Produccion de Nano Particula Por Via Fermentativa PDF

Instituto Politécnico Nacional
Unidad profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
TÍTULO DEL TRABAJO:
PRODUCCIÓN DE NANO PARTÍCULAS POR VÍA FERMENTATIVA
TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN

CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOTECNÓLOGO
PRESENTA:
LEOBARDO OTTMAR PALMA GALLARDO
DIRIGIDA POR:
DIRECTOR EXTERNO:
DR. FERMÍN PÉREZ GUEVARA
DIRECTOR INTERNO:
DRA. ROSA ISELA CARBAJAL DE NOVA
EVALUADOR EXTERNO:
M. EN C. RICARDO SÁNCHEZ RICO
EVALUADOR INTERNO:
DR. FRANCISCO ARTURO RAMÍREZ ORTEGA
México, D. F. Enero 2016

AGRADECIMIENTOS
A mis padres, el M.C. Leobardo Palma Cortes y a la Nutr. Miriam Senorina Gallardo Mena,
y a mi hermana, Miriam Yaxkin Palma Gallardo, por confiar en mí y apoyarme durante todo
mi desempeño tanto académico como al desarrollar el presente trabajo, además de
brindarme una experiencia inolvidable durante sus visitas. A la IBT. Beatriz Elizabeth Flores
Reyna por apoyarme con los trámites académicos, redacción de la tesina, a de más de
brindarme apoyo moral y compañía durante mi formación como Ingeniero Biotecnólogo.
Al Dr. Fermín Pérez Guevara por apoyarme, financiar, corregir, dirigir y brindarme un lugar
donde desarrollar un proyecto en mi área de interés.
A mis compañeros de laboratorio, el M. en C. Joel Alba Flores y el M. en C. Ricardo Sánchez

Rico por su apoyo, paciencia, enseñanza y guía durante el aprendizaje de las técnicas en
el laboratorio, desarrollo experimental y la redacción de la tesina; al PhD. Gurusamy
Muniasamy y al Técnico en Investigación Luis Francisco Flores Velazco por su apoyo y
consejos durante la elaboración de este proyecto.
A mis asesores la Dra. Rosa Isela Carvajal de Nova y al Dr. Francisco Arturo Ramírez
Ortega, por sus consejos y discusiones para la redacción del presente trabajo.
A la IBT. Mónica Paola Lozada Cruz por su apoyo, compañía y amistad, durante mi carrera
y por su bicicleta. Al igual que a mis compañeros, del laboratorio de Ecología de suelos, la
M. en C. Fabiola Gómez Basurto, la Dra. Verónica Lorena Cano García y al I.Q. Mario
Hernández Guzmán, por su compañía, apoyo y amistad y al M- en C. Hugo y al M. en C.
Abdi Escalante Sánchez por sus enseñanza y consejos.
A UPIBI por brindarme una educación y formación como profesionista de calidad y al

CINVESTAV por brindarme un lugar donde elaborar el proyecto.
Y a mis mascotas, Waffle, Shampoo, Schwarzer y Lupi, por animarme y darme apoyo
siempre.
“La única manera de hacer un trabajo genial es amar lo que haces”. Steve Jobs
“Eppur si move”. Galileo Galilei

RESUMEN
Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son poliésteres de reserva producidos por bacterias
cuando son sometidas a condiciones de estrés. El avance de la biotecnología ha permitido
que su implementación como biopolímeros se haya convertido en una alternativa
sustentable para contrarrestar no sólo los aumentos en el precio del petróleo y sus
derivados, sino además su posible agotamiento.
Sin embargo su obtención a través de microorganismos procariontes tiene la limitante de

que éstos los almacenan en su interior (Matin et al., 1979). Por esta razón se transformó a
la cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 con el plásmido PKMJ26, el cual le permite
expresar la enzima (obtenida de Pseudomonas putida) PHA sintasa II (phaC2) en la
membrana de sus vesículas de excreción de proteínas. Este mecanismo permite que, una
vez producidas las nanopartículas de PHA dentro de las vesículas, éstas sean exportadas
al exterior de la célula, lo cual representa una ventaja al disminuir los métodos y costos de
extracción y lisis celular (Muniasamy & Pérez-Guevara, 2014).
Actualmente, obtener PHAs no es suficiente, también es necesario poder predecir y

optimizar su producción con el fin de hacer de ésta una solución rentable. Para lograr este
cometido se llevaron a cabo varios experimentos con el objetivo de desarrollar un modelo
matemático (mediante el uso de métodos numéricos y condiciones lógicas) que ayude en
la predicción del comportamiento de la cepa transformada S. cerevisiae J26 bajo diferentes
condiciones de crecimiento, además de simular, con el modelo desarrollado, su
comportamiento en un proceso por lote alimentado.
El modelo desarrollado se comparó y baso con los modelos de Monod, con y sin inhibición,
Gompertz, Ludeking-Piret, Aborthey y Williamson, Pirt, Cooper y Galaction.
TABLA DE CONTENIDO
ANTECEDENTES .............................................................................................................. 1
POLIHIDROXIALCANOATOS........................................................................................ 1
BIOSÍNTESIS DE PHAS ................................................................................................ 2
SACCHAROMYCES CEREVISIAE ................................................................................ 3
SISTEMA DE EXPORTACIÓN DE VESÍCULAS ........................................................ 5
EFECTO CRABTREE ................................................................................................ 6
S. CEREVISIAE J26 .................................................................................................. 7
FASES DEL CRECIMIENTO ..................................................................................... 8
MODELOS MATEMÁTICOS ........................................................................................ 10
CONDICIONES LÓGICAS .............................................. ¡Error! Marcador no definido.
MÉTODOS NUMÉRICOS ............................................................................................ 11
CULTIVO POR LOTE .................................................................................................. 12
FORMACIÓN DE BIOMASA .................................................................................... 12
FORMACIÓN DE PRODUCTO ................................................................................ 16
CONSUMO DE SUSTRATO .................................................................................... 16
CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO .......................................................................... 16
CULTIVO LOTE (QUIMIOSTATO SIMPLE ETAPA) .................................................... 18
AIREACIÓN ................................................................................................................. 19
JUSTIFICACION.............................................................................................................. 23
OBJETIVOS .................................................................................................................... 24
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 24
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 24
METODOLOGÍA .............................................................................................................. 25
INÓCULO .................................................................................................................... 26
FERMENTACIONES ................................................................................................... 26
MATERIAL....................................................................................................................... 28
CEPAS ........................................................................................................................ 28
MEDIOS ...................................................................................................................... 28
NIVEL MATRAZ ....................................................................................................... 28
FERMENTADOR DE 5L........................................................................................... 28
METODOLOGÍA DE CÁLCULOS .................................................................................... 30
CALCULO DE ERRORES ........................................................................................... 30
BIOMASA (PESO SECO) ........................................................................................ 30
ETANOL (CROMATOGRAFÍA DE GASES) ............................................................. 31
GLUCOSA (AZUCARES REDUCTORES) ............................................................... 31
PROTEÍNAS (LOWRY) ............................................................................................ 31
BALANCE DE CARBONO ........................................................................................... 32
RENDIMIENTOS Y CONSTANTES, TEÓRICAS Y EXPERIMENTALES ..................... 34
RENDIMIENTO TEÓRICO DE SUSTRATO A BIOMASA 𝒀𝑿𝒔: ................................ 34
RENDIMIENTO DE SUSTRATO A BIOMASA YXS: .................................................. 34
RENDIMIENTO TEÓRICO DE ETANOL A SUSTRATO 𝒀𝑬𝒕𝒔:................................. 35
RENDIMIENTO DE ETANOL A SUSTRATO YETS: ................................................... 35
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO ....................................................... 35
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE FORMACIÓN DE ETANOL 𝒒𝑬𝒕 .............................. 35
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CONSUMO DE SUSTRATO 𝒒𝑺 .............................. 35

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CONSUMO DE PROTEÍNAS 𝒒𝑷𝒓𝒐𝒕 ....................... 36
TÉCNICAS ...................................................................................................................... 37
CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA (DNS) (MILLER, 1959) .......................................... 37
CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA POR PESO SECO: ................................................ 37
CUANTIFICACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES: ..................... 38
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY (LOWRY ET AL.,

1951): .......................................................................................................................... 38
RECUPERACIÓN DE NANO –PHAS .......................................................................... 40
EQUIPOS ........................................................................................................................ 41
PROCESAMIENTO DE DATOS ...................................................................................... 42
MODELOS MATEMÁTICOS ........................................................................................ 42
MODELOS EMPLEADOS A NIVEL MATRAZ .............................................................. 43
MONOD (M) ............................................................................................................. 43
MONOD CON INHIBICIÓN (M-I).............................................................................. 43
GOMPERTZ (G)....................................................................................................... 43
MONOD CON CONSUMO DE PROTEÍNAS (M-P) .................................................. 44
MODELOS INICIAL EMPLEADOS PARA EL CULTIVO POR LOTE Y LOTE

ALIMENTADO EXPONENCIAL: .................................................................................. 45
RESULTADOS ................................................................................................................ 46
NIVEL MATRAZ CON S. CEREVISIAE ATCC 9763 .................................................... 46
CINÉTICA CON LA CEPA SILVESTRE (WT) .......................................................... 46
NIVEL MATRAZ CON S. CEREVISIAE J26 ................................................................. 50
CINÉTICA 1 (F1) ...................................................................................................... 50
CINETICA 4 (F4) ...................................................................................................... 54
CINÉTICA 2 (F2) ...................................................................................................... 58
CINÉTICA 3 (F3) ...................................................................................................... 62

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES DE LAS CINÉTICAS A NIVEL
MATRAZ ...................................................................................................................... 65
BIOMASA ................................................................................................................ 66
GLUCOSA ............................................................................................................... 66
PROTEÍNAS O NITRÓGENO DISPONIBLE ............................................................ 66
ETANOL .................................................................................................................. 67
YXS Y YETS ................................................................................................................ 67
BALANCES DE CARBONO ..................................................................................... 67
AJUSTES..................................................................................................................... 69
WT ........................................................................................................................... 69
F1 ............................................................................................................................ 70
F4 ............................................................................................................................ 71
F2 ............................................................................................................................ 72
F3 ............................................................................................................................ 73
ANÁLISIS DE LAS SIMULACIONES........................................................................ 74
BASES PARA EL MODELO DEL LOTE ALIMENTADO............................................... 81
LOTE ALIMENTADO EXPONENCIAL ......................................................................... 84
S. CEREVISIAE ATCC WT (CLA-WT) ................................................................... 84
SIMULACIONES ...................................................................................................... 87
RECOMENDACIONES .................................................................................................... 97
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 98
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 99
NOMENCLATURA ......................................................................................................... 102

TABLA DE FIGURAS
FIGURA 1 (A) ESTRUCTURA DEL PHA, (B) ESTRUCTURA DEL PHA MÁS COMÚN
POLI-HIRDROXI-3-BUTIRATO (PH3B) ..................................................................... 1
FIGURA 2 (A) RUTAS METABÓLICAS PARA LA PRODUCCIÓN DE PHAS Y
ALMACENAMIENTO DE LÍPIDOS, PARTIENDO DE ACETIL COA; (A) FORMACIÓN
DE LAS TRIGLICÉRIDOS (TAGS) , (B) PRODUCCIÓN DE PHASCL (CADENA DE
LONGITUD CORTA), (C) PRODUCCIÓN DE PHAMCL (CADENA DE LONGITUD
MEDIA), (D) PRODUCCIÓN DE ESTERES DE CERAS (WE) (THOMSON ET AL.,
2010). (B) REACCIÓN GENERAL PARA LA FORMACIÓN DE PHAS EMPLEANDO
PHAC2 (IMAGEN OBTENIDA DE METACYC). ......................................................... 3
FIGURA 3 RUTA METABÓLICA CORRESPONDIENTE A LA FORMACIÓN DE PHAS EN
EL CITOSOL DE S CEREVISIAE .............................................................................. 4
FIGURA 4 RUTA DE OXIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS EN EL PEROXISOMA .... 4
FIGURA 5 SISTEMA DE TRANSPORTE DE PROTEÍNAS AL EXTERIOR POR MEDIO
DE VESÍCULAS ......................................................................................................... 5
FIGURA 6 SITIOS SNARE EN VESÍCULAS E INTERACCIÓN CON LA MEMBRANA ...... 6
FIGURA 7 RUTA DE RESPIRACIÓN Y FERMENTACIÓN ................................................ 7
FIGURA 8 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE S. CEREVISIAE J26, EXCRETANDO LAS
NANOPARTÍCULAS. FOTOGRAFÍA TOMADA POR MUNIASAMY .......................... 8
FIGURA 9 FASES DEL CRECIMIENTO MICROBIANO SEGÚN DUTTA. LAG (A), LAG
ACELERADA (B), EXPONENCIAL (C), DESACELERACIÓN (D) ,ESTACIONARIA
(E) Y MUERTE CELULAR (F). (DUTTA, 1986) .......................................................... 9
FIGURA 10 COMPORTAMIENTO DE µ [1/H] CON RESPECTO AL SUSTRATO [G/L] .. 13
FIGURA 11 MODELO DE GOMPERTZ ........................................................................... 14
FIGURA 12 µ [1/H] Y X [G/L] SEGÚN EL MODELO DE GOMPERTZ (IZQUIERDA),
MODELO DE GOMPERTZ Y SU DERIVADA Y SU PUNTO DE INFLEXIÓN
FLECHA PUNTEADA (DERECHA). ......................................................................... 15
FIGURA 13 NUMERO DE POTENCIA PARA UNA TURBINA RUSHTON CON RELACIÓN
AL NÚMERO DE REYNOLDS ................................................................................. 21
FIGURA 14 LINEALIZACIÓN DE NP EN FUNCIÓN DE RE ............................................ 21
FIGURA 15 ERROR EN LA MEDICIÓN CON RESPECTO A LOS ML DE MUESTRA (A) Y
CON RESPECTO A LA DIFERENCIA DE PESOS (B) ............................................. 30
FIGURA 16 EVOLUCIÓN DE LA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE WT A 250 RPM ....... 47
FIGURA 17 COMPORTAMIENTO DE µ SEGÚN EL MÉTODO DIFERENCIAL (DX) Y EL
LOGARÍTMICO (LN) CONTRA EL SUSTRATO CON EL PASO DEL TIEMPO DE LA
CINÉTICA CON S. CEREVISIAE WT A 250 RPM ................................................... 48
FIGURA 18 COMPORTAMIENTO DE YXS Y YETS (IZQUIERDA) Y QS Y QET CON EL
PASO DEL TIEMPO (DERECHA) DE LA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE WT A 250
RPM ......................................................................................................................... 48
FIGURA 19 ERRORES PARA EL CARBONO TOTAL EN LA CINÉTICA CON S.
CEREVISIAE WT A 250 RPM .................................................................................. 49
FIGURA 20 EVOLUCIÓN DE LA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A 200 RPM DE LA
CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A 200 RPM ................................................... 51
LOGARÍTMICO (LN) CON EL PASO DEL TIEMPO DE LA CINÉTICA CON S.
CEREVISIAE J26 A 200 RPM .................................................................................. 51
PASO DEL TIEMPO (DERECHA) DE LA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A 200
RPM ......................................................................................................................... 52
FIGURA 23 ERRORES PARA EL CARBONO TOTAL EN LA CINÉTICA CON S.
FIGURA 24 EVOLUCIÓN DE LA 2DA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A 200 RPM 55
LOGARÍTMICO (LN) CONTRA EL SUSTRATO CON EL PASO DEL TIEMPO DE LA
2DA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A 200 RPM ............................................. 56
PASO DEL TIEMPO (DERECHA) DE LA 2DA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A
200 RPM .................................................................................................................. 56
FIGURA 27 ERRORES PARA EL CARBONO TOTA EN LA 2DA CINÉTICA CON S.
FIGURA 28 EVOLUCIÓN DE LA CINÉTICA F2 A 250 RPM........................................... 59
LOGARÍTMICO (LN) EL PASO DEL L TIEMPO (DERECHA) DE LA CINÉTICA F2 A
250 RPM .................................................................................................................. 60
PASO DEL TIEMPO (DERECHA) DE LA CINÉTICA F2 A 250 RPM ...................... 60
FIGURA 31 ERRORES EN EL CARBONO TOTAL EN LA CINÉTICA F2 A 250 RPM.... 61
FIGURA 32 EVOLUCIÓN DE LA CINÉTICA F3 A 250 RPM............................................ 63
LOGARÍTMICO (LN) CON EL PASO DEL TIEMPO (DERECHA) DE LA CINÉTICA
F3 A 250 RPM ......................................................................................................... 63
PASO DEL TIEMPO (DERECHA) DE LA CINÉTICA F3 A 250 RPM ....................... 64
FIGURA 35 ERRORES EN EL CARBONO TOTAL EN LA CINÉTICA F3 A 250 RPM.... 64
FIGURA 36 SIMULACIONES DE LOS AJUSTES CON LOS MODELOS MONOD (M)
(SUPERIOR IZQUIERDA), GOMPERTZ (G) (SUPERIOR DERECHA), MONOD CON
INHIBICIÓN (M-I) (INFERIOR IZQUIERDA) Y MONOD Y PROTEÍNAS (M-P)
(INFERIOR DERECHA) PARA LA CINÉTICA WT ................................................... 69
(INFERIOR DERECHA) PARA LA CINÉTICA F1 ..................................................... 70
FIGURA 41 VALORES DE P, Q Y R2 PARA LOS DIFERENTES MODELOS
PROPUESTOS ........................................................................................................ 82
FIGURA 42 VARIACIÓN DE LAS CONSTANTES EN LOS DIFERENTES MODELOS ... 83
FIGURA 43 RESULTADOS EXPERIMENTALES PARA LA CINÉTICA CLA-WT EN EL
REACTOR DE 5L..................................................................................................... 84
FIGURA 44 PERFIL DE LAS RPM Y DOT DURANTE LA CINÉTICA CLA-WT ............... 85
FIGURA 45 FLUJOS DE ALIMENTACIÓN Y DE AIRE DURANTE LA CINÉTICA CLA-WT
................................................................................................................................. 85
FIGURA 46 PERFIL DE LA Μ DURANTE LA CINÉTICA CLA-WT POR EL MÉTODO
DIFERENCIAL Y LOGARÍTMICO ........................................................................... 86
FIGURA 47 SIMULACIÓN DE LA CINÉTICA CLA-WT SIN CONSIDERAR LE
TRANSFERENCIA DE OXÍGENO Y CON UN KS=0, ALIMENTACIÓN
EXPONENCIAL CONSTANTE (IZQUIERDA), CONSIDERANDO LA ALIMENTACIÓN
POR PULSOS (DERECHA) ..................................................................................... 87
TRANSFERENCIA DE OXÍGENO Y CON UN KS=0.025 H-1, CON UNA
ALIMENTACIÓN EXPONENCIAL CONSTANTE (IZQUIERDA), CONSIDERANDO LA
ALIMENTACIÓN POR PULSOS (DERECHA) .......................................................... 88
TRANSFERENCIA DE OXÍGENO Y CON UN KS=0.025 Y SC=0.03, CON UNA
ALIMENTACIÓN EXPONENCIAL CONSTANTE (IZQUIERDA), CONSIDERANDO LA
ALIMENTACIÓN POR PULSOS (DERECHA) .......................................................... 88
FIGURA 50 SIMULACIÓN DE LA CINÉTICA CLA-WT CONSIDERANDO LAS
ECUACIONES PARA EL KLA DE COOPER Y CL. .................................................. 90
FIGURA 51 SIMULACIÓN DE LA CINÉTICA CLA-WT CONSIDERANDO LAS
ECUACIONES PARA EL KLA DE COOPER Y CL Y C*........................................... 91
FIGURA 52 SIMULACIÓN DE LA CINÉTICA CLA-WT LAS ECUACIONES PARA EL KLA
SEGÚN GALACTION Y CL. .................................................................................... 92
FIGURA 53 SIMULACIÓN DE LA CINÉTICA CLA-WT LAS ECUACIONES PARA EL KLA
SEGÚN GALACTION, CL Y C*. ............................................................................... 93
TABLA DE TABLAS
TABLA. 1 CONDICIONES DE OPERACIÓN DE LAS FERMENTACIONES .................... 27
TABLA. 2 MEDIOS DE CULTIVO PARA EXPERIMENTOS A NIVEL MATRAZ............... 28
TABLA. 3 MEDIOS DE CULTIVO PARA LOS DIFERENTES SISTEMAS DEL REACTOR
DE 5 L ...................................................................................................................... 28
TABLA. 4 FORMULACIÓN DE LOS ELEMENTOS TRAZA ............................................. 29
TABLA. 5 FORMULACIÓN DE LAS VITAMINAS ............................................................. 29
TABLA. 6 VALORES PARA EL BALANCE DE CARBONO.............................................. 32
TABLA. 7 COMPOSICIÓN DE LA POLIPEPTONA EMPLEADA (FLUKA ANALYTICAL.
SIGMA-ALDRICH) ................................................................................................... 33
TABLA. 8 SOLUCIONES A, B Y C PARA PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LOWRY ....... 39
TABLA. 9 DILUCIÓN DE BSA PARA LA CURVA ESTÁNDAR ........................................ 39
TABLA. 10 RESULTADOS PROMEDIO DE LA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE WT A
250 RPM .................................................................................................................. 46
TABLA. 11 RESULTADOS PROMEDIO DE LA CINÉTICA CON S. CEREVISIAE J26 A
200 RPM .................................................................................................................. 50
TABLA. 12 RESULTADOS PROMEDIO DE LA CINÉTICA F2 A 250 RPM ..................... 58
TABLA. 13 RESULTADOS PROMEDIO DE LA CINÉTICA F3 A 250 RPM ..................... 62
TABLA. 14 COMPARACIÓN DE LAS CONDICIONES INICIALES Y CONSTANTES
EXPERIMENTALES ................................................................................................. 65
TABLA. 15 VALORES ENCONTRADOS PARA EL AJUSTE CON EL MODELO DE
MONOD ................................................................................................................... 74
TABLA. 16 RESULTADOS ENCONTRADO PARA EL AJUSTE CON EL MODELO DE
MONOD CON INHIBICIÓN ...................................................................................... 76
TABLA. 18 VALORES ENCONTRADOS PARA EL AJUSTE CON EL MODELO DE
GOMPERTZ............................................................................................................. 78
TABLA. 17 RESULTADOS ENCONTRADO PARA EL AJUSTE CON EL MODELO DE
MONOD Y CONSUMO DE PROTEÍNAS ................................................................. 80
TABLA. 19 CONSTANTES, PARÁMETROS, MEDIDAS DEL BIORREACTOR Y
CONDICIONES INICIALES DE LA PRIMERA SIMULACIÓN................................... 87
TABLA. 20 CONDICIONES PARA LAS SIMULACIONES PARA PREDECIR EL DOT .... 89
TABLA. 21 SÍMBOLOS Y LETRAS GRIEGAS ............................................................... 102
TABLA. 22 SUBÍNDICES ............................................................................................... 103
ANTECEDENTES
POLIHIDROXIALCANOATOS
Los polihidroxialcanoatos o PHAs, son poliésteres lineales de (R)-3-hidroxiácidos en los

