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Manual de Torres PDF
Manual de Torres PDF
BACTERIOLOGÍA MÉDICA
por
Miguel F. Torres
Portada interna:
Microfotografía electrónica de Salmonella typhi en división. Muestra los flagelos, las
fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibu-
jos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
Por muchos años fue microbiólogo del Instituto Guatemalteco de Seguridad Social
(IGSS) y del Hospital Militar en la ciudad de Guatemala. Es miembro de la Acade-
mia de Ciencias Médicas, Físicas y Naturales de Guatemala, y fundador de la Aca-
demia Guatemalteca de Historia de la Medicina.
PRESENTACIÓN / 11
AGRADECIMIENTOS / 13
PRÓLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.
CAPÍTULO 1:
BREVE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad
para el Laboratorio de Microbiología. Medidas de Bioseguridad. Métodos de
Esterilización o Desinfección. Descontaminación. Antisepsia. Uso efectivo de
Antisépticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilización. Resistencia de
Microorganismos a Germicidas Químicos.
CAPÍTULO 2:
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA / 29
Cómo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriología. Fig. 1 Mesa de Trabajo para
Bacteriología. La Coloración de Gram. Foto: Hans Gram. Fórmulas: Reactivos para
la Coloración de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiológicas y su Uso, 1 Asas para
Bacteriología, 2 Asas para Micología y Micobacterias. Fig. 3 Inoculación de Medios
Sólidos por Estrías.
CAPÍTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriológica para Coprocultivo.
Interpretación de Resultados. Fig. 5 Observación y Señalamiento de Colonias
Sospechosas. Fig. 6 Técnica para tomar Inóculo de Colonias Individuales. Reacciones
de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciación de las Especies del Género
Shigella. Diferenciación de las Especies del Género Salmonella. Informe.
Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Colección
de Muestras Duodenales. La Epidemiología y Etiología de la Diarrea. Patógenos
Frecuentemente Identificados en Niños con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros
de Tratamiento, en Países en Desarrollo.
CAPÍTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CÓLERA / 63
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados. Fig. 7 Marcha
Bacteriológica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Fórmulas:
1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPÍTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propósito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretación de
Resultados. Informe.
CAPÍTULO 6:
INVESTIGACIÓN DE Helicobacter pylori / 75
Propósito. Muestra. Observación Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.
CAPÍTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propósito. Manifestaciones Clínicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos
de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.
Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Niños Pequeños. Punción
Supra-púbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha
Bacteriológica para Urocultivo. Interpretación de Resultados. Informe. Detección
de Bacteriuria por la Coloración de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPÍTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propósito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriológica para Cultivo de
Garganta/Exudado Faríngeo. Interpretación. Foto: Interpretación de la Prueba de
Bacitracina. Identificación Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba
de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretación de la Prueba de CAMP. Características
Físicas, Hematológicas y Químicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la
Sangre de Carnero en el Laboratorio Clínico.
CAPÍTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propósito. Investigación de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.
Interpretación de Resultados. Informe. Investigación de Neisseria meningitidis en
Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretación.
Informe.
CAPÍTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propósito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretación del Frote Gram de
Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretación de Resultados e Informe. Etiología y
Sintomatología de Neumonía y Bronquitis.
CAPÍTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propósito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan
el Diagnóstico Bacteriológico. Interpretación de Resultados. Etiología y
Sintomatología de Septicemia. Informe.
CAPÍTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propósito. Muestra. 1 Piel. Etiología y Sintomatología de Heridas Infectadas. 2 Ojos.
Etiología y Sintomatología de Infección Ocular. 3 Oídos. Etiología y Sintomatología
de Otitis Media. 4 Misceláneos. Procedimiento. Interpretación de Resultados e
Informe. Principales Pruebas para la Diferenciación de Tres Especies del Género
Staphylococcus de Origen Humano.
CAPÍTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propósito. Diagnóstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus
Uretral Masculino. Diferenciación de Dos Especies de Neisseria de Importancia
Clínica. Diagnóstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnóstico Directo de la
Sífilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos
del Tracto Genital Femenino. Introducción. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes
Etiológicos.
CAPÍTULO 14:
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propósito. Muestra. Etiología y Sintomatología de Infección Osea y Articulaciones.
Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriológica para Líquido Cefalorraquídeo (LCR).
Interpretación de Resultados. Informe.
CAPÍTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
Propósito. Muestra. Procedimiento. Interpretación de Resultados e Informe.
CAPÍTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propósito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12
Marcha Bacteriológica para Antibiograma. Antibióticos Aprobados (FDA-USA) que
deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos
Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gram-
negativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretación de
Resultados. Interpretación de los Diámetros de las Zonas de Inhibición (mm) para
Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretación de los Diámetros de las
Zonas de Inhibición (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Límites
Aceptables de los Halos de Inhibición (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas
Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPÍTULO 17:
ANAEROBIOS / 193
Propósito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de
las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretación de Resultados.
Características Morfológicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de
Importancia Médica. Interpretación del Cultivo. Morfología Microscópica. Fig. 12
Diversas Morfologías Bacterianas. Informe.
CAPÍTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propósito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gástrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.
Procedimiento. Procedimiento de la Coloración de Ziehl-Neelsen. Fórmulas:
Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloración de Kinyoun. Fórmulas: Reactivos para
Kinyoun. Interpretación e Informe de Baciloscopías. Reporte de Frotes para
Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestión y Descontaminación de
Esputos. Método de Digestión y Descontaminación con N-acetil-levo-cisteína
(NALC). Fórmulas. Digestión y Descontaminación de Esputos por el Método
Convencional de Hidróxido de Sodio. Fórmulas. Procedimiento de Digestión/
Descontaminación para Esputos de Pacientes cuyas muestras están constantemente
contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados
Gástricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Faríngeo.
Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.
Interpretación del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias
“Atípicas”).
BIBLIOGRAFÍA / 223
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
1 Asas para Bacteriología
2 Asas para Micología
Fig.3 / 40
INOCULACIÓN DE MEDIOS SÓLIDOS POR ESTRÍAS
Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Fig.5 / 46
OBSERVACIÓN Y SEÑALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig.6 / 48
TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio
cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO
Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA
FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP
Fig. 11 / 166
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)
Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA
Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la página 111 aparecen 32 fotografías a color y
sus explicaciones correspondientes.
Guatemala, agosto de 1996
PRESENTACIÓN
Esta obra fue completada por el autor durante su año sabático de la Universidad
de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas
carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos éxitos.
Atentamente,
Las tres diferentes formas que presentan las bacterias fueron observadas por
primera vez por Antonio van Leeuwenhoek en Delft, Holanda, en el siglo XVII. Sin
embargo, la bacteriología médica surgió como tal hacia fines del siglo XIX, con los
geniales descubrimientos de Pasteur en Francia y Koch en Alemania. Por primera
vez en la historia, en 1876, Roberto Koch propagó una bacteria patógena en cultivo
puro fuera del cuerpo. Al aislar Bacillus anthracis no sólo estableció ésta bacteria
como causa del ántrax en el ganado vacuno, sino inauguró un método de
investigación de las infecciones, actualmente vigente.
15
Es imperativo hacer mención del gran aporte que el invento del microscopio
representó para las ciencias biológicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo
XVII fue el primer humano que observó las bacterias. Este personaje longevo, no
sólo efectuó grandes descubrimientos con sus microscopios de “lente de gota”,
sino también nos legó su ejemplo del valor de la palabra científica escrita. El
microscopio compuesto que usamos hoy en día fue inventado posteriormente por
los hermanos Hans y Zacarías Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue
perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
16
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,
antes de la invención del microscopio, el hombre desconoció la vida microscópica y la estructura
celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.
Fabricó ingeniosos microscopios con pequeños lentes fundidos en placas de diversos metales.
Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser
humano que observó las bacterias, los protozoos, los glóbulos rojos y los espermatozoides.
17
Carta a sus hermanas:
“La voluntad es algo grande, pues la acción y el trabajo
generalmente siguen a la voluntad y casi siempre el trabajo se
acompaña del éxito.
19
CAPÍTULO 1
21
En todos los ambientes que rodean al hombre existen microorganismos. Las
bacterias y los hongos son los más abundantes; prácticamente todos los objetos que
vemos y tocamos están cubiertos de ellos. El cuerpo humano, especialmente don-
de hay membranas mucosas (intestino, vagina, boca, etc.), está cubierto de
bacterias. De los microorganismos que viven constantemente en el hombre, se dice
que forman parte de alguna “microbiota”. Por microbiota se entiende aquel con-
junto de diversos microorganismos que normalmente convive con el hombre sin
causarle ningún daño. La palabra “flora” no es correcta, y por lo tanto no debe
utilizarse. Se dice que los microorganismos de las microbiotas “colonizan”, no
infectan, aunque eventualmente pueden hacerlo y en este caso se les llama
“oportunistas”.
Todos los nombres científicos de los seres vivos, de acuerdo con el sistema
binario de Linneo, se componen de dos palabras: la primera que indica un gran
grupo, es el género y siempre se escribe la primera letra con mayúscula. El segundo
nombre es la especie y siempre se escribe con letras minúsculas. Casi todos los
nombres científicos de los microorganismos se derivan del griego o del latín, por
esta razón:
Ejemplos:
Además del nombre científico, en algunos casos existe un nombre de uso co-
mún o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
22
Nombre correcto: Nombre vulgar:
Ejemplos:
Tomado de:
23
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
Equipo necesario:
1. Campana bacteriológica
2. Campana de flujo laminar cuando es necesario
3. Lámpara de pie
4. Mechero o incinerador
5. Incubadora bacteriológica
6. Autoclave
7. Horno esterilizador
8. Agitador de tubos
9. Centrífuga
24
Equipo de seguridad necesario en un laboratorio de investigación:
ESTERILIZACIÓN:
Calor Húmedo (autoclave) 121° C a diferentes intervalos de tiempo
Seco (horno) 171° C por 1 hora; 160° C por 2 horas;
121° C por 16 horas
Gas Oxido de etileno 450-500 mg/litro a 55-60° C
Líquido Glutaraldehido variable
Peróxido de hidrógeno 6-30%
Formaldehido 6-8%
Dióxido de cloro variable
DESINFECCIÓN
Calor Húmedo
(incluye pasteurización) 75-100° C alta
Líquido glutaraldehido variable alta-media
peróxido de hidrógeno 3-6% alta-media
formaldehido 1-8% alta-media
compuestos clorinados 500-5,000 mg de cloro libre/litro intermedia
alcoholes (etanol, isopropílico) 70% intermedia
compuestos fenólicos 0.5-3% media-baja
compuestos yodados 0.1-0.2% media-baja
ANTISEPSIA
alcoholes 70%
yodóforos 1-2 mg de yodo libre/litro
hexaclorofeno 1-3%
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DESINFECCIÓN:
Factores:
DESCONTAMINACIÓN:
ANTISEPSIA:
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ESTERILIZACIÓN:
Tipos de esterilización:
Calor húmedo: autoclave de vapor
Calor seco: horno esterilizador
Gas de óxido de etileno
Esterilizantes químicos: germicidas basados en glutaraldehido.
