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Mtodos luminiscentes 2
Tema 4
METODOS LUMINISCENTES
Cuando una especie qumica absorbe radiacin electromagntica ultravioleta o

visible pasa a un estado electrnico excitado. Muchas sustancias en dicho estado
disipan el exceso de energa en forma de calor, mediante colisiones con tomos o
molculas vecinas, como ocurre en la espectrofotometra de absorcin. Sin embargo,
un cierto nmero de especies pierde solo una parte de este exceso de energa en
forma de calor, y emite la energa remanente en forma de radiacin electromagntica,
de distinta frecuencia que la absorbida, y que puede utilizarse con fines analticos.
X + CALOR
X + h X*
X + calor + h '
absorcin emisin
(espectrofotometra) (fotoluminiscencia)
El proceso de emisin de radiacin como consecuencia de la desactivacin de una

molcula se denomina genricamente luminiscencia, mientras que el trmino
fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el que la excitacin tenga lugar por
absorcin de fotones. Cuando la energa de excitacin es de otro tipo, se originan
otras modalidades de luminiscencia: as, la quimio-luminiscencia es un fenmeno
anlogo a la fluorescencia, excepto en el hecho de que la energa de excitacin
proviene de una reaccin qumica. Cuando la quimio-luminiscencia tiene lugar en un ser
vivo, como por ejemplo, en la lucirnaga, recibe el nombre de bioluminiscencia. Por
otra parte, la tribo-luminiscencia (del Griegro, tribo = frotar) se produce al liberarse
la energa almacenada en ciertas sustancias cristalinas, como azcar, y como
consecuencia de su rotura.
La fotoluminiscencia puede clasificarse, en principio, en fluorescencia y

fosforescencia, segn el mecanismo mediante el cual la sustancia vuelve al estado
fundamental, si bien, una distincin desde el punto de vista prctico se basa en el
tiempo transcurrido entre la absorcin y la emisin.
Claudio Gonzlez Prez 3
El contenido de este captulo se enfoca fundamentalmente hacia la fluorescencia,

pues la fosforescencia se aplica en escala mucho ms limitada. As mismo, al final del
captulo se indican brevemente algunas caractersticas y aplicaciones de la quicio-
luminiscencia.
La luminiscencia puede considerarse como una de las tcnicas analticas ms

antiguas, pues su descubrimiento data del siglo XVI, cuando el fsico y botnico
espaol Nicolas Monardes observ, en 1565, un misterioso matiz azulado en el agua
almacenada en un recipiente construido con madera de la especie "Lignum nifriticum".
Sin embargo, no fue hasta el siglo XIX en que el fsico ingls George Stokes
estableci las bases de su utilidad analtica al describir los primitivos mecanismos de
absorcin y emisin.
FUNDAMENTO DE LA FOTOLUMINISCENCIA
Para que una sustancia origine emisin foto-luminiscente es necesario que

previamente tenga lugar la absorcin de radiacin electromagntica. En la figura 3.6.
del tema anterior se han representado las transiciones electrnicas ms comunes que
pueden tener lugar cuando una molcula orgnica absorbe radiacin. De todas ellas, las
que tienen lugar entre los orbitales enlazantes y antienlazantes (>*) son las de
mayor inters en los procesos luminiscentes. A continuacin se ampliarn algunos
conceptos relacionados con los procesos de absorcin y emisin de forma general,
pero que son aplicables a las mencionadas transiciones >*.
La multiplicidad molecular, M, se define como:
M = 2S + 1
donde S es el nmero cuntico de espn de la molcula, y es la suma de los espines de

cada uno de sus electrones.
Muchas molculas orgnicas tienen un nmero par de electrones, por lo que S=0 y
M=1. A dicho estado se le denomina singulete. El estado energtico ms bajo (estado
fundamental) deber ser uno en el cual todos los electrones estn apareados, y a
dicho estado se le denomina estado singulete fundamental (figura 4.1.a.)
Cuando un electrn pasa a un nivel energtico superior, (por ejemplo, pasa de a

*) puede ocurrir que conserve su espn, o que se produzca cambio de ste. En el
primer caso se tiene un estado singulete excitado (figura 4.1.b.) y en el segundo, un

1 1
S=+ + = 1.
estado triplete, ya que, en estas condiciones, M=3, debido a que 2 2 Las
transiciones desde el estado singulete fundamental hasta el estado triplete son muy
poco probables; normalmente es necesario pasar a travs del estado singulete
excitado*.
a b c
singulete fundamental singulete excitado triplete excitado
Figura 4.1. Estados singulete y triplete.
En la figura 4.2. se han representado parcialmente diferentes niveles de energa

para una molcula fotoluminiscente.
Relajacin vibracional
v2 Conversin interna
S v1
2
v0 Cruzamiento
entre sistemas ..
S1
v2 T
v1 1
v0
E
desactivacin no radiante
Absorcin
Fluorescencia
Fosforescencia
v2
So v1
v0
2 1 3 4
Figura 4.2. Niveles de energa de un sistema fotoluminiscente.
* Las molculas con electrones desapareados (nmero impar de electrones) constituyen un estado doblete y
es el caso, por ejemplo, de radicales libres orgnicos.
El nivel So representa el estado singulete fundamental, mientras que S1 y S2

estados singulete excitados, y T1 el estado triplete. Por otra parte, superpuestos a
cada nivel de energa electrnico hay una serie de niveles de energa vibracionales
estrechamente espaciados, representados en la figura por vo, v1, v2, etc. Los niveles
rotacionales no se han incluido porque no pueden resolverse con los espectrmetros
convencionales.
Cuando una molcula absorbe radiacin se produce el paso desde el estado

electrnico y vibracional fundamental a un estado electrnico excitado y cualquiera de
los posibles estados vibracionales excitados. Este proceso de excitacin tiene lugar en
un tiempo del orden de los 1015 segundos.
En sistemas condensados, como cuando se opera en disolucin, el exceso de

energa vibracional se pierde inmediatamente, como consecuencia de los choques entre
las molculas excitadas y el disolvente. Este proceso recibe el nombre de relajacin
vibracional. Adems, puede ocurrir que se pase a un estado electrnico de ms baja
energa sin emisin de radiacin (S2 a S1). Este proceso, denominado conversin
interna, se produce cuando dos niveles de energa electrnicos estn suficientemente
prximos para que haya un solpamiento de los niveles de energa vibracionales.
Los procesos de conversin interna y de relajacin vibracional transcurren en un

tiempo muy pequeo (del orden de los 1012 seg.)
El proceso de emisin de un fotn desde S1 a So recibe el nombre de

