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TEMA 2: ANLISIS DE LA GLUCEMIA Y PARMETROS

RELACIONADOS

1. Alteraciones del metabolismo glucdico, la diabetes (clasificacin,


sntomas y diagnstico).
2. Glucemia basal.
3. Pruebas de sobrecarga: Curva de glucemia y Test de O'Sullivan.
4. Determinaci n de glucosa: mtodos.
5. Otras pruebas: anlisis de protenas glicosiladas, pptido C, glucosuria,
insulinemia y determinacin de cuerpos cetnicos.
Apndice: Cromatografa.

Introduccin

Los hidratos de carbono son compuestos orgnicos formados


fundamentalmente por C, O e H a partir de los cuales se puede obtener
energa con gran rapidez y que aportan, aproximadamente, el 50% de las
caloras que recibimos de la dieta.

Se ingieren en forma de polisacridos (ej. almidn), disacridos (ej.


sacarosa y fructosa) o monosacridos (ej. glucosa y galactosa). En
cualquier caso, se desdoblan en el intestino hasta obtener monosacridos
que son absorbidos y transformados en glucosa a nivel heptico.

Los niveles de glucosa en sangre (glucemia) se mantienen dentro de unos


lmites muy estrechos y constantes gracias, fundamentalmente, a la accin
de dos hormonas: la insulina (hipoglucemiante) y el glucagn
(hiperglucemiante). As, tras la ingestin aumenta la glucemia pero, en las
personas con un correcto metabolismo hidrocarbonado, estos niveles
descienden rpidamente (gracias a la liberacin de insulina) de manera que
tras 1,5-2 horas la glucemia vuelve al nivel basal.

1. Alteraciones del metabolismo glucdico , la diabetes

Aunque las patologas relacionadas con alteraciones del metabolismo


glucdico son muy diversas, vamos a centrarnos en los trastornos en la
regulacin del nivel de glucosa en sangre

Cuando la homeostasis de la glucosa se rompe por disfuncin de cualquier


elemento que la mantiene, sobrevienen los sndromes hiper o
hipoglucmicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento
(>120 mg/dL en ayunas) o la disminucin (<45-50mg/dL) de la glucemia,
respectivamente.

1.1. Diabetes mellitus

La diabetes mellitus es la causa ms frecuente y grave de hiperglucemia. Es


una metabolopata crnica que aparece como consecuencia de la deficiencia
absoluta o relativa de insulina. En estas condiciones, la entrada de glucosa
en las clulas est disminuida y en consecuencia los niveles en sangre se
mantienen elevados (hiperglucemia). Esta deficiencia da lugar a una serie

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de complicaciones a largo plazo, lo que origina una gran morbilidad y
mortalidad.

Existe otro tipo de alteracin denominada disminucin de la tolerancia a la


glucosa o tolerancia anormal a la glucosa que se caracteriza por valores de
glucemia intermedios entre los normales y los de los diabticos.

1.1.1. Clasificacin:
Actualmente la diabetes se clasifica en:
Diabetes tipo I (dficit total de insulina).
Diabetes tipo II (resistencia a la insulina o defecto secretor con
resistencia a la insulina, los enfermos al principio no requieren la
administracin de insulina).
Diabetes secundaria (enfermedades pancreticas, tumores
endocrinos).
Diabetes gestacional (se detecta durante el embarazo).

1.1.2. Sntomas
La diabetes cursa con polifagia, polidipsia, poliuria, disminucin del peso
corporal, hiperglucemia y en ocasiones glucosuria.

1.1.3. Diagnstico

Las pruebas ms utilizadas para el diagnstico de la diabetes se basan en la


demostracin de una tolerancia anormal a la glucosa. Concretamente se
suele:
Determinar la glucemia basal
Realizar pruebas de provocacin o sobrecarga en las que se
administra al paciente una cantidad conocida de glucosa y se analiza
la evolucin de la glucemia. Entra estas pruebas se incluyen la curva
de glucemia y el test de OSullivan.

Se considera diabetes si se cumple alguno de los tres puntos que se citan a


continuacin:
Nivel de glucemia > 200 mg/dL acompaado de los sntomas tpicos
de la enfermedad.
Glucemia en ayunas > 140 mg/dL, obtenida en dos ocasiones
Glucemia en ayunas entre 110 y 140 mg/dL y dos curvas de glucemia
positivas

2. Determinacin de la glucemia basal

Esta prueba consiste en determinar la glucemia tras un ayuno de 10-16h).