RESISTENCIA
RESISTENCIADE
DEMICROORGANISMOS
MICROORGANISMOSAAGERMICIDASGERMICIDASQUÍMICOS
QUIMICOS(*)
(*)
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
27
CAPÍTULO 2
INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola célula muy sim-
ple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentación y reproducción.
Son uno de los grupos microbianos más frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condicio-
nes de laboratorio, debe proporcionárseles todas las sustancias nutritivas que re-
quieren (proteínas, azúcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
según cada medio de cultivo.
29
d. Facultativas: Son capaces de crecern en ausencia de oxígeno y tienen la
facultad de también crecer en aerobiosis.
30
A B
31
CÓMO ORGANIZAR EL ÁREA DE TRABAJO DE BACTERIOLOGÍA
5. Un soporte de asas, que puede ser de madera forrada con fórmica, con las
siguientes asas de “nichrome” (aleación de níquel y cromo), según se ilustra en la
figura 2 (pág. 39): dos en anillo (no calibrada), dos en aguja, y una asa calibrada de
platino puro en anillo pequeño para tomar 0.001 ml (para inocular urocultivos).
Para trabajar Micología (hongos) debe contarse también con asa espatulada, asa en
“L” y dos agujas de disección. Las asas bacteriológicas deben ponerse rectas y lim-
piarse diariamente. Esto se hace fácilmente haciéndolas rodar en el suelo deslizan-
do el zapato a manera que rueden y luego hacer el anillo con el cabo de otra asa.
Debe trabajarse siempre con dos asas en anillo, cuando una se forma, se usa la que
ya está fría.
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6. Una lámpara de mesa de pie corto (tipo escritorio) o de “cuello de ganso”;
colocarla al frente, ligeramente hacia la izquierda, de manera que ilumine fuerte-
mente el área sobre la mesa, pero que la luz no dé directamente a los ojos.
13. Frascos grandes de boca ancha, de los que se usan para dulces en las tien-
das, con tapadera metálica de rosca que cierre bien. Tener suficientes veladoras
(velas gruesas) de parafina. Alternativamente usar jarra Gas-Pak con sobres
microaerofílicos.
33
Fig. 1 MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGÍA
34
LA COLORACIÓN DE GRAM
1. Cubrir el frote ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un
minuto (ver preparación de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de
agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo sua-
vemente con agua corriente, escurrir bien.
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4. Cubrir el frote con safranina sólo por 30 segundos. Enjuagar suavemente
con agua, escurrir y dejar secar. El frote puede secarse dentro de la incubadora a
36° C, o flamear muy levemente, si es urgente. Otra alternativa es secarlo con aire
obtenido de una pera de hule o un secador para manos.
c) Resultados:
d) Informe:
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en singular con respecto al Gram, nunca gram-positivos o gram-negativos en
plural.
1. CRISTAL VIOLETA:
Solución “A”:
Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos
Alcohol etílico al 95 % ....................................................... 20 ml
Solución “B”:
Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos
Agua destilada ................................................................... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24
horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloración.
2. LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo
Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos
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Agua destilada ................................................................... 300 ml
3. ALCOHOL-ACETONA (Decolorante):
Mezclar volúmenes iguales de acetona pura (para análisis) y alcohol etílico
al 95 %.
4. SAFRANINA:
Solución stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos
Alcohol etílico al 95 %. ...................................................... 100 ml
Solución de trabajo:
Diluir 1:10 la solución stock (concentrada), así:
Solución stock .................................................................... 10 ml
Agua destilada ................................................................... 90 ml
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Fig . 2 CLASES DE ASAS MICROBIOLÓGICAS Y SU USO
ASAS PARA BACTERIOLOGÍA:
2. Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificación, o subcultivo.
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Fig . 3 INOCULACIÓN DE MEDIOS
SÓLIDOS POR ESTRÍAS
40
CAPÍTULO 3
COPROCULTIVO
PROPÓSITO:
MUESTRA:
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- material obtenido por proctoscopía
- biopsia de mucosa intestinal
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las
heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas
de ser emitidas; no es necesario que el paciente esté en ayunas. El hisopo rectal es
una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces
reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros,
dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los niños, introducir el
hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es más fácil
tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y él mismo separándose los
glúteos. Los niños deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar
ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego
introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37° C dentro del intestino, son colecta-
das y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20° C), el pH baja
considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pier-
dan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razón si la mues-
tra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un me-
dio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propó-
sito colocar con hisopo estéril una porción anormal de las heces (con moco, sangre
o pus) aproximadamente del tamaño del hisopo bien cargado en tubos o viales con
3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente
para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio
de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de
enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36°C por aproximadamente 18 horas
antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de
glicerol-salino bufferado.
42
El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapón de rosca y
luego autoclavear a 121°C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica
y vira a color amarillo.
PROCEDIMIENTO:
Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (con-
tienen inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)
y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produ-
ce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).
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COLOR COLONIAS COLONIAS COLONIAS
MEDIO ANTES DE LACTOSA- LACTOSA- CON ÁCIDO
INOCULAR POSITIVO NEGATIVO SULFHÍDRICO
rosado
SS ligeramente rojo incoloras negro
amarillento
anaranjado- verde
Hektoen verde claro salmón azuladas negro
1- Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de mues-
tra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inóculo
se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las cajas de ambos
medios. Inocular sólo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.
El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2- Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfría (ver figura 3, pág. 40).
44
Fig. 4 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA COPROCULTIVO
Muestras:
Material de
Heces frescas Hisopo rectal Sedimento de proctoscopía,
enema salino biospia intestinal
INOCULAR Opcional
Rutina
Medios:
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Marcar colonias
sospechosas por
detrás de la caja de Petri
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2- El laboratorio debe contar con un microscopio estereoscópico para hacer los
sub-cultivos con asa en aguja o recta así:
Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas bajo el microscopio
estereoscópico y enfocar. Usar un par de asas en hilo bien rectas, flameadas y
frías, acostúmbrese a usarlas según se indica a continuación: apoyándose en
el borde del microscopio con los dedos meñique y anular de la mano derecha
(izquierda si es zurdo), tome el asa recta a manera de lápiz y bájela lentamen-
te hasta que aparezca en el campo del microscopio y sólo toque la superficie
de la colonia seleccionada, con cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13X100) de TSI (medio rojo)
con el dedo meñique de la mano derecha, flamee bien la boca del tubo y
luego pinche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exacta-
mente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y
luego haga un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada. Sin flamear
y con la misma asa, inocule el medio LIA (morado) pinchando esta vez tres
veces y luego estriar la superficie y con la misma asa sin flamear, haga una
estría en un tubo de agar urea de Christensen (mejor tomar una nueva colo-
nia de igual morfología). Si no cuenta con microscopio estereoscópico proce-
da así:
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Fig. 6 TÉCNICA PARA TOMAR INÓCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
3- Incube a 36°C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no
quede duda de qué tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en
incubación de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente
flojos para permitir la entrada de oxígeno. Las colonias marcadas “g” (E. coli,
niños menores de un año) pueden pasar sólo a TSI, para ahorrar LIA y urea.
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Reacción ya
Reacción ya
incubada
incubada Gas (g) ácido
A=ácido K=alcalino R=rojo N=neutro (-a+++) sulfhídrico
Medio sin (h) (-a+++)
Medio sin
inocular
inocular
TSI no no burbujas
(rojo) Amarillo rojo aplicable aplicable o negro
rupturas
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las
abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, según la tabla anterior en este orden: superficie/
fondo, gas, ácido sulfhídrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan así:
49
5- Los tubos de TSI, marcados “g” y que corresponden a coprocultivos de
niños menores de un año deben aglutinarse para investigar Escherichia
coli enteropatógena (“pools” A, B y C) (Según Dr. Myron Levine, U. de
Maryland VI Congreso C.A. de Microbiología, comunicacion personal). El
informe final deberá reportarse así: “Se aisló Escherichia coli enteropatógena
del grupo ___ ” . Debe hacerse notar que aunque el valor cIínico de esta prue-
ba ha sido puesto en duda, ya que también existen E. coli invasivas y produc-
toras de toxinas que no se investigan, actualmente debe realizarse la
aglutinación para demostrar la presencia de serotipos clásicos enteropatógenos
en los niños pequeños. Inocule una asada pequeña en caldo tripticasa soya o
caldo BHI (infusión de cerebro y corazón de buey), proceda efectuar la prue-
ba de susceptibilidad antimicrobiana según el método de Bauer-Kirby, des-
crito más adelante. Si no se observa ninguna aglutinación, ni se aisla Shigella o
Salmonella apunte en el libro de trabajo la clave N-SSE, y el informe final debe
redactarse así: “Negativo para Shigella, Salmonella y Escherichia coli
enteropatógena”. (Sólo para niños menores de un año). Las claves sugeridas
para registro en los libros de trabajo evitan escritura innecesaria, facilitan y
aceleran el trabajo.
50
REACCIONES DE VARIAS ENTEROBACTERIAS EN TSI Y LIA
Morganella morganii
K/A, g-(+), h- KóR/A, g-, h- +
(antes Proteus morganii)
Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto
es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre
paréntesis. Todas las reacciones con reacción roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente
son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clínica en coprocultivos
y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es sólo una guía, que debe actualizarse
constantemente.
