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Practica N 7. TINCIONES SIMPLES Y COMPUESTAS PARA BACTERIAS. ; William Tlaga Taquinas, 112093 Yeiner Humberto Taquinas Peteche; 112095.

Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira.

RESUMEN. Las tinciones simples y diferenciales permiten determinar la forma y estructura que presentan las bacterias, tienen amplio uso en la microbiologa, uno de ellos es en la taxonoma bacteriana, para separar grandes grupos como las Gram. Con el propsito de observar las principales estructuras bacterianas aisladas de hojas de pitahaya, se realiz un frotis fijo para las tinciones que fueron: Gram, flagelos, endosporas y capsulas bacterianas, y se utiliz los colorantes: cristal violeta, Lugol, verde malaquita, safranina y el alcohol-acetona al 95% como decolorante. Las placas obtenidas se observaron en el microscopio al objetivo de inmersin 100x. Se obtuvo como resultado que la bacteria pertenece al grupo de las Gram positivas, que presento endosporas y no flagelos ni capsulas. Palabras claves: Tincin diferencial, Colorantes, Frotis. INTRODUCCION. Loa microrganismo son seres pequeos y su protoplasma posee un ndice de refraccin cercano al del agua, por lo cual se requiere generalmente de tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente. Las tinciones se preparan en soluciones acuosas y orgnicas de colorantes o de grupo de colorantes que confieren una variedad de colores a los microrganismos.(http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albe rtorojastrivino.2011.pdf. Consultado en Octubre de 2012). La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen un grupo benceno ms un grupo cromofro, con alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Los colorantes catinicos mas usados son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. (http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_an io/biotecnologia/practico4.pdf, Consultado Octubre de 2012). Estos colorantes son utilizados en muchas ocasiones para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas. Las tinciones diferenciales permiten separar grupos (Tincin de Gram; Tincin acido-resistente), visualizar estructuras (Tincin de: flagelos, capsulas, esporas y grnulos); por otro lado las tinciones simples permiten definir la morfologa bacteriana (cocos, bacilos, etc) y las agrupaciones (ttradas, cadenas, etc) (http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.20 11.pdf. Consultado en Octubre de 2012). MATERIALES. Para las tinciones de flagelos, endosporas, capsulas y Gram se utilizaron los siguientes materiales: 1 Asa Bacteriolgica, 1 mechero Bunsen, 1 bandeja para tincin, papel filtro o toalla, 10 portaobjetos desengrasados, 10 cubreobjetos desengrasados, Aceite de inmersin, 1 microscopio binocular compuesto, 6 pipetas Pasteur plsticas, 1 hornilla elctrica, papel para ptica, colorante Cristal violeta, azul de metileno, Lugol de Gram, Alcohol-acetona, safranina, verde malaquita, fucsina, 1 Cultivo Bacteriano en agar Nutritivo sembrado por agotamiento, 1 cultivo bacteriano en caldo nutritivo de 18-24 horas, cido sulfrico 1%, azul de metileno de Zeehl-Neelsen. 1 pinza metlica, 1 rejilla metlica, 1 Beaker de 1000 mL, reactivo de Hiss, reactivo de Albert, tinta china, colorante de Leifson, solucin de fenol 5%, Fuschina carblica de Zeehl-Neelsen. METODOS. Tincin de Gram para bacterias. Se elabor una frotis fija y se sumergi la placa en Cristal Violeta por 1 minuto, se retir se lav con abundante agua destilada para eliminar el exceso de colorante, se sumergi la placa en Lugol (Solucin de Iodo-Ioduro de Potasio), por 1 minuto, se retir la placa y se lav con agua destilada despus se sumergi la placa en solucin decolorante de Alcohol Acetona por 30 segundos, se retir la placa se lav con agua destilada y se sumergi en solucin de contraste Safranina y se dej actuar al colorante por 45 segundos, se retir la placa se lav con agua destilada para eliminar el exceso de colorante y se dej secar la placa a temperatura ambiente, se llev la placa al microscopio y observo hasta el objetivo de inmersin 100x. Tincin de cpsulas bacterianas (Tincin negativa). En uno de los extremos de un portaobjetos se coloc tinta china, se Tom con asa bacteriolgica estril una alcuota de la bacteria (contenida en la caja de agar nutritivo) y se emulsion sobre la tinta china, luego con un cubreobjetos se extendi la muestra preparada (tinta china + inoculo), se dej secar a temperatura ambiente y se sumerga la placa en Safranina para que permitiera actuar el contraste por 1-2 minutos, se retir la placa y se lav suavemente retirando el exceso de colorante, se sec a temperatura ambiente, se mont al microscopio y se observ al objetivo de inmersin 100x.

Tincin de endosporas bacterianas (Schaeffer-Fulton). Se elabor una frotis y se le coloc sobre ella un segmento de papel de filtro; con una pinza se sujet, y se cubri el papel filtro con abundante colorante Verde malaquita. Se calent al mechero por 5 minutos sin dejar secar la preparacin, adicionando colorante, se retir el papel de filtro y sumergi la placa en colorante de contraste Safranina por 1 minuto, se retir la placa y lavo con agua destilada para eliminar el exceso de colorante, se sec a temperatura ambiente y se mont al microscopio en el objetivo de inmersin 100x.

Tincin de flagelos bacterianos (Modificada de Leifson). Se prepar una suspensin poco densa de bacterias en agua a partir de un cultivo joven, se tomo dos gotas de la solucin y se puso en el extremo del cubre objetos, se sec al aire; se coloc el portaobjetos en forma inclinada y se le agrego una pelcula de colorante por un periodo de 5-15 minutos, dejando que se formara un precipitado a medida que se evaporaba el alcohol, despus se enjuago el porta objetos con agua destilada, se sec a aire libre y se observo al microscopio hasta el objetivo de inmersin 100x.

Imagen 2. Tincin negativa, para capsula bacteriana, en este caso la bacteria no presenta capsula. Tincin de endosporas bacterianas (Schaeffer-Fulton). Por las observaciones realizadas las bacterias presentaron esporas, pues se denoto una coloracin verde oscuro dentro de las bacterias bacilares de color rosado oscuro. Tincin de flagelos bacterianos (Modificada de Leifson) Segn lo observado las bacterias no presentaron flagelos, solo se observ la estructura bacilar de estas, de color rosado. DISCUSIN. En las bacterias de pared Gram positivas lo primero a sealar es la gruesa capa de peptidoglicano en forma de mltiples capas. Unidos a l se encuentran los cidos teicoicos (del griego techos, pared). Son polisacridos que se unen al cido N-acetil murmico del peptidoglicano. Algunos cidos teicoicos tienen unido un lpido (cidos lipoteicoicos). Los cidos lipoteicoicos estn embebidos en la membrana citoplasmtica por su porcin lipdica. Los cidos teicoicos tienen por funcin estabilizar la pared. La superficie externa del peptidoglicano de las bacterias Gram positivas est usualmente cubierta de protenas. Los diferentes grupos de bacterias Gram positivas y las diferentes especies, difieren en la composicin de sus protenas y cidos teicoicos, siendo esto til para la clasificacin serolgica y la identificacin (http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/fil es/6046b373-a0b6-4737-8f6b-4553dfefcd53/09.%20Morfologia%20y%20estrucutra%20bacteriana.pdf. Consultado en Octubre 2012). La gruesa capa de peptidoglicano es la caracterstica que hace que las bacterias se observen del color violeta tpico de las gran positiva, es decir, que conserva el color del cristal violeta pues despus de aplicarle el alcohol que acta como agente decolorante esta no pierde su color. Debido a que el alcohol no penetra toda la capa. Lo contrario sucede en las Gram negativas donde el decolorante destruye los lpidos de la pared formando grandes huecos por donde sale el cristal

RESULTADOS. Tincin de Gram para bacterias. La prueba dio como resultado que la bacteria es Gram positiva, la coloracin observada fue violeta, adems presento una forma de bacilar agrupado en diplobacilos.

Imagen 1. Tincin de gran positiva, las bacterias se observan de coloracin violeta. Tincin de cpsulas bacterianas (Tincin negativa). La prueba dio como resultado que las bacterias no presentan capsulas, pues la placa observada muestra una forma de bacilar con bordes regulares.

violeta y queda la safranina dando el color rosado-rojo caracterstico de las Gram negativas. En la Tincin de cpsulas bacterianas (Tincin negativa) que se efectu, determina la estructura externa que envuelve la bacteria que para el caso dio como resultado que no presenta capsula, debido a que no se denoto ningn halo sobre los bacilos. En cambio las bacterias que presentan capsula en el microscopio estas capsulas se observan transparentes rodeando la bacteria estas no se tie y el fondo permanece oscuro por la accin de la tinta china. Tincin de endosporas bacterianas (Schaeffer-Fulton): La bacterias teidas presentaron endosporas, Los datos publicados sobre la longevidad de las endosporas indican que pueden permanecer viables durante varias dcadas y probablemente mucho tiempo ms segn las condiciones a las que est sometida. Las bacterias que forman esporas se encuentran habitualmente en el suelo, y pertenecen principalmente a los gneros Streptomyces, Clostridium y Bacillus. Cuando una clula bacteriana capaz de esporular abandona su crecimiento exponencial debido a la deprivacin de nutrientes esenciales en su hbitat debe tomar la decisin de esporular o arriesgarse a continuar creciendo como tal y correr el riesgo de morir. Si la clula elige esporular se embarcar en un proceso irreversible de diferenciacin celular que dar como resultado una forma de vida inactiva que permanecer como tal indefinidamente hasta que mejoren las condiciones de su medio externo, las cuales le permitirn germinar y volver a crecer (http://www.terragene.com.ar/espaniol/pdf/de_bacterias_a_e sporas.pdf. Consultado en Octubre de 2012). Tincin de flagelos bacterianos (Modificada de Leifson): Los flagelos son rganos de locomocin delgados, de naturaleza proteica que se originan en la regin protoplasmtica inmediatamente debajo de la pared celular. No todas las bacterias poseen estas estructuras y en consecuencia, la presencia de flagelos, al igual que la distribucin y las cantidades en que estn presentes en ellas son caractersticas tiles para su clasificacin (http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.20 11.pdf. Consultado en Octubre de 2012). En el caso la tincin realizada la bacteria no presenta patrones de flagelacin pues se observ solo su forma de bacilo. CONCLUSION. Por medio de las tcnicas diferenciales se puede separar las bacterias grupos como las Gram positivas y Gram negativas, las acido resistentes. Tambin estas tcnicas no permiten observar estructuras como flagelos, esporas, capsulas y grnulos que puede resultar de gran ayuda en la identificacin taxonmica de un microorganismo. Para las diferentes tinciones diferenciales se usan dos tipos de colorantes, uno de tincin y otro de contraste, mientras que las tinciones simple un colorante. Los colorantes

permiten diferenciar por medio de los colores que forman en los tejidos de las clulas o alrededor de ellas, as mismo los colorantes pueden servir como indicadores de cambio de pH o de xido-reduccin para determinar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias. BIBLIOGRAFIA. Pirez, M. Morfologa y Estructura Bacteriana (2004). Espaa: Consejera de Educacin Comunidad de Madrid. [Consultado en, Octubre de 2012]. Disponible en Internet: <http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/fil es/6046b373-a0b6-4737-8f6b-4553dfefcd53/09.%20Morfologia%20y%20estrucutra%20bacteriana.pdf>. Rojas, T. E. Conceptos y prcticas de microbiologa general (2011) [en lnea]. Colombia: Universidad Nacional de ColombiaSede Palmira. Facultad de Ciencias Agropecuarias. [Consultado en Octubre, 2012]. Disponible en Internet: <http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.20 11.pdf>. Santambrosio, E. Catedra de Biotecnologa (2009) [en lnea]. Rosario Central Argentina. Universidad Tecnolgica Nacional, Departamento de Ingeniera qumica. [Consultado en, Octubre de 2012]. Disponible en Internet: < http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_ani o/biotecnologia/practico4.pdf> Terragene. De Bacterias a Esporas (2007) Argentina. [Consultado en, Octubre de 2012]. Disponible en Internet: <http://www.terragene.com.ar/espaniol/pdf/de_bacterias_a_e sporas.pdf>