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Tesismadrid PDF
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TESIS DOCTORAL
CIUDAD UNIVERSITARIA
28040 MADRID
CERTIFICAN:
it 2< jCMCx,
A miabuelo
Deca un amgo mo, [.4, que haba que intentar todos los cambios, asomarse a
todos los mares, llamar a todas las puertas
C.J. Cela
Lina de las ltimas esperanzas es sencillamente que peds los motores ros
detengis a or la cancin de la vida Porque s porque suena bien, ypone la piel a punto
para las caricias de le libertad
3. Araujo
Quiero apresar mi agradecimiento al Profesor Dr Juan Antonio OrdoHez Pereda,
Director de este Departamento, por darme acogida en este centro y facilitarme la
realizacin de esta Tesis Doctoral
rambb quiero dar las gracis a las queseras dcteas del Jarama, Porlasa y
Cooperativa de Ganaderos Manchegos, por proporcionarme parte de las muestras
utilizadas en este trabajo, y en especial a los veterinarios Dr. Mario Rornn, Carlos Calvo
y Javier Pastor.
e
U
A mis am(gos de Albacete por haber sobrellevado m,~ angustias con paciencia y e.
e
e.
Quiero agradecer a todos los miembros de este Departamento su amistad y apoyo.
e
e
A mis compafleros de laboratorio por el da a da que hemos compartido, Eduardo,
Guiamar, Toms, Cormencita, y en especial, a LegoHa, que adems de ser una gran e
e
compaera, ha demostrado ser una excelente conductora, de insuperables destrezas en e
e
el arte de la serologa manchega y del moldeado artstico, y sobre todo por ser una e
amjqa. U
U
e.
A Esther, Youssef, y a los ya doctores Maribel y Adrin, autnticos aliados en la e
batalla contra las letras y los atropellos informticos, por compartir durante un afro la e
U
tecnolgicas, a Ana Haza, por sus buenas consejos electrnicos, a Mara Marn y e.
e
Manuela, a .Shangs, Sergio, Vktor y Rosalba que nunca olvidar aunque nos separen unos U
mis vecinitos LAS, Ana Surez, Jose Man y Carmen, y para Alicia, Adriana, Ana e.
Cspedes, Yolanda, tuis, Antonio, Mara Blanco, Jose Bruna, Elena, BeoyMatilde. U
e
e
Finalmente, quiero agradecer a la Junta de Castilla-La Mancha, la concesin de una e.
U
e.
U
U
e.
e.
e
mx
mx
NDICE
ndice
Pg.
ndice
Abreviaturas vii
1. INTRODUCCIN
1. Aspectos medioambientales de la actividad industrial 1
1. 1. Contexto social y normativo 1
1. 2. Problemtica medioambiental del sector agroalimentario, en
comparacin con otras actividades industriales 5
1. 3. Pautas para la caracterizacin de residuos y medida de la contaminacin
que producen 8
2. Subproductos alimentarios y sus formas de aprovechamiento 15
2. 1. Subproductos de origen vegetal 16
2. 2. Subproductos de origen animal 20
2. 3. El suero de quesera como subproducto 24
2. 3. 1. Produccin de suero a nivel mundial, europeo y espaol 24
2. 3. 2. Composicin de los principales tipos de suero de quesera 26
2. 3. 3. Principales formas de aprovechamiento del suero de quesera 31
2. 3. 3. 1. Utilizacin del suero completo 32
2. 3. 3. 2. Utilizacin del suero fraccionado 38
a. Protenas 39
b. Lactosa 41
2. 3. 3. 3. Tasas de aprovechamiento del suero de quesera 44
3. Residuos alimentarios 46
3. 1. Residuos slidos 46
3. 2. Residuos lquidos 47
3. 2. 1. Residuos lquidos de origen vegetal 47
3. 2. 2. Residuos lquidos de origen animal 51
4. Tratamiento de residuos alimentarios 60
4. 1. Residuos slidos 60
4. 2. Residuos lquidos 61
4. 2. 1. Tratamientos fisico-quimicos 62
4. 2. 2. Tratamientos biolgicos 68
Pg.
e.
u.
ndice
u.
lv
Pg. u.
u.
4. 2. 2. 3. Tratamientos combinados 81
4. 3. Vertidos lcteos 82
5. Levaduras en medios lcteos 95
5. 1. Levaduras que utilizan lactosa: principales gneros y especies 95
5. 2. Levaduras deseables en quesos y leches fermentadas 99
5. 3. Levaduras contaminantes en instalaciones y productos lcteos 101
5. 4. Rutas aerobias y anaerobias de utilizacin de lactosa 103
5. 4. 1. Transporte 104
5.4.2. Hidrlisis 106
5. 4. 3. Metabolismo intermediario 107
5. 4. 4. Utilizacin aerobia y anaerobia de azcares en distintas levaduras 109
5.5. Rutas de utilizacin de nutrientes nitrogenados 110
5.6. Floculacin de levaduras 113
5. 7. Procesos de bioconversin utilizando levaduras 115
U. .alat.tcaIsLlktz y d~I1LdL1UI1~ U1UU~LI14I~ Ut 14t,tflStI 1 iL
u
ndice
Pg.
111
U,
ndice
lv
u.-
Pg. u..
u,
u.
11. 5. Determinacin del Carbono Orgnico Total (COT) y del Carbono u.
Inorgnico Total (CIT) 161 u.
11. 6. Determinacin de compuestos orgnicos solubles 162
u.
mx
11. 7. 2. Ensayos enzimticos 165 mx
12. Determinacin de la actividad lactsica intra- y extracelular 166 e
12. 1. Preparacin y conservacin de las muestras 166 e.
e.
12. 2. Permeabilizacin de las clulas 166
U,
e
1. 1. Hidrlisis con ~-galactosidasa comercial 173
e.
1. 2. Productos de la hidrlisis 174 e
e
1. 3. Efecto de la hidrlisis del permeado sobre los cultivos aerobios con
e
inculo de aguas residuales 176 e.
1. 3. 1. Efecto sobre la flora 176 U
e
1. 3.2. Efecto sobre las frentes de C y la DQO 180
1.3.3. Efecto de la regulacin del pH sobre la DQO 185
1.3. 4. Efecto de la suplementacin con hierro sobre la DQO 188 0
U,
1. 3. 5. Formacin de cidos orgnicos, etanol y glicerol 190
2. Utilizacin de levaduras como pretratamiento en la depuracin de suero y e
de su permeado 197 e.
U
2. 1. Evaluacin y adaptacin de mtodos 197
e
e
e
e
iv U,
mx
U,
u.
ndice
Pg.
V. CONCLUSIONES 267
y
e.
pr
pr
pr
lv,
pr
mx
u.
u.
mx
mx
mxx
e
e
u.
e
mt
u.
e
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U
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e
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mt
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e
a
ABREVL4 TUllAS
mt
pr
pr
u,
u,
u,
u,
u.
mx-
e
mx
mx
mx
e,
e,
u.
mx
mx
e
e
mx
e,
e
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e
t
U
e.
U
e.
U
U
U
e
e
e.
e.
U,
e
e
e
e
e
e
e
mt
e
mt
U,
U,
Abreviaturas
lx
U,
Abreviaturas
t
uy
u,
U
NDIR: Detector No Dispersivo de Infrarrojos
NTA: cido Nitrio Triactico mt
e
OMEA: Agar de extracto de malta con oxitetraciclina e,
ONP: Orto-Nitrofenil O
U
ONPG: Orto-Nitrofenil--Galactopiransido e.
PCA: Agar para recuento en placa U
e
PES: Politer Sulfona e
t
a-
Abreviaturas
xl
L INTRODUCCIN
Introduccin
1
mx
e
Introduccin e,
e.
e
t
U,
tienen una consideracin especial los residuos considerados como txicos y peligrosos e.
U
(regulados en el RD 952/1997). Esta ley obliga al seguimiento de los residuos, incluidos e
los slidos urbanos, desde que son generados, as como su posesin, recogida y e
e
eliminacin, para lograr una gestin adecuada de los mismos, y defme las
correspondientes responsabilidades y competencias administrativas, y las normas sobre la U
U
declaracin de suelos contaminados. En relacin con los objetivos de esta Ley existen
e
diversas vas de apoyo pblico para el desarrollo de tecnologas limpias (plan PuMA, e
e
ATYCA, etc.) y para la gestin de residuos (como catlogos y bolsas de residuos, etc.). e,
U
Los vertidos lquidos estn regulados por la Ley de Aguas (Ley 29/1985, de 2 de e
agosto) y el Real Decreto-Ley 11/1995, de 28 de diciembre que es la trasposicin de la U
e.
Directiva 91/271/CEE sobre el tratamiento de Aguas Residuales Urbanas, para los e.
Hidrolgica (RiD 927/1988, de 29 de julio) que ampla los ttulos JI y III de la Ley, y el
e.
Reglamento del Dominio Pblico Hidrulico (RDPH) (RD 849/1986, de 11 de abril), e.
derivado de los ttulos Preliminar, 1, IV, Y, VI y VII. e.
e
destinado a la proteccin y mejora de las aguas de cada cuenca hidrogrfica, cuyo importe e.
es tlmcin de la carga contaminante. Existe por otra parte, una norma referente a los e.
e
venidos al mar, la Ley 22/1988, de 28 de julio, de Costas (desarrollada en el Real Decreto mt
U
1417/89).
U
El Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo (desarrollo de parte del RD-L 11/1995) U
Tabla 1. Relacin de algunos de los valores lmite para los venidos segn
diversas normas.
Concentracin
RDPH Ley 10/1993
Parmetro
1U> 509/1996
(RD 849/1986) (BOCAM, 12/11/93)
PH 5,5-9,5 6-9
Conductividad (jiS/cm)
5.000
Aceites y grasas (mg/L)
20~40* loo
Slidos en suspensin
(mgIL) 80~300* 35 (optativo) 1.000
DRO
5 (mg/L) 40~300* 25 .000
3
Introduccin
Por lo que se refiere a la Proteccin del ambiente atmosfrico est la Ley 38/1972
(de 22 de diciembre) y su desarrollo, el Decreto 833/1975 (de 6 de febrero), que establece
los niveles de inmisin y emisin de contaminantes, y especifica las actividades
industriales potencialmente contaminantes.
4
Introduccin
Los vertidos lquidos alimentarios suelen ser muy diversos, pero de fcil
biodegradabilidad; la mayora de ellos no se consideran peligrosos para la salud del
hombre, con la salvedad de que puedan estar fuertemente contaminados con pesticidas o
fertilizantes (Tarbox, 1993; Niranjan y Shilton, 1994). Frecuentemente, estas aguas
poseen un elevado contenido en materia orgnica, fsforo y nitrgeno (Niranjan y
Shilton, 1994; Amos, 1997); la acumulacin de estos nutrientes en lagos o cauces de agua,
denominada eutrofizacin, favorece un crecimiento excesivo de algas y vegetales
superiores, que provocan un desequilibrio del conjunto de organismos que habitan el
medio acutico y una prdida en las posibilidades de uso de las aguas y sus cauces.
5
e
Jntroduceln
u,
e
e
6
Introduccin
puede provocar una seria contaminacin de las aguas, la atmsfera y los suelos. Los
purines tienen un alto contenido en compuestos nitrogenados (mayoritariamente con
amonio) fcilmente oxidables a nitratos que, una vez en el suelo, pueden ser lixiviados y
contaminar aguas subterrneas o superficiales, o evaporarse a la atmsfera. (APXA,
1997).
7
e.
Introduccin
e.
u.
mx
que producen
u.
Todo residuo o vertido debe ser caracterizado antes de decidir su posterior u.
u.
tratamiento o destino. As, debe conocerse el volumen de residuos generados, su mx
los requeridos para la obtencin de su materia prima, a los que comporte la eliminacin de e
U
sus residuos. La tendencia en este sentido es que sean los productores los que carguen con e.
la responsabilidad de la gestin de los residuos, o que compensen econmicamente a la U
e
administracin pblica por desempear en su lugar esa funcin (Fullana y Puig, 1997). e,
e.
La caracterizacin de residuos slidos, a parte de realizarse como ya se ha indicado e.
para residuos en general, habr de regirse en los prximos aos segn lo que se regula e
e
para cada una de las 16 categoras previstas en la Ley 10/1998 dc Residuos y lo referente
a envases, en la mucho ms detallada Ley 11/1997 de Envases y Residuos de Envases y su e
e
correspondiente Reglamento. e.
e
La contaminacin atmosfrica se calcula analizando los niveles de emisin (las e
sustancias que se vierten a la atmsfera), as como el nivel de inmisin atmosfrico, esto e.
e.
es, la respuesta de la atmsfera para cada tipo de contaminante al actuar como depsito y e.
filtro. Los contaminantes atmosfricos se presentan en forma de gases o de partculas; e
e
entre los primeros se incluyen SO2, CO2, NO2, hidrocarburos, derivados del azufre, del e
nitrgeno, compuestos halogenados, etc. En forma de partculas se emiten los polvos e
e
(partculas sedimentables y en suspensin), humos y aerosoles. Tambin las mezclas de e.
compuestos voltiles que dan lugar a olores molestos, se consideran contaminantes U
e
atmosfricos. Las tcnicas para el anlisis de estos contaminantes estn desarrolladas en e
una Orden de 10 de agosto de 1976. e.
e
e.
e
U
e
8 mx
mx
e
Introduccin
9
Introduccin
e
mx
e
e
Las aguas residuales contienen normalmente miles de compuestos organicos mx
diferentes, por lo que no es posible realizar el anlisis individual de cada uno de ellos. Se
e
consumido al oxidarse la materia orgnica (DBO, DQO, DTO y DTeO) y los que
cuantifican la cantidad de CO2 as producido (COlfl (Ronzano y Dapena, 1995). e
e
Demanda Bioqumica de Oxgeno (DBO): Tambin denominada Demanda
Biolgica de Oxgeno Q3OD en ingls), es un indicador que se viene utilizando desde
hace unos 50 aos y representa el contenido en materia orgnica biodegradable. Se defme
como la cantidad de oxigeno en mgl (ppm) consumida en condiciones de ensayo
0C y oscuridad) durante el tiempo necesario para asegurar la oxidacin de
(incubacin a 20
las materias biodegradables presentes en el agua, por va biolgica. La DBO es el
indicador de contaminacin orgnica ms empleado para aguas residuales y refleja
solamente la materia orgnica eliminable, o mejor dicho digerible, por los
microorganismos presentes y en presencia de los inhibidores de stos que puedan coexistir
U
en la muestra. e
e
Tanto las aguas residuales procedentes de la elaboracin de alimentos como las
domsticas pueden tener un alto contenido en materia orgnica, por lo que, es necesario
e
diluiras correctamente antes de proceder a su anlisis, ya que de lo contrario el oxgeno
disponible podra agotarse antes de completarse el periodo de incubacin y la e
e
metabolizacin de la materia orgnica. Generalmente las muestras se diluyen con agua U
Con el sistema clsico de DBO, se calcula por diferencia el oxgeno consumido, tras
determinar el oxgeno disuelto que queda en la muestra. Sin embargo, la DBO puede
medirse tambin de forma continua cuando se dispone de un equipo de tipo Warburg.
e
lo e
U
U,
Introduccin
Este equipo consta de un recipiente que contiene la muestra y en cuyo interior se aloja un
segundo contenedor en el que se encuentra una solucin de KOH, capaz de absorber el
CO2 generado durante la incubacin. Gracias a un manmetro adaptado al recipiente de la
II
U
e
Introduccin
e
mx
u.
mx
Las razones por las que en la actualidad la DBO se utiliza cada vez con menos u.
frecuencia son el prolongado tiempo de incubacin, la necesidad de diluir algunas e
e
muestras de forma considerable y la posibilidad de que las muestras contengan sustancias e
e
orgnico de las aguas por la determinacin del 02 consumido en su reaccin con agentes mt
e
qumicos fUertemente oxidantes, en caliente y medio cido (Rodier, 1981; Ramalho, 1991;
e
Metcalf y Eddy, 1998; Ronzano y Dapena, 1995). Actualmente se emplea el mtodo
e
normalizado del dicromato potsico, que junto con la muestra y en presencia de cido e.
sullUrico, se mantiene durante 2 horas a altas temperaturas y reflujo para llevar a cabo la e
U
oxidacin de los materiales presentes, biodegradables o no (Ramalho, 1991; APHA- U
e
Materia orgnica (CaHbOc) + Cr2Oj 2 + H~ > Cr~3 + CO
2 + H20
U
U
e.
Tras la oxidacin se realiza una valoracin colorimtrica con sulfato amnico U
mtodos slo permiten la determinacin de alrededor del 65% del valor obtenido con el
e
mtodo normalizado, en el caso de aguas residuales (Ramalho, 1991), y del 60-70%, en el U
12 mt
U,
e
Introduccin
relativamente sencilla que se puede automatizar (Ronzano y Dapena, 1995). Desde hace
poco tiempo se encuentra en el mercado un kit para el anlisis de la DQO (para un
mtervalo de O a 20.000 ppm de 02) en muestras lcteas, comercializado con la marca
Tubetest por la empresa Palintest (Annimo, 1 998c).
13
e,
e
Introduccin
concentracin de cada uno de sus componentes (Droste, 1997). Para su clculo se debe
mx
establecer el balance de la reaccin estequiomtrica de cada uno de los componentes
e
orgnicos con el oxgeno para rendir H20, CO2 y/o compuestos inorgnicos oxidados. La u.
e
DTeO total del agua residual corresponde al sumatorio de las DTeO individuales u.
obtenidas. A continuacin se muestra, a modo de ejemplo, el clculo de la DTeO de una
u.
muestra que contiene 150 mgL de glucosa y 15 mgl de benzeno:
u.
Las ecuaciones para la oxidacin total de ambos constituyentes y los
u.
correspondientes pesos moleculares son e
mx
e
mt
mt
e
U
la DTeO de la solucin es U
e.
1,07 x 150 mg/L + 3,08 x 15 mg/L = 206,7 mg 021. U
U
Carbono Orgnico Total (COT): Los mtodos que determinan el COT se basan en
la oxidacin del carbono de la materia orgnica a CO2, que se mide con un analizador de
infrarrojos no dispersivo. Entre los mtodos ms utilizados estn los de oxidacin
cataltica en horno a alta temperatura (oxidacin por combustin) y los de oxidacin
hmeda a baja temperatura. En un fUturo, es probable que el COT se implante como
sistema de control de aguas residuales, ya que pennite un anlisis rpido (5-10 mlii),
automatizado y continuo de las muestras, siendo adems ms riguroso que la DQO
(Ronzano y Dapena, 1995; Metcalf y Eddy, 1998). Esta tendencia analtica se recoge en la
U
e.
14 U,
U,
mt
Introduccin
Directiva 91/271/CEE, donde se explicita que la medida del COT puede sustituir a la de
DQO siempre y cuando se establezca previamente la relacin entre ambos parmetros
para cada tipo de muestra. La principal limitacin de este mtodo es que no aporta
mformacin sobre el estado de oxidacin de la materia orgnica y por tanto sobre la
cantidad de oxgeno necesario para llevar a cabo dicha oxidacin. Adems, en el caso de
muestras brutas pueden existir problemas de inyeccin y requiere reactivos altamente
corrosivos, como el cido sulfrico o fosfrico.
15
U
e
Introduccin
e-
de Residuos para facilitar su aprovechamiento por empresas distintas de las que los
generan. A continuacin se hace un resumen por sectores de los principales subproductos e
e
de la industria alimentaria, y sus posibles formas de aprovechamiento. Se ha excluido de
este resumen el llamado producto no conforme, que no se puede comercializar. Su mx
mx
aprovechamiento depende del tipo de defecto que presente, que puede no afectar a su e
u.
idoneidad como alimento (es el caso de unidades o partidas con peso o etiquetado
mx
incorrecto). mx
mx
mx
U,
mt
16 mt
U
mx
e
Introduccin
Los bagazos de caa de azcar, la pulpa de remolacha y las melazas son los
subproductos tpicos de la industria azucarera. Los bagazos de caa de azcar se han
17
e
Introduccin
e
e-
1998). U
U
18 e
mt
U
e
Introduccin
19
introduccin
mx,
U
pas. As, en EEUU se considera subproducto cualquier parte de un animal que no sea la U
e
canal limpia (Ockerman y Hansen, 1994). Sin embargo, en otros pases como Espaa, U
existe tradicin de consumo de algunos despojos como hgado, riones y lengua, que no U
e
se consideran subproductos. El empleo de vsceras para consumo humano se ha reducido e
mucho en los ltimos aos debido a los frecuentes casos de contenidos excesivos de U
U
diversos medicamentos y contaminantes ambientales. Hay adems otras razones para el e
e
descenso en el consumo de estos productos: la alta velocidad de deterioro (caso por e.
ejemplo del hgado y diversas glndulas por su alto contenido en enzimas), el contenido e
e.
alto de colesterol (caso de los sesos), o de grasas saturadas de los guisos en que se U
u
u
20
Introduccin
tipo de carne, conocida como carne recuperada mecnicamente, puede llegar a rendir 6,5
kg por cabeza de vacuno y es muy apreciada, por sus propiedades fUncionales, como
ingrediente para la elaboracin de numerosos productos crnicos (Ockerman y Hansen,
1994).
Entre los subproductos tpicos de la industria crnica destacan las pieles y los
huesos, que pueden llegar a suponer entre el 12-19% del peso del animal vivo (Ockerman
y Hansen, 1994). Aunque de las pieles se pueden obtener productos tan diversos como
felpudos, brochas, productos cosmticos a base de colgeno, etc., sus principales clientes
son la industria del cuero y calzado. Los huesos, tras su tratamiento trmico, se emplean
frecuentemente, solos o junto con restos de carne, para la obtencin de harinas para el
ganado. Una caracterstica de los huesos y de las pieles es su alto contenido en colgeno,
por lo que se emplean a menudo para la produccin de colas y gelatinas. Las gelatinas se
emplean por sus propiedades gelificantes, espumantes, emulsificantes y de textura en la
elaboracin de caramelos blandos, cerveza, quesos, y como agentes de recubrimiento en
derivados crnicos. La gelatina (colgeno desnaturalizado) se caracteriza por la falta
absoluta de trptfano, por lo que necesita combinarse en la ingesta con casi cualquier otra
protena, para ser aprovechada como fUente de aminocidos esenciales. Las colas, por sus
propiedades adhesivas, suelen destinarse a industrias de carpintera, cartonaje y papelera.
21
e
e
Introduccin U
e.
e.
e
e.
fresca, congelada o desecada. El fraccionamiento de la sangre no coagulada e -
e.
higinicamente extrada para obtener plasma deshidratado (mayoritariamente albmina),
U
un excelente gelificante y espumante, es prctica relativamente comn en la industria e.
e.
aminocidos esenciales, con los azufrados (Met -f- Cys) como limitantes. e
U
En el aprovechamiento de los subproductos avcolas, adems de la obtencin de e
U
harina de huesos y carne recuperada mecnicamente, hay que sealar tambin el empleo
e.
de plumas para la fabricacin de ropa de cama, equipos deportivos, aislamientos y e.
e
fertilizantes. Sin embargo, la produccin de harina de plumas es el proceso actualmente de e.
mayor importancia. Las plumas se caracterizan por un alto contenido en queratina, una e.
e
protena de bastante baja digestibilidad, por lo que la calidad nutritiva de las U
olor y sabor a pescado a la carne de los animales consumidores, las harinas son una buena e.
e
fUente de aminocidos esenciales, vitaminas del grupo B y minerales, y los aceites de e.
vitaminas A y D. Estos ltimos se pueden refmar para su empleo en consumo humano, e.
e.
U
U
U
22 0
u
u
e
Introduccin
23
Introduccin
24
Introduccin
En Espaa existen 504 queseras, lo que representa el 48% del total de las industrias
del sector lcteo. De ellas tan solo 28 tienen una produccin superior a 2.500 Tm]ao
(MANiLA, 1996). La cantidad total de queso producido en nuestro pas en 1995 ha sido
estimada por la FAO (1996) en 172.000 Tm y por la FENIL en 269.000 Tm (Annimo,
1998a). Segn esta ltima fUente, la produccin en 1996 fUe similar a la del ao anterior,
correspondiendo el 50% a queso de mezcla, el 25% a queso de vaca, el 14% a quesos
fUndidos y el resto a quesos de oveja y cabra (Annimo, 1998a). Aunque en Espaa se
comercializan ms de 100 variedades de queso, destaca por su volumen de produccin,
despus del queso de mezcla, el de vaca fresco, que en 1996 alcanz las 4547.000 Tm
(Annimo, 1997). A pesar de que los quesos con Denominacin de Origen son muy
apreciados en nuestro pas, su produccin fUe tan slo de 8,2 Tm en 1996,
correspondiendo el 50% de esta cifra a queso Manchego (Annimo, 1997). En general, se
puede decir que la produccin quesera espaola se mantiene ms o menos constante, ya
que el aumento en la produccin de quesos frescos ha sido compensado por un descenso
en la elaboracin de quesos de mezcla (P. Valentn Gamazo, comunicacin personal).
Los quesos producidos en continuo (una proporcin muy pequea, actualmente) son
los nicos que no dan lugar a suero como subproducto. Su proceso de elaboracin
comienza por la concentracin de la leche por ultrafiltracin (dando como subproducto un
lquido permeado ms pobre en material nitrogenado que el obtenible a partir del suero de
quesera convencional) y despus de la coagulacin no se realiza desuerado.
25
Introduccin
mx
mx
mx
2. 3. 2. Composicin de los princ~ales tipos de suero de quesera
mx
El Cdigo Alimentario Espaol, define como suero los lquidos formados por parte mx
U
de los componentes de la leche que resultan de diversos procesos de elaboracin de mx
productos lcteos. Esta defmicin incluye el suero de quesera, el de mantequilla
U
(mazada) y los procedentes de la obtencin de casenas. El suero de quesera es ah mx
defmido como el lquido residual de la elaboracin del queso.
e
e
sea ms o menos lctica y/o enzimtica se obtienen distintos tipos de cuajadas y sueros. U
1984; Zal, 1992; Madrid, 1994; Castillo y col., 1996). La Tabla 2 muestra una relacin de e
U
minerales, cido lctico y bastante alta concentracin de vitaminas del grupo B (Hargrovc U
U
y col., 1976; Glass y Hedrick, 1977a; Glass y Hedrick, 1977b; Marwaha y Kennedy, e
e
1988; Zal, 1992; Luquet, 1993; Madrid, 1994; Mawson, 1994; Yang y Silva, 1995;
U
Castillo y col., 1996; Gonzlez Siso, 1996). e.
U
La lactosa suele estar presente en sueros dulces o cidos en similar concentracin, e.
e
aunque, en algunos sueros cidos, su nivel puede ser algo ms bajo como consecuencia de
U
U
queso (Olass y Hedrick, 1 977a; Mawson, 1994). El contenido mineral suele ser
e
ligeramente superior en los sueros cidos (1-largrove y col., 1976; Glass y Hedrick, 1977b; mt
e
Zal, 1992). En este tipo de sueros puede ser tambin particularmente alta (hasta 0,7%) la U
e
e
U,
26
U
e
Introduccin
cantidad de cido lctico (Mawson, 1994). Ambas variedades de suero suelen presentar un
alto contenido salino, constituyendo el NaC y el KCI ms del 50% del total de las sales
presentes (ZaIl, 1992; Gonzlez Siso, 1996). Los sueros, particularmente los cidos,
contienen bastante fosfato clcico (Glass y Hedrick, 1977b; Gonzlez Siso, 1996) y son
muy pobres en hieao y yodo (Glass y Hedrick, 1977b; Zal, 1992). En general, los sueros
son una excelente fuente de vitaminas del grupo B, especialmente de B12, riboflavina,
cido pantotnico, biotina y colina (Glass y Hedrick, 1977b; Zal, 1992; Madrid, 1994).
Factores ambientales
Manipulacin de la cuajada
Edad
Tamaflo del corte
Alimentacin Temperatura/tiempo
Nmero de partos Agitacin
Desuerado
Fase de la lactacin
27
mx
Introduccin
Contenido en slidos mx
Lactosa 4,4-5,1 3,7-5 4,9-5,8 4,3-4,55 mx
e.