cuales el grupo carboxilo de un monómero forma un enlace tipo éster con el grupo hidroxilo
del monómero siguiente (Figura 1.). Son producidos en la naturaleza por la acción de las
bacterias al consumir los carbohidratos o lípidos. Las bacterias usualmente los producen
como material de almacenamiento de carbono y energía (Matin et al., 1979) en condiciones
de ausencia de fósforo o nitrógeno (Schlegel et al., 1961), y a que los PHAs son insolubles
en agua, por lo cual su acumulación no genera cambios en la presión osmótica (Peters,
Becher, & Rehm, 2007).
Existen más de 150 monómeros diferentes, los cuales se pueden combinar para dar este
tipo de materiales con propiedades extremadamente diferentes (Almeida, Ruiz, Lopez, &
Pettinari, 2004).
A) B)
Figura 1. (A) Estructura del PHA, (B) estructura del PHA más común Poli-Hirdroxi-3-Butirato (PH3B)
Los PHAs, son polímeros cristalinos relativamente rígidos y quebradizos. Son plásticos
biodegradables, es decir, pueden ser degradados por la actividad enzimática de bacterias,
hongos y algas, o degradarse de forma natural hasta formar CO2 y H2O (Jendrossek,
Schirmer, & Schlegel, 1996). Se emplean en la producción de biopolímeros ya que pueden
ser materiales termoplásticos o elastómeros, con puntos de fusión de entre 40 y 180°C,
degradándose a temperaturas ligeramente por encima de su punto de fusión (De Koning,
1995); pueden procesarse por los equipos tradicionales, utilizándose mayormente en
películas e inyecciones. Existen múltiples aplicaciones potenciales en los ámbitos
medicinales y farmacéuticos debido a su biodegradabilidad y solubilidad en el cuerpo
humano.
A pesar de las evidentes ventajas de los PHAs, frente a los plásticos derivados del petróleo,
su uso está muy limitado debido a su alto costo de producción, ya que usualmente los
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microorganismos que los producen, los acumulan en su interior, siendo necesario un
proceso de lisis, así como varias etapas de purificación para su recuperación (Almeida et
al., 2004).Por estos motivos, gran parte de las investigaciones realizadas sobre la
producción de los PHAs en los últimos años se han concentrado en reducir los costos de
producción y purificación, así como en aumentar la productividad, utilizando diversas
estrategias (Almeida et al., 2004), entre las que se encuentran, el rastreo de nuevas cepas
productoras, la optimización de los métodos de cultivo (Cserjan-Puschmann et al., 1999)
(Notley-McRobb et al., 2002) y la producción de PHAs utilizando cepas recombinantes
(Poirier et al., 1995).
BIOSÍNTESIS DE PHAS
En condiciones normales de crecimiento, los PHAs se producen a causa de que el Acetil-

CoA, derivado del piruvato por medio de la glucolisis, es enviado a la ruta del ácido
tricarboxílico (TCA), como consecuencia, el CoA inhibe a la acetyl-CoA-acetiltransferasa y
la síntesis de PHAs. Sin embargo, cuando existe limitación de nutrientes (Oxígeno,
Nitrógeno o Fósforo) y carbono en exceso (Schlegel et al., 1961), la actividad de la NADH
(nicotinamida adenina dinucleótido hidrogenada) oxidasa disminuye, por lo que el NADH se
incrementa e inhibe a la citrato-sintasa e isocitrato-dehidrogenasa, ocasionando que la
acetil-CoA-acetiltransferasa consuma el CoA.
Esta reacción genera acetoacetil-CoA e inicia la síntesis de PHAs. La elevada

concentración de NADH/NAD, ocasionada por una limitación de oxígeno, desencadena la
síntesis de PHAs, el cual se transforma en el nuevo aceptor de electrones. También durante
el crecimiento normal, la 3-ketiolasa se inhibe por la coenzima-A libre, que sale del ciclo de
Krebs; sin embargo, cuando entra la acetil-CoA al ciclo de Krebs, éste es restringido
(durante la limitación de nutrientes sin carbono), por lo que la acetil-CoA excedente es
canalizada para la biosíntesis de PHB (Ratledge and Kristiansen 2001).
Durante la obtención de PHAs, la PHA sintasa II (phaC2) juega un papel importante, ya que
mediante esta enzima se polimerizan los derivados de Acetil-CoA (Thomson, Summers &
Sivaniah, 2010) (Figura 2.), al emplearla en un organismo recombinante, es necesario que
los precursores se encuentren en el citosol (Figura 3.). En este proyecto, para nuestra cepa
transformada, S. cerevisiae J26, empleara los derivados de Acetil CoA que se encuentren
en libres en el citosol (Figura 5.), para producir y excretar PHAs en sus vesículas
exportadoras de proteínas.
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A
Figura 2. (A) Rutas metabólicas para la producción de PHAs y almacenamiento de lípidos, partiendo de Acetil
CoA; (a) formación de las triglicéridos (TAGs) , (b) producción de PHASCL (cadena de longitud corta), (c)
producción de PHAMCL (cadena de longitud media), (d) producción de esteres de ceras (WE) (Thomson et al.,
2010). (B) Reacción general para la formación de PHAs empleando phaC2 (imagen obtenida de Metacyc).
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Se empleó una cepa de S. cerevisiae debido a 2 razones principales, la primera es que de

forma natural puede producir los precursores que emplea la phaC2 (derivados de Acetil-
CoA, Figura 3.), para la producción de PHAs, además de liberarlos en su citosol; segundo,
posee la capacidad de exportar péptidos al exterior por medio de vesículas (Bennett &
Scheller, 1993).
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Figura 3. Ruta metabólica correspondiente a la formación de PHAs en el citosol de S cerevisiae
Figura 4. Ruta de oxidación de los ácidos grasos en el peroxisoma
Se pueden sintetizar PHAs en el citosol de S. cerevisiae empleado compuestos

intermediarios de la ß-oxidación, ruta para la formación de ácidos grasos en el peroxisoma,
(Figura 4.) debido a que en algunos estudios se demostró que del 15 al 25% de la actividad
enzimática de oxidación de ácidos grasos se encuentra en el citosol de la levadura. Zhang,
Carlson & Srienc, (2006) sugirieron que la ß-oxidación puede ocurrir parcialmente en el
citosol de S. cerevisiae y esta no se limita únicamente a los peroxisomas, como se creía
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anteriormente. Esto explica porque en otros trabajos los PHAs se sintetizaron de forma
natural en las levaduras (Zhang et al., 2006).
Sin embargo una de las desventajas de emplear una levadura para la producción de
metabolitos de interés, es su capacidad de producción de etanol al entrar en vía
fermentativa (debido a la ausencia de oxígeno), o por el efecto Crabtree (Pfeiffer & Morley,
2014), el cual puede ser ocasionado por un exceso de fuente de carbono (en el interior de
la levadura), o por una deficiencia (pero no ausencia) de oxígeno, lo cual ocasiona una
disminución en la formación de biomasa.
SISTEMA DE EXPORTACIÓN MEDIANTE VESÍCULAS
Una de las características distintivas de las levaduras como S. cerevisiae, es su sistema

natural de exportación de proteínas al exterior por medio de vesículas (Figura 5). El sistema
de endomembranas (el responsable de las vesículas y el aparato de Golgi, entre otros),
proporciona una vía intracelular para la circulación de sus materiales a trave´s de vesículas
(un empaque) inclusive para la exportación de algunos de ellos. Para dirigirlos emplea un
sistema proteico de señales que le permite darles el destino final para el cual fueron
sintetizados, ya sea en el interior de la célula o en el medio extracelular.
Figura 5 Sistema de transporte de proteínas al exterior por medio de vesículas
El recorrido intracelular realizado por las vesículas excretoras de proteínas, tiene lugar
desde el aparato de Golgi hasta la membrana plasmática (Figura 5).
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Esto se logra al fusionar las vesículas con la membrana, y para esto las levaduras poseen
los sitios SNARE (del inglés Proteínas receptoras SNAP), estas proteínas sirven como
receptores para distinguir a qué membrana se deben fusionar las vesículas. En este caso
la célula utiliza las moléculas complementarias v-SNARE (localizadas en la vesículas) y las
t-SNARE (situadas en el destino o target), las cuales fusionan las vesículas a la membrana.
Cuando se reconoce el conjunto v-SNARE /t-SNARE, se libera el contenido de la vesícula
al exterior de la célula (Figura 6). Esta es la proteína más importante que está presente en
la superficie de las vesículas secretoras de proteínas. Una vez que es excretado el
contenido de las vesículas, la levadura puede hacer dos cosas, a) acoplar la vesícula y sus
proteínas a la membrana o b) reciclar las vesículas, enviándolas nuevamente al aparato de
Golgi, para evitar el incremento de la membrana.
Figura 6 Sitios SNARE en vesículas e interacción con la membrana
EFECTO CRABTREE
Este efecto describe el fenómeno que la levadura, S. cerevisiae, experimenta al producir

etanol en condiciones aeróbicas (en presencia de oxígeno) en lugar de producir la biomasa
a través del TCA. El aumento de la concentración interna de glucosa acelera la glicólisis,
ocasionando la producción de elevadas cantidades de adenosin trifosfato (ATP) a través de
la fosforilación a nivel de sustrato. Esto inhibe la fosforilación oxidativa realizada por el ciclo
de Krebs a través de la cadena de transporte de electrones y por lo tanto, disminuye el
consumo de oxígeno.
Al entrar en la vía fermentativa, las levaduras producen 2 ATP por glucosa y reciclan el
NADH+, mientras que por la vía de TCA producen 18 ATP por glucosa. Se cree que este
fenómeno evolucionó como un mecanismo de competencia debido a la naturaleza
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antiséptica del etanol, en otras palabras, la levadura no puede pasar el exceso de azúcar a
través de la trayectoria principal y simplemente la desvía a través de una ruta alternativa, el
etanol (Figura 7) (Pfeiffer & Morley, 2014).
Como se observa en la Figura 7, el piruvato es el precursor tanto de la vía del TCA

(respiración celular), como de la vía de producción de etanol (vía fermentativa), las cuales
son vías opuestas; esto quiere decir que en presencia de oxígeno el piruvato toma la ruta
del ciclo de Krebs, y la producción de etanol no se efectúa. No obstante según la teoría del
efecto Crabtree, puede haber producción de etanol y biomasa al mismo tiempo, pero, la
generación de biomasa se verá reducida debido a que parte del piruvato será desviado para
la producción de etanol. Por consecuencia para tener una mayor producción de biomasa,
es necesario disminuir la producción de etanol.
Figura 7 Ruta de respiración y fermentación
S. CEREVISIAE J26
Debido a que sí existen fuentes disponibles en S. cerevisiae para la producción de PHAs

en el citoplasma, en el trabajo de Muniasamy & Pérez-Guevara (2014) se aprovechó el
sistema de vesículas excretoras de proteínas como estrategia para evitar la lisis celular,
que se requiere en bacterias para extraer los PHAs almacenados. Esto lo vuelve un sistema
más rentable, en términos de los procesos downstream que pueden ser evitados. Para
lograrlo se fusionó a la phaC2 con la región conservada de los SNARE, y de esta forma se
asegura que los nano-PHAs se produzcan en las vesículas y sean excretados.
S. cerevisiae J26 es la cepa recombinante, creada al transformar a S. cerevisiae ATCC9763

con el plásmido PKMJ26, el cual le permite expresar la enzima phaC2, de Pseudomonas
putida CA-3, para producir las nano partículas de interés, empleando los dominios
conservados de SNARE, para integrarla en sus vesículas excretoras de proteínas
(Muniasamy & Pérez-Guevara, 2014) y para exportar las nano partículas de PHAs al
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exterior. Este plásmido también le confiere a J26, la resistencia al antibiótico Zeocina, como
su marcador de selección, y es necesario cultiva esta cepa a una concentración de 0.5 µl/ml
para que el plásmido se conserve en las siguientes generaciones.
Considerando que vesícula viaja desde el aparato de Golgi a la membrana celular (Figura
5) únicamente posee el tiempo de su trayectoria para la generación de PHAs, debido a que
es un trayecto relativamente cortó y rápido, por esto las partículas que se generan son
nano-PHAs (Figura 8).
Figura 8 microscopia electrónica de S. cerevisiae J26, excretando las nanopartículas. Fotografía tomada por
Muniasamy
FASES DEL CRECIMIENTO
Al graficar la concentración de la biomasa con respecto al tiempo, el crecimiento bacteriano,

en un cultivo por lote se pueden observar un comportamiento que posee cuatro diferentes
fases principales (Acevedo, et al. 2002): fase de adaptación (lag), fase exponencial (exp),
fase estacionaria (log), y fase de muerte celular (Figura 9).
Fase se adaptación o rezago (Lag): Durante esta fase, las bacterias se adaptan a las
nuevas condiciones de crecimiento. En este el período las bacterias están madurando y
aún no tienen la posibilidad de dividirse. También, se sintetizan el ARN, enzimas y otras
moléculas. En esta fase los microorganismos no están latentes. A su vez, esta fase se
puede dividir en 2: Lag, cuando no hay velocidad de crecimiento; y la Lag acelerada, la
pequeña curva entre lag y fase exponencial (Dutta, 1986).
Fase Exponencial: es un período caracterizado por la duplicación celular, es decir, el

número de microorganismos que se generan por unidad de tiempo es proporcional a la
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población actual. Si el crecimiento no se limita, la duplicación continuará a un ritmo
constante, por lo tanto el número de células de la población se duplica con cada período de
tiempo consecutivo. Para este tipo de crecimiento exponencial, la representación gráfica
del logaritmo del número de células frente al tiempo genera una línea recta. La pendiente
de la recta en la figura depende de la base del logaritmo utilizada, y, dependiendo de esa
base, en la literatura se han asignado diferentes nombres para dicha pendiente y se han
aplicado diferentes fórmulas para su estudio. También afectan a la pendiente las
condiciones de crecimiento, que afectan la frecuencia de la división celular y la probabilidad
de que ambas células hijas sobrevivan. Debido a que el crecimiento exponencial no puede
continuar indefinidamente, también se puede dividir esta fase en dos partes, la exponencial,
donde los microrganismo crecen a la µmax; y la fase de desaceleración, la curva entre fase
exponencial y estacionaria; se llega a esta fase cuando se acaba el sustrato, el oxígeno o
por la acumulación de desechos tóxicos (Dutta, 1986).
Fase estacionara (Log): La tasa de crecimiento disminuye o es casi nula, como

consecuencia del agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos tóxicos. Se
caracteriza por un valor constante del número de microorganismos a medida que la tasa de
crecimiento de las bacterias se iguala con la tasa de muerte bacteriana.
Muerte celular: Las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren, la viabilidad del cultivo
también decae.
Figura 9 Fases del crecimiento microbiano según Dutta. Lag (A), lag acelerada (B), exponencial (C),
desaceleración (D) ,estacionaria (E) y muerte celular (F). (Dutta, 1986)
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MODELOS MATEMÁTICOS
Son las ecuaciones que expresan relaciones, variables, parámetros, entidades y relaciones
entre variables y/o entidades u operaciones, para estudiar y predecir el comportamiento de
sistemas complejos ante situaciones complicadas de observar en la realidad. Estos se
pueden clasificar:
Según la información de entrada, con respecto a la función del origen de la información

utilizada para construir los modelos:
 Modelos heurísticos: Se basan en las explicaciones sobre las causas o

mecanismos naturales que dan lugar al fenómeno estudiado.
 Modelos empíricos: Emplean las observaciones directas o los resultados de
experimentos del fenómeno estudiado.
Según el tipo de representación o aplicación:
 Modelos cualitativos o conceptuales: usan figuras o gráficos, en general predicen

si el estado del sistema, la dirección, incremento o disminución de alguna magnitud.
 Modelos cuantitativos o numéricos: usan números para representar sistema, e
incluyen fórmulas y algoritmos matemáticos que relacionan los valores numéricos.
El cálculo con los mismos permite representar el proceso físico o los cambios
cuantitativos del sistema modelado.
Según la aleatoriedad, según si a una entrada o situación inicial pueden corresponder o no

diversas salidas o resultados, en este caso los modelos se clasifican en:
 Determinista: Se conoce de manera puntual la forma del resultado, no hay

incertidumbre. Además, los datos utilizados para alimentar el modelo son
completamente conocidos y determinados.
 Estocástico o Probabilístico: se desconoce el resultado esperado, pero si su
probabilidad y existe por tanto incertidumbre.
Clasificación según su aplicación u objetivo:
 Modelo de simulación o descriptivo: se emplean en situaciones medibles de

manera precisa o aleatoria, pueden ser precisos o probabilísticos. Pretenden
predecir qué sucede en una situación concreta dada.
 Modelo de optimización: determinan el punto exacto para resolver alguna
problemática. Cuando la optimización es entera o no lineal, combinada, se refiere a
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modelos matemáticos poco predecibles, sin embargo pueden acoplarse a alguna
alternativa existente y aproximada en su cuantificación (métodos numéricos). Este
tipo de modelos compara diversas condiciones, casos o valores de un parámetro y
optimiza según el criterio elegido.
 Modelo de control: Para conocer con precisión como está algo en un momento
específico. Ayudan a decidir qué nuevas medidas, variables o parámetros deben
ajustarse para lograr un resultado o estado del sistema.
En biotecnología los modelos pueden clasificarse según la distribución de la biomasa

(Mitchell et al., 1999):
 Segregados: Consideran que la biomasas puede encontrarse en diferentes estados

fisiológicos. O tratan de predecir lo que ocurre dentro de microorganismo, rutas
metabólicas y enzimas.
 No segregados: Consideran que las células son indistinguibles unas de otras. Es
indiferente lo que ocurre dentro de la célula.
Para este proyecto, los modelos matemáticos dinámicos se emplearon para describir el
comportamiento de los microorganismos: actividad y crecimiento, formación de producto,
consumo de sustrato, con el paso del tiempo; bajo diferentes condiciones físicas o químicas
tales como: aireación o cantidad de sustrato o biomasa inicial (Zwietering et al., 1990), para
la detección de las zonas críticas de la producción y la distribución de proceso, y para
optimizar la producción y los rendimientos (Gelmi Weston, 1999).
Para construir, mejorar y validar estos modelos, es necesario hacer un seguimiento de la

mayor cantidad de variables posibles para posteriormente modelar con ecuaciones. Para
desarrollar los modelos, se emplearon modelos heurísticos, ya propuestos (Mauch et al.,
1997) que se emplean para obtener una aproximación al comportamiento de la formación
de biomasa, etanol y consumo de sustrato; y se mejoraron, acoplándolos a condiciones
empíricas, por medio de condiciones lógicas. A su vez el modelo se empleara para realizar
simulaciones y por medio de algoritmos y métodos numéricos se optimizara el valor de sus
constantes.
MÉTODOS NUMÉRICOS
El análisis numérico o cálculo numérico diseñar y emplea algoritmos, los cuales, a través
de números y reglas matemáticas, simulan procesos matemáticos complejos aplicados a
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procesos. El análisis numérico se realiza empleando computadoras, ya que son útiles para
cálculos matemáticos extremadamente complejos.
Muchas de las operaciones matemáticas pueden llevarse adelante a través de la

generación de una serie de números que a su vez alimentan de nuevo el algoritmo
(retroalimentación). Esto proporciona un poder de cálculo y refinamiento, el cual, a medida
que va completando un ciclo, llega a la solución. El error y la retroalimentación, sirven para
determinar hasta cuándo deberá continuar con el ciclo, o si nos estamos alejando de la
solución del problema.
Estos métodos se aplican cuando se necesita un valor numérico como solución a un

problema matemático, y los procedimientos exactos o analíticos (manipulaciones
algebraicas, teoría de ecuaciones diferenciales, métodos de integración, etc.) son
incapaces de dar una respuesta exacta. Aunque la precisión no sea completa, se pueden
obtener intervalos que engloban la gran mayoría de resultados experimentales.
En este proyecto, se emplearan los métodos numéricos para encontrar los valores de las
constantes que cada modelo posee y que proporcionen un mejor ajuste. A causa de que
los modelos no son sistemas lineares, sino más bien, un sistema de ecuaciones
diferenciales, derivadas parciales y ecuaciones lineales que además poseen condiciones
lógicas, se emplearan los algoritmos, Simplex (Dantzig, 1940), para ajustar ecuaciones
lineales y el algoritmo de Levenberg–Marquardt (LMA) (Marquardt, 1963) y se evaluara su
ajuste por medio de mínimos cuadrados entre el valor experimental y el simulado (), además
de analizar el ajuste del modelo según los teoremas P y Q, según los cuales P indica la
probabilidad de que el modelo desarrollado prediga mal, debe tener valores menores o
iguales a 0.001; y Q nos indica la probabilidad de que el modelo este prediciendo
adecuadamente, debe tener valores cercanos a 1 (ModelMaker, User Manual, 2003).
CULTIVO POR LOTE
Las ecuaciones comúnmente empleadas son las que predicen el crecimiento por lote y
describen cómo se comporta el microorganismo en un ambiente parcialmente cerrado,
debido a que existe transferencia de oxígeno; es decir cómo crece, forma productos y
consume el o las fuentes de alimentación.
FORMACIÓN DE BIOMASA
MODELO DE MONOD
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Propuesto por Jacques-Lucien Monod, este modelo implica que la µ se puede ajustar a una
hipérbola con giro, donde μmax es el punto máximo que alcanza la hipérbola y Ks es la mitad
del tiempo requerido para alcanzar la mitad de la μmax (Monod, 1949).
𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑆
𝜇= … 𝐸𝑐(1)
𝐾𝑠 + 𝑆
Figura 10 Comportamiento de µ [1/h] con respecto al Sustrato [g/L]
MONOD CON INHIBICIÓN POR ETANOL
Es necesario multiplicar a la Ec.1, que describe la velocidad de crecimiento (µ), por la

