MANUAL MICRODIAGNOSTICA

SEGUNDA PARTE

DIAGNOSTICO DE HONGOS Y
LEVADURAS
 ndice:

Diagnstico Clnico de las Micosis 3

Micosis Superficiales 4
Micosis Profundas 5
Diagnstico Clnico 7
Obtencin de Muestras 8
Transporte 9
Manejo 9
Procesamiento de las Muestras 9
Muestras ms comunes, etiologa ms probable, recogida y transporte 12
Examen Directo 16
Agentes etiolgicos de micosis superficiales cutneas y mucocutneas 17
Clasificacin de Medios de Cultivo 20
Eleccin de medios de Cultivo 20
Identificacin 23
Otros Medios Diagnsticos Complementarios 24
Pruebas de Sensibilidad 26
Bibliografa 27

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 DIAGNOSTICO CLINICO DE LAS MICOSIS
Durante la ltima dcada se ha observado un incremento de las enfermedades micticas, so-
bre todo las de tipo oportunista, ello ha significado la aparicin de nuevas formas clnicas de micosis
as como localizaciones o presentaciones no habituales, adems de la presencia de nuevas especies
fngicas consideradas antiguamente como no patgenas pero que excepcionalmente producan
enfermedad en individuos inmunodeprimidos. Diversos factores han permitido la aparicin de infec-
ciones emergentes: cambios poblacionales y sus patrones de costumbres, avances tecnolgicos y
desarrollo econmico de algunos pases, que ha permitido la generalizacin de tratamientos mdi-
cos quirrgicos invasivos, con supervivencia de enfermos que difcilmente superaban procesos pato-
lgicos y que favorecen el desarrollo de micosis sistmicas; incremento de viajes inter y transconti-
nentales, nuevos mecanismos de adaptacin de algunos microorganismos que conlleva a la apari-
cin de resistencia a los antifngicos e infeccin por VIH.
Actualmente se reconocen entre 300 y 400 especies de hongos causantes de micosis sistmi-
cas, las cuales constituyen un pequeo porcentaje del total de ms de 100 000 especies cataloga-
das. Por todo ello se prefiere mencionar un comportamiento oportunista por parte del hongo, de-
bido a que los patgenos primarios al infectar a individuos inmunosuprimidos, se comportan con
mayor agresividad, originando infecciones sistmicas, diseminadas, de evolucin aguda y mal pro-
nstico. En este tipo de micosis es necesario considerar al binomio husped parsito. Las infeccio-
nes oportunistas se producen cuando los mecanismos de defensa especficos e inespecficos del
husped son ineficaces, mientras que las sistmicas o diseminadas se producen cuando fallan los
mecanismos celulares de defensa en los neutrfilos.
La mayora de las micosis oportunistas siguen siendo ocasionadas por las especies clsicas:
Candida albicans,Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans. Sin embargo, por las razones ex-
puestas anteriormente han emergido nuevos hongos oportunistas
Durante las ltimas dcadas, el aumento en la prevalencia de las infecciones fngicas ha sido
constante, relacionado fundamentalmente con el incremento de pacientes inmunocomprometidos
y con el uso generalizado de antimicrobianos, la utilizacin de inmunosupresores, maniobras diag-
nsticas invasoras y la implantacin de alimentacin parenteral.
Junto a estas micosis invasoras, que podramos llamar oportunistas, coexisten otras micosis,
que podramos considerar primarias, causadas por hongos muy adaptados para la supervivencia en
los tejidos infectados. Algunas de ellas se comportan como micosis profundas, y se caracterizan por-
que se distribuyen en determinadas zonas geogrficas, donde resultan endmicas. Otras, ubicuas,
se caracterizan por afectar a piel y mucosas: se trata de las dermatomicosis y candidosis de las muco-
sas. Con menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutneas, caracterizadas por la agresividad
local y poca tendencia a la diseminacin a distancia, y que suelen contar con antecedentes traumti-
cos que justifican la inoculacin del hongo.
El cultivo sigue siendo el "gold standard" del diagnstico microbiolgico, ya que permite la
identificacin del agente etiolgico y la realizacin del estudio de sensibilidad. Sin embargo, no est
exento de inconvenientes: la necesidad de obtener muestras por mtodos invasores, la posible con-
taminacin de la muestra, su dificultad para diferenciar fcilmente entre infeccin y colonizacin, la
baja sensibilidad que presenta y su lentitud para el diagnstico.
Las pruebas de sensibilidad a los antifngicos estn basadas en las tcnicas de microdilucin
en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in vitro de los antibacterianos. Estas tcni-
cas determinan la CMI (concentracin mnima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de
inhibicin respecto a un control de crecimiento. Los estndares incluyen recomendaciones para la
conservacin, la preparacin y la interpretacin de las pruebas, as como un sistema para controlar
la calidad de los resultados. La introduccin de estas tcnicas produjo un cambio cualitativo en los
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MICOSIS SUPERFICIALES

1. COSMTICAS. Son las que afectan la capa crnea de la piel y la porcin suprafolicular del cabello y
vellos, generalmente asintomticas por la poca o nula respuesta inmune.
a) Pitiriasis versicolor. Producida por especies del hongo lipofilico Malassezia: M.furfur, M. globosa,
M. obtusa, M. restricta, M. slooffiae, M. sympodiales, hongo que puede ser colonizante de la epider-
mis; se relaciona con la presencia de ciertos aminocidos y compuestos hidrfobos en la piel, as co-
mo la disminucin del recambio epitelial del estrato crneo. El cuadro clnico se manifiesta por la pre-
sencia de lesiones maculares hiper o hipopigmentadas en la piel del trax, parte superior de la espal-
da y brazos. Las especies del hongo Malassezia pueden estar involucradas en otros cuadros clnicos
como la dermatitis seborreica, foliculitis en pacientes inmunocomprometidos, fungemia en lactantes
prematuros en nutricin parenteral con emulsiones lipdicas y sndrome de Gougerot-Carteaud, que
es una papilomatosis en regin intermamaria, interescapular, cuello y abdomen.
b) Tia negra palmar. Infeccin crnica del estrato crneo causada por el hongo levaduriforme de-
matiaceo Phaeoannelomyces wernekii, que consiste en lesiones maculares color oscuro afectando
principalmente las palmas de las manos y las plantas de los pies, rara vez en la cara.
c) Piedra negra. Son ndulos duros, negros, adheridos a la porcin extrafolicular del cabello, produci-
da por la forma sexual del hongo Piedraia hortae.
d) Piedra blanca. Son ndulos blandos de color blanquecino que se pueden localizar en vellos de ce-
jas, bigote o pelo escrotal y vulva, al igual que en cabello de la cabeza. Es producida por coloniza-
cin de especies del hongo levaduriforme Trichosporum: T. asteroides, T. beigelii/cutaneum, T. inkin,
T. mucoides, T. ovoides, T. pullulans. Este hongo tambin se ha asociado a fungemia en pacientes
inmunosuprimidos, especialmente VIH positivos.
2. CUTNEAS. Se refiere a una diversidad de cuadros clnicos en los que estn involucrados la piel y
sus anexos. Las manifestaciones en piel son prurito, eritema y descamacin; en cuero cabelludo son
alopecia e invasin al cabello tipo endothrix, ectrothrix y tipo fvico; y en uas, onicomicosis.
a)Dermatofitosis. Producida por un grupo de hongos queratinolticos identificados como dermatofi-
tos: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton. Sus cuadros clnicos se denominan tias y se en-
cuentran entre las infecciones ms prevalentes a nivel mundial, principalmente en pases en desarro-
llo. Las Tias del cuero cabelludo son: Tia capitis no inflamatoria, tia capitis inflamatoria, con for-
macin de queriom de celso y tia fvica. Las otras, dependiendo del lugar del cuerpo comprometi-
do son: Tia barbae, Tia crporis, Tia manum, Tia ungium u onicomicosis, Tia cruris y Tia pe-
dis.
Estos hongos se han clasificado segn su hbitat en antropoflicos, zooflicos y geofsicos. Los prop-
gulos infectantes son los artroconidios, que son adquiridos por contacto directo, se adhieren espe-
cialmente a los corneocitos (no a clulas endoteliales), germinan y penetran al estrato corneo for-
mando ramificaciones de hifas; la invasin es favorecida por las condiciones especficas de este hbi-
tat: clulas muertas, temperatura inferior a 37C, humedad adecuada y aporte suficiente de hierro y
otros nutrientes. Los dermatofitos tienen potentes queratinasas capaces de desdoblar en el pelo la
queratina rica en cisteina, y la metionina en la piel; estas diferencias podran explicar el tropismo de
algunas especies por ciertos tejidos.
b)Dermatomicosis. Son infecciones crnicas que afectan la piel altamente queratinizadas de palmas,
plantas, uas y espacios interdigitales. Los cuadros clnicos son muy similares a las tias producidas
por dermatofitos, pero el tratamiento es diferente. Dentro de los principales agentes etiolgicos es-
tn los hongos hialinos como el Scytalidium dimidiatum, S. hyalinum, Fusarium sp, Aspergillus spp,
especies de Cndida y hongos negros como especies del gnero Phialophora, Curvularia, Alternaria,
Bipolares, etc.
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MICOSIS PROFUNDAS