Contenido en minerales e
Calcio 0,04-0,05 0,1 0,04-0,05 0,14 e.
Fsforo 0,03-0,05 0,08 0,03 e.
Hierro <0,001 0,001 <0,001 <0,001 U
e.
Sodio 0,04-0,5 0,05 0,04-0,06 0,05
U
Potasio 0,13-0,16 0,14 0,13-0,18 0,17 e.
o
Vitaminas <> U
Vit. A (UI/l00 g) 69-240 47-165 - e
28
Introduccin
El componente de los sueros con mayor valor comercial son las protenas, que
constituyen del 0,5 al 0,9% del peso hmedo. La protena del suero bovino tiene un perfil
de aminocidos esenciales tan bueno como el de la Protena de Referencia de la FAO (la
protena imaginaria que representa la proporcin de aminocidos ideal para cubrir las
necesidades humanas). Por ello se emplea en preparados para lactantes. El nivel de lisina
es incluso mayor que el de la Protena de Referencia, por lo que complementa
perfectamente a la protena de cereales, limitante en este aminocido.
Separando las protenas del suero por ultrafiltracin, o bien por precipitacin
mediante calentamiento o tratamiento con sales, se obtienen, respectivamente, el
permeado y el suero desproteinizado (Zadow, 1984; Zal, 1992). Aunque su contenido en
solutos de bajo peso molecular es similar al de los correspondientes sueros, su contenido
en grasas y material nitrogenado depende del tamao del poro de la membrana de
filtracin o del tratamiento de desproteinizacin aplicado. Aunque en esta tesis se ha
trabajado sobre todo con penneado procedente de la ultrafiltracin de suero de quesera
dulce, incluimos en la Tabla 3 la composicin qumica descrita por varios autores para
29
Introduccin
mx
mx
*
mx
diferentes permeados de ultrafiltracin (utilizando membranas con poros de distintos mt
e
tamaos).
mx
mt
e
mt
e.
Histidina 0,12-0,28 0,03-0,16
e.
Arginina 0,04-0,21 0,09-0,25 e.
cido asprtico 0,25-0,41 0,04-0,43 mt
e
Serma 0,06-0,08 0,05-0,17
U
cido glutmico 0,95-3,32 0,28-2,50 e
e.
Prolina 0,49-1,74 0,15-0,83
e
Glicina 0,03-0,07 0,07-0,38
e.
Alanina 0,06-0,21 0,07-0,52 e
Valina U
0,03-0,16 0,02-0,15
U
Leucina 0,05-0,17 0,02-0,10 U
Tirosina 0,2 1-0,99 0,02-0,20 e
U
Fenilalanina 0,09-0,29 0,02-0,28
U
Cistina 0,01-0,04 0,04
U
U
U
a
30
U
mt
Introduccin
mgl (Marwaha y Kennedy, 1988; Reinbold y Takemoto, 1988; Harden, 1996). Una
fbrica que procese 100.000 L de leche/da da lugar a una contaminacin equivalente a la
generada por una poblacin de 55.000-65.000 habitantes (Gonzlez Siso, 1996; MMA,
1996). Los 4,6 millones de litros de suero generados diariamente en Espaa, en caso de no
ser utilizados o depurados aportaran una carga contaminante equivalente a la de las aguas
residuales domsticas generadas por 4,5 millones de personas.
31
Introduccin
mx
mx
mx
U
formas de aprovechamiento. U
U
fertilizante natural (Yang y Silva, 1995). Para queseras con producciones de entre 50.000 U
U
y 200.000 L de suero/da puede ser rentable instalar un sistema de ultrafiltracin para
recuperar las protenas, o fabricar requesn o suero en polvo, o incluso emplear algn tipo U
U
de fermentacin para la produccin de suero amoniacal (FACW Fermented Ammonium U
e
e
2. 3. 3. 1. Utilizacin del suero completo e
U
Entre las principales altemativas disponibles para la utilizacin del suero sin ningn e
e
tipo de tratamiento est su adicin a piensos y aguas de bebida de animales, sobre todo
U
de cerdos (Marwaha y Kennedy, 1988; Morr, 1992; Yang y Silva, 1995; Gonzlez Siso, U
U
e
32 mt
mt
mt
mx
Introduccin
<1)
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u
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H
1
33
mx
Introduccin
y-
e
e
1996). El empleo del suero en polvo para alimentacin animal ha constituido hasta hace
e
poco una de las aplicaciones ms importantes, bien incorporado a piensos o frmulas para
u
animales lactantes, o bien en forma de bloques para lamer (Hobman, 1984; Morr, 1992;
e
Yang y Silva, 1995). La deshidratacin o concentracin de los sueros facilita su manejo y
e
abarata su transporte a las granjas, a la vez que preserva las cualidades del suero fresco. e
e
Adems, aplicando ligeras transformaciones (por mezcla o fermentacin) se han logrado
aditivos para alimentacin animal aceptados por la FDA (Food and Drug Administration) e
U
de Estados Unidos, como es el suero amoniacal (o FACW) antes citado, que se destina a U
anlogo de queso (Mysost) evaporando por ebullicin cerca del 50% del agua. U-
e
Aunque el principal destino de los sueros en polvo sea la alimentacin animal U
e
(Gonzlez Siso, 1996), en inferior proporcin se utilizan tambin en alimentacin
humana, como ingredientes alimentarios en la industria lctea (yogures, helados, postres),
e
crnica (embutidos cocidos), panadera, pastelera y en la fabricacin de bebidas (para
deportistas, por ejemplo) y alimentos infantiles (Mathur y Shahani, 1979; Marwaha y U-
e
Kennedy, 1988; Morr, 1992; Gonzlez Siso, 1996). En estos productos, el suero (a veces e
limitante para la utilizacin del suero es el alto contenido en sales, que le confiere un U
e
sabor salado/metlico poco atractivo para el consumidor y que es ms acusado en los e
sueros cidos (Hoppe y Higgins, 1992; Morr, 1992; Gonzlez Siso, 1996). La U
e
desmineralizacin (por smosis inversa, por ejemplo), amplia pues considerablemente las e
posibilidades de aplicacin (Hoppe y Fliggins, 1992). En la Tabla 5 se presentan algunas U
e
de las aplicaciones comerciales del suero como ingrediente en alimentos. Dentro de estas e
e
U
34 e
e
e
Introduccin
Suero dulce
Quesos especiales
Requesn
Helados
Panes, bollos, galletas
Glaseados, caramelos y recubrimientos para caramelos, chocolate
Margarina, salsas, tentempis
Zumos de frutas y otras bebidas
Sopas, alimentos infantiles
Productos crnicos
Suero cido
35
U
Introduccin *
U-
e
U
u,
1998). Para este uso, se somete previamente el suero fresco a un proceso de incubacin, e
U
para promover el crecimiento de la microflora especfica para la maduracin de esos
U-
quesos. Tambin se han empleado sueros como medio de cultivo, para cl desarrollo de u
e
cultivos iniciadores destinados a la fabricacin de yogures, mantequilla, etc. (Mathur y
Shahan, 1979). U-
e
Aunque en muchas ocasiones se requiere su suplementacin con nutrientes, o el uso e
U-
de tratamientos previos, el suero constituye un excelente medio de cultivo para un amplio e.
nmero de microorganismos. Se han desarrollado diversos procesos biotecnolgicos, de e.
U
bioconversin o fermentacin del suero, orientados a la obtencin de diversos tipos de
e.
materiales: a) productos que se obtienen en grandes volmenes, pero con un valor U
e
comercial relativamente bajo, como es el caso del metano, el etanol, la biomasa proteica, e.
o los efluentes tras la depuracin; b) productos con un valor comercial mayor y que U
U
tambin se producen en grandes cantidades (ingredientes o aditivos para alimentacin e.
Los procesos de bioconversin del suero se basan sobre todo en el uso de levaduras,
U-
y sern ampliamente descritos en la seccin 5. 7. de esta Introduccin. Sin embargo, e.
la sal en carreteras heladas (Yang y Silva, 1995). Otro caso es el del cultivo de Shewareta U-
mt
putrefaciens en suero dulce, para obtener cidos grasos oi~-3 empleables en dietas e.
e
adecuadas para patologias cardiovasculares e inflamatorias (Cadieux y col., 1998).
U
En agricultura, y por su aptitud como fertilizante se est utilizando suero, dentro de e
determinados limites, para riegos de terrenos (Robbins y Lehrsch, 1998). El uso de suero e.
U
para riego debe ser muy controlado ya que puede conducir a una excesiva salinizacin de
e
los suelos (Zal, 1992; Yang y Silva, 1995). Recientemente, se ha visto que la adicin e
e
conjunta de suero y paja a terrenos calcreos susceptibles de erosin, puede mejorar su
U
U
mt
36 mt
mt
Introduccin
cido lctico Bacterias lcticas, horno- y Suero o permeado con o sin (3 9 10, 13)
heterofermentativas suplementacin
Xanthomonas sp.
Polisacridos (xantano) Arthrobacter sp. Suero (3)
Alcaligenes sp.
Zooglea sp.
Diacetilo Lactococcus lactis subsp. lactis Suero (3)
cido giberl ico Fusariwn moniftforine Suero 3
37
Introduccin
estabilidad y permeabilidad (Brown y col., 1998). Esta aplicacin podra ser de inters en
nuestro pas, de gran tradicin en el cultivo de cereales y con serios problemas de erosin.
El primer paso del fraccionamiento del suero para la separacin de las protenas se
lleva a cabo generalmente por ultrafiltracin, o por desnaturalizacin trmica y/o
isoelctrica; las protenas desnaturalizadas se recuperan por decantacin o centritbgacin
(Hobman, 1992). La desproteinizacin da lugar a un subproducto liquido que posee
todava el 90% de los slidos del suero. La ultrafiltracin se realiza a travs de membranas
semipermeables, que en el caso del suero excluyen molculas con peso molecular superior
a 15.000-25.000 daltons. El proceso se realiza a presin, y el flujo del lquido es
tangencial a la membrana. La solucin que atraviesa la membrana se denominapermeado
y contiene, adems de agua y lactosa, minerales y nitrgeno no proteico. Al lquido que no
atraviesa la membrana, se le llama retenido y es un concentrado de protenas y restos de
grasa, adems de incluir lactosa y sales en la misma concentracin que el suero. Para
rebajar la concentracin de molculas de pequeo tamao, se puede aadir agua al
retenido y tiltrarlo de nuevo (lo que se llama diatiltracin).
38
Introduccin
a. Protenas
Las protenas del suero representan el 20% del total de protenas de la leche.
Aproximadamente un 50% de las seroproteinas corresponde a la p-lactoglobulina y un 12-
20% a la a-lactoalbmina; el resto est constituido por inmunoglobulinas, seroalbmina
bovina (BSA), lactoferrinas, lactoperoxidasa, casein macropptido (CMP) y otras
fracciones peptdicas (Renner, 1992; Morr y Ha, 1993; Gonzlez Siso, 1996; Clare, 1998).
Como ya se ha indicado, estas protenas tienen un alto valor nutricional, por lo que se
aprovechan sobre todo en preparados para lactantes y nios de corta edad. Sus
propiedades funcionales son excelentes, por lo que su utilizacin como ingrediente en
todo tipo de alimentos est aumentando considerablemente en los ltimos aos (Mann,
1997a); cabe destacar sus cualidades como emulsionante y espumante, su alta solubilidad,
su gran aptitud gelificante y adhesiva y su elevada capacidad de retencin de agua
(Mangino, 1992; Mor y Ha, 1993; Castillo y col., 1996; De Wit, 1998; Ju y Kilara, 1998).
Los derivados del suero ms conocidos son los concentrados proteicos, conocidos
por las siglas WPC (Whey Protein Concentrate) (Morr y Ha, 1993; De Wit, 1998), y
obtenidos por ultrafiltracin, dafiltracin y secado (Mangino, 1992). Los WPC tienen
entre un 35- 75% de protenas (Pearce, 1992; Mor y Ha, 1993; De Wit, 1998) y se
emplean en productos lcteos, tentempis, caramelos, chocolates, sopas, salsas, pelculas y
recubrimientos comestibles, productos de panaderia y crnicos, alimentos dietticos,
bebidas, etc. (Mathur y Shahani, 1979; Mangino, 1992; Mor y Ha, 1993; Baneijee y
39
Introduccin
Chen, 1995; Brun y Dalgleish, 1997; Le Hnaff y col., 1997; De Wit, 1998; Gogoi y col., e,
1998; Kailasapathy y Supriadi, 1998; Kim y Ustunol, 1998; Levy y McGregor, 1998;
mt
Sherwin y col., 1998). e,,
e.
FI desarrollo de los procedimientos de separacin por membranas ha permitido la
obtencin de productos mejorados, como los aislados proteicos o WPI (Whey Protein
Isolates), que se obtienen combinando ultrafiltracin y cromatografia de intercambio
inico, y cuyo contenido en protenas es mayor (90-95%) (Castillo y col., 1996; De Wit,
1998). Su calidad funcional y el hecho de estar prcticamente libres de lactosa, grasa y
minerales, hace a los WPI muy verstiles e idneos para muy diversas aplicaciones como
ingredientes funcionales y nutritivos (Morr y Ha, 1993; Castillo y col., 1996, De Wit,
1998). Un ejemplo de aplicacin de alto valor aadido son los geles microparticulados
empleados como imitadores de grasas (Simplesse, Trailbazer). Los WPJ sirven tambin
para elaborar pelculas comestibles (Banerjee y Chen, 1995; Miller y col., 1998; Yildirim
y Hettiarachchy, 1998) y se est estudiando la posibilidad de hacer con estas protenas
microcpsulas para vehicular sustancias lquidas fcilmente oxidables (Rosenberg y col.,
1998; Sheu y Rosenberg, 1998). u,
U
40 U
mt
mt
Introduccin
lactoperoxidasa (0Mev, 1994; Yang y Silva, 1995; Mann, 1997a; Mann, l997b; Kim y Li-
Chan, 1998). Recientemente estn recibiendo mucha atencin las propiedades y
posibilidades de aprovechamiento del CMP (tambin denominado glicomacropptido, o
GMP) que en ocasiones puede llegar a representar hasta el 15% de las proteinas del suero;
sus posibilidades para la elaboracin de dietas para fenilcetonricos son prometedoras ya
que carece de aminocidos aromticos, adems de poseer excelente capacidad
eniulsificante y buena solubilidad en intervalos amplios de pH y temperatura (Clare,
1998).
b. Lactosa
41
Introduccin
e,
e,
chocolates) (Zadow, 1984; Harper, 1992; Yang y Silva, 1995; Morr y Barrantes, 1998).
Las principales propiedades por las que se utiliza este disacrido en alimentos son el bajo
poder edulcorante, la aptitud para la fijacin de aromas, la adsorcin de pigmentos y
voltiles, el poder emulsificante y agregante, la mejora de la textura, la participacin en
reacciones de Maillard (favoreciendo la coloracin tostada tpica de los productos de
panadera) y la potenciacin de la absorcin intestinal del calcio (Zadow, 1984; Harper,
1992; Yang y Silva, 1995). Tambin se emplea frecuentemente como excipiente en la
fhbricacin de medicamentos como pldoras o pastillas y como sustrato en los cultivos
para la produccin de antibiticos (Zadow, 1984; Harper, 1992). Se utiliza adems, para la
produccin de espumas rgidas de poliuretano, empleadas como materiales de
construccin y para embalaje (Hu y col., 1997).
U
U-
42
U
U
Introduccin
43
Introduccin
Los datos ms recientes indican que aproximadamente un 60% del suero europeo
est siendo aprovechado (De Wit, 1998). De esta cantidad, un 45% se emplea
44
Introduccin
45
u,
Introduccin
el suero que destina a la venta para piensos (FENIL, 1998). Curiosamente, y a pesar del
escaso aprovechamiento, en Espaa se est importando cada vez ms protena concentrada
(FENIL, 1998), lo que resalta la conveniencia de explotar esta alternativa.
Segn datos estimados por la FENIL (1998) la produccin anual de suero en polvo e,
en Espaa estaba en 1997 por debajo de las 50.000-60.000 Tm, y la de lactosa se cifraba
e,
en unas 2.500 Tm. Actualmente, existen varios proyectos de asociacin de varias e,
e,
(Alimarket, 1998). e,
e
e
u,
3. RESIDUOS ALIMENTARIOS
e,
e
alimentos de origen vegetal son asimilables a, o eliminables como, residuos slidos u,
urbanos y por tanto deben cumplir lo dispuesto en la Ley 10/1 998. Sin embargo, las tierras U-
e>
separadas durante las fases de recepcin y limpieza de las materias primas se pueden u,
destinar a su valorizacin para tratamiento de los suelos, tal y como indica el apartado U-
e.
R.1O del anexo II.B de la Decisin 96/350/CE. e.
mt
Los residuos de origen animal, y en especial los de mataderos, deben por razones u,
sanitarias, transformarse para la elaboracin de piensos o eliminarse por procedimientos U-
U
especiales legislados en el Real Decreto 2224/1993. Esta norma es de aplicacin cuando la e.
adoptar con los animales afectados de enfermedades graves y a los continentes de residuos U-
u,
Mu.~ pu.uaIl a~1ata a a a4IUu IItflhlmIa U alIllilal ~ U aJIA.aI ~t.ito a u ua~aiiitai~u U
trmico adecuado. u,
u,
u,
46
e
mt
e
Introduccin
3. 2. Residuos lquidos
47
a
Introduccin
Las aguas residuales generadas durante la extraccin del aceite de oliva reciben el
nombre de alpechines o aguas de vegetacin. De carcter cido (pH 4,5-5,2), aspecto
oscuro y olor desagradable, los vertidos de las almazaras varian ostensiblemente en su
volumen y composicin dependiendo de la variedad de aceituna, poca de recoleccin,
climatologa, tipo de suelo de cultivo y sobre todo, del sistema de extraccin del aceite (Di
Giovaechio, 1998; Civantos y col., 1992; Garca Rodrguez, 1991). Si la extraccin se
realiza por prensado, se generan del orden de 0,5-0,8 L de alpechn por cada Kg de
U
48 mt
mt
mt
a
Introduccin
aceituna procesado (Hamdi, 1996; Civantos y col., 1992) y con un poder contaminante
muy elevado, 120.000-130.000 mg/l de DQO (Fiestas y Borja, 1991). Si se emplea
centrifUgacin en continuo (la aceituna molida y batida con agua, se centrilliga en un
decantador o centrfUga horizontal que separa 3 fases diferentes: orujos, alpechines y
aceite), se producen mayores volmenes de alpechines ms diluidos (0,9-1,2 L/Kg
aceituna) y con carga contammante inferior, 45.00080.000 mg/L DQO (Uceda Ojeda y
col., 1995; Civantos y col., 1992; Fiestas y Borja, 1991). Los azcares, mucho ms
elevados en los alpechines de prensado (20-80 gIL), que en los de centrifUgacin (5-26
gIL) (Civantos y col., 1992; Garca Rodrguez, 1991), son uno de los componentes
orgnicos mayoritarios. La biodegradabilidad de los alpechines es sin embargo bastante
baja, ya que la presencia de grandes cantidades de compuestos fenlicos (10-24 g/L en
prensado y 3-8 gIL en centrifUgacin) (Civantos y col., 1992; Garca Rodrguez, 1991)
tiene un frene efecto antimicrobiano (Fiestas y Borja, 1991). Aunque poseen una carga
contaminante inferior, los alpechines de centrifUgacin presentan niveles de SS superiores
a los de prensado (9.000 mg/L frente a 1.000 mg/L; Civantos y col., 1992; Fiestas y Borja,
1991), y un mayor contenido en grasas emulsionadas (3.000-10.000 mg/E frente a 300-
4.500 mg/L) (Uceda Ojeda y col., 1995; Fiestas y Borja, 1991). El resto de los
componentes caractersticos de los alpechines, se encuentran en similar proporcin en los
de prensado y centrifUgacin e incluyen sustancias nitrogenadas (1-25 gIL), cidos
orgnicos (5-15 gIL), polialcoholes (10-15 g/L), hemicelulosas, pectinas, muclagos y
taninos (10 gIL) (Garca Rodrguez, 1991). Al igual que los materiales orgnicos, los
contenidos minerales son ms elevados en los alpechines de prensado (15 g/L frente a 4
g/L en los de centrifUgacin), siendo el potasio y el fsforo los elementos mayoritarios (>
1 giL) (Civantos y col., 1992; Kiritsakis, 1992).
49
e
Introduccin
e,
es
e
e
A principio de los aos 90 se empezaron a implantar en la industria aceitera los
procesos de centrifUgacin de 2 fases (que separan el aceite del resto de los componentes,
U
denominados alperujos), promovidos principalmente por exigencias medioambientales u,
(Di Giovacehio, 1998; Uceda Ojeda y col., 1995). La mayor parte de los componentes del U
U
alpechin quedan as retenidos en el alperujo, cuyo destino, a pesar de su mayor contenido e
U
acuoso, es similar, tras un secado ms intenso, al de los orujos tradicionales (Suria
U
Guasch, 1996). La fase oleosa separada arrastra pequeas cantidades de alpechin (0,036- e
U
0,2 L/Kg aceituna), de bajo contenido graso (400 mg/L; Uceda Ojeda y col., 1995), cuya
U
solventes (Domnguez y col; 1995; Ziga y col., 1995) y para desarrollar la extraccin U
u,
con fluidos supercriticos como el CO2, no txico y de manejo ms sencillo que los
solventes orgnicos (Cocero y Calvo, 1995). U
e.
Dentro del sector de bebidas alcohlicas, las industrias dedicadas a la fabricacin U
U
de cerveza son las que producen un mayor volumen de vertidos (Wheatley, 1994). Se ha u,
estimado que este tipo de industrias descargan entre 2,4 y 9 L de agua residual por cada L mt
u,
de cerveza producido (Tarbox, 1993). Su carga contaminante es, sin embargo, moderada e.
en comparacin con la de otros sectores; la DQO oscila entre 500 y 1.800 mg/E, de la cual e
U
el 60% procede de las aguas de lavado de los tanques de fermentacin y el contenido en u,
U-
u
50 U
mt
mt
Introduccin
SS suele ser de 240-800 mgIL (Hough, 1990; Wheatley, 1994). La relacin DBOIDQO se
sita entorno a 0,67; son pues vertidos fcilmente biodegradables durante los tratamientos
aerobios normalmente empleados en la depuracin (Wheatley, 1994).
Sin lugar a dudas, los efluentes con mayor poder contaminante de este sector son los
procedentes de destileras, con valores de DQO comprendidos entre 10.000 y 60.000
mgIL (Tarbox, 1993; Wheatley, 1994). El consumo de agua en estas industrias es de
alrededor de 10 L por L de aguardiente elaborado (Wheatley, 1994). Tanto los efluentes
generados en procesos que emplean cereales como materia prima (whisky, ginebra,
vodka), como los procedentes de la transformacin de melazas (ron), poseen
frecuentemente niveles elevados de sulfatos (3.000-8.000 mgIL; Wheatley, 1994). Estos
compuestos estimulan, durante los procesos de depuracin anaerobios, el crecimiento de
bacterias sulfato-reductoras, las cuales compiten con las bacterias metanognicas para la
captacin de sustratos (F12 y cido actico). Adems, algunos de sus productos
metablicos, como el 5H2, ejercen un efecto txico sobre la microbiota depuradora
(Percheron y col, 1997). Dado que el pH cido de estos efluentes (3,5- 4) imposibilita a
menudo su tratamiento aerobio, se estn realizando numerosos esfUerzos para solventar la
ineficacia de los sistemas anaerobios derivada de la presencia de sulfatos procurando, por
ejemplo, su precipitacin mediante adicin de hierro, niquel y otros minerales (Tarbox,
1993; Percheron y col., 1997).
51
e
Introduccin
w.
4.000-5.000 mgIL de DQO y 1.000-3.400 mgIL de SS (Johns, 1995; Nez y col., 1998;
Madrid, 1999). Dado que una gran parte de la carga contaminante se presenta en forma
grosera como SS (40-50% de la DQO total; Johns, 1995), los procedimientos de eleccin
para el tratamiento primario de estos efluentes son el desbaste, la decantacin y la
flotacin por aire disuelto (Ockerman y Hansen, 1994; Jolms, 1995; Nez y col., 1998).
Se calcula que aproximadamente dos tercios del total de los mataderos espaoles depuran
sus efluentes aplicando slo este tipo de tratamientos (Nez y col., 1998). No obstante, el
tratamiento de las aguas por coagulacin-floculacin est recibiendo una buena acogida,
ya que permite reducir la DQO en un 60 % y el contenido en SS en un 80 % (Nez y
col., 1998). Los mataderos de mayor tamao, sin embargo, suelen aplicar un tratamiento
biolgico posterior, estando ms arraigados en nuestro pas los aerobios que los
anaerobios (Nez y col., 1998).
52
Introduccin
Los vertidos lquidos de la industria lctea son los ms abundantes entre los de la
industria alimentaria (Wheatley, 1994), aunque dependen del tipo de producto y proceso y
de las caractersticas de los equipos empleados (Iglesias, 1994; MMA, 1996). En la
elaboracin de leches lquidas se ha estimado que el consumo de agua ronda los 3-4 L de
agua/Kg producto final, mientras que en la de queso y mantequilla esta relacin aumenta a
25 L (MMA, 1996). Estas industrias vierten en general los lquidos de forma discontinua,
siendo la composicin variable en cada descarga (MMA, 1996; Strydom y col., 1997). En
la Tabla 7 se muestran las principales caractersticas de los efluentes generados durante la
elaboracin de distintos productos lcteos.
Los efluentes lcteos estn constituidos principalmente por las aguas de lavado, los
agentes de limpieza y desinfeccin y los restos de leche y diversos materiales lcteos
desechados o derramados durante los procesos productivos (Lpez Mateos y col., 1986;
Tarbox, 1993; Wendorft 1998).
53
Introduccin
e,
e,
Leche (1)
consume Mantequilla Queso Helados Otros
mg/L (2) (3) (4) (5)
Temp.
pH 4,4-II 5,8-lO <4-9,5 8-] 8-11
54
Introduccin
Los efluentes lcteos, salvo los procedentes de procesos que incluyen la adicin de
cultivos iniciadores, se caracterizan por contener un nivel bajo de microorganismos
(Wendortl 1998). De ah, que la concentracin de desinfectantes empleados sea ms baja
que en otras industrias alimentarias (Wendorff, 1998). Los de uso ms comn son los
derivados dorados, el 14202 y el cido paractico (IDF, 1994).
55
Introduccin
1993). Otro factor a tener en cuenta es la riqueza habitual en nitrgeno y fsforo de estos
efluentes (Tabla 7) (Wendorfr 1998). Obviamente, estas caractersticas condicionan los
tratamientos de depuracin aplicables a este tipo de vertidos, tratados en el apartado 4.3.
de esta introduccin.
56
Introduccin
Aguas de lmpeza y
derrames de leche
Sustancias slidas
separadas
Aguas de lmpieza y
derrames de leche
Aguas de limpieza
Aguas de limpieza y
derrames de leche
57
e,,
e
Introduccin es
e
es
mt
e
RECEPCIN Y CONTROL Aguas de limpieza y U
DE CALIDAD derrames de [eche
U
+ U
SEPARACIN FISICADE Sustancias slidas e.
IMPUREZAS separadas mt
4.
de limpieza y
1
Aguas
ALMACENAMIENTO
derrames de leche
1 NORMALIZACIN
+
1
u,
U
U
E PASTERIZACIN
+
Aguas de
limpieza
Cultivos
iniciadores SIEMBRA
j
Cuajo +
CI2Ca COAGULACIN
e.
CORTE DE CUAJADA
+
3 U
u,
1
u,
DESUERADO Suero U
4. U
Aguas de
LAVADO/COCCIN r lavado o coccin
MADURACIN
u,
Figura 3. Vertidos generados en el proceso de produccin de queso.