51
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SHIGELLA:
Oler el medio de TSI sin tocarlo con nariz o boca, el olor a “semen” es caracte-
rístico de Shigella spp., especialmente de Shigella grupo B (Shigella flexneri), la más
frecuente en Guatemala. El fondo de los tubos de TSI y LIA no presentan gas, ni
ácido sulfhídrico y tienen un color “amarillo canario”. La reacción K (alcalino) de
la superficie del TSI es roja de un tono fresa no muy intenso. Aglutinar el creci-
miento del TSI sospechoso, o del LIA así:
Utilice la tapadera limpia y seca de una caja de Petri, ráyela con crayón graso
por detrás a manera de hacer rayas paralelas y perpendiculares que formen cuadritos
de aproximadamente un centímetro cuadrado. Coloque todas sus parejas TSI/LIA
con reacción sospechosa de Shigella, en orden numérico en una gradilla. En la mis-
ma gradilla pero en otro extremo ordene en pares los TSI/LIA con reacción sospe-
chosa de Salmonella y los TSI marcados “C” (Escherichia coli) para proceder a aglutinar.
Por cada pareja sospechosa de Shigella (K/A,g-,h-; K/A,g-,h-) coloque en el centro
de un cuadrito una gotita de antisuero “Shigella grupo B” (Shigella flexneri). Aglutine
tomando una porción pequeña del crecimiento en TSI (puede ser también del LIA)
con asa en anillo estéril; coloque el crecimiento sobre la caja (mueva el asa en óvalo
pequeño sin tocar la gota), luego suspenda bien el crecimiento en la gota a manera
de obtener una suspensión ligeramente lechosa. Observe inmediatamente después
de inclinar la tapadera de la caja hacia adelante y hacia atrás la aparición de
aglutinación franca y obvia.
52
DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DEL GÉNERO SALMONELLA:
La taxonomía moderna del género Salmonella ha cambiado, sin embargo para fines
prácticos de diagnóstico y de investigación, se recomienda usar la clasificación an-
tigua simplificada así:
1- No produce gas.
2- Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra,
a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza el
inclinado).
3- Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)
4- Es citrato-negativo.
5- Aglutina con el antisuero anti-antígeno Vi.
verde = negativo
azul = positivo
53
Diferencie presuntivamente las especies del género Salmonella con estas tres
pruebas sencillas:
54
trabajo las especies de enterobacterias con sistemas de múltiples pruebas
bioquímicas miniaturizadas, por ejemplo API, según las condiciones de trabajo.
INFORME:
CLAVE
RESULTADO en libro de trabajo TEXTO (Secretaria)
(técnico)
55
PROCEDIMIENTO PARA CULTIVO DE CUERDAS ENCAPSULADAS
(ENTEROTEST)
PARA COLECCIÓN DE MUESTRAS DUODENALES
Procedimiento:
1- El médico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una trac-
ción rápida pero suave. Luego cortar con tijeras estériles la punta de la cuerda
(amarilla por la bilis), a manera de que caiga asépticamente en un tubo o
botellita con caldo tetrationato.
3- Después de la incubación, inocular por estrías una asada del caldo tetra-
tionato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aeróbicamente a
36° C.
5- Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y
citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antígeno Vi y gru-
po D, según ya se explicó.
Medio de cultivo:
56
Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, ca-
lentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45° C y luego agregar: 10 ml de
solución de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml
de solución acuosa de verde brillante al 0.1 %.
Medir 10 ml en frasquitos estériles (de los que vienen con el medio Thayer
Martin) o tubos estériles con tapón de rosca. El medio debe quedar verde con pre-
cipitado blanco.
Adaptado de:
World Health Organization. 1992. Control of Diarrheal Diseases Program.
Readings on Diarrhea, Student Manual, Unit I The Epidemiology and Etiology
of Diarrhea. Geneva.
57
Disentería
Los pacientes con disentería causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Ba-
cilo de Shiga), están a menudo clínicamente muy enfermos. Este síndrome
clínico casi siempre incluye fiebre alta, síntomas tóxicos y cólicos abdomina-
les intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se
acompaña de complicaciones graves, como el síndrome hemolítico urémico.
EPIDEMIOLOGÍA
58
- Usar biberones para alimentar a los niños.
- Guardar alimentos a temperatura ambiente.
- Beber agua contaminada con bacterias fecales.
- No lavarse las manos después de defecar, después de desechar las
heces de los niños o de limpiar los pañales y antes de preparar o
servir alimentos.
- No desechar higiénicamente las heces (incluyendo las de los
lactantes).
Epidemias
En las áreas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el año, au-
menta su frecuencia durante los meses secos y más fríos, mientras que las
diarreas bacterianas aumentan durante la estación lluviosa y más cálida. La
incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrón estacional de la dia-
rrea aguda líquida.
ETIOLOGÍA
Enteropatógenos importantes:
Virus: Rotavirus
Bacterias: Escherichia coli enterotoxigénica
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae 01
Salmonella spp.
Protozoos: Cryptosporidium parvum
59
Patógenos frecuentemente identificados en niños con diarrea
aguda, atendidos en centros de tratamiento, en países en desarrollo
60
Otros patógenos, cuya importancia como causa de diarrea aguda en
niños en los países en desarrollo es mínima, o no está bien definida. Estos
incluyen:
Virus: agente Norwalk
adenovirus entéricos
Virus
Los rotavirus se replican dentro de las células epiteliales maduras que
cubren la porción superior de las vellosidades intestinales, causando destruc-
ción celular y acortamiento de las vellosidades.
Bacterias
Adherencia a la mucosa
Producción de toxinas que causan secreción intestinal
Invasión de la mucosa
Protozoos
Adherencia a la mucosa
Invasión de la mucosa
61
Shigella
62
CAPÍTULO 4
PROPÓSITO:
63
El diagnóstico definitivo de cólera se establece sólo por la demostración de V.
cholerae 01 por medio de cultivo. El frote Gram directo de las heces puede ser indi-
cativo de cólera, pero no se considera un procedimiento diagnóstico exacto.
MUESTRA:
PROCEDIMIENTO:
64
3. Después del tiempo crítico de incubación del APA, retirar el tubo cuida-
dosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o
soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,
tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no más de 5
mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar
sangre de carnero al 5%. Incubar aeróbicamente 18 a 24 horas a 36° C.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
3. Aglutinar las colonias típicas y aisladas del agar sangre de carnero, con
antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las
65
colonias pequeñas o blancas que pueden aparecer, ya que el medio no es
inhibitorio. Nunca debe aglutinarse del TCBS, pues en este medio las
colonias son “chiclosas”, muy adherentes al medio, y no se pueden sus-
pender bien en el antisuero, por lo que la aglutinación sólo es confiable
a partir del crecimiento en agar sangre de carnero.
66
Fig. 7 MARCHA BACTERIOLÓGICA ACORTADA PARA
AISLAMIENTO DE Vibrio cholerae 01
Muestras:
Vibro cholerae
en la superficie
del APA
3. Tomar inóculo de la
superficie del APA
4. Sembrar TCBS y agar
sangre de carnero (ASC)
APA No agitar 5. Incubar 18-24 horas
o
a 36 C
67
INFORME:
En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica
plenamente usar una técnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para aho-
rrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el re-
porte de un cultivo positivo. Se recomienda informar así, lo más pronto posible, y
al lugar más indicado:
FÓRMULAS:
68
2. MEDIO DE TRANSPORTE CARY-BLAIR:
69
CAPÍTULO 5
PROPÓSITO:
La infección intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,
fiebre y ocasionalmente vómitos. Puede haber sangre macroscópica en las heces,
especialmente en las muestras pediátricas. La infección se adquiere por vía oral,
al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y
leche no pasteurizada. La infección puede adquirirse de otro humano, o ser una
zoonosis, pues también puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuen-
te en animales domésticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras
aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, además
de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis séptica, meningitis y otras
infecciones.
71
campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abun-
dantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnóstico definitivo se establece por
medio del aislamiento e identificación de C. jejuni.
MUESTRA:
CONDICIONES NECESARIAS:
72
PROCEDIMIENTO:
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
73
4. De otra colonia típica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar
Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de
agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmósfera microaerofílica a
42° C, según ya fue descrito.
- El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin ácido sulfídrico.
INFORME:
74
CAPÍTULO 6
PROPÓSITO:
MUESTRA:
75
OBSERVACIÓN DIRECTA:
PRUEBA DE UREASA:
H. pylori produce abundante ureasa, enzima que actúa sobre el sustrato urea,
con producción de abundante amoníaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba
indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera
presuntiva. Proceder así:
CULTIVO:
76
3. Introducir las cajas en un jarro Gas-Pak (BBL), sin catalítico en la tapadera,
ni indicador de anaerobiosis. Introducir según las instrucciones del pro-
ductor, un sobre rojo generador de anaerobiosis. Sin el catalítico presen-
te, proporciona una atmósfera microaerofílica adecuada para el cultivo
de H. pylori.
6. Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes:
INFORME:
77
CAPÍTULO 7
UROCULTIVO
PROPÓSITO:
Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminación.
79
MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y MICROORGANISMOS ASOCIADOS
CON VARIOS TIPOS DE INFECCIONES URINARIAS
MICROORGANISMOS CONTEO
TIPO DE MANIFESTACIONES
ASOCIADOS CON SIGNIFICATIVO
INFECCIÓN CLÍNICAS
LA INFECCIÓN (UFC/ml)
Tracto urinario Agudo: fiebre, calofríos, dolor *Bacilos gram-negativo Mayor o igual a
superior: de cintura posterior, náusea, Staphylococcus aureus 100,000
pielonefritis vómitos, cilindros leucocita- Staphylococcus coagulasa-negativo (criterio de Kass)
rios, invasión tisular Candida spp. (hongo)
Crónico: asintomático, Mycobacterium spp.
moderado o agudo, lesiones, Mycoplasma hominis
cilindros leucocitarios
Tracto urinario Sintomático: disuria, *Escherichia coli Mayor o igual a
inferior: frecuencia *Otros bacilos gram-negativo 100,000
80
cistitis Asintomático Enterococcus spp. (criterio de Kass)
Staphylococcus coagulasa-negativo
Uretritis Disuria, frecuencia *Escherichia coli Mayor o igual a
Chlamydia trachomatis 100
Neisseria gonorrhoeae
Staphylococcus saprophyticus
Trichomonas vaginalis (protozoo)
Virus Herpes simplex tipo 2
Candida albicans (hongo)
Prostatitis Agudo: fiebre, calofríos, *Bacilos gram-negativo Mayor o igual a
dolor de espalda Ureaplasma urealyticum 100
Chlamydia trachomatis
* Aislamiento común. Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.
