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Introducción a la bioquímica clínica

Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio I (Universidad Mayor)

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Bioquímica clínica y diagnóstico de laboratorio I

Clase 2

Anticoagulantes
EDTA  Tubo tapa lila
➢ También conocido como ácido
etilendiaminotetraacético.
➢ Hay dos formas: el EDTA Na2 y el K3. Por lo tanto, es
un catión.
➢ Es un quelante de Calcio, es decir, lo atrapa. El Calcio
está involucrado en la cascada de coagulación, por lo
que si no se tiene Calcio disponible la cascada no
funciona y no hay coagulación.
➢ Utilizado principalmente para hematología, porque
es un buen conservante de la morfología celular.
➢ Estudio físico químico de líquidos y hemoglobina
glicosilada.

Citrato de sodio 1:9  Tubo tapa celeste

➢ Existen dos formas: C6H5O7 Na3 x 2H2O y C6H5O7
Na3 x 11H2O.
➢ Impide que el calcio se ionice, evitando así la
coagulación.
➢ Se utiliza en estudios de Coagulación.

Heparina de sodio / litio  Tubo tapa verde

➢ Es más común la heparina de litio, ya que si tiene sodio puede interferir con la medición de ciertos analitos
(falsos positivos).
➢ Es un anticoagulante fisiológico, lo que quiere decir que nosotros tenemos heparina en el cuerpo.
➢ Impide que la protrombina se transforme en trombina.
➢ Muy usada en bioquímica clínica.
➢ Si no se mezcla uniforme e inmediatamente con la sangre extraída pueden formarse microcoágulos.

Fluoruro de sodio – oxalato de potasio  Tubo tapa gris

➢ El oxalato de potasio  anticoagulante (precipitación del calcio).
➢ Fluoruro de sodio  inhibidor de la glicolisis (enolasa).
➢ Glicemia, se utiliza cuando la muestra no puede ser procesada dentro de un plazo prudente (1 – 2 horas), ya que
más allá de ese plazo los mismos eritrocitos comienzan a consumir la glucosa y su medición seria equivocada.
➢ Determinación de lactato y alcoholemia.

Citrato de sodio 1:4  Tubo tapa negra

➢ También tiene citrato de sodio pero en diferente proporción.
➢ Es más usado para el examen de VHS.
➢ Lo que hace es precipitar el Calcio.

Sin anticoagulante
Gel separador de suero  Tubo tapa amarilla
➢ Cuando el tubo se centrifuga el gel se posiciona entre la fracción de células y la fracción de suero, por lo que
permite inmediatamente separar las células del suero y evitar que haya algún tipo de modificación de los
analitos presentes por acción de las células.
➢ Se ubica entre medio porque la densidad del gel es intermedia entre el suero y la suspensión de celulas.

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Orden de toma de muestra

Extracción con el sistema al vacío
El orden es establecido para que exista la menor interferencia entre los tubos.
1. Frascos de hemocultivos  Es necesario que exista el menor contacto con el medio ambiente externo de
manera de evidenciar si en la primera muestra que salió tiene algún microorganismo, porque si se toma
después, mientras que se cambia un tubo y otro hay contacto con el medio externo.
2. Tubos sin anticoagulantes (tubo tapa roja y amarilla)  Porque si se toma el tubo de anticoagulante primero, al
ser la misma aguja puede ser que quede un poco de anticoagulante que va a contaminar la muestra sin
anticoagulante.
3. Tapa celeste
4. Tapa negra
5. Tapa lila
6. Tupo tapa ve de, g is, et …

Extracción con jeringa

1. Tubo con anticoagulante  Porque en la jeringa comienza el proceso de coagulación, por lo que se debe pasar
inmediatamente al tubo para que la muestra no se coagule.
2. Tubo para prueba de coagulación
3. Tubo seco

Los distintos anticoagulantes pueden llegar a ser interferentes en la realización de ciertos exámenes, es por esto que
para cada examen dice que tipo de anticoagulante usar o no usar.
Por lo tanto, en cada una de las técnicas es necesario saber que tubo se debe ocupar.

Por ejemplo, el EDTA inhibe a la creatin quinasa, por lo

que en los resultados del examen esta va a encontrarse
falsamente disminuida.

