PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN

Aislamiento y selección de cepas de Lactobacillus spp. nativas del municipio de

Montería para su empleo como probiótico en la salud y producción de porcina.

Título: Efecto probiótico de Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus

plantarum en los indicadores biológicos de cerdos en crecimiento-engorda.

INVESTIGADOR betanci@yahoo.
Cesar Augusto Betancur Hurtado 15’956.418 3002134359
PRINCIPAL com
Lara_mantilla_c
COINVESTIGADOR Cecilia Lara Mantilla 63`280.089 7821639 ecilia@hotmail.c
om
Tu irías como investigador invitado (Yordan Martinez Y)

RESUMEN DEL PROYECTO

El uso indiscriminado de los antibióticos como promotores de crecimiento en las producciones

intensivas porcinas pueden incrementar el número de cepas resistentes, así como transferir
resistencia cruzada a otros microorganismos, el reto es buscar nuevas alternativas para modelar y
maximizar la producción animal. Con el objetivo de caracterizar las cepas de Lactobacillus spp.
nativas del municipio de Montería y evaluar su efecto probiótico en la salud y producción de
porcina, se desarrollará un experimento para aislar e identificar cepas de Lactobacillus en cerdos
aparentemente sanos. Además, se determinará la acción probiótica in vitro de estas cepas frente a
bacterias patógenas intestinales porcinas. Se valorará el efecto probiótico in vivo de las bacterias
Lactobacillus spp. en los principales indicadores productivos de los cerdos, también se determinará
la incidencia, frecuencia, grado y causa de la diarrea. Por otro lado, se identificarán las variaciones
fisiológicas en los cerdos alimentados cepas de Lactobacillus spp. tales como inmunoglobulinas,
conteo sanguíneo completo, aminoácidos, lípidos, prostanglandinas, electrolitos y status ácido-
básico. Se evaluará el efecto de cepas de Lactobacillus spp. en el peso relativo de las porciones
comestibles y la calidad de la carne de cerdos, así como las variaciones en el peso de los órganos y
vísceras, morfometría intestinal, pH, exclusión competitiva y producción de ácidos grasos volátiles.
Este proyecto de investigación obtendrá a partir de cepa probióticas, un nuevo suplemento
alimenticio para la producción porcina, lo que incrementará los indicadores productivos y reducirá
el síndrome diarreico (sobre todo después del destete) mediante una exclusión competitiva en el
TGI y modulación del sistema inmune, sin el uso de antibióticos preventivos convencionales, a su
vez mejorará la calidad del producto final, con disminución de los lípidos perjudiciales e
incremento de carne magra. Los indicadores verificables obtenidos de este proyecto de
investigación, se evidenciarán en la divulgación de los principales resultados en revistas de alto
impacto (A1), presentación de Congresos, Eventos y/o Reuniones científicas internacionales y
escritura de un libro sobre la temática.|

1. PROBLEMA Y SU JUSTIFICACIÓN

En las producciones intensivas actuales, los cerdos están sometidos a diferentes

situaciones de estrés que provocan desbalances en la microbiota intestinal, desarrollo de
microorganismos patógenos, inmunosupresión, ineficiente conversión de los alimentos y
disminución de la respuesta zootécnica; por lo que constituye un reto sustituir el empleo de
antibióticos como preventivos por bacterias benéficas, sobre todo nativas con posible
efecto nutracéutico, que mejoren la salud y reduzcan el riesgo de contraer enfermedades
digestivas, como principal causa de mortalidad y desbalance nutricional.

La satisfacción de las necesidades nutricionales en los seres vivos es una condición

indispensable para la vida; el hombre a través del tiempo ha hecho una selección de los
alimentos atendiendo a su entorno, las condiciones alimentarias que éste ofrece y los
recursos técnicos disponibles para satisfacer estas necesidades (Martínez et al., 2013).