fluorescencia, y ocurre inmediatamente despus de la excitacin (en
aproximadamente 109 a 107 segundos), por lo cual, no es posible percibir visualmente
la emisin de fluorescencia una vez eliminada la fuente de excitacin. Por otra parte,
debido a la conversin interna y a los procesos de relajacin vibracional, la emisin de
fotones fluorescentes desde estados electrnicos excitados superiores al primero son
procesos muy poco probables. As, en relacin con la figura 4.2., la excitacin por
radiacin a la longitud de onda 2 normalmente provoca fluorescencia de una longitud
de onda 3, con exclusin de la transicin que resultara entre S2 y So.
La desactivacin de un estado electrnico excitado por prdida de energa no

radiante puede tener lugar mediante unos procesos de conversin interna, si los
niveles vibracionales del estado fundamental se solapan con los del primer estado
excitado, o por conversin externa, lo cual implica interaccin y transferencia de
energa entre la molcula excitada y el disolvente u otros solutos.
Como se coment anteriormente, mientras una molcula est en un estado

excitado, puede tener lugar un cambio de espn en un electrn, con lo que se adquiere
el estado triplete. Este proceso de transformacin de un estado singulete a un estado

triplete se denomina cruzamiento entre sistemas, y la probabilidad de que esto
suceda aumenta si los niveles vibracionales se solapan.
Una vez adquirido el estado triplete, la molcula puede llegar al nivel vibracional
inferior mediante procesos de relajacin vibracional, y posteriormente emitir un fotn
para retornar finalmente al estado fundamental. Esta emisin se denomina
fosforescencia.
Debido a que las transiciones entre estados de diferentes multiplicidades estn

"prohibidas", la emisin fosforescente se produce con un cierto retraso respecto a la
absorcin (entre 103 y 10 segundos). Por ello, con frecuencia, puede ser observada a
simple vista despus de cesar la radiacin de excitacin. Sin embargo, como
consecuencia del mayor tiempo de vida del estado triplete, los procesos de
desactivacin en forma de energa no radiante pueden competir ms eficazmente con
la fosforescencia que con la fluorescencia. Por esta razn, la fosforescencia casi
nunca se observa a temperatura ambiente, siendo necesario operar en condiciones
criognicas para que se reduzca la probabilidad de desactivacin por choques*.
A modo de resumen, puede decirse que los procesos de desactivacin de una

especie en forma de energa no radiante son los ms probables, seguidos de la emisin
fluorescente, y los menos probables son los correspondientes a la fosforescencia.
Esto hace que los mtodos absorciomtricos sean ms numerosos que los
fluorimtricos, y stos, a su vez, ms que los basados en el empleo de la
fosforescencia.
FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA
La emisin fluorescente observada en una determinada especie est condicionada

por la propia estructura molecular de la sustancia y por otros factores dependientes
del medio en que se trabaje.
Influencia de la estructura molecular sobre la fluorescencia
El primer requisito para que exista florescencia (o fosforescencia) es que la

molcula posea una estructura capaz de absorber radiacin ultravioleta o visible,
esto es, puedan tener lugar transiciones >* y n>*. Sin embargo,
* En poca relativamente reciente, ha sido posible observar fosforescencia a temperatura ambiente cuando la
muestra se incorpora a una matriz slida.
experimentalmente se ha observado que el comportamiento fluorescente se presenta

con ms frecuencia en compuestos en los que la transicin es >* y no en aquellos
en los que es n>*. Esta condicin elimina virtualmente los compuestos orgnicos
saturados, mientras que los compuestos conteniendo dobles enlaces conjugados,
especialmente aquellos con un alto grado de estabilizacin por resonancia sern muy
prometedores. As, suelen presentar fluorescencia muchos hidrocarburos aromticos,
particularmente si tienen gran rigidez y estructuras multi-cclicas.
Las caractersticas de la emisin fluorescente (longitud de onda de mxima

emisin y su intensidad) de una molcula orgnica aromtica suele estar muy influida
por los sustituyentes en el anillo bencnico. As, por ejemplo, cuando los
sustituyentes son halgenos, se observa una disminucin de la fluorescencia al
aumentar el peso atmico del halgeno, lo cual parece debido al llamado efecto del
tomo pesado. Este efecto aumenta la probabilidad de que se produzca el
cruzamiento entre sistemas, con el consiguiente aumento de la fosforescencia. Por
otra parte, la presencia de un cido carboxlico en un anillo aromtico hace que tengan
lugar transiciones n>* con menos energa que >*, lo cual generalmente inhibe la
fluorescencia.
Un factor estructural importante es la rigidez. Experimentalmente se observa

que la fluorescencia est particularmente favorecida en molculas que poseen
estructuras rgidas. As, la intensidad de la fluorescencia del fluoreno es unas cinco
veces mayor que la del bifenilo.
.
.
CH 2
fluoreno bifenilo
La diferencia parece ser debida a la rigidez que proporciona el grupo metileno

del fluoreno. Asimismo, la fluorescena presenta una intensa fluorescencia en
disolucin lquida y, sin embargo, la fenolftalena no, a pesar de su similitud
estructural.
O O O O

COO COO
fluorescena fenolftalena
En ambos ejemplos, la forma rgida (fluoreno y fluorescena) presenta mayor

fluorescencia. Este efecto se debe a que las estructuras ms rgidas limitan las
vibraciones, lo cual minimiza la degradacin por colisiones y el cruzamiento de
sistemas.
El aumento de fluorescencia de ciertos agentes orgnicos cuando forman

quelatos con iones metlicos parece debido tambin a producirse un incremento en la
rigidez del sistema. As, por ejemplo, el colorante pontacromo BBR no es fluorescente,
pero s lo es su quelato con Al3+.
H 2O H2O
3+
Al
OH HO
O HO
N=N SO 3 Na
N=N SO 3 Na
Pontacrom o BBR Pontacrom o BBRAl 3+
La formacin del quelato aumenta considerablemente la rigidez molecular, al

impedir que la molcula gire alrededor del grupo azo.
Otros factores de tipo estructural que influyen sobre el comportamiento

luminiscente son:
* La presencia de grupos donadores de electrones, como NH2 y OH

favorecen la fluorescencia, puesto que aumentan la probabilidad de transicin
entre el estado singulete de menor energa vibracional y el estado fundamental.
* La introduccin de un tomo de nmero atmico elevado en un sistema de

electrones suele aumentar la fosforescencia, en detrimento de la
fluorescencia.
* Los grupos aceptores de electrones, como COOH, NO2, N=N y X

disminuyen y, en ocasiones inhiben la fluorescencia.
Influencia de otros factores medioambientales sobre la fluorescencia
El "ambiente" en el que se encuentre la especie fluorescente constituye un

parmetro importante que puede usarse en anlisis para incrementar la sensibilidad y
la selectividad de la fluorescencia, ya que existen varios factores medioambientales
que pueden influir fuertemente sobre el comportamiento fluorescente de molculas

