Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnologa

Precipitacin

Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa
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Precipitacin
En la precipitacin se concentra el soluto de una solucin convirtindolo en slido
mediante la accin de un agente precipitante.

Tericamente la precipitacin debe producir un soluto concentrado y puro, por

lo que es una operacin que se utiliza al inicio de un proceso de bioseparacin
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Ventajas

1. Operacin que se adapta fcilmente a gran escala

1. Puede realizase en forma continua

2. El equipo que se utiliza es sencillo

3. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos stos

son baratos
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Fundamentos
Principio Agente precipitante
Disminucin de la solubilidad Sales (Sulfato de amonio)
pH (precipitacin isoelctrica)
Solventes (etanol)
Polmeros no inicos
Desnaturalizacin selectiva Temperatura
pH
Solventes

Afinidad Ligandos
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Precipitacin por disminucin de la solubilidad

- + - - +
-+ - - - Al agregar un agente
+ - + +
+ precipitante
+ +
- Las protenas con mayor
- +
+
- - hidrofobicidad superficial
+ + precipitan primero
- - -+
+
- + - + - +
Regiones hidrofbicas

Precipitacin de
Precipitacin con sales

protenas por
Precipitacin isoelctrica
disminucin de la
Precipitacin con solventes
solubilidad
Precipitacin con polmeros no inicos
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Precipitacin con sales

Solubilizacin Insolubilizacin
por salado por salado

(Salting-in) (Salting-out)

[Sal]

La adicin de sales elimina el agua de la protena

Mecanismo hidratada, dejando las regiones hidrofbicas en
libertad de combinarse intermolecularmente
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Precipitacin por incremento de la fuerza inica

(Salting-out)
100
Protena total
Protena de inters

80
Concentracin relativa (%)

60

40

20

0
0 20 40 60 80 100
Concentracin de Sal (% Saturacin)
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Ecuacin de la precipitacin con sales

log S = A m[Sal]
Donde:
S = Solubilidad de la protena a un valor dado de concentracin salina.

A = Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante

usualmente toma un valor mnimo en el punto isoelctrico, es caracterstica de
cada protena e independiente del tipo de sal.

m = Pendiente de la curva de solubilizacin por salado. sta es independiente del

pH y la temperatura, pero vara con el tipo de sal y de protena. Las sales que
contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de m
mayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el
magnesio disminuyen el valor de m.
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Naturaleza de la sal

1. Los aniones son ms efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):

citrato3 > tartrato2 > SO42 > F > IO3 > H 2 PO4 >
CH 3COO > Cl > ClO3 > Br > O3 > ClO4 > I
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
H 4+ > K + > a +
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que
requiere el mtodo.
4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea
diferente a la de la solucin para facilitar su separacin.
5. Aadirla sal en forma slida y no como solucin, para minimizar la dilucin.
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Precipitacin isoelctrica
Esta tcnica se basa en la disminucin de la solubilidad en el punto isoelctrico
Las protenas por su naturaleza anfotrica presentan una carga neta negativa a
pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH
Mecanismo isoelctrico al cual la carga neta de la protena es cero. A este pH la molcula
es incapaz de desplazarse en un campo elctrico
+ + +
Repulsin
+ + + +
+ + + +
+ +
-
+ + - -
Efecto de las fuerzas Atraccin
+ + - -
-
electrostticas sobre la protena +
++ - -
-

- + + -
+ Baja interaccin - +
- + -
- + + en el punto
- isoelcrico - +
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Precipitacin con solventes

Esta tcnica se basa en la disminucin de la solubilidad mediante la adicin de un
solvente orgnico ligeramente polar
El agua se caracteriza por su alta constante dielctrica, lo cual significa que los iones en
solucin acuosa presentan interacciones ms dbiles que con otros medios.
La adicin de un solvente orgnico (etanol o acetona) produce agregados de molculas
proteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una
Mecanismo
constante dielctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las
fuerzas de atraccin entre cargas opuestas y una disminucin en el grado de ionizacin
de los radicales de las protenas, y en consecuencia una disminucin en la solubilidad de
sta.
Constantes dielctricas de algunos lquidos a 20C
Lquido D
Agua 80.0
Matanol 33.0
Etanol 24.0
Acetona 21.4
Benceno 2.3
Hexano 1.9
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Ecuacin de la precipitacin con solventes

K
log S = log S 0 + 2
DS
donde:
S = Solubilidad de la protena
DS = Es la constante dielctrica de la mezcla solvente-agua, misma que vara
dependiendo de la cantidad de solvente agregada.
K = Es una constante que toma en cuenta la constante dielctrica original del
medio acuoso.
S0 = Es la solubilidad extrapolada

El solvente debe ser completamente miscible en agua

Seleccin No debe reaccionar con las protenas
del solvente Debe ser un buen agente precipitante
Debe ser seguro (flamabilidad del solvente)
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Precipitacin con polmeros no inicos

La precipitacin de protenas tambin puede realizarse utilizando polmeros

neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes.