El consumidor moderno busca alimentos con características nutritivas excepcionales y que

a la vez aporte salud y bienestar, es por eso que las características cualitativas de los
alimentos son de carácter prioritario (Lee et al., 2012).

Por las características biológicas del cerdo, en cuanto a la productividad numérica, ritmo
de crecimiento y hábitos alimenticios es considerado entre los animales más eficientes
para producir carne y satisfacer las necesidades nutritivas del hombre, por lo que
desempeña un papel protagónico en el mundo. No obstante, la producción porcina a nivel
mundial, al igual que otros sectores de la producción animal, está sufriendo una profunda
transformación, determinada por las demandas del consumidor sobre la industria
alimentaria para la producción de alimentos de calidad. De igual forma, en la búsqueda de
alternativas para la producción y comercialización de carne, se presta cada vez mayor
atención al cerdo como fuente estable y saludable de proteínas para la alimentación
humana. Este sector porcino supone el 30% del producto final agrario (Mejía et al. 2007).

En los nuevos esquemas de producción, los lechones que han sido destetados precozmente
(entre 15 y 28 días de edad) son sometidos a tensiones ambientales y nutricionales,
provocando la proliferación de bacterias patógenas intestinales (Escherichia coli
Clostridium perfringens y Salmonella typhimurium), síndrome diarreico, retraso en el
crecimiento y trastornos en su sistema inmunológico, así como aumento de la morbilidad y
mortalidad alrededor del 41% de la camada (Mejía et al., 2007, Kong et al., 2007a; Kong
et al., 2007b; Liu et al, 2008).

Los antibióticos se han suplementado en las dietas de los cerdos para corregir los
problemas del tracto gastrointestinal mediante el incremento de los indicadores
productivos y la reducción de la incidencia de la diarrea (Wang et al., 2011). Sin embargo,
en los últimos años, ha habido un mayor interés para eliminar o minimizar el uso de
antibióticos a niveles subterapéuticos en la ganadería como promotores de crecimiento,
debido a que los antibióticos pueden incrementar el número de cepas resistentes, así como
transferir resistencia cruzada a otros microorganismos (Martínez et al., 2013) .

En este sentido, las investigaciones destinadas a obtener nuevos aditivos promotores del
crecimiento alcanzan cada día más desarrollo, a raíz de la prohibición de los antibióticos
(Wenk, 2003; Carro & Ranilla 2005). Al respecto el 28 de mayo de 1999, el CDC de la
Comisión Europea emitió un dictamen sobre la resistencia hacia los antibióticos. Esta
comisión señalaba la necesidad de una rápida actuación a fin de reducir el uso global de
los agentes antimicrobianos de una manera equilibrada en todas las áreas: medicina
humana, medicina veterinaria, cría de animales y productos fitosanitarios. Por lo que se
debían realizar estudios sobre los sectores más críticos (en particular la producción de
cerdos y pollos de ceba), a fin de reducir las posibles pérdidas económicas o el incremento
en el uso de los antibióticos para tratamientos prescritos por un veterinario y disponer de
otras clases de aditivos utilizados como factores de crecimiento. Por tal razón, en la
actualidad existe una tendencia, cada vez más creciente, a la utilización de aditivos más
inocuos, como los probióticos (Gutiérrez et al. 2002).
En los últimos años, el uso de probióticos en la profilaxis y terapia de enfermedades
gastrointestinales ha sido objeto de gran interés y de controversia científica. Hoy en día se
reconoce la importancia y posible eficacia de la terapia biótica (probióticos y prebióticos)
como herramienta médica en el tratamiento de enfermedades digestivas (Nava et al., 2004).
En este sentido, a partir de 1908, Metchnikoff, evaluó las facetas benefactoras de los
Lactobacillus, para posteriormente en 1974, proponer el término de "probióticos" en
contraposición al de antibióticos, ya que la primera acepción hace referencia a los efectos
favorables de la vida (García, 2004). Por otro lado, Fuller (1989) define a los “probióticos”
como suplementos alimenticios microbianos vivos, que afectan beneficiosamente al animal
huésped mejorando su equilibrio microbiano intestinal.

