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Nº5 MICROPROPAGACION DE 0RQUIDEAS.

I.-ANTECEDENTES HISTORICOS. Hardley ( 19829) llegó a la conclusión que las orquídeas obtenian los hidratos de carbono de los hongos. Pero está lejos de la realidad. Sin embargo se ha comprobado que las orquídeas reciben a veces aminoácidos ( glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico y ácido nicotínico) provenientes del hongo. (Hyner y Arditti 1973). Knudson ( 1922), demostró que era posible la germinación sobre un medio simple que contuviera minerales y azúcartes, sin la presencia de hongos. La investigación desarrollada por Knudson (1922) supuso una conmoción en el mundo de las orquídeas, al demostrar que las semillas de Cattleya, Epidendrum y otras orquídeas eran capaces de germinar asimbióticamente in vitro. A pesar del descubrimiento de Knudson, se comprobó que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada especie de orquídea pueda germinar y desarrollar..Se han descrito muchos medios nutritivos, para muchos géneros y especies diferentes (Arditti,1967, 1982, Arditti y Ernst, 1982 y Fast, 1980). Razones por las que no puede germinar: 1.-Las semillas de orquídea son muy pequeñas y alimenticia. 2.-La germinación y el subsiguiente desarrollo de la plántula, dependen en la naturaleza de la relación simbiótica con un hongo, sin embargo, en in vitro es posible sustituir la acción del hongo por un medio nutritivo, a esta germinación se denomina asimbiótica. 3.-La siembra in vitro permite germinar embriones inmanduros de orquídea, disminuyendo su ciclo de mejora. 4.-La germinación y el desarrollo es más eficiente en in vitro, ya que se realiza en un ambiente acondicionado, y sin competencia con hongos y bacterias. contienen poco o nada de reserva

En el extremo distal del embrión existe un punto de crecimiento potencial. Harley (1969) y Pierik ( 1982) se puede describir de la siguiente forma: El embrión absorbe agua a través de la testa.2 II. Las semillas constan de una testa gruesa.DESCRIPCION DE LAS ORQUIDEAS2. que encierra un embrión de alrededor de 200 células. y sobre aquel se puede distinguir un meristemo del vástago. A continuación se forma una estructura de tipo protocormo. según Arditti (1967). rompiendo el embrión la cubierta seminal. Se producen en cantidades elevadas por cápsula : 1300 -4 000 000. que es diferente para cada especie. Luego se diferencia los órganos ( meristemo del vástago en un lado y rizoides en el opuesto).. Si el protocormo está expuesto a la luz. 2.2.. en forma de red. de tal forma que cada semilla puede ser considerada como un auténtico globo. Después se inicia la división celular.La cubierta tiene un aspecto exterior característico. no identificable en el estado de semilla.1. a partir del agregado de células.La testa está formada por un tejido muerto. comienza un período de crecimiento intenso. aumentando de volumen. adquiere el color verde y al mismo tiempo se desarrolla hojas. La mayor parte de las semillas de orquídeas están escasamente diferenciadas: No se distinguen cotiledones ni raíces y carecen de endospermo. Las semillas de orquídeas son muy pequeñas.-LA GERMINACION DE LAS SEMILLAS. Luego se forman las raíces verdaderas en forma endógena.-LAS CARACTERISTICAS ANATOMICAS DE LAS SEMILLAS. Posteriormente el protocormo y los rizoides pierden su misión nutritiva y desaparecen.5-1mm de ancho. La germinación de las semillas de orquídeas. El embrión tiene una forma redondeada o esférica. . compuesto hasta en un 96% de aire. 1-2mm de largo y 0.Como resultado de la formación de la clorofila de planta se hace autótrofo.

2. 3.El mismo recomienda que las semillas no se deben sembrar in vitro.-ESTERILIZACION.4. mientras que los no viables quedan blancos). Lucke (1971) afirmó que. antes de que la cápsula haya llegado a los dos tercios de su madurez. Odontoglossum 7 meses 2. La esterilización se realiza de dos formas: 1. la prueba clásico del tetrazolio. al final.-Inmersión en agua estéril durante 24 horas.-En este caso la esterilización es muy simple: . Calanthe Cattleya Coelogyne Dendrobium Epidendrum Miltonia Phalaenopsisi 4 meses 11 meses 13 meses 12 meses 4 meses 9 meses. cuya viabilidad se determina bajo tres etapas: 1.-Preparación de la semilla en una solución al 5% de Ca (0Cl)2 más 1% tween 80.3 2. puede ser utilizado para determinar la viabilidad de las semillas de orquídeas tropicales epífitas.3. Sing (19819) demostró que el test del tetrazolio ( los embriones viables se tiñen de rojo.En la tabla que se da a continuación (Lucke 1971) se indican los períodos de tiempo entre la fertilización y la madurez. 6 meses. Van Waes y Debergh (1986) han demostrado que el método Sing no puede ser aplicado a las orquídeas del oeste de Europa. Se aconseja almacenar las semillas maduras a 5°C ( Fast 1980). las semillas de orquídea se pueden sembrar cuando la semilla se encuentra en el estadío intermedio entre la fertilización y la maduración de la cápsula.-METODOS DE LA PRUEBA DE LA VIABILIDAD. en principio.-CAPSULAS CERRADAS.-Aplicación.