TOMA DE LA MUESTRA:
1. Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estéril em-
papada en jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra
gasa estéril, empapada en agua estéril.
1. Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos índice y medio de la mano izquierda
debe separarse los labios genitales mayores.
81
2. Con una gasa empapada en jabón antiséptico no irritante limpiar bien
toda el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada en agua
estéril.
Con los niños que aún no saben hablar para comprender instrucciones y
orinar a voluntad, debe procederse así:
82
- Malformación anatómica que evite la micción normal del niño, causan-
do contaminaciones.
- Urocultivo aerobio negativo varias veces, continúan los síntomas, el
sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infección
urinaria causada por bacterias anaerobios.
Nota importante: Jamás introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios
años que esta técnica cayó en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que están
colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la prime-
ra orina de la mañana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse
un mínimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo
para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta números
significativos dentro del sistema urinario.
PROCEDIMIENTO:
2. Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio)
que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador
“vortex”, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Intro-
ducir verticalmente el asa flameada y fría
en la orina, justamente por debajo de la
superficie.
Agar sangre carnero
3. Inocular primero el agar sangre deslizan-
do el asa una sola vez a lo largo de la caja MacConkey
y pasando por el centro. Flamear e ino-
cular en igual forma el MacConkey. Al-
ternativamente, sembrar una biplaca de
agar sangre de carnero y MacConkey, con Biplaca para urocultivo
83
Fig. 8 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA UROCULTIVO
1. Agitar
2. Tomar 0.001 ml
con asa calibrada
de platino,
verticalmente y
justamente por
debajo de la
superficie
ASC
MacConkey
84
0.001 ml en cada mitad según la foto. Esto permite el ahorro de cajas
de Petri.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
85
No. colonias contadas UFC/ml de orina
25 25,000
78 78,000
100 en adelante más de 100,000
CLAVE : TEXTO
(en libro de registros) DEL INFORME:
De una colonia típica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para
confirmar la identificación presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la
misma colonia y otras idénticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o
antibiograma, según la técnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de
E. coli fermentadoras lentas de lactosa y deberán identificarse con TSI y LIA, no
presentan diseminación en cepas en el agar sangre.
CLAVE: TEXTO:
86
hemolíticas y de color verdoso), y los cultivos huelen a perraje o güipil
nuevo (telas típicas de Guatemala, olor semejante a uvas), inocular para
confirmar TSI y LIA y susceptibilidad, informar:
CLAVE: TEXTO:
CLAVE: TEXTO:
Proteus sp. más de 100,000 Se aisló Proteus sp. más de 100,000 UFC ml. Infección urina-
UFC ml. S/A. ria verdadera, según el criterio de Kass. S/A.
87
Staphylococcus aureus: colonias grandes (1 a 2 mm de diámetro), pueden o no
ser hemolíticas (no importante), a veces presentan pigmento amarillo. Coloración
de Gram: cocos gram-positivo, bien redondos, agrupados en racimos. Identificar
con dos pruebas específicas descritas en el Capítulo 8: coagulasa y manitol-sal.
Inocular prueba de susceptibilidad con discos de antibióticos para gram-positivo
según la tabla del capítulo correspondiente. Staphylocccus epidermidis (coagualasa y
manitol-negativos). Generalmente es contaminante. Tomarlo en cuenta y reportar
sólo si está presente en cantidad significativa y en cultivo puro.
CLAVE: TEXTO:
INFORME:
88
UFC/ml CRITERIO PARA REPORTAR
50,000 - 100,000 Se aisló _________ , _____ ,000 UFC/ml. S/A (reportar el número
de UFC contado y la especie bacteriana con su S/A).
*30 a 50 por ciento de mujeres con infección vesical y/o uretral con disuria,
urgencia y frecuencia (síndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass.
En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el límite para hacer diagnóstico
correcto, en asociación íntima con el médico tratante. (Según Jacobo Sabbaj K.,
VI Congreso Centroamericano de Microbiología, Guatemala, 5-9 de diciembre de
1983).
2. Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrás con un círculo de
crayón graso y colorear cuidadosamente con Gran.
89
6. La presencia de muchas células epiteliales (citoplasma grande y claro,
núcleo pequeño) y diferentes tipos de bacterias indican contaminación
y el examen debe repetirse.
90
CAPÍTULO 8
CULTIVO DE GARGANTA
PROPÓSITO
MUESTRA:
91
siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar
preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones:
2. Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y
diga aahh.
5. Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado
de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos
(cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
92
disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y
Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico neomicina,
por lo que crecen en cultivo casi puro alrededor de este disco. Como
el disco de bacitracina (también llamado taxo A) se encuentra muy
cerca frecuentemente puede acelerarse la identificación presutiva.
Las colonias que crecen alrededor del disco de neomicina (N-30)
pueden usarse para hacer sub-cultivos y antibiogramas (según:
Maxted, W. R.: J. Clin. Path. 6: 224, 1953).
Evitar el uso de sangre humana vencida de banco de sangre en todos los cul-
tivos bacteriológicos ya que puede ser inhibitoria al crecimiento bacteriano por
contener anticoagulantes, anticuerpos o antibióticos, además del peligro potencial
de la transmisión del virus del SIDA, hepatitis B, etc.
93
Fig. 9 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA CULTIVO
DE GARGANTA/EXUDADO FARÍNGEO
1. Muestra: Tomar un
hisopo faríngeo con Úvula
buena luz y baja-
lenguas Amígdala
Farínge
posterior
2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estrías, con dos cortadas
de 1 cm, sin flamear entre cada estría
3. Colocar sobre la primera estría, un disco de bacitracina de 0.04 unidades
y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre sí
4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C
Cortada 1
Disco de bacitracina
A
N
30
Disco de neomicina
Cortada 2
94
INTERPRETACIÓN:
95
anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo
inicial. Colocar con pinzas estériles un disco bacitracina en el inicio de la
segunda estría.
* La inhibición por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier
diámetro de halo de inhibición se considera significativo. Efectuar simultáneamente susceptibili-
dad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibiótico, lo que
aumenta la certeza de la identificación, junto con la prueba de CAMP negativa (técnica adelante).
96
7. Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infeccio-
nes de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacte-
rias que se citan a continuación solamente cuando predominan por en-
cima de la microbiota normal. Examinar la última estría que presenta
colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay más
colonias que Streptococcus sp. alfa hemolítico y Neisseria sp., de:
97
Inhibición por disco de optoquina Informar
Clave Informar
98
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE INFECCIONES
RESPIRATORIAS SUPERIORES
SIGNOS Y SÍNTOMAS BACTERIA POTENCIALMENTE ASOCIADA
Sinusitis/Rinitis: Streptococcus pneumoniae
Cefalea Streptococcus pyogenes (grupo A)
Dolor/eritema en región malar Staphylococcus aureus
Rayos-X: Consolidación, nivel Haemophilus influenzae
de líquido, engrosamiento de la
Klebsiella spp. y otras enterobacterias
pared de los senos
Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)
Garganta y faringe: Streptococcus pyogenes (grupo A)
Eritema y edema de mucosas Corynebacterium diphtheriae
Pus en amígdalas Neisseria gonorrhoeae
Pseudomembranas Bordetella pertussis
Edema de la úvula
Lengua con cubierta grisácea
Linfadenitis cervical
2. Luego con sumo cuidado, hacer una estría con el Streptococccus beta
hemolítico a identificar, perpendicular a la estría de S. aureus pero que
no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeño de
hemólisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.
99
Fig. 10 SIEMBRA E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA DE CAMP
Strepto. Strepto.
Flecha
Staph. Staph.
100
Tomado de:
101
4,000-12,000/mm 3 (promedio: 8,000); linfocitos 62%; velocidad de
sedimentación 0.5 mm/hr. Los valores de hemoglobina y hematocrito dismi-
nuyen con la edad y se elevan cuando el animal está excitado.
Los glóbulos rojos ovinos son más pequeños que los humanos. La mem-
brana celular de los pequeños eritocitos de carnero es muy susceptible a la
acción de las hemolisinas bacterianas. Esto es especialmente cierto en el caso
de las estreptolisinas O y S de Streptococcus pyogenes. Esta característica auna-
da a su fragilidad ligeramente mayor en comparación a los eritrocitos huma-
nos, hace que los eritrocitos ovinos sean excelentes indicadores de hemólisis
in vitro.
Tomado de:
102
VENTAJAS DEL USO DE LA SANGRE DE CARNERO
EN EL LABORATORIO CLÍNICO
3
gre de carnero por su bajo contenido de nucleótidos de piridina
(factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produ-
ce colonias idénticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita
falsos positivos.
103
La sangre de carnero desfibrinada asépticamente, no contiene
5
Se evita manipular volúmenes considerables de sangre humana,
por lo que se anula el riesgo de contraer SIDA, hepatitis B y otras
infecciones humanas, durante la preparación del agar sangre.
Referencia:
104
CAPÍTULO 9
PROPÓSITO:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
105
ancho que otro). En el frote Gram de material tomado directamente de las
pseudo-membranas de la garganta. No puede diferenciarse de otros “difteroides”
de igual morfología.
3. Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar
chocolate-telurito de potasio. Incubar aeróbicamente a 36° C por 18 a 24
horas.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Proceder así:
106
2. Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y
teñirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.
INFORME:
107
2. Si la morfología microscópica del crecimiento en Loeffler es típica y hay
colonias negras en chocolate-telurito, reportar:
Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identificación preliminar,
pendiente de demostrar la producción de toxina in vitro o in vivo.
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
Proceder así:
2. Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio Thayer-
Martin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.
108
3. Introducir los tubos, con el tapón de rosca ligeramente flojo, dentro
de un jarro con candela encendida y humedad. Incubar por 18 a 24
horas a 36° C.
INTERPRETACIÓN:
2. Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeño frote Gram
de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negati-
vo en forma de “granos de café”, agrupados en parejas.
3. Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta
morfología microscópica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores),
e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.
INFORME:
Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se está seguro que no se trata
de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota nor-
mal de la garganta, informar: Se aisló Neisseria meningitidis.
Si se cuenta con los antisueros de tipificación, realícela e informe:
Se aisló Neisseria meningitidis del grupo __. (según el que haya aglutinado)
109
Fotografías
a
Color
111
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11 12
13 14
15 16
17 18
19 20
21 22
23 24
25 26
27 28
29 30
116
31 32
FOTOGRAFÍAS
Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo.
Bacilos gram-negativo, regulares, de coloración sólida y bordes redondeados. Esta
morfología es típica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington,
D.C., E.U.A.
Foto 8. Bacteroides fragilis, coloración de Gram de cultivo puro. Presenta coloración rojo
pálido (típica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe
Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A.
Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics.
Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciación. Las
colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmón; las lactosa-
117
negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde pálido. Las colonias
productoras de ácido sulfhídrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la
colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 11. Reacciones típicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie
alcalina (rojo), fondo ácido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta
abundante gas (burbuja y fondo separado) y ácido sulfhídrico (negro). El LIA (arriba)
es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilación del aminoácido lisina,
también presenta precipitado negro debido al ácido sulfhídrico. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 12. Reacciones típicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina
(rojo), fondo ácido (amarillo), no presenta gas ni ácido sulfhídrico. El LIA (arriba) es
alcalino/ácido (K/A), sin gas ni ácido sulfhídrico. En Shigella spp. frecuentemente el
color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel
F. Torres, Guatemala.
Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con
cólera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS.
Colonias típicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
118
Foto 17. Urocultivo positivo a Klebsiella pneumoniae, más de 100,000 UFC/ml, en agar
MacConkey sembrado con de 0.001 ml de orina con asa calibrada de platino. Muestra
colonias grandes y muy mucosas debido a la presencia de cápsula. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 18. Urocultivo positivo a Escherichia coli, más de 100,000 UFC/ ml, en agar
MacConkey. Esta imagen es la más frecuente en urocultivos positivos. Las incontables
colonias son rojas, brillantes y de bordes enteros. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 19. Streptococcus pyogenes, sub-cultivo sobre agar sangre de carnero al 5%, con un
disco de bacitracina. Este cultivo fué incubado en jarro húmedo con candela a 37 grados
centígrados por 24 horas. Se observa claramente la inhibición del crecimiento provocada
selectivamente por este antibiótico, como un halo rojo (sin destrucción de los eritrocitos
ovinos) alrededor del disco. En el crecimento de esta bacteria se observa intensa
hemólisis de tipo beta. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 20. Streptococcus pyogenes, prueba de CAMP negativa; siembra sobre agar sangre
de carnero. Las estrías verticales de Staphylococcus aureus de doble zona de beta hemólisis
presentan crecimiento blanco. Las estrías perpendiculares de varias cepas de S. pyogenes
son beta hemolíticas, pero la hemólisis no se incrementa en forma de flecha donde el
crecimiento de ambas bacterias se acerca sin tocarse. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 22. Sub-cultivo del crecimiento original de la foto anterior con disco de optoquina.
El halo de inhibión mayor de 14 mm de diámetro, identifica presuntivamente a
Streptococcus pneumoniae. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 23. Cultivo de esputo en agar sangre de carnero, de paciente guatemalteco con
neumonía lobar causada por Streptococcus pyogenes. Las cepas muy virulentas que
poseen cápsula gruesa, presentan colonias mucosas como las de éste caso. Las colonias
confluentes presentan la típica hemólisis tipo alfa. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 24. Sub-cultivo del crecimiento mucoso de la foto anterior, con un disco de
optoquina. Se observa un amplio halo de inhibición del cultivo por el hidrocloruro de
119
etil cupreína (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan también las
reacciones típicas de inhibición y alfa hemólisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad según el
método de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutrición de
Centroamérica y Panamá, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto:
Leonardo J. Mata, Costa Rica.
Foto 27. Demostración del método para preparación de frotes de esputo entre dos porta-
objetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriología II, Laboratorio de
Microbiología, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: anónima.
Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la técnica de Ziehl-
Neelsen. Los bacilos alcohol-ácido resistentes aparecen teñidos de color rojo. La
coloración de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds,
Inglaterra.
Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordón. Las cepas más virulentas
de M. tuberculsis manifiestan esta característica. Se observa el crecimiento en forma de
cordones sinuosos. Foto: Rubén Mayorga Peralta.
120
CAPÍTULO 10
CULTIVO DE ESPUTO
PROPÓSITO:
MUESTRA:
121
micobacterias (BK). Si la muestra no se va a procesar de inmediato, debe refrigerarse
por no más de tres horas.
Debe ponerse atención en el color, olor y consistencia del esputo. Las mues-
tras hialinas y completamente líquidas deben rechazarse de inmediato pues no son
esputo, son saliva. Una muestra de esputo muy tenaz y adherente puede indicar la
presencia de Klebsiella pneumoniae. Mal olor indica la presencia de anaerobios, pero
el esputo nunca debe cultivarse para anaerobios, pues siempre van a estar presen-
tes por el paso de la muestra a través de la boca, donde son muy abundantes. En
caso de sospecharse infección pulmonar por anaerobios, debe obtenerse muestra
por punción trans-traqueal.
4. Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor
122
sobre el mechero. Colorear el frote seleccionado con Gram y el otro con
Ziehl-Neelsen, si así fue solicitado por el médico.
123
de Streptococcus pneumoniae (neumococo) como agente causante de la
neumonía.
CULTIVO DE ESPUTO:
El esputo vertido en una caja de Petri estéril (para poder seleccionar mejor la
fracción de la muestra a analizar), debe procesarse así:
124
alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), planas (deprimidas en el centro y
con los bordes ligeramente más elevados), brillantes, transparentes, y
pequeñas (menos de un milímetro de diámetro). Algunas veces las colo-
nias de S. pneumoniae no son típicas, y pueden ser grandes (hasta 4 mm),
convexas y muy mucosas (debido a la cápsula). Siempre presentan la
hemólisis verdosa (alfa) característica.
125
miento sólo muy cerca de la estría de S. aureus). El frote Gram del creci-
miento de las pequeñas colonias satélites presenta predominio de
cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasa-
positivo.
7. Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtie-
nen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neu-
monía humana, solamente si su crecimiento predomina.
126
ETIOLOGÍA Y SINTOMATOLOGÍA DE NEUMONÍA Y BRONQUITIS
127
CAPÍTULO 11
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO
PROPÓSITO:
MUESTRA:
129
1. La cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 ml
y en adultos usualmente 5 ml, aunque sería preferible cultivar 10 ml.
3. Es una buena práctica rutinaria lavar con agua y jabón el brazo del
130
paciente, antes de aplicar desinfectantes. Limpiar el sitio exacto con un
algodón empapado en tintura de yodo al 3 por ciento. Dejar secar y
luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol,
con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio
de punción. Después de esta prepación no se debe volver a tocar la vena.
131
ilíaca. Esta muestra debe procesarse exactamente igual que el
hemocultivo.
PROCEDIMIENTO:
132
3. En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suave-
mente, limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar
con jeringa y aguja estériles (puede ser de tuberculina) y aspirar una
pequeña cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa
sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate;
incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres
gotas del hemocultivo, pero sólo estriar una. Si no se observa crecimien-
to en las gotas no rayadas y lo hay en las estrías, posiblemente se trata
de contaminación. Simultáneamente, dejar secar dos gotas del caldo so-
bre un porta-objetos; colorear con Gram.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS;
133
grupo D, y anti-antígeno Vi. Si hay aglutinación franca, reportar inme-
diatamente la presencia de Salmonella typhi.
- Salmonella typhi
- Escherichia coli
- Streptococcus pneumoniae
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Pseudomonas aeruginosa
- Haemophilus influenzae
134
INFORME:
135
CAPÍTULO 12
SECRECIONES DIVERSAS
PROPÓSITO:
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Streptococcus pneumoniae
MUESTRA:
137
Debe considerarse como regla general indispensable, hacer siempre un frote
para Gram, sobre un porta-objetos limpio. Es de vital importancia observar las
bacterias en el frote, especialmente cuando deben interpretarse cultivos con alguna
microbiota normal además de algún patógeno.
1. PIEL:
Si no hay apertura por donde salga el pus, escoger una lesión intacta y “ma-
dura”, de preferencia con punta blanquecina. Limpiar el área de donde se tomará
la muestra para frote Gram y cultivo, con algodón empapado en alcohol y exprimi-
do. Limpiar bien pero con cuidado de no sacar el pus, luego con lanceta estéril o
bisturí pequeño, puncionar a manera de evitar que salga sangre. Si es necesario
(usar guantes de hule estériles) presionar a los lados de la lesión, hacia el centro,
para “exprimir” el pus hacia afuera. Tomar una pequeña gota de pus con el asa
espatulada estéril, punta de aplicador de madera estéril (quebrado) o hisopo esté-
ril, e inocular siempre los siguientes medios de cultivo, en este orden:
Luego hacer un frote Gram delgado, sin frotar mucho sobre el porta-objetos.
Los medios de cultivo deben inocularse con una asada de pus, en un extremo de la
caja. El objeto de hacerlo en el orden indicado, es evitar el acarreo de inhibidores
del MacConkey y manitol-sal, hacia el agar sangre de carnero y el agar chocolate,
que no son inhibitorios.
138
2. OJOS:
Tomar la muestra con hisopo estéril, así: bajar el párpado inferior, haciendo
presión hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar
guantes de hule estériles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo
hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar san-
gre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden.
Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra. Hacer un
frote pequeño sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesiva-
mente.
3. OÍDOS:
139
den. Con un segundo hisopo estéril, tomar más muestra y sin frotar mucho, hacer
un pequeño frote sobre porta-objetos limpio.
4. MISCELÁNEOS:
El material para tomar las muestras debe ser estéril. La toma de muestra debe
ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesión
seca y no de un sitio representativo, es completamente inútil. El sangrado debe
evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difíciles o invasivas,
que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervención del
microbiólogo o del médico.