1. SUBCUTANEAS. Son infecciones del tejido celular subcutneo, adquiridas por trauma con material
contaminado por hongos saprofitos ambientales. Afectan la dermis y epidermis y las manifestaciones
clnicas son crnicas; se pueden caracterizar por ser inflamatorias y granulomatosas.
a)Esporotricosis. El hongo que la produce se denomina Sporothrix schenkii. Despus de un perodo
de incubacin de 15 a 30 das (se ha reportado hasta 2 aos) se produce una lesin nodular, deno-
minada chancro, en el tejido cutneo y subcutneo en el sitio de inoculacin. Clnicamente se pue-
den producir diferentes cuadros como la esporotricosis linfocutanea, que compromete vasos linfti-
cos drenantes; la fija o dermoepidrmica, con lesin nica y sin compromiso de vasos linfticos; la
pulmonar primaria, que se observa en pacientes inmunosuprimidos, se adquiere por inhalacin y si-
mula una tuberculosis cavitaria; la pulmonar metastsica; la osteoarticular, forma diseminada en hue-
sos y articulaciones; la esporotricosis invasiva generalizada, que es rara; y se han descrito casos de
formas menngeas y oculares en pacientes inmunosuprimidos.
b) Cromoblastomicosis. Micosis producida por un grupo de hongos dematiaceos, tales como Fonse-
cae pedrosoi, Fonsecae compactum, Phialophora verrucosa, Cladosporum carrionii y Rhinocladiella
aquasperma. Las lesiones son crnicas, de meses a aos, y en las muestras clnicas (raspado de pun-
tos negros y biopsias) se observan las clulas esclerticas de medlar o clulas fumagoides que son
patognomnicas de esta entidad.
c) Lobomicosis. Producida por el hongo Loboa loboi, con lesiones crnicas tipo queloides en sitios
anatmicos expuestos, como por ejemplo la regin sacra, miembros inferiores, superiores y regin
auricular.
d) Rinosporidiasis. El agente etiolgico no es un hongo, es un microorganismo acutico pertenecien-
te al reino Stromophila denominado Rhinosporidium seeberii. La rinosporidiosis se caracteriza por la
formacin de lesiones polipoides, pedunculadas y papilomatosas que obstruyen los conductos a-
reos, la nasofaringe, laringe y conjuntivas.
e) Eumicetomas. Infeccin de carcter crnico que se adquiere por trauma con material contamina-
do por hongos como Madurella mycetomatis y Exophiala sp. El cuadro clnico se caracteriza por fistu-
lizacin, edemas y grnulos de azufre.
f) Faeohifomicosis. Infeccin por inoculacin traumtica de hongos dematiaceos, como por ejemplo
Alternaria alternata, Bipolaris spicifera, Curvularia geniculata, Exophiala jeanselmei, Exophiala mo-
niliae, Wangiella dermatitidis. En las lesiones se observan hifas pigmentadas y no clulas esclerticas.
Estos hongos tambin pueden causar infeccin cutnea y sistmica.
g) Hialohifomicosis. Infeccin por inoculacin traumtica de hongos hialinos a nivel subcutneo, pe-
ro tambin puede cursar con compromiso sistmico. Los pacientes inmunocomprometidos los pue-
den adquirir por va area, por ejemplo infeccin por Fusarium spp, y Aspergillus spp.
2. SISTMICAS. Este tipo de micosis se adquieren por inhalacin de propgulos de los hongos que
estn en el medio ambiente, muchas veces en nichos ecolgicos muy restringidos. Causan cuadros
clnicos que dependen del estado inmunolgico del husped y de la cantidad de propgulos inhala-
dos, y pueden ser desde cuadros asintomticos inespecficos, hasta procesos pulmonares granuloma-
tosos; en pacientes inmunocomprometidos se manifiesta de forma generalizada.
a) Histoplasmosis. Es producida por el hongo Histoplasma capsulatum variedad capsulatum, quien
predomina en Amrica, desde el sur de Canad hasta Argentina, y la variedad duboisii en el frica;
su nicho son cuevas de murcilagos, gallineros y palomares. Dentro de las formas clnicas tenemos la
presentacin aguda y crnica, la pulmonar (asintomtica, leve, moderada, grave, neumnica o cavi-
tada), la diseminada, de leve a progresiva, y la mucocutnea.

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b) Blastomicosis. Infeccin causada por Blastomyces dermatitidis, cuyo nicho ecolgico es el suelo de
gallineros, corrales y establos, terrenos con alto contenido orgnico, abonados o con deyecciones de
animales, ph cido y elevada humedad. La infeccin es crnica, con lesiones granulomatosas y supu-
rativas; la ms frecuente es la pulmonar (aguda o crnica), pero tambin se presenta la forma extra-
pulmonar crnica con afeccin de piel, huesos y tracto genitourinario, la forma aguda fulminante y
las formas asintomticas.
c) Coccidioidomicosis. Infeccin causada por Coccidioides inmitis en zonas endmicas desde el sud-
oeste estadounidense, Centro Amrica, Venezuela, Paraguay hasta la Patagonia en Argentina. La
inhalacin de artroconidios puede causar un cuadro pulmonar con o sin diseminacin sistmica
(sea, menngea y cutnea) principalmente en pacientes inmunocomprometidos.
d) Paracoccidioidomicosis. Micosis granulomatosa producida por el hongo dimrfico Paracoccidioi-
des brasiliensis, restringido a zonas boscosas de los grandes ros y lagos del Brasil, Venezuela, Colom-
bia, Paraguay y norte de Argentina. La infeccin puede ser asintomtica o sintomtica, como la for-
ma juvenil aguda, con compromiso pulmonar y del sistema reticuloendotelial, con adenopatas, he-
patomegalia y afeccin sea, o como la forma crnica del adulto con lesiones pulmonares y metsta-
sis a diversos rganos, y lesiones en mucosa orofarngea y ulcero-vegetativas peribucales.
e) Criptococosis. Infeccin subaguda o crnica pulmonar o menngea causada por Cryptococcus
neoformans, hongo ubicuo en la naturaleza principalmente en excretas de palomas (variedad neo-
formans y grubii) y detritus de rboles (variedad gatti). Las levaduras desecadas y de menor tamao
son inhaladas, llegan a espacios alveolares, pero el desarrollo de la enfermedad depende de la res-
puesta del sistema inmune celular. Aunque el foco primario es el pulmn, el tropismo por el Sistema
Nervioso Central (SNC) puede llevar a diseminacin a meninges; en pacientes inmunosuprimidos
puede haber presentacin clnica mucocutanea que corresponde a metstasis de la forma disemina-
da.
3. OPORTUNISTAS. Este tipo de micosis involucra especies de hongos que forman parte de la micro-
flora ambiental o son comensales de la piel y mucosa, y quienes habitualmente son eliminadas por el
sistema inmune celular. Cuando hay deficiencia de la respuesta inmune, alteraciones de la flora bac-
teriana por suministro de antibiticos o la existencia de enfermedades de base en el paciente, como
por ejemplo la diabetes o enfermedades mieloproloferativas con neutropenia, pueden causar una
infeccin diseminada fatal para el paciente.
a) Candidiasis sistmica. Es la micosis ms frecuente. Es producida por Cndida albicans y otras espe-
cies del mismo gnero, capaces de invadir sangre y otros rganos profundos. Las levaduras de Cn-
dida son colonizadoras de la mucosa rectal, vaginal y bucal, por lo que las infecciones pueden ser
endgenas; tambin se ha demostrado la transmisin interpersonal o como resultado de contamina-
cin con sondas y catteres.
b) Aspergilosis sistmica. Es producida por especies del gnero Aspergillus. Aspergillus fumigatus es
el agente causal de ms del 90% de los casos de aspergilosis invasora; se adquiere por inhalacin de
conidios, que germinan e invaden los tejidos. Los pacientes con neutropenia prolongada. Confor-
man el principal grupo de pacientes con riesgo para adquirir esta grave infeccin, al igual que pa-
cientes leucmicos y receptores de rganos, los cuales pueden sufrir aspergilosis pulmonar invasora
o aspergilosis sistmica con compromiso del SNC, infarto cerebral, vasculitis o abscesos cerebrales.
c) Zigomicosis. Infecciones causadas por hongos pertenecientes a los mucorales: Mucor spp, Rhi-
zomucors spp, Rhizopus spp, Cunninhanella spp, etc. Su hbitat es la materia orgnica en descompo-
sicin. Causan cuadros principalmente subcutneos, pero formas sistmicas han sido tambin descri-
tas, siendo la ms frecuente la rinocerebral; tambin se puede presentar a nivel pulmonar, cutneo,
intestinal, en SNC, periorbitaria y nasal.
d) Pneumocistosis. Neumona causada por el hongo Pneumocystis jiroveci y que afecta pacientes
inmunocomprometidos, principalmente VIH positivos.

