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SECUENCIACIÓN
DE ÁCIDOS NUCLEICOS
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
ROSALIA DE NECOCHEA CAMPION
JUAN CARLOS CANUL TEC
1.0 INTRODUCCIÓN 5
1.1 Los orígenes de la investigación de los ácidos nucleícos 6
1.2 La identificación de los componentes 7
1.3 El descubrimiento de la estructura del ADN 8
7.0 REFERENCIAS 43
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INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figuras
Tablas
Tabla 1. 22
Descubrimientos significativos que permitieron el desarrollo de métodos
automatizados de secuenciación de ácidos nucleicos
Tabla 2. 35
Algunas de las enzimas que han tenido un papel importante
en el desarrollo de los métodos de secuenciación
2
Algunos acontecimientos relevantes al desarrollo de los métodos de
secuenciación de los ácidos nucleícos
1944. Oswald Avery, Colin McLeod y Macyln McCarthy demuestran que el ADN
es la substancia en donde reside la información genética.
1953. James Watson y Francis Crick proponen el modelo de la doble hélice del
ADN.
1958. Matthew Meselson y Frank Stahl demuestran que la replicación del ADN
es semiconservativa.
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1986. Leroy Hood y Lloyd Smith desarrollan el primer secuenciador automático,
que usa un láser que reconoce marcadores de fluorescencia en el ADN.
1987. Kary Mullis desarrolla la técnica de PCR que permite amplificar millones
de veces fragmentos específicos de ADN.
2002. Se reportan las secuencias nucleotídicas de los genomás del ratón (Mus
musculus) y del arroz (Oryza sativa).
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1.0 INTRODUCCIÓN.
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Con la determinación de la secuencia nucleotídica del genoma humano y
la de otros organismos nos hemos adentrado en el conocimiento de la célula.
Conociendo la secuencia de todos los genes de un organismo, es posible
deducir su proteoma. Asimismo, con la información que se tiene, es posible
empezar el estudio integral y global de las redes metabólicas y conocer la
manera en que una célula regula la expresión genética en diferentes
condiciones metabólicas. Sin embargo, este nuevo conocimiento es preliminar.
Si bien podemos enlistar todos los genes de una célula, la determinación de las
posibles interacciones entre sus productos es una meta a largo plazo todavía.
Hay, pues, mucho más que conocer para entender el proceso mismo de la
vida.
Figura 2. Estructura
química de los (a)
ribonucleótidos y (b)
desoxirribonucleótidos
, constituyentes de los
ácidos nucleicos. En el
ARN, el C-1´ de la D-
ribosa está unido al N-
9 de A o G, o al N-1 de
C o U. En el ADN, la 2´-
desoxi-D-ribosa está
unida de la misma forma a las cuatro bases, pero la T toma el lugar del U (los
números con tilde se refieren a los átomos de la pentosa; los números sin tilde se
refieren a los de la base nitrogenada). Los grupos fosfato pueden estar unidos al
C3´ o al C5´ de la pentosa. Si el grupo fosfato está ausente, el compuesto es un
nucleósido. En todos los nucleótidos y nucleósidos naturales, el enlace N-
glicosídico que une la base nitrogenada al C1´ del azúcar es de configuración _
(Voet & Voet, 1995).
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sucesores, sin embargo, cada contribución tenía un error. En 1938, William
Astbury obtuvo un patrón de difracción de rayos-x de fibras secas de ADN, y
dedujo que el espacio de 3.34 Å a lo largo del eje de la fibra correspondía al de
una sucesión cercana de nucleótidos planos. Éstos sobresalían
perpendicularmente a lo largo del eje de la molécula para formar una estructura
relativamente rígida. Algunos años después, J. Gulland estudió la viscosidad y
la birrefringencia de flujo del ADN y postuló la presencia de puentes de
hidrógeno que unían a los grupos hidroxilo de la piridina y la purina y a algunos
de los grupos aminos. Desafortunadamente, utilizó las formás tautoméricas
enol para la timina y la guanina. La importancia de las formás tautoméricas
correctas (ceto), se reconoció hasta 1953.
