Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en

alimentos.

OBJETIVOS

Realizar adecuadamente la cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos,

mediante la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana.
Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de
Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES

Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan
solos, en pares o racimos, no son mviles, ni esporulados; algunos biotipos son
capaces de producir una toxina altamente termoestable, as por ejemplo,
Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones
en el hombre.

Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una

gran variedad de carbohidratos en condiciones aerbicas, con la subsecuente liberacin
de cido, principalmente cido actico con pequeas cantidades de bixido de carbono;
en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentacin es el cido lctico.

Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a la

neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de microorganismos
competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es
competitivo en presencia de otros microorganismos.

Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo,
superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por
ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y
derivados lcteos, tambin se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas
concentraciones de sal, uno de ellos sera el jamn; otro factor importante en los
alimentos es el pH, as tenemos en el caso de la mayonesa, sta tiene un pH lo
suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y
neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para
permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxignico y finalmente c) tambin
se puede localizar en personas y animales. Estos ltimos, los animales y las personas
son los principales reservorios de estos microorganismos.

Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una
contaminacin postproceso con tipos enterotoxignicos de Staphylococcus aureus, por
ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de
conservacin inapropiadas; este problema se acenta por la ausencia de flora
competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo

El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por

tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al
ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencion con anterioridad
son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la A la ms nociva

La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0

microgramo), para causar intoxicacin, es de 106 UFC/g de alimento, de acuerdo con la
Norma Oficial Mexicana, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece
que una cantidad de Staphylococcus aureus patgeno, en el que se encuentren 105
UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente
un nanogramo de toxina estafilocccica por gramo de alimento, es suficiente para
causar sntomas asociados con la intoxicacin antes mencionada. Tambin es
importante observar, que en la mayora de los brotes de intoxicacin causados por este
microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina
ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido an ms
bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicacin en el
hombre.

Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna

diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se
distinguen de los alimentos que no estn contaminados con este microorganismo, por
esta razn el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin
darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulacin durante su
preparacin y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 C y por
debajo de 60 C) despus de su preparacin, son los alimentos ms involucrados en la
intoxicacin estafilocccica.

Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas,

productos de pastelera, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas
de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sndwiches y papas, son los ms
comnmente asociados con intoxicaciones estafilocccicas.

En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma especfica en el tracto

nasofarngeo, cabello y piel del 50% o ms de los individuos, sin causar dao aparente
(portadores asintomticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos
y desarrollarse con rapidez en ellos.

La especie aureus, es la considerada patgena dentro del gnero Staphylococcus y

est comnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumona y en
algunos casos puede llegar a ocasionar prdida del conocimiento. Las cepas de este
microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las ms
importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.
El establecimiento de los sntomas de la intoxicacin, por lo general se presentan
rpidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la
susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento
contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los
sntomas ms comunes de intoxicacin consisten en nusea, vmito, dolor o espasmos
abdominales y postracin. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no
manifestar todos estos sntomas asociados a la enfermedad. En casos ms severos, se
puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares as como cambios
intermitentes en la presin sangunea y pulso. La recuperacin parcial se alcanza a los
2 das, sin embargo la recuperacin completa puede durar ms das en casos muy
severos.

El trmino Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas

que secretan una enzima que provoca coagulacin del fibringeno sanguneo,
utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos
de defensa del husped. Esta reaccin se utiliza in vitro para la identificacin de cepas
de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma.

Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son:

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de

intoxicaciones.
Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este
microorganismo enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin postproceso, la cual es usualmente debida a contacto
humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

FUNDAMENTO

La presente tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus, consiste en los

siguientes pasos:

1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe el desarrollo

de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems permite reconocer el
desarrollo caracterstico del microorganismo buscado.
2. Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas daadas de
Staphylococcus aureus.
3. Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y especie de
Staphylococcus aureus enterotoxignico.

Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima
coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterizacin bioqumica de
Staphylococcus aureus toxignico en estas pruebas es la siguiente:
Presencia de coagulasa positiva
Presencia de termonucleasa positiva
La determinacin del Staphylococcus aureus mediante extensin del inculo en
superficie, es adecuado para el anlisis de alimentos en los que se espere encontrar
ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus/g 10 clulas de Staphylococcus
aureus/ mL de alimento.

El aspecto cuantitativo en la investigacin de Staphylococcus aureus es de suma

importancia, no slo desde el punto de vista econmico, sino en el de salud pblica; la
Norma establece un lmite mximo de 106 UFC/g de alimento para que ste pueda ser
consumido. Desde este punto de vista y de acuerdo con la tcnica mencionada, la
sensibilidad mnima de deteccin en el recuento en placa, utilizando el mtodo de
extensin de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras slidas 10
UFC/mL para alimentos lquidos.

NOTA

La sensibilidad se podr aumentar a 10 UFC/g 1 UFC/mL, solamente si se coloca 1.0

mL de la primer dilucin del alimento, distribuido en tres placas de agar Baird Parker,
esto representa una cantidad aproximada de inculo de 0.33 mL por caja.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker a.