𝐸𝑡
función (1 − 𝐾𝐸𝑡), la cual implica un descenso de la µ cuando se alcanza la concentración
de etanol definida por KEt (concentración inhibitoria) Hinshelwood (1946).
𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑆 𝐸𝑡
𝜇= ∗ (1 − ) … 𝐸𝑐(2)
𝐾𝑠 + 𝑆 𝐾𝐸𝑡
MODELO DE GOMPERTZ
El modelo de Gompertz se describe por la siguiente ecuación de forma sigmoidea:

(𝑏−𝑐∗𝑡)
𝑦 = 𝑎 ∗ 𝑒 −𝑒 … 𝐸𝑐(3)
Podemos cambiar sus literales por variables, dejando el modelo de 2 formas:
Para cuando la biomasa inicia en valores muy cercanos a cero, y en lugar de la biomasa se
cuenta el número de células por litro, y después se ajusta con el peso aproximado de una
célula (Navarro-mtz & Pérez-guevara, 2014).
(µmax−λ∗t)
X = Xmax ∗ e−e … Ec(4)
O podemos considerar el desplazamiento para cuando la biomasa inicial no tiene valores

cercanos a cero, por lo que podemos definir variables de interés, tal que:
𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑒 𝜇𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑒
𝑐= … 𝐸𝑐(5); 𝑏= ∗𝜆+1 … 𝐸𝑐(6);
𝑎 𝑎
𝑋𝑓 𝑋
𝑎 = 𝐴 = 𝑙𝑛 ( ) … 𝐸𝑐. 6; 𝑦 = 𝑙𝑛 ( ) … 𝐸𝑐. 8
𝑋𝑜 𝑋𝑜
Donde el modelo toma Xo como punto de partida (0).
El sustituyendo Ec.5, Ec.6, Ec.7 y Ec.8 en Ec.4, queda expresada de la forma (Zwietering
et al., 1990):
𝜇𝑚𝑎𝑥∗𝑒
( ∗(𝜆−𝑡)+1)
𝑋𝑓
𝑋 𝑋𝑓 ln( )
𝑋𝑜
ln ( ) = ln ( ) ∗ 𝑒 −𝑒 … 𝐸𝑐. 9
𝑋𝑜 𝑋𝑜
𝑋𝑓
Donde 𝐴 = 𝑙𝑛 ( ) es el punto máximo que alcanza el modelo, la pendiente de la fase
𝑋𝑜
exponencial es la μmax, y λ es el punto donde la pendiente tocaría el eje de las x.
Figura 11 Modelo de Gompertz
Sin embargo, el eje “y” de la gráfica del modelo de Gompertz está en escala de logaritmos
naturales, por lo que es necesario reestructurar la ecuación de Gompertz (Ec.9),
despejando Xo, para obtener la biomasa (Cyré, Vignolo, & Garro, 2004):
𝜇𝑚𝑎𝑥∗𝑒∗(𝜆−𝑡)
[1+ ]
𝑋𝑓
ln( )
𝑋𝑓 𝑋𝑜
ln( )∗𝑒 −𝑒
𝑋 = 𝑋𝑜 ∗ 𝑒 𝑋𝑜 … 𝐸𝑐. 10
Para saber el comportamiento de µ si sabemos que:
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𝑑𝑥 𝑑𝑥 𝑑𝑥
=𝜇∗𝑋 … 𝐸𝑐. 11; 𝜇 = … 𝐸𝑐. 11. 𝑎; 𝑠𝑖 = 𝑋´ … 𝐸𝑐. 12
𝑑𝑡 𝑑𝑡 ∗ 𝑋 𝑑𝑡
Derivando X (Ec.10) para obtener la Ec.12 y sustituyéndola en la Ec.11.a, obtendremos la

ecuación que describe el comportamiento de µ, y esta quedaría:
𝜇𝑚𝑎𝑥∗𝑒∗(𝜆−𝑡) 𝜇𝑚𝑎𝑥∗𝑒∗(𝜆−𝑡)
[1+ ] [1+ ]
𝑋𝑓
𝑋´ 𝑋𝑓
ln( )
ln( )
𝑋𝑜
𝜇 = = µ𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑒 1 ∗ 𝑒 𝑋𝑜 ∗𝑒 −𝑒
… 𝐸𝑐. 13
𝑋
Figura 12 µ [1/h] y X [g/L] según el modelo de Gompertz (Izquierda), modelo de Gompertz y su derivada y su
punto de inflexión flecha punteada (derecha).
Como podemos observar en la Figura 12, con el modelo de Gompertz es posible predecir
el comportamiento de la biomasa (X [g/L]) y de µ [1/h], con el paso de tiempo, la principal
ventajas de emplear este modelo es que su curva es capaz de representar con mucha
precisión a 3 de las fases de crecimiento (lag, exponencial y log) y además es asimétrica
en su punto de inflexión, es decir que el punto de inflexión de le curva no necesariamente
se encuentra en el centro de la fase exponencial, esto es importante ya que no
necesariamente el cambio de la fase log a exponencial y el de la exponencial a log son
simétricos (Winsor, 1932), sin embargo este modelo no toma en cuenta a la concentración
del sustrato.
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FORMACIÓN DE PRODUCTO
MODELO DE LUDEKING-PIRET
Este modelo hace dos consideraciones para la formación de producto, donde, α asocia la
formación de producto a µ y β es la formación de producto independiente (Ludeking-Piret,
1959).
𝑞𝑃 = 𝛼 ∗ 𝜇 + 𝛽 … 𝐸𝑐. 14
Cuando la formación de producto se asocia a crecimiento α es mayor que 0, cuando no

está asociado al crecimiento β es mayor a 0. También la formación de producto puede ser
parcialmente asociado a ambos (Röels y Kossen, 1978), (Gaden, 1959).
CONSUMO DE SUSTRATO
MODELO DE ABORTHEY Y WILLIAMSON
Este modelo considera que el consumo del sustrato se emplea para 3 procesos: crecimiento
𝜇 𝑞𝑃
o formación de biomasa ( ), formación de producto ( ) y mantenimiento celular (𝑚𝑠),
𝑌𝑋𝑆 𝑌𝑃𝑆
el cual es independiente de µ (Pirt, 1965).
𝜇 𝑞𝑃
−𝑞𝑆 = + + 𝑚𝑠 … 𝐸𝑐. 15
𝑌𝑋𝑆 𝑌𝑃𝑆
Donde YXS y YPS son los rendimientos de formación de biomasa (X) y producto (P),
respectivamente, dependientes del sustrato (S).
CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO
En este tipo de cultivo se inicia con un lote y posteriormente se alimenta sustrato, con
diferentes finalidades, a) para mantener la formación de producto o biomasa constante, o
b) para mantener un crecimiento exponencial de biomasa. El cultivo por Lote alimentado
tiene tres variantes de acuerdo a la función oferta de la alimentación del sustrato:
Exponencial, Constante, Lineal.
Si se desea un crecimiento es exponencial, la alimentación que éste requiere también lo

es, y como sólo hay entrada y no salida, el volumen también incrementara de forma
exponencial, por lo que el crecimiento únicamente se verá limitado por la transferencia de
oxígeno del equipo.
En este caso, alimentación Exponencial, el flujo de alimentación se rige por la siguiente

ecuación:
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𝑞𝑠 ∗ 𝑋𝑜 ∗ 𝑉𝑜
𝐹=( ) ∗ 𝑒 𝜇𝑜𝑝 ∗𝑡 … 𝐸𝑐. 16
𝑆𝑎
Donde la µop es la µ a la que deseamos crezca el microorganismo durante la alimentación

exponencial, y debe ser lo más cercana a la µmax, pero menor a ésta y nunca mayor, ya que
se considera que el cambio de metabolismo completamente respiratorio a metabolismo
respiro-fermentativo ocurre a una µcrítica, representada por el 60% de µmax. Para conocer el
incremento del flujo que se requiere y suponiendo que la µ de crecimiento sea constante
durante el crecimiento del microorganismo, es necesario aplicar la trasformada de Laplace
al término 𝑒 𝜇∗𝑡
1 1
𝐿{𝑒 𝜇𝑜𝑝 ∗𝑡 } = = … 𝐸𝑐. 17
𝑠 − 𝑎 1 − 𝜇𝑜𝑝
Por lo que la ecuación también se puede expresar en función del tiempo como:
𝑡
𝑞𝑆 ∗ 𝑋𝑜 ∗ 𝑉𝑜 1
𝐹(𝑡) = ( )∗( ) … 𝐸𝑐. 16. 𝑎
𝑆𝑎 1 − 𝜇𝑜𝑝
A causa de que únicamente se está alimentando y no hay una salida de volumen, el cambio
del volumen se rige por la ecuación:
𝑉(𝑡) = 𝑉𝑜 + 𝐹(𝑡) … 𝐸𝑐. 18
Las ecuaciones para la formación de biomasa, producto y consumo de sustrato se verán

𝐹
modificadas considerando que cuando se alimenta hay una tasa de dilución 𝐷 = (𝑉), y
quedan expresadas de la siguiente forma:
𝑑𝑋 𝐹(𝑡)
= (𝜇 − )∗𝑋 … 𝐸𝑐. 19
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
𝑑𝑃 𝐹(𝑡)
= 𝑞𝑃 ∗ 𝑋 − ∗𝑃 … 𝐸𝑐. 20
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
CONSUMO DE SUSTRATO
𝑑𝑆 𝐹(𝑡)
= −𝑞𝑆 ∗ 𝑋 − ∗ (𝑆𝑎 − 𝑆) … 𝐸𝑐. 21
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
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CULTIVO LOTE (QUIMIOSTATO SIMPLE ETAPA)
Se emplea este tipo de cultivo cuando ya se alcanzó una densidad celular muy elevada y
se desea seguir produciendo biomasa y productos dependientes de ésta. En este tipo de
cultivos el volumen de operación no cambia, lo único que cambia son los flujos de
alimentación y de salida.
Para mantener el volumen constante en este tipo de cultivos en necesario que la entrada
sea igual a la salida, por lo que:
𝐹(𝑡) = 𝐹(𝑡)𝐴 = 𝐹(𝑡)𝑆 … 𝐸𝑐. 22
Ya que deseamos que el crecimiento sea constante:
𝐹
𝐹 = 𝜇𝑐 ∗ 𝑉𝑜𝑝 𝑜 𝐷= … 𝐸𝑐. 23
𝑉𝑜𝑝
Donde la µc también debe ser lo más cercana a la µmax, pero no mayor, para evitar pérdidas
de la biomasa, es decir que si µc*X, o D*X, es mayor a la tasa de crecimiento de la biomasa
(µ*X), la biomasa saldrá del reactor antes de poder duplicarse, a esto se le conoce como
lavado del biorreactor, en otras palabras si la dilución es mayor al crecimiento, no habrá
crecimiento y si es menor, existirá una acumulación del sustrato.
Y las ecuaciones para describir el cambio de biomasa, producto y sustrato, son idénticas a
las de cultivo alimentado, pero con la diferencia de que el flujo y el volumen permanecen
constantes con respecto al tiempo, por lo que quedarían expresadas:
𝑑𝑋 𝐹
= (𝜇 − ) ∗ 𝑋 … 𝐸𝑐. 24
𝑑𝑡 𝑉
𝑑𝑃 𝐹
= 𝑞𝑃 ∗ 𝑋 − ∗ 𝑃 … 𝐸𝑐. 25
𝑑𝑡 𝑉
CONSUMO DE SUSTRATO
𝑑𝑆 𝐹
= −𝑞𝑆 ∗ 𝑋 − ∗ (𝑆𝑎 − 𝑆) … 𝐸𝑐. 26
𝑑𝑡 𝑉
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AIREACIÓN
Otro factor que influye durante las fermentaciones aireadas es el oxígeno disuelto y su
transferencia (Kla), para predecir este comportamiento se emplearan las siguientes
ecuaciones (Galaction et al., 2004):
Debido a que el crecimiento se ve limitado por el oxígeno, la µ se verá afectada según la

disponibilidad de oxígeno (Wincure et al., 1995), por lo que la Ec. 1 cambiara a:
𝜇𝑚𝑎𝑥 𝐶𝐿
𝜇=𝑆∗ ∗( ) … 𝐸𝑐. 27
𝑘𝑆 + 𝑆 𝐶𝑙 + 𝐾𝑂2
Donde Cl es la concentración del oxígeno disuelto y KO2 es la concentración a la que el

crecimiento empieza a volverse lento.
Para predecir el CL se emplea la ecuación:
𝑑𝐶𝐿
= 𝐾𝑙𝑎 ∗ (𝐶 ∗ − 𝐶𝑙) − 𝑞𝑂2 ∗ 𝑋 … 𝐸𝑐. 28
𝑑𝑡
Donde el Kla se estimara por la correlación empírica propuesta por Cooper y Miller (1944):
0.0318 𝑃𝑔 𝑎
𝐾𝑙𝑎 = ∗ ( ) ∗ 𝑉𝑠 𝑏 … 𝐸𝑐. 29
𝐻 𝑉
Donde encontraron los siguientes valores para sus coeficientes: a=0.95 y b=0.67
Y por la ecuación propuesta por Galaction et al. (2004), en la cual se considera que la
biomasa afecta al Kla:
𝑃𝑔 𝑎
𝐾𝑙𝑎 = 188784 ∗ ( ) ∗ 𝑉𝑠 𝑏 ∗ 𝐶𝑠 𝑐 … 𝐸𝑐. 29 − 𝐺
𝑉
Donde según su ajuste, encontraron los siguientes valores parar sus coeficientes:
a=-0.0762, b=0.514 y c=-0.702
Donde:
0.45
2
𝐷𝑖 3
𝑃𝑔 = 𝐶 ∗ (𝑃𝑟𝑒𝑎𝑙 ∗ 𝑟𝑝𝑚 ∗ ) … 𝐸𝑐. 30 𝑃𝑟𝑒𝑎𝑙 = 𝑃𝑜𝑡 ∗ 𝑓𝑐 ∗ 𝑛𝑖 … 𝐸𝑐. 31
𝑄𝑎𝑖𝑟𝑒 0.56
𝐻𝑙 𝐷𝑡 0.5
∗ 𝑉 − 𝑉𝑒𝑙𝑖𝑝
𝑓𝑐 = [𝐷𝑖 𝐷𝑖 ] … 𝐸𝑐. 32 𝐻𝑙 = 𝜋 + 𝐻𝑒𝑙𝑖𝑝 … 𝐸𝑐. 33
9 ∗ 𝐷𝑡 2
4
𝐷𝑖 5 𝑄𝑎𝑖𝑟𝑒
𝑃𝑜𝑡 = 𝑁𝑝 ∗ (𝜌 ∗ 𝑟𝑝𝑠 3 ∗ ) ∗ 1.315𝑥10−7 … 𝐸𝑐. 34 𝑉𝑠 = 𝜋 … 𝐸𝑐. 35
𝐺𝑐 2
4 ∗ 𝐷𝑡
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Kla para ambas ecuaciones estará dado en h.
H es la constante de Henry; ya que el cultivo se llevó a cabo a 30°C, la solubilidad máxima

del O2 en agua a esta temperatura es de 1.16 molO2/L.atm o 37.1 mgO2/L.atm (Dutta, 1986)
o 0.0012 kgmol O2/L.atm (unidades requeridas para emplear la ecuación de Miller).
Hl es la altura del líquido en el tanque [m].
Helip es la altura de la elipse que forma la parte baja del reactor [m].
Dt es el diámetro del tanque [m].
Di es el diámetro del impulsor [m].
Preal es la potencia real [Hp].
Pot es la potencia por agitación [Hp].
fc es un factor que correlaciona las las dimensiones del reactor empleado con las de un
reactor de dimensiones estándar.
ni es el número de impulsores.
Qaire, es el flujo de aire en L/min.
Vs es la velocidad superficial del aire [m/h].
rps o rpm son las revoluciones por minuto empleadas según sus unidades.
El número de potencia se obtendrá de la Grafica que relaciona el número de potencia con

el Reynolds para reactores con turbinas de tipo Rushton (Figura 13).
Página | 20
Figura 13 Numero de potencia para una turbina Rushton con relación al Número de Reynolds
Para facilitar la predicción del número de potencia, se linealizaron diferentes puntos de las
recta y se obtuvo una regresión lineal de 6° orden para describir el comportamiento del
Número de potencia en función del número de Reynolds (Figura 14).
4.5
y = -5E-05x6 + 0.0018x5 - 0.0264x4 + 0.1704x3 - 0.3492x2 - 0.7946x + 4.2807
4 R² = 0.9961
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Figura 14 Linealización de Np en función de Re
Por lo que la ecuación que describe a Np será:

−05 ln(𝑅𝑒)6 +0.0018∗ln(𝑅𝑒)5 −0.0264∗ln(𝑅𝑒)5 +0.1704∗ln(𝑅𝑒)5 −0.3492∗ln(𝑅𝑒)5 −0.7946∗ln(𝑅𝑒)+ 4.2807 )
𝑁𝑝 = 𝑒 (−5∗10
𝑆𝑖 𝑅𝑒 ≥ 4000, 𝑁𝑝 = 6
Donde:
𝑟𝑝𝑚
𝑅𝑒 = 𝐷𝑖 2 ∗ 𝜌 ∗ ∗ 𝜇𝐿
60
Página | 21
ρ es la densidad del medio de cultivo [Kg/L].
µL es la viscosidad del líquido [g/cm3].
qO2 es el consumo de Oxigeno por gramo de célula.

