Materiales y mtodos

Perfusin de corazones aislados de ratn

Para todos los ensayos, se utilizaron ratones de la cepa Balb/C, de 2 meses de

edad. Como primer paso se inyect heparina 15 minutos antes del comienzo del
protocolo para evitar la coagulacin de la sangre al momento de la canulacin
de la arteria aorta. La dosis usada, fue de 2,5 unidades/gr. Pasado ese tiempo,
se anestesiaron con ketamina/diazepan (100 y 5 mg/Kg respectivamente).
Cuando se corrobor que estaban adormecidos, se realiz una tracotoma para
extraer el corazn y realizar la canulacin en un equipo de perfusin retrgada
(tcnica de Langerdoff).
El corazn aislado (entre 0,2 y 0,3 gr de peso hmedo) se perfundi con solucin
salina Tyrode modificada (en mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 0,33 KH2PO4, 1
MgCl2, 10 glucosa, y 10 HEPES; pH 7,4; equilibrado con O2 100%), a
temperatura y presin constantes (37C y 80 mmHg respectivamente).
Luego de 10 minutos de estabilizacin para asegurar la viabilidad del corazn,
se continu con el bloque de la frecuencia espontnea de los mismos
controlada por el ndulo sinusal. El bloqueo se realiz por pinzamiento del
tabique interauricular. Para evaluar la actividad mecnica de los corazones, se
retir por diseccin la aurcula izquierda y se coloc un baln de polietileno
dentro del ventrculo izquierdo (VI), a travs del orificio aurculo-ventricular. El
baln se conect a un transductor de presin (MPX5050 Motorola, USA) a travs
de una delgada cnula. El baln y la cnula se llenaron con agua bidestilada
desgaseada (para evitar la formacin de burbujas que atenuaran la seal) de
modo de fijar la presin de fin de distole del VI (PFD). La contractilidad del VI
se evalu por medio de la presin desarrollada del VI (PD) y la velocidad de
desarrollo de presin (+dp/dtmx), y la relajacin del ventrculo se estudi a travs
de la medida del tiempo hasta la mitad de la relajacin (t50) y la velocidad de la
misma (-dp/dtmn).
Protocolo de isquemia y reperfusin

Cuando los corazones se mantuvieron estables por 10 minutos (perodo llamado

preisquemia), se sometieron al protocolo de isquemia/reperfusin (I/R) (15
minutos/3 minutos). Se realizaron dos protocolos diferentes, con el fin de
evaluarlos. Uno por cese global de flujo (isquemia no simulada, INS), y otra por
isquemia simulada (IS) (pH 6,2, ausencia de glucosa, y reemplazo del O2 por
N2). Finalizado cada experimento, los corazones se congelaron con una pinza
tipo Wollenberger pre enfriada por inmersin en N2 lquido. El corazn congelado
se pes y se conserv a -80 C hasta el momento de realizar las determinaciones
bioqumicas.

Medicin de los potenciales de accin

Otra metodologa usada, luego de la pre-isquemia, fue el registro de los

potenciales de accin (PA). Para esto, se usaron microelectrodos de
vidrio cargados con una solucin 3M de KCl saturado. Para obtener la
seal, estos se colocaron en la cara anterior del VI y una vez verificado
el potencial de membrana polarizado se procedi al registro de la seal y
al protocolo de I/R.

Los microelectrodos estuvieron conectados a un cabezal que funciona

como pre-amplificador, parte de un amplificador de seal (Molecular
Devices-Axoclamp 2A). Las seales digitales se filtraron a un ancho de
banda de 500KHz y se muestrearon digitalmente a una frecuencia de
100KHz. Se utiliz el software de adquisicin (LabChart) del sistema
PowerLab 4ST de ADInstruments.