Muestra de orina
➢ En general es una técnica no invasiva.
➢ Puede ser orina aislada u orina de 24 horas.

Aislada
- Se requiere de una única micción.
- Se prefiere la primera orina de la mañana, debido a
que todos los elementos están más concentrados.
- Se toma la orina desde el segundo chorro, eliminando
el primer chorro por la presencia de bacterias.
- La primera orina de la mañana tiene menores
fluctuaciones en las determinaciones influidas por la
dieta, a tividad físi a, et …
- Al azar se acepta por urgencia con retención vesical de
3h.

Orina de 24 horas
- Se pide cuando es necesario evaluar analitos cuyas
concentraciones difieren a lo largo del día. También se
pide para evaluar la diuresis y para proteínas urinarias.
- Muestra homogénea y representativa de los analitos
que se excretan en forma inconstante a lo largo del día.
- Es necesario registrar el peso y la estatura del
paciente.

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- Se debe ocupar un vaso plástico, opaco, boca ancha, de 3L y graduado.

- Indicaciones: El primer día se elimina la primera orina de la mañana, luego durante el día se toma todo lo que sigue
hasta la primera orina de la mañana del segundo día.

Técnicas de recolección de orina

1. Micción previo aseo, que es la más común.
2. Colección pediátrica (dispositivos plásticos).
3. Espécimen desde catéteres para personas que están sondeadas.
4. Punción suprapúbica, se punciona la vejiga con una aguja para recolectar orina y analizar MO anaerobios.

Si el análisis demorará más de 2 horas el transporte deberá ser en frío (4º C) (PP uratos y fosfatos amorfos, hemólisis),
esto es para:
- Evitar la proliferación de bacterias, puesto que las bacterias se multiplican constantemente a temperatura ambiente,
pudiendo modificar la concentración de glucosa y el pH.
- La descomposición de ciertos analitos.
El procesamiento debe realizarse en las 2 a 3 horas recogida, si no es si, se debe refrigerar la muestra a 4°C.

¿Dónde recolectar la muestra?

➢ Micción previo aseo se toma con un frasco boca ancha, graduado y estéril.
➢ Bolsa recolectora pediátrica para guaguas que no tienen control del esfínter. Esta recolección es un
procedimiento realizado por la enfermera, se debe cambiar cada 20 minutos y se debe realizar un aseo cada vez
que se cambia, porque existe la posibilidad de que haya alguna contaminación con el medio externo.
➢ En el caso de los pacientes sondeado tienen una bolsa recolectora de la cual se debe puncionar para sacar orina.
La zona a puncionar debe ser lo más alejada a la bolsa recolectora de orina y con previa desinfección de la zona,
ya que no se sabe cuánto tiempo ha estado la orina recolectada.
➢ En la punción suprapúbica, al ser un procedimiento médico se deben cumplir con todas las técnicas de asepsia,
se realiza una punción a la vejiga y obtención de la muestra. Es la recolección de orina más invasiva.

Transporte de muestra
Sangre
➢ Evitar agitación (hemolisis).
➢ Mantener y transportar a 4°C.
➢ Proteger de la exposición directa a la luz (degradación de algunos analitos, por ejemplo, bilirrubina o caroteno).
➢ Mantener en posición vertical, con el tapón hacia arriba, lo que reduce la agitación del tubo y favorece la
formación completa del coágulo
Orina
➢ Tomar y transportar en contenedores de plástico desechables.
➢ Mantener en posición vertical y a 4º C.
➢ En pacientes pediátricos se recoge en bolsas de polietileno que pueden sellarse para el transporte.

4. Procesamiento pre analítico

Incluye todo lo que es la preparación de la muestra una vez tomada, pero antes de pasársela al tecnólogo, incluyendo la
centrifugación Normalmente lo hace el técnico de laboratorio.

Obtención de suero, plasma

➢ ¿Tiempo de coagulación?  si la muestra no se coagula completamente al no esperar el tiempo suficiente
queda una surte de coágulos de fibrina en el suero, lo que tapona las vías de los equipos.
➢ 2500 – 3000 rpm x 10 minutos.
➢ Procesamiento directo del tubo primario, es decir, no se sacan alícuotas a menos que se necesite almacenar.
➢ Siempre que la muestra se guarde para procesarla después de un día, es necesario separar los elementos
figurados, porque las células siguen vivas y trabajando.
➢ El almacenamiento tiene que depender del analito, por lo que se debe leer el inserto.

