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Objetivos
Objetivo general:
- Aislar e identificar microorganismos con capacidad amiloltica procedentes de
tierras frtiles, compostas, cscara de papa y saliva humana.
Objetivos especficos:
1. Recolectar y procesar muestras de diferentes fuentes para obtener
microorganismos productores de amilasas
2. Formular e inocular medios de cultivo de microorganismos productores de
amilasas
3. Aislar y seleccionar microorganismos productores de amilasa
4. Evaluar cepas mediante el test de lugol para seleccionar las de mayor actividad
amiloltica
5. Identificar cepas con mayor actividad amiloltica mediante pruebas bioqumicas.
Marco terico
La biotecnologa es la aplicacin de los principios cientficos y tcnicos al
tratamiento de materiales por los agentes biolgicos para obtener los productos
utilizados en las industrias farmacuticas, biomdicas, de alimentos y de
transformacin de materias primas. El uso de la biotecnologa desde la primera
mitad de nuestro siglo se fundamenta en las propiedades de las enzimas y
persigue principalmente mejorar las cualidades de los alimento (Lpez, 2014)
El uso de microorganismos en esta rama tiene como propsito la obtencin de
productos ampliamente usados en la industria; Las enzimas son polmeros
formados por aminocidos covalentemente unidos entre s, que catalizan en los
organismos una gran variedad de reacciones qumicas. Su actividad cataltica
depende de que mantengan su plegamiento y de la estructura tridimensional que
presentan; dicha estructura forma cavidades, llamadas sitios activos, los cuales
muestran afinidad por ciertas molculas especficas llamados sustratos. En
combinacin con los diferentes grupos funcionales que presenta el sitio activo y el
sustrato se generan interacciones covalentes y no covalentes, formando un
complejo llamado Enzima-sustrato que da lugar a un producto. Las enzimas se
encuentran clasificadas en 5 grandes clases o grupos, en funcin de su accin
cataltica especfica: xidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, ligasas
(Ramrez y Ayala, 2014).
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En el presente trabajo nos centraremos en las hidrolasas. Actan en la reaccin
de la degradacin del almidn
-amilasa
Las -amilasas pertenece a una familia de endo-amilasas que cataliza la hidrlisis
inicial del almidn en oligosacridos ms cortos a travs de la escisin de enlaces
-D- (1-4) glicosdicos como se muestra en la figura1.
Los productos finales de la accin de la -amilasa son oligosacridos de longitud
variable con una configuracin y dextrinas -limitadas, que constituyen una
mezcla de maltosa, maltotriosa y oligosacridos ramificados de 6-8 unidades de
glucosa que contienen tanto - 1,4 y -1,6 Otras enzimas amilolticas participan en
el proceso de descomposicin del almidn, pero la contribucin de la -amilasa es
la ms importante para el inicio de este proceso (Monteiro y Oliveira, 2010). La
actividad hidrolitica se encuentra a un pH de 7 (Sundarram y Krishna, 2014).
-amilasa
Las -amilasas son enzimas exo-hidrolasas que acta a partir del extremo no
reductor de una cadena polisacrida por hidrlisis de enlaces -1, 4-glucano para
producir unidades sucesivas de maltosa. Dado que es incapaz de escindir enlaces
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ramificados en polisacridos tales como glicgeno o amilopectina, la hidrlisis es
incompleta y quedan unidades de dextrina. Las fuentes primarias de -amilasa
son las semillas de las plantas superiores y las papas. El pH de la enzima oscila
entre 4,0 y 5,5 (Sundarram y Krishna, 2014).
y-amilasa
Las -amilasas escinden los enlaces glucosdicos (1-6), adems de romper los
ltimos enlaces (1-4) glicosdicos en el extremo no reductor de amilosa y
amilopectina, a diferencia de las otras formas de amilasa produciendo glucosa. La
obtencin de este tipo de amilasa es ms eficiente a un pH de 3 (Sundarram y
Krishna Murthy, 2014).
Almidn
El almidn es un polmero de glucosa unido entre s a travs del enlace entre el
oxgeno y C1, conocido como enlace glicosdico. Este enlace glicosdico es
estable a pH alto, pero se hidroliza a pH bajo. Al final de la cadena polimrica est
presente un grupo aldehdo latente. Este grupo se conoce como el extremo
reductor.
En el almidn estn presentes dos tipos de polmeros de glucosa: (i) amilosa y (ii)
amilopectina. La amilosa es un polmero lineal que consta de hasta 6000 unidades
de glucosa con enlaces 1-4 glicosdicos (Van der Maarel et.al, 2002).
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Figura 2 Diferentes enzimas involucradas en la degradacin del almidn
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que el detergente sea ambientalmente seguro. As mismo se emplea en la
produccin de alcohol. Las -amilasas tambin se utilizan en la industria de la
panadera, en la industria textil para el proceso de desensado y en la industria del
papel para la modificacin de almidn de papel revestido (Monteiro y Oliveira,
2010).
Test de lugol
Las cepas productores de enzimas hidrolticas del almidn se detectan al observar
un halo de degradacin del almidn, es decir, un crculo claro alrededor de las
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colonias amloliticas. Este halo se produce debido a la ausencia de almidn en el
medio; ya que en la presencia de almidn el lugol se acompleja con el polisacrido
dando una coloracin negra azulada (Gonzlez, 2004).
Aplicacin espectrofotomtrica
Dicho mtodo tiene una aplicacin espectrofotomtrica en la que la absorbancia
se puede leer despus de que se haya terminado la reaccin del sustrato
enzimtico. Esto da una medida de la magnitud de hidrlisis del almidn por -
amilasa (Sundarram y Krishna, 2014).
Tincin de Gram
Esta tcnica diferencia las bacterias en dos variedades fundamentales de clulas.
Se dice que las bacterias que conservan la coloracin inicial por el cristal violeta
(prpura) son "gram-positivas", mientras que las que se decoloran y se tien de
safranina se dice que son "gram-negativas". Esta respuesta de tincin se basa en
las caractersticas qumicas y estructurales de las paredes celulares de las
bacterias. Los gram positivos tienen una pared gruesa y relativamente
impermeable que resiste la decoloracin y est compuesta por peptidoglicano y
polmeros secundarios; mientras que los gram negativos tienen una delgada capa
de peptidoglicano ms una bicapa lipoproteica conocida como membrana externa
que puede ser decolorada (Beveridge, 2001).
Pruebas bioqumicas
La identificacin del microorganismo se realiza con una serie de pruebas de
caracterizacin que incluye: forma y disposicin celular, tipo de metabolismo,
propiedades tintoriales, etc. aunado a las pruebas bioqumicas, las cuales
permiten determinar las caractersticas metablicas de las bacterias para su
clasificacin. Algunas de estas pruebas son tcnicas rpidas, ya que evalan la
presencia de una enzima preformada y su lectura vara en funcin de los
reactivos, las condiciones de incubacin y el tiempo de lectura (Cantn, 2010).
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Justificacin
Hoy en da, el potencial uso de microorganismos como fuente biolgica de
enzimas industrialmente econmicas ha estimulado el inters en la explotacin de
la actividad enzimtica extracelular en varios microorganismos. (Basma et.al.,
2015). Debido a la importancia que conlleva el uso de enzimas que hidrolizan
polmeros complejos como el almidn para la obtencin de azcares de inters
industrial, surge la necesidad de encontrar nuevas fuentes enzimticas en
microorganismos como las bacterias. Por lo que la presente investigacin se basa
en el aislamiento, comparacin e identificacin de bacterias con actividad
amiloltica, a partir de fuentes ricas en almidn.
Hiptesis
Metodologa
1.1. Obtencin, transporte y procesamiento de la muestra
1.1.1. Tierras frtiles y composta:
a) Recolectar las muestras de distintos tipos de suelo, introducir la
pala aproximadamente 20 cm y transferir la muestra a una bolsa
resellable. (Tomar varios puntos de muestreo en un mismo lugar
para formar una muestra compuesta).
b) Transportar a temperatura ambiente.
c) Una vez en el laboratorio suspender 1g de la muestra (1X10 8
UFC/g) (Calvo y Zuiga, 2008) en 10 mL de agua destilada con
agitacin mecnica durante 15 minutos.
d) A partir de la suspensin preparada realizar una dilucin 1:10.
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e) Repetir el inciso (d) 4 veces ms para llegar a una dilucin 1X10 2
UFC/mL
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2.2. Inoculacin de las muestras en los medios de cultivo
2.2.1. Sembrado por esparcido
a) Colocar 100 L de las 3 ltimas disoluciones de cada muestra en el
centro de una placa de agar almidn con cicloheximida.
b) Extender con varilla de vidrio estril (o esptula de Drigalsky)
mientras se hace girar la caja.
c) Invertir la placa e incubar de 24 36 horas.
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d) Del caldo preparado anteriormente aadir 25 mL a cada matraz
Erlenmeyer (10 matraces de 50 ml)
e) Esterilizar por 15 min a 121C
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Fuente: Manual de Bergey
Referencias
o E. Basma T., El-Sawy M., Gamal R.F, Abou-Taleb K.A. (2015). Production
of amylases from Bacillus amyloliquefaciens under submerged
fermentation using some agro-industrial by-products. ELSEVIER,
60(2), pp 193-202.
Mxic
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o Beveridge TJ. (2001). Use of the gram stain in microbiology. Biotech
Histochem, 76(3), pp 111-8.
o Calvo V., P., Reymundo M., L., & Zuiga D., D. (2008). Estudio de las
poblaciones microbianas de la rizsfera del cultivo de papa (Solanum
tuberosum) EN ZONAS ALTOANDINAS. Ecologa Aplicada , 141-148.
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o Snchez, C., Mejia, C., Figueroa, M., Esquivia, M. Agudelo, L., Zapata, N.
(2004) Estudio de cepas nativas amiloliticas. Revista de la facultad de
qumica farmaceutica, 12(2), pp 21-28.
o Van der Maarel M., Van der Veen B., Uitdehaag J., Leemhuis H., Dijkhuizen
L. (2002). Properties and applications of starch-converting enzymes of
the -amylase family. Journal of Biotechnology, 94(2), pp 137-155.
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