poliatmicas.
Influencia del disolvente. En muchas ocasiones se observa que al aumentar la

polaridad del disolvente se produce un desplazamiento en el espectro de fluorescencia
hacia mayores longitudes de onda. Este hecho puede explicarse de la forma siguiente:
Las transiciones electrnicas entre diferentes niveles energticos ocurren muy

rpidamente, de forma que cuando una molcula en estado fundamental absorbe
un fotn, pasa a un estado excitado meta-estable (estado excitado Franck-
Condon), en el cual la geometra molecular y la configuracin del disolvente son
todava las caractersticas del estado fundamental (figura 4.3.).
La reorientacin del disolvente tiene lugar aproximadamente 10111012 segundos

despus de la excitacin, originando un estado excitado de "equilibrio", en el cual
la configuracin del disolvente es ptima para la geometra y configuracin
electrnica de la molcula. La emisin ocurre desde ese estado excitado de
"equilibrio", hasta un estado fundamental meta-estable, teniendo lugar
posteriormente la relajacin del disolvente, para conducir hasta el verdadero
estado fundamental.
En la mayora de las molculas polares el estado excitado es ms polar que el

estado fundamental; por ello, al aumentar la polaridad del disolvente se tiende
hacia una estabilizacin del estado excitado, en mayor grado que lo hace el
estado fundamental (figura 4.3.A, B y C). En consecuencia, al aumentar la
polaridad del disolvente tiene lugar un desplazamiento hacia mayores longitudes
de onda (menor energa).
Figura 4.3. Influencia de la polaridad del disolvente sobre la emisin de fluorescencia.

Respecto a la constitucin del disolvente hay que hacer notar lo siguiente:

anteriormente se ha mencionado que la introduccin de tomos pesados como
sustituyentes en molculas aromticas produce un incremento en la fosforescencia a
expensas de la fluorescencia. Este efecto se observa frecuentemente incluso cuando
el elemento en cuestin no forma parte de la molcula luminiscente. As, disolventes
conteniendo tomos pesados, normalmente dan lugar a una disminucin de la
fluorescencia. Este comportamiento puede justificarse en algunos casos:
concretamente cuando se trata de disolventes halogenados, por formacin de
complejos 1:1 en los que interviene el estado excitado del soluto fluorescente, pues la
reactividad de los estados excitados es normalmente diferente a la que presenta la
molcula en estado fundamental.
Influencia del pH. El espectro de fluorescencia de muchos compuestos

aromticos conteniendo grupos funcionales cidos o bsicos es sensible al pH. Los
cambios en la emisin de los compuestos de este tipo proviene del nmero de especies
resonantes diferentes que estn asociadas con las formas cidas o bsicas de las
molculas. As, por ejemplo, la anilina, en medio neutro y alcalino presenta
fluorescencia en la regin visible, pero dicha fluorescencia desaparece en medio cido.
La razn est en que el ion anilinio (forma cida) tiene las mismas formas resonantes
que el benceno y solo presenta fluorescencia, como l, en la regin ultravioleta,
mientras que la anilina tiene tres estructuras resonantes adicionales.
H H
H
N(+) H H H+ H H + H
N: N N

.
.
ion anilinio anilina
Estas formas resonantes adicionales proporcionan una mayor estabilidad al

primer estado excitado, y la consecuencia es una emisin fluorescente a mayor
longitud de onda.
La fluorescencia de ciertos compuestos en funcin del pH ha sido utilizada para

la deteccin de puntos finales en volumetras cidobase. Sin embargo, es realmente
curioso el hecho de que el cambio de comportamiento espectral se produzca a un pH
diferente del que puede predecirse de su constante de disociacin. As, el pKa del 2-
naftol es 9.5, por lo que la fluorescencia de la forma aninica solo debera observarse
a valores de pH superiores a 9.5, mientras que en la prctica, se percibe a pH muy
inferiores a ese valor. La explicacin de este hecho reside en que la molcula excitada
(el primer estado singulete excitado) posee un carcter cido diferente del estado
fundamental. Algo parecido sucede con los estados triplete, si bien, en menor medida.
Influencia del oxgeno disuelto. El efecto del oxgeno disuelto es uno de los
problemas ms molestos de la fluorimetra, ya que a menudo reduce la intensidad de
emisin de una disolucin fluorescente. Normalmente, el oxgeno presente en
concentracin 103 M reduce la emisin fluorescente del orden del 20%. Por ello, es
necesario desairear las disoluciones antes de llevar a cabo la medida.
El papel que juega el oxgeno en la atenuacin de la fluorescencia se debe

fundamentalmente a sus propiedades oxidantes y a sus caractersticas
paramagnticas. As, frente a especies reductoras, el oxgeno puede llevar a cabo la
oxidacin inducida foto-qumicamente de las especies fluorescentes, si bien, con
mayor frecuencia, la atenuacin de la fluorescencia se produce debido a que el
paramagnetismo del oxgeno molecular favorece el cruzamiento entre sistemas, lo cual
conduce hasta el estado triplete. Al parecer, el cruce entre sistemas se produce
mediante colisiones con especies excitadas y por formacin transitoria de complejos
de transferencia de carga.
Por otra parte, el que la presencia de oxgeno favorezca el cruzamiento entre

sistemas en muchas molculas fluorescentes no significa que aumente la
fosforescencia, pues el O2 es tambin un efectivo atenuador de estados tripletes.
Debido a que el estado triplete tiene una vida ms larga que el singulete, le hace
mucho ms susceptible para colisionar con impurezas, tales como el propio oxgeno, u
otras producidas por foto-descomposicin del soluto.
En cualquier caso, la capacidad del oxgeno para inhibir la fotoluminiscencia

puede ser utilizada para su determinacin en disolucin.
Otros gases paramagnticos, como el xido ntrico, se comportan de forma

similar, as como iones paramagnticos de los metales de transicin.
Influencia de la temperatura. La temperatura es una variable importante en

fluorimetra analtica, observndose una disminucin de la fluorescencia al aumentar
aquella. El cambio en la fluorescencia es normalmente del 1 % por C, si bien, en
algunos compuestos, como el triptofano o la rodamina B puede ser hasta del 5 %. La
disminucin de la emisin fluorescente con la temperatura se debe a que el aumento
de la frecuencia de choques a temperatura elevada incrementa la probabilidad de
desactivacin en forma de energa no radiante. Por otra parte, el aumento de
temperatura hace disminuir la viscosidad del disolvente, lo cual, tambin aumenta la

probabilidad de desactivacin mediante colisiones.
RELACION ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y

CONCENTRACION
La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la

concentracin, C, de la sustancia absorbente, pero solo a concentraciones
relativamente bajas, lo cual puede demostrarse como sigue: la fraccin de radiacin
transmitida, segn la Ley de Beer, es:
P bC
T= = 10
Po
donde, Po=potencia del haz incidente

