TCNICA HISTOLGICA

CSAR EDUARDO MONTALVO ARENAS

Agosto de 2010.

INTRODUCCIN.
Parece factible que, si deseamos estudiar una clula o una
asociacin de ellas, para conocer su estructura morfolgica
microscpica y deducir, en lo posible sus funciones, bastara Fig Tec. de tincin: Micromanipulacin mecanica (microelectrodos
que a traviesasn la emembran celular)
examinarlas a travs de los instrumentos que amplan
imgenes de los objetos observados (microscopios fotnicos
COLORACIN VITAL Puede ser de dos tipos:
y electrnicos); este procedimiento no es factible de
1. Coloracin intravital, consiste en la administracin de
realizar; al intentar hacerlo se presentan serias dificultades
colorantes vitales a travs de las vas digestiva o
en la manipulacin de los especimenes y el inicio de los
intratraqueal; mediante inyecciones sanguneas,
procesos propios de desarreglo molecular (autlisis) y
linfticas, subcutnea, o intraperitoneal. Las soluciones
celular que suelen presentarse despus que las clulas y los
de uso ms frecuente son: tinta china, carmn de litio,
tejidos abandonan su hbitat natural. Por lo tanto, es
azul tripan (partculas colorantes que demuestran la
necesario utilizar una serie de procedimientos y artificios
capacidad fagoctica).
que nos permitan describir, comprender y analizar la
estructura microscpica de las clulas, tejidos y rganos.
2. Coloracin supravital, En este procedimiento se
emplean colorantes que se aplican a clulas o tejidos
Se denomina TCNICA HISTOLOGICA al conjunto de provenientes de organismos vivos. Se demuestran:
procedimientos aplicados a un material biolgico (animal o mitocondrias con el verde de Jano, los grnulos de las
vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las clulas cebadas con el rojo neutro, la sustancia
condiciones ptimas para poder observar, examinar y granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul
analizar sus componentes morfolgicos a travs de los brillante de cresyl, ramificaciones nerviosas con el
microscopios fotnicos y electrnicos. azul de metileno; o el ADN y el ARN de las clulas con
naranja de acridina (empleando el microscopio de
fluorescencia).
PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES
Permiten la observacin y el estudio de protozoarios, clulas
sanguneas, clulas descamadas o disociadas, clulas en
cultivo de tejidos; estructuras muy delgadas y translcidas
como la membrana peritoneal de animales pequeos o
epidermis de vegetales, granos de polen etc. suspendidas en
los lquidos de su hbitat natural o solucin salina
balanceada. Para una observacin ptima suele utilizarse
tipos especiales de microscopios fotnicos como el de
campo oscuro o el de contraste de fases: observacin al
estado fresco.
Fig Tec. de tincin 1: Tincin supervital de macrofagos de tejido
conectivo por agregado de Carmin de litio a una preparacin de Tejido
En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna Vivo.
estructura celular o tisular se pueden emplear colorantes
inocuos para la vida de las clulas, no modifican la PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES
estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este Tienen por finalidad preparar clulas, tejidos y rganos
procedimiento se le conoce como coloracin vital. procedentes de seres en los que los procesos vitales se han
detenido y es necesario conservar la estructura que tenan en
Para el estudio de las manifestaciones vitales de las vida.
muestras suelen emplearse una serie de microinstrumentos De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario
que facilitan la introduccin, al interior de las clulas, de realizar los siguientes pasos:
sustancias o la extraccin de ciertos componentes mediante
microinyectores, micropipetas, microelectrodos o
instrumentos que emiten haces sumamente delgado de - Toma de la muestra
radiaciones de alta energa (rayos laser). - Fijacin
- Inclusin
- Microtoma
- Coloracin o tincin
- Montaje