140
PROCEDIMIENTO:
141
lonias planas alfa hemolíticas (hemólisis verdosa), identificar un sub-cultivo en agar
sangre de carnero con disco de optoquina para Streptococcus pneumoniae.
142
tubo es más sensible y confiable, pero si la reacción da positiva en lámina es sufi-
ciente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por
ciento de correlación.
143
género por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciación hasta especie re-
quiere de pruebas más complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en
agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos
microaerofílicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el
primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de
los eritrocitos.
144
Con fines prácticos, es aceptable el reporte de los aislamientos con satelitismo
positivo así:
- Cultivo de ojos, reportar: Se aisló Haemophilus aegyptius.
- Cultivo de cualquier otra secreción: Se aisló Haemophilus influenzae.
145
CAPÍTULO 13
SECRECIONES GENITALES
PROPÓSITO:
DIAGNÓSTICO DE GONORREA
Muestra:
El agente causal de la
gonorrea es la bacteria Neisseria
gonorrhoeae un diplococo gram-ne-
gativo (rojo). Las neiserias presen-
tan forma arriñonada y se agrupan
en pares que semejan granos de Neisseria gonorrhoeae, frote
café. El diagnóstico de laboratorio Gram de pus uretral masculino.
de la gonorrea consiste en la obser-
147
vación de la morfología típica de la bacteria en frotes Gram de pus uretral (sólo en
el hombre, no así en la mujer), y en el cultivo de la bacteria Neisseria gonorrhoeae.
Puede aislarse de descargas uretrales, vaginales e hisopos rectales; rara vez se ais-
lan de heces, sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. Los niños que
nacen de madres con gonorrea, se infectan con la bacteria al pasar por el canal
vaginal durante el parto y generalmente presentan conjuntivitis purulenta. En el
pus de los ojos de estos niños puede observarse y cultivarse la bacteria.
Hombres:
Mujeres:
148
2- Con la punta de algodón de un hisopo estéril tomar pus de donde se
localice (usar buena luz), es decir del cuello uterino, vagina o uretra.
Preparar un frote para Gram haciendo rodar el hisopo sobre un porta-
objetos de vidrio.
3- Tomar más pus con otro hisopo estéril, e inocular una caja o botellita de
Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.
Procedimiento:
2- Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inóculo sobre toda
la superficie de cajas o botellitas.
Interpretación de resultados:
Cultivo:
149
nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sus-
tancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sus-
tancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general sólo crece este microorganismo
en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeñas (menos de 1 mm de
diámetro), translúcidas, brillantes y de bordes lisos.
Efectuar la prueba con el reactivo líquido así: aplicar unas gotas del reactivo
recién preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias to-
man rápidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es posi-
tiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es
positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia típica sin reactivo, o una colo-
nia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas
a 36°C en jarro húmedo con candela. Después de incubar, hacer frote Gram al
crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arriñonados gram-
negativo.
150
hasta una concentración de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapón de
rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien
cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo sólo unos pocos milímetros
por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapón de rosca e
incubar de 48 a 72 horas a 37° C. Una coloración amarilla en la superficie del medio
indica reacción positiva. Interpretar resultados según esta tabla:
Neisseria gonorrhoeae + - -
Neisseria meningitidis* + + -
* Ver capítulo 14
Informe:
151
DIAGNÓSTICO DE CHANCRO BLANDO (CHANCROIDE)
Muestra y Procedimiento:
Las lesiones en los genitales son generalmente úlceras bien circunscritas do-
lorosas con base necrótica y bordes socavados y blandos. De estas características se
deriva el nombre de chancro blando o chancroide (similar al chancro sifilítico típi-
co). Las lesiones rara vez son más grandes de 2 cm de diámetro, pueden haber
lesiones múltiples por autoinoculación y en más de la mitad de los casos, los ganglios
de la ingle están endurecidos.
152
DIAGNÓSTICO DIRECTO DE LA SIFILIS
En la mayoría de los casos de sífilis primaria aparece una lesión típica en los
órganos genitales, llamada “chancro”. El chancro se caracteriza por ser una úlcera
no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una le-
sión muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse
con guantes.
Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colo-
rantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observación microscópica en
fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no
haya recibido tratamiento con antibióticos especialmente penicilina, que hace des-
aparecer rápidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede
así:
153
ño para tubos capilares (de los que vienen en kits de serología), porta-
objetos, cubre-objetos, solución salina estéril en frasco, gasa estéril y al-
godón con alcohol.
4- Con la mano izquierda, tomar la lesión entre los dedos pulgar e índice y
presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesión un líquido
translúcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe
soportar el dolor sin anestesia.
5- Causar leve abrasión con el tubo capilar sin causar sangramiento, rápi-
damente dejar caer en el centro de la lesión una gota de solución salina
del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesión, dos o tres
veces más. Debe usarse lo menos posible de solución salina para no di-
luir la muestra, que debe ser un líquido lechoso ligeramente hemorrágico
que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa
estéril si se considera más fácil de manejar.
154
9- Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el mi-
croscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el
condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de
inmersión de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire.
Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir
lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por de-
bajo de la lámina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de
la luz del microscopio al máximo, luego enfocar la muestra con seco
débil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el
máximo de contraste, es decir los objetos más brillantes y el campo más
oscuro.
10- Cambiar al lente seco fuerte (de preferencia con diafragma) y enfocar de
nuevo con el tornillo micrométrico y la altura del condensador. Una vez
claramente enfocado, buscar detenidamente bacterias (ver foto y figura
12) con las siguientes características:
155
Interpretación de resultados e informe:
Los treponemas son bacterias muy delgadas y por lo tanto difíciles de colo-
rear. Antiguamente se utilizaban coloraciones por impregnación con sales de plata
para observarlos, con malos resultados. Ninguno de los tratados modernos revisa-
dos para la preparación del presente manual menciona este tipo de coloraciones,
que han caído en desuso. Puede utilizarse el condensador de contraste de fases,
pero los treponemas se observan menos obvios que con campo oscuro. Si no se
cuenta con microscopio con campo oscuro, remitir al paciente a una unidad que sí
cuente con esta facilidad.
156
AGENTES INFECCIOSOS DEL TRACTO GENITAL FEMENINO
INTRODUCCION
Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el moti-
vo de consulta más frecuente en las clínicas de Ginecología. Se manifiestan
clínicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o
sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son
importantes además de las molestias que causan a la paciente, por las poten-
ciales complicaciones al diseminarse a otros órganos como el útero o las trom-
pas de Falopio y porque representan también un riesgo para el feto en la
mujer embarazada.
Según el área anatómica afectada por los procesos infecciosos, éstos pue-
den clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis,
salpingitis, enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ováricos.
Esta clasificación brinda las bases para el manejo clínico y también orienta
sobre la etiología, epidemiología y tratamiento de los mismos. Es también
importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiológicas de la
vida de la mujer (niñez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se
presentan con mayor o menor frecuencia algún tipo de microorganismos en
particular.
VAGINITIS
157
viceversa. Por este motivo, es importante establecer criterios objetivos que
permiten determinar cuando se encuentra presente un proceso infeccioso y
cuando son situaciones fisiológicas. La vaginitis es definida objetivamente
cuando se encuentran trastornos cualitativos o cuantitativos en el flujo vaginal
y/o síntomas asociados a la presencia de microorganismos patógenos. Los
cambios cualitativos incluyen aumento del pH por arriba de 4.5, prueba de
amina positiva y presencia de células clave.
158
3. Vaginitis en mujeres postmenopáusicas
A. Tricomoniasis
B. Candidosis vulvovaginal
159
C. Vaginosis bacteriana
CERVICITIS
160
de planificación familiar (gonorrea=0.3% y clamidia=7.0%) y en 9.0% de las
adolescentes (gonorrea=1.7% y clamidia=6.8%).
161
CAPÍTULO 14
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y
FLUIDOS CORPORALES
PROPÓSITO:
Gram negativo:
- Neisseria meningitidis (causa meningitis meningocócica severa)
- Haemophilus influenzae (especialmente en niños de 6 meses a 4 años de
edad)
- Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos
y post-craneotomía)
- Pseudomonas aeruginosa
Gram-positivo:
- Streptococcus pneumoniae (muy importante)
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos)
- Streptococcus pyogenes
- Listeria monocytogenes (raro)
MUESTRA:
163
Líquido ventricular (líquido cisternal, líquido craneal)
Fluido abdominal (líquido peritoneal o aseíbico, líquido de parasentesis, lí-
quido de diálisis, bilis)
Líquido pleural, torasentesis y empiema (obtenido del tórax)
Líquido pericárdico
Líquido sinovial
Médula ósea, sangre (ver capítulo de hemocultivo y mielocultivo)
Por lo general estas muestras son obtenidas por el médico que solicita su aná-
lisis. Deben obtenerse antes de iniciar tratamiento con antibióticos y las debe colec-
tar en recipientes estériles proporcionados por el laboratorio.
164
PROCEDIMIENTO:
165
Fig. 11 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO (LCR)
GRAM ZIEHL-NEELSEN
sedimento
Tioglicolato Lowenstein-Jensen
agar sangre agar MacConkey NO INCLINAR
de carnero chocolate Sabouraud
4. Incubar en jarro 5. Incubar aeróbicamente a 36o C,
con candela Sabouraud a 27o C
166
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Lo más pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente de
inmersión. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inme-
diato de pacientes con infección grave de las meninges, su observación debe hacer-
se con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologías:
167
Los cultivos deben observarse a las 24 horas de incubación a 36°C. Si no se
observa crecimiento, reincubar todas las cajas. Si a las 48 horas de incubación tam-
poco hay crecimiento, apuntar en el libro de control: N-48, y reportar “Negativo a
las 48 horas de incubación a 36°C en aero-anaerobiosis”. Si se observa algún creci-
miento a las 24 ó 48 horas, comparar con la siguiente tabla:
Crecimiento en
BACTERIA
Agar Sangre Agar Chocolate MacConkey Tioglicolato Sabouraud
N. meningitidis -/+ + - - -
H. influenzae - + - - -
S. pneumoniae + + - +/- +
Enterobacterias
+ + + + +
y pseudomonas
Cryptococcus
- - - - +
neoformans
Anaerobios - - - + -
* Aglutinar con antisueros específicos, los grupos más frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma
en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo.