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Obtención de pellet urinario

➢ Centrifugar la muestra a 1500 - 2000 rpm por 10 minutos.
➢ Rescatar el sobrenadante.
➢ Dejar el sedimento con un mínimo volumen.
➢ Resuspender.

Almacenamiento
Vamos a trabajar nosotros normalmente con:
➢ T° ambiente.
➢ 4°C - 10°C  Es la temperatura del refrigerador.
➢ -20°C  Es la temperatura del congelador.
➢ El nitrógeno líquido no es algo que se use en la clínica, sino algo que se usa en investigación. Tiene -120°C.

Interpretación de los resultados

El clínico para poder interpretar necesita tener un intervalo de referencia con respecto a los resultados.
Si existe algún tipo de variabilidad, debe ser capaz de pensar en todos los factores de variabilidad que pueden ser capaces
y cuál es el más probable.

Factores de variabilidad de un resultado

Variabilidad: responsable de que los valores de un determinado parámetro sean diferentes entre diferentes individuos y
de que incluso en una misma persona difieran en el tiempo.

➢ Pre-analítica  depende de la calidad de la muestra. i gú esultado es ejo ue la uest a de la ual se

obtuvo.

Puede deberse a:
- Ayuno
- Hora de toma de muestra
- Pacientes con vías
- Ejercicio intenso
- Tiempo de aplicación del torniquete
- Orina – aseo, eliminación primer chorro
- Tipo de anticoagulante
- Posición
- Consumo alcohol o tabaco

➢ Biológica  puede ser intraindividual o interindividual.

- Intraindividual: de la misma persona. Se puede modificar el
estado emocional, estar tomando algún medicamento, la
edad, la etapa e st ual, et …
- Interindividual: entre personas diferentes.

Los parámetros que oscilan menos son el sodio, el potasio y el

cloro, ya que los niveles de estos analitos son más controlados
en el organismo.

La variabilidad interindividual es mucho más alta ya que

depende de la genética de cada persona (edad, raza, sexo,
ciclo menstrual, alimentación, ejercicio, peso, masa
muscular, peso, localización geográfica … .

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➢ Analítica  cuando se repite una determinación es imposible que sea el mismo resultado, pero mientras más
parecido es más preciso. Por lo tanto, la variabilidad analítica tiene que ver con la imprecisión de un método
cuantitativo y la dispersión de los valores obtenidos para una misma muestra alrededor del promedio.

Cada una de las técnicas tiene un cierto grado de exactitud y precisión.

Precisión: indica la repetibilidad o reproductibilidad de la medida, siendo más preciso cuando da siempre
resultados cercanos.
Exactitud: indica la proximidad de los resultados de la medición con respecto al valor verdadero.

Repetibilidad intraserie: repetir la misma determinación, el mismo equipo, el mismo operador, la misma muestra
y la misma técnica.
Reproducibilidad interserie: es tomar una muestra y medirla hoy, tomar la misma muestra y medirla mañana,
tomar la misma muestra y medirla pasado mañana y así sucesivamente. La diferencia es que aquí se tiene la misma
técnica y el mismo equipo, pero puede ser otro operador.

Es más difícil lograr una buena reproducibilidad, porque día a día cambia el operador y muchos otros factores.

El coeficiente de variación de control patológico generalmente siempre es mayor, porque el rango es mucho
mayor.
Siempre lo que se debe evaluar es el coeficiente de variación, no la desviación estándar

Por ejemplo:

Kit N°1 $100 Kit N°2 $150

100 100
101 100 Aprender a usar
101 99
99 101 mi calculadora
97 100
103 100
104 100

= 100.7 = 100
DE = 4 DE = 1

4 = X 1 = X
100.7 100 100 100

CV = 3,95% CV = 1%

De estas 2 técnicas la más precisa es la 2.

En tema de conveniencia podemos comprar la técnica 1 para algunos analitos como la glicemia, en donde ±4 no
tiene mucha implicancia, pero no en la bilirrubina en donde si la tiene. Todo esto se tiene que tener en cuenta
para tomar estas decisiones.