1
A) TOMA DE LA MUESTRA
La calidad y la fidelidad con que una clula o un tejido
muestren una imagen al microscopio, con las
caractersticas morfolgicas que posean cuando
estaban con vida, dependen esencialmente de la
prontitud y el cuidado que se aplic para obtener la
muestra a ser procesada mediante los pasos
mencionados anteriormente.
Existen diversos procedimientos que permiten obtener
muestras de tejidos y rganos para conseguir
preparaciones histolgicas de buena calidad. Estos son:
a) Mediante la biopsia: (del griego bios = vida y
opsis = visin), consiste en la toma de un
fragmento de tejido u rgano de un ser vivo. realiza
a travs de una operacin quirrgica hecha
exprofesamente o durante la intervencin
quirrgica efectuada en pacientes y corroborar as
un diagnstico de una determinada lesin. La
biopsia puede ser:
incisional
excisional
por sacabocados
por puncin y absorcin
por raspado
por trepanacin
Fig Tec de tincin: Aguja de biopsia incisional (el embolo se retrae al
insertar la aguja
El estudio de clulas de superficies epiteliales de renovacin
constante (mucosas bucal, gstrica, vaginal, uretral), se
realiza a travs de la Citologa Exfoliativa. En otros casos
clulas obtenidas mediante puncin (clulas sanguneas o de
la mdula sea) se extienden en una lmina portaobjetos
para hacer los frotis, colorearlas y examinarlas.
Fig Tec. de tincin: Puncin
b) mediante la necropsia, las muestras se obtienen de
seres muertos: En este caso es recomendable que
los tejidos y rganos se obtengan inmediatamente
despus de producida la muerte.
Recomendaciones para la toma de las muestras.
Los tejidos y los rganos provenientes de biopsias y
necropsias se seccionar empleando bisturs o navajas de
afeitar nuevos, sin hacer presin sobre ellos. No es
recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues
stas ocasionan compresiones y jalonamientos de los
tejidos y rganos que distorsionar su estructura
microscpica. El tamao de las muestras no debe exceder de
10 mm por lado con un grosor de 5 mm.
B) FIJACION.
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es
Detener la vida de las clulas e impedir las modificaciones
post morten que pueda sufrir la clula (procesos autolticos),
manteniendo la estructura morfolgica de clulas y tejidos
sin que ocurran cambios notables en ellos.
Esto se consigue inmovilizando (por coagulacin o
precipitacin) las molculas protenicas e inhibiendo
principalmente las enzimticas hacindolas insolubles. Esta
accin garantiza la integridad de las clulas y tejidos; se
efecta por mediante agentes qumicos denominados
fijadores.
Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos:
a) Oxidantes: el tetraxido de osmio (cido smico), el
bicromato de potasio, cido crmico, bicloruro de mercurio
o sublimado corrosivo, cido pcrico, cido actico.
b) Reductores: el formaldehdo, el glutaraldehdo, el
alcohol etlico, el alcohol metlico.
La accin oxidante o reductora de los fijadores le confieren
a las clulas ciertas condiciones que posibilitan una mejor
aplicacin de las sustancias colorantes, por ejemplo: el
alcohol etlico absoluto conserva el glucgeno, el bicloruro
de mercurio provoca que las anilinas coloreen de manera
ms brillante a las fibras colgenas, el bicromato de potasio
facilita la coloracin de las mitocondrias, el cido actico
permite una mejor tincin de los ncleos, el cloruro de
calcio conserva e insolubiliza parcialmente a los lpidos.
Los fijadores son:
a) Gaseosos: como el formaldehdo
b) lquidos: como el cido actico, al alcohol etlico, la
acetona, etc.
c) slidos: como el bicloruro de mercurio, el bicromato
de potasio, etc.
2
Condiciones de un buen fijador.
Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y
adecuada sus funciones debe poseer las siguientes
condiciones:
Matar inmediatamente a las clulas, impidiendo la
aparicin de los procesos autolticos. Para tal fin el
fijador debe poseer:
Un buen poder de penetracin, que en contados
instantes se introduzca con rapidez en el espesor de la
muestra
Un buen poder de difusin, que no fije slo la porcin
superficial de la muestra sino que alcance las porciones
ms profundas de la misma.
Producir cierta dureza a los tejidos sin que se
provoque excesiva retraccin o hacerlos quebradizos y
friables.
Debe de ser de fcil manipulacin.
No debe disolver componentes celulares.
Que sea fcil de conseguir y que sea barato.
Las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples, o
fijadores compuestos (mezclas fijadoras) en las que utilizan
ms de una sustancia fijadora.
Ejemplo de fijador simple:
Formol o formalina. Est considerado como la sustancia
fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan
tcnica histolgica. El formol comercial consiste en una
solucin acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Se
presenta como un lquido claro, incoloro, que emite vapores
sumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosa
respiratoria. Su accin fijadora se ejerce coagulando las
protenas.
Es un fijador que posee un buen poder de penetracin y
difusin. Mantiene de manera adecuada la estructura y
facilita la coloracin posterior de los componentes celulares
y tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva bastante
bien a las grasas.
Se le emplea en una solucin al 10% (10 del formol
comercial y 90 partes de agua)
El tiempo de fijacin de las muestras, dependiendo del
tamao de ellas, debe ser de 24 a 48 horas como mnimo y
si es posible, en refrigeracin.
Fijadores compuestos.
Una sola sustancia fijadora difcilmente rene todas las
condiciones para ejercer una buena fijacin, por lo tanto es
aconsejable usar mezclas fijadoras a travs de las cuales se
acrecientan las cualidades de un fijador y se atenan sus
defectos y desventajas.
A continuacin se presentan algunos ejemplos de fijadores
compuestos o mezclas fijadoras que se emplean con mayor
frecuencia:
Formol - fosfato (formol tamponado):
- solucin de formaldehdo (37% a 40%)--------------100 ml
- agua destilada ------------------------------------------- 900 ml
- fosfato de sodio monobsico (NaH2PO4 - H2O)-----4.0 gr
- fosfato de sodio dibsico (Na2HPO4)------------------6.5 gr
Suele emplearse como un fijador de rutina, al igual que el
formol al 10%. Posee un pH de 6.8 a 7.0 aproximadamente.
Es ligeramente hipotnico.
Formol - bicloruro de mercurio.
- solucin de formaldehdo (37% a 40%)--------------150 ml
- agua destilada--------------------------------------------850 ml
- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr
Es recomendable usarlo para fijar tejidos hematopoytico y
linfticoreticular. El material nuclear se fija de manera
precisa y ntida. Facilita la tincin de fibras colgenas y
clulas conjuntivas mediante el empleo de colorantes que
tienen como base a las anilinas. Se utiliza para los tejidos en
los que se aplicar tcnicas inmunohistoqumicas. Los
tejidos no deben mantenerse mucho tiempo en fijacin (no
ms de 48 horas) porque se endurecen demasiado. HgCl2 es
una sustancia que corroe el instrumental metlico. Antes de
aplicar una tincin es necesario eliminar los pigmentos
precipitados del bicloruro de mercurio en los tejidos.
Formol - cloruro de calcio.
- solucin de formaldehido (37% a 40%)---------------100 ml
- cloruro de calcio--------------------------------------------10 gr
- agua destilada----------------------------------------------900ml
Se recomienda fijar las muestras en esta solucin cuando se
desean preservar lpidos, especialmente fosfolpidos: Antes
de obtener los cortes, las muestras se incluyen en gelatina o
se congelan directamente para seccionarlas con empleando
microtomos de congelacin o el criostato.
Lquido fijador de Boin.
- solucin acuosa saturada de cido pcrico-------------750 ml
- solucin de formaldehido (37% a 40%)---------------250 ml
- cido actico glacial--------------------------------------- 50 ml
Es un buen fijador de uso rutinario. Tiene un buen poder de
penetracin y de difusin. Ofrece resultados satisfactorios
con ciertos tricrmicos como el de Masson. Pueden fijarse
piezas de un centmetro de grosor y dos o tres centmetros
de longitud. Se le emplea con resultados ptimos en la
fijacin de embriones y fetos pequeos pues ejerce cierto
poder descalcificante. Dependiendo del volumen de la
muestra, el tiempo de fijacin ser de 12, 24 a 48 horas.
3
Antes de la inclusin, es conveniente eliminar el cido
pcrico de las muestras (tie de color amarillo intenso a los
tejidos)El lavado se hace con una solucin de alcohol etlico
al 70% a la que se aaden algunas gotas de una solucin al
5% de carbonato de litio. El lavado finaliza cuando el
alcohol litinado ya no muestra color amarillento.
Lquido fijador de Zenker ( Solucin madre o stock)
- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr
- bicromato de potasio--------------------------------------25 gr
- agua destilada ------------------------------------------1000 ml
La solucin madre se puede guardar durante mucho
tiempo. Cuando a ella se le aade cido actico forma el
Lquido de Zenker (solucin de trabajo):
- solucin madre (stock) de Zenker-----------------------95 ml
- cido actico glacial-----------------------------------------5 ml
En cambio, si a la solucin madre de Zenker se le agrega
formol comercial se convierte en
Lquido fijador de Helly
- solucin madre (stock) de Zenker-----------------------90 ml
- solucin de formaldehido (37% a 40%)-----------------10 ml
El formol se debe agregar antes de usar la mezcla, pues la
accin reductora del formol inhibe la actividad fijadora del
bicromato de potasio. Las muestras deben ser pequeas y
fijarse por un lapso no mayor de 24 horas, porque se
endurecen en exceso, se disminuye la basofilia de los
ncleos y se incrementa la acidofilia del citoplasma. Tiene
una ventaja: preserva muy bien a los eritrocitos y a los
grnulos de las clulas de glndulas endocrinas.
Fijador de Carnoy,
- alcohol etlico absoluto------------------------------------60 ml
- cloroformo--------------------------------------------------30 ml
- cido actico glacial---------------------------------------10 ml
Posee un excelente poder de penetracin y de difusin. Las
muestras delgadas de tejidos y rganos se fijan en dos o tres
horas. Produce lisis de los eritrocitos. Es el fijador adecuado
cuando se desea demostrar glucgeno y la tincin de
ncleos y especialmente cromosomas.
CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA
FIJACIN.
a) Eleccin del fijador. La solucin fijadora a utilizar
depende del estudio que se quiere realizar. Para las
preparaciones de tejidos y rganos, en las que interesan
un estudio topogrfico de los mismos, deben usarse
fijadores con un buen poder de penetracin y de
difusin. Para estos casos se recomienda utilizar los
lquidos de Zenker, Boin o Helly: En caso contrario
se emplear la solucin de formol al 10% 15% que
permite obtener resultados satisfactorios. Lquido
considerado como el fijador universal pues facilita
el empleo posterior de cualquier otro fijador
(postfijacin) capaz de complementar su accin.
b) Tamao de las muestras. El tamao y grosor de las
muestras deben ser pequeas y delgadas, de 1cm2 a 2
cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente
si se emplean fijadores con escaso poder de penetracin
y de difusin.
c) Volumen del fijador. Una proporcin que es necesario
emplear ser de 1 a 20 (muestra fijador). Ser la ms
adecuada para garantizar una buena fijacin.
d) Tiempo de fijacin. El tiempo en la fijacin es
importante en dos aspectos.
I. El intervalo que media entre la interrupcin del
aporte sanguneo y la inmersin de las muestras en
la solucin fijadora. Lo deseable es que las
muestras se fijen inmediatamente despus de
obtenidas mediante una biopsia o que la necropsia
se efecte al poco tiempo de producida la muerte.
Mientras ms largo es este lapso, los procesos
autolticos que sufran los tejidos sern ms
evidentes.
II. Debe tenerse en cuenta el tiempo que
permanecern las muestras sumergidas en los
fijadores. Este tiempo vara con relacin al tipo de
fijador que se utiliza; al tamao y la naturaleza de
la muestra y la temperatura de fijacin. Por lo tanto
los lapsos de fijacin varan en rangos muy
amplios. En cualquier circunstancia, siempre deben
respetarse los tiempos recomendados para cada
tipo de fijador para garantizar la conservacin de
una buena estructura celular y tisular de los tejidos.
e) Temperatura de la fijacin. Es recomendable efectuar
la fijacin a bajas temperaturas ( 4o C.) dentro de un
refrigerador y con la solucin fijadora enfriada
previamente. Este procedimiento retardar el tiempo de
fijacin pero disminuir de manera notable la autlisis
de los tejidos.
Fijacin por perfusin.
Un mtodo de fijacin casi instantneo es aquel que consiste
en perfundir los tejidos y rganos de un animal con una
solucin fijadora. Este procedimiento se utiliza
frecuentemente para fijar tejidos que sern procesados y
examinados mediante el microscopio electrnico. La
perfusin consiste en anestesiar el animal y, mediante un
sistema especial de inyeccin y drenaje, reemplazar la
sangre con una solucin salina y despus se inyecta el
fijador. La fijacin se hace en contados instantes para
garantizar que los tejidos se fijaron rpidamente.
4