𝜇
𝑞𝑂2 =
𝑌𝑆𝑂2
Página | 22
JUSTIFICACION
Dado que los PHAs poseen propiedades mecánicas similares a varios plásticos sintéticos,
su uso como biopolímeros se ha convertido en una alternativa sustentable para
contrarrestar no sólo el aumento en el precio de dichos derivados del petróleo, sino para
mediar el problema ecológico que surge a la degradación de la mayoría de estos polímeros
sintéticos.
Para su producción, y con el fin de disminuir los costos de separación y purificación de

PHAs, se empleará una cepa trasformada de S. cerevisiae de la cual se aprovechará su
sistema de transporte y excreción de proteínas.
La cepa transformada S. cerevisiae J26, que posee el plásmido PKMJ26, aprovecha este
mecanismo para producir los PHAs, por medio de laenzima pha sintasa, y exportarlos al
exterior.
Así mismo se emplearán simulaciones con los modelos matemáticos desarrollados con el
objetivo de encontrar y establecer mejoras en el rendimiento de biomasa, para así
incrementar la obtención de PHAs.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
 Producir PHAs empleando la cepa transformada S. cerevisiae J26
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desarrollar un modelo matemático que prediga el comportamiento de la cepa

transformada S. cerevisiae J26, bajo diferentes condiciones de proceso.
 Por medio de una simulación por lote alimentado maximizar la producción de
biomasa y disminuir la producción de etanol variando el flujo de alimentación.
 Escalar la producción de las nano-partículas de interés a nivel reactor de 5L en
cultivo por lote alimentado.
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METODOLOGÍA
1) Se realizaron 4 fermentaciones, con la cepa transformada S. cerevisiae J26, y 1
fermentación, con la cepa silvestre S. cerevisiae ATCC9763, a nivel matraz bajo
diferentes condiciones: velocidad de agitación, concentración inicial de biomasa y
de sustrato, realizando el seguimiento de la producción de etanol, biomasa,
consumo de sustrato y proteínas. Al final se recuperaron los nano PHAs producidos.
2) Desarrollar un modelo, empleando los modelos existentes y acoplándolos a

condiciones lógicas, que permita predecir cambios en la producción de biomasa y
etanol, consumo de sustrato y proteínas.
Para la obtención de las constantes relacionadas a cada modelo, se emplearan

métodos numéricos y se verificó el ajuste empleado mínimos cuadrados, y los
teoremas: P y Q.
3) Seleccionar el que mejor ajuste las generaciones de biomasas y etanol, y consumo

de sustrato y proteínas, en las diferentes condiciones, para continuar mejorándolo
al comparar las constantes obtenidas para las diferentes condiciones de operación
y buscar mejoras para el desarrollo de las condiciones lógicas, inducciones o
inhibiciones.
4) Realizar simulaciones con el modelo, empleando un lote seguido de un lote

alimentado con alimentación exponencial para encontrar el flujo de alimentación que
optimice la generación de biomasa y tenga la menor producción de etanol.
5) Si las constantes obtenidas para la cepa trasformada J26 y la cepa silvestre S.

cerevisiae ATCC9763, no son muy diferentes, realizar la fermentación por lote y lote
alimentado, en el reactor de 5L (con la cepa silvestre para ahorrar costos al no
emplear Zeocina), con las condiciones óptimas encontradas para este tipo de
cultivo.
6) Verificar la predicción del modelo con los resultados obtenidos experimentalmente,

si el modelo produjo resultados cercanos a lo real, realizar los ajustes pertinentes
relacionados con la trasferencia de oxígeno en el fermentador, para que este se
aproxime aún más a lo real.
Para maximizar la generación de biomasa, es necesario alcanzar el volumen

máximo del reactor durante el lote alimentado, por lo que los ajustes se pueden
realizar en la distancia entre los impulsores o cantidad de estos a emplear, en el
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volumen inicial, el flujo inicial de alimentación o el incremento de este con respecto
al tiempo, evitando llegar al límite de trasferencia de oxígeno.
Otra opción para mantener la mayor producción de biomasas posible, se puede

realizar un cultivo por lote continuo antes de llegar al límite de trasferencia de
oxígeno del equipo, preferentemente cuando se llegue al límite del reactor.
7) Realizar una fermentación con la cepa trasformada y verificar que el modelo puede
predecir la generación de biomasa y etanol y el consumo de sustrato y anticipar los
posibles problemas causados por la trasferencia de oxígeno, empleando las
estrategias pertinentes (cambiar los volúmenes o flujos o mover los impulsores),
ajustar nuevamente las constantes para la cepa transformada.
8) Validar nuevamente el modelo a nivel reactor agitado
INÓCULO
Se realizó 1 inóculo, en matraces de 500 ml con 100 ml de medio, para cada 3 matraces de
fermentación, los inóculos se realizaron en las mismas condiciones de crecimiento que las
fermentaciones consecutivas (Tabla. 1), cada matraz se inóculo con una asada de la cepa
transformada S. cerevisiae J26, los tiempos de cultivo variaron según el experimento y
posteriormente se realizó la fermentación.
El día previo a cada fermentación se inoculo una caja Petri, con medio YPD adicionado con
Zeocina, y se dejó crecer 24 h en la incubadora a 30°C.
FERMENTACIONES
Todas las fermentaciones se realizaron por triplicado en matraces de 1000 ml con 300 ml
de medio, en una incubadora con agitación. Para conocer las bases del crecimiento de la
cepa S. cerevisiae Se realizaron 4 experimentos, con las siguientes variaciones, y una
fermentación con la cepa S. cerevisiae ATCC 9763, para saber si el plásmido PKMJ26
ocasionó cambios en el crecimiento de J26, se compararan las generación de etanol,
biomasa y tiempo de fermentación, así como la µmax de crecimiento y las constantes de
cada modelo.
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Tabla. 1 Condiciones de operación de las fermentaciones
F1 F4 F2 F3* Wt
RPM 200 200 250 250 250
t inóculo [h] 12 10 12 9 8
T [°C] 30 32 32 32 32
*Para el caso de F3 la cinética se realizó de la siguiente manera, después del inóculo se

realizó una primer fermentación y a las 6 horas (durante la fase exponencial) se cosecho la
biomasa, debido a que se considera que durante esta fase, la µ alcanza su valor máximo
al no existir limitación, al menos por sustrato. Y se inició una segunda etapa de fermentación
a la que se le dio el seguimiento.
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MATERIAL
CEPAS
Cepa silvestre (Wt): Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763
Cepa transformada: Saccharomyces cerevisiae J26 (Muniasamy & Pérez-Guevara, 2014).
MEDIOS
NIVEL MATRAZ
Tabla. 2 Medios de cultivo para experimentos a nivel matraz
YPD YPD adicionado con Zeocina
Glucosa 15 g/L
Glucosa 15 g/L
Extracto de levadura 10 g/L
Extracto de levadura 10 g/L
Polipeptona 10 g/L
Polipeptona 10 g/L
Zeocina 0.5 μl/ml
pH 5.6
pH 5.6
Donde el medio YPD se empleó para las cinéticas de la sepa silvestre S. cerevisiae ATCC
9763 y el medio YPD adicionado con Zeocina se empleó para las fermentaciones con la
cepa transformada J26, a causa de que la Zeocina es su marcador de selección.
FERMENTADOR DE 5L
Tabla. 3 Medios de cultivo para los diferentes sistemas del reactor de 5 L
Inoculo Lote alimentado
(NH4)2SO4 [g/L] 7.5
KH2PO4 [g/L] 8 9
MgSO4 7H20 [g/L] 6.14 5.11
ZnSO4 7H20 [g/L] 0.89 0.106
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K2SO4 [g/L] 3.5
Na2SO4 [g/L] 0.28
Glucosa [g/L] 12 500
Vitaminas [ml/L] 12.5 12.5
Elementos traza [ml/L] 10 10
Tabla. 4 Formulación de los Elementos traza
Elementos traza en 100ml Tabla. 5 Formulación de las vitaminas
EDTA [mg] 1.5 Vitaminas en 100 ml
MnCl2 • 4H2O [mg] 46.9 Inositol [mg] 22.6
CuSO4 • 5H2O [mg] 78.2 Tiamina [mg] 3.4
CoCl2 • 6H2O [mg] 91.5 Ac Pantoténico [mg] 1.8
Na2MoO4 • 2H2O [mg] 58.7 Piridoxina [mg] 1.2
CaCl2 • 2H2O [mg] 397.3 d-biotina [mg] 46
FeSO4 • 7H2O [mg] 549
Las formulaciones de los medios para el Lote y lote alimentado exponencial y continuo, se
cambiaron según lo que se ha reportado por otros autores (Melchy et al., 2000), (Van Hoeek
et al.,2000), para obtener concentraciones elevadas de biomasa (hasta 150 g/L) es
necesario adicionar vitaminas y emplear un medio mineral para el crecimiento de S.
cerevisiae.
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METODOLOGÍA DE CÁLCULOS
CALCULO DE ERRORES
Para el cálculo de los errores se consideraron los errores de medición correspondientes a

las diferentes etapas de los equipos.
BIOMASA (PESO SECO)
Para obtener el error se consideró lo siguiente: se toman 4ml de muestra con micropipetas
de 0.5 µl de error cada una. La balanza granataria donde se pesan las membranas tiene un
error de 0.001 g, por lo que el error para cada muestra se obtiene con la siguiente ecuación:
#𝑣𝑒𝑐𝑒𝑠 ∗ 𝑉 ∗ 𝑒𝑟𝑟𝑏𝑎𝑙𝑎𝑛𝑧𝑎 + ∆𝑝𝑒𝑠𝑜𝑠 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑎𝑠 ∗ 𝑒𝑟𝑟 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡𝑎𝑠

𝑉2
2 ∗ 4 𝑚𝑙 ∗ .001𝑔 + 0.009 𝑔 ∗ 0.5 ∗ 10−3 𝑚𝑙 𝑚𝑙 𝑔

= ∗ 1000 = 0.5
42 𝑚𝑙 2 𝐿 𝐿
Se obtuvo que el error promedio de medición, cuando se toman 4 ml de muestra es de 0.5

g/L.
0.8 0.20025
A B
0.7
0.2002
Error en la medición
Error en la medición
0.6
0.20015
0.5
0.4 0.2001
0.3
0.20005
0.2
0.2
0.1
0 0.19995
0 5 10 15 20 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
ml muestra Diferencia de pesos
Figura 15 Error en la medición con respecto a los ml de muestra (A) y con respecto a la diferencia de pesos (B)
Para disminuir el error de la medición de la biomasas, se graficó como este se ve afectado

por la cantidad de muestra tomada en ml (Figura 15 (A)), y podemos observar que a partir
de los 10 ml de muestra el error disminuye muy poco, por esta razón, para las
fermentaciones realizadas en el lote se tomaran 10 ml de muestra para determinar la
biomasa. Mientras que el aumento de la biomasa por muestra casi no afecta el error de la
medición (Figura 15 (B)).
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ETANOL (CROMATOGRAFÍA DE GASES)
Para el caso del etanol, el error de la muestra depende de la jeringa empleada para tomar
la muestra e inyectar al cromatógrafo. El error de la jeringa empleada es de .01 μl. Por lo
que el error al muestrear se obtiene con la ecuación:
𝑔
𝐸𝑡𝑒𝑟𝑟 = 𝑒𝑟𝑟𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 ∗ 𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎 + 𝑒𝑟𝑟𝑗𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔𝑎 ∗ 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐿
𝑔 𝑔 𝑔
𝐸𝑡𝑒𝑟𝑟 = (1 − 0.98) ∗ 100 ∗ 2 ∗ 10−3 𝑚𝑙 + .01 ∗ 10−3 𝑚𝑙 ∗ 8 = .0048
𝐿 𝐿 𝐿
Donde el factor 100 g/L se emplea para convertir el coeficiente r2, a las unidades g/L, la
curva tipo presento una r2 = 0.98 y la máxima concentración de una muestra fue de 8 g/L.
Se obtuvo que el error promedio de medición, para el etanol, cuando se toman 2 μl de

muestra es de 0.005 g/L.
GLUCOSA (AZUCARES REDUCTORES)
Para la determinación de la glucosa, el error de la muestra depende de la cantidad de

muestra y su dilución al determinar con el método de DNS (Miller, 1959), debido a que la
cantidad máxima que se puede determinar es de 1 gramo de glucosa por litro. Por lo que el
error al muestrear se obtiene con la ecuación:
𝑔
(𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎) 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐺𝑙𝑢𝑒𝑟𝑟 = 𝑒𝑟𝑟𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 ∗ + 𝑒𝑟𝑟𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡𝑎 ∗ 𝐿
𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑔
1 𝐿 ∗ 10−3 𝑚𝑙 1 𝑔 𝑔
= (1 − .98) ∗ 100 ∗ + .5 ∗ 10−3 𝑚𝑙 ∗ = 0.25
0.01 0.01 𝐿 𝐿
Donde suponemos que la curva tipo tuviera una r2 = 0.98 y la máxima concentración de una
muestra es de 1 g/L.
Se obtuvo que el error de medición más alto, para la glucosa, cuando se diluye 100 veces
la muestra (primeros puntos) es de 0.25 g/L.
PROTEÍNAS (LOWRY)
Para la determinación de las proteínas, el error de la muestra depende de la cantidad de

muestra y su dilución al determinar con el método de (Lowry, Rosebrougth, Farr, & Randall,
1951), debido a que la cantidad máxima que se puede determinar es de 0.5 miligramos de
proteína por litro, es necesario realizar diluciones. Por lo que el error al muestrear se obtiene
con la ecuación:
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𝑔
(𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎) ∗ #𝑣𝑒𝑐𝑒𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑟𝑟 = 𝑒𝑟𝑟𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 ∗ + 𝑒𝑟𝑟𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡𝑎 ∗ 𝐿
𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑔
0.5 𝐿 ∗ 10−3 𝑚𝑙 ∗ 3 0.5 𝑔 𝑔
= (1 − .98) ∗ 100 ∗ + 0.5 ∗ 10−3 𝑚𝑙 ∗ ∗ 3 = 0.325
0.01 0.01 𝐿 𝐿
Donde suponemos que la curva tipo tuviera una r2 = 0.98 y la máxima concentración de una
muestra es de 1 g/L.
Se obtuvo que el error de medición más alto, para las Proteínas, cuando se diluye 100
veces la muestra (todos los puntos) y contiene la concentración máxima de proteínas es de
0.325 g/L.
Se obtuvo que el error de medición más alto es de: 0.33 g/L.
BALANCE DE CARBONO
Para corroborar si las mediciones obtenidas en las fermentaciones se aproximan a lo real,

se realizó un balance de carbono para los diferentes puntos tomados. Sabemos que la
reacción general es:
𝑆 + 𝑃𝑟𝑜𝑡 + 𝑋 + 𝐸𝑡ℎ + 𝑃𝐻𝐴 → 𝑆 + 𝑃𝑟𝑜𝑡 + 𝑋 + 𝐸𝑡ℎ + 𝐶𝑂2 + 𝑃𝐻𝐴
Para realizar este balance, no se consideró el oxígeno debido a que es un balance de

carbono, se consideraron las siguientes fórmulas mínimas y pesos moleculares. El
porcentaje de carbono se obtiene de dividir el peso molecular del carbono entre el peso
molecular de cada componente (Tabla. 6):
Tabla. 6 Valores para el balance de carbono
Fórmula mínima PM [g/mol] %C [gC / gcomponente]
S (Glucosa) 𝐶𝐻2 𝑂 30.0259 0.4
Prot (Proteínas)* 𝐶𝐻1.98 𝑁0.3 𝑂0.54 𝑆0.03 23.8309 0.4476
X (Biomasa) 𝐶𝐻1.75 𝑁.15 𝑂.5 23.8754 .5031
Et (Etanol) 𝐶𝐻3 𝑂.5 23.0343 .5214
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*Para la proteína se consideró la fórmula de cada aminoácido que conforma la polipeptona,
después se obtuvieron sus fórmulas mínimas y la formula mínima global de la polipeptona
(Tabla. 7).
Tabla. 7 Composición de la polipeptona empleada (Fluka Analytical. Sigma-Aldrich)
Aminoácidos libres cadena C H O N S Ctot Htot Otot Ntot Stot Cmin Hmin Omin Nmin Smin
Ala 0.8 5.6 3 7 2 1 0 19.2 44.8 12.8 6.4 0 1 2.3333 0.6667 0.3333 0
Arg 3.8 5.5 6 14 2 4 0 55.8 130.2 18.6 37.2 0 1 2.3333 0.3333 0.6667 0
Asn 0.2 4 8 3 2 0 0.8 1.6 0.6 0.4 0 1 2 0.75 0.5 0
Asp 0.3 4.9 4 7 4 1 0 20.8 36.4 20.8 5.2 0 1 1.75 1 0.25 0
Cys 0.1 0.7 3 7 2 1 1 2.4 5.6 1.6 0.8 0.8 1 2.3333 0.6667 0.3333 0.3333
Gln 0.2 5 10 3 2 0 1 2 0.6 0.4 0 1 2 0.6 0.4 0
Glu 0.7 10.6 5 9 4 1 0 56.5 101.7 45.2 11.3 0 1 1.8 0.8 0.2 0
Gly 0.7 11.3 2 5 2 1 0 24 60 24 12 0 1 2.5 1 0.5 0
His 0.3 1 6 9 2 3 0 7.8 11.7 2.6 3.9 0 1 1.5 0.3333 0.5 0
Ile 0.7 1.9 6 13 2 1 0 15.6 33.8 5.2 2.6 0 1 2.1667 0.3333 0.1667 0
Leu 2.2 3.7 6 13 2 1 0 35.4 76.7 11.8 5.9 0 1 2.1667 0.3333 0.1667 0
Lys 2.3 3.8 6 14 2 2 0 36.6 85.4 12.2 12.2 0 1 2.3333 0.3333 0.3333 0
Met 0.5 1.2 5 11 2 1 1 8.5 18.7 3.4 1.7 1.7 1 2.2 0.4 0.2 0.2
Phe 1.3 2.2 9 11 2 1 0 31.5 38.5 7 3.5 0 1 1.2222 0.2222 0.1111 0
Pro 0.5 10 5 9 2 1 0 52.5 94.5 21 10.5 0 1 1.8 0.4 0.2 0
Ser 0.3 3.1 3 7 3 1 0 10.2 23.8 10.2 3.4 0 1 2.3333 1 0.3333 0
Thr 0.2 0.3 4 9 3 1 0 2 4.5 1.5 0.5 0 1 2.25 0.75 0.25 0
Trp 0.2 11 12 2 2 0 2.2 2.4 0.4 0.4 0 1 1.0909 0.1818 0.1818 0
Tyr 0.4 0.6 9 11 3 1 0 9 11 3 1 0 1 1.2222 0.3333 0.1111 0
Val 0.9 2.7 5 11 2 1 0 18 39.6 7.2 3.6 0 1 2.2 0.4 0.2 0
sum 16.6 69.1 107 197 49 29 2 409.8 822.9 209.7 122.9 2.5 20 39.535 10.837 5.9374 0.5333
Por lo que la formula empírica aproximada de la polipeptona empleada sería:

C20N5.94H39.53O10.83S0.53, por lo que su fórmula mínima seria: CN0.3H1.98O0.54S0.03.
Para saber la generación de carbono, se consideraron los coeficientes estequiométricos de

los balances de síntesis de etanol y biomasa a partir de glucosa.
Etanol: 𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2 ∗ 𝐶2 𝐻6 𝑂 + 2 ∗ 𝐶𝑂2
Donde por cada 6 mol C de glucosa se generan 4 mol C de etanol. Es decir un rendimiento
de 2/3 para la formación de moles C de etanol a partir de glucosa. Y por cada 4 mol C de
etanol, hay 2 mol C de CO2, es decir una correlación de ½ mol C.
Biomasa: 2 ∗ 𝐶𝐻2 𝑂 + 0.8125 ∗ 𝑂2 → 𝐶𝐻1.75 𝑁0.15 𝑂0.5 + 𝐶𝑂2 + 1.125 ∗ 𝐻2 𝑂
Donde por cada 2 mol C de glucosa se genera 1 mol C de etanol. Es decir un rendimiento
de 1/2 para la formación de moles C de biomasa a partir de glucosa. Y por cada mol C de
biomasas hay 1 mol C de CO2, es decir una correlación 1 de mol C.
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Por lo tanto por cada 2 moles C de etanol hay 1 mol C de CO2; y por cada mol C de biomasa
hay un mol C de CO2.
Para determinar el error de la medición en gramos de carbono por litro [gC/L], es necesario
multiplicar el error de la medición de cada variable por su porcentaje de carbono [gC /
gcomponente] y sumarlos.
𝑒𝑟𝑟𝐶 = 𝑒𝑟𝑟𝑋 ∗ %𝐶𝑋 + 𝑒𝑟𝑟𝐸𝑡 ∗ %𝐶𝐸𝑡 + 𝑒𝑟𝑟𝑆 ∗ %𝐶𝑆 + 𝑒𝑟𝑟𝐶𝑂2 ∗ %𝐶𝐶𝑂2

𝑔𝑋 𝑔𝐶 𝑔𝐸𝑡 𝑔𝐶 𝑔𝑆 𝑔𝐶 𝑔𝑃𝑟𝑜𝑡
𝑒𝑟𝑟𝐶 = 0.5 ∗ 0.5031 + 0.005 ∗ 0.5214 + 0.25 ∗ 0.4 + 0.25
𝐿 𝑔𝑋 𝐿 𝑔𝐸𝑡 𝐿 𝑔𝑆 𝐿
𝑔𝐶 𝑔𝐶𝑂2 𝑔𝐶 𝑔𝐶
∗ 0.04476 + (0.5 + 0.005 ∗ 0.5) ∗ 0.8563 = 0.8404
𝑔𝑃𝑟𝑜𝑡 𝐿 𝑔𝐶𝑂2 𝐿
Una vez realizados los cálculos puntuales de la cinética, se considera el primer punto
(Concentración inicial) como la cantidad de carbono total real, y a este valor se le resta el
valor obtenido en los demás puntos, para obtener sus valores residuales puntuales y ver
qué tan lejos o cerca están del valor real (Tomas, Cuadros, & Gonzales, 2006).
RENDIMIENTOS Y CONSTANTES, TEÓRICAS Y EXPERIMENTALES
RENDIMIENTO TEÓRICO DE SUSTRATO A BIOMASA 𝒀̂

𝑿𝒔 :
Para el cálculo del rendimiento teórico de formación de biomasa a partir de glucosa se

emplea el siguiente balance estequiométrico:
2 ∗ 𝐶𝐻2 𝑂 + 0.8125 ∗ 𝑂2 → 𝐶𝐻1.75 𝑁0.15 𝑂0.5 + 𝐶𝑂2 + 1.125 ∗ 𝐻2 𝑂