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Figura 3. Representación esquemática de la estructura de la doble hélice del ADN.
En el texto se explica la configuración de la estructura.
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preparar una digestión específica en C y otras digestiones similares para
escindir los otros residuos.
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Después de 1975, se realizó un progreso dramático en la tecnología de
la secuenciación de los ácidos nucleicos. Tres avances hicieron esto posible:
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generadas, se puede comparar contra un tratamiento que
favorezca el corte de las adeninas.
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1 2 3 4
Figura 4. El método de Maxam y Gilbert para secuenciar ADN. Los números de los
carriles en el gel corresponden a los distintos tipos de corte que se describen en el
texto.
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etiquetados para el análisis. Alternativamente, las dos hebras marcadas
pueden ser desnaturalizadas y separadas en un gel (Maxam y Gilbert, 1977).
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4.1.1 La técnica de PCR y su relevancia en la secuenciación de ADN.
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4.1.5 Secuenciación automatizada
CEQ 2000 (Evans, 2000) _ Esta secuenciadora tiene ocho capilares con
un detector de cuatro colores. Los pasos para preparar el gel, i.e., la
desnaturalización de la muestra y la carga, son automatizadas. Este
sistema es capaz de determinar 500 bases de secuencia de cada capilar
en 2 horas, o leer hasta 96 muestras automáticamente en un día.
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Figura 9. La secuenciadora ABI PRISM 3700. Es el aparato que actualmente se tiene
en el IBt-UNAM. Hay una segunda máquina en el Centro de Investigación sobre
Fijación de Nitrogeno (CIFN-UNAM). Puede correr 768 reacciones de secuencia sin
atención técnica en 36 horas. La longitud de las lecturas obtenidas es de un
promedio de 600-700 bases” (kinish.cifn.unam.mx/~retligen/infrastructura.htm).
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4.2.2 Métodos directos
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b) Método químico-- En 1977 se presentó un método de ruptura química
del ARN similar al de Maxam y Gilbert (Donis-Keller et al., 1977). La
molécula de ARN (en este caso ARN ribosomal) se marca con una
molécula de 32P en un extremo. Después se utilizaron nucleasas para
hacer digestiones de la molécula de ARN marcado en distintos
lugares. La RNAsa T1 corta las guaninas, la RNAsa U2 corta las
adeninas y una hidrólisis alcalina rompe todos los enlaces
fosfodiéster (Donis-Keller et al., 1977). Se utiliza un gel de acrilamida
para separar los fragmentos de estos tres tipos de ruptura, lo que
permite determinar el orden de las guaninas, adeninas y pirimidinas
de una molécula de ARN ribosomal.
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Tabla 2- Algunas de las enzimas que han tenido un papel importante en el
desarrollo de los métodos de secuenciación
c) Mejorar la bioquímica analítica del ADN - Este era el reto más grande
cuando se anunció el inicio del proyecto de secuenciación del
genoma humano, ya que se refería a mejorar las herramientas para
el análisis de ADN. Éste era un reto técnico, ya que para obtener la
secuencia completa del genoma humano en el tiempo propuesto era
necesario desarrollar la estrategia y las máquinas de secuenciación
con capacidad de secuenciar dos Mpb por año.
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5.2 Estrategias para la secuenciación de fragmentos grandes de ADN.
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Figura 10. La estrategia “chromosome walking” permite determinar la secuencia de
un fragmento enorme de ADN ensamblando muchas secuencias pequeñas de
distintas clonas (www.bio.miami.edu/dana/250/25003_10.htm).
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Al conocerse la secuencia del genoma humano se hicieron varios hallazgos
importantes (Venter et al., 2001; Internacional Human Genome Sequencing
Consortium, 2001):
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6.0 El FUTURO DE LA SECUENCIACION
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7.0 REFERENCIAS
Bennet, P. (2003) DNA sequencing and the human genome Project. Molecular
Biology In Cellular Pathology. John Wiley & Sons, Ltd pp. 308-328
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