Cuales son los niveles de accin de

la Terapia Molecular?

Terapia molecular
Diseo de nuevas molculas (DNA,
RNA, protenas, compuestos
qumicos) en base al
conocimiento de la estructura y
funcin de las dianas
moleculares, cuya funcin se
desea interrumpir,
disminuir,corregir o aumentar
para obtener un efecto
terapetico en el individuo.

Sustrato
DNA
1
GEN

Niveles de intervencin terapetica molecular

1. GEN:
de genes

Terapia gnica o Terapia por transferencia

2. Expresin gnica: (Aumento o disminucin)

Control de transcripcin:
Metilacin, desacetilacin (disminucin) y
demetilacin y acetilacin (aumento) de histonas.
Control de factores de transcripcin
Control de splicing de pre-mRNAs
Control del transpote y de la traduccin de mRNAs
DNA
1

RNA

PROTEINA
3

Expresion gnica

4
Producto
Metabolismo

3. Protena
Reemplazamiento de protena: extracelular o intracelular.
Suministrada extracelularmente a nivel sistmico o dirigido a
clulas especficas.

Ej: Maquinaria proteca de sealizacin celular

Primeros mensajeros: hormonas, factores de crecimiento
Receptores
Maquinaria de Transduccin
Segundos mensajeros
Cascadas de protena quinasas
Control de expresin gnica
DNA

4. Manipulacin metablica

RNA

RNA

PROTEINA
3

Qu es la terapia gnica?

Restriccin en la dieta
Reemplazamiento de metabolitos o cofactores
Inhibicin de rutas metablicas
Depleccin de metabolitos txicos

vector
(gen terapetico)

Sustrato

Protena
(Enzimas)

4
Producto

Metabolismo

La expresin de un nuevo gen dentro de una

clula diana resultando en un cambio en las
caracteristicas funcionales de la clula que
produce un beneficio terapetico para el
paciente

1953
Watson & Crick
determinan la
estructura del DNA
1944
DNA lleva la
informacin gentica

1990
Comienzo era
moderna de
terapia gnica
~1974
Secuenciacin y
clonaje del primer
gen humano
1980
primeros
ensayos de
terapia en
humanos

1940

1950 1960

1970

1980

Terapia gnica: Material

gnico a transferir y vehculo
vehculo

DNA

Desnudo
Liposomas

1999
primera
demostracin de
un beneficio en
humanos con
terapia gnica

1990 2000

Terapia gnica Ex vivo vs In vivo

Ex vivo Aislar clulas del cuerpo, incubar con el DNA a transferir, seleccionar
retornar al cuerpo las clulas modificadas. Lo mas usado.
In situ In vivo Vector se introduce directamente en clulas afectadas. AdenoCFTR
bronquial. Inyeccin en tumores. AdenoDistrofina msculo. Oligonucletidos,
estenosis coronaria

Virus

Gen
oligonucletido

Vehculo, Eficiencia de transferencia,

Integracin vs no integracin
Eficiencia

DNA desnudo

Gen clonado en vector adecuado

Poco e
ficiente

DNA plasmido
oligonucletido

In vivo

20-100%

Transportador
molecular
Liposomas
Virus
(adenovirus,
AAV,HSV)

Ex vivo

Clulas

Virus
(retrovirus)

s
oda
% t
100 lulas
c
o
las
er
,p s
% lula
0
10 lo c o
so cicl
en

10
c 0%
no lu in
se las clu
di que so
co
vid
n
en

El desarrollo de la terapia gnica

Virus Lentivirus

Transferencia no viral
1. Liposomas
2. Polimeros catinicos

4. Uso de ligandos especficos

1. Liposomas
2. Complejos de Liposomas-policationes
3. Microinyeccin
4. Sistemas basados en ligandos especficos

3. Microinyeccin

Oligonuclotidos
anti-sentido

Pasos sucesivos para una buena terapia gnica:

1. Desarrollo de vector
2. Obtener la construccin adecuada para la transferencia
3. Proliferacin y mantenimiento de las clulas diana
4. Transfeccin eficiente e integracin del DNA transferido al
genoma nuclear o mantenimiento del DNA transferido
5. Expansin de las clulas modificadas y transferencia al
paciente

Plsmidos
de expresin

DNA desnudo
Ventajas:

Alto rendimiento en obtencin del material gnico

No se introducen genes virales
Desventajas: Eficiencia de transferencia baja
Expresin no estable

Adenovirus

Vectores virales
virus DNA
1. Adenovirus

2. Adeno-associated viruses (AAV)

3. Herpes simplex (HSV)

virus RNA (Retrovirus, lentivirus)

1. Virus leucemia murina (MuLV)

2. Human immunodeficiency viruses (HIV)

3. Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV)

Ventajas
1. Alta eficiencia de infeccin
2. Alto nivel de expresin gnica
3. Puede acomodar DNAs algo
mayores
Desventajas:
1. Expresin transitoria
2. Dificil conseguir que se
infecten solo las clulas a tratar
3. El virus infecta muchos tipos
celulares
4. Reaccin inmunologica
5. Seguridad

Vectores adenovirales
E1

Retrovirus

Genes tardos (L1-L5)

E3

ITR

ITR

E2
E1

E4
E3

cDNA
del gen a transferir

poliA

Clulas 293 (para empaquetamiento del virus)

transfectadas con un vector que codifica para E1
E1

Ventajas:
1. Integracin en el genoma al azar
2. Amplio espectro de huspedes
3. El transgen se expresa durante tiempos largos
Desventajas:
1. Genes que se pueden insertar pequeos
2. Infectividad limitada a clulas que puedan proliferar in
vitro
3. Inactivacin por la cascada del complemento
4. Problemas de seguridad

Sntesis de un vector retroviral de terapia gnica

Marcador selectivo de
resistencia para aislar las
clulas que incorporan el gen

Gen X

Objetivos de la terapia gnica.

Aumento (recuperar) funcin.
Muerte celular.

Terapia de aumento
gnico

Gen toxina

Seal para encapsidacin

del genoma retroviral

LTR

Clulas con fenotipo normal

por aumento de la expresin del
gen X

Clulas enfermas

Sitio de insercin del gen

(cDNA hasta 7Kb)

GAG POL ENV

Gen conversor
de una droga

Muerte directa de
clulas enfermas

Clulas enfermas

Clulas enfermas mueren por

expresar el gen de una toxina

Clulas enfermas

pA

droga

Clulas enfermas mueren al

suministrar la droga al paciente

Genoma retroviral en la clula de empaquetamiento

Objetivos de la terapia gnica

Hacer responder al sistema inmune

Objetivos de la terapia gnica

reemplazamiento gnico
Recombinacin
homloga

Gen de un Antgeno nuevo

Gen normal

Clulas con nuevos antgenos

eliminadas por el sistema inmune

Clulas enfermas

Clulas normales que

expresan el gen normal

Clulas enfermas
que contienen un
gen mutado

Gen citoquina

DNA

M
Clulas enfermas mueren porque las
citoquinas activan el sistema inmune

Activan sistema
inmune

Objetivos de la terapia gnica

Inhibicin de la expresin gnica
Gen anti-sentido
Gen anti-sentido
M

DNA

mRNA

Objetivo de la terapia gnica

Inhibicin de la expresin gnica
oligonucleotido anti-sentido y ribozimas
Oligonucletido
Anti-sentido

mRNA

Gen Anti-sentido

mRNA

Formacin de
triple hlice

Transcripcin

Clulas enfermas
que contienen un
Traduccin
gen mutado
o cualquier gen
que queramos
anular su expresin
No protena

Clulas normales que

no expresan
el gen mutado

-RISC (RNA Induced Silencing

Complex) Es un complejo que produce el
desplazamiento de la hebra del RNA
con sentido del duplex de siRNA y
por tanto luego se puede dirigir al
mRNA correspondiente y por la
accin de endonucleasas y
exonucleasas degradar el mRNA
especfico al que va dirigido.