U
e.
U
e
e
58 U
mt
Introduccin
Microorganismos
59
Introduccin
4. 1. Residuos slidos
Dependiendo del tipo de fango, su destino final puede variar. As, los procedentes de
tratamientos primarios de efluentes de la industria alimentaria pueden secarse y emplearse
como pienso; los residuales, tras sufrir un tratamiento biolgico, pueden mezcarse con
arena o paja y servir como abono. No obstante y sea cual sea el tratamiento de lodos
aplicado, siempre se obtiene una cierta cantidad de residuos slidos que hay que eliminar,
junto con otros restos alimenticios, por alguno de los mtodos descritos a continuacin.
60
Introduccin
Otro destino que se ha venido dando a los residuos ha sido el enterramiento, pero
tambin en este caso se producen olores desagradables, a la vez que se fomenta la
proliferacin de insectos y roedores en las zonas de enterramiento (Brennan y col., 1998).
En el caso de los residuos de origen animal la normativa vigente establece que stos deben
ser incinerados o enterrados (RD 2224/1993). De realizarse el enterramiento, ste debe ser
autorizado y vigilado por los rganos autonmicos competentes y realizarse a suficiente
profundidad para que los animales camvoros no puedan acceder a los cadveres o
animales muertos y desperdicios, y en terreno adecuado para evitar la contaminacin de
las capas freticas o cualquier dao al medio ambiente. En caso necesario, estos restos
deben adems rociarse previamente con desinfectantes (RD 2224/93).
4. 2. Residuos lquidos
Aunque los contaminantes de las aguas residuales suelen eliminarse mediante procesos
que combinan procedimientos fisico-quimicos y biolgicos, en algunos casos es posible
61
Introduccin
e,
4. 2. 1. Tratamientos fisico-quimicos U
Las rejas suelen estar constituidas por varillas o barras paralelas metlicas. Estos
elementos separadores suelen disponerse en vertical o con una ligera inclinacin,
pudiendo ser fijos o mviles. Se utilizan rejas fijas cuando la cantidad de slidos del agua
residual no es excesiva, ya que su sistema de limpieza es manual. Por el contrario, cuando
u,
U
62 mt
mt
U
e,
introduccin
Los tamices suelen estar constituidos por placas perforadas o mallas metlicas,
dispuestos en vertical o inclinados, fijos o mviles, con forma plana o como tambores
rotatorios. Tambin pueden emplearse tamices en otras fases del proceso de depuracin,
por ejemplo despus de la sedimentacin de las aguas procedentes de un tratamiento
biolgico; en estos casos sin embargo, las mallas utilizadas tienen un tamao de exclusin
menor.
63
Introduccin
64
introduccin
. Agua tetada
i~eLdcLg..
(b)
Agua r~idtel
Agua tetada
Agua residual.
(e)
Agua raddual
65
introdaccin
Los desarenadores ms frecuentes son los de flujo horizontal, los aireados y los de
vrtice. Los primeros son canales abiertos, cuya longitud y velocidad de flujo permiten la
sedimentacin del material de tipo arenoso, pero no la de las partculas orgnicas. Los
desarenadores aireados tienen un flujo en espiral, impulsado por aire, de forma que las
panculas orgnicas se mantienen en suspensin (Figura 5 b). Los de vrtce tienen forma
cilndrica; su flujo de entrada es tangencial y crea una corriente en vrtice, en el que las
arenas se separan por las fUerzas centrfUga y gravitatoria.
La filtracin permite eliminar de las aguas residuales partculas fmas slidas pero
no sedimentables, coloides fmos, protozoos y algas, as como reducir el contenido de otros
microorganismos de menor tamao (bacterias, levaduras y mohos). Esta operacin suele
realizarse para eliminar el material slido no descartado durante la sedimentacin, para
eliminar la turbidez de los efluentes procedentes de los clarificadores acoplados a
tratamientos biolgicos, para eliminar las algas de los efluentes de las lagunas de
estabilizacin, y como tratamiento preliminar de las aguas residuales con un elevado
contenido en slidos en suspension.
En los filtros de lechos mltiples, sin embargo, la limpieza se lleva a cabo haciendo
pasar agua sola o combinada con aire a contracorriente a una velocidad suficiente para
expandir el medio; la liberacin del material acumulado en estos lechos, no slo se
66
Introduccin
67
Introduccin
e
u
e
impulsa hacia arriba las espumas (Figura 5 d). Normalmente, los equipos de flotacin,
adems de tener dispositivos barredores del material flotante, poseen sistemas para
recoger los fangos depositados en el fondo del tanque.
mt
a
68 mt
mt
U
Introduccin
Oxidacin COHNS + 02 + Masa microbiana 4 Co2 + NI-13 + Otros productos finales + Energa
(Materia orgnica)
69
introduccin
Aunque los requerimientos de oxigeno no suelen ser elevados (del orden de 2 mgL)
(Metcalf y Eddy, 1998; Droste, 1997), es imprescindible que su distribucin en el medio
sea lo ms rpida y homognea posible. El apode de oxgeno suele realizarse mediante
distintos sistemas de aireacin, siendo los ms frecuentes los de difusin y los mecnicos.
En los primeros, el difusor se suele situar en el fondo del reactor y el aire suministrado
asciende en forma de burbujas. El nmero y el tamao de las burbujas liberadas
condicionan la velocidad de la transferencia gaseosa, que es mayor cuanto menor es el
tamao de las burbujas. En funcin del tamao de burbuja deseado, se dispone de distintos
modelos de difusores, como los tubulares, de placa, o de domo, entre otros, En ocasiones
se utilizan aireadores mecnicos (normalmente turbinas) que pueden disponerse
superficialmente o sumergidos. Mientras que en los superficiales el aire proviene de la
70
Introduccin
71
Introduccin
mt
mt
mt
[Siraurn
abatible
u~ easealee,da
(a)
Setal St
Catiteas
del saque
delta (b)
de .ia.ain
Sautajusa
& aulgtaa
Agua ~- Agua
ras dual bauda
Iteamna
del Fart$.
(e)
Canal de
aguas tratadas
Agua residual
(d)
Aguas alaaias
72
Introduccin
El sistema de oxgeno puro emplea este gas en vez de aire y se basa en que la
velocidad especfica de transferencia de oxgeno es mayor pan el oxgeno puro que para
el atmosfrico. Este tratamiento se realiza en tanques de aireacin de menor tamao,
cubiertos y divididos a menudo internamente en secciones para permitir mayor superficie
y tiempo de contacto con el oxgeno (Figura 6 b). Con este sistema se consigue mejorar
los rendimientos y reducir la cantidad de fangos producidos, estando especialmente
indicado para el tratamiento de aguas con un contenido elevado en materia organica.
73
r
Introduccin
t
t
ea
u,
nutrientes del agua residual. Los procesos de pelcula fija favorecen el desarrollo de U
aireacin en los filtros percoladores no suele ser forzada, sino que tiene lugar por las U
u,
corrientes naturales de conveccin que se originan como consecuencia de la diferencia de
u,
temperatura existente entre la atmsfera y el agua residual. A medida que las pelculas U
e
aumentan de espesor, la materia orgnica y el oxigeno difunden ms lentamente a los
e
microorganismos de las capas ms prximas a la superficie de adhesin, lo que puede U
U
llegar a provocar el desprendimiento de la pelcula. Este desprendimiento puede hacer
necesaria la decantacin de las aguas tratadas. Por ello, cuando la carga contaminante del U
e.
efluente es intermedia o alta, pueden disearse procesos con ms de una unidad de filtros
percoladores, decantadores y recirculadores de fangos, intercalados en distintas fases del U
e.
proceso. u,
U
74 mt
mt
mt
Introduccin
d). Los discos se encuentran parcialmente sumergidos en el agua residual, de forma que al
girar, la biomasa adherida contacta alternativamente con el lquido a tratar y con el
oxgeno atmosfrico. Las pelculas desprendidas y arrastradas por el agua se eliminan
posteriormente por decantacin.
4. 2. 2. 2. Tratamientos anaerobios
75
Introduccin
2 Metanognica
2
2 CH4
Acetotrficas cido actico CO,
2
76
Introduccin
Otro parmetro que las bacterias metanognicas exigen controlar es el pH, que
ptimamente no debera desviarse del intervalo 6-8 (Valls y col., 1980; Droste, 1997;
Urcelay, 1998). Una acidificacin excesiva puede ocurrir por ejemplo por un aumento de
la produccin de cidos voltiles, por parte de la flora acidognica, cuyo pH ptimo est
entre 5,5 y 6,5 (Valls y col., 1980).
77
Introduccin
It
U
ml
S1
En el influente pueden existir componentes txicos o inhibidores, desfavorables para
el crecimiento de la flora metanognica; ste es el caso de algunos metales pesados,
detergentes y concentraciones altas de Na, K, Ca o Mg (Urcelay, 1998). No obstante, y sin
lugar a dudas, el principal elemento inhibidor es el oxgeno (Valls y col., 1980). Su
efecto se evita utilizando reactores sellados, para impedir la entrada de aire. Esto tambin
sirve para limitar la diffisin de olores desagradables a los alrededores de la planta
depuradora. U
U
instalaciones anaerobias deba ser ms especializada, y por tanto, ms cara que la de las e.
mt
aerobias (Siena y Pealver, 1989; 11W, 1990; Droste, 1997). e.
En los tratamientos anaerobios, al igual que en los aerobios, se utilizan procesos con
la biomasa en suspensin o en pelcula fija, pero tambin hay reactores de un tercer tipo
(hbridos), en los que se combinan los dos tipos de procedimiento anteriormente citados.
U
78
Introduccin
separacin de los fangos tienen lugar en el mismo reactor (Figura 7 a); sin embargo,
tambin es posible emplear dos o ms reactores en serie para separar ambas fases. Por el
contrario, en el proceso de contacto, los fangos digeridos se separan en un decantador o
unidad de flotacin, y se emplean como inculo del influente (Figura 7 b).
Los reactores de pelcula fija ms utilizados son los de lecho compacto y flujo
ascendente (Figura 7 e), y los de lecho fluidificado o expandido (Figura 7 d). En los de
lecho compacto, los microorganismos se adhieren a superficies grandes, de distintos
materiales y formas geomtricas, dispuestas de forma compacta y fija en el interior del
reactor. Sin embargo, en los reactores de lecho fluidificado, la microbiota forma biofihns
alrededor de pequeas partculas mviles, granos de arena por ejemplo. En estos sistemas,
las partculas del lecho se mantienen en movimiento en el interior del reactor por el flujo
ascendente del influente; una vez fmalizado el proceso, un dispositivo separador retiene a
las panculas del lecho para su recirculacin. El uso de mayor superficie til aumenta el
rendimiento de la biodegradacin.
Entre los reactores hbridos destacan los de manto de fango anaerobio de flujo
ascendente (UASB) (Figura 7 e), en los que la biomasa forma grnulos de tamao similar
al de un guisante. El mecanismo de agregacin implicado en la formacin de estos
grnulos no se conoce con exactitud. El influente entra por el fondo del reactor, donde se
encuentran concentrados los grnulos. Como consecuencia del gas generado durante la
bioconversin, parte de los grnulos son arrastrados y se encuentran en suspensin en el
lquido. Colocando en el tanque una vlvula que permita la salida del gas, pero no la de
los grnulos, stos pueden sedimentar y volver a formar parte del lecho, evitndose la
necesidad de dispositivos para la recirculacin de fangos. Este proceso es, sin duda, uno
de los sistemas anaerobios ms rpidos, permitiendo conseguir tiempos de retencin
inferiores a 1 da.
Basados en los UASB convencionales, se han diseado los reactores UASB de lecho
fluidificado, en los que se ha aumentado la velocidad de flujo para conseguir una mayor
dispersin de los grnulos. Este tipo de reactores parecen especialmente adecuados para el
tratamiento de aguas de baja carga a bajas temperaturas.
79
Introduccin
(a)
Os.
Fango
(b) (c)
Agua Agua
Agua res~duaJ
U
Gas
Gas
(e)
Agua
residual
Agua residual
e.
Figura 7. Esquema de funcionamiento de distintos reactores empleados en el
tratamiento anaerobio de aguas residuales. (a) Convencional; (b) De
contacto; (e) De flujo ascendente; (d) Lecho fluidificado; (e) UASB.
Tomado de: Droste (1997). U
u,
U
mt
80
U
U
Introduccin
Finalmente, hay que mencionar que los tratamientos anaerobios tambin pueden
realizarse en lagunas o estanques muy profundos (hasta 6 metros) excavados en el suelo e
impermeabilizados, en cuyo fondo sedimentan los residuos a tratar. El agua as tratada
suele necesitar un segundo tratamiento antes de su vertido.
4. 2. 2. 3. Tratamientos combinados
81
Introduccin
Las limitaciones legales para los vertidos de fsforo han condicionado el diseo de
procesos para la eliminacin de fsforo. Una de las alternativas disponibles es el uso de
tratamientos biolgicos, basados en la capacidad de algunos microorganismos aerobios,
como Acinetobacter, para acumular intracelularmente el fsforo en forma de polifosfatos.
Esta actividad se favorece notablemente en presencia de cidos grasos de cadena corta.
Como en la fase acidognica de la depuracin anaerobia se produce gran cantidad de este
tipo de cidos, normalmente los procesos que pretenden la eliminacin de fsforo
incluyen un tratamiento anaerobio, seguido de otro aerobio.
4. 3. Vertidos lcteos
82
Introduccin
Groenewold, 1981; MMA, 1996; Wendorrn 1998). Esta alternativa es sencilla y barata, y
conleva un efecto fertilizante. Sin embargo, si el riego con vertidos lcteos se realiza con
excesiva frecuencia, los suelos se compactan y acidifican, se producen olores
desagradables, y aumenta el riesgo de contaminacin por infiltracin de los recursos
hidralicos subterrneos (Zal, 1992; MIMA, 1996). Por ello, el volmen mximo de
vertidos lcteos recomendado est entre los 10 y 15 m311-Ialda, dejando 15-30 das entre
cada irrigacin (MMA, 1996) para que la microbiota del suelo asimile los sustratos lcteos
sm que se pierda su capacidad depurativa (MMA, 1996; Wendorft 1998).
A pesar de que en los vertidos lcteos no abundan los slidos en suspensin de gran
tamao, es aconsejable comenzar su depuracin haciendo pasar el influente a travs de
tamices de malla metlica de 0,95 cm de tamao de exclusin, como desbaste para
eliminar restos groseros de cuajada, caseinatos, residuos de embalajes, etc. (Wheatland
1974; Wheatley, 1994; Wendorff 1998).
La homogeneizacin de las aguas residuales lcteas en tanques de equilibrado es una
operacin crtica, tanto para aquellas que van a ser sometidas a tratamientos posteriores de
depuracin en la propia industria, como para las aguas que se viertan directamente a redes
de saneamiento pblicas, donde las fluctuaciones de composicin y volumen de descarga
del vertido, pueden llegar a afectar negativamente al funcionamiento de las depuradoras
municipales (IDF, 1984; WendorW 1998).
83
mt
It
Introduccin
te
te
te
84
Introduccin
85
Introduccin
La separacin por membranas es, sin duda, una de las tecnologas ms eficaces para
reducir la carga contaminante de las aguas residuales. Sin embargo, la frecuente necesidad
de combinar varios tipos de separacin, el uso de presiones altas y el precio de las
membranas, suponen un coste econmico demasiado elevado para numerosas industrias,
incluida la lctea. As, la microfiltracin resulta eficaz para la recuperacin de panculas
relativamente grandes (Yacubowiccz, 1996; Yip y col., 1996), mientras que la
ultrafiltracin combinada con smosis inversa permite adems de recuperar protenas,
reducir la DRO de los vertidos lcteos en ms de un 90% (Wheatland, 1974; Mann, 1979).
El inters creciente por recuperar y reutilizar los agentes de limpieza, junto con el gran
desarrollo experimentado por los procesos de separacin por membranas, ha permitido la
comercializacin de algunos sistemas, como el denominado AlkaSave (Mann, 1979;
Yacubowiccz, 1996; Yip y col., 1996). Este sistema sirve para recuperar por
nanofiltracin las soluciones de sosa empleadas en la limpieza in situ de los equipos, que
pueden reutilizarse entre 7 y 10 veces (Yacubowiccz, 1996). Adems, la retencin de la
mayor parte de los componentes lcteos de las aguas de lavado se traduce en una
reduccin del 95% de su DQO. Si el lquido retenido por la membrana se somete a un
tratamiento posterior por diafiltracin, para eliminar restos de sosa, se puede emplear en la
formulacin de piensos (Yacubowiccz, 1996).
Una vez que los efluentes lcteos se han acondicionado mediante la aplicacin en
serie de varios de los procedimientos fisico-quimicos ya descritos, como
homogeneizacin, neutralizacin y separacin de grasas, ya pueden ser tratados
biolgicamente (IDE, 1990; Carballo, 1994; Wheatley, 1994). Tradicionalmente, en la
industria lctea se han empleado tratamientos aerobios (Pereda y col., 1996; Wendorff
1998). En los aos 70 comenzaron los estudios de laboratorio para la aplicacin de
tratamientos anaerobios a efluentes lcteos de elevada carga orgnica (IDE, 1990). En las
primeras experiencias industriales, llevadas a cabo 10 aos ms tarde, se observ ya que la
reduccin de la carga orgnica podia llegar a ser del 90% para efluentes con una DQO
superior a los 1.500 mg /t (IDF, 1990; Wendorfr 1998). No obstante, estos niveles de
86
Introduccin
reduccin pueden no ser suficientes para descargar el efluente tratado a un cauce fluvial
(IDE, 1990), haciendo necesario un paso aerobio posterior (IDF, 1990). Una limitacin
inicial de los tratamientos anaerobios era su poca eficacia para depurar vertidos lcteos
con DQO inferior a 1.000 mg/L (Ndon y Dague, 1997); esto ha sido superado con la
puesta a punto de procesos ms lentos que operan a temperaturas ms bajas (16-250C)
(Kato y col., 1994; Viraraghavan y Varadarajan, 1996; Ndon y Dague, 1997).
87
e.
te
Introduccin
88
Introduccin
orgnica. En su lugar, suelen emplearse otros sistemas, como los de aireacin prolongada,
de oxgeno puro, o de contacto y estabilizacin, que permiten reducciones de la DQO
superiores al 90% (Bul y col., 1981; Lpez Mateos y Mastral Lajusticia, 1986, Carballo,
1994; Wendorff, 1998). Quizs el proceso ms comn sea el reactor discontinuo
secuencial (SBR), ya que adems de limitar el bulldng, permite regular las condiciones de
aireacin para que tengan lugar simultneamente los procesos de nitrificacin-
desnitrificacin y de eliminacin de fsforo (Malaspina y col., 1995; Kolarski y Nyhuis,
1996; Donkin, 1997; Wendorff, 1998).
89
Introduccin
mt
e
e
1990; Perle y col., 1995; Petruy y Lettinga, 1997). De ah que se aconseje eliminar
previamente la grasa del vertido por un procedimiento fisico-quimico hasta una
concentracin mxima de 100 mgl (Perle y col., 1995). Tambin se ha sugerido el
empleo de compuestos surfactantes que no afecten a la microbiota anaerobia, como sodio
lauril sulfato, Tween-80, Triton-X100 o Tegopren 3022 (Patel y Madamwar, 1998).
u,
Al ser la lactosa uno de los componentes mayoritarios de los efluentes lcteos, su u,
utilizacin por parte de la mcrobiota anaerobia ha sido objeto de numerosos estudios. Se U
e
sabe que durante la primera fase de la digestin anaerobia, los organismos hidrolitico- u,
U
fennentativos lactasa positivos metabolizan este azcar por la va Embden-Meyerhof-
u,
Pamas (EMP); a partir del piruvato se producen entonces diversos cidos orgnicos e.
u,
(lactato, formato, butirato, propionato, entre otros), as como etanol, hidrgeno y dixido
de carbono; siendo el lactato el principal metabolito intermediario (Figura 8) (Pipyn y e
e.
Verstraete, 1981; Chartrain y Zeikus, 1986a; Kisaalita y col., 1987). La microbiota e.
responsable de estas primeras transformaciones en vertidos lcteos, ha sido caracterizada e
e
parcialmente, identificndose bacterias lcticas (Lactobacillus spp. y Leuconostoc U
mesenteroides), enterobacterias (Klebsiella oxytoca) y Clostridiu.n butyricum (Chartrain y e
u,
Zeikus, 1986b; Morgan y col., 1991; Fournier y col., 1993). Entre las bacterias que e.
participan en la fase acidognica-acetognica durante el tratamiento de vertidos lcteos
e
Chartrain y Zeikus (1 986b) han identificado a Clostridium propionicum y Des4fovibrio u,
e
vulgaris.
u,
90 U
e
U
Introduccin
este sentido cuando la presin parcial de hidrgeno es baja. Esto suele lograrse gracias a
que las bacterias metanognicas utilizan el hidrgeno como sustrato. Esta simbiosis es una
forma de asociacin sintrofica (Bryant, 1979; Gottschalk, 1986). Dado que la cantidad de
hidrgeno liberado en la degradacin del cido propinico es mayor que la del cido
butrico, la conversin del primero es ms lenta (Figura 8).
Butira
to+2H,O-*2acetato+ II -*-21-t
A 13 + 48,1 kJ/reocc,n
k
Propionato + 3 lizO 4 acetato + bkarbonato + it + 3 H,
A 13< + 16,1 kJ/reaccin
Otro factor importante, adems del pH, que afecta los rendimientos de conversin
acidognica es la concentracin inicial de lactosa en los vertidos lcteos. En este sentido,
se ha constatado que las concentraciones altas de este azcar en el agua residual no
modifican significativamente la cantidad de acetato producido, pero si la de butirato,
91
Introduccin
e
e
e
adems de favorecer la multiplicacin celular (Chartrain y col., 1987; Yu y Pinder, u,
1 993b). U
u,
Quizs uno de los principales avances tecnolgicos en este tipo de tratamientos, sea e.
u,
la utilizacin de cultivos iniciadores. En este sentido, se ha propuesto el empleo de u,
bacterias acidognicas aisladas de fangos lcteos, como Leuconostoc mesenteroides, U
u,
Desulfovibrio vulgaris y Klebsiella oxytoca, de forma aislada o combinada (Chartrain y e.
col., 1987; Strydom y col., 1997). Algunos autores sugieren incluso el empleo de inculos U
U
de bacterias metanognicas (Chartrain y col., 1987; Yang y col., 1988). Una fonna de e.
inculo algo burda pero posiblemente adecuada en algunos casos, es la adicin, al agua U
U
residual lctea, de excrementos vacunos (Fournier y col., 1993). e.
u,
u,
U
92 e
U
U
Introduccin
Se ha observado por otra parte, que cuando se emplea un reactor de pelcula fija de
lecho compacto para tratar suero, los soportes ms adecuados son los porosos (carbn
vegetal o vidrio sinterizado). La microbiota se acantona en sus cavidades y, por tanto, se
encuentra ms protegida de las inclemencias del proceso (Anderson y col., 1994; Patel y
col., 1995). Si se emplea un reactor de lecho fluidificado para tratar efluentes lcteos, los
materiales de eleccin parecen ser los arcillosos (bentonita y saponita), menos densos y
con mejores prestaciones que los arenosos (Borja y col., 1992; Morgan y col., 1991).
Recientemente, se han ensayado con xito nuevos soportes polimricos naturales, como
quitosano-lignosulfonato, para inmovilizar la microbiota anaerobia para el tratamiento de
aguas residuales de industrias alimentarias (Tartakovsky y col., 1998).
93
U
Introduccin
e.
w.
mt~
lcteos; Chartrain y Zeikus, 1986b) para utilizar cido actico, compitiendo con la flora
e.
metanognica (Bitton, 1994), podra estar implicada en la produccin excesiva de cido
U
sulfidrico observada, durante el tratamiento de efluentes lcteos, en los reactores UASB
mt
(Hernndez Surez, 1994).
U
Sin lugar a dudas, el principal problema de la depuracin anaerobia de los efluentes
U
u,
que hace disminuir el rendimiento de metano; este hecho determina la necesidad de U
regular el pH durante todo el proceso (Kisaalita y col., 1987; Yan y col., 1993; Monroy y U
e.
col., 1994; Kalyuzhnyi y col., 1997). Por esta razn, la industria lctea es pionera en el U
(Malaspina y col., 1996). Estos reactores estn divididos internamente en dos secciones U
e.
independientes; en una de ellas, dedicada a la fase acidognica, el agua residual atraviesa u,
con un flujo descendente un lecho compacto, quedando retenida en el fondo del tanque, u,
u,
donde prosigue la bioconversin en cidos orgnicos por parte de la microbiota e.
Substrate Shuttle, que introduce una unidad de intercambio inico para disminuir el U
u,
contenido en cidos orgnicos del agua procedente del reactor de acidognesis, antes de e.
U
ser incorporada al de metanognesis (Cohen y col., 1994).
u,
e
Despus de un tratamiento biolgico, es posible aplicar algn tipo de lagunaje para
U
e
u,
e
U
94 U
U
e.
Introduccin
Las levaduras han convivido con el hombre desde el Neoltico, fermentando los
carbohidratos de diversos cereales, frutas, tubrculos y leche de diversas especies
animales, dando lugar a una gran variedad de alimentos tradicionales que se utilizan hasta
nuestros das. Tambin pueden ser causantes del deterioro de algunos productos
alimenticios con un contenido en agua relativamente bajo.
En los ltimos aos se viene mtentando poner a punto, con fmes taxonmicos,
nuevas tcnicas de identificacin basadas en pruebas bioqumicas y genticas sofisticadas
(Fung y Liang, 1990; De Groote y col., 1995; Welthagen y Viljoen, 1997; Costabeber y
col., 1998). Sin embargo, todava es necesario recurrir a las pruebas morfolgicas y
fisiolgicas tradicionales para llegar a identificar de forma segura las levaduras de origen
alimentario (Costabeber y col., 1998). Estas pruebas tienen el inconveniente de ser largas
y tediosas, y de requerir bastante experiencia para interpretar los resultados (van der Walt,
1971; van der Walt y Yarrow, 1984; Barnett y col., 1 990a). Por esta razn, se han
desarrollado sistemas rpidos, que incluyen algunas pruebas fisiolgicas y morfolgicas,
junto con programas informticos que facilitan la interpretacin de los datos obtenidos
(Dek y Beuchat, 1987; Barnett y col., 1990a; Barnett y col., 1990b; Kotzekidou, 1997;
Praphailong y col., 1997). Los estudios taxonmicos se reflejan en la reordenacin y
95
U
Introduccin
El gnero Kluyveromyces van der Walt emend. van der Walt es un ascomiceto
teleomrfico perfecto, con 13 especies aceptadas, que vegetativamente se reproduce por
gemacin multipolar y puede desarrollar pseudohifas. Sus ascas pueden ser esfricas o
elongadas y se presentan normalmente no conjugadas. Una caracterstica del gnero es la
delicuescencia de la pared de las ascas al madurar. Todas las especies de Kluyveromyces
tienen, de forma caracterstica, en su cadena respiratoria, Co Q-61. La mayora presenta
entre 1-4 ascosporas, que son lisas y de forma entre esferoidal y renifonne. Todas las
especies fermentan glucosa, y algunas tambin lactosa (K. lactis y K marxianus). K
lactis se ha convertido en la especie de levaduras ms estudiada desde un punto de vista
gentico despus de Saccharomyces cerevisiae (Wsolowski-Louvel y col., 1996).
La estructura del sistema ubiquinona o coenzima Q de la cadena respiratoria varia en el nmero de unidades
is~it ju l itgh Sui caiatrfti eijildndifteicii ~kuiy fe vti de us
levaduras a otras; los ascomicetos poseen entre 6 y 10, y los basidiomicetos entre 8 y lO unidades (van da Walt
y Yarrow, 1984).
