos fases. La retención depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la
matriz sólida, y de que tanto la fase móvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el
analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa
Capítulo 3 Página 28
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
de solvente adherida a la matriz sólida, y como vemos también, el analito se distribuye entre la capa de
solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta
sobre una columna, por ello se le llaman partición de columna.
Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene
diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separación del analito de la mezcla
se logra por migración diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la
columna, el reparto en esta será mayor que en la fase móvil.
Aplicaciones. Esta técnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o líquidos
inmiscibles.
La separación basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga
durante una migración osmótica a través de geles. La filtración en gel es el método de separación que
consiste en la separación de moléculas basado en el tamaño relativo de las mismas.
En la cromatografía en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimérica cuyos poros se
llenan con el solvente que se usará en la fase móvil.
El flujo de la fase móvil provocará que moléculas mayores pasen a través de la columna
libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas más pequeñas tardarán más tiempo en
salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen
de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.
Capítulo 3 Página 29
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del líquido afuera de la matriz de gel
(V0, volumen de la fase móvil que eludirá a una molécula completamente excluida ), el volumen del
líquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).
Kd caracteriza el comportamiento de retención del soluto. Representa la fracción del volumen del gel
que es accesible a la molécula en cuestión. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una
serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:
En un rango pequeño de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una línea recta:
K d A B log M
La separación por cromatografía en gel está influenciada por las propiedades de los poros de la
red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material
para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polímeros
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente
suave. Los aerogeles son sólidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el
vidrio y silica porosos. El nombre de los geles más comúnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel
Capítulo 3 Página 30
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Las resinas cambiadoras de iones están constituidas por una red tridimensional de cadenas
polímeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase
insoluble con sitios iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se
mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condición de
que se mantenga la electroneutralidad. Una resina típica se prepara por polimerización de estireno y
divinilbenceno.
Cambiadores catiónicos. Los grupos funcionales ácidos se pueden introducir fácilmente, tienen el
protón disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones
positivos.
Cambiadores aniónicos. Si se introducen grupos funcionales básicos, la resina intercambia aniones. Los
cambiadores aniónicos se preparan con aminas, obteniéndose in grupo amonio, y por tanto, un medio
básico.
Capítulo 3 Página 31
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
K [ HR]
KD
[H ]
Efecto del pH del eluyente. La carga eléctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir
por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relación de distribución o evitar un
intercambio total. El efecto del pH sobre la elusión:
Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metálicos dando iones complejos
de carga negativa. En esta forma, los cationes metálicos que se separen mal en cambiadores catiónicos,
se pueden complejar y separar en cambiadores aniónicos.
Separación de aminoácidos. La naturaleza anfótera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o
eliminar la carga neta, de modo que un ácido determinado se puede intercambiar en una resina
aniónica, en una resina catiónica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solución.
Capítulo 3 Página 32
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
a) Ligandos: Se trata de biomoléculas que se encuentran en una base sólida, siendo estas las
responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2
maneras: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y
los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las
lectinas y nucleótidos.
b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe
poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carácter suficientemente
hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica,
en especial para trabajar a alta presión, estos soportes generalmente geles orgánicos derivados de los
polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
Capítulo 3 Página 33
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Es un método cromatográfico, el cual nos permite separar de una manera rápida, fiable y económica;
principalmente utilizada para la separación y purificación de proteínas.
La Cromatografía Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la
separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez.
El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuración de las columnas (variables por el
usuario), una bomba peristáltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiación
ultravioleta para detectar las biomoléculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de
elusión, las válvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyección de la muestra, la selección
de la columna o corriente de inversión, y un controlador con una función de integración
computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el análisis.
depuración de grandes cantidades de diferentes biomoléculas (es decir, las proteínas y el ADN).
2.14 Resumen
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con
partículas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho
con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de
dos sencillos pasos: a) colocación de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)
Verificación de compactación (no espacios vacíos).
El desplazamiento de la muestra a través de la columna, depende de la afinidad por ésta y del disolvente
empleado para el proceso.
Capítulo 3 Página 34
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
La elución es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos
de elusiones: Elusión por gradiente (cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de
aumento de fuerza eluyente) y elusión isocrática (un solo disolvente).
Cromatografía de partición de columna: sta técnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una
columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente químicamente similar al analito, en el que este
queda disuelto y retenido cuando pasa la fase móvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases,
en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna.
Cromatografía en gel: consiste en la filtración en gel que consiste en la separación de moléculas basado
en el tamaño relativo de las mismas. El flujo de la fase móvil del sistema provocará que moléculas
mayores pasen a través de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas
más pequeñas tardarán más tiempo en salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el mismo.
Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.
Cromatografía Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la
separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una técnica muy utilizada en el área de
bioquímica ya que nos permite separar biomoléculas y proteínas.
Capítulo 3 Página 35
Cromatografía en fase líquida a columna abierta
2.15 Bibliografía
BERMEJO, F. - Química Analítica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma
edición, Madrid 1991.
HARRIS, D. - Análisis Químico Cuantitativo - Ed. Reverté - 2ª edición - España, 2001.
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Química Analítica - 7ª ed - McGraw Hill – México, 2001.
ROUESSAC - Métodos y técnicas instrumentales modernas. Análisis Químico - McGraw Hill – USA, 2003.
SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosíntesis and Functions - Addison-Wesley - New
York, 1975.
PECSOK, Robert – Métodos Modernos de Análisis Químico – Editorial Limusa – México, 1981.
BRAITHWAITE, SMITH – Chromatografic Methods – 4° edición - Chapman & Hall – UK, 1994.
http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm
http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf
http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf
http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm
www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm
Capítulo 3 Página 36
Cromatografía de gases
Capítulo 4
Cromatografía de gases
Esta técnica permite el análisis rápido y exacto de gases, vapores líquidos; permite identificar los
componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado
notablemente en separación, identificación y determinación de compuestos volátiles (gases y líquidos)
de puntos de ebullición de hasta 350-400°C. El método tiene las ventajas de ser sensible, rápido y
sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra información cuantitativa exacta con cantidades
muy pequeñas de muestra.
En la cromatografía gas sólido se produce la retención de los analitos de una fase estacionaria
como consecuencia de la absorción física. La cromatografía gas sólido ha tenido una aplicación limitada
debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de
elusión con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de absorción),
de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas
especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografía gas líquido se basa en la distribución del
analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquido inmovilizada sobre la superficie de un sólido
inerte.
4.1 Instrumentación
Los componentes básicos de un instrumento para la cromatografía de gases se muestran a
continuación, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposición se utiliza
cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la
presencia de las moléculas de analito.
Capítulo 4 37
Cromatografía de gases
Gas portador. Entre los gases portadores deben ser químicamente inertes, se encuentran el
helio, nitrógeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de
presión, manómetros y medidores de caudal. Además el sistema de gas portador contiene a menudo un
tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente
mediante un regulador de presión de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algún tipo de
regulador de presión o regulador de flujo instalado en el cromatógrafo.
sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un <tapón> de vapor, la inyección lenta de la
muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolución .El
método mas común de inyección de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una
muestra liquida o gaseosa a través de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cámara de
vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara demuestra normalmente esta
unos 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra.
Capítulo 4 38
Cromatografía de gases
excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas
abiertas más eficaces y rápidas. Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 hasta 50m de
longitud o más. Están construidas con acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón.
Sistemas de detección. El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes
características.
1.- adecuada sensibilidad
2.- buena estabilidad y reproducibilidad
3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud
4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos
400°C
5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal
6.-alta fiabilidad y manejo sencillo
7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente
predecible para uno o más tipos de soluto
8.-no destructivo de la muestra.
Resolución (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolución de la columna y
que se denomina resolución de la columna y se define:
2 𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1
𝑅𝑠 =
𝑊𝑏1 + 𝑊𝑏2
2 𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1
𝑅𝑠 =
𝑊
Para los picos que están próximos entre sí Wb1 y Wb2 serán lo suficientemente parecidos como
para que baste medir sólo uno.
Capítulo 4 39
Cromatografía de gases
Como lo muestra la figura, la resolución 1.5 nos da una separación prácticamente completa de
los solutos, mientras que una resolución de 0.75 no lo hace. A una resolución de 1, la zona X contiene
casi 4% de Y y viceversa, a una resolución de 1.5 la superposición es de aproximadamente 0.3%. Para el
mismo tipo de empaque, la resolución puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto
aumentando el número de platos teóricos.
Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con un
diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia está en torno a 1.000-2.000
(platos teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, máximo 10 componentes. La
columna está rellena de un material sólido (soporte), finamente dividido y homogéneo; recubierto, por
una capa de 0,05-1 μm de espesor, de fase estacionaria líquida. Está configurada en forma helicoidal, con
un diámetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado
Capítulo 4 40
Cromatografía de gases
Inercia química.
Los valores del factor de capacidad (k´) y del factor de selectividad (α) de los analitos deben estar
dentro de los intervalos aconsejados.
Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las
compuestas por poliéster son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separación, los
alcoholes, ácidos y aminas son polares; los ésteres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y
son de baja polaridad los hidrocarburos saturados.
Otro factor a tener en cuenta son los límites de temperatura que puede soportar la fase
estacionaria, el límite inferior será el punto de fusión o temperatura a la que la viscosidad de la fase
líquida es muy elevada, lo que haría disminuir la eficacia. El límite superior es la temperatura a la que la
o
presión de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullición) por encima de esta
temperatura se produce arrastre de la fase líquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,
suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna.
En una fase líquida cualquiera, una serie homóloga se eluye según orden creciente de número de
átomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen según orden creciente de punto
de ebullición. En una fase polar se retendrán más los solutos polares que los no polares a igualdad de
puntos de ebullición.
Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte sólido empleado en las
columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase
líquida en forma de película muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase
móvil y fase estacionaria.
2
Las características de los soportes sólidos son, una elevada superficie específica (1m /g); una
superficie homogénea; estabilidad térmica; geometría adecuada; baja dispersión de tamaño de las
partículas, entre 150-250 μm; dureza mecánica; inercia química y naturaleza porosa.
Capítulo 4 41
Cromatografía de gases
Los soporte, más generalizados, son los de silíceo como las tierras de diatomeas o sintéticos; de
vidrio y de polifluorocarbonados (teflón). Los soportes de diatomeas están constituidos por residuos de
algas unicelulares diatomáceas que se unen formando filamentos.
Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen
2
una superficie específica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhídrido silícico SiO (90%),
2
o
tratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb
W de superficie poco adsorbente por lo que es muy útil para separar compuestos polares.
Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,
tiene mayor resistencia mecánica y superficie específica que el anterior, pero es muy activo y no se
puede utilizar con compuestos polares.
Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de sílice fundida, en las
columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado
picos cromatográficos distorsionados.
Se ha demostrado que este fenómeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la
superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las moléculas orgánicas
polares. Este proceso puede desactivarse por sililación con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el
2 3 2
Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos básicos: WCOT,
de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto.
Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto
con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte
interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de
relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a
las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última, ya que en su fabricación se emplean mayores
cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en
primer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columnas tubulares
abiertas de sílice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de sílice especialmente pura, sin
Capítulo 4 42
Cromatografía de gases
apenas contenido de óxidos metálicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo
proceso de obtención del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede
enrollarse con un diámetro de unos pocos centímetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de
2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con diámetros de
10 a 30 cm, dependiendo del tamaño del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja
reactividad, resistencia física y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clásicas.
Las columnas FSOT tienen diámetros internos variables, entre 250 y 320 μm y 150-200 μm para
columnas de alta resolución. Estas últimas requieren menor cantidad de analito y un detector más
sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con diámetros de
hasta 530 μm, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores
prestaciones.
En estas columnas existe un problema debido a la adsorción del analito sobre la superficie de la
sílice fundida, adsorción debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertemente
con moléculas polares orgánicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por
sililación con DMCS. La adsorción debida a los óxidos metálicos se ve paliada en gran parte por la elevada
pureza de la sílice empleada.
Capítulo 4 43
Cromatografía de gases
Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamaño de
poro depende del tipo de catión presente. Los preparados comerciales de esos materiales están
disponibles en tamaños de partícula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican según el
diámetro máximo de las moléculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices moleculares
comerciales ser encuentran con tamaños de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las moléculas más
pequeñas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las partículas donde tiene lugar la
adsorcion, para estas moléculas el área de la superficie disponible es enorme cuando se compara con el
área disponible para las moléculas más grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para
separar las moléculas pequeñas de las grandes.