Fig Tec. de tincin: perfusin
f) Almacenamiento de las muestras. En ciertos casos los
tejidos fijados no necesitan ser procesados
inmediatamente para aplicarles otros pasos de la tcnica
histolgica. Por lo tanto es conveniente almacenar y
conservar los tejidos fijados para un uso posterior.
Despus de eliminar el fijador mediante un lavado, se
guardan en una solucin de alcohol al 70%. As los
tejidos pueden guardarse por un tiempo bastante largo
sin que sufran modificaciones morfolgicas notorias.
g) Lavado de las muestras fijadas. Al concluir la fijacin,
el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal
fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o
alcohol. Se evita, as, que los tejidos se endurezcan
demasiado o que ciertos componentes del fijador
introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan
una adecuada obtencin de secciones delgadas o la
coloracin correcta de sus componentes celulares.
C) INCLUSION.
Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y
dureza, pero no la suficiente para que, de ellos, se
obtengan secciones delgadas. Estas secciones, del orden
de algunas milsimas de milmetro (5 a 10 m), se
conseguirn cuando los tejidos se infiltren con
sustancias denominadas de inclusin y adquieran tal
dureza que sometidos al filo de una navaja produzcan
secciones, cortes o lminas sumamente delgados y
transparentes.
Las sustancias de inclusin tienen la propiedad de
incorporarse e infiltrarse al interior de las clulas y
tejidos con la finalidad de servirles de soporte. As los
tejidos y la sustancia de inclusin forman un bloque
homogneo en dureza y consistencia, a pesar que sus
componentes tuvieron originalmente distinta dureza.
Existen una serie de sustancias de inclusin que se han
empleado o se utilizan actualmente. Unas son solubles
en agua (gelatina, carbowax, glicol metacrilato) otras,
solubles en solventes orgnicos (parafina, celoidina,
resinas epxicas).
Cualquiera que sea el medio de inclusin a emplear es
condicin indispensable que la muestra a incluir se
encuentre embebida en la sustancia que disuelve al medio de
inclusin
Inclusin en parafina. Despus de la fijacin y el lavado
de las muestras, stas se encuentran embebidas en agua o en
alcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren con
parafina, medio de inclusin insoluble en agua y alcohol.
Por lo tanto, para que los tejidos puedan ser incluidos en
parafina se requiere deshidratarlos e infiltrarlos con el
solvente de la sustancia de inclusin.
Los pasos a seguir para la inclusin de las muestras en
parafina son:
a) Deshidratacin
b) Impregnacin en el solvente ( a este paso
tambin se le denomina aclaracin o diafanizacin)
c) Inclusin y formacin del bloque de parafina
a) Deshidratacin. Significa extraer o remover el agua de
los tejidos fijados. La deshidratacin debe ser completa
porque, de lo contrario, el solvente no acta de forma
adecuada y el bloque de inclusin no alcanza la dureza
requerida. Para tal fin se utilizan lquidos
deshidratadores en los cuales se sumergen los tejidos.
Los deshidratadores ms usados son el alcohol etlico,
el alcohol isoproplico, el dioxano y el cloroformo.
En el caso de la inclusin en parafina, las muestras se
deshidratan en baos sucesivos en soluciones de
concentracin crecientes de alcohol etlico. El
procedimiento de rutina es el siguiente:
1) alcohol etlico al 70 % ------------------- 12 horas
2) alcohol etlico al 70 % ------------------- 12 horas
3) alcohol etlico al 95 % --------------------- 1 hora
4) alcohol etlico al 95 % --------------------- 1 hora
5) alcohol etlico al 100 % (absoluto) --------1 hora
6) alcohol etlico al 100 % (absoluto)---------1 a 1.5 horas.
Nota: En cada caso es necesario agitar de vez en cuando
los frascos que contienen las muestras
Los tiempos indicados son los que se aplicarn a las
muestras de tamao mediano (1 cm2 x 0.5 cm. de grosor).
Los tiempos pueden disminuirse o incrementarse si las
piezas son ms pequeas o ms grandes.
La deshidratacin incompleta de los tejidos se comprueba
cuando stos al sumergirse en el lquido diafanizador
muestran un aspecto turbio blanquecino
5
b) Diafanizacin. Las muestras deshidratadas se
encuentran totalmente embebidas en alcohol etlico
absoluto; pero la parafina tampoco es soluble en
alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por
sustancias que sean capaces, simultneamente, de
mezclarse con el alcohol y disolver la parafina. Estas se
denominan lquidos diafanizadores o intermediarios.
Ejemplos: xilol, tolueno, benceno, y el cloroformo.
El lquido diafanizador de uso ms frecuente es el xilol
La actividad aclaradora o diafanizadora del xilol se emplea
tambin en el procedimiento de coloracin. La diafanizacin
de los tejidos deshidratados se debe a que estas sustancias
poseen un alto ndice de refraccin y al interactuar con los
tejidos los vuelven transparentes.
El procedimiento de diafanizacin se realiza de la siguiente
manera:
7) alcohol absoluto (50%) - xilol (50%)--------1 hora
8) xilol-----------------------------------------------1 hora
9) xilol-----------------------------------------------1 hora
Nota: las muestras deben agitarse continuamente para
permitir la renovacin de los lquidos.
c) Inclusin y formacin del bloque de parafina. Las
parafinas son hidrocarburos saturados provenientes de
la destilacin del petrleo. Generalmente son sustancias
slidas a temperatura ambiente. Existen diferentes tipos
de parafina que se caracterizan por sus puntos de
fusin. Estos oscilan entre 40o y 60o C. La parafina
hierve a 300o C. y emite vapores que son muy
inflamables. Las parafinas se clasifican en:
Blandas. tienen un punto de fusin de 45 o C -
52o C. Son recomendables para incluir tejidos en
los se detectarn antgenos mediante
inmunohistoqumica.
Semiduras. Sus puntos de fusin son de 54o C -
58o C. Es la parafina que se emplea con mayor
frecuencia en los laboratorios donde se realiza
tcnica histolgica. De acuerdo a la temperatura
del medio, se recomienda su uso pues se pueden
obtener secciones de 5 a 7 de m.
Duras. Tienen un punto de fusin de 60o C - 65o
C. Son parafinas que deben usarse en ambientes
con climas de temperaturas altas.
La penetracin de la parafina al interior de los tejidos se
efecta cuando sta se encuentre en estado lquido. En el
comercio las parafinas se expenden en forma de bloques
discoidales, escamas, tabletas rectangulares o en forma de
grumos pequeos. Las parafinas, se disuelven usando
estufas que las mantienen en ese estado. Las estufas
permanecen a una temperatura constante, generalmente de
2o C a 4o C por encima del punto de fusin de la parafina a
emplear.
La parafina diluida se coloca en tres recipientes dentro de la