96
Introduccin
Aessosporon 0 1 0 0
Brettanomyces 2 1 2 0
Bullera 3 0 0 0
Candida 17 II 1
Cryptacaccus 8 7 0 0
Jlebaryomyces 2 4 0
fllobasidium 0 0 0
f-iansenula 1 1 0 0
Kuyveromyces 4 2 1 3
Jieucosporidium l 1 0 0
Lipomyces 0 4 0 0
Pie/ita 4 0 0 0
Rliodosporidium 0 2 0 0
Rhodotorula 0 5 0 0
Sarcinosporon 0 0 0
Sporobolornyces 2 0 0 0
Steriginatomyces 3 2 0 0
Torulopsis 1 2 0
trie/zosporon 2 3 0
Total 52 46 4 7
Tomado de Castillo (1990)
El smbolo + indica rpida utilizacin de lactosa
2 indicalenta
El smboloesy ligera, que oalgunas cepas utilizan la lactosa y otras no, o bien que la
utilizacin poco caracterizada
Dentro del muy heterogneo gnero Candida Berkhout (160 especies) (Boekhout y
Kurtzman, 1996), se incluyen C. kefyr, C. sphaerica y C. famata, que son las formas
97
Introduccin
Deb. suhglobosus
Debaryomyces hansenil Torulaspora hansenii
Saccharomyces keftr
S. fragilis
1 marxianus
Kluyverornyces marxianus K. fragilis
K ,narxianus var. ,narxianus
K. hugaricus
S. lactis
Kluyveromyces ladis var, actis1 K. marxianus var. ladis
K. lactis
C. pseudotropicalis
Candida kejJr2 Torulopsis kefyr
Tone/a cremoris
Nomenclatura segn Lachance (993).
2 Estado imperfecto o asexual de K. marxianus
98
Introduccin
Puede decirse que entre las levaduras que son contaminadoras naturales en la
industria lctea, las especies no fermentadoras de lactosa y halotolerantes suelen ser ms
frecuentes que las fermentativas (Besaqon y col., 1992; Rohm y col., 1992; Viljoen y
Greylng, 1995; Serrano y col., 1996; Roostita y Fleet, 1997; Welthagen y Viljoen, 1998;
Westall y Fltenborg, 1998a). Entre las especies ms comnmente presentes, suele
predominar, la alguna vez deseable, Deb. hansenii y su forma imperfecta C. famata (hasta
e] 50% de las cepas aisladas) (F]eet y Mian; 1987; Besaqon y col., 1992; Rohm y col.,
1992; Sarais y col., 1996; Serrano y col., 1996; Roostita y Fleet, 1997; Welthagen y
Viljoen, 1998; Wyder y Puhan, 1999). Algunas levaduras con gran capacidad fermentativa
de lactosa, como K marxianus o K lactis se encuentran tambin en este entorno
ambiental, pero en mucha menor proporcin (Besa9on y col., 1992; Rohm y col., 1992;
Viljoen y Greyling, 1995; Sarais y col., 1996; Roostita y Fleet, 1997; Welthagen y
Viljoen, 1998; Westall y Filtenborg, 1998a), igual que las correspondientes formas
imperfectas. Tambin se aslan con cierta frecuencia de productos lcteos especies
pertenecientes a los gneros Rhodotorula, Pichia, Saccharornyces, Torulopsis, Yarrowia y
Candida (Fleet, 1990).
99
Introduccin
e
*
1979; Fleel y Man, 1987; Fleet, 1990). Algunas especies contribuyen a la maduracin del
e
producto produciendo vitaminas o utilizando el cido lctico, elevando as el pH, lo que
favorece el crecimiento de las bacterias proteolticas y lipoliticas implicadas en los e
e
procesos madurativos (Fleet, 1990; Rolan y col., 1992; Viljoen y Greyling, 1995). Otras
e.
son capaces de producir sus propias enzimas lipoliticas y proteolticas, participando as e
e
directamente en la maduracin; otras an fermentan la lactosa, produciendo compuestos
que contribuyen al sabor y el aroma (Viljoen y Greyling, 1995). Este es el caso de algunos e
e.
compuestos voltiles producidos por levaduras (etanol, acetaldehidos, etilbutiratos, e.
azules (Fleet, 1990; Viljoen y Greyling, 1995). Tambin se ha descrito el efecto positivo e.
de las levaduras sobre la calidad de los quesos, por su accin degradadora de las aminas e.
e
all presentes; recurdese que la ingestin de alimentos ricos en aminas (como algunos e
quesos muy madurados), y ms an si coincide con la de bebidas alcohlicas, puede U
U
antagonizar la accin de frmacos antidepresivos del tipo JMAO (inhibidores de la e.
e
100 U
e
Introduccin
lctico y un 1% de etanol, adems de CO2 (Rose, 1982). La compleja flora levadrica del
kefir ha sido descrita por varios autores (Marshall y col., 1984; Fleet, 1990; Rohm y col.,
1992; Angulo y col., 1993; Tamime y Marshall, 1997), e incluye especies que fermentan
la lactosa como K. marvianus, K lactis, C. kefrr, Pichia fermentar y otras que no la
fennentan como 8. cerevisiae y Torulaspora delbrueckii (Rohm y col., 1992; Angulo y
col., 1993; Tamime y Marshall, 1997; Gilliland, 1998). El kumiss se elabora con leche de
yegua vaca, y es un producto lquido y gaseoso, con bastante cido lctico (0,7-1,8%) y
etanol (1-2,5%), adems de CO2 (Rose, 1982). Entre su flora se encuentran algunas
especies fermentadoras de la lactosa (K. lactis, Torula koumis, etc.) y otras que no la
fermentan (S. cartilaginosus) (Tamime y Marshall, 1997).
I01
U-
Introduccin
Entre las levaduras aisladas de quesos y asociadas a defectos, son frecuentes Deb.
hanssenii, K. marxianus, K. lactis y S. cerevisiae, consideradas a veces como responsables
de la formacin de aromas afrutados o a levadura y de sabores amargos o rancios, de
cambios de textura y de formacin excesiva de gas (Walker y Ayres, 1970; Miller, 1979;
Johnson, 1998; Westall y Filtenborg, 1998b). Algunas alteraciones de los quesos se
relacionan con la presencia de levaduras fermentadoras de lactosa (Guiraud y Galzy,
1976; Romano y col., 1989; Fleet, 1990; Viljoen y Greyling, 1995). Asi, Romano y col.
(1989) han asociado la presencia de K marxianus con la formacin de gas en quesos
Parmesanos. Una variante de alteracin de queso fresco con formacin de gas y sabores
picantes, ha sido atribuida exclusivamente a Candida sphaerica (forma asexual de K
lactis) (Guiraud y Galzy, 1976). Esta misma especie se ha visto implicada en diversas
formas de deterioro de quesos Gouda, Cheddar, Stracchino (Viljocn y Greyling, 1995;
Fleet, 1990; Fleet y Mian, 1987; Sarais y col., 1996), con formacin de grandes cantidades
de gas (provocando hinchamiento) y modificaciones del sabor, olor y textura (Fleet,
1990; Westall y Filtenborg, 1998b; Romano y col., 1989). En las salmueras, por otra
parte, se favorece el crecimiento de especies halotolerantes (principalmente Deb.
hansenil) (Seiler y Busse, 1990). Algunas levaduras presentes en queso excretan killer
factors (factores letales) que son protenas o glicoproteinas con un espectro
antimicrobiano amplio; estos compuestos pueden tener efectos negativos sobre la
elaboracin y la calidad fmal del producto, por afectar a microorganismos de los cultivos
iniciadores, pero tambin pueden ejercer efectos positivos al actuar contra enterobacterias,
por ejemplo (Jakobsen y Narvhus, 1996).
102
Introduccin
(sustratos y vehculos excelentes para las levaduras) es crtico el control higinico de estos
ingredientes y de las condiciones en las que se realiza su incorporacin. En el yogur son
frecuentes contaminantes las especies lactosa-fermentativas, como A? lactis o A?
marxianus (que tienen cepas termotolerantes) (van der Walt y Johanusen, 1984), y sus
formas imperfectas, C. sphaerica o C. kefrr, adems de C. famata, C. krusei o C.
lusitaniae (Jakobsen y Narvhus, 19%). Las alteraciones causadas por levaduras en yogur
son similares a las ya descritas en quesos (Suriyarachchi y Fleet, 1981; Fleet, 1990). En
ocasiones la produccin de gas es tan abundante que llega a provocar el hinchamiento y la
rotura de los envases (Jakobsen y Narvhus, 19%).
2 lEn levaduras, alcontrario que en bacterias, los genes suelen designarse con letras maysculas.
103
Introduccin
e
e
e
e
respectivamente, codifican las enzimas que intervienen en la via de Leloir, en la que la
galactosa se fosforila y luego epimeriza a glucosa fosfato (Wsolowski-Louvel y col.,
1996). e
e.
U
e
5. 4. 1. Transporte
e.
e
104
U
e
Introduccin
(1) Weusthuis y col. (994); (2) Bisson y col. (1993); (3) Castillo <990); (4) Boze y col.
(987); (5) Simsy ccl. (1984); (6) DicksonyBarr(1983); (7) Bamett y Sims (982).
105
U,
Introduccin
e-.
1997; Gancedo y Serrano, 1989), y ha sido atribuido por algunos autores a una
insuficiente disponibilidad energtica (ATP) para mantener el transporte transmembrana
de estos azcares (Sims y col., 1984; Schulz y Hfer, 1986). Deb. polymorphus y algunas
cepas de K. marxianus muestran este efecto para la lactosa, cuyo transporte puede
reducirse hasta en un 90% (Schulz y Hfer, 1986).
5. 4. 2. Hidrlisis
106
Introduccin
5. 4. 3. Metabolismo intermediario
107
introduccin
e
e
AD? + Pi
ADP
ATT>
Glucosa Galactosa
ATT>
4hexoquinasa
Galactosa- -fosfato
4IDP-~lucosa
1
Glucosa-.6-fosfato
~ Glucosa- -fosfato
fosfoglucomutosa
~>,/
4-eptmerasa
Fructosa-6-fosfato
AIF
Fructosa- 1 ,6-bifosfato
$
Glicera[deLudo-3-fosfato
ah/alaso
+
Dihidroxiacetona fosfato
It
Gliceraldehido-3-fosfato (2)
2 P
2NAO gli cera? dehido-3-fosfato deshdrogenasa
2 NADI! +uW
1 ,3-l3ifosfoglicerato (2)
a cetoglutarato
-
4/t
- -- 1cREus
fosfoglicerato malaxa y
-- - - -- - malato
2-Fosfoglicerato (2) oxalacetato _
y
NAO EL
NAO
Acetil-CeA + CO2
2 Op enoJosa PirlAato
deshidrogenasa
Fosfoenolpiruvato (2) > PIRTJVATO
<~1
2ADP 2A1? Aldehdo deshidrogenasa
e
e.
108
Introduccin
109
U
U
introduccin U
U
U
u,
U
Todas las levaduras son capaces de utilizar el amonio del medio como ffiente de
nitrgeno empleando preferentemente glutamato deshidrogenasas para su asimilacin
(Cartwright y col., 1989). Se ha visto que en el caso de levaduras empleadas en panadera
existen dos sistemas de transporte para el NI-1j, uno de baja y otro de alta afinidad
(Bendeker y col., 1990). 8. cerevisiae es adems capaz de incorporar NH2 al medio
intracelular utilizando un sistema inespecfico de transporte que sirve para otros cationes
u,
monovalentes (Bendeker y coL, 1990).
e.
U
U
110
introduccin
El material nitrogenado de alto peso molecular tan solo puede ser asimilado tras su
hidrlisis. Algunas especies pertenecientes a los gneros Kluyveromyces, Candida,
Aureabasidium, Cryprococcus, Trichosporwn son capaces de producir proteasas
extracelulares (Aheam y col., 1968; Schmidt y col., 1979; Bilinski y Stewart, 1990). Sin
embargo, otras levaduras como S. cerevisiae carecen de dicha habilidad (Bilinski y
Stewart, 1990). Estas proteasas suelen en general ser tennolbiles, son sintetizadas en la
fase exponencial de crecimiento y su expresin est sujeta a factores nutritivos y otras
111
r
Introduccin
e
U
U
nitrgeno (Large, 1986). Cuando los aminocidos constituyen la nica fuente de nitrgeno e.
e.
del medio, tres son las vas de utilizacin predominantes. Las tres se inhiben total o
u,
parcialmente en medios que contienen sales amnicas (Bendeker y col., 1990). Por la va e
U
de Ehrlich, los aminocidos son desaminados, decarboxilados y finalmente oxidados o
e.
reducidos. Dependiendo del tipo de aminocido se obtienen por esta va compuestos e
e
diferentes; as, a partir de vaIna, leucina e isoleucina se producen por reduccin los U.
o menos pronunciado en la clula. Sin embargo, la toxicidad derivada del uso de un solo e
e
aminocido se anula en presencia de otros aminocidos; por ejemplo la vaIna bloquea el e
U.
112 e
e
U
Introduccin
fenilalanina, histidina) junto con algn receptor de Hl (glicina, omitina, arginina, prolina,
hidroxiprolina, triptfano), asocindose una reaccin de xido-reduccin con la
desaminacin de ambos tipos de sustratos de la reaccin (Kockkov-Kratochvilov,
1990).
5. 6. Floculacin de levaduras
Las levaduras tienen una pared celular que, al contrario que las bacterias, no posee
peptidoglucanos (Reiss, 1985). Es una pared relativamente rgida, laminada, responsable
de la morfologa caracterstica de las clulas, que acta como barrera metablica,
permitiendo solo el paso de compuestos de bajo peso molecular (Reiss, 1985). Los
principales componentes de la pared celular son polisacridos, entre cuya trama se ubican
diversos tipos de enzimas hidrolticas (invertasa, melibiasa, fosfatasa cida, etc.). Los
polisacridos intervienen en la interaccin entre clulas, particularmente en la floculacin,
y en sus caractersticas antignicas (Kockov-Kratochvlov, 1990).
Adems de polisacridos (ms del 60%), la pared incluye proteinas (13%), lpidos
(8,5%) y otros constituyentes menores como DNA, RNA, esteroles y enzimas hidrolticas
(Kockov-Kratochvlov, 1990). Entre los polisacridos hay homopolisacridos
(glucanos, quitina y mananos) y heteropolisacridos (galactomananos, flicomananos,
xilomananos y arabomananos) (Kockov-Kratochvlov, 1990). Los glucanos se
encuentran formando un complejo insoluble con la quitina y constituyen la matriz de la
pared celular (Reiss, 1985). Aunque los polisacridos de la pared son muy heterogneos,
predominan los polmeros lineales que se asocian para formar fibrillas parcialmente
cristalizadas, impartiendo as rigidez a la pared. A pesar de que la quitina es un
componente minoritario de la pared celular, en algunos casos como cerevisiae puede
llegar a suponer el 1% de su peso seco (Reiss, 1985). Su contenido aumenta en la pared
celular cuando las levaduras pasan de la forma celular a miceliar, una transformacin
caracterstica y fundamental de las levaduras patgenas (Reiss, 1985; Kockov-
Kratochvilov, 1990). Los mananos estn constituidos por una familia de polimeros de
manosa, se encuentran embebidos en la matriz de glucano-quitina, y forman uniones
113
Introduccin
covalentes con las protenas. La cantidad de polisacrido por clula depende de la fase de
crecimiento de la levadura y su estructura, de la especie. Ciertas cadenas laterales de los
mananos les confieren propiedades antignicas (Kockov-Kratochvlov, 1990).
114
Introduccin
presencia de Ca2~) (Hussain y col., 1986; Calleja, 1987; Stratford, 1989b; Stratford y
Pearson, 1992), el pH (Calleja, 1987), la temperatura (Calleja, 1987; Femandes y col.,
1993) y la agitacin (Calleja, 1987; Stratford, 1989a).
La utilizacin <le levaduras para obtener biomasa con gran riqueza proteica,
tambin denominada SCP (Single Cel Protein), utilizando suero como medio de cultivo,
es una prctica industrial iniciada hace ms de 50 aos (Castillo, 1990; Kilara y Patel,
1992; Mawson, 1994; Gonzlez Siso, 1996).
15
Introduccin
Ir
Sr
Para optimizar la produccin de biomasa es necesario regular parmetros como la e.
e
1990) y el pH (rangos entre 2 y 6, que adems previenen el crecimiento de otros
microorganismos; Michel y col., 1987; Castillo, 1990; Mawson, 1994). U
U
1993; Mawson, 1994). Por este motivo es aconsejable el empleo de levaduras Crabtree- e.
U
negativas para la produccin de SCP (Moulin y col., 1983a). e.
u,
La biomasa debe ser recuperada del caldo de cultivo, lo que generalmente se realiza U
U
Michel y col., 1987; EI-Samragy y col., 1988; De Felice y Scioli, 1994), adems de ser U
abundantes las vitaminas del grupo B (Michel y col., 1987). La proporcin de usina en la U
u,
u,
e.
116 U
U
e
Introduccin
117
Introduccin Ir
e>
e
e
e
En los cultivos para obtencin de biomasa se han alcanzado rendimientos de hasta el Ir
50% de biomasa en peso seco (respecto a la lactosa presente) con un contenido proteico U
u,
de hasta el 50% (Moulin y col., 1983b; Michel y col., 1987; Gonzlez Siso, 1996), aunque
en la mayora de los resultados descritos los rendimientos suelen ser inferiores (Michel y U
e.
col., 1987; EI-Samragy y Zal, 1988). e
U
El grupo de Gonzlez y col. (1993) ha realizado estudios sobre la viabilidad U
del suero: tras perodos de cultivo que oscilan desde unas pocas horas hasta 1 2 das, la U
u,
DQO y la DBO5 presentan valores que oscilan entre el 60 y el 90% del valor inicial u,
(Mickle y col., 1974; Vananuval y Kinsella, 1975; Gilliland, 1979; Gholson y Gough, e.
e
1980; Moresi y col., 198Db; Bayer, 1983; Maiorella y Castillo, 1984; Reinhold y e.
U
Takemoto, 1988; Castillo, 1990; Gonzlez y col., 1993; De Felice y Scioli, 1994; Harden,
u,
1996). El modo de recuperacin de la biomasa determina tambin la cantidad y calidad e.
u,
del residuo; por ejemplo, el secado de la totalidad del caldo de fermentacin minimiza los
e
residuos, pero la biomasa as obtenida tiene un contenido mayor en sales (Mawson, 1994). e.
e
Cuando se separan las levaduras del caldo por centrifugacin, la eficiencia en cuanto a e.
disminucin de la materia orgncia en el liquido residual puede ser similar a la obtenida e.
U
por depuracin anaerobia del suero, con una reduccin de la DBO de ms del 90% e.
(Mawson, 1994). U
U
e.
U
118 U
U
Sr
Introduccin
que producen etanol a partir de suero (Castillo, 1990; Mawson, 1994). Este ltimo pas
destina el 50% de su produccin para obtener etanol (Mawson, 1994).
Tanto en los sistemas con clulas libres como en los inmovilizados, una cierta
aireacin es factor importante en el proceso, ya que si bien la fermentacin alcohlica
tiene lugar en anaerobiosis, algo de oxgeno es necesario para la sntesis de esterol y de
los cidos grasos insaturados esenciales en la estructura de la membrana plasmtica
(Nagashima, 1990). La optimizacin de este aspecto ha sido estudiada por varios autores
en K marxianus y C. kefrr y, concluyendo que niveles de microaireacin del orden de 0,1
v.v.m. son los que rinden mejores producciones (Varela y col., 1992; Ghaly y EI-Taweel,
1995a).
119
Introduccin
1995b; Gonzlez Siso, 1996). Niveles de sustrato demasiado elevados (superiores al 20-
25% de lactosa) pueden llegar no obstante, a inhibir el crecimiento celular, por las
desfavorables condiciones de elevada presin osmtica y baja actividad de agua que
originan (Ghaly y EI-Taweel, 1 995b).
Tras la fermentacin, el etanol se separa del medio por destilacin. Las proporciones
de este alcohol que se obtienen en la fermentacin de K marxianus o C. kefrr representan
rendimientos superiores al 80% del valor terico, que es de 0,53 g de etanollg de lactosa
(Vienne y von Stockar, 1985; Varela y col., 1992; Mawson, 1994; Ghaly y EI-Taweel,
1995a), agotndose ms del 90% de la lactosa inicial (Castillo, 1990; Mawson, 1994;
Gonzlez Siso. 1996).
120
Introduccin
el paso del acetaldehido a etanol hacia la formacin a glicerol (Jenq y col., 1989; Rapin y
col,, 1994). Esta podra ser una alternativa interesante desde un punto de vista econmico,
que puede competir con la obtencin de glicerol por sntesis qumica a partir de derivados
del petrleo (Jenq y col., 1989).
121
Introduccin
u.
U
u.
Como hemos visto, las levaduras utilizan parte de los nutrientes en los sueros para
transformarlos en otros de mayor valor aadido, y permiten rebajar la carga contaminante
de los efluentes. La produccin de otros productos distintos de biomasa o etanol, como
cidos orgnicos, tambin reduce la DQO aunque generalmente en menor proporcin
(Sorlin y col., 1993; Gonzlez Siso, 1996). U
e.
Tambin se han utilizado las levaduras estrictamente para depurar efluentes lcteos,
consiguiendo reducir la DQO en proporcin prxima al 90% (Marwaha y col., 1988b y
1989). Un parmetro que, de no ser controlado, puede causar algn problema de
contaminacin por los correspondientes medios gastados puede ser el pH, ya que el
cultivo de las levaduras acidifica en general los medios (Ghaly y Singh, 1989). Los
medios de cultivo restantes una vez separadas las clulas o productos valorizables todava
presentan valores de DQO considerables (4.000-5.000 mg/L) lo que puede implicar la
necesidad de aplicar un tratamiento de depuracin antes de su descarga. El cultivo de
levaduras debe pues considerarse como un pretratam lento ms que como un tratamiento
defmitivo. Por ltimo, hay una ventaja del cultivo de levaduras sobre el de mohos o
bacterias: la no produccin de metabolitos secundarios que puedan antagonizar a los
microorganismos implicados en los tratamientos de depuracin.
e.
U
u,
6. CARACTERSTICAS Y APLICACIONES INDUSTRIALES DE LACTASA u,
U
u,
La 3-D-galactosdasa o 3-galactosil-transferasa (lactasa, EC 3.2.1.23) es una enzima
e.
que, sin ser frecuente, puede encontrarse en muy distintos tipos de seres vivos (existe en e.
U
algunas plantas, animales, bacterias, mohos y levaduras) (Shukla, 1975). Entre las
e
levaduras, se ha estimado que aproximadamente un 15% de las especies conocidas son e
e
lactasa positivas; los gneros ms destacados en este sentido ya se mencionaron en la e.
Tabla 9 (seccin 5.1.). Entre los mohos es caracterstica la produccin de lactasa en varias e
e.
especies de los gneros Neurospora, Aspergllus, Mucor, Alternara, Fusarium, e.
e
122
Introduccin
Quien puso nombre a la lactasa file l3eijerinck, quien en 1889 obtuvo un extracto de
clulas que fermentaban lactosa, procedente de un cultivo de levaduras a las que
denomin Saccharotnyces kefrr (ahora Kluyveronyces marxianus). El efecto hidroltico
de la enzima, sin embargo, fije caracterizado ms tarde (1894) por Fischer (Rouwenhorst
y col., 1989).
123
u
Introduccin U
e-
Sr
U
U
levaduras a tratamientos fisicos o qumicos, para extraer la enzima o para aumentar la e.
e.
u,
e.
U
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U
U
e.
U
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U
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e.
11 e
e.
e.
u,
e
e
0E4 U
(140 U
e.
u,
u,
e
e.
e.
Como ya se ha indicado, la lactasa puede diferir en su localizacin; los mohos la e.
u,
Fenton, 1982; Decleire y col., 1987; Champluvier y col., 1988; Flores y col., 1994; Siso y U
u,
col., 1994; Stredansk y col., 1993); tambin se emplean para este fin detergentes, como u,
e.
124 U
a
e
Introduccin
Tween 80, Oxgall, Brij 35, Triton X-100, SDS, (sodio dodecil sulfato) o CTAB (bromuro
de cetiltrimetilamonio) (Flores y col., 1994; Somkuti y Steinberg, 1994; Bachhawat y col.,
1996) o surfactantes como la digitonina (Joshi y col., 1989). Como mtodo enzimtico se
ha ensayado la utilizacin de glucanasas, que destruyen la pared y propician la lisis celular
(Zomer y col., 1987). Como mtodos fisicos se ha empleado la ruptura celular por cizalla
(Schtitte y Kula, 1988), la sonicacin (Decleire y col., 1987), y la ruptura por
determinados procedimientos de congelacin (Flores y col,, 1994).
La lactasa puede estar constituida por una o varias subunidades; mientras que E. cali
posee 4 subunidades (Ricbmond y col., 1981), se han encontrado de 9 a 10 en K
marxianus (Mahoney y Whitaker, 1978); y 2 idnticas en K ladis (Cavaille y Combes,
1995). FI peso molecular varia dependiendo de la Ibente, entre 90 Kdaltons en A. oryzae,
201 Kda en K marxianus y 850 Kda en determinadas cepas de E. col (Shukla, 1975;
Mahoney y Whitaker, 1978; Richmond y col., 1981; Gekas y Lpez-Leiva, 1985; Fenema,
1996). Los intervalos ptimos de pH varan segn el origen y las dems condiciones de
reaccin (Shukla, 1975; Richmond y col., 1981; Gekas y Lpez-Leiva, 1985). Las
variantes procedentes de levaduras o bacterias son ms activas a pH neutro (6,5 7) y
125
Introduccin
temperaturas de entre 35 y 400C, por lo que estn indicadas para el uso en leche y sueros
dulces. Las de origen fngico, sin embargo, operan mejor a pH cido (2,5 6) y
temperaturas superiores a los 500C, y por ello son ms adecuadas para el tratamiento de
sueros cidos (Shukla, 1975; Geikas y Lpez-Leiva, 1985; Zadow, 1992; Cavaille y
Combes, 1995; Pivarnik y col.. 1995). Las enzimas de K marxianus, K lactis y Ci kefrr
suelen requerir la presencia de algunos cofactores catinicos, Mnt K~, Na~ o el Mg~
segn las especies (Davies, 1964; Wendorff y Amundson, 1971; Sonawat y col., 1981;
Castillo, 1990; Cavailles y Combes, 1995), y se inhiben en presencia de metales pesados
(Wendorff y Amundson, 1971; Itoh y col., 1982; Castillo y Moreno, 1983; Pivarnik y col,,
1995). En cambio, las enzimas de A. nger y A. oryzae parecen menos dependientes de
iones activadores (Pivamik y col., 1995). Las enzimas de ambas frentes se inhiben
competitivamente por galactosa y no competitivamente por glucosa (Wendorff y
Amundson, 1971; Gekas y Lpez-Leiva, 1985; Cavailles y Combes, 1995; Pivarnik y col.,
1995). La eleccin de un tipo u otro de enzima y su rendimiento, dependen pues, del
medio en que se pretenda hidrolizar la lactosa y de las condiciones de pH y temperatura
all presentes (Gekas y Lpez-Leiva, 1985; Pivamik y col., 1995). Para la mayora de las
aplicaciones comerciales se considera aceptable un porcentaje entre un 75 y 85% de
hidrlisis de lactosa (Prenosil y col., 1 987b; Coton, 1980).
126
Introduccin
Entre las fuentes de lactasa que se han empleado para obtener preparaciones
inmovilizadas, estn algunas cepas de Lactobacillus sp., Streptococcus thermophilus y
Bacillus circullans, que producen enzimas termnorresistentes. Estas enzimas permiten el
empleo de temperaturas de reaccin ms altas, proporcionando velocidades de
transformacin elevadas, sin riesgo de proliferacin de microorganismos contaminantes
(Pivamik y col., 1995). Tambin se ha estudiado la utilizacin de enzimas de
127
Introduccin
9,
9,
Sr
128 U
Sr
Sr
Introduccin
Por otra parte, la hidrlisis de la lactosa aumenta el dulzor de la leche y el suero sin
incrementar su valor calrico y evita los problemas de textura causados por la
cristalizacin de la lactosa en productos deshidratados o congelados, permitiendo su
empleo como ingrediente en un mayor nmero de alimentos (Poutanen y col., 1978;
Cocho y col., 1982; Marwaha y Kennedy, 1988; Zadow, 1992; Gonzlez Siso, 1996).