P=potencia del haz transmitido
=absortividad
b=espesor de la cubeta (camino ptico)
C=concentracin
La fraccin de radiacin absorbida es:
P bC
1 = 1 10
Po
y la cantidad de radiacin absorbida es:
Po P = Po (1 10bC)
La intensidad de la radiacin fluorescente, If, est relacionada con la cantidad de

radiacin absorbida de la forma siguiente:
If = k f (PoP)
donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parmetros

instrumentales (eficacia del sistema detector y geometra) y f es el rendimiento
cuntico de la fluorescencia (relacin entre el nmero de fotones emitidos y los
absorbidos por unidad de tiempo).
El trmino 110bC puede desarrollarse como una serie de McLaren,

1 10bC = 1 e2.3bC
2 3
bC 2.3 bC 2.3 bC
1 10 = 1 1 2.3 bC + + =
2! 3!
2 3
2.3 bC 2.3 bC
= 2.3 bC +
2! 3!
de donde,
2 3
2.3 bC 2.3 bC
If = k f Po 2.3 bC + [I ]
2! 3!
Para bajas concentraciones, cuando el trmino bC sea menor que

aproximadamente 0.05, todos los trminos de la ecuacin [I], excepto el primero, son
muy pequeos, y la expresin se reduce a
If = k f Po 2.3 b C
As, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia ser

directamente proporcional a la concentracin:
If = K C
En la figura 4.4. se muestra una representacin grfica de la variacin de la

intensidad de fluorescencia con la concentracin.
K Po
If
fluorescencia
no uniforme
fluorescencia
uniforme
C
Figura 4.4. Relacin entre la intensidad de fluorescencia y la concentracin.
A concentraciones relativamente altas, los trminos de mayor orden de la

ecuacin [I] pueden ser lo suficientemente importantes para que se pierda la
linealidad, como ya se coment anteriormente. Sin embargo, existen otras causas para
la no linealidad a concentraciones altas. Son las siguientes:
* Autoatenuacin. Se produce como consecuencia del choque entre molculas

excitadas, lo cual origina una desactivacin en forma de energa no radiante.
Lgicamente, al aumentar la concentracin, aumentar la probabilidad de que se
produzcan esas colisiones.
* Autoabsorcin. En este caso, la fluorescencia de una molcula es absorbida por

otra molcula del mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales
eventos crece al aumentar la concentracin. La auto-absorcin reduce la
intensidad de fluorescencia, salvo que f sea la unidad. Por ello, la representacin
grfica de If frente a C puede hacerse incluso descendente para altos valores de
C.
* Como ya se vio, If es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorcin,

mayor fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorcin es demasiado grande y la
disolucin bastante concentrada, la porcin de la disolucin ms prxima a la
fuente luminosa absorbe mucha radiacin, de forma que queda muy poca
disponible para el resto. Si la concentracin es tan grande que toda la radiacin
incidente es absorbida, If = k f (Po P) = k f Po, en cuyo caso, If tiende al valor
de k Po (ver figura 4.4.).
* Muchas molculas aromticas (especialmente aquellas con grupos funcionales

capaces de unirse por enlaces de hidrgeno) forman dmeros u otros agregados
en disolucin. Esta tendencia, lgicamente ser mayor a altas concentraciones de
soluto. Considerando que, con frecuencia, los dmeros son menos fluorescentes
que el correspondiente monmero, se observar un descenso de If como
consecuencia de la formacin de estas especies dmeras.
Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen

tendencia a formar asociaciones con molculas de su misma especie en estado
fundamental. El espectro de emisin de estas asociaciones suele estar
desplazado hacia mayores longitudes de onda respecto al del correspondiente
monmero.
INSTRUMENTACION
Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los mtodos

espectroscpicos, los componentes principales de un fluormetro son: una fuente de
radiacin, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador), una
clula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia importante
entre la fluorimetra (tambin la fosforimetra) y los dems mtodos
espectroscpicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para

seleccionar la longitud de onda de excitacin y otro para la de emisin.
En la figura 4.4. se han representado los componentes bsicos de un fluormetro.
En espectrmetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiacin ms

intensas que las lmparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las medidas de
absorcin. Anteriormente se indic que la intensidad de fluorescencia es
directamente proporcional a la potencia del haz incidente.
La lmpara de arco de xenn presenta un espectro esencialmente continuo que

se extiende por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectro-
fluormetros de red. Por otra parte, en los fluormetros de filtro, suele utilizarse la
lmpara de arco de mercurio, la cual emite un intenso espectro de lneas sobre un
fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar una mayor sensibilidad, debido a
la alta intensidad de las lneas del mercurio.
Muestra
Fuente de monocromador
radiacin (o filtro)
de excitacin
.
Medidor monocromador
Detector (o filtro)
o registro de emisin
.
Figura 4.4. Componentes bsicos de un fluormetro.
Los sistemas para seleccionar la longitud de onda ms empleados en

instrumentos de luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se
clasifican en flormetros de filtro y espectrofluormetros de red. De los primeros, los
ms utilizados son los filtros de interferencia, por proporcionar pequeas anchuras
de banda.
Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolucin
uniforme y dispersin lineal a todas las longitudes de onda. El mayor inconveniente es
que pasan varios rdenes espectrales, lo cual puede evitarse usando filtros en el
camino ptico.
Los prismas se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque

proporcionan una gran dispersin en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan
muchas medidas, y, adems, para obtener una sensibilidad adecuada se necesitara un
prisma muy grande, lo cual no es econmico.
Las cubetas utilizadas para contener la muestra suelen ser de cuarzo, para
permitir el paso de la radiacin ultravioleta. Las ms tpicas son de 1 cm de espesor,
como las utilizadas para medidas de absorcin, excepto que todas las caras son
transparentes a la radiacin (estn pulidas), ya que generalmente las medidas de
fluorescencia se realizan en un ngulo de 90 respecto a la radiacin incidente; a otros
ngulos, la dispersin por la disolucin y las propias paredes de la cubeta puede
originar mayor ruido de fondo.
En cuanto a los detectores, la mayor parte de los fluormetros y

espectrofluormetros actuales usan tubos fotomultiplicadores como sistemas para
detectar la radiacin de fluorescencia.
Finalmente, mencionar que mientras que los ms precisos espectrofotmetros de

absorcin ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operacin no
es prctica en instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta
siempre los problemas inherentes al empleo de haz sencillo.
ESPECTROS DE EXCITACION Y EMISION
Debido a la presencia de dos monocromadores, pueden registrarse dos tipos de

espectros: el espectro de excitacin (intensidad de fluorescencia observada en
funcin de la longitud de onda de excitacin a una determinada longitud de onda de
emisin) y el espectro de emisin (intensidad de la emisin fluorescente en funcin de
la longitud de onda de emisin, a longitud de onda de excitacin fija). Esto es, si se
fija la ex y se mide la radiacin emitida a las diferentes em se obtiene el espectro de
emisin. En cambio, si se mantiene constante la em y se van variando las ex , se
obtiene el espectro de excitacin. Este es ligeramente diferente del espectro de
absorcin, pero muy semejante a l.
Excitacin - absorcin
Fluorescencia
300 350 400 450

