SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS

1. SECUENCIACION DEL DNA

Secuenciar una molécula de ADN consiste en determinar en qué orden se disponen los cuatro
nucleótidos (A, T, C y G) que componen la molécula.

La secuencia informa la clase de información genética que se transporta en un segmento

específico de ADN. Por ejemplo, los científicos pueden usar la información de las secuencias
para determinar qué tramos de ADN contienen genes y qué tramos transportan instrucciones
regulatorias, que activan o desactivan genes. Además, y de manera muy importante, los datos
de las secuencias pueden resaltar los cambios en un gen que pueden causar enfermedades.

1.1. METODO QUIMICO

El primer método diseñado para secuenciar el ADN fue desarrollado por Allan Maxam y
Walter Gilbert en 1977. Es un método químico que somete la molécula de DNA a distintos
métodos de ruptura. Este método es bastante laborioso y ha sido sustituido por métodos
enzimáticos que se pueden llevar a cabo de forma automatizada.

- Corte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil sulfato
(DMS). Después, la reacción es tratada en condiciones alcalinas; la molécula de ADN se
fragmenta en purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras
que corresponden a las guaninas y bandas claras que corresponden a las adeninas.
- Corte de adeninas. Esta reacción es una variación de la anterior. Las purinas metiladas
se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas
metiladas. Después de un tratamiento alcalino las guaninas también son cortadas. Este
tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las
adeninas, y las guaninas, respectivamente.
- Corte de pirimidinas. Esta reacción utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases
citosina y timina.
- Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de hidracina con tiamina,
y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en
citosina.

1.2. MÉTODO DE SANGER

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Fue diseñado por Fred Sanger en 1977. También se conoce como método didesoxi o
secuenciación por terminación de la cadena. Es un método enzimático que permite
determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su hebra complementaria. Se
necesitan los siguientes componentes:

 Un ADN de cadena sencilla que actúa como molde

 Un cebador para iniciar la síntesis de ADN
 Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
 La enzima ADN-polimerasa
 Los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato que son utilizados por la ADN
polimerasa para construir la nueva hebra; una vez incorporados impiden la adición de
nuevos nucleótidos.

PROCEDIMIENTO

La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos. Cada tubo contiene el molde, el cebador,
los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un ddNTP distinto en
cada caso.

En cada tubo, cuando la ADN polimerasa incorpora aleatoriamente un ddNTP la reacción se

detiene, de manera que se generan fragmentos de distinta longitud, todos ellos con el mismo
ddNTP terminal. Los diversos fragmentos se separan en función de su tamaño mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida, una técnica que permite separar fragmentos de ADN
cuya longitud difiere en un sólo nucleótido. A partir del gel se puede reconstruir la secuencia
que se ha sintetizado, que es complementaria a la secuencia del molde. Mediante esta
tecnología, se puede determinar la secuencia de moléculas de ADN de hasta 800 nucleótidos
de longitud.

1.3. MÉTODO DE SANGER MODIFICADO

Introduciendo ligeras variaciones en el método original de Sanger se ha conseguido

automatizar el proceso. Las mejoras introducidas son las siguientes:

1. Los ddNTP terminadores de cadena están marcados fluorescentemente. Cada ddNTP

se marca con un fluoróforo distinto, que no interfiere en la reacción de la polimerasa
y que emite luz con una longitud de onda característica. De este modo, la reacción se
lleva a cabo en un sólo tubo, no en cuatro.

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 2. Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa. De este modo es posible
automatizar el proceso como si se tratara de una PCR. En cada ciclo aumenta de forma
exponencial el número de fragmentos generados, cada uno marcado con una molécula
fluorescente que emite luz de distinto color, en función del ddNTP terminal.
(secuenciación cíclica).
3. La separación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis capilar, que es más
rápida que la electroforesis en gel. El color de esta fluorescencia determina de qué
nucleótido se trata. El gráfico resultante se denomina electroferograma, en el que se
observan picos de diversos colores. Cada color indica qué nucleótido ocupa cada
posición en la molécula de ADN o su secuencia.

1.4. PIROSECUENCIACIÓN

La pirosecuenciación es otro método enzimático que permite determinar la secuencia de una

molécula de ADN. Se necesitan los siguientes componentes:

- Un ADN de cadena sencilla que actúa como molde

- Un cebador para iniciar la síntesis de ADN
- Tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más desoxiadenosina
alfa-tiotrifosfato
- Cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa
- Adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
- Luciferina

El método consiste en 4 pasos:

1. Fragmentación del ADN (o ARN).

2. Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos.
3. Amplificación clonal (mediante PCR en emulsión).
4. Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación optimizado en un
soporte sólido y en escala de picolitros.

Más en detalle, luego de fragmentar el ADN, se ligan oligonucléotidos adaptadores a cada

extremo del ADN. Estas secuencias adaptadoras comunes a todos los fragmentos serán
utilizadas, tanto para ligar cada fragmento a las esferas, como secuencias donde se unirán los
cebadores de la PCR y además presenta la secuencia donde se unirá el cebador de

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secuenciación. Una vez ligados los adaptadores, se ligan a las beads (esferas que contienen
el complementario a uno de los adaptadores en su superficie), por un método de dilución
límite, de modo de obtener un único fragmento unido a una esfera. Se busca, entonces,
obtener en cada bead un único fragmento de ADN, el mismo es amplificado mediante PCR
en emulsión.

SECUENCIACIÓN DEL ARN

El ARN es el ácido nucleico más abundante en la célula. Lo sintetiza la enzima ARN

polimerasa a partir de una molécula de ADN mediante un proceso denominado transcripción.

1. Métodos indirectos

El ARN se convierte primero a cADN con la enzima transcriptasa reversa y luego se usa el
fragmento obtenido como templado para la reacción de secuenciación. En realidad, este
método determina la secuencia de una molécula de ADN a partir de la cual se infiere la
secuencia de la molécula de ARN. Este método indirecto es uno de los más comunes para la
secuenciación de ARN porque tiene todas las ventajas de la secuenciación de ADN.

2. Métodos directos

Estos métodos se utilizan para secuenciar la molécula de ARN cuando es complicado utilizar
el método indirecto. Esto suele suceder con ARNs muy pequeños, o con estructuras
secundarias extensas (ribosomales, transferencia). Todas estas técnicas requieren de que el
ARN este en forma pura.

- Método enzimático- utilización de una forma enzimática para secuenciar ARN

directamente. Se reporta los resultados de la secuenciación de una molécula de
mARN de 200 pb. Utilizando un iniciador marcado con 32P y la transcriptasa reversa.
Usando reacciones similares a las del método de Sanger; generaron fragmentos de
cADN con una terminación específica dada por ddNTPs. Luego se determinan el
orden de los fragmentos de ADN generados en un gel de acrilamida.
- Método químico un método de ruptura química del ARN similar al de Maxam y
Gilbert. La molécula de ARN (en este caso ARN ribosomal) se marca con una
molécula de 32P en un extremo. Después se utilizaron nucleasas para hacer
digestiones de la molécula de ARN marcado en distintos lugares. La RNAsa T1 corta
las guaninas, la RNAsa U2 corta las adeninas y una hidrólisis alcalina rompe todos

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los enlaces fosfodiéster. Se utiliza un gel de acrilamida para separar los fragmentos
de estos tres tipos de ruptura, lo que permite determinar el orden de las guaninas,
adeninas y pirimidinas de una molécula de ARN ribosomal. A diferencia del método
enzimático, en el que se puede usar un iniciador marcado para generar los fragmentos
que serán secuenciados, el método químico requiere que la molécula de ARN sea
marcada directamente.