En general se considera que:
Valores menores de 110 mg/dL son normales.
Valores entre 110 y 140 mg/dL son dudosos y deben ser
confirmados.
Valores mayores de 140 mg/dL son probablemente indicativos de
diabetes.

3. Pruebas de sobrecarga: curva de glucemia y test de OSullivan

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3.1. Curva de glucemia
Esta prueba se realiza para comprobar definitivamente el diagnstico de la
diabetes y es obligatoria cuando la glucemia basal es dudosa.
Consiste en la medicin de la glucemia en ayuno y a intervalos regulares
tras una sobrecarga de glucosa.

Concretamente hay que considerar los siguientes aspectos:


Durante los tres das previos a la prueba el paciente debe tener una
dieta sin restriccin en hidratos de carbono (de al menos 150g de
hidratos de carbono/da).
Se realiza por la maana, despus de 10-16h de ayuno.
Se obtiene una muestra de sangre en la que se determinar la
glucemia basal.
Se administra (va oral) al paciente 75g de glucosa disueltos en
saborizante. (en nios la dosis se ajusta en funcin de su peso 1.75g
glucosa/Kg)
Se extrae sangre cada 30 minutos durante 2h (puede variar en
funcin del protocolo) para evaluar la modificacin de la glucemia a lo
largo del tiempo.
Cualquier nausea o vmito debe ser anotado.

En la imagen inferior se han representado 2 curvas correspondientes a un


paciente sano, diabtico y con disminucin de tolerancia a la glucosa.

En un paciente sano: en ningn momento se superan los 200mg/dL

En un paciente diabtico: la glucemia a las 2 horas es superior a 200 mg/dL


y al menos otro valor intermedio es tambin superior a 200 mg/dL.

En un paciente con tolerancia anormal a la glucosa:


la glucemia basal es inferior a 140mg/dL
en la curva de glucemia el punto final es superior o igual a 140 mg/dL
pero inferior a 200 mg/dL, pero algn punto intermedio es superior a
200 mg/dL.

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3.2. Test de OSullivan

Esta prueba se realiza rutinariamente en mujeres embarazadas


(aproximadamente a las 23 semanas de gestacin) como screening inicial
para detectar diabticas gestacionales.
Consiste en determinar la glucemia basal y 1 hora tras la ingestin, va oral,
de 50g de glucosa disueltos en saborizante. Si la glucemia tras 1 hora
supera los 140mg/dL es posible que exista diabetes gestacional aunque es
imprescindible realizar una curva de glucemia para confirmar el diagnstico.

4. Determinacin de glucosa: mtodos.


De todo lo anterior se deduce que para el diagnstico de la diabetes es
necesario determinar la glucemia, pero cmo se cuantifica el nivel de
glucosa en una muestra?

Los mtodos para determinar la concentracin de glucosa se clasifican en


dos grandes grupos:

a) Mtodos basados en el poder reductor de los hidratos de


carbono (reaccin de Benedict, mtodo de la o-toluidina)

b) Mtodos enzimticos: son los ms utilizados, utilizan enzimas


como reactivos (ej. glucosa oxidasa, hexoquinasa) a fin de aumentar
la especificidad. Los dos mtodos que vamos a citar se pueden
utilizar para determinar la glucosa en muestras de suero, orina y
lquido cefalorraqudeo

b.1.) Mtodo de la hexoquinasa: Es el mtodo de referencia y


consiste en dos reacciones acopladas.

En la primera reaccin (especfica), catalizada por la enzima


hexoquinasa, se fosforila la glucosa formndose glucosa 6-fosfato. La
glucosa 6-fosfato, en una reaccin posterior (reaccin indicadora), se
transforma en 6-fosfogluconato producindose NADPH (1 mol por cada
molcula de glucosa). La produccin de NADPH origina un aumento de
absorbancia a 340nm. El incremento de absorbancia a esta longitud de
onda ser directamente proporcional a la concentracin de glucosa.

