Enzimología - Inhibidores 1

Inhibición reversible

La inhibición de la actividad enzimática es un proceso de enorme importancia

biológica. Muchos caminos metabólicos son regulados a través de la inhibición
selectiva de una o más de las enzimas que los componen. Además de este efecto
fisiológico, la inhibición puede presentar efectos perjudiciales, en el caso de
muchas intoxicaciones, o beneficiosas, en el caso de los medicamentos que se
comportan como inhibidores. Precisamente el uso terapéutico de los inhibidores es
un estímulo para el estudio a fondo de los procesos de inhibición de enzimas.
La inhibición es la disminución de la actividad enzimática por algún agente
químico, un ligando, a diferencia de la desnaturalización, que es el cese
permanente de la actividad enzimática por un agente físico o químico.
La inhibición reversible está caracterizada por un equilibrio entre la enzima y el
inhibidor, definido éste por una constante de equilibrio que mide la afinidad de la
enzima (E) por el inhibidor (I). La inhibición reversible implica que desaparece el
efecto inhibitorio si se remueve el inhibidor, y que va a existir inhibición en su
presencia en un grado que depende de la concentración del I.
La inhibición puede apreciarse como una disminución de VMAX o aumento de Km
solamente, o por una combinación de efectos sobre ambos.

Inhibición competitiva
a. Totalmente competitiva
En la Inhibición competitiva el sustrato (S) y el I compiten por la enzima libre,
pudiendo unirse uno o el otro, pero no ambos simultáneamente, hay una
interacción mutuamente excluyente del S y de I con la enzima. La unión de E a I
conduce a la formación de un complejo no productivo.

k+1 kp
E + S ∏ ES Æ E + P
k-1

k+2
E + I ∏ EI
k-2

La constante de disociación para el inhibidor se define como:

Ki =
[E][]I = k − 2
[EI] k + 2

Acá es claro que el grado de inhibición depende de la relación de

concentración entre S e I. Eventualmente, todo el I puede ser desplazado de la
enzima si se aumenta suficientemente la [S], llegando a VMAX pero a costa de una
mayor [S], o sea que aumenta el valor de Km aparente (Kmapp).
Enzimología - Inhibidores 2

Las formas en que un I puede interactuar con una enzima para dar inhibición
competitiva son varias.
El ejemplo más común es el de un ligando que posee una estructura
análoga, muy parecida a la del sustrato, pudiendo interactuar directamente con el
sitio catalítico:

S
X
I

Ejemplos de inhibidores competitivos por analogía con el sustrato:

COOH H 2N H2N
COOH
FAD FADH2
CH2
H 2C
Succinato
COOH deshidrogenasa COOH
HOOC H2NO2S
succinato fumarato
PABA Sulfanilamida

COOH El oxalato es un inhibidor Las sulfanilamidas son antibióticos

competitivo de la sintéticos. Son inhibidores competitivos
H2 C succinato de la síntesis de folato en bacterias
COOH deshidrogenasa, una (inhiben a la dihidrofolato sintetasa),
enzima del ciclo de los uno de cuyos precursores es el ác. p-
malonato ácidos tricarboxílicos aminobenzoico.

Otra posibilidad es que el I cause un impedimento estérico con la unión del S

uniéndose en un sitio diferente al sitio activo:
S

X
I
Enzimología - Inhibidores 3

o bien que la unión del I cause un cambio conformacional tal que se

modifique la afinidad de la E por el S. Así, estaríamos en presencia de una
interacción de tipo alostérico.

I
S X
I

Ejemplo de este tipo de inhibidores son los acilsulfatos y acilfosfonatos que

inhiben de forma alostérica y competitiva a la actividad de fosfolípido fosfatasa
asociada a algunas epoxido hidrolasas.

Determinación de la ecuación de velocidad

Ks kp
E + S ∏ ES Æ E + P
+ k-1
I
Ki Ki =
[E][]I = k − 2
∏

[EI] k + 2
EI

v = kp [ES]

[E]t está distribuido en 3 especies: [E], [ES] y [EI].

