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1. Introduccin
2. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
3. Consideraciones generales sobre la cromatografa de elucin
4. Anlisis qumico con mtodos cromatogrficos
5. Cromatografa de gases
6. Cromatografa de lquidos
1. INTRODUCCIN
La mayora de los mtodos de anlisis son en los casos ms favorables selectivos,
pero no especficos. Por ello, cuando se trata de muestras complejas la separacin del
analito de de las posibles interferencias es una etapa esencial. An mejor sera la
posibilidad de determinar varios analitos despus de una separacin previa.
Uno de los mejores mtodos para conseguir esa separacin, y posiblemente, el ms
utilizado es la cromatografa. Este conjunto de tcnicas permite la separacin de
componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. La cromatografa en
sus orgenes era exclusivamente una tcnica de separacin que se transform en
tcnica de anlisis cuando se acopl con un dispositivo para monitorizar las especies
qumicas que se iban separando. As, la cromatografa se ha convertido en un mtodo
analtico de primer orden para separar, identificar y cuantificar los compuestos
presentes en muestras lquidas o gaseosas (para muestras slidas se requiere una
etapa de disolucin o extraccin).
En cromatografa, los solutos se separan en base a la distinta velocidad de
desplazamiento cuando son arrastrados por una fase mvil a travs de un lecho
cromatogrfico que contiene a una fase estacionaria (slida o liquda).
La muestra se disuelve en la fase movil y se hace pasar a travs de la fase
estacionaria (inmiscible con la mvil) que se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie plana. Las dos fases se eligen de tal modo que los componentes de la
muestra se distribuyen de modo distinto entre las dos fases. Aquellos que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de
fase mvil, mientras que los que se retiene dbilmente avanzan con ms rapidez.
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Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse segn diferentes criterios:
atendiendo al modo como las fases se ponen en contacto y atendiendo a fundamento
del proceso de separacin. En este ltimo caso en definitiva se trata de la naturaleza
de las fases y del tipo de interacciones que tienen lugar entre lso solutos y las fases
utilizadas.
Clasificacin atendiendo al fundamento de la separacin (naturaleza de las fases
y tipo de interacciones):
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- cromatografa de particin o reparto la fase estacionaria es un lquido retenido por
impregnacin o por enlace sobre un slido inerte. Se basa en equilibrios de
distribucin.
C. CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS (la fase mvil es un fluido
supercrtico)
Un fluido supercrtico es un fluido calentado a t y P superiores a las crticas. Posee
algunas caractersticas propias de un gas y algunas propias de un lquido. la fase
estacionaria puede ser lquida o slida.
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de un pico representa la elucin de un componente de la muestra. la separacin se
completa cuando el cromatograma presenta tantos picos como compuestos formaban
parte de la mezcla objeto de anlisis.
Un constituyente se caracteriza por su tiempo de retencin tR , que representa el
tiempo transcurrido entre el instante de la introduccin de la muestra en la columna y
el momento en que dicho constituyente alcanza el mximo de seal en el detector.
Tambin se emplea el llamado tiempo de retencin reducido o ajustado, que es la
diferencia entre el tiempo de retencin de un constituyente y el tiempo muerto. El
tiempo muerto (tm) se define como el tiempo necesario para que un constituyente no
retenido (o la fase mvil) llegue al detector.
Se habla tambin en cromatografa del factor de retencin (k) de un componente, que
se define como:
t R tm
k=
tm
cuanto mayor sea el tiempo que un componente es retenido en la columna mayor es
su factor de retencin.
Muy frecuentemente se considera un trmino denominado coeficiente de reparto o
coeficiente de distribucin (K):
Cs
K=
Cm
Donde Cs y Cm son las concentraciones del componente considerado en la fase
estacionaria y movil, respectivamente. Coeficientes de distribucin grandes favorecen
una buena separacin entre distintos componentes pero incrementan el tiempo
necesario para la elucin, lo que provoca un ensanchamiento de la banda del
componente. Se debe por lo tanto buscar una solucin de compromiso.
