Espectrometra Lectura N 8

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Espectrometra

Objeto de Estudio N 6

LECTURA N 8

ESPECTROMETRA DE
FLUORESCENCIA MOLECULAR

Bibliografa:
SKOOG, D.A.; Leary J.J.; ANLISIS INSTRUMENTAL, 4 ed.; Ed. McGraw-Hill
(1994), pgs. 201-219.

F.C.Q.
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Facultad de Ciencias Qumicas

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR

El fenmeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie qumica es excitada por

medio de radiacin electromagntica y como consecuencia la especie pierde la energa
adquirida reemitiendo esta en forma parcial o total. Esto es, parte de la energa adquirida
por la especie qumica se reemite en forma de choques moleculares y parte en forma de
energa luminosa o el total de la energa adquirida se reemite en forma de radiacin.

La fluorescencia y la fosforescencia son dos manifestaciones diferentes del fenmeno

fotoluminiscente. Estos dos efectos difieren entre s en el mecanismo a travs del cual
son producidos, adems del tiempo de duracin de la fotoluminiscencia una vez que ha
cesado de excitarse la muestra con radiacin electromagntica. La fluorescencia cesa
casi inmediatamente despus de que a la muestra se le suspende la radiacin (<10-6
seg.), mientras que la fosforescencia puede durar varios segundos o minutos en iguales
circunstancias. La fluorescencia no est restringida a un estado fsico determinado de la
materia, esta puede existir en: gases, slidos o lquidos.

Uno de los aspectos ms atractivos de la luminiscencia es su sensibilidad inherente, con

lmites de deteccin que son a menudo tres rdenes de magnitud ms pequeos que los
encontrados en espectroscopa de absorcin. Los lmites de deteccin tpicos son el
orden de partes por billn.

ESTADOS EXCITADOS.- Cuando se forma un enlace entre dos tomos en una molcula,
los orbitales atmicos de cada uno de los tomos que forman el enlace generan dos
orbitales: uno enlazante de baja energa y otro antienlazante de energa mucho mayor.

Cuando la molcula no est excitada, los electrones que forman un enlace especfico se
encuentran ocupando los orbitales enlazantes, debido a que estos son de energa menor
y por lo tanto de esta manera la molcula es ms estable.

Asociados a cada nivel electrnico se encuentran diferentes niveles vibracionales, por lo

que cuando una molcula es irradiada con energa de cierta frecuencia o longitud de
onda esta puede pasar a diferentes niveles vibracionales de alguno de los estados
excitados So y S1 (Figura 1).

SPN DEL ELECTRON.- La mayora de las molculas poseen un nmero par de

electrones. Estos dos electrones poseen diferente giro o diferente spin cuando estn en el
estado basal. En esta situacin se dice que los electrones estn apareados y el momento
magntico producido por el spin es cancelado, siendo la molcula diamagntica. Cuando
los pares electrnicos se encuentran apareados se le llama estado singulete. So y S1 son
el primero y segundo estado excitado de un singulete. Otra posibilidad es que durante el
proceso de transferencia del electrn del estado basal al estado excitado cambie su spin
y en este caso los dos electrones tienen el mismo giro.

Tal estado en espectroscopia se conoce como triplete y en este caso la molcula es

paramagntica ya que el vector magntico creado por el giro de los dos electrones no se
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anula sino que se suma y da un valor neto de momento cuntico magntico de spin.
Estos estados se pueden representar de la manera siguiente:

. . .

. . .

Singulete estado basal Singulete excitado Triplete excitado

La Figura 1 es un diagrama parcial de niveles de energa para una hipottica molcula

fotoluminiscente. La lnea horizontal So representa la energa del estado fundamental de
la molcula, el cual normalmente es un estado singulete, en este nivel electrnico al igual
que en los otros estados excitados se encuentran asociados varios niveles vibracionales
de la molcula. A temperatura ambiente la energa electrnica de prcticamente todas las
molculas es So. Las dos lneas de la izquierda representan S1 y S2 corresponden
respectivamente primero y segundo estado singulete excitado. El de la derecha T1
corresponde al primer estado triplete excitado. Hay que sealar que el estado triplete es
menos energtico que el correspondiente estado excitado singulete.

Figura 1: Diagrama parcial de energa para un sistema fotoluminiscente.