Por lo tanto

[E]t = [E] + [ES] + [EI]

dividiendo la ecuación anterior por [E]t

v k p [ES ]
=
[E]t [E] + [ES ] + [EI]
como
[ES ] = [S] [E] [EI] = I [E]
Ks KI
 Enzimología - Inhibidores 4

Entonces, pasando kp al primer miembro y reemplazando [ES] y [EI] queda:

[S] [E]
v Ks
=
k p [E ]t [E ] + ] [E ] + []
[S I
[E]
Ks Ki
Simplificando [E] y reordenando:

v=
[S] * Vmax
⎛ []I ⎞
⎜ 1 + ⎟ + [S ]
Ki ⎜
⎝ K i ⎟⎠

Es claro de esta ecuación que al tender [I] a 0 la ecuación se convierte en la

Michaelis Menten. Si E posee una alta afinidad por I, es decir una Ki baja, el efecto
se logra con bajas [I]. Por otro lado, al tender [S] a ∞, el denominador tiende a ser
igual a [S] y v tiende a VMAX. Es decir, a alta [S] se revierte la inhibición,
alcanzando la VMAX.
Los gráficos van a adoptar la siguiente forma:

v
Vmax

Vmax/2
1/v
[I1]

Km Kmapp [S]

1
=
1
+
Km []I 1
(1 + )
v Vmax Vmax K I [S ]
-1/Km 1/[S]
[I1]
)
-1/Km
)
1+
Ki
Enzimología - Inhibidores 5

b. Parcialmente competitiva

Ks kp
E ∏ ES Æ E+P

Ki Ki´
∏

K´s kp
EI ∏ ESI Æ EI + P

En este caso, el S y el inhibidor no son v

mutuamente excluyentes del sitio catalítico,
el complejo EI puede unir S (con menor
afinidad) y el complejo ES puede unir I
(con menor afinidad también) para dar el
complejo ternario ESI. El complejo ESI
parcial
puede descomponerse para dar el
producto, con la misma velocidad que en
ausencia del I. total
Da el mismo tipo de gráficos que la pura o
totalmente competitiva. [I]
Se distingue entre ambas graficando la
velocidad obtenida a diferentes concentraciones de inhibidor y con una
concentración de S no saturante. En el caso de que sea total, la inhibición a muy
alta [I] lleva la actividad a 0. Si es parcial, aunque la enzima esté saturada con I, al
descomponerse ESi va a haber una velocidad residual que se mantiene aunque se
aumente mucho [I].

Inhibición no competitiva

No se afecta la unión de S con E, pero se ve alterada VMAX. Hay dos posibilidades:

a - EIS no se descompone en EI + P y la velocidad es la que corresponde a la

ruptura de ES (en este caso el efecto del inhibidor es reducir la cantidad de
enzima activa).

b - EIS se descompone a una velocidad menor y la velocidad es la resultante de la

suma de ambas reacciones.
 Enzimología - Inhibidores 6

a. No competitiva completamente

k+1 kp
E ∏ ES Æ E+P
k-1
k-3 k+3 k-5 k+5
∏
∏

k+4
EI ∏ ESI
k-4

De este esquema es claro que la velocidad disminuye la bajar la [ES], del cual
depende la velocidad final observada.
En condiciones de equilibrio existen sólo 2 constantes de equilibrio a considerar
dado que, por definición, la combinación e S o I no afecta la afinidad de la enzima
por el otro.
Así,

k -1 k − 4 k -3 k −5
KS = = KI = =
k +1 k + 4 k +3 k +5

v = kp [ES]

v k p [ES ]
=
[E]t [E] + [ES ] + [ESI] + [EI]
considerando que la concentración de los complejos es:

[ES ] = [S] [E] [EI] = I [E] [ESI] = [S] [EI] = [S][]I [E]
Ks KI KS K IK S

reemplazando en la ecuación anterior:

[S] [E]
v Ks
=
k p [E ]t [E] + [S] [E] + []I [E] + [S][]I [E]
Ks Ki K SK i

[S]
v
= Ks =
[S]
Vmax
1+
[S] + []I + [S][]I Ks(1 + []I ) + [S](1 + []I )
K s K i K SK i Ki Ki
 Enzimología - Inhibidores 7

[S] * Vmax /(1 + []I )

v= Ki
Ks + [S]

Así, llevando [I] a ∞ v tiende a 0 y esto no se puede revertir incrementando [S].