7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusin cerebro corazn (BHI) b.
1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA c.
7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol c. (opcional)
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua
peptonada al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.
3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solucin
amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Colorantes para Tincin de Gram b

Parafina o aceite mineral estrilc. (slo si se siembra en caldo manitol)
Colorante azul de orto-toluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no
contenga este indicador) d.
HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d.

BIOLGICOS

Plasma de conejo c.
MATERIAL Y EQUIPO

Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a, c. (se debe utilizar una
pipeta para cada dilucin)
Pipetas Pasteur estriles a, b. c. d.
Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn . a. (en caso que la
muestra sea lquida.
Propipeta. a, b, c, d
Varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm. de largo,
dobladas en ngulo recto (forma de L), estriles (se debe utilizar una por dilucin). a
Utensilios estriles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras,
esptulas y separador de huevo. a
Vaso de licuadora estril o Bolsa para Stomacher a.
Motor para licuadora o Stomacher a.
Asa bacteriolgicab.
Portaobjetosb.
Microscopio ptico b.
Balanza granataria a.
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autoclave
Bao de agua a ebullicind
Incubadora a 35 2Cd

NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 48 h de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 72 h de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 96 h de iniciada la prctica.
 DETERMINACIN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS

Realizar diluciones decimales empleando tubos

Homogenizar con 90.0 mL de
con 9.0 mL de solucin diluyente
diluyente

1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Pesar 10.0 g 10-1 10-2 10-3 10-4

de muestra en 0.1 mL
condiciones de
asepsia

10-2 10-3 10-4 10-5

Depositar por duplicado 0.1 mL de cada dilucin
en cajas petri con agar Baird Parker.

Incubar 24 - 48 h a 37C

Distribuir la muestra con Contar aquellas colonias

una varilla de vidrio negras con hidrlisis de
estril lecitina

Coagulasa

Incubar 24 h
37C

Siembra de colonias
Fermentacin Plasma DNAsa termoestable Realizar pruebas tpicas en tubos con
del manitol ms bioqumicas a caldo BHI. Consultar
desarrollo cada tubo Cuadro 1
en BHI
PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento selectivo.

1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estril.

2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora
estril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estril al 0.1% o solucin amortiguadora
de fosfatos 0.1M de pH 7.2.
4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos
en licuadora a velocidad mnima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el nmero de diluciones est en
funcin de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm
conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.
6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con
agar Baird Parker.
7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla
de vidrio estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo
de inoculacin por extensin en superficie).
8. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el
agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 1 C. durante 45 a 48 h.
10. Despus de incubar, observar las colonias caractersticas de este
microorganismo en el agar Baird Parker (BP). stas se presentan como:
colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con dimetro de 1 a 2
mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

2. Recuperacin de la cepa.

1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias tpicas de S.

aureus, si no es posible, seleccionar las placas que contienen
concentraciones de la muestra ms diluidas, no obstante que contengan
ms de 150 colonias.
2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias tpicas, tambin
pueden ser utilizadas y al reportar se deber agregar la nota de valor
estimado.
3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el nmero de colonias a evaluar,
tomando en cuenta el nmero de colonias tpicas de S. aureus obtenidas en
el agar Baird-Parker: As mismo seleccionar las colonias para realizar las
pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas ltimas estn
comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.
4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son
caractersticas de este microorganismo, utilizando asa bacteriolgica recta
estril, en caldo infusin cerebro corazn.
5. Incubar a 35 1 C durante 24 h.
 6. Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 6538 y
S. epidermidis ATCC 12228, como controles positivo y negativo
respectivamente de las pruebas bioqumicas.

CUADRO 1. Nmero de colonias a evaluar de S. aureus.

Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar
en una caja representativa bioqumicamente
Menos de 50 UFC 3
51-100 UFC 5
101-150 UFC 7

3. Pruebas bioqumicas.

1. Realizar la confirmacin bioqumica del microorganismo, haciendo las pruebas

de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa.

3.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.

1. Con una pipeta estril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensin del

microorganismo que desarroll en el caldo infusin cerebro corazn, adicionar
0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a
volumen con solucin salina estril.
2. Incubar en bao Mara o en incubadora, entre 35 y 37 C y observar durante 6
h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formacin de cogulo,
prolongar el perodo de observacin hasta por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de
plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente
aadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un cogulo entre 10
a 15 segundos.

NOTA

Analizar la consistencia del cogulo y registrar sta, de acuerdo con los valores
del cuadro 2.

Considerar la prueba positiva solamente si hay formacin de cogulo con un valor

igual o superior a 2 cruces.

CUADRO 2. Interpretacin de las reacciones en la prueba de la coagulasa

VALOR CARACTERSTICA
negativa No se observa formacin de cogulo.
Formacin de cogulos pequeos
1+ (positiva)
desorganizados.
2+ (positiva) Formacin de cogulo pequeo organizado
3+ (positiva) Formacin de un gran cogulo organizado
 Todo el contenido del tubo est coagulado.
4+ (positiva) Al invertir el tubo este cogulo se mantiene
en el fondo del mismo.