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b.2.) Mtodo de la glucosa oxidasa: Al igual que el anterior consiste
en dos reacciones acopladas

En la primera reaccin (reaccin especfica), catalizada por la enzima


glucosa oxidasa (GOD), se oxida la glucosa y se genera H2O2 . En la segunda
reaccin (reaccin indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza la
descomposicin del H2 O2 lo que provoca oxidacin de un cromgeno que
pasa de su forma reducida (incolora) a su forma oxidada (coloreada). La
aparicin del cromgeno oxidado se evala mediante un espectrofotmetro
y ser directamente proporcional a la concentracin de glucosa en la
muestra.
Este mtodo (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos
compuestos presentes en el suero u orina (bilirrubina, cido ascrbico y
cido rico) pueden ser oxidados por el H2 O2 producido en la reaccin
catalizada por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado (se da
un resultado superior al real).
Tambin se puede cuantificar la concentracin de glucosa de la muestra
utilizando slo la primera reaccin y evaluando la cantidad de oxgeno
consumido mediante un electrodo de oxgeno (lo estudiaremos ms
adelante). La cantidad de glucosa en la muestra es directamente
proporcional a la cantidad de oxgeno consumido.

Aspectos prcticos a considerar cuando se analiza la glucemia:


1. Centrifugar la sangre lo antes posible: los eritrocitos y leucocitos
consumen glucosa, por tanto , si el contacto con las clulas es
prolongado se pueden dar resultados falsamente bajos (a T
ambiente puede incluso desaparecer al cabo de 6h). Actualmente,
existen tubos con separador de suero que funciona como una
interfase entre las clulas y el suero despus de la centrifugacin,
haciendo que no sea necesario separar el suero en otro tubo.
2. Si no se van a analizar inmediatamente, se puede refrigerar la
muestra o aadir un conservante ej. Fluoruro sdico.
3. La concentracin de glucosa en suero refrigerado es estable durante
3 das.

5. Otras pruebas: anlisis de protenas glicosiladas, pptido C,


insulinemia y determinacin de cuerpos cetnicos, glucosuria.

5.1. Anlisis de protenas glicosiladas


Las protenas que estn en contacto con concentraciones elevadas de
glucosa durante un tiempo prolongado se glucosilan (unin covalente de
glucosa a las protenas) generando protenas glicosiladas o glucosiladas.

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La glucosilacin depende de la concentracin de glucosa y de la vida media
de las protenas. Puesto que la hiperglucemia es caracterstica de la
diabetes, la determinacin de protenas glucosiladas se utiliza como
indicador restrospectivo del control de la diabetes.
En el laboratorio clnico se suelen analizar la glucohemoglobina y
fructosamina.

5.1.1. Glucohemoglobina
La glucohemoglobina es una fracci n de hemoglobina A (principalmente
A1C ) unida, de forma irreversible a la glucosa, que representa, en
condiciones fisiolgicas un 6-8% de la hemoglobina total.

La vida media de la hemoglobina es de aproximadamente 2 meses, por


tanto su cuantificacin nos puede indicar el cumplimiento del tratamiento o
el grado de control de la diabetes durante ese perodo de tiempo (la
elevacin de glucohemoglobina coincide con elevaciones de la glucemia en
los dos meses anteriores).

Es una prueba muy especfica pero que no se utiliza para el diagnstico


puesto que es poco sensible. Los valores de personas sanas se solapan con
los de aquellos que tienen intolerancia a la glucosa y los de stos con los de
los pacientes diabticos. En general valores superiores al 12% indican un
control deficiente de la diabetes.

La determinacin se suele hacer con bemolizado de eritrocitos, para ello:

1. La sangre se recoge con EDTA como anticoagulante.


2. Se centrifuga (ej. 5 min a 3000 rpm)
3. El sedimento (pellet) se resuspende en solucin salina (ClNa 0.9%) y
se vuelve a centrifugar. Este paso se repite varias veces (se lava el
sedimento).
4. Se lisan los eritrocitos ej. se aade agua destilada y cloroformo se
agita enrgicamente y se centrifuga de nuevo. El sobrenadante es el
bemolizado de eritrocitos.

Los mtodos de determinacin ms utilizados son:


1. Mtodos cromatogrficos (HPLC, cromatografa de intercambio inico,
cromatografa de afinidad). Ver el apndice del tema
2. Mtodos inmunolgicos con lectura por turbidimetra (se estudiar en
el tema siguiente).
3. Electroforesis (se estudiar en el tema siguiente).