estufa. El primero, con una capacidad de 1000 a 1500 cc,
recibir a las muestras embebidas en xilol; la parafina
reemplazar el xilol de las muestras y se infiltrar al interior
de las mismas. Los otros dos recipientes son ms pequeos
(500 cc. de capacidad) y, de manera consecutiva recibirn a
los tejidos. El ltimo de ellos servir para contener a las
muestras antes del proceso de formacin de los bloques
de parafina. En el interior de la estufa debe existir otro
recipiente conteniendo parafina lquida pura, que se
emplear para la formacin de los bloques.
El tiempo que permanezcan las muestras dentro de los
recipientes de parafina depender de la naturaleza del tejido
y el tamao de las muestras. Se sugieren los siguientes
lapsos:
10) Primer bao de parafina------------------1 a 1.5 horas
11) Segundo bao de parafina----------------1 a 1.5 horas
12) Tercer bao de parafina-----------------30 a 60 minutos
Nota: agitar las muestras con cierta frecuencia
La inclusin o formacin del bloque de parafina se efecta
empleando moldes de diversos materiales y diferentes reas
y profundidades. Pueden ser de papel, metal o plstico. El
bloque de parafina debe contener la muestra correctamente
orientada para facilitar la obtencin de las secciones o
cortes.
El molde elegido se llena con parafina caliente pura; con
una pinza calentada en un mechero se toma una pieza de
tejido del tercer recipiente y se orienta una de sus
superficies (aquella que se pondr en contacto con el filo de
la navaja) se sumerge al interior del molde, en el que la
parafina ha empezado a solidificarse y se le aplica una leve
presin. Despus los moldes se enfran de inmediato (se
sumergen en agua fra o se introducen en el refrigerador)
para que la parafina se solidifique de manera homognea.
Todos los procedimientos mencionados, desde la
deshidratacin hasta la infiltracin en los dos o tres
recipientes de parafina lquida, se pueden efectuar de
manera automtica. Existen una serie de procesadores
automticos que facilitan estas tareas.
Igualmente existen instrumentos que contienen parafina
fundida que la dispensan a voluntad del usuario para luego
formar los bloques. Tienen anexos a ellos reas o superficies
que se mantienen calientes o fras, con la finalidad de
orientar correctamente las piezas de los tejidos y
posteriormente producir el enfriamiento rpido, la
solidificacin de la parafina y la formacin del bloque.
6
D) MICROTOMIA (OBTENCIN DE LOS CORTES)
En esta etapa, los tejidos y la parafina integran un solo
bloque que, posee la dureza y la consistencia suficientes
para obtener secciones delgadas y transparentes.
Las secciones delgadas o cortes se obtienen utilizando
instrumentos mecnicos diseados para que en forma mas o
menos automtica, seccionen el bloque de parafina en cortes
delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se
denominan microtomos
El sistema de funcionamiento de los microtomos consta de
cuatro mecanismos principales:
sujecin del bloque de parafina.
sujecin de la navaja.
El que permite que el filo de la navaja seccione al
bloque en cortes delgados y de grosor uniforme.
El de avance del bloque en un nmero determinado de
micrmetros despus que se ha obtenido un corte.
Los microtomos se clasifican de acuerdo a la manera como
se desplaza el bloque que contiene el tejido incluido; as,
existen:
a) Microtomo de rotacin tipo Minot.
Mediante una manivela circular denominada volante, el
mecanismo que sujeta al bloque de parafina se desplaza
frente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo y
viceversa en un movimiento vertical.
b) Microtomo de deslizamiento. El movimiento que se
realiza para obtener los cortes es horizontal, es decir de
atrs hacia adelante y viceversa. Generalmente el
mecanismo que sujeta al bloque de parafina es el que
se desplaza y a la navaja permanece esttica.
Fig Tec. de tincin: Microtomo
Los microtomos tipo Minot son los de uso ms frecuente
en cualquier laboratorio donde de realiza tcnica
histolgica, especialmente cuando los tejidos estn incluidos
en parafina. Los microtomos de deslizamiento, en cambio,
se emplean cuando los tejidos estn incluidos en celoidina o
cuando la inclusin en parafina contiene porciones
voluminosas de tejidos y rganos.
Los microtomos tipo Minot permiten obtener secciones
delgadas, del orden de 4 a 7m de espesor. Producen cortes
seriados, es decir, cuando se obtiene un corte, ste queda
adherido por su borde anterior al borde posterior del que lo
precedi; formndose de esta manera una cinta de cortes que
va descendiendo por la superficie anterior de la navaja.
Los cortes seriados se emplean cuando se desea realizar
reconstrucciones tridimensionales del rgano procesado,
cuando se requieren comparar secciones vecinas, del tejido
u rgano, coloreadas por diversas tcnicas de tincin o
cuando se hace el estudio microscpico topogrfico en
embriones y fetos.
Existen dos condiciones indispensables que garantizan la
obtencin de secciones delgadas, uniformes y seriadas:
a) Que la deshidratacin, impregnacin e inclusin hayan
sido realizadas correctamente.
b) El empleo de una navaja o cuchilla muy bien afilada y
asentada y que el filo de la misma ofrezca la
inclinacin adecuada hacia la superficie del bloque.
Las navajas o cuchillas de microtoma requieren de un
afilado y un asentado muy cuidadoso, pues el
mantenimiento del filo de ellas depende que se obtengan,
con xito, buenos cortes.
Las navajas se afilan utilizando afiladores automticos que
efectan la operacin en forma rpida y garantizan un
afilado uniforme.
Para el afilado de las cuchillas se requieren una placa de
vidrio despulida finamente y sustancias abrasivas.
Existen varios modelos de afiladores automticos, pero
todos ellos funcionan bajo ciertos mecanismos:
a) movimiento y deslizamiento de las cuchillas sobre la
superficie del vidrio despulido (movimiento rotatorio o
de atrs hacia adelante y viceversa)
b) movimiento y rotacin peridica de las dos superficies
de la cuchilla para enfrentarse de manera alternativa y
similar a la superficie del vidrio con el abrasivo
c) En ciertos modelos, la placa de vidrio tambin puede
realizar movimientos restringidos de rotacin
Las sustancias abrasivas suelen estar disueltas en agua o en
aceite. Generalmente se emplean dos tipos de abrasivos:
Unos, de grano grueso, utilizados para desgastar algunas
melladuras visibles de las navajas y otros, de grano fino que
sirven para afilar verdaderamente las navajas.
La perfeccin del afilado se obtiene cuando el filo de las
navajas se asienta empleando, para tal fin, una superficie de
cuero para asentar. Esta operacin se realiza momentos
previos a la obtencin de los cortes.
7