, nm
Figura 4.5. Espectros de excitacin y de emisin.
El espectro de emisin aparece, evidentemente, a longitudes de onda ms largas

que el de excitacin (absorcin) (figura 4.5.). Solamente las bandas de mayor longitud
de onda del espectro de absorcin suelen estar superpuestas con las bandas de
menores longitudes de onda de la emisin*. Adems, debido a que los espaciados entre
los niveles vibracionales son similares en el estado fundamental y en el primer estado
singulete excitado, el espectro de fluorescencia es aproximadamente una imagen
especular del espectro de absorcin.
Para aplicaciones analticas se usa el espectro de emisin, aunque

corrientemente, cuando se trabaja con un espectrofluormetro, se obtiene primero un
espectro de excitacin, con objeto de confirmar la identidad de la sustancia y
seleccionar la longitud de onda ptima de excitacin.
* Estas bandas, ordinariamente llamadas "transiciones 00" se producen como consecuencia de transiciones
entre niveles vibracionales cero de los estados fundamentales y primer estado singulete excitado.
Espectro verdadero y aparente
Debido a que los espectrmetros de luminiscencia suelen ser de haz sencillo,

todos los problemas inherentes a esta forma de operar (fluctuaciones de la fuente de
radiacin, inestabilidad del detector, etc.) estn potencialmente presentes. Hay dos
problemas particularmente molestos y son, que tanto la intensidad de la fuente de
radiacin como la sensibilidad de cualquier detector pueden variar con la longitud de
onda.
Cuando se obtienen espectros que dependen de las caractersticas del

instrumento utilizado se denominan aparentes (tanto de excitacin como de emisin,
si bien, las distorsiones debidas a parmetros instrumentales se ponen de manifiesto
fundamentalmente en el espectro de excitacin). Cuando es posible corregir el
espectro aparente considerando las caractersticas de la fuente y del detector se
obtiene el espectro verdadero o corregido. La correccin puede hacerse de forma
manual si se conocen las caractersticas de la fuente y del detector, si bien, existen
instrumentos especialmente diseados para llevar a cabo la correccin de forma
automtica.
APLICACIONES
Antes de describir algunas aplicaciones de los mtodos fluorescentes, es

interesante comparar la sensibilidad y la selectividad de los mtodos luminiscentes en
relacin con los absorciomtricos.
Sensibilidad. Los mtodos fluorimtricos son ms sensibles que los

absorciomtricos. Esto se debe, sobre todo, a que en estos mtodos el detector debe
distinguir una pequea diferencia entre dos seales grandes (Po y P), cada una de las
cuales lleva su correspondiente ruido de fondo, mientras que en fluorimetra, el
detector solo necesita poner de manifiesto una pequea seal positiva frente a un
ruido de fondo pequeo. De hecho, la sensibilidad en fluorimetra puede mejorarse
aumentando Po, mientras que en absorciometra, al aumentar Po aumenta tambin P, no
afectando a la absorbancia. En general, los mtodos fluorimtricos suelen ser entre 10
y 100 veces ms sensibles que los espectrofotomtricos.
Selectividad. La selectividad de los mtodos luminiscentes suele ser mayor que

la de los absorciomtricos. De hecho, hay muchas especies capaces de absorber
radiacin, pero el nmero de ellas que pueden re-emitir es mucho menor. Adems, en
los mtodos de fluorescencia, tanto la longitud de onda de excitacin, como la de
emisin, pueden seleccionarse para minimizar interferencias, mientras que en
espectrofotometra solo la longitud de onda de absorcin es seleccionable. Por tanto,
si dos materiales fluorescentes difieren en el espectro de excitacin o de emisin, es
factible analizar uno selectivamente en presencia del otro.
En cuanto a las aplicaciones de los mtodos fluorimtricos, y ante la imposibilidad

de dar cuenta de todas ellas, se citarn algunos ejemplos especficos, dentro de los
grupos que se relacionan seguidamente.
Sustancias inorgnicas
Las sustancias inorgnicas pueden determinarse por los mtodos siguientes:
a) Anlisis directo. Aunque bastantes especies inorgnicas presentan

fluorescencia en estado slido, pocos son los sistemas de este tipo aplicables
analticamente.
En disolucin, tampoco son demasiado numerosas las determinaciones directas;

prcticamente se circunscriben a compuestos de uranilo (las sales de uranio
tetravalente y los uranatos no son fluorescentes), algunos elementos pertenecientes a
las tierras raras [Ce(III), Eu(III), Tb(III), Dy(III)] y Tl(I). Este ltimo, en
presencia de cloruro (TlCl43) muestra una intensa emisin fluorescente a 450 nm. Un
ensayo cualitativo para Tl(I) se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl.
b) Formacin de quelatos fluorescentes. La formacin de quelatos

fluorescentes por combinacin de un in metlico con un ligando orgnico proporciona
uno de los mtodos ms sensibles y selectivos para la determinacin de muchos
elementos. En la tabla 4.1. se muestran algunos ejemplos.
La mayor parte de las aplicaciones inorgnicas de la fluorimetra se han

desarrollado para elementos que no son de transicin, pues aunque muchos iones
metlicos de transicin forman quelatos muy estables y complejos con ligandos
aromticos, un nmero relativamente pequeo de ellos son fluorescentes. Ello se debe
a lo siguiente: en primer lugar, muchos iones de transicin son paramagnticos, lo cual
favorece el cruzamiento entre sistemas y, en consecuencia, disminuye la probabilidad
de desactivacin por fluorescencia. Adems, muchos complejos de metales de
transicin poseen una gran cantidad de niveles energticos poco espaciados, lo cual
aumenta la probabilidad de desactivacin por conversin interna.
Tabla 4.1.
Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas
Quelatos fluorescentes
Especie Reactivo Sensibilidad
( g/mL)
Ag+ Butilrodamina S 0.01
Al3+ Morina 0.05
Al3+ Rojo de alizarina R 0.007
Cu2+ Luminocupferrn 0.1
Li+ 8-hidroxiquinolena 0.2
Sn4+ Flavonol 0.1
Determinaciones indirectas
( g/mL)
Cl Nitrato de uranilo 1.0
F Almorina 0.2
PO43 Almorina 0.05
c) Determinaciones indirectas. Algunos aniones, tales como F o CN pueden