5.1.2. Fructosamina
Las protenas plasmticas tambin se glican y, puesto que la vida media
de la albmina y protenas plasmticas oscila entre 17 y 30 das, su
determinacin nos informa de la tasa de glucemia del paciente en las 2-3
semanas previas a la determinacin (perodo ms corto que la
glucohemoglobina).
Puesto que la albmina es, con diferencia, la protena srica ms
abundante realmente se evala la albmina glucosilada.

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Mtodo de determinacin: mtodo colorimtrico (espectrofotomtrico)
basado en la reduccin del colorante nitroazul de tetrazolio (por accin
de la fructosamina).

Fructosamina + nitroazul de tetrazolio reduccin del colorante


Lectura en espectrofotmetro (530nm)

5.2. Pptido C

El pptido C es el resto de cadena polipeptdica que se escinde de la


proinsulina al convertirse en insulina. Su aparicin en sangre nos indica
que las clulas secretoras de insulina son funcionales.

Puesto que los preparados comerciales de insulina no llevan pptido C,


permite conocer por ej. si una hiperinsulinemia es de origen exgeno o
endgeno . Adems, es frecuente que los pacientes diabticos desarrollen
anticuerpos antiinsulnicos que interfieren en los ensayos inmunolgicos
para la cuantificacin de insulina, por tanto, se utiliza como alternativa al
anlisis de insulina para valorar el funcionamiento de las clulas .

Mtodo de determinacin: Inmunoanlisis (lo estudiaremos ms


adelante en el tema) ej. RIA (radioinmunoanlisis).

5.3. Insulinemia
La determinacin de insulina no suele hacerse de forma habitual puesto
que su presencia no asegura que sta sea funcional. Sin embargo, s es
til en las hipoglucemias (ej. insulinemia elevada cuando la glucemia es
baja puede indicar la existencia de un tumor productor de insulina).

Mtodo de determinacin: Inmunoanlisis (lo estudiaremos ms


adelante en el tema) ej. RIA o EIA (enzimoinmunoanlisis).

5.4. Determinacin de cuerpos cetnicos


En la diabetes, la deficiencia de glucosa en las clulas, activa el catabolismo
de los cidos grasos generando mucha acetilCoA. El exceso de acetilCoA da
lugar a la produccin de cuerpos cetnicos (cetognesis): acetoactico, y
sus derivados acetona y -hidroxibutirato que aparecern en sangre
(cetonemia) y orina (cetonuria).

Cetonemia
Diabetes Liplisis Acidos grasos Cetognesis
Cetonuria

Es una prueba complementaria que corrobora el diagnstico de la diabetes


tipo I.

Determinacin:
Aunque existen otros mtodos (ej. enzimticos), el ms empleado es su
determinacin colorimtrica mediante la prueba del nitrofrerricianuro de

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sodio. Este procedimiento no detecta -hidroxibutirato y es mucho menos
sensible para la acetona que para acetoactico.
El fundamento de este mtodo consiste la aparicin de un color rosado o
purpreo al reaccionar, fundamentalmente el acetoactico, con ferricianuro
de sodio en medio alcalino. La prueba se puede llevar a cabo con una tira
reactiva o una tableta slida.

Muestra: suero, plasma u orina.


Precauciones:
Las orinas coloreadas o las muestras hemolizadas pueden dar falsos
negativos.
La contaminacin bacteriana de la orina aumenta la desaparicin.
La acetona es voltil por tanto, la muestra debe refrigerarse.

5.5. Glucosuria
La glucosa se filtra en el glomrulo pero es reabsorbida en los tmulos
renales con lo que vuelve de nuevo a la sangre y no debe aparecer en orina.
Sin embargo, si la glucemia es superior a 160mg/dL se supera el umbral
renal para la glucosa y sta aparece en la orina (glucosuria).

La glucosuria tiene escaso valor puesto que es poco especfica ej. tambin
aparece en patologas cardiacas o renales

Determinacin: se utiliza el mtodo GOD/POD en tiras reactivas.

