INSTITUTO DE QUMICA

Universidad Catlica de Valparaso.

SECCIN BIOQUMICA

CINTICA ENZIMTICA
ASPECTOS TERICOS

La funcin de las enzimas es catalizar reacciones. La cintica enzimtica es la rama

de la enzimologa que estudia los factores que afectan la velocidad de las reacciones
enzimticas.
Los factores ms importantes son: concentracin de enzima, concentracin de
ligandos, (sustratos, productos, inhibidores y actividores) pH, fuerza inica y
temperatura. Cuando estos factores son analizados apropiadamente, es posible
aprender acerca de la naturaleza de las enzimas. Por ejemplo, variando la
concentracin de sustrato(s) y de producto(s) es posible deducir el mecanismo
cintico de la reaccin, esto es, el orden segn el cual se unen los sustratos y los
productos se disocian de la enzima. Estos estudios establecen los tipos de complejos
E-S y E-P que pueden formarse y por lo tanto, nos hablan acerca de la arquitectura
del centro activo. En algunos casos la cintica de la reaccin da evidencia de
intermediarios covalentes estables, indetectables por anlisis qumicos comunes.
Algunas constantes cinticas pueden determinarse y a partir de ellas podemos hacer
"un educated guess" acerca de las concentraciones intracelulares actuales de
sustratos y productos y de la direccin fisiolgica de la reaccin. La cintica de una
reaccin puede indicar la forma cmo puede ser regulada la actividad enzimtica in
vivo. Un estudio del efecto del pH y de la temperatura en las constantes cinticas
provee informacin concerniente a la identidad de residuos de aminocidos del
centro activo.

Un anlisis cintico puede llevar a un modelo de una reaccin catalizada, y al mismo

tiempo, los principios de cintica enzimtica pueden utilizarse para escribir la
ecuacin cintica para un modelo atractivo. La ecuacin cintica indica como
interaccionan todos los ligandos del sistema al afectar la velocidad de la reaccin.
Una vez que se tiene una ecuacin posible, el modelo debe ser probado experimen-
talmente.

Los principios de cintica enzimtica permiten disear experimentos e indicar, si se

est trabajando con una sla enzima, o si la preparacin contiene mltiples enzimas
que catalizan la misma reaccin. Por otra parte informan si la preparacin enzimtica
contiene inhibidores o activadores. Comparando las constantes cinticas de
aparentes enzimas idnticas de tejidos diferentes, o del mismo tejido en diferentes
etapas de desarrollo, es posible decidir si las dos enzimas son producto del mismo
1
gen, o si son protenas diferentes que catalizan la misma reaccin.

METODOS DE ENSAYOS ENZIMATICOS

La propiedad caracterstica de las enzimas es catalizar reacciones especficas. Su

presencia se detecta por la realizacin de dichas reacciones. La cantidad y
concentracin de enzima presente en una solucin se estima por la velocidad de la
reaccin catalizada. Es por ello que la medida de velocidad es esencial en la
investigacin de enzimas y para ello se requiere de mtodos confiables y
reproducibles.

Si se ha alcanzado el estado estacionario, la actividad de una enzima puede

estudiarse por la velocidad de formacin de un producto, o por la velocidad de
desaparicin de un sustrato.

Para muchas enzimas hay ensayos alternativos disponibles, la eleccin puede

hacerse en trminos de la conveniencia, costo, la disponibilidad de equipos y
reactivos adecuados, y el nivel de sensibilidad requerida.

Muchas reacciones producen cambios en las propiedades de los reactantes que

pueden ser seguidos directa y continuamente. En otros casos, no hay cambios que
puedan observarse directamente y es necesario usar un ensayo indirecto que
involucra un tratamiento posterior de la mezcla de ensayo. En algunos casos, es
posible usar un ensayo indirecto para seguir el progreso de la reaccin en forma
continua. P.e. cuando una segunda enzima se usa en el mismo ensayo para producir
un cambio detectable en forma directa. En otros, es necesario detener la reaccin
antes de realizar el tratamiento de la mezcla de reaccin que permita determinar la
extensin de la reaccin.