Una de las primeras industrias utilizadoras de leche y suero hidrolizados tite la de
elaboracin de helados, a los que la lactosa cristalizada confiere una textura arenosa
(Pomeranz, 1964). Tambin se ha aplicado la hidrlisis a la fabricacin de yogures
hipocalricos dulces (loba y col., 1990; Pivarnik y col., 1995). Debido al aumento del
poder edulcorante, la hidrlisis de lactosa reduce el nivel de sacarosa habitualmente
requerido en la formulacin de leches condensadas, helados, alimentos infantiles,
129
Introduccin
9,
130 Sr
Sr
Sr
Introduccin
131
Introduccin
9,
*
9,
intestino grueso, donde actan como promotores del crecimiento de las bifidobacterias Sr
Sr
(Tanaka y col., 1983; Hartemak y col., 1994; Tomomatsu, 1994; Yang y Silva, 1995). Las a
ingestas elevadas, no obstante, provocan molestias por formacin de gases (el hidrgeno y
U
metano formado por las bacterias que metabolizan estos compuestos) e incluso diarreas
(por el agua que retienen). U
U
Sr
e
e
Sr
e.
e
e
e
U
U
e
e
U
e
U
u,
e
e
e
e
e
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e
e
e
e
e
U
e
e.
U
e
e
U
e.
e
132 Sr
a
a
IL OBJETIVOS
Objetivos
1. Obtener cepas de levadura que crecieran bien en el lquido ultrafiltrado o permeado del
suero de quesena y que pudieran servir para reducir la carga contaminante de
permeados, sueros y efluentes y en caso de sueros y permeados para ser utilizadas como
Riente de proteina y lactasa.
135
III. MATERIAL Y
MTODOS
e-.
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
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e
e
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e
e
e
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e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
Material y Mtodos
1. LEVADURAS
2. OTROS MICROORGANISMOS
139
e-
e-
Materialy Mtodos 9,
e
e
e
e
e
e
LII CHN-22 O R-703 e
e
Lactococcus ladis subsp. cremoris Lactococcus actis subsp. lactis e
Lactococcus ladis subsp. lactEs Lactococcus lactEs subsp. cremoris e
e
Lactococcus lactis subsp. diacetylactis (5-30 %) e
Leuconoswc inesenreroides subsp. cremoris (1-le %) e
e
e
e
e
3. SUERO DULCE Y SU PERMEADO e
e
El permeado se obtuvo a partir de suero dulce donado por la empresa Lcteas del e
e
Jarama (Fuente del Saz, Madrid). El suero proceda de la fabricacin por coagulacin e
e
enzimtica de queso fresco, a partir de una mezcla de leche de vaca (92%), oveja y cabra
e
(8% entre las dos). El suero fUe recogido de la cuba de desuerado en recipientes de plstico e
e
desinfectados y mantenido en refrigeracin hasta su utilizacin (tiempo no superior a 2 e
horas). La Tabla 13 muestra los resultados obtenidos del anlisis de varios de dichos sueros e
e
a su llegada al laboratorio. e
e
e
e
e
e
Tabla 13. Algunas caractersticas del suero dulce y de su correspondiente e
permeado. e
Suero Permeado u,
e
pH 6,5 6,7 6,46,6
e
100- 32 HO- 20 e
Lactosa (mM)
1-1,5 e
Galactosa (mM)
e
Proteina (gIL) 6,99,57 0,5 0,9
e
DQO (mg/L) 72.500-75.000 45.000-55.000 e
e
Microorganismos totales (ufcf mi) 6,4x 1027,8x jo4 o
e
Bacterias lcticas (en agar MRS; ufcf mi) 8,1 x 10 1,5 ~ o e
e
e
e
e
140
e
e
Material y Mtodos
141
e-
Maten aly Mtodos e-
9+
e,
e,
e
Figura 11. Diagrama de fUncionamiento del equipo de ultrafiltracin de flujo
e
tangencial.
e
ALIMENTACION PrtYIBo
~ Q)~ CZ= o cm
ti LIRADO
cZZI Al Ml NI ACION,RIgTIZNII)O
~ Fil FRADO
e
Figura 13. Seccin de un cassette de ultrafiltracin
e
de flujo tangencial
e
e
e
142
u
e
Materialy Mtodos
4. EFLUENTES LACTEOS
Los efluentes lcteos utilizados para el aislamiento de levaduras, fUeron donados por
las empresas Forlasa (Villarrobledo, Albacete), Lcteas del Jarama (Fuente del Saz,
Madrid) y Cooperativa de Ganaderos Manchegos (Tomelloso, Ciudad Real).
143
Material y Mtodos
e-
e
(80% oveja y 20% cabra) a partir de leche pasterizada y de leche cruda. El suero lcteo se
destina en parte a la fabricacin de requesn. La mayor parte del efluente lcteo de esta u,
u,
u,
requesn y suero lcteo no aprovechado, aunque tambin estn incluidos los desaglies de
e
los lavabos del personal. u,
u,
u,
Cuando se tom la muestra de efluente, sus principales componentes eran aguas de
u,
u,
Forlasa procesa entre 700.000 y 1 milln de litros de leche al da. Elabora distintos e
e
e
Material y Mtodos
rallados y azules. Latotalidad del suero obtenido es desnatado, desecado por atomizacin y
destinado a la venta.
La planta ERAR Valdebebas, prxima a Paracuellos del Jarama (Madrid), trata las
aguas residuales procedentes de este municipio y de la zona norte y nordeste de la ciudad
de Madrid, con un caudal medio de 0,4 m3/s. Recibe una carga contaminante de 144.000
e.h. (habitantes equivalentes) (GarcaAlvarez y Cortacans Torre, 1986).
145
e-,
Material y Mtodos U,
U,
u,
u,
activados. La base terica de fUncionamiento es la misma, existiendo ligeras diferencias en u,
e
cuanto al diseo y nmero de elementos de las diferentes instalaciones. Est capacitada
u,
para una poblacin dc 1.300.00 habitantes y tiene un caudal medio de 3,3 m3lseg (Garca
e
Grande, 1986).
e
e
e
e
e
Tabla 14. Caracteristicas de las aguas residuales urbanas recibidas por las u,
e
Slidos en suspensin 370 420
e
Garca Grande (1986) y lvarez y Cortacans Torre (1986).
e
u,
e
e
u,
e
El material de vidrio utilizado en todas las experiencias fUe calidad Pyrex o similar. e
e
Para la conservacin de las muestras en refrigeracin se utilizaron frigorficos
e
e
e
e
146 e
e
e
Malerialy Mtodos
Las siembras se realizaron en una cmara de flujo laminar Testa? tipo CE-A,
equipada con lmpara ultravioleta.
147
9+
Material y Mtodos
e,
e
regulndose el flujo de salida con un manmetro mod. M-2 1-O. En algunos casos, se e
conect al fermentador una bomba de aire de acuario Sirocco mod. Aireador D-2P. 9+
e
e
En la determinacin de la Demanda Qumica de Oxgeno se emplearon matraces de e
la marca Afora de fondo redondo de 500 mL y cuello de vidrio esmerilado 29/32, e
e
refrigerantes de serpentn de 300 mm con junta de cristal esmerilado 29/32 y un bao de u,
Todos los productos qumicos utilizados en esta tesis eran de calidad reactivo y de las e
marcas Merck, Sigma y Panreac.
u,
e
En las experiencias microbiolgicas, los productos empleados procedan de las fuinas
e
Difco, Oxoid y Merck. e
e
Las enzimas se compraron a Boebringer, Sigma y Gist-Brocades, segn se e
u,
indica en cada caso. e
e
El oxgeno y el nitrgeno se obtuvieron de Carburos Metlicos, S.A.. u.
e.
e
8. CULTIVOS e
e
8. 1. Medios de cultivo U
e
148 e
e
e
Materia/y Mtodos
Cuando se estudi la capacidad de las levaduras para reducir la DQO del permeado,
stas se revitalizaron en YM suplementado con un 2% (p/v) de lactosa, con el fin de inducir
la actividad lactsica. Este suplemento tambin se aadi para conservar en congelacin las
levaduras aisladas de efluentes.
8. 1. 2. Caldo YPD
149
r
U
Material y Mtodos
e
9+
e,
U,
Extracto de malta 30,0 g u,
Agar 15,0 g
pH 5 4 + 0 2 e
e
Al medio MEA se le adicion clorhidrato de oxitetraciclina (Terramicina~ 100, u.
u.
Pfizer) a una concentracin final de 100 ig/mL. e.
u,
e
e
8. 1. 5. Agar Rosa-Bengala Cloranfenicol (RBC) (Oxoid) u,
e
Este agar se utiliz para el recuento selectivo en placa de levaduras procedentes de e
cultivos mixtos, tal y como describe Jarvis (1973). Para su preparacin se disolvieron 32 g de e
e
Agar Rosa-Bengala por litro de medio. Su composicin por litro del medio es la que sigue: e
u,
Peptona micolgica 5,0 g
e
Dextrosa 10,0 g u,
e
Fosfato dipotsico 1,0 g
e
Sulfato magnsico 0,5 g e.
Rosa de Bengala 0,05 g e
e
Agar 15,5 g e
pH 7,2 0,2. e
e
A este medio se le adicion cloranfenicol (SIGMA) disuelto en etanol a una e
e
concentracin final del 0,01% (p/v). e
e
u.
e
8. 1.6. Agar para recuento en placa (PCA) (Oxoid) u.
u.
Este agar se utiliz como medio para el recuento en placa de microorganismos e.
totales, empleando 17,5 g por litro de agua. Su composicin por litro es: e
e
Triptona 5,0 g e
u,
Extracto de levadura 2,5 g
e
Glucosa 1,0 g e
9,0 g e
Agar
e
e
e
e
150
u.
e
Materialy Mtodos
Este agar se utiliz como medio para el recuento en placa de las bacterias lcticas, tal
y como describe Reuter (1985). Su composicin por litro de medio es:
Peptona 10,0 g
Lab.Lemco en polvo 8,0 g
Extracto de levadura 4,0 g
Dextrosa 20,0 g
Tween 80 1,0 mL
Fosfato dipotsico 2,0 g
Acetato de sodio.3 l~I2O 2,0 g
Citrato de triamonio 5,0 g
Sulfato de magnesio.7H20 0,2 g
Sulfato de manganeso.4H20 0,2 g
Agar 10,0 g
pH 6,2 (aprox)
Este agar se utiliz en ocasiones como medio selectivo para el recuento de bacterias
lcticas, tal y como recomienda Reuter (1985). Al medio MRS, cuya composicin se indica
en el apartado anterior, se le adicion cido srbico disuelto en NaOH 1 M, para obtener
una concentracin fmal del 0,06% (p/v) o del 0,1% (p/v), segn se indique. Posteriormente
se ajust el pH del medio a 5,7 con HCI 2,5 N.
151
9+
Material y Mtodos
U
e-
U
Extracto de levadura 5,0 g e,
e
Acetato de sodio 5,0 g
e
Citrato de sodio 3,0 g u,
e
Tween 80 1,0 g
e
Sulfato de magnesio 0,2 g e
Sulfato de manganeso 0,05 g u,
u,;
Agar-agar 16,0 g
e
e
e
8. 1. 10. AgarMacConkey (prpura) (Oxoid)
e
e
Este agar se emple para el recuento en placa de bacterias colifonnes (British
u.
Department ofEnvironment, 1982). Su composicin por litro de medio es: e
e
Peptona 20,0 g e
u,
Lactosa 10,0 g
e
Sales biliares 5,0 g e
Cloruro sdico u,
5,0 g
e
Prpura de bromocresol 0,01 g e
Agar 5,0 g e
e
pH 7,4 (aprox.).
u,
e
e
e
8. 1. 11. Permeado de suero dulce
e
e
El permeado utilizado como medio de cultivo se obtuvo tal y como ya se ha descrito
u,
en el apartado 3 de este Material y Mtodos. u,
e
e
e.
8. 1. 12. Permeado con la lactosa hidrolizada e.
e
En los cultivos inoculados con la flora procedente de aguas residuales urbanas, se u.
e
utiliz permeado (ver 8.1.11) previamente incubado con j3-galactosidasa, para comprobar el u.
e
e
152
e
u,
9+
Materialy Mtodos
Las principales caracteristicas del suero dulce procedente de la quesera Lcteas del
Jarama, se muestran en la Tabla 13 dc este trabajo. Antes de ser utilizado como medio de
cultivo, el suero se centrifUg a 4.800 g x 15 mm para eliminar los restos de casena y
grasa
8. 2. Condiciones de cultiva
Todas las levaduras se revitalizaron antes de ser sembradas en los medios de cultivo,
para lo que se inocularon en 5 ml de caldo YM y se incubaron en condiciones estticas a
300C durante 18 horas. Cuando se quiso partir de clulas con la lactasa inducida, la
153
9+
Material y Mtodos e-
e.
e,
e
e
revitalizacin se realiz en caldo YM suplementado con 2% Lactosa. Antes de ser
e
inoculadas en los medios, las clulas se lavaron dos veces en agua destilada estril, y se
e
recuperaron mediante centrifUgacin a 4.520 g durante 10 mm, resuspendindose en agua e
e
destilada. La absorbancia a 600 nm de las clulas resuspendidas se ajust a 0,4 (aprox.), u.
diluyendo con agua destilada (esta absorbancia equivale aproximadamente a 1 o~ ufc/mL). a
e
Estas suspensiones celulares se utilizaron para inocular al 0,001, 0,01, 0,04 y 0,4% (y/y) u,
e
segn los casos, matraces Erlenmeyer de 250 mL (que contenan 150 ni del medio), de
e
100 mL (que contenan 50 mL de medio) o de 50 mL (que contenan 25 mL de medio), u,
e
para obtener niveles iniciales aproximados de 1 o~, o5, 106 y o~ ufc de levaduras/mL,
respectivamente. Todos estos cultivos sembrados con levaduras se incubaron a 3 00C en un
u.
bafio-incubador orbital, con una agitacin de 150 rpm.
u,
agitacin de 200 rpm. La presin parcial de oxigeno en los cultivos se mantuvo al 60% u,
mediante el aporte de oxgeno puro con un flujo mximo de entrada de 1,6 vvm (volumen e
u,
de gas por volumen de medio por minuto). La formacin de espumas en estos cultivos se
control mediante la adicin de antiespumante (B.Braun-Biotech) al 0,05%. e
e.
Cuando el permeado, utilizado como medio de cultivo para el crecimiento de u.
e
levaduras, se suplement con distintos compuestos (sulfato amnico, fosfato dipotsico y
u,
cloruro frrico), las correspondientes soluciones se filtraron por filtros Acrodise 0,22 gtm
e
antes de ser aadidas al permeado, extremando las condiciones de higiene. e
e
Las suspensiones celulares procedentes de aguas residuales urbanas, obtenidas como u,
e
se describe en el apartado 9, se utilizaron para inocular al 10% (y/y) 50 mL de permeado, e
contenidos en matraces erlenmeyer de 100 mL de capacidad. Los correspondientes cultivos e
e
se incubaron a 300C en un bao-incubador orbital, con una agitacin de 150 rpm.
u.
Para el estudio de floculacin, los precultivos con la lactasa inducida se transfirieron e.
al 0,5% (y/y) a tubos de 7 mm de dimetro y 10 mL de capacidad que contenan 5 mL de e
e
permeado o de caldo YPD, y se cultivaron a 300C y 100 rpm durante 72 h. u,
e
154 e
e
e
Materialy Mtodos
8. 3. Toma de muestras
A lo largo de todas las incubaciones se tomaron, en condiciones estriles, alcuotas
comprendidas entre 1,5 y 100 mL de los distintos lquidos de cultivo. Para la estimacin del
crecimiento de las levadurasy de las bacterias, las muestras se utilizaron inmediatamente.
155
e,
Materia/y Mtodos
9+
e,
e
e,
En los cultivos en suero dulce se estim el crecimiento de las levaduras mediante e,
e
siembra en profUndidad en agar RBC. Las placas se incubaron a 300C durante 3 das u,
(Seiler, 1985) e
e
El recuento de bacterias lcticas presentes en las aguas residuales urbanas y en los e
e
efluentes lcteos se realiz mediante siembra en superficie en agar LaS. Este mismo
mtodo tambin se emple para esttmar el crecimiento de estas bacterias en permeados u,
e
inoculados con aguas residuales urbanas. Las placas se incubaron a 300 C durante 2 das, u,
permeado, se estim mediante siembra en agar MRS. El agar MRS-S se emple en los e
e
cultivos en suero dulce inoculado con levaduras, para estimar el crecimiento de la flora e
lctica. Las siembras en agar MAS y MIRS-S se realizaron en profUndidad, aadiendo una
e
segunda capa de agar que cubriera a la de siembra para conseguir las condiciones de u,
microaerofllia. La incubacin se realiz a 300 C durante 3 das, tal como indica Reuter e
e
(1985). e
u,
Para estimar la concentracin de bacterias coliformes en los cultivos inoculados con u,
e
las aguas residuales urbanas y en los efluentes lcteos, se realizaron siembras en superficie u,
en agar MacConkey. Las placas se incubaron a 370 C durante 2 das (British Department of e
e
Environment, 1982). u,
e
El recuento total de microorganismos presentes en el suero, permeado y efluentes
lcteos y en los cultivos inoculados con aguas residuales urbanas, se realiz mediante u,
e
siembra en profUndidad en PCA, incubando las placas a 300 C durante 2 das.
e
En todos los casos, los resultados se expresaron como unidades fonnadoras de colonia
por ni de cultivo (ufc/mL). e
e
Para calcular el tiempo de duplicacin celular (td) se utiliz la representacin del e
e
logaritmo neperiano de las ufc/mL en fUncin del tiempo de crecimiento (expresado en e
e
horas). A partir de la recta de regresin resultante de la fase exponencial del crecimiento, se e
e
u,
e
156 e
e
e
Materia/y Mtodos
La flora natural procedente de aguas residuales urbanas se utiliz como inculo para
comparar la reduccin de la DQO, al proliferar en permeado dulce normal y con la lactosa
hidrolizada. Para obtenerla, las muestras de aguas residuales urbanas se mantuvieron a 40<?
durante 4 horas, para favorecer la decantacin de las partculas ms groseras.
Posteriormente, se recogi la parte superior del sobrenadante (aprox. 1/3) y se mantuvo a
40C durante 15 h. Transcurrido este tiempo, 200 mL de este sobrenadante se centrifgaron
a 3.330 g durante 10 mlii y el sedimento se resuspendi en 20 mL de agua destilada estril.
Esta suspensin celular se utiliz para inocular los distintos tipos de permeado como se
describe en el apartado 8. 2 sobre Condiciones de Cultivo.
157
e-
U
Materiat y Mtodos e
e,
e
u,
10. 2. Aislamiento de levaduras adaptadas a permeado e
e.
Para seleccionar de la flora de efluentes de quesera, las levaduras ms aptas para
u,
crecer en penneado, se prepararon mezclas que contenan 50 mL de permeado y 50 mL del
u.
efluente lcteo correspondiente. Estas mezclas se incubaron a 30C durante 6 das, e
u.
sustituyndose diariamente la mitad del volumen de cada cultivo por permeado fresco. El
u.
aislamiento de levaduras a partir de estas mezclas se realiz siguiendo el mtodo descrito u,
u,
en el apartado anterior.
e
e
u,
10. 3. Seleccin de levaduras u,
e
Del conjunto de cepas de mohos y levaduras aislados en medio OMEA directamente e
o tras adaptacin, se eliminaron los mohos. Para ello, cada cepa se inocul en dos tubos u.
e
conteniendo caldo YM con 2% de lactosa. A uno de ellos se le adicion una capa de aceite e
u,
de paralina estril de aproximadamente 1 cm de espesor para conseguir condiciones de
e
microacrofilia (no toleradas por mohos), mientras que el otro se mantuvo intacto; el tipo de
u.
crecimiento en ambos tubos file registrado tras la incubacin a 250<? durante 24 h u,
u,
microscopio ptico tras tincin Gram con objetivo de imnersin, para comprobar que se e
trataba de levaduras. Todas las cepas cuya morfologa no se correspondi con la tpica de u.
e
levaduras fUeron descartadas. u.
e
pruebas: u.
e
* Pruebas de pureza e
e
e
158 e
e
u.
Materia/y Mtodos
159
Materia/y Mtodos
e
e
e,
u,
metileno al 0,1%, disueltos en alcohol etlico (96% y/y). Este indicador vira de violeta a u,
verde a pH 5,4. e
u,
El porcentaje de nitrgeno se calcul mediante la frmula: u.
e
u.
e
Nitrgeno = V x N x 14,007 x 1000/mL muestra e
e
u,
e
Los resultados finales se expresaron en mg de NI de muestra,
e
e
e
e
11. 3. Determinacin de los slidos totales, slidos disueltos y biomasa e
u.
La determinacin de los slidos totales de las muestras se realiz desecando a 1000<? e
un volumen de 100 mL hasta peso constante, tal y como recomienda la AOAC (1995). Para
e
determinar los slidos disueltos y la biomasa, 150 mL de muestra se centrifUgaron a 6.540 u,
g durante 15 mm, desecndose a 1000<? hasta peso constante, tanto el sobrenadante como el
u,
sedimento. e
e
e
u,
11. 4. Determinacin de la Demanda Qumica de Oxigeno (DOO) e
e.
La determinacin de la DQO se hizo en los lquidos libres de clulas, siguiendo el u,
e
mtodo normalizado 973.46E recomendado por la AOAC (1995) para el anlisis de
e
efluentes industriales. Este mtodo se basa en la oxidacin de las sustancias orgnicas por u.
e
el dicromato potsico disuelto en cido sulfrico, a temperatura de ebullicin, en presencia u,
e
Despus se incorporaron lentamente y en fro 5 mL de H2S04, 25 mL de K2Cr2O1 0,25 N, e
e
u.
160 e
e
e
Materia/y Mtodos
matraces se mantuvieron en ebullicin a reflujo durante 2 horas. Una vez fros, los tubos
refrigerantes se aclararon con agua destilada, incorporndose este agua de lavado a las
mezclas de reaccin. Finalmente, dichas mezclas se enrasaron a 300 ml con agua
destilada.
DQOQng/I==[(B-M)xNxSOOO]/V
La determinacin del Carbono Orgnico Total (COT) y del Carbono Inorgnico Total
(CIT) se realiz mediante oxidacin hmeda a baja temperatura, en un analizador
161
e,
Materia/y Mtodos e
e
e,
e,
e
automtico de la marca 0.1. Analytical mod. TOC Analyzer 1010. Este analizador opera e
u,
Dispersivo de Infrarrojos (NDIR). Finalinente, se aaden 600 jt de una solucin de e
u.
nuevo, el CO2 producido se registra en el detector NDIR, una vez desplazado de las
e
muestras por borboteo de nitrgeno. El tiempo de deteccin seleccionado para ambos tipos e
e
de anlisis fUe de 1,30 min.
u,
Las muestras se diluyeron en agua bidestilada de forma que la cantidad de carbono
e
estuviera comprendida dentro del intervalo de sensibilidad del ensayo. Como blanco se e
e
utiliz el mismo agua bidestilada empleada para diluir las muestras, y los valores de CIT y u.
e
u,
162 u.
e
e
Materialy Mtodos
o
o
o>
Co
u-a
o E
o
u
u
o.>
oca
te o> o
4->
o> .4
O)
1/ 4 N
14
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o-
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4>1~
La
:9 U
o-
-c ~
<a
C3
163
Materia/y Mtodos e,
e
e
e
e
11. 6. 1. Toma de muestras u,
e
Las muestras (10 ni) de los tiempos finales de cultivo se tomaron con jeringa y se u.
inyectaron en vial de cristal hermticamente cenado, extremando las precauciones para
e
minimizar las prdidas de voltiles en la manipulacin. Para detener el crecimiento de los e
e
microorganismos presentes en el cultivo se adicion anda sdica al 0,02%. Posteriormente, u.
las muestras se congelaron a 200C hasta su anlisis. u,
e.
e
e
5890A, acoplado a un detector de masas HP 5971 A, con fUente de ionizacin por impacto e
u,
electrnico (El) a 70eV. La temperatura del inyector y de la interfase tite de 2500<?. El u,
u,
rango de masas tite de 40-350 unidades de masa atmica. La longitud de la columna
u,
e
u.
11. 7. Determinacin enzintica de compuestos de bajo peso molecular u.
e
11. 7. 1. Preparacin de las muestras e
u.
El permeado se utiliz, sin tratamiento previo, para la determinacin de compuestos e
e
de bajo peso molecular. Sin embargo, los efluentes lcteos y el suero, fUeron e
e
164 e
e
a
Materia/y Mtodos
165
e,
Material y Mtodos e
e
e
e-
e
En la mayor parte de las muestras, sin embargo, la concentracin de lactosa se
determin no por kit, sino por el procedimiento descrito por Beuter (1984), con 3- e
t
galactosidasa y lactosa deshidrogenasa de Boehringer (n0 cat. 745.731 y 662.046, e
e
respectivamente), e.
e
e
e
12. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD LACTSICA INTRA- Y e
e.
EXTRACELULAR u,
e
e
12. 1. Preparacin y conservacin de las muestras
e.
e
5 mL procedentes de un cultivo de levadura de 16 h sc centrifUgaron a 4.520 g
durante 5 mi congelndose inmediatamente el sobrenadante obtenido a ~20o C, para el e
u,
anlisis de la actividad lactsica extracelular. Por otra parte, las clulas se lavaron u,
u,
con una concentracin de o~ ufc/mL, hasta una concentracin final del 2% (y/y). Las e
0C y 150 rpm durante 40 mm. e
u,
mezclas se incubaron a 37
e
En pruebas metodolgicas previas se prob para permeabilizar cloroformo que se e
e
e
e
e.
e
e
166 *
mr
e
Materia/y Mtodos
Centrifugacin
(4.520 g, 5 miii)
si
Sobrenadante
L Clulas j
Li Resuspensin
(tampnfosfato)
Centrifugacin
(4.520 g, 5 an)
PERMEABILIZACIN
Resuspensin
a
(tampn fosfato)
Adicin tolueno al 2%
Clulas en tampn
fosfato (5 mL)
Incubacin
0C, 40 mm) 50 rpm
(17
st 3$
Solucin Solucin
ONPC Centrifugacin
(5 mL)
carbonato (8.824 g, 1 mm)
sdico
2LJ 1
(2 mL
1 300C 5 mm
(420 mn)
Figura 15. Preparacin, permeabilizacin y ensayo de la actividad lactsica de
las levaduras.