Se recomienda, para una misma cuchilla:
a) utilizar un solo afilador y si es posible la misma placa
de vidrio despulido
b) marcarlas de tal manera que siempre deben sujetarse al
mecanismo del afilador conservando una posicin y
orientacin determinadas
Esto impide que se formen facetas desiguales en el filo de la
navaja producindose, con ello, un afilado deficiente.
Efectuado el afilado de las cuchillas, stas deben limpiarse
prolijamente, pues cualquier partcula de abrasivo que se
quede adherido al filo de la navaja lo daar y tambin al
tejido, durante la microtoma.
En la actualidad se expenden en el mercado cuchillas
descartables. Se venden en gran cantidad, generalmente por
cientos, son relativamente baratas. Se emplean para obtener
algunos cortes y luego se descartan. Ofrecen dos ventajas:
no se requiere afilarlas y siempre el usuario tendr un
instrumento bien afilado.
Obtencin de los cortes.
Para alcanzar este propsito se deben seguir los siguientes
pasos
a) Sujetar firmemente el bloque con el sistema de
abrazaderas y la muestra orientada correctamente.
b) Alinear el sistema de sujecin de la navaja y el filo de
la misma, con la superficie de corte del bloque.
c) Desgastar la superficie del bloque de parafina hasta
alcanzar el tejido y se tenga la certeza de abarcar toda
el rea que se desea seccionar.
d) Marcar en el dial del microtomo, el nmero de
micrmetros de grosor que deben alcanzar los cortes.
e) Accionar la manivela que desplaza la abrazadera con el
bloque de parafina para obtener los cortes (aislados o
seriados). Obtenidos los cortes se recogen
cuidadosamente con unas pinzas o pinceles finos.
Fig Tec. de tincin: Microtomo, cinta transportadora, Bao de
flotacin
Extensin y adhesin de los cortes al portaobjetos. los
cortes obtenidos, aislados o en forma de cintas,
generalmente se presentan arrugados y muestran una rea
menor que la que poseen en la inclusin, por lo que es
necesario extenderlos y luego adherirlos a las lminas
portaobjetos ( esto facilita su manipulacin posterior).
Los cortes se extienden al depositarlos sobre la superficie
del lquido extendedor contenido en un recipiente
denominado bao de flotacin (ste mantiene la
temperatura entre 40o a 45o C). Las secciones se depositan
en el lquido procurando que la superficie brillante (aquella
correspondiente al filo de la navaja) se ponga en contacto
con el lquido caliente. En caso que ciertas arrugas persistan,
se emplean unas pinzas finas o un pincel de pelo de camello,
para ejercer una ligera traccin entre los extremos de los
cortes y as desarrugarlos totalmente.
Fig. Tec de tincin: Bao de flotacin
Las secciones se extienden aisladas o formando cintas,
estas se recogen y adhieren al portaobjetos de la misma
forma; en el caso que se requiera recoger los cortes aislados,
extendidos previamente como una cinta, deben separarse
utilizando las mismas pinzas finas o agujas de diseccin.
Para garantizar una mejor adhesin de los cortes a los
portaobjetos, se recomienda incorporar sustancias
adherentes al lquido extendedor o, en ciertos casos, al
portaobjetos. Estas sustancias suelen emplearse de dos
maneras:
a) Extensin previa de la sustancia adherente a una de las
superficies de la lmina portaobjetos, por ejemplo, la
albmina de Mayer, constituida por partes iguales de
glicerina y clara de huevo, a la mezcla se le aaden
algunos cristales de timol como ingrediente
conservante. La mezcla se filtra y se guarda en
refrigeracin. Se le utiliza extendiendo una gota de la
mezcla en el portaobjetos y se deja secar. Los cortes se
recogen cuidadosamente sumergiendo, por debajo de
ellos, el portaobjetos en forma oblicua. Otra sustancia
adherente que se emplea de la misma manera es la poli-
L-lysina (solucin de 25 miligramos de la sustancia en
25 ml de agua destilada). Una gota de la solucin se
extiende en el portaobjetos y stos se secan a 50 o - 55o
C. durante toda la noche y est lista para su uso.
8
 Teora de la coloracin.
b) Al lquido de flotacin se le aaden sustancias
Existen dos teoras que explican el procedimiento de la
adherentes. Uno de los procedimientos ms sencillos es
coloracin
el que consiste en disolver, en el agua ya caliente del
bao de flotacin (dos litros) 0.5 g de gelatina. En otros
a) Teora fsica. Considera que la coloracin es un
casos se emplea una solucin que posee los ingredientes
proceso fsico de adsorcin. As, las partculas de las
siguientes:
sustancias colorantes disueltas penetran en los
- agua destilada --------------------------------- 1,000 ml
espacios intra e intercelulares en los que se mantienen
- bicromato de potasio--------------------------0.2 gramos
adheridas en razn de la cohesin molecular. Por
- gelatina -----------------------------------------0.2 gramos
ejemplo, la coloracin de las grasas o lpidos es una
tincin por adsorcin; los Sudanes III o IV tien las
El agua destilada se calienta a 60 o C para disolver en ella
grasas por la facilidad que tienen para disolverse en
la gelatina y el bicromato de potasio, sucesivamente. Se
ellas.
filtra y est lista para su uso.
Este lquido previamente filtrado se puede utilizar varias
veces. (se recomienda guardarlo en el refrigerador).