Las bolitas de los polímeros porosos de tamaño uniforme se fabrican a partir de estireno
polimerizado con divinilbenceno. El tamaño de poro en estas bolitas es uniforme y se controla por el
grado de polimerización. Los polímeros porosos han encontrado una gran aplicación en la separación de
especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrogeno, óxidos de nitrógeno, agua, dióxido de
carbono, metanol y cloruro de vinilo.
Capítulo 4 44
Cromatografía de gases
En la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicación característica de una columna
abierta revestida con un polímero poroso (columna PLOT).
4.4 Aplicaciones.
Se sabe que los ácidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDL
en sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de ácidos grasos trans aumenta el riesgo de
enfermedad cardiovascular. La aumentada preocupación por los ácidos grasos trans requiere de
métodos precisos y convenientes para el análisis de productos comerciales.
Existen varios métodos analíticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como los
métodos del AOAC (Asociación Oficial de Químicos Agricultores) y AOCS (Asociación Americana de
Químicos y Aceites) (por sus siglas en inglés).
A pesar de que el método de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: un
tiempo de análisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificación de
los picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos económicos
debidos a el uso de un estándar caro.
Por lo tanto debe buscarse un método más conveniente de GC, particularmente para el
propósito de control de calidad.
Capítulo 4 45
Cromatografía de gases
1
Método 1 Método 2 Método 3
TM TM
Columna TC- 70 (GL- Science) SP-2560 (Supelco Inc.)
Fase estacionaria bis cianopropilsiloxano polisilfenileno bis cianopropil polisiloxano
Longitud 30m 60m 100m
Diámetro interno 0.25mm 0.25mm
Grosor de película 0.25μm 0.20μm
2
Temperatura 190ºC 180ºC
Inj/Det 250ºC/260ºC 250ºC/250ºC
Gas acarreador 1 ml/min Helio 1 ml/min Helio
Split 100:1 100:1
3
Volumen inyectado 1μl 1μl
Tiempo de corrida 18min 40 min 74min
Tabla 1. Ejemplo del trabajo hecho por Shirasawa y colaboradores para encontrar un mejor método de
determinación de ácidos grasos trans
Por otro lado, derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi(MDA), 3,4 -
metilendioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4- metilendioximetilanfetamina (MDMA) constituyen un grupo
de estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del comportamiento bien
identificados. El abuso de estas drogas es especialmente problemático entre la población joven y a pesar
de que las intoxicaciones agudas han sido ampliamente documentadas el potencial de toxicidad por
lapsos mayores de tiempo para el sistema nervioso es el tema de muchas controversias. MDMA se
excreta en la orina generalmente sin cambio alguno junto con otros derivados de las anfetaminas como
HHMA, HHA, HMMA y HMA.
Capítulo 4 46
Cromatografía de gases
Tabla 2. Ejemplo del trabajo de Pirnay y colaboradores en la cuantificación de derivados de anfetaminas en orina
por GC-MS
4.5 Resumen
En el caso de la cromatografía de líquidos, los parámetros dependen del poder del eluyente (la
polaridad de este); para la cromatografía de gases, los parámetros dependen de la temperatura a la cual
se esté trabajando y del flujo del gas de arrastre.
Las partes esenciales de un equipo de cromatografía son: fuente de gas portador, sistema de
regulación de caudales, bloque termostatado de inyección de las muestras, columna termostatada,
detector termostatado, con amplificador de señal y registro gráfico y caudalímetro de precisión.
4.6 Bibliografía
http://www.upct.es/~sait/_sit/html/recursos_masas_y_gases.htm
http://instrumental.uprh.edu
BERMEJO, Francisco. BERMEJO, Pilar. BERMEJO, Adela. Química Analítica generla, cuantitativa e
instrumental. Vol. 2. 6ta. Edición. Ed. Paraninfo. Madrid 1991.
SKOOG, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Análisis Instrumental,Madrid: McGraw-Hill.
Pirnay et al. Sensitive Gas Chromatography – Mass Spectrometry Method for Simultaneous
Measurement of MDEA, MDMA, and metabolites HMA, MDA, and HMMA in human urine. Drug
Monitoring and Toxicology. Clinical Chemistry 52:9. 1728-1734. (2006).
Shirasawa et al. A Rapid Method for Trans- Fatty Acid Determination Using a Single Capillary GC
.Journal of Oleo Science. J. Oleo Sci. 56 (2) 53- 58. (2007)
Rubinson, Kenneth. Analisis Instrumental. Editorial Pearson Education, Madrid 2001. pps 680-
700.
Capítulo 4 47
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Capítulo 5
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La cromatografía es un método físico de separación, basado en la distribución de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra móvil. En cromatografía
líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase
estacionaria. La cromatografía líquida se lleva a cabo en una columna de vidrio. Después se coloca la
muestra por la parte superior y se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la
gravedad. Para aumentar la eficiencia en las separaciones, en la cromatografía de alta resolución; el
tamaño de las partículas de fase fija se disminuye hasta los micrones, usando altas presiones para lograr
que la fase móvil pueda fluir.
Partición Líquido Líquido Adsorbida en un sólido poroso sostenido en una columna tubular
Capítulo 5 48
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Es la técnica más usada para la separación de compuestos orgánicos neutros, es adecuada para
compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. Se basa en la afinidad
de adsorción, su fase estacionaria es la superficie de un sólido finamente dividido. El soluto compite por
los sitios sobre la superficie del sólido con el disolvente utilizado como eluyente; la retención es el
resultado de la adsorción. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la
alúmina, siendo la primera la preferida. La elección de la fase móvil es fundamental para el éxito de una
cromatografía líquido-sólido; variando el disolvente, si este presenta una alta fuerza de elución eluirá las
especies absorbidas más rápidamente que uno que tenga un valor más bajo. La cromatografía de capa
fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un
plano, en la forma de un soporte sólido en un plato inerte.
Aplicaciones: se utiliza para compuestos no polares con masas <5000, muestras solubles en
Capítulo 5 49
Cromatografía de líquidos de alta resolución
relacionadas. Ejemplos típicos son la resolución de los numerosos aminoácidos formados en la hidrólisis
de una proteína, la separación y análisis de alcoholes alifáticos y la separación de derivados de azucares.
El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones, es muy utilizada en la
química inorgánica, también se usa para la separación de aminoácidos y otros ácidos y bases orgánicas.
Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria.
El intercambio iónico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una
solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. La fase estacionaria es una
resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies
ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH.
Capítulo 5 50
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Dentro de los intercambiadores encontramos: arcillas y las ceolitas, así como resinas sintéticas.
Estas últimas pueden ser usadas para intercambio de cationes se usan: resinas ácidas fuertes las cuales
contienen grupos de ácidos sulfónico y resinas ácidas débiles con grupos de ácido carboxílico. En el caso
de intercambiadores aniónicos, contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula de
polímero generalmente son aminas. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que
contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la
Fase Móvil es generalmente una solución amortiguador de pH.
Aplicaciones: encuentra mucho uso en los analizadores para aminoácidos, se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo fármacos y sus metabolitos, sueros,
conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y preparaciones farmacéuticas.
Figura 3.-Cromatografía Iónica (a) Separación de aniones en una columna de intercambio aniónico. (b) separación
de iones alcalinotérreos en una columna de intercambio catiónico .
tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa
(Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula
para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.
Figura 4.- Cromatograma Sephadex G-200 superfine. Peaks: 1. catalase; 2. aldolase; 3. Bovine serumalbumin; 4.
ovoalbumin; 5 chymotrypsinogen A; 6 ribonuclease A.
La separación se produce sobre una capa de un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre
una superficie plana, es un método notablemente simple y de bajo costo. Técnica de separación en la
que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano, éste puede ser un papel, que esté
impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria o una capa de partículas sólidas extendida
sobre un soporte, tal como una placa de vidrio. A veces a la se la llama Cromatografía de Lecho Abierto.
La cromatografía plana tiene como fase móvil un líquido y como fase estacionaria un líquido o
un sólido dispuestos sobre una superficie plana; existen tres tipos, cromatografía en papel, donde una
hoja o tira de papel de filtro sirve como fase estacionaria y medio de separación; cromatografía en capa
fina, en la que la separación se produce sobre una capa de sólido finamente dividido que se ha fijado
Capítulo 5 52
Cromatografía de líquidos de alta resolución
sobre una superficie plana; y la electroforésis. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria
por capilaridad, a veces es ayudado por gravedad o por potencial eléctrico.
Se utilizan papeles especiales de elevada pureza, Es una técnica muy sencilla, se utiliza una tira de papel
de filtro (Whatman nº 1 por ejemplo) como soporte para la separación. El mecanismo que interviene en
la separación fundamentalmente de reparto. La fase estacionaria esta constituida por el agua absorbida
sobre las moléculas de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser papel de filtro estándar o papel,
La fase móvil se selecciona empíricamente, se emplean mezclas consistentes en compuestos orgánicos,
agua y otras especies (ácidos, bases, agentes complejantes) que modifiquen la solubilidad de los
compuestos de la muestra.
Se realiza en placas de vidrio o plástico recubiertos con una capa delgada de partículas finamente
divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo predominante es la adsorción. Los materiales
más usados han sido: gel de sílice, alúmina, celita, poliamidas. La fase móvil el disolvente a utilizar debe
reunir una serie de características: inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase
estacionaria, elevada pureza, adecuada viscosidad y tensión superficial, bajo punto de ebullición para
facilitar el secado de las placas, económico y baja inflamabilidad y toxicidad.
Figura 5.- Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de sílice) de algunos aminoácidos. Disolvente A:
tolueno/2- cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/ácido acético. Aminoácidos: (1) ácido
aspártico, (2) ácido glutámico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9)
isoleucina y (10) cisteína.
Capítulo 5 53
Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.8 Instrumentación.
La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo importantes es
que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan
interferir en la elución de la muestra o bien que contengan algunas pequeñas partículas que puedan
tapar la columna; por lo que es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna.
La bomba envía el disolvente hacia la válvula inyectora que es una válvula de seis vías que
permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan al detector. El cual da una
señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia; esta señal es enviada al registrador que a su vez da
un cromatograma de intensidad en función del tiempo (figura 7); en el cual, lo ideal es obtener picos
gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra.
Capítulo 5 54
Cromatografía de líquidos de alta resolución
El integrador calcula el área de cada pico, la cual se puede relacionar con la concentración del
componente si se tiene una curva patrón; si no se cuenta con ella, sólo sería cualitativa.
Debido a que los detectores que se usan en estos equipos no son destructivos, es posible
recuperar los productos que salen de él, y de esta manera realizar otro tipo de separaciones (por
ejemplo) analíticas (también depende del tamaño del loop, de la columna y del tipo de bomba).
El volumen de fase móvil (o tiempo para Tr) necesario para transportar la banda de soluto desde
el punto de inyección a través de la columna, hasta el detector, en el punto máximo del pico del soluto
se define como volumen de retención (Vr).
El volumen muerto (V0) representa lo que se conoce como espacio muerto o volumen de retraso de la
columna, incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, tubería, conexión, columna y
detector.
Capítulo 5 55
Cromatografía de líquidos de alta resolución
𝐾𝐴 ∗ 𝑉𝑆
𝐾𝐴 =
𝑉𝑀
donde KA es la constante de distribución del soluto A, Vs es el volumen del soluto en la fase estacionaria y
Vm el volumen del soluto en la fase móvil (Skoog y cols., 2001).
5.11 Selectividad
El factor de selectividad α de una columna para dos solutos, A y B, se define como la relación de la
constante de distribución del soluto retenido con más fuerza, B, y la constante de distribución del soluto
retenido con menos fuerza, A:
𝐾𝐵
𝛼=
𝐾𝐴
5.12 Eficiencia
La eficiencia de una columna cromatográfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre
cuando un compuesto pasa a través de la columna. Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de
las columnas cromatográficas se emplean dos términos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o
número de platos teóricos N. Los dos están relacionados por la ecuación:
𝐿
𝑁=
𝐻
donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas cromatográficas
aumenta a medida que es mayor el número de platos N y la altura H es menor. Se observan grandes
diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado de las diferencias en el tipo de columna y de
las fases móvil y estacionaria. En términos de número de platos teóricos, la eficiencia puede variar desde
unos centímetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos varía desde unas décimas hasta
milésimas de centímetro y son comunes incluso mas pequeñas (Skoog y cols., 2001).