Desde el descubrimiento de la cromatografa se han propuesto diferentes teoras para
conseguir una explicacin del modelo cromatogrfico. Una de las ms conocidas es la
teora de platos. Aunque se trata de un modelo antiguo, hoy considerado obsoleto,
permite describir de forma sencilla las separaciones. Consiste en considerar la
separacin cromatogrfica como una serie de equilibrios sucesivos de distribucin
entre las fases mvil y estacionaria a medida que el soluto avanza por la columna.
Estos equilibrios sucesivos se basan en el concepto de plato terico, segn el cual se
puede imaginar la columna dividida de longitud L dividida en N segmentos en cada
uno de los cuales se establece un equilibrio. As aunque la cromatografa es un
proceso continuo este modelo es un enfoque esttico, que reproduce la migracin del
soluto en la columna mediante el encadenamiento de una serie de etapas estticas. El
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trmino plato terico proviene de la teora de platos descrita para la destilacin, y
aunque no tiene ningn significado fsico real se ha aceptado y conservado
universalmente.
La eficacia de una columna para separar solutos depende del nmero de platos
tericos. A mayor nmero de platos tericos mejor es la separacin. Para una columna
de longitud dada, la eficacia de la separacin ser tanto mejor cuanto menor sea la
altura equivalente de plato terico (H):
H = L/N
En las expresiones consideradas hasta el momento solo se ha tenido en cuenta la
naturaleza del componente y de las fases mvil y estacionaria para alcanzar los
equilibrios sucesivos. Sin embargo, la fase mvil se desplaza a travs de la fase
estacionaria con cierta velocidad. Por tanto, el movimiento del soluto no puede ser
completamente descrito en trminos de equilibrio, pues estaramos suponiendo que el
equilibrio se alcanza infinitamente rpido. Evidentemente, la velocidad de la fase mvil
debe tener una incidencia en el avance de los solutos, su dispersin y por tanto en la
eficacia de la separacin.
La primera ecuacin cintica que describi la influencia de la fase mvil en la eficacia
de la columna es la ecuacin de van Deemter, quien la desarroll para columnas
empaquetadas en cromatografa de gases. Posteriormente se han propuesto
ecuaciones para otros tipos de columnas (capilares) y para cromatografa lquida. Aqu
nos referiremos exclusivamente a la ecuacin de van Deemter. Esta ecuacin
relaciona la altura equivalente de plato terico (H) con la velocidad lineal media de
caudal de la fase movil (v):
B
H = A+ + Cv
v
A, B y C son constantes caractersticas de cada columna. Se comprueba que existe
un caudal ptimo para cada columna, correspondiente al mnimo de la curva
representativa de esta ecuacin. La explicacin de este comportamiento se obtiene
considerando los distintos mecanismos que contribuyen al aumento de la altura
equivalente de plato terico. Podemos imaginar estos factores como aquellos que
provocan el ensanchamiento de la banda de un constituyente que se mueve a travs
de la fase estacionaria arrastrado por la fase mvil. Todos aquellos fenmenos que
contribuyen al ensanchamiento de banda disminuyen la eficacia de la separacin.
Estos fenmenos responsables del ensanchamiento de zona son:
- Difusin longitudinal: el soluto tiende a difundir hacia los bordes de la zona,
ensanchando la banda. Cuanto menor es el caudal de fase mvil mayor es el
ensanchamiento por difusin. (Trmino B/v).
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- Transferencia de masa entre las fases: es responsable del trmino Cv, ya que
el soluto requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases mvil y
estacionaria, cuando el caudal es demasiado rpido no puede alcanzarse el
equilibrio.