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 DIAGNOSTICO CLINICO

La clnica solo provee un diagnstico presuntivo:

Las lesiones de consulta ambulatoria frecuente caracterizadas por prurito y eritema pueden suge-
rir micosis superficiales cutneas, mas sin embargo otras enfermedades pueden presentar cuadros
clnicos similares. Adicionalmente, el uso de corticoides tpicos en lesiones de este tipo pueden ge-
nerar cuadros atpicos de difcil diagnstico clnico.
Las micosis de rganos profundos son cada vez ms frecuentes en la prctica clnica, afectando
especialmente a sujetos con grados variables de inmunocompromiso, como en aquellos con infec-
cin por el VIH y enfermedades hematolgicas malignas. Las manifestaciones clnicas pueden ser
inespecficas y no siempre sugerir infeccin por hongos, por lo tanto un diagnstico micolgico pre-
coz aumenta considerablemente el xito del tratamiento.
Segn un consenso entre la Organizacin Europea para el Tratamiento del Cncer, el Grupo
Cooperativo de Infecciones Invasivas por Hongos de Bruselas, el Instituto Nacional de Alergias, el
Grupo de Estudio de Enfermedades Infecciosas por Hongos y el Instituto Nacional de Salud de Bet-
hesda, Maryland, se defini que para el diagnstico de las infecciones fngicas invasoras en pacien-
tes con cncer y transplante de precursores hematopoyticos se deben considerar los factores pre-
disponentes en el hospedero, elementos clnicos-radiolgicos y hallazgos del laboratorio. Estos facto-
res considerados conjuntamente permitiran clasificar estas infecciones como demostradas, proba-
bles o posibles.
a) Infeccin demostrada: Es suficiente el hallazgo de hongos en sangre o en sitio normalmente
estril con un cultivo o examen directo, independiente de la presencia de factores predispo-
nentes en el husped o elementos clnicoradiolgicos.
b) b) Infeccin probable: Es aquella en que existen factores predisponentes en el husped, ele-
mentos clnicos sugerentes y un estudio micolgico positivo, pero no definitorio, como podra
ser una serologa de galactomanan positiva o un cultivo positivo de sitio no estril.
c) Infeccin posible: Es aquella en que alguno de los tres elementos no esta presente, ya sean los
factores predisponentes, los elementos clnico-radiolgicos o la micologa.
Papel del laboratorio en el diagnstico de las micosis
Los procedimientos del laboratorio son de gran utilidad para los mdicos ya que confirman un
diagnstico presuntivo.
Establece el agente etiolgico.
Son tiles en la seleccin y monitoreo de la terapia antifngica, seguimiento evolutivo y para con-
firmar la curacin.
Los procedimientos del laboratorio incluyen:
1. Demostracin de los hongos en los especimenes a estudiar mediante
a) Microscopa ptica:
-Frescos ( KOH, Tinta china).
-Tinciones (Gram, Giemsa, HP)
b) Cultivos (incluye identificacin hasta especie y la determinacin de la sensibilidad in vitro).
2. Deteccin de la respuesta humoral especfica en determinados hongos patgenos.
3. Deteccin de antgenos fngicos y metabolitos en fluidos corporales o tejidos mediante tcnicas
serolgicas.

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Objetivo principal del laboratorio
Detectar rpida y eficazmente la presencia de los hongos en muestras clnicas y determinar si es el
agente etiolgico o es un contaminante.

OBTENCION DE LAS MUESTRAS

Para alcanzar el xito en el diagnstico micolgico partiendo de una sospecha clnica, es funda-
mental realizar adecuadamente la recogida de la muestra a partir de la lesin, su correcta manipula-
cin para mantener la viabilidad del agente etiolgico y evitar posibles contaminaciones en su trans-
porte y procesamiento, la siembra de la misma en los medios idneos y a la temperatura adecuada,
as como la identificacin e interpretacin correcta de los aislamientos. nicamente con el procesa-
miento adecuado se puede recuperar el hongo claramente asociado con el proceso infeccioso. A la
hora de valorar un crecimiento fngico hay que tener siempre presente la necesidad de diferenciar
un "aislamiento significativo" de otros que no lo son, ya que no es lo mismo identificar una especie
fngica que diagnosticar una micosis.

Consejos generales para optimizar la recogida de las muestras:

1. Debe disponerse de un protocolo de recogida de muestras que ser actualizado peridicamente.
2. Es responsabilidad del mdico asegurar una correcta recogida y envo en condiciones adecuadas
de las muestras, funciones que no deben ser delegadas en personal no cualificado.
3. Es necesario recoger las muestras aspticamente, utilizando contenedores estriles, remitirlas al
laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible.
4. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parte activa de la le-
sin (cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible una muestra respiratoria que un hemo-
cultivo).
5. Se debe evitar la utilizacin de hisopos siempre que el tipo de lesin lo permita, pues estn conta-
minados frecuentemente con flora bacteriana. Sin embargo, algunas muestras (conducto auditivo,
faringe, vagina, crvix) no pueden ser recogidas de otra forma.
6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un gran rendimiento. Deben aspi-
rarse con jeringa y transferirse a un contenedor estril con solucin salina, prestando atencin a la
recogida de grnulos, si los hubiese.
7. El raspado de lesiones de piel y mucosas puede realizarse con distintos materiales; los ms utiliza-
dos son bistur, moqueta o cepillo.
8. En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe establecerse la necesidad de una
recogida de muestras ambientales, familiares o animales.
9. El recipiente de recogida se identificar con los datos del enfermo (nombre y localizacin), y debe
protegerse para que no se rompa en su transporte al laboratorio.
10. Las muestras deben ir acompaadas obligatoriamente de la orden de peticin para Microbiolo-
ga. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguiente informacin: datos del paciente (nombre
y apellidos, nmero de historia clnica, fecha de nacimiento y sexo); datos clnicos (orientacin diag-
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nstica, tratamiento antimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes de inters); datos del m-
dico solicitante.
11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongos peligrosos. Tambin
si se sospecha la presencia de hongos con requerimientos especiales, Malassezia spp, por ejemplo,
as como de viajes u origen de paciente.
Los envases para la recogida de las muestras pueden variar segn el tipo de muestra a recoger y
transportar:
- Tubos estriles con tapn de rosca: LCR y otros lquidos biolgicos.
- Frascos estriles de boca ancha con tapn de rosca: orinas, esputos, heces, fragmentos de tejidos,
etc.
- Torulas o hisopos de algodn estriles: Se usan para tomar muestras de superficies y orificios cor-
porales (exudados, secreciones).
- Jeringas estriles: slo se admiten cuando su volumen no permita transferir la muestra a un medio
de transporte adecuado.
- Frascos de hemocultivo para lquidos biolgicos.
- Placas de Petri estriles.
TRANSPORTE
Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rpidamente, sin conservantes. Las muestras
deben transportarse en un recipiente estril, humidificado y a prueba de vertidos; sin embargo, las
muestras dermatolgicas pueden transportarse en un recipiente seco (placa de Petri, papel de foto-
grafa negro, entre dos portas). En general, no deben introducirse en medios de transporte, a no
ser que sea fcil retirar la muestra del medio. Las muestras en que se sospeche la presencia de der-
matofitos u hongos dimrficos se conservarn a temperatura ambiente, nunca refrigerados. Los
raspados corneales y hemocultivos deben sembrase directamente en el medio de cultivo adecuado.
Si esto no fuera posible, se usarn medios de transporte adecuados o se conservaran a 4 C.