Capítulo 5 56
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B. la resolución de cada
columna queda definida como:
Se puede mejorar la resolución para una fase estacionaria determinada alargando la columna, lo
que incrementa el número de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa de añadir platos es un
incremento en el tiempo necesario para la separación de los componentes (Skoog y cols., 2001).
Expresada como una cantidad adimensional, refleja el número de veces que el soluto se reparte entre las
dos fases durante su paso a través de la columna.
𝐿
𝑁=
𝐻
El factor de asimetría del pico (AF, de asymetry factor) se define como la razón de las mitades del ancho
del pico a una altura dada. Conforme se mida más abajo la asimetría del pico AF es mayor, debido al
ruido del detector, un compromiso aceptable es medir AF en 10% de la altura del pico.
SF=A/B A
Capítulo 5 57
Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.16 Instrumentación
Como algunas de las fases móviles usadas en HPLC pueden ser químicamente activas como
ácidos, bases o líquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estén fabricados con
materiales resistentes, por lo que la mayoría de las partes en contacto con la fase móvil suelen estar
fabricadas con acero inoxidable (Hernández L. 2002).
Los disolventes más usados en HPLC son agua, disoluciones tampón acuosas y disolventes
orgánicos como el metanol. Deben ser espectroscópicamente puros, exentos de partículas sólidas y
degasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio.
Como fase estacionaria lo más común es usar partículas microporosas esféricas de sílice muy
puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001).
Capítulo 5 58
Cromatografía de líquidos de alta resolución
A) Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil tienen que ser inertes, es decir, el
disolvente no deberá extraer especie alguna del material con el que estén construidos. Suelen ser
botellas de vidrio y tubos de teflón. Están provistos de unos filtros, indispensables para eliminar los gases
disueltos y partículas que pueda contener la fase móvil (Harris, . 2001).
B) Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeño tamaño de las partículas de la fase
estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase móvil o disolvente a través
de la columna.
Los sistemas de bombeo deberán reunir las siguientes características: (Hernández, L. 2002).
Bombas recíprocas o de vaivén, son las más utilizadas. Están formadas por una pequeña cámara
cilíndrica que se llena y luego se vacía por oscilación de un pistón de zafiro. El bombeo produce un flujo
pulsado que después debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones
elevadas y se suministra un caudal constante, pudiéndose adaptar a la técnica de elución con gradiente,
debido a su pequeño volumen interno (Skoog, D. A. et al. 2001).
C) Los volúmenes que se inyectan de muestra deberán ser pequeños para evitar la sobrecarga de la
columna. Hay varios tipos:
El método más simple es la utilización de una jeringa de alta presión con un diafragma (“septum”) a la
entrada de la columna. Está limitado a una presión máxima de operación de 1500 psi.
Capítulo 5 59
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Las válvulas de inyección con bucles de volumen conocido, es el método más utilizado (Harris, D. C.
2001).
D) En las columnas cromatográficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que
permite su separación (Harris, D. C. 2001). El material de las columnas cromatográficas suele ser de
acero inoxidable cuya longitud varía de 5 a 30 cm y un diámetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas
aumenta al disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria. El tamaño típico de las
partículas es de 3-10 um (Harris, D. 2001).
Columna para HPLC. Fuente: P.V.G. Lab. 3-D, Facultad de Química, 2007
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna
con otra más corta, la precolumna, que retiene por adsorción las impurezas de forma irreversible (Harris,
D. 2001).
F) El papel del detector es indicar los momentos de aparición de los componentes, y proporcionar
indicación cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la
muestra y deberá reunir una serie de características como son, tener una sensibilidad elevada, buena
estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presión y la
temperatura. Se pueden clasificar de la forma siguiente: (Hernández, L. 2002)
El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentración del soluto y se registra
en función del tiempo y obteniéndose una serie de picos, generándose un grafico que se denomina
cromatograma. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra.
Capítulo 5 60
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase móvil. Suelen ser
muy selectivos y sensibles:
Los detectores basados en una propiedad de la disolución, responden a un conjunto amplio de solutos,
pero suelen ser poco sensibles:
Detectores de índice de refracción, está formado por una celda con dos compartimentos, en uno
se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra
en la celda soluto de distinto índice de refracción al disolvente el has se desvía y varía la señal dada por la
fotocélula (Harris, D. C. 2001). El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de
temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusión con gradiente.
Detectores de conductividad, son los más utilizados cuando los solutos eluidos son iónicos, como
ácidos y bases, así como cationes y aniones inorgánicos después de su separación por cromatografía de
cambio iónico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duración.
Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviación arbitraria.
Capítulo 5 61
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Rango Dinámico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal
que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector está
operativo sin que alguna sustancia pase a través de él. Esta señal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
Capítulo 5 62
Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.17 Bibliografía
BERMEJO, M. F. – “Química analítica general, cuantitativa e instrumental “. Vol. 2. Ed. Paraninfo, S. A.
Madrid. 1991.
HARRIS, D. C. – “Análisis químico cuantitativo”. Ed. Reverte, S. A. Barcelona. 2001.
HERNÁNDEZ, L. y GONZÁLEZ, C. – “Introducción al análisis instrumental”. Ed. Arial Ciencia. 2002.
KIRK, R. S., SAWYER, R., EGAN, H. – “Compuestos y análisis de alimentos de Pearson” Ed. Continental, S.
A. México. 1996.
LORO, J. F. – “Manual de cromatografía”. Colección Textos Universitarios. 2001
ROUESSAC, F. y ROUESSAC, A. – “Análisis químico: Métodos y técnicas instrumentales modernas”. Ed. Mc
Graw Hill. 2003.
SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J. – “Química analítica”. Ed. Mc Graw Hill. 7ª edición. 2001.
SKOOG, A y LEARY – “Análisis instrumental”. Ed. Mc Graw Hill. 1998
Capítulo 5 63
Cromatografía de líquidos de alta resolución
En esta técnica una mezcla de agua/solvente orgánico es comúnmente usada como fase móvil, y
un sólido de área de superficie altamente no polar es empleado como fase estacionaria. La última es
usualmente un empaque de alcanos adheridas a sílice, por ejemplo, con grupos alquilo de 8 o 18
carbonos cubriendo la superficie de sílice. RPC (reverse phase chromatography) es actualmente el
método más popular de cromatografía en líquidos; mas del 70 % de todas las separaciones por HPLC son
llevadas a cabo por este método.
Xm + zMs ↔ Xz + zMm
Donde M es una molécula de fase móvil. Los subíndices m y s refirieren a las moléculas en la fase
móvil o estacionaria respectivamente. La ecuación 1.1 asume que una competencia entre el soluto y las
moléculas de la fase móvil por un lugar en la superficie de la fase estacionaria existe. Esto es, una
molécula adsorbida, X, desplazara un numero z de moléculas M previamente adsorbidas. Las pruebas
que favorecen un proceso de particiones en RPC son de varias clases:
Primero, la retención de una serie de alcanos sustituidos del tipo Cn-substituidos en el empaque
de una columna, muestra una discontinuidad diferente cuando el soluto alquilo sustituido es igual en
tamaño con el grupo Cn de la fase estacionaria. Esto indica que los grupos n-alquilo en un soluto la
molécula puede penetrar (partición) dentro de la fase estacionaria, mientras no sean demasiado largos
[1]
Los compuestos ópticamente activos han atraído una gran atención porque los sistemas de la
vida son quirales. Proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos poseen características quirales las cuales
poseen una estrecha relación con sus funciones.
Capítulo 5 64
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Los estereoisomeros son isómeros con una constitución idéntica pero un arreglo espacial
diferente. Los estereoisomeros se clasifican de acuerdo a si factor de de simetría en un carbono
denominado el carbono quiral.
Los enantiomeros tienen propiedades físicas idénticas excepto por el signo de la rotación óptica.
Generalmente los enantiomeros se obtienen en una mezcla racemica, mezcla en la cual la cantidad de
los enantiomeros es igual.
Este el más antiguo y ampliamente usado método cromatográfico para distinguir enantiomeros.
La columna de derivación de un soluto ópticamente activo con otra molécula ópticamente activa
depende de la habilidad de separar a la molécula buscada. Un número importante de de grupos que
desvían la actividad de los compuesto a separar se han estudiado entre ellos están los grupos amino,
(separados con amidas, carbamatos, ureas, tioureas, y sulfoaminas) grupos hidroxilo, (separados con
esteres, carbonatos, y carbamatos) grupos carboxilo (esteres y amidas), epóxidos (isotiocianatos),
olefinas (con complejos quirales de platino), y tioles (con tioeteres).
Capítulo 5 65
Cromatografía de líquidos de alta resolución
A diferencia del método anterior en este método los complejos se forman en la fase estacionaria,
donde los aditivos se encuentran ya fijados. El enlace que se forma con uno de los enantiomeros hace
posible la separación de estos mismos. Existen 5 tipos principales de sistemas usados en esta técnica.
1) Es los complejos soluto fase estacionaria son formados por interacciones atractivas, puentes de
hidrogeno, interacciones pi, dipolos instantáneos, etc., entre el soluto y la fase estacionaria.
2) El mecanismo para la formación de complejos soluto-fase estacionaria es a través de
interacciones atractivas en donde la inclusión de complejos juega un papel importante.
3) El soluto entra dentro de cavidades quirales en la fase estacionaria para formar los complejos
incrustados.
4) El soluto es parte de un complejo metálico diastomérico.
5) La fase estacionaria es una proteína y el complejo soluto-fase estacionaria se basa en
combinaciones e interacciones hidrofóbicas y polares.
Capítulo 5 66
Cromatografía de líquidos de alta resolución
En este tipo de cromatografía los iones del analito se separan basándose en las diferencias entre
sus afinidades relativas por la fase estacionaria (iones de la fase inerte), contra aquellos que se
encuentran en la fase móvil, de forma tal, que se establece un continuo intercambio de cargas en donde
los iones de la matriz son reemplazados por los de la muestra a su paso por la columna.
Los iones que se intercambian más frecuentemente son cationes como NH4+, metales grupo I y II, NO2-,
NO3-, PO42-, haluros, SO42-.
Fundamento
Es un proceso en el que una solución de un electrolito es puesta en contacto con una resina
intercambiadora, en donde los iones activos de la resina son reemplazados por aquellos iones de la
misma carga presentes en el analito.
Un intercambiador catiónico es aquel en el que los iones activos sobre la matriz son cationes y el
proceso de intercambio involucra cationes, entre los más comunes se encuentran:
Los grupos más comunes en una resina aniónica son grupos amino terciarios y cuaternarios y se
intercambian de manera análoga a una resina catiónica.
policondensación, de fenoles ya minas aromáticas con formaldehído. Algunos grupos inorgánicos eran
introducidos por condensación de formaldehído con sulfo o carboxil derivados. Actualmente estas se han
reemplazado por materiales basados en estireno (poliacrilatos y divinilbencen derivados) los cuales
pueden ser modificados para adaptar el tamaño de partícula, así como para mejorar la selectividad y la
capacidad de retención de la columna.
Capítulo 5 67
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Las resinas se preparan por copolimerización de estireno con divinilbenceno, de la cual se origina
una maya tridimensional que puede ser modificada con gradientes de concentración para obtener
diferencias en el tamaño de poro y así aumentar la selectividad.
Para las resinas aniónicas, se realiza una clorometilación de la matriz polimérica seguida de un
tratamiento con la correspondiente amina.
funcionales a pH bajos. Elevado hinchamiento y contracción lo que hace aumentar las pérdidas de carga
o provocar roturas en las botellas cuando no cuentan con suficiente espacio en su interior. Se trata de
una resina muy eficiente, requiere menos ácido para su regeneración, aunque trabajan a flujos menores
que las de ácido fuerte. Es habitual regenerarlas con el ácido de desecho procedente de las de ácido
fuerte.
Resinas aniónicas de base débil. Se trata de una resina muy eficiente, requiere menos
sosa para su regeneración. No se puede utilizar a pH altos. Pueden sufrir problemas de oxidación o
ensuciamiento.