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La excitacin de esta molcula puede tener lugar por absorcin de dos bandas de
radiacin, una centrada alrededor de la longitud de onda 1 (S0 S1) y la segunda
alrededor de la longitud de onda ms corta 2 (S0S2). El paso directo de la molcula de
un estado singulete basal S0 a un triplete excitado T1 no ocurre debido a que ciertas
transiciones estn prohibidas por las Leyes cunticas, pero es posible tener la molcula
en un triplete excitado a travs de una transicin indirecta como se explicar
posteriormente.

PROCESOS DE DESACTIVACIN

Una vez que la especie ha sido excitada a niveles energticos superiores, la

desactivacin o prdida de la energa en exceso se puede efectuar a travs de diferentes
procesos. El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el
tiempo de vida del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por fluorescencia es
rpida con respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal emisin.

En la mayor parte de las especies qumicas, la desactivacin por relajaciones no

radiactivas (choques moleculares de la especie excitada con el solvente) es la ruta
cinticamente favorecida, ya que el nmero de especies fluorescentes es muy pequea
en comparacin con las especies no fluorescentes. El fenmeno de fluorescencia est
restringida a un nmero relativamente pequeo de sistemas que poseen caractersticas
estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de relajacin o
desactivacin sin radiacin se reduzca hasta el punto que la reaccin de emisin puede
competir cinticamente . Los procesos que son posibles de ocurrir en una molcula que
tiene niveles de energa similares a los mostrados en la Figura 1 son los siguientes:

CONVERSIN EXTERNA.- Este es el proceso que ocurre ms frecuentemente en las

especies atmicas y moleculares. Durante este proceso y el exceso de energa que tiene
la especie excitada se pierde por choques moleculares entre la especie excitada y el
solvente, el resultado neto es una transferencia de energa de la especie excitada a las
molculas vecinas y un incremento mnimo en la temperatura del solvente.

CONVERSIN INTERNA.- En este proceso una molcula excitada pasa del estado
electrnico ms alto al estado electrnico ms bajo ocasionando una serie de
relajaciones vibracionales sin emisin de radiacin , se favorece cuando dos niveles
electrnicos son de energa similar y puede ocurrir un traslapamiento.

En estas circunstancias la fluorescencia tiene lugar slo a 3. A pesar de que la radiacin

de longitud de 1 o 2 fue la responsable de la excitacin. La quinina es un ejemplo
clsico de este comportamiento, esta sustancia presenta una banda de excitacin a 340
nm y una banda de emisin a 450 nm.

Un espectro de fluorescencia siempre implica longitud de onda de mayor que la utilizada

para la excitacin de la especie, pues como se ve en el diagrama parte de la energa que
recibe la molcula se disipa en forma de calor ( procesos no radiativos ) y solo parte de
esta energa se reemite como radiacin electromagntica ( Fluorescencia ).
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CRUZAMIENTO INTERSISTEMAS.- Es un proceso en el que el espn de un electrn

excitado se invierte y da lugar a un cambio en la multiplicidad de la molcula. Como se
observa en la figura 1 La transicin directa de un singulete a un triplete es altamente
improbable debido a las restricciones cunticas. La presencia de especies
paramagnticas como el oxgeno molecular en disolucin tambin favorece el
cruzamiento entre sistemas y consecuentemente disminuye la fluorescencia.

EFICACIA CUNTICA Y TIPO DE TRANSICIN.- Empricamente se observa que el

comportamiento fluorescente lo presentan con ms frecuencia compuestos en los que la
transicin es el tipo , * ya que tales transiciones presentan tiempos de vida promedio
ms cortos y no aquellos compuestos en los que la transicin de menor energa es del
tipo n, *; esto es, la eficacia cuntica es mayor para transiciones *, .

FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

La fluorescencia es un fenmeno no muy comn, pero la fosforescencia es an menos

frecuente de presentarse en sistemas qumicos. Este ltimo fenmeno est confinado a
compuestos qumicos muy especficos y bajo condiciones extraordinarias.

Para que los procesos de desactivacin por fluorescencia puedan competir con los
procesos de desactivacin por fluorescencia y por relajaciones no radiativas, el medio
debe ser altamente viscoso y la temperatura del sistema debe ser del orden de la
temperatura del nitrgeno lquido aunque hay excepciones sobre todo en slidos en las
cuales la fosforescencia se presenta en condiciones normales, por ejemplo, el mineral
wilmenita (ZnSiO4) cuando es excitado con radiacin Ultravioleta, fosforesce en
condiciones ordinarias y el tiempo que dura la fosforescencia es alrededor de 340 horas
despus de que ha cesado la excitacin.