siRNA mechanism

siRNA: Small Interfering

RNA. RNA interferente:

Ribozima.RNA cataltico

Objetivo de la terapia gnica

Inhibicin de la expresin gnica
RNA interferente

Degradacin
del mRNA

Bloqueo de la
traduccin del mRNA

Ribozima

Adems inhibe la expresin por mecanismos

Similares a oligonucletidos anti-sentido

-Dicer: Enzima similar

a Rnasa II que genera el duplex
siRNA a partir de dsRNA.

Ataque por
RNAsa H

Clulas enfermas
o no enfermas

No protena

siRNA modificado con colesterol

permea mejor en las clulas y permite terapia

sistmica
Colesterol unido al 3 de la cadena con sentido del siRNA
Chol-siRNA

21-23 nucletidos

Nature. 2004 Nov 11;432(7014):173-8 .

Terapia gnica por reas mdicas

Terapias gnicas en marcha

OTRAS
5%

60
50

HIV
8%

40
30
20

Reumatologia

G.I.

Vascular

Hematologia

10

Oncologia

% del total de
terapias gnicas

70

Algunos problemas de la terapia

gnica
Reaccin Inmunlogica
Transformacin

Adenovirus

Vector para
transferir el gen
normal OTC
Inyectado en sangre
lleg al hgado
Jesse tuvo una
reaccin inmune
aguda contra el
virus

MONOGEN
ICAS
22%
CANCER
65%

Problemas de la terapia gnica

Jesse Gelsinger, 18
Comienza en 1999
terapia gnica
contra deficit de
ornitina
transcarbamilasa
(OTC)
Muri 4 das
despus

Reaccin fatal

Virus se adhieren a macrfagos

sensibilizados
Macrfagos liberan grandes cantidades
de interleuquinas
Fallo heptico

Terapia gnica de SCID ligada a X

Severe Combined Immunodeficiency
IL-2R IL-15R IL-21R
IL-2

IL-15

IL-21

IL-7R

IL-4R
IL-4

IL-7

Citoquinas requeridas para la

formacin de clulas linfoides

IL-9R
IL-9

STEM
CELL

IL-3
Clulas Maduras
IL-2,4,6,7,10,13,14,15,21

Linfoide
STEM CELL

IL-2,4,6,7,9,12,15
IL-2,12,15

Linfocitos B
Linfocitos T
Linfocitos NK

X-SCID: Dficit de C
Produccin
de IgG
por linfocitos B

Resultados de la terapia gnica en

SCID ligado al X

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0

T-Cells

After

Patient 2
Peripheral Blood T-cells

Peripheral Blood T-cells

Patient 1
Before

Before

After

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0

Interrupcion de la terapia gnica de

X-linked SCID
Vector usado: retrovirus con cadena -C
Tratamiento ex-vivo: infeccin de clulas CD34+
de medula sea y reinyeccin al paciente
Problema: En un paciente se ha producido
un linfoma linfoblstico T.
CAUSA: El retrovirus se ha insertado prximo
al gen LMO-2. Cuyas mutaciones o aumento
de expresin de este factor de Transcripcin
produce linfomas T
Se ha interrumpido el tratamiento: en USA
y Francia. Se ha comenzado de nuevo.

Consideraciones ticas
de la terapia gnica
Uso de la tecnologa de transferencia gnicas
para otras aplicaciones: mejora funcional o fines
cosmticos. Tratamiento de la calvicie por
transferencia gnica en clulas foliculares,
aumento de estatura por transferencia de
hormona del crecimiento, aumento de masa
muscular para atletas.
In utero terapia gnica somtica solamente
deben tratarse enfermedades muy graves y
balancear muy bien el riesgo para la madre y
para el feto.
Abuso del uso de las tcnicas de clonaje para el
clonaje reproductivo.