𝑔𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
1 𝑚𝑜𝑙𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 ∗ 23.8754 𝑔𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
𝑚𝑜𝑙𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
𝑌̂
𝑋𝑆 = 𝑔𝑔𝑙𝑢 = 0.3976
2𝑚𝑜𝑙𝑔𝑙𝑢 ∗ 30.259 𝑔𝑔𝑙𝑢
𝑚𝑜𝑙𝑔𝑙𝑢
RENDIMIENTO DE SUSTRATO A BIOMASA YXS:
El rendimiento puntual de sustrato a biomasa se obtuvo con la fórmula:
(𝑋𝑛+1 − 𝑋𝑛 )
𝑌𝑥𝑠 =
(𝑆𝑛 − 𝑆𝑛+1 )
El rendimiento global de sustrato a biomasa se obtuvo con la fórmula:
(𝑋𝑓 − 𝑋0 )
𝑌𝑥𝑠 𝑔 =
(𝑆0 − 𝑆𝑓 )
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̂
RENDIMIENTO TEÓRICO DE ETANOL A SUSTRATO 𝒀𝑬𝒕𝒔 :
Para el cálculo del rendimiento teórico de formación de etanol se emplea el siguiente

balance estequiométrico (Beck and von Meyenburg, 1968):
𝐶6 𝐻12 𝑂6 → 2 ∗ 𝐶2 𝐻6 𝑂 + 2 ∗ 𝐶𝑂2
𝑔𝑒𝑡
2 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑡 ∗ 46.68 𝑔𝑒𝑡
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑡
𝑌̂
𝐸𝑡𝑠 = 𝑔𝑔𝑙𝑢 = 0.5114
1𝑚𝑜𝑙𝑔𝑙𝑢 ∗ 180.1554 𝑔𝑔𝑙𝑢
𝑚𝑜𝑙𝑔𝑙𝑢
RENDIMIENTO DE ETANOL A SUSTRATO YETS:
El rendimiento puntual de sustrato a etanol se obtuvo con la fórmula:
(𝐸𝑡ℎ𝑛+1 − 𝐸𝑡ℎ𝑛 )
𝑌𝐸𝑡ℎ𝑠 =
(𝑆𝑛 − 𝑆𝑛+1 )
Y el rendimiento global de sustrato a etanol se obtuvo con la fórmula:
(𝐸𝑡ℎ𝑓 − 𝐸𝑡ℎ0 )
𝑌𝐸𝑡ℎ𝑠 𝑔 =
(𝑆0 − 𝑆𝑓 )
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO
La µ en las diferentes etapas del proceso se obtiene con 2 fórmulas:
𝑋𝑛
𝑋1 − 𝑋0 ln (𝑋𝑜 )
𝜇 𝑑𝑥 = ; 𝜇 𝑙𝑛 =
(𝑡1 − 𝑡0 ) ∗ 𝑋0 𝑡
Donde el metido de diferenciales se emplea para las fases lag y estacionaria, o cuando se
tienen deltas de tiempo muy cortos. El método logarítmico se emplea para la fase lag o
cuando los deltas de tiempo son mayores a 1 hora.
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE FORMACIÓN DE ETANOL 𝒒𝑬𝒕
La qEt en las diferentes etapas del proceso se obtiene con la fórmula:
𝐸𝑡ℎ1 − 𝐸𝑡ℎ0
𝑞𝐸𝑡ℎ =
(𝑡1 − 𝑡0 ) ∗ 𝑋0
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CONSUMO DE SUSTRATO 𝒒𝑺
La qS en las diferentes etapas del proceso se obtiene con la fórmula:
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𝑆1 − 𝑆0
𝑞𝑆 =
(𝑡1 − 𝑡0 ) ∗ 𝑋0
VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CONSUMO DE PROTEÍNAS 𝒒𝑷𝒓𝒐𝒕
La qProt en las diferentes etapas del proceso se obtiene con la fórmula:
𝑃𝑟𝑜𝑡1 − 𝑃𝑟𝑜𝑡0
𝑞𝑃𝑟𝑜𝑡 =
(𝑡1 − 𝑡0 ) ∗ 𝑋0
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TÉCNICAS
CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA (DNS) (MILLER, 1959)
PREPARACIÓN DEL DNS
Para el DNS mezclar en un total de 1416 ml de H2O:
 12.8 g de NaOH
 10.6 g de 3-5 dinitrosalicílico
 7.6 g de fenol fundido
 306 g de tartrato doble de sodio y potasio
 8 g de metabisulfito de sodio
Determinación de azucares reductores con DNS:
1) Centrifugar 3 ml de muestra en 2 tubos eppendorf (1.5 ml en cada uno) a 1000 rpm

durante 10 minutos a 4°C.
2) Diluir el sobre nadante de acuerdo con la concentración de azúcares esperada (se
diluirá 1 a 50 en las primeras horas de la fermentación debido a que se esperan más
de 1g/L de azúcares y 1 a 10 en las últimas horas debido a que se esperan menos
de 1 g/L.
3) Colocar 1 ml de dilución por triplicado en tubos con rosca.
4) Agregar 1.5 ml de DNS a cada uno en los tubos.
5) Llevar a ebullición durante 5 minutos en baño maría a una temperatura entre 80-90
°C.
6) Enfriar a 25 °C y añadir 7.5 ml de H2O.
7) Leer en el espectrofotómetro a 535 nm, en el siguiente orden: blanco, curva
estándar, muestras y curva tipo.
CURVA TIPO
 Se pesaron 20g de glucosa y después se dejó en el desecador por 1 día.

 Pesar 1 g de glucosa y diluirla en 1 litro de agua bidestilada.
 Realizar diluciones para obtener 5 puntos en la curva tipo (1, 0.8, 0.6, 0.4 y 0.2 g/L).
CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA POR PESO SECO:
Se numeran y dejan secar las membranas, necesarias para las muestras, por 2 días en un
desecador. Al termino de este tiempo se pesan las membranas de nitrocelulosa de 0.22 μm.
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Se monta el sistema Millipore de filtración por vacío con las membranas en el centro para
filtrar (La membranas se cambian para cada muestra).
Se toman los mililitros necesarios de muestra (mínimo 4 ml), se centrifugan, se recupera el

sobrenadante necesario para hacer las cuantificaciones de etanol, proteínas y glucosa, 1.5
o 2 ml, se resuspende el pellet en el sobrenadante restante y se procede a filtrar.
Para la filtración, es importante dejar caer las gotas, con cuidado, lo más cerca al centro de
la membrana, evitando que el líquido sature la membrana o toque las paredes del sistema
Millipore.
Cuando las membranas ya poseen la biomasa, se dejan secar por 48 h en un secador a

45°C.
Finalmente se pesan las membranas y se calcula la biomasa contenida en los ml que se

tomaron de muestra, haciendo la diferencia entre el peso inicial y final, y dividiéndolos entre
el volumen de muestra, al final se reporta en gramos de biomasas entre Litros de medio de
cultivo [g/L].
DENSIDAD ÓPTICA:
Para la densidad óptica se tomó 1 ml de muestra y se midió en el espectrofotómetro a 600

nm, como blanco se empleó Agua bidestilada (“Caracterización Microbiológica,” n.d.).
Para la cinética en el fermentador de 5 L el blanco se cambió por medio de cultivo.
CUANTIFICACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES:
CURVA TIPO
Se realiza una curva tipo empleando etanol a diferentes concentraciones, 10 puntos desde
0.1 hasta 2 ml e isobutanol a una concentración constante, (1 ml) (para usarlo como
referencia) y ambos se diluyen en 1 ml.
Para el cromatógrafo, se emplean 2 μl de cada muestra tanto para la curva tipo, como para
las diferentes muestras.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY (LOWRY ET

AL., 1951):
La solución de Lowry se debe empezar fresco y se debe preparar en 3 soluciones

diferentes.
Página | 38
Tabla. 8 Soluciones A, B Y C para preparar la solución de Lowry
Solución A (500 ml) Solución B (100 ml) Solución C (100 ml)
2.8598 g de NaOH 1.4232 g de CuSO4 - 2.85299 g de Tartrato de

14.3084 g de Na2CO3 5*(H2O) Na2 -2*(H2O)
La solución de Lowry se prepara en una relación 100:1:1 de Solución A:B:C (Tabla. 8).
El reactivo de Folin se prepara con 5 ml a 2 N de reactivo de Folin:
Fenol reactivo + 6ml de agua bidestilada.
Esta solución es sensible a la luz y se debe preparar a los 5 min de incubar la muestra y se
debe mantener en un frasco ámbar.
CURVA ESTÁNDAR CON BSA
Se pesan 0.05 g de BSA y se adicionan a 500ml de agua bidestilada hasta que se disuelvan
bien, la concentración final será de 100 mg de BSA/L. Ahora hay 1ue preparar diluciones:
Tabla. 9 Dilución de BSA para la curva estándar
Volumen de agua Volumen de stock de Concentración final

bidestilada [mL] solución de BSA [mL] [mg/L]
10 0 0
8 2 20
6 4 40
4 6 60
2 8 80
0 10 100
PROCEDIMIENTO
 Emplear guantes y googles.

 Preparar las diluciones para la curva estándar según la Tabla. 9.
 Preparar la solución de Lowry mezclado las soluciones A, B y C (Tabla. 8).
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 Si es necesario diluir las muestras, trabajar por triplicado.
 Mesclar en el vortex tus muestras y tomar 0.5 ml a un tubo de vidrio de 10 ml.
Emplear una micropipeta de 1 mL.
 Adicionar 700 ml del reactivo de Lowry. Emplear una micropipeta.
 Mesclar brevemente el vortex la mezcla a una velocidad naja.
 Incubar en obscuridad durante 20 min.
 Pasando 5 minutos, preparar el reactivo de Folin.
 Después de 20 min de incubación adicionar 0.1 ml del reactivo de Folin a las
muestras.
 Incubar una vez más en obscuridad durante 30 min.
 Una vez estabilizadas las muestras, leer en el espectrofotómetro a 750 nm.
RECUPERACIÓN DE NANO –PHAS
Debido a que la producción de PHAs es muy baja, ya que está asociada al crecimiento, al
depender de derivados de Acetil-CoA (Thomson et al., 2010) presentes en el citosol
(Muniasamy et al., 2014), los PHAs solo se recuperan al final de la fermentación.
A causa de los PHAs son insolubles en agua (Peters et al., 2007) y además tiene un tamaño
manométrico (Figura 8), se espera que las partículas se encuentren flotando en la parte
superior del medio, por esta razón se recuperan los 10 ml de cada centrifugación, por medio
de decantación, y se lavan 3 veces 5700 rpm a 4°C y aforándolos hasta 45 ml. En la última
lavada se recuperan 15ml.
Para obtener a las nano-partículas lo más puras posibles se realizan eluciones en una
columna con sílica, dando 6 pulsos de 15 ml. Se recupera únicamente el último pulso y se
liofiliza, posteriormente se pesa.
Se obtiene aproximadamente 80 ng de nano-PHAs al término de la recuperación y se cree

que se están teniendo pérdidas del 60 al 80 % durante las etapas de recuperación, esto se
debe a que hasta el momento no se ha encontrado una sustancia en la que sea soluble el
PHA y que no intervenga con su espectro para realizar una cuantificación por
espectrofotometría.
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EQUIPOS
CROMATÓGRAFO DE GASES
Gas Chromatograph SRI 8610C.
COLUMNA
Columna empacada con CHROMOSORB W-AW 80/100
CENTRIFUGA
Centrífuga 5180 R. marca Eppendorf®. 5811F no. 0031309.
BALANZA
AdvernturerTM PRO. Marca Ohaus®. Modelo Adveturer Pro AV2102
BALANZA GRANATARIA
ABT 220-5DM. Marca KERN®. Modelo ABT220-5DM. Ser. No. WB09E0030.
POTENCIÓMETRO
pH meter 440. Marca CORNING®
INCUBADORA
Boekel. Boekel scientific
INCUBADORA CON AGITACIÓN
SECADOR
Heraeus. Modelo HANANU tipo RVT 500F.-Nt. 7604879
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PROCESAMIENTO DE DATOS
MODELOS MATEMÁTICOS
El modelado de las cinéticas de crecimiento o biomasa (X [g/L]) de S. cerevisiae J26 y S.

cerevisiae ATCC 9763 para cada fermentación se realizó un ajuste variando los modelos
para la predicción de la µ según Monod (Ec. 1), Monod con inhibición (Ec.2), Gompertz
(Ec.13), también se realizó otra simulación done en el modelo se consideró el consumo de
proteína.Para la formación de etanol (Et [g/L]) se empleó el modelo de Ludeking Piret (Ec.
14).Para el consumo de sustrato (S [g/L]) se empleó el modelo de Aborthey y Williamson
(Ec. 15), y para el consumo de proteínas (Prot [g/L]) se empleó un modelo puesto basado
en modelo de Abotrthey y Williamson.
Los parámetros correspondientes a cada modelo, μmax [h-1], λ [h], Ks [h], α [1/h], β [1/h], Yxs
[gX/gS], Yps [gProt/gS] y ms [h-1] fueron obtenidos por métodos numéricos con el programa
ModelMaker versión 3.0.3 de Cherwell Scientific, empleando el método simplex, para
ecuaciones lineales y obtener una aproximación del valor de estos, y posteriormente se
empleó el método de Marquardt, para la solución de ecuaciones no lineales, hasta obtener
el mejor ajuste según el método de mínimos cuadrados, también se obtuvo el palor del
teorema P y Q. A su vez se simularon en el mismo programa empleando un Runge -Kutta
de orden variable con un tamaño de paso máximo de .001 y tamaño de paso mínimo de
1x1010 y evaluando el error de integración con respecto a la derivada de la función. Para el
caso de los modelos basados en el modelo de Monod, se evaluaron las 3 o 4 ecuaciones
simultáneamente, cuando no se consideran las proteínas y cuando si, mientras que para
los modelos basados en el modelo de Gompertz los ajustes se realizaron en el siguiente
orden; Biomasa, Etanol y Sustrato.
Los modelos se presentan con el nombre correspondiente al autor que propuso la ecuación
para describir el comportamiento de la µ ya que para la predicción de la formación de
producto y consumo de sustrato se emplearon las mismas ecuaciones en todos los
modelos.
Para presentar las gráficas se empleó el programa Matlab R2012b empleando la función
ode15s.
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MODELOS EMPLEADOS A NIVEL MATRAZ
MONOD (M)
Biomasa X [g/L] Etanol Et [g/L] Sustrato S [g/L]
𝑑𝑋 𝑑𝐸𝑡 𝑑𝑆
=𝜇∗𝑋 = 𝑞𝐸𝑡 ∗ 𝑋 = −𝑞𝑆 ∗ 𝑋
𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡
𝑆 ∗ 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝜇 𝑞𝐸𝑡
𝑎∗𝜇+𝛽 + + 𝑚𝑠
𝜇 = { 𝐾𝑠 + 𝑆 𝑞𝐸𝑡 = { 𝑞𝑆 = {𝑌𝑋𝑆 𝑌𝐸𝑡𝑆
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0 0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
MONOD CON INHIBICIÓN (M-I)
Biomasa X [g/L] Etanol Et [g/L] Sustrato S [g/L]
𝑑𝑋 𝑑𝐸𝑡 𝑑𝑆
=𝜇∗𝑋 = 𝑞𝐸𝑡 ∗ 𝑋 = −𝑞𝑆 ∗ 𝑋
𝑑𝑡 𝑑𝑡 𝑑𝑡
𝑆 ∗ 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝐸𝑡 𝑞𝐸𝑡 𝜇 𝑞𝐸𝑡

∗ (1 − ) + + 𝑚𝑠
𝜇 = { 𝐾𝑠 + 𝑆 𝐾𝐸𝑡 𝑎∗𝜇+𝛽 𝑞𝑆 = {𝑌𝑋𝑆 𝑌𝐸𝑡𝑆
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0 ={ 0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
Donde KEt es la concentración de inhibición de etanol.
GOMPERTZ (G)
Biomasa X [g/L]
𝑑𝑋
=𝜇∗𝑋
𝑑𝑡
𝜇𝑚𝑎𝑥∗𝑒∗(𝜆−𝑡) 𝜇𝑚𝑎𝑥∗𝑒∗(𝜆−𝑡)
[1+ ]
[1+ 𝑋𝑓 ] 𝑋𝑓
𝜇={ ln( )
ln( )
𝑋𝑜
µ𝑚𝑎𝑥 ∗ 𝑒 1 ∗ 𝑒 𝑋𝑜 ∗𝑒 −𝑒
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
Página | 43
Etanol Et [g/L] Sustrato S [g/L]
𝑑𝐸𝑡 𝑑𝑆
= 𝑞𝐸𝑡 ∗ 𝑋 = −𝑞𝑆 ∗ 𝑋
𝑑𝑡 𝑑𝑡
𝜇 𝑞𝐸𝑡
𝑎∗𝜇+𝛽 + + 𝑚𝑠
𝑞𝐸𝑡 = { 𝑞𝑆 = {𝑌𝑋𝑆 𝑌𝐸𝑡𝑆
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
MONOD CON CONSUMO DE PROTEÍNAS (M-P)
Biomasa X [g/L] Etanol Et [g/L]
𝑑𝑋 𝑑𝐸𝑡
=𝜇∗𝑋 = 𝑞𝐸𝑡 ∗ 𝑋
𝑑𝑡 𝑑𝑡
𝜇 = 𝜇𝑆 + 𝜇𝑃𝑟𝑜𝑡
𝑞𝐸𝑡 = 𝑞𝐸𝑡𝑆 + 𝑞𝐸𝑡𝑃𝑟𝑜𝑡
𝑆 ∗ 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝜇𝑆 = { 𝐾𝑠𝑆 + 𝑆 𝑎𝑆 ∗ 𝜇 + 𝛽𝑆
𝑞𝐸𝑡𝑆 = {
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0 0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
𝑃𝑟𝑜𝑡 ∗ 𝜇𝑚𝑎𝑥 𝑃𝑟𝑜𝑡 𝑞𝐸𝑡𝑃𝑟𝑜𝑡 = 𝑎𝑃𝑟𝑜𝑡 ∗ 𝜇 + 𝛽𝑃𝑟𝑜𝑡

𝜇𝑆 =
𝐾𝑠𝑃𝑟𝑜𝑡 + 𝑃𝑟𝑜𝑡
Sustrato S [g/L] Proteínas Prot [g/L]
𝑑𝑆 𝑑𝑃𝑟𝑜𝑡
= −𝑞𝑆 ∗ 𝑋 = −𝑞𝑃𝑟𝑜𝑡 ∗ 𝑋
𝑑𝑡 𝑑𝑡
𝜇𝑆 𝑞𝐸𝑡𝑆 𝜇𝑃𝑟𝑜𝑡 𝑞𝐸𝑡𝑃𝑟𝑜𝑡

+ + 𝑚𝑠 𝑞𝑆 = + + 𝑚𝑠𝑃𝑟𝑜𝑡
𝑞𝑆 = {𝑌𝑋𝑆 𝑌𝐸𝑡𝑆 𝑌𝑋𝑃𝑟𝑜𝑡 𝑌𝐸𝑡𝑃𝑟𝑜𝑡
0, 𝑆𝑖 𝑆 < 0
Donde qProt se propone según la teoría de Aborty y Pirt. Y qEtProt se propone según la
teoría de Ludeking-Piret.
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MODELOS INICIAL EMPLEADOS PARA EL CULTIVO POR LOTE Y LOTE
ALIMENTADO EXPONENCIAL:
Para el Flujo y el volumen
0
𝑡−𝑡𝐶𝐿𝐴
𝐹(𝑡) = { 1 𝑉(𝑡) = 𝑉𝑜 + 𝐹(𝑡)
(𝐹𝑜) ∗ ( ) , 𝑠𝑖 𝑡 > 𝑡𝐶𝐿𝐴
1 − 𝜇𝑜𝑝
Para la formación de Biomasa
𝑑𝑥 𝐹(𝑡)
= (𝜇 − )∗𝑋 𝜇 = 𝜇𝑆 + 𝜇𝐸𝑡
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
Crecimiento por consumo de Sustrato Crecimiento por consumo de Etanol
𝜇𝑚𝑎𝑥𝑆 ∗ 𝑆 𝜇𝑚𝑎𝑥𝐸𝑡 ∗ 𝐸𝑡
𝜇𝑆 = { 𝑆 + 𝑘𝑆 𝜇𝐸𝑡 = { 𝐸𝑡 + 𝑘𝐸𝑡
0, 𝑠𝑖 𝑆 ≤ 0, 0, 𝑠𝑖 𝐸𝑡 ≤ 0
Para la formación de etanol
𝑑𝐸𝑡 𝐹(𝑡)
= 𝑞𝐸𝑡 ∗ 𝑋 − ∗ 𝐸𝑡 𝑞𝐸𝑡 = 𝑞𝐸𝑡𝑝 − 𝑞𝐸𝑡𝑐
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
Consumo de etanol
Producción de etanol
𝜇𝐸𝑡
𝛽 + 𝑚𝑠
𝑞𝐸𝑡𝑝 = { 𝑞𝐸𝑡𝑐 = { 𝑌𝑋𝐸𝑡
0, 𝑠𝑖 𝑆 ≤ 0
0, 𝑠𝑖 𝑆 ≤ 0
Para el consumo de sustrato
𝜇𝑆 𝑞𝐸𝑡𝑝
𝑑𝑆 𝐹(𝑡) + + 𝑚𝑠
= −𝑞𝑆 ∗ 𝑋 − ∗ (𝑆𝑎 − 𝑆) 𝑞𝑆 = {𝑌𝑋𝑆 𝑌𝐸𝑡𝑆
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
0, 𝑠𝑖 𝑆 ≤ 0
Debido a que en el lote alimentado se cambió el medio y no se emplearon proteínas, se

