Facultad de Farmacia.

Universidad de Granada Departamento de Química Física.

Práctica 1
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
UNA MEZCLA DE SUSTANCIAS
 Objetivo de la práctica:

Determinar las concentraciones de vitamina B2 y B12

en una mezcla de ambas, utilizando un método
espectrofotométrico.
Fundamentos teóricos
La ley más importante sobre la absorción de radiación electromagnética

en disoluciones, es la de Beer : A=abc

Siendo:

P0 Ps P0= Potencia de la radiación incidente

Ps= Potencia de la radiación a la salida

b b= espesor de la cubeta que contiene a

la muestra

Ps Ps / P0 = Transmitancia
- log — = - log T = A =abc A = Absorbancia (adimensional)
P0 a = absortividad molar (L . mol-1. cm-1 )
c = concentración molar (moles/L)

A = - log T = - log ( T.100/100) = - log T% + 2 ; A = 2 – log T%

 Determinación de a:
1.- Registro del espectro de la sustancia ( A frente a la longitud de onda, λ )

Longitud de onda λ (nm)

2.- Selección de la longitud de onda máxima ( λmax) en el espectrofotómetro

3.- Preparación de disoluciones patrón de concentraciones conocidas.

4.- Medida de la Absorbancia (A) de cada disolución de concentración

conocida a la longitud de onda seleccionada ( λmax)

Concentración Absorbancia (A)

C1 A1
C2 A2
C2 A3
C3 A4
C4 A5
C5 A6
 5.- Representación de A (absorbancia) frente a C (concentración).

y2 6.- Trazar la recta que mejor se ajuste

a los datos experimentales. Si pasa
por el origen se cumple la ley de Beer

y1 y la pendiente será a.b

(absortividad . espesor de la cubeta).

x1 x2 C
Nota: Para determinar la pendiente por el método gráfico, se toman dos puntos de
la recta (no experimentales): (y2 ,x2) e (y1 , x1) y se plantea la siguiente expresión

y2 − y1
Pendiente =
x2 − x1
 Análisis de mezclas
Amezcla = Acomponente 1 + Acomponente 2+ Acomponente 3+ ....

1.- Se escogen tantas λmax como componentes tenga la mezcla.

445 nm
550 nm

Longitud de onda (nm)

En nuestro caso serán dos: 445 nm (máximo de la vitamina B2) y 550 nm

(máximo de la vitamina B12)
2.- Se determinan las absortividades molares de cada
vitamina mediante la ley de Beer, a las 2 λmax
seleccionadas:

445 445 550

a B2 ;a B12 ;a B12

a 550
B2 = 0 (No absorbe a esa λ )
Se establece el sistema de ecuaciones:

A550
mezcla =a 550
B2 ⋅ b ⋅ cB 2 + a 550
B12 ⋅ b ⋅ cB12 = a 550
B12 ⋅ b ⋅ cB12
445
Amezcla = aB445
2 ⋅ b ⋅ c B2 + a B12 ⋅ b ⋅ c B12
445

Calculamos cB2 y cB12

Método experimental
 Esquema de un espectrofotómetro de haz simple.

Lámpara W
Rendijas

Red
Detector
Muestra

Indicador
 Espectrofotómetros:

Spectro 23

SP-2100P+

El manejo de cada uno de ellos se indica a continuación.

Manejo del SP-2100P+
Encender el espectrofotómetro pulsando el botón rojo.
Seleccionar la longitud de onda mediante las flechas.
El modo de medida (transmitancia o absorbancia) con el botón MODE.
 Abrir la tapa del
portamuestras

Colocar las cubetas

de la referencia y la
muestra en los lugares
señalados.

Entre R y S1 se encuentra
el obturador (en esa
posición intermedia, la
Muestra transmitancia debe ser
Referencia 0%)
Cuando la radiación atraviesa la referencia, debemos ajustar al 100 %T.

Para ello, pulsar el botón que indica 100%T.