167
Materia/y Mtodos
168
Materia/y Mtodos
169
e,
e,
e,
e
e.
e
e
e
e
e
e
e
e
u.
e
e
u,
e
e
u,
u,
u,
u.
e
u,
e
e
u,
e
u,
e
u.
e
e
e
e
e
e
u.
e
e
u,
u,
mr
e
e
u,
u.
e
e
u.
e
u,
e
e
u.
e
1V RESULTADOS Y
DISCUSION
t
e,
e
e
e
e
e
e,
mr
e
e
e
e
e
e
e
u,
e
e
e
u,
u,
e
e
u.
e
e
u,
e
e
e
e
e
e
u,
e
u,
e
e
u.
u,
mr
u,
e
e
e
e
e
e
e
e
mr
Resultadosy Discusin
I00
80
ce
o
4-i
o
ce
60
-eo)
~0
.4 40
20
o
0 2 4 6 8 10
Tiempo (horas)
173
e,
Resultados y Discusin e
e,
e.
e
e
Varios autores han dado cifras de los porcentajes obtenidos de hidrlisis de lactosa en
leche (Forsman y col., 1979) y permeados (Chin y Kosikowski, 1985; Abril y Stull, 1989) e
e
tratados con concentraciones similares o superiores de f3-galactosidasa de Kluyveromyces e
u,
lactis (Maxilact); estas cifras pueden ser superiores al 80%, en tiempos de entre 4 y 5 h, lo
e
que se considera industrialmente aceptable. e
e
Chiu y Kosikowski (1985), para hidrolizar perneados dulces con 7,5-30% de lactosa e
e
y con concentraciones de enzima similares a las empleadas en nuestro ensayo (3.300 e.
u.lsu/L de Maxilact LX 5.000), obtuvieron una hidrlisis del 95% a las 5 h a 400<?, en e
e
perneado con un 15% de lactosa y de un 90% con un 7,5% de lactosa. u,
e
Abril y Snl (1985), trabajando con lactasa procedente de Kluyveromyces ladis a e
concentraciones muy superiores a las nuestras (100.000 u.l.n./L) y con perneado e
e
de 4 horas a 330<?. Asimismo, Forsman y col. (1979), con concentraciones de entre 2.400 y u,
4.800 u.l.n. de enzimal, obtuvieron entre un 80 y un 98% de hidrlisis en 5 h a 300<?, en e
e
leche tJHT. Las temperaturas de incubacin y/o las concentraciones de lactosa y lactasa u,
empleadas por ambos grupos fUeron superiores a las empleadas en nuestro estudio.
e
e
e
u,
1. 2. Productos de la hidrlisis e
e
Tambin se estudi la evolucin de la lactosa, galactosa y glucosa durante las 10 h de u,
incubacin del perneado con 3.000 u.l.n./L de Maxilact L 2.000, a 300<? (Figura 17). u.
u,
Durante el perodo de incubacin se observ que a los tiempos intermedios las e.
e
concentraciones de glucosa y galactosa no eran iguales, siendo siempre superior la de e.
glucosa, con una diferencia de hasta el 20%. Las concentraciones de ambos monosacridos e
e
se igualaron al cabo de las 10 h, en que la hidrlisis era completa.
u.
Esa diferencia entre las concentraciones de glucosa y galactosa durante la hidrlisis e
podra deberse a la formacin y luego hidrlisis de oligosacridos. Como ya se indic en la e
u,
introduccin la formacin de oligosacridos por transgalactosidacin ha sido descrita por u.
e
e
e
174
e
u.
Rau/fados y Discusin
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (horas)
1 75
e
Resultados y Discusin
e
e-
e
e-
Por el alto porcentaje de hidrlisis de lactosa conseguido y por la aparente ausencia u.
e
de oligo-galactosacridos, optamos por incubar el perneado durante 10 h con 3.000
u.l.n./L, en las condiciones descritas en Material y Mtodos. u
mr
u
u.
e
1. 3. Efecto de la hidrlisis del perneado sobre los cultivos aerobios con inculo e
mr
de aguas residuales e
e
La hiptesis de trabajo era que la hidrlisis de la lactosa facilitara globalmente el e
crecimiento microbiano (con el consiguiente descenso en la DQO del lquido), e
u,
proporcionando sustratos ms ampliamente utilizables que la lactosa y minimizando la
acidificacin causada por las bacterias lcticas. Para comprobarla, inoculamos el permeado e
e
u
Madrid. Se trataba de comprobar basta qu punto la hidrlisis modifica la seleccin de flora e
u,
originada por la lactosa, cuando es la principal fUente de carbono del medio. u.
e
e
e
1. 3. 1. Efecto sobre laflora u,
e
A pesar de la presumible variedad de la flora de las aguas residuales urbanas, la u,
u
nmero de microorganismos totales y bacterias coliformes tite inicialmente, de 1 x 1o~ y 7 x u.
106 ufc/mI, respectivamente, alcanzando ambos recuentos niveles de 1 & ufc/mL al llegar a u
e
la thse estacionaria, tras 10 h de incubacton. u.
u,
En los cultivos inoculados con las aguas de entrada de la depuradora de La China, la u.
proporcin inicial de bacterias coliformes respecto a totales fUe algo inferior que en el caso e
u,
u.
e
u.
176 u
e
e
Resaltadasy Discusin
II
10
9
o)
lo
-~ 9
O
4-
o 8
6
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
177
9.
Resultados y Discusin e
e-
e.
u,
de Valdebebas (Figuras 18 y 19). Tambin fue algo menor la proporcin final, pero la e
e
hidrlisis del permeado apenas influy sobre la evolucin de las poblaciones microbianas.
e
e
Las aguas residuales urbanas suelen tener un elevado contenido de heces humanas y
animales, bastante ricas en microorganismos coliformes (2 x i09 coliformes/personalda) e
u,
(Bitton, 1994). Mientras que aproximadamente el 99% de las bacterias de la flora intestinal u,
son anaerobias obligadas (Berg, 1996), hay una pequea fraccin que slo son anaerobias e
e
facultativas y entre ellas estn las Enterobacterias y los Lactobacilos. As pues, en las aguas u.
residuales, ricas en heces pero expuestas al oxgeno, slo sobreviven esas fracciones
e
facultativamente anaerobias y en panicular, dentro de las Enterobacterias, las coliformes. e
u.
stas, bsicamente Escherichia cdi y Enterobacter aerogenes, por efecto de la seleccin,
pasan de constituir un 0,02% de la flora de las heces a ms del 50% en las aguas residuales e
e
urbanas (Sanford, 1982). u,
e
Aunque se ha analizado bastante detalladamente la flora de los fangos (aerobios y e.
anaerobios) de las depuradoras, son pocos los trabajos realizados sobre caracterizacin e
u,
colifonnes. u,
e.
Nuestra conclusin es que, dada la abundancia de coliformes en estas aguas y la e
u.
posibilidad de inducir lactasa de estas bacterias, la hidrlisis de la lactosa tiene poco efecto u.
u,
sobre la seleccin de la flora de aguas residuales. Es de presumir que el metabolismo (o la
e
supervivencia) de los microorganismos no coliformes, acompaantes pero no muy e
e
pero su desaparicin solo seda apreciable en aguas relativamente limpias o al menos con e
e
pocos restos fecales. Tambin es posible que la presencia de clulas microbianas no viables u,
(las anaerobias obligadas mayoritarias en las heces) presentes en nuestro inculo y lisadas
e
mr
178 e
e
e
Resultados y Discusin
11
10
9
O
o
8
10
O
9
<4-
o
8
6
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
179
9.
Resultados y Discusin 9.
e.
e
e
durante el cultivo, pueda servir a todo tipo de organismos como fuente de nutrientes, mr
e-
quitando a la lactosa parte de su poder selectivo.
e
e
u,
e
despus de los 3 das (Figura 21 A). En el perneado con la lactosa hidrolizada, por el e
u,
contrario, los microorganismos consumieron toda la glucosa en las primeras 24 h, y slo e
despus de agotar este azcar comenzaron a utilizar la galactosa, que al final del cultivo e
e
haban consumido totalmente (Figura 21 B). e.
u.
u.
u,
50000
u,
e
u,
e
u,
~ti) 30000 e
e.
o e
~20000 u.
o
e
u,
10000 e.
e
e
o e
0 10 20 30 40 50 60 70 80
u,
Tiempo (horas) u.
u.
Figura 20. DQO del perneado control ( ) y del perneado con la lactosa
hidrolizada(o) durante el cultivo (a 300C y 150 rpm) de la flora u,
e
del agua residual de Valdebebas. e.
e
u.
u.
180
e
e
Resultados y Discusin
120
100
80
60
E
40
20
100
80
60
40
20
o
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
181
e,
e
Resultados y Discusin e.
e
e
e
En el caso de los cultivos con inculo de la depuradora de La China (Figura 22), el e
e
descenso de la DQO de los sobrenadantes tras cl cultivo, fue del 21% para el permeado e
e
control y del 45% para el hidrolizado. Es probable que esa mayor diferencia en la cada de
e
u.
e
40000
u,
e
e
ti 30000
A e
o u,
a
o 20000 e
u.
e
10000 e
e
u.
o e
0 10 20 30 40 50 60 70 80 u.
Tiempo (horas) e.
e
Figura 22. DQO del perneado control ( )y del permeado con la lactosa u.
hidrolizada (O ) durante el cultivo (a 300C y 150 rpm) de la flora e.
del agua residual de La China. e
e
u.
e
En la Figura 23 se muestra la evolucin de las concentraciones de azcares en los mr
e
cultivos con inculo de La China. Tambin en este caso, como en el presentado en la
e
Figura 21, puede verse que con el tamao de inculo y los tiempos de incubacin e.
u,
empleados, apenas se llega a consumir la mitad de la lactosa disponible en los perneados e
no hidrolizados. Tambin coinciden en lineas generales los perfiles de consumo de la e
u,
glucosa y la galactosa. La velocidad de consumo de la galactosa aumenta al agotarse la e
e
glucosa.
e
u.
u.
182
e
e
Resultados y Discusin
120
100
80
E 60
40
20
100
80
60
40
20
o
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
183
Resultados y Discusin
La escasa diferencia en prdida de DQO en los cultivos con flora residual del
permeado control y el hidrolizado parece atribuible a la elevada proporcin en el inculo de
bacterias coliformes, en las que se puede inducir lactasa. Es posible que con otro tipo de
inculo, menos rico en aguas fecales, la diferencia en la velocidad de descenso de la DQO
por efectode la hidrlisis de la lactosa, Ibera mayor.
El descenso poco pronunciado de la DQO, con o sin hidrlisis de lactosa, siendo este
azcar, o los monosacridos derivados, la principal fuente de carbono del medio, sugiere
una utilizacin incompleta de estos sustratos, que podran metabolizarse parcialmente de
forma anaerobia. Fournier y col. (1993), trabajando en continuo con perneado inoculado
con fbngos y estircol de ternera, advirtieron un consumo incompleto de la lactosa que en
su caso atribuyeron a una posible limitacin de fuentes de nitrgeno.
Las bajadas muy acusadas del pH producidas durante los cultivos en suero lcteo, han
sido atribuidas a la formacin de diversos cidos orgnicos (Kisaalita y col., 1987; Bilton,
1994). Burgess (1985), trabajando con efluentes ricos en lactosa en un reactor de
anaerobiosis de 2 fases, advirti que la fase acidognica es tan rpida que en poco tiempo
(24 h) el 50% de la DQO est en forma de cidos. Estos bajos valores de pH podran ser los
causantes del retraso en el crecimiento del cultivo en permeado con la lactosa hidrolizada,
as como de la baja reduccin de la DQO en este caso y en el control, siendo la formacin
de cidos menos acusada en los cultivos control porque el consumo de la lactosa es ms
lento.
184
Resultados y Discusin
Kato y Tanaka (1998) sealan que la pobre transferencia de 02 que tiene lugar en los
cultivos en matraz, as como la acumulacin de CO2, acerca a los cultivos a condiciones de
Los bajos valores de pH alcanzados por los cultivos en pencado de flora residual
(Figura 24), pueden en principio condicionar el crecimiento de determinados
microorganismos, sobre todo en el caso del perneado hidrolizado. Para estudiar el efecto
del pH, cultivos en permeado hidrolizado inicalmente iguales fueron ajustados a varios
valores de pH como se muestra en la Tabla 16. El ajuste de pH se realiz manualmente, a
intervalos de 4 horas con NaOH JN, observndose rpidos descensos entre dichos
intervalos.
185
Resultadosy Discusin
e
9.
2
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
Figura 24. pH del penneado control ( ) y del pernieado con la lactosa hidrolizada
(o ) durante el cultivo (a 300(2 y 150 rpm) de la flora del agua residual dc
La China.
Tabla 16. Efecto de la regulacin del pH del permeado con la lactosa hidrolizada en
el recuento de microorganismos totales y de bacterias coliformes y
lcticas, durante el cultivo de la flora del agua residual de La China a 300(2
y 150 rpm a las 76 h de incubacin.
u,
e
5,5 4,3 x 108 3,4 x 108 1,5 x 108
u,
5 8 x o~ l,8x108 7,9x108
e
e
186 e
mr
Resultados y Discusin
Tabla 17. Efecto de la regulacin del pH en la DQO del perneado con la lactosa
hidrolizada durante el cultivo de la flora del agua residual de La China a
300(2 y 150 rpm a las 76 h de incubacin. (DQO inicial= 36.000 mg/L).
7 21.650 39
6,5 23.736 34
6 21.759 39
5,5 22.564 37
5 24.913 31
4,5 22.546 37
Los tratamientos biolgicos, por regla general, se suelen realizar a pH neutro (Bitton,
1994). Se estima normalmente que los pHs muy cidos favorecen un crecimiento excesivo
de microorganismos no deseables de baja especificidad y poca estabilidad (Schroder y De
Haast, 1989; Ghaly, 1996), que pueden inhibir el metabolismo de las bacterias
metanognicas en los tratamientos anaerobios (Ghaly, 1996). El efecto del pH en la
acidognesis a partir de glucosa ha sido estudiado por Zoctemeyer y col. (1982), que a
diferencia de los resultados obtenidos en nuestro estudio, s encontraron variaciones
notables en el crecimiento de los microorganismos totales al modificar el pH, con
resultados mximos a pH entre 5,8 y 6,2. Tambin observaron diferencias cualitativas y
cuantitativas en la formacin de cidos orgnicos.
187
Resultados y Discusin
9.
e
e
e
e.
1. 3. 4. Efecto de a suplementacin con hierro sobre a DQO
e
e
Dado que el oligonutriente ms obviamente escaso en la leche, y por tanto en el
e
perneado, es el hierro (Glass y Hedrick, 1 977b), que es particularmente crtico para el e
e
metabolismo aerobio de los microorganismos, probamos a suplementar los perneados con e
este oligoelemento, para mejorar el metabolismo aerobio y as reducir ms la DQO del u.
e
medio libre de clulas. u.
e
El contenido habitual de hierro del penneado, que dependen del procedimiento de u.
e
elaboracin del queso y del tamao de poro de las membranas de ultrafiltracin, oscila
e
entre 4,1 y 16 gM (Zal, 1992). Para favorecer el crecimiento aerobio del inculo, optamos e
e
por suplementar un permeado con la lactosa hidrolizada con cloruro frrico 0,1 mM, lo que
e
u.
u.
e
e
u.
Tabla 18. Evolucin de los microorganismos totales y de la concentracin de galactosa e
e
en el perneado con la lactosa hidrolizada, durante el cultivo de la flora del
e
agua residual de Valdebebas suplementado con cloruro fnico 0,1 mM. e
e
2,7x109 63 2,2x109 71 e
66
u.
u,
u.
mr
e
e
u
mr
188 e
e
Resultados y Discusin
50000
40000
&tsJ 30000
o
a 20000
o
10000
o
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
189
9.
e,.
ResultadosyDiscusin e
e
mr
e
mr
1. 3. 5. Formacin de cidos orgnicos, etanoly glicerol u.
u.
El descenso pronunciado del pH en los cultivos de permeado hidrolizado inoculado e
e
con agua residual y la escasa reduccin de la DQO en esos cultivos, nos llev a comprobar u.
la presencia de posibles productos de fermentacin. Habindose detectado sensorialinente e
e
fuertes aromas avinagrados y dado que bacterias coliformes como E. cali son u.
e
importante de la poblacin microbiana en estos cultivos, comprobamos tambin la
e
formacin de cido L-lctico. e
e
largo del cultivo en el permeado control. A medida que fue disminuyendo el pH (Figura 26 u,
A) y la concentracin de lactosa (Figura 26 B), comenzaron a aparecer pequeas e
u,
u,
lactosa hidrolizada. La evolucin de los microorganismos totales y de las bacterias lcticas
e
se muestra en la Figura 27 A, donde tambin puede verse el rpido descenso del pH a lo u.
u.
largo del cultivo, hasta 3,5. La concentracin de cido lctico acumulado en este caso es
similar a la observada en el cultivo control, igual que el nivel alcanzado por las bacterias e
u,
lcticas. Sin embargo, a diferencia del cultivo control y paralelamente al descenso de pH, u,
e
A continuacin, intentamos caracterizar otros compuestos formados a lo largo de los u.
u.
cultivos, buscando especiaImente cido butrico y propinico. Para ello, se realiz un u.
anlisis, por cromatografa de gases y espectrometra de masas, del sobrenadante al final de e
u,
los cultivos en perneado control y con la lactosa hidrolizada. En la Figura 28 se muestran u.
190 e
mr
e
Resultados y Discusin
lo 8
9 7
8
6
ci
7
o 5
6
5 4
4 3
100
80
60
40
20
O
60
40
20
o
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
191
Resultados y Discusin e,
e
e
e
e
lo 8 e
u.
9 7 e
8 u,
6 e
o
7 e
o 5 u.
6
e.
5 4 e
e
4 3 e
u,
100
e.
80 e
e
60 u.
e
40 u,
20 e
e
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e
mr
60
u.
e
40 e
E
u,
u.
20
e
u.
o u,
0 10 20 30 40 50 60 70 80 e
Tiempo (horas)
u.
u.
e
u,
e
mr
192
Resultados y Discusin
o
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o
o
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Qe
04 o
04
193
Resultados y Discusin
194
Resultados y Discusin
Varios autores que han estudiado la fermentacin acidognica con flora de fangos
sobre soluciones de glucosa, detallan la produccin de actico en cantidades importantes
(Zoetemeyer y col., 1982; Gmez y Goma, 1986; Fynn y Syafila, 1990). Sin embargo,
tambin describen la formacin de los cidos orgnicos mencionados en el prrafo anterior
como productos finales de la fermentacin de la lactosa (Zoetemeyer y col., 1982; Gmez y
Goma, 1986; Fynn y Syafila, 1990).
195
mr
Resultados y Discusin e,
e
e
mr
u.
acetognica de la flora presente (esto se sugiere en parte en la Figura 26 (2). Es probable u,
e.
por otra parte que, sobre todo en los cultivos con la lactosa hidrolizada, se hayan perdido
e
ciertas cantidades de componentes voltiles (diversos cidos orgnicos, alcoholes, cetonas y u.
e
CO2) que en nuestras condiciones de aireacin no permanecen disueltos en los medios de
e
cultivo.
e
Respecto a las condiciones de aireacin, parece ser que en nuestro caso, con la simple u.
e
agitacin de los matraces, el 02 es limitante y los cultivos desarrollan un metabolismo u,
u,
parcialmente anaerobio. Por eso los productos finales pueden hasta cierto punto compararse
e
con los del tratamiento anaerobio del suero que han estudiado diversos autores. La mayora u.
e
de ellos coinciden en que con la flora de fangos, la mayor parte de la lactosa se transforma, u.
en las primeras fases del proceso (fases hidroltica y acidognica) en cido lctico (Pipyn y e
u,
Verstraete, 1981; Chartrain yZeikus, 1986a). De hecho, Kisaalita y col. (1989) proponen al u.
lctico como mejor indicador para optimizar esa fase del proceso anaerobio. Con la
e
acetato, formato, succinato, y otros productos similares a los de las bacterias lcticas e
u.
heterofermentativas. u.
e
autores que trabajan en condiciones anaerobias con fangos, como Fournier y col. (1993) o u.
e
Chartrain y Zeikus (1 986a), pero cualitativamente las transformaciones registradas son
e
similares. Nuestro proceso, con hidrlisis enzimtica de la lactosa y con flora slo
e
parcialmente anaerobia (de agua residual), es hasta cierto punto comparable al de las fases u.
hidroltica y acidognica del procesado anaerobio de lactosa, con la flora de fangos. O>
e
e
196 mr
e
e
Resultados y Discusin
cido lctico y otros cidos orgnicos. Es probable que tengamos flora acetognica en
nuestras muestras, tanto de los cultivos en permeado control como de los de penneado
hidrolizado, ya que en ambos se produce acetato.
Kisaalita y col. (1987) y Ghaly (1996) proponen por esa razn y para el tratamiento
anerobio del suero, realizar en fermentadores separados la fase metanognica para poder
regular el pH y maximizar la produccin de acetato en una primera fase y de metano en la
segunda.
Es posible pues que nuestro proceso, con la hidrlisis enzimtica y con flora de aguas
residuales en condiciones parcialmente aerobias pueda constituir una alternativa a la
primera fase del tratamiento anaerobio. Es probable, sin embargo, que la proporcin de
enterobacterias en el inculo sea un factor fundamental en el resultado global del proceso.
197
e
e
Resultados y Discusin
e
e
e
e
bacterias lcticas, porque ellas serian, en los medios naturales que nos interesan, los e.
e
organismos que competiran ms directamente con las levaduras. e
e
Para elegir un medio selectivo para levaduras, se compar previamente el cultivo de e
e
C. kefyr NCYC 744 y de K marxianus NCYC 151 en tres medios diferentes. Dos de ellos,
e
el Agar Extracto de Malta con Oxitetraciclina (OMEA) y el agar Rosa-Bengala e
u,
Cloranfenicol (RBC) estn recomendados para el aislamiento selectivo de levaduras y
e
mohos a partir de cultivos asociados con bacterias (Seiler, 1985; Fleet y Mian, 1987; e.
e
Suriyarachchi y Fleet, 1981), mientras que el Agar para Levaduras y Mohos (YM), se mr
9,3x o7 1 x108 e
C.kefyr NCYC 744 9,7x o~
e
K.marxianusNCYClSl 3,3x107 1,9x107 l,9x107 e
e
u,
e
e
u,
Dado que las levaduras se iban a cultivar en suero de quesera, quisimos comprobar u,
e
silos dos medios selectivos usados (OMEA y BBC) eran capaces de impedir o limitar el
u,
u,
en la elaboracin de quesos espaoles. Uno de ellos, el Hansen O R-703 est constituido
e
e
e
mr
198
mr
e
Resultados y Discusin
por especies del gnero Laaococcus, mientras que el Hansen LD CHN-22 incluye
especies de los gneros Lactococcus y Leuconostoc. Como puede verse en la Tabla 21,
ninguno de los dos inculos bacterianos probados, lite capaz de fonuar colonias en los
medios para levaduras, en nuestras condiciones.
C.kefyrNCYC744 + + + + + -
BACTERIAS LACTICAS
En la Tabla 21 tambin se recogen los datos sobre la capacidad de las levaduras para
crecer en algunos medios de cultivo recomendados para la enumeracin selectiva o electiva
de bacterias lcticas (Reuter, 1985). Los medios utilizados frieron: el Man-Rogosa-
Sharpe sin suplementar (MRS) (medio electivo para bacterias lcticas) y suplementado
con cido srbico al 0,06 y al 0,1% (MRS-S) (selectivo para Lactobacillus, Lactococcus
mesfilos y Leuconostoc), as como el agar cido srbico (LaS) (selectivo para
Lactobacillus). Salvo en agar LaS, las dos cepas de levadura crecieron en todos los medios
probados, tras 48 horas de incubacin a 300(2 (Tabla 21). Cuando el tiempo de incubacin
199
Resultados y Discusin
e.
e
de las placas se redujo a 24 horas, de nuevo se observ la formacin de colonias en todos
los medios con excepcin del agar LaS (datos no mostrados). Desafortunadamente, los e
e
cultivos iniciadores no crecieron o lo hicieron slo en forma de microcolonias en el agar e
e
LaS (Tabla 21), incluso cuando la incubacin de las placas a 300(2 se prolong hasta las 72 u.
horas (datos no mostrados). u.
u.
A la vista de estos resultados y dada la dificultad, en estas condiciones, para enumerar u.
e
de forma selectiva y fiable la flora lctica, optamos por emplear el medio OMEA para la e
lactsica e
u.
e
El ONPG (o-nitrofenil--galactopiransido), sustrato anlogo a la lactosa que se
e
este motivo, antes de ensayar esta actividad es frecuente someter a las clulas a u.
e
de la membrana al ONPG. e
e
Por otra parte, la estructura de las envolturas celulares (membrana y pared) varia con
e
la edad (Serrano y col., 1973; Zomer y col., 1987). Varia sobre todo, la composicin de la
pared celular, aunque las modificaciones son diferentes de unas especies a otras (Zomer y e
e
col., 1987; Fleet, 1991). La susceptibilidad de diferentes especies a los tratamientos e.
u,
hidrolticos para alterar la pared, es mayor cuando las clulas son jvenes (Zomer y col., u,
1987; Henschke y Rose, 1991). A pesar de ello, varios estudios sobre la produccin de e
u,
e
200
u.
e
Resultados y Discusin
lactasa de diferentes levaduras crecidas en suero, evidencian que esta enzima se sintetiza
activamente durante la fase exponencial y alcanza su mxima produccin al comienzo de la
fase estacionada de las cultivos (Davies, 1956; Mahoney y col., 1974; Sonawat y col.,
1981; Siso, 1994). Por ello, los estudios sobre permeabilizacin celular se realizaron sobre
clulas de K. marxianus NCYC 151 procedentes de la incubacin en permeado a las 16 h
de cultivo, tiempo coincidente con el final de la fase exponencial, cuya concentracin
celular corresponda a unas 10 ufc/mL.
El tampn fosfato ha sido uno de los compuestos utilizados con xito para extraer la
201
Resultados y Discusin
e>
provocaba lisis celular. Para ello, determinamos la lactasa en los sobrenadantes
e
procedentes de una suspensin celular de K. marxianus NCYC 151 permeabilizada con
e
cloroformo durante 10 mm. La actividad extracelular registrada slo represent un 0,4% de mr
e
la actividad total (datos no mostrados), lo que indica que la enzima se mantena
mayoritariamente intracelular tras el tratamiento. Es probable pues que los precipitados u,
u,
mencionados se deban a restos de clulas, muertas antes de aadir el solvente. Para limitar
e
la formacin de flculos durante la permeabilizacin se incorpor EDTA al solvente.
u,
Randsdorp, 1999), opt por emplear EDTA 50 gM en las mezclas de reaccin, sta tite
tambin la concentracin seleccionada para aadir al cloroformo para la penneabilizacin. e
e
u.
300 e
u,
250 U
e
U
~ 200 U
o
u,
t 150 u.
CC u,
a)
u,
loo
u,
ev
50 u,
u,
o U
0 20 40 60 80 100 120 e
e
Tiempo (mm.)
Figura 29. Efecto del tiempo de incubacin con cloroformo al 2% (y/y) en ausencia e
y presencia de EDTA 50 ~tM,en la actividad lactsica registrada en una
misma suspensin celular dc Kh<yveromyces marxicrnus NCYC 151. (Las e
clulas procedan de un cultivo de 16 h en permeado a 300C y 100 rpm y se u,
200
150
o loo
CC
a)
50
1 1 1
o
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (mm.)
203
e.
Resultados y Discusin e>
e
u.
mr
mr
A diferencia del cloroformo, la adicin de tolueno no indujo turbidez ni modific la u.
e
apariencia de las suspensiones celulares. No obstante, quisimos aseguramos que tras el
u,
u,
un 0,5% de la actividad lactsica total result estar presente en el medio extracelular (datos u,
e
no mostrados), siendo este porcentaje de liberacin similar al descrito para otras cepas por
u,
e
e
La ausencia de precipitacin en las mezclas de permeabilizacin, junto con la mayor
estabilidad de la actividad lactsica en presencia de tolueno, hicieron que seleccionramos u.
u,
este solvente como agente penneabilizante.
u.