** Prueba de “satelitismo” para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).
168
Efectuar la prueba de satelitismo así:
INFORME:
El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el día
en que se recibió la muestra. Después informar lo más pronto posible el resultado
del cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observa-
das (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo:
169
CAPÍTULO 15
TEJIDOS Y BIOPSIAS
PROPÓSITO:
MUESTRA:
171
muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estéril con un poco
de solución salina estéril al laboratorio de microbiología.
PROCEDIMIENTO:
No es adecuado inocular los medios sólo tocando o frotando la pieza con una
asa. Debe hacerse de la siguiente manera:
1- Colocar la pieza con pinzas estériles en una caja de Petri estéril. Con
tijeras estériles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de
tejido estéril o, si no lo hay, a un pequeño mortero estéril.
6- Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.
172
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS E INFORME
173
ANUNCIO
ZITHROMAX
175
DOCUMENTO
ZITHROMAX
176
CAPÍTULO 16
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
(ANTIBIOGRAMA)
PROPÓSITO
MEDIO DE CULTIVO
177
cilla que siempre debe efectuarse con el agar de Mueller-Hinton; el grosor de la
caja, concentración del inóculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar
perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre
los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta técnica sólo
sirve para efectuar el antibiograma de las siguientes bacterias aeróbicas o facultati-
vas de crecimiento rápido:
- Staphylococcus aureus
- Enterobacterias
- Pseudomonas
3- El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con
potenciómetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un peque-
ño beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario,
antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.
4- De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36° C para com-
probar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas
para efectuar antibiograma después de ser incubadas.
178
Almacenaje de discos con antibióticos
PROCEDIMIENTO:
179
Preparar el estándar 0.5 de MacFarland así: mezclar 0.5 ml de cloruro de
bario 0.048 M (1.175 g BaCl2. 2H2O en balón de 100 ml, aforar con agua
destilada), más 99.5 ml de ácido sulfúrico 0.36 N (1 ml de H2SO4 en
balón de 100 ml, aforar con agua destilada). Llenar tubos que cierren
bien, sellarlos, guardarlos en la oscuridad con fecha. Hacer nuevo
estándar cada 6 meses.
9- Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas a 36° C, nunca usar jarro
con candela (excepto para Haemophilus spp. y Neisseria spp.)
180
Fig. 12 MARCHA BACTERIOLÓGICA PARA ANTIBIOGRAMA
1. Tomar 4 ó 5 colonias
de igual morfología
del cultivo original
o
3. Incubar por 2 a 5 hrs a 36 C hasta alcanzar la
turbidez del estándar 0.5 de MacFarland
Agar Mueller-Hinton
5. Sembrar caja
pre-secada en tres
direcciones opuestas
181
ANTIBIÓTICOS APROBADOS (FDA-USA) QUE DEBEN
USARSE RUTINARIAMENTE PARA PRUEBAS DE
SUSCEPTIBILIDAD EN VARIOS GRUPOS BACTERIANOS
Enterobacterias:
182
Pseudomonas aeruginosa y otros bacilos gram-negativo facultativos no de la
familia Enterobacteriaceae:
Staphylococcus spp.:
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
183
con una regla por detrás de la caja de Petri, o con patrones especiales.
No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhi-
bición o crecimiento muy débil (80% de inhibición). Sin embargo, si se
observan múltiples colonias dentro del halo de inhibición, éstas deben
sub-cultivarse para descartar contaminación. En caso de tratarse de la
misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias
que crecen dentro del halo. El “velo” de crecimiento de Proteus sp. den-
tro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el
márgen donde se inicia el crecimiento grueso.
184
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIÓN (mm)
PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae
185
(Continuación)
Agente Contenido Moderadamente
Resistente Intermedio Susceptible
Antimicrobiano del disco (mcg) susceptible
Ticarcilina-ácido
75/10 ≤14 15-19 ≥20
clavulánico
Tobramicina 310 ≤12 13-14 ≥15
Trimetoprim-
1.25/23.75 ≤10 11-15 ≥16
sulfametoxazol
Reportar sólo en
urocultivos:
Carbenicilina 100 ≤19 20-22 ≥23
Cinoxacina 100 ≤14 15-18 ≥19
Nitrofurantoína 300 ≤14 15-16 ≥17
Norfloxacina 310 ≤12 13-16 ≥17
Ofloxacina 315 ≤12 13-15 ≥16
Sulfisoxazol 250 ó 300 ≤12 13-16 ≥17
Trimetoprim 315 ≤10 11-15 >16
186
(Continuación)
Agente Contenido Moderadamente
Resistente Intermedio Susceptible
antimicrobiano del disco susceptible
Meticilina 135 mcg ≤9 10-13 ≤9 ≥14
Ofloxacina 315 mcg ≤12 ≤12 13-15 ≥16
Oxacilina 311 mcg ≤10 11-12 ≤10 ≥13
Penicilina G 10 U ≤28 ≤28 ≤28 ≥29
Rifampicina 315 mcg ≤16 17-19 ≤16 ≥20
Tetraciclina 330 mcg ≤14 15-18 3≤14 ≥19
Trimetoprim- ≤10
1.25/23.75 mcg ≤10 11-15 ≥16
sulfametoxazol
Vancomicina 330 mcg 3≤9 10-11 3≤9 3≥12
Reportar sólo sólo
Reportar en uro:
en urocultivos:
Nitrofurantoína 300 mcg ≤14 15-16 ≤14 ≥17
Norfloxacina 310 mcg ≤12 13-16 ≤12 ≥17
Sulfisoxazol 250 ó 300 mcg ≤12 13-16 ≥17
Trimetoprim 315 mcg ≤10 11-15 ≥16
Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor
in Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Two
volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basado
en: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova,
Pennsylvania, U.S.A.
CONTROL DE CALIDAD
La susceptibilidad de las dos cepas patrón debe probarse con cada lote nuevo
187
de medio Mueller-Hinton, o una vez a la semana. Nunca hacerlo de los cultivos
refrigerados, hacerlo de colonias previamente sub-cultivadas en agar sangre.
Las zonas de inhibición de los patrones conocidos sirven para evaluar la pre-
cisión de la prueba. Los halos de inhibición de las dos cepas control deben estar
entre los rangos de la siguiente tabla:
Trimetoprim-sulfametoxazol 24 - 32 24 - 32
188
16- Mala preparación o almacenaje del estándar 0.5 de MacFarland.
17- No exprimir el hisopo en las paredes del tubo.
18- Retraso entre la preparación del inóculo y la siembra (aumenta la
concentración bacteriana).
19- Retraso en la aplicación de los discos en las cajas ya inoculadas.
10- Exceso de incubación de las cajas.
11- Uso de jarro con candela o incubación a otra temperatura que no sea
36° C.
12- Lectura prematura antes de 16 a 18 horas de incubación.
13- Mala medición de los halos de inhibición.
14- Cultivos mixto, no puros.
15- Aplicación de la técnica a anaerobios o bacterias de crecimiento lento.
16- No usar las cepas control.
17- Errores de transcripción de resultados.
189
ANUNCIO
UNASYN
(blanco y negro,
cara de niño)
191
DOCUMENTO
UNASYN
(blanco y negro
columna vertical,
debe decir
UNASYN al
principio)
192
CAPÍTULO 17
ANAEROBIOS
PROPÓSITO:
MUESTRA:
- Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxígeno del aire. Si los
anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pier-
den muy rápidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cul-
tivo). Por esta razón deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto
para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.
193
13- Tejido necrótico, gangrena o formación de pseudo-membranas.
14- Gas en tejido o secreción.
15- Endocarditis con hemocultivos rutinarios negativos.
16- Infección asociada con cáncer u otros procesos que causan destrucción
de tejidos.
17- Infección relacionada con uso de antibióticos aminoglucósidos.
18- Tromboflebitis séptica.
19- Bacteremia con ictericia.
10- Infección causada por mordidas humanas o de animales (investigar
Pasteurella multocida, cocobacilo gram-negativo aerobio).
11- Pus sanguinolento y negruzco que puede fluorecer de color rojo bajo
luz ultravioleta (Bacteroides melaninogenicus).
12- Presencia de “gránulos de azufre” en pus de lesiones en mandíbula u
otro sitio (actinomicosis, buscar Actinomyces israelii).
13- Signos y síntomas de gangrena gaseosa.
14- Entidades clínicas que generalmente implican anaerobios como aborto
séptico, o cirugía gastrointestinal infectada.
1- Pus aspirado.
2- Tejidos varios (biopsia, cirugía, autopsia).
3- Fluidos corporales (LCR, líquido pleural, paracentésis, pericárdico,
sinovial).
4- Aspirado por punción trans-traqueal.
5- Aspirado por punción pulmonar directa.
6- Orina aspirada por punción supra-púbica.
7- “Gránulos de azufre” de pacientes con sospecha de actinomicosis.
194
4- Heces, contenido intestinal, hisopo rectal.
5- Hisopo de lesiones superficiales (úlceras de decúbito, etc.)
6- Material contiguo a mucosas.
7- Orina colectada al vuelo.
8- Hisopos vaginales o cervicales.
195
Si la muestra se aspiró con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no que-
den burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapón de hule.
PROCEDIMIENTO:
H2+CO2
3- Introducir rápidamente la caja con el
medio hacia arriba y el tioglicolato en
un jarro Gas-Pak limpio y seco. Abrir
un sobrecito indicador de anaerobiosis
Jarro Gas-Pak
y colocarlo dentro del jarro a manera
de que la almohadilla con azul de metileno se vea claramente. Inmedia-
tamente cortar con tijera la esquina indicada del sobre generador de hi-
drógeno y CO2 (sin apacharlo), y con pipeta de vidrio (no insertarla),
agregarle 10 ml de agua destilada. Colocar el sobre con la abertura hacia
arriba y cerrar fuertemente el jarro con la tapadera especial y la pinza de
tornillo. La tapadera tiene por dentro una canastilla metálica que puede
desenroscarse. Adentro debe colocarse un sobrecito de trocitos de paladio
iridiado que actúa como catalítico para combinar el oxígeno dentro del
jarro con el hidrógeno producido por el sobre generador y formar agua.