ya que las semillas crecen así mejor que cuando están aislados.-LA SIEMBRA. . Para ser trasplantado al suelo. la germinación es baja.La esterilización se realiza durante 5-10 minutos.La esterilización de las semillas individuales constituye un proceso más delicado y complejo. 2. posteriormente se aclaran las semillas con agua esterilizada.Se utiliza una espátula aguja de siembra para distribuir las semillas de forma uniforme sobre el medio. La cápsula que contiene las semills. Cuando las orquídeas se trasplantan al suelo. es necesario repicar las plántulas de orquídeas dos a tres veces. El tiempo que las orquídeas permanecen en el tubo es muy variable : entre 6 meses y 2 años. es influida por la concentración de ABA de las semillas: De manera que si la concentración de ABA es alto.1982). bien por vertido. Las orquídeas in vitro se refieren en grupos. luego se abre con una escapel estéril. La densidad a la que se siembran dependen de la proporción de las semillas viables y también de la especie de orquídea de que se trate. Van Der Kinderen (1982) indica que la germinación de algunas orquídeas. que generalmente está estéril en su interior.5.4 Se baña la cápsula en alcohol de 96% y posteriormente se flamea. o con la ayuda de una pipeta. El medio en el que se repican es generalmente diferente de la siembra. Sin embargo. mientras los que flotan. también se pueden suspender las semillas en agua estéril y hacer la siembra por medio de una gota (Arditti. no contienen embrión.. El repicado es necesario. Las semillas se siembra sobre el agar.Se colocan las semillas en un pequeño matráz conteniendo lejía al 10% t Tween 20 en una proporción de 2-5 % (v/v). Las semillas viables se hunden en la lejía.Después de la fertilización el líquido es retirado. Smith (1975) afirmó que la cubierta seminal no tiene efecto inhibidor sobre la germinación. generalmente se llevan en macetas madre.-CAPSULAS ABIERTAS. La siembra se realiza generalmente sobre un medio nutritivo sólido con una cierta pendiente. 2. sino se realiza las plantas llegan a estar demasiado apretados y el crecimiento es lento.

6 . Un pH más bajo de 4 o más alto de 7 resulta muy desfavorable. 2. Las orquídeas terrestres requieren un medio. especialmente para las semillas que germinan en la oscuridad. Fast (1980) Hadley (1975. Por lo general se emplea Sacarosa. de las plántulas de endrobium.8-5.Se utiliza el homogenizado de plátano. 3. mientras las epífitas necesitan un medio más rico en sales. Thomale (1957) y Zimmer (1980). triptona. vitamina C.25°C. Cattleya y otros.5 2.La duración del día es de 12-16 horas ( tubos fluorescentes) se aconseja una irradiación baja de 2. Las Revistas American orchid Society bulletin. Arditti y Ernst (1982)..-Las semillas germinan a 20. jugo de piña. 7. peptona.. Concentraciones bajas de IBA y NAA. 4. 1982). piridoxina.-AZUCAR.-EL pH debe situarse entre 4.-AGAR. 5.5-10 w/m2.8 % (Bacto-Agar-Difco). 8.1982). Los factores complejos que influyen la germnación y el crecimiento de orquídeas.1977. Leche de coco. Harley (1969) .-MINERALES.-Es necesario añadir las siguientes vitaminas : biotina.Esta información se ha recopilado con la ayuda de los siguientes artículos: Arditti (1967. Las orquídeas generalmente necesitan Fe para germinar y es muy probable que necesite Mn.-La temperatura. 6.-La concentración recomendada es de 0. a veces estimulan el crecimiento . jugo de tomate y extracto de patata. 1. die orquidae.6. Hidrolizado de caseína.-Se recomienda utilizar un medio que contenga micro-macronutrientes. 9.-VITAMINAS.-FACTORES QUE AFECTAN A LA GERMINACION Y AL CRECIMIENTO.0. a veces se utiliza una mezcla de glucosa y fructosa.8 .Generalmente no son necesarios para la germinación de las semillas y su presencia puede producir efectos no deseados ( Formación de callos ..-MEZCLAS COMPLEJAS.-LUZ. Levadura de fermentación. pobre en sales. ácido Nicotínico.Los efectos estimuladores de estas mezclas se explica por su contenido en vitaminas y aminoácidos. Rao (1977). o vástago Adventicio) .-Es importante como fuente de energía. además dependen en gran medida de la especie.-LOS REGULADORES. ácido pantoténico.