Dado el gran nmero de muestras a ensayar y la escasa disponibilidad de tiempo entre e
U
toma y toma de muestra, se hacia difcil la detenninacin inmediata de la actividad
e
u,
tampn fosfato, a dos temperaturas (20 y 40(0). Dado que la permeabilidad de las e
e.
membranas de las levaduras puede variar con a edad (Flores y col., 1994), este estudio se e
e
realiz con clulas de fase exponencial y fase estacionaria. En la Tabla 22 se observa que
en las clulas jvenes (en fase exponencial), la actividad lactsica aumenta con el tiempo U
u.
de conservacin, siendo un 24% ms elevada que la inicial despus de 30 h a 40(0~ Este
meremento de la actividad lactsica podra atribuirse a diversos factores. Por una parte, el
u,
tampn fosfato en el que se encuentran las clulas podra haber alterado la membrana e
u.
celular, favoreciendo un mayor grado de permeabilizacin. Por otro lado, podra haber
e
aumentado un poco el nmero de clulas, a pesar de que la temperatura mnima de e
u.
crecimiento de esta cepa esta en tomo a los 1 00C (Boud, 1993). La actividad lactAsica de
u.
las clulas en fase estacionaria disminuy sin embargo con el tiempo de conservacin a u.
e
mr
204 u,
e
e
Resultados y Discusin
40(0 siendo hasta un 38% inferior que la del correspondiente control, lo que probablemente
Fase de crecimiento
18h 43b
Mmacenan,iento Actividad acUsica Actividad acUsica
205
e>
Resultados y Discusin
e
e
e
No obstante, y dado el menor efecto que la congelacin tuvo sobre la actividad lactsica, e
e
decidimos utilizar este sistema de conservacin durante un tiempo no superior a las 72 h. e
e
u,
u
u
e
Tabla 23. Actividad lactsica de suspensiones celulares de Candida ke.frr NCYC e
U
Fase de crecimiento
U
18h 43h e
e
U
(horas) (nnioles/mn.) (nmoles/min.) u,
e
0 825 100 2.886 100
e
24 801 97 2.563 88 U
e
48 726 88 2.487 86 e
e
72 774 93 2.343 81 U
u,
e
e
2. 2. Estudio bsico de las levaduras y aguas residuales U
U
objetivo de este estudio, tanto de las cepas de coleccin como de las aisladas (que se
e
describen en el siguiente apartado), ffie seleccionar aquellas que mostraran una mejor u,
e
aptitud para rebajar la concentracin de lactosa del permeado y para flocular, ya que esta e
e
e
e
206
e
e
Resultados y Discusin
Los criterios para seleccionar cepas del catlogo de la coleccin britnica (Boud,
1993), fueron en primer lugar, su capacidad para fermentar lactosa y por otra parte, el
hecho de estar consideradas, por la FDA (Food and Drug Administration) de Estados
Unidos, como GRAS (Generally Recognized As Safe), ya fuera el microorganismo (caso de
Kluyveromyces marxianus) (Harden, 1996) o sus enzimas (A? niarxianus, K. lactis y (0.
kefrr (VDA, 1984; Wassennan, 1984). Esto abrira las puertas para su empleo en alimentos
para consumo humano, respetndose las Buenas Prcticas de Fabricacin.
Cuando se inocul el permeado con o~ ufe/niL de cada cepa, todas las tomadas de la
coleccin britnica alcanzaron las 108 ufc/mL despus de 20 h de cultivo (datos no
mostrados). Los tiempos de duplicacin celular mostraron una variacin moderada, no
observndose diferencias marcadas en cuanto a adaptacin al medio entre los dos gneros
estudiados (Tabla 24). Las cepas que mostraron mayor velocidad de crecimiento fueron las
NCYC 851 y 143.
207
Resultados y Discusin
Al comparar nuestros resultados con los de otros autores, es preciso recordar que la
mayor parte de los estudios publicados se han realizado utilizando permeados enriquecidos
con suplementos nutritivos. Tambin hay que tener en cuenta que el valor nutritivo de los
permeados, sobre todo en cuanto a material nitrogenado, depende de las enzimas, la flora y
las condiciones de fermentacin en la quesera, as como del tamao de poro de las
membranas de ultrafiltracin, que retengan ms o menos pptidos. Castillo y De Snchez
(1978) y Barbosa y col. (1985) han determinado los tiempos de duplicacin celular de
distintas cepas de K marzianus, entre ellas de la NCYC 587 empleada en este trabajo, en
suero desproteinizado por acidificacin y calentamiento, suplementado con sulfato amnico
y extracto de levadura. Estos tiempos oscilaban entre 56 y 154 mi comparables pues con
los obtenidos aqui para la misma especie (70-97 mm). Tambin EI-Samragy y Zal (1988)
registraron tasas de crecimiento aceptables en cultivos de distintas especies de
Kluyveromyces y Candida en permeados de ultrafiltracin tratados trmicamente pero sin
suplementar. Esto parece sugerir que al menos este tipo de permeado de ultratiltracin no
es un medio muy limitante para el crecimiento de este tipo de levaduras. En otra parte del
trabajo presentamos nuestros datos sobre los efectos de la suplementacin.
208
Resultados y Discusin
las cepas K. marxianus NCYC 151, K. marrianus NCYC 1429, 0 kefyr NCYC 143 y (01
kefrr NCYC 744 (Tabla 25). Dentro de este ltimo grupo destacaron por su velocidad de
degradacin las levaduras pertenecientes a la especie C. keJJr, que consumieron alrededor
de la mitad de la lactosa inicial en slo 22 h de cultivo.
209
e.
e.
Resultados y Discusin
e.
mr
U
U
con otra de las cepas empleadas en nuestro estudio, la C. lcefyr NCYC 744 (Bales y
Castillo, 1979). Varios grupos de trabajo han sugerido que el consumo de lactosa se
favorece cuando se adiciona fsforo al suero desproteinizado (Wasserman y col., 1958;
Haju y col., 1976). El empleo de este suplemento, sin embargo, parece dar distintos
resultados en funcin del tipo de permeado o suero y tambin de las cepas de levadura
empleadas. As por ejemplo, la adicin de fsforo en concentraciones comprendidas entre
el 0,3 y el 0,5 % no result mejorar significativamente la velocidad de utilizacin de la
lactosa en cultivos de Kluyveromyces marxianus (Wendorf y col., 1970; Castillo y De
Snchez, 1978) ni de Candida kefyr (Bales y Castillo, 1979).
Aunque no existen muchos datos disponibles sobre este particular, EI-Samragy y Zail
(1988) han observado, al cultivar distintas especies de Kluyveromyces y Candida en
permeado sin suplementar, que la desaparicin de lactosa tras 72 h de cultivo puede oscilar
entre el 37 y el 100 %, habindose alcanzado un nivel de crecimiento de entre
e
ufcfmL. u.
e
A pesar de que es posible que algunas de las cepas de la coleccin britnica probadas
por nosotros mostraran un comportamiento diferente en presencia de distintos suplementos,
pre-seleccionamos aquellas pertenecientes a los grupos de moderadamente y muy
activamente utilizadoras de lactosa para estudios posteriores.
u.
e.
e
U
210
e
a
Resultados y Discusin
Tabla 26. Desarrollo del consumo de lactosa en los cultivos en permeado inoculados
con cepas de la coleccin espaola.
DESAPARICIN DE LACTOSA
CEPA (%)
IOh 24h 48k
211
Resultados y Discusin e
mr
e
e
u,
que hemos registrado para estas Debaryomyces pudiera mejorar forzando la afreacton. mr
u,
Esto, como el empleo de suplementos, puede encarecer considerablemente un proceso para U
u.
el que se desea economizar costes al mximo posible.
e
u,
u,
2. 2. 1. 2. Floculacin de las cepas de coleccin
e
e
Con objeto de abaratar el proceso de produccin (concretamente la fase de
u,
e
en el permeado de ultrafiltracin tras alcanzar la fase estacionaria, es decir, cuando la e
lactosa ya haba sido mayoritariamente utilizada tras 72 h de cultivo. Como se observa en u.
e
las Tablas 27 y 28 ninguna cepa de los tres gneros empleados (Kluyveronzyces, Candida y u.
e
Debaromyces) mostr una capacidad de floculacin elevada.
e
e
e
u.
u,
Tabla 27. Medida de la floculacin en tubos de cepas procedentes de la Coleccin e
Nacional Britnica cultivadas en permeado y en medio YPD1. e
u.
Cepa Permeado Medio YPD
e
NCVC 151 o 1 u,
NCVC 587 1 u,
NCYC 851 o 0 u,
NCYC 1429 O 0 U
U
NCYC 1368 1 0
e
NCYC 1548 o 1
e
NCVC 143 1 u.
NCVC 744 o 0 e
e
e
e
212
e
e
Resaltadosy Discusin
Diversos autores han descrito que la presencia de lactosa en el medio puede provocar
un ligero efecto inhibitorio de la floculacin, tanto en especies incapaces de utilizar la
lactosa como sustrato (Saccharomycodes ludwigii; Stratford y Pearson, 1992), como en las
que s la utilizan (A? bulgaricus oK. lactis; Hussain y col., 1986; Bellal y col., 1995). La
galactosa, aunque se encuentra en muy pequea concentracin (1,2 mlvi) en el penneado,
podra quizs tambin contribuir a originar una merma en la capacidad de floculacin. Se
ha descrito una inhibicin de la floculacin por adicin de D-galactosa 15 y III mM en los
gneros Candida y Kluyveromyces (Hussain y col., 1986; AI-Mabmood y col., 1988; Bellal
y col., 1995). El mecanismo por el cual la D-galactosa inhibe la formacin de flculos no se
conoce adecuadamente. En un principio se postul que este monosacarido actuaba como un
impedimento estrico, saturando las lectinas, que reconocen a los polisacridos especficos
de la pared, de tipo galactomanano. Sin embargo, al no haberse encontrado galacto-
polisacridos (Hussain y col., 1986) en la pared celular de Kluyveromycesi, AI-Mahmood y
col. (1988) sugirieron una nueva teora, segn la cual la D-galactosa inducira la sntesis de
proteasas endgenas, que desprenderan a las lectinas de la pared, con la consiguiente
incapacitacin para la floculacin.
213
w
Resultadosy Discusin
e.
e.
u
e.
menor a la presente en el permeado de suero (10 mM Ca2~; Zadow, 1992). Otros autores,
sin embargo, registran buenos niveles de floculacin elevando la concentracin de calcio
e
hasta 70 mM (Femandes y col., 1993). e
u.
Bellal y col. (1995) encontraron por otra parte, que los porcentajes de floculacin e
e
aumentaban al cultivar K lacds en medios ricos en glucosa y peptona. Por este motivo,
e
decidimos comprobar la capacidad de floculacin de nuestras cepas en el medio YPD, u.
e
abundante en los compuestos citados, y que ha sido utilizado por diversos autores para u,
estudiar la floculacin de levaduras (Miki y col., 1982a; Watari y col., 1991; Stratford y e
e
Pearson, 1992; Cubels y col., 1996). e
e
Como puede verse en la Tabla 27, el uso de medio YPD no supuso una mejora en la u.
u,
capacidad de floculacin de las cepas procedentes de la coleccin britnica, pero s mejor
u,
ligeramente la de Deb. hansenil CECT 10360 (Tabla 28). Este aumento podra deberse a la u.
e
peptona, descrita como estimulante de la floculacin de su forma imperfecta C. famata u.
1429, NCYC 1548, NCYC 1368, NCYC 744 y NCYC 143, para su posterior estudio en e
e
otros aspectos.
e
e
e
e
2. 2. 2. Cepas procedentes de las aguas residuales de quesera
e
e
2. 2. 2. 1. Obtencin y seleccin de cepas de aguas residuales. Consumo de lactosa u,
u.
Las cepas aisladas de los efluentes lcteos, tal y como se describe en el apartado 10 u,
de Material y Mtodos, se cultivaron en permeado para seleccionar las que mostrasen una u.
e
mejor capacidad para utilizar la lactosa. Las cepas aisladas directamente de los efluentes se e
u,
denominaron con la letra D y las que tenan el mismo origen pero ifieron adaptadas al
e
u.
214 e
e
e
Resultados y Discusin
Por lo que se refiere al efluente de la quesera mediana, slo proporcion dos cepas
del tipo D. Las del tipo A no mostraron mejor aptitud para crecer en penneado que las D
(Tabla 30). En general, todas las cepas consumieron poca lactosa, excepto la Dl- 14 que fine
capaz de utilizar la mitad de la lactosa inicial a las 72 h (Tabla 30). Descartamos pues las
posibilidades de empleo de las levaduras obtenidas de esta quesera.
215
0~
Resultados y Discusin
e
e
e
e
u,
u.
Tabla 29. DesarroUo del consumo de lactosa (%) y recuentos
a las 72 h en los e
e
quesera Pequea.
u,
DESAPARICIN DE LACTOSA u,
DT31 O lO 18 3,6x107 u,
DT33 5 15 32 2,4xl08 e
AT 0 24 27 1,3x108 e
AT3 0 18 30 8,4x1O7 e
AT4 2 2 11 1,9x106 e
AT5 0 20 22 l,1x109 e
AT6 0 0 13 2,4x106 e
AT9 0 12 14 7,7x108 e
e
e
u,
e
u.
u,
U
e
216
u.
e
Res,,liadosy Discusin
Tabla 30. Desarrollo del consumo de lactosa (%) y recuentos a las 72 h en los
cultivos en permeado inoculados con cepas procedentes del efluente de
la quesera Mediana.
De manera similar a lo observado en las cepas de las dos queseras descritas, en las
procedentes de la quesera grande, no siempre se constat una correlacin positiva entre el
mve] de crecimiento y la capacidad para utilizar la lactosa como sustrato (Tabla 31). En este
caso, y a diferencia de lo observado en las cepas de la quesera pequea, la adaptacin previa al
medio de cultivo no sirvi para seleccionar cepas que consumieran el disacrido ms
rpidamente. Por el contrario, las cepas que mostraron un consumo ms alto fUeron la DF-5 y
la DF-27. Entre las adaptadas, tan solo la cepa AF-9, mostr una buena aptitud para el
consumo de la lactosa. El agua residual empleada para obtener ambos tipos de cepas (D y A),
proceda de la balsa de homogeneizacin adscrita al sistema de depuracin que tiene instalado
dicha industria. Es posible que en ella se produzca cierto grado de adaptacin de las levaduras
para el aprovechamiento de lactosa, lo que explicara un mejor comportamiento en este
sentido, entre las cepas de tipo D. De esta quesera se seleccionaron las cepas DF-5, DF-27 y
AF-9 para su posterior estudio e identificacin.
217
e
Resultados y Discusin
e,
e,
e,
e,
Tabla 31. Desarrollo del consumo de lactosa (%) y recuentos a las 72 h en los mr
cultivos en permeado inoculados con cepas procedentes del efluente de e
la quesera Grande. u,
u.
DESAPARICIN DE LACTOSA RECUENTOS
CEPA (%) (ufcmL) U
DF22 0 13 19 I,6x106 e
DF27 42 100 100 8,2x107 e
AFI 0 0 14 2,3x107 e
AFZ 0 11 11 3,6x106 u,
AF3 0 3 12 1,3x108 e
AF4 0 9 12 3,1x106 u,
AF6 0 8 22 l,5x106 e
AF9 42 88 99 1,8x108 e
AFlX 0 26 60 2,7x107 u,
AFX2 0 18 18 l,8x107 e
AF13 0 18 35 1,4x1& e
AF19 0 2 11 6 x108 u.
AFIZ 0 7 17 I,6x107 u,
AiF23 0 5 10 4,1x106 e
AF24 0 3 5 3 x107 u.
AF27 0 3 6 3,6x107 e
AF2S 0 8 14 2,8x107 u,
AF29 O II 77 l,9x103
AF3O 0 21 21 2,2x106 u,
AF31 0 3 34 6,3x107
El inculo de partida tite de to~ ufc/niL en todos los casos.
e
e
u,
u.
Al igual que las cepas de las colecciones espaola y britnica, el estudio del grado de
e
floculacin de la totalidad de las 59 cepas aisladas revel que ninguna de stas poscia
buena aptitud floculante tras cultivarse 48 h en permeado (Tabla 32). Las cepas e
u,
consideradas como buenas utilizadoras de lactosa no frieron capaces de flocular, y las que e
u,
silo hicieron, no mostraron una velocidad adecuada de consumo del azcar (Tablas 29, 30,
31 y 32). Cuando se analiz la capacidad floculante de cada una de ellas en medio YPD, u.
e
218
e
mr
Resultadosy Discusin
tan solo una, la AF-22, ms bien pobre utilizadora de lactosa, alcanz un grado de
floculacin aceptable (Tabla 32).
Tabla 32. Medida de la floculacin en tubos de todas las cepas aisladas de efluentes
lcteos cultivadas en permeado y en medio YPD.
219
e,
Resultados y Discusin
e,
e,
e,
e,
2.2.2.3. Clasificacin
e
Las 5 cepas por nosotros aisladas y seleccionadas por su capacidad de utilizar la e
lactosa (DF-5, DF-27, AF-9, AT-7 y Al-lo), fueron identificadas por la Divisin de e
e
Levaduras (Servicio de Identificacin) del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) u.
e
de Holanda. En la clasificacin se utilizaron las pruebas de identificacin y caracterizacin
morfolgica y fisiolgica enumeradas en el apartado 10. 3 de Material y Mtodos. e
e
En las Tablas 33, 34 y 35 se muestran los resultados obtenidos en las diversas pruebas e
u,
realizadas a las cinco cepas. Como puede verse, cuatro de las cinco cepas se identificaron
como Kluyvero,nyces marxianus (DF-27, AF-9, AT-7 y Al-lo) y la quinta como Candida
e
intermedia (DF-5) (especie que se caracteriza por no fermentar lactosa, aunque es capaz de e
u.
asimilara) (van Uden y Buckley, 1971; Meyer y col., 1984). Es interesante observar que las
e
5 cepas resultaron ser capaces de utilizar, adems de lactosa, celobiosa, otro disacrido con e
u,
enlace 13 1-4 que pocos organismos degradan. Otro aspecto de inters industrial es la u,
capacidad de las 4 Kluyveromyces no slo para fermentar la lactosa, sino tambin para e
u.
utilizar el lactato y crecer a 370C, aptitudes todas ellas de las que carece nuestra Candida u.
intermedia (DF-5). e
e
u.
Hasta donde nosotros conocemos, no se han realizado estudios de caracterizacin de
u.
las levaduras presentes en los efluentes lcteos. Sin embargo, existen diversos autores que e
u.
han aislado e identificado levaduras a partir de instalaciones y productos lcteos comoya se
mr
describi en el apartado 5 de la Introduccin. En dicho captulo se puso de manifiesto el e
e
papel destacado de K marxianus como levadura deseable y contaminante en los procesos u.
de elaboracin de quesos. u.
e
Aunque, Candida intermedio tambin ha sido aislada de quesos (Rohm y col., 1992; e
u,
Westall y Filtenborg, 1998a), sueros (Rohm y col., 1992; Westall y Filtenborg, 1998a), e
e
salmueras (Seiler y Busse, 1990; Rohm y col., 1992; Westall y Filtenborg, 1998a) e
e
instalaciones de la industria lctea (Viljoen y Oreyling, 1995; Westall y Filtenborg, 1998a), e
e
su incidencia es bastante escasa. Aunque slo hay datos preliminares al respecto, la
e
U
u,
e
mr
220 mr
e
u.
Resultados y Discusin
Morfologa
Colonias rosadas - - - -
Filamentos + + + + +
Artroconidias
Aseosporas +,(1) ,(1) +,(I) +,(1)
Gemacin + + + + +
Pseudohifas + + + + +
Halistoconidias
Fisin
Rifas septadas
Balistoconidias simtricas - - - -
(1) oval-reniforme
221
Resuftados y Discusin
e
e,
e,
e,
e
Cepa DF-5 DF-27 AF-9 AT-7 AT-lO
u.
e
Asimilacin de compuestos carbonados e
e
O-Glucosa + + + + + e
O-Galactosa + + + + + e
e
L-Sorbosa + - - -
e
0-Olucosamina + - - - -
e
0-Ribosa - - - - - u,
e
O-Xilosa + + + + +
u,
L-Arabinosa - + + + + e
0-Arabinosa - - - - - u.
u,
L-Ramnosa - - - - -
e
Sacarosa + + + + + e
Maltosa + - - - - e
u,
a,ct-Trealosa + - - - -
e
med a-O-glucsido + - - -
u,
Celobiosa + + + + + e
u.
Salicina + + + + +
e
Arbutina + + + + + u.
Melobiosa - - - - - e
e
Lactosa + + + + +
e
Rafinosa + + + + + u.
Melecitosa + - - - - u,
Inulina - + + + + e
u.
Almidn soluble + - - - -
u.
e
u,
e
e
e
e
u.
u,
e
222 e
mr
e
Resultados y Discusin
Glicerol - - + + +
,neso-Eritritol - - -
Ribitol + - + + +
Xilitol + + +
L-Arabnitol - - - - -
0-Glucitol + + + + +
0-Manitol + - + + +
Gajactitol
mio-lnos:tol - - - - -
Glucono 5-lactona + - - - -
2-Keto-O-gluconato nd ud nd nd nd
0-Gluconato + - - - -
0-Glucuronato - - - - -
D-Galacturonato - - - - -
DL-Lactato - + + + +
Suecinato + + + + +
Citrato + + - + +
Metanol - - - - -
Etanol + + + + +
Propano 1,2 diol + - - - -
Butano2,3diol - + + + +
Acido quinico + - - - -
Sacarato
(nd): no determinado.
223
Resultados y Discusin
e,
u,
e
Tabla 34. (continuacin).
Nitrato
Cadaverina + + + + +
Etilamina + + + + +
L-Lisina + + + + +
Produccin e
u.
Acido actico - - - - -
e
Almidn U
Crecimiento
A 3~C
+ + + +
Fermentacin
0-Glucosa + + + + +
O-Galactosa + + + + +
Maltosa + - - - -
Sacarosa + + + + +
Lactosa - + + + +
Rafinosa + + + + + e
u,
u.
e
u,
224
Resultados y Discusin
225
Resultados y Discusin
e,
u
e
e
Los valores de ph registrados frieron prximos a la neutralidad en las aguas
residuales correspondientes a las queseras pequea y grande, mientras que el pH de la
quesera mediana mostr un valor muy alcalino (pH 10). Este ltimo valor de ph es
atribuido a la presencia de agentes custicos, a pesar de que se procur que la recogida de
las aguas no coincidiese en horario con las prcticas de limpieza de la industria. La
alcalinidad es una caracterstica frecuente en las aguas residuales procedentes de la
industria lctea (Bu) y col., 1981; Wheatley, 1994; Espigares y col., 1997; Strydom y col.,
1997). Adems, el pH de las aguas residuales producidas por una misma industria puede
oscilar entre 2 y 11 a lo largo de un da, dependiendo de los ciclos de produccin, el
sistema de produccin empleado en cada ciclo (Strydorn y col., 1997) y el procedimiento de
limpieza aplicado (Bul y col., 1981; Strydom y col., 1997).
u,
La cifra de slidos totales (ST) en el agua residual de la quesera pequea result ser
mucho mayor que la de las otras dos. (Tabla 36). La proporcin de slidos disueltos (SD)
respecto a los totales lite elevada en los 3 casos. La cantidad de ST presentes en las aguas
residuales de queseras es tambin un parmetro muy variable, oscilando los valores
descritos entre 4 y 59 g/L (Boda y col., 1992; Kalyuzhnyi y col., 1997; Strydom y col.,
1997) dependiendo tambin en este caso de diversos aspectos de los sistemas de
produccin e higiene.
U
Los valores de DQO, COT y nitrgeno total de las aguas de las queseras mediana y
grande no mostraron diferencias significativas, pero la concentracin de lactosa y protena
tite superior en la mediana. Esta diferencia puede deberse a los distintos sistemas de
aprovechamiento del suero empleados en estas queseras, en el momento de la toma.
Mientras que en la quesera grande el suero se deshidrataba en su totalidad para obtener
e
u,
226 e
u,
e
Resultados y Discusin
suero en polvo, en la quesera mediana se elaboraba requesn con parte del suero, vertiendo
el resto al agua residual.
Uno de los principales factores que influyen en la composicin qumica de las aguas
residuales es el volumen de agua utilizado durante el procesado. Entre el 75 y el 95% del
agua utilizada pasa fmalxnente a formar parte del agua residual (Strydom y col., 1997),
obtenindose, por dilucin, una correlacin negativa entre el consumo de agua y la
concentracin de DQO de las correspondientes aguas residuales.
depuracin de los vertidos (Iglesias, 1994). No es pues de extraar, que los valores de
DQO de vertidos lquidos queseros descritos en la bibliografia oscilen entre 1,3 y 77 g/L
(Marwaha y col., 1989; Borja y col., 1992; Iglesias, 1994; Kalyuzhnyi y col., 1997;
Strydom y col., 1997).
227
Resultados y Discusin
e,
t
y
e
cifrado entre io~ y lo7 ufc/mL el recuento total de microorganismos de estas aguas e,
e
(Marwaba y coL, 1989; Espigares y col., 1997). e
e
Al estimarse el nmero de levaduras y mohos se observ que este tipo de flora era
e
particularmente abundante en el agua residual de la quesera pequea. Es posible que esto e
e
sea debido a un menor aislamiento del entorno, debido al pequeo tamao y relativa u,
sencillez de esta instalacin y a su empleo de leche cruda para la elaboracin del queso. e
e
Marwaha y col. (1989) han estudiado la incidencia de levaduras y mohos en distintas aguas u,
lo que era previsible dado que en ella se elabora exclusivamente queso fresco. No es este el e
e
caso, en las otras dos industrias. No obstante, en las tres muestras estudiadas, las bacterias u,
u,
lcticas se mostraron un orden de magnitud por debajo de las totales, y frieron menos
U
lactsica en el medio libre de clulas al final del cultivo de las cepas seleccionadas, no
detectndose actividad alguna en ningn caso (datos no mostrados).
Como puede verse en las Figuras 31 y 32, la actividad lactsica comenz a detectarse
en todas las cepas a partir de las 14 h de incubacin en los cultivos iniciados con o~
ufc/mL, salvo en los correspondientes a las cepas del gnero Candida (NCYC 143, NCYC
744 y DF-5), donde apareci dos horas ms tarde. El nivel de poblacin en esa flise estaba
entre 106 y 07 ufc/mL. La actividad lactsica no se mantuvo estable a lo largo del cultivo,
sino que mostr variaciones en funcin del tiempo de incubacin y de la cepa (Figuras 31
y 32). Al alcanzar la fase estacionaria se observ en todos los casos una disminucin de la
actividad lactsica llegando a niveles prximos a O en las cepas NCYC 151, 1368 y 744,
DF-5, AF-9 y AT-10 al final del cultivo (Figuras 31 y 32). En la Tabla 37 se observa que
los niveles mximos de produccin (expresados en unidades/mg) se alcanzaron en distintos
tiempos de incubacin dependiendo de la cepa utilizada, correspondiendo sin embargo
todos ellos a cerca de 108 ufc/mL, o sea, principio de la fase estacionaria.
229
Resultados y Discusin
e,
e
e
e
e
400 e
e
350
u,
300 U
e.
250 U
u,
200 e
e
o 150
<-4 e
d <7
.2 o 100 e
~j, e
o.
50 e
u.
j~C o
e
o,
e
Ito 350
u,
300 e
U
250 e
U
200 u,
e
150
e
100 e
e
50 e
e
o e
0 10 20 30 40 50 60 70 e
Tiempo (horas) U
u,
u,
Figura 31. Evolucin de la actividad lactsica de las cepas de la coleccin britnica
u,
durante su cultivo en permeado. (A) Cepas con baja actividad lactsica
(inferior a 150 nmoles ONP/minIlO7 ufc): K. marxanus NCYC 151 ( )
u,
e
yNCYC 1429c[o),K lactsNCYC 1368(u)yC. kefrrNCYC744( a).
e
(II) Cepas con alta actividad lactsica (superior a 150 nmoles ONPImin/107
ufc): C. kefrr NCYC 143 (4) y K ladis NCYC 1548 (A). U
U
230
e
e
Resultados y Discusin
400
350
300
250
200
150
ci loo
50
<4j
,
o
350
rt~
300
250
200
150
100
50
o
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (horas)
Figura 32.
Evolucin de la actividad lactsica de las cepas aisladas en este trabajo
durante su cultivo en permeado. (A) Cepas con baja actividad lactsica
(inferior a 150 timoles ONP/min/107 ufe): C. intermedia DF-5 ( ) y K
marxianus DF-27 (o). (B) Cepas con alta actividad lactsica (superior a
150 nmoles ONP/minulO7 ufc): K. tnarxianus AF-9 ( u ), AT-7 ( A ) y
AT-l0(t).