Una diferencia especfica con respecto a la fluorescencia y la fosforescencia es el tiempo

de duracin del fenmeno. La fluorescencia cesa de inmediato una vez que la fuente de
excitacin ha sido retirada de la sustancia (<10-6 seg.) la fosforescencia dura al menor 10-
4
seg. y en algunos casos hasta horas como en el caso de la wilmenita.

Ambas tcnicas son muy tiles en el estudio terico de estructura qumica, enlaces,
configuracin electrnica en molculas, niveles de energa en teora de orbitales
moleculares, etc., sin embargo debido a las limitaciones fsicas que impone la
fosforescencia, en qumica analtica la aplicacin de estos fenmenos est restringida a la
fluorometra, que consiste en la cuantificacin de la radiacin emitida por fluorescencia de
una especie qumica que posee estas caractersticas y que es directamente proporcional
a su concentracin.

RELACIN ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y CONCENTRACIN.- La

relacin que existe entre fluorescencia y concentracin es directamente proporcional; a
mayor concentracin mayor fluorescencia y viceversa, por lo que una grfica de
intensidad de fluorescencia contra concentracin es una lnea recta (siempre y cuando
A<0.05 ).
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FACTORES QUE AFECTAN LA FLUORESCENCIA.- La intensidad de fluorescencia es

afectada por los siguientes factores:

1. Estructura: La fluorescencia se presenta ms comnmente y en forma ms intensa

con compuestos que tienen grupos funcionales aromticos con bajas energas de
transicin . Compuestos que tienen estructuras de carbonilos alifticos y
alicclicos o de dobles enlaces cojugados con un alto grado de estabilidad de
resonancia tambin pueden presentar fluorescencia, pero el nmero de estos es
relativamente pequeo comparado con el nmero de sistemas aromticos
fluorescentes.
La sustitucin de grupo funcional en el anillo de benceno cambia la longitud de onda
de mxima absorcin con un cambio correspondiente en la posicin e intensidad de la
lnea de emisin de fluorescencia.

2. Temperatura y naturaleza del solvente: El efecto de un aumento en la temperatura

incrementa el nmero de choques moleculares, por lo que la desactivacin tiende a
efectuarse a travs de procesos no radiativos y por lo tanto se inhibe la fluorescencia.
La viscosidad del solvente tiene efectos similares, a mayor viscosidad menor nmero
de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia.
La polaridad del solvente tambin tiene influencia en la fluorescencia, debido al efecto
hipsocrmico y batocrmico que el solvente ejerce sobre el compuesto.

3. Efecto del pH: Debido a las diferentes formas qumicas que son posibles de existir a
diferentes condiciones de pH, la intensidad de fluorescencia tambin es afectado por
este factor. Ejemplo: el fenol y el in fenolato tienen diferentes propiedades
fluorescentes, por lo que si las condiciones son de pH bsico la especie estar en el
equilibrio qumico en la forma del fenol y/o ion fenolato, afectando as la intensidad de
fluorescencia.

4. Efecto del oxgeno disuelto: Debido al paramagnetismo de la molcula de oxgeno,

esta tiende a desactivar cualesquier estado activado por oxidacin fotoqumica de la
especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las
molculas excitadas al estado triplete .por lo que es deseable que el oxgeno no se
encuentra presente en solucin o su concentracin sea mnima

INSTRUMENTACIN PARA FLUORESCENCIA

Los componentes de un fluormetro o espectrofluormetro son muy similares a los de un

espectrmetro Visible- UV. Un diagrama simplificado de los componentes de un
fluormetro son los que aparecen en la Figura 2.

El diagrama de doble haz es sumamente til para compensar por las fluctuaciones en la
intensidad de la fuente de excitacin. El haz de referencia pasa a travs de un atenuador
de radiacin y se ajusta ste hasta hacer que la intensidad de este haz sea igual a la
intensidad del haz de fluorescencia que pasa por el recipiente de muestra cuando se
encuentra en ste un blanco.
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El haz de radiacin dirigido al recipiente de muestra pasa por un filtro (fluormetro) o por
un monocromador (espectrofluormetro), donde se selecciona la longitud de onda de la
radiacin que va ha incidir en la muestra. La radiacin fluorescente emitida por la muestra
es en todas direcciones pero es ms convenientemente medida a un ngulo de 90 con
respecto al haz incidente ya que la radiacin dispersada por la solucin y por la celda
misma puede interferir con la radiacin emitida por la especie fluorescente.