Recogidos los cortes, stos an se pueden orientar

aprovechando de la capa de lquido que queda entre el
portaobjetos y los cortes. Posteriormente las lminas se
apoyan en forma oblicua para que escurra el lquido
sobrante y luego se colocan horizontalmente dentro de una
estufa o encima de una plancha caliente ( a 50o C
aproximadamente). Despus de unas 3 a 4 horas, el lquido
se habr evaporado totalmente y la sustancia adhesiva unir
firmemente el corte al portaobjetos.

E) COLORACION O TINCION.
Los cortes de los tejidos adheridos a los portaobjetos
estn listos para ser coloreados.
El procedimiento de coloracin o tincin consiste en que
una estructura celular o tisular adquiere especficamente un
color bajo la accin de una sustancia colorante.
Se considera que una estructura se ha coloreado o teido
cuando al ser lavada con el lquido que disuelve al
colorante, no se decolora.
Fig Tec. de Tincin: Tejido adiposo teido con Sudn
b) Teora qumica. El colorante se une a la sustancia
coloreable combinndose con ella ntimamente debido a
la presencia de agrupaciones moleculares cidas o
bsicas en los componentes celulares o tisulares que se
unen respectivamente a los cromgenos bsicos y
cidos de los colorantes, formando sales insolubles.
Una prueba de ello es el hecho de la casi imposibilidad
de separar completamente el colorante de los
componentes en donde ejerci su accin de tincin an
empleando sus lquidos solventes.

De acuerdo a esta teora los colorantes se unen (ligan) a los

El proporcionar color a las estructuras que constituyen un
tejido o un rgano se hace con la finalidad de distinguirlas
entre s y facilitar su observacin.
Si se examina al microscopio una seccin de tejido sin
colorear, ya adherida al portaobjetos, se podr constatar que
no es fcil discernir sus componentes, pues lo delgado de los
cortes y la diafanizacin producida en los tejidos igualan sus
ndices de refraccin. La coloracin proporciona diferencias
evidentes entre las estructuras y al observar los cortes ser
fcil reconocerlas.
tejidos por enlaces inicos, covalentes o de hidrgeno.
El enlace inico o electrosttico ocurre cuando el colorante
y la sustancia que se va a teir, desarrollan diferentes cargas
elctricas y entonces se atraen una a la otra, por ejemplo, el
citoplasma se colorea porque las protenas citoplasmticas
poseen carga elctrica ( + ) y las partculas del colorante
tienen carga elctrica (-).

Clasificacin de los colorantes.

Se denomina sustancia colorante a aquella que puede Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:
transferir su color a otro cuerpo. a) Por su origen. pueden ser naturales y artificiales
(sintticos).