- Difusin turbulenta. Est relacionado con el perfil de caudal de la fase mvil a
travs de la fase estacionaria. El tamao de las partculas de relleno, su
distribucin por tamaos y su regularidad son el origen de la formacin de
caminos preferentes. Por tanto, el soluto puede recorrer mltiples trayectorias
de distinta longitud aleatoriamente. Este trmino (A) es independiente de la
velocidad de la fase mvil.
As la eficacia mxima de separacin se obtiene cuando la altura equivalente de plato
terico (H) es mnima. Para velocidades menores que la ptima la difusin longitudinal
causa un ensanchamiento de la banda y con ello un incremento de H. Para
velocidades mayores que la ptima la dificultad para alcanzar el equilibrio entre las
fases hace que la banda se extienda. Para un tipo dado de fase estacionaria cuanto
menor es el tamao de partcula mejor es la eficacia de la separacin, ya que el soluto
debe recorrer menores distancias para alcanzar el equilibrio. El problema es que
cuanto menores son las partculas de relleno mayor resistencia se opone al flujo de
fase mvil por lo que hay que trabajar con alta presin.
Z 2Z 2 [(t R )B (t R )A ]
Rs = = =
wA 2 + wB 2 wA + wB wA + wB
Cuanto mayor sea Rs mejor separados estarn los picos cromatogrficos de los
componentes A y B. La resolucin de una columna aumenta al aumentar el nmero d
platos tericos de la misma y por lo tanto al aumentar la longitud.
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En gradiente: las caractersticas de la elucin se van modificando durante la
separacin. Con ello puede conseguirse una mejor resolucin de mezclas complejas.
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parmetro cuantitativo se emplea ahora la relacin entre el area de pico del
componente de inters y el area de pico del estndar interno. De este modo se
compensan variaciones en el volumen de muestra inyectado. Entre los requisitos que
debe cumplir el estndar interno es que su pico cromatogrfico se encuentre bien
resuelto respecto a los que constituyen la muestra y que no debe encontrarse
inicialmente en la muestra.
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5. CROMATOGRAFA DE GASES
1. Introduccin
2. Componentes bsicos de un cromatgrafo de gases.
3. Anlisis cuantitativo empleando cromatografa de gases
4. Preparacin de muestras ambientales para cromatografa de gases
5. Aplicaciones ms relevantes en medio ambiente
5.1. Introduccin
En cromatografa de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de la
columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil gaseosa.
La fase mvil en cromatografa de gases es un gas inerte, es decir, no interacciona
con las molculas de analito, slo las transporta a travs de la fase estacionaria.
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cmara est unos 50 grados centgrados por encima de la temperatura de
volatilizacin del componente menos voltil de la muestra. El volumen de muestra
inyectado es de unos pocos microlitros. Las columnas denominadas capilares
necesitan mucha menor cantidad de muestra, por ello suele usarse un divisor de
muestra, que permite pasar a la columna slo una pequa fraccin del volumen
inyectado desechando el resto. Este sistema de inyeccin manual tiene como principal
inconveniente la poca reproducibilidad de la inyeccin. Esto puede mejorarse con
inyectores automticos.
3. Columna cromatogrfica situada en horno termostatizado. En ella se va a
producir la separacin de los analitos.existen dos tipos de columnas, la columnas
empaquetadas (o de relleno) y las capilares (o tubulares abiertas). Las empaquetadas
son columnas rellenas con un soporte slido de grano muy fino que bien actua como
fase estacionaria o est recubierto de una fina capa de fase estacionaria lquida no
voltil. El soporte ideal son pequeas partculas esfericas de tamao uniforme y gran
superficie especfica. El material debe ser inerte y resistente a elevadas temperaturas.
El soporte ms usado es la tierra de diatomeas, consistente en los esqueletos de slice
de algas microscpicas. Estas columnas poseen dimetros de 3-6 mm y longitud de 1-
5 metros.