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VARIACIÓN TOTAL CONSIDERANDO VARIACIÓN PRE ANALÍTICA = 0

Para comparar muestras siempre deben ser del mismo laboratorio, porque se pueden tener factores de
variabilidad diferentes

➢ Debido a cambios en el estado de salud

Causas frecuentes de rechazo de muestras sanguíneas

- Registro incorrecto de la orden médica.
- Utilización de tubo inadecuado.
- Muestra hemolizada (*).
- Muestra lipémica (*).
- Muestra coagulada. (*) Criterio
- Muestra insuficiente (*).
- Muestra no recibida.
- Muestra mal identificada.
- Muestra sin orden médica.
- Temperatura de transporte inadecuada.
- Recorrido preanalítico inadecuado.

¿Cuál es el problema de procesar una muestra hemolizada o lipémica?

➢ Interferencia analítica (Hb, turbidez)  los mayores interferentes son: Hb, bilirrubina en exceso y triglicéridos en
exceso (lipemia).
➢ Elevación de concentración de analitos abundantes dentro del GR (LDH, K+, GOT). Por lo tanto, en una muestra
hemolizada los niveles de estos tres analitos van a estar falsamente elevados.
➢ El ayuno necesario para que la muestra no se encuentre lipémica es de 12 horas.

Hemólisis
Se debe discriminar entre hemolisis intravascular y hemolisis in vitro:
➢ Intravascular (mínimo%)  Existen enfermedades como la anémia hemolítica que la povocan.
➢ Punción/Transporte/Procesamiento inadecuado.

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Fase analítica: Métodos instrumentales de análisis usados en BQ Clínica

Electroforesis: técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.
Métodos electroquímicos: se basan en la medida de una magnitud eléctrica básica: intensidad de corriente, potencia,
resistencia o conductancia y carga. Utilizan electrodos.
Técnicas inmunológicas: utilizan anticuerpos para establecer complejos antígenos-anticuerpos.
Técnicas fotométricas: basadas en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con las moléculas.
Cromatografía: permiten separar moléculas y cuantificar moléculas mediante el uso de columnas.

Técnicas fotométricas
➢ Basadas en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con las moléculas.
➢ Son muy importantes en bioquímica clínica.
➢ Vamos a ver 3:
- Espectrofotometría de absorción UV-visible.
- Turbidimetría.
- Nefelometría.
➢ La relación entre la luz absorbida, incidente y la transmitida.
➢ Cuando veo una luz verde es porque se absorbe todo menos el color verde.

Interacción entre ondas electromagnéticas y moléculas

 Se tiene una solución a la cual se le hace
incidir un haz de luz. Este haz de luz puede
sufrir diferentes procesos: se puede reflejar
(volver por donde mismo salió), dispersar
(irse a diferentes partes), absorber o
transmitir.
La relación entre la luz incidente, la luz
transmitida y la luz absorbida se expresa en
ciertas magnitudes que son la absorbancia y
la tramitancia.
Absorbancia: nos habla de la luz
absorbida.
Tramitancia: de la luz
transmitida.

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¿Qué tipo de luz se utiliza en la espectrofotometría de absorción UV-visible?

La ultravioleta que se encuentra entre los 100 - 400 nm y la visible que se
encuentra entre los 400 - 800 nm.
Una luz verde se ve así porque se absorbe todo menos el color verde y así con
todos los demás colores.

Entonces lo que estudia la espectrofotometría de absorción es como absorbe la

luz una molécula que está en una solución.
Esta absorción por parte de una molécula está regida por una ley llamada: ley de
Lambert Beer

Ley de Lambert Beer

➢ Absorbancia es directamente proporcional a la concentración del analito, ya que el
coeficiente de extinción molar y el largo de la cubeta se mantienen constantes.
➢ Mientras más cantidad de analitos por volumen se tenga, mayor
va a ser la absorbancia.
➢ Esto nos permite cuantificar la concentración de un analito en
una solución, dependiendo de la absorbancia que tenga este analito.
Mientras más absorbancia, más concentración del analito.
➢ La recta de la curva de calibración es válida hasta cierto punto en
donde se desvía.

Espectrofotómetro: monocromador.

Fotómetro: filtro.