Tamaño de la partícula
Capítulo 5 68
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Para una resina catiónica, esta cantidad se define como la capacidad de intercambiar H+,
mientras que para una resina aniónica esta capacidad esta e función de la cantidad de iones Cl- que
pueda intercambiar.
función de la resina y de los iones. Esto se puede expresar como un equilibrio de la siguiente forma:
Donde el último término representa las concentraciones de los iones. Entre mayor sea el valor se
Kd mayor será la afinidad de la partícula por la resina intercambiada y en consecuencia aumentará la
capacidad de intercambio.
La afinidad de los cationes de las resinas e solución acuosa se incrementa caudno la carga se
incrementa; para cationes de la misma carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del ion
hidratado. Algunas secuencias de afinidad se muestran a continuación:
Capítulo 5 69
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Para las resinas aniónicas el intercambio depende del grado de polarizabilidad del anión por el
intercambiador; en la medida en la que la polarización sea mayor, mayor será la fuerza con la cual se
desplaza el ion de la matriz por el ion de la muestra. En general los iones polivalentes tienen una mayor
afinidad que los monovalentes; y para los aniones de la misma carga el ion de mayor tamaño tendrá una
afinidad:
F- < HCO3- < Cl- < HSO3- < CN- < Br- < NO3- < I- << SO4 2-
En general:
Parámetro Observaciones
5.25 Aplicaciones
Esta técnica tiene una de sus aplicaciones primordiales en el campo del análisis clínico, en donde
se utiliza comúnmente para la determinación de la presencia de desórdenes metabólicos cuando se
separan aminoácidos y otras aminas de importancia fisiológica de las muestra de las pacientes. En
condiciones normales, los aminoácidos se separan en su forma protonada como ácidos, utilizando
diferentes combinaciones de buffers de citratos y boratos. Posteriormente estos aminoácidos pueden
ser caracterizados por medio de técnicas como espectroscopia UV y fluorescencia.
Capítulo 5 70
Cromatografía de líquidos de alta resolución
La cromatografía de pares iónicos utiliza una columna HPLC de fase inversa, en lugar de una
columna de intercambio iónico. Para separar una mezcla de cationes se añade a la fase móvil un
surfactante aniónico, como n-C8H17-SO3. El surfactante se aloja en la fase estacionaria convirtiéndola
eficazmente en un intercambiador iónico. Cuando los cationes del analito pasan a través de la columna
se pueden unir a la fase estacionaria por atracción electrostática con los aniones del surfactante. El
mecanismo de retención es una mezcla de interacciones con fase inversa y de intercambio iónico. Para
separar los analitos aniónicos se pueden añadir a la fase móvil sales de tetrabutilamonio, como reactivo
de par iónico. La cromatografía de pares iónicos es más compleja que la cromatografía de fase inversa,
por que el equilibrio del surfactante con la fase estacionaria es lento, la separación es más sensible a
variaciones de temperatura y pH, y la concentración del surfactante no afecta la separación. El
disolvente a elegir es el metanol debido a que los surfactantes iónicos son mas solubles en mezclas
metanol/agua que en mezclas acetonitrilo/agua. Las estrategias para el desarrollo de un método
dependen de las variaciones en el pH y la concentración de surfactante, para una concentración de
metanol y temperatura fija. Dada la lentitud del equilibrio entre el surfactante y la fase estacionaria, no
se recomienda una elución gradiente en cromatografía de pares iónicos.
Figura 1. Fundamento de la
cromatografía de pares iónicos. EL
surfactante octamonosulfato sódico
añadido a la fase móvil se une a la
fase estacionaria no polar. Los grupos
sulfonato negativos, que sobresalen
de la fase estacionaria, actúan como
puntos activos de intercambio iónico
frente analitos catiónicos, como
bases orgánicas protonadas, BH+ [6]
Capítulo 5 71
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Conforme la muestra pasa por la columna las moléculas del soluto se ordenan. Las moléculas muy
grandes no pueden entrar en muchos de los poros e incluso penetran menos en las regiones
comparativamente abiertas del empaque. Las moléculas muy pequeñas difunden hacia dentro de todos
o muchos de los poros accesibles a ellas. Con un mayor volumen de la columna a su disposición, las
moléculas pequeñas tardan más en salir de la columna.
Los vidrios y sílices porosos cumplen una amplia gama de tamaños de poro. A continuación se
presentan unos ejemplos y los correspondientes intervalos de operación.
4 1 000 – 8 000
10 1 000 – 30 000
Capítulo 5 72
Cromatografía de líquidos de alta resolución
muestra. Si la diferencia en la viscosidad entra una muestra inyectada y la fase móvil es muy grande,
puede producirse la distorsión del pico y anomalía en los tiempos de elusión.
característica de los empaques de las columnas se puede describir en términos muy simples. Si se
supone que el tiempo que toma un soluto para difundirse dentro de un poro es pequeño con respecto al
tiempo que la molécula está en la vecindad del poro, entonces el proceso de separación es totalmente
independiente del proceso de difusión, esto se representa de la siguiente forma (coeficiente de
distribución:
VR VM
K
VS
Se puede enunciar como la fracción interna del volumen de poro que es accesible al soluto.
Donde VR (volumen de retención): es el volumen de eluyente que fluye de una columna entre la
inyección de la muestra y su salida en el eluyente; VM: es el volumen ocupado por la fase móvil (esto es,
en los intersticios entre las partículas porosas llenas de disolvente), que s e estima con la elución de un
soluto totalmente excluido; VS: es el volumen interno acumulado dentro de los poros de las partículas y
disponible para un soluto totalmente incluido o para las moléculas del disolvente.
Las moléculas totalmente excluida eluyen en un volumen vacío, esto es, VR=VM y por lo tanto
K=0. Para las moléculas pequeña que pueden entrar en todos los poros del empaque, VR=VM+VS y, por lo
tanto, K=1. Las moléculas de tamaño intermedio eluyen entre estos dos límites y K se encuentra en el
intervalo de 0 a 1.
Capítulo 5 73
Cromatografía de líquidos de alta resolución
5.27 Aplicaciones
Mucho del trabajo en la industria de los alimentos y las bebidas o en muestras fisiológicas en las
que la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, se realiza con facilidad con columnas de
exclusión de aniones. Vino, cerveza, jugo de fruta y muchos productos lácteos se analizan rápidamente
con una preparación mínima de la muestra (generalmente sólo filtración o centrifugación). Otra
aplicación es la separación de oligosacáridos y azúcares de alcohol con una columna de exclusión de
aniones en la forma iónica de calcio con agua como eluyente y una temperatura de 90°C. La maltotriosa
y otros oligosacáridos superiores se separan del mono y los disacáridos por efectos de exclusión estérica.
Los empaques de columna más utilizados más ampliamente para cromatografía de reparto
líquido-líquido, son aquellos con fases estacionarias orgánicas enlazadas. Reemplazan a los empaques
clásicos en los que el líquido estacionario recubre un material de soporte. El reparto ocurre entre la fase
enlazada y una fase móvil líquida.
Preparación de soportes con fase enlazada Los soportes con fase enlazada se
preparan uniendo covalentemente a la superficie de la sílice una especie orgánica de hidrocarburo. Los
soportes incluyen geles de sílice de poro grandes, cuentas con lechos porosos y micropartículas. El
siloxano se ha convertido en el estándar de las fases enlazadas comerciales. Es poco probable que la
porción hidrocarbonada de octilo u octadecilo se extienda totalmente dentro de la fase móvil. Las fases
monoméricas responden rápidamente a los cambios en la composición de la fase móvil, cuando son
mojadas por ellas. La falta de mojado causa una eficiencia pobre, presentándose adsorción en la
interfase o entrecara adsorbente-disolvente en adición al equilibrio de reparto líquido – líquido
esperado.
Una fase enlazada popular es un hidrocarburo de cadena lineal. El grupo alquilo puede ser de diversas
longitudes, normalmente es un grupo etilo (C-2), octilo (C-8) u octadecilo (C-18). Este último puede
utilizarse para las aplicaciones donde se requiere un máximo de retención.
Capítulo 5 74
Cromatografía de líquidos de alta resolución
Utiliza una fase estacionaria polar (frecuentemente hidrofílica) y una fase móvil menos polar.
Para seleccionar una fase óptima, es mejor empezar con una fase móvil de un hidrocarburo puro como el
heptano. Si la muestra se retiene fuertemente, la polaridad de la fase móvil debe aumentarse, quizá
añadiendo pequeñas cantidades de metanol o de dioxano.
Utiliza un empaque enlazado hidrofóbico, usualmente con un grupo funcional octadecilo (C-18) u
octilo(C-8) y una fase móvil polar, frecuentemente una fase móvil parcial o totalmente acuosa. Conforme
aumenta el carácter hidrofóbico de los solutos, la retención aumenta. El agua es el eluyente más débil. El
metanol y el acetonitrilo son disolventes populares porque tienen baja viscosidad y son fáciles de
conseguir con excelente pureza.
formas es el modo más ampliamente utilizado en HPLC e incluye cerca de la mitad de los métodos de
cromatografía líquida. Esta técnica es la que probablemente proporcionará retención y selectividad
óptimas cuando los compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrógeno o no tienen un carácter
predominantemente alifático o aromático. El método es muy apropiado para separar solutos con base
en el tamaño y estructura de los grupos alquilo.
En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis cuantitativo de las drogas de
abuso por medio de esta técnica. Los productos farmacéuticos que se analizan en forma rutinaria
incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los
métodos de fase inversa son los preservativos alimentarios, herbicidas y azúcares.
Capítulo 5 75
Cromatografía de líquidos de alta resolución
frecuencia pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna empacada con
octadecilo y disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano[7].
Bibliografía
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[7]
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Capítulo 5 76
Técnicas acopladas
Capítulo 6
Es necesaria una interfase entre ambos instrumentos que tiene como misión fundamental
eliminar el eluyente (fase móvil) antes de la introducción de los analitos en el espectrómetro.
Capítulo 6 81
Técnicas acopladas
Estos acoplamientos permiten reunir las ventajas de una técnica poderosa de separación con una
herramienta poderosa de identificación. Pueden registrarse espectros de masas a lo largo de toda la
separación cromatográfica. Así pueden registrarse inequívocamente los picos y comprobar incluso su
pureza, es decir si la separación ha sido completa o se ha producido en algún momento la co-elución de
dos compuestos.
Tal vez una de las desventajas de esta técnica es que los espectros de masas de los compuestos
orgánicos analizados por esta técnica, dependen de las condiciones de análisis, principalmente del tipo
de fase móvil y del potencial de ionización aplicado; ya que comúnmente a partir del espectro de masas
se obtiene normalmente el ión molecular y fragmentos que proporcionan a su vez el peso molecular del
compuesto. En tanto que en la técnica del HPLC-MS, el ión molecular forma fragmentos con el
disolvente empleado en la fase móvil y por tanto, no corresponden directamente con el peso molecular
del compuesto analizado. Razón por la cual, se hace necesario inyectar disoluciones patrón que
contengan los compuestos objetos del análisis, en las mismas condiciones experimentales (eluyente
potencial y ionización), para conocer el espectro de masas característico del compuesto en cada caso.
Sin embargo pese a ello esta técnica resulta extremadamente útil en el análisis de ultratrazas
(ng/kg) de compuestos orgánicos. Donde un análisis de tan bajos niveles de concentración (ultratrazas)
puede resultar necesario cuando se trata de compuestos de muy altos niveles de toxicidad y que se
cumula en los organismos vivos. Es el caso de las dibenzoparadioxinas policloradas (PCDDs), los
dibenzofuranos policlorados (PCDFs), o los bifenilos policlorados. Se analizan en los suelos y organismos
vivos principalmente ya que se acumulan en la materia orgánica del suelo.
Capítulo 6 82
Técnicas acopladas
Otra de las aplicaciones de esta técnica, es la identificación de analitos desconocidos, ya sea como
productos secundarios de síntesis, análisis de herbicidas y pesticidas, impurezas de drogas comerciales,
ó la identificación inequívoca de sustancias de estructura similar, para las que un simple espectro masas
es insuficiente; cabe mencionar que el acoplamiento HPLC-MS es una herramienta muy selectiva que se
emplea hoy día permite la identificación de algunos péptidos y proteínas.
El Detector de Ultravioleta Visible es el más común acoplado a HPLC, se usa cuando los componentes
absorben radiación UV- visible, como los compuestos aromáticos, alquenos, moléculas con enlaces C-O,
C-N, C-S. Pueden ser de longitud de onda fija o variable (arreglo de diodos).