 Tirar suavemente del mando externo

Cuando la radiación incida sobre el obturador,

la transmitancia debe ser del 0 %. De no ser así,
la fijaremos pulsando el botón 0%T
 Si seguimos tirando del mando externo,
la radiación incide sobre la muestra y
podremos leer el valor de transmitancia.

Si deseamos el valor de absorbancia,

pulsaremos el botón MODE
Manejo del Spectro 23
Encender el espectrofotómetro
Seleccionar Absorbance pulsando A T / C F,
Ajustar la longitud de onda mediante el mando adecuado.
Abrir la tapa del receptáculo que contiene los portacubetas.
Colocar la referencia en
el camino de la radiación.
Introducimos la muestra en el portacubetas adecuado.

Cerrar la tapa.
Pulsar en 0 de A, 100% T (corresponde a la referencia)
Cuando la referencia es atravesada por la radiación,

el valor de Absorbancia debe ser 0.000

Con la tapa cerrada y tirando del mando suavemente, la muestra queda
colocada en la trayectoria de la radiación.
Efectuar la medida de absorbancia
Método experimental
Partiremos de dos disoluciones de las vitaminas B2 y B12:

1º) Disolución madre (DM) de vitamina B2

que contiene 0’030 g disueltos en 1 L de agua
(peso molecular de la vitamina B2 = 376’4 g/mol).

2º) Disolución madre de vitamina B12

que contiene 0’150 g disueltos en 1 L de agua
(peso molecular de la vitamina B12 = 1355’4 g/mol).
 Material

Células de vidrio
de 1 cm de espesor Tubos de ensayo

2 Pipetas graduadas de 10 ml Disoluciones de Vitamina B2 y B12

1.- Registrar los espectros visibles de cada una de las
disoluciones anteriores (vitamina B2 y vitamina B12) y
calcular la longitud de onda a la cual presentan el máximo
de absorción.

λmax B2 = 445 nm

λmax B12 = 550 nm

2 - Preparar 9 disoluciones de vitamina B2, tomando 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ml
de la disolución madre de vitamina B2 (0,030 g/L)
completando hasta 10 ml con agua destilada.
Concentración de la disolución madre (DM) de vitamina B2 : 0,030 g/L
Expresada en molaridad sería: ( 0,030 g/L) / (376,4 g/mol) = 7.97 10-5 M
donde 376,4 g/mol es el peso molecular de la vitamina B2 .
Concentración en cada tubo: VDM . CDM = VFinal . CFinal

Tubo 1 (1 mL) Î 1. 7,97 .10-5 = 10 . C1 Î C1 = 7,97 .10-6 M

Tubo 1 (2 mL) Î 2. 7,97 .10-5 = 10 . C2
Tubo 1 (3 mL) Î 3. 7,97 .10-5 = 10 . C3
Tubo 1 (4 mL) Î 4. 7,97 .10-5 = 10 . C4
Tubo 1 (5 mL) Î 5. 7,97 .10-5 = 10 . C5
Tubo 1 (6 mL) Î 6. 7,97 .10-5 = 10 . C6
Tubo 1 (7 mL) Î 7. 7,97 .10-5 = 10 . C7
Tubo 1 (8 mL) Î 8. 7,97 .10-5 = 10 . C8
Tubo 1 (9 mL) Î 9. 7,97 .10-5 = 10 . C9
Î C2 = 1,59 .10-5 M
Î C3 = 2,39 .10-5 M
Î C4 = 3,19 .10-5 M
Î C5 = 3,99 .10-5 M
Î C6 = 4,78 .10-5 M
Î C7 = 5,58 .10-5 M
Î C8 = 6,38 .10-5 M
Î C9 = 7,17 .10-5 M

Es decir, basta multiplicar la concentración del tubo 1 por: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

4.- Medir la absorbancia de cada uno de estos tubos a la longitud
de onda del máximo: 445 nm. La vitamina B2 no absorbe a 550 nm.