determinarse indirectamente por medida de la disminucin de la intensidad de
fluorescencia de un determinado quelato (tabla 4.1.). As, por ejemplo, el fluoruro
puede determinarse indirectamente mediante el descenso de la fluorescencia que su
presencia ejerce sobre la fluorescencia del complejo aluminiomorina, con un lmite de
deteccin de 0.2 g/mL. En otros casos tiene lugar la liberacin de un ligando y la
formacin posterior de un quelato fluorescente con otra especie. As, es posible la
determinacin de cianuro mediante el proceso siguiente:
SO 3K SO 3K
2
2 + 4 CN 2 + Pd(CN) 4
N N
O O
Pd/2
SO 3K 2+
Mg
N
O
Mg/2
fluorescente
Sustancias orgnicas
Existe una amplia variedad de compuestos orgnicos que pueden determinarse

por mtodos fluorimtricos a niveles inferiores a 1 p.p.m. (g/mL), y algunas de las
especies ms fluorescentes, tales como la fluoerescena o la quinina a niveles
considerablemente inferiores.
Hay que recordar que, en principio, presentarn fluorescencia molecular especies

altamente absorbentes, como compuestos no aromticos altamente conjugados,
aromticos y heterocclicos. Por eso, gran cantidad de hidrocarburos, colorantes,
cidos, aldehdos, alcoholes, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono,
pesticidas, porfirinas, esteroides, frmacos, etc. son susceptibles de ser detectados o
determinados por mtodos fluorimtricos.
A modo de ejemplo, puede citarse la determinacin de vitaminas, interesante

desde el punto de vista histrico, por ser uno de los primeros grupos de compuestos
biolgicamente activos para los que se describieron mtodos fluorimtricos. Muchos
de estos compuestos tienen estructuras que presentan fluorescencia nativa, mientras
que otros pueden convertirse en fluorforos por procedimientos sencillos (tabla 4.2.)
Tabla 4.2.
Determinacin fluorimtrica de vitaminas
Vitamina Reactivo ex em
A fluorescencia nativa 340 480
B1 + ferricianuro 365 445
B2 fluorescencia nativa 370 440
B6 +KMnO4 350 450
B12 fluorescencia nativa 275 305
C ac. dehidroascrbico
+ o-fenilendiamina 350 430
D2
D3 + ac. tricloroactico 390 480
E fluorescencia nativa 270 370

K
La vitamina A puede determinarse aprovechando la fluorescencia nativa que

presenta, midiendo la radiacin emitida a 480 nm.
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

CH2 OH
.
CH3
Vitamina A
Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa,
como la B2 (riboflavina) y la B12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B1
(tiamina) y la B6 (piridoxina) necesitan una transformacin previa, lo cual se consigue
por oxidacin con ferricianuro y permanganato rspectivamente.
La vitamina C requiere la transformacin previa en cido dehidroascrbico y

posterior condensacin con o-fenilendiamina, para originar un fluorforo azul. Por su
parte, las vitaminas D2 y D3 dan productos altamente fluorescentes cuando se tratan
con cido tricloroactico y otros cidos.
El tocoferol (vitamina E) puede determinarse fluorimtricamente haciendo uso

de su fluorescencia nativa, o bien, puede condensarse con o-fenilendiamina, despus
de oxidacin para dar un derivado fluorescente de fenacina.
Para la vitamina K no se han descrito mtodos fluorescentes debido a que sufre

descomposicin a la luz ultravioleta.
Dentro de este epgrafe general en el que se trata de las aplicaciones de la

fluorimetra a la deteccin y determinacin de compuestos orgnicos, se indican
seguidamente algunas aplicaciones dentro de campos concretos.
Qumica clnica. La ms extensa aplicacin de los mtodos fluorimtricos, en

trminos de nmero de anlisis realizados por dia, tiene lugar, probablemente, en
qumica clnica. Muchas determinaciones clnicas importantes se realizan
rutinariamente por estos mtodos en muchos laboratorios. La alta sensibilidad,
simplicidad y bajo coste de la instalacin son factores importantes en la adopcin de
estos mtodos. De los centenares de mtodos descritos para decenas de compuestos
diferentes, se citan, a modo de ejemplo, y como curiosidad algunos de ellos.
La determinacin de fenilalanina es posible fluorimtricamente usando solamente

25 L de suero. Es importante esta determinacin para la prevencin de ciertos tipos
de subnormalidad, ya que, la incapacidad para metabolizar este aminocido hace que
tenga lugar su acumulacin en los tejidos, originando daos en el cerebro y retraso
mental progresivo.
Asimismo, pueden determinarse estrgenos en orina, en concentraciones del

orden de 0.05 g/mL, corticosteroides, de gran importancia para evaluar la funcin de
las glndulas suprarrenales, catecolaminas, importantes por su influencia sobre el
sistema vascular, porfirinas en orina, que pueden servir para indicar defectos en la
mdula sea, trastornos hepticos e incluso envenenamiento por plomo, as como otras
especies de gran importancia prctica en muchos casos de inters clnico.
La fluorimetra tambin se utiliza con xito en anlisis bioqumico. As, por

ejemplo, es posible la determinacin de la secuencia de nucletidos en el ADN con
marcas fluorescentes, lo cual es fundamental para la elaboracin de los cdigos
genticos. La forma de proceder consiste en "marcar" las unidades fundamentales de
terminacin de cadena con grupos fluorescentes que emitan a longitudes de onda
determinadas.
Anlisis forense. La gran sensibilidad de muchos mtodos fluorimtricos hace

que sean particularmente adecuados en muchas determinaciones relacionadas con
anlisis forense. Como ejemplo se muestra seguidamente la forma de detectar huellas
digitales latentes por fluorescencia producida por lser*
Cuando un dedo presiona sobre una superficie, aproximadamente 0.1 mg de material

permanece adherido a ella. De l, el 98-99 % es agua, que se evapora, quedando un
residuo del orden de 1 g. Aproximadamente, la mitad son sustancias inorgnicas (por
ejemplo, NaCl) y el resto una mezcla de sustancias orgnicas (aminocidos, lpidos,
vitaminas). La deteccin de los restos de aminocidos se lleva a cabo por tratamiento con
ninhidrina (I), la cual reacciona con ellos originando un producto prpura (II), no
fluorescente, invisible si la cantidad es muy pequea.
* Anal. Chem. 61, 557 A (1989).