Con el uso, el catalítico se inactiva, por lo que una vez a la semana de-
ben calentarse los trocitos a 100° C por treinta minutos (en cápsula de
porcelana, dentro del horno de secar material), para reactivarlo y secar-
lo periódicamente.
196
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
197
4- Comparar con la siguiente tabla como guía, y correlacionar con el culti-
vo anaerobio.
198
co de los anaerobios. Descartar el indicador y el sobre generador de hi-
drógeno y CO2.
199
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE VARIOS
ANAEROBIOS DE IMPORTANCIA MÉDiCA
Bacilos gram-positivo gruesos o finos que presentan esporas las Clostridium sp.
cuales no se tiñen con Gram.
200
Fig. 13 DIVERSAS MORFOLOGÍAS BACTERIANAS
201
7- En el caso de bacilos anaerobios gram-negativo, hacer un sub-cultivo en
agar sangre de carnero y colocar en las primeras estrías los siguientes
discos:
Bacteroides fragilis R R R
B. melaninogenicus R R V
B. ureolyticus S R S
Fusobacterium nucleolatum S R S
F. necrophorum S R S
F. mortiferum S R S
F. varium S R S
Fusobacterium sp. S R S
INFORME:
Según los criterios anteriores y otros que pueden obtenerse en literatura espe-
cializada, informar las bacterias anaerobias aisladas. No se efectúa prueba de sus-
ceptibilidad para anaerobios mientras no se cuente con una técnica sencilla que
pueda implementarse en los diversos laboratorios de nuestro medio.
202
CAPÍTULO 18
MICOBACTERIAS
PROPÓSITO:
Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tiñen con dificultad por el alto
contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse coloran-
tes con fenol y/o calor. Una vez teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les lla-
ma “bacilos alcohol-ácido resistentes” (abreviado BAAR). No usar el término “áci-
do-alcohol resistentes”.
MUESTRAS
203
El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al
despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días
alternos.
Colectar la muestra de esputo así: el esputo, al igual que cualquier otra mues-
tra para micobacterias, debe colectarse antes de iniciar tratamiento, que pue-
de inhibir el crecimiento.
Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con agua
corriente; no usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.
204
En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios
métodos:
b) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para ex-
traer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para
niños pequeños a los cuales no se les puede pedir una muestra adecua-
da.
205
El lavado gástrico debe ser efectuado en la mañana, cuando el estómago está
vacío (por lo menos 8 horas después que el paciente ha comido o tomado
medicamentos orales), es mejor que el paciente se levante de su cama y que la
muestra se obtenga 30 minutos después de inducir esputo por nebulización.
206
- Raspado endometrial/sangre menstrual
- Médula ósea
- Líquido pericárdico
- Trozos de varios tejidos obtenidos en autopsia
- Heces (en ocasiones muy especiales)
Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el médico en recipien-
tes estériles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adi-
cionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservati-
vos o fijadores.
PROCEDIMIENTO:
207
12- Cubrir el papel filtro con fuchsina carbónica de Ziehl-Neelsen; debe quedar
bien empapado.
14- Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presión).
15- Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo
(aproximadamente 2 minutos). Debe insistirse en la decoloración ya que es el
paso diferencial. Los frotes gruesos requieren mayor tiempo de decoloración,
pero tampoco se debe decolorar excesivamente.
19- Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absor-
bente.
10- Examinar el frote con el lente de inmersión, con cuidado de limpiar el aceite
del lente entre cada frote para no acarrear micobacterias de una muestra a
otra.
208
Solución acuosa de fenol al 5% ........................................ 90 ml
Preparar solución de fenol al 5%, así: (Fundir los cristales de fenol en baño de
María, medir 5 ml con probeta, (no con pipeta), y luego llevar a volumen de
100 ml con agua destilada estéril.
2- Alcohol-ácido (decolorante):
Acido clorhídrico concentrado ......................................... 93 ml
Alcohol etílico al 95% ........................................................ 95 ml
COLORACIÓN DE KINYOUN:
4- Decolorar el frote con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante rojo.
Insistir en este paso pues es el que diferencia a las bacterias.
8- Dejar secar y examinar con el lente de inmersión. En general tomar las míni-
mas precauciones que para la coloración de Ziehl-Neelsen.
209
REACTIVOS PARA KINYOUN
1- Sin excepción alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los fro-
tes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la
Asociación Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Esta-
dos Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos labora-
torios y orientar adecuadamente al médico.
210
REPORTE DE FROTES PARA MICOBACTERIAS
NÚMERO DE BACILOS
REPORTE
ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTE
7- En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote
211
es muy grueso es probable que se desprenda de la lámina durante la coloración,
por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparación a otra
por medio de aceite de inmersión, lentes sucios o colorantes.
19- Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por
cultivo, ya que la baciloscopía es menos sensible para detectar micobacterias
que el cultivo.
10- Nunca dejar el azul de metileno por más tiempo del indicado: 1 ó 2 minutos.
11- A veces es difícil distinguir los artefactos acidófilos (rojos) de verdaderos ba-
cilos alcohol-ácido resistentes. La observación de “cuerpos esféricos alcohol-
ácido resistentes” debe mencionarse como “sospechosa”. Los “gránulos de
Much” son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positi-
vo y no alcohol-ácido resistentes.
212
DIGESTIÓN Y DESCONTAMINACIÓN DE ESPUTOS
La NALC digiere el moco del esputo por ruptura de las uniones disalfuro de
la mucina y además destruye las bacterias comunes sin dañar a las micobacterias.
Al procesar esputos u otras muestras para cultivo, debe hacerse con sumo
cuidado y dentro de una campana bacteriológica. Descartar todo el material conta-
minado en recipientes con fenol al 5 por ciento. Evitar los aerosoles que se produ-
cen al flamear las asas; introducirlas antes de flamear dentro de un recipiente con
alcohol y arena en el fondo (el alcohol debe quedar 2.5 cms por encima de la arena).
213
Cantidad a NaOH al 4% Citrato de sodio Polvo de NALC
preparar estéril al 2.9% estéril (refrigerado)
150 ml 25 ml 25 ml 0.25 g
100 ml 50 ml 50 ml 0.5 g
6- Llenar el tubo con agua destilada estéril, hasta que el nivel del líquido quede
12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinación para mez-
clar bien.
214
18- Decantar el tubo a manera de guardar el sedimento (sobre un recipiente con
desinfectante, formol al 10%). Flamear la boca de los tubos para evitar conta-
minación.
19- Con una pipeta serológica estéril, adicionar al sedimento 1.0 ml de albúmina
bovina al 0.2% (aproximadamente 20 gotas), mezclar bien a mano. Efectuar
asépticamente un frote si este no se ha hecho de esputo original, colorear con
Ziehl-Neelsen o Kinyoun.
10- Con pipeta capilar estéril, inocular dos gotas del sedimento con albúmina en
la superficie de un tubo (dos de preferencia según disponibilidad), de medio
de cultivo Lowenstein-Jensen.
11- Colocar los tubos dentro de la incubadora a 36° C, inclinados de manera que
la superficie del medio quede totalmente horizontal por 1 a 2 días para distri-
buir bien el inóculo; luego incubar verticalmente en gradilla.
12- De preferencia colocar a cada tubo un capuchón de cartulina negra para evi-
tar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapón de rosca ligeramente flojo.
215
5- Con pipeta Pasteur estéril, adicionar lentamente ácido clorhídrico 2N, hasta
obtener un color amarillo definitivo.
7- Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedi-
mento.
3- Agregar solución salina estéril para bajar el peso específico y diluir el ácido.
216
5- Decantar el líquido sobrenadante y neutralizar el sedimento con NaOH al
3.5% con 0.004% de rojo fenol.
Si el material es mucoide:
1- Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gástrico.
Si el material es fluido:
217
4- Mezclar y dejar en reposo por exactamente 15 minutos.
218
Procedimiento para otros fluidos corporales:
Si el material es muco-purulento:
Si el material es fluido:
Examinar los tubos con lupa o microscopio estereoscópico y buena luz, a los 5
días después de inoculados, y luego una vez por semana, los días lunes, para ob-
servar crecimiento. Los tubos negativos deben incubarse hasta 6 a 8 semanas, a
36° C, antes de ser descartados como negativos. Debe reportarse como negativo a
las 6 semanas; si hay crecimiento posterior debe modificarse el reporte.
219
Si se observan colonias eugónicas de color crema formadas por bacilos
alcohol-ácido resistentes (las cepas más virulentas con “factor cordón”:
forman cordones sinuosos de bacilos agrupados paralelamente), y no
produce pigmento, presuntivamente se trata de Mycobacterium tubercu-
losis.
Prueba de niacina:
220
Las colonias eugónicas no pigmentadas sobre el medio, producen niacina la
cual se difunde hacia el medio. La niacina se produce lentamente al igual que se
desarrollan las colonias. Por esta razón, la prueba sólo puede hacerse en cultivos
puros que tengan de 50 a 100 colonias (1 +), y de 3 a 4 semanas de incubación.
6- Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solución salina utili-
zada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo
“control negativo”.
7- Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de
niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que
la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos
inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeración.
221
9- Después de 12 a 15 minutos, pero no después de 30 minutos, comparar
el color de los extractos.
Grupo I:
Fotocromógenos: producen pigmento sólo cuando el cultivo se expone a la luz. En
la obscuridad producen colonias sin pigmentación, son de crecimiento lento. Ejem-
plos: Mycobacterium kansasii y Mycobacterium marinum (crece a 30°C).
Grupo II:
Escotocromógenos: producen pigmento tanto en la oscuridad como en la luz y son
de crecimiento lento. Ejemplo: Mycobacterium scrofulacem, que causa adenopatía
cervical en niños.
Grupo III:
No fotocromógenos: no producen pigmento y son de crecimiento lento. Ejemplo:
Mycobacterium avium-intracelulare.
Grupo IV:
Crecedores rápidos: se caracterizan por crecer antes de 7 días de incubación. Ejem-
plo: Mycobacterium fortuitum, puede causar tuberculosis resistente a varias drogas.
222
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Esta publicación fue impresa en los talleres
gráficos de Editorial Serviprensa C.A. de
Guatemala, C.A. en el mes de septiembre
de 1996. Esta edición consta de 1,000
ejemplares en papel bond 80 gramos.