MTODOS ANALTICOS FSICOS Y QUMICOS

1.1. ENSAYOS DIRECTOS CONTINUOS.

Cualquier diferencia detectable entre las propiedades del sustrato y del producto
pueden ser utilizados como base para un ensayo directo continuo.
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Ensayos continuos tienen la ventaja de permitir obtener la curva progreso de la
reaccin continuamente, lo que facilita determinar velocidades iniciales y observar
cualquier desviacin en la fase inicial.

Cambios en absorbancia, fluorescencia, rotacin ptica, pH, conductividad, entalpa,

viscosidad o volumen de la mezcla de reaccin han sido utilizadas en ensayos de
enzimas.

Los ensayos espectrofotomtricos son probablemente los ms comunes.

a. El producto o el sustrato absorben radiacin electromagntica.
b. Reacciones de oxido-reduccin.
Reacciones catalizadas por deshidrogenasas que utilizan NAD+ o NADP+, ya
que la forma reducida de estas coenzimas muestra un mximo de absorbancia
a 340 nm. La velocidad de la reaccin puede determinarse por el cambio
(aumento o disminucin) de absorbancia a 340 nm cuando se incuban sustrato,
cofactor y la enzima en condiciones apropiadas.
Reacciones donde participa el FMN o FAD pueden seguirse
espectrofotomtricamente, la forma oxidada absorbe a 450 nm y la reducida,
en un porcentaje menor.

En reacciones de oxido-reduccin se pueden ocupar aceptores de electrones

artificiales, como ferricianuro y colorantes como el azul de metileno, azul de
indofenol, diclorofenol indofenol, etc., donde una de las formas oxidada o
reducida absorben radiacin electromagntica.

c. Sustratos artificiales colorimtricos. La -galactosidasa (EC 3. 2. 1. 23) que

cataliza la hidrlisis de la lactosa tambin acta sobre el o-nitrofenil--D-
galactopiransido (oNPG). Hidrlisis de este ltimo produce o-nitrofenol, cuya
forma disociada (color amarillo) absorbe alrededor de 405 nm. Estos sustratos
sintticos proveen de mtodos de rutina rpidos, pero su uso en estudios ms
detallados pueden llevar a error si el mecanismo cintico no corresponde al
seguido cuando se usa el sustrato natural.

d. En casos donde la reaccin catalizada resulta en cambios de fluorescencia si

pueden usar ensayos fluoromtricos, con lo que se gana generalmente en
sensibilidad. Este es el caso para deshidrogenasas, ya que el NADH y NADPH
fluorescen a 457 nm cuando son excitados a 340 nm (Fig. 1.b). Este
procedimiento es particularmente til cuando se dispone de pequeas
cantidades de la enzima o al realizar estudios cinticos con enzimas que
presentan Km muy bajos.

3
e. Reacciones que significan asociacin o disociacin de protones pueden
seguirse en soluciones no tamponadas o pobremente tamponadas midiendo el
cambio de pH con un pH-metro.
R-CO-O-R + H2O R-CO-O- + H+ + R-OH
El uso de este mtodo restringe el pH a un pH mayor que el valor de pK A del
producto formado y generalmente a la zona del pH ptimo, donde el cambio de
pH sea lo menor posible y no afecte en forma significativa la actividad de la
enzima. Un mtodo alternativo que impide el cambio de pH es el uso de un
auto titulador (pH-stat) que titula la mezcla de reaccin aadiendo cido o
base, para mantener el pH constante y al mismo tiempo, registrando la
velocidad de adicin. Es ventajoso trabajar a bajas concentraciones de tampn
(1 mM) para minimizar fluctuaciones dramticas de pH.

f. Reacciones que involucran toma o liberacin de un gas como oxgeno o

dixido de carbono pueden ser seguidas manomtricamente monitoreando el
cambio de presin o volumen. El uso de electrodos de oxgeno da un ensayo
sensible y conveniente.
1.2. ENSAYOS INDIRECTOS.

Requieren de manipulacin posterior de la mezcla de ensayo para aumentar la

sensibilidad o cuando no hay un ensayo directo conveniente.
Debido a que estos ensayos dan la extensin de la reaccin despus de un periodo
de tiempo elegido, es tentador elegir un tiempo de reacin y asumir que las
condiciones de velocidad inicial se cumplen a ese tiempo. Estas suposiciones pueden
llevar a errores grandes, es necesario demostrar que la formacin del producto
procede linealmente en el tiempo en las condiciones utilizadas.