El mecanismo no est claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos

propuestos.

Ogston y Laurent sugieren que los polmeros excluyen a las protenas de parte
de la solucin y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su
solvatacin.

Mecanismo El modelo de Ogston se basa en la teora termodinmica y concluye que los

sistemas pueden ser explicados en trminos de los coeficientes de interaccin
protena-polmero, y protena-protena de las especies presentes.
El modelo de Laurent se basa en un mecanismo de exclusin geomtrica de
regiones hidratadas de la protena por el polmero.
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Ecuaciones de la precipitacin con solventes

Modelo de Laurent: log S = log k KC
S = Solubilidad de la protena
C = Concentracin del polmero
k = constante de proporcionalidad
3
v rs + rp v = Volumen parcial especfico del polmero
K= rS = Radio de la molcula de protena
2.303 rp rP = Radio del cilindro del polmero

Modelo de Ogston: log S = X aC

S = Solubilidad de la protena
C = Concentracin del polmero
a = coeficiente de interaccin protena-polietilen glicol

i = Potencial qumico de la protena en presencia del polmero

i 0
i0 = Potencial qumico de la protena en el estado estndar
X= i
RT R = Contante de los gases ideales
T = Temperatura absoluta
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Precipitacin de protenas por desnaturalizacin

selectiva

El objetivo de la desnaturalizacin selectiva es crear las condiciones en las cuales

la protena de inters no se desnaturaliza o su desnaturalizacin es mnima

Si la protena que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas

de temperatura, pH, o en solventes orgnicos, puede utilizarse esta propiedad en
las primeras etapas del proceso de purificacin
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Desnaturalizacin por temperatura

El proceso de desnaturalizacin de la protena por efecto de la temperatura puede
ser descrito como un proceso de primer orden
d [P ]
= k [P ]
dt
[P] = Concentracin de la protena disuelta
t = tiempo
k = Velocidad especfica de desnaturalizacin
La dependencia del proceso de desnaturalizacin con la temperatura est dado por:

E
k = k0 exp
RT
d [P ] E
= k0 exp [P ]
dt RT
k0 = Constante caracterstica
E = Energa de activacin de la desnaturalizacin
R = Constante de los gases
T = Temperatura
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Desnaturalizacin por pH
Debido a que ciertas protenas son estables a pHs extremos, se ha utilizado esta
propiedad para purificarlas mediante su precipitacin por desnaturalizacin selectiva de
las protenas contaminantes.

La velocidad de desnaturalizacin a pKs extremos ya sea cidos o bsicos depende del

tiempo que tarde la protena en abrirse y perder su conformacin.

Desnaturalizacin por solventes orgnicos

La estabilidad que presentan algunas protenas en una solucin con solventes orgnicos
es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificacin, mediante la
precipitacin de protenas contaminantes.

El pH y la temperatura de la solucin deben definirse y manejarse cuidadosamente con

el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la protena de inters, y de lograr la
mxima precipitacin de las protenas contaminantes.
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Precipitacin por afinidad

La precipitacin de proteinas por afinidad es un mtodo de preciptacin selectivo que

se basa en la capacidad que tienen las protenas para unirse con ligandos por medio
de sus sitios activos.

En el caso de la afinidad bioespecfica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o

un anticuerpo.

En el caso de la pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales.

Nota: La simple adicin de ligandos a una solucin proteica generalmente no es suficiente

para que ocurra la precipitacin. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregacin
de los complejos ligando-protena.
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Equipos de precipitacin

La operacin de precipitacin puede llevarse en diferentes tipos de reactores entre los

que se encuentran los:

Alimentacin

Alimentacin Producto

Intermitentes
Tubulares Continuos tipo
Producto
tanque agitado
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Diseo de Precipitadores
En el diseo de un proceso de precipitacin debe tomarse como base el comportamiento
cintico de las partculas en solucin. El conocimiento de este comportamiento permite
hacer la seleccin adecuada de la geometra en la que se realizar el proceso.

Precipitacin a gran escala

Gran escala significa procesos los cuales son 10 veces o ms que los mtodos de
laboratorio existentes. En otras palabras se est interesado en el escalamiento.