Estos detectores utilizan también como fuente de luz una lámpara de deuterio o halógeno, que
en algunos modelos puede ser intercambiada por una de tungsteno para la detección en el rango visible.
Al ser constructivamente más complejos que los detectores fotométricos son algo menos sensibles y más
costosos.
Capítulo 6 84
Técnicas acopladas
El acoplamiento de HPLC y RMN requiere el ajuste de los sistemas de análisis. El flujo de la fase
móvil lleva a un período de exposición limitada (m) para los núcleos de células de la corriente. El tiempo
(m) es definido como la proporción del volumen de detección de la velocidad de flujo. Por otra parte, el
estado de equilibrio se alcance en un tiempo más corto permitiendo un rápido tiempo de la tasa de
repetición de la exposición de un espectro y, por tanto, un aumento en la sensibilidad.
En la técnica de HPLC la mayoría de las separaciones se realizan con materiales de fase invertido usando
mezclas binarias de disolventes como acetonitrilo / agua, acetona / agua o metanol / agua como móvil
fases. La elección de la fase móvil debe ser adaptada a la espectroscopía de RMN. Una ventaja evidente
es la de obtener un número pequeño de señales del disolvente en el espectro de RMN, ya que el
disolvente puede ocultar las señales de la muestra espectros. En general, las condiciones en
Capítulo 6 85
Técnicas acopladas
cromatografía HPLC-RMN los experimentos son los mismos que en la cromatografía convencional, pero
el agua se sustituye por agua deuterada. El uso de disolventes deuterados orgánicos en general es
demasiado caro. Para un ajuste correcto del receptor de la ganancia RMN instrumento, la intensidad de
las señales de disolvente debe reducirse a la altura de la muestra mediante la aplicación de una técnica
de represión del disolvente.
1.- Acoplamiento directo: parecido al de CG-IR, se emplea un tubo lumínico que actúa de célula de flujo.
Los interferogramas obtenidos durante todo el proceso cromatográficos son almacenados y
posteriormente se ofrecen los espectros IR convencionales de los analitos cuando el ordenador ha
sustraído en los mismos las bandas de absorción correspondientes a la fase móvil. Para evitar un bloqueo
excesivo del espectro por parte del disolvente se reducen las dimensiones de la célula (el paso de la luz
de 0.1 a 0.2 mm y el volumen entre 3 y 12 µL) y aun así existen inconvenientes:
Capítulo 6 86
Técnicas acopladas
soportados sobre una placa metálica. El efluyente cromatográfico es rociado en un tubo concentrador,
usando nitrógeno que evaporara un 90 % del disolvente; al entrar un pico a dicho tubo se abre una
válvula y se vierte el contenido en los pocillos del muestreador (se vierte de pozo en pozo al cerrarse y
abrirse la válvula). La detección se realiza por reflectancia difusa.
El cromatograma, que registra los picos de elución de los analitos a su salida de la columna y sus
tiempos de retención. Esta información es de especial interés en series homólogas (compuestos de la
misma familia que se distinguen entre sí sólo por la longitud de la cadena alifática, por ejemplo, la serie
homóloga de los alcoholes ya que permite hacerse una idea sobre el peso molecular de la especie.
El espectro de masas correspondiente a cada pico de elución, que permite identificar el pico con
un compuesto determinado. La espectrometría MS consiste en la ionización de moléculas en fase
gaseosa y la separación de los iones resultantes de acuerdo a su relación masa/carga (m/z). Un haz de
electrones colisiona con las moléculas que entran en la cámara de ionización del espectrómetro de
masas y, paradójicamente, les arranca un electrón, dando lugar a diversos fragmentos cargados
positivamente. Estos fragmentos son acelerados en un campo electromagnético y llegan al detector.
Capítulo 6 87
Técnicas acopladas
Una ventaja sustancial de esta hibridación es que la fase móvil cromatográfica no absorbe en la
zona de IR, por lo que no es precisa su separación previa de los analitos., además del carácter no
destructivo del detector acoplado. Este acoplamiento puede llevarse a cabo mediante dos
planteamientos técnicos diferentes:
b) Tubo lumínico, está cubierto de oro en su interior para reflejar la luz, y calentado eléctricamente. Se
sitúa alineado axialmente a la radiación de IR modulada incidente. Sus extremos so de material
transparente a esta radiación, generalmente KCl. El flujo gaseoso entra y sale mediante dos orificios.
Capítulo 6 88
Técnicas acopladas
cromatográma (c) comprobar la pureza de espectral. (d) Comparar los espectros obtenidos con
los almacenados para identificar a los analitos.
Muestra representativa de una determinación de herbicidas en los sedimentos de una plata industrial
Se trata de las combinaciones más simples, ya que las correspondientes interfases son
atomizadores comerciales, con escasas variaciones. La facilidad y sencillez de los montajes aumenta en
el siguiente sentido Hornos de grafito< llamas < plasmas.
Los plasmas ICP, DCP, MIP y los atomizadores de llama pueden acoplarse directamente con el
efluyente de un cromatógrafo de gases debido a que el caudal cromatográfico es generalmente
compatible con el de introducción a estos atomizadores. En el caso de los plasmas, el argón o helio
deben ser los gases portadores usados en el cromatógrafo. Las ventajas del uso de emisión atómica en
plasma son: Mayor sensibilidad, posibilidad de multidetección atómica con instrumentos comerciales,
mayor campo de aplicación.
En general los diferentes diseños descritos tienen por objetivo aumentar el tiempo de los átomos
en la zona de absorción lumínica.
procesos naturales). Pese a que estas técnicas presentan una gran sensibilidad (generalmente el límite
de detección es inferior al ng), siempre son necesarias técnicas de preconcentración debido a que se
encuentran en niveles sumamente bajos en la naturaleza. Lo limites de detección alcanzados para
compuestos organometálicos de plomo son 250pg Pb/m3 para tretrametilplomo y 375pg Pb/m3 para
tetraetilplomo.
Figura: Una de dichas técnicas presente dos etapas: En la primera tiene lugar la retención de los analitos en un tubo
de absorción de polímetro poroso. La segunda etapa la desorcion-determinación continúa con la hibridación CG-
EAA. Se utiliza una corriente adicional de hidrogeno y un tubo de cuarzo sobre la llama.
El caudal de aspiración de las muestras en los plasmas es de 1y 2 mL/min. Lo que los hace
compatibles con los caudales de los efluyentes cromatográficos líquidos. Cuando el disolvente de la fase
móvil es fundamentalmente acuoso (en cromatografía de líquidos en fase invertida, cromatografía de
intercambio iónico) un nebulizador convencional es la interfase CG-EAE. Cuando los disolventes son
hidrocarburos o compuestos orgánicos halogenados, debe unirse un nebulizador especial de impacto.
Los plasmas de microondas (MIP) no son recomendables para ser hibridados en HPLC.
Los métodos atómicos de llama tienen un caudal entre 3 y 6 mL/min, superior el de los caudales
usuales de salida en HPLC por lo cual puede usarse un flujo adicional un que los analitos sufres una
dilución excesiva, una solución interesante es la propuesta por Slavin que se basa en la formación de
una gota a la salida del efluyente. Cuando esta alcanza un determinado tamaño (≈100l) se desprende y
cae sobre un micro embudo de teflón conectado directamente al nebulizador.
Las interfases más complejas son las que se necesitan para acoplar un HPLC con un
espectrofotómetro de absorción atómica con vaporización electrotérmica. Esto se debe a la
Capítulo 6 90
Técnicas acopladas
Una posibilidad mas es de conectar HPLC con EAA (cámara de grafito) se utiliza un muestreador
comercial adaptado a la absorción atómica con cámara de grafito. El eluyente cromatográfico puede ser
recogido en su totalidad en los pocillos a intervalos regulares de tiempo o bien puede programarse de
tal forma que el eluyente valla alternativamente a los pocillos receptores y al desecho según lo
programado.
Estas interfases son más complejas respecto a las que origina un atomizador de llama, pero la
vaporización electrotérmica origina sensibilidades superiores, de ahí su atractivo.
6.9 Resumen
En general todas las técnicas de acoplamiento constan de una interfase entre los dos
instrumentos que constituyen la conexión que produce el fluido que emerge de la columna
cromatográfica y el sistema de detección. Es imprescindible el control coordinado del funcionamiento de
ambos instrumentos (separativo y determinativo).
Capítulo 6 91
Técnicas acopladas
Hoy las técnicas acopladas son una gran herramienta para los
químicos y la ciencia en general y son por este orden las más
usadas: Espectrometría de masas (EM), Espectroscopia de
Absorción Infrarroja con transformada de Fourier (IR-TF), Técnicas
Espectroscópicas Atómicas de Emisión (ICP) ó Absorción Atómica
(EAA) y Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
6.10 Bibliografía
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Duglas A., Leary J., Skoog. Análisis Instrumental. Editorial McGraw Hill, 4 ta. Edición. p.p.722-727.1992.
Capítulo 6 92
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Capítulo 7
Una parte importante de la cromatografía de gases y líquidos son los detectores, Un detector es
un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica.
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una
señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. En
cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre el eluyente puro y el mismo
eluyente llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta
acción se traduce en una señal tipo eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador
gráfico ó integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. El significado práctico de la linealidad del detector es
el que le indica al analista la concentración para la cual el detector es confiable. Hay dos límites en la
curva de linealidad:
Límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección y, límite Superior,
definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma un
5% de desviación.
Rango Dinámico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El significado de
conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinación de la cantidad
mínima detectable y el límite inferior del rango lineal.
Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir
una señal que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector
está operativo sin que alguna sustancia pasa a través de él. Esta señal es muy importante, ya que
permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
Detector de Conductividad Térmica (DCT). Mide la conductividad térmica del gas portador,
ocasionada por la presencia de substancias eluídas.
El funcionamiento del DCT esta basado en el hecho que la velocidad de pérdida de calor de un
cuerpo caliente para un cuerpo más frío es proporcional, entre otros factores, a la conductividad térmica
del gás que separa estos cuerpos. Un filamento metálico muy delgado (de W, Au o aleación W-Re) es
calentado por el pasaje de una corriente eléctrica constante. Este filamento está colocado dentro de un
orificio en un bloque metálico (celda), calentado a una temperatura más baja que aquella del filamento,
por donde el gas de arrastre proveniente de la columna pasa continuamente (Fig.1). Mientras pasa gas
de arrastre puro por la celda, la proporción de pérdida de calor del filamento para el bloque es constante
y la temperatura del filamento no varía. Cuando un componente es eluido de la columna, este sale
mezclado con el gas de arrastre y pasa por el detector. Si la conductividad de esta mezcla es diferente de
aquella del gas de arrastre puro, el filamento pasa a perder calor para el bloque en una proporción
diferente de aquella del equilibrio. Por ejemplo, si la proporción de pérdida de calor disminuye, el
filamento se calienta cuando la muestra es eluida. El calentamiento del filamento causa una variación en
Capítulo 7 94
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Capítulo 7 95
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
un detector sensible a la masa (al número de átomos de carbono que salen de la columna) más que a la
concentración, por lo tanto no le afectan demasiado los cambios en el flujo de salida.
Existen algunos grupos funcionales que no dan respuesta en este detector, como el carbonilo,
alcohol, halógeno o amina, y tampoco responden gases no inflamables como el CO2, SO2, agua y óxidos
de nitrógeno. Este hecho, más que limitar el ámbito de aplicación de este detector, permite el análisis de
muestras contaminadas con alguno de los compuestos mencionados.
Ventajas:
-13
♠ Alta sensibilidad, del orden de 10 g/s.
7
♠ Amplio intervalo lineal de respuesta, 10 unidades.
Desventajas:
♠ Destruye la muestra (la piroliza).
Capítulo 7 96
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
el detector se ioniza por electrones de gran energía ("rayos beta") emitidos por una lámina que contiene
63
Ni radiactivo. Los electrones así formados son atrapados por un ánodo, produciendo una pequeña
corriente continua. Cuando llegan moléculas de analito de gran electroafinidad captan algunos
electrones. El detector responde modificando la frecuencia de los impulsos de voltaje entre el ánodo y el
cátodo para mantener constante la corriente. Cuando estos compuestos se difunden a la estratosfera,
catalizan la descomposición de las moléculas de ozono
La fotometría de llama se emplea para determinar el sodio y el calcio en una muestra biológica,
debemos conseguir que ese sodio, en la forma que este en la muestra, pase a estar en forma de átomo
de sodio libre en fase gaseosa. Debe producirse la activación de ese átomo pasando el electrón de
valencia del nivel fundamental a niveles excitados, al volver de ese nivel al fundamental emite energía,
se trata de cuantificar la intensidad de la energía emitida por los electrones al volver a su nivel
fundamental.