MANEJO
Todas las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente peli-
grosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a
una inspeccin previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Se
rechazar en los siguientes casos: a) muestra no identificada, b) transporte inadecuado o demasia-
do prolongado, c) muestra derramada, d) cantidad insuficiente o inadecuada. En todos estos casos
se contactar con el mdico solicitante para pedir nueva muestra o solucionar el problema de la
misma.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Para realizar un buen diagnstico micolgico es importante que la muestra se recoja y se
transporte en condiciones idneas y que no se demore su cultivo. Aunque hay pocos estudios so-
bre la disminucin de la viabilidad de los hongos a temperatura ambiente o por la accin del hielo
seco, es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus en muestras en las que se demora el
cultivo, y tambin, la prdida de viabilidad de algunos hongos por la desecacin, temperatura ele-
vada (>37 C) o baja (<10 C), sobrecrecimiento bacteriano, presencia leucocitos, etc. La refrigera-
cin puede comprometer el aislamiento de hongos dermatofitos, Malassezia spp. e H. capsulatum.
Las muestras que estn potencialmente contaminadas con flora bacteriana (muestras de piel, aspi-
rados trans-traqueales, aspirados de odo interno, muestras de conjuntiva) deben enviarse a tempe-
9
ratura ambiente.
En trminos generales, los procedimientos utilizados en el laboratorio de bacteriologa son
adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en cuenta que, habitualmente, la carga
microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto a las bacterias. Esto obliga a recoger
mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento ptimo. Las muestras inaceptables no de-
ben procesarse y el facultativo debe ser informado inmediatamente. Todo laboratorio debe distri-
buir por escrito las normas de rechazo de muestras.
Los resultados de laboratorio dependen de la toma de muestra, la cual debe hacerse antes de
instituido el tratamiento o cuando ste se ha suspendido previamente (1-2 semanas, para piel o pe-
lo; varios meses, para las uas). Las micosis superficiales estudiadas en este captulo se limitan a la
piel, el pelo y las uas. Otros procesos que afectan a las capas ms superficiales de la piel son pro-
ducidos por bacterias y no forman parte de esta Gua; sin embargo, el eritrasma (producido por
Corynebacterium minutissimum) se ha estudiado clsicamente dentro de la Micologa Mdica y re-
quiere habitualmente un diagnstico diferencial con las micosis superficiales
Para la adecuada toma de muestra de las micosis superficiales se recomienda seguir las si-
guientes recomendaciones: examen con luz de Wood, limpieza del rea afectada y recogida de la
muestra.
Examen con luz de Wood
Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial es aconsejable examinar las
lesiones de la piel (sospechosas de pitiriasis versicolor o eritrasma) y cuero cabelludo
(dermatofitosis) en una habitacin completamente oscura bajo la luz de Wood (luz ultravioleta de
365 nm de longitud de onda, que pasa a travs de un filtro de cristal que contiene xido de nquel).
La piel normal muestra un color azul, mientras que en infecciones bacterianas como el eritrasma,
emite fluorescencia rojo coral.
En micosis como la pitiriasis versicolor, las reas afectas emiten una fluorescencia brillante ver-
dosa amarillenta (pudiendo poner de manifiesto lesiones no perceptibles a simple vista). En tinea
capitis debidas a Microsporum spp. o Trichophyton schoenleinii, las lesiones muestran una fluores-
cencia caracterstica.
El descubrimiento de Margarot y Deveze, en 1925, de que pelos infectados por ciertos derma-
tofitos producan una fluorescencia caracterstica bajo la luz ultravioleta de la lmpara de Wood fue
un importante avance en la Micologa Mdica. La naturaleza y fuente de las sustancias fluorescen-
tes en los pelos infectados no son del todo conocidas y la sugerencia de que era una pteridina ha
sido cuestionada El pelo permanece fluorescente despus de que el hongo deje de ser viable, y el
material fluorescente puede ser extrado del pelo en agua caliente o solucin fra de bromuro de
sodio. Debido a que el crecimiento del hongo, en el medio de cultivo o de forma in vitro en el pelo,
no origina fluorescencia, esta se atribuye a alguna sustancia producida por la interaccin entre el
crecimiento del hongo y del pelo. Solamente algunos dermatofitos capaces de invadir el pelo pro-
ducen fluorescencia:
M. canis y M. audouinii, siempre producen fluorescencia verde; sin embargo, M. gypseum y M.
nanum, lo hacen ocasionalmente.

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 T. shoenleinii, causa una fluorescencia verde plida.
En reas geogrficas donde Microsporum spp. y el favus son prevalentes, la luz Wood es una
herramienta esencial tanto en el diagnstico y el tratamiento del enfermo, como en el control de
epidemias.Adems, la lmpara es fcilmente trasportable y puede ser usada en instituciones para el
rpido examen de los contactos.

Limpieza del rea afectada

Antes de realizar la recogida de la muestra, la piel, pelos o uas afectados deben limpiarse
con etanol (70%) para eliminar la flora bacteriana, exudacin o restos de excipientes de tratamien-
tos previos que dificultan el examen directo y el cultivo

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Tabla 1. Muestras ms comunes, etiologa ms probable, recogida y transporte
Muestra Hongo probable Recogida y transporte
Abscesos sub- Aspirar con jeringa y aguja.
cutneos Transporte anaerobio o inocula-
cin directa > 1 ml.
Biopsias Levaduras, hongos Usar estrictas condiciones de
filamentosos. asepsia y tomar la muestra de la nar a 4 C.
Siempre que se zona central de la lesin.
sospeche micosis Colocar la muestra en un tubo o
profunda. frasco estril con suero fisiolgi-
co estril no bacteriosttico para
prevenir la desecacin.
Catter Candida spp. 5 cm. distales colocarlos en con-
Malassezia spp. tenedor estril.
Conjuntival y Tomar la muestra con torula
exudado lacri- estril de algodn o alginato
mal clcico, humedecida en medio
de cultivo o suero fisiolgico
estril, frotar la zona lesionada
suavemente e introducir la to-
runda en el medio de transporte.
Corneal, raspa- C. albicans, C. Inocular directamente en el me-
do neoformans. dio y en el porta, mediante ras-
Hongos filamento- pado con esptula.
sos muchas espe- Obtencin de la muestra por el
cies (Aspergillus oftalmlogo en quirfano; des-
spp., Fusarium pus de raspar varias veces la
spp.; Paecilomyces crnea con un asa de Kimura o
spp., Penicillium con bistur, se debe sembrar en
spp., hongos de- placa Petri en X o en C clavan-
maticeos) do el asa en el agar. Otra parte
de la muestra se fija en portaob-
jetos para el estudio anatomo-
patolgico
Espacios inter- Dermatofitos Limpiar la zona con alcohol al
digitales 70%.
Raspar con un bistur estril y
depositar en placa de Petri est-
ril.
En el caso de que haya exuda-
do, tomar con torula.
Tiempo y tempera-
tura de transporte Notas
y conservacin
24 h, temperatura Muestra de la base
ambiente (TA). de la lesin y pared
del absceso
< 24 h, TA. Almace- Sospecha de zigo-
micetos y hongos
dimrficos, proce-
sar inmediatamen-
te. Biopsias obteni-
das por Punch:
pueden utilizarse
para las lesiones
de piel.
No estandarizado
actualmente.
Si se dispone de los
medios de cultivo es
preferible hacer la
inoculacin directa-
mente.
Se puede guardar a Sembrar tocando
temperatura am- con ambos lados
biente si se retrasa de la esptula di-
su envo al laborato- bujando una C en
rio. el medio.
El transporte de es- No usar torulas,
tas muestras debe excepto cuando la
ser inmediato. lesin sea purulen-
Conservacin de ta o se encuentre
estas muestras: a en zonas hmedas
temperatura am- de la piel o en
biente mejor que a membranas muco-
4C, ya que algunos sas. Si la toma se
dermatofitos no so- hace con torula, el
breviven a la refrige- examen directo no
racin. es vlido y el culti-
vo no ser todo lo
ptimo que sera
deseable.
12
Grnulos sub- Grnulo blanco: Recoger pus, exudado, biopsia, < 24 h, TA. Granos o grnulos
cutneos Acremonium falci- y drenaje de tractos sinuosos. en eumicetoma.
forme, Acremonium Lavar los grnulos con solucin
recifei, Aspergillus salina que contenga antibiticos.
nidulans, Neotestu-
dina rosatii, Pseu-
doallesheria boydii;
Grnulo negro:
Exophiala jeansel-
mei, Leptosphaeria
senegalensis, Ma-
durella grisea, Ma-
durella mycetoma-
tis, Pyrenochaeta
romeroi
Heces Slo se recomien- Si las heces son formadas, ho- Transporte inmedia-
da en caso de can- mogenizar con suero fisiolgico to. Almacenamiento
didiasis disemina- estril. Para el diagnstico de a 4 C.
da. infecciones fngicas del tracto
gastrointestinal es ms til to-
mar muestras de biopsia.
Herida Levaduras, miceto- Muestra aspirada de la parte Transporte inmedia- Muestra del mar-
mas, actinomicosis profunda y transporte en jeringa to. gen activo.
y esporotricosis sin aguja. Si la muestra se
Remitir en contenedor estril recoge por ciruga,
Si se utiliza hisopo, deberan remitir tambin una
remitirse varios. porcin de la pared
del absceso.