1.2.1. Ensayos indirectos discontinuos (muestreo).

La reaccin se detiene a un tiempo definido y se trata la mezcla para producir un

cambio detectable en las propiedades del sustrato o del producto.

En reacciones enzimticas donde se utiliza o forma fosfato inorgnico, ste puede

cuantificarse usando algn mtodo colorimtrico una vez que la reaccin se ha
detenido.

Ensayos discontinuos son particularmente atractivos porque, una vez que se ha

desarrollado un mtodo confiable, es posible realizar un gran nmero de ensayos
individuales al mismo tiempo. Sin embargo, hay que confirmar que se estn
obteniendo velocidades iniciales y para ello hay que determinar el curso de la
reaccin, detenindola a diferentes tiempos, ya sea sacando alcuotas de la mezcla
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de ensayo o a mezclas idnticas despus de diferentes tiempos de incubacin. En
cualquiera de estos casos se obtienen puntos separados de la curva progreso de la
reaccin.

Detencin de la reaccin.
Es importante que los procedimientos sean virtualmente instantneos y que no
interfieran con el anlisis posterior. Cuando se realiza un ensayo nuevo es
conveniente chequear que la reaccin ha sido detenida completamente.
Generalmente se detienen por inactivacin de la enzima.
a. Calor.
Generalmente se coloca la muestra en un bao de agua hirviendo cuidando que la
transferencia de calor sea rpida ya que en las reacciones catalticas aumenta la
velocidad con la temperatura hasta que ocurre desnaturalizacin. Es conveniente usar
volmenes pequeos y tubos de paredes delgadas. El calor tiene la ventaja de que
es poco probable que interfiera en el procedimiento analtico subsiguiente, pero debe
recordarse que algunas enzimas (adenilato quinasa y ribonucleasa) no son
inactivadas en una exposicin corta a 100C. La misma consideracin debe tomarse
si se detiene la reaccin colocando la mezcla de ensayo en un bao de agua con
hielo.
b. cidos.
Las enzimas se desnaturalizan rpidamente con cidos fuertes. El cido
tricloroactico y el perclrico son particularmente efectivos a concentraciones finales
de 3% p/v. En el caso que sea necesario el perclorato puede ser removido por
neutralizacin con KHCO3, ya que KClO4 es poco soluble a 4C. El tricloroacetato
presenta la caracterstica de ser extrable con ter.
c. Bases.
Si una solucin fuertemente alcalina es compatible con el procedimiento analtico
posterior, se usa una base fuerte (p.e. NaOH, Na 2CO3) para detener la reaccin. En
ensayos con sustratos sintticos del tipo nitrofenilderivados, la base detiene la
reaccin y deprotona al p-nitrofenol obtenindose el p-nitrofenolato de color amarillo
que absorbe alrededor de 405 nm.
d. Solventes orgnicos.
En algunos casos solventes miscibles en agua (alcohol, acetona) pueden ser
utilizados en una proporcin aproximada a lo menos del 50%.

1.2.2. Ensayos indirectos continuos.

Estos ensayos involucran realizar la manipulacin necesaria para detectar el

producto o el sustrato remanente dentro de la mezcla de ensayo de modo que el
cambio pueda monitorearse continuamente.

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Como en los ensayos continuos estos mtodos tienen la ventaja de no ser
susceptibles a errores durante la manipulacin posterior de la muestra y que adems
permiten obtener la curva progreso de la reaccin en un slo experimento.

Los reactivos que reaccionan con uno de los productos para formar un compuesto
detectable pueden ser incluidos en la mezcla de ensayo siempre y cuando no
reaccionen con la enzima o algn otro componente del sistema.

Por otra parte, la reaccin de deteccin debe ser rpida de modo que la reaccin
catalizada en estudio sea siempre la limitante en la velocidad. De este modo la
velocidad medida corresponde a la actividad de la enzima en estudio.

En un ensayo para la acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.17) desarrollado por Ellman y col.

(1961) la acetiltiocolina es hidrolizada por la enzima para formar acetato y tiocolina,
ste ltimo compuesto reacciona no enzimticamente con el reactivo 5,5'-ditiobis-
2-nitrobenzoato (DTNB) presente en la mezcla, dando un compuesto amarillo TNB:
5-tio-2-nitrobenzoato que puede medirse espectrofotomtricamente a 412 nm.