El uso de probióticos en las estrategias de alimentación animal ha ganado favorables

criterios en muchos sectores académicos (Wang et al., 2011). En los animales,
especialmente Bacillus y Lactobacilum se han utilizado como aditivos en la dieta, con el
objetivo de promover el peso vivo, salud intestinal, digestibilidad de los nutrientes,
capacidad antioxidante, inmunidad y disminución de la incidencia de la diarrea (Kalavathy
et al., 2003; Saxelin et al., 2005). Estos efectos positivos son provocados por una exclusión
competitiva de bacterias patógenas por una eficiente colonización de bacterias benéficas en
el tracto gastrointestinal. Además se logra la eliminación de patógenos en el tracto
gastrointestinal, así como residuos de antibióticos y sustancias análogas en productos
finales, lo que permitirá expresar el potencia genético del modelo animal en estudio (Marco
et al., 2006).

En cerdos los estudios han sido dirigidos a mejorar los síntomas de estrés, actuando como
un promotor natural del crecimiento, con aumento de la producción y el estado general del
animal (Carcelén et al., 2005). En casos de diarreas y pérdida de peso, las colonias de
bacterias probióticas se reducen en poco tiempo, sin importar la causa. Por lo que
reincorporación de dichas cepas probióticas lo antes posible podrá contrarrestan los
microorganismo patógenos que son frecuentemente en la causa de la diarrea. Tanto la
duración como la intensidad de los ataques de diarrea pueden ser reducida (Vera, 2007).
Por tal razón la aplicación de las cepas probióticas de Lactobacillus collinoides,
Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum, como suplemento alimenticio de cerdos
post-destete en el departamento de Córdoba, Colombia contribuirá de manera significativa
al mejoramiento de la sanidad animal y la producción porcina en Colombia.

2. Hipótesis

Conociendo que las levaduras tienen efectos beneficios en la producción y salud animal, el
empleo de Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum, como
suplemento dietéticos en cerdos en crecimiento-engorda, pudiera mejorar los indicadores
productivos y la calidad del producto final, con reducción de la incidencia de diarrea.

3. Objetivo general
Caracterizar las cepas de Lactobacillus spp. nativas del municipio de Montería y evaluar su efecto
probiótico en la salud y producción de porcina como reemplazo de los antibióticos preventivos.

3,1 Objetivos específicos

 Determinar la acción probiótica in vitro (antimicrobiana) de Lactobacillus collinoides,

Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum frente a bacterias patógenas
intestinales procedente de cerdos en producción.
 Valorar si los principales indicadores productivos de los cerdos en diferentes etapas
productivas se modifican, cuando son alimentados con suplementaciones de
Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.
 Determinar la incidencia, frecuencia, grado y causa de la diarrea de cerdos (sobre todo
después del destete) alimentados con suplementaciones de Lactobacillus collinoides,
Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.
 Identificar las variaciones hematológicas de inmunoglobulinas, conteo sanguíneo
completo, aminoácidos, lípidos, prostanglandinas, electrolitos y status ácido-básico en
cerdos (sobre todo después del destete) alimentados con suplementaciones de
Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.
 Evaluar el peso relativo de las porciones comestibles y la calidad de la carne de cerdos
alimentados con suplementaciones de Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis y
 Lactobacillus plantarum.
 Evaluar el peso relativo de los órganos digestivos y vísceras; así como la morfometría,
el pH, la exclusión competitiva de microorganismos y la producción de AGV en el
TGI de cerdos alimentados con suplementaciones de Lactobacillus collinoides,
Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Aislar e identificar las cepas de Lactobacillus spp. en heces de cerdos

aparentemente sanos en la etapa de crecimiento.