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Apndice
CROMATOGRAFA

La cromatografa agrupa un importante grupo de tcnicas que permiten


separar componentes de mezclas complejas.
En todas las separaciones cromatogrficas la muestra que se desea separar
se disuelve en la "fase mvil" que normalmente est formada por un gas o
un lquido. La fase mvil se hace pasar a travs de una "una fase
estacionaria", la cual se mantiene fija en una columna o en una superficie
slida que acta como soporte.
NOTA:
Fase mvil: aquella en la cual estn los solutos que se van a separar
Fase estacionaria: lecho a travs del que fluye la fase mvil
Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase mvil. Los componentes con baja afinidad
por la fase estacionaria se desplazan con ms rapidez al ser arrastrados por
la fase mvil.
Una vez que todos los componentes han atravesado la fase estacionaria,
salen separados unos de otros lo que permite utilizar las fracciones en
procesos de identificacin o cuantificacin.

FASES DEL PROCESO CROMATOGRFICO


1. Preparacin de la fase estacionaria
2. Introduccin de la muestra vehiculada por una fase mvil
3. Paso a travs de una fase estacionaria donde se producen las
interacciones que ms tarde llevarn a su separacin
4. Elucin (segn en que tcnica)
5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma

MECANISMOS IMPLICADOS
1. Adsorcin
2. Reparto
3. Intercambio inico
4. Exclusin molecular
5. Afinidad
Cromatografa de adsorcin: poco usada en clnica
Cromatografia de reparto: basada en las diferencias de solubilidad de las
distintos analitos en dos fases inmiscibles Ejemplo: cromatografa en capa
fina (ver la figura):
Sobre un cristal u otra superficie se deposita una suspensin
uniforme de partculas (ej gel de slice) que ms tarde se seca y activa. En
dicha placa se aplica la muestra y se deja secar.
Se introduce la placa en una cmara en cuyo fondo hay un disolvente
que va subiendo por capilaridad y arrastrar a los componentes de la
mezcla en funcin de la solubilidad de los mismos en la fase mvil.
Se deja hasta que el frente llegue al final

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Los resultados se visualizan por ejemplo por tincin con colorantes.
Aparecern unas manchas que se pueden identificar mediante el uso de
patrones o cuantificar mediante densitometra o raspado de las manchas,
disolucin y determinacin espectrofotomtrica.

Cromatografia de intercambio inico: basada en un mecanismo

electrosttico por atraccin entre iones de distinta carga. En el laboratorio


clnico se utiliza en analizadores de aminocidos, separacin de Hb,
isoenzimas y esteroides.

Cromatografia de exclusin molecular: basadas en la diferencia de


tamao de las distintas sustancias a separar. En clnica se utiliza para
purificaciones ej de hormonas.

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Cromatografia de afinidad: basada en mecanismos que implican
interacciones especficas entre dos molculas como uniones enzima-
sustrato, hormona-receptor, antgeno-anticuerpo.

HPLC o cromatografa lquida de alta presin (resolucin): es un


sistema de cromatografa en columna (la fase estacionaria se deposita en
una columna) con un sistema inyector de la muestra y un impulsor de la
fase mvil que acelera el proceso

Preguntas de revisin

a) Espectrofotometra

1. Qu expresin matemtica define la relacin entre la concentracin


de una sustancia y su absorbancia?

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2. Para trabajar en la zona UV por debajo de 320 nm se precisan
cubetas de:
a) Vidrio
b) Poliestireno
c) Polietileno
d) Cuarzo
e) Plstico
3. Un blanco de suero se emplea:
a) Cuando tenemos prisa
b) Cuando queremos eliminar interferencias por el reactivo
c) Cuando queremos eliminar interferencias por el suero
d) Cuando queremos eliminar interferencias de la fuente de luz
e) Cuando hay que hacer una curva de calibracin
4. Un blanco de reactivo se emplea:
a) Cuando tenemos prisa
b) Cuando queremos eliminar interferencias por el reactivo
c) Cuando queremos eliminar interferencias por el suero
d) Cuando queremos eliminar interferencias de la fuente de luz
e) Cuando hay que hacer una curva de calibracin
5. Desviaciones de la ley de Beer (desviaciones en la relacin lineal
entre concentracin de una solucin y absorbancia) se producen cuando:
a) Se miden concentraciones muy elevadas de cromgeno
b) La radiacin incidente no es monocromtica
c) La luz es transmitida por otros mecanismos
d) La cubeta est sucia
e) Todos los anteriores
6. La curva de calibracin:
a) Describe la relacin entre transmitancia y absorbancia
b) Describe la relacin entre absorbancia y concentracin
c) Describe la relacin absorbancia y velocidad de reaccin
d) b y c son correctas
7. La longitud de onda a la que se mide una reaccin es:
a) Aquella a la que el cromgeno tienen menos absorcin
b) Aquella a la que el cromgeno tiene el mximo de absorcin.
c) Aquella a la que la lmpara da ms luz.
d) Aquella a la que se lee ms deprisa
8. Construya una curva de calibracin para una tcnica de
determinacin de glucosa en suero con los siguientes datos:

A Concentracin (mg/dl)
0.05 50
0.1 100
0.150 150
0.250 250
0.500 500
0.600 800

A partir de ella:
a) Calcule la concentracin de glucosa en un suero que da una lectura de
0.125
b)Qu hara con un suero que diera una lectura de 0.7? Interpolara la
lectura sin ms o lo diluiras?

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c) Cul se considerara el limite de linealidad con arreglo a esta curva de
calibracin? Por qu?
9. Vamos a hacer una determinacin de glucosa en sangre, y para ello
recurrimos al empleo de una solucin estndar de glucosa de concentracin
100mg/dl. Una vez llevada a cabo la lectura obtenemos los siguientes
datos:
Absorbancia del estndar: 0,2
Absobancia del problema-1: 0,4
Absorbancia del problema-2: 0,8
Absorbancia del problema-3: 1,5
a) Con estos datos, calcular las concentraciones que tendran los tres
sueros problema.
b) Sabiendo que el lmite de linealidad de la tcnica es de 600mg/dl
habra que diluir alguna muestra y repetir la determinacin? Cules
diluira y qu factores de dilucin empleara? Por qu?
c) Diluimos la muestra nmero tres al 1/5, y repetimos la
determinacin. Ahora, la lectura que obtenemos es de 0,320 Cul ser la
concentracin real de glucosa en ese suero?

b) Otros contenidos tericos del tema

1. Al hacer una determinacin de glucosa es conveniente separar la clulas


lo antes posible por qu? qu tipo de error cometeramos si no lo
hiciramos?
2. Un paciente tiene una glucemia basal de 120mg/dl Qu prueba llevara
a cabo para confirmar una posible diabetes? Cmo realizara dicha prueba?
3. Cules son los dos mtodos enzimticos ms utilizados para la
determinacin de glucosa en una muestra de suero?
4. Qu utilidad tiene la cuantificacin de protenas glicosiladas?
5. Cules son las dos determinaciones de protenas glicosiladas ms
utilizadas en el laboratorio clnico?
6. Cite algn mtodo para analizar hemoglobina glicosilada
7. En los mtodos anteriores Qu se utiliza como muestra?
a) Suero
b) Plasma
c) Sangre completa
d) Hemolizado de eritrocitos
8. Cmo se llama la presencia de cuerpos cetnicos en orina? Cmo se
determinan habitualmente?
a) Por cromatografa de afinidad
b) Mediante espectrofotometra
c) Mediante electroforesis
d) Mediante inmunodifusin
9. Hemos determinado la glucosa en una muestra de orina recibida en el
laboratorio por medio de dos tcnicas: a) mtodo de Benedict b) mtodo
GOD/POD. Los resultados obtenidos han sido: a) 200 mg/dL, b) 150mg/dL.
A qu puede ser debida la disparidad de ambos valores.
10. Qu determinaciones haras a un paciente que llega al laboratorio para
controlarse?
11. Qu determinaciones haras a un paciente para diagnosticar una
diabetes?

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12. A un paciente le han solicitado una determinacin de hemoglobina
glicada para averiguar si tiene diabetes Es correcta la peticin? Por qu?
13. A las cinco de la tarde llega una muestra de sangre al laboratorio que se
extrajo a las ocho de la maana, para determinar la glucosa, y que se haba
dejado olvidada encima de la mesa desde entonces. Qu debemos hacer?
Por qu?
14. Un paciente viene al laboratorio para hacerse un anlisis de glucosa, y
nos explica que ha desayunado hace 20 minutos Qu debemos hacer? Por
qu?

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