9
 Colorantes naturales, se extraen de:
1) Animales. Como el carmn, que se extrae de la
cochinilla, artrpodo parsito de los tallos del
nopal (tuna). El carmn (de color rojo intenso) es
uno de los colorantes naturales ms empleado en
la industria alimentaria y cosmtica.
En tcnica histolgica se utiliza el carmn de Best
para demostrar glucgeno, el carmn de Mayer
para demostrar mucina; las clulas fagocticas se
evidencian con el carmn de litio (colorante vital).
2) Vegetales. Como la hematoxilina, obtenida de la
corteza de un rbol, el palo de campeche
(Haematoxilum campechanum), la safranina que
se extrae de una liliacea ( pistilos de la flor de
azafran) o la orcena que se obtiene de un liquen.
Colorantes artificiales o sintticos. Son productos
derivados de la destilacin de la hulla o carbn.
Genricamente se les conoce como colorantes derivados de
la anilina.
Los colorantes artificiales son sales. Son compuestos
orgnicos formados por las modificaciones que experimenta
el anillo bencnico cuando se reemplazan dos tomos de
hidrgeno por un tomo de oxgeno o con otro tomo o por
un grupo qumico que tenga enlaces de doble valencia en
vez de uno, dando como resultado un compuesto coloreado.
La anilina es incolora, pero las modificaciones qumicas
producidas en el anillo bencnico le confieren, a los
compuestos nuevos, un color determinado.
Los colorantes artificiales y sintticos se clasifican en:
a) Acidos: son sales cuya parte bsica es incolora y el
componente cido posee color. As, en el colorante
eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante se
debe al cido eosnico y no a la base, el sodio.
Poseen una carga elctrica positiva, por lo tanto son
colorantes catinicos. Se les denomina tambin colorantes
nucleares, pues tienen afinidad por los cidos nucleicos
(ADN y ARN).
Las sustancias teidas por los colorantes bsicos se
denominan basfilas y estn constituidas por
componentes cidos.
Ejemplos: la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de
metileno, la tionina, el azul de toluidina, la fucsina bsica.
c) Neutros. Son sales en las que tanto la parte bsica
como la parte cida proporcionan color. Por ejemplo el
eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur de
metileno.
Estos colorantes tienen la propiedad de teir de manera
simultnea, a los componentes nucleares y a los
citoplasmticos, inclusive pueden proporcionar colores
distintos (metacromasia) a determinados componentes
citoplasmticos como las granulaciones especficas de los
granulocitos (cierto tipo de leucocitos).
Forman parte de las frmulas colorantes para frotis de
sangre como los colorantes de Wright, May Grnwald,
Giemsa, Leischman, etc.
d) Indiferentes.- No forman sales. Son compuestos no
inicos incapaces de la disociacin electroltica.
Son insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos
como el alcohol y tambin en las grasas o lpidos y, aunque
ellos poseen color, en realidad estrictamente hablando no
son colorantes.
Basndose en que son solubles en las grasas, estas
sustancias se utilizan para demostrar la presencia de ellas en
clulas y tejidos, pues tien selectivamente a los lpidos.
Los ejemplos son: El sudan negro, el sudn III y el sudn
IV, El rojo oleoso.

Los colorantes cidos tienen carga elctrica negativa, por

lo tanto la designacin correcta es la de colorantes
aninicos. Tambin se les conoce como colorantes
citoplasmticos, pues tien al grupo qumico, cargado
elctricamente, localizado en un extremo de la cadena de
aminocidos que integran las protenas citoplasmticas.
Las sustancias que atraen elctricamente a los colorantes
cidos se denominan acidfilas y qumicamente estn
constituidas por componentes bsicos o alcalinos.
Ejemplos: la eosina, el amarillo de metanilo, la fucsina
cida, el cido pcrico, el verde rpido, el naranja G, la
safranina, el azul de anilina, etc.

b) Bsicos. Son sales que poseen la base coloreada e

incolora la porcin cida; por ejemplo, el azul de
metileno o clorhidrato de azul de metileno, debe su Fig Tec. de Tincin: a) Dibujo esquematico de la metacromasia,
propiedad colorante a la base azul de metileno y no al agregacin de las molculas colorantes sobre superpie de un polimero
cido clorhdrico que es incoloro. de alto peso molecular