La fuente de radiación que provoca la activación de los átomos es una llama. El monocromador
será en aparatos complejos filtros interferenciales y en aparatos sencillos redes de bajo poder de
resolución. Los detectores podrán ser células fotovoltaicas o fototubos, pueden medir intensidades
relativamente altas.
Detector de Ionización de Llama Alcalina. El detector de nitrógeno fósforo, también llamado detector de
llama alcalina, es un detector de ionización de llama modificado, que es especialmente sensible a
compuestos que contienen nitrógeno y fósforo (pero que, en general, responde también a
hidrocarburos.) En particular, tiene interés en análisis de medicamentos, pesticidas y herbicidas.
Cuando estos elementos se ponen en contacto con una bola de vidrio, que contienen Rb2SO4 y
que está en la punta de un mechero, producen iones que crean una corriente que se puede medir. Desde
luego, no se puede usar N2 como gas portador, si se analizan muestras que contienen nitrógeno.
Capítulo 7 97
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
De quimiluminiscencia
De nitrógeno: N
De emisión atómica: la mayoría de los elementos (seleccionados individualmente). Espectrómetro de
masas: la mayoría de los analitos
Espectrómetro de infrarrojos: la mayoría de los analitos
Un detector fotométrico de llama mide la emisión óptica procedente del fósforo, azufre, plomo,
estaño, y algún otro elemento concreto. Cuando el eluato pasa por una llama de H2-aire, análoga a la de
un detector de ionización de llama, los átomos excitados emiten luz característica. Las emisiones del
fósforo a 536 nm y del azufre a 394 nm se pueden aislar con un filtro interferencial de banda estrecha y
detectar con un tubo fotomultiplicador.
El detector de fotoionización utiliza una fuente ultravioleta de vacío para ionizar compuestos
aromáticos y no saturados, pero apenas responde a hidrocarburos saturados. Recoge y mide los
electrones producidos por ionización de estos compuestos.
Capítulo 7 98
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
El detector más común en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la
que se muestra en la figura 3, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas más
simples utilizan la intensa raya de emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio. Los instrumentos más
versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o volframio, y un monocromador, con el que se puede
elegir la longitud de onda óptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.
El sistema de la figura 4 utiliza una fila de fotodiodos, para registrar todo el espectro de cualquier
soluto que pasa por el detector. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa
desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia. En la escala más sensible, una absorbancia de 0,0005, daría
una señal del 100%, con un nivel de ruido del 1 %, de fondo de escala. El intervalo lineal cubre más de
cinco órdenes de magnitud de concentración de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que
se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta están indicados para elución gradiente, y para
disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo.
Detector de Índice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente
existen ahora dos tipos:
Tipo Deflexión
Tipo Fresnel
Capítulo 7 99
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Fig. 3. Camino óptico de una microcelda de un detector espectrofotométrico. Una celda ordinaria contiene un
camino óptico de 0,5 cm y contiene sólo 8μl de líquido.
Un detector de índice de refracción responde a casi cualquier soluto, pero su límite de detección es
aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de
deflexión, que se muestra en la figura 5, tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 μl: a través de
uno pasa disolvente puro, y a través del otro eluato. Para eliminar la radiación infrarroja (que calentaría
la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a través de la celda, con disolvente puro en los
dos compartimientos, y se dirige a la fotocélula mediante la placa de deflexión. Cuando entra en la celda
soluto de diferente índice de refracción, el haz se desvía, y varía la señal dada por la fotocélula.
Los detectores de índice de refracción no sirven en elución gradiente, porque es imposible ajustar
exactamente la muestra y la referencia mientras varía la composición del disolvente. Los detectores de í-
ndice de refracción son sensibles a las variaciones de presión y temperatura (~0,01 °C). Debido a su baja
sensibilidad, los detectores de índice de refracción no sirven en análisis de trazas. Tienen intervalos
Capítulo 7 100
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Detector de dispersión de luz. Responde a todos los solutos que son claramente menos volátiles
que la fase móvil.
El detector de dispersión de luz es compatible con una elución gradiente. Además, no hay picos
asociados con el frente del disolvente, y así no se dan interferencias con los picos que se eluyen al
principio.
Capítulo 7 101
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan
fluorescencia nativa o inducida.
La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitación. Semejantes a los detectores de absorbancia. Son altamente sensitivos
Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperométrico, Detector
Conductimétrico y Detector Potenciométrico
Se basan en métodos electroquímicos (amperometría, voltamperometría, conductimetría y
coulombimetría). Elevada sensitividad. El analito debe contener grupos susceptibles de sufrir procesos
redox. Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroquímicos para asegurarse análisis
reproducibles:
Checar que estén conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador-
integrador.
Usar bombas reciprocantes de doble pistón
Mantener en todo momento el flujo de la fase móvil en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Capítulo 7 102
Detectores para cromatografía de gases y líquidos
Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la eficiencia que nos indique la
necesidad de reacondicionar los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras en solución 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de
referencia en la celda 1 ó 2 veces a la semana.
Desconectar el detector electroquímico cuando este limpiando las columnas.
Utilizar agua, buffer y solventes orgánicos de alta pureza.
Comparación de detectores comerciales usados en HPLC:
a
Detector límite de detección aproximado (ng) ¿útil en elución gradiente?
De ultravioleta 0,1-1 Sí
Electroquímico 0,01-1 No
De fluorescencia 0,001-0,01 Sí
De conductividad 0,5-1 No
7.5 Bibliografía
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Capítulo 7 103
Procesamiento de datos cromatográficos
Capítulo 8
Es la Representación de la respuesta o señal del sistema de detección continuo (CLAR o CG) o discontinuo
en función del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho Cromatográfico. El cromatograma puede
tomar varias diversas formas: un registro en la carta de un registrador o plotter, una mancha en cromatografía
plana, o un número determinado de datos tomados por un microcomputador después de la correspondiente
transformación. Según el tipo de detector continuo, el cromatograma puede ser diferencial, cuando la señal
solo se origina al pasar analito por el mismo, e integral, cuando la señal se acumula (Figura 1).
Capítulo 8 104
Procesamiento de datos cromatográficos
Ajuste de datos
El software realiza en primer lugar un ajuste de datos, con la finalidad de eliminar el ruido y permitir el
correcto funcionamiento del algoritmo de integración. Con tal finalidad, se probaron distintos métodos
optándose finalmente por splines de segundo orden con derivada primera continua. Este método permitió una
mejor identificación del comienzo de pico y de los máximos, aún en condiciones de alto ruido.
En la Figura 4 se muestra en detalle un trozo de cromatograma, en el que puede observarse la curva continua del
ajuste y los datos con el ruido de la señal.
Para ello se tiene en cuenta el valor de la señal, su derivada (D1) y su derivada segunda (D2).
Picos simples: Se considera detectado el comienzo del pico cuando la derivada primera de la señal supera un
valor prefijado (D1 > Ls) punto 2 de la Figura 5.
Cuando la derivada pasa por cero siendo la derivada segunda negativa, se detecta el máximo (D1=0, D2<0)
Punto 3 de la Figura 5.
El final de pico se detecta cuando la derivada segunda es positiva y la derivada primera supera el valor
prefijado (D1>Li) Punto 4 de la Figura 5.
Los valores de Ls y Li pueden ser variables a lo largo del cromatograma, lo cual permite compensar el efecto de
ensanchamiento de los picos.
El tiempo de retención que identifica al componente es aquel en el cual ocurre el máximo, punto 3 de la Figura
5.
Capítulo 8 105
Procesamiento de datos cromatográficos
Picos superpuestos: En el caso de dos o más picos fusionados o superpuestos se traza una línea de base
entre el comienzo del primero y el fin del último. El criterio usual es trazar rectas verticales desde los valles
hasta la línea de base común y en base a esta división se asignan las áreas.
Picos tangentes: Los picos pequeños montados sobre uno mucho mayor se denominan tangentes y su
línea de base se traza de manera especial. Para detectarlo un criterio común es comparar alturas con la misma
diferencia medida en el pico anterior, si este valor cae por debajo de un límite prefijado, el pico será
considerado tangente.
Capítulo 8 106
Procesamiento de datos cromatográficos
colectar y analizar los datos de modo de obtener información cualitativa y cuantitativa y generar los
reportes correspondientes
Detección
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una
señal elaborable y ofrece información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. Es la parte del
cromatógrafo que se encarga de determinar cuándo ha salido el analito por el final de la columna.
En cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre la muestra a analizar y la
sustancia portadora llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna,
esta acción se traduce en una señal tipo eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador
gráfico ó integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una señal eléctrica
medible.
o Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. El significado práctico de la linealidad del detector es el
que le indica al analista la concentración para la cual el detector es confiable.
Rango Dinámico Lineal: Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Capítulo 8 107
Procesamiento de datos cromatográficos
Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal
Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector está
operativo sin que alguna sustancia pasa a través de él. Esta señal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un registro de la
cromatografía en la forma de un cromatograma. La señal del detector debe ser proporcional a la cantidad de
cada soluto (analito). Con lo cual debe ser posible realizar un análisis cuantitativo.
Registro e integración
La señal proveniente del detector, se transmite a un sistema de registro e integración, el cual genera un
cromatograma que representa un registro del análisis. Los datos obtenidos son procesados mediante un
registrador e integrador sin ninguna o muy poca capacidad de procesamiento, o a través de sistemas
computarizados que incluyen un procesamiento posterior (post-run analysis) mas sofisticado y completo
mediante el empleo de un software apropiado. En la mayor parte de los casos, el sistema integra
automáticamente el área de cada pico, realiza los cálculos e imprime un reporte con los resultados
cuantitativos y los tiempos de retención.
La cromatografía tuvo un gran crecimiento durante las anteriores cuatro décadas, en parte a que se trata
de una técnica rápida, sencilla, de bajo costo y esencialmente a su gran aplicación como herramienta de
separación. No obstante su gran éxito se debe sin duda a que también proporciona información cualitativa
acerca de las especies separadas. La cromatografía en columna cuantitativa tiene como principio la
comparación de las alturas, o de las áreas del pico del analito con la de uno o más patrones, en la
cromatografía en plano el área ocupada por las especies separadas sirve como parámetro analítico, si las
condiciones son controladas adecuadamente esos parámetros varían linealmente con la concentración, es
decir, que el área del pico cromatografico es directamente proporcional a la concentración del analito, así es
fundamental para la confiabilidad del análisis que el área de los picos sea medida lo más exacto y
reproduciblemente posible.
Los instrumentos cromatográficos modernos estas equipados con integradores electrónicos digitales, los
cuales permiten una precisa estimación de las áreas de los picos, si no se dispone de tales equipos tienen que
hacerse una estimación manual. Existen varias maneras de medir el área de los picos cromatográficos. Una de
Capítulo 8 108
Procesamiento de datos cromatográficos
esta técnicas consiste en suponer que el pico se asemeja a un triangulo isósceles, para lo cual se mide la altura
del pico (h) y el ancho de la base del pico (Wb) o ya sea la mitad de la altura (Wh) y se calcula el área del pico
empleando la formula usada para el calculo del área de un triangulo.
𝒃×𝒉 𝒉 × 𝑾𝒃
𝑨= ∴ 𝑨= ó 𝑨 = 𝒉 × 𝑾𝒉
𝟐 𝟐
Las limitantes de esta técnica es que su utilización depende de la simetría y del ancho del pico.
Otra técnica utilizada para determinar el área del pico es la llamada corte y pesada esta técnica consiste
en recortar el pico del cromatograma, luego se pesa en una balanza analítica y se determina su peso relativo
al peso de un área conocida de papel de registro. Dicho recorte y pesada depende mucho de la habilidad del
operador, pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, homogeneidad del papel, etc.
Para la utilización de esta técnica se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el
original. En general las técnicas de integración manual proporcionan áreas que son reproducibles a un nivel del
2 al 5 por 100; por el contrario los integradores digitales son al menos un orden de magnitud más precisos.