Selección del analito

Si se tiene una muestra de plasma y se quiere medir la absorbancia de un analito en específico de esa muestra lo
primero que se debe hacer es separar las células y seleccionarlo.
El proceso de separación se hace mediante una reacción química/enzimática que es específica para esa molécula y se va
a medir la absorbancia del producto de esa reacción.

¿Cómo cuantificar?
1. Curva de calibración  método utilizado para determinar la concentración de una sustancia (analito) en una
muestra desconocida basándose en la relación proporcional entre la concentración y una determinada señal
analítica (propiedad).
Existen formas más exactas para hacer la medición como lo es la de hacer una regresión lineal de los datos.

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Una regresión lineal es un procesamiento matemático de los datos que permite establecer cuál es la mejor recta
obtenida por los puntos. Nos entrega una ecuación de la recta.

Y = mX
A = mC

Y = 0.5X  Definición de la mejor recta

A = 0.5C
C=A* 1 Factor de calibración, por lo tanto, el factor siempre va a ser: 1
0.5 m

Entonces, si se quiere detectar glucosa en el laboratorio se debe realizar una curva de calibración con
concentraciones crecientes de glucosa.
Gracias a esta curva de calibración se obtendrá la ecuación de la recta, de la cual me va a servir la pendiente
para sacar el factor de calibración.

2. Calibrador o estándar  es una solución de concentración conocida del analito normalmente utilizada en el
laboratorio. Se define uno de los puntos de la curva de calibración y simplemente se hace una regla de tres.
Podemos usar:
Estándar/Calibrador único: solución que tiene solamente un analito presente.
Calibrador universal: solución que tiene muchos analitos presentes.

Ejemplo:
Concentración Absorbancia
Glucosa 100 mg/dL 0,500 (UA)
MP glucosa X mg/dL 0,300 (UA)

X mg/dL = 100 mg/dL * 0,300 Por lo tanto [Muestra] = [Calibrador] * Abs muestra
0,500 Abs calibrador
X mg/dL = 60 mg/dL Fcal = [Calibrador]
Abs calibrador

Etapas
1. Desarrollar técnica elegida, la cual viene en un kit en donde ya está desarrollada la técnica y es creado por las
empresas.
2. Calibrar técnica para obtener el factor de calibración Se puede calibrar usando una curva de calibración o
usando un calibrador o estándar.
3. Controlar técnica, diariamente para ver si no se echó a perder, se hace con alguna muestra que ya se sabe que
concentración tiene, si da lo esperado la técnica esta controlada. Se utiliza un control normal y un control
patológico.
4. Procesar muestras, se procesan las muestras de los pacientes.

Para calibrar la técnica necesitamos:

Blancos
➢ Blanco de agua (Abs del agua)  Debería ser 0 Son más utilizados normalmente
➢ Blanco de reactivo (Abs reactivo)  es como tarar
➢ Blanco de muestra (Abs de muestra s/rx)

Calibración de técnicas
➢ Solución estándar
➢ Calibrador universal  muestra que tiene muchos analitos a concentraciones conocidas.

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Control de técnicas
➢ Control normal
➢ Control patológico

Controles
Control calidad interno:
- Uso de Control Normal y Control Patológico
- Carta control de Levey-Jennings
- Reglas de Westgard

Control calidad externo:

- Programa externo de evaluación de calidad (PEEC), ISPCH

Carta control de Levey –Jennings

Cuando se controla todos los días, estos controles se grafican en la carta de control de Levey - Jennings
Método gráfico que muestra los resultados de los controles.
Los resultados se grafican secuencialmente en el tiempo (eje X) y el resultado de la medición (eje Y).

 O u e este a i a, a ajo po la
variabilidad propia de las técnicas.
 Existe un cierto grado de variabilidad
aceptable, el cual está definido por ciertas
reglas llamadas Reglas de Westgard.
 El error es aleatorio, es decir, siempre va a
ser arriba, abajo. Si nos dan todos los datos
sobre la media significa que estamos haciendo
algo mal, como por ejemplo, pipetear más de la
cuenta.

Reglas de Westgard
Serie de reglas de control usadas en el procedimiento de calidad para analiza la medición del control.
Regla 13s  nos dice que el rango de aceptación del control no puede superar las tres desviaciones estándar arriba o
debajo de la media. Evalúa los errores aleatorios ocurridos mediante la determinación analítica.