Semillas provenientes de cápsulas dehiscentes. -Medio Knudson C (1946) -Agar -Gel-Rite. Brotes vegetativos de 5-15 cm de longitud. -Sucrosa -Tiamina -Carbón activado -Kinetina -Alcohol etilico al 96% -Hipoclorito de calcio -Hipoclorito de sodio al 10% -Teween 20 -Trifenil tetrazolium -Tubos de ensayo -Tapones de tubos -Macetas de plásticos y arcilla. a.-MATERIALES VEGETALES.OBJETIVOS. -Carbón vegetal -Polipropileno. b. IV.-MATERIALES Y METODOS. -Musgo . A.MATERIALES.-REACTIVOS Y OTROS. Frutos inmaduros (cápsulas)... -Sales Nutritivas Básicas del medio de cultivo Murashige Skoag (1962).6 III.

Se utiliza el Hipoclorito de calcio ó sodio al 2%. Pasado este tiempo el sobre es trasladado a agua destilada estéril para el enjuague. Los explantes sembraron en medio basal de Murashije y Skoog (1962).Los brotes fueron lavados con una escobilla suave. 2g/L de Carbón activado. . 0. Se enjuaga con agua destilada estéril y se ubican en placa estéril . Se aplican las técnicas de cultivo in vitro en la propagación de las especies de orquídeas. Luego se procede a sembrar las semillas en condiciones asépticas en el medio basal de Muraashige y Skoog (1962). a partir de semillas (Arditti. Se hicieron dos esterilizaciones superficiales. 1995).-PROPAGACI0N POR YEMAS DE BROTES VEGETATIVOS. El aislamiento de las yemas de brote vegetativo se realiza mediante cortes laterales a las yemas expuestas. Se eliminaron los restos de tejidos muerto que podría ser fuente de contaminación.4mg/L de Tiamina. Pasado este tiempo el brote se ubica en una placa petri estéril y se eliminan las hojas envolventes descubriendo las yemas. 2g/L de Carbón activado.-SIEMBRA DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CAPSULA DEHISCENTE.1984) de la siguiente manera.( León Fernández Marco 1995). Se colectaron brotes vegetativos de Cattleya Máxima y Cattleya Rex en pleno crecimiento de 5 a 15 cm de longitud. 2g/L de Gel-Rite o 8g/L de Agar y 20g/L sucrosa. y en el medio Knudson C suplementado en 20 g/L de sucrosa.5mg/L de Acido nicotínico. Se realiza la segunda esterilización de los brotes sumergidos por 10 minutos en una solución de Hipoclorito de sodio al 2% a la cual se agregó 2 gotas /l00 ml de tween 20. Para su esterilización las semillas pueden colocarse en un pequeño sobre de papel de filtro bien cerrado. mediante el corte en la parte basal. agua y detergente para luego ser sumergido por unos segundos en alcohol al 75 %. 1982) y de yemas (Marel. León Fenández.En la primera esterilización los brotes fueron sumergidos por 20 minutos en una solución de Hipoclorito de sodio al 4% a la cual se agregó Tween -20 (2 gotas/100ml). 1.(Tesis.7 METODOS. 2g/L de Gel-Rite o 8g/L de Agar . 2. a fin de evitar que se pierdan las semillas durante el enjuague. durante 15-25 minutos. suplementado con 0.

2. V.uk/microprop. El sustrato en el que se sembraron las plántulas fue una mezcla de musgo y pequeños trozos de carbón 3 partes de musgo: 1 parte de carbón) que permite una buena retención de humedad y a la vez un buena ventilación de las raíces. 3.T Hartmann. Luego de ser sembrados las plántulas se trasfieren a la cámara de Aclimatación que esta condiocionado para proporcionar una alta humedad y evitar su deshidratación. fueron extraídos de los frascos y sometidos al proceso de aclimatación.BIBLIOGRAFIA. CONSERVACION DE ESPECIES PERUANAS DE ORQUIDEAS UTILIZANDO TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS IN VITRO . Encyclopaedia of cultivated Orchids. 5. D. 4. HAWKES ..6ta Edición. Las plantas fueron retiradas de los frascos limpiados y lavados eliminando el agar adherida a las raices.-PIERIK R.-PREPARACION DE LAS PLANTULAS. Luego del segundo replante. medianos y pequeños. Cultivo in vitro de las plantas superiores. 2.-SIEMBRA. (Tesis León Fernández.. 3.F. Marco A.rbgkew. Se eliminan las raíces delgadas que podría ser una vía de infección para la plántula. 1997.-H.-ALEX D.L.1995. http:/grffin. Royal Botanic Gardens. 1. cuando las plantas desarrollaron varias hojas y un buen sistema radicular.-MICROPROPAGACION.M. 1995). Plant Propagation Principles and Practices.E Kester. 1989.-PREPARACION DEL SUSTRATO.org. 1.8 ACLIMATACION DE LAS ORQUIDEAS.-LEON MARTINEZ. Se sembró por grupos en macetas comunitarios cuyo tercio inferiior fue llenado con pedazos pequeños de polipropileno y dos tercios superior rstante con el sustrato estéril (Wright-Tippit. TESIS. davies. Se seleccionaron plántulas por tamaños: Grandes. 1994).T. Kew: Information sheets: . Este sustrato fue esterilizado en una estufa a 80°C por 6 horas.

. http:/aggie-horticulture.9 6.-THE Many Dimensions of Plant Tissue Culture Research.tamu.edu/tissult/pltissue/pltissue .

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