3.2 Prueba de la enzima termonucleasa.

1. Calentar 0.3 mL de la suspensin del microorganismo que creci en caldo

infusin cerebro corazn durante 15 minutos en bao de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensin
bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estril. Es
recomendable incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC 6538), como
negativos (S. epidermidis ATCC 12228).
3. Incubar a 35 2 C en cmara hmeda, durante 4 a 24 h.
4. Despus de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los
orificios hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el
indicador de orto-toluidina).
5. La formacin de un color rosa brillante extendido por lo menos un milmetro
alrededor del orificio, en donde se inocul, indicar que el microorganismo
posee la enzima termonucleasa.
6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como
indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente
alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco.

NOTA

Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el indicador de

orto toluidina, por lo que despus de la incubacin se podr observar la coloracin
rosa en donde se inocul, en caso de encontrarse dicha enzima.

Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioqumicas: la fermentacin

de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima
catalasa; cuando ambas pruebas son positivas, quiere decir que el
microorganismo fermenta el manitol y produce cido en condiciones anaerbicas y
adems contiene la enzima catalasa.

3.3 Prueba de fermentacin de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige

la norma).

1. Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensin del microorganismo que

desarrollado en el medio infusin cerebro corazn.
2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5
mL de parafina o aceite mineral estril.
3. Incubar a 35C 2 C por 24 h. y observar los resultados.
4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el
indicador. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe
virar a color amarillo por la produccin de acidez.

3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma).

1. Con una asa bacteriolgica, tomar un inculo del caldo infusin cerebro
corazn despus de su incubacin, y colocarlo sobre un portaobjetos,
2. Adicionar una o dos gotas de perxido de hidrgeno al 30%, mezclar
perfectamente bien y observar los resultados.
3. Si se presenta formacin de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es
que s contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba
se interpretar como ausencia de esta enzima.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Para determinar el nmero de S. aureus enterotoxignico presentes en 1.0 g de

alimento se deben de considerar: a) el nmero total de colonias sospechosas y
caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el nmero de colonias que resultaron
positivas en las pruebas bioqumicas efectuadas.

Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodologa, se

encontr que la caja Petri representativa estadsticamente, contena 70 UFC
sospechosas de S. aureus (negras, brillantes con halo y precipitado blanco). stas
se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilucin 10-3 (0.001g/mL), como en
este mtodo se inoculan 0.1 mL el factor que hay que aplicar es 10 -4 (0.0001g)
para este caso. Tomando en cuenta el cuadro nmero uno, se tomaron 5 colonias
para caracterizarlas bioqumicamente.
De estas 5 colonias analizadas, solamente 2 resultaron positivas para las pruebas
de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa.
Para conocer Cuntas UFC/g de S. auresus toxignico, se encuentran en este
alimento? y se puede consumir el alimento?, el razonamiento es el siguiente:

a) determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxignico.

Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas, dos colonias positivas,

a qu porcentaje corresponden?, expresado en forma aritmtica es:

5 UFC 100%
2 UFC X
X= 40%

El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70

UFC en la caja sembrada con 0.1 mL de dilucin 10-3:
 70 UFC 0.0001 g (10 -4g)
X 1g
X= 700,000 UFC/g de alimento.

De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxignicas (tomando

en cuenta el primer clculo) entonces cuntas UFC toxignicas por gramo se
encuentran en este alimento?

700,000 UFC/g 100%

X 40%
X=280,000 UFC/g

Tomando en cuenta solamente 2 dgitos y potencias de 10, la forma correcta de

expresar el resultado es:

Staphylococcus aureus enterotoxignico= 28X104 UFC/g

Estas 280,000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g), de acuerdo con lo que estupula

la Norma Oficial Mexicana, el alimento se encuentra escasamente dentro de las
especificaciones, sin embargo en la legislacin estadounidense de acuerdo con lo
que estipula la FDA (Jablonski, 2001) presentan riesgo para la salud pblica; por
lo que no se debe consumir.

NOTA

No olvidar que la metodologa empleada es por extensin en superficie y que

solamente nmeros de unidades formadoras de colonias de S. aureus toxignico
superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicacin
alimentaria. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias
concretas del alimento estudiado, para determinar la aceptabilidad o rechazo del
alimento en funcin del nmero de UFC/g de alimento del microorganismo
estudiado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para
todos los alimentos en forma especfica, pero se deben desarrollar criterios a partir
de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o
rechazar un alimento.

Para elaborar un informe de resultados, se sugiere seguir las indicaciones que a

continuacin se expresan:

Cuando las UFC encontradas en una caja Petri, estn dentro del rango
estadstico (de 15 a 150 UFC/caja), se reporta como en el ejemplo antes
descrito.
Si se est en el valor estimado, esto es que no existen colonias tpicas, se debe
reportar la sensibilidad del mtodo, en este caso ser de 100 UFC/g para
muestras slidas y 10 UFC/mL en caso de muestras lquidas.
 Cuando todas las pruebas bioqumicas son negativas, se informar:
< 10 UFC/mL en muestras lquidas de la dilucin 1:10
< 100 UFC/g para muestras slidas de la dilucin 1:10

BIBLIOGRAFA.

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