Lentes de con- Siempre que sea posible enviar Almacenamiento a 4

tacto: la lente al laboratorio, si no es C.
posible prescindir de la lente,
frotar con torula la superficie de
contacto corneal.
Lquido intra- Endoftalmitis y ce- Las muestras tienen que reco- < 24 h TA. Si es lavado intra-
ocular lulitis orbitaria gerse por el oftalmlogo en el ocular, centrifugar
quirfano, mediante puncin y antes de sembrar.
aspiracin del fluido. Si la mues-
tra es muy densa se recoge con
bistur y se coloca en contene-
dor de boca ancha estril. Tam-
bin se recomienda inoculacin
directa en los medios de cultivo
y la preparacin de dos o ms
preparaciones para tincin.
Lquidos estri- Candida spp. Tras la preparacin adecuada Procesamiento in- El aspirado o biop-
les (LCR, pleu- H. capsulatum, C. de la zona, obtener el lquido mediato. < 24h, TA. sia cerebral pue-
ral, perito- neoformans con jeringa en condiciones de Nunca refrigerar. den ser necesarios
neal...) esterilidad.
Transferir a tubo estril.
Recoger como para bacterias, al
menos 2 ml en contenedor est-
ril.
Mdula sea Histoplasmosis, Preparar para incisin quirrgi- Como la sangre. Si se usa un siste-
candidosis, cripto- ca. Lisis centrifugacin. ma automatizado,
cocosis. Medio apropiado en la cabecera revisar las normas
(C. neoformans, H. del enfermo del fabricante.
capsulatum)

13
Odo externo Aspergillus niger, Girar con firmeza el hisopo en el <2 h, TA
Aspergillus flavus canal externo. <24 h, 4C
Oral Candida spp., Pa- Tomar con hisopo de la lesin < 24 h, TA Medio selectivo
racoccidioides bra- activa; enjuagar con solucin para levaduras.
siliensis salina para Candida. Medio de
transporte para el hisopo o con-
tenedor estril.
Orina Sospecha de can- Primera orina de la maana en < 15 min, TA Usar la orina de la
didosis urinaria, contenedor estril. Orina obteni- < 24 h, 4 C parte media de la
candidosis disemi- da por sondaje. Orina postma- miccin. Puede
nada y criptococo- saje prosttico. utilizarse para de-
sis. Volumen necesario entre 10 y teccin de ant-
Levaduras 50 ml. geno de Histoplas-
C. neoformans, C. ma.
immitis, H. capsula-
tum, B. dermatiti-
dis.
Pelos Sospecha de tia Limpiar la lesin con alcohol al Contenedor seco. Depositar en una
de la cabeza: Tri- 70% o con agua destilada est- Si se hace con hiso- placa Petri estril.
chophyton spp. ril. po sembrar directa- Para el transporte
Microsporum spp. Seleccionar el rea, arrancar mente. no usar tubos que
(tinea capitis) con pinzas al menos 10-12 pe- < 72 h, TA. mantengan la hu-
los frgiles que estn fragmen- medad, favorece el
tados, o que presenten fluores- sobrecrecimiento
cencia a la lmpara de Wood y bacteriano.
recoger escamas.
En nios con exudado puede
ser til frotar con un hisopo.
Piel lampia Sospecha de infec- Desinfectar con alcohol de 70%. Colocar una gota de La humedad, favo-
cin por dermatofi- Raspar el borde de la lesin con agua sobre la lesin rece el sobrecreci-
tos y candidiasis un escarpelo, bistur o porta. La para evitar que las miento bacteriano.
cutnea muestra debe tomarse de la escamas "vuelen".
parte perifrica de la lesin que Directamente sobre
Trichophyton spp. va a ser donde van a estar los el medio o en conte-
E. floccosum hongos en su fase proliferativa, nedor estril o entre
Microsporum spp. mientras que en el centro de la dos portas.
Candida spp. lesin la mayora de estos hon- < 72 h, TA.
Sporothrix schenkii gos pueden ser no viables.

Piel lampia, Malassezia spp. Adherir cinta adhesiva (scotch) Raspar varias lesio-
pitiriasis versi- de varias zonas de la piel para nes de la piel sobre
color observacin directa al microsco- placa Petri.
pio.
Respiratorias: Micosis profundas Recoger 3 esputos en 3 das Contenedor estril Esputo de 24 h no
esputo, aspira- (blastomicosis, consecutivos. >1 ml. es aceptable. Los
do traqueal, candidosis, cocci- La utilidad de esta muestra vie- < 2 h, TA / < 24 h, 4 hongos dimrficos
aspirado bron- diomicosis, histo- ne condicionada por su "calidad" C sobreviven poco
quial, lavado plasmosis, aspergi- en funcin del nmero de leuco- tiempo. Requieren
broncoalveolar losis, mucormico- citos polimorfonucleares e his- procesamiento in-
sis...) y actinomico- tiocitos en la muestra, mediato.
sis (actinomicosis, Cuando sea posible lavado Hacer las extensio-
nocardiosis) de broncoalveolar, cepillado bron- nes para tinciones
localizacin pulmo- quial. de Gram, Giemsa.
nar.
Levaduras, hongos
filamentosos.

14
Sangre Cuando se sospe- Desinfectar la zona con com- < 24 h, TA. La mayora de las
cha criptococosis, puesto iodado. Candida spp. se
candidosis, histo- Sistemas automatizados. puede recuperar
plasmosis disemi- Medios bifsicos de infusin en los hemoculti-
nada y otras funge- cerebro-corazn. vos. Si se usa un
mias (Fusarium Extraer la mxima cantidad de sistema automati-
spp., Scedospo- sangre recomendada. zado determinar
rium spp., Paeci- qu hongos se
lomyces spp., As- pueden detectar.
pergillus spp.). Para los hongos
Candida spp., Ma- dimrficos: lisis
lassezia spp., C. centrifugacin.
neoformans, H. Puede detectarse
capsulatum. antgeno criptoc-
cico, de Histoplas-
ma o Aspergillus.

Seno nasal Recoger el contenido del seno < 24 h, TA.

quirrgicamente. Inocular direc-
tamente o transportar en una
gasa estril hmeda.
Uas Sospecha de oni- Desinfectar con alcohol 70%. Depositar la muestra La humedad, favo-
comicosis. Lesiones dorsales: raspar la en placa Petri estril rece el sobrecreci-
Trichophyton spp. superficie y desecharla, recoger o en tubo. miento bacteriano.
Epidermophyton la parte profunda. < 72 h, TA.
floccosum Lesiones subungueales o dsta-
Microsporum spp. les: recoger los residuos de de-
Candida spp. bajo de la ua con bistur, elimi-
Scopulariopsis bre- nando las primeras porciones y
vicaulis cortar la ua con unas tijeras
Otros hongos fila- estriles y posteriormente ras-
mentosos de ms par con un bistur estril la parte
difcil interpreta- inferior de la ua.
cin. Lesiones periungueales: tomar
escamas o exudado.