Vitamina B2

c (mol/L) A(λ=445 nm)

7,97E-06
1,59E-05
2,39E-05
3,19E-05
3,99E-05
4,78E-05
5,58E-05
6,38E-05
7,17E-05
5.- Construir una curva de calibrado para la longitud de onda de 445 nm,
representando A (absorbancia) en ordenadas frente a concentración
en moles/L , en abscisas .

1,600
1,400
1,200
1,000
0,800
A

0,600
0,400
0,200
0,000
0,00E + 00 2,00E -05 4,00E -05 6,00E -05 8,00E -05
c (m o l/L )
6.- Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer y calcular la
absortividad molar de la vitamina B2 , por el método gráfico y por
el método de los mínimos cuadrados, a dicha longitud de onda.

a445B2 = ……….. L. mol-1.cm-1

7.- Preparar 9 disoluciones de vitamina B12, tomando 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ml
de la disolución madre (DM) de vitamina B12 (0,150 g/l)
completando hasta 10 ml con agua destilada.
Concentración de la disolución madre (DM) de vitamina B12 : 0,150 g/L
Expresada en molaridad sería: ( 0,150 g/L) / (1355,4 g/mol) = 1,107 10-4 M
donde 376,4 g/mol es el peso molecular de la vitamina B12 .
Concentración en cada tubo: VDM . CDM = VFinal . CFinal

Tubo 1 (1 mL) Î 1. 1,107 .10-4 = 10 . C1 Î C1 = 1,11 .10-5 M

Tubo 1 (2 mL) Î 2. 1,107 .10-4 = 10 . C2
Tubo 1 (3 mL) Î 3. 1,107 .10-4 = 10 . C3
Tubo 1 (4 mL) Î 4. 1,107 .10-4 = 10 . C4
Tubo 1 (5 mL) Î 5. 1,107 .10-4 = 10 . C5
Tubo 1 (6 mL) Î 6. 1,107 .10-4 = 10 . C6
Tubo 1 (7 mL) Î 7. 1,107 .10-4 = 10 . C7
Tubo 1 (8 mL) Î 8. 1,107 .10-4 = 10 . C8
Tubo 1 (9 mL) Î 9. 1,107 .10-4 = 10 . C9
Î C2 = 2,21 .10-5 M
Î C3 = 3,32 .10-5 M
Î C4 = 4,43 .10-5 M
Î C5 = 5,54 .10-5 M
Î C6 = 6,64 .10-5 M
Î C7 = 7,75 .10-5 M
Î C8 = 8,86 .10-5 M
Î C9 = 9,96 .10-5 M

Es decir, basta multiplicar la concentración del tubo 1 por: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

8.- Mediremos las absorbancias a 445 y 550 nm de las disoluciones de B12.

Vitamina B12

c (mol/L) A(λ=445 nm) A(λ = 550 nm)

1,11 .10-5

2,21 .10-5

3,32 .10-5

4,43 .10-5

5,54 .10-5

6,64 .10-5

7,75 .10-5

8,86 .10-5

9,96 .10-5
9.- Construir las curvas de calibrado para la longitudes de onda de
445 y 550 nm, representando A (absorbancia) en ordenadas frente a
concentración en moles/L , en abscisas .

Vitamina
B12
10.- Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer y calcular la
absortividad molar de la vitamina B12 , por el método gráfico y por
el método de los mínimos cuadrados, a las dos longitudes de onda
(445 y 550 nm).

a445B12 = ……….. L. mol-1.cm-1

a445B12 = ……….. L. mol-1.cm-1

Valoración simultánea de una mezcla de vitaminas B2 y B12

Mezclar x ml de vitamina B2 con y ml de vitamina B12 .

Medir la absorbancia de la mezcla a las longitudes de onda

de 445 nm y 550 nm.

Plantear el sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, indicado

en los fundamentos teóricos.

Calcular las concentraciones de ambas vitaminas en la mezcla problema.