10
Clasificacin de las coloraciones.
Existen procesos a travs de los cuales clulas y tejidos son
coloreados por las sustancias colorantes. De acuerdo a ellos,
las coloraciones se clasifican en:
a) Coloracin directa o sustantiva. Se denomina as a la
tincin que se ejerce sobre clulas y tejidos cuando
stos se ponen en contacto con la solucin colorante, el
resultado indica una verdadera afinidad entre el tejido y
el colorante. Ejemplo: la tincin de los ncleos por el
azul de metileno.
b) Coloracin indirecta o adjetiva. Para que lleve a
efecto la coloracin es indispensable recurrir al empleo
de sustancias intermediarias que faciliten la adhesin
del colorante en las estructuras tisulares. La sustancia
intermediaria que se utiliza se denomina mordiente.
El mordiente se aplica antes de la utilizacin de la
solucin colorante o puede formar parte de ella. La
combinacin que se efecta entre el mordiente y el
colorante se denomina laca. La mayora de las
soluciones colorantes de hematoxilina requieren de un
mordiente para que aquella proporcione color.
c) Coloracin progresiva. Se refiere a la marcha misma
de la coloracin. Los tejidos se ponen en contacto con
la solucin colorante para que, conforme transcurre el
tiempo de coloracin, el tejido, de manera progresiva,
alcance la intensidad de tincin deseada; en ese
momento se detiene la coloracin mediante lavado y la
eliminacin del colorante sobrante.
d) Coloracin regresiva. En este caso los tejidos se
sobrecolorean con el colorante para someterlos despus
a la accin de una sustancia denominada diferenciador,
ste extrae parte del colorante y, mediante la
observacin al microscopio, se detiene el proceso de
diferenciacin cuando los componentes alcanzan la
tincin deseada.
e) Coloracin simple. Es el procedimiento en el que se
utiliza un solo colorante para teir algn componente
celular o tisular. Por ejemplo, teir los ncleos con
tionina.
f) Coloracin compuesta o combinada. Consiste en la
aplicacin, a una muestra de tejido u rgano, de varios
colorantes con la finalidad de destacar, mediante
colores diferentes, estructuras especficas que forman
parte de ella. Puede ser:
Simultnea, cuando en una misma solucin de
coloracin se mezclan varios colorantes. En este caso
los tejidos reciben la tincin en un solo evento,
Ejemplos: las soluciones colorantes de algunos
tricrmicos como el de Van Gieson (fucsina cida y
cido pcrico) o el de Mallory (azul de anilina y
naranja G) o el de Shorr ( verde brillante, fucsina
cida y naranja G).
Fig Tec de tincin: Mtodo de Mallory (tinvin selectiva)
Sucesiva, Consiste en aplicar a los tejidos soluciones
sucesivas de varios colorantes, con la finalidad que
ciertos componentes se tian con algunos de ellos. El
ejemplo ms demostrativo es la coloracin de
hematoxilina. eosina, en ella los ncleos se tien con
la hematoxilina y despus la eosina se encarga de
colorear al citoplasma.
g) Coloracin ortocromtica. Es la accin de tincin que
ejerce un colorante al colorear una determinada
estructura con su propio color. La gran mayora de los
colorantes producen coloracin ortocromtica.
h) Coloracin metacromtica. Es la tincin en la cual, un
colorante adems de ceder su propio color a una
estructura celular o tisular tambin tie de color distinto
a otras estructuras. La tionina y el azul de toluidina
colorean de azul a los ncleos y a otras estructuras
basfilas pero, al mismo tiempo, ciertos componentes
tisulares como la mucina, la matriz cartilaginosa o el
cido hialurnico se tien de violeta o rosado.
Fig Tec de tincin: Medula espinal teida con Tionina.
i) Coloracin pancromtica. Es producida por la
actividad tintorial de los colorantes neutros. En este
caso, las porciones bsicas y cidas ejercen su accin de
tincin pero, adems ciertos componentes celulares se
tien de colores diferentes a los originales adquiriendo
tonalidades que resultan de la mezcla de ellos.
El ejemplo ms evidente de esta coloracin se produce
cuando se tien frotis de sangre. La utilizacin de las
soluciones colorantes de Wright, May Grnwald, Giemsa o
Leischman hace que las plaquetas y los leucocitos
(granulocitos y mononucleares) muestren granulaciones
especficas e inespecficas fcilmente diferenciables por esta
capacidad pancromtica del colorante.
11
COLORACION DE HEMATOXILINA -EOSINA
(H&E)
La coloracin de hematoxilina - eosina se considera como
la tcnica de tincin de uso ms frecuente en el estudio de
clulas y tejidos, a travs del microscopio fotnico.
Consiste en la tincin de:
a) los ncleos mediante una hematoxilina, previamente
oxidada y transformada en hemateina a la que se le
aade una sustancia mordiente para formar una laca
(para tal fin se usan sales metlicas de aluminio, plomo
o fierro). Los ncleos se colorean de azul, azul
morado, violeta, pardo oscuro o negro, dependiendo de
los agentes oxidantes y mordientes que se utilizaron.
b) el citoplasma y material extracelular utilizando la
eosina que les confiere diversos grados de color
rosado.
7. Colorear con una solucin alcohlica o acuosa de
eosina------------------------------------------ 3 a 5 minutos
8. Deshidratar en baos crecientes de alcohol etlico
- alcohol de 70o ------------------------------- 1 minuto
- alcohol de 95o -------------------------------1 minuto
- alcohol de 95o --------------------------------1 minuto
- alcohol absoluto (100o ) --------------------1 minuto
- alcohol absoluto (100o) ---------------------2 minutos
9. Diafanizar o aclarar empleando xilol
- xilol ------------------------------------------- 1 minuto
- xilol ------------------------------------------- 2 minutos
En estas condiciones los tejidos estn preparados para
realizar en ellos el montaje.

El procedimiento de coloracin de H & E es el siguiente:

1. Desparafinar los cortes en

- xilol -------------------------- 3 minutos
- xilol -------------------------- 3 minutos
Fig Tec de Tincin: gamas de color del mtodo de tincin H&E
2. Hidratar los cortes en baos decrecientes de alcohol
- alcohol absoluto (100o) ------3 minutos
F) MONTAJE.
- alcohol absoluto (100o) ------ 3 minutos
Concluido el proceso de la tincin de los cortes, stos
- alcohol de 95o ---------------- 3 minutos
se deben colocar en condiciones de proteccin y de
- alcohol de 95o ----------------- 3 minutos
poderlos utilizar infinidad de veces sin que se
- alcohol de 70o ----------------- 3 minutos
deterioren. Para alcanzar tales propsitos se recurre al
- agua corriente ----------------- 5 minutos.
ltimo procedimiento que es el montaje.
- agua destilada (2 baos)-------1 minuto (cada uno)
Este procedimiento consiste en colocar encima del corte
3. Colorear con la solucin de hematoxilina. En este paso
coloreado y diafanizado una gota de una sustancia
es conveniente respetar el tiempo de coloracin que
adherente, diluida, generalmente en xilol (resina natural
recomienda cada tipo de solucin de hematoxilina.
como el blsamo de Canad o resinas sintticas, cuyos
Dependiendo de la frmula de preparacin el tiempo
ndices de refraccin son similares a los del vidrio) y encima
puede variar de 3 a 20 minutos.
de ellos, una laminilla cubreobjetos, cuidando que no
La hematoxilina de uso ms frecuente es la
queden burbujas de aire entre la resina.
hematoxilina alumnica de Harris -------3 a 5 minutos
A continuacin se deja que el xilol se evapore, y la resina
4. Lavado en agua destilada (2 baos)------un minuto
adquiera solidez suficiente; para ello las lminas se colocan
cada uno.
en una platina caliente ( 45o 50o C) durante 24 a 48 horas y
estarn listas para ser observadas.
5. Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante, se
emplea el alcohol cido, hasta que los ncleos y los
Existen otros procedimientos en la tcnica histolgica que
componentes basfilos de las clulas sean lo nicos que
permiten la observacin de clulas y tejidos en los cuales no
permanezcan teidos
se utilizan colorantes naturales y/o artificiales. Estos
- lavar en agua corriente----------------- 2 minutos
procedimientos emplean sales de metales pesados, los
cuales se contacto con los componentes celulares y tisulares
6. Virar al color azul, empleando soluciones de:
y a travs, de sustancias reductoras u oxidantes se depositan
Sustancias alcalinas como agua amoniacal
en algunas de ellas (precipitacin o impregnacin). Al
Solucin de bicarbonato de sodio al 2%
conjunto de procedimientos se les conoce como
Carbonato de litio al 1%.
impregnaciones metlicas
- lavar en agua corriente -------------------- 5 minutos
- lavar en agua destilada (2 baos ) -------1 minuto c/u.

12