Vaginal C. albicans, C. gla- Como para bacterias. Medio de transporte.

brata, Candida <24 h, TA o refrige-
spp. rado

15
 EXAMEN DIRECTO
El diagnstico definitivo de la mayora de las micosis requiere el aislamiento e identificacin del
hongo a partir del cultivo, lo que supone con frecuencia, varios das o semanas de dilacin. Las
muestras para estudio micolgico deben examinarse tanto macroscpica como microscpicamente.
El mtodo ms rpido para la deteccin de estructuras fngicas en una muestra clnica es el examen
microscpico de la misma. Este examen puede aportar, en ocasiones, un diagnstico definitivo
(pitiriasis versicolor) y en otras, un diagnstico de sospecha previo a la confirmacin definitiva por
cultivo. Por lo tanto, es un procedimiento que debera realizarse en todos los laboratorios ya que uti-
liza tcnicas sencillas, permitiendo un cultivo mejor dirigido, seleccionando los medios ms apropia-
dos. Sin embargo, si la muestra es escasa, el cultivo debe ser prioritario. Las tcnicas moleculares co-
mienzan a ser una realidad y permitirn un diagnstico ms rpido que el cultivo, si bien estn me-
nos desarrolladas que para las bacterias o los virus.
Observacion macroscopica. Las muestras, antes de ser procesadas, tienen que observarse macros-
cpicamente, en busca de material caseoso, purulento, hemorrgico, necrtico o grnulos.
Observacion microscopica. El examen microscpico directo de una muestra clnica correctamente
tomada es el medio ms simple y rpido de detectar una infeccin fngica. Cuando los elementos
fngicos estn presentes en nmero suficiente se puede establecer una orientacin diagnstica pre-
suntiva, en ocasiones definitiva, y en pocos minutos informar al clnico, lo cual permitir la instaura-
cin temprana de una terapia antifngica, siendo ste uno de los factores esenciales en el pronsti-
co de las micosis en los pacientes inmunocomprometidos.
La microscopa sigue siendo una de las herramientas ms antiguas y tiles del miclogo clnico.
Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidigenas caractersticas para su
identificacin definitiva. Por lo tanto, es de gran utilidad que a la vez que se inoculan los medios de
cultivo, se realicen las tcnicas microscpicas que, en tiempo real (menos de 10 min), puedan orien-
tar de forma preliminar la etiologa del proceso.
El examen microscpico directo proporciona un diagnstico definitivo si se observan elemen-
tos fngicos patognomnicos: cpsula de Cryptococcus neoformans, clulas fumagoides en cromo-
blastomicosis, levaduras pequeas intracelulares de Histoplasma capsulatum, quistes/ascas tpicos
de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de Blastomyces dermatitidis, levaduras con gema-
cin multipolar en rueda de timn de Paracoccidiodes brasiliensis o las esfrulas de Coccidiodes
immitis. En algunos casos, el diagnstico microscpico puede ser la nica evidencia de infeccin
fngica y, en otros, su negatividad puede sustentar la interpretacin de aislamientos como contami-
nantes. La escasez de la muestra es, en la prctica, la nica razn para no efectuar la observacin
microscpica en beneficio del cultivo. El examen microscpico puede tambin orientar la tcnica de
cultivo (medios, temperatura, tiempo de incubacin, precauciones especiales de bioseguridad) e,
incluso, su inutilidad por tratarse de patgenos enigmticos no cultivables como Rhinosporidium
seeberi, Lacazia loboi o Pneumocystis jiroveci.
Los mtodos usados para la visualizacin fngica difieren en algunos aspectos de los de las
bacterias; el mayor tamao de los hongos hace, generalmente, innecesarios la tincin de frotis se-
cos; en su lugar son ms utilizadas las preparaciones directas en fresco con o sin lquidos de montaje
y clarificacin. La observacin microscpica se realiza con bajo aumento, seguida de alto aumento
en seco y, si es necesario, con aceite de inmersin. Las dos formas observadas habitualmente son
16
 Tabla 2: Agentes etiolgicos de micosis superficiales cutneas y mucocutneas

Tabla mostrando las caractersticas morfolgicas de las diferentes

especies de hongos patgenos y su morfologa
in vivo : tal como se observa la morfologa en una tincin al fresco
y al directo de la muestra;
In vitro: tal como se observa la morfologa de un frotis al fresco del
cultivo de la misma muestra.
17
Tabla 3 : Agentes etiolgicos de micosis profundas , subcutneas y sistmicas

Tabla mostrando las caractersticas morfolgicas

de las diferentes especies de hongos patgenos
y su morfologa

in vivo : tal como se observa la morfologa en

una tincin al fresco y al directo de la muestra ;
In vitro: tal como se observa la morfologa de un
frotis al fresco del cultivo de la misma muestra.

18
levaduras y/o elementos miceliares. La mayora de los hongos se pueden detectar sin tincin, en la
mayor parte de las muestras clnicas como esputos, orinas, exudados y LCR, usando siempre que
sea posible microscopia de contraste de fases. No obstante, se han desarrollado una serie de tincio-
nes (tinta china, Giemsa, argnticas, agentes quimiofluorescentes, etc.) para mejorar la sensibilidad
de la tcnica. Las tcnicas microscpicas directas son de gran utilidad en el estudio de muestras cl-
nicas de pacientes con micosis que afectan a la piel y mucosas, pero tambin son muy tiles en el
diagnstico de micosis subcutneas y profundas.
Son mltiples las tcnicas de observacin microscpica para el diagnstico de las micosis. Se
utilizan montajes hmedos, tinciones fijas y diversas tcnicas histolgicas para las muestras de teji-
dos. En los montajes hmedos, la adicin de KOH y dimetil-sulfxido (DMSO) permiten la clarifica-
cin de la muestra, mientras que la adicin de glicerol, mejora la conservacin de las estructuras
fngicas. La sensibilidad de las diferentes tcnicas en montaje hmedo es semejante, aunque la
observacin requiere menos experiencia en el caso de las tinciones basadas en mtodos fluores-
centes. De entre las tinciones fijas e histolgicas, las tinciones argnticas y el PAS son las ms ade-
cuadas para la observacin de estructuras fngicas. En la tabla 2 se resumen las tcnicas que se
pueden utilizar.

Limitaciones del examen microscpico

Un examen directo negativo nunca descarta una infeccin fngica. La sensibilidad de la
tcnica puede estar entre 103-105 elementos fngicos por ml y puede depender del lugar
anatmico, tipo de paciente, tincin y experiencia del observador.
El examen microscpico puede originar falsos positivos al confundirse ciertas estructuras
con elementos fngicos (linfocitos lisados que se confunden con C. neoformans en la tincin
con tinta china, fibras de colgeno o del hisopo que se confunden con elementos fngicos,
gotas de grasa con levaduras en gemacin, etc.). Estos posibles errores pueden minimizarse
con un segundo examen o con la experiencia del observador.
El examen microscpico debe realizarse, al menos, en todas las muestras con alta sospe-
cha de micosis; aunque lo ideal sera realizarlo siempre que fuese posible.
Posee una relativamente baja sensibilidad diagnstica.
En la mayora de los casos, no es posible identificar la especie fngica.
No permite la realizacin de estudios de sensibilidad a los antifngicos.

En fresco:
-KOH
-KOH + tinta Parker
-KOH + blanco calcoflor
-Tinta china (Cryptococcus)
Tinciones:
-KOH, KOH + tinta Parker, KOH + blanco calcoflor: uso general.
-Giemsa: uso general.
-PAS: uso general.
-Tinciones argnticas: uso general.
-Fontana Masson: Pneumocystis, dematiceos.

SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO

El objetivo fundamental de la utilizacin de los medios de cultivo es optimizar el crecimiento
de los microorganismos. En los medios de cultivo micolgicos, los antimicrobianos se utilizan tanto
para inhibir el crecimiento bacteriano como el de otros hongos ambientales.