Cepas salvajes de Escherichia coli, Salmonella spp. y Staphylococcus spp, y cepas de Lactobacillus
spp con posible acción probiótica se identificarán y se aislarán de cerdos en producción en el
laboratorio GRUBIODEQ de la Universidad de Córdoba.

Todas las cepas patógenas se inocularán en caldo nutriente enriquecido y se incubarán en zaranda
termostatada (MAXQ-600) durante 18 h a 37 ºC, por otro lado, las cepas de Lactobacillus spp. se
cultivarán en caldo MRS por 18 horas a 37 oC, en condiciones estáticas.

4.2. Determinación de la actividad antimicrobiana in vitro de cepas de Lactobacillus

spp. Nativas del municipio de Montería.

De los cultivos de las cepas se tomarán 200 Ml, se inocularán en tubos con 20 Ml de agar nutriente
enriquecido (con 1 % de Ion-Agar, OXOID) a 45 ºC, luego se verterán en placas para su
solidificación. En cada placa que contiene las cepas indicadoras se abrieran pocillos de 7 mm de
diámetro, en los que se depositarán 20 Ml de las variantes 1, 2 y 3 de la mezcla productora. Se
realizarán además controles positivos con la mezcla M2 más ácido láctico 1N hasta alcanzar Ph 3 y
controles negativos con M2 a Ph 7. Las placas se mantendrán a 5 ºC por un tiempo de 4 h para una
mejor difusión de las sustancias en el agar. Luego se incubarán por 24 h a 37 ºC hasta detectar el
crecimiento y la aparición de los halos de inhibición. El diámetro de los halos se medirá con una
regla milimetrada. A cada valor se le restará el diámetro de los pocillos (Pérez et al., 2011).

4.3. Valorar si los principales indicadores productivos de los cerdos en diferentes

etapas productivas se modifican, cuando son alimentados con
suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp.

4.4. Ubicación y ecología experimental

La investigación se desarrollará en las áreas de experimentación porcina de la Universidad de
Córdoba, Montería, Colombia y en las áreas del Centro de Estudio de Producción Animal de
la Universidad de Granma, Cuba. Se determinará la humedad relativa y temperatura
ambiental según un termógrafo en las áreas de investigación.
 4.5. Animales y tratamientos

Se utilizarán 150 cerdos destetados de forma precoz (mayor de 5.5 kg) hasta completar su vida
productiva, se ubicarán según diseño completamente aleatorizado con 30 cerdos/tratamiento y 10
repeticiones/tratamiento. Las dietas se formularán según Rostagno et al. (2011). Para la confección
de la dieta se empleará los siguientes alimentos: harina de maíz, harina de torta de soya, premezcla
de minerales y vitaminas, sal común, aminoácidos sintéticos, antioxidantes, aceite vegetal y polvo
de arroz. Los tratamientos experimentales se diseñarán como se muestra a continuación:

Control negativo: Solo dieta convencional

Control positivo: Se utilizará un antibiótico dietético (colistina 200 mg/kg)
Tratamiento 3: Cepa nativas de Lactobacillus spp. (1) (5×1011 CFU kg-1)
Tratamiento 4: Cepa nativas de Lactobacillus spp. (2) (5×1011 CFU kg-1)
Tratamiento 5: Cepa nativas de Lactobacillus spp (3) (5×1011 CFU kg-1)

4.6. Condiciones experimentales

El experimento se llevará a cabo de acuerdo con las directrices colombianas y cubanas para el
bienestar animal y el protocolo experimental.

Todos los corrales serán equipados con un comedero, un bebedero tipo de pezón y pisos de metal
expandido de plástico cubierto. Los correales tendrán las siguiente características: longitud de 0.5
m, ancho, 0.3 m y altura 0.4 m. El agua y la comida se ofertarán ad libitum.