(CH3)3N+CH2CH2SCOCH3 + H2O CH3COO- + (CH3)3N+CH2CH2S- + 2H+

(CH3)3N+CH2CH2S- + RSSR (CH3)3N+CH2CH2SSR + RS-

(DTNB) (TNB)
R = O2N-fenil-(o)COO-
-

Los ensayos ms comunes de este tipo ocupan enzimas adicionales para catalizar la
reaccin de uno de los productos dando un compuesto que sea detectable
directamente. Ensayos de este tipo se conocen como ensayos acoplados y las
enzimas que participan en la deteccin, enzimas auxiliares.
Frecuentemente los ensayos acoplados involucran la oxidacin o reduccin de
nucletidos piridnicos, ya que estas reaccionan pueden ser seguidas espectrofoto o
fluoromtricamente.
HKe
gl u cos a ATP glu cos a 6P ADP
I
I NADP
G6PDa I
I NADPH

6 P gluconato

No es necesario que el ensayo acoplado est restringido a una sola enzima, un

ensayo para detectar actividad ATP-asa ocupa 2 enzimas auxiliares.
ATPasa
ATP H2 O ADP Pi H
I I
I PK

aux
I
I
piruv ato PE P
I
I NADH
I LD a ux
I NAD

l acta to

El sistema regenera el ATP que es hidrolizado por la ATP-asa y por lo tanto previene
cualquier disminucin de la velocidad causada por disminucin de la concentracin
6
del sustrato.

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A continuacin se muestra un ensayo para enzimas que producen fosfato que ocupa 3
enzimas auxiliares.
(E1)e
Glucosa + Pi glucosa-1P

(E2)aux

Glucosa-6P
NADP+
(E3)aux
NADPH + H+

6P-gluconato
E1 = glicgeno fosforilasa
E2 = fosfoglucomutasa
E3 = glucosa 6 fosfato deshidrogenasa

Para que el ensayo acoplado de una medida exacta de la actividad de la enzima en

estudio es necesario asegurarse que la reaccin acoplada no se transforme en
limitante de velocidad.

La velocidad de la reaccin catalizada por la enzima auxiliar depender de la

concentracin de su sustrato, que es producido en la reaccin catalizada en estudio,
no debe ser afectada por aumento en la concentracin de esta enzima. En la prctica
el funcionamiento correcto de ensayos acoplados se alcanza cuando la(s) enzima(s)
auxiliar(es) est(n) presente(s) en exceso. Es posible calcular la cantidad de enzima
auxiliar que debe agregarse para lograr que la reaccin acoplada se realice en un
tiempo dado.

1.3. ENSAYOS AUTOMATIZADOS.

Se han desarrollado mtodos para automatizar el proceso de ensayo de enzimas con
el objetivo de apurar el ensayo de un gran nmero de muestras. Muchos de estos
sistemas ocupan una bomba multicanal para mezclar los reactantes a una velocidad
constante y un sistema automtico para aadir la enzima.

ENSAYOS ESPECIFICOS.
Los ejemplos presentados intentan ilustrar hechos generales de tipos de ensayo
especfico. Ensayos convenientes para enzimas individuales se encuentran en :
8
Methods of Enzymology, Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer), Enzyme
Handbook, como tambin en la literatura original.
CONSIDERACIONES PRCTICAS.

ELECCIN DEL MTODO DE ENSAYO.

Generalmente hay una variedad de diferentes mtodos de ensayo disponibles para
una enzima. En la medida que hayan controles adecuados de modo de asegurar la
determinacin de velocidades iniciales y que no hayan artefactos asociados al
mtodo, la eleccin depender de la conveniencia y disponibilidad de materiales y
equipos. Hay sin embargo, ciertas consideraciones generales que son tiles en la
eleccin entre mtodos alternativos.