Las columnas tubulares abiertas o capilares son ms estrechas (0.2-0.5 mm) y
suelen ser mucho ms largas (10-100 m). La pared interior de la columna se recubre
con una pelcula de la fase estacionaria, (slida o lquida) con un espesor de unas
pocas micras. De este modo al no existir la oposicin del relleno al paso del gas
pueden hacerse ms largas. Estas columnas poseen una menor AEPT que las
columnas empaquetadas, pues el termino A de la ecuacin de van Deemter, asociado
a la multitud de trayectorias posibles desaparece. La cantidad de muestra necesaria
para estas columnas es menor que para las empaquetadas. Todo ello se traduce en
que las columnas capilares poseen mucha mejor resolucin, mayor sensibilidad y
necesitan menor tiempo de anlisis. Por ello prcticamente han reemplazado por
completo a las empaquetadas.
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Existe una gran variedad de fases estacionarias lquidas. La seleccin de una u otra
suele hacerse empricamente. Debe buscarse que la fase estacionaria disuelva los
componentes de la mezcla separar de forma diferente, que no queden muy retenido ni
tampoco demasiado poco. En general suele seguirse el principio de que lo semejante
disuelve a lo semejante. As, se utilizan fases estacionarias polares para separar
compuestos polares, dichas fases suelen tener grupos tipo CN, -CO, -NH. Las fases
estacionarias apolares se emplean para separar compuestos apolares.
Adems del empleo de lquidos no voltiles como fases estacionarias, es cada vez
ms frecuente el uso de fases enlazadas. Se trata de molculas unidas
covalentemente al soporte slido para minimizar la prdida de fase lquida de la
columna.
La columna cromatogrfica se encuentra en el interior de un horno termostatizado, ya
que la temperatura es una variable crucial en las separaciones por cromatografa de
gases. La temperatura afecta al equilibrio de distribucin de los analitos entre la fase
mvil y estacionaria. Cuando se aumenta la temperatura de la columna se acelera la
elucin. La temperatura ptima reflejar un equilibrio entre la consecucin de la
resolucin necesaria y la velocidad de la separacin. Puede trabajarse a temperatura
constante (isotrmicamente) o con programacin de temperaturas (en gradiente o
rampa de temperatura). Esta ltima modalidad permite separar grupos de compuestos
con volatilidad muy variada en periodos de tiempo ms breves.
4. Detectores. El detector es el sistema encargado de poner de manifiesto la
presencia de solutos que salen de la columna cromatogrfica. Se han usado muchos
detectores. Las caractersticas de un detector ideal en cromatografa de gases son:
- adecuada sensibilidad
- buena estabilidad y reproducibilidad
- respuesta lineal en un intervalo amplio de concentracin
- amplio intervalo de temperatura de trabajo
- tiempo de respuesta corto
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compuestos orgnicos al quemarse producen iones y electrones, que pueden conducir
la corriente electrica. Se mide la intensidad de corriente entre dos electrodos situados
a los lados de la llama. Es uno de los detectores ms utilizados, debido a su respuesta
casi universal a los compuestos orgnicos. Solo los gases no combustibles, como
CO2, SO2, oxidos de nitrgeno N2O, NO, NO2, NH3 no producen respuesta en este
detector. Este detector posee elevada sensibilidad (10-13 g/s), amplio intervalo lineal de
respuesta (107) y bajo ruido de fondo. Se trata de un detector destructivo.
b) Detector de conductividad trmica. Este detector responde a cualquier soluto
cuya conductividad trmica sea diferente de la del gas portador. Este trmino se
refiere a la capacidad de una sustancia de transportar calor de una regin caliente a
una fria. El funcionamiento se basa en la disminucin de la conductividad del gas
portador cuando un soluto sale de la columna. Se suele usar he generalmente por su
elevada conductividad termica. Se emplea un filamento calentado elctricamente cuya
resistencia depende del calor disipado. Se necesita una referencia, un gas que no
pasa por la columna. Este dtector sensible que el anterior y suele emplearse para
aquellas especies que no producen respuesta en el FID, puesto que responde a
cualquier compuesto cuya conductividad trmica sea diferente a la del gas portador.