Los dobles recíprocos toman esta forma:

(1 +
[]I )
1
=
KI
+
Km []I 1
(1 + ) 1/v
v Vmax Vmax K I [S ] [I1]

[I1]
)V
app )
1/Vmax = 1 + Ki max

-1/Km 1/[S]

El análisis de estado estacionario da ecuaciones que contienen el cuadrado de las

concentraciones de S e I y en consecuencia los doble recíprocos no son lineales.

b. Parcialmente no competitiva

Se da cuando ESI se descompone en EI + P, siendo la velocidad

v = k [ES] + k´ [ESI]

k+1 kp
E ∏ ES Æ E+P

k-3 k+3 k-5 k+5

∏
∏

k-1
k+4 k´p
EI ∏ ESI Æ EI + P
k-4
Enzimología - Inhibidores 8

En este caso en exceso de inhibidor la velocidad tiende a un mínimo distinto de 0.

La enzima con inhibidor unido puede unir S también, pero la descomposición del
complejo ESI transcurre a una velocidad menor.

Inhibición mixta

a. Totalmente mixta
La inhibición mixta se caracteriza por gráficos doble recíprocos que se intersectan
no sobre un eje sino en algún cuadrante. VMAX siempre va a disminuir, mientras
que Km puede subir o bajar.
Este tipo de inhibición puede aparecer por distintas razones y de varias maneras.
El caso particular que se presenta aquí es el de una inhibición mixta con
asociación de inhibición no competitiva pura y parcialmente competitiva para
enzimas que obedecen a cinéticas de equilibrio.
Se asume que están afectadas las afinidades de E y EI por el sustrato y que ESI
es inactivo.

KS kp
E ∏ ES Æ E+P

KI´
∏
∏

KI
K´S
EI ∏ ESI

Este esquema es similar al observado para la inhibición parcialmente competitiva,

excepto que ESi no se descompone y entonces

V = k [ES]

Resolviendo como antes llegamos a la ecuación:

Vmax
(1 +
[]I )
Vmax K ´I
v= o v=
KS []I []I []I
(1 + )
(1 + ) + (1 + ´ )
[S] Ki KI 1+
KS
* Ki
[S] (1 + []I )
K ´I
Enzimología - Inhibidores 9

Los gráficos doble recíprocos muestran que las intersecciones tanto en el eje x
como en el y varían con la adición de I. Los gráficos se intersectan en el segundo
o tercer cuadrantes.

1/v
[I3] > [I2] > [I1]
[I3]
[I3]
)V Esta situación se da cuando Ki´> Ki
app )
1/Vmax = 1 + [I2]
porque entonces Km se va a
K´i max [I1] incrementar cuando suba la [I].

1/[S]

1/v

Ki> Ki´

1/[S]

Inhibición acompetitiva
Enzimología - Inhibidores 10

Un inhibidor acompetitivo es aquel que se define cinéticamente como el que

afecta a Km y VMAX en un mismo grado. Hay más de una manera en que esto
puede ocurrir. Una de ellas aparece cuando una enzima que presenta cinética de
estado estacionario posee una k-1 << k+2 (o kp). Entonces Km, que es igual a (k-1 +
k+2)/k+1 tiene a ser igual a k+2/k+1 al tornarse k-1 despreciable frente a k+2.
De esta manera, un inhibidor que afecte a a k+2 (y por lo tanto a VMAX) va a
afectar a Km proporcionalmente, al desplazar las concentraciones del estado
estacionario.
En forma más general, podemos asumir que I se combina sólo con el complejo
ES y que no reacciona para dar P.

k+1 k+2
E ∏ ES Æ E+P
k-1
KI
∏

ESI
Así, disminuye [ES] y por consiguiente baja VMAX pero también Km, ya que se
secuestra complejo ES y se desplaza el equilibrio en el sentido de su formación,
en apariencia aumenta la afinidad.