Otra manera de obtener el área del pico es sustituir el integrador por un computador el cual es un
dispositivo que convierte la señal eléctrica en números que puedan guardarse en una memora (conversor
analogo-digital) y que disponga de un programa para la realización del análisis del cromatograma digitalizado,
Capítulo 8 109
Procesamiento de datos cromatográficos
el costo del computador con los accesorio necesarios para hacer el análisis es por lo general inferior al de un
buen integrador, además con el computador se obtiene resultados más confiables.
El control de la temperatura de la columna es una de las formas más sencillas y más efectivas de
influenciar la separación de los componentes. La columna se fija entre un inyector mantenido a una
temperatura de inyección, y un detector mantenido a una temperatura también predeterminada. Por lo tanto,
se debe definir la temperatura a la que cada uno de los componentes opera.
La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación de los
diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha temperatura
depende del punto de ebullición del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente
superior a él.
Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de
temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el
ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable
utilizar temperaturas bajas para la elución, pero conforme la temperatura es mayor la elución es más rápida,
pero corriendo el riesgo de descomponer el analito. Por ejemplo:
Si al meter a eluir una muestra nos salen cuatro analitos con tiempos muy diferentes de elución la
temperatura adecuada para que eluyan todos se calcula con la rampa de temperatura:
Capítulo 8 110
Procesamiento de datos cromatográficos
El proceso de elución en cromatografía de adsorción, el disolvente compite con las moléculas de soluto
por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria. La diferente capacidad de los distintos disolventes para
eluir un determinado soluto del adsorbente es independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la
elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente
La fuerza eluyente (ε0 ) es una medida de la energía de adsorción del disolvente, supuesto el valor de
cero para el sistema pentano/ sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
Capítulo 8 111
Procesamiento de datos cromatográficos
respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente , tanto
más rápidamente se eluirán los solutos de la columna.
La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, que se
caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más polar tiene
fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se caracteriza por que la fase
estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un disolvente menos polar tiene
mayor fuerza eluyente.
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un
disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una
elución en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de aumento
de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del
disolvente.
En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo así
un gradiente continuo el análisis utilizando el método de elución por gradiente permite mantener una
resolución deseada y al mismo tiempo disminuir la duración del análisis.
Por ejemplo en la figura 15 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente de la elución isocrática de
ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separación con fase inversa , la fuerza eluyente
disminuye a medida que el disolvente se hace más polar . El primer cromatograma (superior izquierda) se
obtuvo con un disolvente que tenía 90% de acetonitrilo y 10% de tampón acuoso. El acetonitrilo tiene una gran
fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rápidamente. Se observan sólo 4 picos por que los demás están
solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgánico. El primer
cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con
80% de B, se consigue una separación un poco mejor, observándose 5 picos. Con 60% de B, se empiezan a ver 6
picos. Con 40% de B se ven claramente 8 picos. Con 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la
separación tarda demasiado (cerca de 2 horas).
A partir de los datos obtenidos con las elusiones isocráticas de figura 13, se eligió el gradiente que se
presenta en la figura 25.11, con el que se consiguió resolver todos los picos en 38min. Primero se trabajo con
30% de B (B=acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1,2,3. A continuación se fue
aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se
mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente se modifico el disolvente hasta alcanzar un
80% de B en 2 minutos, manteniéndose esa composición para eluir los últimos picos.
Capítulo 8 112
Procesamiento de datos cromatográficos
Figura 15. Separación isocrática en HPLC de una mezcla de compuestos aromáticos en una columna Hypersil ODS (C18
sobre sílice de 5μm), de o.46 x 25cm, caudal de 1.0ml/min,temperatura ambiente ( ˜22°C). (1) alcohol bencílico, (2) fenol,
(3)3¨,4¨-dimetoxiacetofenona, (4) benzoína, (5) benzoato de etilo, (6) tolueno, (7)2,6-dimetoxitolueno, (8) o-
metixibifenilo.El eluyente estaba formado por un tampón acuoso (designado por A ) y acetonitrilo (designado por B). El
tampón contenía KH2PO4 25mM y 0.1 g/L de azida de sodio con el pH ajustado a 3.2 con HCl
Aplicaciones
La cromatografía es utilizada para análisis del principio activo de un producto farmacéutico, por ejemplo
la determinación de cafeína y ácido acetilsalicílico en cafiaspirina , los siguientes datos fueron obtenidos para
determinar la cantidad de cafeína y ácido acetilsalicílico contenidos una tableta de cafiaspirina. En este caso
se realizo el análisis en HPLC
Para tal análisis se tomo como estándar las siguientes concentraciones de cafeína y ácido acetilsalicílico:
Cromatograma de la inyección número 1 del estándar Cromatograma de la inyección número 3 del estándar
Capítulo 8 113
Procesamiento de datos cromatográficos
Cromatograma de la inyección número 4 del estándar Cromatograma de la inyección número 5 del estándar
1 149019 1 615352
2 187639 2 784811
3 162884 3 684670
4 201409 4 874595
5 184141 5 797979
Ã=177018.4 Ã=751481.4
A partir de estos datos se obtuvo el factor de respuesta para cada componente en estudio con la siguiente
ecuación A=FrC.
(lote 7605H2, fecha de caducidad Julio 2009), obteniendo los siguientes datos.
Capítulo 8 114
Procesamiento de datos cromatográficos
1 177343 1 678496
2 178856 2 717425
3 182458 3 723643
Ã= 179552.3 Ã= 706521.3
Con los datos de las áreas y el factor de respuesta se obtuvieron la cantidad presente del de
cafeína y ácido acetilsalicílico en cada tableta.
Capítulo 8 115
Procesamiento de datos cromatográficos
Conocer el contenido de etanol en muestras analizadas a partir del método del estándar interno. Se
analiza el tequila comercial “Herradura”, EtOH 40%
Se trabajo a 70°C y se realizaron corridas a diferentes concentraciones de EtOH (2, 4, 6, 8, 10%v/v) y una
concentración constante de Acetona (6%v/v; estándar interno. Para la curva patrón, las diferentes disoluciones
se realizaron a partir de una solución Stock de EtOH al 20%.
En los cromatogramas aparecen 2 picos con 2 áreas diferentes. El primer pico y área corresponde a la
acetona, ya que es el compuesto menos polar. El segundo correspondo al del EtOH. Los valores de área para la
curva patrón:
752578 6 225296 2
394769 6 125961 2
175540 6 57133 2
270166 6 198196 4
251991 6 183560 4
168917 6 142527 4
183014 6 207592 6
177426 6 219475 6
Capítulo 8 116
Procesamiento de datos cromatográficos
234651 6 282560 6
276769 6 382117 8
145605 6 228924 8
178488 6 341568 10
168642 6 350407 10
266046 6 486201 10
2.5
2
Ae/Aei
1.5
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2
y = 1.2536x - 0.075
Ce/Cei R2 = 0.9868
Frr=1.2536 Ae/Aei=Frr*(Ce/Ci)
E.I.
Capítulo 8 117
Procesamiento de datos cromatográficos
Los resultados obtenidos en la tabla se obtuvieron con cálculos de regresión lineal, de la misma manera
que se realizaron para la muestra del destilado.
Tomando en cuenta el factor de dilución utilizado se encontrará la concentración (%v/v) del etanol en la
muestra de Tequila.
Para hacer la dilución de la muestra se tomaron 1.5ml del tequila, y se aforaron a 10ml para llevarlo a
una concentración del 6% (equivalente a la de la acetona, el estándar interno).
Según la información del producto, este indicaba que el porcentaje de etanol que contenía es del 40%. El
estudio cromatográfico, encontró una concentración del 30%. El estudio de la muestra a través del estándar
interno, disminuye el error caudado por la inyección es por ello que el resultado es confiable. La cromatografía
tiene una gran aplicación una de ellos es la determinación del grado alcohólico de una muestra para comparar
con el porcentaje reportado por el fabricante.
Capítulo 8 118
Procesamiento de datos cromatográficos
RESUMEN
La colección y procesamiento de datos así como su análisis se realiza con el fin de obtener
información cualitativa y cuantitativa y generar los reportes correspondientes, obteniéndose los datos a
partir de un detector; éste es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible
directamente, en una señal elaborable que ofrece información sobre la naturaleza y magnitud de la
propiedad física. La señal proveniente del detector se transmite a un sistema de registro e integración,
el cual genera un cromatograma. Los datos obtenidos son procesados mediante un registrador e
integrador.
La cromatografía es utilizada para análisis del principio activo de un producto farmacéutico, Otra
de las aplicaciones de la cromatografía en este caso la de líquidos, es la determinación del grado
alcohólico de una bebida. Entre muchas otras más.
BIBLIOGRAFÍA
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
Capítulo 8 120
Procesamiento de datos cromatográficos
Procedimiento. Para productos lácteos (yogur o leche) se debe liofilizar una alícuota de
aproximadamente 100mg. Para vegetales frecos se extrae en baño de agua a 50ºC durante 1 hora con
etanol 70%. El extracto se rotovapora a sequedad en evaporador rotatorio de vacío a 50ºC como
máximo. Añadir a cada frasco de muestra 1 mL de solución de estándar interno (2mg/mL de m-inositol o
1mg de xilosa) antes de liofilizar.
Preparación Estándar. Pipetear 1mL de cada solución de estándares y estándar interno en etanol en un
matraz de fondo cónico y boca esmerilada. Llevar a sequedad en el evaporador rotatorio a una
temperatura no mayor de 40ºC.
Condiciones operacionales
Flujo de gas acarreador (nitrógeno): 35mL /min.
Temperatura: Detector: 300ºC, Inyector: 250ºC, Horno (programado): 180ºC (2min) a 8ºC/min, hasta
250ºC.
Se inyectará 1 µL de la mezcla de estándares hasta obtener reproducibilidad en la respuesta del
equipo. Es decir que el factor de respuesta (km) debe de ser mínima la variación. Ajustar las demás
Capítulo 8 121
Procesamiento de datos cromatográficos
condiciones de operaciones de tal forma que el estándar de glucosa brinde una señal aproximadamente
igual a la mitad de la escala del registrador o el dispositivo de salida del cromatógrafo de gases.
Los azúcares se identifican por comparación con los tiempos de retención de cada estándar
correspondiente. La concentración se determina por el método de estándar interno utilizando las
fórmulas siguientes.
(1)
Donde:
Km = Factor de respuesta para el azúcar (ej glucosa)
AM = Área del pico del estándar correspondiente (ej. Glucosa)
Mi = Masa tomada del estándar interno utilizado (2mg para inositol o 1 mg para xilosa)
Ai = Área del pico estándar interno
MM = Masa tomada del estándar correspondiente (1mg de glucosa)
Se calculan tantos valores de km como azúcares se cuantifiquen.
(2)
Donde:
MM = peso del azúcar correspondiente en la muestra
AM = área del pico del azúcar en la muestra (mm)
Mi = masa del estándar interno añadido a las muestras (mg)
Ai = área del pico estándar interno añadido a las muestras (mm)
Km = valor promedio obtenidos mediante la fórmula (1) para el azúcar correspondiente.
Un cromatograma típico de la separación de algunos TMS derivados de azúcar se muestra en la figura1.
Capítulo 8 122
Procesamiento de datos cromatográficos
2. Se desea determinar el contenido de etanol en una bebida alcohólica. Para ello se realizó un
análisis cromatográfico utilizando una curva de calibración relativa.
Preparación de soluciones
Tabla 2.
0.1 1 10
0.5 1 10
1.0 1 10
1.5 1 10
2.0 1 10
Preparación de la muestra
Se tomaron 5 mL de licor, se adicionó 1mL de acetona (EI), se aforó a 10ml con agua. La muestra se
inyectó en el cromatógrafo 5 veces (1µL).
Capítulo 8 123
Procesamiento de datos cromatográficos
Condiciones cromatagráficas
Cromatógrafo de gases integrado con inyector split/splitless, detector de ionzación de flama y una
columna de sílice fundida SP 1000, fase polar (30m x0.32mm x 0.251µm).
Programa de temperatura: temperatura inicial 80ºC / 1.3 min, incrementandose a 20ºC/min hasta
130ºC y mateniendose a esa temperatura durante 5 min.
Resultados
Tabla 3.