La solubilidad de un soluto particular en un proceso a gran escala no es diferente al del

proceso a pequea escala. Lo que se puede cambiar en un proceso a gran escala es la
cintica. Se desea que ambas cinticas sean las mismas.

Se demuestra que la precipitacin se obtiene con mejor xito a una potencia por unidad
de volumen constante (P/V).
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Se puede idealizar la precipitacin como un mecanismo de 6 etapas:

1. Mezclado inicial: La alimentacin conteniendo el soluto es mezclada con el

no-solvente o la sal

2. Nucleacin: Aparecen pequeas semillas e inicia la precipitacin

3. Crecimiento limitado por difusin: El precipitado crece por difusin

4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es ayudado por mezclado

5. Floculacin: Partculas coloides se agregan en flculos grandes

6. Centrifugacin: Los flculos son separados por los mtodos ya descritos

Alguno de estos procesos ocurrirn simultneamente, pero se discutirn como si

ocurriesen secuencialmente
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Mezclado Inicial:

El tiempo requerido para producir homogeneidad puede ser estimado de la ecuacin:

l2
t=
4D
donde: l es el tamao promedio de los eddies turbulentos causados por el mezclado y
D es el coeficiente de difusin del soluto.
El tamao de estos eddies puede ser estimado de la ecuacin:

1
3
4
l =
P /V

donde: es la densidad de la solucin, es la viscosidad cinemtica, y P/V es la potencia

por volumen de la agitacin.
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Nucleacin:

La nucleacin es la parte del proceso donde pequeas partculas aparecen y empiezan a

crecer:

 En sistemas inorgnicos, la nucleacin puede ser lenta y la sobresaturacin puede

persistir por largos periodos

 Para sistemas coloides, este proceso es efectivamente instantneo

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Crecimiento limitado por difusin (Crecimiento Pericintico):

Despus de la nucleacin, las partculas del precipitado crecen cuando el soluto disuelto
difunde hacia ellos de la solucin circundante. Este crecimiento usualmente sigue un
proceso de segundo orden:
dyi
= kyi2
dt
donde: yi es la concentracin de partculas de soluto, y k es la constante de la tasa del
proceso.

La constante k es una funcin del coeficiente de difusin D:

k = 8Dd
donde: d es el dimetro del soluto, y es el nmero de Avogadro.
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La ecuacin de segundo orden puede ser fcilmente integrada:

1 1
= + kt
yi yi0

donde: yio es la concentracin inicial de soluto.

Sin embargo, frecuentemente es ms difcil medir yi que determinar el peso molecular
promedio M del precipitado. La ecuacin anterior se puede escribir en trminos del peso
molecular mediante un balance de masa

yi M = yi0 M 0
donde: M 0 es el peso molecular del soluto inicial.
Combinando las dos ecuaciones previas:
(
M = M 0 1 + yi0 kt )
As las mediciones del peso molecular promedio contra el tiempo provee valores de la
constante k.
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Crecimiento influenciado por flujo (Crecimiento o agregacin ortocintica):

La difusin limita el crecimiento de pequeas partculas pero es menos importante que el

crecimiento de partculas grandes.

Para estas partculas grandes, el crecimiento usualmente involucra coalisin entre

especies las cuales son barridas junto con el mezclado.

El crecimiento en esta regin obedece a una cintica de segundo orden:

dyi
= kyi2
dt
donde la constante de la tasa est dada por:
1/ 2
2 P /V
k = d 3
3
donde: es un coeficiente de pegamiento, un factor insertado para considerar el hecho
de que no todas las coaliciones producen crecimiento .
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La integracin directa de esta ecuacin es complicada por el hecho de que el dimetro de

la partcula y la constante de la tasa k son funcin del tiempo.

Se puede resolver la complicacin considerando una fraccin de volumen del soluto

1
= d 3 yi
6
Esta fraccin de volumen es independiente del tiempo. As podemos reescribir las
ecuaciones anteriores en trminos de
dyi 4 P / V
1/ 2

= yi

dt

Integrando encontramos:

yi 4 P / V
1/ 2


= exp t

yi0

Ejemplo 9.3
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Floculacin:

Los flujos altos para el crecimiento de partculas pequeas puede destruir los flculos
ms grandes, as esta etapa es algunas veces llevada a cabo en tanques no agitados.

Los polielectrolitos sintticos pueden algunas veces ayudar a la floculacin, tal como
ocurre en la filtracin.

Nota: Recuerde que si el precipitado es el producto deseado, el polielectrolito debe ser

removido despus.