19
 CLASIFICACIN
Atendiendo a su composicin, los medios de cultivo pueden ser generales, enriquecidos, selectivos,
diferenciales y especiales.
Generales: El ms caracterstico y clsico es el agar Sabouraud con glucosa . Se utiliza como medio
de cultivo general y fundamentalmente para la realizar la descripcin de las caractersticas morfol-
gicas de la mayora de los hongos.
Enriquecidos: Se utilizan especialmente en micosis sistmicas endmicas (histoplasmosis, blastomico-
sis), para la recuperacin de la fase levaduriforme. Un ejemplo de estos medios es el agar cerebro-
corazn con sangre (BHI).
Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de los microorganismos deseados impidiendo el
de otros. Los componentes ms utilizados como agentes selectivos son antibacterianos
(cloranfenicol, gentamicina, penicilina, estreptomicina) y tambin inhibidores de hongos como la
cicloheximida que es especialmente til en las muestras cutneas y respiratorias para el diagnstico
de micosis sistmicas endmicas.
Diferenciales: Se utilizan para ayudar a la identificacin del hongo basada en la apariencia de ste
en dicho medio, merced a la adicin de determinados componentes como por ejemplo sustancias
cromgenas, o indicadores de pH como en el DTM.
Especiales: Son aquellos medios que contienen algn componente (por ejemplo, cido cafeico) des-
tinado a aislar un agente concreto ( C. neoformans), favorecer la identificacin de ciertas especies
(por ejemplo, el medio de Czapeck), u obtener estructuras de reproduccin sexual (por ejemplo,
agar acetato, agar patata-zanahoria).
ELECCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios ms utilizados en el cultivo de hongos son: agar Sabouraud glucosa (AGS), habi-
tualmente con la modificacin de Emmons, con cloranfenicol y con/sin actidiona; agar infusin cere-
bro corazn (BHI) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sin antibacterianos; y agar papa dextro-
sa . Sin embargo, los hongos tambin pueden crecer en medios no selectivos, incluidos la mayora
de los medios bacteriolgicos, si se incuban el tiempo suficiente. La eleccin y el nmero de medios
a utilizar estn condicionados por el costo, la disponibilidad y las preferencias personales, pero siem-
pre se deben incluir medios con antibacterianos y sin ellos. La incorporacin de cicloheximida
(actidiona), inhibidor de muchos hongos considerados contaminantes, ayuda especialmente en las
micosis de la piel, aunque pueda inhibir algunos patgenos fngicos importantes; por ello, debe uti-
lizarse siempre en combinacin con otro medio sin cicloheximida.
Los medios de cultivo ms empleados en micologa pueden agruparse en dos categoras en funcin
de su utilidad: aislamiento e identificacin. Para el aislamiento, la utilizacin de 3-4 medios prctica-
mente cubre todas las necesidades: AGS con/sin antimicrobianos; un medio con cicloheximida y
agar infusin cerebro corazn, para las micosis sistmicas endmicas. Para la identificacin, puede
ser necesario un nmero mayor de medios que depender del nmero de muestras, las etiologas
ms probables en la zona geogrfica, las posibilidades del laboratorio y el nivel diagnstico espera-
ble segn el tipo de centro.
Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. y Pe-
nicillium spp. Es el medio de referencia para la identificacin de Aspergillus spp.
Agar de papa dextrosa : es un medio utilizado para la estimulacin de la formacin de conidias, en
la preparacin de inculos de hongos miceliales y en la estimulacin de produccin de pigmentos:
rojo en Trichosporum rubrum, rosa salmn en Microsporum audouinii y amarillo en Microsporum
canis. Se utiliza con frecuencia en microcultivos para observar las caractersticas morfolgicas.
Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse aadiendo clo-
ranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.
20
21
 Agar Sabouraud + Glucosa modificado por Emmons: es el medio estndar para el aislamiento, espo-
rulacin y conservacin de muchos hongos. Su pH y la concentracin de glucosa favorecen la espo-
rulacin.
Agar infusin de cerebro corazn: puede utilizarse como medio enriquecido para facilitar el creci-
miento de C. neoformans a partir de muestras estriles como el LCR y el mantenimiento de la fase
levaduriforme de algunas micosis sistmicas, ya sea con sangre o sin ella. En general, est indicado
para el aislamiento de una gran variedad de patgenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias
como Nocardia. Enriquecido con sangre de carnero al 10%, se utiliza para el aislamiento de todos
los hongos, incluyendo los hongos dimrficos. Pueden aadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o
gentamicina) para convertirlo en selectivo. En algunas ocasiones tambin puede completarse con
cicloheximida (facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis).
Agar inhibidor de mohos: es un medio enriquecido que contiene cloranfenicol o gentamicina, pero
no actidiona. Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles a la cicloheximida ( Cryptococcus, zigo-
micetos, etc.) a partir de muestras contaminadas. Permite el desarrollo de la mayora de los mohos y
de las levaduras.
Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol: es un medio selectivo utilizado para el aislamien-
to de hongos patgenos a partir de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias.
Se utiliza fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimrficos. Inhibe algunas
especies de hongos de inters mdico ( Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C. neofor-
mans, etc.).
Agar urea de Christensen: se utiliza en la identificacin de algunos dermatofitos, especialmente Tri-
chophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes y de algunas levaduras ( C. neoformans).
Medios cromognicos para levaduras: Cromocandida contienen diversos sustratos enzimticos que
estn unidos a compuestos cromognicos. Muy til para el estudio de levaduras.
Dermatophyte test medium: medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos en muestras muy
contaminadas, proporcionando una identificacin presuntiva. Los dermatofitos producen alcaliniza-
cin, virando el medio de amarillo a rojo. Algunas bacterias y algunos hongos tambin pueden pro-
ducir alcalinizacin. Debido a que se trata de un medio coloreado, no es un medio til para la carac-
terizacin de los pigmentos producidos por los dermatofitos. La cicloheximida inhibe muchos de los
hongos saprofitos.
Agar harina de maz con/sin Tween 80: se utiliza en el cultivo y diferenciacin de especies de Candi-
da basndose en las caractersticas miceliales. El Tween 80 se incorpora para demostrar la formacin
de clamidoconidias. Si se le aaden 10 g de glucosa puede utilizarse en la diferenciacin de T. ru-
brum y T. mentagrophytes basndose en la produccin de pigmento.
Agar Lactrimel : Medio conteniendo leche, harina de trigo, y miel. Adems contiene inhibidores lo
que impiude el desarrollo de Bacterias :(E.Coli y cocceas : S.aureus)

INCUBACIN
La temperatura ptima de crecimiento de la mayora de los hongos patgenos es 30 C. Sin
embargo, Sporothrix schenckii es una excepcin, crece ms rpido a 2728 C. Hay laboratorios que
utilizan la temperatura ambiente en lugar de 30C, pero no es recomendable, ya que los cambios de
temperatura son notables entre el da y la noche en la mayora de los laboratorios. La temperatura
de 37C no se recomienda por dos razones principales: 1) muchas muestras contienen abundantes
bacterias que crecen muy bien a esta temperatura; 2) algunos hongos crecen mal a esta temperatu-
ra o no crecen, especialmente los hongos que infectan la piel. No hay ventaja en incubar simult-
neamente a 30C y a 37C. La temperatura de 37C debe reservarse para hongos dimrficos o algn

22
hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura. Los cultivos de hongos deben incubarse durante
3-4 semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando se asla un hongo, sino que
debe completarse el periodo de incubacin. Sin embargo, hay muestras que se pueden eliminar an-
tes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 das, cuando se realizan cultivos habituales.
IDENTIFICACIN
HONGOS FILAMENTOSOS
Cuando el crecimiento detectado corresponda a un hongo filamentoso, la identificacin se de-
be hacer por el examen macroscpico de la colonia: forma, color, textura, velocidad de crecimiento y
reverso. Si el hongo tiene abundantes formas de reproduccin se emplea la tcnica del scotch o pa-
pel de celofn, que consiste en tocar la superficie de la colonia con la cinta adhesiva y colocarla so-
bre un porta, en el que se ha depositado una gota de azul de lactofenol y observar al microscopio.
Cuando no se puede conseguir una buena observacin de las formas de reproduccin por las
tcnicas anteriores, es necesario hacer un microcultivo. Esta tcnica consiste en depositar sobre un
porta un trozo de agar de Sabouraud, o del medio recomendado segn el gnero de hongo fila-
mentoso que se presume, de 1 cm2 de superficie aproximadamente, en cuyos extremos se inocula el
hongo problema (en profundidad). Posteriormente se le coloca un cubre encima y se incuba en c-
mara hmeda a 25C hasta observar crecimiento; entonces se toma el cubre, que es donde se han
depositado las formas de reproduccin, y se coloca sobre un porta que lleva una gota de azul de lac-
tofenol y se observa al microscopio.
Los criterios de identificacin son fundamentalmente morfolgicos basados en la presencia de
estructuras de reproduccin sexual, estructuras de reproduccin asexual y caractersticas especiales
de las hifas, cuya descripcin pueden ser consultados en atlas micolgicos. En ocasiones, la identifi-
cacin se complementa con pruebas bioqumicas, como la investigacin de la ureasa, que diferencia
T. mentagrophytes (positivo) de T. rubrum (negativo).
Todava limitada a determinados laboratorios especializados, pero en continuo desarrollo, est
la identificacin molecular de los aislamientos fngicos, basada en los mapas de restriccin de frag-
mentos del opern ribosomal, digeridos con un panel de enzimas de restriccin, que permite la ela-
boracin de rboles filogenticos.

