Bioquímica Bacteriana

1. INTRODUCCIÓN:

Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear

materia orgánica a partir de elementos inorgánicos, por eso, han de nutrirse a
expensa del medio en que se encuentren, y de ahí que en el interior de éstos
ocurran una serie de reacciones de síntesis y de descomposición de sustancias
orgánicas, las cuales reciben el nombre de metabolismo. A partir de estas
características metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la identificación
de microorganismos y productos obtenidos de la relación microorganismo-
medio. Otro de los aspectos importantes de la realización de estas pruebas, es
que a partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación
de los alimentos por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de
bioquímica han proporcionado una herramienta útil para la detección directa de
los microorganismos contaminantes. La identificación bacteriana se puede
realizar por medio de una serie de análisis que necesitan de diferentes cultivos
y procedimientos para llegar a identificar las especies bacterianas que
contaminan los alimentos o las aguas. A continuación, se desarrollan diferentes
técnicas para la identificación de algunos microorganismos y productos
obtenidos en la relación ya mencionada, microorganismo-medio.

2. OBJETIVOS:

• Aprender a identificar a las bacterias de acuerdo a las reacciones

metabólicas que tienen frente a los diferentes reactivos o medios de
cultivo.

• Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una

previainterpretación.

3. MARCO TEÓRICO:

• Hidrólisis de la Úrea:

Fundamento: Se determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea

formando dos moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa. La urea
es una diamina del ácido carbónico (carbamida), la hidrólisis de la urea es
catalizada por una enzima específica la ureasa, para dar dos moléculas de
amoníaco. En solución, la úrea se hidroliza, dando carbonato de amonio como
producto final. Esta enzima está vinculada con la descomposición de los
compuestos orgánicos. La ureasa rompe por hidrólisis el enlace entre el N 2 y el
C siendo el N2 disociado a amoníaco.

El medio utilizado es el agar base de Christensen (1946):

Peptona de gelatina 1 g

Cloruro de sodio 5 g
Fosfato monopotásico 2 g

Rojo de fenol 0,012 g

Agua destilada 1 l

Agar 20 g

Ejemplos de resultados:

Klebsiella pneumoniae Reacción a la urea +

Escherichia coli Reacción a la urea –

Proteus spp. Reacción a la urea +++

• Hidrólisis de Almidón:

Fundamento: El almidón es una macromolécula (unidades de glucosa) que

necesita una hidrólisis previa para ser utilizado por los microorganismos. Con
esta prueba se detecta la enzima amilasa que hidroliza el almidón en glucosa y
restos de maltosa.

Resultado:

. Si existe una coloración azul-parda alrededor del cultivo significa que el

almidón no ha sido hidrolizado por el microorganismo, debido a que no posee
la enzima y por lo tanto es amilasa negativo.

• Hidrólisis de Gelatina:

Fundamento: Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado

grande para entrar en la célula bacteriana, por lo que primero deben ser
degradadas a polipéptidos y finalmente hasta aminoácidos, que entrarán en la
célula. La gelatina, proteína de estructura sencilla, es un colágeno
desnaturalizado que tiene poco valor nutritivo, pero se usa para detectar la
actividad proteolítica. Con este test se determina la capacidad de un organismo
para producir enzimas de tipo proteolítico, gelatinasas, que licúan la gelatina.

Resultados: Una halo incoloro alrededor del inóculo indica la hidrólisis de la

gelatina, y por lo tanto el microorganismo es gelatinasa (+). Si existe formación
de un precipitado blanco alrededor del cultivo se considera negativo, ya que
esto corresponde a la reacción de la gelatina con el reactivo de Frazier, lo que
indica que el microorganismo no posee la enzima gelatinasa.

• Prueba de óxido/fermentación.

Fundamento: Se llama también prueba de Hugh-Leifson. Con esta prueba se

investiga si el microorganismo actúa sobre un azúcar por vía oxidativa o
fermentativa. Se utiliza un medio de agar nutritivo semisólido más glucosa al
1% y un indicador de pH, púrpura de bromocresol. Se prepara el medio
semisólido, se funde al mechero y luego se distribuye en tubos de ensayo a
razón de 7 ml por tubo. Se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121 ºC.

El medio neutro tiene un color violeta.

El medio ácido tiene color amarillo.

El medio básico tiene un color azulado-púrpura.

4. PARTE EXPERIMENTAL

Tenemos 2 tubos con agar nutritivo

glucosídico (verde) y un tubo con
contenido de urea (rojo grosella)

Inoculamos cada tubo con Salmonella typhi

A uno de los tubos con agar

nutritivo le añadimos 5 ml de
parafina aproximadamente
para generar un medio
anaeróbico.
Encubamos a 37 ºC por 24h y
observamos los resultados.

Observamos el cambio de color a

consecuencia de la degradación de la
glucosa por el microorganismo, dando
la prueba positiva.

En ambos tubos de produjo una

oxidación, pero en el tubo con parafina
se observó una fermentación, por
presencia de gas

No ocurrió ninguna degradación en la

prueba, no se produjo ninguna variación
de color, prueba negativa.

Tenemos 2 placas Petri, una con

agar de almidón y la otra con agar
de gelatina.
 Inoculamos ambas placas con
Salmonella typhi, con método que
gustemos. Encubamos a 37 ºC
por 24h y observamos los
resultados.

Pasado el tiempo de encubación

añadimos lugol a la placa con agar
almidón y dejamos actuar al lugol por
5 min aprox.

Pasado el tiempo de encubación

añadimos HCl a la placa con agar
gelatina y dejamos actuar al lugol por 5
min aprox.

Observamos que no se produjo

ningún halo de inhibición,
resultando que el
microorganismo no degrada la
gelatina .La prueba fue negativa.
 No observamos ningun cambio de
color alrededor de la siembra del
microorganismo, determinando
que no hubo degradación de
almidón.

5. DISCUSIONES:

Según Granados R. (2003).La Prueba Al realizar esta prueba de

de Oxidación /Fermentativo debe dar
como resultado fermentativo en las
Enterobacterias como la Salmonella
tiphy.
oxidación/fermentativo efectivamente
dió como resultado fermentativo al
usar la Salmonella tiphy como cepa
ya que hubo una fosforilación inicial
de la glucosa previamente a su
degradación.

6. CONCLUSIONES:

• La diferencia principal entre el metabolismo fermentativo y

oxidativo requiere de los requerimientos de oxígeno atmosférico y
de la fosforilación inicial.

• La degradación de las pequeñas cantidades de úrea, es

aumentada por las aminas formadas a partir de la
Descarboxilacion de los aminoácidos.

• Bibliografía

• Ganados R. (2003) Microbiología Tomo 1. Editorial Paraninfo.

España.

• Pascual M. (2000) Microbiología Alimentaria. Editorial Díaz de

Santos. España.