La resolución de la ecuación de velocidad da:

([E]t - [ES] - [ESI])*[S] = Ks [ES]

[ES][I] = Ki [ESI]

v = k+2 [ES]
Vmax
[]I )
(1 +
KI
v=
K 1
1+ m *
[S] (1 + []I )
KI

El mismo factor afecta tanto a VMAX como a Km. rearreglando tenemos:

v=
Vmax 1
=
1 []I
(1 + ) +
Km 1
Km
+ (1 +
[]I ) v Vmax KI Vmax [S ]
[S] KI
Enzimología - Inhibidores 11

Como queda claro de la ecuación recíproca, al graficar a diferentes [I] se

obtendrá una familia de rectas con la misma pendiente y diferentes coordenadas
al origen

1/v [I3] > [I2] > [I1]

[I3]
[I2]

[I1]

1/[S]

En la inhibición parcialmente acompetitiva ESI puede descomponerse y los

dobles recíprocos se cortan en el primer cuadrante.

1/v

1/[S]
Enzimología - Inhibidores 12

Determinación del valor de Ki

Se utilizan gráficos secundarios, cuyos datos provienen de los datos primarios

de v vs. [S] a distintas [I].

Gráficos de Dixon

Se grafica 1/v versus la concentración de I a diferentes concentraciones de S.

100

[I]4
v 80 1/v
[I]3 S3
1/v1
60
1/v2
[I]2
v2 40
[I]1
v1
20

0
0
-Ki [I]1 [I]2 [I]3 [I]4
[S] [I]
[S]1 [S]2 [S]3 [S]4

En la inhibición no competitiva las líneas se juntan sobre el eje x dando el

valor de KI. En la inhibición acompetitiva, se obtiene un conjunto de líneas

S2 > S1 > S0
1/v 1/v
S1
Acompetitivo S0
No Competitivo S1
S2 > S1 S2
Soo

S2

-Ki [I] -Ki [I]

paralelas que tienden a aglomerarse a medida que aumenta la [S]. El valor de

KI se obtiene por aproximación trabajando con concentraciones muy altas de S.
Enzimología - Inhibidores 13

En la inhibición competitiva se observa una familia de rectas que se

intersectan sobre el segundo cuadrante, en un punto cuya abscisa determina Ki. Al
tender la [S] a ∞ la recta se hace horizontal, lo que indica que la velocidad no varía
con la concentración de I, ya que la enzima se halla saturada por el S y en
consecuencia no es inhibida. Así, un gráfico de las pendientes de estas rectas
versus 1/[S] tiene su origen en 0.

1/v S1
-Ki Competitivo

S2 pendiente
S2 > S1
Soo

-Ki [I] 1/[S]

La inhibición mixta presenta cruzamiento de rectas en el segundo o tercer

cuadrante, con una intersección cuya abscisa determina el valor de KI.

1/v S1 1/v S1
S2 Mixto
Mixto
S2

S2 > S1
S2 > S1

-Ki
[I] -Ki [I]

Si bien en algún caso puede presentarse un resultado análogo al de la

inhibición competitiva, graficando la pendiente versus 1/[S] se verifica que la línea
no parte del origen en este caso, dado que por más que se aumente la [S] la
inhibición no desaparece totalmente y la pendiente a muy alta [S] nunca llega a ser
0.

pendiente

1/[S]
Enzimología - Inhibidores 14

Gráficos de Cornish Bowden

Se grafica [S]/v versus [I]. Si hubiera alguna duda usando Dixon del tipo de
inhibición en el caso de un inhibidor competitivo o mixto, en este caso queda claro
al resultar paralelas las rectas obtenidas en el caso de la inhibición competitiva,
mientras que se mantiene el perfil en el caso de un inhibidor mixto.

[S]/v S2 > S1
[S]/v
S1
Competitivo
No Competitivo S2
S2 > S1

S1
S2

-Ki [I] -Ki [I]

1/v S2 1/v S2
S1
Mixto
Mixto
S1

S2 > S1
S2 > S1

-Ki
[I] -Ki [I]

1/v S2
Acompetitivo

S1

S2 > S1

-Ki [I]