descartó la ecuación referente a su consumo.
Página | 45
RESULTADOS
NIVEL MATRAZ CON S. CEREVISIAE ATCC 9763
CINÉTICA CON LA CEPA SILVESTRE (WT)
Para este experimento se empleó la cepa silvestre S. cerevisiae ATCC9763, el inóculo duro
8 h y se mantuvo con 250 rpm de agitación, al igual que la cinética.
Tabla. 10 Resultados promedio de la cinética con S. cerevisiae wt a 250 rpm
S X Et Prot
t [h] Sd sd sd Sd
[g/L] [g/L] [g/L] [g/L]
0 16.52 2.16 0.15 0.21 0.08 0.02 11.18 0.97
1.17 13.93 0.70 0.18 0.02 0.19 0.04 12.19 2.12
2.33 12.23 0.89 0.28 0.02 0.40 0.09 11.65 1.13
3.50 11.94 1.26 0.51 0.06 1.54 0.10 13.85 1.78
4.67 7.60 0.19 1.11 0.03 2.90 0.58 11.93 1.16
5.83 0.13 0.02 2.28 0.03 4.58 0.60 10.65 0.38
7.00 0.12 0.02 2.40 0.06 7.27 0.72 9.46 0.31
8.17 0.04 0.05 2.61 0.06 4.10 0.44 10.51 0.32
Página | 46
18
16
14
S, X, Et, Prot [g/L]
12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t [h]
S [g/L] X [g/L] Et [g/L] Prot[g/L]
Figura 16 Evolución de la cinética con S. cerevisiae wt a 250 rpm
Para esta cinética se observa (Figura 16) que la levadura de forman natural si presenta el
efecto Crabtree, ya que siempre hay una producción de etanol, sin embargo al final, cuando
se termina el sustrato, pareciera que hay un consumo del etanol, pero no se observa un
incremento notable en la biomasa. Aun así su producción final (7.27) es aproximadamente
2 veces mayor que la de la biomasa (2.40 g/L). También se aprecia que la cinética concluye
a las 6 horas, y que existe un consumo de proteínas.
Página | 47
1.2
0.8
µ [h-1]
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
t [h]
µ (dx) µ (ln)
Figura 17 Comportamiento de µ según el método diferencial (dx) y el logarítmico (ln) contra el sustrato con el
paso del tiempo de la cinética con S. cerevisiae wt a 250 rpm
De la Figura 17 podemos observar que el crecimiento tiene un declive en sus etapas finales,
por lo que no sigue un comportamiento idéntico al propuesto por Monod. Y según el método
diferencial se observa una µmax cercana a 1 h-1, mientras que por el logarítmico es de 0.5 h-
1
.
4.5 16
qs [gS/h*gX], qEt [gEt/h*gX]
4 14
Yxs [gX/gS], YEtS [gEt/gS]
3.5 12
3
10
2.5
8
2
6
1.5
1 4
0.5 2
0 0
0 2 4 6 8 0 1 2 3 4 5 6
t [h] t [h]
Yxs YEtS qS qEt
Figura 18 Comportamiento de YXS y YEtS (izquierda) y qS y qEt con el paso del tiempo (derecha) de la cinética con S. cerevisiae
wt a 250 rpm
En la Figura 18, si se descarta el punto central para la YXS y YEtS, las velocidades estarían
por debajo de 0.5 g/g, para el caso de qS se observa que al inicio de la cinética se consume
Página | 48
más sustrato que al final y para el qEt se observa que se va produciendo con forme va
creciendo la levadura y que al final casi no hay producción porque se está acabando el
sustrato.
También se realizó un balance de carbono para ver que tanto afectan los errores a las
mediciones.
1.5
0.5
[glC/L]
0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00
-0.5
-1
-1.5
t[h]
Figura 19 Errores para el carbono total en la cinética con S. cerevisiae wt a 250 rpm
De la Figura 19 podemos observar que lo errores, en el balance de carbono, obtenidos para

los diferentes puntos de la cinética se encuentran muy cercanos a los esperados por la
medición.
Página | 49
NIVEL MATRAZ CON S. CEREVISIAE J26
CINÉTICA 1 (F1)
El primer experimento consistió en realizar una cinética a 200 rpm y 30°C, el inóculo se dejó
crecer por 12 h.
Tabla. 11 Resultados promedio de la cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
Prot
t [h] S [g/L] Sd X [g/L] sd Et [g/L] sd Sd
[g/L]
0 16.43 0.94 1.22 0.22 0.13 0.04 8.60 0.94
1.25 15.74 0.50 1.32 0.01 0.47 0.16 7.43 0.41
3.25 15.39 0.15 1.48 0.12 0.65 0.03 7.54 0.68
5.25 14.87 0.39 1.72 0.10 0.80 0.22 7.41 1.21
7.25 12.13 0.61 2.12 0.30 2.15 0.61 7.56 0.75
9.25 7.12 1.00 2.52 0.30 4.08 1.13 7.28 0.47
11.25 0.29 0.04 2.84 0.18 6.33 0.91 6.71 0.27
13.25 0.17 0.09 3.08 0.06 6.89 0.85 6.90 0.11
Página | 50
18
16
14
S, X, Et, Prot [g/L]
12
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14
t [h]
Figura 20 Evolución de la cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm de la cinética con S. cerevisiae J26 a 200
rpm
En esta cinética podemos observar (Figura 20) que la cepa transformada consumo toda la
glucosa a las 11.5 h, también observamos que hay un ligero consumo de proteínas (1.2).
También se observa que siempre hay producción de etanol y su concentración final (6.9
g/L) es 2.2 veces mayor a la de la biomasa (3.08 g/L)).
0.14
0.12
0.1
0.08
[1/h]
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6 8 10 12 14
t [h]
µ (dx) µ (ln)
Figura 21 Comportamiento de µ según el método diferencial (dx) y el logarítmico (ln) con el paso del tiempo de la cinética con
S. cerevisiae J26 a 200 rpm
Página | 51
Para esta cinética se observa (Figura 21) que la µmax de crecimiento según el método de
diferencias es de 0.12, mientras que para el logarítmico es de 0.08. Por el método de
diferencias se observa nuevamente el declive al final, lo cual puede significar que está
habiendo algún tipo de inhibición ó que el sustrato está limitando el crecimiento debido a
que se está acabando.
1.4 1.6
qs [gS/h*gX], qEt [gEt /h*gX]

1.2 1.4
1.2
1
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2 0.2
0 0
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12
t [h] t [h]
Yxs YEtS qS qEt
Figura 22 Comportamiento de YXS y YEtS (izquierda) y qS y qEt con el paso del tiempo (derecha) de la cinética con S. cerevisiae
J26 a 200 rpm
Para esta cinética, se observa que los valores de YXS (Figura 22) están cercanas y por
debajo del 0.5 g/g, mientras que los valores de Y YEtS, están muy dispersos. Para qS y qEt
se observa que estos tienen un comportamiento muy similar, lo cual puede significar que
casi todo el sustrato se está transformando en etanol.
Para el balance de carbono se obtuvieron los siguientes resultados finales
Página | 52
1
0.8
0.6
0.4
0.2
[glC/L]
0
-0.2 0 2 4 6 8 10 12
-0.4
-0.6
-0.8
-1
t[h]
Figura 23 Errores para el carbono total en la cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
De la Figura 23 podemos observar que todos los errores, en el balance de carbono,

obtenidos para los diferentes puntos de la cinética se encuentran muy cercanos al valor
inicial y solo un punto en lo esperado por la medición, lo cual nos indica que los errores
obtenidos en las determinaciones se encuentran dentro del rango esperado por los errores
en la medición.
Página | 53
CINETICA 4 (F4)
Este experimento se realizó a 200 rpm y con un inoculo de 8h
Tabla. Resultados promedio de la 2da cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
Et Prot
t [h] S [g/L] sd X [g/L] sd sd sd
[g/L] [g/L]
0 16.06 0.62 0.27 0.10 0.54 0.17 12.77 2.25
1.67 15.25 1.16 0.37 0.02 0.67 0.14 11.26 1.33
3.33 13.51 0.35 0.46 0.01 1.56 0.79 10.23 0.36
5.00 11.98 0.45 0.67 0.06 2.05 0.25 9.38 0.97
6.67 9.54 2.00 1.27 0.05 3.48 0.34 9.50 1.36
8.33 1.84 0.36 2.13 0.08 6.95 0.11 9.96 0.82
10.00 0.38 0.03 2.49 0.01 7.61 0.70 11.07 2.69
11.67 0.21 0.01 2.48 0.06 8.41 0.32 13.10 1.27
Página | 54
18
16
14
S, X, Et , Prot [g/L]
12
10
0
0 2 4 6 8 10 12
t [h]
Figura 24 Evolución de la 2da cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
Esta cinética (F4), al igual que la anterior (F1), termino aproximadamente a las 10 h, lo cual
significa que el microorganismo está respondiendo bien al medio de cultivo y hay
reproducibilidad, a su vez se observa (Figura 24) que hay una producción elevada de etanol
(8.41 g/L) en comparación con la biomasa (2.48 g/L), para esta cinética en particular el
consumo e proteínas tuvo un comportamiento inusual, comenzamos con 13g/L y
terminamos con 13g/L , el cual se puede deber a que se cambió el proveedor del extracto
de levadura, y a causa de la complejidad de su composición, esta puede variar entre un
proveedor y otro, otra posible alternativa es que en esta cinética la levadura haya producido
y exportado muchas proteínas al exterior, además los puntos tienen un error muy grande.
Página | 55
0.6
0.5
0.4
µ [h-1]
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
t [h]
µ (dx) µ (ln)
Figura 25 Comportamiento de µ según el método diferencial (dx) y el logarítmico (ln) contra el sustrato con el
paso del tiempo de la 2da cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
Para esta cinética podemos apreciar (Figura 27) que por el método diferencial la µmax es
aproximadamente 0.6 y por el logarítmico 0.3, nuevamente observamos que la µ disminuye
al final, puede ser por la concentración de glucosa o por una inhibición, los punto
intermedios de la µ logarítmica, que corresponden a las fase exponencial, no están muy
distantes de la µ inicial.
0.7 4
qs [gS/h*gX], qEt [gEt/h*gX]
0.6 3.5
3
0.5
2.5
0.4
2
0.3
1.5
0.2
1
0.1 0.5
0 0
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12
t [h] t [h]
Yxs YEtS qS qEt
Figura 26 Comportamiento de YXS y YEtS (izquierda) y qS y qEt con el paso del tiempo (derecha) de la 2da
cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
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Para esta fermentación se observa (Figura 26) que el valor de YXS siempre estuvo por
debajo de 0.5 g/L, mientras que para YEtS tenemos dos puntos que sobrepasan el 0.5114
g/g (valor máximo teórico), muestras que para qS y qEt nuevamente observamos una
tendencia similar, además de una producción elevada de etanol, lo cual nos hace pensar
que la levadura únicamente está produciendo etanol, ya que si lo consumiera, la qEt
disminuiría con el paso del tiempo y que el crecimiento se podría estar viendo inhibida o
limitada por la transferencia de oxígeno en el matraz.
2
1.5
1
0.5
[glC/L]
0
0 2 4 6 8 10 12
-0.5
-1
-1.5
-2
t[h]
Figura 27 Errores para el carbono tota en la 2da cinética con S. cerevisiae J26 a 200 rpm
En la Figura 27 podemos observar que para esta cinética la mayoría de los puntos se
encuentran cercanos al error esperado por la medición con excepción de dos puntos.
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CINÉTICA 2 (F2)
El segundo experimento consistió en realizar una cinética a 250 rpm y 32°C, el inóculo se
dejó crecer por 12 h.
Los resultados promedio de las repeticiones obtenidos fueron los siguientes:
Tabla. 12 Resultados promedio de la cinética F2 a 250 rpm
S X Et Prot
t [h] Sd sd sd sd
[g/L] [g/L] [g/L] [g/L]
0 16.04 0.34 0.06 0.01 0.30 0.03 8.45 0.47
2.00 14.78 1.13 0.20 0.05 0.52 0.03 9.36 2.21
4.00 12.39 1.64 0.40 0.05 1.22 0.04 7.78 1.56
6.00 8.24 0.62 1.12 0.01 2.97 0.04 9.32 0.65
8.00 0.40 0.04 1.97 0.02 6.09 0.06 9.18 0.52
10.00 0.33 0.01 2.09 0.12 5.82 0.22 9.38 0.76
12.00 0.29 0.01 2.41 0.01 5.70 0.34 9.38 0.83
14.00 0.26 0.01 2.42 0.13 5.62 0.29 7.63 1.58
Página | 58
16
14
12
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14
t [h]
Figura 28 Evolución de la cinética F2 a 250 rpm
Esta cinética termino a las 8 h aproximadamente (Figura 28), al aumentar la agitación se

espera que haya una mayor transferencia de oxígeno, esta lo podemos ver en una
disminución de la producción del etanol (5.62) en comparación con las cinéticas anteriores
(F1 y F4), sin embargo la producción de biomasa no incremento mucho (2.42 g/L), al igual
que en las cinéticas anteriores hay un consumo aparente de proteínas y posteriormente
una producción y nuevamente un consumo, lo cual observando sus errores, podría significar
que la levadura consume y produce proteínas.
Página | 59
1.2
0.8
[1/h]
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
t [h]
µ (dx) µ (ln)
Figura 29 Comportamiento de µ según el método diferencial (dx) y el logarítmico (ln) el paso del l tiempo
(derecha) de la cinética F2 a 250 rpm
Para esta cinética (Figura 29) se obtuvieron valores muy elevados de µmax de casi 1 h-1 para
el método diferencial y de 0.5 h-1 para el logarítmico, lo cual puede deberse a que se tiene
únicamente 5 puntos dentro de la cinética para calcular las constantes.
0.45 12
0.4
Yxs [gX/gS], YEt S [gEt /gS]
10
0.35
0.3 8
0.25
6
0.2
0.15 4
0.1
2
0.05
0 0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
t [h] t [h]
Yxs YEtS qS qEt
Figura 30 Comportamiento de YXS y YEtS (izquierda) y qS y qEt con el paso del tiempo (derecha) de la cinética F2 a 250 rpm
Para esta fermentación se observa (Figura 30) que el valor de YXS siempre estuvo por
debajo de 0.39 g/L, al igual YEtS siempre por debajo del 0.5114 g/g (valor máximo teórico),
muestras que para qS y qEt observamos valores muy elevados.
Página | 60
1
0.8
0.6
0.4
0.2
[glC/L]
0
-0.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
-0.4
-0.6
-0.8
-1
t[h]
Figura 31 Errores en el carbono total en la cinética F2 a 250 rpm
Para esta cinética (Figura 31), los errores del balance de carbono, se encuentran por debajo
de los esperados por los errores en la medición. Lo cual podría significar que las variaciones
de la µ, qS y qEt son debido a la cantidad de puntos tomados durante la cinética.
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CINÉTICA 3 (F3)
El tercer experimento consistió en realizar una cinética de la cual se cosecho la biomasa y

después se inició otra, ambas se realizaron a 250 rpm y 32°C, el inóculo se dejó crecer por
8 h.
Tabla. 13 Resultados promedio de la cinética F3 a 250 rpm
S X Et Prot
t [h] Sd sd sd Sd
[g/L] [g/L] [g/L] [g/L]
0 14.10 0.34 0.81 0.08 0.08 0.05 12.50 2.20
1.50 13.26 0.23 0.99 0.01 0.36 0.08 11.03 1.30
3.00 12.29 0.40 1.13 0.06 0.74 0.26 10.02 0.35
4.50 10.29 0.41 1.45 0.02 2.09 0.43 9.18 0.95
6.00 6.81 0.47 2.00 0.01 2.85 0.37 9.30 1.33
7.50 0.15 0.01 2.72 0.01 5.53 0.19 9.75 0.80
9.00 0.11 0.01 3.03 0.17 5.98 0.59 10.84 2.64
10.50 0.10 0.01 2.86 0.20 5.56 0.83 12.83 1.25
12.00 0.08 0.02 3.01 0.16 5.58 0.63 9.80 0.90
Página | 62
15
13.5
12
10.5
9
7.5
6
4.5
3
1.5
0
0 2 4 6 8 10 12
t [h]
Figura 32 Evolución de la cinética F3 a 250 rpm
Para el caso particular de esta cinética (Figura 32) donde la biomasa inicio en una fase
exponencial podemos ver que se terminó la glucosa poco antes de las 8 h, además produjo
5.58 g/L de etanol y 3.01 g/L de biomasa. Los cuales son resultados muy cercanos a lo
anterior (F2).
0.3
0.25
0.2
[1/h]
0.15
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t [h]
µ (dx) µ (ln)
Figura 33 Comportamiento de µ según el método diferencial (dx) y el logarítmico (ln) con el paso del tiempo
(derecha) de la cinética F3 a 250 rpm
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Para esta cinética (Figura 33) se obtuvieron valores muy elevados para la µmax de 2.5 h-1
para el método diferencial y de 0.16 h-1 para el logarítmico, lo cual para la fase exponencial
coincide con lo reportado en literatura (0.18 a 0.2 h-1).
0.8 2.5

0.7
Yxs [gX/gS], YEt S [gEt /gS]
2
0.6
0.5 1.5
0.4
0.3 1
0.2
0.5
0.1
0 0
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
t [h] t [h]
Yxs YEtS qS qEt
Figura 34 Comportamiento de YXS y YEtS (izquierda) y qS y qEt con el paso del tiempo (derecha) de la cinética F3 a 250 rpm
Para esta cinética F3 (Figura 34), al igual que en la F2, F3 Y F4, los valores de YXS se
encuentran por debajo del 0.39 g/G teórico, y para YEtS solo un punto se encuentra por
encima del teórico (0.5114 g/g)., nuevamente la qS y qEt tiene comportamientos similares.
1.5
0.5
[glC/L]
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
-0.5
-1
-1.5
t[h]
Figura 35 Errores en el carbono total en la cinética F3 a 250 rpm
Para esta cinética (Figura 35) podemos observar que todos los valores residuales son
negativos y muy cercanos al error por medición, lo cual significaría que se está generando
carbono.
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ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES DE LAS CINÉTICAS A
NIVEL MATRAZ
Tabla. 14 Comparación de las condiciones iniciales y constantes experimentales
Wt F1 F4 F2 F3
rpm 250 200 200 250 250
t inóculo
8 12 10 8 6
[h]
t [h] 5.83 11.25 10.00 12 7.5
wt f1 f4 f2 f3
sd sd sd sd sd
Xo [g/L] 0.1537 0.21 1.2175 0.22 0.2725 0.10 0.0644 0.01 0.8142 0.08
X f[g/L] 2.2808 0.03 2.8367 0.18 2.4875 0.01 2.4142 0.01 2.7183 0.01
Xg [g/L] 2.1271 0.24 1.6192 0.39 2.2150 0.11 2.3497 0.02 1.9042 0.09
So [g/L] 16.5233 2.16 16.4266 0.94 16.0550 0.62 16.0419 0.34 14.0953 0.34
Eto [g/L] 0.0803 0.02 0.1266 0.04 0.5364 0.17 0.3027 0.03 0.0792 0.05
Etg [g/L] 4.5000 0.03 6.2064 0.07 7.0771 0.33 5.3964 0.06 5.4461 0.11
Proto [g/] 11.1792 0.97 8.6023 0.94 12.7677 2.25 8.4544 0.47 12.5020 2.20
Protc
0.5311 1.35 1.8947 1.21 1.7006 4.94 -0.9297 1.30 2.7502 3.00
[g/L]
μmax
1.0044 0.1173 0.5399 1.0259 0.2546
[1/h]
μmax
0.4623 0.0784 0.2466 0.5579 0.1607
[1/h] ln
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BIOMASA
Para la biomasa, el aumento de las rpm aparentemente influye muy poco en la formación
de biomasa. Lo que parece afectar más a la µ es la concentración inicial de biomasa,
también este valor se puede ver afectado por la cantidad de puntos tomados durante la
cinética, en la mayoría de las fermentaciones solo tenemos 5 puntos durante esta, por lo
cual no podemos asegurar que los valores de µ sean los más exactos, ya que no se tienen
suficientes puntos en la parte lag, exponencial y estacionaria. Sin embargo es posible
acercarse un poco más a los valores reales empleando el método logarítmico para
encontrar el valor de la µmax, otra forma para encontrar el valor, es emplear métodos
numéricos que ajusten con base a mínimos cuadrados, para obtener los valores.
GLUCOSA
A pesar de que se colocan 15 g/L, y esto se realizó con azúcar seca, en los experimentos
se puede observar que la cantidad inicial es mayor, este aumento se puede ocasionar
debido a la cantidad de agua evaporada durante la esterilización o a que el medio lleva
extracto de levadura y polipeptona, los cuales podrían contener azucares reductores en su
composición. Este comportamiento se repitió en todas las cinéticas, excepto en el
experimento F3.
PROTEÍNAS O NITRÓGENO DISPONIBLE
Se puede observar en la Tabla. 1 que el consumo aparente de las proteínas es muy bajo,
por lo que el Nitrógeno no fue un factor limitante para el crecimiento, en los experimentos
realizado a nivel matraz, los errores y desviaciones tan elevados que se presentan en las
mediciones pueden deberse a tres factores:
1) Para el análisis solo se requieren 0.5 µl de muestra con un error de + 0.05 µl, y segundo
las fuentes de proteínas agregadas son una polipeptona y extracto de levadura, en
ambos casos los componentes proteicos no están caracterizados en un 100%.
2) Además puede haber cadenas de proteínas que se van rompiendo conforme S.
cerevisiae J26 o S. cerevisiae ATCC 9763 las van necesitando, y el método de
cuantificación de proteínas (método de Lowry), cuantifica los enlaces peptídicos que se
encuentran desdoblados o son de fácil acceso, por esta razón pareciera que en
ocasiones se generan proteínas.
Página | 66
3) Se está realizando una cuantificación total (método de Lowry), por lo que también las
proteínas exportadas al medio por S. cerevisiae J26 o S. cerevisiae ATCC 9763 están
saliendo en el análisis.
Para tener mejore resultados en las fermentaciones por lote y lote alimentado a nivel reactor
de 5 L, se cambió por el medio empleado en reportes de fermentaciones de S. cerevisiae a
nivel reactor (Melchy et al., 2000). Con esto se evitó el uso de polipeptona, y ya no se
cuantificaron las proteínas totales, ya que la fuente de nitrógeno empleada fue Hidróxido
de amonio, el cual también ayuda a regular el pH.
ETANOL
Para la formación etanol, en la Tabla. 14, podemos ver que este aparentemente no está
inhibiendo la formación de biomasa, sin embargo para ambas cepas tenemos
concentraciones finales elevadas de etanol. Como se mencionó en la introducción esto
puede deberse al efecto Crabtree, el cual podemos observar en los diferentes experimentos
ya que cuando aumentamos las rpm, también se aumenta la transferencia de oxígeno, y
por ende la cantidad de Oxígeno disuelto, lo cual disminuyo las concentraciones finales de
Etanol casi en 1 g/L al aumentar en 50 rpm.
YXS Y YETS
Con excepción de algunos puntos, se puede observar que en las cinéticas F1 y F4 y F2 Y

