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CASERO
OBJETIVOS
FUNDAMENTO TEÓRICO
Es vital importancia que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se mantengan
desinfectadas desde el principio del proceso de germinación. Cualquier bacteria u hongo que se
introduzca en los frascos crecerá más rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hasta
matarlas.
MATERIAL
Lejía.
Ácido clorhídrico.
Hidróxido sódico.
Lavajillas.
MEDIO DE CULTIVO: FÓRMULA DEL PLÁTANO (para 1
Reactivos litro)
100g de plátano maduro hecho puré o licuado
10 g de agar-agar.
15 g de azúcar.
900 ml de agua destilada.
1,2 g Tiamina *
Material biológico Cápsula semillas orquídea u otra semilla.
*4 comprimidos de algún remedio compuesto de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg. Puede ser
substituido por complejos polivitamínicos (Teragram M o Supradyn).
MÉTODO
Se lavan bien los frascos y tapas con jabón y lejía. Se le quitan todos los restos
de etiquetas.
1. Poner en una olla los 180 ml de agua destilada, 20g de plátano maduro hecho puré o licuado, 1 g
de azúcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se añaden 2 g de agar agar y se hierve el medio. (lo
ideal es hacerlo en el microondas o en un hornillo con agitación continua para que el agar no se
estropee). Si se hace en una olla, usar una cuchara de madera o de plástico hasta disolver todos
los componentes.
2. Mide el pH y ajústalo (usa HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo). Debe de quedar
entre 5.5 y 6.
3. Distribuye el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos, para ello utiliza un embudo de
vidrio. Ten especial cuidado en que el medio de cultivo no entre en contacto con la apertura de
los frascos, ya que esto puede ayudar a la contaminación por hongos y bacterias.
4. Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de más o menos 1 centímetro (45 a
50 ml). Por cada litro de preparado podemos llenar más o menos 20 frascos.
Los frascos se esterilizan en una olla a presión, la cual se puede considerar como un pequeño
autoclave. Nos sirve para esterilizar medios o material sometiéndolos a temperatura y presión
elevadas. Los pasos para la esterilización son los siguientes:
Se pone un pedazo de tela en el fondo de la olla (un trapo cualquiera) para impedir así que los
frascos toquen el fondo de la olla y se revienten con el calor.
Se añaden dos o tres centímetros de agua.
Colocamos los frascos (con el medio) tapados, pero sin cerrar del todo, la tapadera debe
quedar suelta o de lo contrario los botes acumularán presión y estallarán.
Cerrar y calentar en un fogón a fuego fuerte hasta que la pesa comience a moverse y liberar
vapor o el medidor marque 15 PSI.
Dejar a 15 PSI unos 20 o 30 minutos a fuego suave.
Apagar una vez trascurrido el tiempo y esperar a que la olla baje y esté totalmente enfriada.
No se debe abrir la olla antes porque la diferencia de presión o temperatura hará que entre
aire “no estéril” a los frascos, creando un peligro de contaminación.
Se dejan enfriar hasta que el medio gelifique (se solidifique) por acción del agar. Con guantes
desinfectados con alcohol, se terminan de cerrar los botes para evitar la entrada de aire no estéril.
Los frascos se pueden guardar por varios días y meses en la nevera o congelados.
-Prepara dos recipientes con agua (a la mitad de su capacidad) y uno vacío y se cubren con
tapas dobles de aluminio. Los botes se esterilizan en el autoclave o una olla a presión. Dejar
enfriar todo el material. La esterilización se puede hacer en el microondas (5-10 min) pero en
este caso los frascos se tapan con papel film. Dejar enfriar antes de usarlo para la
esterilización de las semillas.
-Las semillas se envuelven en una gasa y se sumergen en una solución 50% lejía con unas
gotas de lavavajillas. El tiempo que deben estar en lejía es variable, puede ser de 10 a 30 min
según el tipo de semilla. Como termino medio se tienen 15 min y después comprobar (si nos
pasamos no germinan y si las tenemos poco tiempo se contaminan).
- Pasa las semillas por los dos botes de agua estéril, 5 minutos mínimo en cada bote, para
eliminar la lejía de su superficie. Este paso debe hacerse en condiciones de esterilidad
ambiental, trabajando cerca de la llama del mechero para evitar la caída de esporas en las
semillas o en el medio y lo contamine. Las pinzas metálicas deben ser flameadas antes de su
uso.
Si las cápsulas están cerradas, se esterilizan la cápsula entera en lejía, se esterilizan el bisturí y la
espátula en el mechero de alcohol y se corta la cápsula con el bisturí cerca de la llama, antes de
introducirlas en los frascos.
- Limpia la superficie de trabajo con lejía. Sí tienes el pelo largo recógelo y, si es posible, ponte una
mascarilla para que este todo prefecto. Hay que trabajar con mucho cuidado y muchísima limpieza.
Los frascos muy fácilmente se contaminan con hongos.
- En todo momento trabajaremos cerca del mechero. Las semillas se pasan del recipiente con agua a
los botes con el medio con una pinza que previamente hemos flameado con etanol para esterilizarla.
Abre cuidadosamente un poco el bote, sin destapar el bote del todo, y coloca las semillas sobre el
medio de cultivo. Este paso debe hacerse cerca de la llama del mechero. Cierra rápidamente la tapa
para que no entre ningún microrganismo.
-Una vez se han puesto de 4 o 5 semillas por bote. Se cierran los frascos herméticamente cerca del
mechero y se sellan con cinta adhesiva o film de parafina. Etiqueta los botes con la fecha y tipo de
semilla cultivado, también puedes anotar los nombres de los componentes del grupo.
-Estos botes se mantienen en oscuridad hasta que se observe la germinación de la semilla, que puede
tardar de uno a diez días.
- En ese momento, se colocan los frascos en un sitio con bastante luz, pero sin sol directo a
temperatura constante (de unos 22-24 ºC) evitando una exposición directa al sol, sin embargo son
necesarias de 16 a 18 horas de luz al día, así pues, será preciso prever una iluminación de apoyo
como un fosforescente.