Es un detector no destructivo, por lo que puede emplearse en serie con otros y as
mejorar la cantidad de informacin obtenida.
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acoplamientos de cromatgrafos con detectores ms potentes, que proporcionan
mucha mayor cantidad de informacin cualitativa. EJ. Con espectroscopia infrarroja.
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- Cromatografa de espacio de cabeza: se utiliza para determinar los
constituyentes volatiles de muestras slidas o lquidas analizando la fase de vapor que
se encuentra en equilibrio termodinmico con la muestra en un recipiente cerrado. Un
calentamiento suave favorece el establecimiento de este equilibrio.
- Tcnica de Purga y Atrapamiento: cosnsite en extraer los componentes
volatiles de una muestra lquida, generalmente acuosa usando un gas inerte de purga.
Generalmente depus los compuesto son retenidos en un adsorbente que luego se
somete a calentamiento para liberalos en introducirlos en el cromatografo.
Anlisis de compuestos orgnicos en general, para los que se emplea el detector FID.
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6. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
1. Introduccin
2. Instrumentacin
3. Cromatografa de particin
4. Cromatografa de adsorcin
5. Cromatografa inica
6. Cromatografa de exclusin por tamaos
6.1 Introduccin
Entre las tcnicas cromatogrficas cuya fase mvil es un lquido la cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC) es la ms utilizada. Esta tcnica deriva de una
evolucin de la cromatografa preparativa en columna, en la que la cromatografa se
realizaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500
cm. Para que el flujo de fase mvil fuese razonablemente rpido las partculas de fase
estacionaria deban ser de gran dimetro (150-200 m), lo que se traduca en una
separacin poco eficaz y, a pesar de todo, lenta. Para aumentar la eficacia de la
separacin y as incrementar la resolucin era necesario emplear fases estacionarias
con tamao de partcula mucho menor (entre 2 y 5 m), ya que la difusin de los
solutos entre las fases mvil y estacionaria se hace ms rpida. Pero ello implica la
necesidad de impulsar la fase mvil con un sistema de alta presin, nace as la
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
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de bombeo en HPLC son muy rigurosos ya que en algunos detectores las
fluctuaciones en el flujo de fase mvil dan lugar a fluctuaciones de la seal,
produciendo un ruido de fondo que impide la observacin de seales dbiles. En
HPLC es deseable que el control y la reproducibilidad del caudal de fase mvil sean
mejores que el 0.5%. Existen diferentes tipos de bombas de alta presin con distintas
caractersticas, ventajas e inconvenientes. Las ms frecuentes son bombas de pistn.
c) Columna cromatogrfica
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Las columnas de HPLC son tubos rectos de acero que miden entre 3 y 30 cm de
longitud. Su dimetro entre 2 y 5 mm. La fase estacionaria se mantiene entre dos
discos porosos situados en los extremos de la columna.
En HPLC se emplean dos tipos de relleno para las columnas:
- Relleno pelicular: se utilizan bolitas de vidrio o polmero no porosas esfricas de
dimetro entre 30-40 m. Sobre su superficie se deposita una capa delgada de
partculas muy pequeas (2-5 m) gel de slice, almina o un cambiador inico que
actan como fase estacionaria. Si la fase estacionaria es lquida se coloca una fina
pelcula de lquido sobre las esferas no porosas.
- Partculas porosas: se trata de micropartculas porosas con tamaos entre 3-10 m
de slice, almina o cambiadores inicos, que actan como fases estacionarias.
Tambin pueden recubrirse con pelculas orgnicas lquidas retenidas por adsorcin.
Son mas fciles de empaquetar pero menos eficaces que las segundas
Adems pueden emplearse fases enlazadas, que son generalmente partculas de gel
de slice modificadas qumicamente. Estas resultan mucho ms estables que los
lquidos retenidos fsicamente.
Muchas veces para alargar la vida de la columna analtica se atizan precolumnas con
objeto de retener impurezas de la muestra que podran perjudicar la columna
croamatografica. El relleno de la precolumna es similar al de la columna analtica pero
con mayor tamao de partcula.
d) Detector
Un detector ideal en HPLC debe ser sensible a pequeas concentraciones de analito,
dar una respuesta lineal amplia, tener poco ruido de fondo y ser estable en el tiempo
que dura el cromatograma. Adems, en caso de que se utilice gradiente debe ser
insensible a los cambios de composicin de la fase mvil. Es tambin importante que
la celda de flujo del detector tenga un volumen mnimo para no provocar
ensanchamiento de las bandas. La mayora de los detectores empleados responden a
alguna propiedad caracterstica de los compuestos a analizar aunque existen tambin
detectores que responden a la variacin de una propiedad de la fase mvil debido a la
presencia de solutos.
Algunos de los detectores ms usados son:
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Detectores espectrofotomtricos. Miden la absorbancia a una o varias longitudes de
onda en el ultravioleta o en el visible. La fase mvil no debe ser muy absorbente. Es
muy frecuente emplear deteccin en UV a 254 nm donde absorben gran cantidad de
compuestos orgnicos. En instrumentos ms verstiles pueden seleccionarse otras
longitudes de onda e incluso registrar espectros completos. Este detector puede
emplearse con gradiente si se utilizan disolventes no absorbentes.
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Se trata probablemente del tipo ms usado de cromatografa lquida de alta resolucin.
En ella se considera tanto el uso de fases lquidas retenidas sobre un soporte slido
como el de fases enlazadas unidas qumicamente al soporte slido.
La separacin de los solutos se basa en la diferente solubilidad entre las fases mvil y
estacionaria. En general la fase estacionaria debe tener polaridad semejante a la de
los analitos y la fase mvil se escoge de diferente polaridad (aunque no tan diferente
que el tiempo de retencin sea excesivamente largo).
Una vez fijada la fase estacionaria las caractersticas de la fase mvil son el factor
clave de la separacin cromatogrfica. Las fases mviles se caracterizan por los su
capacidad de desplazamiento y selectividad. En fase normal los disolventes polares
eluyen ms rpidamente (tienen mayor capacidad de desplazamiento) mientras que en
fase inversa es al revs. La selectividad se basa en las interacciones especficas entre
el soluto y la fase mvil. Puede emplearse elucin isocrtica o en gradiente.
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para la determinacin de iones grandes, como los surfactantes. Tambin ha ofrecido
buenos resultados para iones como nitrato (NO3-) y clorato (ClO3-).
Los rellenos de cambio inico empleados como fases estacionarias suelen ser
polmeros activados introduciendo en su estructura grupos funcionales cargados,
generalmente cidos o bsicos. Son frecuentes por ejemplo los cambiadores con
grupos -SO3-, -COO-, -NR4+.
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La fase mvil en cromatografa de cambio inico suele ser una disolucin acuosa (con
cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua) que
contiene especies inicas en forma, generalmente, de disolucin reguladora del pH
(variable clave en la elucin). Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por
los sitios activos de la fase estacionaria. Por ello, la fuerza eluyente y la selectividad
de la fase mvil dependen del tipo y concentracin de iones aadidos.
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La cromatografa inica tiene importantes aplicaciones en anlisis de aguas. La
determinacin de cationes funciona bien para alcalinos y alcalinoterros. Para otros
cationes la diferencia en los coeficientes de selectividad no es suficiente para permitir
la separacin directa y son necesarios otros mtodos como la formacin de especies
que si presenten ms diferencia. En cambio, para la determinacin de aniones en
aguas resulta uno de los mejores mtodos posibles. Con cromatografa inica pueden
determinarse los iones ms habituales de forma mucho ms rpida que empleando
mtodos individuales de anlisis para cada uno.
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