F3, para la YXS, sus valores están por debajo del teórico de 0.39 g/g, y lo mismo para el
YEtS con un valor teórico de 0.5114 g/g.
BALANCES DE CARBONO
En los balances puntuales se puede observar (Figura 19, Figura 23, Figura 27, Figura 31,
Figura 35) que hay partes en la cinética donde se consume más carbono del que se libera,
puntos negativos, y este es liberado en tiempos posteriores. Además en el balance global,
la salida de carbono no siempre era menor que la entrada, esto es porque:
 Se consideró que todo el etanol que se produce es por vía aerobia (efecto Crabtree),
es decir no sabemos ni consideramos si en algún momento la cepa entro en vía
anaerobia, ni como esto influye en el balance.
 Aún no sabemos cuánto carbono se destina a PHA y por el momento creemos que
este solo se produce por derivados de CoA que se encuentran libres en el citosol.
Página | 67
 Ocurre el mismo problema que al determinar las proteínas, no sabemos con
exactitud cuánto carbono aportan tanto el extracto de levadura, como la polipeptona.
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AJUSTES
WT
Figura 36 Simulaciones de los ajustes con los modelos Monod (M) (superior izquierda), Gompertz (G) (Superior derecha), Monod
con inhibición (M-I) (inferior izquierda) y Monod y proteínas (M-P) (inferior derecha) para la cinética wt
Podemos observar (Figura 36) que los 4 modelos propuestos tienen una aproximación muy
cercana a lo experimental, con pequeñas variaciones en el consumo de sustrato y un punto
en la producción de etanol. También se observa que el consumo de proteínas no es
relevante para los modelos a causa de sus variaciones, ya que aumenta y disminuye su
valor con el paso del tiempo y la ecuación propuesta no predice estos cambios, ya que no
considera formación de proteínas.
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F1
Figura 37 Simulaciones de los ajustes con los modelos Monod (M) (superior izquierda), Gompertz (G) (Superior derecha),
Monod con inhibición (M-I) (inferior izquierda) y Monod y proteínas (M-P) (inferior derecha) para la cinética F1
Podemos observar (Figura 37) que los 3 modelos basados en Monod (M, M-I, M-P) tienen
el mismo comportamiento para predecir los resultados experimentales de la biomasas,
mientras que el modelo de Gompertz hace una predicción muy precisa, con pequeñas
variaciones en el consumo de sustrato y un punto en la producción de etanol. Para esta
cinética el consumo de proteínas se intentó predecir, pero con mucha diferencias. Los 4
modelos presentaron la misma tendencia para ´redecir el consumo de glucosa.
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F4
Figura 38 Simulaciones de los ajustes con los modelos Monod (M) (superior izquierda), Gompertz (G) (Superior derecha),
Monod con inhibición (M-I) (inferior izquierda) y Monod y proteínas (M-P) (inferior derecha) para la cinética F4
Podemos observar (Figura 38) que los 4 modelos presentaron la misma tendencia para la
predicción de la biomasas, sustrato y etanol, y el que considera un consumo de proteínas,
únicamente ajusto en 2 puntos, debido al que al final tenemos un valor muy elevado de
proteínas nuevamente a causa del error durante su determinación por la técnica empleada
y a que el modelo no considera la producción de proteínas.
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F2
con inhibición (M-I) (inferior izquierda) y Monod y proteínas (M-P) (inferior derecha) para la cinética F2
Podemos observar (Figura 39) que los 4 modelos presentaron la misma tendencia para la
predicción de la biomasas, sustrato y etanol, pero el que considera un consumo de
proteínas, desprecio su consumo y mantuvo prácticamente constante su valor con el parao
del tiempo, debido a sus variaciones y a las limitaciones del modelo.
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F3
con inhibición (M-I) (inferior izquierda) y Monod y proteínas (M-P) (inferior derecha) para la cinética F3
Para esta cinética en particular (Figura 40) el modelo de Gompertz, parece predecir mejor
el comportamiento de todas las variables con el paso del tiempo, mientras que los 3
modelos basado en Monod tienen tendencias muy similares, para el que considera un
consumo de proteínas, tiene una predicción muy ineficiente, debido al error durante su
determinación.
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ANÁLISIS DE LAS SIMULACIONES
MONOD (M)
Tabla. 15 Valores encontrados para el ajuste con el modelo de Monod
wt F1 F4 F2 F3
μmaxS [h-1] 0.446 0.101 0.260 0.473 0.176
KsS [h-1] 2.0E-10 2.0E-04 2.93E-16 2.05E-16 2.73E-16
α [h-1] 1.3E-15 1.3E-09 0.270 1.37E-04 1.76E-04
β [h-1] 1.193 0.214 0.677 1.257 0.386
YXS [gX/gS] 0.355262 0.552 0.495106 0.398 0.445
YEtS [gEt/gS] 0.474 0.621 0.676219 0.506 0.671
ms [gS/gX*h] 2.5E-26 4.6E-27 2.0E-33 4.71E-33 5.9E-33
P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
Q 0.687 0.023 0.996 1.000 0.834
r2 0.964 0.921 0.986 0.995 0.958
De la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. podemos observar que para la

max, esta tiene valores desde 0.446 hasta 0.101 h-1, y el Ks tiene valores muy bajos.
Para la reducción de etanol encontramos que los valores de α son muy cercanos a 0 por lo
cual se corrobora que la producción de este no se relaciona con el crecimiento, mientras
que para β tenemos valores desde 0.214 hasta 1.257 h-1.
Para el consumo de sustrato, podemos ver que YXS tiene variaciones desde 0.335 hasta
0.552 gX/gS, muestras que para YEtS tenemos valores desde 0.474 hasta 0.676 gEt/gS
mientras que para ms tenemos valores cercanos a cero.
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También observamos que según el teorema P y Q solamente la cinética F1 podría no estar
siendo predicha por el modelo de Monod. Sin embargo todos los modelos tienen un ajuste
de mínimos cuadrados mayor a 0.9.
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MONOD CON INHIBICIÓN (MI)
Tabla. 16 Resultados encontrado para el ajuste con el modelo de Monod con inhibición
Wt F1 F4 F2 F3
μmaxS [h-1] 0.445 0.110 0.277 0.473 0.176
KsS [h-1] 1.22E-06 7.33E-01 5.47E-01 2.08E-03 2.52E-03
KEt [gEt-1] 1.45E+18 7.34E+11 9.80E+17 2.76E+12 1.03E+16
α [h-1] 7.78E-06 5.16E-02 2.15E-03 5.34E-02 7.33E-07
β [h-1] 1.1984 0.2051 0.7242 1.2308 0.3857
YXS [gX/gS] 0.3618 3.4892 120.8745 9.9562 0.4679
YEtS [gEt/gS] 0.4687 0.4296 0.4592 0.3469 0.6485
ms [gS/gX*h] 2.88E-23 1.55E-25 4.00E-24 1.69E-27 4.15E-26
P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
Q 0.93442 0.16849 0.93442 1 0.93442
r2 0.96568 0.92172 0.98634 0.99572 0.97124
Como se observa en la Tabla. 16 al considerar una posible inhibición por la concentración

del etanol, las μmax predichas serán un poco mayor en comparación con los valores
obtenidos en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia., para compensar la
nhibición por etanol y poder imitar la curva de crecimiento de la biomas. Sin embargo
podemos que la constante de inhibición tiene valores muy elevados, mayores a 7*1011 [ gEt-
1
], esto no coincide con lo reportado en literatura (3.8 hasta 50 g/L), esto quiere decir que
el etanol, no está inhibiendo realmente o que existen otras fuentes de inhibición que no se
consideraron en el modelo y, también lo podemos observar en los valores de ajuste de r2,
los cuales aumentaron un poco.
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Para la formación de etanol, nuevamente esta únicamente depende de beta, ya que los
valores de alfa tienen valores muy cercanos a ceros.
Con excepción de la cinética F3 los valores de YEtS tiene valores cercanos al teórico, sin
embargo para las cinéticas F1, F4 y F2 el YXS tiene valores muy elevados, lo que significa
que posiblemente el crecimiento de la biomasa no se debe al consumo de sustrato y que
casi todo el sustrato consumido se trasforma en etanol.
Y según los teoremas P y Q y los valores de r2 mayores a 0.9, se podría pensar que este
modelo ajusta mejor que el de Monod, pero al considerar los valores tan elevados y
dispersos de KEt podemos decir que matemáticamente este valor es muy alto como para
presentar un efecto realmente apreciable en el modelo.
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GOMPERTZ (G)
Tabla. 17 Valores encontrados para el ajuste con el modelo de Gompertz
Wt F1 F4 F2 F3
μmaxS [h-1] 1.147 0.098 0.536 0.735 0.278
λ [h-1] 2.666 1.190 3.425 1.476 2.255
Xmax [g/L] 2.66 3.76 2.64 2.45 3.096
α [h-1] 1.1E-22 1.8E-41 0.000 9.2E-27 6.2E-25
β [h-1] 1.970 0.248 1.013 1.302 0.452
YXS [gX/gS] 0.471 0.326 0.402 0.899 0.358
YEtS [gEt/gS] 0.423 0.652 0.671 0.387 0.649
ms [gS/gX*h] 1.01E-13 0.000 2.17E-14 0.000 0.000
P 1.000 0.001 1.000 0.001 0.001
Q 0.743 0.025 1.000 1.000 0.999
r2 0.954 0.919 0.990 0.992 0.981
Para los ajustes con el modelo de Gompertz (Tabla. 17) podemos observar que para la µmax,
esta tiene valores desde 0.278 hasta 1.147 h-1, esto se debe a que el modelo predice el
crecimiento de la biomasa considerando la concentración inicial de la biomasa en una
escala logarítmica, sin embargo si se calcula la mu de forma logarítmica para este modelo,
se puede observar que se parece mucho a la obtenida experimental mente por este método;
mientras que Ks tiene valores muy bajos.
Para la producción de etanol al igual que en todos los modelos se encontraron valores de
α muy cercanos a 0, mientras que para β tenemos valores desde 0.248 hasta 1.970 h-1.
Estos valores son más elevados a los demás debido a que este es el modelo que mejor
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predice el comportamiento de la biomasa y la producción de etanol únicamente depende
de la cantidad de biomasa.
Para el consumo de sustrato, podemos ver que YXS tiene variaciones desde 0.326 hasta
0.899 gX/gS; mientras que para YEtS tenemos valores desde 0.387 hasta 0.671 gEt/gS; y para
ms tenemos valores cercanos a cero.
También observamos que según el teorema P las cinéticas F4 y wt podrían no estar siendo
predichas adecuadamente por el modelo de Gompertz; y según el teorema Q la cinética F1
no está siendo predicha adecuadamente por este modelo. Sin embargo todos los modelos
tienen un ajuste de mínimos cuadrados mayor a 0.9.
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MONOD Y PROTEÍNAS (M-P)
Tabla. 18 Resultados encontrado para el ajuste con el modelo de Monod y consumo de Proteínas
Wt F1 F4 F2 F3
μmaxS [h-1] 0.051 0.257 0.360 0.360 0.157
KsS [h-1] 1.84E-02 6.85E-201 1.96E-198 1.06E-198 1.06E-198
KsProt [h-1] 2.18E-18 4.55E-19 1.03E-19 1.03E-19 7.06E-19
μmaxProt [h-1] 4.69E-02 1.11E-08 9.42E-04 9.42E-04 4.04E-03
α [h-1] 4.00E-07 6.41E-200 9.09E-200 9.09E-200 0.00E+00
β [h-1] 0.217 0.708 1.000 1.000 0.385
α Prot [h-1] 5.33E-25 1.30E-32 4.35E-27 4.35E-27 4.59E-27
β Prot [h-1] 1.57E-26 9.11E-30 2.06E-25 2.06E-25 7.42E-29
YXS [gX/gS] 0.474 0.806 2.590 2.590 0.308
YEtS [gEt/gS] 0.509 0.519 0.361 0.361 0.739
ms [gS/gX*h] 3.21E-193 1.67E-200 1.02E-198 1.02E-198 3.32E-03
YXProt [gX/gProt] 1.999 1.991 2.000 2.000 0.251
YEt Prot [gEt/gProt] 1.094 0.027 0.632 0.632 0.011
msProt [gS/gX*h] 7.75E-10 1.41E-01 8.94E-08 8.94E-08 5.38E-02
P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
Q 0.012 0.004 0.996 0.996 0.004
r2 0.911 0.911 0.985 0.985 0.890
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Como se observa en la Tabla. 18 si se considera un posible crecimiento de la biomasa y
formación de etanol a partir del consumo de proteínas, las μmax predichas disminuirán en
comparación con los valores obtenidos en la ¡Error! No se encuentra el origen de la
eferencia.. Sin embargo podemos observar que su consumo es muy bajo.
Para la formación de etanol, nuevamente esta únicamente depende de beta y de la glucosa,

ya que los valores de alfa y beta dependientes del consumo de proteínas tienen valores
muy cercanos a ceros.
Nuevamente los valores de los rendimientos de consumo tanto de sustrato como de

proteínas, tienen valores muy diferentes unos entre otros.
Y según los teoremas P y Q solamente las cinéticas F4 y F 2 están bien representadas por
este modelo a pesar de que todos los modelos presentan valores de r2 mayores a 0.9, el
hecho de que este modelo haya presentado tantas inconsistencias se puede deber al gran
error que se acarreó con las proteínas ya que no tenían una tendencia fija.
BASES PARA EL MODELO DEL LOTE ALIMENTADO
Para optimizar el proceso, es decir, aumentar la biomasa y producción de PHA, es

necesario disminuir la producción de etanol ya que la ruta de producción de PHA depende
de compuestos derivados del A-CoA, el cual se obtiene un paso por debajo de la formación
de etanol. Por lo cual existen 4 posibles alternativas:
1. Transformar otra cepa de S. cerevisiae, pero que no produzca mucho etanol durante
la respiración.
2. Modificar a la cepa S. cerevisiae J26, inhibiendo los genes involucrados a la
formación de etanol
3. Modificar la cepa para que pueda consumir el etanol.
4. Según los resultados obtenidos y la literatura consultada, es necesario que el cultivo
sea en un lote alimentado exponencial o continúo para poder controlar la cantidad
de glucosa alimentada y el crecimiento de S. cerevisiae, evitando que se vaya a
fermentación aerobia, y para eliminar un poco del etanol producido.
Debido a que uno de los objetivos de este trabajo es emplear los modelos matemáticos
para mejorar la producción, se optara por el 4 punto. También se cambió el medio de cultivo
para el lote alimentado, por varias razones:
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 Al emplear el medio YPD se encontraron muchas variaciones para las
constantes cinéticas en todos los valores empleados.
 En muchos artículos se emplean medios donde se conoce la concentración de
todos los componentes.
 Según otros experimentos no reportados por Ortega, et al., es necesario emplear
un medio mineral adicionado con vitaminas para obtener altas concentraciones
de biomasa al emplear un sistema por lote alimentado, en comparación de un
medio YPD.
5 1.000
0.975
Cinéticas aceptadas
0.950
3
0.925
r2
2
0.900
1
0.875
0 0.850
M G M-I M-P
P Q r2
Figura 41 Valores de P, Q y r2 para los diferentes modelos propuestos
Considerando los resultados obtenidos de los ajustes con los 4 modelos Figura 41,
podemos observar que la predicción basada en el modelo de Monod considerando las
condición de que cuando no hay sustrato no hay crecimiento ni formación de etanol,
presenta un ajuste muy cercano a lo real (con valores de r2 desde 0.921 hasta 0.995) y
valores de P de 0.001 y de Q mayores a 0.6, con excepción de un caso. Por lo que este es
el modelo más estable y que genera las mejores predicciones, en los otros modelos
basados en Monod, los teoremas P y Q presentan la posibilidad de que estos modelos no
sean los más adecuados para las predicciones; a pesar de que el modelo de Gompertz es
el que representa mejor el cambio de la biomasa con respecto al tiempo, y también el de la
μ predicha con el método logarítmico, la cual no es constante. Sin embargo al momento de
predecir el etanol y consumo de sustrato y proteínas, el modelo de Gompertz, no permitió
obtener ajustes muy buenos, ya que todas las variables, se vuelven dependientes de la
formación de biomasa (X [g/L]), que depende únicamente del tiempo, y 3 variables, por lo
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que estos modelos presentan menos grados de libertad para sus ajuste y su simulación no
permite ver el cambio en el comportamiento de X por otras variables. Posiblemente se
podría intentar mejorar el modelo de Gompertz al volverlo dependiente de S y que se afecte
por los productos, pero es algo que no se realizó en este proyecto.
1.5 7.E-02
µmax [h-1], β [h-1], YXS [gX/gS], YEtS
Ks [h-1], α [h-1], ms[gS/gX*h]

1.25 6.E-02
5.E-02
1
4.E-02
[gEt/gS]
0.75
3.E-02
0.5
2.E-02
0.25 1.E-02
0 0.E+00
wt F1 F4 F2 F3
μmaxS [h-1] β [h-1] YXS [gX/gS] YEtS [gEt/gS]
Ks [h-1] α [h-1] ms [gS/gX*h]
Figura 42 Variación de las constantes en los diferentes modelos
Se puede observar (Figura 42) que YXS y YEtS al realizar los ajustes, se encontraron valores
constantes, los cuales casi siempre estaban cercanos a los teóricos, considerando esto,
para la simulación del lote alimentado se emplearan los valores teóricos y en caso de ser
necesario se cambiara el valor de estos. Mientras que Ks siempre tuvo valores muy
cercanos a 0 y menores a 0.025, para α también se encontraron valores muy pequeños, lo
cual coincide con lo reportado en literatura, de que la formación de etanol no está asociada
al crecimiento.
En la parte del lote se disminuyó la cantidad de glucosa inicial, ya que según los resultados
obtenido a nivel matraz y la literatura revisada (efecto Crabtree), la disminución del etanol
producido al aumentar la agitación (aireación) es muy poco. Por esta razón si empleamos
una menor cantidad de fuente de carbono, tendremos una menor cantidad de etanol al final
del lote, lo cual reducirá el tiempo necesario para que tanto S. cerevisiae disminuya la
concentración de etanol hasta 1 g/L y así poder iniciar la alimentación exponencial.
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LOTE ALIMENTADO EXPONENCIAL
S. CEREVISIAE ATCC WT (CLA-WT)
Primero se realizó una fermentación con la cepa silvestre, con la intención de ver si el
modelo sirve para predecir el crecimiento de S. cerevisiae en un fermentador de 5 L con
alimentación exponencial, además de corroborar si efectivamente se pueden llegar a
concentraciones mayores a 50 g/L ya que de lo contrario sería necesario cambiar la
estrategia para maximizar la producción de nano partículas.
Figura 43 Resultados experimentales para la cinética CLA-wt en el reactor de 5L
Como se puede observar en la Figura 43 es necesario anexar una ecuación para el

consumo del etanol únicamente cuando el sustrato tiene concentraciones muy cercanas a
0 gS que se relacione con el incremento de la biomasa.
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100 1050
90 950
80
850
70
rpm [1/min]
60 750
Do [%]
50 650
40 550
30
450
20
10 350
0 250
0 4 8 12 16 20 24 28 32
t [h]
Oxígeno disuelto Agit.
Figura 44 Perfil de las RPM y DOT durante la cinética CLA-wt
0.2 7
0.18 6.5
0.16
Flujo de aire [L/min]