Tanto el haz de referencia como el haz de muestra son dirigidos a un sistema de foto
tubos y posteriormente a un amplificador diferencial que se encuentra conectado a un
sistema de lectura, tal como una escala digital o de aguja (Figura 2).

Figura 2 : Componentes de un fluormetro o un espectrofluormetro

La seleccin en la compra de un espectrofluormetro o un fluormetro radica

esencialmente en el costo y en la finalidad del trabajo que se desea hacer con un
instrumento de este tipo. Un espetrofluormetro es mucho ms costoso que un simple
fluormetro de filtros. Con el primero es posible hacer estudios sofisticados sobre una
estructura electrnica y de niveles energticos en molculas o iones adems de anlisis
cuantitativo.

Un fluormetro de filtros es de mucho menos precio y funciona en forma completamente

satisfactoria en aspectos de trabajo rutinario y con tcnicas ya establecidas (Ejemplo:
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laboratorios de anlisis clnicos, laboratorios de control de calidad), por lo que en

laboratorios de anlisis, es mucho ms frecuente encontrar fluormetros simples que
espectrofluormetros.

COMPONENTES DE FLUORMETROS

FUENTES DE EXCITACIN.- La lmpara de tungsteno ordinaria no da suficiente

intensidad para ser utilizada en fluorescencia. Son comunes las lmparas de Xenn y de
Mercurio.

La lmpara de xenn es ms verstil que la lmpara de mercurio. La lmpara de xenn

produce una intensa radiacin por el paso de corriente en una atmsfera de xenn; el
espectro de este tipo de lmpara es continua de 250 a 600 nm. Con un pico de mxima
intensidad a 470 nm.

FILTROS Y MONOCROMADORES.- Para fluormetros de filtros de utilizan

frecuentemente filtros de absorcin y filtros de interferencia. Los espectrofluormetros
generalmente utilizan rejillas de difraccin como monocromadores.

DETECTORES.- Debido a que la seal de fluorescencia es de baja intensidad se requiere

de un potente sistema de amplificacin. Por esto son preferidos los tubos
fotomultiplicadores, aunque tambin se usan comnmente los fototubos en aparatos de
menor precio.

CELDAS.- En fluorescencia se utilizan celdas de vidrio comn cuando la radiacin que se

maneja es de rango visible. Para Ultravioleta es necesario utilizar slice o cuarzo.

APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA

Durante un tiempo y no hace muchos aos, la espectroscopia de fluorescencia molecular

estuvo restringida en sus aplicaciones cuantitativas a unos cuantos qumicos raros.

Hoy da la fluorescencia es de primordial importancia en la qumica analtica. Una de sus

ms espectaculares aplicaciones ha sido en la deteccin y cuantificacin de substancias
que son separadas a travs del uso de la cromatografa de lquidos.

Muchos sistemas bioqumicos son de estructura tal que frecuentemente presentan

fluorescencia o pueden ser trasformados a especies de este tipo si originalmente no lo
son.

Por otra lado, especies inorgnicas que son difciles de detectar y cuantificar por
espectroscopia UV-Visible o por Absorcin Atmica se utilizan por fluorescencia.
Adicionalmente a esto los niveles de deteccin son del orden de partes por billn,
cantidades que por otras tcnicas son difciles de detectar. Estas entre otras son las
razones de la importancia creciente de la fluorescencia molecular.

Algunas de las especies que pueden ser analizadas por fluorescencia son las siguientes:
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Compuestos Orgnicos y Bioqumicos: adenina, cido antranlico, cistena, hidrocarburos

aromticos policclicos, indol, naftol, protenas, cido saliclico, escatol, triptfano, cido
rico, adrenalina, alquilmorfina, LSD, penicilina, fenobarbital, procana, reserpina,
clorofila, alcaloides, flavonoides, esteroides, cido ascrbico, cido flico, nicotinamida,
piridoxal, corticoesteroides, estrgenos, progesterona, andrgenos, cidos biliares,
colesterol, triglicridos, creatinina, deshidrogenasas, transaminasas, fosfatasas,
perioxidasas, ATP, luciferina, luciferasa, vitaminas: A, B1, B2, B6, C y la E, etc.

Compuestos Inorgnicos: cianuro, fluoruro, sulfatos, fosfatos, aluminio, arsnico, berilio,

boro, calcio, magnesio, tierras raras, selenio, uranio, etc.

Sin duda alguna las aplicaciones ms importantes en la fluoromtria son en anlisis de

alimentos, de productos farmacuticos, de productos naturales y en anlisis clnicos.