O O O
OH
. OH N=
O .
O O
[I] [II]
Posteriormente, por tratamiento con cloruro de cinc, se forma un producto fluorescente

(III) que se pone de manifiesto mediante su fluorescencia inducida por lser.
O O
O Zn O
H2 O Cl H2 O
[III]
Frmacos y drogas. La fluorimetra tambin encuentra amplia aplicacin en el

anlisis de frmacos y drogas. Su importancia se basa en la gran sensibilidad y
selectividad de las tcnicas fluorimtricas. Hay que considerar que la farmacologa
requiere mtodos analticos capaces de distinguir entre varios medicamentos y sus
productos metablicos. Debido a que muchos frmacos se administran en dosis muy
pequeas, con frecuencia inferiores a 100 g diarios, los mtodos analticos deben ser
altamente sensibles, sensibilidad que debe ser suficiente para detectar las pequeas
cantidades expulsadas del organismo.
En la tabla 4.3. se muestran algunos ejemplos de determinaciones fluorimtricas

para este tipo de sustancias.
Tabla 4.3.
Determinacin fluorimtrica de frmacos y drogas
ex em Sensibilidad
Sustancia Condiciones (nm) (nm) (g/mL)
Adrenalina pH 1 295 335 0.1
Ac. saliclico pH 11 310 435 0.1
Ampicilina hidrlisis 346 422 0.05
Aspirina HAcCHCl3 280 335 0.01
Atropina eosina 365 556 1.0
Codeina pH 1 245,285 350 0.1
Digital HCl-glicerina 350 465 0.1
Estreptomicina pH 13 366 445 0.1
LSD pH 7 325 365 0.002
Morfina pH 1 285 350 0.1
Pentotal pH 13 315 530 0.1
Quinina pH 1 350 450 0.002
En Qumica Agroalimentaria tambin se utilizan las tcnicas luminiscentes con

cierta extensin. As, por ejemplo, los antioxidantes son sustancias que se aaden a
los alimentos que contienen grasas o aceites para evitar su degradacin durante el
proceso de elaboracin. Una de las sustancias empleadas es el hidroxianisol butilado
(BHA). Esta sustancia est permitida por la legislacin vigente y puede separarse por
destilacin con arrastre en corriente de vapor y determinarla directamente en el
destilado por espectrofluorimetra (ex=293 nm; em=323 nm).
Contaminacin ambiental. Muchas aplicaciones de los mtodos fluorimtricos en

relacin con la contaminacin atmosfrica se refieren a la determinacin de
hidrocarburos aromticos polinucleares, muchos de los cuales son cancergenos. En
ocasiones, pueden cuantificarse productos no fluorescentes mediante una reaccin
previa que origine un fluorforo y en combinacin con tcnicas de separacin

cromatogrfica. As, por ejemplo, se han encontrado isocianatos alifticos (muy
perjudiciales para la salud) en el aire de lugares de trabajo donde se emplean espumas
de poliuretano. El procedimiento consiste en tratar con 1-naftil-metilamina para
formar derivados fluorescentes que pueden separarse por cromatografa lquida.
NH 2
NCO NHCNHCH 2
+ 2
.
NCO
NHCNHCH 2
diisocianato derivado fluorescente

.
Respecto a la contaminacin de aguas, se encuentra un interesante ejemplo en el

uso del espectro de fluorescencia casi como "huella digital" para la identificacin de
crudos y otros materiales petrolferos procedentes de vertidos. La tcnica,
relativamente moderna, proporciona unos resultados tan dignos de confianza, al
menos, como los obtenidos por procedimientos de identificacin convencionales,
habiendo sido adoptada por los servicios de guarda costas de algunos pases.
FOSFORESCENCIA
Las medidas de fosforescencia se llevan a cabo de forma anloga a las de
fluorescencia, excepto en lo siguiente: la muestra normalmente se mide a la
temperatura del nitrgeno lquido (77K) para minimizar la desactivacin por
colisiones, y la excitacin debe ser interrumpida un cierto tiempo para observar la
emisin de fosforescencia en ausencia de la emisin fluorescente. Para ello se utilizan
dispositivos como el representado en la figura 4.6.
cubeta con la muestra
vaso Dewar con N 2 lquido
.
Figura 4.6. Medida de fosforescencia.
En cuanto a las aplicaciones, la fosforimetra no ha tenido una utilizacin tan

amplia como la fluorimetra, debido probablemente a la necesidad de trabajar a bajas
temperaturas y a la poca precisin de las medidas. Sin embargo, la gran selectividad
que potencialmente presenta esta tcnica la hace particularmente adecuada para
algunas determinaciones. As, por ejemplo, de entre las muchas sustancias que
normalmente se encuentran en la sangre, solo el triptofano presenta una cierta
fosforescencia. Ello hace que la sangre normal muestre muy poca fosforescencia, lo
cual hace posible la determinacin de un cierto nmero de frmacos fosforescentes
presentes a nivel de trazas.
Las medidas de fosforescencia a temperatura ambiente pueden llevarse a cabo

en ocasiones sobre compuestos adsorbidos en un soporte rgido, como papel de filtro,
lo cual minimiza la desactivacin del estado triplete en forma no radiante.
QUIMIOLUMINISCENCIA
La quicio-luminiscencia se origina cuando se produce una especie excitada como
consecuencia de una reaccin qumica.
A + B > X*
X* > X + h
El nmero de reacciones qumicas que dan lugar a productos luminiscentes es muy

escaso, lo cual limita las posibilidades de uso de esta tcnica. Sin embargo se observan
ciertas ventajas en orden a su alta selectividad, simplicidad y gran sensibilidad.
La instrumentacin necesaria para llevar a cabo medidas quicio-luminiscentes es

muy simple; nicamente es necesario un recipiente donde tenga lugar la reaccin y un
tubo fotomultiplicador para detectar la radiacin emitida. No suele ser necesario
dispositivo alguno para seleccionar la longitud de onda, ya que la nica fuente de
radiacin es la reaccin qumica.
La mayor parte de las aplicaciones analticas de la quicio-luminiscencia en fase

lquida se basan en la medida de la luminiscencia producida por ciertos reactivos, como
luminol [I] y lucigenina [II] en presencia de oxidantes y en medio alcalino.
CH 3
+
N
NH 2
O
.
NH
.
NH
N+
O
CH 3
[I] [II]
La oxidacin del luminol da lugar a una luminiscencia azul con un mximo de

emisin a 425 nm, originada en un proceso del tipo siguiente:
NH 2 NH 2
O
COO
NH
. + OH + O 2 + N 2 + 2 H2 O + h
NH
COO
O
La intensidad de la luminiscencia producida por el luminol y la lucigenina se

modifica frecuentemente por la presencia de ciertos iones metlicos, lo cual
proporciona un mtodo muy sensible para su determinacin. En muchos casos se
observa una exaltacin de la intensidad de la radiacin emitida, y en algunos se
produce una inhibicin de la luminiscencia. En la tabla 4.4. se muestran algunos
ejemplos de determinaciones de iones metlicos por este procedimiento.
Tabla 4.4.
Determinacin quimioluminiscente de metales