F alimentación [L/h]
6
0.14
0.12 5.5
0.1 5
0.08 4.5
0.06
4
0.04
0.02 3.5
0 3
0 4 8 12 16 20 24 28 32
t [h]
F alimentación F aire
Figura 45 Flujos de alimentación y de aire durante la cinética CLA-wt
Al observar la Figura 43, la Figura 44 y Figura 45, podemos notar que la producción de
etanol empezó a ocurrir cuando el DOT alcanzo valores menores al 20%, a las 24 h, también
se observa que al variar el flujo de alimentación de aire se aumentó el DOT, sin embargo
se llegó al límite de alimentación y de agitación. Lo cual demuestra lo reportado en literatura,
durante la alimentación exponencial la única limitante es la transferencia de oxígeno.
También se cambió el tipo de alimentación al llegar a esta hora para tratar de conservar un
crecimiento constante de S. cerevisiae ATCC 9763, para evitar esta limitación en
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fermentaciones futuras, se moverá el segundo impulsor, a un impulsor de distancia del otro,
y se incrementara el volumen de inicio, para tener 2 impulsores durante toda la siguiente
fermentación.
0.5
0.4
0.3
µ [1/h]
0.2
0.1
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
t[h]
µ (1/h) µ ln (1/h)
Figura 46 Perfil de la μ durante la cinética CLA-wt por el método diferencial y logarítmico
Se puede observar (Figura 46) que el por el método logarítmico se tiene una menor
variación para determinar a la μ, y que durante la alimentación está casi siempre tuvo
valores cercanos y menores a la μ de operación (0.18h-1).
En la fermentación, durante la etapa por lote a nivel reactor, podemos observar que al inicio
de la fermentación hay producción de etanol, a pesar de tener valores elevados de oxígeno
disuelto, lo cual demuestra que la cepa presenta el efecto Crabtree. Pero, durante la
alimentación exponencial, podemos observar que cuando la trasferencia de oxígeno llego
a su límite o empezó a ser deficiente, se empezó a formar etanol (24 h), por esta razón,
para mejorar la cinética es necesario mantener la transferencia de oxígeno en la mayor
cantidad posible.
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SIMULACIONES
Para las simulaciones siguientes se emplearon las siguientes condiciones iniciales y constantes (
Tabla. 19), debido a que se cambió el medio de cultivo, se emplearon valores reportados
por diferentes autores (Díaz Ordaz, Orozco, Acevedo, Dutta, Melchy) y los rendimientos
teóricos.
Tabla. 19 Constantes, parámetros, medidas del biorreactor y condiciones iniciales de la primera simulación
Sc [gS] 0
μmaxS [h-1] 0.22 Impulsores 1
YXS [gX/gS] 0.39
μmaxEt [h-1] 0.1 Bafles 4
YEtS [gEt/gS] 0.5114
KsS [h-1] 0 Xo [gX/L] 1.26
ms [gS/gX*h] 0.1
-1
KsEt [h ] 1.2 Eto [gEt/L] 0.32
Di [m] 0.085
β [h-1] 0.25 So [gS/L] 10.22
Dt [m 0.18
YXEt [gX/gS] 1 Vo [L] 2
Helip [m] 0.115
msEt Sa [gS/L] 500
0.0005
[gEt/gX*h] Velip [m3] 0.0014
Primero se simulo la fermentación sin considerar la transferencia de oxígeno, a continuación

se muestran algunos resultados y como se mejorando el modelo.
Figura 47 Simulación de la cinética CLA-wt sin considerar le transferencia de oxígeno y con un ks=0,
alimentación exponencial constante (izquierda), considerando la alimentación por pulsos (derecha)
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El la Figura 47, se simulo la fermentación, sin considerar la transferencia de oxígeno, es
decir sin predecir el DOT, Kla y C*, además de emplear una μ que no se ve afectada por el
oxígeno, a su vez se despreció el ks para poder observar la influencia de este término
(debido a que en los ajustes a nivel matraz este tenía valores muy cercanos a 0),y mejorar
las ecuaciones para la predicción del consumo de sustrato. También se aprecia la
importancia de considerar que la alimentación se dio por pulsos, esto es debido a que en el
laboratorio las bombas no son automáticas, por lo que el flujo de la alimentación se cambió
cada hora, al hacer esta consideración el etanol se predice mejor.
Figura 48 Simulación de la cinética CLA-wt sin considerar le transferencia de oxígeno y con un ks=0.025 h-1,
con una alimentación exponencial constante (izquierda), considerando la alimentación por pulsos (derecha)
El la Figura 48, nuevamente se simulo la fermentación, sin considerar la transferencia de

oxígeno, además de emplear una μ que no se ve afectada por el oxígeno, pero se le dio un
valor a Ks, al comparar con la Figura 47, se observa que el etanol aumenta demasiado. Y
la producción de biomasa de ver disminuida.
Figura 49 Simulación de la cinética CLA-wt sin considerar le transferencia de oxígeno y con un ks=0.025 y
Sc=0.03, con una alimentación exponencial constante (izquierda), considerando la alimentación por pulsos
(derecha)
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Se puede apreciar en las figuras anteriores que el etanol se consume aun en presencia de
glucosa, para esto, Figura 49, se le anexo una nueva condición al modelo para predecir el
consumo de etanol, esta condición es que si el sustrato es menor a una concentración Sc
(en este caso 0.025), S. cerevisiae empezara a consumir el etanol y el sustrato al mismo
tiempo, sin producir etanol. Esta simulación se aproxima un poco más a los resultados
experimentales para la producción del etanol. Y es muy claro la diferencia al modelar la
alimentación real contra la supuesta.
De estas simulaciones podemos decir que al suponer que el DOT siempre es mayor al 20%
y no tener ninguna ecuación para predecirlo, y a pesar de esto, podemos ver que ajusta
muy bien para la parte donde se cumple esta condición para el consumo de sustrato y
formación de biomasa, sin embargo para poder tener un mejor ajuste es necesario emplear
ecuaciones que permitan describir el cambio de las concentraciones del Oxígeno disuelto
en el medio de cultivo con el paso del tempo. Para encontrar el modelo de Kla que prediga
mejor el DOT en el reactor, se adicionaron las siguientes condiciones (Tabla. 20):
Tabla. 20 Condiciones para las simulaciones para predecir el DOT
Ks 0.025 1/h
Sc 0.03 gS
Yso2 0.9 gO2/gX
YEto2 1 gO2/gX
mso2 0.5 gO2/gX.h
Ccrit .14 mgO2/L
C*o 6.06 mgO2
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Figura 50 Simulación de la cinética CLA-wt considerando las ecuaciones para el KLA de Cooper y CL.
Primero se modelo (Figura 50) empleando el modelo de Kla propuesto por Cooper, donde
para esta simulación, en la predicción del DOT no se llega a la inhibición, por lo cual no
podemos observar su efecto inhibitorio en la formación de etanol y biomasa.
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Figura 51 Simulación de la cinética CLA-wt considerando las ecuaciones para el KLA de Cooper y CL y C*.
Posteriormente (Figura 50) empleando el modelo de Kla propuesto por Cooper, se

emplearon las ecuaciones para la predicción del C*, donde para esta simulación,
nuevamente en la predicción del DOT no se llega a la inhibición, por lo cual no podemos
observar su efecto, sin embargo podemos observar que la predicción de S, X y Et en ambas
simulaciones es similar, por lo cual hasta el momento lo único que hce falta mejorar es la
predicción del CL con el paso del tiempo.
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Figura 52 Simulación de la cinética CLA-wt las ecuaciones para el KLA según Galaction y CL.
Se empleó el modelo de Kla según Galaction (Figura 52), podemos observar que no logra
describir el comportamiento durante la fase de lote y al comienzo de la alimentación, sin
embargo podemos observar cómo influye la deficiencia del Cl cuando llegamos a valores
menores del 20 de DOT, la biomasa cesa su crecimiento exponencial y se produce más
etanol.
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Figura 53 Simulación de la cinética CLA-wt las ecuaciones para el KLA según Galaction, CL y C*.
Al emplear tanto el modelo de Galaction como el C*, podemos observar (Figura 53), que no
predice el comportamiento del CL, sin embargo podemos observar cómo afecta nuestro
factor de inhibición en la formación de biomasas y etanol, mientras que la biomasa
disminuye su producción, la formación de etanol se ve favorecida. Este modelo pudo no
haber predicho adecuadamente debido a las diferencias entre el reactor que el empleo y el
usado en esta cinética, a de más de que él recomienda emplear su ecuación en
concentraciones de biomasa mayores a 33g/L.
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De éstas últimas 4 figuras podemos decir que los modelos propuestos para la predicción
del Cl en reactor no has sido los adecuados. Por lo que es necesario realizar más
experimentos para poder predecirlo, y el problema puede están tanto en las ecuaciones
para predecir la C* y el Kla del reactor.
Por lo que el modelo quedaría descrito por las siguientes ecuaciones:
Flujo y Volumen
0.022 0
0.044, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 0.5 𝐹𝑜, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴
0.066, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 1.5 0.0025, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 1.5
0.088, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 2 0.0065, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 2.5
0.110, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 2.5 0.0079, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 3.5
0.132, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 3 0.0095, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 4.5
0.154, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 3.5 0.0116, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 5.5
0.176, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 4 0.0140, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 6.5
0.198, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 4.5 0.0169, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 7.5
0.22, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 5 0.0205, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 8.5
0.236, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 5.5 0.0248, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 9.5
0.252, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 6 𝐹 = 0.0300, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 10.5
0.268, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 7 0.0363, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 11.5
0.284, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 8 0.0439, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 12.5
𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 =
0.300, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 10 0.0531, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 13.5
0.316, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 10.5 0.0642, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 14.5
0.331, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 12 0.0777, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 15.5
0.346, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 14 0.0940, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 16.5
0.361, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 16 0.1138, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 17.5
0.376, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 18 0.1377, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 18.5
0.391, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 20 0.1666, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 19.5
0.406, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 22 0.0777, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 23.5
0.421, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 24 {0.0940, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴 + 25.5
0.436, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 26
0.4495, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 28 𝑑𝑉𝐴𝑙𝑜𝑖𝑚
=𝐹
0.463, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 30 𝑑𝑡
0.476, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 32
{ 0.489, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 34 𝑉 = 𝑉𝑜 + 𝑉𝐴𝑙𝑖𝑚 − 𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Formación de Biomasa
𝑑𝑥 𝐹(𝑡)
= (𝜇 − )∗𝑋 𝜇 = 𝜇𝑆 + 𝜇𝐸𝑡ℎ
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
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Crecimiento por consumo de etanol
Crecimiento por consumo de glucosa
𝜇𝑚𝑎𝑥𝐸𝑡 ∗ 𝐸𝑡 𝐶𝐿
𝜇𝑚𝑎𝑥𝑆 ∗ 𝑆 𝐶𝐿 ∗( )
∗( ) 𝐸𝑡 + 𝑘𝐸𝑡 𝐶𝐿 + 𝐾𝑂2
𝜇𝑆 = { 𝑆 + 𝑘𝑆 𝐶𝐿 + 𝐾𝑂2 𝜇𝐸𝑡 = 0, 𝑠𝑖 𝑆 ≥ 𝑆𝑐
0, 𝑠𝑖 𝑆 ≤ 0
0, 𝑠𝑖 𝐸𝑡 ≤ 0
0, 𝑠𝑖 𝐶𝐿 ≤ 0 { 0, 𝑠𝑖 𝐶𝐿 ≤ 0
Consumo y Producción de etanol
𝑑𝐸𝑡 𝐹(𝑡)
= 𝑞𝐸𝑡 ∗ 𝑋 − ∗ 𝐸𝑡 𝑞𝐸𝑡 = 𝑞𝐸𝑡𝑝 − 𝑞𝐸𝑡𝑐
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
Consumo de etanol
Producción de etanol
𝜇𝐸𝑡
+ 𝑚𝑠𝐸𝑡
𝛽
𝑞𝐸𝑡𝑝 = { 𝑞𝐸𝑡𝑐 = {𝑌𝑋𝐸𝑡
0, 𝑠𝑖 𝑆𝑐 ≥ 𝑆 0, 𝑠𝑖 𝑆 ≥ 𝑆𝑐
0, 𝑠𝑖 𝐶𝑙 ≤ 0
Consumo de Glucosa
𝜇𝑆 𝑞𝐸𝑡𝑝
𝑑𝑆 𝐹(𝑡) + + 𝑚𝑠
= −𝑞𝑆 ∗ 𝑋 − ∗ (𝑆𝑎 − 𝑆) 𝑞𝑆 = {𝑌𝑋𝑆 𝑌𝐸𝑡𝑆
𝑑𝑡 𝑉(𝑡)
0 𝑠𝑖 𝑆 ≤ 0
Oxígeno disuelto en el reactor
𝑑𝐶𝐿 0.016 𝑃𝑔 0.95

= (𝐾𝑙𝑎 ∗ [𝐶𝑙 − 𝐶 ∗ ]) − 𝑞𝑂2 ∗ 𝑋 𝐾𝑙𝑎 = ∗( ) ∗ 𝑉𝑠 0.67
𝑑𝑡 𝐻 𝑉
𝑃𝑟𝑒𝑎𝑙 = 𝑃𝑜𝑡 ∗ 𝑓𝑐 ∗ 𝑛𝑖
𝐻𝑙 𝐷𝑡 0.5
∗
𝑓𝑐 = [𝐷𝑖 𝐷𝑖 ] 𝜇𝑆
+
𝜇𝐸𝑡
+ 𝑚𝑠𝑂2
9 𝑞𝑂2 = {𝑌𝑆𝑂2 𝑌𝐸𝑡𝑂2
0, 𝑠𝑖 𝐶𝑙 ≤ 0
𝐷𝑖 3
0.45 𝑉 − 𝑉𝑒𝑙𝑖𝑝
𝑃𝑔 = 𝐶 ∗ (𝑃𝑟𝑒𝑎𝑙2 ∗ 𝑟𝑝𝑚 ∗ ) 𝐻𝑙 = 𝜋 + 𝐻𝑒𝑙𝑖𝑝
∗ 𝐷𝑡 2
𝑄𝑎𝑖𝑟𝑒 0.56 4
𝐷𝑖 5 𝑄𝑎𝑖𝑟𝑒
𝑃𝑜𝑡 = 𝑁𝑝 ∗ (𝜌 ∗ 𝑟𝑝𝑠 3 ∗ ) ∗ 1.315𝑥10−7 𝑉𝑠 = 𝜋
2
𝐺𝑐 4 ∗ 𝐷𝑡
Página | 95
4
5, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 20 350
𝑄𝑎𝑖𝑟𝑒 = { 450, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 𝑡𝐶𝐿𝐴
6, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 21
6.5, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 22 550, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 11
650, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 14
𝑟𝑝𝑚 𝑟𝑝𝑚 =
700, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 18
𝑟𝑝𝑠 =
60 800, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 19
900, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 20
𝐶𝐿 { 950, 𝑠𝑖 𝑡 ≥ 22
𝐷𝑂𝑇 = ∗ 100
𝐶 ∗𝑜
A causa de la complejidad del modelo y las limitaciones de las computadoras, no se

optimizaron los valores de las constantes.
Página | 96
RECOMENDACIONES
 Tener pocos valores experimentales durante la cinética genera mucho ruido para la
obtención de las constantes cinéticas.
 Es necesario tomar mayores volúmenes de muestra para la determinación de las
variables para disminuir el error.
 Los métodos numéricos permiten obtener una aproximación de los parámetros
cinéticos.
 Las condiciones lógicas facilitan y mejoran la predicción del comportamiento
biológico.
Página | 97
CONCLUSIONES
 La disponibilidad de oxígeno disuelto y la velocidad de alimentación exponencial

disminuyen la formación de etanol.
 Existe una concentración de glucosa (Sc) a partir de la cual se consumen glucosa y
etanol.
 Los modelos de Kla propuestos por Galaction, al considerar la biomasa, y el de
Cooper no ofrecen una aproximación a los resultados obtenidos en el fermentador
empleado, debido a las diferencias geométricas y a las condiciones de los
fermentadores empleados.
 Se requiere de un mejor modelo para predecir el comportamiento de C*, CL (DOT)
y Kla, el cual considere una zona de transición adicional.
Página | 98
BIBLIOGRAFÍA
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the Bacterial Growth Curve. Applied and Environmental Microbiology.
Página | 101
NOMENCLATURA
Tabla. 21 Símbolos y letras griegas
C* mgO2/L Concentración de oxígeno disuelto en equilibrio

Ccrit mgO2/L Concentración de O2 a la que el microorganismo deja de crecer
CL mgO2/L Concentración de Oxígeno disuelto
Di m o cm Diámetro del impulsor
Dt m o cm Diámetro del tanque
Ef - Eficiencia
FoQ L/h o m3/min Flujo
Fc - factor de relación de la potencia
H m o cm altura
H mgO2/L*atm constante de Henry para Oxígeno/Agua
Kla h-1 Coeficiente de transferencia de Oxígeno
Ks h-1 Constante de afinidad
ms g/g*h Mantenimiento celular
Ni - Número de impulsores
Np - Número de potencia
Patm atm Presión atmosférica
Pent atm Presión a la entrada
Pg Hp Potencia gaseada
Phidr atm Presión hidrostática
Pin atm Presión interna
Pot Hp Potencia teórica
Preal Hp Potencia real
Psal atm Presión a la salida
Pstd atm Presión estándar
q g/gX*h Velocidad de formación/consumo
Re - Numero de Reynolds
rpm min-1 Velocidad de agitación
Sc gS Valor de glucosa para consumo de etanol
V L o m3 Volumen
Vs L/h o m3/min Velocidad superficial del aire
Y g/g Rendimiento para la síntesis
α h-1 Coeficiente de formación de producto asociado al crecimiento
β h-1 Coeficiente de formación de producto no asociado al crecimiento
μ h-1 Velocidad específica de crecimiento
μmax h-1 Velocidad máxima de crecimiento
ρ g/cm3 densidad del caldo
φO2 - fracción parcial de O2 en el aire
Página | 102
Tabla. 22 Subíndices
aire Aire
Alim alimentación
elip Elipse (tapa inferior del biorreactor)
Et Etanol
L Liquido/ Caldo en el reactor
O Condición inicial
O2 Oxígeno
P Producto
Prot Proteínas
S Glucosa
tom Tomas para muestra
X Biomasa
Página | 103

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Instituto Politécnico Nacional

Unidad profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

TÍTULO DEL TRABAJO:

PRODUCCIÓN DE NANO PARTÍCULAS POR VÍA FERMENTATIVA

TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN

PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

LEOBARDO OTTMAR PALMA GALLARDO

DR. FERMÍN PÉREZ GUEVARA

DRA. ROSA ISELA CARBAJAL DE NOVA

M. EN C. RICARDO SÁNCHEZ RICO

DR. FRANCISCO ARTURO RAMÍREZ ORTEGA

México, D. F. Enero 2016

A mis compañeros de laboratorio, el M. en C. Joel Alba Flores y el M. en C. Ricardo Sánchez

A UPIBI por brindarme una educación y formación como profesionista de calidad y al

“Eppur si move”. Galileo Galilei

Sin embargo su obtención a través de microorganismos procariontes tiene la limitante de

Actualmente, obtener PHAs no es suficiente, también es necesario poder predecir y

BIOSÍNTESIS DE PHAS ................................................................................................ 2

SACCHAROMYCES CEREVISIAE ................................................................................ 3

SISTEMA DE EXPORTACIÓN DE VESÍCULAS ........................................................ 5

EFECTO CRABTREE ................................................................................................ 6

S. CEREVISIAE J26 .................................................................................................. 7

FASES DEL CRECIMIENTO ..................................................................................... 8

MODELOS MATEMÁTICOS ........................................................................................ 10

CONDICIONES LÓGICAS .............................................. ¡Error! Marcador no definido.

MÉTODOS NUMÉRICOS ............................................................................................ 11

CULTIVO POR LOTE .................................................................................................. 12

FORMACIÓN DE BIOMASA .................................................................................... 12

FORMACIÓN DE PRODUCTO ................................................................................ 16

CONSUMO DE SUSTRATO .................................................................................... 16

CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO .......................................................................... 16

FORMACIÓN DE BIOMASA .................................................................................... 17

FORMACIÓN DE PRODUCTO ................................................................................ 17

CONSUMO DE SUSTRATO .................................................................................... 17

CULTIVO LOTE (QUIMIOSTATO SIMPLE ETAPA) .................................................... 18

FORMACIÓN DE BIOMASA .................................................................................... 18

FORMACIÓN DE PRODUCTO ................................................................................ 18

CONSUMO DE SUSTRATO .................................................................................... 18

OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 24

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 24

NIVEL MATRAZ ....................................................................................................... 28

METODOLOGÍA DE CÁLCULOS .................................................................................... 30

CALCULO DE ERRORES ........................................................................................... 30

BIOMASA (PESO SECO) ........................................................................................ 30

ETANOL (CROMATOGRAFÍA DE GASES) ............................................................. 31

GLUCOSA (AZUCARES REDUCTORES) ............................................................... 31

PROTEÍNAS (LOWRY) ............................................................................................ 31

BALANCE DE CARBONO ........................................................................................... 32

RENDIMIENTOS Y CONSTANTES, TEÓRICAS Y EXPERIMENTALES ..................... 34

RENDIMIENTO TEÓRICO DE SUSTRATO A BIOMASA 𝒀𝑿𝒔: ................................ 34

RENDIMIENTO DE SUSTRATO A BIOMASA YXS: .................................................. 34

RENDIMIENTO TEÓRICO DE ETANOL A SUSTRATO 𝒀𝑬𝒕𝒔:................................. 35

RENDIMIENTO DE ETANOL A SUSTRATO YETS: ................................................... 35

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO ....................................................... 35

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE FORMACIÓN DE ETANOL 𝒒𝑬𝒕 .............................. 35

VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CONSUMO DE SUSTRATO 𝒒𝑺 .............................. 35

CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA (DNS) (MILLER, 1959) .......................................... 37

CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA POR PESO SECO: ................................................ 37

CUANTIFICACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES: ..................... 38

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY (LOWRY ET AL.,

RECUPERACIÓN DE NANO –PHAS .......................................................................... 40

PROCESAMIENTO DE DATOS ...................................................................................... 42

MODELOS MATEMÁTICOS ........................................................................................ 42