Promedio 1 2 3 1 2 3 Promedio
1 296800 187150
2 290840 185900
3 287960 185880
4 285800 183680
5 291010 187180
Capítulo 8 124
Procesamiento de datos cromatográficos
Tomando en cuenta los promedios de las áreas tanto de Etanol como del Estándar Interno (tabla 3.) así
como la relación entre éstas y de las concentraciones tanto de la solución patrón como la interna que se
muestran en la tabla 2. Se grafica y se obtiene la pendiente que en este caso es el Frr (factor de
respuesta relativo); en base a éste dato se puede determinar la concentración de etanol en la muestra.
Curva Patrón
y = 0.9114x + 0.0403
2 R2 = 0.9974
AEtOH / AEI
1.5
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
[sp] /[EI]
Capítulo 8 125
Procesamiento de datos cromatográficos
Fundamento del método. Los ácidos grasos libres juegan un papel importante en el sabor de muchos
quesos y se producen por la hidrólisis de los triglicéridos de la grasa por las lipasas nativas de la leche, las
lipasas microbianas y las lipasas de las células somáticas. También se liberan durante el metabolismo de
los carbohidratos y aminoácidos por las bacterias.
Los ácidos grasos de bajo peso molecular son consecuencia de la fermentación bacteriana, mientras que
los ácidos grasos restantes son el resultado de la acción de la lipasa [1]. Se ha demostrado que los
ácidos grasos libres deben estar presentes dentro de un rango específico y a un nivel óptimo de
concentración para un sabor deseable. Cantidades excesivas de ácidos grasos libres se asocian con
rancidez hidrolítica y causan sabores desagradables.
Procedimiento. Los ácidos grasos libres (AGL) analizados fueron: butírico (C4), caproico (C6), caprílico
(C8), caprico (C10), laurico (C12), miristico (C14), palmitico (C16), estearico
Extracción de los lípidos del queso. Se mezclaron 2 g de queso rayado con 6 g de sulfato de sodio
hidratado para absorber la humedad y 0,6 ml de ácido sulfúrico 2,5 mol/l. Se procedió a la extracción de
los lípidos con 6 ml de eter/heptano (1:1 v/v) en un tubo de centrífuga de 75 ml mediante centrifugación
a 2.500 rpm/min por 2 min. Esta extracción se repitió dos veces añadiendo la misma cantidad de
eter/heptano (1:1 v/v) al residuo. Los tres extractos se mezclaron.
Separación de los ácidos grasos libres. Se utilizó como estandar interno el ácido pelargónico (C9) (0,043
mg) el cual se adicionó al extracto lipídico antes de proceder al aislamiento de los ácidos grasos libres.
Para tal fin se utilizaron columnas aminopropílicas de 3 ml (Supelclean LC-NH2 de Supelco, Inc)
acondicionadas con 2 ml de heptano. El volumen total del extracto se aplicó a la columna con presión
positiva. Los lípidos neutros fueron eluídos con 3 ml de cloroformo/2-propanol 2:1 v/v. A continuación
los ácidos grasos libres adsorbidos en la columna fueron eluídos con 3 ml de dietil eter con 2% de ácido
fórmico. El primer ml se descartó por no contener ácidos grasos libres. De los siguientes 2 ml eluídos,
con la totalidad de los AGL, se inyectó 1 ml al cromatógrafo para su determinación. Se realizaron 2
extracciones de cada muestra de queso y cada extracción se inyectó por duplicado al cromatógrafo [2,3].
Capítulo 8 126
Procesamiento de datos cromatográficos
Se utilizó un cromatógrafo de gas Hewlett Packard 5890 equipado con un detector de ionización
de llama y una columna capilar de sílica de 15 m x 0,53 mm (Nukol de Supelco, Inc.) calibrado con
soluciones de referencia de los ácidos grasos a analizar (Sigma) [6]. Se adaptó inyección directa debido a
las bajas concentraciones de los ácidos grasos. La cuantificación se realizó relacionando las áreas de los
picos con el área del estándar interno (C9) mediante un integrador Hewlett Packard 3393A. Se obtuvo
la media y la desviación estandar de todos los AGL.
Resultados
Capítulo 8 120
Procesamiento de datos cromatográficos
Se observan amplias variaciones entre las muestras, debido posiblemente a la influencia de las
diferentes condiciones del proceso de elaboración en la composición de los quesos, así como la
manipulación y almacenamiento durante el período de comercialización.
Fundamento. Los alimentos infantiles instantáneos, en su gran mayoría, son fortificados normalmente
utilizando formulaciones especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo, siendo la ingesta diaria
recomendada de 400-700 g devitamina A, para niños de 1-10 años de edad 3.
En ese sentido, y buscando una óptima metodología de análisis, en el presente estudio se realizó la
validación de la metodología por HPLC para la determinación de vitamina A contenida en alimentos
infantiles instantáneos.
Capítulo 8 120
Procesamiento de datos cromatográficos
que contenía aproximadamente 0,5 g de BHT ó ácido ascórbico. Se efectuó dos veces más la extracción y
se juntaron los extractos en el balón de 250 mL. Se evaporó a sequedad el solvente, haciendo uso de un
rotavapor con baño de agua a 40°C, se diluyó inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se
llevó a volumen en un matraz volumétrico de 10 mL. Finalmente, se pasó la solución final por un filtro de
0,2 m, llenándolos en viales ámbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatógrafo.
Cálculos:
Donde: Am (Área del pico de vitamina A en la muestra), As (Área del pico de vitamina A en el estándar),
Cs (Concentración de vitamina A en el estándar, mg/ml), D (Factor de dilución), Wm (Peso de la muestra.
Resultados
Capítulo 8 121
Procesamiento de datos cromatográficos
Toma de muestras. Para el muestreo personal colocar el muestreador pasivo 3M-3551 en la zona de
respiración. Una vez terminado el período de captación desmontar la membrana y el aro de sujeción
colocando en su lugar la tapa para la desorción, asegurando la hermeticidad de ésta y los tapones de la
misma.
Calibración. La disolución patrón se prepara por triplicado, añadiendo una cantidad determinada de 2-
bromoetano a un volumen de disolución desorbente de 10% de cloruro de metileno en metanol a fin de
obtener una disolución patrón de concentración similar a la muestra a analizar. Dicha concentración se
debe expresar en mg/ml de disolución desorbente.
Desarrollo de una curva de calibrado. Para el desarrollo de la misma, se preparan cinco disoluciones de
calibración de los analitos de interés que cubran el intervalo de concentraciones de aplicación del
método. Analizar los patrones en las mismas condiciones que las muestras. Se recomienda un mínimo de
seis inyecciones. Calcular para cada concentración y analito el promedio de las respuestas obtenidas y la
desviación típica correspondiente. Las curvas de calibración se construyen representando los intervalos
Capítulo 8 122
Procesamiento de datos cromatográficos
de los valores promedios ±2 desviaciones típicas, frente a las concentraciones en mg/ml de cada analito.
Comprobar diariamente la curva de calibrado mediante el análisis de uno de los patrones de calibración.
El valor obtenido para cada analito debe encontrarse dentro del intervalo asociado a ese patrón.
Las condiciones de trabajo para el cromatógrafo de gases equipado son las siguientes:
Se calcula el factor de respuesta del analito con los datos obtenidos mediante la expresión:
Fz = m/A
donde:
m= es la cantidad de analito en las disoluciones patrón
A es el área promedio correspondiente al analito en las disoluciones patrón.
La concentración en miligramos por mililitro de analito en las disoluciones de desorción de cada muestra,
se determina según la expresión:
co = Ao x FR
donde:
co= es la concentración de analito en mg/ml de disolución.
Ao= es el área correspondiente al pico de analito en la muestra.
FR= es el factor de respuesta.
Calibración multinivel. Leer la concentración en miligramos por mililitro en la curva de calibración
realizada.
Capítulo 8 123
Procesamiento de datos cromatográficos
Una vez determinada la cantidad de óxido de etileno en la disolución de desorción, se calcula la cantidad
en mg de compuesto mediante la siguiente expresión:
ms = ci x Vd
ms= es la masa de óxido de etileno captada por el muestreador.
Vd= es el volumen de desorción (1,5 ml).
Determinación de la concentración ambiental de óxido de etileno
Se calcula la concentración de óxido de etileno en aire muestreado, en miligramos por metro cúbico, por
medio de la siguiente ecuación:
𝑚𝑠 × 106
𝐶𝑖 =
𝑆𝑅 × 𝐶𝑅 × 𝑡
donde:
Ci= es la concentración ambiental del contaminante (mg/m3).
ms= es la masa de contaminante captada (mg).
SR= es el caudal de muestreo específico para el óxido de etileno (49,3 ml/min 760 mm Hg, 25 %
Humedad relativa) .
CR= es el coeficiente de recuperación específico para óxido de etileno en tanto por uno (0,92).
t es el tiempo de exposición en minutos.
La concentración de óxido de etileno en aire, expresada en mililitro por metro cúbico (ppm), se calcula
por medio de la siguiente expresión:
Cppm = Ci (24.0/44.05)*(101.3/P)*(T+273.15/293.15)
donde:
P= es la presión del aire muestrado en kPa (103 N/m3).
T= es la temperatura del aire muestreado en ºC.
44,05 = es el peso molecular de óxido de etileno en g/mol.
Capítulo 8 120
Procesamiento de datos cromatográficos
Fundamento. Se cuantificó los fenilpropanoides libres: ácido clorogénico y ácido cichórico, glicosídicos
así como las alcamidas presentes en extractos de raíces de las plantas medicinales Echinacea purpurea y
E. angustifolia.
Procedimiento. Se recolectaron 300 g de material vegetal, fue macerada con una mezcla 80:20 de etanol
al 95%: agua. Después de realizar 3 maceraciones, el extracto hidroalcohólico fue concentrado en un
evaporador rotativo a presión reducida y 45[grados]C, obteniéndose 1,5 litros de extracto concentrado.
Las alcamidas fueron identificadas según los tiempos de retención y los espectros de masas de
los picos obtenidos en los cromatogramas, comparados con los obtenidos con las disoluciones de
sustancias puras, previamente analizados y almacenados en una base de datos. La cuantificación se
realizó con el método de estándar externo empleando patrones en rango de concentración de 0-1,5% en
peso.
Resultados
El análisis por HPLC se obtuvo que los contenidos de metabolitos secundarios producidos tanto
en Echinacea purpurea como en E. angustifolia, en condiciones de Costa Rica, son mayores que los
reportados en los EE.UU., de donde es originaria esta planta. Se encontró que E. angustifolia, además
produce un equinacósido que no sintetiza E. purpurea y que es de suma importancia por ser uno de los
principales compuestos para mejorar el sistema inmunológico de los seres humanos.
Capítulo 8 121
Procesamiento de datos cromatográficos
La anfotericina B (AnB), comercializada en el año 1956, continúa siendo el fármaco de elección para el
tratamiento de las micosis sistémicas, aunque su utilización no está exenta de toxicidad.
Procedimiento. Se determinó analizando 10 veces dentro de la misma serie analítica, dos muestras, una
de concentración de AnB de 0.5 -g/mL y otra de 2.5 -glmL, preparadas a partir de un "pool'Lde sueros al
cual le fue adicionado el fármaco.
Capítulo 8 122
Procesamiento de datos cromatográficos
Resultados
Se realizó una curva de calibración, misma que se calculó por regresión lineal a partir de las áreas
de los picos correspondientes a los estándares, procesados en cada serie analitica. La concentración de
las muestras se obtuvo por interpelación de su área en la recta de calibración. Se resenta un método de
determinación de AnB en suero humano por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase
reversa y columna corta (30 mm). Para ello. se escogib una columna de octadecilsilano (C18), más corta
(30 mm x 4.6 mm ID) que en los métodos de referencia (125 a 300 mm) (108,119,120,129,131), con el fin
de obtener tiempos de retención más pequeños y se utilizó la fase móvil del método descrito por Wang
et al (131) (acetonitrilo y tampón EDTA ).
Bibliografia:
Sanchez Ma. Dolores. Venezuela. 2004. Estudio sobre los ácidos grasos libres en queso blanco,
Universidad de Los Andes. 46:2.
Serie Académicos CBS. Cromatografía de gases y de líquidos de alta resolución México 2000. pag.
215-231 255-305.
Khoo SH, Bond J, Denning DW. Administering arnphotericin B-a practica1 approach. J Antimicrob
Chemother 1994;33:203-13.
Capítulo 8 123