LEVADURAS
La identificacin de la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier otro lquido
corporal estril est plenamente justificada. Tambin es conveniente la identificacin de las levadu-
ras de otras procedencias, sobre todo cuando ocurre de forma reiterada en diferentes muestras clni-
cas del mismo paciente, y siempre que se asuma que se trata de un organismo responsable de pato-
loga.
La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero de medios
de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiologa (agar sangre, agar chocolate,
agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS, con o sin antibiticos aadidos, es el medio de aislamiento por
excelencia para la identificacin de levaduras. En el medio AGS las colonias de levaduras suelen ser
completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o rugosa, con olor dul-
zn agradable, volvindose ms pastosas a medida que la colonia envejece. Por lo general, las colo-
nias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones pueden aparecer prolongacio-
nes aracneiformes en la periferia de las colonias.
Identificacin convencional. Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera posibili-
dad de levaduras, se realiza una extensin en fresco. Si en la misma se observan levaduras, se proce-
de a la identificacin mediante subcultivo a un medio cromognico, Cromocandida. En el caso que

23
no se trate de ninguna de las especies que este medio identifica, se procede a hacer la identificacin
mediante auxonograma de carbono preparado en el propio laboratorio, o mediante alguno de los
mtodos comerciales basados en l. La identificacin bioqumica debe completarse con una identifi-
cacin morfolgica mediante un subcultivo al medio agar harina de maz con o sin Tween 80.
Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate de un
hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar micelio verdadero como
Geotrichum, Dipodascus o Trichosporon. Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la
formacin de cpsulas y puede ser el paso inicial para la identificacin de C. neoformans. Las colo-
nias de color rojoanaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso son caractersticas de las es-
pecies del gnero Rhodotorula ( rhodo: rojo), color que manifiesta esta levadura por su riqueza en
carotenoides.

Otros medios diagnsticos complementarios

- Prueba del tubo germinal o filamentacin precoz: el tubo germinal es una extensin filamentosa
de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la clula progeni-
tora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la clula madre. Slo C. albicans, y en menor medi-
da C. dubliniensis, son capaces de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras espe-
cies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar a los tubos germi-
nales pero con una zona de constriccin caracterstica adyacente a la clula madre, por lo que esta
prueba es til para diferenciar C. albicans y C. dubliniensis del resto de las especies de Candida.
Falsos negativos: aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans dan negativa la prueba de los
tubos germinales. Si se utiliza un inculo demasiado abundante de levaduras, tambin pueden obte-
nerse falsos resultados negativos.
Metodologa: 1) emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano, de caba-
llo o de conejo. 2) Incubar a 35C durante 2 horas. 3) Depositar una gota de la emulsin sobre un
portaobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubre-objetos y visualizar a 100 X, 400 X 1000 X.
Interpretacin: La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales.
- Deteccin de ureasa: una levadura con reaccin positiva a la prueba de la ureasa es sugestiva de
pertenecer al gnero Cryptococcus. Concretamente, las cepas de C. neoformans comienzan a pro-
vocar cambio de color a las 2 horas de incubacin a 35C en un tubo de urea de Christensen inocu-
lado con una colonia del aislado sospechoso. Esta prueba tambin puede utilizarse para diferenciar
Trichosporon (ureasa positiva) de Geotrichum (ureasa negativa).
- Prueba de la enzima nitrato-reductasa: la capacidad de C. neoformans de reducir nitratos a nitritos
es una prueba de utilidad cuando se pretende identificar esta levadura.
Procedimiento: 1) pasar la punta de un hisopo por la superficie de 2-3 colonias aisladas de un cultivo
de 48-72 horas de crecimiento en cualquiera de los medios habituales. 2) Incubar el tubo con el hi-
sopo a 45C durante 10 min. 3) Sacar el hisopo y agregar al tubo 2 gotas de alfa-naftilamida y 2 go-
tas de cido sulfanlico. 4) Reintroducir el hisopo en el tubo para que absorba los reactivos.
Interpretacin: el desarrollo inmediato de un color rojo indica una reaccin positiva.
- Prueba de la fenol-oxidasa: C. neoformans produce fenol-oxidasa, una enzima necesaria para el
metabolismo de la 3,4-dihidroxifenilanina (DOPA) y otros compuestos fenlicos en la sntesis de la
melanina. Esto se evidencia por la produccin de un pigmento marrn oscuro o negro alrededor de
la colonia de C. neoformans en el medio que contenga catecoles, como el cido cafeico, o el medio
preparado con semillas de nger ( Guizotia abyssinica).
Interpretacin: el desarrollo de una pigmentacin marrn oscura alrededor del crecimiento es carac-

24
terstico de C. neoformans.
-Deteccin de antgenos y Anticuerpos :Se han descrito numerosas tcnicas para la deteccin de an-
tgenos fngicos, algunas de ellas incluso disponibles comercialmente.
Ltex para Cryptococcus: este mtodo de aglutinacin se utiliza para la deteccin del polisacrido
capsular de C. neoformans, tanto en suero como en LCR, con fines diagnsticos y de monitoreo de la
terapia. Tiene una sensibilidad cercana al 95% y una especificidad entre 93 y 100%15,16.
Inmunofluorescencia para Pneumocystis jiroveci (ex carinii): esta tcnica utiliza anticuerpos monoclo-
nales especficos contra determinantes antignicos de la pared de los quistes y trofozoitos de P. jiro-
veci. Tiene una sensibilidad reportada cercana a 100% y una especificidad de alrededor de 96%
17,18.
Antigenemia para bsqueda de Aspergillus spp: recientemente se ha incorporado un inmunoensayo
tipo "sandwich" comercial que utiliza un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cadena lateral 1,5
b-D galactofuransido del galactomanano. El ensayo tiene un lmite de deteccin entre 0,5 y 1,0 ng/
ml de suero, superior a los 15 ng/ml de suero descrito para el ltex existente previamente. En un es-
tudio cuyo estndar de oro fue el cultivo y la histologa, la sensibilidad fue de 92,6% y la especifici-
dad de 95,4%. El test fue positivo en promedio 6 das antes que la sospecha clnica19. Actualmente
se considera que un examen positivo debe ser confirmado con una segunda muestra y forma parte
de los criterios usados por EORTC y NIAID para definir micosis invasoras.
Deteccin de antgenos de Candida spp: mtodo de aglutinacin con partculas de ltex para un
antgeno termolbil no bien caracterizado, que en los diferentes estudios ha mostrado valores desde
25 hasta 100% de sensibilidad para el diagnstico de candidiasis invasora, y por lo tanto no existe
consenso sobre su utilidad clnica. Otras molculas blanco como por ejemplo manano, enolasa y D-
arabinitol, han sido estudiadas para el diagnstico de candidiasis invasora, pero lamentablemente
todos estos ensayos han tenido una utilidad muy limitada..
-Biologa molecular
Debido a las dificultades tanto de sensibilidad, especificidad y retardo de las tcnicas microbiolgicas
tradicionales, se han desarrollado durante la ltima dcada diversas tcnicas en el campo de la biolo-
ga molecular con gran potencial en el rea del diagnstico micolgico, tanto para la pesquisa e
identificacin del agente causal como para la evaluacin de clonalidad con distintos fines.
Entre las tcnicas ms difundidas est la amplificacin por RPC, especialmente por su alta sensibili-
dad y rapidez. Esta tcnica se ha implementado en diferentes aproximaciones: RPC con partidores
especie o gnero -especficos, RPC y Southern blot, RPC y anlisis con enzimas de restriccin, RPC
anidada, RPC en tiempo real, RPC con anlisis de fragmentos y secuenciacin.

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 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
Los medios de cultivo necesarios para hacer las pruebas de sensibilidad dependern del mto-
do que se siga. En general son medios sintticos definidos, como el RPMI con o sin glucosa. Se de-
ben hacer pruebas de esterilidad del medio as como de medida del pH, que debe situarse alrede-
dor de 7,0 0,3. En caso contrario, los antifngicos pueden perder parte de su capacidad inhibito-
ria. Los antifngicos deben obtenerse en forma de sustancia valorada solicitndolos al laboratorio
que los produce o en aquellos casos en los que sea posible, adquirindolos a travs de un distribui-
dor acreditado. Debe conocerse el nmero de lote, potencia, fecha de caducidad y condiciones de
conservacin. Las formulaciones preparadas para uso clnico no deben emplearse, pueden tener
excipientes o formulaciones indeseables.
Los mtodos de referencia describen con precisin todo el proceso de preparacin de soluciones
madre de los antimicrobianos, de las placas o tubos con concentraciones decrecientes, del inculo,
de la forma de inoculacin y de lectura. Se aconseja realizar recuentos en placa a partir de las sus-
pensiones inoculadas para comprobar que no se han cometidos errores en la preparacin del
inculo. Deben incluirse cepas control (ver PNT-MIC-05) en todas las pruebas para poder validar los
resultados. Si se decide utilizar un mtodo comercial deben seguirse fielmente las instrucciones del
fabricante. Las condiciones de incubacin no son especiales. Generalmente se cultivan en atmsfera
normal, a 30 35C, durante 24-72 horas, dependiendo del mtodo y de las especies fngicas.

Panel Sensititre Yeast One

para el estudio de la sensibilidad in vitro

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DIAGNSTICO POR LABORATORIO DE LAS INFECCIONES POR HONGOS Fabiola Eugenia Gonzlez Cuellar
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