Dependiendo de la regla que se defina para el laboratorio, va a ser lo estricto que se será en el laboratorio

 Si llegara a ocurrir una violación a la regla 13S se debe:

- Controlar nuevamente la técnica.
- Si de nuevo ocurre el error se debe calibrar nuevamente la
técnica.

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Clasificaciones de técnicas usadas en fotometría UV - visible

Se pueden clasificar de diferentes formas:
✓ Química  cuando la reacción que se genera
entre un analito y su reactivo es meramente
química.
✓ Enzimática  cuando la reacción se genera
gracias a una enzima.

Esta técnica permite

detectar α-AMILASA

✓ Reacción directa  donde existe una

única reacción química o enzimática para la
selección de una molécula.
✓ Indirecta  donde existen reacciones
acopladas o reveladoras que me permiten detectar
este analito. Esto es debido a que en una primera
reacción no da ningún producto que pueda ser
absorbido a alguna longitud de onda, por lo que se
hace una segunda reacción en la que los productos si
son capaces de absorber luz a una longitud de onda.

✓ Detección de analito
✓ Determinación de actividad enzimática

Curva de progreso de una reacción enzimática

 A medida que va avanzando el tiempo:

El sustrato se va consumiendo
El producto se va generando
El complejo enzima sustrato se mantiene estable
La enzima libre va disminuyendo y de ahí se mantiene estable

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✓ Visibles (colorimétricas)  de 400-800nm

✓ UV  de 100-400nm

✓ Creciente o detección de
formación de producto 
cuando se está tratando de
detectar la elaboración de
producto.
✓ Decreciente o detección de
desaparición de sustrato 
cuando se está tratando de
detectar la desaparición de un
sustrato.

Por lo tanto, se debe conocer

la ecuación para saber dónde
se encuentra la molécula que se está midiendo. Si se encuentra en el lado de los reactantes, lo que se está
midiendo es la desaparición de la molécula, mientras que si se encuentra en el lado de los productos se está
midiendo la aparición de la molécula.

✓ Técnica de punto final  cuando se hace la reacción química se incuba y se mide.

✓ Técnica de dos puntos  cuando se incuba, pasa el tiempo, se hace una medición, pasa más tiempo y luego se
vuelve a hacer otra medición.
✓ Técnica cinética  cuando se incuba y se va midiendo constantemente que está pasando con la absorbancia.

Tarea: clasificar y definir componentes de reactivos y muestras de las reacciones al final

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Caracterización de cada técnica (características de desempeño)

1. Lí ite de dete ió se si ilidad
2. Linealidad
3. Estabilidad de la muestra
4. Reactivo listo para usar o se debe preparar
5. Estabilidad de reactivos
6. Efecto de interferentes
7. Estabilidad de la reacción
8. Precisión
9. Repetibilidad
10. Reproducibilidad
11. Exactitud

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Turbidimetría - Inmunoturbidimetría (ag – ac)

➢ La turbidimetría mide la reducción de la
intensidad de la luz en su paso a través
de una suspensión, a causa de las
partículas presentes en esta.
➢ Determinación de proteínas totales en
LCR u orina (haciendo que las proteínas
precipiten con TCA o ácido
sulfosalicílico)
➢ Uso de fotómetro.
➢ Inmunoturbidimetría: MAU, PCR, ASLO, Factor reumatoídeo.

Nefelometría - Inmunonefelometría (Ag – Ac)

➢ La nefelometría mide la luz desviada en diversos ángulos
(entre 15º y 90º) por las partículas presentes en esta
suspensión.
➢ Nefelómetro  las lecturas se dan en NTU (Unidades
Nefelométricas de Turbidez).
➢ Se suele utilizar para soluciones con concentraciones
más diluidas.

Clasificación de las enzimas

Oxidorreductasas Transferencia de electrones (iones hidruro o átomos de hidrogeno)

Transferasas Transferencia de grupos
Hidrolasas Reacciones de hidrólisis
Liasas Adición de grupos a dobles enlaces
Formación de dobles enlaces
Isomerasas Transferencia de grupos dentro de una molécula
Ligasas Formación de enlaces (C-C // C-S // C-O // C-N) mediante reacciones acopladas de ATP

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