Determinaciones bioqumicas

Preparacin de homogenatos

El tejido ventricular pulverizado se homogeneiz en 5 volmenes de medio de

homogeneizacin pre enfriado (en mM: 30 KH2PO4, 5 Na2EDTA, 25 NaF, 300
sacarosa, y los inhibidores de proteasas 1 PMSF, 1 benzamidina, 4 g/ml de
leupeptina, 0,4 g/ml de pepstatina, pH 7,0 a 4C) con un homogeneizador
manual (P1200E Kinematica Polytron, USA). Luego, el homogenato se
centrifug a 11500xg durante 15 minutos a 4C. El sobrenadante obtenido se
separ en alcuotas para ser congelado a -80C. La concentracin de protenas
se determin por el mtodo de Bradford (Bradford, 1976) con seroalbmina
bovina como protena estndar para la curva de calibracin. El rendimiento
aproximado fue de 30 mg de protena por gramo de corazn.

Electroforesis y anlisis por Western Blot

Para el estudio de la fosforilacin de PLN, se realiz la separacin electrofortica

de las protenas en geles de poliacrilamida-SDS (minigeles de 1 mm de espesor)
de acuerdo a una modificacin de la tcnica de Laemmli (Laemmli, 1970)
introducida por Porzio y Pearson (Porzio y Pearson, 1977). El gel de apilamiento
se prepar segn la siguiente composicin: acrilamida 4%, Tris-HCl 125 mM (pH:
6,8) y SDS 0,1%, y el gel de resolucin: acrilamida 12%, (relacin
acrilamida/N,N'-metilenbisacrilamida 30:0,8) Tris/glicina 400 mM (3:1) (pH 8,8),
glicerol 5%, SDS 0,1% y EDTA 0,2 mM. La polimerizacin fue catalizada por el
agregado de tetrametilendiamina 0,08%, y se inici por el agregado de trazas de
persulfato de amonio.
Las muestras se disolvieron en solucin solubilizante (SDS 2%, Tris/HCl 62,5
mM a pH 6,8, glicerol 10%, -mercaptoetanol 5% y azul de bromofenol 0,001%
como indicador del frente de corrida). Se sembraron 25 g de protena en cada
surco del gel. La electroforesis se realiz a potencial constante, comenzando a
100 voltios durante el apilamiento de las muestras, y luego a 120 voltios durante
la resolucin de las protenas. La corrida electrofortica se continu hasta que el
frente de corrida, indicado por la lnea azul del colorante, llegase al lmite inferior
del gel. Finalizada la electroforesis, los geles se estabilizaron en solucin de
transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 15%) e inmediatamente las
protenas se transfirieron electroforticamente a una membrana de polivinilideno
difluoruro (Immobilon-P, Millipore, USA) en condiciones semisecas durante una
hora a 12 voltios. La correcta transferencia de las protenas a la membrana se
confirm por tincin con el colorante reversible rojo Ponceau S. Para eliminar el
colorante se lavaron las membranas 2 o 3 veces con solucin salina
amortiguadora de Tris (TBS, del ingls Tris Buffered Saline, Tris 50 mM y NaCl
150 mM, pH 7,4). Una vez libres de colorante, las membranas se incubaron
durante 2 horas a temperatura ambiente con solucin de 5% de leche
descremada en TBS con el objeto de bloquear los sitios libres de protenas en la
membrana, y as evitar la unin inespecfica del anticuerpo a la superficie de la
membrana. Una vez bloqueadas las membranas, se incubaron durante la noche
con los anticuerpos policlonales, dirigidos contra pptidos de fosfolamban
(residuos 9-19) fosforilados en Ser16 o Thr17 (anti-PSer16 y anti-PThr17)
generados en conejo. Estos anticuerpos se prepararon en solucin 5% de leche
descremada en TBS (dilucin 1:5000, Badrilla, UK).
Posteriormente, para la deteccin de los anticuerpos primarios, se lavaron las
membranas 5 veces (un lavado de 15 minutos y cuatro de 5 minutos) con TBS y
luego se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos anti-PSer16 y anti-
PThr17. Nuevamente se realizaron 5 lavados para quitar el exceso de
anticuerpo. El revelado se realiz sobre placas radiogrficas por reaccin
quimioluminiscente con el uso de un kit comercial (ECL Plus, Amersham Biosc.,
USA), obteniendo bandas de diferente intensidad y tamao de acuerdo a la
cantidad de antgeno detectado.
La cuantificacin de las bandas se realiz con un programa de computacin
(ImageJ 1.37v NIH, USA), con el cual se mide la intensidad de las seales
digitalizadas por escaneo de las placas radiogrficas.