4.7. Indicadores productivos

Todos los animales se pesarán semanalmente. El consumo de alimentos, EM y nutrientes de los

cerdos se medirán diariamente durante todas las semanas experimentales, mediante la diferencia
entre la pesada de la oferta y el rechazo. Se calculará la ganancia media diaria, la conversión
alimenticia y la viabilidad semanalmente.

5. Determinar la incidencia, frecuencia, grado y causa de la diarrea de cerdos (sobre todo

después del destete) alimentados con suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp.
nativas del municipio de Montería.

Se evaluará la incidencia, frecuencia y grado de la diarrea en los cerditos. Para esto se observará si
hay presencia de la misma a las 12, 24, 48, 72 horas y 15 días postdestete. La consistencia se
determinará con una escala de rangos del 0 al 3 (0= heces normales, 1= heces pastosas, 2= heces
semilíquidas y 3= heces líquidas o acuosas). Si el valor de la escala es superior a 1 se considerará
como animal con diarrea. El grado, frecuencia e incidencia de diarreas se determinará de acuerdo a
la metodología de Ding et al. (2011).

Para la determinar la causa de diarrea se tomarán muestras de heces fecales de animales diarreicos,
luego las muestras serán enviadas al laboratorio para realizar pruebas microbiológicas.
 6. Identificar las variaciones fisiológicas: inmunoglobulinas, conteo sanguíneo
completo, prostanglandinas, status ácido-básico, aminoácidos, lípidos y
electrolitos.

6.1. Plasma sanguíneo

De la vena yugular se tomará 20 mL de 5 cerdos/tratamiento y se le adicionará heparina sódica, se
centrifugará a 3000 rpm por 20 minutos a 20 °C. Seguido, el status ácido-básico se determinará por
los análisis de pH, PCO2, SB, BB y BE, mediante un equipo Astrup (Astrup, 1963).
Los leucocitos se analizarán por frotis sanguíneo y colorante de giemsa; la hemoglobina, por el
método Hemotest; el hematocrito según Wintrobe y las proteínas totales por Biuret, serán leídas
mediante un espectrofotómetro ultravioleta.

6.2. Suero sanguíneo

Después de la extracción de sangre de la vena yugular de 5 cerdos/tratamiento, 15 ml de sangre se

depositarán en tubos sin revestimiento de plástico. Seguido las muestras de sangre se centrifugarán
a 8000 rpm y 4 ºC durante 10 min. Mediante Kit enzimáticos se determinarán las IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, TNF, y la prostaglandina PG2.

Mediante un espectrofotómetro ultravioleta y Kit enzimáticos se cuantificarán los electrolitos. Para

determinar los aminoácidos séricos 1 ml de muestra y 2.5 ml de solución de ácido tricloroacético al
7.5% se mezclarán a fondo, seguido se centrifugará a 12.000 rpm y 4 ºC durante 15 minutos.
Después, el fluido sobrenadante se recogerá y la concentración de aminoácidos se determinará
mediante un analizador de intercambio iónico AA.

Para determinar los lípidos totales, triglicéridos, colesterol total, lipoproteínas de alta densidad
(LAD), lipoproteínas de baja densidad (LBD) y las lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD), se
utilizarán métodos enzimáticos colorimétricos, mediante la utilización de Kits y un
espectrofotómetro ultravioleta. También se calculará el índice aterogénico (IA), de acuerdo con la
relación informada por Salma et al. (2007): IA=LBD/LAD.

7. Evaluar el peso relativo de las porciones comestibles y la calidad de la carne de

cerdos alimentados con suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp. nativas
del municipio de Montería.

Al finalizar el experimento se sacrificarán 5 cerdos/tratamiento en un matadero comercial. Antes

del sacrificio los animales se mantendrán en ayuna durante 16 horas, solo con agua ad libitum
(Terán et al., 2004).