Co(II) luminol + H2O2 109 M
Cu(II) luminol + H2O2 109 M
Fe(II) luminol + H2O2 109 M
Hg(II) luminol + H2O2 0.2 g/mL
Hg(II) lumniol+H2O2+Cu2++CN 0.002* g/mL
V(IV) luminol + O2 + P2O74 0.002 g/mL
Ti(IV) luminol + H2O2 + Cu2+ 0.02* g/mL
*Atenuacin de la quimioluminiscencia
En muchos casos, los iones metlicos ejercen un efecto cataltico sobre la

oxidacin del reactivo. Algunos sistemas de este tipo, basados en la oxidacin del
luminol catalizada por iones metlicos, se han adaptado para el anlisis de oxidantes,
tales como H2O2, ClO, Br2, I2, Fe(CN)63 y MnO4, obtenindose lmites de deteccin
del orden de 109 a 1010 M. Asimismo, determinadas especies orgnicas presentan
tambin un efecto cataltico o inhibidor sobre la reaccin del luminol con el perxido
de hidrgeno o con el oxgeno, haciendo posible su determinacin. As, por ejemplo, el
efecto cataltico de la hemoglobina sobre la oxidacin del luminol permite detectar la
presencia de sangre en diluciones de 1 en 107.
La quicio-luminiscencia tambin se utiliza para el anlisis de gases, siendo

particularmente importantes los mtodos desarrollados para ciertos contaminantes
atmosfricos. As, los analizadores automticos para el NO se basan en la reaccin
quicio-luminiscente entre dicha especie y ozono:
NO + O3(reactivo) > NO2* + O2

NO2* > NO2 + h
La respuesta es lineal entre 1 ppb y 10000 ppm. Esta reaccin se utiliza tambin
para la determinacin de NO2 en muestras de inters ambiental. En este caso, es
necesaria una reduccin previa de NO2 a NO, lo cual se lleva a cabo operando a 800
en presencia de radiacin ultravioleta.
UV
NO 2 NO
800
+O 3 NO 2 *+ O 2
NO 2 + h
El propio ozono puede ser determinado midiendo la luminiscencia producida por

reaccin con rodamina B adsorbida en la superficie de gel de slice.
Otro ejemplo de proceso quimioluminiscente es el basado en la reaccin de un

oxidante, como el flor, con especies orgnicas que contengan el grupo tio:
RSR + fluor > Productos + h
Esta reaccin es la base del detector quicio-luminiscente utilizado en

cromatografa, especfico para esos compuestos orgnicos.

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Mtodos luminiscentes 2

Cuando una especie qumica absorbe radiacin electromagntica ultravioleta o

El proceso de emisin de radiacin como consecuencia de la desactivacin de una

La fotoluminiscencia puede clasificarse, en principio, en fluorescencia y

El contenido de este captulo se enfoca fundamentalmente hacia la fluorescencia,

La luminiscencia puede considerarse como una de las tcnicas analticas ms

Para que una sustancia origine emisin foto-luminiscente es necesario que

La multiplicidad molecular, M, se define como:

donde S es el nmero cuntico de espn de la molcula, y es la suma de los espines de

Cuando un electrn pasa a un nivel energtico superior, (por ejemplo, pasa de a

primer caso se tiene un estado singulete excitado (figura 4.1.b.) y en el segundo, un

Figura 4.1. Estados singulete y triplete.

En la figura 4.2. se han representado parcialmente diferentes niveles de energa

Figura 4.2. Niveles de energa de un sistema fotoluminiscente.

El nivel So representa el estado singulete fundamental, mientras que S1 y S2

Cuando una molcula absorbe radiacin se produce el paso desde el estado

En sistemas condensados, como cuando se opera en disolucin, el exceso de

Los procesos de conversin interna y de relajacin vibracional transcurren en un

El proceso de emisin de un fotn desde S1 a So recibe el nombre de

La desactivacin de un estado electrnico excitado por prdida de energa no

Como se coment anteriormente, mientras una molcula est en un estado

el estado triplete. Este proceso de transformacin de un estado singulete a un estado

Debido a que las transiciones entre estados de diferentes multiplicidades estn

A modo de resumen, puede decirse que los procesos de desactivacin de una

FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

La emisin fluorescente observada en una determinada especie est condicionada

Influencia de la estructura molecular sobre la fluorescencia

El primer requisito para que exista florescencia (o fosforescencia) es que la

experimentalmente se ha observado que el comportamiento fluorescente se presenta

Las caractersticas de la emisin fluorescente (longitud de onda de mxima

Un factor estructural importante es la rigidez. Experimentalmente se observa

La diferencia parece ser debida a la rigidez que proporciona el grupo metileno

En ambos ejemplos, la forma rgida (fluoreno y fluorescena) presenta mayor

El aumento de fluorescencia de ciertos agentes orgnicos cuando forman

Pontacrom o BBR Pontacrom o BBRAl 3+

La formacin del quelato aumenta considerablemente la rigidez molecular, al

Otros factores de tipo estructural que influyen sobre el comportamiento

* La presencia de grupos donadores de electrones, como NH2 y OH

* La introduccin de un tomo de nmero atmico elevado en un sistema de

* Los grupos aceptores de electrones, como COOH, NO2, N=N y X

Influencia de otros factores medioambientales sobre la fluorescencia

El "ambiente" en el que se encuentre la especie fluorescente constituye un

que pueden influir fuertemente sobre el comportamiento fluorescente de molculas

Influencia del disolvente. En muchas ocasiones se observa que al aumentar la

Las transiciones electrnicas entre diferentes niveles energticos ocurren muy

La reorientacin del disolvente tiene lugar aproximadamente 10111012 segundos

En la mayora de las molculas polares el estado excitado es ms polar que el

Figura 4.3. Influencia de la polaridad del disolvente sobre la emisin de fluorescencia.

Respecto a la constitucin del disolvente hay que hacer notar lo siguiente:

Influencia del pH. El espectro de fluorescencia de muchos compuestos

ion anilinio anilina

Estas formas resonantes adicionales proporcionan una mayor estabilidad al

La fluorescencia de ciertos compuestos en funcin del pH ha sido utilizada para

El papel que juega el oxgeno en la atenuacin de la fluorescencia se debe

Por otra parte, el que la presencia de oxgeno favorezca el cruzamiento entre

En cualquier caso, la capacidad del oxgeno para inhibir la fotoluminiscencia

Otros gases paramagnticos, como el xido ntrico, se comportan de forma

Influencia de la temperatura. La temperatura es una variable importante en

temperatura hace disminuir la viscosidad del disolvente, lo cual, tambin aumenta la

RELACION ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y

La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la

donde, Po=potencia del haz incidente

La fraccin de radiacin absorbida es: