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Manual de Torres PDF
Manual de Torres PDF
BACTERIOLOGA MDICA
por
Miguel F. Torres
Portada interna:
Microfotografa electrnica de Salmonella typhi en divisin. Muestra los flagelos, las
fimbrias y la pared celular de la bacteria que causa la fiebre tifoidea. Inserto: dibujos de bacterias de la microbiota oral, por A. van Leeuwenhoek, siglo XVII.
NDICE
PRESENTACIN / 11
AGRADECIMIENTOS / 13
PRLOGO / 15
Foto: Antonio van Leeuwenhoek. Foto: Luis Pasteur. Foto: Roberto Koch.
CAPTULO 1:
BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA / 21
El Nombre Correcto de los Microorganismos. Recomendaciones de Bioseguridad
para el Laboratorio de Microbiologa. Medidas de Bioseguridad. Mtodos de
Esterilizacin o Desinfeccin. Descontaminacin. Antisepsia. Uso efectivo de
Antispticos, Desinfectantes y Procedimientos de Esterilizacin. Resistencia de
Microorganismos a Germicidas Qumicos.
CAPTULO 2:
INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA / 29
Cmo Organizar el Area de Trabajo de Bacteriologa. Fig. 1 Mesa de Trabajo para
Bacteriologa. La Coloracin de Gram. Foto: Hans Gram. Frmulas: Reactivos para
la Coloracin de Gram. Fig. 2 Clases de Asas Microbiolgicas y su Uso, 1 Asas para
Bacteriologa, 2 Asas para Micologa y Micobacterias. Fig. 3 Inoculacin de Medios
Slidos por Estras.
CAPTULO 3:
COPROCULTIVO / 41
Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 4 Marcha Bacteriolgica para Coprocultivo.
Interpretacin de Resultados. Fig. 5 Observacin y Sealamiento de Colonias
Sospechosas. Fig. 6 Tcnica para tomar Inculo de Colonias Individuales. Reacciones
de varias Enterobacterias en TSI/LIA. Diferenciacin de las Especies del Gnero
Shigella. Diferenciacin de las Especies del Gnero Salmonella. Informe.
Procedimiento para Cultivo de Cuerdas Encapsuladas (Enterotest) para Coleccin
de Muestras Duodenales. La Epidemiologa y Etiologa de la Diarrea. Patgenos
Frecuentemente Identificados en Nios con Diarrea Aguda, Atendidos en Centros
de Tratamiento, en Pases en Desarrollo.
CAPTULO 4:
COPROCULTIVO PARA CLERA / 63
Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados. Fig. 7 Marcha
Bacteriolgica Acortada para Aislamiento de Vibrio cholerae 01. Informe. Frmulas:
1 Agua Peptonada Alcalina (APA), 2 Medio de Transporte Cary-Blair.
CAPTULO 5:
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni / 71
Propsito. Muestra. Condiciones necesarias. Procedimiento. Interpretacin de
Resultados. Informe.
CAPTULO 6:
INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori / 75
Propsito. Muestra. Observacin Directa. Prueba de Ureasa. Cultivo. Informe.
CAPTULO 7:
UROCULTIVO / 79
Propsito. Manifestaciones Clnicas y Microorganismos Asociados con Varios Tipos
de Infecciones Urinarias. Toma de la Muesta. Toma de Urocultivo en el Hombre.
Toma de Urocultivo en la Mujer. Toma de Urocultivo en Nios Pequeos. Puncin
Supra-pbica (PSP). Procedimiento. Foto: Biplaca para Urocultivo. Fig. 8 Marcha
Bacteriolgica para Urocultivo. Interpretacin de Resultados. Informe. Deteccin
de Bacteriuria por la Coloracin de Gram de Orina no Centrifugada.
CAPTULO 8:
CULTIVO DE GARGANTA / 91
Propsito. Muestra. Procedimiento. Fig. 9 Marcha Bacteriolgica para Cultivo de
Garganta/Exudado Farngeo. Interpretacin. Foto: Interpretacin de la Prueba de
Bacitracina. Identificacin Presuntiva de Streptococcus agalactiae (Grupo B), Prueba
de CAMP. Fig. 10 Siembra e Interpretacin de la Prueba de CAMP. Caractersticas
Fsicas, Hematolgicas y Qumicas de la Sangre de Carnero. Ventajas del Uso de la
Sangre de Carnero en el Laboratorio Clnico.
CAPTULO 9:
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES / 105
Propsito. Investigacin de Corynebacterium diphtheriae. Muestra y Procedimento.
Interpretacin de Resultados. Informe. Investigacin de Neisseria meningitidis en
Cultivos de Garganta de Contactos. Muestra y Procedimiento. Interpretacin.
Informe.
CAPTULO 10:
CULTIVO DE ESPUTO / 121
Propsito. Muestra. El Frote Gram de Esputo. Interpretacin del Frote Gram de
Esputo. Cultivo de Esputo. Interpretacin de Resultados e Informe. Etiologa y
Sintomatologa de Neumona y Bronquitis.
CAPTULO 11:
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO / 129
Propsito. Muestra. Procedimiento. Observaciones en Hemocultivos que Orientan
el Diagnstico Bacteriolgico. Interpretacin de Resultados. Etiologa y
Sintomatologa de Septicemia. Informe.
CAPTULO 12:
SECRECIONES DIVERSAS / 137
Propsito. Muestra. 1 Piel. Etiologa y Sintomatologa de Heridas Infectadas. 2 Ojos.
Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Ocular. 3 Odos. Etiologa y Sintomatologa
de Otitis Media. 4 Miscelneos. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e
Informe. Principales Pruebas para la Diferenciacin de Tres Especies del Gnero
Staphylococcus de Origen Humano.
CAPTULO 13:
SECRECIONES GENITALES / 147
Propsito. Diagnstico de Gonorrea. Foto: Neisseria gonorrhoeae, Frote Gram de Pus
Uretral Masculino. Diferenciacin de Dos Especies de Neisseria de Importancia
Clnica. Diagnstico de Chancro Blando (Chancroide). Diagnstico Directo de la
Sfilis. Foto: Treponema pallidum, Campo Oscuro de Chancro. Agentes Infecciosos
del Tracto Genital Femenino. Introduccin. Vaginitis. Cervicitis. Otros Agentes
Etiolgicos.
CAPTULO 14:
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y FLUIDOS CORPORALES / 163
Propsito. Muestra. Etiologa y Sintomatologa de Infeccin Osea y Articulaciones.
Procedimiento. Fig. 11 Marcha Bacteriolgica para Lquido Cefalorraqudeo (LCR).
Interpretacin de Resultados. Informe.
CAPTULO 15:
TEJIDOS Y BIOPSIAS / 171
Propsito. Muestra. Procedimiento. Interpretacin de Resultados e Informe.
CAPTULO 16:
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD (ANTIBIOGRAMA) / 177
Propsito. Medio de Cultivo. Procedimiento. Esquema: Jarro Gas-Pak. Fig. 12
Marcha Bacteriolgica para Antibiograma. Antibiticos Aprobados (FDA-USA) que
deben Usarse Rutinariamente para Pruebas de Susceptibilidad en Varios Grupos
Bacterianos. 1 Enterobacterias, 2 Pseudomonas aeruginosa y otros Bacilos gramnegativo no de la Familia Enterobacteriaceae, 3 Sthapylococcus spp. Interpretacin de
Resultados. Interpretacin de los Dimetros de las Zonas de Inhibicin (mm) para
Miembros de la Familia Enterobacteriaceae. Interpretacin de los Dimetros de las
Zonas de Inhibicin (mm) para Staphylococcus spp. Control de Calidad. Lmites
Aceptables de los Halos de Inhibicin (mm) que Deben Obtenerse con las Cepas
Control. Fuentes Comunes de Error.
CAPTULO 17:
ANAEROBIOS / 193
Propsito. Muestra. Toma de Muestra para Cultivo de Anaerobios. Transporte de
las Muestras al Laboratorio. Procedimiento. Interpretacin de Resultados.
Caractersticas Morfolgicas de Algunos Bacilos Anaerobios Gram-negativo de
Importancia Mdica. Interpretacin del Cultivo. Morfologa Microscpica. Fig. 12
Diversas Morfologas Bacterianas. Informe.
CAPTULO 18:
MICOBACTERIAS / 203
Propsito. Muestras. 1 Esputo, 2 Lavado Gstrico, 3 Orina, 4 Otro Tipo de Muestras.
Procedimiento. Procedimiento de la Coloracin de Ziehl-Neelsen. Frmulas:
Reactivos para Ziehl-Neelsen. Coloracin de Kinyoun. Frmulas: Reactivos para
Kinyoun. Interpretacin e Informe de Baciloscopas. Reporte de Frotes para
Micobacterias. Cultivo para Micobacterias. Digestin y Descontaminacin de
Esputos. Mtodo de Digestin y Descontaminacin con N-acetil-levo-cistena
(NALC). Frmulas. Digestin y Descontaminacin de Esputos por el Mtodo
Convencional de Hidrxido de Sodio. Frmulas. Procedimiento de Digestin/
Descontaminacin para Esputos de Pacientes cuyas muestras estn constantemente
contaminadas con Pseudomonas sp. o Proteus sp. Procedimiento para Lavados
Gstricos. Procedimiento para Orina. Procedimiento para Hisopo Farngeo.
Procedimiento para Tejido o Piel. Procedimiento para Otros Fluidos Corporales.
Interpretacin del Cultivo. Prueba de Niacina. Grupos de Runyon (Micobacterias
Atpicas).
BIBLIOGRAFA / 223
NDICE DE FIGURAS
Fig.1 / 34
MESA DE TRABAJO PARA BACTERIOLOGA
Fig.2 / 39
CLASES DE ASAS MICROBIOLGICAS Y SU USO
1 Asas para Bacteriologa
2 Asas para Micologa
Fig.3 / 40
INOCULACIN DE MEDIOS SLIDOS POR ESTRAS
Fig.4 / 45
MARCHA BACTERIOLGICA PARA COPROCULTIVO
Fig.5 / 46
OBSERVACIN Y SEALAMIENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Fig.6 / 48
TCNICA PARA TOMAR INCULO DE COLONIAS INDIVIDUALES
Fig.7 / 67
MARCHA BACTERIOLGICA ACORTADA PARA AISLAMIENTO DE Vibrio
cholerae 01
Fig.8 / 84
MARCHA BACTERIOLGICA PARA UROCULTIVO
Fig.9 / 94
MARCHA BACTERIOLGICA PARA CULTIVO DE GARGANTA
FIG.10 / 100
SIEMBRA E INTERPRETACIN DE LA PRUEBA DE CAMP
Fig. 11 / 166
MARCHA BACTERIOLGICA PARA LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)
Fig.12 / 181
MARCHA BACTERIOLGICA PARA ANTIBIOGRAMA
Fig.13 / 201
DIVERSAS MORFOLOGAS BACTERIANAS
Nota:
Al centro del libro, a partir de la pgina 111 aparecen 32 fotografas a color y
sus explicaciones correspondientes.
PRESENTACIN
Las enfermedades infecciosas continan siendo la principal causa de morbimortalidad en Mesoamrica. Entre las variadas infecciones que afectan la salud
pblica de nuestros pueblos, las infecciones de origen bacteriano son unas de las
ms frecuentes. Por este motivo, cualquier esfuerzo orientado a capacitar personal
de salud en diagnstico bacteriolgico, incide directamente en su mejor tratamiento
y control.
La Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos
de Guatemala, se complace en presentar el siguiente MANUAL PRCTICO DE
BACTERIOLOGA MDICA a la comunidad cientfica de Guatemala y Centroamrica.
Como su ttulo lo indica, se trata de un libro fcil de leer, comprender y aplicar,
dirigido a profesionales, estudiantes y tcnicos que estudian o trabajan directamente
la bacteriologa en los laboratorios clnicos privados o estatales.
El autor es catedrtico titular desde hace 22 aos en el Departamento de
Microbiologa, Escuela de Qumica Biolgica de esta Casa de Estudios. Durante estos
aos, ha tenido a su cargo la enseanza de la bacteriologa mdica a los estudiantes
de Qumica Biolgica. Cuenta con una gran trayectoria profesional dentro y fuera
de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Se ha destacado no slo como
catedrtico e investigador a travs de sus mltiples publicaciones en revistas
cientficas nacionales e internacionales, sino tambin a lo largo de los aos ha
demostrado su empeo por mejorar la microbiologa en nuestro medio. Uno de sus
principales logros fue la creacin del Laboratorio Microbiolgico de Referencia
-LAMIR- en 1991.
La experiencia de Miguel F. Torres en la docencia e investigacin en
bacteriologa, parasitologa y micologa, aunados a sus conocimientos y experiencia
adquiridos durante varios aos de servicio como microbilogo clnico del Instituto
Guatemalteco de Seguridad Social y del Hospital Militar, garantizan el contenido
del manual.
Esta obra fue completada por el autor durante su ao sabtico de la Universidad
de San Carlos. Constituye un valioso libro de texto para los estudiantes de diversas
carreras. Por este motivo, no dudamos en recomendarlo y desearle muchos xitos.
Atentamente,
Lic. Jorge Rodolfo Prez Folgar
Decano
Lic. Gerardo Arroyo Cataln
Director de la Escuela
de Qumica Biolgica
AGRADECIMIENTOS
El autor desea patentizar sus agradecimientos a los siguientes destacados
bacterilogos de Centroamrica y el Caribe, por su valiosa colaboracin al haber
revisado el manuscrito de este libro. Los distinguidos colegas efectuaron valiosos
comentarios y sugerencias, los cuales dada su gran experiencia y prestigio,
enriquecen la obra.
Licda. Floridalma Cano Granados
Supervisora del Laboratorio de Bacteriologa y Parasitologa Intestinal
Laboratorios de Microbiologa Dr. Leonardo J. Mata
Instituto de Nutricin de Centroamrica y Panam
Guatemala
Dr. Edmundo E. Poujol
Ex-Director del Departamento de Microbiologa
Universidad Nacional Autnoma
Honduras
Dr. Jaime Guevara R.
Jefe de la Seccin de Laboratorios
Direccin Tcnica de Servicios de Salud
Caja Costarricense de Seguro Social
Costa Rica
Dra. Marion C. de Martin
Vice-decana de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional
Panam
Dr. Gerardo F. Martnez
Jefe del Departamento de Bacteriologa / Micologa
Sub-Direccin de Microbiologa
Instituto de Medicina Tropical Dr. Pedro Kour
Cuba
A los personeros del Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social de
Guatemala que brindaron su apoyo para lograr el financiamiento de 250 copias de
la Segunda Edicin del presente Manual. Ellos permitieron hacer llegar nuestro
mensaje acadmico y gua de trabajo a profesionales, tcnicos de laboratorio y
estudiantes. Actualizar y estandarizar la bacteriologa mdica en nuestros pases,
debe ser la meta. Estas labores deben ser dinmicas y constantes.
Es imperativo hacer mencin del gran aporte que el invento del microscopio
represent para las ciencias biolgicas. Antonio van Leeuwenhoek durante el siglo
XVII fue el primer humano que observ las bacterias. Este personaje longevo, no
slo efectu grandes descubrimientos con sus microscopios de lente de gota,
sino tambin nos leg su ejemplo del valor de la palabra cientfica escrita. El
microscopio compuesto que usamos hoy en da fue inventado posteriormente por
los hermanos Hans y Zacaras Janssen, en Middleburg, Holanda. Luego fue
perfeccionado por Galileo Galilei y Johannes Kepler.
Durante el siglo XVIII, estos refinados instrumentos fueron curiosa
entretencin para cientficos y aficionados, incluyendo a las ilustradas damas de
las cortes europeas. No fue sino hasta el siglo XIX, que los grandes titanes de la
bacteriologa, Luis Pasteur en Francia y Roberto Koch en Alemania, efectuaron los
descubrimientos bsicos que han permitido el desarrollo de la bacteriologa mdica
moderna. Los logros de estos dos pioneros fueron mltiples, por lo que es muy
difcil sumarizarlos. Conviene recordar que el increble avance de la bacteriologa
en las postrimeras del siglo XX, y el que vivirn nuestros descendientes en el
prximo milenio, se fundamentan en sus descubrimientos y los de sus discpulos.
La Primera Edicin de este MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA
MDICA, fue patrocinada por la compaa farmacutica Pfizer, en septiembre de
1996. Esta edicin se agot rpidamente entre profesionales y estudiantes de
laboratorio clnico en Centroamrica. Hasta la fecha, este libro ha sido adoptado
como referencia del trabajo rutinario en bacteriologa clnica en mltiples
laboratorios y es libro de texto en varias universidades.
En 1999, el Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social de Guatemala, ha
reconocido la necesidad de patrocinar una Segunda Edicin, la cual llegar a todos
los profesionales y tcnicos de la Red Nacional de Laboratorios Clnicos, ahora
como norma obligatoria a observar en bacteriologa mdica. El autor ha plasmado
en el presente libro, treinta aos de experiencia en la materia, de manera simplista
y expresando lo mnimo que es necesario efectuar en los laboratorios clnicos de
Mesoamrica.
Miguel F. Torres, Q.B., M.A.
Ciudad de Guatemala, 25 de octubre de 1999
16
El ojo humano es incapaz de visualizar objetos menores de 30 micras. Por este motivo,
antes de la invencin del microscopio, el hombre desconoci la vida microscpica y la estructura
celular de los tejidos.
Antonio van Leeuwenhoek fue un comerciante de telas, nacido en 1632 en Delft, Holanda.
Fabric ingeniosos microscopios con pequeos lentes fundidos en placas de diversos metales.
Con los cientos de microscopios que hizo personalmente a lo largo de su vida, fue el primer ser
humano que observ las bacterias, los protozoos, los glbulos rojos y los espermatozoides.
Durante 50 aos, inform peridicamente sus maravillosos hallazgos en detalladas cartas
dirigidas a la Real Sociedad de Londres. A partir de preparaciones de material interdental,
dibuj y report por primera vez los tres tipos de formas bacterianas.
17
Roberto Koch fue un mdico rural alemn, nacido en 1843. Sus aportes a la
bacteriologa mdica fueron enormes. Primero cultiv la bacteria causante del ntrax en
humor vtreo de buey. Luego desarroll gradualmente tcnicas bacteriolgicas fundamentales,
como el uso del agar extrado de algas marinas para solidificar los medios de cultivo y
as poder observar colonias.
Con su discpulo Paul Ehrlich, aplic los colorantes derivados de la anilina a la
coloracin de microorganismos. Descubri las bacterias causantes de el clera, la tuberculosis (bacilo de Koch) y el protozoo causante de la enfermedad del sueo.
19
CAPTULO 1
BREVE INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA
La microbiologa es la ciencia que estudia a los seres vivos microscpicos, es
decir que slo pueden observarse con ayuda del microscopio. Los pequeos organismos microscpicos son llamados vulgarmente microbios, pero la palabra correcta para designarlos es microorganismos. La microbiologa se aplica no slo a la
ciencia mdica, sino tambin a la veterinaria, a la agronoma y a la industria, por lo
que forma parte del plan de estudios de varias carreras universitarias.
Existen muchas clases de microorganismos, los cuales se clasifican segn su
estructura, manera de reproducirse y muchas otras caractersticas. Los grupos ms
importantes de microorganismos son: los virus, las bacterias, los protozoos y los
hongos. Los virus son los microorganismos ms pequeos, se reproducen nicamente dentro de las clulas y tienen forma similar a cristales. La palabra
microorganismo abarca grupos de seres vivos muy diferentes entre s.
La microbiologa se sub-divide en varias disciplinas que estudian cada grupo
taxonmico de microorganismos. Algunos no son propiamente microorganismos,
pero su estudio se basa en estructuras microscpicas.
Microbiologa
Bacteriologa (bacterias)
Micologa (hongos)
Virologa (virus)
Parasitologa
Protozoologa (protozoos)
Helmintologa (helmintos)
Entomologa (insectos, caros, otros)
Ejemplos:
Staphylococcus aureus (bacteria)
Escherichia coli (bacteria)
Streptococcus pyogenes (bacteria)
Pseudomonas aeruginosa (bacteria)
Entamoeba histolytica (parsito, protozoo)
Giardia lamblia (parsito, protozoo)
Ascaris lumbricoides (parsito, helminto)
Trichophyton rubrum (hongo)
Microsporum canis (hongo)
Adems del nombre cientfico, en algunos casos existe un nombre de uso comn o vulgar. El uso de este tipo de nombres debe evitarse.
Los nombres vulgares ms conocidos son los siguientes:
22
Nombre correcto:
Nombre vulgar:
Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae
Neisseria gonorrhoeae
Enterobius vermicularis
Trichuris trichiura
Entamoeba histolytica
Entamoeba coli
Hymenolepis nana
Candida albicans
colibacilo (bacteria)
neumococo (bacteria)
gonococo (bacteria)
oxiuro (parsito, helminto)
tricocfalo (parsito, helminto)
ameba histoltica (parsito, protozoo)
ameba coli (parsito, protozoo)
tenia nana (parsito, helminto)
monilia (hongo)
Si se desea hacer referencia a todas las especies de un gnero se usa la abreviatura para especies: spp. y no se subraya. Si slo se refiere a una especie no
determinada de un gnero dado, se usa: sp. abreviatura de especie.
Ejemplos:
Streptococcus spp. = todos los estreptococos que existen.
Shigella sp. = una especie no determinada del gnero Shigella.
Tomado de:
23
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Equipo necesario:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Campana bacteriolgica
Campana de flujo laminar cuando es necesario
Lmpara de pie
Mechero o incinerador
Incubadora bacteriolgica
Autoclave
Horno esterilizador
Agitador de tubos
Centrfuga
24
Mtodo
ESTERILIZACIN:
Calor
Hmedo (autoclave)
Seco (horno)
Concentracin o nivel
Gas
Oxido de etileno
Lquido Glutaraldehido
Perxido de hidrgeno
Formaldehido
Dixido de cloro
DESINFECCIN
Calor
Hmedo
(incluye pasteurizacin)
Lquido glutaraldehido
perxido de hidrgeno
formaldehido
compuestos clorinados
alcoholes (etanol, isoproplico)
compuestos fenlicos
compuestos yodados
75-100 C
variable
3-6%
1-8%
500-5,000 mg de cloro libre/litro
70%
0.5-3%
0.1-0.2%
ANTISEPSIA
alcoholes
yodforos
hexaclorofeno
70%
1-2 mg de yodo libre/litro
1-3%
25
Actividad
alta
alta-media
alta-media
alta-media
intermedia
intermedia
media-baja
media-baja
DESINFECCIN:
Proceso generalmente menos letal que la esterilizacin.
Elimina virtualmente todos los microorganismos patgenos pero no necesariamente todas las formas microbianas (esporas).
El procedimiento de desinfeccin carece del margen de seguridad que
se logra por los procedimientos de esterilizacin.
Factores:
1.
2.
3.
4.
DESCONTAMINACIN:
Es un trmino usado para describir un proceso o tratamiento aplicado a
una superficie ambiental o a un instrumento de trabajo. Este trmino abarca
desde lavado con agua y jabn hasta la desinfeccin o esterilizacin.
ANTISEPSIA:
Un antisptico es definido como un germicida usado sobre piel o tejido
vivo con el propsito de inhibir o destruir microorganismos.
USO EFECTIVO DE ANTISPTICOS, DESINFECTANTES Y
PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIN
Factores para la eleccin de desinfectantes y procedimientos de
esterilizacin.
1.
2.
3.
26
ESTERILIZACIN:
Uso de procedimiento fsico o qumico para destruir toda la vida
microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas bacterianas
altamente resistentes.
Tipos de esterilizacin:
Calor hmedo: autoclave de vapor
Calor seco: horno esterilizador
Gas de xido de etileno
Esterilizantes qumicos: germicidas basados en glutaraldehido.
RESISTENCIA
RESISTENCIADE
DEMICROORGANISMOS
MICROORGANISMOSAAGERMICIDAS
GERMICIDASQUMICOS
QUIMICOS(*)
(*)
ESPORAS BACTERIANAS
Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes
MICOBACTERIAS
Mycobacterium tuberculosis var. bovis
VIRUS PEQUEOS O NO LIPDICOS
Poliovirus - Coxsackievirus - Rhinovirus
HONGOS
Trichophyton sp.-Cryptococcus sp.-Candida sp.
BACTERIAS VEGETATIVAS
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Salmonella choleraesuis
VIRUS DE MEDIANO TAMAO O LIPDICOS
Herpes simplex - Cytomegalovirus
Virus sincitial respiratorio
Virus de Hepatitis B
Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
(*) En orden descendente de resistencia
27
CAPTULO 2
INTRODUCCIN A LA BACTERIOLOGA
Las bacterias son microorganismos formados por una sola clula muy simple, que en condiciones ideales realiza funciones de alimentacin y reproduccin.
Son uno de los grupos microbianos ms frecuentes y abundantes en casi todos los
ambientes.
La reproduccin de las bacterias ocurre por simple particin de una clula en
dos clulas hijas, y ocurre en un tiempo muy corto en comparacin con la reproduccin de otros seres vivientes. Algunas tienen la capacidad de producir esporas
que son estructuras de resistencia. Las bacterias pueden ser mviles o inmviles.
Cuando tienen movimiento, lo hacen por medio de flagelos o filamentos largos
que agitan en forma de ltigo.
Para que las bacterias puedan reproducirse in vitro, es decir en las condiciones de laboratorio, debe proporcionrseles todas las sustancias nutritivas que requieren (protenas, azcares, vitaminas, etc.). Estos nutrientes se encuentran en los
medios de cultivo. El pH es muy importante y debe mantenerse estable y regulado
segn cada medio de cultivo.
Las bacterias se clasifican en base a diversas caractersticas. Segn sus requerimientos de oxgeno, las bacterias pueden ser:
a.
Aerobias: Crecen bien en la atmsfera que respiramos, es decir en presencia de oxgeno, el cual requieren para su sobrevivencia.
b.
Microaeroflicas: Crecen mejor en presencia de pocas cantidades de oxgeno. Para disminuir la concentracin de oxgeno en el microambiente
en el cual se incuban cultivos de bacterias, se recomienda introducirlos
en jarros de vidrio con una candela encendida, lo que enriquece con un
5 al 10 % de anhdrido carbnico (CO2).
c.
29
d.
Mesfilas: Crecen a temperaturas intermedias, semejantes a la temperatura del cuerpo humano o a la temperatura del ambiente. En este
grupo se incluyen todas las bacterias patgenas, por esta razn la temperatura a la cual deben mantenerse constantemente las incubadoras
bacteriolgicas es de 36 grados centgrados.
b.
c.
d.
b.
c.
b.
c.
30
C
31
33
34
LA COLORACIN DE GRAM
Las bacterias son microorganismos incoloros, por
este motivo deben teirse para poder observarlos con ayuda del microscopio. Por esta razn, a continuacin se describe la tcnica ms importante que debe usarse para diferenciar bacterias: la coloracin de Gram. Se recomienda
usar la modificacin de Hucker segn Bartholomew, de
acuerdo con la bibliografa que aparece al final de este
manual.
a)
Preparacin de frotes:
Hans Gram
1. Cubrir el frote ya fijado y fro con cristal violeta, dejar el colorante por un
minuto (ver preparacin de colorantes adelante). Enjuagar en un chorro suave de
agua corriente. Escurrir muy bien.
2. Cubrir con lugol de Gram y dejar por un minuto. Enjuagar de nuevo suavemente con agua corriente, escurrir bien.
3. Aplicar gota a gota el decolorante alcohol-acetona por 4 5 segundos,
hasta que ya no salga ms cristal violeta. Este paso es crucial y debe ser muy breve
en frotes delgados y ms prolongado en frotes gruesos.
35
Resultados:
Informe:
36
CRISTAL VIOLETA:
Solucin A:
Cristal violeta (certificado) ............................................... 2 gramos
Alcohol etlico al 95 % ....................................................... 20 ml
Solucin B:
Oxalato de amonio ............................................................ 0.8 gramos
Agua destilada ................................................................... 80 ml
Mezclar ambas soluciones, para preparar 100 ml. Guardar (en oscuridad) 24
horas antes de usarse y filtrar con papel filtro directamente al frasco de coloracin.
2.
LUGOL DE GRAM:
Cristales de yodo ............................................................... 1 gramo
Yoduro de potasio .............................................................. 2 gramos
37
SAFRANINA:
Solucin stock (concentrada):
Safranina-0 (certificada) .................................................... 2.5 gramos
Alcohol etlico al 95 %. ...................................................... 100 ml
Solucin de trabajo:
Diluir 1:10 la solucin stock (concentrada), as:
Solucin stock .................................................................... 10 ml
Agua destilada ................................................................... 90 ml
38
1.
2.
Asa recta o en hilo. Sirve para trasladar una sola colonia a medios de
identificacin, o subcultivo.
3.
4.
5.
6.
39
40
CAPTULO 3
COPROCULTIVO
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatgenas,
es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.
Las principales especies enteropatgenas que se buscan en el coprocultivo,
en orden de importancia en Guatemala son:
-
Shigella flexneri
Salmonella typhi
Shigella sonnei
Salmonella enteritidis
Shigella dysenteriae tipo 1
Shigella boydii
Salmonella choleraesuis
Arizona hinshawii
Edwardsiella tarda
Yersinia enterocolitica
(Shigella grupo B)
(agente de fiebre tifoidea)
(Shigella grupo D)
(Shigella A-1 o Bacilo de Shiga,
causa severa disentera epidmica)
(Shigella grupo C, rara en Guatemala)
(rara)
(muy rara)
(muy rara)
Las bacterias de la familia Enterobacteriaceae, normalmente habitan en el intestino humano, por lo que se conocen comnmente como enterobacterias. Forman aproximadamente el uno por ciento de la microbiota fecal, el resto son bacterias anaerobias. Por esta razn es muy importante que el laboratorio est en capacidad de aislar, diferenciar e identificar correctamente los enteropatgenos de la lista
anterior.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
-
41
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibiticos. Las
heces debern procesarse lo ms pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas
de ser emitidas; no es necesario que el paciente est en ayunas. El hisopo rectal es
una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestra de heces
reciente) porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa.
En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estril 4 centmetros,
dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En los nios, introducir el
hisopo 2.5 centmetros y dar la misma cantidad de vueltas. En el adulto es ms fcil
tomar el hisopo rectal, con el paciente acostado de lado y l mismo separndose los
glteos. Los nios deben acostarse boca arriba y con la mano izquierda tomar
ambos pies, presionar a manera de flexionar las rodillas hacia abajo y luego
introducir el hisopo.
Cuando las heces, que se encuentran a 37 C dentro del intestino, son colectadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20 C), el pH baja
considerablemente (acidez) y hace que las bacterias especialmente Shigella spp. pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para este propsito colocar con hisopo estril una porcin anormal de las heces (con moco, sangre
o pus) aproximadamente del tamao del hisopo bien cargado en tubos o viales con
3 ml del siguiente medio de transporte: glicerol-salino bufferado, (especialmente
para Shigella), o caldo Hajna GN (Gram-negativo). Probablemente el mejor medio
de transporte para enterobacterias sea Carry-Blair. El caldo GN es de
enriquecimiento, por lo que debe incubarse a 36C por aproximadamente 18 horas
antes de sembrarse, pero puede usarse como transporte alternativo en ausencia de
glicerol-salino bufferado.
Glicerol salino bufferado
Para transporte de coprocultivos
Cloruro de sodio ...................................................................... 4.2 gramos
Fosfato dipotsico (anhidro) ..................................................3.1 gramos
Fosfato monopotsico (anhidro) ...........................................1.0 gramos
Rojo fenol .................................................................................. 0.003 gramos
Agua destilada .........................................................................700 ml
Glicerina ...................................................................................300 ml
42
El pH final debe ser 7.2. Medir 3 ml en viales o tubos con tapn de rosca y
luego autoclavear a 121C por 10 a 15 minutos. Descartar si el medio se acidifica
y vira a color amarillo.
Otros caldos de enriquecimiento como Selenito-F o Tetrationato con yodo no
deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella spp., ya que
su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clnica.
La coloracin de Gram de heces nunca debe practicarse por carecer de significado clnico, excepto en los siguientes casos: colitis pseudomembranosa causada
por Staphylococcus aureus donde predominan en el frote cocos gram-positivo, o en
caso de candidosis intestinal, donde predominan en el Gram las levaduras
(gram-positivo).
PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es nio menor de 6 meses.
Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que slo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativo)
y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce cido, lo que hace cambiar el color de las colonias y as las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma
de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen cido sulfhdrico.
El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos/diferenciales diferentes,
de preferencia uno ms inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar
MacConkey y agar XLD o agar SS (Salmonella y Shigella).
En caso de heces con moco y sangre (disentera) debe incluirse adicionalmente
el medio de Hektoen, lo mismo que para material obtenido por biopsia intestinal y
proctoscopa.
El color original y los virajes producidos por el crecimiento bacteriano, en
estos tres medios que contienen el azcar lactosa (como agente diferencial) es el
siguiente:
43
MEDIO
COLOR
ANTES DE
INOCULAR
COLONIAS
LACTOSAPOSITIVO
COLONIAS
LACTOSANEGATIVO
COLONIAS
CON CIDO
SULFHDRICO
MacConkey
rosado
rojo (rosado)
incoloras
no cambian
SS
rosado
ligeramente
amarillento
rojo
incoloras
negro
Hektoen
verde claro
anaranjadosalmn
verde
azuladas
negro
XLD
rojo
amarillas
rojas
negro
Inocular una porcin anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de MacConkey y una caja de SS. El inculo
se coloca con asa en anillo (flameada y fra) o con hisopo en las cajas de ambos
medios. Inocular slo 1/2 cm en un extremo en el MacConkey y 1 cm en el SS.
El Hektoen se inocula igual que el MacConkey.
2-
Diseminar el inculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfra (ver figura 3, pg. 40).
3-
44
Muestras:
MacConkey
Material de
proctoscopa,
biospia intestinal
XLD SS
Medios:
Opcional
Hektoen
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1-
CR
AY
GR
AS
Marcar colonias
sospechosas por
detrs de la caja de Petri
46
2-
47
3-
Incube a 36C la gradilla con las parejas TSI/ LIA y urea, de manera que no
quede duda de qu tubo de TSI corresponde a su LIA. Deben permanecer en
incubacin de 18 a 24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente
flojos para permitir la entrada de oxgeno. Las colonias marcadas g (E. coli,
nios menores de un ao) pueden pasar slo a TSI, para ahorrar LIA y urea.
4-
Reaccin ya
ya
Reaccin
incubada
incubada
A=cido K=alcalino
R=rojo
N=neutro
Gas (g)
(-a+++)
Medio sin
Medio sin
inocular
inocular
cido
sulfhdrico
(h) (-a+++)
TSI
(rojo)
Amarillo
rojo
no
aplicable
no
aplicable
burbujas
o
rupturas
negro
LIA
(morado)
Amarillo
violeta
Superficie
roja
antre
amarillo
y morado
burbujas
o
rupturas
negro
Para expresar en clave y abreviadamente las reacciones en TSI o LIA use las
abreviaturas A, K, R, N, -, +, g, h, segn la tabla anterior en este orden: superficie/
fondo, gas, cido sulfhdrico.
Por ejemplo las reacciones de Escherichia coli en TSI; LIA se expresan as:
TSI;LIA = A/A, g+; h-/ K/K, g+, h- o
TSI;LIA = K/A, g-; h-/K/N, g-, hLas reacciones coloreadas en TSI/LIA, son muy tiles para la identificacin
de los enterobacterias, por lo que en el laboratorio debe contarse con una tabla
actualizada de reacciones en TSI/LIA y pruebas bioqumicas en general.
Reacciones a las cuales debe ponerse especial atencin:
Bacteria
TSI
LIA
UREA
Shigella spp.
K/A,g-,h-
K/A (N),g-,h-
Salmonella sp.
K/A,g+,h++
K/K,g+,h+
Yersinia enterocolitica
A/A,g-,h-
A (K)/A,g-,h-
49
5-
50
Enterobacteria
LIA
TSI
UREA
Escherichia coli
A(K)/A, g+ (-), h-
K/KN, g-+, h-
Shigella spp.*
K/A, g-, h-
K/A, g-, h-
Salmonella typhi*
Salmonella spp.*
Arizona hinshawii*
Yersinia enterocolitica*
A/A, g-, h-
A(K)/A, g-, h-
Citrobacter sp.
Edwarsiella tarda
K/K, g-+, h+
Klebsiella sp.
KN/KN, g+, h-
Enterobacter sp.
A/A, g++, h-
KN/KN, g+(-), h-
-(+)
Serratia sp.
KA/A, g-, h-
KN/KN, g-, h-
-+
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Morganella morganii
(antes Proteus morganii)
K/A, g-(+), h-
KR/A, g-, h-
Providencia sp.
K/A, g+ -, h
R/A, g-, h-
+-
Nota Importante:
Solamente reportar como coprocultivo positivo las enterobacterias marcadas con * el resto
es microbiota normal y no debe reportarse nunca. Reacciones menos probables entre
parntesis. Todas las reacciones con reaccin roja (R) en la superficie de LIA, presuntivamente
son Proteus sp., Morganella sp. o Providencia sp., no tienen importancia clnica en coprocultivos
y no deben tomarse en cuenta. Esta tabla es slo una gua, que debe actualizarse
constantemente.
51
- La ms frecuente en Guatemala
- La segunda ms frecuente en
Guatemala
Shigella dysenteriae, grupo A - Rara pero grave y epidmica, debe
darse alerta al mdico.
Shigella boydii, grupo C
- Muy rara vez se aisla en el pas.
52
Salmonella typhi:
causa fiebre tifoidea con diseminacin generalizada de la bacteria (puede aislarse de heces,
mdula sea, sangre, orina, etc).
Salmonella enteritidis:
Salmonella choleraesuis:
345-
No produce gas.
Produce poco cido sulfhdrico (una pequea mancha negra,
a veces difcil de apreciarse en el rea del tubo donde empieza el
inclinado).
Generalmente, el LIA es todo morado (K/K,g-,h-(+)
Es citrato-negativo.
Aglutina con el antisuero anti-antgeno Vi.
53
Diferencie presuntivamente las especies del gnero Salmonella con estas tres
pruebas sencillas:
Prueba
Especie
Gas
(TSI)
cido sulhdrico
(TSI)
Citrato
Salmonella typhi
+ dbil
Salmonella enteritidis
+++
Salmonella choleraesuis
+ (slo 60%)
(+)
2-
3-
4-
Ttulo: coprocultivo, cultivo de biopsia colnica, etc. De preferencia debe escribirse con maysculas y centrado.
2-
Resultado: Para ahorrar tiempo y trabajo, debe apuntarse el resultado en clave, en el libro de trabajo y luego la secretaria del laboratorio lo deber
transcribir con el texto correcto, segn la prxima tabla. Incluir el grupo de
Salmonella si se efectu. En el caso de Shigella no es necesario poner el grupo,
slo la especie, par ejemplo: Se aisl Shigella flexneri.
3-
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana (S/A): con los antibiticos de utilidad clnica para tratar infecciones por enterobacterias.
Utilice la siguiente tabla para registrar e informar el resultado del coprocultivo:
RESULTADO
CLAVE
en libro de trabajo
(tcnico)
TEXTO (Secretaria)
Coprocultivo negativo
de adulto
NP
Coprocultivo negativo de
nio menor de un ao
N-SSE
Coprocultivo positivo
Shigella A
Shigella B
Shigella C
Shigella D
Salmonella typhi
Salmonella choleraesuis
Arizona
Yersinia
55
El mdico debe extraer (usar guantes) la cuerda de la boca mediante una traccin rpida pero suave. Luego cortar con tijeras estriles la punta de la cuerda
(amarilla por la bilis), a manera de que caiga aspticamente en un tubo o
botellita con caldo tetrationato.
2-
3-
Despus de la incubacin, inocular por estras una asada del caldo tetrationato (agitado) en MacConkey y SS. Incubar 18 a 24 horas aerbicamente a
36 C.
4-
5-
Identificar Salmonella typhi por medio de sus reacciones en TSI, LIA, urea y
citrato. Aglutinar con anti-suero polivalente de Salmonella, antgeno Vi y grupo D, segn ya se explic.
Medio de cultivo:
Preparar el caldo de tetrationato adicionado con yodo y verde brillante segn
las instrucciones en el frasco de la base en polvo, as:
56
Suspender 17.5 gramos de la base en polvo en 500 ml de agua destilada, calentar hasta que hierva. Dejar enfriar a menos de 45 C y luego agregar: 10 ml de
solucin de yodo (yodo: 6 g, yoduro de potasio: 5 g, agua destilada: 20 ml.) y 5 ml
de solucin acuosa de verde brillante al 0.1 %.
Medir 10 ml en frasquitos estriles (de los que vienen con el medio Thayer
Martin) o tubos estriles con tapn de rosca. El medio debe quedar verde con precipitado blanco.
57
Disentera
Esta forma de diarrea se caracteriza por la presencia de sangre visible en
las heces fecales y frecuentemente presencia de moco. Sus efectos importantes incluyen anorexia, prdida de peso rpida y daos a la mucosa intestinal
causados por la bacteria invasora.
La mayora de los casos de disentera aguda en nios, son causados por
Shigella spp. Otras causas son Campylobacter jejuni y menos frecuentemente
Escherichia coli entero invasora (EIEC) y Salmonella. El protozoo Entamoeba
histolytica, puede causar disentera seria en adultos jvenes, pero es una causa
muy rara en nios. En alrededor de 90% de los casos de infeccin intestinal
por Entamoeba histolytica, las cepas no son virulentas.
Los pacientes con disentera causada por Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga), estn a menudo clnicamente muy enfermos. Este sndrome
clnico casi siempre incluye fiebre alta, sntomas txicos y clicos abdominales intensos y tenesmo. Ocasionalmente se registran convulsiones. A veces se
acompaa de complicaciones graves, como el sndrome hemoltico urmico.
Pueden presentarse epidemias de gran magnitud causadas por este
enteropatgeno. Esto ocurri en Centroamrica en los aos 1969 y 1970. La
terapia antimicrobiana apropiada aminora significativamente la gravedad y
duracin de la disentera y de la fiebre, as como la excrecin del patgeno.
EPIDEMIOLOGA
Transmisin de los agentes que causan diarrea
Los agentes infecciosos que causan diarrea generalmente se diseminan
por la ruta fecal-oral, lo cual incluye la ingestin de agua o alimentos contaminados fecalmente, y el contacto directo con heces fecales.
Varios comportamientos especficos de las personas contribuyen a la
propagacin de los enteropatgenos y por consiguiente incrementan el riesgo de sufrir diarrea. Estos incluyen:
-
Epidemias
En las reas tropicales, la diarrea por rotavirus ocurre todo el ao, aumenta su frecuencia durante los meses secos y ms fros, mientras que las
diarreas bacterianas aumentan durante la estacin lluviosa y ms clida. La
incidencia de diarrea persistente sigue el mismo patrn estacional de la diarrea aguda lquida.
Hay dos enteropatgenos Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae tipo 1 que
provocan grandes epidemias en las que la morbilidad y mortalidad en todos
los grupos de edad son altas. Desde 1961, el clera causado por el biotipo
Eltor de V. cholerae 01 se ha diseminado a pases de Asia, el Mediterrneo
Oriental, Africa, y a algunos pases de Europa. Desde 1991, ha causado epidemias en prcticamente todos los pases de Amrica Latina y casos sin
diseminacin secundaria en los Estados Unidos. Durante el mismo perodo
de tiempo Shigella dysenteriae tipo 1 ha ocasionado grandes epidemias de
disentera grave en Centro Amrica (69-70) y, ms recientemente, en Africa
Central y Sur de Asia.
ETIOLOGA
Enteropatgenos importantes:
Virus:
Rotavirus
Bacterias: Escherichia coli enterotoxignica
Shigella spp.
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae 01
Salmonella spp.
Protozoos: Cryptosporidium parvum
59
Porcentaje de
casos
Antimicrobianos
recomendados en
base clnica*
Virus
Rotavirus
15-25
Ninguno***
Bacterias
Escherichia coli
enterotoxignica
10-20
Ninguno
Shigella
5-15
Trimetoprimsulfametoxazol,
cido nalidxico
Campylobacter jejuni
10-15
Ninguno
Vibrio cholerae 01
5-10**
Tetraciclina,
Doxiciclina,
otros
1-5
Ninguno***
Escherichia coli
enteropatgena
1-5
Ninguno
Cryptosporidium parvum
5-15
Ninguno***
20-30
Ninguno***
Protozoos
Ningn patgeno
aislado
*
**
***
60
61
Shigella
Shigella es la causa ms importante de disentera, encontrndose en alrededor de 60% de todos los episodios y en prcticamente en todos los episodios graves de esta forma de diarrea; tambin pueden causar diarrea lquida.
S. flexneri es la especie ms prevalente en pases en desarrollo, sin embargo, S. dysenteriae tipo 1 que causa epidemias regionales es responsable de
la disentera ms grave. La destruccin tisular y posiblemente la diarrea lquida son producidas en parte por la extremadamente potente toxina de
Shiga, que es producida en cantidades relativamente grandes por S. dysenteriae
tipo 1. Shigella se disemina principalmente por la transmisin de persona a
persona. El tratamiento efectivo contra Shigella spp. se hace con
antimicrobianos a los cuales son susceptibles, pero es comn la resistencia
antimicrobiana. Puede haber resistencia a mltiples antimicrobianos especialmente en las cepas de S. dysenteriae tipo 1. Los antimicrobianos ms tiles son
trimetoprim-sulfametoxazol y cido nalidxico; en algunas reas tambin es
efectiva la ampicilina.
62
CAPTULO 4
COPROCULTIVO PARA CLERA
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de Vibrio cholerae 01, la bacteria
causante del clera. Esta bacteria se adquiere por ingestin de bebidas o alimentos
contaminados. Llega al intestino delgado, donde se adhiere a la mucosa y, debido a
la produccin de una potente toxina, causa la salida masiva de agua y electrolitos.
En un bajo porcentaje de los pacientes infectados, se produce el colera gravis, la
forma clnica del clera agudo, con muy abundante diarrea acuosa (semejante a
agua de arroz) y vmitos. Esto provoca en el paciente deshidratacin severa que
puede causar la muerte, si no se instituye tratamiento de rehidratacin y antibiticos.
El clera ha sido endmico en la India y en otros pases desde la ms remota
antigedad. En 1961 se inici la sptima pandemia en Indonesia. En enero de 1991
apareci en Per y a partir de all se ha diseminado a varios pases de Latinoamrica,
donde ahora es una infeccin endmica, ms frecuente durante la poca lluviosa.
Vibrio cholerae 01 (01 indica que pertenece al serogrupo 1 segn su antgeno
somtico), se subdivide en tres serotipos: Inaba, Ogawa, y el serotipo Hikojima que
an no se ha detectado en Latinoamrica. Generalmente si la epidemia se inicia
con el serotipo Inaba, despus de algn tiempo se transforma en Ogawa, debido a
cambio de antgenos. Esta clasificacin slo tiene inters epidemiolgico. Existen
dos biotipos de V. cholerae 01: eltor y clsico. En Latinoamrica, durante la presente
pandemia, el biotipo presente es eltor, el cual se caracteriza por causar epidemias
con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves o
asintomticos; tambin sobrevive ms tiempo en el medio ambiente, y es ms resistente a los agentes qumicos.
El tratamiento principal del clera es evitar la muerte por deshidratacin, por
medio del pronto reemplazo de agua y electrolitos. Debe hacerse por va oral y si
es necesario por va intravenosa. El tratamiento con antibiticos ayuda a la recuperacin, pues elimina los vibrios y acorta la diarrea, adems evita portadores de la
bacteria. En adultos se recomienda la tetraciclina, y en nios el trimetoprimsulfametoxazol (cotrimoxazol). En el caso de mujeres embarazadas se indica la
furazolidona.
63
2.
3.
Despus del tiempo crtico de incubacin del APA, retirar el tubo cuidadosamente de la incubadora y colocarlo verticalmente en una gradilla o
soporte. Destaparlo despacio, sin que se agite, y con el asa en anillo,
tomar verticalmente una asada de la superficie del caldo (no ms de 5
mm de profundidad). Inocular una caja de agar TCBS y una de agar
sangre de carnero al 5%. Incubar aerbicamente 18 a 24 horas a 36 C.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
El agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa) contiene elevadas
concentraciones de tiosulfato de sodio y citrato de sodio. La fuerte alcalinidad del
medio de cultivo TCBS, inhibe considerablemente las enterobacterias; la bilis de
buey y el colato inhiben sobre todo a los enterococos. Los coliformes que eventualmente puedan crecer, no fermentan la sacarosa (sinnimo: sucrosa). Contiene dos
indicadores de pH: azul de timol y azul de bromotimol, que viran al color amarillo
en presencia de acidez. Vibrio cholerae es sacarosa positivo, por lo que produce colonias amarillas. Vibrio fluvialis, V. furnissii y V. alginolyticus, tambin producen
colonias amarillas en TCBS; estos vibrios son de muy poca importancia
epidemiolgica. Algunas cepas de enterococos, Proteus y Klebsiella sacarosa-positivo, tambin pueden producir colonias amarillas, pero de morfologa distinta a las
que produce V. cholerae 01.
1.
Vibrio cholerae 01 produce en TCBS el crecimiento masivo y puro de colonias grandes (de 2 a 3 mm de dimetro), de color amarillo canario
(sacarosa-positivo), aplanadas o de bordes delgados. Este tipo de colonias en TCBS, en grandes cantidades debido al enriquecimiento selectivo en APA, son muy indicativas de la presencia de la bacteria.
2.
Si hay crecimiento tpico en TCBS, en el agar sangre de carnero se desarrollar un crecimiento masivo y casi puro de colonias grandes incoloras, brillantes, de bordes aplanados y no hemolticas. En el rea de la
caja donde el crecimiento es confluente, generalmente aparece una zona
de decoloracin del medio que semeja hemlisis; probablemente se debe
al metabolismo de la bacteria, reminiscencia de la hemlisis especfica a
los eritrocitos de carnero, que presentaba originalmente V. cholerae 01
del biotipo eltor; en todo caso, es una caracterstica adicional que ayuda
a sospechar la presencia de la bacteria en este medio.
3.
Aglutinar las colonias tpicas y aisladas del agar sangre de carnero, con
antisuero polivalente anti-V. cholerae 01. Al hacerlo, evitar tomar de las
65
5.
6.
66
Heces lquidas
Hisopo rectal
Vmitos
APA
3. Tomar inculo de la
superficie del APA
4. Sembrar TCBS y agar
sangre de carnero (ASC)
5. Incubar 18-24 horas
o
a 36 C
No agitar
6. Interpretar simultneamente
TCBS
Colonias:
- Amarillas
- Grandes
- Planas
Sembrar antibiograma
ASC
Colonias:
- Grandes
- No hemolticas
Hacer frote
Gram: bacilos
gram-negativo, algunos curvos.
Aglutinar, si positivo dar informe
STAT
STAT: Vibrio cholerae 01
INFORME:
En el caso de clera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de este resultado. Por este motivo se justifica
plenamente usar una tcnica simplificada y evitar pruebas innecesarias, para ahorrar tiempo. Nunca debe esperarse el resultado del antibiograma para hacer el reporte de un cultivo positivo. Se recomienda informar as, lo ms pronto posible, y
al lugar ms indicado:
1.
2.
3.
FRMULAS:
1. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):
Peptona ...................................................................... 10 gramos
Cloruro de sodio. ...................................................... 10 gramos
Agua destilada .......................................................... 1,000 ml
Ajustar pH final a 9.0-9.2 con hidrxido de sodio 1N.
Distribuir 5 ml en tubos 13x100 o de mayor volumen con tapn de rosca.
Autoclavear 15 minutos a 121 C (15 libras de presin por pulgada cuadrada).
68
69
CAPTULO 5
COPROCULTIVO PARA Campylobacter jejuni
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de Campylobacter jejuni. A partir
de 1977, se considera a esta bacteria como un importante agente causal de diarrea
humana. C. jejuni es ms frecuente que Shigella y Salmonella en coprocultivos. Estudios efectuados por el autor en Guatemala, revelan que en heces de nios menores
de cinco aos de edad con diarrea, esta bacteria se aisla aproximadamente en el 10
por ciento. Estos resultados son comparables con otros estudios similares en Latino-amrica; la frecuencia mundial de aislamiento a partir de coprocultivos vara
del 4 al 30 por ciento. Sin embargo, debido a que su aislamiento requiere de un
medio de cultivo y condiciones de incubacin especiales, su bsqueda no se efecta rutinariamente, lo cual debera hacerse debido a su importancia epidemiolgica.
Campylobacter jejuni es un bacilo gram-negativo, curvo, en espiral o en
forma de S. Presenta dos flagelos, uno en cada extremo de la clula, lo que le
proporciona un movimiento rpido y helicoidal, que lanza a la bacteria a manera
de dardo. Es una bacteria estrictamente microaeroflica, oxidasa-positivo, que no
fermenta ni oxida los carbohidratos. Crece a 36 grados centgrados, pero se utiliza
su capacidad diferencial (termfila) de crecer mejor a 42 grados centgrados, para
su aislamiento.
La infeccin intestinal por este bacilo causa diarrea con dolor abdominal,
fiebre y ocasionalmente vmitos. Puede haber sangre macroscpica en las heces,
especialmente en las muestras peditricas. La infeccin se adquiere por va oral,
al consumir agua o alimentos contaminados, especialmente carne mal cocinada y
leche no pasteurizada. La infeccin puede adquirirse de otro humano, o ser una
zoonosis, pues tambin puede adquirirse de los animales. C. jejuni es muy frecuente en animales domsticos y mascotas. Especialmente coloniza pollos y otras
aves; causa enteritis en ganado bovino, y aborto en ovejas. En el humano, adems
de enteritis, ocasionalmente causa septicemia, artritis sptica, meningitis y otras
infecciones.
El diagnstico de campilobacteriosis puede efectuarse presuntivamente por
la observacin directa de bacterias con movimiento de dardo en las heces con
71
campo oscuro o contraste de fases. Un frote coloreado con Gram, muestra abundantes bacilos gram-negativo curvos. El diagnstico definitivo se establece por
medio del aislamiento e identificacin de C. jejuni.
MUESTRA:
En vista que para el aislamiento de C. jejuni se deben aplicar procedimientos
especializados, las muestras deben ser heces frescas, que deben procesarse antes de
dos horas de haber sido emitidas. Las heces no deben estar contaminadas con
orina. Tambin puede utilizarse hisopo rectal, si la inoculacin se efecta inmediatamente.
CONDICIONES NECESARIAS:
El procedimiento para el aislamiento eficaz de esta bacteria, debe incluir los
siguientes aspectos:
1.
2.
3.
72
PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1.
2.
De una colonia aislada con morfologa tpica, hacer inmediata y cuidadosamente un frote (de preferencia del velo circundante), en una pequea gota de agua. Colorear con Gram (dejar la safranina por tres minutos, pues la bacteria se tie plidamente), o con fuchsina bsica al 1%
por 10 a 20 segundos, despus de fijar al calor.
3.
4.
De otra colonia tpica, subcultivar con el asa en hilo a otra caja de Agar
Skirrow, y a una caja de agar sangre de carnero, e inocular un tubo de
agar TSI. Estriar e incubar los tres medios en atmsfera microaeroflica a
42 C, segn ya fue descrito.
5.
El tubo de TSI debe ser K/K, sin gas, y sin cido sulfdrico.
INFORME:
Al detectar la morfologa bacteriana tpica en las colonias que desarrollan a
las 48 horas de incubacin, informar:
Se aisl Campylobacter jejuni, confirmacin pendiente.
Al efectuar las pruebas confirmatorias, reportar:
Se aisl Campylobacter jejuni, se recomienda considerar el tratamiento
con eritromicina.
74
CAPTULO 6
INVESTIGACIN DE Helicobacter pylori
PROPSITO:
Demostrar por medio de observacin, cultivo, o la tcnica indirecta de ureasa,
la presencia de Helicobacter pylori. Esta bacteria se ha reconocido recientemente como
agente causal de gastritis crnica activa tipo B, y predispone a la produccin de
lceras ppticas. Anteriormente se clasificaba en el gnero Campylobacter, pero debido a varias diferencias en su estructura, composicin y susceptibilidad
antimicrobiana, a partir de 1989, se clasifica en el gnero Helicobacter.
Es un bacilo gram-negativo helicoidal o espiral, que presenta movilidad en
forma de dardo debida a sus flagelos. Es una bacteria microaeroflica, cuyo crecimiento ptimo es a 36 C. Se observa o aisla a partir de biopsias de la mucosa
gstrica.
Su deteccin tiene actualmente mucha importancia clnica. El mecanismo
ms probable para explicar la patologa gstrica que causa, es su gran actividad
sobre las clulas parietales del estmago, lo que induce la produccin de gran cantidad de cido clorhdrico. Adems, la potente enzima ureasa que produce H. pylori,
degrada la mucina del moco gstrico y libera gran cantidad de amonio. En
Latinoamrica en general, la gastritis es una enfermedad muy frecuente. Se sabe
que el 70 por ciento la poblacin guatemalteca sufre de infeccin gstrica asociada
a H. pylori, lo que indica la importancia de su bsqueda en nuestro medio. Esta
bacteria es susceptible a eritromicina, tetraciclina, penicilina, gentamicina, cefalotina,
clindamicina, ciprofloxacina y otros antibiticos; tambin es susceptible a las sales
de bismuto que contienen varios medicamentos contra la gastritis. Es resistente a
las sulfonamidas, cido nalidxico y trimetoprim-sulfametoxazol.
MUESTRA:
La muestra siempre debe ser obtenida por el gastroenterlogo por medio de
gastroscopa. Las biopsias, cepillados o aspirados, se toman por el gastroscopio, de
antro pilrico, de cuerpo y de fondo del estmago. Las biopsias producen los resultados ms confiables. Tambin puede usarse la tcnica de la cuerda encapsulada o
Enterotest para extraer moco gstrico.
75
OBSERVACIN DIRECTA:
Puede efectuarse por medio de la observacin de la bacteria en fresco (en
preparaciones con solucin salina), con microscopa de contraste de fases (o campo
oscuro), o en frotes coloreados. En el caso de la observacin en fresco y contraste de
fases, se buscan bacilos curvos muy mviles con el tpico movimiento en forma de
dardo. La coloracin de Gram no se considera adecuada para teir H. pylori. Lo
ms usado es la deteccin de la bacteria en el laboratorio de Patologa, donde se
preparan cortes y frotes por aposicin de la biopsia, y se tien con Giemsa modificado, hematoxilina-eosina o la compleja impregnacin con sales de plata segn
Warthin-Starry. Se buscan abundantes bacilos curvos o helicoidales directamente
sobre la mucosa.
PRUEBA DE UREASA:
H. pylori produce abundante ureasa, enzima que acta sobre el sustrato urea,
con produccin de abundante amonaco, lo cual alcaliniza el medio. Es una prueba
indirecta de la presencia de H. pylori en la muestra, por lo tanto se considera
presuntiva. Proceder as:
1.
2.
3.
4.
Se considera como una prueba positiva cuando el medio vira rpidamente a color rosado fuerte, al alcalinizarse.
CULTIVO:
El aislamiento de H. pylori por medio de cultivo, constituye la confirmacin
definitiva de este diagnstico bacteriolgico. Para efectuarlo, se recomienda proceder as:
1.
2.
3.
4.
5.
Despus de la incubacin prolongada, buscar con ayuda del microscopio estereoscpico o lupa, colonias con las siguientes caractersticas: muy
pequeas (0.5 mm de dimetro, no mayores de 2 mm), circulares,
translcidas y no pigmentadas. Efectuar observacin en fresco con contraste de fases o campo oscuro y/o frote Gram modificado (fucsina bsica al 1% como contraste). Si se observan bacterias con el tpico movimiento en forma de dardo y bacilos gram-negativo curvos o espirales, el
cultivo es compatible con H. pylori.
6.
Las pruebas confirmatorias a partir del cultivo puro son las siguientes:
-
INFORME:
1.
2.
3.
77
CAPTULO 7
UROCULTIVO
PROPSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o urocultivo se
efecta para demostrar la presencia de un nmero significativo de bacterias. En
condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razn, el criterio para interpretar
el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado criterio de Kass, un
nmero de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (unidades formadoras de
colonia por mililitro de orina) se considera infeccin urinaria verdadera, es decir,
es un recuento significativo.
A diferencia de otros cultivos bacteriolgicos, las bacterias que causan la
infeccin urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rpido. Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son las enterobacterias
(bacilos gram-negativo). Escherichia coli es sin duda la bacteria que con ms
frecuencia se aisla de urocultivos positivos, luego:
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Proteus spp.
Pseudomonas aeruginosa (no es enterobacteria)
De menor importancia son los cocos gram positivo:
Enterococcus spp.
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes y Streptococcus sp. (raros)
Staphylococcus epidermidis (puede ser contaminacin)
Staphylococcus saprophyticus (puede ser contaminacin)
Las infecciones mixtas causadas por dos o ms especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indica contaminacin.
La demostracin de la piuria (presencia de leucocitos polimorfonucleares en
el sedimento urinario) y la bacteriuria (bacterias en la orina), son ambos de gran
importancia para establecer el diagnstico de infeccin urinaria.
79
80
*Escherichia coli
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Staphylococcus saprophyticus
Trichomonas vaginalis (protozoo)
Virus Herpes simplex tipo 2
Candida albicans (hongo)
*Bacilos gram-negativo
Ureaplasma urealyticum
Chlamydia trachomatis
Sintomtico: disuria,
frecuencia
Asintomtico
Disuria, frecuencia
Tracto urinario
inferior:
cistitis
Uretritis
Prostatitis
Mayor o igual a
100
Mayor o igual a
100
Mayor o igual a
100,000
(criterio de Kass)
Mayor o igual a
100,000
(criterio de Kass)
CONTEO
SIGNIFICATIVO
(UFC/ml)
Tomado de: Pezzlo, M. 1992. Urine Culture Procedure. In: Isenberg, H.D. (Editor in Chief). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. Two volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA.
*Escherichia coli
*Otros bacilos gram-negativo
Enterococcus spp.
Staphylococcus coagulasa-negativo
Tracto urinario
superior:
pielonefritis
* Aislamiento comn.
*Bacilos gram-negativo
Staphylococcus aureus
Staphylococcus coagulasa-negativo
Candida spp. (hongo)
Mycobacterium spp.
Mycoplasma hominis
MANIFESTACIONES
CLNICAS
TIPO DE
INFECCIN
MICROORGANISMOS
ASOCIADOS CON
LA INFECCIN
TOMA DE LA MUESTRA:
Si en algn examen bacteriolgico la toma de la muestra es crucial, para obtener un resultado de cultivo con correlacin clnica, es en el urocultivo. El meato
urinario, o sea el agujero de salida de la uretra (tubo que desagua la vejiga), est
siempre colonizado por bacterias saprfitas, tanto en el hombre como en la mujer.
Por esta razn, los genitales deben desinfectarse antes de tomar la muestra, segn
se explica a continuacin. Tomar la muestra de orina para urocultivo despus de
dos horas sin que el paciente haya orinado. Si la muestra se toma antes, la orina no
ha pasado suficiente tiempo en la vejiga, para alcanzar cantidades significativas.
TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:
1.
Desinfectar bien la punta del pene del paciente con una gasa estril empapada en jabn antisptico no irritante. Remover el jabn con otra
gasa estril, empapada en agua estril.
2.
3.
4.
Solicitar a la paciente que se coloque sobre la taza del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos ndice y medio de la mano izquierda
debe separarse los labios genitales mayores.
81
2.
3.
4.
2.
3.
Malformacin anatmica que evite la miccin normal del nio, causando contaminaciones.
Urocultivo aerobio negativo varias veces, continan los sntomas, el
sedimento urinario presenta leucocitos y se sospecha de una infeccin
urinaria causada por bacterias anaerobios.
Nota importante: Jams introduzca sonda para tomar el urocultivo. Hace varios
aos que esta tcnica cay en desuso, pues introduce a la vejiga bacterias que estn
colonizando el meato urinario. Recuerde que de ser posible debe tomarse la primera orina de la maana, generalmente esto no es posible, por lo que debe esperarse
un mnimo de dos horas sin que el paciente orine antes de obtener el urocultivo
para que las bacterias tengan suficiente tiempo para reproducirse hasta nmeros
significativos dentro del sistema urinario.
PROCEDIMIENTO:
1.
Ya que la muestra ha sido colectada siguiendo estrictamente las instrucciones anteriores, sembrar la orina en dos medios de cultivo segn la
tcnica del asa calibrada usada en la Clnica Mayo (Rochester, Minnesota,
EUA). Los dos medios de cultivo a utilizar son:
Agar sangre de carnero al 5%: crecen la mayora de bacterias.
MacConkey: crecen slo bacilos gram-negativo aerobios (enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
Alternativamente usar solamente el medio CLED si el microbilogo
a cargo conoce su interpretacin, la cual puede ser confusa, por lo
que no se recomienda.
2.
Para sembrar, usar una asa calibrada de platino (95% platino, 5% rodio)
que tome 0.001 ml. Agitar el frasco de orina (de preferencia con agitador
vortex, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fra
en la orina, justamente por debajo de la
superficie.
3.
Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja
y pasando por el centro. Flamear e inocular en igual forma el MacConkey. Alternativamente, sembrar una biplaca de
agar sangre de carnero y MacConkey, con
83
1. Agitar
2. Tomar 0.001 ml
con asa calibrada
de platino,
verticalmente y
justamente por
debajo de la
superficie
INOCULAR DE RUTINA
BIPLACA
ASC
MacConkey
Medios: 1o: Agar sangre
de carnero (ASC)
2o. MacConkey
5.
5.
6.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1.
2.
Tericamente cada bacteria origina una colonia en la superficie del medio, pero esto no es estrictamente cierto, pues cadenas o grupos de bacterias tambin pueden originar una sola colonia. Por esta razn se deben contar y reportar unidades formadoras de colonias o UFC. La
cantidad de colonias, en el agar sangre debe ser igual o muy similar en
el MacConkey. Si en el MacConkey crece una enterobacteria, en el agar
sangre tambin deber aparecer, es decir, debe haber correlacin entre
ambas cajas. De all se deriva la importancia de interpretar el crecimiento de ambas cajas simultneamente y de usar un medio selectivo/diferencial y otro rico no inhibidor, cuando se trata de una bacteria grampositivo, slo crece en agar sangre.
3.
85
UFC/ml de orina
25,000
78,000
ms de 100,000
TEXTO
DEL INFORME:
E. coli ms de 100,000
UFC /ml. S/A (susceptibilidad antimicrobiana)
Se aisl Escherichia coli, ms de 100,000 UFC /ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
De una colonia tpica, inocular un TSI, LIA, MIO y Citrato de Simmons para
confirmar la identificacin presuntiva de E. coli y al mismo tiempo inocular de la
misma colonia y otras idnticas, la prueba de susceptibilidad antimimicrobiana o
antibiograma, segn la tcnica de Bauer-Kirby descrita. Pueden aislarse cepas de
E. coli fermentadoras lentas de lactosa y debern identificarse con TSI y LIA, no
presentan diseminacin en cepas en el agar sangre.
Si las colonias en el MacConkey son rojas (lactosa positivo) pero mucosas,
informar:
CLAVE:
TEXTO:
Klebsiella-Enterobacter ms
de 100,000 UFC /ml. S/A.
Se aisl Klebsiella-Enterobacter ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
Si las colonias en MacConkey son lactosa-negativo (incoloras), hay correlacin en el agar sangre (donde las colonias son grandes, beta
86
TEXTO:
Pseudomonas aeruginosa
ms de 100,000 UFC /ml.
S/A.
Se aisl Pseudomonas aeruginosa, ms de 100,000 UFC/ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
TEXTO:
Se aisl Proteus sp. ms de 100,000 UFC ml. Infeccin urinaria verdadera, segn el criterio de Kass. S/A.
Despus de 18 a 24 horas de incubacin a 36 C de las pruebas de identificacin interpretar para confirmar su reporte inicial con las reacciones en TSI, LIA y
urea segn el Captulo del coprocultivo. Notar reaccin roja (R) en la superficie de
LIA y urea positivo para el gnero Proteus.
8.
SE OBSERVA
Alfa
Un halo verde
Beta
87
Si no se observa ningn crecimiento a las 24 horas de incubacin, descarte las cajas y reporte as los urocultivos negativos:
CLAVE:
TEXTO:
N-24
88
UFC/ml
10,000 - 10,000 *
10,000 - 50,000
50,000 - 100,000
100,000 o ms
Se aisl_________ , ms de 100,000 UFC/ml. Infeccin urinaria verdadera de acuerdo con el criterio de Kass. S/A.
*30 a 50 por ciento de mujeres con infeccin vesical y/o uretral con disuria,
urgencia y frecuencia (sndrome uretral agudo) no llenan el criterio de Kass.
En estos casos, 100 UFC/ml de orina debe ser el lmite para hacer diagnstico
correcto, en asociacin ntima con el mdico tratante. (Segn Jacobo Sabbaj K.,
VI Congreso Centroamericano de Microbiologa, Guatemala, 5-9 de diciembre de
1983).
DETECCIN DE BACTERIURIA POR LA COLORACIN
DE GRAM DE ORINA NO CENTRIFUGADA:
En aquellos laboratorios en donde no es posible efectuar urocultivo, este mtodo fcil y barato lo sustituye. La coloracin de Gram de orina puede detectar
tanto la presencia de bacterias como de leucocitos. Proceder as:
1.
2.
Dejar secar al aire, fijar con calor, marcar por detrs con un crculo de
crayn graso y colorear cuidadosamente con Gran.
3.
4.
5.
6.
90
CAPTULO 8
CULTIVO DE GARGANTA
PROPSITO
El cultivo de garganta, se efecta para demostrar la presencia de Streptococcus
pyogenes (Streptococcus que pertenece al grupo A de Lancefield y es beta hemoltico).
No debe llamarse orocultivo, pues este trmino significa literalmente cultivo de
boca. Algunas otras bacterias mucho menos importantes en infecciones de la faringe,
son:
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Klebsiella pneumoniae
Otras enterobacterias
Pseudomonas aeruginosa
Estos microorganismos slo deben reportarse si predominan sobre la
microbiota normal de la garganta, que es abundante y muy variada.
Streptococcus agalactiae del grupo B y los estreptococos de los grupos C, F y G
de Lancefield tambin son beta hemolticos (generalmente presenta poca hemlisis
beta). Pueden ser agentes etiolgicos de faringitis, por lo que debe identificarse
adecuadamente.
Los sntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe por
Streptococcus pyogenes son: dolor de garganta, ganglios linfticos del cuello agrandados, dolor de cabeza, nusea, vmitos y dolor abdominal. La infeccin de la
faringe causada por virus provoca tos, secrecin nasal y nariz tapada. Sin embargo,
con mucha frecuencia no es posible establecer diagnstico slo en base a observaciones clnicas.
MUESTRA:
No es necesario que el paciente est en ayunas; sin embargo, conviene dejar
pasar 1 a 2 horas para que se vuelva a formar la secrecin que fue deglutida. Debe
tomarse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibiticos. El cultivo de
garganta debe tomarse con sumo cuidado. Es indispensable examinar bien las le-
91
siones en la garganta del paciente en el laboratorio para tomar la muestra del lugar
preciso. Siga al pie de la letra las siguientes instrucciones:
1.
2.
Pedir al paciente, viendo hacia arriba que abra la boca, saque la lengua y
diga aahh.
3.
4.
Localizar en el fondo de la garganta y en las amgdalas (que se encuentran a los lados), las siguientes lesiones:
Inflamacin (enrojecimiento)
Pus (secrecin blanquecina o amarillenta)
lceras blanquecinas
5.
Con un hisopo estril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado
de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos
(cachetes) o los labios, al retirar el hisopo.
PROCEDIMIENTO:
1.
2.
Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel hmeda, colocar la caja con el medio arriba y
luego introducir sobre una tapa de caja de Petri una veladora o candela
corta encendida. Cerrar el frasco bien, sellarlo con masking-tape. La
vela se apagar sola. Es conveniente aplicar (una vez a la semana) un
poco de cera a la boca del frasco y a la rosca interna de la tapadera, para
que sellen bien.
4.
93
Muestra: Tomar un
hisopo farngeo con
buena luz y bajalenguas
vula
Amgdala
Farnge
posterior
2. Inocular una caja de agar sangre de carnero por estras, con dos cortadas
de 1 cm, sin flamear entre cada estra
3. Colocar sobre la primera estra, un disco de bacitracina de 0.04 unidades
y un disco de 30 mcg de neomicina, separados 8-10 mm entre s
4. Incubar en jarro con candela y humedad a 36o C
Cortada 1
Disco de bacitracina
Disco de neomicina
A
N
30
Cortada 2
INTERPRETACIN:
La microbiota de la faringe es sumamente variada; predominan Streptococcus
sp. alfa hemolticos (hemlisis verde) llamados por esta razn grupo viridans y
neisserias no patgenas. Estos grupos bacterianos nunca deben reportarse.
Con el objeto de no perderse en la interpretacin de este cultivo, que siempre
presenta muchos tipos de colonias, utilice los siguientes criterios:
1.
2.
3.
4.
Si las colonias beta hemolticas no estn aisladas, hacer una purificacin as: con una asa recta o aguja de diseccin flameada, tomar las colonias beta hemolticas con cuidado, aunque se tome de otras colonias
que estn muy cercanas o adyacentes. De preferencia hacer esto bajo el
microscopio estereoscpico. Trasladar el inculo dos o tres veces a un
extremo de una caja de agar sangre de carnero y luego con dos asas en
95
anillo, estriar en toda la caja con dos cortadas, al igual que el cultivo
inicial. Colocar con pinzas estriles un disco bacitracina en el inicio de la
segunda estra.
5.
Tipo de hemlisis
Apariencia de halo
Alfa
Verde (incompleta)
Beta
6.
Reportar
- (no inhibicin)
La inhibicin por el disco de bacitracina identifica a S. pyogenes con 95% de certeza. Cualquier
dimetro de halo de inhibicin se considera significativo. Efectuar simultneamente susceptibilidad a un disco de trimetoprim-sulfametoxazol; S. pyogenes es resistente a este antibitico, lo que
aumenta la certeza de la identificacin, junto con la prueba de CAMP negativa (tcnica adelante).
7.
8.
Aparte de las causadas por Streptococcus pyogenes, son raras las infecciones de la garganta ocasionadas por otras bacterias. Reportar las bacterias que se citan a continuacin solamente cuando predominan por encima de la microbiota normal. Examinar la ltima estra que presenta
colonias separadas. Con mucho cuidado y con lupa, observar si hay ms
colonias que Streptococcus sp. alfa hemoltico y Neisseria sp., de:
Streptococcus pneumoniae (neumococo): coco gram-positivo ovalado o lanceolado, agrupado en parejas. Colonias alfa hemolticas
aplanadas o ligeramente mucosas (debido a la presencia de cpsula). Al pasarlo a otro agar sangre de carnero es inhibido por el
disco de optoquina Taxo P o Disco N). Ver tabla adelante en
nmero 8. Esta bacteria es parte de la microbiota normal de la garganta, en bajas concentraciones.
97
Informar
+ (presencia de halo)*
- (no inhibe)
**
9.
Informar
NP
(en libro de registro)
10.
98
Cefalea
Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Klebsiella spp. y otras enterobacterias
Bacteroides spp. y otros anaerobios (sinusitis)
Garganta y faringe:
Corynebacterium diphtheriae
Pus en amgdalas
Neisseria gonorrhoeae
Pseudomembranas
Bordetella pertussis
Edema de la vula
Lengua con cubierta griscea
Linfadenitis cervical
2.
Luego con sumo cuidado, hacer una estra con el Streptococccus beta
hemoltico a identificar, perpendicular a la estra de S. aureus pero que
no la toque (A). Generalmente S. agalactiae presenta un halo pequeo de
hemlisis beta, el cual puede disminuir al sub-cultivar.
3.
Incubar en jarro con candela y humedad de 18 a 24 horas a 36 C. Interpretar como Streptococcus agalactiae del grupo B de Lancefield si se
produce una flecha de intensa beta hemlisis que apunta hacia la estra de Staphylococcus aureus (B).
99
Strepto.
Strepto.
Flecha
Staph.
Staph.
4.
5.
100
Tomado de:
101
Tomado de:
102
1
2
3
Debido a que los eritrocitos de la especie Ovis aries (carnero: macho, oveja: hembra y cra: cordero) son sumamente susceptibles a
la accin de las hemolisinas bacterianas, se incrementan considerablemente las hemlisis de tipo beta.
Se evitan reacciones hemolticas dudosas, que dificultan la interpretacin de los cultivos, pues en agar sangre de carnero se diferencian perfectamente las hemlisis verdosas de tipo alfa, de las
reacciones de hemlisis completa tipo beta.
En los cultivos de garganta es muy importante su uso, pues la sangre de carnero por su bajo contenido de nucletidos de piridina
(factor V) es inhibitoria para Haemophilus haemolyticus, que produce colonias idnticas a Streptococcus pyogenes, por lo que evita
falsos positivos.
103
4
5
Referencia:
Torres, M.F. 1986. Estandarizacin de la Bacteriologa Mdica en Guatemala
(Conferencia magistral). En: Memorias, III Congreso Nacional de
Microbiologa, pgina 20. Guatemala 2-6 diciembre.
104
CAPTULO 9
CULTIVOS DE GARGANTA ESPECIALES
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo la presencia de dos bacterias que solamente
deben investigarse en casos especiales y justificados:
1.
2.
Neisseria meningitidis: es la bacteria causante de severa y muy contagiosa meningitis (infeccin de las membranas que cubren el cerebro), y por
lo tanto se investiga principalmente en lquido cefalorraqudeo. Su presencia debe investigarse por cultivo de garganta en parientes, mdicos,
enfermeras, o tcnicos de laboratorio que han estado en contacto directo
con pacientes (generalmente nios) con meningitis meningocccica. A
estas personas se les llama contactos. El propsito fundamental es
erradicar la bacteria de la garganta de los contactos con tratamiento
antibitico adecuado, para evitar la diseminacin de la infeccin que
puede llegar a ser epidmica.
INVESTIGACIN DE Corynebacterium diphtheriae:
MUESTRA Y PROCEDIMIENTO:
El diagnstico de la difteria es primordialmente clnico. De ninguna manera
es aceptable que el mdico delegue esta responsabilidad en el laboratorio de
microbiologa, por medio de un frote de exudado farngeo coloreado con Gram.
C. diphtheriae es un bacilo gram-positivo en forma de maza (un extremo ms
105
2.
3.
Tomar de nuevo muestra con otro hisopo, e inocular una caja de agar
chocolate-telurito de potasio. Incubar aerbicamente a 36 C por 18 a 24
horas.
4.
Tomar un tercer hisopo de las pseudo-membranas, e inocular directamente una caja de agar sangre de carnero al 5%, con cortadas, para investigar la presencia de Streptococcus pyogenes. Incubar en jarro hmedo
con candela a 36 C.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
El objeto del medio de Loeffler es permitir que C. diphtheriae crezca ms
abundantemente que la microbiota de la garganta, slo durante las primeras
ocho horas de incubacin, y sobre todo con su morfologa tpica.
Proceder as:
1.
106
2.
Colorear un frote con Gram. Fijar el otro frote con calor leve a la llama, y
teirlo un minuto con azul de metileno de Ziehl-Neelsen.
3.
4.
5.
6.
INFORME:
1.
Si la morfologa del crecimiento en Loeffler (incubado slo de 2 a 8 horas) es muy tpica, y no se cultiv en chocolate-telurito, informar:
Se aisl un bacilo gram-positivo, de morfologa compatible con
Corynebacterium diphtheriae.
107
2.
2.
Con cada hisopo por separado, inocular un tubo del medio ThayerMartin; estriar bien la superficie del medio con el mismo hisopo.
108
3.
INTERPRETACIN:
1.
2.
Con el asa en hilo, y con mucho cuidado, hacer un pequeo frote Gram
de las colonias sospechosas; deben observarse diplococos gram-negativo en forma de granos de caf, agrupados en parejas.
3.
Para obtener un cultivo puro, subcultivar las colonias que presentan esta
morfologa microscpica a una caja de agar chocolate (sin inhibidores),
e incubar en jarro con candela por 18 a 24 horas.
4.
Efectuar la prueba de oxidasa, ya sea agregando el reactivo directamente sobre la caja, o frotar las colonias con palillo de madera sobre discos
hmedos con el reactivo de oxidasa. La aparicin de coloracin morado
oscuro-negro, indica una prueba positiva. Si este es el caso, proceder a
efectuar la prueba de oxidacin de maltosa y sacarosa, segn se indica
en el captulo de secreciones genitales. N. meningitidis oxida la maltosa,
pero no la sacarosa (sucrosa). Neisseria lactomica que tambin crece en el
medio Thayer-Martin y tiene inters clnico, debe identificarse con la
oxidacin positiva de la lactosa.
5.
INFORME:
Si todas las pruebas anteriores son positivas, y se est seguro que no se trata
de una Neisseria sp. o Branhamella catarrhalis, tan frecuentes en la microbiota normal de la garganta, informar: Se aisl Neisseria meningitidis.
Si se cuenta con los antisueros de tipificacin, realcela e informe:
Se aisl Neisseria meningitidis del grupo __. (segn el que haya aglutinado)
109
Fotografas
a
Color
111
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
116
31
32
FOTOGRAFAS
Foto 1. Listeria monocytogenes, en contraste de fases. Los bacilos aparecen incoloros y
brillantes . No es una coloracin, sta tcnica de observacin en fresco proporciona
excelente contraste. Foto: CDC, Atlanta, Georgia, EUA.
Foto 2. Listeria monocytogenes, coloracin de Gram. Aislamiento de lquido
cefalorraqudeo. Bacilos regulares de coloracin slida. Presentan el tpico color morado
negruzco las bacterias gram-positivo. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C.,
E.U.A.
Foto 3. Staphylococcus aureus, coloracin de Gram de cultivo puro obtenido de secrecin
de herida infectada. Son cocos esfricos de una micra de dimetro, agrupados en forma
de racimos. Foto: Walter Reed Institute, Washington, D.C., E.U.A.
Foto 4. Streptococcus pyogenes, frote Gram de secrecin de oreja necrtica. Presenta
abundantes cocos gram-positivo pequeos y ligeramente ovalados, sueltos, en parejas
y cadenas cortas. Infeccin infantil mortal, Laboratorio de Microbiologa, Hospital
General del IGSS zona 9, agosto de 1982. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 5. Streptococcus pneumoniae, frote Gram de esputo purulento de paciente con
neumona lobar. Imagen tpica de esta bacteria: cocos gram-positivo agrupada en
parejas. Foto: Institut Pasteur, Pars, Francia.
Foto 6. Streptococcus pneumoniae, frote de sedimento de lquido cefalorraqudeo (LCR)
de paciente con meningitis grave. Presenta abundantes cocos gram-positivo ovalados;
se insina la cpsula como un halo claro difuso alrededor de las clulas. Aparecen dos
leucocitos polimorfonucleares (gram-negativo). Foto: Rubn Mayorga Peralta,
Guatemala.
Foto 7. Escherichia coli, frote Gram de cultivo puro obtenido de urocultivo positivo.
Bacilos gram-negativo, regulares, de coloracin slida y bordes redondeados. Esta
morfologa es tpica en las enterobacterias. Foto: Walter Reed Institute, Washington,
D.C., E.U.A.
Foto 8. Bacteroides fragilis, coloracin de Gram de cultivo puro. Presenta coloracin rojo
plido (tpica de los anaerobios gram-negativo) y pleomorfismo. Foto: Anaerobe
Laboratory, Virginia Politechnic Institute, Blacksbourg, E.U.A.
Foto 9. Shigella flexneri, Salmonella enteritidis y Escherichia coli en Agar Hektoen Enterics.
Este medio selectivo para bacilos gram-negativo, brinda buena diferenciacin. Las
colonias de bacterias lactosa-positivo como E. coli presentan color salmn; las lactosa-
117
negativo como Shigella spp. dan colonias puntiformes color verde plido. Las colonias
productoras de cido sulfhdrico como Salmonella spp. manifiestan color negro en la
colonia. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 10. Arizona hinshawii y Escherichia coli en MacConkey (izquierda) y Hektoen
(derecha). Cultivo mixto de miositis necrotizante severa en un paciente peditrico,
Hospital General del IGSS zona 9, 1982. Este cultivo semeja un coprocultivo positivo a
Salmonella enteritidis. En MacConkey las colonias lactosa-positivo son rojas y las lactosanegativo incoloras. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 11. Reacciones tpicas de Salmonella enteritidis en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie
alcalina (rojo), fondo cido (amarillo, oculto por el precipitado negro), presenta
abundante gas (burbuja y fondo separado) y cido sulfhdrico (negro). El LIA (arriba)
es alcalino/alcalino (violeta), lo que indica descarboxilacin del aminocido lisina,
tambin presenta precipitado negro debido al cido sulfhdrico. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 12. Reacciones tpicas de Shigella flexneri en TSI/LIA. TSI (abajo): superficie alcalina
(rojo), fondo cido (amarillo), no presenta gas ni cido sulfhdrico. El LIA (arriba) es
alcalino/cido (K/A), sin gas ni cido sulfhdrico. En Shigella spp. frecuentemente el
color del fondo de ambos tubos es amarillo canario y el TSI huele a semen. Foto: Miguel
F. Torres, Guatemala.
Foto 13. Reacciones de tres enterobacterias en TSI. De izquierda a derecha: medio no
inoculado (K/K), Escherichia coli (A/A,++,-), Salmonella enteritidis (K/A, +,+++) y
Salmonella typhi (K/A,-,+poco). Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
Foto 14. Vibrio cholerae 01 en agar TCBS. Cultivo de heces de paciente guatemalteco con
clera enriquecido en agua peptonada alcalina (APA), luego sembrada en TCBS.
Colonias tpicas: grandes, aplanadas y amarillas (sacarosa-positivo). Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 15. Efecto del enriquecimento de coprocultivo en APA para el aislamiento de
Vibrio cholerae 01. Izquierda: cultivo en TCBS de enriquecimiento en APA, muestra
crecimiento puro y masivo. Derecha: cultivo de heces sembradas directamente en TCBS,
sin enriquecimiento, presenta crecimiento ms escaso de cultivo mixto. Foto: Miguel F.
Torres, Guatemala.
Foto 16. Prueba de susceptibilidad segn el mtodo de Bauer-Kirby. El biotipo eltor de
Vibrio cholerae 01 es resistente al disco de 50 UI de Polimixina-B, que se observa en el
centro. Fotografa: Miguel F. Torres, previamente publicada en Torres, M. et al. 1991.
Etiologa y Diagnstico de Laboratorio de el Clera. OPS/OMS, Guatemala.
118
119
etil cuprena (optoquina, derivado de la quinina). Las cepas mucosas dan tambin las
reacciones tpicas de inhibicin y alfa hemlisis. Foto: Miguel F. Torres, Guatemala.
Foto 25. Haemophilus influenzae, prueba de satelitismo de sub-cultivo de aislamiento de
LCR. Paciente guatemalteco de un ao con meningitis mortal. H. influenzae crece slo
muy cerca de la estra de Staphylococcus aureus. En el agar sangre de carnero el factor V
(nucletidos de piridina o nicotinamida adenina dinucletido) se encuentra dentro de
los eritrocitos, el factor X (hemina) s se encuentra libre en el medio. S. aureus libera
factor V, por lo que causa satelitismo de ciertos Haemophilus spp. Foto: Miguel F. Torres,
Guatemala.
Foto 26. Shigella dysenteriae tipo 1 (Bacilo de Shiga). Prueba de susceptibilidad segn el
mtodo de Bauer-Kirby, de una cepa aislada en INCAP (Instituto de Nutricin de
Centroamrica y Panam, Guatemala) durante la epidemia de shigellosis 1969-70. Foto:
Leonardo J. Mata, Costa Rica.
Foto 27. Demostracin del mtodo para preparacin de frotes de esputo entre dos portaobjetos. M. Torres y sus estudiantes en el curso Bacteriologa II, Laboratorio de
Microbiologa, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, USAC, 1979. Foto: annima.
Foto 28. Mycobacterium tuberculosis en frote de esputo coloreado con la tcnica de ZiehlNeelsen. Los bacilos alcohol-cido resistentes aparecen teidos de color rojo. La
coloracin de Kinyoun da los mismos resultados. Foto: Gillies R.R. y T.C. Dodds,
Inglaterra.
Foto 29. Colonias de Mycobacterium tuberculosis, acercamiento con microscopio
estereoscpico. Este tipo de colonias rugosas y de bordes irregulares, son llamadas
eugnicas. No presentan pigmento. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
Foto 30. Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, con factor cordn. Las cepas ms virulentas
de M. tuberculsis manifiestan esta caracterstica. Se observa el crecimiento en forma de
cordones sinuosos. Foto: Rubn Mayorga Peralta.
Foto 31. Mycobacterium kansasii, crecimiento eugnico en el medio de Lowenstein-Jensen.
Fu cultivado en la oscuridad por varias semanas, con el tubo cubierto por papel negro
de manera que no tuviera contacto con la luz. No presenta pigmento. Foto: CDC, Atlanta,
E.U.A.
Foto 32. Mycobacterium kansasii, cultivo en Lowenstein-Jensen despus de exposicin a
la luz. Es fotocromgeno, es decir que presenta pigmento anaranjado fuerte slo en
presencia de luz. Foto: CDC, Atlanta, E.U.A.
120
CAPTULO 10
CULTIVO DE ESPUTO
PROPSITO:
Demostrar por medio de frote coloreado con Gram y cultivo, la presencia de
bacterias causantes de infeccin respiratoria inferior. La neumona bacteriana, o
infeccin del pulmn causada por bacterias puede ser de dos tipos:
a.
b.
MUESTRA:
La infeccin bacteriana de trquea y bronquios produce abundante esputo.
Debe obtenerse el primer esputo de la maana, pues es ms espeso y no est contaminado por comida. Indicar al paciente que al despertar, se enjuague la boca con
agua corriente (sin usar antispticos ni pasta dental) y luego acostado en su cama
(boca abajo) debe desgarrar esputo con fuerza, y depositarlo directamente en un
recipiente estril de boca ancha proporcionado por el laboratorio. Para este propsito, el laboratorio debe contar con recipientes estriles de plstico, descartables. Si
no se cuenta con este material, deben esterilizarse suficientes frascos de vidrio,
pequeos y de boca ancha.
En el caso del cultivo de esputo, para obtener resultados confiables, es crucial
la obtencin de una buena muestra. Si el cultivo se efecta de material inadecuado
como saliva, el resultado confundir al mdico tratante porque no se detect el
verdadero patgeno, o se recuper de la microbiota de la saliva un patgeno potencial que no es el agente etiolgico primario de la neumona. Por este motivo, el
laboratorio deber rechazar sin vacilar las muestras que se consideren insatisfactorias, segn los criterios que aparecen ms adelante.
Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para
efectuar el frote Gram y cultivo de rutina, pero son insuficientes para el cultivo de
121
2.
Quebrar los extremos de dos aplicadores de madera estriles. Con ayuda de las puntas irregulares, seleccionar las partculas anormales: con
pus (blanquecino), o sangre (rojizo).
3.
4.
Seleccionar el mejor de los dos frotes. Dejar secar, y luego fijar con calor
122
Ms de 10 clulas epiteliales/campo, y
Menos de 25 leucocitos/campo (criterio de la Clnica Mayo, de
Murray y Washington, y de Van Scoy).
2.
No debe sobre interpretarse la presencia de bacterias. Es muy importante detectar y reportar principalmente el tipo de bacterias que predomina. Los cocos gram-positivo usualmente se localizan alrededor de las
clulas epiteliales.
3.
El predominio de un tipo de bacterias, permite distinguir simple colonizacin de infeccin verdadera. El mdico debe relacionar estos datos
con las observaciones clnicas.
4.
Observar cuidadosamente la presencia de pequeos cocobacilos gramnegativo (Haemophilus influenzae), hongos filamentosos que son grampositivo, y filamentos gram-positivo delgados y ramificados (Nocardia
asteroides o Actinomyces israelii). Los hongos intracelulares deben detectarse con la coloracin de Giemsa.
6.
CULTIVO DE ESPUTO:
El esputo vertido en una caja de Petri estril (para poder seleccionar mejor la
fraccin de la muestra a analizar), debe procesarse as:
1.
2.
3.
4.
5.
Examinar las cajas simultneamente, con lupa y buena luz o microscopio estereoscpico. En primer lugar, buscar en el agar sangre de carnero
colonias de Streptococcus pneumoniae, con las siguientes caractersticas:
124
b.
4.
miento slo muy cerca de la estra de S. aureus). El frote Gram del crecimiento de las pequeas colonias satlites presenta predominio de
cocobacilos gram-negativo, con algunas formas filamentosas. Es oxidasapositivo.
5.
6.
En el caso de Streptococcus pneumoniae: debe efectuarse prueba de susceptibilidad antimicrobiana a la penicilina. Cada vez aparecen ms reportes en la literatura de cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina
por la produccin de beta lactamasa. Hacer la prueba para determinar
la susceptibilidad a la penicilina en agar Mueller-Hinton + 5% de sangre
de carnero en jarro con candela, con un disco de 1 g de oxacilina; se
interpreta como susceptible la presencia de un halo de inhibicin mayor
o igual a 20 mm (NCCLS, M100-56, 1995). Si es posible, detectar la produccin de beta lactamasa por un mtodo confiable. En el caso de
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, otras
enterobacterias o Haemophilus influenzae (en este caso en agar chocolate), s efectuar prueba de susceptibilidad.
7.
Debe tomarse en cuenta que en los cultivos de esputo, rara vez se obtienen cultivos puros. Identificar otras bacterias que pueden causar neumona humana, solamente si su crecimiento predomina.
8.
9.
Tos
Streptococcus pneumoniae
Dolor torxico
Haemophilus influenzae
Disnea
Staphylococcus aureus
Consolidacin pulmonar
Sonidos anormales
Legionella spp.
Mycobacterium spp.
Infiltrado (Rayos-X)
Fusobacterium nucleatum
Matidez a la percusin
Bacteroides melaninogenicus
Cavitacin
y otros anaerobios
Empiema
127
CAPTULO 11
HEMOCULTIVO / MIELOCULTIVO
PROPSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se
estn reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el
cultivo de mdula sea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. La septicemia es una de las enfermedades infecciosas
ms graves, por esta razn la deteccin efectiva y rpida de la bacteria causante,
constituye una de las funciones ms importantes del diagnstico bacteriolgico. La
deteccin de bacterias en sangre o mdula sea tiene importancia diagnstica y
pronstica. En el caso de fiebre tifoidea, causada por S. typhi, su hallazgo en la
sangre, o ms efectivamente en mdula sea, constituye el diagnstico de sta severa infeccin, y permite instituir tratamiento con el delicado antibitico de eleccin (cloranfenicol).
En condiciones normales no se detectan bacterias en la sangre. Las bacterias
penetran hacia el torrente circulatorio desde sitios extravasculares, por los vasos
linfticos. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema reticulo-endotelial para removerlas de la sangre, ocurre la
septicemia. Se diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio, la cual ocurre cotidianamente durante el cepillado
dental, contacto sexual, etc. Actualmente existe la tendencia por usar estos dos
trminos (septicemia y bacteremia) indistintamente
Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. Sin embargo, la
septicemia polimicrobiana se presenta con una frecuencia no despreciable.
MUESTRA:
Los sntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo
son: aumento sbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, calofros,
postracin y presin baja. La recuperacin de las bacterias de la sangre depende de
estos factores:
129
1.
2.
3.
4.
5.
2.
Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisin el sitio donde se va a puncionar.
3.
Es una buena prctica rutinaria lavar con agua y jabn el brazo del
130
5.
Nunca debe cambiarse aguja despus de obtener la sangre, excepto cuando se falla en el intento de hacerlo, y se punciona en otro sitio. Inyectar
exactamente 5 ml de sangre en el frasco que contiene 45 ml de caldo, o
10 ml en un frasco con 90 ml de caldo. En los hemocultivos peditricos,
inyectar 2.5 ml de sangre en 25 ml de caldo.
6.
7.
8.
9.
Las muestras de mdula sea para efectuar el mielocultivo siempre deben ser obtenidas por el mdico, quien puncionar el esternn o la cresta
131
2.
Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar alguno de los siguientes signos
visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el
tipo de bacteria que est creciendo:
OBSERVACIONES EN HEMOCULTIVOS QUE ORIENTAN
EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
Signo visible
Posible bacteria
Turbidez
Hemlisis
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Listeria spp.
Clostridium spp.
Bacillus spp.
Formacin de gas
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Formacin de pelcula
Pseudomonas spp.
Bacillus spp.
Levaduras
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
132
3.
En caso de observar cualquiera de estas caractersticas, agitar suavemente, limpiar el tapn perforable con algodn y alcohol, puncionar
con jeringa y aguja estriles (puede ser de tuberculina) y aspirar una
pequea cantidad del caldo. Inocular una gota, y luego estriar con asa
sobre una caja de agar sangre de carnero y una caja de agar chocolate;
incubar ambas cajas en jarro con candela. Es aconsejable sembrar tres
gotas del hemocultivo, pero slo estriar una. Si no se observa crecimiento en las gotas no rayadas y lo hay en las estras, posiblemente se trata
de contaminacin. Simultneamente, dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta-objetos; colorear con Gram.
4.
5.
Si se observan cocos gram-positivo esfricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el
aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. Si se observan
diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar
los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estra del agar
sangre de carnero, para acelerar la identificacin presuntiva de
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
6.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS;
1.
grupo D, y anti-antgeno Vi. Si hay aglutinacin franca, reportar inmediatamente la presencia de Salmonella typhi.
2.
3.
Salmonella typhi
Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
SIGNOS Y SNTOMAS
Fiebre en picos
Calofros
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Malestar
134
INFORME:
1.
2.
3.
4.
135
CAPTULO 12
SECRECIONES DIVERSAS
PROPSITO:
Detectar por medio de frote Gram y cultivo aerobio, la presencia de bacterias
que causan infecciones con presencia de pus en la piel, ojos, odos, tejido subcutneo, heridas infectadas y otros sitios anatmicos diversos. A las bacterias que
provocan la formacin de pus se les llama pigenas. En este tipo de infecciones,
son de especial inters los llamados cocos pigenos gram-positivo, que son los
siguientes:
-
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Menos frecuentemente pueden aislarse de este tipo de lesiones, otras bacterias tales como:
-
MUESTRA:
La muestra deber obtenerse segn el sitio anatmico, siempre con material
estril y antes de tratamiento con antibiticos. En la mayora de los casos puede
usarse hisopo estril (envuelto en papel individual, no dentro de frasco). Cuando
la cantidad de pus es muy escasa, tomar la muestra con el extremo puntiagudo y
delgado de un aplicador de madera estril que ha sido quebrado por los extremos.
Tambin puede usarse la punta de una asa espatulada flameada y fra, bistur pequeo (nmero 15), o una lanceta estril.
137
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Eritema y edema
Enterobacterias
Dolor
Pseudomonas aeruginosa
Enterococos
138
2. OJOS:
Tomar la muestra con hisopo estril, as: bajar el prpado inferior, haciendo
presin hacia abajo, a manera de exponer la conjuntiva enrojecida y purulenta (usar
guantes de hule estriles). Frotar la conjuntiva al mismo tiempo que se rota el hisopo
hacia afuera, con mucho cuidado de no raspar el globo del ojo. Inocular agar sangre de carnero, agar chocolate, agar manitol-sal y agar MacConkey, en ese orden.
Descartar el hisopo, y con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra. Hacer un
frote pequeo sobre un porta-objetos limpio, con cuidado de no frotar excesivamente.
En los cultivos oculares es muy importante incluir siempre agar chocolate,
para lograr el crecimiento de las bacterias fastidiosas (difciles de cultivar) que causan conjuntivitis. Si en el frote Gram se observan diplococos gram-negativo, inocular un tubo de medio Thayer-Martin, selectivo para N. gonorrhoeae.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE INFECCIN OCULAR
SIGNOS Y SNTOMAS
Secrecin conjuntival serosa
o purulenta
Hiperemia ocular
Dolor ocular
3. ODOS:
En los casos de otitis media, generalmente no es necesario que el mdico
otorrinolaringlogo puncione el tmpano (timpanocentesis). Este procedimiento
jams debe practicarse por el personal del laboratorio. Proceder as: con un hisopo
empapado en alcohol, y luego exprimido con papel absorbente, limpiar bien el
odo externo. Introducir en el canal auditivo otro hisopo estril, despacio y sin tocar el pabelln de la oreja, con cuidado de no llegar al tmpano. No debe haber
sangrado. Con el hisopo empapado en pus, inocular los siguientes medios: agar
sangre de carnero, agar chocolate, agar manito-sal y agar MacConkey, en ese or139
den. Con un segundo hisopo estril, tomar ms muestra y sin frotar mucho, hacer
un pequeo frote sobre porta-objetos limpio.
ETIOLOGA Y SINTOMATOLOGA DE OTITIS MEDIA
SIGNOS Y SNTOMAS
Secrecin tica purulenta
Streptococcus pneumoniae
Cefalea pulstil
Haemophilus influenzae
Crnico:
Pseudomonas aeruginosa
Proteus spp.
Anaerobios
4. MISCELNEOS:
Antes de obtener la muestra, debe ponerse especial cuidado en desinfectar
bien las reas que se espera estn colonizadas por abundante microbiota. El objeto
de esta operacin, es evitar contaminaciones innecesarias que dificultan la interpretacin del frote Gram y el cultivo.
El material para tomar las muestras debe ser estril. La toma de muestra debe
ser agresiva pero cuidadosa; un hisopo frotado descuidadamente sobre una lesin
seca y no de un sitio representativo, es completamente intil. El sangrado debe
evitarse en la medida de lo posible. Para la toma de muestras difciles o invasivas,
que representen peligro para el paciente, debe solicitarse la intervencin del
microbilogo o del mdico.
Los lquidos acuosos y de volumen grande, deben centrifugarse y luego hacer frote Gram y cultivo del sedimento. Inocular el medio de Thayer-Martin si se
sospecha la presencia de Neisseria gonorrhoeae, y el medio de Lowenstein-Jensen si
se sospecha la presencia de Mycobacterium tuberculosis. En el captulo 17 sobre
Anaerobios, se explica que tipo de muestras deben sembrarse en anaerobiosis y
como deben procesarse.
140
PROCEDIMIENTO:
Teir el frote con la coloracin de Gram, segn el captulo correspondiente.
Las muestras obtenidas siguiendo las instrucciones anteriores, y que fueron inoculadas directamente en un extremo de cada caja, deben diseminarse aspticamente
en la superficie de los medios de cultivo. Para este propsito, usar dos asas en
argolla (bien rectas y con la argolla circular y cerrada). Mientras una asa se flamea,
la otra se enfra en el soporte que la mantiene vertical. Segn se indic, trabajar
cerca del mechero encendido y con buena luz.
Si en el frote Gram de una secrecin purulenta (especialmente de piel), se
observan abundantes cocos gram-positivo, ligeramente ovalados, con tendencia a
agruparse en pares o cadenas cortas y acompaados de abundantes leucocitos
polimorfonucleares, inocular el agar sangre de carnero con cortadas (igual que el
cultivo de garganta). Luego colocar con pinzas flameadas un disco de bacitracina
de 0.04 unidades en la segunda estra, para acelerar y facilitar el aislamiento e identificacin de Streptococcus pyogenes.
Incubar el agar sangre de carnero y el agar chocolate a 36 C en jarro con
candela encendida y humedad (papel absorbente hmedo en el fondo del jarro). La
boca del jarro, donde enrosca la tapadera, debe frotarse espordicamente con la
misma candela, para que la cera o parafina forme un sello. Cerrar bien el jarro, y
luego sellar con masking tape. Incubar el agar manitol-sal y MacConkey
aerbicamente.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS E INFORME:
Es importante observar el frote lo ms pronto posible, ya que en base a este
resultado se puede iniciar tratamiento preliminar. Observar los frotes Gram con
aceite y el lente objetivo de inmersin. Es de gran importancia observar cual es la
bacteria que predomina en el frote. Informar la cantidad de bactrias observadas, la
cantidad de leucocitos y de qu tipo son. En el frote, los leucocitos deben observarse gram-negativo (rojos); si aparecen gram-positivo (morados), falta decoloracin
y debe aplicarse ms alcohol-acetona.
Examinar los cultivos despus de 18 a 24 horas de incubacin, con microscopio estereoscpico o lupa y buena luz. En el agar sangre buscar colonias pequeas
beta hemolticas; si las hay, identificar un subcultivo en agar sangre de carnero con
discos de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol y prueba de CAMP. Si hay co-
141
tubo es ms sensible y confiable, pero si la reaccin da positiva en lmina es suficiente para identificar a Stapylococcus aureus, pues hay aproximadamente 96 por
ciento de correlacin.
Si la prueba de coagulasa es negativa, y la fermentecin del manitol tambin
es negativa (colonias rosadas en manitol-sal), puede reportarse presuntivamente
Staphylococcus epidermidis o Staphylococcus coagulasa-negativo. Hacer el reporte de
esta bacteria con prudencia, ya que en la gran mayora de los casos no causa infeccin, pero se aisla con frecuencia pues es miembro importante de la microbiota de
la piel. Si la coagulasa es negativa y la fermentacin del manitol positiva, puede
tratarse de Staphylococcus saprophyticus, hacer susceptibilidad a un disco con
novobiocina, que debe presentar inhibicin. Si es necesario, hacer pruebas adicionales segn la tabla a continuacin. En caso de cocos gram-positivo con agrupacin en pares, paquetes o grupos de cuatro bacterias, descartar Micrococcus sp. por
la prueba de OF-glucosa, es oxidativo.
PRINCIPALES PRUEBAS PARA LA DIFERENCIACIN DE TRES
ESPECIES DEL GNERO Staphylococcus DE ORIGEN HUMANO*
PRUEBA
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Coagulasa
+/-
DNAsa
Resistencia a novobiocina
Crecimiento en anaerobiosis
Hemlisis
gnero por medio de la prueba de satelitismo; la diferenciacin hasta especie requiere de pruebas ms complejas. El crecimiento de Haemophilus spp. se logra en
agar chocolate incubado en jarro con candela, pues son microorganismos
microaeroflicos. Crece solamente en agar chocolate, y no en agar sangre, pues en el
primero los factores de crecimiento se encuentran libres en el medio, y no dentro de
los eritrocitos.
Hacer la identificacin de Haemophilus sp. por medio de la prueba de
satelitismo, as:
1.
2.
Tomar una asada del crecimiento en agar chocolate y estriarla en el centro de una caja de agar sangre de carnero al 5%, slo en una direccin.
3.
4.
144
145
CAPTULO 13
SECRECIONES GENITALES
PROPSITO:
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos que infectan los
rganos genitales femeninos y masculinos, en especial los siguientes:
Neisseria gonorrhoeae
Bacteria, causante de la gonorrea.
Treponema pallidum
Bacteria, causante de la sfilis.
Gardnerella vaginalis
Bacteria, bacilo gram-negativo causante de
vaginosis.
Candida albicans
Hongo levaduriforme, causante de vulvovaginitis.
Trichomonas vaginalis
Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.
DIAGNSTICO DE GONORREA
Muestra:
La gonorrea es una enfermedad de transmisin sexual que en
el hombre generalmente causa el
aparecimiento de pus cremoso,
amarillento o verdoso que sale de
la punta del pene. En la mujer,
este sntoma puede no ser
evidente, lo que hace ms difcil
el diagnstico.
El agente causal de la
gonorrea es la bacteria Neisseria
gonorrhoeae un diplococo gram-negativo (rojo). Las neiserias presentan forma arrionada y se agrupan
en pares que semejan granos de
caf. El diagnstico de laboratorio
de la gonorrea consiste en la obser-
147
2-
3-
4-
5-
Mujeres:
1-
2-
3-
Tomar ms pus con otro hisopo estril, e inocular una caja o botellita de
Thayer-Martin, y una caja de agar sangre de carnero.
Procedimiento:
1-
2-
Con asas flameadas y fras, diseminar por estras el inculo sobre toda
la superficie de cajas o botellitas.
3-
Interpretacin de resultados:
Gram: buscar diplococos adosados en forma de granos de caf y gram-negativo (rojos). Anotar si se encuentran adentro de los leucocitos polimorfonucleares
(intracelulares), o libres fuera de estas clulas (extracelulares). En el pus uretral
masculino, la presencia de estas bacterias tpicas indica gonorrea. Reportar la cantidad y clase de leucocitos observados. En los frotes masculinos, los diplococos
gram-negativo intracelulares se asocian a gonorrea aguda; extacelulares se asocian
a gonorrea crnica. El frote Gram endocervical es de diagnstico limitado y
correlaciona con el cultivo en Thayer-Martin en 65 por ciento de los casos.
En el caso de las mujeres por lo general la imagen microscpica no es tpica y
se observan muchas clases de bacterias, tanto gram-positivo como gram-negativo, de la abundante microbiota normal de la vagina. Algunas bacterias de esta
microbiota pueden ser idnticas a Neisseria gonorrhoeae . Por estas razones el diagnstico de gonorrea femenina se basa en el cultivo y no en el frote Gram.
Cultivo:
Despus de 24 a 48 horas de incubacin a 36 C en jarro con candela, exami149
nar el Thayer-Martin con buena luz. Debido a que el Thayer-Martin contiene sustancias enriquecedoras que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae, y sustancias inhibidoras de otras bacterias, por lo general slo crece este microorganismo
en cultivo puro. N. gonorrhoeae presenta colonias pequeas (menos de 1 mm de
dimetro), translcidas, brillantes y de bordes lisos.
Hacer una coloracin de Gram de las pequeas colonias en Thayer-Martin,
suspenderlas en una pequea gota de agua destilada o solucin salina fijar con
calor y luego colorear. Si se observan diplococos gram-negativo, el cultivo es muy
sospechoso de N. gonorrhoeae y debe efectuarse la prueba de oxidasa. Esta prueba
demuestra la presencia de la enzima indofenol-oxidasa, que da al reactivo
(dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina al 1% en agua, 0.1 g en 10 ml de
agua) un color morado o negro.
La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo
lquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnados con el reactivo.
Para efectuar la prueba en discos de papel, proceder as: con pinzas flameadas,
colocar un disco de oxidasa en una caja de Petri vaca. Humedecerlo con una gota
de solucin salina. Con el asa calibrada de platino o palillo de dientes de madera
tomar una o dos colonias tpicas frotar este crecimiento sobre el disco hmedo. Si
aparece una coloracin morado-negruzco antes de 10 segundos en la parte del disco donde se frotaron las colonias, la prueba es positiva. Esta prueba debe
interpretarse antes de 10 segundos, pues el oxgeno del aire puede ocasionar falsos
positivos. Nunca usar el asa corriente en esta prueba, pues el alambre con hierro o
nichrome causa por s solo una reaccin positiva.
Efectuar la prueba con el reactivo lquido as: aplicar unas gotas del reactivo
recin preparado directamente sobre la caja de Thayer-Martin, si las colonias toman rpidamente un color rosado, luego morado y luego negro, la prueba es positiva. Si se observa este viraje en el color de las colonias, o la prueba en disco es
positiva, sub-cultivar inmediatamente una colonia tpica sin reactivo, o una colonia al empezar a cambiar de color a una caja de agar chocolate. Incubar 24 horas
a 36C en jarro hmedo con candela. Despus de incubar, hacer frote Gram al
crecimiento en agar chocolate, que debe presentar diplococos arrionados gramnegativo.
Identificar la especie N. gonorrhoeae por medio de la prueba de oxidacin de
los tres azcares: maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa) en el medio base de CTA
(cistina-tripticasa agar). El medio CTA es un medio semi-slido; al medio base estril se le adiciona el carbohidrato en solucin acuosa (esterilizado por filtracin)
150
hasta una concentracin de 1%. Debe prepararse en tubos 13 X 100 con tapn de
rosca, inocular los tres tubos de maltosa, glucosa y sacarosa con dos asadas bien
cargadas por tubo. Depositar el crecimiento masivo slo unos pocos milmetros
por debajo de la superficie del medio. Cerrar bien apretado el tapn de rosca e
incubar de 48 a 72 horas a 37 C. Una coloracin amarilla en la superficie del medio
indica reaccin positiva. Interpretar resultados segn esta tabla:
Diferenciacin de dos especies de Neisseria
de importancia clnica
Especie
Glucosa
Maltosa
Sacarosa
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis*
Ver captulo 14
Las pruebas de CTA frecuentemente dan resultados dudosos, tienen la desventaja que para preparar los medios en tubo se requiere esterilizar por filtracin la
solucin del carbohidrato que debe ser muy puro. Es adecuado usar por lo menos
slo el tubo con maltosa, que diferencia bien las dos especies.
En trminos generales y segn las caractersticas del trabajo bacteriolgico en
nuestro medio, se considera adecuado reportar (aunque sea presuntivamente) como
Neisseria gonorrhoeae a aquellos aislamientos de secreciones genitales con morfologa
tpica de Neisseria, oxidasa positivo y un frote Gram de la secrecin que indique la
presencia de esta bacteria. Efectuar la prueba de susceptibilidad inoculando masivamente la bacteria en cultivo puro, en la superficie de una caja de agar chocolate
(base Mueller-Hinton caliente + 5% sangre de carnero).
Informe:
Tomando en cuenta los procedimientos y comentarios anteriores, si se est seguro aunque sea presuntivamente, reportar la presencia de N. gonorrhoeae. Debe tomarse en cuenta que un reporte de este tipo implica que el o la paciente contrajeron
una infeccin por contacto sexual. Un error del laboratorio puede por lo tanto causar serios problemas conyugales o dejar a un paciente infectado sin tratamiento.
151
152
Treponema pallidum,
campo oscuro de chancro.
En la mayora de los casos de sfilis primaria aparece una lesin tpica en los
rganos genitales, llamada chancro. El chancro se caracteriza por ser una lcera
no purulenta, generalmente de forma redondeada y de bordes duros. Es una lesin muy infectiva que contiene muchas espiroquetas, por lo que debe manipularse
con guantes.
Debido a que T. pallidum es una bacteria muy delgada y que no toma los colorantes de Gram, su presencia debe demostrarse por observacin microscpica en
fresco con condensador de campo oscuro. Es muy importante que el paciente no
haya recibido tratamiento con antibiticos especialmente penicilina, que hace desaparecer rpidamente los treponemas de las lesiones. Para el examen se procede
as:
1-
o para tubos capilares (de los que vienen en kits de serologa), portaobjetos, cubre-objetos, solucin salina estril en frasco, gasa estril y algodn con alcohol.
2-
3-
4-
Con la mano izquierda, tomar la lesin entre los dedos pulgar e ndice y
presionar fuertemente hasta que brote del fondo de la lesin un lquido
translcido. Este procedimiento es doloroso para el paciente, pero debe
soportar el dolor sin anestesia.
5-
Causar leve abrasin con el tubo capilar sin causar sangramiento, rpidamente dejar caer en el centro de la lesin una gota de solucin salina
del tubo capilar, succionarla. Gotearla de nuevo en la lesin, dos o tres
veces ms. Debe usarse lo menos posible de solucin salina para no diluir la muestra, que debe ser un lquido lechoso ligeramente hemorrgico
que queda dentro del tubo capilar. Puede usarse pipeta Pasteur o asa
estril si se considera ms fcil de manejar.
6-
Colocar con cuidado una gota de la muestra as obtenida en un portaobjetos limpio, cubrir con cubre-objetos a manera de no dejar burbujas
en la preparacin en fresco.
7-
8-
154
9-
Cambiar el condensador de campo claro corriente que se usa en el microscopio, por un condensador especial para campo oscuro. Bajar el
condensador de campo oscuro y colocarle dos gotas de aceite de
inmersin de buena calidad, de manera que no queden burbujas de aire.
Colocar la muestra en la platina con el cubre-objetos hacia arriba. Subir
lentamente el condensador hasta que el lente pegue con el aceite por debajo de la lmina (que no queden burbujas). Aumentar la intensidad de
la luz del microscopio al mximo, luego enfocar la muestra con seco
dbil; subir y bajar lentamente el condensador hasta que se obtenga el
mximo de contraste, es decir los objetos ms brillantes y el campo ms
oscuro.
10-
11-
12-
155
156
INTRODUCCION
Los procesos infecciosos del tracto genital femenino (TGF) son el motivo de consulta ms frecuente en las clnicas de Ginecologa. Se manifiestan
clnicamente por la presencia de flujo vaginal, prurito, eritema, dispareunia o
sangrado anormal (menorragia o metrorragia). Las infecciones del TGF son
importantes adems de las molestias que causan a la paciente, por las potenciales complicaciones al diseminarse a otros rganos como el tero o las trompas de Falopio y porque representan tambin un riesgo para el feto en la
mujer embarazada.
Segn el rea anatmica afectada por los procesos infecciosos, stos pueden clasificarse como vaginitis, vulvovaginitis, cervicitis, endometritis,
salpingitis, enfermedad plvica inflamatoria (EPI) o abcesos tubo-ovricos.
Esta clasificacin brinda las bases para el manejo clnico y tambin orienta
sobre la etiologa, epidemiologa y tratamiento de los mismos. Es tambin
importante mencionar, que durante las diferentes etapas fisiolgicas de la
vida de la mujer (niez, edad reproductiva, postparto o postmenopausia), se
presentan con mayor o menor frecuencia algn tipo de microorganismos en
particular.
VAGINITIS
La etiologa de la vaginitis depende de la edad y de la etapa fisiolgica
de la paciente, por lo que debe dividirse en vaginitis en nias premenrquicas,
vaginitis en la mujer en edad reproductiva y vaginitis en la mujer
postmenopusica. Los sntomas y signos clnicos de la vaginitis incluyen
flujo vaginal, prurito, eritema de la mucosa vaginal y exocervical y sangrado
anormal. Estas manifestaciones son interpretadas de diversas maneras por
las pacientes que pueden aceptar condiciones patolgicas como normales, o
157
158
3.
Tricomoniasis
La tricomoniasis es una enfermedad de transmisin sexual, que se presenta clnicamente con flujo vaginal profuso, de color amarillo-verdoso, a veces
espumoso, de mal olor, acompaado de prurito, y eritema de la vagina y
exocrvix. El eritema del exocrvix ha sido descrito como cuello en fresa.
El pH del flujo vaginal es arriba de 5.0, la prueba de amina es generalmente
positiva y al examen en fresco es posible observar Tropozoitos mviles de
Trichomonas vaginalis, con un alto grado de sensibilidad y especificidad.
La tricomoniasis ha sido identificada en 10.3% de mujeres embarazadas, 7.3% de mujeres en clnicas de planificacin familiar y en 8.5% de mujeres adolescentes (12 a 18 aos).
B.
Candidosis vulvovaginal
159
C.
Vaginosis bacteriana
160
endometritis, salpingitis
vaginitis, cervicitis
vaginitis en nias
161
CAPTULO 14
LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y
FLUIDOS CORPORALES
PROPSITO:
Demostrar por medio de bacterioscopa con Gram y cultivo, la presencia de
bacterias en estas muestras, que normalmente deben ser estriles. Las bacterias que
tienen mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son:
Gram negativo:
Neisseria meningitidis (causa meningitis meningoccica severa)
Haemophilus influenzae (especialmente en nios de 6 meses a 4 aos de
edad)
Escherichia coli y otras enterobacterias (en pacientes debilitados, neonatos
y post-craneotoma)
Pseudomonas aeruginosa
Gram-positivo:
Streptococcus pneumoniae (muy importante)
Staphylococcus aureus
Streptococcus sp. (grupos B y D en neonatos)
Streptococcus pyogenes
Listeria monocytogenes (raro)
Otros microorganismos importantes:
Mycobacterium tuberculosis, Leptospira interrogans y Treponema pallidum
(bacterias).
Cryptococcus neoformans y Candida albicans (hongos levaduriformes)
V arios virus (enterovirus, paperas y otros).
MUESTRA:
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
Lquido cefalorraqudeo (conocido tambin como fluido espinal o LCR)
163
Edema articular
Staphylococcus aureus
Eritema y calor
Haemophilus influenzae
Dolor al movimiento
Streptococcus pyogenes
Dolor a la palpacin
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus pneumoniae
Enterobacterias
Micobacterias
164
PROCEDIMIENTO:
1.
El mdico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo) en dos tubos estriles 13 x 100 con
tapn de rosca o frasquitos estriles que cierren bien. Enviarlos inmediatamente al laboratorio. Mantener la muestra dentro de la incubadora a 36C mientras se procesa. En caso de recibirse un solo frasquito
separar aspticamente en dos porciones.
2.
3.
Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm). Decantar aspticamente, tapar agitar y procesar slo el sedimento.
4.
5.
Diseminar por estras en toda la superficie de los medios slidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo con
candela encendida. Incubar todos los medios a 36C, excepto el
Sabouraud que se incuba a 27C (o a temperatura ambiente para aislamiento de hongos patgenos especialmente Cryptococcus neoformans).
6.
7.
165
ZIEHL-NEELSEN
sedimento
3. RUTINARIAMENTE SEMBRAR EN
agar sangre
agar
MacConkey
de carnero chocolate
Sabouraud
4. Incubar en jarro
con candela
OPCIONAL
Tioglicolato Lowenstein-Jensen
NO INCLINAR
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Lo ms pronto posible, observar los frotes de sedimento de LCR con lente de
inmersin. En vista que del resultado de los frotes depende el tratamiento inmediato de pacientes con infeccin grave de las meninges, su observacin debe hacerse con todo cuidado. Poner especial cuidado en observar las siguientes morfologas:
1.
2.
Cocobacilos gram-negativo (rojo plido) pleomrficos, con escasas formas bacilares: morfologa compatible con H. influenzae, agente de
meningitis en nios de 6 meses a 4 aos; raro en adultos.
3.
4.
5.
Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales, gram-positivo, se insina cpsula, hacer tinta china para demostrar la presencia
de la levadura capsulada C. neoformans.
6.
En el Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-cido resistente (rojos), cortos, algunos con coloracin dispareja en forma de grnulos: morfologa compatible con M. tuberculosis.
167
Agar Chocolate
MacConkey
Tioglicolato
Sabouraud
-/+
H. influenzae
S. pneumoniae
+/-
Enterobacterias
y pseudomonas
Cryptococcus
neoformans
Anaerobios
N. meningitidis
*
**
COLONIAS
PRUEBAS DE CONFIRMACIN
N. meningitidis
H. influenzae
S. pneumoniae
Enterobacterias
TSI/LIA/MIO/urea/citrato; o API.
Aglutina-cin con antisueros
Aglutinar con antisueros especficos, los grupos ms frecuentes son A, B y C. Hacer antibiograma
en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre, achocolatdo.
Prueba de satelitismo para H. influenzae (de LCR, secreciones) y H. aegyptis (de ojos).
168
4.
5.
INFORME:
El informe del frote Gram de LCR debe haberse enviado previamente, el da
en que se recibi la muestra. Despus informar lo ms pronto posible el resultado
del cultivo con el nombre correcto de la bacteria, y la cantidad de colonias observadas (escaso, regular, abundante cantidad) en las cajas originales, por ejemplo:
Primer informe, entregar el mismo da de obtencin de la muestra:
Frote Gram: Se observan escasos diplococos gram-positivo, lanceolados
y capsulados, de morfologa compatible con S. pneumoniae. Leucocitos
polimorfonucleares: regular cantidad. Cultivo: Pendiente
Segundo informe, entregar el da que termina la identificacin:
Cultivo: Se aisl S. pneumoniae. Antibiograma.
169
CAPTULO 15
TEJIDOS Y BIOPSIAS
PROPSITO:
Demostrar por frote y cultivo la presencia de bacterias en piezas de tejidos de
sala de operaciones, o piezas an ms pequeas obtenidas por biopsia. Las bacterias que pueden estar presentes son muy variadas. Anteriormente slo se efectuaba histopatologa de estas muestras, en la actualidad el examen microbiolgico es
tambin de gran ayuda diagnstica. Adems, la microbiologa post-mortem contribuye a elucidar las infecciones mortales.
MUESTRA:
Este tipo de muestras son exclusivamente obtenidas por el mdico en condiciones aspticas, y depositadas en recipientes estriles de boca ancha con un poco
de solucin salina estril, proporcionados por el laboratorio.
Debe obtenerse suficiente cantidad y no debe adicionarse ninguna sustancia
fijadora como formol. Despus de procesarse, la muestra debe almacenarse en refrigeracin o congelacin, en solucin salina estril para que no se deseque, con el
propsito de preservarla para nuevos estudios, ya que generalmente hay riesgo
para el paciente al tomar nueva muestra.
De lcera o tractos fistulosos debe efectuarse curetaje profundo tomando parte del tejido de la pared del tracto fistuloso. Debe desinfectarse la piel circundante
e introducir un catter venoso de plstico estril, y luego aspirar con jeringa estril.
De las lceras obtener material de la base. Si se justifica, el material de estas muestras debe obtenerse en algn medio de transporte anaerbico adecuado (ver captulo 17). En el caso de material de fstulas, debe hacerse una preparacin en fresco
para buscar grnulos de Actinomyces, Nocardia u hongos.
Para obtener cultivos de material de autopsia, la piel debe ser desinfectada
aplicando una esptula caliente para quemar la piel. Si se trata de un rgano, debe
sumergirse en agua hirviendo por 5 a 10 segundos, y luego debe disecarse con
instrumentos estriles y tomar para cultivo material del centro. La mitad de la
171
muestra debe fijarse en formol, y la otra enviarse en recipiente estril con un poco
de solucin salina estril al laboratorio de microbiologa.
PROCEDIMIENTO:
No es adecuado inocular los medios slo tocando o frotando la pieza con una
asa. Debe hacerse de la siguiente manera:
1-
Colocar la pieza con pinzas estriles en una caja de Petri estril. Con
tijeras estriles, picarla finamente y luego pasarla a un macerador de
tejido estril o, si no lo hay, a un pequeo mortero estril.
2-
Usar arena esteril para triturar bien la muestra. Si se hace en un mortero, adicionar una pequea cantidad de solucin salina estril. Dejar sedimentar para cultivar el sobrenadante. Si se sospecha la presencia de
hongos, no triturar, slo picar finamente con tijeras estriles.
3-
4-
5-
6-
Preparar dos frotes, colorear uno con Gram y el otro con Ziehl-Neelsen.
7-
172
173
ANUNCIO
ZITHROMAX
175
DOCUMENTO
ZITHROMAX
176
CAPTULO 16
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
(ANTIBIOGRAMA)
PROPSITO
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in vitro a qu antibiticos
es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente.
Este mtodo permite al mdico escoger el antibitico ms adecuado con base cientfica proporcionada por el laboratorio, y evita dar tratamientos tiles.
Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infeccin son
inhibidos por concentraciones de antibitico obtenidas con un rgimen usual de
dosificacin.
Moderadamente susceptible: Cuando los microorganismos son inhibidos por
concentraciones altas de antibitico.
Resistente: Si los microorganismos que causan la infeccin, toleran concentraciones de antibitico superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por
medio de un rgimen usual de dosificacin.
Intermedio (Indeterminado): Hoy en da se considera como prueba errtica
que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una poblacin bacteriana
resistente.
El nombre Antibiograma es adecuado para designar esta prueba, pero no
lo es Prueba de sensibilidad, pues las bacterias no sienten la accin de los
antibiticos, son susceptibles a estos medicamentos. La tcnica que debe usarse es
la de Bauer-Kirby, ligeramente modificada por el Comit Nacional de Estndares
para Laboratorios Clnicos de Estados Unidos (NCCLS).
MEDIO DE CULTIVO
Por medio de la tcnica de Bauer-Kirby modificada se obtienen resultados
confiables, reproducibles y de gran utilidad clnica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones de este captulo. Es una tcnica relativamente sen177
Staphylococcus aureus
Enterobacterias
Pseudomonas
El antibiograma para Haemophilus spp. y Neisseria spp. debe hacerse en MuellerHinton con 5% de sangre, achocolatado.
Preparar el agar Mueller-Hinton segn las indicaciones del productor y con
las siguientes caractersticas:
1-
2-
3-
El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. Medir el pH del medio con
potencimetro. Dejar solidificar un poco del medio dentro de un pequeo beaker alrededor del electrodo del aparato. Ajustar si es necesario,
antes de autoclavear, con NaOH 1N, o HCl 1N.
4-
De cada lote de medio, incubar dos cajas por 24 horas a 36 C para comprobar su esterilidad. Descartar estas cajas ya que no son adecuadas
para efectuar antibiograma despus de ser incubadas.
5-
2-
3-
PROCEDIMIENTO:
Efectuar el antibiograma as:
1-
2-
3-
4-
179
Antes de quince minutos de diludos los caldos, inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton as: introducir un hisopo estril en el
caldo de turbidez igual al estndar; exprimir bien el hisopo presionndolo firmemente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.
6-
7-
8-
Con pinzas estriles o dispersador especial, colocar los discos impregnados de antibiticos a manera de que queden lo ms separados entre s
que sea posible. Con las pinzas flameadas y fras presionar los discos ya
colocados para adherirlos bien al medio de cultivo.
Escoger los antibiticos a colocar dependiendo de la bacteria estudiada,
segn el listado bsico actualizado de cada laboratorio y de acuerdo
con los listados oficiales del NCCLS (1995), que aparecen en las pginas
182 y 183 de este manual.
Es preferible usar discos comerciales y no los obsequiados por el productor del antibitico. Al recibir discos obsequiados por el productor
del antibitico, debe verificarse que stos sean elaborados por una compaa especializada (por ejemplo: DIFCO o BBL), y no por la misma
compaa productora del antibitico.
9-
180
1. Tomar 4 5 colonias
de igual morfologa
del cultivo original
2. Inocular un tubo con
4 ml de caldo
Cualquier
medio slido
6. Dejar secar de 3 a 5
minutos (no ms de 15)
y colocar discos de
antibiticos para
gram-positivo o
gram-negativo
182
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1-
2-
con una regla por detrs de la caja de Petri, o con patrones especiales.
No tomar en cuenta escasas colonias separadas dentro del halo de inhibicin o crecimiento muy dbil (80% de inhibicin). Sin embargo, si se
observan mltiples colonias dentro del halo de inhibicin, stas deben
sub-cultivarse para descartar contaminacin. En caso de tratarse de la
misma bacteria que se analiza, repetir el antibiograma de las colonias
que crecen dentro del halo. El velo de crecimiento de Proteus sp. dentro del halo, tampoco debe tomarse en cuenta. Medir siempre hasta el
mrgen donde se inicia el crecimiento grueso.
3-
4-
5-
184
Moderadamente
Contenido
Resistente Intermedio
Susceptible
susceptible
del disco (mcg)
17
130
14
20/10
13
14-17
18
15-16
110
13
14-16
17
10/10
11
12-14
15
130
15
16-21
22
Cefamandol
130
14
15-17
18
Cefazolina
130
14
15-17
18
Cefmetazol
130
12
13-15
16
Cefonicida
130
14
15-17
18
Cefoperazona
175
15
16-20
21
Cefotaxima
130
14
15-22
23
Cefotetan
130
12
13-15
16
Cefoxitina
130
14
15-17
18
Ceftazidima
130
14
15-17
18
Ceftizoxima
130
14
15-19
20
Ceftriaxona
130
13
14-20
21
Cefuroxima (oral)
130
14
15-22
23
Cefuroxima (parenteral)
130
14
15-17
18
Cefalotina
130
14
15-17
18
Cloranfenicol
130
12
Ciprofloxacina
135
15
Gentamicina
110
12
Imipenem
110
13
Kanamicina
130
13
Mezlocilina
175
17
Netilmicina
130
12
Piperacilina
100
17
Tetraciclina
130
14
Ticarcilina
175
14
Ampicilina
Ampicilina-sulbactam
Aztreonam
185
18
13-17
16-20
21
15
13-14
14-15
16
18
14-17
18-20
21
15
13-14
18-20
21
19
15-18
15-19
20
(Continuacin)
Agente
Antimicrobiano
Ticarcilina-cido
clavulnico
Moderadamente
Contenido
Resistente Intermedio
Susceptible
del disco (mcg)
susceptible
20
75/10
14
310
12
1.25/23.75
10
11-15
16
Carbenicilina
100
19
20-22
23
Cinoxacina
100
14
15-18
19
Nitrofurantona
300
14
15-16
17
Norfloxacina
310
12
13-16
17
Ofloxacina
315
12
13-15
16
Sulfisoxazol
250 300
12
13-16
17
315
10
11-15
>16
Tobramicina
Trimetoprimsulfametoxazol
15-19
15
13-14
Reportar slo en
urocultivos:
Trimetoprim
Contenido
del disco
Resistente Intermedio
Moderadamente
Susceptible
susceptible
Amoxicilina- cido
clavulnico
120/10 mcg
19
20
Ampicilina
10 mcg/ml
28
29
Ampicilina-sulbactam
15
10/10 mcg
11
15-17
Cefazolina
30 mcg
14
15-17
Cefotaxima
30 mcg
14
15-22
23
Ceftriaxona
30 mcg
13
14-20
21
Cefalotina
30 mcg
14
15-17
18
Cloranfenicol
30 mcg
12
Ciprofloxacina
35 mcg
15
Clindamicina
32 mcg
14
15-20
21
Eritromicina
15 mcg
13
14-22
23
Gentamicina
10 mcg
12
13-14
15
Imipenem
10 mcg
13
186
12-14
18
18
13-17
16-20
14-15
21
16
(Continuacin)
Agente
antimicrobiano
Contenido
del disco
Resistente Intermedio
Moderadamente
Susceptible
susceptible
Meticilina
135 mcg
10-13
14
Ofloxacina
315 mcg
12
12
13-15
16
Oxacilina
311 mcg
10
11-12
10
13
Penicilina G
10 U
28
28
28
29
Rifampicina
315 mcg
16
17-19
16
20
Tetraciclina
330 mcg
14
15-18
314
19
1.25/23.75 mcg
10
10
11-15
16
330 mcg
39
10-11
39
312
Trimetoprimsulfametoxazol
Vancomicina
Reportar
slo slo
en uro:
Reportar
en urocultivos:
Nitrofurantona
300 mcg
14
15-16
14
17
Norfloxacina
310 mcg
12
13-16
17
Sulfisoxazol
12
12
13-16
Trimetoprim
315 mcg
10
11-15
16
17
Tomado de: Munro, S. 1992. Disk Diffusion Susceptibility Testing. In: Isenberg, H.D. (Editor
in Chief). CLINICAL MICROBIOLOGY PROCEDURES HANDBOOK. Two
volumes. American Society for Microbiology. Washington, D.C., U.S.A. Basado
en: NCCLS. 1991. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing. Third informational supplement. M100-S3. NCCLS, Villanova,
Pennsylvania, U.S.A.
CONTROL DE CALIDAD
Para controlar la efectividad y reproducibilidad de la prueba, cada laboratorio
debe mantener refrigeradas en agar inclinado y sub-cultivar semanalmente las
siguientes dos cepas bacterianas estndar, que producen patrones de suscepti-bilidad
conocidos:
a)
b)
La susceptibilidad de las dos cepas patrn debe probarse con cada lote nuevo
187
Amikacina
--------
19 - 26
Ampicilina
27 - 35
16 - 22
Ampicilina-sulbactam
29 - 37
20 - 24
Aztreonam
--------
28 - 36
Ceftazidima
--------
25 - 32
Clindamicina
24 - 30
--------
Cloranfenicol
19 - 26
21 - 27
Eritromicina
22 - 30
--------
Gentamicina
19 - 27
19 - 26
Penicilina-G
26 - 37
--------
Tetraciclina
19 - 28
18 - 25
Tobramicina
--------
18 - 26
Trimetoprim-sulfametoxazol
24 - 32
24 - 32
161718191011121314151617-
Nombre
comercial
Azitromicina
(macrlido,
azlido)
Zithromax
Ampicilinasulbactam
Unasyn
(Sultamicilina)
Contenido
del disco
15 mcg
13
14-17
18
10 mcg de
ampicilina +
10 mcg
sulbactam
11
12-14**
15
189
ANUNCIO
UNASYN
(blanco y negro,
cara de nio)
191
DOCUMENTO
UNASYN
(blanco y negro
columna vertical,
debe decir
UNASYN al
principio)
192
CAPTULO 17
ANAEROBIOS
PROPSITO:
Demostrar por medio de cultivo con procedimientos especiales, la presencia
de bacterias anaerobias, es decir aquellas que no crecen en presencia de oxgeno
del aire. Estas bacterias son normales y predominan en las microbiotas de las
mucosas (boca, intestino, heces, vagina, etc.) En determinadas circunstancias llegan a sitios anatmicos diferentes y causan infeccin, generalmente en asociacin
con bacterias aerobias tales como enterobacterias, pseudomonas o cocos gram-positivo. Por esta razn, siempre debe hacerse frote Gram del material clnico y cultivo aerobio, adems del cultivo en anaerobiosis (ausencia de oxgeno).
MUESTRA:
Si en algn tipo de anlisis bacteriolgico es de vital importancia la toma de
la muestra y su transporte al laboratorio, es en el caso de los anaerobios. Esto se
debe principalmente a dos factores:
-
La muestra debe tomarse con mucho cuidado a manera de no contaminarla con bacterias de los sitios colonizados normalmente por anaerobios.
Por esta razn, el mdico a veces debe tomar muestras de secreciones
del pulmn por puncin trans-traqueal (para evitar los anaerobios de la
orofaringe), o puncin suprapbica de la vejiga (para evitar los
anaerobios de la uretra).
Las bacterias anaerobias son muy susceptibles al oxgeno del aire. Si los
anaerobios en la muestra entran brevemente en contacto con aire, pierden muy rpidamente su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn deben seguirse al pie de la letra instrucciones, tanto
para toma de la muestra como para su transporte al laboratorio.
131415161718191011121314-
Pus aspirado.
Tejidos varios (biopsia, ciruga, autopsia).
Fluidos corporales (LCR, lquido pleural, paracentsis, pericrdico,
sinovial).
Aspirado por puncin trans-traqueal.
Aspirado por puncin pulmonar directa.
Orina aspirada por puncin supra-pbica.
Grnulos de azufre de pacientes con sospecha de actinomicosis.
Las muestras no aceptables para cultivo de anaerobios, pues contienen normalmente estas bacterias y siempre deben ser rechazadas si se solicita este tipo de
cultivo, son:
123-
45678-
195
Si la muestra se aspir con una jeringa, debe sacarse todo el aire (que no queden burbujas), y sellar la punta de la aguja insertando un tapn de hule.
PROCEDIMIENTO:
La muestra recin tomada, o adecuadamente transportada al laboratorio, debe procesarse as:
En primer lugar, siempre hacer un frote y colorearlo con Gram.
2-
3-
4-
196
H2+CO2
1-
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Hallazgos bacteriolgicos que sugieren la presencia de anaerobios:
1-
2-
3-
Crecimiento en el fondo del tioglicolato hace sospechar anaerobios. Ausencia de crecimiento en tioglicolato no descarta definitivamente la presencia de anaerobios.
4-
5-
6-
2-
3-
Cualquier caracterstica morfolgica especial como ramificacin pseudoramificacin, formacin de cadenas, filamentos, cuerpos esfricos o diminutas formas granulares.
197
4-
Comparar con la siguiente tabla como gua, y correlacionar con el cultivo anaerobio.
MORFOLOGA MICROSCPICA
COLONIA
Bacteroides
fragilis
Bacteroides
melaninogenicus
Colonias negras en
agar sangre despus de
4-5 das de incubacin.
Bacteroides
variabilis
Colonias circulares,
enteras, brillantes u
opacas con bordes
translcidos.
Fusobacterium
necrophorum
(Sphaerophorus
necrophorus)
Fusobacterium
fusiforme
Circular, entera.
Despus de no menos de 48 horas de incubacin, destapar el jarro: Antes de abrirlo notar que el indicador debe estar blanco y la superficie
interior del jarro con gotas de agua. Si el indicador est celeste y no hay
agua de condensacin, significa que no se produjo anaerobiosis y deben
revisarse los procedimientos. Notar un fuerte olor ptrido caractersti198
3-
Hacer inmediatamente frote Gram y sub-cultivo en agar sangre de carnero al 5% y en tioglicolato (hervido y enfriado) de cada tipo de colonias
que no corresponda a aerobios ya previamente identificados. Tambin
sembrar un sub-cultivo en agar sangre aerobio donde los anaerobios
verdaderos no crecen. Es muy frecuente que se encuentran en la misma
muestra dos o ms anaerobios adems de varios aerobios.
4-
5-
6-
199
Bacteroides sp.
Fusobacterium sp.
Veillonella sp.
Clostridium sp.
REPORTAR
Peptostreptococcus sp.
Cocos gram-positivo redondos con tendencia a agruparse en racimos*; semejantes a Staphylococcus sp., pero anaerobios
Peptococcus sp.
Se aisl un bacilo
anaerobio gram-negativo no esporulado.
Actinomyces sp.
200
Cocos sueltos
Cocos en parejas
(diplococos)
Cocos en cadenas
(estreptococos)
Cocos en racimos
(estafilococos)
Cocos en
ttradas
Cocobacilos
Bacilos en forma
de maza
(difteroides)
Bacilos con
bordes
cuadrados
Fusobacterium sp.
Vibrio sp.
Spirillum sp.
Borrelia sp.
Treponema sp.
201
Leptospira sp.
7-
Kanamicina
Vancomicina
Colistina
(1,000 mcg)
(5 mcg)
(10 mcg)
La presencia de halo de inhibicin indica susceptible (S), no hay halo es resistente (R), V = variable. Interpretar los resultados junto con otras pruebas
confirmatorias, as:
Bacteria
Kanamicina
Vancomicina
Colistin
Bacteroides fragilis
B. melaninogenicus
B. ureolyticus
Fusobacterium nucleolatum
F. necrophorum
F. mortiferum
F. varium
Fusobacterium sp.
CAPTULO 18
MICOBACTERIAS
PROPSITO:
Demostrar por medio de coloraciones y cultivos especiales la presencia de
bacterias pertenecientes al gnero Mycobacterium especialmente Mycobacterium tuberculosis, llamado comnmente BK (Bacilo de Koch).
Este grupo de bacterias en forma de bacilo, se tien con dificultad por el alto
contenido de grasas en su pared celular. Para lograr teirlas deben usarse colorantes con fenol y/o calor. Una vez teidas con fuchsina carblica (fenolada) no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta caracterstica muy particular se les llama bacilos alcohol-cido resistentes (abreviado BAAR). No usar el trmino cido-alcohol resistentes.
Las micobacterias son aerobios estrictos, no mviles, no poseen cpsula ni
producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento; la mayora de las especies
patgenas crecen despus de 2 a 6 semanas de incubacin a 36 C en el medio de
Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se asocian a
infeccin humana. En nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis es la especie
ms importante. Las micobacterias en general producen granulomas destructivos
de crecimiento lento, que pueden sufrir necrosis o cavitacin. La deteccin de
micobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiologa, ya
que un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para el
paciente y afecta su vida con un tratamiento especfico por varios meses, o incluso
aos.
MUESTRAS
1.
Esputo: La tuberculosis es en nuestro medio la infeccin humana ms importante causada por micobacterias. Esta infeccin crnica generalmente ocurre
en los pulmones por la inhalacin del agente causal, el cual por lo general es
M. tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. kansasii). Por esta razn, el esputo
es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigacin de tuberculosis.
203
En pacientes que tienen dificultad para producir esputo puede usarse varios
mtodos:
2.
a)
b)
Los hisopos farngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para
nios pequeos a los cuales no se les puede pedir una muestra adecuada.
c)
b)
c)
Los que no pueden expectorar porque padecen de otros trastornos: estados de coma, enfermedad neurolgica, etc.
d)
La investigacin microscpica de BAAR en lavado gstrico no es recomendable como un procedimiento diagnstico nico y definitivo, pues BAAR como
M. gastri forman parte de la microbiota gstrica y no se pueden diferenciar de
M. tuberculosis. Sin embargo, mltiples BAAR en contenido gstrico generalmente se correlacionan con cultivos positivos de M. tuberculosis y constituye
informacin valiosa inmediata con utilidad clnica.
205
4.
Por lo general este tipo de muestras son obtenidas por el mdico en recipientes estriles proporcionados por el laboratorio. Si es necesario se puede adicionar heparina o citrato de sodio como anticoagulantes; no usar preservativos o fijadores.
Es conveniente obtener un volumen grande de muestra; si la cantidad es pequea adicionar solucin salina para evitar desecacin. Si la muestra no se
examina inmediatamente debe refrigerarse.
PROCEDIMIENTO:
Baciloscopa: El diagnstico de micobacteriosis se basa en la observacin de
los bacilos alcohol-cido resistente en la muestra y su cultivo in vitro. Los bacilos
alcohol-cido resistentes deben teirse con las coloraciones de Ziehl-Neelsen o
Kinyoun; ambas tinciones dan buenos resultados. La diferencia fundamental consiste en lo siguiente: Ziehl-Neelsen s utiliza calentamiento de la lmina y Kinyoun
no, adems la fuchsina de Kinyoun es ms concentrada.
Coloracin de Ziehl-Neelsen: Preparar frotes delgados de la muestra a examinar. Si se trata de esputo trasladar la muestra a una caja de Petri estril y examinarla con buena luz sobre fondo oscuro. Con aplicadores de madera quebrados,
seleccionar los fragmentos anormales (con pus verdoso, blanquesino o amarillento; sangre rojiza o herrumbrosa). Colocar un pequeo fragmento entre dos
portaobjetos de vidrio, aplastar varias veces el esputo y luego deslizar una lmina
sobre otra para obtener dos frotes parejos y delgados. Escoger el mejor, dejar secar
y luego fijar moderadamente con calor sobre la llama del mechero (igual que para
la coloracin de Gram). Puede colorearse sedimento del esputo digerido/
descontaminado, u otras muestras clnicas.
Procedimiento de la coloracin de Ziehl-Neelsen:
1-
12-
13-
14-
Remover el papel filtro y lavar con agua corriente (usar poca presin).
15-
16-
17-
18-
19-
Dejar secar al aire o flamear muy brevemente, pero no secar con papel absorbente.
10-
11-
208
Alcohol-cido (decolorante):
Acido clorhdrico concentrado ......................................... 93 ml
Alcohol etlico al 95% ........................................................ 95 ml
3-
COLORACIN DE KINYOUN:
Esta coloracin da buenos resultados, comparables al Ziehl-Neelsen, si se efecta segn la tcnica exacta. Tiene la ventaja que no necesita calentamiento. Proceder as:
1-
2-
3-
4-
5-
6-
7-
8-
Dejar secar y examinar con el lente de inmersin. En general tomar las mnimas precauciones que para la coloracin de Ziehl-Neelsen.
209
2-
3-
Sin excepcin alguna, utilice la siguiente clave para reportar todos los frotes para micobacterias. Esta forma de reportar ha sido estandarizada por la
Asociacin Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de Estados Unidos, con el objeto de poder comparar resultados de distintos laboratorios y orientar adecuadamente al mdico.
210
REPORTE
No se observan bacilos alcohol-cido resistentes
1 a 2 en todo el frote
3 a 9 en todo el frote
+ o escasos
10 ms en todo el frote
++ o regular cantidad
1 ms por campo
+++ o abundantes
2-
3-
La especie del microorganismo alcohol-cido resistente no puede determinarse slo por la morfologa microscpica, debe hacerce por cultivo. Sin embargo, algunas caractersticas pueden orientar, por ejemplo:
Nocardia spp. frecuentemente produce ramificaciones y Mycobacterium kansasii
puede formar clulas largas y anchas, con coloracin en bandas.
4-
5-
6-
En el frote pueden aparecer artefactos alcohol-cido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue suficientemente decolorado. Slo bacilos bien
definidos deben considerarse BAAR.
7-
En caso que se observen muy escasos BAAR debe repetirse el frote. Si el frote
211
19-
Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por
cultivo, ya que la baciloscopa es menos sensible para detectar micobacterias
que el cultivo.
10-
11-
A veces es difcil distinguir los artefactos acidfilos (rojos) de verdaderos bacilos alcohol-cido resistentes. La observacin de cuerpos esfricos alcoholcido resistentes debe mencionarse como sospechosa. Los grnulos de
Much son micobacterias, sin pared celular (esferoplastos), son gram-positivo y no alcohol-cido resistentes.
12-
13-
Los BAAR observados no presentes originalmente en la muestra, pueden provenir del agua del chorro, colorantes contaminados, recipientes o de
portaobjetos sucios.
212
213
Cantidad a
preparar
NaOH al 4%
estril
Citrato de sodio
al 2.9% estril
Polvo de NALC
(refrigerado)
125 ml
12.4 ml
12.5 ml
0.125 g
150 ml
25 ml
25 ml
0.25 g
100 ml
50 ml
50 ml
0.5
2-
Colectar la muestra de esputo segn lo indicado. Transferir aproximadamente 10 ml a un tubo plstico, descartable de 50 ml. Esto debe hacerse bajo una
campana bacteriolgica. Limpiar la superficie de trabajo peridicamente, con
desinfectante.
3-
4-
5-
6-
Llenar el tubo con agua destilada estril, hasta que el nivel del lquido quede
12 mm por debajo del borde. Tapar el tubo y agitar por inclinacin para mezclar bien.
7-
18-
19-
10-
Con pipeta capilar estril, inocular dos gotas del sedimento con albmina en
la superficie de un tubo (dos de preferencia segn disponibilidad), de medio
de cultivo Lowenstein-Jensen.
11-
12-
De preferencia colocar a cada tubo un capuchn de cartulina negra para evitar que al cultivo le de la luz. Dejar el tapn de rosca ligeramente flojo.
2-
3-
4-
5-
Con pipeta Pasteur estril, adicionar lentamente cido clorhdrico 2N, hasta
obtener un color amarillo definitivo.
6-
7-
Inocular un tubo del medio de Lowenstein-Jensen con dos asadas del sedimento.
8-
2-
2-
Mezclar en agitador vortex y dejar en reposo 30 minutos a temperatura ambiente, con agitacin ocasional.
3-
Agregar solucin salina estril para bajar el peso especfico y diluir el cido.
4-
5-
6-
Agregar una pizca (50 a 100 mg) de polvo NALC a 20-50 ml del lavado gstrico.
2-
3-
4-
5-
Si el material es fluido:
1-
2-
3-
2-
3-
4-
5-
6-
7-
2-
3-
4-
5-
6-
7-
8-
Utilizar macerador de tejidos o mortero estril para triturar la muestra aspticamente en solucin salina estril. Si el tejido es mucoso (por ejemplo pulmn), adicionar una pizca de polvo NALC. Si se desea investigar hongos patgenos es mejor no triturar, mejor cortar en pedazos finos con tijeras estriles.
2-
3-
2-
Si el material es fluido:
1-
2-
Si el material no se obtuvo aspticamente, proceder como esputo si el volumen es menor de 10 ml, si es mayor procesar como lavado gstrico fluido.
3-
Efectuar procedimientos especiales para aislamiento de micobacterias de sangre o heces fecales, debe justificarse plenamente y por lo general no se efecta. Mdula sea: sembrar directamente en Lowenstein-Jensen.
Disgnicas: Colonias brillantes de superficie lisa y bordes enteros tpicas de Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium-intracelulare. Al observarse estos tipos de crecimiento en el tubo de Lowenstein-Jensen de
preferencia observados con microscopio estereoscpico, hacer frote en
una gota de solucin salina o colorear con Ziehl-Neelsen.
219
Reporte de cantidad
No se observan colonias
Menos de 50 colonias
50-100 colonias
+(1+)
100-200 colonias
++ ( 2 + )
+++ ( 3 + )
++++ ( 4 + )
Crecimiento lento de colonias eugnicas no pigmentadas en LowensteinJensen que crecen entre 4 y 7 semanas.
2-
3-
Prueba de niacina:
La produccin de la vitamina niacina (cido nicotnico) en el medio
Lowenstein-Jensen es tpica de M. tuberculosis. Las otras micobacterias son niacina
negativo, por lo que con esta nica prueba se logra una diferenciacin adecuada.
Esta diferenciacin se conoce desde 1955 segn Konno et al. (Science, 124: 985, 1956
y Am. Rev. Resp. Dis. 75: 529, 1957).
220
2-
Con el asa espatulada o pipeta capilar, cortar profundamente varias veces el medio de cultivo dentro del tubo, para que el agua o solucin
salina penetre y extraiga la niacina.
3-
4-
5-
6-
Como control negativo, pipetear 0.6 ml del agua o solucin salina utilizada para hacer el extracto en otro tubo 13 X 75 mm. Marcar el tubo
control negativo.
7-
Con pinzas flameadas, dejar caer en ambos tubos una tira reactiva de
niacina (DIFCO 3182-30-8, Bacto-TB Niacina Test Strips), de manera que
la flecha indicadora quede apuntando al fondo del tubo; tapar los tubos
inmediatamente. Mantener las tiras en refrigeracin.
8-
9-
10-
Interpretacin: la prueba de niacina es positiva si aparece color amarillo en el extracto de la muestra, y el control negativo no presenta color.
Autoclavear los tubos con extractos de muestras.
222
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