Se realizará un pesaje antes del sacrificio, después del sacrificio se pesará la canal (costillar, grasa
perirrenal, lomo, solomo, paleta, lacón, jamón y panceta). Los diferentes cortes se separaron en
carne, grasa más piel y hueso.

La calidad de la carne se determinará por la terneza, pérdida de goteo, flacidez, pérdida por
cocción, luminosidad, grasa dorsal (paleta, lomo y principio, centro y final del músculo glúteo),
grasa intramuscular, pH (45 min y 24 horas post mortem) y humedad (Terán et al., 2004 y Sánchez
et al., 2011).
En los músculos longissimus dorsi y semitendinosus de 5 cerdos/tratamiento se determinará la
materia seca, cenizas, proteína bruta y extracto etéreo según la AOAC (2006). Los aminoácidos y
los lípidos se determinarán según la metodología descripta en el acápite 5.4.

Para la calidad sensorial de la carne, se seleccionarán los músculos longissimus dorsi y

semitendinosus después de la maduración de la carne y se conformará un panel de catadores con
perfecto estado de salud, sin hábitos de fumar o consumidores habituales de café y/o bebidas
alcohólicas, edades entre 20 y 55 años. Se seguirá la metodología descrita por Tan et al. (2009). Los
parámetros para la calidad sensorial encuestados serán: Aroma (normal y anormal), Sabor (normal
y anormal), Dureza (Normal, dura, muy dura y muy blanda), Color (Normal, pálido e intenso).

8. Evaluar el peso relativo de los órganos digestivos y vísceras; así como la

morfometría, el pH, la exclusión competitiva de microorganismos y la producción
de ácidos grasos volátiles en el tracto gastrointestinal de cerdos alimentados con
suplementaciones de cepas de Lactobacillus spp. nativas del municipio de Montería.

Después del sacrificio, 5 cerdos/tratamiento se seleccionarán al azar para determinar el peso

absoluto y la longitud del esófago, estómago, intestinos delgado y grueso y ciego. Además se
pesarán el corazón, hígado, riñones, bazo y páncreas. También, se tomarán y refrigerarán en
congelación muestras de ciego para la determinación del pH.

Pasados 24 horas del sacrificio, las muestras (ciego) se descongelarán hasta alcanzar la
temperatura ambiente, seguido se cortarán varias porciones de ciego y se homogenizarán en
forma de pasta en un mortero de parmela. Luego las muestras se pesarán en un vidrio reloj de 2 g,
se añadirá 10 ml de agua destilada y se homogenizará en un vortex por 2 min. A esta preparación
se le determinará el pH en un potenciómetro digital Bantex modelo 300 A, calibrado con
soluciones buffer de pH 7 y 10.

Al sacrificio de los cerdos, se extraerá 5 ciegos/tratamiento y mediante técnica PCR a tiempo

real, se determinará Staphylococcus aureus, Lactobacillus salivarius, Ruminococcus forques,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium y
Clostridium lituseburens según la metodología descrita por Simpson et al. (1999). Los
AGCC totales e individuales (ácido acético, propiónico, butírico, valérico e isovalérico) se
determinarán por cromatografía gaseosa según la metodología de Abou-Donia et al. (2008).

1. Resultados esperados

 Obtener a partir de cepas probióticas, un nuevo suplemento alimenticio para cerdos en

crecimiento y establecer el mejor tratamiento.
 Incrementar los indicadores productivos de los cerdos en las etapas productivas, debido
a su efecto promotor de crecimiento no antibiótico.
 Reducir la incidencia del síndrome diarreico, así como modular una mejor respuesta
inmunológica y mayor circulación de nutrientes séricos, por el incremento de una
exclusión competitiva en el TGI.
 Mejorar la calidad de la carne de cerdos, por una reducción de los lípidos perjudiciales
e incremento de los aminoácidos esenciales.
 Difundir la importancia de la aplicación de los probióticos como suplemento
alimenticio, para el sector porcícola.

6. Referencias

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