En el ensayo de enzimas con alto Km hacia sus sustratos, y si es necesario trabajar a

altas concentraciones de stos en orden a asegurar durante un periodo de tiempo la
linealidad de la curva progreso de la reaccin. En estos casos ser ms exacto seguir
la reaccin de acuerdo a la formacin del producto que la desaparicin del sustrato; lo
ltimo significara medidas de valores muy altos de absorbancia.
Muchos ensayos imponen limitaciones a las condiciones de ensayo.
Esto puede ser por la inestabilidad del sustrato bajo ciertas condiciones, como la
prdida del NAD(P)H a valores bajos de pH, que dificulta le medida de velocidades
iniciales. Las condiciones alcalinas necesarias para cuantificar el p-nitro-fenolato
espectrofotomtricamente pueden inestabilizar al sustrato.
Ensayos acoplados en que uno de los productos es continuamente removido, no
sern adecuados para estudiar la inhibicin por ese producto. Otros ensayos que
consideran la formacin de un producto especfico sern menos prcticos si se
agregan cantidades del producto para estudios de inhibicin.
En ensayos acoplados debe recordarse que cualquier cambio en las condiciones
puede afectar el comportamiento de la enzima auxiliar como tambin, la en estudio.

Lo anterior significa que puede ser necesario usar ms de un ensayo para completar
el estudio de una enzima.

Durante la purificacin de una enzima es conveniente disponer de un mtodo que d

una rpida estimacin de la actividad, esto hace a los ensayos directos ms tiles que
los discontinuos.

Estabilidad enzimtica.
En una serie de estudios con una preparacin enzimtica es esencial ensayar su
actividad en intervalos regulares de tiempo en condiciones estndar para chequear
que sta permanezca constante. Si una enzima es inestable y pierde la actividad en el
tiempo, es posible corregir los valores obtenidos en relacin al inicial si se han
9
realizado una serie de ensayos estndar a diferentes tiempos; esto permite construir
una curva de calibracin de actividad en el tiempo. De todas maneras es mucho mejor
buscar condiciones bajo las cuales la solucin stock de la enzima pueda ser
almacenada sin prdida apreciable de actividad en el tiempo.

Solventes y tampones.
Es esencial asegurarse que todos los solventes usados estn libre de material
contaminante que pueda afectar la actividad de la enzima. Iones de metales pesados
son inhibidores de muchas enzimas, deben por lo tanto eliminarse del sistema.
Algunos sustratos son insolubles en agua y deben agregarse en una solucin
orgnica al ensayo. En este caso es necesario que el solvente orgnico no tenga
efecto sobre la actividad de la enzima en estudio o sobre el mtodo de ensayo
utilizado.
Debe chequearse que la adicin de los componentes no afecte el pH del ensayo.

Mezclas de ensayo.
En mezclas de ensayo que contienen diferentes componentes es posible preparar una
mezcla que los contenga a todos menos a la enzima. Este coctail puede ser til si se
realiza un nmero de ensayos en las mismas condiciones, como podra ser en una
purificacin de enzimas.

Homogenizacin.
Si no hay blank rates significativas en ninguna mezcla incompleta de reaccin, la
eleccin de iniciar la reaccin con la adicin de la enzima o del sustrato puede no ser
importante. Si la enzima es inestable en la mezcla de ensayo es preferible agregarla
al final. En otros casos, puede ser preferible pre-incubar la enzima con la mezcla
incompleta e iniciar la reaccin por la adicin de uno de los sustratos. Como por
ejemplo, cuando por la dilucin de la enzima hay un efecto histertico. Es
generalmente necesario almacenar la enzima y el sustrato en hielo para asegurar su
estabilidad. Por eso es importante de mantener el volumen final del material usado
para iniciar la reaccin tan pequeo como posible para impedir una cada de la
temperatura al ser agregado.

Es esencial asegurar la mezcla apropiada de los componentes. Sin embargo, algunas

enzimas se denaturan por una agitacin violenta. Con un sistema que no se agita en
forma mecnica es posible obtener una mezcla adecuada cubriendo el tubo con
parafilm e invitindolo. Una mezcla ms rpida y tan efectiva puede conseguirse con
un agitador que consiste en una pequea barra de plstico aplanada y doblada en un
extremo, no requiere remover la cuveta del equipo.

BIBLIOGRAFIA.
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K.F. TIPTON (1978)
"Enzyme Assay and Kinetic Studies. B.112
Techniques in protein and enzyme biochemistry - Part II.
B. CRABTREE, A.P. LEECH AND E.A. NEWSHOLME.
" Measurement of enzyme activities in crude extracts of Tissues. B 211.
Techniques in metabolic research. Part. I.
K.F. TIPTON (1992)
In Enzyme Assays, A Practical Approach.
Edited by R. Eisenthal y M.J. Danson.

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