231
u
Resultadosy Discusin e,
e,
e
Tabla 37. Actividad lactsica, tiempo de cultivo y recuentos de levaduras e
e
correspondientes al valor mximo de actividad lactsica registrado en las e
cepas anterionnente seleccionadas, cultivadas en permeado. u
U
Actividad lactsica Tiempo de cultivo Recuentos (ufc/xnu) e
(unidades/mg clula) (horas) U
u,
NCYC 143 1,04 22 4,2 x io~
e
~ NCYC 1548 0,92 43 8,5 x 102 e
e
u NCYC t429 0,23 43 2,2 x 108 e
u, u
u,
NCYC 151 0,10 20 2,4 x 108
e
NCYC 1368 0,10 43 2,5 x
u,
u,
cJ DF-27 0,31 22 8,8 x
e
DF-5 0,01 43 5,1 , o8 e
e
u,
u,
u,
Parece evidente que el nivel mximo de 3-galactosidasa alcanzable no es una e
caracterstica propia de gnero o especie, sino especfica de cada cepa. e
e
e
presumiblemente el resultado de la combinacin de efectos inductores e inhibitorios para la e
sntesis de la enzima ejercidos por la lactosa y los monosacridos procedentes de su e
e
hidrlisis intracelular o presentes en baja concentracin en el suero. u,
u,
ste que se anula por la adicin de cAMP). La presencia de glucosa causa represin de un e
u,
gran nmero de genes codificadores de enzimas requeridas para la utilizacin de otros e
u,
mono-, di- y oligosacridos (Melcher, 1997).
U
e
e
e
e
232 e
U
Resultados y Discusin
233
u
Resultados y Discusin
e,
u
u
*
que Imita su comparacin con nuestros resultados obtenidos con permeado. Por ejemplo,
e,
Bales y Castillo (1979) y Siso (1994) al cultivar C. kefrr NCYC 744 y K. ladis var. lacas
NCYC 1368 (NRRL Y-l 140) en este tipo de suero, registraron un mximo de actividad e
e
lactsica 4 y 10 veces supenor respectivamente, al obtenido en permeado (Tabla 37). Sin
embargo, otros autores al cultivar diversas cepas de K marxianus en sueros suplementados, e
e
obtienen unos niveles mximos entre 0,24 y 1,36 unidades/mg, prximos a los que nosotros e
e
hemos observado en permeado (Snchez y Castillo, 1980; Barbosay col., 1985).
u,
Hay que tener en cuenta adems, que la concentracin de lactosa empleada en los e
medios descritos en la literatura oscila entre 15 y 80 g/L (Bales y Castillo, 1979; Snchez y e
e.
Castillo, 1980; Barbosa y col., 1985; Siso, 1994), lo que puede afectar drsticamente a la e
magnitud de la sntesis de lactasa (Bales y Castillo, 1979; Dickson y Markin, 1980). Existe e
e
una relacin directa entre la concentracin de lactosa en el medio y el nivel de lactasa, e
u,
aunque esa relacin dependa del tipo de cepa. Diversos autores han estimado entre 73 y
e
150 gIL la concentracin de lactosa necesaria para alcanzar el nivel mximo de produccin e
e
de 3-galactosidasa en distintas cepas de K. marxianus y C. kefyr (Wendorff y coL, 1970; e
Mahoney y col., 1974; Bales y Castillo, 1979). Es posible pues que la concentracin natural e
e
de lactosa en permeado (43 g/L) est por debajo de la ptima para obtener el mximo u,
obtenidos de nuestros cultivos. Uno de ellos podra ser la disponibilidad de oxigeno. Los e
e
cultivos en matraz aireados por agitacin no proporcionan concentraciones altas de oxgeno
en solucin (Kato y Tanaka, 1998). Una concentracin que llegara a estar por debajo de los e
e
0,01 mmoles OiL podra favorecer la expresin de la lactasa (Mahoney y col., 1974;
Barberis y Gentina, 1998). Tambin la temperatura y el pH pueden tener un papel. A este e
u,
En todas las cepas aqu recogidas, como en la inmensa mayora de las descritas de los
2. 3. 2. 1. Cultivo en permeado
235
e>
u
e
Resultados y Discusin
e,
e,
e,
e,
100
80
60
1,
o
u 40
-4
20
40000
30000
o
& 20000
10000
4
0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
u,
Figura 33. Evolucin de la desaparicinde la lactosa inicial (%) (a, A), de la Demanda
Qumica de Oxgeno (DQO) (mgl) (b, B) y del pH (e, C) durante la
incubacin en permeado de las levaduras seleccionadas de a coleccin
britnica. Letras minsculas: Cepas con actividad lactsica <150 mnoles
ONP/minulO7ufc: K marxianus NCYC 151 (e ) y NCYC 1429 ( O), K
ladis NCYC 1368 ( u ) y C. kefrr NCYC 744 ( rl). Letras maysculas:
Cepas con actividad lactsica > 150 timoles ONP/min/107 ufc: K lactis
NCYC 1548(A)y C. kefyrNCYC 43(4).
e
e
e
236
e
e
7 -r~- 7~ 1
r~
Resultados y Discusin
Al irse determinando los valores de DQO del medio libre de clulas a lo largo de los
cultivos, observamos que la produccin de 3-galactosidasa no guardaba relacin con la
disminucin de la DQO. As por ejemplo, en los cultivos de las cepas NCYC 1548, 143 y
1429 disminuyeron poco la DQO (inicialniente 48.700 mgl y por encima de los 30.000
mg/L al final de la incubacin, Figuras 33 b y33 B). Por el contrario, las cepas NCYC 151,
744 y 1368 redujeron la DQO hasta un 45 - 56% de la concentracin inicial (Figura 33 b).
Comopuede verse en la Figura 33, el agotamiento de la lactosa en los cultivos de estas tres
ltimas cepas (48 h) no se reflej de forma inmediata en la DQO, sino que fueron
necesarias 24 h ms de incubacin para conseguir el mximo descenso. Atribuimos sto a
una degradacin incompleta de la lactosa, que se traducira en la acumulacin en el medio
de productos solubles poco voltiles, sobre todo alcoholes y cidos orgnicos, como se
discute ms adelante.
237
*
Resultados y Discusin .7
.7
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loo -
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o
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0 20 40 60 80
e,
Tiempo (horas) e,,
e
del suero al aumentar 5 veces la concentracin celular inicial de las levaduras (de 2 x io~ a e
1 x o~ ufc/mL). En nuestras condiciones, como obtuvimos aproximadamente un 20% de e
e
estudiadas anteriormente, en este grupo de cepas s se observaron diferencias importantes
en la velocidad de utilizacin de la lactosa (Figuras 35 a y A). Destacaron en este sentido, e
u,
las cepas de K. marxianus AT-7 y AT-lO, que al cabo de 24 h de cultivo haban consumido
un 73 y 61% de la lactosa inicial, respectivamente (Figuras 35 a y A). Estas dos cepas U
U
frieron, junto con la AF-9, las que haban mostrado adems mayor capacidad de sntesis de e
lactasa (Figura 32 B). Todas las cepas aisladas de efluentes utilizaron la totalidad de la
e
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0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (horas)
Figura 35. Evolucin de la desaparicin de la lactosa inicial (%) (a, A), de la Demanda
Qumica de Oxgeno (DQO) (mg/L) (b, B) y del pH (e, C) durante la
incubacin en permeado de las levaduras aisladas de efluentes de quesera
Letras minsculas: Cepas con actividad lactsica <150 nmoles ONiP/minIlO7
ufc: C. intermedia DF-5 (e) y K. marxianus DF-27 ( o). Letras maysculas:
Cepas con actividad lactsica> 150 nmoles ONP/min/107 ufc: K rnarxianus
AF-9 (u), AT-7 (A) y AT-10 (A).
239
Resultados y Discusin
e
e
e
e,
La evolucin de las concentraciones de glucosa y galactosa no se diferenci
significativamente de la ya descrita para las levaduras de la coleccin britnica (datos no
mostrados).
e
240 U
e
e
Resultados y Discusin
241
e>
Resultados y Discusin
e,
e,
e,
u
(respiratoria o fermentativa) (Castrillo y Ugalde, 1993). As, Siso (1994) ha observado que e,
K. lactis NCYC 1368 puede producir un 50% ms de etanol al aumentarse la lactosa del
U
medio de 30 a 50 g/L. e
e
En funcin de los resultados obtenidos en este apartado seleccionamos para las U
e
siguientes experiencias, las cepas NCYC 151, 744 y 1368, AT-7, Al-lO yAF-9. u,
u,
e
u,
el crecimiento y el uso de las fuentes de carbono, por parte de las levaduras cultivadas en
e
sueros desproteinizados y efluentes lcteos (Moresi y col., 1980a; Bayer, 1983; Marwaha y
e
col., 1 988b). Ante la posibilidad de que el crecimiento en permeado de las cepas e
u,
seleccionadas fuera deficiente en nitrgeno y/o fsforo, ensayamos el efecto de la e
suplementacin conjunta con sulfato amnico y fosfato dipotsico al 0,5% (De Felice y U
e
Scioli, 1994) sobre la reduccin de la DQO en los correspondientes cultivos. Tal y como se u,
muestra en las Figuras 36 y 37, la citada suplementacin del permeado no slo no favoreci U
u,
el descenso de la DQO, sino que en algunos casos se redujo menos (cepas NCYC 151 y u,
Al-lo), u,
e
e
Aunque el sulfato amnico es usado frecuentemente como suplemento de los cultivos
e
de levaduras para favorecer el rendimiento de biomasa o la reduccin de la DQO de sueros u,
e
lcteos (Moresi y col., 1980a; Bayer, 1983; De Felice y Scioli, 1994), su efecto no siempre u,
autores, la baja eficacia mostrada por el sulfato amnico para suplementar el crecimiento y
e
reducir la DQO, podra deberse a que esas levaduras asimilan esta sal de forma incompleta
e
e
242 e,
e
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Resultados y Discusin
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Tiempo (horas)
243
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Resultados y Discusin e,
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u
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e
Tiempo (horas)
u,
244
Resultados y Disensin
o a que se induce una acumulacin de iones amonio en el medio que ejerce un efecto
inhibidor, parcial o total, sobre la asimilacin del nitrgeno orgnico.
Al igual que el antonio, el fsforo suele incluirse entre los suplementos para mejorar
el crecimiento de levaduras en medios naturales procedentes de leche (Moresi y col.,
1 980a; De Felice y Scioli, 1994). Aunque no disponemos de datos sobre el efecto
individual que el fsforo ejerce en los cultivos para la reduccin de la DQO, si se ha
descrito que a concentraciones comprendidas entre 0,01 y 0,5 %, favorece el crecimiento y
la utilizacin de lactosa en cepas de 16 marxianus (Wendorff y col., 1970; Haiju y col.,
1976). Sin embargo, este efecto positivo no se ha observado en cultivos de C. kefir (Bales y
Castillo, 1979).
Dado que ninguna de las cepas de levadura seleccionadas result tener buena
capacidad de floculacin, nos propusimos determinar si eran capaces al menos de
sedimentar de fonna natural aunque friera lentamente despus de su cultivo en permeado.
Esta capacidad podra ser explotada para concentrar las clulas, antes de su separacin, una
vez finalizado el crecimiento y por tanto, el tratamiento con ellas del suero o permeado.
Como puede verse en la Tabla 39, tras las 5 h de reposo, en todos los casos se
recuperaron ms del 50% de las clulas en la mitad inferior del volumen del lquido de
cultivo. Las mayores tasas de recuperacin corresponden a los cultivos de las cepas NCYC
151 y AF-9 con porcentajes de recuperacin de clulas en tomo al 90%.
245
e,
Resultados y Discusin e
e,
e,
u
e,
Tabla 38. Desplazamiento del frente de separacin durante la sedimentacin de e
levaduras, expresado como % del volumen que resulta clarificado. e
e
Tiempo NCYC ~ e
NCYC 744 AF-9 AT-7 AT-10
(mm)
e
0 0 0 0 0 o e.
30 1 ni 5 40 nd e
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u,
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u,
240 45 nd 50 nd nd e
300 60 nd 55 nd nd e
nd. El frente no era ntido. e
e
e
Tabla 39. Tasas de recuperacin de levaduras, decantadas en la mitad inferior e
del volumen del lquido tras 5 h de sedimentacin. u,
u,
e
NCYC 151 NCYC 744 AF-9 AT-7 AT-1O
e
e
e
u,
e
El tiempo del ensayo es critico para la comparacin de los resultados de floculacin e
u,
(Tablas 27 y 32), registrados tras slo 3 minutos de observacin de cultivos jvenes, y los
e
e
dos fenmenos, el estrictamente fisico-quimico, de agregacin de partculas, con el U
e
biolgico, de envejecimiento del cultivo. Un trabajo de Calleja (1987) estudia algunos de
e
los procesos implicados; a tiempos largos y concentraciones de clulas altas, se van u,
e
agregando paulatinamente las clulas que cuando se renen en grupos o ficulos de ms de
e
10 unidades, decantan a velocidad notoriamente superior. U
e.
La sedimentacin libre tiene lugar por la fuerza de la gravedad de acuerdo con la ley de u,
e
Stokes (Earle, 1988), que en principio slo es aplicable cuando el flujo es laminar y las
e
partculas, esfricas: e
e
U
u
246 e
e
e
Resaltadosy Discusin
11) = dimetro
g (PP - G fuerza
= de la gravedad
densidad de la partcula
= slida
donde: densidad del lquido
18 ~ TV viscosidad del lquido
2. 3. 4. Crecimiento en suero
A pesar del bajo nivel inicial de microorganismos del suero empleado, cuando se
compararon las curvas de crecimiento de las cepas de levadura en suero y permeado, se
observ que en todos los casos los niveles alcanzados en suero fueron inferiores,
exceptuando el caso de la cepa NCYC 151, cuyas cifras finales fUeron similares en ambos
247
Resultados y Discusin e
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e
Tiempo (horas)
248
Resultados y Discusin
medios (Tabla 40). Ante la obvia ventaja de disponer de una mayor disponibilidad de N en
suero que en permeado, el suero crudo presenta serios inconvenientes para el crecimiento
de las levaduras. Las bacterias lcticas crecen ms deprisa que ellas, compiten por los
mismos sustratos y producen diversos metabolitos de efecto antagonista, como se comenta
ms adelante.
En la Tabla 41 se observa como el pH inicial del suero (6,6) baj hasta 4,2 en el
control en tan slo 24 li de incubacin. Los pHs de los sueros inoculados con las cepas
NCYC 151 y 744 y AT-7 fueron los que mostraron un menor descenso durante toda la
incubacin (Tabla 41). En general, para todas las cepas de levadura ensayadas, los
descensos de pH registrados en los cultivos en suero fueron ms acusados que los
registrados en permeado (Figuras 33 y 35, Tabla 41).
En la Figura 39 A se observa que slo en los cultivos con las cepas NCYC 151 y AT-
10 se registr una velocidad de consumo de la lactosa apreciablemente mayor que en suero
control (no inoculado), habindose utilizado aproximadamente el 60% de la concentracin
micial de este azcar tras 24 h de incubacin (frente a un 10% en el control). Adems, se
comprob que al finalizar el cultivo de la cepa AF-9 todava quedaba un 15 % de la lactosa
inicial, igual que en el suero control (Figura 39 A).
El valor de DQO del suero aqu empleado fue de 60,000 mgl, lo que supone un
30% ms de carga contaminante que su correspondiente permeado (Figuras 33 b y B y
Figura 39 II). Al estudiar la evolucin de la DQO del suero libre de clulas, durante el
cultivo de las cepas de levadura seleccionadas, observamos que la AT-7, Al-lO y NCYC
151 fueron las que redujeron este parmetro en mayor medida, proporcionando porcentajes
de reduccin del 34, 30 y 23%, respectivamente (Figura 39 B). Las dos ltimas cepas
249
Resultados y Discusin
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Resultados y Discusin
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Resultados y Discusin
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253
Resultados y Discusin
e,
e
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U
Tabla 43. Reduccin de la DQO (%)durante el cultivo de las levaduras en u,
suero y permeado a las 72 h de cultivo. e
e
U
Cepas Suero Permeado
e
e
NCYC 151 23 31 e
e
NCYC 744 20 34 e
U
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AF-9 15 35
e
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AT-7 34 26 e
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U
u,
e
254
e
e
Resultadosy Discusin
255
e
Resultados y Discusin e
u,
e
e
u,
1987; Fonseca y col., 1991), lo que indica una mayor preferencia por dichos sustratos que U
u,
e
Para la comparacin de los efectos sobre la DQO de los cultivos en suero, conviene e
u,
recordar que existen considerables diferencias cuali- y cuantitativas en cuanto a
e
e
u,
e
e
Resultados y Discusin
puro, requirindose en algunas fases del cultivo un flujo de hasta 1,6 v.v.m. a una presin
aproximada de 1 bar, para mantener una pO~ dcl 60%.
2. 4. 1. Aireacinforzada
En todos los casos con aireacin forzada se produjo un descenso de pH, que fue
menos acusado en el caso de la cepa NCYC 151 (Figura 40 B). En el cultivo de la cepa
NCYC 744, sin embargo, y a partir de las 35 h, el pH comenz nuevamente a elevarse
hasta alcanzar un valor prximo al del perineado inicial (Figura 40 B). Es probable que
esto se deba a la utilizacin de algunos de los cidos orgnicos y lo alcoholes formados.
257
Resultados y Discusin e,
e,,
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u,
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e
u,
e
Tiempo (horas)
e
e
Figura 40. Cultivos dc C. kefyr NCYC 744 ( ), K marxianus NCYC 151(0 )
y K marxanus AT-7 ( u ) en penneado a 300C, 200 rpmy aireacin
mantenida al 60% pO
2 (A) Crecimiento, (13) pH, (C) lactosa y (D)
DQO.
e
e
u,
e
e
u,
u,
e
u,
e
e
258
Resultados y Discusin
- Slidos totales (ST) del sobrenadante libre de clulas (g/L), biomasa proteica (g/L), recuentos de
levaduras (ufdmL), Carbono Inorgnico Total (CIl?) (mg/L), Carbono Orgnico Total (COT) (%)
y Demanda Qumica de Oxgeno(DQO).
- ST inicial del permeado: 46 g/L.
- CJT inicial dei pernieado: 70 mg/L.
259
Resultados y Discusin
(Harden, 1996).
260
Resultados y Discusin
261
e,
Resultados y Discusin so
so
e,
so
e,
2. 4. 2. Suplementacin con nitrgeno yfsforo
U
El cultivo aerobio de levaduras para la produccin de protena unicelular (SCP e,
Single Cel Protein-) suele tener generalmente a la depuracin como uno de sus objetivos e
e
(Ghaly y Singh, 1989; Ghaly y EI-Taweel, 1995b). Varios autores sealan que cuando la e
e
finalidad del cultivo es la produccin de biomasa, caso en que la formacin de etanol y u,
otros compuestos orgnicos es indeseable, los requerimientos nutritivos de las levaduras se e
e
deben incrementar, siendo insuficientes los sustratos naturalmente presentes en el suero e
(Castillo, 1990; Kilara y Patel, 1992). Dado que varios autores han conseguido descensos u,
U
de la DQO del 90% en periodos de tiempo ms codos a los nuestros, suplementando los e.
e
medios (sueros y sueros desproteinizados) con fuentes de nitrgeno y/o de fsforo y e
mejorando la aireacin (Moresi y col., 1980b; De Felice y Scioli, 1994; Izlarden, 1996), e
e
intentamos emular estos rendimientos adicionando conjuntamente al permeado sulfato e
e
embargo, otros autores que han estudiado el efecto de la suplementacin con sulfato U
e
262 e,
e
e
Resultados y Discusin
10 7,5
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9
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0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)
Figura 41. Cultivos de (7. kefrr NCYC 744 (e) y K ,narxianus NCYC IS(o)
en permeado a 30 0C, 200 rpm y aireacin mantenida al 60% Po
2,
suplementados S04(NH4)2 y K2P04 al 0,5% (p/v). (A) Crecimiento,
(B) pH , (C) lactosa y (D) DQO.
263
e
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Resultados y Discusin e,
e,.
e,
e,
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Tabla 45. Caractersticas de los cultivos en permeado de las cepas (7. kefrr NCYC 744 y
e,
K mandanus NCYC 151, tras 48 h de incubacin con una PO2 constante del
so
60% y suplementacin de SO4 (NI-14 y K2HPO4 al 0,5% (p/v). e
Cepa ST Biomasa Recuentos CIT COT DQO U
e
(gIL) (gIL) (ufc./mL) (mgIL) (mg/L) (%) (nig/L) (%) e
e
e
NCYC 151 22,1 6,0 5,1 x io~ 67 5.400 74 12.355 75
e
e
- Slidos totales (ST) del sobrenadante libre de clulas (g/L), biomasa proteica (g/L), recuentos de
levaduras (ufc/mL), Carbono Inorgnico Total (CIT) (mg/L), Carbono Orgnico Total (COT) (mg/L y e
% de reduccin) y Demanda Qumica de Oxgeno (DQO) (mgl y % de reduccin) e
e
e
u,
e
En conjunto los descensos de la DQO obtenidos fueron inferiores a los obtenidos sin e
e
suplementacin (Figuras 36, 40 y 41). Tanto en permeado como en permeado e
suplementado, la cepa NCYC 151 fue la que mostr mejores resultados en cuanto a e
e
disminucin de la DQO, lo que podra atribuirse a su menor capacidad fermentativa. e
e
e
e
2. 4.3. Suplementacin con hierro e
e
El contenido en hierro del permeado es bastante pobre (4,1-16 gM) (Zal, 1992). Este e
e
metal es necesario sobre todo para la sntesis de enzimas implicadas en los procesos
e
respiratorios de las levaduras. Considerando que el mantenimiento de las clulas con una e
e
aireacin equivalente al 6O~/o de saturacin, podra provocar un desequilibrio metablico e
debido a la escasez de este nutriente, adicionamos cloruro frrico a una concentracin de 2 e
e
mM a los cultivos de la cepa que haba mostrado una mejor aptitud para reducir la DQO u,
e
(K marxianus NCYC 151).
e
e
Paradjicamente, como resultado de este enriquecimiento, el crecimiento al inicio de
e
la incubacin tite ligeramente inferior que el mostrado por el control (Figuras 42 A vs. 40 e
e
e
e
e
264
e
e
Resultadosy Discusin
10 7,5
9 7,0
6,5
8 6,0
o
(4-7 o,
5,5
o
5,0
5 4,5
4 4,0
50000 100
,~ 40000 80~.
A
A 30000 60 ~
o 2
01 o
ce
0 20000 40 -~
10000 20
O o
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)
Figura 42. Cultivo de K marxianus NCYC 151 en permeado a 300C, 200 rpm
y aireacin mantenida al 60% p0
2, suplementado con Cl3Fe 2 mM.
(A) Crecimiento (e ) y pH ( o ), (B) Evolucin de la DQO ( U
lactosa ( O).
265
e
e
e.
Resultados y Discusin
e,
e,
e,
so
A). Al fmalizar el cultivo no se registraron diferencias destacadas en cuanto a nmero y e-
u
peso celular (slo un 3% superior que el control) (Tablas 44 y 46). La adicin de hierro no e,
e
modific significativamente ni la evolucin del consumo de lactosa ni el pH (Figuras 40 B
e,
y C vs. 42 A y B), ni tampoco el descenso de la DQO, que tan slo fue un 1,5% superior al U
e
del control (Figuras 40 D y 42 B). La reduccin del COT coincidi nuevamente con la de
e
la DQO (Tabla 46). Finalmente, comprobamos que los slidos totales se redujeron tan slo e
e
un 0,6% respecto al control sin suplementar (Tablas 44 y 46). e
e
De Felice y Scioli (1992) sugieren que concentraciones de cloruro fnico 3 mM e
e
que, esa mayor produccin podra deberse al aporte de mayor cantidad de nutrientes
e
U
suplementacin con hierro es inoperante para nuestros fines, y/o en nuestras condiciones. O
e
porque no sea ste el nutriente limitante, o porque contribuya, junto con el abundante u,
e
oxgeno, al estrs oxidativo de las clulas. e
u,
e
u,
u,
Tabla 46. Caractersticas de los cultivos en permeado de K narxianus NCYC 151 tras e
e
48 h de incubacin con una ~O2 constante del 60% y suplementacin de cloruro
u,
frrico 2 ST
mM. Biomasa Recuentos CIT COT DQO
e
e
Cepa (g/L) (g/L) (ufc/mL) (mg/L) (% reduccin) (% reduccin) u,
e
- Slidos totales (ST) del sobrenadante libre de clulas (g/L), biomasa proteica (g/L), recuentos de
levaduras (ufc/mL), Carbono Inorgnico Total (CIT) (mg/L), Carbono Orgnico Total (COT) (%) y e
Demanda Qumicade Oxgeno (DQO). u,
- ST inicial del permeado: 46 g/L. e
- CI) inicial del permeado: 70 mg/L. e
e
u,
e
e
266
e
U
V CONCLUSIONES
4-
e
e
e
u.
e,
mt
U
so
U
e
e
e
e
e
e
e
u,
u,
e
e
e
e
e
u,
e
e
e
so
e
e
U
u,
e
e
e
e
e
e
e
e
u,
u,
e
e.
u,
e
e
e
Conclusiones
1. Para comprobar su aptitud para crecer en el lquido ultrafilttado &enneado) del suero de
quesera, se seleccionaron 11 cepas de levadura de las colecciones espaola y britnica,
capaces de utilizar lactosa y pertenecientes a los gneros Kluyveromyces, Candida y
Debaryomyces. Las cepas de este ltimo gnero crecan muy lentamente en este medio;
el resto lo hacan con tiempos de duplicacin de 70 a 100 horas. La velocidad de
utilizacin de lactosa de cada cepa no se correlacion con su actividad lactsica. En la
mayora de las cepas se observaron dos mximos de actividad lactsica a lo largo del
crecimiento en permeado. El mximo de actividad registrada he de 250 nmoles de
ONP/min/107 ufc, para una Candida kefyr. En nuestras condiciones de cultivo, 4 de las
cepas (dos Kluyveromyces rnarxianus y dos Candida kefyr) consuman toda la lactosa
del permeado en menos de 48 horas.
269
e,
Conclusiones e
e
e
e
De estas 5 cepas, 4 fueron identificadas como Kluyveromyces marxianus y la otra, como e.
Candida intermedia.
e
e,
u,
4. Las levaduras, de coleccin o aisladas de efluentes, en las que se observ mayor
velocidad en la utilizacin de lactosa, no mostraron aptitud para la floculacin u,
u,
espontnea, aun habiendo alcanzado la fase estacionaria. Sin embargo, tras 5 horas de
reposo, al menos dos terceras partes de las clulas, decantaban en la mitad inferior del u,
e
volumen del cultivo; en los cultivos de una de las K marxianus, sedimentan as el 96% u,
U
e
e
6. Para mejorar dicha reduccin de la DQO, se prob a suplementar los permeados con U
e
nitrgeno y fosfato, sin obtenerse diferencias significativas. Sin embargo, al bombear
oxgeno en los cultivos (en fermentador), se lleg a una reduccin de la DQO del 89 %, e
e
con una de las K. marxianus, con un rendimiento de 6,6 g de levadura por litro de u,
e
penneado. El mayor gasto en aireacin, podra pues verse compensado por una mayor e
reduccin de la DQO en el lquido de cultivo y por la recuperacin de clulas utilizables U
e
como fuente de protena y lactasa.
u,
e
7. Las cepas que haban dado mejor resultado, en cuanto a reduccin de la DQO, al crecer
en permeado, dieron resultados muy inferiores al ser cultivadas en suero dulce, debido U
U
u
e
u,
e
270 e
e
e
Conclusiones
271
e
y,
9
e
e
*
mt
e
e
e
u
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
U
e
e
U
e
e
u,
u,
e
e
e
e.
e
e
e
e
e
e
u,
e
e
e
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e
u,
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e
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Normativa mediaambientai citada
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